Mode d`emploi SP5 X Télécharger 3.5
Contents
1. 1 Activer si n cessaire l AOTF UV et ou visible Argon voir annexe B1 pour plus de d tails sur les AOTF en fonction des raies laser dont vous avez besoin 2 R gler les puissances de sortie d AOTF de chacune des raies choisies 3 Passer au contr le du laser blanc en cliquant sur la barre noire switch to WLL 1 1 Load Save single setting 7 Visible Leica Settings Be GB Bleach Point me RE RR a 3 13587 Jun SJUAA 01 JAMES INMAGIC Inmed IMAGIng Center WALL Shutter Constant Percentage 17 or TI y rt E EJ fm fa a FE oh DA D Es 4 Activer l AOTF puis le nombre de raies laser dont vous avez besoin 5 Activer les raies laser puis r gler la longueur d onde pour plus de pr cision double cliquer sur le chiffre pour taper la valeur exacte 6 R gler les puissances de sortie d AOTF de chaque raie pour plus de pr cision double cliquer sur le chiffre pour taper la valeur exacte r intansity of Laser Line Fx Caption OK 3 Cancel 7 La pr sence du trait symbolisant la raie laser dans la partie d tection atteste de l activation du laser 8 Retour au contr le des lasers conventionnels en cliquant sur la barre noire switch to conventional Lasers INMAGIC lnmed IMAGing Center DETECTION 2 1 5 3 1 Activer les d tecteurs dont vous avez besoin Hybrides voir annexe B4 ou PMT classique 2 A titre d in2. A scan Range Properties Detection Begin Detection End Total Detection Range Detection Band Width No of Detection Steps A Detection Stepsize PMT Selection Au niveau de l onglet A Scan Range Properties s lectionner le d tecteur utiliser 1 Indiquer galement 2 les valeurs de d but Begin et de fin End de la s rie Lambda la taille de la bande passante Band With largeur de la fente le nombre d images spectrales No of steps ou le pas entre 2 images spectrales A detection stepsize S il est connu se placer au maximum du spectre d mission du fluorochrome et faire les r glages de puissance laser de gain et d offset Attention il ne faut pas de saturation pour l analyse spectrale Lancer l acquisition en cliquant sur Start Active Enregistrer le spectre d mission du fluorochrome Aller dans le menu Process tools Dye separation Spectral InNMAGIC lnmed IMAGing Center a a Q D f a Aysuaju ua Normalize Scaling Export to Dye Data Base Export Measurement Area fo g Voxels Rescale Q Per Channel e All Channels Remove Le spectre de l chantillon est repr sent automatiquement Mettre l chelle de l axe Y en mode Normalize clic droit sur l axe Scaling 3 D placer la ROI sur l image pour la placer sur une zone d int r t Augmenter la taille de la ROI en fonction de la taille de la zone d int r t plus la RO
3. MANUEL D UTILISATION DU MICROSCOPE CONFOCAL LEICA TCS SP5 X Francois MICHEL PhD Institut de neurobiologie de la m diterran e n M AG C Inmed iMAGIng Center InNMAGIC lnmed iMAGIng Center N h sitez pas demander conseil aux ing nieurs de la plateforme Fran ois poste 28108 et Thomas poste 28118 En leur absence Agn s Baude poste 28131 peut vous aider en cas d urgence AGIC lnmed IMAGing Center DEMARRAGE ET MISE EN MARCHE DU SYSTEME STARTING THE SYSTEM LANCEMENT DU LOGICIEL LAS AF PRESENTATION DE LA PARTIE DE PARAMETRAGE DE L ACQUISITION CHOIX ET CREATION D UNE CONFIGURATION PRESENTATION DU STATIF DM6000B ACQUERIR UNE IMAGE ACQUERIR UNE SERIE EN Z ACQUERIR UNE SERIE EN XZ ECHANTILLONNAGE SPATIAL ACQUERIR PLUSIEURS MARQUAGES SIMULTANNEMENT ACQUERIR PLUSIEURS MARQUAGES SEQUENTIELLEMENT ACQUERIR PLUSIEURS POSITIONS DE PLATINE MARK amp FIND ACQUERIR UNE MOSAIQUE D IMAGES ACQUERIR DES IMAGES EN ILLUMIN ATION TRANSMISE ACQUISITION DE SERIES D IMAGES SPECTRALES VISUALISATION DES IMAGES ACQUISES ET CONTROL DE L AFFICHAGE QUANTIFICATION DE SIGNAL ENREGISTREMENT DES IMAGES MISE HORS TENSION DU SYSTEME TURNING OFF THE SYSTEM ANNEXE A ANNEXE B1 4 ANNEXE C InNMAGIC lnmed IMAGIng Center DEMARRAGE ET MISE EN MARCHE DU SYSTEME Allumer la lampe fluorescence et v rifier le niveau d illumination des d tails sur la lampe en annexe A Au niveau du po
4. chantillonn e en dessous elle est sur chantillonn e La taille des pixels est indiqu e et calcul e dans la fen tre de r glage des param tres d acquisition 1 et resum en en t te de la fen tre Pour modifier la taille des pixels dans l image vous pouvez modifier le zoom plus le zoom est important plus la taille du pixel image est petite ou modifier le format de l image le nombre de pixels que contient votre image Pour faire un zoom 3 possibilit s 2 Appliquer le zoom souhait en faisant varier le Zoom factor ou tapez le 3 Cochez la case Zoom in s lectionner l outil rectangle sur l cran de droite et dessiner la zone zoomer sur l image en live 4 Zoomer en utilisant le bouton Zoom du panel 1 2 2 3 Zoom facto F Zoom in Image Size 1 22 mm 1 22 mm 1 Pixel Sre 238 um 2 38 um 966 00 nm 4 section Thickness 11 075 um 3 Pour modifier le format de l image et donc le nombre de pixels Dans le menu d roulant Format s lectionner une taille d image plus grande 1024 1024 128 x 128 Zoom fact 256 x 256 512 x 32 512 x 64 Image SET PE Pixel Size Mer 1024 x 512 1024 x 1024 Line Avere ET TEE D Frame Ave IEEE B 8192 x 8192 Accumula B More Rotation er N bo B INMAGIC lnmed IMAGIng Center e Echantillonnage axial De la m me fa on lorsque vous effectuez une s rie Z l intervalle entre 2 coupes optiques
5. Cocher la case Same Stack for all Une s rie Z diff rente est acquise pour chaque position Dans ce cas i d cocher same stack for all ii Se placer sur le 1 champ d int r t iii D finir les conditions d acquisition de la s rie Z Begin End et Z step iv Enregistrer la position v Recommencer de facon identique pour toutes les positions a enregistrer Lancer l acquisition en cliquant sur Start INMAGIC lnmed IMAGIng Center ACQUERIR UNE MOSAIQUE D IMAGES VERIFICATION DE LA PLATINE XY Avant de r aliser une acquisition d image mosa que il est n cessaire de v rifier l orientation de la platine XY afin que son d placement soit correct et la reconstitution de l image soit bonne Avec ces v rifications l image obtenue est dans la m me orientation que celle visualis e dans les oculaires Cliquer sur l ic ne Tile Scan La fen tre suivante appara t Ex f x Pos mm Poe mn URS Calibration Scanfield Define Asymmetry mM A WW N Merge Images Acquisition Mode xyz 1 Visualisation des positions enregistr es 2 Enregistrement d une position 3 Suppression de la position s lectionn e 4 Suppression de toutes les positions 5 Acc s aux param tres de calibration 6 Taille du champ scann en nb d images en X x Y 7 La grille jaune sch matise les tuiles 8 Le champ rouge est le champ cran i m V rifier que le
6. Proc der de la m me fa on que dans le paragraphe Acqu rir une image un seul plan une seule couleur pour faire les r glages en prenant soin de les r aliser dans le plan le plus intense Ouvrir le panneau Z stack En mode Live ajuster le Z de fa on a tre au plus bas de votre chantillon 1 Cliquer sur Begin pour marquer la position de d part proche de la lame stack 116696um 310 steps Begin pm End um Nr of steps j 2 step size 3 7 z Volume 4 Travel Range System optimized Compensation 2 Ajuster nouveau le Z avec le control panel de fa on tre au plus haut de l chantillon Cliquez sur End pour marquer la position de fin loign e de la lame 3 D finir le nombre de coupes faire Nr of steps ou entrer la valeur de la distance entre chaque coupe Z step size Attention l chantillonnage axial voir p 25 N B Ne pas utiliser le mode system optimized sauf si on veut travailler la limite de r solution en Z Lancer l acquisition de la s rie Z avec l ic ne Start Renommer le fichier et sauvegarder le r pertoire N oubliez pas de d sactiver les bornes du stack 1 et 2 et de remettre le nombre de coupes 1 si vous ne voulez plus acqu rir de s rie Z InNMAGIC lnmed IMAGing Center COMPENSATION Il est possible de compenser la perte de signal avec la profondeur par une augmentation lin aire et automatique du gain des d tecteurs et ou du laser entre les b
