Microtomie et préparation de coupes en paraffine
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1. Tissus trop trait s Bloc trop froid D coupe trop rapide M canisme de pince pas solidement verrouill Angle de d gagement doit tre adapt M canisme de pince pas solidement verrouill e chantillon tr s dur ou volumineux Mauvais traitement Angle de d gagement insuffisant D coupe trop rapide Microtome us Mauvaise technique de flottation Mauvaise fixation et ou traitement support insuffisant Bloc chaud Coupe trop fine Angle de d gagementtrop grand Eau du bain trop chaude Mauvais traitement support insuffisant Bloc chaud D coupe trop rapide Tranchant mouss Angle de d gagement trop grand Mauvaise qualit de paraffine H Compression excessive 21 28 Pr sence de bulles la base et sur les c t s du bain Mauvaise technique de flottation capturant des bulles sous la coupe Temp rature du bain trop lev e Coupe laiss e trop longtemps sur l eau Mauvaise fixation et ou traitement solvant r siduel Coupe de mauvaise qualit plis bulles Bain de flottation trop froid Utilisation d une lame non rev tue Coupe non soigneusement goutt e apr s flottation Temps de s chage insuffisant Temp rature de s chage trop basse ame sale Bain de flottation non cum ou contamin ames goutt es s ch es ou rang es dans un environnement poussi reux Fragments de cra2. Microtomie et pr paration de coupes en paraffine Scientia Leica Microsystems Education Series Living up to Life MICROSYSTEMS Introduction La pr paration de coupes de grande qualit pourl histopathologie n cessite comp tence et exp rience mais toutes deux peuvent s acqu rir La pr sente brochure s adresse aussi bien aux d butants dans le domaine de la microtomie et de la pr paration de coupes en paraffine qu aux histologistes plus exp riment s Elle recouvre les l ments essentiels pour param trer et utiliser en toute s curit un microtome rotation pour pr parer des coupes en paraffine Quelques unes des erreurs les plus courantes observ es dans les coupes y sont illustr es et des solutions sont propos es Le microtome photographi dans la pr sente brochure est un microtome manuel Leica RM2235 mais les suggestions et commentaires fournis peuvent tre appliqu s aux microtomes rotation les plus modernes Une description des caract ristiques m caniques etde s curit d autres mod les de microtome etdes consignes d utilisation figurent dans le mode d emploi de l appareil correspondant Scientia Connaissance Science Comp tence La s rie ducative Scientia de Leica Microsystems s inscrit dans notre volont d am liorer la th orie et la pratique de l histologie par l ducation la formation et le discours scientifique Auteur Contributions Geoffrey Rolls Claudia Dorenkamp Neville Farmer
3. tre actionn quelle que soit la position du volant Le cran de s ret ou le frein peut tre utilis afin d immobiliser le microtome S lection de l angle de d gagement optimal de la lame L angle de d gagement de la lame peut tre adapt et doit tre d fini pour une performance optimale Angle de facette e angle de d gagement emp che le contact entre la facette du couteau et la face du bloc e Langle de facette est l angle compris entre les deux facettes formant le tranchant Pour un usage en routine les couteaux et lames jetables sontr alis s avec un angle de facette d environ 35 mais cet angle peut varier avec le type de lame et Angle de selon le fabricant d gagement Aussi pour chaque type de lame l angle de d gagement doit tre r gl de mani re optimale Suivezles directives du fabricant de microtomes pour le param trage recommand de l angle Pour les porte couteaux et porte lames Leica on recommande un angle entre 1 et5 9 Fa Augmentation de la dur e de vie de la lame Il existe quelques strat gies simples pour augmenter la dur e de vie de chaque lame e Lors du nettoyage de la lame vitez de frotter quoi que ce soit le long du tranchant M me les fibres de cellulose peuvent endommager la lame e vitez de toucher le tranchant avec tout objet dur tel que les pinces ou le pinceau e Utilisezla lame syst matiquement en travaillant d un bout l autr
