Fiche laboratoire Séparation des hémoglobines A et S par
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1. Fiche laboratoire S paration des h moglobines A et S par lectrophor se Principes de l lectrophor se des prot ines L lectrophor se est une m thode d analyse ou de fractionnement des prot ines sous l effet d un champ lectrique Les prot ines sont d pos es sur une bande d ac tate de cellulose plongeant chaque extr mit dans un bac rempli de solution tampon Une tension continue est appliqu e 2 lectrodes plongeant chacune dans un des bacs de tampon Une prot ine migrera sur son support d autant plus rapidement que sa charge globale nette est lev e et que sa taille est r duite Les tampons utilis s ont un pH basique afin que les prot ines se chargent n gativement et migrent vers l anode couvercle deux compartiments conte nant i luian tampon Dans le cas des h moglobines A et S Les h moglobines A et S ne diff rent que part 1 acide amin de la cha ne B globine constitu e de 147 AA la diff rence de migration est si faible Le radical R des deux acides amin s est pour HbA GLU CH2 CH2 COOH et pour HbS VAL CH CH3 2 Malgr une masse molaire l g rement plus importante HbA migre plus vite que l HbS vers l anode en raison de la pr sence d une fonction COOH suppl mentaire dans l AA GLU COOH gt COO H Les lectrophor grammes obtenus peuvent tre r v l s par un colorant des prot ines tel que le rouge ponceau Dans le cas des h moglobines natur2. ellement color es en rouge cette derni re op ration n est pas indispensable Informations techniques Mat riel cuve lectrophor se g n rateur de tension micropipette 5 10 uL pinces pour la manipulation des bandes r cipients pour les diff rents bains bacs plastiques Consommables bandes d ac tate de cellulose papier absorbant embouts pour micropipette microtubes pour les solutions d Hb R actifs 100uL d HbA et d HES 2 5 mg mL dans du tampon l ctrophor se I L de tampon lectrophor se par exemple du tampon tris v ronal pH 8 6 9 2 1 L de solution de transparisation acide ac tique 5 100mL de colorant rouge ponceau 1g de rouge ponceeau dans 100 mL d acide ac tique 1 La conservation des bandes d ac tate de cellulose se fait dans du m thanol 35 Le tampon et le colorant sont r cup rables A pr parer juste avant le TP Placer 15 les bandes d lectrophor se dans un bain de tampon lectrophor se puis les s cher sur une feuille de papier absorbant Disposer les bandes d ac tate de cellulose sur leur support dans la cuve lectrophor se Les extr mit s de la bande plongent dans le tampon La face absorbante des bandes surface mate est plac e vers le haut Eviter de poser les doigts sur la bande Remplir la cuve lectrophor se de tampon Suivre les consignes du constructeur pour sa mise en service Disposer dans des r cipients
3. la taille des bandes utilis es le colorant et 4 bains d acide ac tique L activit pratique des l ves La cuve lectrophor se n tant pas aliment e d poser au moyen d une micropipette 5 10 ul de chaque solution d h moglobine c t cathode perpendiculairement l axe de la bande Couvrir la cuve lectrophor se et brancher le g n rateur r gl sur 200V voir mode d emploi de chaque g n rateur Laisser migrer 1 h D brancher le g n rateur Retirer les bandes en les manipulant au moyen d une pince R v ler les bandes par bains successifs 5 dans le colorant puis 4 fois 2 dans l acide ac tique 5 Observer les r sultats en pla ant la bande d lectrophor se sur une plaque de verre Dur e de la manipulation pr paration 20 d p ts 10 migration 60 r v lation et lecture des r sultats 15
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