7. besoin Typiquement le laser blanc WLL et la diode 405 si vous avez un marquage de type DAPI NB chaque fen tre comporte une ic ne qui donne une aide contextuelle et l acc s l aide en ligne particuli rement compl te mais claire et facile d utilisation Microscope Objective Beam Path it Ctrl Panel Super Z IPS Masks INMAGIC iInmed iMAGIng Center WLL BB 405 Diode ES Argon Le laser Blanc White Ligth Laser est un laser puls picoseconde lt 0 5 W la cl sur le boitier d alimentation doit toujours tre sur ON ne pas toucher le boitier gauche du statif L talement spectral vient d effets d optique non lin aire dans le passage du faisceau puls dans une fibre sp ciale induisant un super continuum dont on utilise qu une partie dans le spectre visible 470 670 nm d autres d tails en Annexe B1 La diode 405 est puissante lt 60 mW et peut exciter de nombreux fluorophores comme la GFP spectre d excitation large elle doit donc tre mani e avec discernement en mode s quentiel principalement Cependant elle est peu efficace pour le DAPI dont le pic d excitation est proche de 350 nm et l excitation du DAPI peut requ rir plus de 50 de la puissance de la diode l autre solution possible et plus pratique laser UV aurait cout plus de 20 k Le laser Argon n a vocation tre utilis que dans certains cas pr cis utilisation de la raie 458 nm CFP chan
8. de la GFP ou choisissez des param tres spectraux plus appropri s gr ce au laser blanc en excitation et ou aux fentes spectrales l mission Si le laser a 488 nm excite la DsRed il faut l encore diminuer la puissance du laser jusqu a disparition du signal ou bien d caler vers le bleu la longueur d onde du laser d excitation de la GFP Allumer la raie a 560 nm et effectuer les r glages sur le canal de la DsRed sans augmenter le gain de l HyB3 S il est impossible de supprimer les d bordements ou qu il faut r v ler plus de trois couleurs vous devez obligatoirement travailler en mode s quentiel voir p 28 N h sitez pas a demander conseil aux ing nieurs de la plate forme INMAGIC lnmed iIMAGIng Center ACQUERIR PLUSIEURS MARQUAGES SEQUENTIELLEMENT Avec ou sans s rie Z Disposer la lame sur le microscope faire la mise au point et choisir un champ Cr er une configuration pour une acquisition simultan e avec plusieurs longueurs d onde d excitation voir pr c dent Cliquer sur le bouton Sequential n Acquisition Mode xyz Ajouter autant de nouvelles s quences que de couleurs en cliquant sur le bouton la s quence pr c dente servira alors de mod le la nouvelle Vous pouvez ajouter autant de s quences que vous voulez Pour retirez une s quence cliquez sur le bouton qui supprimera la derni re s quence cr e Sequential Scan LA between lines a between frames B betwe
9. manuellement en corrigeant les chiffres dans la fen tre mosa que 6 Lorsqu on effectue une mosa que de stacks l ensemble des tuiles auront la m me paisseur la configuration des bornes du stack doit tenir compte des extr mes de l ensemble de la mosa que idem pour les r glages de gain et de laser Chercher un champ d int r t se placer dans le bon plan puis d finir la position de d but de scan en cliquant sur E Recommencer de la m me fa on pour enregistrer la position de fin de scan 9 Par d faut le logiciel fusionne automatiquement les tuiles auto stitching et effectue un filtre qui smooth le recouvrement Pour les mosa ques de stack il y a l option avanc e pour effectuer un auto stitching 3D Lancer l acquisition en cliquant sur Start InNMAGIC lnmed IMAGIng Center ACQUERIR DES IMAGES EN ILLUMIN ATION TRANSMISE Faire la mise au point sur votre chantillon V rifier le s lecteur l arri re du statif seule partie non motoris e de ce microscope il y a deux positions i Vers l avant comme sur la photo o l illumination en transmission est op rationnelle c est la position pour le visuel ii Vers l arri re ou c est le PMT transmis qui est fonctionnel c est la position pour l acquisition PMT en transmission de type standard Lampe halog ne pour l illumination en transmission S lecteur entre lampe et PMT Sur le statif appuyer sur TL IL pour passer en
10. mode lumi re transmise et choisir le mode d illumination BF DIC Pol pour un cadrage visuel Activer l AOTF visible et s lectionner une raie du laser blanc plut t dans la partie initiale du spectre 470 500 nm qui est la zone du PMT la plus sensible voir annexe B4 Cliquer sur Additional Channels et activer le PMT Trans S lectionner le mode de contraste dans la liste d roulante Scan BF pour faire des images en transmission simple Scan DIC pour faire des images en DIC v rifier l orientation de l analyseur sur le statif voir p 17 pour obtenir une image optimale Scan PH Lancer un scan en Live et faire les r glages d AOTF attention le laser doit tre r gl a faible intensit de gain d offset et de Z mise au point Appliquer un average si n cessaire Acqu rir l image en cliquant sur Capture Image Renommer le fichier et sauvegarder le r pertoire voir p 41 INMAGIC lnmed iIMAGIng Center ACQUISITION DE SERIES D IMAGES SPECTRALES spectres et s paration spectrale SPECTRE D EMISSION Le syst me de d tection Leica bas sur un talement spectrale et une s lection par fentes motoris es voir annexe B3 permet l obtention de spectres d mission par balayage de la fente la largeur de la fente minimale est de 5 nm donc le pas de scan efficace minimum est de 3 nm Astuce pour couvrir l ensemble du spectre d mission du fluorophore tudi il est pr f rable d exciter a
11. ne New 3 Pour ouvrir un dossier d j existant cliquer sur l ic ne Open 4 Pour r utiliser tous les param tres d une image anciennement acquise s lectionn le fichier et cliquer sur Apply quivalent de re Use Maw InNMAGIC lnmed IMAGIng Center MISE HORS TENSION DU SYSTEME V rifier sur le planning en ligne si le syst me est r serv apr s votre session e Si le syst me est r serv apr s votre s ance ou dans les 3h qui suivent vous ne devez pas l teindre compl tement mais proc der de la fa on suivante V rifier que toutes les donn es sont bien sauvegard es Fermer le logiciel LAS AF menu File gt Exit Transf rer ou graver les donn es et les supprimer du disque dur Quitter la session Windows Start Log off V rifier que tous les objectifs soient bien nettoy s lentille c t s Mettre l objectif 5 X et descendre la platine Lower Z DEAR ENS e Si le syst me n est pas utilis apr s vous vous devez l teindre compl tement V rifier que toutes les donn es sont bien sauvegard es en lif et ou tif Eteindre les lasers Menu Configuration Laser d cocher tous les lasers allum s Fermer l application LAS AF menu File gt Exit Eteindre l ordinateur s lectionner dans la barre d outils Start Shutdown Mettre les lasers hors tension au niveau du poste de commande remettre la clef Laser Emission sur Off Le voyant indicateur d mission laser
