1 cycle de PCR - BiOutils
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1. ADN se s parent On parle de d naturation de l ADN 2 tape l hybridation 40 65 C En descendant la temp rature les amorces s apparient s hybrident par compl mentarit leurs s quences cibles sur l ADN 3 me tape l longation 72 C A cette temp rature la Taq synth tise les brins d ADN compl mentaires en ajoutant des desoxynucl otides triphosphates la suite des amorces Le temps d longation d pend de la taille du fragment amplifier et de la vitesse de polym risation de l enzyme la Taq ajoute environ 1000 nucl otides par minute Ces trois tapes correspondent 1 cycle de PCR la suite duquel on a doubl le nombre de fragment d ADN cible initial Environ une trentaine de cycle sont en principe effectu s dans une exp rience de PCR classique Ainsi apr s 30 cycles on aura amplifi 2 fois notre ADN cible Exp rience 10 page 1 de 7 Sch ma des cycles de PCR 1 cycle 2 me cycle D naturation Hybridation Elongation D naturation etc jusqu n cycles temp rature C Sch ma de l amplification par PCR ADN initial 1 cycle Sn 0 A Z ALLELULELLELELELUEELLEEELELLELLELEEUELL 2 5 gt 5 5 ae C T Q Hybridation Elongation E K BIQutils Exp rience 10 page 2 de 7 Les VNTR L ADN de tr s nombreux organismes vivant contient des s quences de nucl otides r p t es en tandem les unes la suite des autres Ces2. Migration mm par rapport au puit Pour convertir la taille d un all le en nombre de r p tition utiliser la formule suivante Taille en pb 129 16 N r p titions 32 N r p titions 129 pb de 16 pb 1r Taille d un all le Voici un exemple de r sultat taille en pb M M marqueur de taille Lignes 1 5 g notypes de 5 individus Noter que l individu 1 est homozygote pour l all le DIS80 C contr le n gatif sans ADN ce contr le permet de v rifier l absence de contaminations d ADN P primers BiQutils Exp rience 10 page 6 de 7 AAV Mat riel Pipettes P20 et embouts st riles Pipettes P200 et embouts st riles Pipettes P1000 et embouts st riles Ecouvillons st riles Gants Microcentrifugeuse Bloc chauffant 95 C Tubes r action Eppendorf 1 5ml Tubes PCR 0 2 ml Machine PCR H20 st rile NaOH 200 mM HCI 200 mM Tris HCL pH 8 5 200 mM 2x Taq mix comprenant la Taq DNA polym rase les ANTPSs et le tampon Primers Agarose Cuve d lectrophor se Tampon de migration TBE 1x SYBR Safe Lampe de d tection d ADN lumi re bleue Marqueur de poids mol culaire Stockage du mat riel Le 2x Taq mix est stock au cong lateur 20 C d gel sur glace ou bri vement temp rature ambiante gard dans la bo te r frig rante pendant la manipulation et remis 20 C apr s usage Le SYBR Safe est stock au frigo 4 C Il faut le s
3. 10 La PCR La technique de polym risation en cha ne en anglais polymerase chain reaction ou PCR permet d amplifier des millions de fois un unique fragment d ADN Cette m thode est devenue un outil pr cieux non seulement pour la recherche en biologie mol culaire mais galement pour le diagnostique m dical la d termination de microorganismes ou encore la criminologie L invention de la PCR revient Kary Mullis dans les ann es 80 Il obtint pour cette d couverte le Prix Nobel de Chimie en 1993 La d couverte d ADN polym rases thermor sistantes la Taq polym rase par exemple isol es de bact ries Thermus aquaticus vivant dans des sources d eau chaude a facilit l utilisation de la PCR et a permis son automatisation Th mes la PCR la structure du g nome humain le g notypage la criminologie l ADN l lectrophor se La PCR Le principe de la PCR Une r action de PCR n cessite 1 de l ADN amplifier d nomm template 2 des amorces galement appel s primers 3 des desoxynucl otides triphosphates dATP dCTP dGTP dTTP 4 une ADN polym rase thermor sistante la Taq par exemple 5 du magn sium M g indispensable au fonctionnement de l ADN polym rase Ces 5 ingr dients sont m lang s dans un tube essai et soumis diff rents cycles de temp ratures 1 cycle de PCR 1 tape la d naturation 94 C L ADN template est chauff 94 C Les deux brins de l
