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biochemisches praktikum i - Christian-Albrechts

1. Durchf hrung I 6 Kunststoff R hrchen werden entsprechend den Angaben in der Tabelle beschickt Ansatz 1 3 4 5 6 Succinat 1 0 ml 3 0 ml Malonat 1 0 ml 1 0 ml DCPIP 1 0 ml 1 0 ml 1 0 ml KCN 0 1 ml 0 1 ml 0 1 ml Puffer 2 0 ml 4 0 ml Mitochondrie 1 0 ml 1 0 ml 1 0 ml n 2 Durch die Zugabe der Rattenleber Mitochondrien wird die Reaktion gestartet Der Inhalt der R hrchen muss gut durchmischt werden Die R hrchen werden f r 30 Minuten in einem 37 C Wasserbad inkubiert In Abst nden von 1 2 Minuten wird die nderung der Farbintensit ten in den Ans tzen abgesch tzt 122 Biochemisches Praktikum IV Aufgabe 5 Aktivierung der Pankreaslipase durch Gallens uren Grundlagen Pankreaslipasen werden in den Acinuszellen des Pankreas synthetisiert und sezerniert Diese Enzyme spalten Nahrungstriglyceride langkettiger Fetts uren Palmitin Stearin ls ure Als Reaktionsprodukte entstehen freie Fetts uren und Di bzw Monoglyceride Pankreaslipase unterscheidet sich von unspezifischen triglyceridspaltenden Esterasen dadurch dass sie zum Einem ihre Wirkung spezifisch an der Grenzfl che vom Emulsionen langkettiger Triglyceride entfaltet und zum Anderem dass sie durch Gallens uren aktiviert wird Lipasen die Triglyceride langkettiger Fetts uren spalten kommen au er im Pankreas relative Aktivit t 100 auch in einer Reihe von Organen jedoch in wesentlich geringerer Aktivit t vor Nie
2. Abbildung 2 Kurve A oder I gegen V Anstelle der Michaelis Menten Gleichung h S tritt die Gleichung a h VEN ax max nn m SI Ky S K y Der Exponent h Hill Koeffizient bestimmt das Ausma der sigmoiden Durchbiegung Bei h 1 geht die Kurve in die Hyperbel ber Die Anwesenheit des Inhibitors bewirkt eine Rechtsverschiebung der Kurve und eine verst rkte sigmoidale Durchbiegung Abbildung 2 Kurve B die Anwesenheit eines Aktivators hat den gegenteiligen Effekt 227 Biochemisches Praktikum VII A 0 ungehemmt B 2x104MCTP Reaktionsgeschwindigkeit v mol min denaturiert 0 5 10 15 20 25 30 Aspartatkonzentration S mol Abbildung 2 Substratabh ngigkeit der Aspartat Transcarbamylase Reaktion A ungehemmt B in Gegenwart von 2x 10 M CTP C nach Denaturierung der regulatorischen Uhntereinheit durch W rme Reaktion in Ab V V bzw Anwesenheit V V von CTP Enzyme mit derartiger sigmoidaler Kinetik sind Oligomere d h aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzt die entweder identisch oder unterschiedlich sein k nnen Im letzteren Fall ist der Substratbindungsort und das aktive Zentrum auf der katalytischen Untereinheit lokalisiert Der Bindungsort f r den Effektor befindet sich hingegen auf der regulatorischen Untereinheit siehe auch Aufbau und Bindungsstellen der Aspartat Transcarbamylase Abbildung 1 Die sigmoiden Kurven in Abbildung 2 beruhen auf dem kooperativen Effe
3. Alle Angaben in 30 60 90 120 180 mg 100 ml N chternwert Minutenwert Minutenwert Minutenwert Normalbereich lt 100 160 120 100 Grenzbereich 100 130 160 220 120 150 100 130 Patholog Bereich gt 130 220 150 130 Tabelle 1 Blutglucose im Serum nach Belastung mit 75 g Glucose oral bergewichtiger Altersdiabetiker Normalperson mg dl vuU m l mg dl uU ml 8 300 5 300 200 100 100 Glucose Konzentration im Serum Glucose Konzentration im Ser 0 30 60 90 120 150 0 30 60 90 120 150 Zeit min Zeit min Abb 5 Zeitliche nderung der Konzentration von Glucose und Insulin im Glucose Toleranz Test beim Diabetes mellitus Typ 2 im Vergleich zum Gesunden 114 Biochemisches Praktikum IV Aufgabe 1 Chemische und enzymatische Hydrolyse von St rke Polysaccharide k nnen durch saure Hydrolyse oder durch Hydrolasen gespalten werden Ben tigte L sungen St rkel sung 1 g St rke ad 100 ml Aqua bidest Kupfersulfat L sung 4 g CuSO ad 100 ml Aqua bidest Natronlauge 10 g NaOH ad 100 ml Aqua bidest verd nnte HCI 2 M HCI Jod L sung 10 mg Jod nach Lugol in 10 ml einer 12 mM Kaliumjodid L sung gel st Speichel Praktikantenspucke Durchf hrung Achtung Glasr hrchen verwenden Versuch a S urehydrolyse der St rke 1 1 ml der St rkel sung wird in einem Reagenzglas mit 2 ml der verd nnten Salzs ure vermischt und 2 Minuten ber dem Bunsenbrenner
4. Biochemisches Praktikum VIII Offene Wunde gr ndlich aussp len oder unter Aufsicht ausbluten lassen Desinfektion mit Wunddesinfektionsmittel Bei Spritzer ins Auge mit der Augendusche intensiv sp len 10 min Augenarzt aufsuchen Verletzungen sind dem Projektleiter und dem BBS unverz glich zu melden und in das Verbandbuch einzutragen Bei intensivem Kontakt z B Verschlucken Inkorporation durch Verletzungen Arzt aufsuchen Ggf Notarzt Ersthelfer und Betriebsarzt benachrichtigen Abf lle die gentechnisch ver nderte Organismen enthalten sind zu kennzeichnen GVO und vor Verlassen der Gen Anlage vorzugsweise zu autoklavieren andernfalls mit Desinfektionsmitteln zu inaktivieren Autoklav im Altbau Biochemie 1 Etage Raum 111 316 Veranstaltungsordnung zum Biochemischem Praktikum ab SS2012 Praktikumsordnung 1 Die durch das Studentensekretariat vorgenommene Gruppeneinteilung gilt ebenfalls f r die Biochemie und ist f r alle Semester verbindlich Bitte entnehmen Sie die Praktikumstage den ausgeh ngten Pl nen Vers umte Praktika k nnen grunds tzlich nur bei Vorlage eines rztlichen Attestes nach Entscheidung des Praktikumsleiters nachgeholt werden Tauschen zwischen Gruppen ist grunds tzlich nicht m glich 2 Jede r Student in erh lt an seinem ihrem ersten Seminartermin einen Laufzettel f r die Praktika und die dazugeh rigen Seminare Der Laufzettel verbleibt in der Hand des Studenten Die erfolgreic
5. ber die Gefahreigenschaften und somit ein Hilfsmittel f r den sicheren Umgang mit Gefahrstoffen Sie muss bei handels blichen Produkten folgende Informationen beinhalten 2 1 Bezeichnung des Stoffes Name Synonyme und ggf Konzentrationsangaben 2 2 Name des Herstellers Beim Hersteller k nnen jederzeit Sicherheitsdatenbl tter oder andere Stoffinformationen angefordert werden 2 3 R und S S tze R S tze sind Gefahrenhinweise Risk S S tze sind Sicherheitsratschl ge Safe Bei Ber cksichtigung dieser Hinweise und Ratschl ge auf den Etiketten k nnen bereits grundlegende Ma nahmen zur Verhinderung von Gesundheitsgefahren ergriffen werden s a Punkt 7 2 4 Gefahrensymbole Schwarze Schrift auf orangem Grund 292 Anhang Die gef hrliche Eigenschaft einer Substanz kann durch folgende Gefahrensymbole gekennzeichnet werden Sehr giftig Sehr giftig sind Stoffe die bereits in sehr geringen Mengen bei Einatmen Verschlucken oder Ber hren mit der Haut schwere Gesundheitssch den hervorrufen oder zum Tode f hren k nnen z B Cyanide Quecksilbersalze Vorsicht Jeglicher Kontakt mit dem menschlichen K rper ist zu vermeiden Bei Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen Giftig Giftig sind Stoffe die bei Einatmen Verschlucken oder Ber hrung mit der Haut ernste Gesundheitssch den hervorrufen oder zum Tode f hren k nnen 293 Anhang z B Formaldehyd Phenol Benzol Vorsicht Jegl
6. e Trennung von Nukleins uren nach Molek lgr e und Struktur e Schmelzen und Re Assoziation von DNA e Photometrie e Elektrophorese Agarosegel e Restriktionsverdau von DNA e Amplifikation von DNA mit Hilfe der Polymerase Kettenrreaktion e Transformation von Bakterien 19 Biochemisches Praktikum Il Einleitung Nukleins uren Grunds tzlich unterscheidet man zwei Klassen von Nukleins uren Desoxyribonukleins ure DNA und Ribonukleins ure RNA Beides sind Nukleotid Polymere die als RNA Ribose oder als DNA Desoxyribose Reste enthalten diese sind durch 3 5 Phosophodiesterbindungen verkn pft Raumstruktur von Nukleins uren Die biologische Funktion der Nukleins uren beruht weitgehend auf ihrer F higkeit durch paarweise Zusammenlagerung ihrer Basen Sekund r und Terti r Strukturen zu bilden Hierbei bilden sich zwischen den Basen G und drei Wasserstoffbr cken H Br cken aus zwischen A und T bzw A und U zwei H Br cken Die Bindung G C ist etwas fester als die Bindung A T A U W hrend RNA durch derartige Basenpaarung z T komplizierte individuelle Konformationen analog den Proteinen bildet bekannt besonders von der transfer RNA liegt native DNA fast ausschlie lich als regul re hochmolekulare Doppelhelix aus zwei antiparallel angeordneten DNA Str ngen vor deren Basensequenzen einander komplement r sind Die physikalisch chemischen Eigenschaften von DNA in w sserige
7. 1 Mol Cu pro Mol Enzym mit sehr hoher Substratspezifit t Hemm stoffe sind Cyanid und 2 6 8 tri substituierte Purine Die drei Oxopurine besitzen unterschiedliche Absorptionsspektren im fernen UV Be reich Fig 4 zeigt die Spektren von Xanthin und Harns ure Die Extinktion einer Xanthinl sung bei 293 nm steigt durch Oxidation in Gegenwart von XOD an ver schwindet dagegen bei Abbau der Harns ure durch Uricase Daher k nnen beide Reaktionen durch optische Tests in der K vette verfolgt werden 188 Biochemisches Praktikum VI Adenosin Guanosin Inosin Guanin O l H O H O O O N N IR gt HN 5 O H O Q XOD a N N O N H O Alloxanthin 2 H O O CO H O O H NH XN a N N a Allantoin Abbildung 4 Uratbildung aus Hypoxanthin Allopurinolwirkung Uratabbau S ugerleber bei Primaten fehlt Reaktion Ill Ausstehende L sungen 1 4 10 M Xanthinl sung in 0 06 M Glycylglycinpuffer pH 8 2 8 104 M Allopurinoll sung Xanthinoxidase L sung in 0 2 M Natriumphosphatpuffer pH 7 4 RD Uricase L sung 189 Biochemisches Praktikum VI Ausf hrung a 3 ml Xanthinl sung 1 in K vette geben b Extinktionswert bei 293 nm mit Verst rkungsregelung auf E O einstellen c 20 ul XOD L sung 3 in K vette pipettieren Im gleichen Moment Stoppuhr starten und K vetteninhalt mit Plastikspatel kurz aber gr ndlich mischen d Nach 30 s und anschlie end jede halbe Minute bis zur 4 Minute die E
8. Die Bestimmung der LDH Isoenzyme im Serum ist daher zu einer wertvollen Hilfe f r die Diagnose und die Verlaufskontrolle dieser Krankheiten geworden Die im Serum messbare LDH Aktivit t stellt eine Summe der aus verschiedenen Organen stammenden Isoenzyme dar Man kann daher aus einer einfachen Aktivit tsbestimmung nicht unbedingt R ckschl sse auf die Organherkunft der Enzyme ziehen Da aber das Verh ltnis der einzelnen Isoenzyme von Organ zu Organ verschieden ist spiegelt sich die Sch digung eines bestimmten Gewebes auch als typisches Isoenzym Muster im Serum wieder Im klinischen Labor wird h ufig auf die aufwendige Elektrophorese der LDH Isoenzyme verzichtet Man nutzt die Tatsache dass ein Substratanaloges des Lactats das a Hydroxybutyrat von LDH 1 und etwas geringer von LDH 2 besser umgesetzt wird als von LDH 5 Je kleiner der Quotient Lactat Dehydrogenase Aktivit t a Hydroxybutyrat Dehydrogenase Aktivit t LDH HBDH Quotient desto gr er ist der Anteil der aus dem Herzmuskel stammenden Ilsoenzyme 105 Biochemisches Praktikum IV LDH Isoenzym Elektrophorese Myokardinfarkt 0 Lungeninfarkt O Pernizi se oder h molytische An mie Normalserum 6 RUN SS Nierenerkrankung O Ko RUN NR SR SR Lebererkrankung 0 w D N ONA Maligne Neoplasten und Schock mit Nekrose wichtiger Organe oO O Ba I 5 VVTI
9. Fe lll CN Hb lll Fe ll CN cn CN Hb III Achtung VORSICHT BEIM UMGANG MIT DER TRANSFORMATIONS L SUNG KCN NICHT S UREN UND KCN ZUSAMMEN IN DEN AUSGUSS GEBEN KCN IM GEKENNZEICHNETEN ABZUG SAMMELN DISPENSER BENUTZEN KEINE PIPETTE 153 Biochemisches Praktikum V Experimentelle Ausf hrung Reagenz Transformationsl sung enth lt 0 025 KzFe CN s 0 025 KCN Ger te Eppendorf Photometer 546 nm 5 ml Vollpipette 3 graduierte R hrchen Ausf hrung In 3 graduierte R hrchen pipettieren Doppelbestimmung Leerwert 2 Messans tze 200 ul H molysat 5 ml Transformationsl sung Dispenser 1 Leerwert 200 ul H2O 5 ml Transformationsl sung Dispenser Nach 5 Minuten Inkubation wird die Extinktion der Messans tze gegen Leerwert bei 546 nm im Eppendorf Photometer bestimmt 154 Biochemisches Praktikum V Aufgabe 2 Nachweis von H moglobin mit ABTS 2 2 Azino di 3 thylbenzthiazolinsulfonat 6 Prinzip Peroxidasen katalysieren die Reaktion D f r Donator DH2 H2O2 gt D 2H 0 Katalasen verwenden H20 als H Donator H202 H202 O2 2H20 Bei genetisch bedingtem Fehlen von Katalase resultieren keine St rungen Das giftige von vielen Oxidoreduktasen insbes Flavoproteinen erzeugte H2O kann durch die Peroxidasen beseitigt werden Katalase und Peroxidasen sind eisenhaltige Proteine die intrazellul r in den Peroxisomen gelagert werden H moglobin besitzt
10. Kallikrein inhibitor Hereditary angodeme Dyax P pastoris Includes apgrowad products and Ihase in clinical development Sources G Walsh 2003 or personal communication Biochemisches Praktikum Proteine Sequenzen Prim rstrukturen Aminos uresequenzen finden sie am Besten in der bereits oben beschriebenen Datenbank http www ncbi nlm nih gov entrez query fegi CMD search amp DB protein Neben der Prim rstruktur erhalten sie dort allerdings noch viele andere Informationen ber das Protein z B ob es potentielle Glykosylierungstellen besitzt aus wie vielen und welchen Dom nen es besteht wer es zuerst beschrieben hat und vieles mehr Sekund rstrukturvorhersage Aus der Prim rstruktur l sst sich die Sekund rstruktur eines Proteins vorhersagen Diese Vorhersage beruht auf empirischen Daten Hierbei wurden die H ufigkeiten einer Aminos ure bestimmt mit der sie in bekannten Terti rstrukturen innerhalb eines Sekund rstrukturelementes vorkommt Die unten stehende Tabelle zeigt eine ganze Reihe solcher Verfahren Ans tze zur Sekund rstrukturvorhersage 54 Statistische Analyse 1988 Quian 62 Einschichtiges Feedforward Netz Sejnowski 1993 Rost PHD gt 72 Kombination von zwei Feedforward Netzen o 1996 Riis Krogh 72 Netzwerk Ensembles f r B und coils 1999 Baldi BRNN 73 Kombination von r ckgekoppelten Netzen 1999 Jones PSIRED 77 Besonderes Sequenzalignme
11. O 10 ul PCR Puffer 10 ul ANTP Mix 10 ul Primer Mix In den einen Ansatz werden dann 10ul pRSET 5d hu IL 6 und in den anderen 10 ul pRSET 5d Plasmid L sung gegeben 10 ul Taq Polymerase Verd nnung 0 25U uUI Nun erfolgt die Durchf hrung der PCR Reaktion im Thermocycler nach folgendem Temperaturprogramm Assistent 94 C 5min 94 C 30 sec 60 C 30 sec 72 C 30 sec x20 72 C 5 min 10 C Nach Ablauf der Reaktion erfolgt die Analyse der PCR Produkte durch eine Agarosegel Elektrophorese In beide Reaktionsgef e werden jeweils 10 ul Auftragspuffer Xylencyanol 0 25 Bromphenolblau 0 25 Ficoll 400 20 in Aqua bidest pipettiert durch auf und abpipettieren gemischt kurz zentrifugiert 30 sec 14 000 rpm rounds per minute damit sich die gesamte L sung am Boden des Reaktionsgef es befindet Die Probe ist nun fertig und kann auf das Agarosegel aufgetragen werden zusammen mit den Proben aus Versuch Nr 4 Elektrophorese Sowohl Proteine als auch Nukleins uren k nnen durch Wanderung im elektrischen Feld Elektrophorese charakterisiert werden Gemische verschiedener Proteine bzw Nukleins uren unterschiedlicher L nge und oder Struktur k nnen elektrophoretisch voneinander getrennt werden 36 Biochemisches Praktikum Il Die Agarosegelelektrophorese ist eine der wichtigsten Methoden zur Gr enbestimmung von DNA Fragmenten Bei dieser Technik werden die DNA Fragmente auf ein horizontal
12. Vorbereitung der Proben f r die Polyacrylamid Gelelektrophorese Die Proben werden im Verh ltnis 1 1 in 2x L mmli Puffer aufgenommen und anschlie end 5 Minuten bei 95 C inkubiert Bis zur Gelelektrophorese siehe 5 4 werden die Proben auf dem Labortisch aufbewahrt Analyse der Fragmente mittels Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid gelelektrophorese SDS PAGE Die Natriumdodecylsulfat Polyacrylamidgelelektrophorese ist die am h ufigsten angewendete elektrophoretische Methode zur qualitativen Analyse von Proteinen Aufgrund der Tatsache dass vor der Elektrophorese die Proteine in einer Probe denaturiert und mit dem anionischen Detergenz Natriumdodecylsulfat ges ttigt werden erfolgt die Auftrennung im elektrischen Feld in der Polyacrylamidmatrix aufgrund ihrer Gr e Die im Gel getrennten Proteine k nnen durch verschiedene F rbemethoden visualisiert werden Die Gele werden gestellt und die Analyse der Gele erfolgt durch einen Assistenten 74 Biochemisches Praktikum Ill kDa Protein 0 1 0 2mg ml Source 116 0 B galactosidase Ecol 2 562 Bovine serum albumin bovine pisma 3 450 Ovalbumin chicken egg white 4 350 Lactate dehydrogenase porcine muscle 5 50 REase Bsp98l E coli 6 18 4 B lactoglobulin bovine milk 7 144 Lysozyme chicken egg white 8 amp 12 Tris glycine SDS PAGE Staining with PageBlue Protein Staining Solution R0571 L sungen Lysis Puffer 50 mM Tris HCI pH 7
13. die in Hefen produziert werden Biochemisches Praktikum I Commercial name Recombinant proteln Company Expression system Actrapid Iraulin Konehlordisk 5 caravisias Amibirix Hapetitis 8 surface antigen GlaxsSmithKline 5 caravisias Elitex Urate PEAR Sanoi i Synthelsha oO caravisiaa a nonea Sowab HEVAXPRO Hepatitis B suface antigen Aventis Pharma S cerevisiae Hexavac Hepatitis B surface antigen Aventis Pasteur 3 Cena Infanrix Penta Hepatitis B surface antigen GlawSmlthK line 5 Cererlalne B Leukine _ Gtanuioeyle rserophagecolom Berlex 8 cerevisiae fe simulating factor Navalag Insulin Novo Nordisk 8 cerevisiae Padiarix Hepatitis B surface antigen Gasos kline T Cerevisiae Frocomvax Hepatit is B surface antigen Avenlis Pasteur a ceraviaide Retuldan Hirudin lepirudim Hoecht 3 cerevisiae Regranee rh Piatelet derved growth factor Ortho McNeil Phama 5 carevisiar t US Janssen Cilag EU Ravase Hirudiruidesirudin Svenils F S carerisiae Twinrix Hepatitis B surface antigen GlaxoSmithkline 5 cerevisiag Angiestalin Antiangiogenic factor EntreMed F pastoris Endostatin Antiangiegenic factor EntreMed F pastoris Epidermal growth Diabetas O Transition Therapeuties P pasoris fastor analog um ah DE Er EN Insulin Eke growth Insulin ilke growth tactoe 1 Cenhal n pastoris facbor deficlen cy Human sarum Stabilizing blood valum ir Mitsubishi Pharma F pastoris albumin bums sh ock formerly Weitide l