12. s teint V rifier que tous les objectifs soient bien nettoy s lentille c t s Mettre l objectif 5 X et descendre la platine Lower Z Eteindre la station de travail TCS bouton vert PC Microscope Eteindre le scanner bouton vert Scanner Power 10 Eteindre la lampe fluorescence 11 Si vous avez utilis le laser Argon attendre 15 min et teindre l extraction d air et l alimentation des lasers bouton vert Laser Power ee US UE O OND INMAGIC lnmed IMAGIng Center TURNING OFF THE SYSTEM FIRST PLEASE CHECK THE PLANNING ONLINE If the system is used within 3 hours after your session you do not turn it off completely but proceed as follows Check that all your data are saved Close LAS AF software menu File gt Exit Transfer the data Logout Windows Start gt Log Off Check that all objectives are properly cleaned lens side Put the stage in the lower position and select 5X objective SAR a a a If the system is not used after you you must turn it off completely Check that all your data are saved Turn off the lasers Setup Menu gt Laser and then uncheck all lasers Close LAS AF application menu File gt Exit Turn off the computer Start gt Shutdown Turn off the laser turn the Laser Emission key on Off 0 Check that all objectives are properly cleaned lens side Put the stage in the lower position and select 5X objective Turn off the workstation TCS green bu
13. scan est orient 89 puis Cliquer sur l ic ne 5 stage config Par d faut l overlap est de 10 il est bon mais peut tre ajust dans cette fen tre V rifier que l orientation du scan des tuiles est bien custom Flip X et Y Stage Configuration Stage Configuration Delay after moving with mouse wipes 09 s Orientation of stage axes gx VM Stack to focus position relation Restore Z Wide QO Asymmetric e Symmetric Tile Scan Set overlap sizes to Overlap manual stitching Overlap auto stitching x foo um x 10 0 B y oo E um y 10 0 B Tile Scan Set merge settings to InNMAGIC lnmed IMAGing Center Activer Flip X dans Configuration Setting Image orientation Hardware Settings Settings Step Size po Activate z Movement Limitation Bidirectional XYZT Acquisition Line Average during Live Acquisition D den Data Transfer Mode ACQUISITION L acquisition d une image mosa que se fait en enregistrant la position du coin inf rieur droit puis la position du coin sup rieur gauche Le logiciel calcule automatiquement le nombre d images effectuer pour scanner tout le champ Il est possible d ajouter des positions interm diaires pour tre s r que l acquisition couvre bien toute la partie de l chantillon n cessaire On peut galement enlever une ou plusieurs lignes en partant du haut et ou une ou plusieurs colonnes en partant de la gauche
14. 737 95 6965196385433 510 526315789474 100 515 78947368421 98 8547910888432 21 052631578947 76 183233425785 526 315789473684 57 323074170171 531 578947368421 52 2680504607676 536 842105263158 43 4642569562495 542 105263157895 40 8875369061464 547 368421052632 33 2378992574035 552 631578947368 25 9550863380156 557 894736842105 24 0135993558201 563 157894736842 21 1237362440725 D 568 421052631579 11 2552563299633 9 Rentrer les informations concernant le spectre dans la Spectra Database 11 Cliquer sur Save 12 Le nom du spectre apparait dans la liste de la Soectra Database Sur la lame exclusivement YFP R aliser exactement les m mes tapes que pour la lame exclusivement GFP Attention Les conditions d acquisition largeur de BP Abeg Aend Astep doivent tre identiques celles de l acquisition de la GFP Sur la lame doublement marqu e GFP YFP Acqu rir un spectre dans les m mes conditions que pour la GFP et I YFP Pour s parer les spectres Aller dans le menu Process Dye separation Spectral S lectionner les spectres de la GFP et de la YFP r alis s pr c demment dans Select Spectrum from Database 13 Appuyer sur Apply 14 InNMAGIC lnmed IMAGing Center Spectral Dye Separation oO w 3 gt oO wo Spectral Dye Separation Measurement Area 20 a Voxels Save Current Spectrum Resoale o Per Channel Channels Le r sultat de la s parati
15. E constant l espace entre le laser et le d but de la fente spectrale du d tecteur Gap to SP Unit et la largeur de la fente bandwidth size Automatic SP Movement Method Gap to SP Unit Bandwidth Size Lancer l acquisition en cliquant sur Start PMT Selection Attention il ne faut pas de saturation pour l analyse spectrale Le traitement des valeurs spectrales s effectue de fa on similaire a celles des spectres d missions DETECTER LA PRESENCE D AUTOFLUORESCENCE Lorsqu un marquage fluorescent pr sente une intensit faible il est conseill de v rifier si la fluorescence observ e correspond effectivement au fluorochrome utilis ou si celle ci n est pas due de l autofluorescence Pour le v rifier faire un spectre de l chantillon Voir paragraphe Sur la lame exclusivement GFP ci dessus Un spectre ne correspondant pas celui du fluorochrome utilis indique que la fluorescence observ e est probablement due de l autofluorescence InNMAGIC lnmed IMAGIng Center VISUALISATION DES IMAGES ACQUISES ET CONTROL DE L AFFICHAGE Sur l cran de droite diff rentes ic nes vous permettent d acc der aux diff rents modes de visualisation de vos images Un double clic sur l image d un canal ou le merge donne un affichage plein cran de ce canal Un clic droit permet de faire un snapshot saisie d cran de l image en cours jpeg A gauche Outils d annotation perm
16. I est grande moins le spectre sera bruit 4 Pour exporter les valeurs du spectre clic droit sur le graphique Export Excel un fichier csv est cr 5 V rifier si le fichier csv g n rer utilise bien un espace comme s parateur entre les valeurs de longueur d onde et l intensit de fluorescence et non une virgule en ouvrant ce fichier dans Wordpad par exemple dans ce cas faire la correction et sauver le fichier Cliquer sur Save Current Spectrum 6 La fen tre Spectrum DataBase s ouvre 2x Spectra Database IN Spectra Database A mission 11 Mito Tracker Red Propidium lodide Sytox Green Texas Red Tere Name Date 24 10 2007 11 33 26 Tu Full Name Spectrum O nm Excitation max Emission max Cube ese Dsred essai Green Synap Comment Comment Green Synap seul Julien RFP i New M 7 cf mn 15 INMAGIC lnmed IMAGIng Center Dans la liste Table of Spectra faire un clic droit puis New 7 Cliquer sur Get Data Point 8 Dans la fen tre Text Loader cliquer sur Browse 9 et chercher le fichier csv qui vient d tre enregistr Valider en cliquant sur User text shown 10 V rifier si le fichier csv utilise un espace comme s parateur et non une virgule dans Wordpad par exemple et faire la correction si n cessaire T Text Loader a Spectrum Axis m ROM 500 70 6182338731324 505 263157894
17. IEL LAS AF D marrer le logiciel en cliquant sur l ic ne LAS AF sur le bureau Assurez vous que la platine soit baiss e au maximum Lower Z Leica Application Suite Advanced Fluorescence 2 5 2 6939 eCica Sterted Server MICROSYSTEMS Check configuration machine no ZGalvo init Hardware Server Loniiquration Camera Leica DFC310 FX achine SimulatorSP5 1 V rifier la configuration machine confocal ou Camera DFC310 FX pour travailler avec la cam ra 2 D marrer le logiciel LAS AF en cliquant sur le bouton OK 3 R pondre NON au message d initialisation de la platine XY except dans le cas ou vous souhaitez enregistrer des positions de platine ou acqu rir des images mosa ques Microscope Stand Initialize Stage DM6000 Stage If yes please protect turret by limiting stage working area 3 and watch out for condenser before microscope stage is Moved to lower limit NB Si vous initialisez la platine attention a baisser compl tement la platine lower Z et a mettre l objectif 5X AVANT de r pondre au message InNMAGIC Inmed IMAGIng Center Le logiciel LAS AF se r partit en deux parties la gauche d di e aux r glages des acquisitions celle de droite d di e l affichage des images 00 h 00 mie 00 s 000 ms Frame Count 0 Mettre en marche les lasers Dans le menu Configuration Laser allumer les lasers dont vous avez
