HLA Typing Trays - Thermo Fisher Scientific
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1. GARDE MANIPULER COMME POUVANT TRANSMETTRE DES MALADIES INFECTIEUSES Le plasma et ou le s rum partir duquel ce produit a t d riv a t test par une m thode d analyse approuv e par la FDA et les r sultats obtenus taient n gatifs en ce qui concerne l antig ne HBs le VIH 1 et le VHC Toutefois aucune m thode de test n offre une garantie absolue que le VIH le virus de l h patite B ou d autres agents d infection sont absents Ils doivent donc tre manipul s comme tant des pr l vements de sang humain pouvant tre infectieux 2 Composants du kit 2 1 Des plaques de 72 puits contenant 1 ul puits d antis rum contenant de l azide de sodium 0 1 comme agent de conservation et du rouge de ph nol comme indicateur de pH couverts d une couche de 4 5 ul d huile min rale Conserver 55 C ou en dessous dans un CONG LATEUR N ELIMINANT PAS LE GIVRE 2 2 Compl ment de lapin 3 ml vial s Conserver 55 C ou en dessous dans un CONG LATEUR N ELIMINANT PAS LE GIVRE 2 3 Fiche de travail Certificat d analyse 3 Mat riaux r actifs et quipement non fournis 3 1 Centrifugeuse de paillasse 3 2 Microscope optique 3 3 Microscope contraste de phase ou fluorescence invers 3 4 Pipettes Pasteur de 15 et 23 cm 3 5 Seringues microtitrage de 50 ul 100 ul 250 pl 3 6 prouvettes de 12 x 75 mm et 17 x 100 mm 3 7 H mocytom tre 3 8 Lame protectrice en verre 5 x 7 5 cm2. ner une r action faussement positive 4 4 Une contamination plaquettaire peut donner lieu une action lytique incompl te des lymphocytes entra nant une r action faussement n gative 4 5 Les lymphocytes peuvent tre pr par s selon la proc dure suivante ou d autres m thodes propos es dans le manuel des proc dures de laboratoire ASHI 5 Pr paration de la suspension lymphocytaire 5 1 Pr lever 10 ml de sang complet dans un tube vacutainer contenant une solution ACD ou citrate de sodiumou de l h parine L EDTA s est trouv tre un anticoagulant non acceptable Conserver l chantillon temp rature ambiante jusqu l utilisation 5 2 Centrifuger le sang pendant 10 minutes 700 900 x g afin d obtenir une couche leuco plaquettaire 9 21 Ceci peut galement tre effectu en utilisant un agr gant tel que le dextran 5 comme suit 5 2 1 1 M langer 2 ml de dextran 5 avec 10 ml de sang total et laisser les globules rouges se d poser 37 C pendant 15 minutes 5 3 l aide d une pipette Pasteur retirer la couche leuco plaquettaire environ 2 ml avec soin et la transf rer dans un tube propre de 17 x 100 mm contenant 5 m de liquide de Hanks Bien m langer 54 Verser 4 ml de solution de gradient Ficoll Hypaque FH 22 C dans un tube propre de 17 x 100 mm Disposer avec soin la suspension de la couche leuco plaquettaire sur la solution de gradient FH 5 5 Centrifuger pendant 20 minutes
3. 3 9 Billes magn tiques Pr paration des cellules HLA de classe Ipar les Dynabeads de InvitrogenT code de produit 21902 USA 21002D Tous autres et Pr paration des cellules HLA de classe lipar les Dynabeads de InvitrogenTM code de produit 21903 USA 21003 Tous autres 3 10 Dextran 5 3 11 Solution Ficoll Hypaque 3 12 Milieu RPMI 1640 avec ajout de tampon HEPES et de Pen Strep 3 13 Liquide de Hanks 3 14 Bleu trypan 3 15 Solution d osine Y ou CFDA 3 16 Formol neutralis 12 37 pH 7 0 0 2 ou iodure de propidium dans une solution de refroidissement 3 17 S rum humain en lots PHS code de produit Invitrogen 34005100 4 Crit res pour chantillons 4 1 Une suspension lymphocytaire est pr par e partir de 10 ml de sang total pr lev dans un tube vacutainer contenant une solution ACD ou de citrate de sodium ou d h parine La concentration des cellules est ajust e 2 3 x 10 cellules ml La suspension lymphocytaire doit tre pr par e dans les 48 heures suivant le pr l vement de sang total pour obtenir une viabilit optimale La suspension doit tre conserv e temp rature ambiante jusqu utilisation 4 2 Une viabilit de plus de 80 sans contamination excessive des cellules non lymphocytaires est essentielle pour obtenir une performance optimale des s rums de typage leucocytaire 4 3 Une contamination granulocytaire ou un bruit de fond de lymphocytes non viables lev pourrait entra