14. dieser Molek le abh ngig Wird ein einfallender Lichtstrahl der Intensit t Io durch eine L sung der Konzentration c4 bis auf Ip Io 2 abgeschw cht so wird er durch die Konzentration 21 Biochemisches Praktikum Il I c 2 c auf 1 0 5 0 5 L ar und durch c 3 c auf I 0 5 0 5 0 5 I reduziert Mit linear ansteigender Konzentration der L sung f llt also die Intensit t Io des austretenden Lichtstrahls exponentiell ab I I e bzw T Ty e I BEERsches Gesetz Dabei ist T die Transmission oder Lichtdurchl ssigkeit sie wird in Prozent ausgedr ckt mit Io 100 und c die Konzentration des Stoffes in der L sung in mol l Zur Vereinfachung verwendet man als Messgr e die der Konzentration proportionale Extinktion E engl auch absorbance A oder optical density OD und dekadische Logarithmen E IgT 18 2 Au er von der Konzentration ist die Extinktion auch von der Schichtdicke d linear abh ngig LAMBERTsches Gesetz Das zusammengefasste LAMBERT BEERsche Gesetz lautet damit E d c bzw E e c d Dabei ist e der molare dekadische Extinktionskoeffizient Extinktion einer molaren L sung des Stoffes bei einer Schichtdicke 1 cm Er ist abh ngig von der chemischen Natur des Stoffes Stoffkonstante von der Wellenl nge der Strahlung der Temperatur dem pH und dem L sungsmittelsystem Welche Dimension hat e Voraussetzung f r die Anwendung eines photometrischen Verfahrens ist dass der zu bestimm
15. f r metabolische Prozesse ben tigt sondern in Harnstoff umgewandelt Es werden etwa 16g Harnstoff t glich von Erwachsenen gebildet Die Harnstoffelimination erfolgt berwiegend renal durch glomul re Filtration Im wesentlichen wird der Harnstoffwert durch die renale Perfusion und Filtration und die Harnstoffbildungsrate z B abh ngig von der t glichen Eiwei zufuhr bestimmt 185 Biochemisches Praktikum VI Indikation e Differenzierung der pr renalen von der postrenalen Azot mie erh hter Harnstoffwert anhand des Harnstoff Creatinin Quotienten e Beiterminaler Niereninsuffizienz e Bei Dialysepatienten da die Harnstoffkonzentration representativ f r den Proteineinabbau ist und einen Hinweis auf den metabolischen Status gibt Prinzip Harnstoff wird in einer durch Urease katalysierten enzymatischen Reaktion in Am moniak und Kohlendioxid gespalten die im w ssrigen Milieu zu Ammoniumcarbonat reagieren Harnstoff 2 H2O a amp e_ 2 NH4 CO2 Die Ammoniumionen reagieren mit Salicylat und Hypochlorid unter Bildung eines roten Farbstoffs dessen Farbintensit t der Harnstoffkonzentration proportional ist Da die Reaktion empfindlich gegen ber Ammoniumsalzen ist stets mit sauberen Glasger ten arbeiten L sungen 1 Harn 1 100 verd nnen mit Aqua dest 2 F rbereagenz 3 Standard Harnstoff 8 3 mmol l 186 Biochemisches Praktikum VI Ausf hrung Auf den Boden von 3 Reagenzgl sern in folg
16. nnt wurde Diskussion der Ergebnisse Aufgabe 5 a Geben Sie bitte die beiden Gerinnungszeiten an und diskutieren Sie den Unterschied b Bestimmen Sie wie bei a die Gerinnungszeiten und diskutieren Sie die Unterschiede 171 Biochemisches Praktikum V 172 Biochemisches Praktikum VI BIOCHEMISCHES PRAKTIUM VI Leber und Leberstoffwechsel Aminos uren Nukleotide H moglobin Cholesterin Lipoproteine Serum Enzymdiagnostik Aufgabe 1 Aufgabe 2 Aufgabe 3 Aufgabe 4 Aufgabe 5 Aufgabe 6 Bestimmung der Aktivit t der Alanin Amino Transferase ALT im Serum Bestimmung der Harnstoffkonzentration im Harn mit Urease Aktivit tsbestimmung von Xanthinoxidase und Uricase Allopurinolwirkung Bestimmung des Gesamt Bilirubins und des konjugierten direkten Bilirubins im Serum mit der Diazoreaktion nach Jendrassik Gr f Bestimmung des Gesamtcholesterins des HDL Cholesterins und des LDL Cholesterins im Serum Nachweis von Harnindikan Christian Albrechts Universit t zu Kiel Biochemisches Institut In der Medizinischen Fakult t Olshausenstrasse 40 24098 Kiel 173 Biochemisches Praktikum VI Stichworte e Transaminierung Desaminierung Stoffwechsel der Aminos uren e _Enzymreaktion der Alanin Amino Transferase ALT e Funktion von Pyridoxal P e Harnstoffbildung Urease e Abbau des Blutfarbstoffes Ikterus e Abbau der Purinbasen Gicht e Abbau und Transport von Choleste
17. so dass sie auch im Aminos ure und Proteinstoffwechsel eine wichtige Rolle spielt Neben diesen metabolischen Funktionen ist die Leber ein wichtiges Speicherorgan vor allem f r Vitamine und Spurenelemente Dies trifft vor allem f r fettl sliche Vitamine sowie f r Fols ure und Vitamin B412 zu Eng mit der Funktion der Leber als Ausscheidungsorgan verbunden ist ihre F higkeit im Organismus selbst hergestellte bzw von au en aufgenommene Stoffe durch die Biotransformationsreaktion soweit zu modifizieren dass sie an Glucurons ure Schwefels ure oder Aminos uren gekoppelt und dann ber spezifische Transportsysteme in die Galle abgegeben werden k nnen Die Galle enth lt dar ber hinaus die Gallens uren als Endprodukte des Cholesterinabbaus die eine 175 Biochemisches Praktikum VI essentielle Funktion bei der Verdauung und Resorption in Lipiden im Intestinaltrakt haben Besondere Bedeutung unter den Nicht Parenchymzellen der Leber haben die Sternzellen oder Ito Zellen Diese sind imstande spezifisch Vitamin A und Carotinoide zu speichern sie synthetisieren au erdem den gr ten Teil der Bestandteile der extrazellul ren Matrix der Leber Hierzu geh ren die Kollagene Ill IV und VI sowie verschiedene Proteoglykane Laminin und Fibronectin Chronische Sch digungen der Leber f hren wahrscheinlich unter Vermittlung spezifischer Zytokine zu einer Umwandlung der Sternzellen in myoepitheliale Zellen deren Kapazit t
18. und liest die Extinktion in 1 min Abst nden 5 Werte bei 366 nm ab 4 Aus den Messwerten wird die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion durch graphische Darstellung ermittelt Das eingesetzte Serum ist mit physiologischer Kochsalzl sung zu verd nnen wenn A E min gt 0 080 wird Bemerkungen 183 Biochemisches Praktikum VI hnliche Systeme werden zur Bestimmung der Aspartat Amino Transferase AST synonym GOT der Aldolase und der Pyruvat Kinase verwendet Je nach Gestaltung der Versuchsanordnung k nnen auch Alanin und a Ketoglutarat mit diesem Test bestimmt werden 184 Biochemisches Praktikum VI Aufgabe 2 Bestimmung der Harnstoffkonzentration im Harn mit Urease Harnstoff ist das Endprodukt des Eiwei und Aminos urestoffwechsels und wird in der Leber gebildet Beim Eiwei abbau werden die Proteine in Aminos uren zerlegt und desaminiert Der dabei anfallende Ammoniak wird in den Mitochrondrien ber den Harnstoffzyklus in Harnstoff umgewandelt e Mh H 8 0 he 1 NH ozo H h H20 H iik H N C NH H Urea Fumarate PE GRT PER i gt Arginase rgininosuccinase 07 Mi o L Arginine NH 6 0 NH ao gh NH CH Urea CH 60 Cycle u CH O H G NH lo HH Omithine Aut ranscarbamoylas Mitochondria L Aspartate Abbildung 3 Schematische Darstellung wichtiger Reaktionen im Harnstoffzyklus Im Mittel enth lt das Nahrungsprotein 16 Stickstoff Von diesem werden 90 nicht
19. 0 i 2 2 7 1 0 mol l 259 Biochemisches Praktikum VII E546 C Theophyiin X104mol Geben Sie die halbmaximale Hemmkonzentration an Erkl ren Sie anhand dieses Versuchs die anregende Wirkung von Kaffee und Tee 260 Aufgabe 3 Biochemisches Praktikum VII Induziert 20 30 40 50 60 Extinktion Bakterien Bakterien dichte Extinktion _ Galakto sidase nicht induziert 20 30 40 50 60 Extinktion Bakterien Bakterien dichte Extinktion _ Galakto sidase Bestimmen Sie die zeitliche Abh ngigkeit des Bakterienwachstums und der Aktivit t der Galaktosidase nach den entsprechenden Induktionszeiten a Die aus der optischen Dichte bei 578 nm ermittelte Bakterienzahl wird f r beide Reihen N und I in einem gemeinsamen Diagramm gegen die Zeit aufgetragen Die Extinktion des durch die B Galaktosidase freigesetzten p Nitrophenols als Ma f r die Enzymaktivit t wird f r beide Reihen N und I in einem gemeinsamen Diagramm gegen die Zeit aufgetragen 261 Biochemisches Praktikum VII E405 Bakterienzahl B Galactosidase Aktivit t 0 10 20 30 40 50 60 Zeit min Interpretieren Sie das Ergebnis Welchen Einfluss hat die Induktion auf das Wachstum der Zellen und die Bildung von Galactosidase 262 Biochemisches Praktikum VII Aufgabe 4 Berechnen Sie bit
20. 1 35 g Glucose 1 phosphat 400 mg Glykogen ad 100 mI H2O pH 6 1 Jod Jodkalium L sung 100 mg J 200 mg KJad 100 mi HCI pH 2 0 Erythrocytenmembranen fertig pr parierte und gewaschene Erythrocytenmembranen werden im Eisbad auf jedem Tisch bereitgestellt 239 Biochemisches Praktikum VII Versuchsdurchf hrung 1 Nach folgendem Pipettierschema werden 8 graduierte Kunststoff Reagenzgl ser bef llt Volumenangaben in ul BE a Er u e e 550 1500 1400 200 700 700 50 100 200 400 fie fee er or 2 In die R hrchen 1 bis 7 werden dann zum Start der Reaktion je 100ul der Reagenzglas HEPES Puffer Theophyllin 100 100 Membran Suspension Phosphorylase b ATP L sung pipettiet die R hrchen mit einem Kunststoffstopfen verschlossen und anschlie end gut gesch ttelt In R hrchen 8 wird keine ATP L sung zugesetzt 3 F r genau 5 Minuten werden die Reagenzgl ser im St nder im Wasserbad bei 37 C inkubiert 4 Dann werden sofort je 1 ml Phosphorylase Reagenz zugesetzt gut gesch ttelt und f r weitere 15 Minuten bei 37 C inkubiert 5 8 frische Kunststoff Reagenzgl ser werden mit je 400 ul Jod Jodkalium L sung bef llt 6 Die Reagenzgl ser im Wasserbad werden herausgenommen und die Membranen sofort in einer Laborzentrifuge f r 3 Minuten auf h chster Stufe abzentrifugiert 7 Anschlie end genau 5 Minuten nach Entnahme der Reagenzgl ser aus dem Wasserbad wird 1 m
21. 12 11 60min 10 30min Omin mg dl 140 Biochemisches Praktikum IV Versuch C Erstellung der Insulin Standardgeraden Tragen Sie die Extinktionswerte der Insulinstandards hier ein oO oO oO oO oO oO oO oO oO oO oo te 50 40 30 20 000 X uoNYyUuNX3 20 40 80 160 320 640 10 oO Insulin uU m und Insulinwerte aus den Versuchen B und Tragen Sie hier die errechneten Glucose C zusammen ein und diskutieren Sie den Verlauf Entsprechen die Werte einer 3 lun i unsuj O N oO m oO o x NN Ip Bw 3soanIg 20 10 30 min 60 min 90 min 120 min 180 min 0 min Glucosetoleranz einer gesunden Person 141 Biochemisches Praktikum V 142 Biochemisches Praktikum V BIOCHEMISCHES PRAKTIKUM V Blut H moglobin Eisenporphyrine Eisenstoffwechsel Blutgerinnung glyciertes H moglobin Aufgabe 1 Quantitative Bestimmung von H moglobin als H moglobin Cyanid Aufgabe 2 Nachweis von H moglobin mit ABTS 2 2 Azino di 3 thylbenzthiazolinsulfonat 6 Aufgabe 3 Isolierung und Bestimmung von Porphobilinogen aus Urin Aufgabe 4 Bestimmung der Eisenkonzentration im Plasma Aufgabe 5 Versuche zur Gerinnung Aufgabe 6 Quantifizierung der HbA Fraktion im Blut Christian Albrechts Universit t zu Kiel Biochemisches Institut In der Medizinischen Fakult t Olshausenstrasse 40 24098 Kiel 143 Biochemisches Praktikum
22. Amplilfikationszyklen kommt es zur Akkumulation der durch die beiden Primer flankierten DNA Sequenz Die PCR Bedingungen m ssen je nach L nge der zu amplifizierenden Sequenz und L nge und G C Gehalt der spezifischen Primer individuell angepasst werden Biochemisches Praktikum Wir haben Ihnen eine kurze Animation auf Ihren Computer geladen die sehr anschaulich die Prinzipien der PCR erkl rt Primerdesign Generell sollten Primer f r Sequenzierungs oder Screeningaufgaben folgende Voraussetzungen m glichst gut erf llen o 18 25 Nukleotide lang bei k rzeren Primern steigt die Gefahr sekund rer Bindungsstellen o Primer mit mehr als 3 bis 4 facher Abfolge einer Base Base Runs sind zu vermeiden o Melting temperature m glichst 52 C bis 58 C Berechnung siehe Formel o M glichst Base G oder C am 3 Ende die sechs 3 terminalen Basen sollten ein ausgeglichenes GG AT Verh ltnis aufweisen o Der GC Gehalt sollte zwischen 40 und 60 liegen Bei geringerem GC Gehalt eventuell den Primer verl ngern um die Schmelztemperatur zu erh hen o Keine Hairpin loops Komplement re R ckfaltung o Keine Palindrome z B 5 AAG CTT 3 o Primer Dimer Bildung sollte ausgeschlossen werden o Kritische Endkontrolle ob Primer und Bindungsstelle auch tats chlich zueinander passen Internetlinksammlung zum Erstellen und berpr fen von Primern Internetlinksammlung zum Erstellen und berpr fen von Primern http
23. Diffusion ineinander laufen Man l sst das Laufmittel an der Luft kurz verdunsten im Abzug da Laufmitteld mpfe gesundheitssch digend sind und entwickelt ein zweites Mal indem man die Platte wieder in die Kammer stellt bis das Laufmittel erneut die Begrenzung bei 12 5 cm erreicht hat Auswertung Zun chst l sst man das Laufmittel wiederum verdunsten und legt die Platte dann in einen abgedunkelten Kasten mit UV Lampe Die einzelnen Substanzen k nnen anhand ihrer Lage durch ihre Eigenfluoreszenz bei 254 nm im UV Licht identifiziert werden Dabei wird der jeweilige Fleck mit einem Bleistift umrandet 252 Biochemisches Praktikum VII Aufgabe 5 Untersuchung zur Stimulierung von Zellen durch Mineralocorticoide Theoretische Grundlagen Wie bereits in der Einleitung im Abschnitt C erw hnt kann man Hormone aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften in zwei Gruppen teilen hydrophile lipidunl sliche Hormone Peptidhormone Proteine Katecholamine und lipophile Hormone W hrend die erste Gruppe hydrophile Hormone ihre Wirkung ber Bindung an Membranrezeptoren initiiert da sie aufgrund ihrer Hydrophilie nicht in die Zelle eindringen k nnen k nnen lipophile Hormone leicht durch Membranen diffundieren Nach Interaktion mit cytoplasmatische Rezeptoren wandern die Hormon Rezeptor Komplexe in den Zellkern wo sie als Transkriptionsfaktoren wirken Cortisol Extrazellul r raum P Plasmamembran inhibitor Rezeptor
24. Enzyminduktion und Enzymrepression Operon Operator Regulatorgen Promotoren Transkriptionsfaktoren Hormone und Signalketten Zellmembranst ndige Rezeptoren Proteohormone Katecholamine first messenger second messenger cAMP Proteinkinase A Adenylatcyclase G Proteine Phosphodiesterase Cytosolische nukle re Rezeptoren Steroidhormone Schilddr senhormone 224 Biochemisches Praktikum VII Einleitung Die Regulation des Stoffwechsels Die Regulation des Stoffwechsels erfolgt durch Kontrolle und gezielte Beeinflussung der Aktivit t von Enzymen Die Enzymaktivit t wird definitionsgem als Substratumsatz pro Zeiteinheit gemessen Bei der bermittlung von Signalen zur Regulation der Enzymaktivit t spielen Hormone eine wichtige Rolle Die Zelle hat viele M glichkeiten die Enzymaktivit t zu beeinflussen z B 1 durch nderung der Substrat Kosubstrat und Produktkonzentrationen 2 durch nderung des Reaktionsmilieus z B pH Wert lonenst rke 3 durch Ver nderung der Struktur des Enzymproteins Konformations nderungen kovalente Modifikationen 4 durch nderung der Enzymmenge Beeinflussung von Enzymsynthese Enzymstabilit t Enzymabbau oder Enzymtransport durch Membranen Die Abh ngigkeit der Enzymaktivit t von der Substratkonzentration nach dem Michaelis Menten Modell Punkt 1 und vom Reaktionsmilieu Punkt 2 wurden im Praktikum III behandelt Dieser Praktikumsteil besch ftigt sich mit d
25. M glichkeit sich ber Forschungsergebnisse zu informieren Literatur F r die Biomedizinische Forschung wird die wichtigste Datenbank PubMed vom National Center for Biotechnology Information bereitgestellt Getragen wird die Datenbank vom amerikanischen National Institute of Health sowie von der National Library of Medicine Die Internetadresse ist http www ncbi nim nih gov Eine wichtige Unterabteilung dieser Sammlung von Datenbanken ist die Datenbank PubMed die derzeit etwa 15 000 000 biomedizinische Zeitschriften Zitationen aus mehr als 5000 Zeitschriften enth lt Die Internetadresse ist http www ncbi nim nih gov entrez query fcgi db PubMed Biochemisches Praktikum In das Suchfeld dieser Datenbank kann man z B Autoren Namen eingeben und erh lt Informationen ber erschienene Artikel in Fachzeitschriften Diese Information geht mehrere Jahrzehnte zur ck und wird t glich aktualisiert Sie k nnen sich also leicht ein Bild dar ber machen welcher Wissenschaftler auf welchem Gebiet forscht und wie produktiv er sie publiziert Dar ber hinaus kann man auch nach Begriffen suchen Hier muss man eventuell eine Kombination von Begriffen eingeben um eine berschaubare Anzahl von Treffern zu erzielen Der Begriff Diabetis erzielt zum Beispiel weit ber 230 000 Treffer Die Eingrenzung type diabetes liefert nur noch gute 40 000 Treffer Eine weitere Eingrenzung auf type diabetes insulin sensitivity erg