4. H 8 5 200 mM dans votre tube Votre pr paration d ADN est pr te et peut tre stock e au cong lateur ou utilis e directement pour la suite de l exp rience 2 Amplification par PCR Pr parer le m lange de r actif pour la PCR juste avant l emploi Ce m lange contient le 2 x Taq mix taq polym rases dNTPs tampon de polym risation et tampon de charge rouge les primers et de l H20 Pour une classe de 16 l ves par exemple on compte 16 r actions plus un contr le n gatif ainsi qu un contr le positif soit un total de 18 r actions Afin de faciliter le pipetage et pour avoir assez de mat riel en cas d erreurs nous pr voyons un m lange pour 22 r actions 1 r action 22 r actions 2 x Taq mix rouge 12 5 ul 275 ul Primers mix 5 ul 110 pl H20 2 5 ul 55 ul Ce m lange est pr par dans un tube Eppendorf 1 5 ml juste avant l emploi M langer en pipetant en haut et en bas d licatement Distribuer ensuite les 20 ul du m lange dans les petits tubes de PCR pr alablement marqu sur le c t par les initiales des personnes tester Dans votre petit tube ajouter 5 ul de votre solution d ADN Fermer le tube Dans le petit tube PCR destin au cont le n gatif ajouter 5 ul d H20 la place de ADN Fermer le tube Dans le petit tube PCR destin au cont le positif ajouter 5 ul d ADN B2B Fermer le tube En suivant les instructions du mode d emploi de la machine PCR mettre les tubes dans la machine et lance
5. fication du gel une petite lamelle d agarose en haut et en bas du gel pour lib rer les lectrodes Lorsque le gel est refroidi et solidifi ajouter du tampon d lectrophor se TBE 1x et enlever le peigne 4 Analyse des g notypes sur gel R cup rer vos tubes Ils contiennent d j le tampon de charge rouge et sont donc pr t tre mis sur gel Charger le gel 1 puits 5 ul de marqueur 2 puits 20 ul du saboteur 3 me puits et suivants 20 ul de vos chantillons Avant dernier puits le contr le n gatif Dernier puits le contr le positif Allumer le transformateur et faire migrer 100V amp rage maximum Quand le colorant rouge de migration arrive en bas du gel arr ter le transformateur Prendre le gel et visualiser les bandes sous la lampe bleue Prendre une photo BiQutils Exp rience 10 page 5 de 7 5 R sultats et discussions D apr s la taille des fragments obtenus identifier le saboteur D apr s la taille de vos fragments obtenus d terminer le nombre de r p tition pour chacun de vos all les Le contr le positif donne 1 bande d environ 500 pb et une autre d environ 600 pb Pour d terminer pr cis ment la taille des fragments il faut tracer un graphique du log de la taille en pb du marqueur en fonction de la distance de migration en mm depuis le puits comme dans l exemple ci dessous Taille Marqueur Saboteur en pb Poids mol culaire pb
6. ortir environ 30 minutes avant de l utiliser pour que la solution soit bien soluble Le marqueur d ADN l ADN B2B contr le positif les primers sont stock s au cong lateur 20 C d gel temp rature ambiante et remis 20 C apr s usage Le reste du mat riel peut tre gard temp rature ambiante Ce protocole est une adaptation de l article suivant D S Jackson C S Abbey and D Nugent 2006 DNA profiling of the D1S80 locus a forensic analysis for undergraduate biochemistry laboratory J Chem Edu 83 774 776 L Universit de Gen ve d cline toutes responsabilit s en cas de dommages survenus durant les exp riences BiQutls Exp rience 10 page 7 de 7