4. 700 x g Suivant la centrifugation les cellules mononucl aires peuvent tre trouv es sous forme d une bande troite l interface entre le plasma diluant et la solution de gradient 5 6 Aspirer la totalit de la couche de cellules mononucl aires et la transf rer dans un tube de 17 x 100 mm Diluer avec 4 ml de liquide de Hanks 5 7 Centrifuger pendant 10 minutes 600 x g Retirer le surnageant suspendre nouveau soigneusement le s diment cellulaire ajouter 4 m de liquide de Hanks et centrifuger pendant 10 minutes 600 x g 5 8 Retirer le surnageant et suspendre nouveau le s diment cellulaire dans 1 ml de RPMI 1640 contenant du PHS 20 5 9 Examiner la suspension cellulaire sur un h mocytom tre valuer la puret et effectuer une num ration cellulaire Ajouter la concentration cellulaire 2 3 x 10 cellules ml 5 10 Effectuer un test de viabilit comme suit 5 10 1 Verser une goutte de bleu trypan et une goutte de suspension cellulaire dans un tube propre et bien m langer 5 10 2 Incuber le m lange temp rature ambiante pendant 15 minutes 5 10 3 Examiner la viabilit des cellules l aide d un hemacytom tre Les cellules viables poss dent une membrane cellulaire 6 1 6 2 6 2 1 6 2 2 6 2 3 7 7 1 7 2 intacte et apparaissent lisses Elles sont capable de rejeter le bleu de Trypan et sont de ce fait incolores Les cellules non viables ont une membrane cellulaire alt r e et n app
5. Plaques de typage HLA Mode d emploi Pour usage diagnostique in vitro 1 Introduction Les plaques de typage HLA InvitrogenTM permettent d identifier et de d finir les antig nes d histocompatibilit et sont utilis es pour le typage HLA L analyse de microlymphocytotoxicit utilise des lymphocytes comme cible Il est facile d extraire des cellules viables du sang p riph rique des ganglions lymphatiques de la rate etc Cette analyse s rologique value la mort cellulaire en activant le compl ment de lapin en pr sence de combinaisons antig nes anticorps La r action antig ne anticorpscompl ment d pendant est valu e en visualisant le test au microscope amplifi 150 x avec clairage par contraste de phase et une coloration vitale telle que l osine Y ou l iodure de propidium Les cellules mortes qui poss dent l antig ne d tect par les antis rums sp cifiques absorberont le colorant et manifesteront un changement de couleur appropri Les cellules n gatives celles o manque l antig ne d tect par les antis rums sp cifiques restent viables et excluent le colorant Les plaques de typage HLA InvitrogenTM sont utilis s dans les analyses de microlymphocytotoxicit afin de d finir les antig nes HLA Les antis rums monosp cifiques et multisp cifiques du point de vue op rationnel pour les antig nes HLA sont inclus Des t moins positifs et n gatifs sont compris dans le sachet deplaques MISE EN
6. ans le plateau de typage HLA manifestent une vaste sp cificit supertypique Ces antis rums sont d finis sur la fiche de travail Les tests HLA qui utilisent les plaques de typage HLA InvitrogenTM doivent tre effectu s en pr sence d un directeur d un superviseur technique et ou d un superviseur g n ral qualifi conform ment aux normes de laboratoires accept es Nous insistons sur le fait que ces produits sont r serv s aux professionnels Les chantillons doivent tre conserv s temp rature ambiante jusqu l emploi et EDTA ne doit pas tre utilis comme anticoagulant pour les chantillons pr lev s Tous les r sultats de typage doivent tre confirm s par une m thode de typage alternative PRO06 R vision 05 Imprim 8 08 European Representative Invitrogen Ltd 11 Bassendale Road Croft Business Park Bromborough Wirral CH62 3QL U K Tel 44 151 346 1234 CE Invitrogen Corporation 9099 North Deerbrook Trail Brown Deer Wisconsin 53223 USA Tel 800 955 6288 Fax 800 331 2286 wWww invitrogen com Produits Auto D clar s marques CE 149986 HLA C Locus Plaques de Typage
7. araissent pas lisses Elles ne sont pas capables de rejeter le bleu de Trypan et sont de ce fait color es Les suspensions de lymphocytes sont pr tes tre utilis pour un test de microlymphocytotoxicit de classe I par la m thode d exclusion de colorant S paration des cellules B et des cellules T Technique de la colonne de nylon Les lymphocytes B et T sont facilement s par s en utilisant la technique de la colonne de nylon Les cellules B et les macrophages adh rent la colonne de nylon alors que ce n est pas le cas pour les cellules T Se reporter la 4 dition du Manuel de laboratoire de ASHI section 1 1 6 S paration des lymphocytes T et B sur colonne de nylon pour la proc dure de s paration des cellules B et T Proc dure l aide de microbilles Les billes magn tiques peuvent tre obtenues aupr s de InvitrogenTM La pr paration des cellules HLA de classe Iet la pr paration des cellules HLA de classe IT InvitrogenTM ont t test es afin de pouvoir tre utilis es avec toutes les plaques d antis rum de Classes I et II Se reporter au mode d emploi du fabricant En g n ral les cellules B et T purifi es par billes magn tiques sont pr marqu es au CFDA diac tate de carboxyfluoresc ine ou au bromure d thidium Test de microlymphocytotoxicit Pr parer une suspension lymphocytaire ayant une viabilit d au moins 80 sans contamination excessive des cellules non lymphocytai