4. 9112 Fax 351 21 385 4668 Singapour T l 65 6779 7823 Fax 465 6773 0628 Espagne Barcelone T l 34 93 494 95 30 Fax 434 93 494 95 32 Su de Kista T l 46 8 625 45 45 Fax 46 8 625 45 10 Suisse Heerbrugg T l 41 71 726 34 34 Fax 41 71 726 34 44 Royaume Uni Milton Keynes T l 44 1908 246 246 Fax 44 1908 609 992 tats Unis Bannockburn lllinois T l 1 847 405 0123 Fax 41 847 405 0164 et des agences dans plus de 100 pays Seica www leica microsystems com MICROSYSTEMS LEICA and the Leica Logo are registered trademarks of Leica Microsystems IR GmbH Order no Francais 11924213 03 2010 95 9582 Rev A
5. le nettoyage Faites contr ler l appareil au moins une fois par an par un technicien qualifi e Respectez les instructions de lubrification de votre mode d emploi et utilisez les lubrifiants recommand s 19 Savoir reconna tre et corriger les erreurs courantes Voici quelques unes des erreurs les plus courantes concernant les coupes incluses en paraffine Mauvais param trage du microm tre Souffle chaud appliqu un bloc froid pour faciliter la d coupe Premi re coupe du ruban choisie D coupe trop grande vitesse Mauvais traitement Le microtome doit tre recalibr Bloc d grossi trop rapidement e Surface du bloc non polie en coupant quelques fines coupes apr s aplanissement paisseur de coupe inappropri e lors du d grossissage Bloc cassant trop trait ou trop froid lors du d grossissage B Trous dus un d grossissage grossier 24 D Dissociation Couteau endommag ou lame us e Mauvais traitement Mat riel dur tel que du calcium dans le bloc D bris dans la cire non filtr e Sels tampons pr cipit s dans les chantillons Manipulation grossi re des chantillons pendant le montage Mauvais traitement d shydratation clarification ou infiltration incompl te Traitement vigoureux pour enlever les plis lors de la flottation Flottation trop longue ou utilisant de l eau trop chaude 25 F Grosses craquelures 26
6. t lisse brillant en bas e Posezles coupes la surface de l eau par un l ger mouvement de balayage e Les coupes peuvent tre tr s facilement endommag es lors de tentative de retrait de plis ou bulles avec un pinceau ou des pinces e Examinez chaque coupe flottant la surface de l eau les imperfections pouvant tre facilement rep r es Laissezla coupe la surface de l eau juste le temps n cessaire pour l aplanir Une dilatation trop importante peut abimer la morphologie lors de coupes sensibles e Pour favoriser un drainage efficace et viter que la coupe glisse de la lame retirer les lames verticalement de l eau e Avantde placer les lames l tuve gouttez les bri vement verticalement pour retirer l exc dent d eau e cumez la surface de l eau avec un papier non pelucheux entre les blocs pour viter l ventualit d une contamination crois e e Pour viter tout risque de m lange faites flotter les coupes d un seul bloc la fois Les coupes de deux blocs diff rents ne doivent pas flotter simultan ment M me si les chantillons sont de type diff rent il y a un risque de contamination crois e et de confusion pouvant entra ner une mauvaise identification Une telle pratique devra toujours tre vit e N 16 S chage appropri des lames Un s chage appropri garantit que les coupes sont compl tement d shydrat es n ont pas subi de dommage thermique sont plates et ne se d co
7. Jan Minshew Kerrie Scott Dowell Fiona Tarbet Cannan wn _ 11 12 13 14 15 16 17 18 Fixation correcte des chantillons Traitement correct des tissus Enrobage soigneux des chantillons Emplacement appropri du microtome Respect des dispositifs de s curit S lection de l angle de d gagement optimal de la lame Augmentation de la dur e de vie de la lame Orientation appropri e des chantillons Les options de votre microtome et leur utilisation Prudence lors des op rations de d grossissage de surfa age ou d aplanissement Prise en compte des facteurs intervenant dans l paisseur oun T TIPP V rification de la temp rature froide desblocs Apprentissage de la technique de r alisation de coupes fines et r guli res de grande qualit Choix des lames et milieux de montage Flottation soigneuse des coupes S chage ad quat des lames Nettoyage et maintenance rigoureux du microtome Savoir reconna tre et corriger les erreurs courantes 2 Microtomie et pr paration de coupes en paraffine l Fixation correcte des chantillons La fixation est l tape la plus importante dans la r a