18. T2 de mani re obtenir quelques pixels bleus saturation sur la zone d int r t de l image et des pixels verts l ext rieur de votre chantillon absence de signal Ajuster les fentes spectrales de mani re optimales Appliquer un average par ligne sauf si l acquisition est en mode s quentielle et que les fentes spectrales bougent entre chaque s quence average par frame Eventuellement enregistrer les positions de d but et de fin d une s rie Z ainsi que le nombre de sections voir p 21 Lancer l acquisition avec Capture image pour une image simple ou Start pour une s rie Z Capture Image Renommer le fichier et sauver le r pertoire InNMAGIC lnmed IMAGing Center Attention a v rifier les ventuels d bordements de fluorescence d un canal dans l autre Exemple d un co marquage GFP DsRed Excitation 488 nm pour la GFP et 560 nm pour la DsRed acquisition de l image de la GFP dans le d tecteur HyB1 et de l image du DsRed dans le HyB3 ou le PMT2 si 3 couleurs Au niveau de l AOTF puissance du laser mettre 0 la raie poss dant la longueur d onde la plus grande ici 560 nm en laissant les 2 d tecteurs activ s En mode Live faire les r glages pour le marquage GFP HyB1 puissance laser minimum de fa on ce qu il n y ait pas de d bordement dans l HyB3 S il subsiste une image de la GFP dans l HyB3 diminuer la puissance du laser jusqu disparition du signal
19. a m me orientation d image entre les ceilletons et l image num rique appliquer une rotation de 90 au scan Zoom factor om 3 Zoom in BIA TI Image Size 1 55 mm 1 55 mm Pixel Sze 3 03 um 3 03 pm Section Thickness 11 075 pm Auto Gain Rotation Se 0 00 Cliquer sur l ic ne Q LUT sur la partie droite image du bureau pour visualiser l image en fausses couleurs Les points bleus repr sentent les pixels satur s niveau 255 gain les points verts l absence de signal niveau 0 offset Se d placer en Z pour trouver le plan d int r t bouton Z position du control panel ou sur le logiciel dans la fen tre Z Stack Eventuellement faire un zoom autour d une structure d int r t voir p24 et recadrer finement 3 Attention l chantillonnage spatial de votre image Ajuster le gain et l offset de mani re obtenir quelques pixels bleus saturation sur la zone d int r t de l image et des pixels verts l ext rieur de votre chantillon absence de signal 2 Appliquer un moyennage average de 2 4 Capture Image Cliquer sur Capture Image pour acqu rir l image gt Renommer le fichier dans l onglet experiments et sauvegarder le r pertoire voir p 41 InNMAGIC lnmed IMAGing Center ACQUERIR UNE SERIE EN Z plusieurs plans une seule couleur Disposer la lame sur le microscope faire la mise au point et choisir un champ
20. doit tre fix en fonction de la r solution axiale de l objectif Selon le crit re de Nyquist l intervalle doit tre inf rieur ou gal la moiti de la r solution en XZ de l objectif utilis Par exemple au 40X la r solution axiale de l objectif est de 300 nm l intervalle optimum entre 2 coupes optiques est donc de 150 nm Au dessus de cette valeur le volume est sous chantillonn en dessous il est sur chantillonn Ces informations et d autres comme la distance de travail ou louverture num rique sont disponible dans Configuration objectifs 5 Objective Configuration H Current selected objective HC PL FLUOTAR 10 0x0 30 DRY HCX PLFLUOTAR 5 0x0 15 DRY HC PLFLUOTAR 10 0x0 30 DRY HCX PL APO CS 20 0x0 70 DRY UV HCX PL APO CS 40 0x1 30 OIL UV HCX PL APO CS 63 0x1 40 OIL UV HCX PL APO CS 100 0x1 40 OIL Empty 1 0x0 00 Description Type Magnification Numerical Aperture Immersion Coverglass Resolution XY 488nm Resolution Z 488nm Free Working Distance Focus Depth Focus Offset Phase Ring IC Prisms Technique Cond Prism DIC Order Number 405 Correction Optic UV Correction Optic HCX PL APO CS 40 1 3 OIL 0 17 150 299 220 0 0 D D1 K3 K6 11506331 Lens 63x 1 4 Oil Lens 63x 1 4 Oil Dans la fen tre de r glage des param tres d acquisition l paisseur de la coupe optique est rappel e 4 de la page 24 et son calcul accessible e
21. en stacks Astuce Dans un premier temps activez toutes les raies et tous les d tecteurs dont vous avez besoin Positionner galement les fentes spectrales de chaque d tecteur puis ajoutez le nombre de s quences n cessaires D sactiver ce qui est inutile la 1 0 mais ne pas l teindre ere s quence le d tecteur et les raies laser mettre l AOTF a Passez sur la 2 s quence et d sactiver activer les lasers d tecteurs utiles la 2 sequence sans toucher aux fentes spectrales des d tecteurs De cette facon les fentes spectrales des d tecteurs sont positionn es de facon identique dans les 2 s quences L acquisition sera plus rapide puisque qu elle ne n cessitera pas de modifier la position des fentes InNMAGIC lnmed IMAGIng Center Choisir le mode d acquisition le plus appropri entre les modes suivant Between lines pour acqu rir une ligne avec une configuration puis la m me ligne avec une autre configuration avant de passer a la ligne suivante C est le mode le plus rapide Dans ce mode les fen tres spectrales de tous les d tecteurs doivent tre identiques pas de changement des fentes spectrales maxi 3 couleurs Between frames pour acqu rir un plan ou un plan d un stack avec les diff rentes configurations avant de passer au plan suivant Mode conseill pour l acquisition de s ries Z en vue d une tude de co localisation ou bien plus de 3 couleurs Between s
22. es renommer et cliquer sur l ic ne Save all Pos001_S002 22 0 MB xyz mikk Close Experiment 141011 S1 000MP IF 7 pee Export Pos002 S002 gt As Tiff As QuickTime Best Focus gt As AVI Close All Ai Attention Les donn es sont susceptibles d tre effac es sans pr avis 4 mois apres leur acquisition Pensez a les graver ou a les transf rer sur le serveur rapidement INMAGIC lnmed iIMAGIng Center Le dossier Experiment est sauvegard sous forme de fichier en format lif Pour r cup rer les donn es en format tif il faut les exporter Pour cela faire un clic droit sur le dossier exporter puis s lectionner Export As Tiff Dans la fen tre Export As Tif cocher Save Raw Data et Use Directory 1 Si la case Overlay channels est coch e seuls les overlays seront sauv s pas les images brutes de chaque canal Destination Folder D wsers 2008 juilleti26 Browse Overlay channels 1 F Use Directories IR o 3 3 FE C Cancel NB Il est fortement conseill de conserver les dossiers en lif pour pouvoir r cup rer les parametres d acquisition ult rieurement Le logiciel LAS AF Lite est disponible sur le r seau NETDATA 9 imagerie logiciels d imagerie Cette version du logiciel permet galement d exporter les fichiers en tif Image J lit ces fichiers lif en natif galement 2 Pour cr er un nouveau dossier cliquer sur l ic