8. f essentiel au d roulement du test de Ilymphocytotoxicit et peut varier d un lot l autre Un compl ment insatisfaisant entra nera de fausses r actions n gatives ou des r actions faibles ou encore un bruit de fond lev dans le contr le n gatif L activit du compl ment d lapin peut tre d termin e en effectuant des tests avec des contr les positifs et n gatifs appropri s ainsi qu avec des lymphocytes et des antis rums connus Invitrogen Corporation recommande l usage de lot compl ment sp cifique a fourni avec la trousse La qualit des compl ments HLA ABC et DR Invitrogen M a t contr l e afin que ces derniers r pondent individuellement aux titrages minimums et la toxicit de l arri re plan voir le catalogue et ou l encart dans le paquet du compl ment Toutefois il est conseill de tester les chantillons de chaque nouveau lot de compl ment en parall le un lot existant ou connu Un compl ment de lapin appropri doit pr senter une lecture de puissance de 8 pour le contr le positif et la majorit des r actions positives Il doit y avoir une lecture de puissance de 1 pour le contr le n gatif et la majorit des puits n gatifs viter toute exposition au CO car elle pourrait entra ner des changements de pH qui risquent d tre anticompl mentaires Une r activit crois e existe dans le syst me HLA et risque d entra ner certaines fausses r actions positives Certains antis rums d
9. min Classe IT fluorescence 60 min 7 7 l aide d une seringue de 100 ul ou son quivalent ajouter 2 ul d osine Y aqueuse filtr e 5 dans chaque puits de test et incuber temp rature ambiante 22 C 3 C pendant 3 5 minutes Ne pas laisser les embouts de la seringue toucher le m lange antis rums lymphocytes Passer cette tape si une analyse base de fluoresc ine est utilis e 7 8 l aide d une seringue de 250 pl ajouter 5 ul de formol neutralis filtr chaque puits de test en prenant soin de ne pas toucher le m lange antis rums lymphocytes Passer cette tape dans les analyses base de fluoresc ine 7 8 1 Analyses base de fluoresc ine ajouter 5 ul d iodure de propidium dans une solution de refroidissement dans chaque puits de test en prenant soin de ne pas toucher le m lange antis rums lymphocytes 7 9 Placer une lame protectrice sur le plateau et laisser les plaques reposer temp rature ambiante pendant 15 minutes pour permettre aux lymphocytes de s dimenter 7 9 1 Les plaques color es l osine Y peuvent tre lues au bout d une heure ou le lendemain 7 9 2 Les plaques color es la fluoresc ine peuvent tre lues au bout de 30 minutes ou le lendemain Remarque la lecture d une plaque color e la fluoresc ine apr s 36 heures risque d entra ner plus de faux positifs 7 10 Lire le test l aide d un microscope amplifi 150 x avec clairage par contra
10. ourni pour chaque lot de plaque aideront expliquer les r actions inattendues Le s rum t moin HLA positif InvitrogenTM s rum lymphocytaire antihumain cunicole est contenu dans chaque plaque Le s rum humain en lot PHS InvitrogenTM est utilis comme s rum t moin n gatif sur chaque plaque Ce s rum a t test par des analyses microlymphocytotoxiques standard et celles ci ne pr sentent pas d anticorps lymphocytotoxiques aux cellules T et B 10 D pannage 10 1 10 1 1 10 1 2 10 1 3 10 1 4 10 1 5 10 1 6 10 2 10 2 1 10 2 2 10 2 3 10 2 4 10 2 5 10 2 6 Un bruit de fond lev ou des faux positifs peuvent tre attribu s aux causes suivantes L chantillon pr sente une faible viabilit des cellules ou quelques cellules endommag es Retirer les cellules mortes avant de les ajouter aux plaques de typage ou pr parer une autre suspension cellulaire L chantillon est contamin par des granulocytes ou d autres cellules non lymphocytaires Retirer les cellules non lymphocytaires avant de les ajouter aux plaques ou pr parer une autre suspension cellulaire Des r actifs qui contiennent des substances toxiques ou dont le pH est hors de la plage physiologique normale peuvent tre la cause de cellules endommag es V rifier que les r actifs utilis s ont t test s de fa on appropri e Le compl ment est trop fort ou a un niveau de toxicit lev Utiliser le lot de compl ment fo