8. cran de s ret du volant est pr sent ici lorsque le couteau ou la lame esten place La garde doit aussi tre utilis e lorsque enclench avec le volant en position de midi Le cran ne s enclenchera dans cette position qu en le microtome est laiss sans surveillance hautdalacoursedetravall e Lefrein du volant bloquera le microtome quelle que soit la position de la poign e et sera utilis lors de r alignement d une face de bloc ou d adaptation du mouvement d approche Le couteau ou la lame seront retir s du microtome lorsque l appareil sera laiss sans surveillance ou lors du nettoyage de l appareil Pour cela le mieux est de d bloquer la lame utiliser ensuite l jecteur de lame sur le c t gauche de la garde etretirer la lame lat ralement du support Elle peut ensuite tre saisie l aide d une pince pas avec les doigts ou soulev e avec l aimant au bout du pinceau Leica et retir e en toute s curit Les lames usag es devront tre limin es de mani re appropri e dans un r cipient objets coupants ou dans le logement lames usag es la base du distributeur de lames Ne posez jamais un couteau ou une lame avec le tranchant orient en haut sur le plan de travail ou dans une bo te Si une lame vous chappe laissez la tomber N essayez en aucun cas de la rattraper r flexe spontan r primer Le frein du volant du Leica RM2235 est pr sent ici en position verrouill e Le frein peut
9. e Vous tirerez ainsi le maximum de chaque partie de la lame e Utilisez une partie de la lame pour d grossir et l autre pour la coupe finale ou utilisez des lames diff rentes pour chacune des deux proc dures e Un microtome r traction prolonge la dur e de vie de la lame en retirant l chantillon de la lame dans sa course ascendante et en emp chant la formation de d bris au dos de la lame Orientation appropri e des chantillons L orientation de l chantillon par rapport la lame pendant la course de travail peut affecter la facilit d obtention d un ruban et peser directement sur la qualit de la coupe Dansla plupart des laboratoires toutes les cassettes sont plac es dans la pince objet suivant la m me orientation p ex tiquette gauche pour une orientation est ouest ou tiquette en haut pour une orientation nord sud Cela permet de faciliter l aplanissement de plusieurs blocs avant de pr parer les coupes de grande qualit et d effectuer des coupes ou des reprises de coupe plus profondes sans perte excessive de tissus L orientation de l chantillon par rapport la lame doit de ce fait tre prise en compte l tape de l enrobage Cette n cessit est souvent n glig e e illustration de la page 12 pr sente l orientation recommand e pour certains chantillons types Les avis divergeront sur la meilleure orientation choisir pour certains chantillons types mais l orientation est un point im
10. ec l alignement de la face du bloc pour la d coupe e Tout exc s de paraffine en dehors de la cassette devra tre supprim avant le serrage afin de garantir que le bloc soit solidement maintenu pendant la d coupe e orientation des chantillons esttr s importante voir point 8 page 11 Exemples de cassettes pas assez gauche trop droite et correctement au centre remplies Des cassettes trop ou pas assez remplies peuvent tre la cause de probl mes durant la microtomie 5 4 Emplacement appropri du microtome L emplacement du microtome au sein du laboratoire est important e Placez le microtome sur un plan stable loin des courants d air des couloirs et des passages Tout mouvement