23. et de s lectionner et d ajouter des lignes rectangles ellipses fl ches textes barre d chelle points pour comptage S lection des couleurs d affichage High Low N amp B couleur PMT Contraste Manuel Automatique R glage Automatique des bornes de niveau de gris Limite l chelle aux bornes de niveau de gris choisies S lection d une ROI S lection de toutes les ROI Effacer les ROI s lectionn es R initialisation de l affichage i Ajout d une barre d chelle Affichage de l histogramme des niveaux de gris Gestion de l chelle de l affichage S lection manuelle des bornes de niveau de gris pour l affichage A droite Nombre et s lection des canaux acquis Superposition des diff rents canaux Projection maximum des plans d une s rie Z Visualisation des sections XZ et YZ d une s rie Z Visualisation des diff rents plans sous forme de galerie INMAGIC lnmed iIMAGIng Center QUANTIFICATION DE SIGNAL Pour quantifier un signal de fluorescence les diff rentes conditions d exp rience doivent tre acquises avec les m mes conditions de r glage m me puissance laser m me gain et Offset pour les PMTs Si possible les conditions d acquisition doivent tre r gl es sur chantillon dont le signal de fluorescence est le plus intense De cette facon les autres chantillons n atteindront pas la Saturation Pour plus de pr cision dans la mesure de la q
24. formation on peu choisir dans la liste d roulante de faire apparaitre le spectre d mission de votre fluorochrome Un clic droit sur la bande spectrale permet d obtenir le spectre d excitation 3 S lectionner la couleur a appliquer au canal chacun des d tecteurs en glissant les bords ou par un double clic sur la bande noire Voir l annexe B3 pour le fonctionnement des fentes spectrales Astuce Si vous avez 2 couleurs utilisez 2 d tecteurs HyB et r glez la fente du PMT au minimum centr e sur la raie laser centrale InNMAGIC Inmed IMAGIng Center 5 R gler le gain et l offset par un clic sur le nom du d tecteur ou gr ce au control panel voir page suivante NB Les d tecteurs Hybrides n ont pas d offset et la plage 4 Fr ve de travail est comprise entre 10 et 500 Une utilisation standard est entre 50 et 100 Attention l usage de t l phone portable r ception et mission d grade la qualit des images acquises avec les d tecteurs Hybrides 6 R gler la taille du pinhole de mani re ce qu il soit en Airy 1 v rifiez en activant l acc s au r glage du pinhole dans la fen tre de param trage ou sur le control panel N B Le r glage du pinhole en Airy 1 lors du changement d objectif se fait de mani re automatique Par d faut unit de grandeur du pinhole est en um cliquer sur unit pour changer en unit d Airy 7 8 Il est possible d utiliser le mode bidi
25. illon et positionnez la ligne blanche pointill e sur l axe choisi Ouvrir le panneau Z stack 3 Pour acqu rir un volume cliquer sur Begin pour marquer la position de d part et End pour la fin et choisir la taille du pas en Y 4 Th Z Stack 280 681 um 742 steps en Ex mmm T a m y Position um 34 04 ea Nr af steps 742 ji QO yestap size um v Volume pm Travel Range 968 75 um amp System optimized Compensation Lancer l acquisition de la s rie avec l ic ne Start Renommer le fichier et sauvegarder le r pertoire Image de la coupe en XZ Image orthogonale du stack XZ Projection en XY du stack D 7 Galerie du stack XZ en fonction de l axe Y N oubliez pas de d sactiver les bornes du stack 1 et 2 et de remettre le nombre de coupes a 1 si vous ne voulez plus acqu rir de s rie XZ InNMAGIC lnmed IMAGing Center ECHANTILLONNAGE SPATIAL e Echantillonnage lat ral XY Pour que vos images soient bien chantillonn es la taille du pixel de l image doit tre gale a moins de la moiti de la r solution en XY de l objectif utilis crit re de Nyquist Par exemple au 63x la r solution lat rale de l objectif est de 140 nm th orique dans la pratique ajouter au moins 50 de la valeur soit 250 nm dans notre cas Une image bien echantillonn e doit donc avoir des pixels de 70 nm 120nm dans la pratique Au dessus de cette valeur l image est sous
26. itale Home Lumiere transmise Fluorescence x Contrast Method FLUO Filtercube GFP Objective 20x 0 7 Contrast Method CS Filtercube EMP 5 M Objective 5x 0 15 M Condenser BF Shutter 1 Choix des onglets Home Illumination Objectifs Platine motoris e Parametres 2 Contr le de la lumi re Intensit FIM Fluorescence Intensity Management Shutter 3 Contr le des diaphragmes Diaphragme d ouverture de champs Trajet optique TL Transmited light IL Fluorescence T INMAGIC lnmed IMAGIng Center Illumination i ATP ili iid wnt ka at THEY BN OB i mi 11 IRE ti inc GIR Fi MH Hil f iil HRT i fin EAU iilii A H a FLUO DIC 4 ul HH i Hil i il all i il Il LA li i mit GFP RED Transmission Fluorescence En transmission exemple contraste interf rentiel diff rentiel DIC avec contr le du prisme et du shutter Fonctionnel avec les objectifs 20 X et plus En Fluorescence voir annexe A choix du cube UV GFP RED RFP et rouge profond et shutter Objectifs Total Magnification on Top Camera 14 00x Otijectve Nosepiece Mode Dry Sec 5 10 20X et huile 40 63 100 X le passage d un type d immersion l autre doit tre confirm par une deuxi me pression sur l cran le bouton de l objectif choisi clignote et la platine se baisse pour ajouter de l huile Le passage vers les objectifs sec n ces
27. la raie laser d excitation et donc d optimiser la d tection L AOBS contr le jusqu 8 raies en m me temps s par es de 8 nm Transmission are oo PATATE CPP I E 450 500 550 600 650 700 750 800 Wavelength nm INMAGIC lnmed IMAGIng Center ANNEXE B3 Caract ristiques de la partie confocale d tection La lumi re d mission est d tect e par trois d tecteurs Elle passe d abord par un prisme qui va faire une ouverture spectrale Puis il y a une s lection de la bande passante par des fentes motoris es qui laissent passer une partie du spectre et refl tent ou absorbent les longueurs d onde non transmisses aux d tecteurs La g om trie du montage permet de s affranchir des filtres d mission d effectuer une analyse spectrale de la lumi re mise avec une r solution de 5 nm Par contre il n y a pas de recouvrement possible entre chaque canal on peut collecter la lumi re verte avec le canal 1 mais la lumi re bleue sera perdue par exemple Canal 3 rouge Canal 2 vert Lumi re d mission Canal 1 bleu InNMAGIC lnmed IMAGing Center ANNEXE B4 Caract ristiques de la partie confocale d tecteurs Hybride PMT Le confocal comporte un PMT classique Hamamatsu derni re g n ration canal 2 et deux d tecteurs hybrides Leica HyD Ces derniers sont beaucoup plus sensibles gr ce l utilisation de photocathodes GaAsP dont le rendement
28. m puissance maximale de 1 5 500 nm 6 mW au dessus de 600 nm par raie e Le laser blanc couvre presque l ensemble des raies laser port es par les lasers disponibles sur le march confocal Le contr le de la puissance de chaque raie laser est bas sur l utilisation d AOTF qui sont tr s rapides temps de r action de l ordre de la us et tr s s lectifs Un cristal bir fringent sp cifique a des caract ristiques de transmission spectrale qui sont affect es par des ondes radio inject es perpendiculairement au cristal Celui ci va d vier s lection et transmettre puissance la lumi re en fonction de sa longueur d onde FONCTIONNEMENT DE L AOTF Acousto Optic Tunable Filter Lumi re Raie monochromatique blanche q diffract e et polaris e Cristal bi r fringent TeO Radio fr quences INMAGIC lnmed IMAGIng Center ANNEXE B2 Caract ristiques de la partie confocale excitation d tection La s paration de la lumi re d excitation et d mission est bas e sur l utilisation d un AOBS Acousto Optic Beam Spliter en effet l utilisation de miroirs dichroiques est proscrite par l utilisation du laser blanc et des 200 longueurs d ondes d excitations potentielles Le ph nom ne physique qui s pare les longueurs d ondes est le m me que pour les AOTF La s lectivit spectrale quelques nm permet de collecter la lumi re d mission au plus pr s 5 nm de