11. res Retirer les plaques de typage HLA InvitrogenTM du cong lateur les d congeler et les amener temp rature ambiante pour des essais imm diats Remettre les autres plaques congel s dans un cong lateur qui produit du givre 55 C ou en dessous 7 2 1 Des sachets de plaques ouverts doivent tre utilis s imm diatement ou peuvent tre conserv s pendant un mois 55 C ou en dessous 7 3 l aide d une seringue de 50 ul ajouter 1 ul de suspension lymphocytaire environ 3 000 lymphocytes sur le dessus de chaque puits de test en prenant soin de ne pas toucher les antis rums Examiner chaque puits pour s assurer que la suspension lymphocytaire et l antis rum sont m lang s 7 4 Incuber les plaques temp rature ambiante 22 C 3 C Classe I exclusion du colorant 30 min Classe I fluorescence 30 min Classe IT fluorescence 45 min 7 5 l aide d une seringue de 250 pl ajouter 5 u1 du compl ment de lapin fourni avec les plaques dans les puits de test en prenant soin de ne pas laisser les embouts de la seringue toucher le m lange antis rums lymphocytes Remarque les plaques de typage ont t optimis es avec le compl mentfourni avec la trousse L utilisation de compl ments diff rents risque d entra ner des r actions faibles ou des faux positifs 7 6 Incuber les plaques temp rature ambiante 22 C 3 C Classe I exclusion du colorant 60 min Classe I fluorescence 50
12. ste de phase 8 R sultats 8 1 Les cellules mortes celles qui poss dent l antig ne absorbent le colorant apparaissent dilat es et fonc es et pr sentent des d tails nucl aires nets Les cellules viables celles qui n ont pas d antig ne excluent le colorant paraissent plus claires et plus petites que les cellules mortes 8 2 D autre part les cellules viables marqu es avec des pigments fluorescents sont vertes et les cellules non viables sont rouges 8 3 Apr s une correction pour le pourcentage de cellules mortes dans des puits d essai n gatifs le test est analys comme suit de cellules Score Interpr tation mortes 0 10 1 N gatif 11 20 2 N gatif douteux 21 50 4 Positif faible 51 80 6 Positif 81 100 8 Positif fort 0 Illisible 9 Normes de performance 9 1 Sp cificit et sensibilit 9 1 1 Les plaques de typage HLA Invitrogen ont fait l objet de tests approfondis par un d pistage interne et externe sur un panel lymphocytaire qualifi compos de divers groupes ethniques Les dilutions et la sp cificit de chaque s rum de typage HLA InvitrogenTM du sachet de plaques ont t d termin es par titrage l aide de dilutions en s rie pour des suspensions lymphocytaires ayant des types HLA connus Chaque s rum est utilis sa dilution optimale pour obtenir r action de 0 8 ou plus Les informations donn es dans le certificat d analyse f
13. urni avec la trousse Le temps d incubation est trop long Suivre de pr s ce mode d emploi pour les temps d incubation calcul s en fonction des techniques d isolation des cellules Une r action incompl te ou des faux positifs peuvent tre le r sultat d un transfert de cellules ou de s rum Une r action faible ou des faux n gatifs peuvent tre attribu s L chantillon est trop concentr V rifier que la concentration des cellules correspond 2 3 x 10 cellules ml L chantillon est contamin par des plaquettes Le pH des r actifs a chang suite une exposition au CO ou une contamination bact rienne Utiliser des r actifs frais et v rifier le pH avant de les utiliser Le compl ment tait trop faible ou inactiv avant d tre ajout aux plaques Utiliser le lot de compl ment fourni avec la trousse La temp rature d incubation est incorrecte Des temp ratures trop basses risquent de causer une r action plus lente alors que des temp ratures trop lev es risquent d entra ner une d gradation des composants thermolabiles S assurer que la temp rature d incubation est de 22 C 3 C Le temps d incubation est trop court Suivre de pr s ce mode d emploi pour les temps d incubation calcul s en fonction des techniques d isolation des cellules 11 Limitations et avertissements 11 1 11 2 11 3 11 4 11 5 11 6 11 8 Le compl ment de lapin est un r acti
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