26. Temperaturen durchgef hrt werden was die Spezifit t des Prozesses erheblich verbessert Primer binden n mlich nicht nur an exakt passende sondern auch an lediglich hnliche Zielsequenzen mit einigen Fehlpaarungen Solche falsch gepaarten Primer Matrizenkomplexe sind allerdings thermolabiler so dass bei h heren Temperaturen die Wahrscheinlichkeit dass der Primer an eine zuf lligerweise hnliche aber falsche Zielsequenz bindet erheblich sinkt Die Berechnung des Schmelzpunktes von Primern und die Kriterien der Primerauswahl wurden bereits am ersten Praktikumstag besprochen Produktion von rekombinanten Proteinen in Bakterien Um Proteine in Bakterien exprimieren zu k nnen ben tigt man komplement re DNAs complementary DNA cDNA Die cDNA leitet sich von der mRNA ab d h sie ist zu der mRNA komplement r und wird durch die in vitro reverse Transkription reverse Transkriptase von mRNA Molek len gewonnen Die so gewonnene cDNA kann nun in einen Vektor z B ein Plasmid eingef gt werden diesen Prozess nennt man Klonierung Die Wahl des Vektors h ngt von dem gew nschten Organismus ab in dem die Produktion des rekombinanten Proteins erfolgen soll siehe Tab 1 Es gibt zahlreiche medizinische und technische Anwendungsbereiche f r hochgereinigte Proteine wie z B Insulin Interferone koloniestimulierende Faktoren rekombinante Antik rper Impfstoffe Enzyme in Waschmitteln Die Herstellung solcher Proteine durch Reinigun
27. Werte von ionisierbaren Gruppen im aktiven Zentrum des Enzyms Solche Gruppen k nnen entweder f r die Bindung des Substrats oder direkt f r den Katalyse Vorgang notwendig sein b pK Werte anderer Gruppen im Enzym die zur Stabilisierung der aktiven Konformation notwendig sind c pK Werte funktioneller Gruppen im Substrat 56 Biochemisches Praktikum Ill Beispiel Enzymatische Spaltung von Nukleins uren Es gibt zahlreiche Nukleasen Nukleins uren spaltende Hydrolasen die nach verschiedenen Gesichtspunkten eingeteilt werden a DNAsen spalten nur DNA RNAsen spalten nur RNA b Endonukleasen spalten innerhalb einer Polynukleotidkette Exonukleasen vom 5 bzw vom 3 Ende einer Polynukleotidkette c Nukleasen der Spezifit t spalten a Typ Bindungen und setzen 5 Phosphor s uremonoester frei Nukleasen der Spezifit t II spalten b Typ Bindungen und setzen 3 Phosphors uremonoester frei Wichtige Nukleasen DNase Pankreas und DNase Il Milz sind Endonukleasen und erzeugen Oligodesoxyribonukleotide Restriktionsendonukleasen spalten DNA nur bei bestimmten Basen Sequenzen meist Palindrome d h mit spiegelsymmetrischer Basenanordnung RNase A Pankreas spaltet nur b Typ Bindungen hinter d h bei blicher Schreibweise von 5 nach 3 rechts von Pyrimidinbasen RNase T aus Pilzen oder U aus Bakterien nur b Typ Bindungen hinter Guanin RNase T hinter Adenin Diese Enzyme sind
28. als Pr pro Insulin an den Ribosomen synthetisiert und durch die Signalsequenz ins ER eingeschleust Dort wird das Pr pro Insulin posttranslational durch Proteolyse zum Proinsulin prozessiert und im letzten Schritt das C Peptid herausgeschnitten wobei das fertige Insulin entsteht Dieses wird in den exozytotischen B Granula der beta Zellen gespeichert Die postprandiale Glucoseerh hung im Blut f hrt dann zur Freisetzung des Insulins siehe oben Welche Aufgabe erf llt nun das Insulin Es ist ein endokrin wirkendes Hormon d h es wird vom Syntheseort Pankreas durch das Blut zu den Erfolgsorganen transportiert Die wichtigsten Erfolgsorgane sind die Muskulatur und das Fettgewebe In diesen Geweben stimuliert das Insulin die Aufnahme von Glucose aus dem Blut 110 Biochemisches Praktikum IV ATP abh ngiger _ Kalium Kanal C spannungsabh ngiger Calcium Kanal ohne Glucose COE DNA Transkription A Prozessierung des Zellkern prim ren Transkripts i g EA Entfemung der Introns I ATP abh ngiger en Depolarisierung 5 8 c A Kalium Kanal durch ATP E Glucose Translation Ribosomen 5 R i i l B Pr pro Insulin H u A SH Hs Entfernung der Signalsequen Faltung Schlie ung der Be o cken durch Depolarisierung a 4 ffnung des Ca Kanals Endoplasmatisches Reticulum N Golg Apparat Proinsulin Golgi Apparat Insulin B Gr nula Abb 2 Die beta Zelle des Pankr
29. an den hohen Aktivit ten von ALT SDH Fruktose 1 phosphat Aldolase und dem Anstieg der GLDH aber die Relation der Enzyme ist im Plasma anders als in der Leber Das Organ Muster erscheint im Se rum verzerrt Die Erfahrung hat gezeigt dass das Ausma der Verzerrung wertvolle Schl sse ber Art und Ablauf z B einer Lebererkrankung erlaubt Bei schweren akuten toxischen Lebersch den L sungsmittelvergiftung z B durch CCL finden sich im Serum h here Aktivit ten der AST als der ALT also eine Konstellation wie man sie in der Leber selbst findet s o Enzymausstattung in Strukturen der Zellen Da etwa 40 der AST in den Mitochondrien lokalisiert sind 211 Biochemisches Praktikum VI im Cytoplasma sind die Aktivit ten der AST und ALT praktisch gleich m ssen auch Mitochondrienmembranen zerst rt worden sein Es liegt also eine schwere Zellsch digung vor Da weiterhin die AST rascher als die ALT im Serum inaktiviert wird muss sich die Sch digung in einem akuten Stadium befinden 2 Bei der akuten Hepatitis werden zu Beginn der Erkrankung meist etwas h here Aktivit ten der ALT als der AST gemessen Der Schluss liegt nahe dass bei der akuten Hepatitis die allgemeine Zellsch digung in der Leber ganz vorwiegend den cytoplasmatischen Raum betrifft aus dem AST und ALT zu etwa gleichen Teilen ins Serum austreten Die schnellere Inaktivierung der AST f hrt bald zu den beobach teten h heren ALT Spiegeln Ist die AST Aktivit t
30. ck in die Leber Dazu verestert es das Cholesterin mit Hilfe der Lecithin Cholesterin Acyltransferase Das in die Leber gelangte Cholesterin wird zu Gallens uren umgewandelt und so ausgeschieden Cholesterin ist in den Lipoproteinen des Blutserums zu ca 2 3 als Fetts ureester und zu ca 1 3 in freier unveresterter Form vorhanden Der berwiegende Teil des 198 Biochemisches Praktikum VI gesamten Serumcholesterins wird in den Lipoproteinen geringer Dichte LDL und in den Lipoproteinen hoher Dichte HDL transportiert der Anteil von Cholesterin in den Chylomikronen und VLDL ist gering Medizinische Bedeutung Erh hte Cholesterinwerte im Serum findet man bei prim rer und sekund rer Hyperlipoprotein mie Es gibt eine Reihe genetisch und nicht genetisch bedingter Hypercholesterin mien die hier nicht im einzelnen dargelegt werden k nnen Eine Erh hung des Gesamtcholesterins im Serum s Tabelle 1 ist ein prim rer Risikofaktor einer Atherosklerose bzw einer koronaren Herzkrankheit Neuere Untersuchungen zeigen jedoch da die atherogene Bedeutung des Gesamtcholesterins differenziert gesehen werden muss Aufgrund zahlreicher epidemiologischer und klinischer Studien werden die LDL die ca 70 des Gesamtcholesterins transportieren als die wichtigsten atherogenen Lipoproteine angesehen Ihre Erh hung bedeutet ein besonders hohes Risiko Im Gegensatz zu den LDL stellt eine Erh hung der zweiten Cholesterin reichen Klasse der Lipopr
31. daher Endonukleasen der Spezifit t Il Die oben genannten RNasen greifen nur RNA Bezirke ohne Sekund rstruktur an Phosphodiesterase aus Schlangengift ist eine Exonuklease die vom 3 Ende einer RNA oder DNA 5 Mononukleotide freisetzt Phosphodiesterase Il aus Milz arbeitet in entgegengesetzter Richtung Biokatalyse Proteine als Katalysatoren Proteine die spezifisch eine chemische Reaktion beschleunigen ohne selbst dabei ver ndert zu werden bezeichnet man als Enzyme in einzelnen F llen wird Biokatalyse auch durch RNA ausge bt man spricht dann von Ribozymen Die Aufgabe 6 soll einige grundlegende Eigenschaften von Enzymen verdeutlichen 57 Biochemisches Praktikum Ill Messung der Enzymaktivit t Um die katalytische Wirksamkeit Aktivit t eines Enzyms zu messen bestimmt man entweder die Abnahme der Substratkonzentration oder besser die Bildung eines Reaktionsproduktes in Abh ngigkeit von der Zeit Die Bedingungen unter denen die zu messende Reaktion abl uft m ssen genau definiert sein z B der pH Wert die Temperatur die Substratkonzentration zu Reaktionsbeginn usw Wir definieren als Ma f r die Enzymaktivit t die Einheit U lumol umgesetztes Substrat 1 Minute 1U Diese Einheit ist international gebr uchlich Das Sl Einheitensystem bildet die Aktivit tseinheit Katal kat aus den Grundeinheiten mol und s 1 mol umgesetztes Substrat 1 Sekunde Diese neuere Einheit hat sich jedoch bisher
32. den Rezeptor Der aktivierte Komplex dimerisiert transloziert in den Zellkern und bindet dort an Ziel DNA Die folgende Abbildung zeigt die Aktivierung des Rezeptors durch lipophile Hormone im Detail Rezeptoren f r lipophile Hormone besitzen drei charakteristische Bereiche Eine Ligandenbindungsdom ne an die das Hormon bindet Eine DNA bindende Dom ne die im inaktiven Zustand oft von Inhibitoren besetzt ist Durch die Bindung eines Hormons kommt es zu einer Konformations nderung des Rezeptors Losl sung von Inhibitoren und der Ausbildung von Homo oder Heterodimeren die sich an spezifische DNA Sequenzen anlagern k nnen Ein weiterer wichtiger Bereich ist die Transkriptions aktivierende Dom ne 254 Biochemisches Praktikum VII transkriptions aktivierende inaktiv Dom ne Liganden bindungs dom ne DNA bindende Dom ne Dimerisierung Ya tn Rezeptoraktivierung durch lipophile Hormone Abbildung nach M ller Esterl Im folgenden Versuch sollen Zellen stimuliert werden in die ein Mineralocorticoid Rezeptor Expressions Konstrukt eingebracht wurde Bei diesem Konstrukt handelt es sich um Plasmid DNA Wie sie aus vorangegangenen Praktikumsteilen wissen sollten sind Plasmide kleine zirkul re DNA Molek le die relativ einfach manipuliert werden k nnen Unter einem starken Promotor CMV Promotor wurde in die Multiple Cloning Ste des Plasmids DNA kloniertt die f r einen Mineralocorticoidrezeptor kodiert Direk
33. der Glucose direkt im Blut ausgenutzt Das Messfeld enth lt entsprechende Enzyme und Substrat dessen Verf rbung durch ein spezielles Photometer quantifiziert werden kann Eine Kalibrierung mit einer Eichkurve ist nicht notwendig da die standardisierte Produktion der Teststreifen eine ausreichende Genauigkeit gew hrleistet Die Handhabung der Ger te ist auf der n chsten Seite beschrieben Sofort nach Praktikumsbeginn entnimmt und analysiert der den Selbstversuch durchf hrende Student die erste Blutprobe mit einem Teststreifen anschlie end trinkt er die ausgegebene Glucose L sung Die Menge der einzunehmenden Glucose wird individualisiert die Vorgabe ist 45 g Glucose pro m K rperoberfl che Die K rperoberfl che w hlt man h ufig als ma gebliche physiologische Bezugsgr e z B bei der Dosierung von Arzneimitteln oder bei Stoffwechsel und Clearance Untersuchungen Sie berechnet sich ann hernd nach der Dubois Formel K rperoberfl che m Gewicht Gr e 0 0071 m kg cm Berechnen Sie vor dem Praktikum wieviel ml der ausstehenden 28 igen Glucose L sung Sie f r den Belastungstest aus dem Vorratsgef zapfen m ssen Notieren Sie die Uhrzeit der Einnahme F r die sp teren Blutproben nach 30 60 und 90 min sind die Zeiten zu beachten 127 Biochemisches Praktikum IV Messvorgang starten S 7 Teststreifen einlegen Den auf dem Messger t Vor dem Einlegen des Teststreifens angezeigten Co
34. die mehr als 10 000 bekannten Proteinstrukturen in ihre Superfamilien Familien etc gem ss ihrer Faltungstopologie eingeteilt Sequenzanalyse DNA Humanes Genom Im Februar des Jahres 2001 wurde die erste Rohfassung der humanen DNA Sequenz publiziert Hierbei handelte es sich um die Ergebnisse zweier Sequenz Projekte Eines wurde mit ffentlichen Geldern finanziert w hrend das andere von einer Firma organisiert und finanziert wurde Es wurden ca 94 der humanen DNA Sequenz bestimmt Dies entspricht etwa 96 des Eu Chromatins Diese Gesamt Sequenz deckt etwa 3 000 000 000 Basenpaare ab Man geht heute davon aus dass diese Sequenz f r 25 000 30 000 Gene kodiert von denen uns in ihrer Funktion etwa 30 40 vollst ndig unbekannt sind Das ffentlich gef rderte humane Genomprojekt HUGO hat inzwischen alle Endfassungen der menschlichen Chromosomen 1 bis 22 sowie des Y und des X Chromosoms ver ffentlicht Die Sequenz Daten des humanen Genomprojektes sind online verf gbar und unter anderem innerhalb der Datenbank http www ncbi nim nih gov abrufbar Single Nucleotide Polymorphisms SNP s Eines der erstaunlichsten Ergebnisse des humanen Genomprojektes waren die hohen individuellen Unterschiede in der DNA Sequenz Es wurden schon bei der Ver ffentlichung der Rohdaten des humanen Genomprojektes 1 500 000 sogenannte Single Nucleotide Polymorphisms SNP s kartiert die sich gleichm ig ber das gesamte Genom erstrecken Di
35. eine Auswertung vornehmen sollen Bei der Bestimmung der Glucose in biologischen Fl ssigkeiten d h in Anwesenheit vieler hnlicher Verbindungen wird die hohe Spezifit t der Enzyme Hexokinase und Glucose 6 phosphatdehydrogenase genutzt die eine selektive Oxidation der Glucose bewirken Die Absorption des bei der Reaktion in st chiometrischen Mengen entstehenden NADH wird bei 334 nm gemessen Folgende Gleichungen beschreiben den Reaktionsablauf Sie entsprechen brigens den ersten Reaktionen des Pentosephosphat Wegs Glucose ATP __Hexokinase__ Glucose 6 Phosphat ADP Glucose 6 Phos Glucose 6 Phos NAD Dehydrogenase Glucons ure 6 Phos NADH Der Vergleich mit gleichzeitig gemessenen Glucose L sungen bekannter Konzentrationen Eichkurve gestattet die Berechnung der Glucose Konzentrationen in den Versuchsans tzen Die Ergebnisse sollten in der zeitgem en Einheit mmol l angegeben werden da aber in der Klinik noch immer die fr here Einheit mg dl gebr uchlich ist und auch das hier verwendete Teststreifen Photometer die Ergebnisse in mg dl ausgibt werden wir den Praktikumsversuch ebenfalls auf Grundlage dieser Einheit auswerten Sie sollen aber in der Lage sein Glucose 129 Biochemisches Praktikum IV Konzentrationen von einer in die andere Einheit umzurechnen Molekulargewicht von Glucose 180 g mol Es werden insgesamt 18 Reaktionsans tze gemessen 6 Glucose Standards sowie 12 Patientenproben 6 Zeitpunk
36. erkannt wird hei t antigene Determinante oder Epitop der erkennende Teil des Antik rpers hei t Paratop Die St rke mit der ein Antigen eine Immunantwort induziert bezeichnet man als Immunogenit t Ein Antigen kann also ein starkes oder schwaches Immunogen sein Die antigenen Determinanten von nat rlichen Antigenen kennt man i d R nicht Die Gr e Beschaffenheit und die Immunogenit t von antigenen Determinanten hat man in Modellversuchen aufgekl rt bei denen man verschiedene kleine Molek le an Tr germolek le carrier gekoppelt hat Es wurde ihre Immunogenit t untersucht und die Spezifit t der induzierten Antik rper bestimmt Eine k nstlich gekoppelte antigene Determinante nennt man Hapten Es zeigte sich da Haptene allein zwar keine Immunantwort ausl sen k nnen w hrend sie dies nach Kopplung an einen Tr ger sehr wohl verm gen Mit graduell ver nderten Haptenen konnte man bestimmen da Antik rper sehr feine molekulare Unterschiede erkennen k nnen z B ob an einem Phenylring ein Substituent in ortho meta oder para Stellung gebunden ist Wenn B Lymphozyten durch ein Antigen aktiviert werden werden sie gleichzeitig zur Proliferation angeregt und sie differenzieren zu Plasmazellen Diese sch tten dann den Antik rper der sie zur Antigenerkennung bef higte in gro er Menge aus Das k nnen bis zu 2000 Antik rper pro Sekunde sein Die sezernierten Antik rper zirkulieren mit dem Blut und vermitteln die humor
37. erkennen die mit einem Virus infiziert sind Diese T Zellen tragen ebenfalls den CD8 Marker werden als zytotoxische T Zellen Tc bezeichnet T Zellen erkennen das Antigen als solches also nicht sondern nur wenn dieses prozessiert also verarbeitet wurde und Teilst cke des Antigens Peptide von den prozessierenden Zellen pr sentiert werden s o Dieses sind demnach die antigen pr sentierenden Zellen antigen processing cells APC Zu diesen geh ren v a Monozyten Makrophagen und dendritische Zellen aber auch B Zellen Die Reaktionsf higkeit von T Lymphozyten ist also eingeschr nkt oder restringiert Die Funktion der T Helferzellen ist dabei durch MHC Klasse Il Molek le restringiert d h sie erkennen antigene Peptide wenn diese an MHC Il gebunden sind Die Funktion der T Suppressorzellen Ts bzw zytotoxischen T Zellen Tc ist dagegen durch MHC Klasse _I Molek le restringiert d h sie erkennen antigene Peptide wenn diese nach dem Prozessieren durch MHC pr sentiert werden Diese Zusammenh nge sind in Abb 2 schematisch gezeigt Es ist zu sehen dass dabei das CD4 Molek l als Rezeptor f r MHC Il und das CD8 Molek l als Rezeptor f r MHC fungiert Prozessiertes Antigen Abb 2 Erkennung von Antigen MHC Protein Komplexen durch T Zellen Die Rezeptoren von T Helferzellen T4 binden mit Unterst tzung von CD4 und CD3 an antigenpr sentierende MHC II Proteine von Zellen die exogenes Antigen durch Endozytose auf
38. exprimieren Fc und C Rezeptoren Dendritische Zellen professionelle Antigen verarbeitende prozessierende Zellen und professionelle Antigen pr sentierende Zellen bei der Induktion einer Immunantwort B Lymphozyten Struktur der Antik rper H und L Ketten variable und konstante Regionen hypervariable Regionen F ab F ab gt Fc Isotypen Klassen Subklassen Typen Antik rpergene V J C f r L V D J C f r H Kette Gr e des Repertoires somatische Mutation Funktion von Antik rpern neutralisierende Ak Phagozytose Komplement Aktivierung Funktion des C Monoklonale Antik rper Pr zipitation Agglutination Prozonen Ph nomen ELISA T Lymphozyten Subpopulationen der T Lymphozyten T Helfer Th Regulatorische T Zellen Treg zytotoxische Tc T Lymphozyten Antigenerkennungskomplex TCR f r TH Treg und Tc d h Restriktion der Antigenerkennung durch Ty Tcyreg Zellen MHC Molek le major histocompatibility complex Klasse l und Klasse Il Molek le und ihre Funktion 265 Biochemisches Praktikum VIII Einleitung Zellen des Immunsystems Die Zellen des Immunsystems IS sind die Leukozyten Granulozyten Monozyten dendritische Zellen die verschiedenen Gewebsmakrophagen und die Lymphozyten Die Gesamtheit dieser Zellen ist f r die spezifischen und unspezifischen Leistungen des IS verantwortlich Spezifisch k nnen nur die Lymphozyten reagieren denn sie besitzen auf ihrer Zellmembran entsprech