d air provenant de climatiseurs ou autres peut rendre la manipulation de coupes tr s difficile Un plan adaptable en hauteur et une chaise ergonomique sont recommand s e lesttr s important que le personnel ne soit pas distrait pendant la manipulation du microtome en raison des risques de blessure avec les lames extr mement tranchantes Il faudra tenir compte des possibilit s d interaction avec d autres membres du personnel lors du choix de l emplacement des microtomes dans un laboratoire e lestpr f rable d avoir un sol non glissant proximit des microtomes car in vitablement des fragments de paraffine vont tomber sur le sol etle rendre glissant De nombreux laboratoires utilisent des tapis antid rapants pour rendre
11. es refroidissez nouveau le bloc et recommencez 18 Ce ruban a t d coup en utilisant une course lente et stable partir d un bloc minutieusement refroidi et bien trait Les coupes montrent une compression tr s faible m amp me avantla flottation 14 Choix des lames et milieux de montage Le choix des lames et du milieu de montage sera influenc par les m thodes de coloration appliquer par la suite Les lames doivent toujours tre d nu es de graisse et de poussi re et stock es et manipul es correctement Sila coloration comprend la recherche des antig nes IHC un pr traitement enzymatique ISH ou des tapes d incubation prolong es des lames charg es ou un milieu de montage telle que l aminoalkylsilane AAS doit tre utilis e Certains colorants sp ciaux surtout ceux employant des r actifs alcalins peuvent galement provoquer le d collage des coupes Les lames doivent toujours tre pr cis ment et convenablement tiquet es conform ment la r glementation locale 15 Flottation soigneuse des coupes La flottation devrait redonner la coupe ses dimensions originales et garantir qu elle 2 soit compl tement plate e Contr lez attentivement la temp rature La temp rature devra tre de 5 9 C au dessous du point de fusion de la cire e V rifiez que l eau est propre sans bulles ni d chets de coupe pour viter une contamination crois e e Placezles coupes c
12. giles risque d endommager la surface de l chantillon Soyez particuli rement prudent lorsque vous utilisez le dispositif de d grossissage m canique 30 um Enfin polissezla face du bloc en r alisant doucement quelques coupes fines Cela permettra d viter le probl me illustr au point 18B la page 24 La pince de l embase du porte couteau A la pince de d placement lat ral B etla pince d orientation x y C devront tre solidement verrouill es avant le d grossissage du bloc Sinon le bloc et la lame pourraient tre endommag s Le dispositif de d grossissage m canique devra tre utilis avec pr caution lors de l aplanissement surtout dans sa configuration la plus basse qui produit des avanc es de 30 pm lorsqu elle est activ e Le volant du mouvement d approche doit tre utilis avec pr caution pour viter la d coupe accidentelle de tranches paisses la surface de l chantillon ettout dommage 115 ll Prise en compte des facteurs intervenant dans l paisseur de la coupe Configurez le microtome selon l paisseur d sir e mais notez qu il existe un certain nombre de facteurs d terminant l paisseur r elle de la coupe e Une coupe homog ne de 4 um peut d livrer plus d informations qu une coupe tr s dissoci e de 2 um paisseur r elle des premi res coupes dans un ruban peut tre plus importante qu indiqu e cause de la dilatation thermique lors de la d coupe d un bl