29. n cliquant sur section thickness cette valeur ne donne pas la r solution mais bien l paisseur de la coupe optique On peut couvrir l ensemble de l chantillon avec un pas de de la coupe optique bouton 6 cependant on n est pas a la r solution maximale Ce mode d chantillonnage est ad quat pour toutes acquisitions descriptives ne n cessitant pas de mesures pr cises ou bien d crivant des objets de grande taille comme des cellules ou pour une reconstruction Neurolucida Formula of Optical Section Thickness x dz AU pm 11 075 V A n NA2 AU n V2 1 22 A NA Emission nm Refractive index n Refractive index from System Numerical aperture NA Airy units AU N h sitez pas demander conseil aux ing nieurs de la plateforme INMAGIC lnmed iIMAGIng Center ACQUERIR PLUSIEURS MARQUAGES SIMULTANNEMENT avec ou sans serie Z Disposer la lame sur le microscope faire la mise au point et choisir un champ Passer en mode Scan en lan ant une acquisition en cliquant sur le bouton Live 1 Proc der de la m me fa on que pour un simple marquage cr er ou utiliser une configuration dans laquelle les raies lasers utiles sont activ es ainsi que les d tecteurs n cessaires privil giez les HyB1 et 3 WLL Shutter j r i 7 Constant Percentage S18 87 BUONUBAUO 0 yumg f Q Standard Q Standard 2 Pour chacun des d tecteurs ajuster le gain et l offset pour le PM
30. on spectrale s affiche sur l cran de droite Deux images sont cr es l une repr sentant le marquage GFP l autre le marquage YFP voir p 39 14 Avant s paration spectrale Apr s s paration spectrale Enregistrer les images voir p 41 InNMAGIC lnmed IMAGing Center SPECTRE D EXCITATION Le SP5 X est dot d un laser blanc qui permet de s lectionner la longueur d onde d excitation au nm pres Il permet galement de g n rer des spectres d excitation S lectionner le mode XYA T7 Acquisition Mode xy Afin d acc l rer l acquisition mettre une cellule ou un l ment d int r t au centre du champ XY 512x641 400 He 15 051 15347 pm sum p y R duire la zone de scan en 512x64 en mode BH Pinto bidirectionnel Mettre un facteur de zoom le cas ch ant Faire un moyennage par 2 pour avoir un spectre un peut moins bruiter Format Speed Bidirectional X Phase m N34 correction X Zoom factor mam Au niveau de l onglet A Scan Range Properties s lectionner le d tecteur a utiliser 1 Indiquer galement 2 les valeurs de d but Begin et de fin End de A Excitation Lambda Scan Settings fs Lightsource la s rie Lambda le nombre d images spectrales No of steps ou Excitation Bagin le pas entre 2 images spectrales A Excitation SERIES Stepsize Total Excitation Range 2 No of Excitation Staps S lectionner la m thode de d tection
31. ornes du stack et ventuellement plusieurs positions dans le stack 4 Ouvrir la boite de dialogue compensation 5 Choisir le mode de compensation d tecteur PMT laser AOTF laser et d tecteur la double compensation n est pas possible en mode d acquisition s quentiel Z Compensation x Method Interpolation Points Linear Compensation by AQTF 90 092506 pm End 39 402284 um 26 603008 um Begin Remove Remove All Restore Settings D finir les bornes du stack avec les niveaux de gain et ou laser souhaiter puis faire add 6 on peut ajouter autant de paliers interm diaires voulu ce qui va changer la pente entre les points ref rences par interpolation Attention il n y a pas d affichage des valeurs m moris es Exemple sur un stack de 100 um 1 um par plan on peut choisir de rester stable sur 20 um puis augmenter de 50 a 100 le gain du d tecteur entre 20 et 70 um soit 1 en plus par pas en Z puis entre 70 et 100 um passer de 100 a 190 de gain 3 par plan et en m me temps le laser de 10 a 40 1 par pas UY _ ee all 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Plans aser ain Plate forme d imagerie de l INMED Version 01 2013 MANUEL D UTILISATION SP5 X Page 23 51 Disposer la lame sur le microscope faire la mise au point et choisir un champ 1 S lectionnez le mode d acquisition en XZY 2 En mode Live ajuster le Z de fa on tre au focus de votre chant
32. quantique est tr s performant et aussi gr ce l utilisation de diodes avalanches comme d tecteurs d lectrons galement tr s sensibles Attention Les diodes a avalanches sont affect es par la saturation et un m canisme de protection bloque automatiquement l acquisition en cours en cas de signal trop intense Les d tecteurs HyD peuvent fonctionner sous trois regimes Normal Bright R et comptage de photon voir brochure Leica pour plus de d tails Le mode Bright R induit une correction Gamma du signal qui pond re la hausse les faibles signaux et la baisse les forts signaux ce qui corrige l image vers plus de sensibilit cependant ce mode n est pas lin aire et exclue toute analyse quantitative pour n tre utilisable qu exclusivement pour des images d anatomie type reconstruction de neurones PMT GaAsP i Gallium Arsenide Phosphide D tecteurs Hybrides HyD Incident photon Incident photon GaAsP photocathode gt GaAsP photocathode Vacuum acceleration over ue 8 5 kV Amplification over cascade of dynodes gain 1 kV Electron bombardment gain Avalanche gain 0 5 kV and even to GaAsP PMTs Attention l usage de t l phone portable r ception et mission d grade la qualit des images acquises avec les d tecteurs HyB InNMAGIC lnmed IMAGIng Center ANNEXE C La formation th orique et pratique de la plate forme est obligatoire pour tre autoris a u
33. rectionnel pour acc l rer l acquisition cependant il y a un recouvrement partiel de l aller et du retour du faisceau laser les fluorophores seront excit s plus souvent et donc subiront un photo blanchiment accru Une correction de la phase en X bien que plut t stable pour ce microscope peut tre n cessaire pour synchroniser les miroirs du scanner en fonction de la vitesse de scan le zoom factor Demandez aux ing nieurs pour plus de d tails A XY 512 x 512 1400 Hz 1111 55 mm 1 55 mm 90 XY 2048 x 2048 1 400 Hz I 1 151 673 91 pm 673 91 pm Q AL Pinhole Format OT Pinhole Bidirectional X Speed Bidirectional X Phase ren 22 48 Zoomfactor jm Sy correction X 2 Zoom in zJ Image Sie 1 55 mm 1 55 mm Pixel See 303 um 3 03 pm M ection Thickness 11 07 Frame Average CE Accu iB Auto Gain Rotation ms 0 00 a Pinhole maimam 7072 um sk Airy 1 Une fois tous les param tres modifi s enregistrer votre configuration Se Cliquer sur Save dans le module Load Save single setting en indiquant votre nom pr nom dans le nom de la configuration ed CONFIGURATION DES BOUTONS DE REGLAGE control panel La fonction ainsi que la valeur associ e est affich e au dessus de chaque bouton du control panel Pour chaque bouton vous pouvez modifier sa fonction et sa sensibilit Les deux petits boutons noirs la gauche des boutons du panel servent lancer un