39. f Kemporen 4 Kemh lle hun Transkription Aktivierung des intrazellul ren Cortisol Rezeptors Abbildung modifiziert nach M ller Esterl Mineralocorticoide z hlen zu den lipophilen Hormonen Steroide Sie werden in der Nebennierenrinde gebildet und spielen eine wichtige Rolle im Wasser und 253 Biochemisches Praktikum VII Mineralhaushalt des K rpers Typische Vertreter sind z B Aldosteron Hydrocortisol In Aufgabe 4 haben Sie sich mit den Hauptsynthesewegen der Steroide besch ftigt In dieser Aufgabe wird die Funktionsweise der Mineralocorticoide genauer untersucht Aufgrund ihrer guten Lipidl slichkeit k nnen Mineralocorticoide leicht durch Zellmembranen diffundieren Im Cytoplasma angelangt binden sie an spezifische Rezeptoren und bilden Hormon Protein Komplexe Durch die Hormon Bindung kommt es zu einer Aktivierung Diese aktivierten Komplexe k nnen Dimere bilden und weiter in den Zellkern wandern wo sie durch Bindung an spezifische Bereiche der DNA die Hormon Responsiven Elemente als Transkriptionsfaktoren wirken d h es kommt zu einer spezifischen Genaktivierung Diese Aktivierung von intrazellul ren Rezeptoren k nnen Sie in der oberen Abbildung am Beispiel Cortisol verfolgen W hrend Aldosteron an den Mineralocorticoidrezeptor bindet bindet Cortisol haupts chlich an den Gilucocorticoidrezeptor Der Mechanismus dahinter ist der gleiche Cortisol diffundiert durch die Membran bindet im Cytosol an
40. gesichert sein Auslaufgef hrdete Stoffe sind durch Auffangwannen zu sichern Zusammenlagerungshinweise in den Betriebsanweisungen oder Sicherheitsdatenbl ttern beachten 308 Anhang Zu beziehen von dem Sicherheitsbeauftragten Tel 2220 4 8 4 9 4 10 4 11 Labort ren geschlossen halten Offenstehende T ren ziehen unkontrollierbare Luftstr mungen nach sich Die Klimaanlage funktioniert nur richtig wenn die T ren geschlossen sind Das Gef hl dass es bei offener T re k hler oder w rmer sei ist objektiv falsch Vor der Arbeit mit Gefahrstoffen sind die sich in unmittelbarer N he aufhaltenden Personen zu unterrichten damit auch von ihnen die notwendigen Schutzma nahmen getroffen und eingehalten werden k nnen Dies gilt insbesondere wenn mehrere Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter gleichzeitig einen Abzug benutzen Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter die mit der Durchf hrung von Versuchen betraut sind d rfen ihren Arbeitsplatz nur dann verlassen wenn eine dauernde berwachung der Versuche nicht erforderlich ist oder wenn ein anderer der ber dien Ablauf des Versuchs unterwiesen ist die berwachung bernimmt Haben sich gef hrliche Stoffe in der Luft am Arbeitsplatz angesammelt sind Messungen zu veranlassen um festzustellen ob die Grenzkonzentrationen MAK Werte f r Gefahrstoffe berschritten sind 309 4 12 Anhang Der MAK Wert ist die h chstzul ssige Konzentration eines
41. hat Blut auftragen und Messergebnisse ablesen S 22 Halten Sie den Blutstropfen an Das Messger t beginnt von f nf bis den schmalen Kanal an der eins r ckw rts zu z hlen Dann oberen Kante des Teststreifens wird Ihr Blutzuckerspiegel so dass er ihn ber hrt zusammen mit der Ma einheit Das Blut wird in den Teststreifen sowie dem Datum und der Uhrzeit eingesogen Halten Sie den der Messung angezeigt Blutstropfen weiter an die obere Kante des Teststreifens bis das Best tigungsfenster vollst ndig gef llt ist Wenn das Messergebnis niedriger h her oder nicht wie erwartet ausf llt lesen Sie bitte die Informationen auf Seite 24 25 128 Biochemisches Praktikum IV Versuch B Glucose Bestimmung der vorbereiteten Proben Jede Gruppe erh lt 6 Seren eines fiktiven Probanden die vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach oraler Glucose Belastung gewonnen wurden Es gilt die Zeitverl ufe der Glucose sowie der Insulin Spiegel zu analysieren um herauszufinden ob es sich um eine gesunde Person oder einen Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 handelt Dabei sollen Sie die Glucose enzymatisch in einem klassischen feucht biochemischen Test im Reagenzglas bestimmen Die Analyse der Insulin Spiegel w rde ein immunologisches Verfahren ELISA erfordern das wir aus Zeitmangel im Praktikum nicht durchf hren k nnen es werden Ihnen deshalb typische Me werte eines solchen Tests ausgegeben mit welchen Sie trocken
42. heran die Fremdstoffe nur in besonderer Weise n mlich in Assoziation mit den eigenen Gewebsantigenen MHC s u erkennen Da diese Zellen vom Thymus stammen werden sie T Lymphozyten oder T Zellen genannt Die T Zellen verlassen den Thymus und besiedeln ber den Blutstrom die sekund ren Lymphorgane wie Lymphknoten Peyer sche Plaques 266 Biochemisches Praktikum VIII Tonsillen Milz T Zellen sind f r die zellul re Immunit t verantwortlich d h nach Aktivierung sind sie selbst als Effektorzellen wirksam k nnen beispielsweise virus infizierte eigene Zellen erkennen und abt ten Das andere prim re Lymphorgan ist bei V geln die Bursa fabricii bei S ugetieren wird die Funktion der Bursa in der fr hen Ontogenese von der fetalen Leber und sp ter vom Knochenmark selbst wahrgenommen Die dort differenzierenden Zellen leiten sich also von der Bursa oder vom Knochenmark engl Bone marrow ab und hei en deshalb B Lymphozyten oder B Zellen W hrend der Differenzierung im prim ren Lymphorgan erhalten sie einen Rezeptor mit denen sie Fremdstoffe direkt erkennen k nnen Diese Rezeptoren sind die Immunglobuline Antik rper Wenn die B Zellen im prim ren Lymphorgan ihre Immunkompetenz erlangt haben besiedeln sie ebenfalls die sekund ren Lymphorgane Die Substanzen die Lymphozyten aktivieren k nnen nennt man Antigene Dies sind in der Regel hochmolekulare Stoffe Der Teil eines solchen Molek ls der direkt vom Antigenrezeptor
43. ht d h die Substrataffinit t des Enzyms I gemittelt ber alle Enzymmolek le ist vermindert EI Bei gleichem I und gro em S liegt das Gleichgewicht auf der Seite von ES Daher wird Vmax bei gro em S erreicht In der Darstellung nach Lineweaver Burk Abbildung 8 schneiden sich die mit verschiedenem I aufgenommenen Geraden auf der Ordinate Kann der Inhibitor I durch das Enzym nicht umgesetzt werden spricht man von dead end inhibition In 66 Biochemisches Praktikum Ill anderen F llen wird umgesetzt wobei ein Produkt P entsteht wird dieses durch die Messmethode f r P nicht mit erfasst resultiert eine kompetitive Hemmung siehe Aufgabe 5 Kompetitive Inhibitoren hneln in ihren f r die Bindung an das Enzym wesentlichen Strukturmerkmalen stets dem Substrat mit dem sie kompetieren Sie sind sterische Substratanaloge Beispiele kompetitiver Inhibition L Benzylsuccinat Hemmung des Verdauungsenzyms Carboxypeptidase Bernsteins uredehydro genase ein Enzym der Mitochondrien hat als Substrat Bernsteins ure und wird durch Malons ure gehemmt CH HIA Chs CH 6 Substrat Acetylcholin Tacrin kompetitiver NH Inhibitor N EG N Acetylcholinesterase Abbildung 9 Inhibition der Acetylcholesterinesterase Acetylcholinesterase ein Enzym in Nervenzellen hat als Substrat Acetylcholin und wird durch Tacrin kompetitiv gehemmt Das Medikament wird bei der Alzheimer krankheit
44. infolge der Zellsch digungen vermehrt in das Blut ber Bei der chronischen Pankreatitis kommt es im allgemeinen nur bei einem Entz ndungsschub oder bei mechanischer Abflu behinderung zum Anstieg der Lipase im Serum In manchen F llen von chronischem Alkoholismus oder bei Erkrankungen der Gallenwege kommt es zur Mitbeteiligung des Pankreas und Anstieg der Lipaseaktivit t im Serum Ein Mangel an Gallens uren im Intestinaltrakt der z B durch Abflu st rungen von Gallenfl ssigkeit bedingt sein kann f hrt zu mangelhaftem enzymatischen Abbau der Nahrungstriglyceride mit den Folgen einer Steatorrhoe Fettstuhl da die Pankreaslipase ohne Gallens uren nicht in der Lage ist die Nahrungstriglyceride abzubauen Diese passieren dann unverdaut den Darmtrakt Versuchsprinzip Zur Bestimmung der Pankreaslipase Aktivit t wird die Abnahme der Tr bung Lichstreuung einer verd nnten Emulsion von Gilycerin tri ls ureester Triolein unter Wirkung der Lipase photometrisch bestimmt Dies wird einmal in Abwesenheit und einmal in Gegenwart von Gallens uren durchgef hrt 124 Biochemisches Praktikum IV Versuchsdurchf hrung Die Substratmischungen 6 und 7 werden kurz vor Beginn des Versuchs f r jeweils mindestens 30 s auf einem Magnetr hrer ger hrt Die Messungen mit den Ans tzen A und B werden parallel durchgef hrt Pipettieren Sie zun chst Wasser sowie die Substratmischungen ohne bzw mit Desoxycholat in drei entsprechend besc
45. nahezu so hoch wie die der ALT oder bersteigt sie diese bei hoch bleibenden Aktivit ten der beiden Transaminasen w hrend des Krankheitsverlaufs so weist das auf eine schwere nekrotisierende Form mit Zelluntergang der Hepatitis hin dann findet man auch hohe GLDH Akti vit ten aus den Mitochondrien Die H he des Enzymanstiegs im Serum ist ein Ma f r die momentane Schwere der Zellsch digung Der Krankheitsverlauf ist leicht durch wiederholte Transaminase Bestimmungen zu kontrollieren Von einer Ausheilung kann erst gesprochen werden wenn die Transaminase Aktivit ten normal geworden sind siehe nachstehende Tabelle und bei k rperlichen Belastungen normal bleiben Mitochondrium Plasmamembran a J A A A fen A R a A geringer Schaden z o a J th 0j o 7 J A amp schwerer Schaden GLDH ALT GOT Zellkern Abbildung 10 Enzym Muster bei unterschiedlichem Grad einer Zellsch digung 212 Biochemisches Praktikum VI 3 Normalisieren sich die Aktivit ten nach einer akuten Hepatitis nicht so muss mit dem bergang in eine persistierende oder in eine chronische Hepatitis gerechnet werden Die Unterscheidung ist nur histologisch m glich Leberbiopsie Bei den chronischen Leberkrankheiten Cirrhosen kompliziert sich n mlich das Bild dadurch dass hier in der Leber durch Zelluntergang und Zellumbau nicht mehr das normale Enzym Muster vorliegt sondern die Leber spezifischen Enzyme daru
46. nicht durchgesetzt l kat Enzymaktivit ten geben die durch Enzymzugabe bewirkte Reaktionsbeschleunigung an gegebenenfalls ist die Geschwindigkeit der chemischen Reaktion ohne Enzym meist sehr gering oder gar nicht messbar als Leerwert abzuziehen Aktivit tsangaben werden meistens auf gewisse Probenvolumina z B 1 ml bezogen Bei der Untersuchung von K rperfl ssigkeiten Serum Harn w hlt man als Bezugseinheit f r die Enzymeinheiten 1 Liter bei der Analyse von zellul rem Material h ufig g Frischgewicht g Trockengewicht oder mg Protein Unter festgelegten Bedingungen ist die Enzymaktivit t ein Ma f r die Enzymmenge Bei der praktischen Bestimmung werden Konzentrations nderungen pro Zeiteinheit verfolgt In vielen F llen sind photometrische Verfahren daf r besonders geeignet Bei der photometrischen Messung wird aus der Extinktions nderung pro Zeiteinheit AE At nach dem Lambert Beerschen Gesetz E e c d unmittelbar die Konzentrations nderung pro Zeiteinheit Ac At erhalten AE 4 AC Ac_ AE bzw At At At At e d Ber cksichtigt werden muss noch die Verd nnung des Volumens der Enzyml sung Vp im Gesamtvolumen des Bestimmungsansatzes vg der Verd nnungsfaktor ist 58 Biochemisches Praktikum Ill somit vg vp Bezogen auf 1 ml Enzyml sung ergibt sich die Gleichung zur Berechnung von Enzymaktivit ten bei photometrischen Bestimmungsverfahren Ba e a At e d v ml AE gemessene lineare
47. nnten Sie die Spektren aufgenommen haben Was ist DNA RNA Was sind Nukleasen Informieren Sie sich ber die Strukturen der einzelnen Basen Adenin Guanin Thymin Cytosin Wo kommt Uracil vor Was gibt der molare Extinktionskoeffizient an Welche Einheit hat er Biochemisches Praktikum Il Aufgabe 2 Kleben Sie hier die UV Spektren ein Vergleichen Sie das UV Spektrum der L sung 1 mit den UV Spektren aus Aufgabe 1 Diskutieren Sie die unterschiedliche Extinktion der drei DNA L sungen unter Ber cksichtigung des hyperchromen Effektes und der Reversibilit t Was ist der hyperchrome Effekt und wovon h ngt es ab Wie w rde sich RNA verhalten Wie stabil ist DNA bzw RNA in 1M Natronlauge Skizzieren Sie was mit RNA in 1M NaOH passiert 46 Biochemisches Praktikum Il Aufgabe 3 und 4 Bestimmen Sie anhand des Polaroidfotos und den bekannten L ngen der Standards Abb 4 die L ngen der mittels PCR amplifizierten und der verdauten Fragmente Wie kann man die L ngen unbekannter Fragmente bestimmen die nicht den Fragmenten des Standards zuzuordnen sind Kleben Sie hier das Foto bzw den Ausdruck ein 47 Biochemisches Praktikum Il Diskutieren Sie die Ergebnisse zur Aufgabe 3 Warum ist nur in dem Ansatz mit den Primern ein PCR Fragment zu erkennen Wo spielt die PCR heutzutage eine wichtige Rolle Diskutieren Sie die Ergebnisse zur Aufgabe 4 Erkl ren Sie das Fragmentmuster und berechnen Sie die Gr e der Fra
48. oder Threoninresten aktiviert bzw inaktiviert Die bertragung der Phosphatgruppe wird durch spezifische Proteinkinasen unter ATP Verbrauch vermittelt Die Abspaltung der Phosphatgruppen erfolgt durch spezifische Proteinphosphatasen Einige Hormone z B Adrenalin oder Glucagon siehe Abbildung 4 wirken in der Zelle ber cAMP als second messenger Dieses wird aus ATP bei der G Protein siehe Abbildung 4 vermittelten Aktivierung der Adenylatcyclase siehe Abbildung 4 gebildet Die erh hte CAMP Konzentration f hrt zum Beispiel durch eine Serie von cytosolischen Enzym Reaktionen letztendlich zur Phosphorylierung der Glykogenphorylase b die dadurch in die aktive Form Glykogenphosphorylase a siehe Abbildung 4 berf hrt wird Die involvierte Proteinkinase A wird von cAMP allosterisch aktiviert CAMP abh ngige Proteinkinase PKA siehe Abbildung 4 Diese Reaktions Kaskade wird reguliert indem das cAMP relativ rasch durch eine membranst ndige Phosphodiesterase siehe Abbildung 4 zu 5 AMP abgebaut wird Dagegen muss die durch die kovalente Modifikation aktivierte Phosphorylasekinasse a und Glykogenphosphorylase a durch entsprechende Proteinphosphatasen dephosphoryliert werden um die Wirkung des Hormons zu beenden 230 Biochemisches Praktikum VII ATP G DP 5 allo amp ferische Oi KA u a RS LY 2ATP 2 ADP ATP TS A Aktivierung D ER durch Phosphorylierung P P Hormon z B G
49. sonst das Wachstum der Bakterien unterbrochen wird 1 Es werden zwei Reihen mit je 7 Plastikreagenzgl sern vorbereitet die folgenderma en beschriftet werden N nicht induziert N10 N20 N30 N20 N50 Neo induziert lio l20 l30 l40 Iso lso 2 Jedes Reagenzglas wird mit 1 ml MEA Puffer bakterizid bef llt 3 Die Erlenmeyerkolben der Bakterienkulturen befinden sich im 37 C Sch ttel wasserbad Jede Gruppe beschriftet zwei Kolben mit Tischnummer Gruppen bezeichnung sowie mit N oder I Zwei Kunstoffk vetten werden mit je 0 5 ml H2O bef llt Die Stopfen werden vorsichtig abgezogen Aus den Kolben N und I werden je 1 ml Suspension mit einer Eppendorfpipette ohne Ber hrung der Innenwand entnommen und in die R hrchen No bzw Io gegeben Zeit t 0 Diese 244 Biochemisches Praktikum VII werden dann sp ter f r die unten beschriebene Bestimmung der Galactosidase Aktivit t benutzt Danach entnimmt man je Kolben weitere 0 5 ml und gibt diese in die vorbereiteten zwei Kunststoffk vetten und misst umgehend die optische Dichte wie unten beschrieben siehe Bestimmung der Bakterienzahl Jetzt wird nur die Bakterienkultur mit 1 ml IPTG L sung versetzt Beide Erlenmeyerkolben werden mit den Stopfen verschlossen und wieder in das Sch ttelwasserbad bei 37 C gestellt Die Probennahme von je 1 ml Bakteriensuspension in die R hrchen N o s0 bzw I4o 60 sowie von je 0 5 ml in K vetten mit 0 5 m
50. sterben an L hmung der Organfunktion Die Enzyme die direkt an der ATP Gewinnung in den Mitochondrien beteiligt sind Cytochrome lassen sich durch Cyanid lonen CN Zyankali irreversibel hemmen Viele Enzyme werden durch Schwermetalle wie Hg Cd As und Pb gehemmt z B GAPD Dabei binden sich die Metallionen an eine SH oder OH Gruppe an der aktiven Stelle Protein SH Pb HS Protein gt Protein S Pb S Protein 2H 69 Biochemisches Praktikum Ill Weitere physiologisch besonders wichtige Enzymhemmungsmechanismen wie z B die allosterische Hemmung und die Substrathemmung werden in Praktikum VII behandelt 70 Biochemisches Praktikum Ill Aufgabe 1 Produktion rekombinanter Proteine in Bakterien Fortsetzung des 2 Praktikumstages Bakterielle Kolonien die auf Ampicillin Platten gewachsen sind sollten das Plasmid das f r ein Ampicillinresistenz Gen kodiert enthalten Wir haben zwei Ans tze vorbereitet der erste Ansatz besteht aus Bakterien die ein Kontrollplasmid ohne Interleukin 6 DNA enthalten Der zweite Ansatz besteht aus Bakterien die ein Plasmid mit Interleukin 6 DNA enthalten Von beiden Ans tzen wurde jeweils mit einer Kolonie eine Bakterienkultur 2 ml angeimpft und bei einer optischen Dichte von A600 0 5 mit IPTG induziert Eine weitere Kultur des zweiten Ansatzes wurde nicht induziert Nach Induktion wurden die Bakterien f r 2 h weiter bei 37 C inkubiert und anschlie e