13. l environnement plus s r 5 Respect des dispositifs de s curit Vous devez connaitre les dispositifs de s curit du microtome que vous utilisez et FL respecter certaines r gles de base lors de la d coupe J e Les couteaux et les lames jetables du microtome sont extr mement tranchantes particuli re lors de leur manipulation Les accidents surviennent lorsqu un microtomiste est distrait et n est pas pleinement concentr ka et peuvent causer de graves blessures si vous n y apportez pas d attention he e Utilisez des pinces ou un pinceau au lieu de vos doigts pour attraper des coupes ou garde de s ret rouge du env Leica RM2235 des fragments de paraffine sur la lame ou la face du bloc estrabattue en position sur cette illustration Elle R AE P recouvre enti rementle tranchant de la lame e Lesmicrotomes rotation Leica sont quip s d une garde de s ret de couteau ou de doigt un cran de s ret et un frein pour le volant pour permettre d op rer en toute s curit y e La garde de s ret peut tre plac e de mani re recouvrir la longueur totale du tranchant e Le cran de s ret du volant bloquera la t te de l objet en haut de la course de travail et doit tre utilis lors du changement de blocs e La garde doit tre en place etle cran de s ret du volant enclench lorsqu un bloc est mis en place ou retir de la pince cassette ou pour toute manipulation du bloc Le
14. lisation des techniques de pr paration des chantillons histologiques Quel que soit le soin apport au traitement et la coupe d chantillons de tissus un d tail morphologique essentiel ne pourra tre mis en vidence que si les tissus ont t fix s rapidement et correctement e Les chantillons mal fix s sont presque toujours plus difficiles couper que ceux qui sont bien fix s e Les tissus mals fix s donneront toujours une morphologie de mauvaise qualit m me s ils sont parfaitementtrait s et soigneusement coup s 2 Traitement correct des tissus Un bloc de paraffine sera difficile couper moins que l chantillon ait t trait correctement en suivant un programme appropri ell arrive que les chantillons soient sous trait s trop grands programme trop court ou sur trait s programme trop long pour la taille et nature de l chantillon Dans les deux cas il peut tre difficile voire impossible de les couper e lexiste de nombreuses techniques pouvant tre utilis es pour obtenir des coupes de blocs difficiles Silebloc est difficile couper parce que les tissus sont durs ou friables la surface expos e peut tre tremp e dans de l eau froide ou un agent adoucissanttelqu une Ce bloc de pancr as n est pas assez fix et a t trait selon un protocole bien trop court Il pr sente les effets types de sous traitement e Pour les chantillons contenant du calcium l utilisati
15. lleront pas pendant la coloration e gouttez l exc dent d eau sous la coupe avant le s chage Ceci est essentiel lorsque les lames sont s ch es plat sur une plaque chaudes e Leslames peuvent tre rang es dans des racks en position droite puis s ch es l tuve G n ralement les temp ratures ne devront pas exc der 65 C e La chaleur excessive peut faire bouillir des gouttelettes d eau sous une coupe ce qui l endommagera e S chez les coupes pendant 10 30 minutes Certains chantillons d licats donneront de bons r sultats s ils sont s ch s 37 C pendant une dur e prolong e de quelques heures toute une nuit 17 Nettoyage et maintenance rigoureux du microtome Il est important de retirer les d bris de tissus et de paraffine accumul s apr s usage Une maintenance r guli re pr ventive est essentielle e Nettoyez l appareil tous les jours Retireztoujours le couteau ou la lame avant de nettoyer e Leporte couteau peut facilement tre retir afin de faciliter l acc s au nettoyage e Les d chets de coupe seront retir s l aide d un pinceau sec e Nenettoyez pas les surfaces externes avec de l alcool ou du xyl ne car elles ne sont pas r sistantes ces solvants ettoute exposition au xyl ne est viter Les d tergents pour paraffine les nettoyants m nagers doux ou de l eau savonneuse sont recommand s e Aucun liquide ne doit p n trer l int rieur de l appareil pendant