34. rement motoris SUR LE COTE GAUCHE 1 Changement d objectif Appuyer sur le bouton du haut pour un passage vers un grossissement sup rieur sur le bouton du bas pour un passage vers un grossissement inf rieur Le passage des objectifs secs 5 10 20 X aux objectifs immersion huile 40 60 100 X ne peux s effectuer que par l cran de contr le en fa ade voir p 18 ou par le logiciel mais pas par ces boutons y L ctive LL on T x0 1 vV HC PL FLUOTAR 10x 0 3 DRY HCX PL APO CS 20x 0 7 DRY HCX PL APO CS 40x 1 3 OIL HCX PL APO CS 63x 1 4 OIL HCX PL APO CS 100x 1 4 OIL More 2 Choix du bloc filtre de fluorescence UV gt GFP gt RED voir annexe A 3 Ouverture fermeture du diaphragme d ouverture a r gler pour chaque objectif 4 R glage de l intensit lumineuse en lumi re blanche ou en fluorescence suivant celle qui est utilis e lors du r glage 5 Ouverture fermeture du diaphragme de champ se voit r gler pour chaque objectif 6 Passage du mode r fl chi fluo au mode transmis lumi re blanche InNMAGIC Inmed IMAGIng Center SUR LE COTE DROIT lt lt lt 4 n LE 2 gt 1 Mise au point lectronique Monte descend objectif jusqu aux but es hautes focus et basses Lower Z programm es 2 Shutter Fluo 3 R glage de l orientation de l analyseur pour le DIC et l illumination polaris e EN FACADE cran de contr le dig
35. s Begin um End um T REE osii 0 osition um a eae Se Nr of steps 1 74 s E LE z step size 0 um 4 z Volume 0 um Travel Range oy System optimized 00 h 00 min 00 s 000 ms 1 Acc s aux menus principaux dont Acquire 2 Diff rents modes d acquisition XYZ XZY XYT XYA Le mode par d faut est XYZ Ic ne d activation des modes s quentiel mosa que mark amp find 3 R glage des param tres d acquisition taille de l image en pixels vitesse d acquisition en Hz facteur de zoom types de moyennage appliqu s taille du pinhole rotation du scan 4 R glages des conditions d acquisition d une s rie en Z Ic nes de lancement arr t des acquisitions 6 R glages des conditions d excitation et de d tection Si InNMAGIC Inmed IMAGIng Center CHOIX ET CREATION D UNE CONFIGURATION POUR UTILISER UNE CONFIGURATION PREETABLIE Load Save single setting 8 Il vous suffit d utiliser le menu d roulant Load Save single settings et de s lectionner une configuration dans la liste Elle contient ae des configurations usine de Leica mais aussi celles sauvees par FEE EEN les utilisateurs user settings ne pas changer ces configurations TRITC cr ez la votre et sauvez la pr nom descriptif TRITCwide UV VIS YFP User Settings CySmeryem damen DAPI Cyd DAPI DAPI mearyam DsRedmeryam FITC FITC maryam FITCyoupi POUR CREER UNE NOUVELLE CONFIGURATION EXCITATION
36. scan en mode Live droite s lectionner un PMT l cran lorsque le mode Smart Gain est actif gauche Pour modifier un bouton deux possibilit s Dans la fen tre principale cliquez sur Control Panel Dans le menu Configuration cliquer sur Ctrl Panel QP coniguratin Sy Acqua Provess ii Hardware Configuration RON Microscope Objective Laser Beam Path IPS Masks Offset PMT NDD2 Offset PMT NDD3 j 0 AT NDD4 Offset PMT Trans Panning horiz Panning vert S lectionner le bouton a modifier 1 puis choisir dans les 2 menus d roulants la fonction 2 et la sensibilit a appliquer 3 Vous pouvez enregistrer votre panel de boutons cliquez sur Save 4 et donnez un nom a votre panel Lors de votre prochaine session vous pouvez le charger en le s lectionnant dans la liste d roulante Quelques astuces Pour le r glage du gain et de l offset des d tecteurs utiliser la fonction Smart Gain et Smart Offset qui vous permettront de r gler le gain et l offset de tous les d tecteurs Pour s lectionner le d tecteur canal a modifier cliquer sur l image correspondante a l cran de l ordinateur elle doit tre entour e de pointill s blancs Pour d sactivez les boutons dont la fonction vous est inutile il existe une position vide tout en haut de la liste d roulante INMAGIC Inmed IMAGIng Center PRESENTATION DU STATIF DM6000B Le statif DM6000B est enti
37. site d enlever toute l huile par de l thanol et du papier optique sinon l image sera fortement d grad e et l objectif sali Chemin de la lumi re dans le microscope oculaires cam ra ER FT K INMAGIC inmed IMAGIng Center Platine motoris e TRA xy X FSO mm 41 82 mm Coase Fine GED OO JOYSTICK 1 D placement en Y 2 D placement en X 3 R glage de la mise au point Z Ne pas changer les r glages en Z On peut garder en m moire jusqu a 6 positions en XY ind pendamment du logiciel attention le rectangle blanc est sensible si on touche l cran la platine se d place pour centrer le point de contact 4 Choisir un num ro de position 5 Enregistrer la position 6 Passer la position s lectionn e 7 Effacer la position 4 Touches de r glage de la vitesse de d placement en XY precise lent fast rapide 5 Touches pour r glage de la vitesse du d placement en Z fine lent coarse rapide s applique galement aux visses de r glage du Z sur le statif InNMAGIC Inmed IMAGIng Center ACQUERIR UNE IMAGE un seul plan une seule couleur Disposer la lame sur le microscope faire la mise au point sur le statif ou au joystick et choisir un champ S lectionner une configuration Leica ou User dans la liste des configurations Lancer une acquisition continue preview en cliquant sur le bouton Live en bas a gauche 1 Pour avoir l
38. ste de commande PC Microscope 1 Mettre en marche la station de travail bouton vert PC Microscope le systeme d exploitation d marre automatiquement Le microscope la platine motoris e XY et l cran du PC s allume Dans la boite de dialogue Login information Pour travailler dans votre session entrer votre login et votre mot de passe d quipe Pour travailler sur la session commune utiliser le login LEICACONFOCALWS TCS User pas de mot de passe 2 Allumer le scanner bouton vert Scanner Power 3 Mettre les lasers sous tension bouton vert Laser Power 4 Allumer le banc lasers UV et Argon en tournant la clef Laser Emission sur ON 1 L allumage final des lasers se fait via le logiciel voir p 7 WInNMAGIC lnmed IMAGIng Center STARTING THE SYSTEM Turn on the fluorescent lamp and check the illumination level ai 2 Start the TCS workstation green button PC microscope The system starts automatically The microscope the motorized XY stage and the screen of the computer are switch on Enter your login and password or for general session login LEICACONFOCALWS TCS User no password 3 Turn on the scanner green button Scanner Power 4 Turn on the laser power green button Laser Power and turn the Laser Emission key on On 1 The final lasers ignition is done via the software PC Microscope Start the LAS AF software InNMAGIC inmed IMAGing Center LANCEMENT DU LOGIC
39. tacks pour acqu rir un stack entier avec une s quence puis le m me stack avec une autre s quence Proc der de la m me fa on que dans le paragraphe Acqu rir une image un seul plan une seule couleur pour faire les r glages de chaque configuration cliquer sur le num ro de la s quence avant le bouton live et prendre soin de r aliser les r glages dans le plan le plus intense si vous faites l acquisition d une s rie Z Pour passer la s quence suivante il faut stopper le scan s lectionner la nouvelle s quence puis reprendre le scan Eventuellement enregistrer les positions de d but et de fin d une s rie Z ainsi que le nombre de sections voir p 21 Lancer l acquisition en cliquant sur le bouton Start Renommer le fichier et sauvegarder le r pertoire voir p 41 Remarque Chaque s quence utilise des configurations propres donc le moyennage et la taille du pinhole peuvent tre diff rents attention l interpr tation des donn es dans ce cas utilisez le mode Between frames Par contre les param tres de scan chantillonnage vitesse orientation restent identiques d une s quence l autre L acquisition de 4 couleurs peut se faire en deux passages DAPI RFP s quence 1 et GFP Cy5 s quence 2 par exemple le tout est de bien v rifier l absence de passage entre la fluorescence de chaque canal par s quence en particulier lors de l utilisation de la diode 405 pour les fluorophores UV