51. und das vorl ufige Protokoll f hrt Jede Gruppe bekommt zwei Suspensionen in denen sich die Bakterien in demselben Lactose freien Medium befinden Als Induktor dient nicht Lactose sondern es wird das in gleicher Weise wirksame Isopropylthio B galactosid IPTG der einen Suspension zugesetzt Suspension I Die andere Bakeriensuspension wird nicht induziert Suspension N Die Aktivit t der B Galactosidase wird durch die enzymatische Spaltung des synthetischen Substrates p Nitrophenyl B galactosid NPG bestimmt Dabei entsteht das im alkalischen Carbonat Puffer gelbe p Nitrophenol das bei 405 nm im Photometer quantitativ bestimmt werden kann CH OH qh CH OH HO o CH HO O fm OH CH OH OH OH Isopropylthiogalactosid IPTG p Nitrophenylgalactosid NPG 243 Ben tigte L sungen Bakteriensuspension Biochemisches Praktikum VII 2x 15 ml E coli Suspension angez chtet in Lactose freiem Medium Kulturmedium MEA Puffer giftig 25 mM Phosphatpuffer pH 7 0 0 2 Mercaptoethanol 0 01 Natrium Azid Carbonat Puffer 1 M Na gt CO in dest H2O IPTG L sung 10 mM NPG L sung 5 mM Versuchsdurchf hrung Vorsicht beim Umgang mit Bakterien H nde waschen nicht mit dem Mund pipettieren etc alle kontaminierten Pipettenspitzen und R hrchen in die besonderen Beh lter Die Bakterienkulturen d rfen nur f r die kurze Zeit der Probenentnahme aus dem 37 C Wasserbad entnommen werden da
52. von Antik rpern f r das Erfassen der Zielmolek le hier Insulin aus Sowohl in der Forschung wie auch in 133 Biochemisches Praktikum IV der Routine Diagnostik des Klinischen Labors werden f r Messungen besonders von Hormonen und Tumor Markern ELISA Teste durchgef hrt ELISA steht f r enzyme linked immunosorbent assay Dabei macht man sich die folgenden Aspekte zunutze gt Die Hybridoma Technologie erm glicht die unbegrenzte Produktion von Antik rpern die sich auf die spezifische Erkennung und Bindung praktisch aller zu messenden Makromolek le abrichten lassen gt Die Reaktionen lassen sich in kleinen Volumina in sogenannten Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit 96 Vertiefungen Kavit ten engl wells durchf hren und sind so weitgehend automatisierbar gt Proteine lassen sich unter Erhalt ihrer biologischen Funktion stabil an die Polystyrol Oberfl che adsorbieren gt Kovalente Komplexe aus Antik rpern und bestimmten Enzymen Konjugate lassen sich unter Erhalt ihrer biologischen Funktionen herstellen Antik rperbindungsf higkeit bzw Enzymaktivit t Diese Werkzeuge erm glichen unterschiedliche Testaufbauten von denen die beiden h ufigsten der Sandwich ELISA und der Kompetitions ELISA sind Der Praktikumsversuch den wir hier aus Zeitgr nden nicht durchf hren k nnen aber mit repr sentativen Werten auswerten wollen basiert auf einem Kompetitions ELISA Hierbei werden neben den Patientenproben einige V
53. vorgelagert ist Endiole wirken stark reduzierend man nennt sie deshalb auch Reduktone Durch Erhitzen im alkalischen Medium wird schlie lich die Kette in un bersichtlicher Reaktion zu kleineren Bruchst cken die au erordentlich stark reduzierend wirken aufgespalten Diese starke Reduktionswirkung nutzen die sogenannten Reduktionsproben auf Zucker zum qualitativen Nachweis aus indem sehr schwache Oxidationsmittel wie z B Cu oder BiO reduziert werden Bei der Trommer schen Probe l uft folgender Vorgang ab 2 wertiges Cu wird durch Glucose zu 1 wertigem Cu reduziert Es entsteht zun chst Kupfer I hydroxid CuOH gelb dann durch Wasserabspaltung Kupfer l oxid Cu gt O rot In dem f r die Reaktion notwendigen alkalischen Milieu f llt Cu als schwer l sliches Hydroxid aus In dem 2 Phasensystem festes Hydroxid fl ssige Glucosel sung w rde die Reduktionsreaktion nur langsam ablaufen das volumin se Hydroxid und das aus diesem durch Dehydratisierung beim Erhitzen entstehende schwarze Kupfer Il oxid CuO w rden au erdem die Erkennung des Farbumschlages verhindern Deshalb sorgt man daf r dass das Schwermetallion als alkalibest ndige l sliche Kom plexverbindung vorliegt Komplexbildner ist der zu bestimmende Zucker Da dieser in relativ geringer Konzentration vorliegt muss man mit sehr kleinen Cu Mengen arbeiten 99 Biochemisches Praktikum IV Anmerkung Da eine freie acetalische Hydroxylgruppe Vor
54. wird Ammoniumsulfat benutzt Die durch Einstellen des IEP oder durch Aussalzen erzielten Proteinf llungen sind voll reversibel wenn man die f llende Ma nahme r ckg ngig macht F llungen durch organische L sungsmittel dagegen nur soweit keine Denaturierung eingetreten ist Abbildung 2 L slichkeit des Hanfsamen Globulins Edestin in Abh ngigkeit von der Konzentration an Na SO Logarithmus der L slichkeit 0 1 2 3 4 lonenst rke 55 Biochemisches Praktikum Ill Der Einfluss von pH und Temperatur auf die Enzymaktivit t Die Geschwindigkeit von Enzymreaktionen steigt wie die anderer chemischer Umsetzungen mit Erh hung der Temperatur Bei 10 Temperaturerh hung wird die Geschwindigkeit etwa verdoppelt bis verdreifacht Mit steigender Temperatur setzt aufgrund des Proteincharakters der Enzyme aber auch ein gegenl ufiger Prozess ein durch Hitze Denaturierung Aufbrechen der Proteinterti rstruktur werden die Enzyme irreversibel inaktiviert So ergibt sich f r Enzymreaktionen ein Temperaturoptimum Abbildung 3 ERROR Denaturierung Abh ngigkeit der relative Reaktions Fe geschwindigkeit Enzymaktivit t von der resultierende Enzymaktivit t Temperatur Temperatur Die meisten Enzyme besitzen ein pH Optimum bei dem ihre Aktivit t ein Maximum durchl uft Die Kurvenform kommt durch berlagerung mehrerer Effekte zustande Verschiedene Parameter k nnen hier bestimmend sein n mlich a die pK
55. zur Synthese von Komponenten der extracellul ren Matrix wesentlich gr er ist Deswegen sind sie an der Fibrosierung der Leber entscheidend beteiligt was letzten Endes zum Zustand der Lebercirrhose f hrt Eine besondere Bedeutung in diesem Rahmen hat ein hoher Alkoholkonsum In die Leber gelangen ber die Pfortader die meisten Produkte der Verdauung Aminos uren Monosaccharide Glycerin und kurzkettige Fetts uren Sie werden je nach Bedarfslage des brigen Organismus von den Hepatocyten in andere nieder molekulare Stoffe umgewandelt zur Biosynthese komplexer Substanzen verwendet f r die Ausscheidung vorbereitet oder auch unver ndert in den gro en Kreislauf ab gegeben bzw gespeichert Die Leber sorgt insbesondere f r die Kontrolle des Plas maspiegels vieler Substanzen Die Leber ist damit das zentrale Organ der Stoff wechselregulation In keinen anderen somatischen Zellen spielen sich so viele ver schiedene Stoffwechselvorg nge ab wie in Hepatocyten Dies zeigt ein stichwort artiger berblick 176 Biochemisches Praktikum VI Aminos uren werden kontrolliert an das Blut abgegeben zu Proteinen der Leber und des Plasmas aufgebaut in andere nicht essentielle Aminos uren umgewan delt desaminiert und das NH3 wird in Harnstoff einge baut abgebaut zu Acetyl CoA Acetacetat oder Dicarbon s uren Glucose wird als Blutzucker kontrolliert ans Blut abgegeben zu Glycogen aufgebaut und gespe
56. 1 k folgt 12 Ku 1 Km ist keine Gleichgewichtskonstante aber sie n hert sich der Gleichgewichtskonstanten des ersten Schrittes der Substratbindung _ E S _ k 13 Es x wenn k wesentlich kleiner ist als k4 Die Umsatzgeschwindigkeit v ist gleich der Geschwindigkeit v mit der das Produkt gebildet wird 14 v2 k2 ES oder nach Substitution von ES aus Gleichung 12 k 1 9 15 Ku So ES kann maximal gleich der Einwaagekonzentration Eo werden wenn das gesamte Enzym als ES vorliegt Daher istk Eo die maximal m gliche Geschwindigkeit der Produktbildung 16 k2 Eo Vmax Es folgt aus 15 und 16 die Michaelis Menten Gleichung v V max 17 Ky j 61 Abbildung 4 Darstellung der Enzymaktivit t nach Michaelis und Menten Biochemisches Praktikum Ill Die Substratabh ngigkeit der Umsatzgeschwindigkeit eines Enzyms kann somit durch die Angabe von Vmax und Ku beschrieben werden Die Michaelis Menten Gleichung sagt eine hyperbolische Abh ngigkeit zwischen der Umsatzgeschwindigkeit v und der Substratkonzentration S voraus siehe Abbildung 4 Dies konnte auch in den meisten F llen best tigt werden Ausnahmen bilden z B allosterische Enzyme die in sp teren Praktikumversuchen bearbeitet werden Praktikum VI Y2 V max Ku So F r So Ku folgt aus 17 18 19 V max 2 y und aus 14 und 16 v Ed Es esj E Bei der Subs
57. 5 1 Tween 20 Waschpuffer 50 mM Tris HCI pH 7 5 Guanidin HCI 50 mM Tris HCI pH 8 6 M Guanidin HCI Redoxpuffer 1 50 mM Tris HCL pH 8 1 M Guanidin HCI 2 mM reduziertes Glutathion und 0 2 mM oxidiertes Glutathion Redoxpuffer 2 50 mM Tris HCI pH 8 0 75 Biochemisches Praktikum Ill Aufgabe 2 pK Wert Bestimmung eines Puffersystems Pufferl sungen Wenn eine L sung bei Zusatz von S ure oder Base ihren pH Wert nur relativ wenig ndert spricht man von einer Pufferl sung W ssrige L sungen dieser Art erh lt man indem man ein Salz einer schwachen S ure gemeinsam mit der freien S ure in Wasser l st oder das Salz einer schwachen Base mit der entsprechenden Base Pufferl sungen enthalten daher eine S ure und ihre korrespondierende Base in Konzentrationen gleicher Gr enordnung z B CH3COOH CH3COO NH4 NH3 H gt sPO4 HPO4 Die schwache S ure H2PO7 die zum Beispiel beim Aufl sen von Kaliumhydrogenphosphat entsteht hat einen pK Wert von 6 8 Mit dem Massenwirkungsgesetz angewendet auf die Dissoziation schwacher S uren kann man den pH Wert von Pufferl sungen berechnen Diese Gleichung logarithmiert und nach pH aufgel st wird nach Henderson und Hasselbalch benannt pH pK log Se c A Ca Konzentration der S ure Cg Konzentration der korrespondierenden Base Durch Mischen einer S ure von geeignetem pK mit ihrer korrespondierenden Base kann man also Pufferl sungen jeden gew nschten pH Werte
58. 7 418 419 420 421 422 dasnssssssnssssssnnnsinune his inneren nn nennen nennen nennen nenne Tabelle aus der Originalarbeit in der die Rohfassung des humanen Genoms ver ffentlicht wurde Nature 409 860 921 2001 Auch die Referenzen beziehen sich auf die Zitate in dieser Arbeit Biochemisches Praktikum RNA Komplement re DNAs cDNAs Das retrovirale Enzym Reverse Transkriptase schreibt RNA in komplement re DNA Sequenzen um Verwendet man dieses Enzym um reife mRNA Molek le in entsprechende doppelstr ngige DNA Sequenzen umzuschreiben erh lt man cDNAs Diese entsprechen also in ihrer Sequenz reifen mRNAs Solche cDNAs haben den Vorteil dass man sie wie andere DNA Molek le ver ndern bzw rekombinieren kann Da cDNAs in der Regel f r ein Protein kodieren kann man cDNAs verwenden um Proteine in Bakterien Hefen oder S ugetierzellen rekombinant zu exprimieren Heutzutage werden die meisten therapeutischen Proteine rekombinant hergestellt Beispiele sind humanes Insulin Erythropoetin Faktor VIII Protein Granulozyten Colony Stimulating Factor G CSF und l slicher Tumornekrosisfaktor Rezeptor Diese Proteine sind heute vielfach verabreichte Therapeutika Rekombinante Proteine Wie oben bereits erw hnt lassen sich humane Proteine auch in anderen Organismen exprimieren Dazu werden sehr h ufig Bakterien oder auch Hefen verwendet Die untenstehende Tabelle gibt einen berblick ber therapeutisch eingesetzte Proteine
59. 9 LWEIVEMRKELCNGNSDCMNNDDALAE KLPEIORNDGCYOTGYNOEICLLKISSGLL il6_mouse sw 61 LGKISAMRKEMCEKYEKCENSKEVLAE PKMAEKDGCFOSGFNOETCLMRITTGLV il6_pig sw 59 LREILEMRKELCNGNSDCMNSDDALS KLPEIORNDGCFOTGYNOEICLLKICSGLL il6_rat sw 61 VDKISAIRKEICEKNDECENSKETLAENKLKLPKMEEKDGCFOSGFNOAICLIKTTAGLL il6_sheep sw nF as KERLE RR BRENNER ERG 121 EYQIYLDYLQNEY EGNQENVRDLRKNIRTLIQILKQKIADL ITTPATNTDLLEKM il6_bovin sw 121 EFEVYLEYLONRF ESSEEQARAVOMSTKVLIOFLOKKAKNLDAITTPDP ASLLTKL il6_human sw 119 EYHSYLEYMKNNLKDNKKDKARVLORDTETLIHIFNOEVKDLHKIVLPTPISNALLTDKL il6_mouse sw 121 EFOIYLDYLOKEY ESNKGNVEAVOISTKALIOTLROKGKNPDKATTPNP AGLLDKL il6_pig sw 119 EFRFYLEFVKNNLODNKKDKARVIOSNTETLVHIFKOEIKDSYKIVLPTPTSNALLMEKL il6_rat sw 121 EYOIYLDFLONEF EGNOETVMELOSSIRTLIQILKEKIAGL ITTPATHTDMLEKM il6_sheep sw X RR Pe ER na SA 176 QSSNEWVKNAKIILILRNLENFLQOFSLRAIRMK il6_bovin sw 180 QAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQ il6_human sw 179 ESQKEWLRTKTIQFILKSLEEFLKVTLRSTRQ il6_mouse sw 180 QSQNEWMKNTKIILILRSLEDFLQOFSLRAIRI il6_pig sw 179 ESOKEWLRTKTIQLILKALEEFLKVTMRSTRO il6_rat sw 176 QOSSNEWVKNAKVIIILRSLENFLOFSLRAIRMK i1l6_sheep sw 12 Biochemisches Praktikum Da die dreidimensionale Struktur des humanen IL 6 bekannt ist kann man mit dessen Hilfe ein dreidimensionales Modell f r die anderen Molek le erstellen indem die einzelnen Aminos uren gem ss dem obigen alignment ausgetauscht werden Ein einfaches P
60. Arbeiten unter dem Abzug ist der Frontschieber so weit wie m glich zu schlie en Achtung Die Betriebszeiten der Abz ge sind unterschiedlich und laufen meist nicht ber Nacht F r eine Inbetriebnahme au erhalb der Betriebszeiten die Technische St rungsannahme Tel 2222 anrufen Dies gilt auch f r die Klimaanlage 307 Anhang 4 7 Gefahrstoffe sind so aufzubewahren oder zu lagern dass sie die menschliche Gesundheit und die Umwelt nicht gef hrden Beh ltnisse mit Gefahrstoffen d rfen nur bis zu einer solchen H he aufbewahrt werden dass sie noch sicher entnommen und abgestellt werden k nnen Im Labor d rfen nicht mehr als 10 brennbare Fl ssigkeiten aufbewahrt werden K hlschr nke und K hltruhen in Normalausf hrung m ssen zur Lagerung von brennbaren Fl ssigkeiten umger stet werden Sehr giftige und giftige Substanzen sind unter Verschluss aufzubewahren Alle Gefahrstoffe m ssen vor einem unmittelbaren Zugriff von Betriebsfremden gesch tzt sein R ume beim Verlassen abschlie en Gefahrstoffe die gesundheitsgef hrdende D mpfe abgeben sind an dauerabgesaugten Orten aufzubewahren Nicht die Arbeits fl chen der Abz ge zustellen Chemikalienschrank nutzen Dewardgef e Vakuummantelgef e aus Glas und andere Glasgef e gleichen Wirkungsprinziprs m ssen mit einem Schutzmantel z B berziehen mit Kunststoff ausger stet oder auf andere Weise gegen die Folgen einer Implosion
61. Aufgabe 4 Das in Aufgabe 3 untersuchte Enzym Lactatdehydrogenase LDH ist zugleich das bekannteste Beispiel f r das Ph nomen der Isoenzyme die heute in der klinischen Diagnostik eine gro e Rolle spielen Im dritten Teil des Praktikums Aufgabe 5 werden die Pankreaslipase und ihre Aktivierung durch Gallens uren untersucht Im vierten Teil des Praktikums Aufgabe 6 werden die zeitliche Ver nderung der Glucose Konzentration nach oraler Glucose Belastung und der Zusammenhang der Glucose und Insulin Konzentration im Serum eines fiktiven Patienten untersucht Nachweis von Monosacchariden mit Reduktionsproben c 0 an s i C H c H Carbonyl Form Enol Form Carbonylverbindungen stehen im tautomeren Gleichgewicht mit ihren Enolen Das Gleichgewicht liegt weit auf der Seite der Carbonyl Form Enole sind jedoch ziemlich starke S uren durch Zuf gen von OH Ionen werden sie ionisiert und 98 Biochemisches Praktikum IV dadurch aus obigem Gleichgewicht entfernt Tr gt das der Carbonylgruppe benachbarte C Atom eine OH Gruppe a Ketol Gruppierung wie das bei den Zuckern der Fall ist so gelangt man entsprechend zu Endiolaten H O H OH H o NY cl N OH N HC OH H A Carbonyl Form Endiol Form Endiolat Anion Es ist zu beachten dass die Endiolisierung im alkalischen Milieu nur aus der offenkettigen Form erfolgt dem obigen Gleichgewicht also noch das Mutarotations Gleichgewicht
62. Biochemisches Institut der Christian Albrechts Universit t Biochemisches Praktikum site III Dieses Skript finden Sie auch inklusive der farbigen Abbildungen auf der Internetseite des Biochemischen Institutes unter www uni kiel de Biochemie unterverzeichnisse teaching undergrdent practical main html Inhaltsverzeichnis Biochemische Informatik 1 Nukleins uren 18 Proteine Aufbau Eigenschaften und Funktionen 50 Kohlenhydrate und Lipide Aufbau Eigenschaften und Funktionen 96 Blut H moglobin Eisenporphyrine Eisenstoffwechsel Blutgerinnung glyciertes H moglobin 143 Leber und Leberstoffwechsel Aminos uren Nukleotide H moglobin Cholesterin Lipoproteine Serum Enzymdiagnostik173 Regulation des Stoffwechsels Hormone 223 Biochemie des Immunsystems 264 Umgang mit Gefahrstoffen 291 Bedienungsanleitung f r Eppendorf Pipetten 314 Gentechnologische Arbeiten 315 GEFAHREN UND GEFAHRENBEZEICHNUNG 315 SCHUTZMASSNAHMEN UND VERHALTENSREGELN 315 VERHALTEN IM GEFAHRFALL 315 ERSTE HILF 316 SACHGERECHTE ENTSORGUNG 316 Biochemisches Praktikum BIOCHEMISCHES PRAKTIKUM I Biochemische Informatik Aufgabe 1 Allgemeine Information zu Interleukin 6 Aufgabe 2 cDNA und Restriktionskarte von Interleukin 6 Aufgabe 3 Aminos uresequenzen von Interleukin 6 und gp 130 Aufgabe 4 Sequenzvergleich verschiedener Insuline Aufgabe 5 Polymerase Ketten Reaktion Aufgabe 6 Single Nucleotide Polymorphisms SNPs Christian Albrec
63. EO EEL OLEETO EEE OLETTO DIE oe in 240 260 280 300 320 340 360 380 400 Der molare Extinktionskoeffizient von NADH und NADPH betr gt bei 366 nm 366 _ 3 p 1 M_ 2 1 ine o o mol cm 3 3 cm4 umol Man ben tigt also f r den optischen Test in der Regel 1 ein Pyridin Adenin Dinucleotid abh ngiges Enzym 2 dessen Substrat 3 Pyridin Adenin Dinucleotid NAD H NADP H als Cosubstrat Liegt das Gleichgewicht auf der Seite des oxidierten Substrats so wird die Reaktion mit reduziertem Substrat und oxidiertem Pyridinnucleotid NAD NADP gestartet und die Zunahme an reduziertem Cosubstrat NADH NADPH bestimmt Wenn da gegen das Gleichgewicht auf der Seite des reduzierten Substrats liegt startet man die Reaktion mit oxidiertem Substrat und reduziertem Cosubstrat NADH NADPH und bestimmt die Abnahme an reduziertem Pyridinnucleotid Viele Enzyme die nicht direkt mit den Pyridinnukleotiden reagieren k nnen mit dem optischen Test erfasst werden indem sie mit einer Pyridinnucleotid abh ngigen Re aktion Indikatorreaktion gekoppelt werden Zwischen Haupt und Indikatorreaktion 179 Biochemisches Praktikum VI k nnen noch ein bis mehrere Hilfsreaktionen eingeschoben sein Hierbei muss die Hauptreaktion Geschwindigkeits bestimmend sein Die Hilfsreaktion soll mit 100 fach die Indikatorreaktionen mit 1000 fach h herer Geschwindigkeit ablaufen als die Hauptreaktion Ein Beispiel f r einen gekoppelten o