16. oc froid comme le montrentles coupes 1 2et3 ci dessous e D autres facteurs tels que la vitesse de rotation le r glage de l angle de d gagement et l tat du tranchant peuvent influencer l paisseur r elle obtenue 12 v rification de la temp rature froide des blocs La d coupe est g n ralement am lior e lorsque l chantillon etla paraffine pr sentent une duret comparable C est la raison pour laquelle la plupart des blocs de paraffine doivent tre froids pour la r alisation des coupes La m thode effectivement utilis e pour refroidir le bloc est importante e La paraffine froide constitue un meilleur support pour les l ments durs dans un chantillon avec la cl des coupes plus fines e Placez les blocs sur une plaque froide ou une surface froide humide telle que la surface de glace fondante pendant quelques minutes e l eau p n tre l g rement dans la face du bloc faisant gonfler les tissus qui se pr tent mieux une d coupe Ceci est particuli rement important pour les tissus extr mement d shydrat s secs ou friables Mettreles blocs au cong lateur peut faire craquer la surface ce la limite des tissus avec la paraffine environnante Cela peut rendre l obtention de coupes homog nes plus difficile Les coupes gauche ont t r alis es partir d un bloc relativement chaud sans refroidissement Les coupes droite ont t effectu es partir du m me bloc apr s refroidis
17. on d un agent d calcifiant ayant provoqu un r tr cissement consid rable de l chantillon dans la paraffine environnante Les tissus taient doux et mous et impossibles plusieurs coupes Bien rincer les blocs avant de les placer dans le porte couper Ils ont n cessit un nouveau traitement chantillon du microtome et de couper nouveau car des traces de l agent d calcifiant endommageraient la plaque de pression du porte lame solution contenant un peu de d tergent d assouplissant ou de Mollifexrw appliqu aux tissus expos s pendant 10 minutes ou plus peut permettre d obtenir e Le Leica Paraffin Tape Transfer System est recommand pour obtenir des coupes partir de blocs difficiles pour lesquels la fixation le traitement ou l infiltration sont peut tre imparfaits et les m thodes de coupe normales n aboutissent pas Lorsqu il est impossible d obtenir des coupes d un bloc parce que l chantillon a t sous trait au d part il est parfois possible de le retraiter 4 3 Enrobage soigneux des chantillons L enrobage estune tape importante qui n cessite une approche d licate Un enrobage b cl peut rendre la microtomie beaucoup plus difficile e vitez de ne pas assez remplir la cassette car cela peut se traduire par un mauvais serrage du microtome et entrainer des coupes paisses puis fines et d autres probl mes e vitez de trop remplir les cassettes car cela peut interf rer av
18. portant qui doit tre pris en compte e Exemple A Intestin la lame passe travers la muqueuse en dernier e Exemple B Col de l ut rus il vaut mieux pr senter la lame des tissus pais que plats e Exemple C Peau la lame passe travers l piderme en dernier Les microtomes tels que le Leica RM2235 ont galement un dispositif d orientation pr cise avec des contr les de calibrage qui permettent de trouver facilement la position z ro ou une variable mesurable sur l axe x y Cette fonction est tr s utile lors de la reprise d une coupe de blocs pr par s dans d autres laboratoires ou avec d autres microtomes pour lesquels un alignement pr cis est n cessaire pour viter une perte inutile de tissus Pour un usage en routine lors de d coupe de plusieurs blocs il est important que le porte chantillon soit en position z ro pour les deux axes avant de commencer la d coupe Gr ce aux indicateurs rouge aux points d encoche crans et aux rep res des indicateurs c estfacilement r alisable A Intestin B Col de l ut rus C Peau 3 uc ccv t 12 Les options de votre microtome et leur utilisation Les microtomes r traction sont concus de mani re ce que l chantillon soit loign de la lame dans sa course ascendante ll est important de savoir si votre microtome pr sente cette fonctionnalit e L ar traction est une fonction qui pr sente diff rents avantages pendant la d coupe et p