40. tiliser ce microscope De m me il est n cessaire d avoir sign la charte et de r server le cr neau horaire sur le site de r servation amadeus http amadeus inmed univ mrs fr mrbs inmed week php Sources et ressources Sur le serveur Netdata 9 Imagerie SP5X vous pouvez trouvez les brochures Leica en pdf illustrant ou expliquant les sp cificit s de ce microscope on peut les trouver sur le site leica http www leica microsystems com products confocal microscopes details product leica tcs sp5 x downloads Pour finir un remerciement sp cial a Aude Jobart Malfait responsable de la plate forme d imagerie photonique de l Institut Jacques Monod http www ijm fr imagerie qui m a donn le fichier originel qui servi de trame a ce mode d emploi
41. tillon pais n cessitant de forte puissance lt 200 mW volont de photobleaching FRAP bien que ce microscope ne soit pas destin cette utilisation pas de module logiciel FRAP et enfin si le laser blanc est en panne Il doit tre mis une puissance d environ 25 C est suffisant dans la majorit des cas mais peut tre pouss au del si le signal observ s av re vraiment trop faible Ne pas travailler avec une puissance laser inf rieur a 5 ou sup rieure 80 I Lors de l extinction d cocher le logiciel et attendre l arr t du ventilateur pour teindre compl tement le banc laser voir p 4 3 Plate forme d imagerie de l INMED Version 01 2013 D INMAGIC MANUEL D UTILISATION SP5 X Page 9 51 inmed IMAGInge Center PRESENTATION DE LA PARTIE DE PARAMETRAGE DE L ACQUISITION Sy LAS AF 0 Beam Path Settings Acquisition Mode xyz TED LA ls s seq XY 512 x 512 400 Hz I 1 1 3 10 mm 3 10 mm Format BRED W Pinhole Speed 400 Hz gt B Bidirectional X Load Save single setting isible Leica Settings a RO Scan a 5 ROI Bleach Point Jase 14617 IUYM 01 YIUMS Zoom factor jte 1 mo Ad Image Size 3 10 mm 3 10 mm EOR Pixel Size 6 07 um 6 07 pm AN fine Average SEE Accu CD ax Rotation mbi 000 Ka F7 Stack Oum 1steps ORY Specimen CHD Set Plane J CON Active SA Active a Active oe EG Additional Channel
42. tton PC Microscope Turn off the scanner green button Scanner Power 10 If you have used Argon laser wait 15 minutes and turn off the air extraction green button LASER POWER 11 Turn off the fluorescence lamp SS eS SS Be InNMAGIC lnmed IMAGIng Center ANNEXE A Caract ristiques du statif Lampe cubes a fluorescence objectifs La lampe fluorescence est une lampe M tal Halide d une dur e de vie de 2000 h mais co te 10 fois plus ch re qu une HBO elle met moins de 5 minutes atteindre sa temp rature de fonctionnement et est moins sensible aux variations de temp rature on peu donc l teindre pendant un stack long ou une mosa que de plus d une heure Son spectre est plus plat que celui d une lampe Vapeur de mercure type HBO IITE Lyd TAP UT AU MINE A 250 J00 9350 00 450 S00 550 600 650 T00 750 L ribin ial Cubes UV A4 GFP L5 RED N2 1 re R solution soo SE 2 i X 0 0 0 1 R solution axiale nm UV A4 DAPI 340 380 400 450 490 GFP L5 460 500 505 512 542 RED N2 1 515 560 580 LP590 Distance de travail um 0 15 INMAGIC lnmed IMAGIng Center ANNEXE B1 Caract ristiques de la partie confocale excitation e Lasers diode UV bleu 405 nm et Argon 458 476 488 514 nm e Laser blanc 470 670 nm jusqu 8 raies simultan es s par es de 8 nm minimum pr cision par raie 1 n
43. uantification les images doivent tre acquises en 12 ou m me 16 bits Pour cela choisir dans le menu Configuration Setting Resolution Hardware Configuration To s Microscope Objective Laser Beam Path Dyes Col Panel Settings Online Maximum Projec IPS Masks R gler les conditions d acquisition Gain Offset et puissance laser et sauv la configuration Sans modifier les conditions d acquisition passer tous les chantillons Dans le cas ou un ou plusieurs chantillons saturent il faut modifier seulement la valeur de gain du PMT Les images pourront ensuite tre corrig es gr ce a la r alisation d une gamme de PMT intensit en fonction du voltage Pour plus de pr cisions sur l acquisition d images en vue d une quantification n h sitez pas contacter les ing nieurs de la plateforme INMAGIC lnmed IMAGIng Center ENREGISTREMENT DES IMAGES La fen tre de gestion des images se trouve dans l onglet Experiments situ sur l cran de gauche A chaque fois que vous effectuez une acquisition Capture image ou Start le logiciel l indique dans cette fen tre Un dossier Experiment est cr automatiquement louverture du logiciel dans lequel seront mises les images acquises Renommer le r pertoire clic droit Rename Il est conseill de cr er un r pertoire Experiment par condition ou s rie d exp rience Pour sauver toutes les autres images et s ries Z r alis es par la suite l
44. une longueur d onde plus basse que le pic d excitation quitte a ne pas exciter de fa on optimale car il y a un recouvrement du spectre d mission sur celui d excitation La proc dure de scan est expliqu e ci apres pour la GFP comme exemple SEPARATION DE DEUX FLUOROCHROMES SPECTRALEMENT PROCHES Lors de l acquisition d images avec deux fluorochromes poss dant des spectres tr s proches il est n cessaire de s parer les deux fluorochromes grace au mode de d tection spectrale du confocal A scan Le principe est d acqu rir les deux spectres de chacun des fluorochromes situ s sur des lames distinctes puis d acqu rir le spectre d une lame doublement marqu e Par traitement logiciel les deux marquages seront s par s spectralement Exemple d un double marquage GFP YFP fluorochromes dont les maxima d mission sont distants de 20 nm Sur la lame exclusivement GFP Acquisition Mode xyA S lectionnez le mode d acquisition en xyA Activer l AOTF du laser blanc et s lectionner la raie laser a 480 nm et le d tecteur HyB1 Afin d acc l rer l acquisition mettre une cellule ou un l ment d int r t au centre du champ R duire la zone de scan en 512x64 en mode bidirectionnel Mettre un facteur de zoom le cas ch ant Faire un moyennage par 2 pour avoir un spectre un peut moins bruiter Format Speed Phase correction X Zoom factor vot InNMAGIC lnmed IMAGing Center
45. voir m thodes p 27 InNMAGIC lnmed IMAGIng Center ACQUERIR PLUSIEURS POSITIONS DE PLATINE Mark amp Find N B La platine XY motoris e doit tre initialis e au lancement du logiciel pour pouvoir effectuer ce type d acquisition voir p 6 Acquisition Mode xyz Cliquer sur l ic ne Mark and Find La fen tre suivante appara t Mark amp Find Visualisation des positions enregistr es Enregistrement d une position Suppression de la position s lectionn e Suppression de toutes les positions Replacement d une position Loader des positions sauvegard es Enregistrer les positions cr es S lection et d placement vers une position CON DM 5 NN HA Same stack for all Define Asymmetry Chercher un champ d int r t se placer dans le bon plan puis cliquer sur Recommencer de la m me facon pour enregistrer toutes les positions Elles sont m moris es dans les 3 dimensions X Y et Z Le rectangle gris est un plan virtuel de la coupe quand on clique sur une coordonn e la platine r elle va bouger a cette position en prenant comme r f rence le point en haut a gauche la ou vous avez cliqu REMARQUE Pour acqu rir une s rie Z pour chaque position il y a 2 possibilit s La m me s rie Z est acquise pour toutes les positions Dans ce cas i D finir les conditions de la s rie Z Begin End et Z step size ii Enregistrer toutes les positions iii
Download Pdf Manuals
Related Search