7. r le programme D1S80 Le programme dure environ 1h15 Il comporte les cycles suivants 94 C 5 minutes 94 C 30 secondes 65 C 30 secondes 30 cycles 72 C 30 secondes 72 C 5 minutes A la fin des cycles de PCR les tubes peuvent tre gard s au cong lateur Arr ter la machine PCR en suivant les indications du mode d emploi E BiQutis Exp rience 10 page 4 de 7 3 Pr paration du gel d agarose Le gel d agarose est une matrice pour s parer les mol cules d ADN selon leur taille dans un champ lectrique Les petits fragments migrent plus vite que les grands la concentration d agarose est choisie en fonction de la taille des fragments s parer Ici nous allons utiliser un gel 1 5 d agarose Peser 1 05 g d agarose et les mettre dans un Erlenmeyer de 250ml Ajouter 70 ml de tampon d lectrophor se TBE 1x Faire bouillir four micro ondes plaque chauffante ou bec bunsen Laisser refroidir le liquide environ 60 C Ajouter 7 ul de SYBR safe intercalant qui permettra de visualiser ADN et m langer en agitant l Erlenmeyer Verser l agarose dans la cuve pr par e avec un peigne pour former les puits attention si l agarose est trop chaud la cuve d lectrophor se se d forme Les cuves d lectrophor se poss dent des petits bloques en plexi pour prot ger les lectrodes Souvent les cuves sont d form es et les bloques ne rentrent plus Il suffit donc de couper apr s solidi
8. re d termin Protocole La quantit d ADN peut tre critique pour obtenir des bons r sultats Bien qu il soit possible d effectuer cette exp rience partir d un bulbe de cheveux il est pr f rable d utiliser des cellules de la bouche plus nombreuses et obtenues facilement partir de l int rieur des joues Le protocole est d crit ci des sous 1 Extraction d ADN partir de cellules pith liales de la bouche Mettre 500 ul d H20 dans un tube Eppendorf Frotter abondamment l int rieur des joues avec un couvillon coton tige st rile afin d obtenir un maximum de cellules pith liales Tremper l couvillon dans le tube contenant les 500 ul d H20 Bien tourner l couvillon et le frotter contre les parois du tube Bien essorer l couvillon en le sortant du tube Centrifuger le tube 2 minutes la vitesse maximum afin de faire tomber les cellules pith liales S BiQutils Exp rience 10 page 3 de 7 A l aide de la P1000 enlever le surnageant en prenant soin de laisser le culot de cellules au fond du tube Attention ne pas aspirer le culot de cellules Le cas ch ant centrifuger nouveau la salive Ajouter 0 1 ml de solution de NaOH 200 mM sur le culot et le resuspendre en vortexant ou en pipetant l aide de la P1000 Fermer le tube et incuber 95 C pendant 10 minutes dans le bloc chauffant Vortexer bri vement Ajouter 0 1 ml de HCL 200 mM dans votre tube Ajouter 0 1 ml Tris HCI p
9. s quences sont d nomm es VNTR variable numbers of tandem repeats Le nombre de ces r p titions varie d un individu l autre de 0 300 r p titions formant ainsi une empreinte g n tique utilis e en criminologie pour des recherches de paternit ou encore pour tudier la g n tique des populations Le locus DIS80 est situ sur le chromosome 1 Ce VNTR poss de un motif de 16 pb r p t de 14 41 fois suivant les individus 27 all les diff rents En regardant le nombre de r p titions sur les deux chromosomes 1 le maternel et le paternel on obtient ainsi 789 g notypes possibles 27x27 789 Locus D1S80 sur le chromosome 1 Chromosome maternel motif de 16 pb Primer 1 Primer 2 Chromosome paternel n r p titions du motif de 16 pb L EXPERIENCE Afin d viter toute contamination d ADN il est pr f rable d utiliser des gants pendant toutes les manipu lations Cette exp rience peut tre envisag e sous la forme d une enqu te polici re Un individu est venu dans le laboratoire de biologie saboter des exp riences Lors de ses m faits il a laiss un indice un cheveu Toute la classe est consid r e comme suspect potentiel et le but de l exp rience sera de mettre la main sur le coupable Le profile g notype de chaque l ve pour ce locus sera observ sur gel d agarose et compar au profil du suspect Le nombre de r p titions de chaque l ve pourra galement t
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