64. Ecke mit einem Kugelschreiber mit dem Namen versehen danach an einem Ende erfasst und mit dem freien Ende voran vorsichtig auf die Pufferl sung gelegt wobei keinesfalls Luftblasen zwischen dem Streifen und dem Puffer bleiben d rfen Nach mindestens 10 Minuten ist der Streifen ausreichend mit Puffer vollgesogen Er wird dann mit Hilfe der Pinzetten kurz zwischen zwei Filterpapieren von bersch ssigem Puffer befreit und danach ber die u eren Falze der Elektrophoresekammer gespannt siehe Abbildung 13 Fixiert wird der Streifen rechts und links durch zwei kleine Magnete Die Folienenden m ssen unbedingt in die Pufferl sung in beiden Teilkammern eintauchen 80 Biochemisches Praktikum Ill Die Elektrophoresekammer wird nach Einlegen des Streifens bis zum Auftragen des Serums durch den Deckel der Kammer geschlossen gehalten um ein Austrocknen des Celluloseacetat Streifens zu vermeiden Sobald alle Arbeitsgruppen eines Tisches ihre Streifen in die Elektrophoresekammer gebracht haben werden die Serumproben unmittelbar nacheinander auf jeden Streifen aufgetragen Hierzu wird eine Auftragsbr cke ber den Streifen gesetzt so dass die Farbmarkierungen an der Br cke mit denen an der Elektrophoresekammer bereinstimmen Die Aussparung am schwarz markierten Ende der Auftragsbr cke muss in den Falz einrasten Zum Auftragen der Probe wird ein Auftragsstempel benutzt Bei Druck auf dessen Taste bis zum Anschlag ragt an seiner Unters
65. Extinktions nderung At Messzeitraum Minuten E molarer Extinktionskoeffizient cm mol 1000 der zu messenden Substanz Extinktion einer 1 M L sung dieser Substanz in K vetten mit 1 cm Wegl nge d Schichtdicke der K vette meist 1 cm Vg Gesamtvolumen des enzymatischen Ansatzes bei der Messung von E in ml Vp Volumen der in den Ansatz gegebenen Enzymprobe in mi Ein Faktor 1000 ergibt sich da s in Liter dagegen die Aktivit t in ml angegeben ist Dividiert man die Enzymeinheiten ml U ml durch die Proteinkonzentration mg ml so erh lt man die spezifische Aktivit t spezifische Aktivit t mg Protein Die Proteinkonzentration ist durch ein gesondertes Bestimmungsverfahren z B Biuret zu ermitteln Zellnomogenate ergeben niedrige spezifische Aktivit ten in reiner Form isolierte Enzyme die maximal m glichen Somit dient die spezifische Aktivit t bei der Anreicherung und Reindarstellung von Enzymen als Kontrollgr e 59 Biochemisches Praktikum Ill Abh ngigkeit der Enzymaktivit t von der Substratkonzentration l Kinetisches Modell nach Michaelis und Menten Ein einfaches Reaktionsschema das auf enzymatische Reaktionen anwendbar ist wurde von Michaelis und Menten vorgeschlagen k k 1 E S ES gt E P k Das Substrat S bindet in einem ersten Schritt an das aktive Zentrum des Enzyms E und bildet den Enzymsubstratkomplex ES In einem zweiten Reaktionsschritt wird das im En
66. LDL Cholesterins verwendet In entsprechend beschriftete Reagenzgl ser mit 1 cm Innendurchmesser wird nach folgendem Schema pipettiert Reagenzien Leerwert Probe Aqua dest 20 ul Serum 20 ul Cholesterin Reagenz 1000 ul 1000 ul Nach Mischen werden Reagenzien Leerwert und Probe 10 min bei 20 25 Raumtemperatur inkubiert Nach der Inkubation werden die Ans tze durch Zugabe von 1000 ul Wasser verd nnt Der entstehende Farbstoff ist ca 1 h lang stabil innerhalb dieser Zeit wird die Extinktion der Probe gegen den Reagenzien Leerwert bei einer Wellenl nge von 546 nm bei 1 cm Schichtdicke gemessen 201 Biochemisches Praktikum VI Reagenzien Cholesterin Reagenz Konzentrationen in der gebrauchsfertigen L sung PIPES Puffer 75 mM Piperazin 1 4 bis 2 ethansulfons ure pH 6 8 Mg 10 mM 4 Aminophenazon gt 0 15 mM Natriumcholat 0 2 mM Phenol 2 42 mM Fettalkoholpolyglykolether 1 Cholesterinesterase Pseudomonas spec 2 0 5 U ml Cholesterinoxidase E coli 2 0 15 U ml Peroxidase Meerrettich 2 0 25 U ml Stabilisatoren und Konservierungsmittel Auswertung Bestimmen Sie die Konzentration des Cholesterins in der Probe in mg dl und mmol l Ccao mmol l 22 06 Eprobe 546 nm Bestimmung des HDL Cholesterins In ein 1 5 ml Eppendorf Gef e werden 40 ul Serum und 100 ul F llungsreagenz HDL C gegeben Nach Mischen l t man 10 min bei Raumtemperatur stehen und zentrifugiert dann 2 min bei 10 000 g Nach Z
67. NA Pr parates bezeichnet Die Schmelztemperatur Tm steigt a mit dem GC Gehalt der DNA und b mit der lonenst rke der L sung Langsame Abk hlung einer denaturierten DNA L sung f hrt bei ausreichender lonenst rke zu relativ weitgehender R ckpaarung Reassoziation der komplement ren Str nge rasche Abk hlung nicht Je mehr identische repetierende Sequenzen eine DNA enth lt desto schneller reassoziiert sie Physikalische Grundlagen zur Photometrie Das Prinzip der Photometrie beruht auf der Tatsache dass Licht von bestimmten Stoffen entweder emittiert Emissions Flammenphotometrie oder abgeschw cht Absorptionsphotometrie werden kann und dass eine Proportionalit t zwischen der Konzentration dieser Stoffe und der Lichtemission bzw absorption besteht Daher l sst sich ber die Messung der Lichtintensit t mit Hilfe von Photozellen in einfacher Weise eine Konzentrationsbestimmung durchf hren Photometrische Verfahren auf der Basis der Absorptions Photometrie spielen heute in der modernen biochemischen und klinisch chemischen Analytik eine berragende Rolle Da sich diese Methode leicht automatisieren l sst ist sie nicht nur f r manuelle Einzelbestimmungen wertvoll sondern findet auch bei den gro en Analyseautomaten z B Aminos ure Analysator Verwendung Da die Lichtabsorption einer L sung durch die einzelnen Molek le des gel sten absorbierenden Stoffes bewirkt wird ist die Gesamtabsorption von der Konzentration
68. Proteine mit bekannter bzw unbekannter Struktur verglichen es wird ein sogenanntes Alignment angefertigt Dieses kann auch aus mehreren Sequenzen der gleichen Proteinfamilie bestehen siehe unten ein Alignment des Interleukin 6 von verschiedenen Species 1 SRFTSAFTPFAVSLGLLLVMTSAFPTPGPLGEDFKNDTTPGRLLLTTPEKTEALIKRM il6_bovin sw 1 SFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHROPLTSSERIDKOIRYI il6_human sw 1 MKFLSARDFHPVAF LGLMLV AFPTSOVRRGDFTEDTTPNRPVYTTSQ VGGLITHV il6_mouse sw IE SLSTSAFSPVAFSLGLLLVMATAFPTPGRLEEDAKGDATSDKMLFTSPDKTEELIKYI il6_pig sw 1 MKFLSARDFOPVAF LGLMLLTATAFPTSOVRRGDFTEDTTHNRPVYTTSO VGGLITYV il6_rat sw al SLFTSAFSPLAVSLGLLLVMTSAFPTPGPLGEDFKNDTTPSRLLLTTPEKTEALIKHI il6_sheep sw S E kxk x k kx 61 VDKISAMRKEICEKNDECESSKETLAENKLNLPKMEEKDGCFOSGFNOAICLIRTTAGLL il6_bovin sw 61 LDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAE PKMAEKDGCFOSGFNEETCLVKIITGLL il6_human sw 5
69. SS SSS Biochemisches Praktikum IV Citratcyclus Hauptort der Energiegewinnung einer Zelle sind die Mitochondrien In ihnen laufen der Citratcyklus und die Atmungskette ab Der Citratcyklus ist eine cyklische Kette von enzymkatalysierten Reaktionen Er dient einmal als Endstrecke f r den Abbau aller Nahrungsstoffe Dabei wird aus diesen CO gebildet und die f r den Energiegewinn in der Atmungskette ben tigten reduzierten wasserstoffbeladenen Coenzyme NADH H FADH 3 u a bereitgestellt Im Citratcyklus kann auch das bei der aeroben Glycolyse aus Glucose gebildete Acetyl CoA abgebaut werden Weiterhin stellen die Metaboliten des Citratcyklus ein Sammelbecken pool f r Zwischenprodukte des Stoffwechsels z B des Aminos urestoffwechsels dar Ein wichtiger Energie liefernder Schritt im Citratcyklus ist die Oxidation von Succinat zu Fumarat wobei FADH gebildet wird Aufgabe 4 Die Atmungskette dient der Oxidation der reduzierten Co Substrate NADH H und FADH des Stoffwechsels unter Bildung von ATP als Energietr ger Sie ist die wichtigste Energie Lieferantin im Organismus ber eine Reihenfolge von Redoxsystemen organischen Verbindungen deren Oxidations und Reduktionszustand unterschiedliche Energieinhalte haben wird der Wasserstoff der reduzierten Co Substrate unter Bildung von Wasser auf Sauerstoff bertragen und die Energie der Wasserbildung durch die oxidative Phosphorylierung in Form von ATP abgesch pft Die Atmungskett
70. Serumproteine auf Celluloseacetatfolie bei pH 8 8 elektrophoretisch getrennt werden Da bei diesem pH Wert mit Ausnahme einiger weniger Immunglobuline alle Serumproteine zur Anode wandern wird das Serum nahe der Kathode aufgetragen Die Streifen werden nach der Elektrophorese einer allgemeinen Proteinf rbung unterzogen Ben tigte Materialien Tris Barbiturat Puffer 66 mM Barbiturs ure ad 1000 mi mit Tris Tris hydroxymethyl Jaminomethan eingestellt auf pH 8 8 Celluloseacetat streifen Serum Verschiedene unverd nnte Seren in Tropfen auf Objekttr gern werden im Verlauf des Kurses ausgeteilt F rbel sung Amidoschwarz in Eisessig Methanol Gemisch 2 x Entf rbel sung Eisessig Methanol Gemisch ohne Amidoschwarz 79 Biochemisches Praktikum Ill Durchf hrung Achtung Bitte die Vorschrift vor Arbeitsbeginn bis zum Ende durchlesen Die Celluloseacetat Streifen bitte ausschlie lich mit Pinzetten ber hren Die Abnahme des Deckels von der Elektrophoresekammer hat automatisch eine Unterbrechung des Stromflusses zur Folge Die Elektrophoresekammer muss derart mit Puffer gef llt sein dass der Celluloseacetat Streifen Elektrode Elektrode Abbildung 13 Schematische Ansicht einer Elektrophoresekammer Pufferpegel in beiden Teilkammern gleich hoch steht Dies wird durch einseitiges Anheben einer Schmalseite der Elektrophoresekammer erreicht Der wei e Celluloseacetat Streifen wird an einer
71. Stoffes Gas Dampf oder Schwebstoff in der Luft am Arbeitsplatz welche die Gesundheit der Besch ftigen nicht beeintr chtigt Dies gilt auch bei wiederholter und l ngerfristiger in der Regel t glich 8 st ndiger Exposition jedoch bei Einhaltung einer durchschnittlichen Wochenarbeitszeit von 40 Stunden Messungen werden von der Abteilung Sicherheitsingenieur Tel 1550 Bei Betriebsschluss sind die Arbeitspl tze zu sichern z B schlie en der Gas und Wasserh hne ziehen der Netzstecker verschlie en der giftigen Chemikalien Licht l schen etc 310 Anhang 5 Verhalten im Gefahrfall Notruf 112 Notrufnummer f r Feuer Unfall von jedem Telefon des Universit tsklinikums e Bei Notf llen durch elektrischen Strom ist sofort der Not Aus Schalter zu bet tigen e Bei Versch ttung von fl ssigen Gefahrstoffen Aufsaugmittel verwenden Im Arbeitsbereich muss ein Vorrat an Bindemitteln bereitgehalten werden Bei Versch tten gro er Mengen tzender Fl ssigkeiten Raum verlassen T ren schlie en und Notruf bet tigen e Bei St rungen an den Abz gen oder der Klimaanlage ist die technische St rungsannahme Tel 2315 zu verst ndigen Jeder Besch ftige muss vor Arbeitsbeginn wissen wo sich die Erste Hilfe Einrichtung befinden Personenschutz geht immer vor Sachschutz Bei allen Unf llen ist das Aufsichtspersonal und die sich im Arbeitsbereich aufhaltenden Personen zu inform
72. V Stichworte Struktur von H m H moglobin Myoglobin Adult und Fetalh moglobin Hb Cyanid und CO Hb Met H moglobin e Peroxidasen Katalase Cytochrom c Cytochromoxidase H m Synthese und ihre Regulation Porphyrien lonenaustauschchromatographie Gelchromatographie Transferrin Ferritin Coeruloplasmin Eisenhaushalt Blutgerinnung Gerinnungsfaktoren Thromboplastinzeit Thrombinzeit Hemmstoffe der Gerinnung Vitamin K Blutglucose Glycierung von H moglobin Diabetes 144 Biochemisches Praktikum V Einleitung Grundlagen Das Blut besteht aus zellul ren Elementen Erythrozyten Granulozyten Lymphozyten Thrombozyten und einer w ssrigen L sung dem Blutplasma das Proteine und anorganische Bestandteile enth lt Neben den Funktionen die sich aus seiner Rolle als Transportorgan f r Gase Wasser Elektrolyte N hrstoffe und Hormone sowie f r die Schlackenausscheidung ableiten lassen besitzt das Blut durch seinen Leukozyten und Antik rpergehalt wichtige Eigenschaften zum Schutz des K rpers vor Krankheitserregern und deren Produkten Au erdem enth lt es neben pH Wert regulierenden Puffersystemen das Gerinnungssystem dessen biologische Bedeutung im Schutz des K rpers vor Blutverlusten bei Verletzung der Gef e besteht Da das Blut mit allen K rperzellen in direktem oder indirektem Kontakt steht spiegelt die Zusammensetzung des Blutes in vielf lt
73. Zur nachfolgenden Tabelle ad 1 Ausbleiben der durch die Uroporphyrinogen Cosynthetase bewirkten Isomerisierung f hrt zur stark vermehrten Produktion von Porphyrinen der Reihe regelm ig alternierende 2 und 3 Seitenketten die weder Eisen Aufnehmen noch wieder abgebaut werden k nnen und durch ihre Lichtabsorption und Fluoreszenz Lichtdermatosen a verursachen N pa Normalerweise machen A bersch ssige Bolyhaptene diese Porphyrine unter 0 1 der HbA Ic Antik rper 4 gesamten Syntheseprodukte aus ad 2a Absinken der H m lt Y gt Konzentration f hrt zur Antik rper Polyhapten Komplex allosterischen Aktivierung und Derepression von ALA Synthetase Klinisch bestehen keine Lichtdermatosen die vorherrschenden neurologischen Symptome sind vermutlich durch Hemmwirkung von amp Aminol vulinat und Porphobilinogen auf Membran transportvorg nge und pr synaptische bertragung zur ckzuf hren Induktoren der ALA Synthetase Barbiturate Kontrazeptiva u a l sen Anf lle aus Glucose hemmt die Induzierbarkeit des Enzyms 165 Biochemisches Praktikum V ad 2b Die Enzymschw che bleibt ohne Belastung durch Arzneimittel vor allem Alkohol aber auch strogene Chloroquin nicht Barbiturate meist latent Die Dermatosen sind nicht eindeutig lichtabh ngig Symptomatische Porphyrien mit hnlichen klinischen Erscheinungen werden bei Vergiftung mit Blei Phosphor Quecksilber und Hexachlorbenzol auch ohn
74. al Nature Genetics 2007 Biochemisches Praktikum I Table 26 Disease genes positionally cloned using the draft genome sequence Locus BRCA2 AIRE PEX1 PDS XLP DFNAS ATP2A2 SEDL WISP3 CCM1 COLT1A2 DFNA13 LGMD 2G EVC ACTN4 SCNTA AASS NDRG1 CNGB3 MUL USHTC MYH9 PRKARTA MYH9 SCA10 OPA1 XLCSNB FGF23 Disorder Breast cancer susceptibility Autoimmune polyglandular syndrome type 1 APS1 or APECED Peroxisome biogenesis disorder Pendred syndrome X linked Iymphoproliferative disease Nonsyndromic deafness Darier s disease X linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda Progressive pseudorheumatoid dysplasia Cerebral cavernous malformations Nonsyndromic deafness Limb girdle muscular dystrophy Ellis Van Creveld syndrome Weyer s acrodental dysostosis Familial focal segmental glomerulosclerosis Generalized epilepsy with febrile seizures plus type 2 Familial hyperlysinaemia Hereditary motor and sensory neuropathy Lom Total colour blindness Mulibrey nanism Usher type 1C May Hegglin anomaly Camey s complex Nonsyndromic hereditary deafness DFNA17 Spinocerebellar ataxia type 10 Optic atrophy X linked congenital stationary night blindness Hypophosphataemic rickets Giant axonal neuropathy Triple A syndrome Schwartz Jampel syndrome Reference s 55 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 41
75. ale Immunit t Diese wird erreicht 267 Biochemisches Praktikum VIII indem die Antik rper an das Antigen beispielsweise eine Bakterienzelle binden und dadurch sekund re Effektormechanismen ausl sen Meistens vermitteln diese den eigentlichen Schutz nicht die Antik rper allein Die beiden wichtigsten sekund ren Effektormechanismen sind 1 die Aktivierung des Komplementsystems welches bewirkt da das Bakterium Iysiert wird und 2 die Bindung des mit Antik rpern beladenen Antigens an Makrophagen Dies geschieht ber sog Fc Rezeptoren das sind Rezeptoren in der Zellmembran f r den Fc Teil eines Antik rpers s u in der Membran der Makrophagen Diese k n nen das Antigen dadurch sehr viel effektiver aufnehmen phagozytieren und an schlie end unsch dlich machen Da Makrophagen auch Rezeptoren f r Kom plementfaktoren besitzen wird die Phagozytose von Antigen Antik rper Komplexe noch zus tzlich durch Komplementfaktoren gesteigert die an die Komplexe gebunden sein k nnen Die St rke einer Immunantwort kann unspezifisch auch gegen schwache Immuno gene erh ht werden indem man es mit Zusatzstoffen sog Adjuvantien injiziert Dies nutzt man bei Schutzimpfungen aus indem der Impfstoff oftmals mit einem Adjuvans verabreicht wird Solche Adjuvantien k nnen sein Aluminiumsalze Lipopoly saccharid von gram negativen Bakterien Mineral l wie beim Freund schen Adjuvans u a Somatische Rekombination und Klo
76. ang zwischen den membranst ndigen Enzymen Adenylatcyclase und Phosphodiesterase soll hier anhand von Membranen von H hnererythrozyten untersucht werden Als kernhaltige Zellen enthalten Erythrozyten von V geln noch das Adenylatcyclase Phosphodiesterase System im Gegensatz zu Erythrozyten von S ugetieren In diesem Reagenzglasversuch wird die Adenylatcyclase Aktivit t durch Substratdruck mit einer unphysiologisch hohen ATP Konzentration erreicht Diese bewirkt eine cAMP Syntheserate die mit der im Organismus durch einen aktivieren Hormon Rezeptor Komplex erreichten vergleichbar ist Das so entstandene cAMP wird aber gleich wieder durch die Phosphodiesterase zu 5 AMP abgebaut In diesem Versuch soll die Wirkung des Purink rpers Theophyllin 1 3 Dimethyl Xanthin sehr hnlich zu Coffein auf die Phosphodiesterase untersucht werden Durch eine Hemmung bliebe das cAMP l nger erhalten und die Hormonwirkung hier durch die hohe ATP Konzentration simuliert w rde verst rkt Prinzip der Nachweisreaktion Bestimmung des 5 AMP Das durch die Phosphodiesterase entstandene 5 AMP tritt nur in sehr geringen Konzentrationen auf Diese lassen sich jedoch indirekt durch folgenden Mechanismus bestimmen Als ein zentrales Enzym im Glykogenabbau unterliegt die Glykogenphosphorylase einer mehrfachen Regulation siehe Abbildung 4 Auf die aktivierende kovalente Modifikation Phosphorylierung zu Gilykogenphosphorylase a wurde bereits eingegangen Eine we