19. rolonge la dur e de vie de la lame e Lors d utilisation d un microtome option de r traction l alignement de la face du bloc au tranchant doit tre effectu lorsque le bloc est en course descendante en position avant non r tract e Siunbloc estalign pr s du tranchanttandis que le bras de l chantillon est r tract lors dela prochaine r volution compl te du volant le bloc avancera de la valeur de r traction plus l paisseur de coupe s lectionn e Il en r sultera une tranche paisse qui pourrait endommager la fois l chantillon etla lame Lesmicrotomes peuvent aussi tre manuels semi motoris s ou enti rement motoris s e Les appareils motoris s r duisent les mouvements r p titifs qui peuvent favoriser des troubles musculo squelettiques 10 Prudence lors des op rations de degrossissage de surfacage ou d aplanissement Cette tape de la microtomie n cessite une grande m ticulosit car des tissus essentiels en termes de diagnostic peuvent tre facilement perdus ou la surface du bloc peut tre endommag e e Avant de commencer le d grossissage v rifiez toujours que tous les m canismes de serrage sont solidement fix s e objectif du d grossissage d un bloc est de d nuder les tissus jusqu un niveau pour lequel on pourra obtenir une coupe repr sentative e Led grossissage est g n ralement effectu des paisseurs de 10 30 pm e Led grossissage en course rapide de tissus fra
20. sement la surface de glace fondante IV 13 Apprentissage de la technique de r alisation de coupes fines et r guli res de grande qualit Rien ne saurait remplacer l exp rience mais il existe quelques tapes fondamentales qui rendront la t che plus facile e Utilisez une lame qui n a pas servi pour le d grossissage brut e Lorsque vous utilisez le mouvement d approche vitez de r aliser des coupes paisses accidentelles car cela abimera votre couteau et peut tre la face du bloc e Unnouveaurefroidissement du bloc peut tre n cessaire si la face du bloc devient chaude ou si des niveaux plus profonds sont requis e G n ralement une course lente et uniforme donne les meilleurs r sultats et une compression moindre e Nevousarr tez pas et ne repartez pas pendant la course car cela produirait des bandes de diff rentes paisseurs dans la coupe e Souffler doucement sur la face d un bloc refroidi imm diatement avant la r alisation de chaque coupe est une pratique commune dans certains laboratoires L application d un souffle chaud humide a tendance rendre les coupes plus homog nes mais g n re galement une dilatation thermique qui rend la coupe plus paisse e Des d bris coll s aux bords sup rieurs ou inf rieurs du bloc ou au dos de la lame peuvent rendre l obtention de rubans homog nes difficile et faire d coller le ruban de la lame dans la course ascendante Si des d bris sont pr sents retirez l
21. yon provenant de l tiquetage 29 R f rences 1 Leica Microsystems Instruction Manual Leica RM2235 V1 3 Nussloch Leica Microsystems 2008 Rolls GO Farmer NJ Hall JB Artifacts in Histological and Cytological Preparations Melbourne Leica Microsystems 2008 106 Rolls G 101 Steps to Better Histology Melbourne Leica Microsystems 2008 Culling CFA Allison RT Barr WT Cellular Pathology Technique 4 ed Londres Butterworths 1985 Santoianni RA Hammami A Nuclear Bubbling an Overlooked Artifact The Journal of Histotechnology 1990 13 135 136 Avec l utilisateur pour l utilisateur Leica Microsystems Active mondialement Australie North Ryde T l 61 2 8870 3500 Fax 61 2 9878 1055 Autriche Vienne T l 43 1 486 80 50 0 Fax 43 1 486 80 50 30 Belgique Groot Bijgaarden T l 32 2 790 98 50 Fax 32 2 790 98 68 Canada Richmond Hill Ontario T l 1 905 762 2000 Fax 1 905 762 8937 Danemark Ballerup T l 45 4454 0101 Fax 45 4454 0111 France Nanterre Cedex T l 33 811 000 664 Fax 33 1 56 05 23 23 Allemagne Wetzlar T l 49 64 41 29 4000 Fax 49 64 41 29 41 55 Italie Milan T l 39 02 574 861 Fax 39 02 574 03392 Japon Tokyo T l 81 3 5421 2800 Fax 81 3 5421 2896 Cor e S oul T l 82 2 514 65 43 Fax 482 2 514 65 48 Pays Bas Rijswijk T l 31 70 4132 100 Fax 31 70 4132 109 R p populaire de Chine Hong Kong T l 852 2564 6699 Fax 4852 2564 4163 Portugal Lisbonne T l 351 21 388
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