77. aure L sung von 4 Dimethylamino benzaldehyd bestimmt werden Die Resultate sind aber nicht sehr genau f r zuverl ssige Untersuchungen muss die Substanz zuerst isoliert werden Zur Isolierung von Porphobilinogen wie auch von Aminol vulins ure wird heute die lIonenaustauscher Chromatographie auf DOWEX nach MAUZERALL und GRANIK oder eine HPLC Methode Hochdruckfl ssigkeitschromatographie mit einem daf r geeigneten Anionentauscher verwendet Zur Methode des lonenaustausches Bei Adsorptionsvorg ngen die auf der Anziehung heteropolarer Teilchen beruhen kann eine Abl sung auch durch Austausch erfolgen Dabei werden die gebundenen Teilchen lonen an das Medium abgegeben und an deren Stelle andere dem System zugef gte lonen gebunden Dieser Vorgang hei t Tauschadsorption Die Einf hrung von Kunstharz Polyelektrolyten hat den Anwendungsbereich der Tauschadsorption wesentlich erweitert Kunstharz lonenaustauscher werden heute in der Medizin f r verschiedene Zwecke benutzt als Medikament zum Entzug von Kalium in der Diagnostik zur sondenlosen Funktionspr fung der Magensaftsekretion oder in der Di tetik zur Herstellung kalziumarmer Milch lonenaustauscher sind hochmolekulare Polyelektrolyte z B Polystyrolharze Polyacryls ure Polyvinylverbindungen bestehend aus einem vernetzten Ger st an welchem die Ladungen fixiert sind Fest lonen Je nach Art dieser Gruppen unterscheidet man Kationen oder Anionenaustauscher Die hete
78. ausgeh ngten Pl nen Biochemie Altbau bzw Internet Ein Tauschen der Gruppen ist prinzipiell nicht m glich Wer ein Seminar vers umt muss ein rztliches Attest vorlegen In diesem Falle wird das Seminar nicht an einem anderen Tag nachgeholt und es liegt in der Verantwortung des Studenten den vers umten Lehrstoff nachzuholen 2 Erfolgskontrolle der Biochemie Seminare f r Humanmediziner Voraussetzung f r den Leistungsnachweis ist die aktive Teilnahme an allen Seminaren im 2 3 und 4 Semester und das Bestehen der Seminarklausur im 3 Semester Die Klausur gilt als bestanden wenn mindestens 21 Punkte von 35 m glichen erreicht werden 3 Das Direktorium des Biochemischen Institutes beh lt sich vor dass in besonderen H rtef llen Studierende zu einer Nachpr fung zugelassen werden k nnen
79. aussetzung f r eine positive Reaktion nach Trommer ist geben einige Zuckerphosphate welche die Reaktion nicht Ascorbins ure ist ein nat rliches Redukton und reagiert daher erwartungsgem bereits in der K lte Nachweis von St rke zu Aufgabe 1 Ein direkter sehr empfindlicher Nachweis von Polysacchariden mit a glycosidischer Verkn pfung St rke Glycogen ist durch molekulares Jod J gt m glich Das Jod lagert sich in die spiraligen Kettenstrukturen ein Einschlussverbindung Clathrat Amylose gibt eine blaue Amylopectin und Glycogen eine braune F rbung Spezifische Nachweise f r Glucose auf enzymatischem Wege a ber Glucose 6 phosphat Glucose wird mit Hexokinase ATP ADP GHOR aa BE o zu Glucose 6 HO OH HO OH phoshat umgesetzt ki OH Hexokinase OH Glucose Glucose 6 phosphat ADP letzteres zum Glucose 6 phosphat Dehydrogenase NADP 6 Phospho glucono K NADPH H lacton oxi diert Das hier wirksame 6 Enzym Glucose 6 S o phosphat Ho o Dehydrogenase ist absolut 100 Biochemisches Praktikum IV substratspezifisch Die Reaktion ist im K rper einer der wenigen Lieferanten von NADPH H b direkte Oxidation siehe Aufgabe 2 Aus Pilzen gewonnene mit dem Coenzym FAD arbeitende Enzyme Glucose Oxidasen werden in den Glucoseteststreifen verwendet Eine angeschlossene Reaktion in der entstehendes H202 zur enzymatischen Umwandlung einer Farbstoff Vorstufe in die farbige Verbindu
80. ben die andere zum erhitzten Speichel 4 Nach Durchmischen der Proben werden die Reagenzgl ser 10 Minuten bei 37 C inkubiert und danach abgek hlt 5 F r die Jod St rkereaktion werden je 1 ml der Proben mit 50 ul Jod Jodkaliuml sung versetzt und durchmischt 6 F r die Trommer sche Probe wird je 1ml Probel sung in einem Reagenzglas kein Kunststoff R hrchen mit 0 5 ml Natronlauge und 20 ul Kupfersulfat L sung versetzt und anschlie end ber der Flamme erhitzt Tragen Sie eine Schutzbrille und halten Sie die R hrchen ffnung nicht auf sich oder andere Bei Gegenwart reduzierender Substanzen entsteht eine Gelb bis Rotf rbung 116 Biochemisches Praktikum IV Aufgabe 2 Nachweis der Blutgruppendeterminanten des ABO Systems mit Glycosidasen Von jedem Tisch ist dieser Versuch nur einmal durchzuf hren Es soll bestimmt werden welche Stoffe f r die Blutgruppenaktivit t verantwortlich sind und in welcher Konformation sie vorliegen Ben tigte L sungen Blut der Blutgruppe 10 ul Vollblut der Blutgruppe B B 10 ul Maleatpuffer pH 6 5 ohne Enzym Blut der Blutgruppe 10 ul Vollblut der Blutgruppe B B 10 ul oa Galactosidase in Maleatpuffer pH 6 5 mit Enzym Antiserum Anti B Durchf hrung 1 Je 10 ul Vollblut der Blutgruppe B wurden mit 10 ul Maleatpuffer Kontrolle bzw 10 ul a Galactosidase in Maleatpuffer In Eppendorf Reagenzgef en gemischt Diese fertigen Proben k nnen Sie in de
81. ber den Streifen gesetzt so dass die Farbmarkierungen an der Br cke mit denen an der Elektrophoresekammer bereinstimmen Die Aussparung am schwarz markierten Ende der Auftragsbr cke muss in den Falz einrasten Zum Auftragen der Probe wird ein Auftragsstempel benutzt Bei Druck auf dessen Taste bis zum Anschlag ragt an seiner Unterseite eine se heraus Deren Unterseite wird mit der jeweiligen Serumprobe ausreichend benetzt indem sie horizontal ber die Oberfl che eines Serumtropfens gestreift wird Der sensteg darf nicht in das Serum eintauchen Folgende Serumproben werden zur Verf gung auf die entsprechende Bahnen aufgetragen Bahn 1 Normalserum Bahn 2 pathologisches Serum Bahn 3 Vergleichspr parat LDH Isoenzyme vom Schwein 119 11 Biochemisches Praktikum IV Nach dem Benetzen soll die Taste langsam in die Ausgangsstellung zur ckgleiten Der Auftragsstempel wird mit der vorderen Nut in das mit 1 gekennzeichnete Loch der Auftragsbr cke gesetzt danach die Taste erneut gedr ckt so dass das an der se haftende Serum auf den Celluloseacetat Streifen bertragen wird Je Probe wird dieser Vorgang dreimal wiederholt Sofort danach wird die se nur diese mit Aqua bidest gesp lt und mit Filterpapier trockengetupft Nach Beendigung des Auftragens wird die Elektrophoresekammer mit dem Deckel so verschlossen dass seine Markierung mit der der Elektrophoresekammer bereinstimmt Die Zuleitungen werden an die gek
82. bgase stark belastet sind z B Taxifahrer 146 Biochemisches Praktikum V H m COOH COOH Abb 1 Struktur des H m Globin Das Globin die Proteinkomponente des Hb ist ein schwach basisches Protein Das Hb Molek l enth lt jeweils 2 Paare genetisch verschiedener Polypeptidketten z B Hb Ao a und Ketten von denen jede ber einen His Rest mit 1 H m assoziiert ist Die besondere Terti rstruktur des Globins schafft die Voraussetzung f r die erfolgreiche Wirkungsweise in 4 H meinheiten im Hb Schon kleinste Unterschiede in der Prim rstruktur des Globins haben eine signifikante nderung der Eigenschaften des Hb O gt Bindungsm glichkeit L slichkeit usw zur Folge Au erdem ben die Globinketten eine Stabilisatorwirkung auf das leicht oxidierbare H meisen aus F llt diese z B bei Denaturierung weg tritt sofort ein Valenzwechsel von Fe zu Fe ein der zu einem Verlust der O gt Bindungsf higkeit f hrt Die verschiedenen H moglobinarten unterscheiden sich ausschlie lich in der Proteinkomponente Im menschlichen Hb kommen neben den a und Ketten auch und y Ketten vor Jedes physiologische Hb enth lt ein Paar a Ketten und Paar einer der anderen Ketten n mlich HbA Q2 B2 HbA gt Q2 O2 HbF q2 Y2 147 Biochemisches Praktikum V H moglobinopathien Es gibt beim Menschen zahlreiche angeborene St rungen der Globinsynthese Bei qualitativen Ver nderungen ist die H moglobinsyntheserate
83. ch dem unten angegebenen Pipettierschema von jeder Verd n nungsstufe des Ak unverd 1 3 1 9 1 27 1 81 BSS als Kontrolle in Doppelwerten 50 ul in die Vertiefungen der Mikrotiter Platte e die Mikrotiter Platten werden mit dem Deckel verschlossen und f r 30 60 min bei 37 C inkubiert e Kontrollieren Sie danach das Ergebnis in den Platten Wo beobachten Sie Agglutination Protokollieren Sie das Ergebnis 281 Biochemisches Praktikum VIII Pipettierschema Verd nnung unverd Een 127 1181 BSS saec OQO Q monaci a Firc srec s OOOO OQO QOO S 1 Gruppe srec IOOIOIOIOIOO I mona pau Fresse OOOO OQO OOOO 2 Gruppe srec OOOO OOOOOOOO I monas sran Firo sRec OQQQOQOQOQOO S 6 Gruppe SRBC e OOOOQOOQQOOQOQQQQ N monaka FITC SRBC H OOOOOOOOQOOQOQOO J 4 Gruppe schwarz Biochemisches Praktikum VIII Aufgabe 4 Bestimmung von Antik rpern mit der ELISA Technik ELISA bedeutet enzyme linked immunosorbent assay Es gibt verschiedene Variationen dieser Technik die sich durch die spezifischen Erfordernisse bedingt unterscheiden Das Prinzip besteht darin dass eine zu messende Substanz z B Antigen mit einem spezifischen Ak reagiert an welchen kovalent ein Enzym Phosphatase oder meistens Peroxidase gekoppelt ist Die Menge des gebundenen Enzyms ist also der Menge der zu messenden Substanz proportional Im n chsten Schritt wird das Substrat des Enzyms zugegeben Bei gekoppelter Peroxidase si
84. ch im Reagenzglasst nder ca 15 min stehengelassen bis die L sung Raumtemperatur erreicht hat Reaktionsgef 2 verbleibt solange im Eisbad bis von allen drei Ans tzen nacheinander UV Spektren aufgenommen werden k nnen Siehe Aufgabe Nr 1 Auswertung Siehe Anhang 34 Biochemisches Praktikum Il Aufgabe 3 Polymerase Kettenreaktion PCR Wir werden eine PCR Reaktion mit einem Plasmid durchf hren das die humane Interleukin 6 Sequenz enth lt siehe Abb 3 Als Kontrolle werden wir dieselbe PCR Reaktion mit einem Kontrollplasmid durchf hren das keine Interleukin 6 Sequenz enth lt Die verwendeten Primer sollten ein DNA Fragment amplifizieren 525 Basenpaare lang ist siehe Abb 3 Die PCR Reaktionen werden ber eine Gelelektrophorese in einem Agarose Gel analysiert Das PCR Protokoll Folgende Komponenten sind typischerweise Bestandteile eines PCR Reaktionsansatzes 1 5 mM MgCl 10 mM Tris HCI pH 8 3 50 mM KCI je 200 uM dATP dGTP dCTP dTTP enthalten im dNTP Mix 1 U Taq DNA Polymerase Taq Pol Verd nnung 50 ng 1 Primer 50 ng 2 Primer 1 ng Plasmid DNA Jede Gruppe bereitet 2 verschiedene Reaktionsans tze vor einen zum Nachweis von IL 6 cDNA und einen mit einem negativen Kontrollplasmid pRSET 5d ohne IL 6 cDNA Beide Ans tze unterscheiden sich nur im zugegebenen Plasmid s u 35 Biochemisches Praktikum Il Durchf hrung Es werden zwei Ans tze folgenderma en pipettiert a u
85. che in globul ren Proteinen Dipolmoment e L slichkeit von globul ren Proteinen e Denaturierung von Proteinen e Abh ngigkeit der Enzymaktivit t von Zeit pH Wert Temperatur e Substratspezifit t von Enzymen e Hydrolasen Phosphatasen Nukleasen e Kinetisches Modell enzymatischer Reaktionen nach Michaelis und Menten e Abh ngigkeit der Enzymaktivit t von der Substratkonzentration in verschiedenen Darstellungen e Km Vmax e Kompetitive nicht kompetitive Enzymhemmung e Reversible und irreversible Enzymhemmung e Rekombinante Proteine aus Bakterien e Gilaselektrode 51 Biochemisches Praktikum Ill Einleitung Proteine als Polyelektrolyte Isoelektrischer Punkt 22 verschiedene Aminos uren dienen als Bausteine der Proteine Alle Aminos uren tragen am a C Atom eine Carboxylgruppe die in neutraler L sung als S ure wirkt d h ein Proton an das Wasser abgibt und eine basische Aminogruppe die unter gleichen Bedingungen ein Proton aus dem Wasser aufnimmt Im fertigen Protein sind diese Gruppen zu Peptidbindungen verkn pft die weder als S uren noch als Basen wirken Da jedoch einige Aminos uren zus tzlich saure oder basische Gruppen in den Seitenketten tragen enthalten auch die Proteine viele solche Gruppen Ein Protein aus 500 Aminos uren enth lt in neutraler L sung etwa 100 geladene Gruppen haupts chlich Carboxylgruppen in den Seitenketten von Glutamins ure und Asparagins ure sowie die Aminogruppe in der Seitenk
86. cheinander in 5 Reagenzgl ser alle Werte in ml Gesamt direktes Auen Standard Leerwerti _ Leerwert 2 Bilirubin Bilirubin Sulfanils ure 1 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 Natriumnitrit 2 0 02 0 02 0 02 Accelerator 3 1 00 1 00 1 00 Serum 0 20 0 20 0 20 0 20 Standard 5 l 0 20 NaCl 6 2 00 2 00 gut mischen 10 60 min bei Raum temperatur stehen lassen Nach genau 5 min Tartrat NaOH 4 1 00 1 00 1 00 Stoppuhr den Ansatz gut durchmischen nach 10 min den r direktes Bilirubin ge Ansatz f r Gesamt Bilirubin und den jgen den Leerwert 2 bei 1 Standard gegen den Leerwert 1 beil 546 nm im Eppendorf 578 nm im Eppendorf Photometer Notometer messen messen Normalwerte Gesamt Bilirubin bis 1 0 mg 100 ml direktes Bilirubin bis 0 25 mg 100 ml 3 Die Formel ist g ltig da die Extinktionskoeffizienten der Farbkomplexe bei der jeweiligen Wellenl nge ungef hr gleich sind 197 Biochemisches Praktikum VI Aufgabe 5 Bestimmung des Gesamitcholesterins des HDL Cholesterins und des LDL Cholesterins im Serum Cholesterin Die Leber wandelt Cholesterin in seine Ausscheidungsform die Chols ure um die ber die Galleng nge in den Darm ausgeschieden wird Da die Leber das Choleste rin den Lipoproteinen des Serums haupts chlich LDL und HDL entnimmt ist sie auch f r die Regulation des Cholesterinspiegels im Serum wesentlich mitverantwo
87. cher Harzes Dowex 2 Die S ule ist f r den Versuch bereits fertig vorbereitet indem die im Handelspr parat vorhandenen Chloridionen durch Auswaschen mit 3 M Na Acetat L sung entfernt wurden Anschlie end wurde das bersch ssige Na Acetat durch Waschen mit Aqua dest entfernt Das Anionenaustauscher Harz enth lt jetzt als Gegen lonen Acetat Wird Urin mit pH 5 7 auf die S ule gegeben so wird Porphobilinogen mit den 2 Carboxylgruppen pro Molek l adsorbiert w hrend andere Urinbestandteile durchlaufen Das Porphobilinogen wird anschlie end mit Essigs ure eluiert und photometrisch mit einem modifizierten Ehrlich Reagenz bestimmt 157 Biochemisches Praktikum V Modifiziertes Ehrlich Reagenz nach Remington 60 g 4 Dimethylamino benzaldehyd werden in 260 mi konz Salzs ure gel st und mit Eisessig auf 1000 ml verd nnt i CH nA e L CH A H HN CH oe ch COOH CH CH CH ana I Pi N CH 3 H Abb 5 4 Dimethylamino benzaldehyd Porphobilinogen gt rotes Kondensationsprodukt Vorgehen 1 1 ml Urin pH evtl auf 5 7 eingestellt der ausgegebene Harn ist bereits fertig eingestellt mit Eppendorf Pipette 1000 ul auf die S ule geben und 2x je 2 ml Aqua dest nach Sinken des Fl ssigkeitsspiegels in den Bereich der Geloberfl che zuf gen Die Eluate werden verworfen VORSICHT Die S ule nie trocken laufen lassen 2 Das adsorbierte Porphobilinogen wird von der S ule mit 1 ml 1M Essigs ure elui
88. chlossenen Laborkittel festes und geschlossenes Schuhwerk sowie Schutzbrille tragen Zum Pipettieren ausschlie lich Pipettierhilfen benutzen Nicht Mundpipettieren Aerosolbildung vermeiden T ren der Arbeitsr ume w hrend der Arbeiten geschlossen halten Spritzen Kan len und Skalpelle sollen nur wenn unbedingt n tig benutzt werden Benutzte Kan len direkt in die Kan lenabfallbeh lter geben nie in die Schutzh llen zur ckstecken Arbeitsplatz aufger umt und sauber halten Nach Beendigung der Arbeiten und vor Verlassen des Arbeitsplatzes H nde desinfizieren und erst danach mit Wasser und Reinigungsmittel waschen Anschlie end Hautpflege gem Hautschutzplan vornehmen Im Labor nicht Essen Trinken Rauchen Schnupfen Kaugummi kauen oder Kosmetika auftragen keine Nahrungs und Genussmittel sowie Kosmetika aufbewahren Identit t und Reinheit der Organismen ist in regelm igen Abst nden zu pr fen Ungeziefer und bertr ger von GVO sind in geeigneter Weise zu bek mpfen Bei Freisetzung in gro er Menge und Konzentration z B Versch tten Bruch einer Kulturflasche Mitarbeiter warnen und den Projektleiter und den Beauftragten f r die biologische Sicherheit sofort informieren Kontaminierte Gegenst nde oder Oberfl chen sofort in geeigneter Weise reinigen Danach mit Fl chendesinfektionsmittel desinfizieren Einwirkzeiten beachten Zum Wischen und Aufsaugen geeignetes Material z B Zellstoff verwenden 315
89. cht in der Leber syntheti siert werden Akute Phase Proteine a1 Antitrypsin Abetalipoprotein mie 180 Biochemisches Praktikum VI 7 Beschreiben Sie alle Gallens uren salze Entstehung Regulation Konjugation Enterohepatischer Kreislauf Zusammensetzung der Leber amp Blasengalle 8 Zusammen mit Nr 7 Funktion der Gallens uren bei der Fettverdauung Steatorrh Cholestatische Lebererkrankungen und Ikterus Formen 9 Zusammen mit Nr 8 H mabbau Bilirubinbildung und ausscheidung direktes indirektes Bilirubin UTP Neugeborenen Ikterus 10 Glycogengehalt von Leber und Muskel Struktur und Eigenschaft des Glycogens Vergleich zu Energiespeicher Fett Enzyme f r Auf amp Abbau 11 Zusammen mit Nr 12 Hormonelle Regulation des Glycogenstoffwechsels Hom ostase der Blutglucose Gluconeogenese Vorstufen Hypoglyk mie 12 Zusammen mit Nr 11 Glycogenosen Typ I von Gierke Typ Ill Mangel an Fructose1 6 bisphosphatase besondere Ern hrung 13 Aufnahme amp Verstoffwechselung von Galactose aus der Nahrung Lactose intoleranz erbliche Galactos mie Folgeerkrankungen Augensch den 14 Aufnanhme amp Verstoffwechselung von Fructose essentielle Fructosurie heredit re Fructoseintoleranz Aldolase B Zusammenhang Sorbitol Fructose 15 Endprodukte des Purinabbaus Wiederverwertung von Basen Harns ure Gicht Allopurinol Lesh Nyhan Syndrom 16 Pyrimidinabbau als weitgehend leberspezifische Leistung Wiederve
90. ckstand getrennt und f r die Cholesterin Bestimmung S Bestimmung des Gesamtcholesterins eingesetzt Nach 10 min tiger Inkubation mit dem Cholesterinreagenz wird der Ansatz durch Zugabe von 1000 ul Wasser verd nnt und wie oben beschrieben gegen den Leerwert gemessen Dazu wird in entsprechend beschriftete Reagenzgl ser nach folgendem Schema einpippetiert Reagenzien Leerwert Probe Aqua dest 100 ul berstand 100 ul Cholesterin Reagenz 1000 ul 1000 ul Reagenzien 1 Cholesterin Reagenz s Bestimmung des Gesamtcholesterins 2 F llungsreagenz 0 68 g l Heparin 64 mM Natriumcitrat Konservierungsmittel Auswertung Bestimmen Sie die Konzentration des LDL Cholesterins in der Probe in mg dl und mmol l Die Cholesterin Konzentration im berstand berechnet sich nach Ccono mmol l 26 54 Eprobe 546 nm Klinische Interpretation der Laborwerte Die bei der Erhebung des Lipidstatus gewonnenne Werte erlauben eine Entscheidung dar ber ob eine Hyperlipoprotein mie therapiebed rftig Di t 204 Biochemisches Praktikum VI Medikamente ist oder nicht Dabei gelten f r M nner und Frauen die in Tabelle 1 dargestellten Richtwerte 205 Biochemisches Praktikum VI Aufgabe 6 Nachweis von Harnindikan Als Beispiel einer Entgiftungsreaktion sei hier die Entstehung von Harnindikan behandelt Durch bakterielle Eiwei f ulnis wird im Darm aus Tryptophan Indol gebildet Dieses wird resorbiert in der Leber zu Indox
91. ctose Fructose Neuramins ure Disacchariden Saccharose Lactose Polysacchariden St rke Amylose Amylopectin Glycogen Zuckerphosphaten Ascorbins ure ATP ADP AMP NADH H NADPH H FADH2 e Hydrolyse Tautomerie Mutarotation Redoxreaktionen e Funktion von Kinasen Hydrolasen Dehydrogenasen e Wirkung und Spezifit t von Disaccharasen u a Glycosidasen Amylasen e Blutgruppendeterminante Substanzen e Glycoproteine Strukturprinzip Bausteine e Glucose und Insulin Lipide e Fetts uren Triglyzeride Phospholipide e Lipoproteine als Transportvesikel e Lipoproteinstoffwechsel Katabolismus e I soenzyme Definition diagnostische Bedeutung Lactatdehydrogenase e Citratcyclus Glycolyse Atmungskette Milchs ureg rung e Wirkungen von KCN und Entkopplern auf die Atmungskette Methoden e Reduktionsproben auf Zucker e Jodreaktion auf Polysaccharide e Glucose Oxidase Glucose 6 phosphat Dehydrogenase e Elektrophorese e Triacylglycerinspaltung e Gilucosebestimmung 97 Biochemisches Praktikum IV Einleitung Gegenstand des ersten Teils dieses Praktikums sind zun chst Struktur Nachweis Spaltung und Eigenschaften einfacher und zusammengesetzter Kohlenhydrate Aufgaben 1 und 2 Im zweiten Teil des Praktikums werden Aufgaben mit Enzymen durchgef hrt die in zentralen intrazellul ren Abbauwegen eine wichtige Rolle spielen n mlich in der Glycolyse Aufgabe 3 und im Citratcyclus sowie der Atmungskette
92. d w hrend der gesamten Messungen im K vettenhalter des JASCO V 530 Photometers hintere Postition bleibt K vette Nr 2 5 werden nacheinander in den vorderen K vettenhalter gestellt und ein entsprechendes Spektrum wird aufgenommen e K vette 1 1ml Standard Saline Citratpuffer SSC verbleibt im Photometer e K vette 2 5 1 mlNacheinander Nukleotid L sungen A B C D in SSC 2 Das Spektrum soll von 320 220 nm aufgenommen werden Die Bedienung des Photometers wird Ihnen von den Assistenten erkl rt Auswertung Siehe Anhang 33 Biochemisches Praktikum Il Aufgabe 2 W rmedenaturierung von nativer DNA In diesem Versuch soll das Verhalten einer DNA L sung bei Hitzedenaturierung demonstriert werden Ben tigte L sungen SSC 150 mM NaCl standard saline 15 mM Natriumcitrat citrate ad 1000 mi mit Aqua bidest eingestellt auf pH 7 5 DNA L sung angesetzt in SSC Durchf hrung 1 Drei 2 ml Reaktionsgef e Eppi werden beschriftet und wie folgt beschickt Probe Eppi 1 1 ml DNA L sung 1 ml DNA L sung 1 ml DNA L sung Wichtig Schlie en Sie die Reaktionsgef e sorgsam und achten Sie darauf dass der am Deckel befindliche Haken unter den Rand des Reaktonsgef es greift 2 Die Reaktionsgef e 2 und 3 werden f r 15 Minuten in ein 100 C Wasserbad gestellt Danach wird Reaktionsgef 2 sofort anschlie end im Eisbad abgek hlt und Reaktionsgef 3 langsam auf dem Labortis
93. da jede L mit jeder H Kette assoziieren kann betr gt das rechnerische Gesamtrepertoire 1 4 x 10 x 9 x 10 12 6 x 107 oder ca 10 Antik rper mit unterschiedlicher Spezifit t 272 Biochemisches Praktikum VIII Weiterhin kommt hinzu dass jede Rekombination zwischen V und J der L Kette und V D und D J bei der H Kette ziemlich ungenau ist Man sch tzt deshalb dass sich f r jede Verbindung das Repertoire um den Faktor 10 erh ht womit man auf ca 10 M glichkeiten kommt Wichtig ist zu wissen dass das rekombinatorische Repertoire also ohne die somatische Mutation bei der Bildung der B Zellen und analog f r den T Zell Rezeptor bei T Zellen siehe Vorlesung entsteht Antik rperfunktionen Die sch tzende Funktion von Antik rpern beruht darauf dass sie a neutralisierend sein k nnen d h Funktionen des Antigens Toxin Virus Anheftung etc blockieren b die Phagozytose f rdern s o und c Komplement aktivieren s o k nnen Monoklonale Antik rper W hrend jeder Immunantwort werden viele B Zellklone aktiviert und folglich enth lt ein Antiserum immer eine Vielzahl von Antik rpern gegen das Antigen d h ein Antiserum ist so gut wie immer polyklonal Au erdem ist ein Antiserum grunds tzlich nicht f r das induzierende Antigen spezifisch Dies liegt daran dass einmal bei einer Immunantwort vielf ltige Aktivierungen stattfinden und dass zum anderen Antigene oft verwandt sind sich also in ihrer Mole
94. das Gemisch gezogen Sobald ein Fibringerinnsel an der se h ngen bleibt wird die Zeit gestoppt Die Kontrolle der Gerinnungszeit mit Faktor III und Ca nach Quick Thromboplastinzeit besitzt klinische Bedeutung zur Kontrolle einer Antikoagulantien therapie mit Vitamin K Antagonisten Cumarinen 162 Biochemisches Praktikum V Vitamin K abh ngig ist die Biosynthese der Faktoren Il VII X und IX von denen die ersten Drei mit dem Test erfasst werden Da die genannten Faktoren alle in der Leber synthetisiert werden l sst eine Ver nderung der Gerinnungszeit auch eine Sch digung des Leberparenchyms erkennen b Einwirkung von Thrombin Prinzip Der letzte Schritt der Gerinnungskaskade ist die Einwirkung von Thrombin Faktor lla auf Fibrinogen Faktor I Die Protease Thrombin spaltet dabei zwei kleine Peptide Fibrinopeptide A und B von der a bzw B Kette des Fibrinogens ab das entstehende Fibrin gerinnt spontan Pr fen Sie ob die Reaktion Ca2 abh ngig ist oder durch den Gerinnungshemmstoff Heparin einem sulfatreichen Mucopoly saccharid aus Mastzellen Lunge oder Leber beeinflusst wird Ausf hrung Wie bei a auf den Boden von drei Plastikr hrchen nacheinander pipettieren Ansatz 1 Ansatz 2 Ansatz 3 Citratplasma 100 ul 100 ul 100 ul 0 01 M CaCla 100 ul 0 4 U ml Heparin E 100 ul H20 200 ul 100 ul 100 yl 2 min im Wasserbad bei 37 C inkubieren dann mit je 100 ul Th
95. de andere Klasse von Ig sezernierenden Zellen kann man erst durch die zus tzliche Zugabe von Anti Ig Antik rpern sichtbar machen Diese verst rken die Iytische Reaktion der Ak beladenen Erythrozyten die sonst nicht Iysiert werden indirekte PFCs Direkter PFC Test je Gruppe von 2 Studenten 1 2 R hrchen 1 5 mi Reaktionsgef e Eppi mit 0 5 mi Puffer BSS balanced salt solution 50 ml R hrchen in Eis und auch weiter dort belassen 2 in jedes R hrchen je 50 ul einer 1 4 verd nnten SRBC Suspension 25 rote L sung im 1 5 ml Eppi zuf gen 3 in ein R hrchen 20 ul Hybridomzellen F2 gt macht Ak3 in das andere R hrchen 20 ul Hybridomzellen SP2 gt macht Ak4 geben entsprechend beschriften 4 in jedes R hrchen je 50 ul Komplement C aus verd nntem Meer schweinchenserum zuf gen 277 Biochemisches Praktikum VIII 5 aus dem Eisbad nehmen gut mischen und jeweils 100 ul mit Eppendorf Pipet te in Kammern f llen die aus zwei an den Querseiten mit doppelseitigem Klebeband verbundenen Objekttr gern bestehen 6 die L ngsseiten der Kammern werden mit Paraffin unter dem Abzug verschlossen bei 37 C 1 2 Stunden inkubieren Auswertung unter Mikroskop bufisias t Zellsuspension Klebestreifen Wachs Abb 3 Beispiel f r eine bef llte Kammer 278 Biochemisches Praktikum VIII Aufgabe 2 Darstellung von Antigenrezeptor tragenden B Zellen als Rosetten Wi
96. de mit dem Code den Code auf dem auf dem Teststreifenr hrchen Teststreifenr hrchen berpr fen vergleichen Achten Sie darauf dass die drei Wenn der Code auf dem Messger t Kontaktstreifen zu Ihnen zeigen nicht mit dem Code auf dem Dr cken Sie den Streifen soweit wie Teststreifenr hrchen bereinstimmt m glich hinein Der Teststreifen darf dr cken Sie auf A bzw W um die sich nicht biegen Codenummer zu ndern Wenn auf dem Anzeigefeld das blinkende Blutstropfensymbol amp erscheint bevor Sie bereit sind ziehen Sie den Teststreifen heraus und starten Sie den Messvorgang von vorne Das Messger t schaltet sich ein es wird eine Startanzeige und dann eine Codenummer L angezeigt Bei der ersten Verwendung des Messger ts erscheint im Anzeigefeld anstelle einer Nummer Das Messger t ist f r die Messung bereit wenn das blinkende Blutstropfensymbol amp erscheint Blutprobe gewinnen Das OneTouch Lanzettenger tt Blutstropfen gewinnen vorbereiten Halten Sie die Kappe des OneTouch Entfernen Sie die blaue Kappe und Lanzettenger ts fest gegen Ihren _ setzen Sie eine neue Lanzette in Finger Dr cken Sie dann den das Lanzettenger t ein Drehen Sie Ausl ser die Schutzkappe ab Setzen die Kappe wieder auf und spannen Sie das Lanzettenger t Dr cken bzw massieren Sie die Fingerbeere sanft bis sich ein runder Blutstropfen von mindestens einem Mikroliter tats chliche Gr e gebildet
97. durch bevorzugt und st rker aktiviert werden Die verschiedenen B Zellklone kompetieren also mit ihren Antik rpern als Antigenrezeptoren um das Antigen 269 Biochemisches Praktikum VIII Monozyten Makrophagen und dendritische Zellen Diese Zellen besitzen zwar keine Antigenrezeptoren sie helfen aber entscheidend beim Start einer Immunantwort mit Sie k nnen Antigene auch unspezifisch oder mit Hilfe schon vorhandener Antik rper aufnehmen phagozytieren und bauen sie ab Dieser Vorgang wird auch Prozessieren oder processing genannt Der Abbau be wirkt da Proteine in kleine Peptide zerlegt werden Diese werden an Gewebs antigene der Klasse II gebunden welche im Haupthistokompatibilit ts komplex major histocompatibility complex MHC beim Menschen humanes Leukozyten Antigen System HLA System kodiert werden Mit den MHC Il Molek len gelangen die antigenen Bruchst cke wieder auf die Zelloberfl che wo dieser Komplex von T Zellen erkannt werden kann Dies zeigt da Monozyten Makrophagen und v a die professionellen Antigen pr sentierenden Zellen die dendritischen Zellen f r die Induktion einer Immunantwort gegen TD Antigene entscheidend wichtig sind da sie den T Zellen das Antigen pr sentieren und sie damit aktivieren Makrophagen haben au erdem eine gro e Bedeutung als sekund re Effektorzellen s o B Lymphozyten Antik rperstruktur Antik rper Abb 1 n chste Seite bestehen grunds tzlich aus zwei
98. e Durch unregelm ige Verteilung von Ladungen und anderen polaren Gruppen auf der Proteinoberfl che existiert ein r umlicher Abstand zwischen den Schwerpunkten positiver und negativer Ladung im Protein der dieses zum elektrischen Dipol macht Die z T erheblichen Dipolmomente das Produkt aus Ladungsgr e und Abstand der Ladungsschwerpunkte f hren stets zur gegenseitigen Attraktion gel ster Proteinmolek le und m ssen beim L sen eines Proteins berwunden werden Der Dipolattraktion entgegen wirken elektrostatische Absto ungskr fte die durch ber wiegen positiver oder negativer Ladungen an allen Proteinmolek len hervorgerufen werden und eine gr ere Reichweite besitzen als die Dipolkr fte Abbildung 1 L slichkeitskurve eines Proteins in Abh ngigkeit Logarithmus der L slichkeit vom pH Wert im abgebildeten Beispiel ist der Isoelektrische Punkt bei pH 5 01203 4 56 78 9 pH Wert 53 Biochemisches Praktikum Ill Die Zu oder Abnahme der ionisierten Amino und Carboxylgruppen durch nderung des pH Wertes ver ndert die L slichkeit der Proteine Ein Beispiel zeigt Abbildung 1 Am Isoelektrischen Punkt IEP tragen Proteinmolek le in der Regel ein Maximum an Ladungen Entsprechend entwickeln sie ein maximales Dipolmoment das die Aggregation der Molek le untereinander f rdert Au erdem ist am IEP die Zahl positiver und negativer Ladungen gleich so dass die Absto ungskr fte die durch das berwiegen gle
99. e Ovar und l sungen Hoden in Chloroform UV Lampe Versuchsdurchf hrung Plattenvorbereitung Legen Sie die Platte in die Auftragsschablone so dass oberer und unterer Rand genau abschlie en Da die Schichtdicke des Kieselgels an den seitlichen R ndern abnimmt ritzen Sie ca 1 cm von beiden seitlichen R ndern eine durchgehende senkrechte Linie mit Bleistift in die Kieselgelschicht und legen sodann den Auftragsschlitten mit seinen 11 Einkerbungen ber den unteren Rand der Platte Da die Einkerbungen etwa 2 5 cm vom unteren Rand entfernt sind und die Laufstrecke 10 cm betragen soll wird mit Hilfe von Bleistift und Lineal eine weitere horizontale Linie etwa 12 5 cm ber dem unteren Rand in die Kieselgelschicht geritzt Auf dem berstehenden Teil k nnen Beschriftungen wie Name Bahnnummerierung etc angebracht werden 250 Biochemisches Praktikum VII Auftragen der Substanzen Die Steroidl sungen werden mit Hilfe einer Kapillare aufgetragen Je Standard und Gewebeextrakt L sung ist eine eigene Kapilare zu verwenden um eine Kontamination der L sungen untereinander zu vermeiden Die Kapillaren befinden sich jeweils in den R hrchen mit den L sungen Nach dem Eintauchen der Kapillare mit Hilfe einer Pinzette in die Standardl sungen der Steroidhormone werden die Kapillaren nur 1 mal kurz in der entsprechenden Kerbe des Auftragsschlittens auf den Startpunkt getippt wobei der Fleck nicht mehr als 2 3 mm betragen sollte Ein zu
100. e Nr 3 bzw 10 ul H20 zu pipettiert und die Mischung dann 15 min auf Eis inkubiert Es folgt ein Hitzeschock bei 42 C im Wasserbad f r genau 90 Sekunden w hrend dieser Zeit nehmen die Bakterien die Plasmid DNA auf Ob ein Plasmid aufgenommen wurde kann man anhand der Expression der auf diesem Plasmid kodierten Antibiotika Resistenz Gene erkennen Werden solche Resistenz Gene exprimiert so verleihen sie den Wirtzellen eine entsprechende Resistenz Die Bakterien werden anschlie end abgek hlt 2 min auf Eis und je Ansatz mit 100 ul LB Medium versetzt Es folgt eine Inkubationsphase f r 30 min im 37 C Brutschrank w hrend dieser Zeit kann die Plasmidreplikation und die Resistenz Gen Expression anlaufen Danach werden die Bakteriensuspensionen resuspendiert und auf die bereitgestellten Agarplatten welche Ampicillin enthalten ausgestrichen Die Inkubation der Platten erfolgte ber Nacht bei 37 C LB Medium 10g L Trypton Pepton 5g L Hefeextrakt 10 g L Natriumchlorid LB Agar 10g L Trypton Pepton 5g L Hefeextrakt 43 Biochemisches Praktikum Il 10g L Natriumchlorid 1 2 Agar Agar Dem LB Agar wurde vor dem Gie en der Platten Ampicillin in einer Endkonzentration von 50 ug mL beigef gt 44 Biochemisches Praktikum Il Praktische Aufgaben 1 bis 5 Praktikumsgruppe Namen der Praktikanten Aufgabe 1 Kleben Sie hier die UV Spektren ein Beschreiben und diskutieren Sie die UV Spektren Von welchen Nukleotiden k
101. e besteht aus Flavoproteinen Hilfssubstraten Ubichinon und Cytochromen die sich in ihren Redoxbereichen d h in den Energiedifferenzen zwischen ihrem oxidierten und ihrem reduzierten Zustand gegenseitig berlagern und somit ineinandergreifend eine geschlossene Elektronentransportkette darstellen Die Cytochrome sind Eisenporphyrin Proteine in denen im Unterschied zu H moglobin und Peroxidasen das Eisen w hrend des Redoxvorganges einem Valenzwechsel unterliegt Die Oxidationszust nde k nnen durch eine allosterische nderung der Proteinkonformation stabil erhalten werden 107 Biochemisches Praktikum IV Lipide Zu den Lipiden geh ren die unveresterten freien Fetts uren die Triglyzeride Triacylglyzerine Phospholipide und Cholesterin frei und verestert Als weitere Gruppe sind Glykolipide zu nennen Sphingolipide und Ganglioside Triglyzeride liefern mit drei an das Glyzerin gebundenen Fetts uren in der B Oxidation Energie Ein besonders hoher Bedarf an Fetts uren zur Energiegewinnung hat der Muskel Als Energiereserve dienen die im Fettgewebe gespeicherten Fetts uren Phospholipide sind prim r wichtig f r die Membranstruktur aller Zellen Sie sind aber auch wichtig bei der Signal bertragung IP3 sowie in Sphingolipiden und Gangliosiden Cholesterin ist Strukturbestandteil der Zellmembranen und Ausgangssubstanz f r Steroidhormone Vitamin D und Gallens uren Die einzige M glichkeit des K rpers Cholesterin auszusch
102. e erbliche Pr disposition beobachtet 166 Biochemisches Praktikum V St rungen der Biosynthese von H m Stoffwechselkrankheit Erbgang 1 Porphyria erythropoetica Morbus G nther rezessiv Manifestation im 1 5 Lebensjahr Porphyria hepatica a acuta intermittens dominant Manifestation im 20 40 Lebensjahr Befund Urin Uroporphyrin I und Koproporphyrin stark erh ht Rotf rbung auch im Dunkeln Faeces Koproporphyrin vermehrt Uroporphyrin I und Koproporphyrin l in Erythroblasten und Erythrozyten Nachweis durch Fluoreszenztechnik Aminol vulins ure ALA und Porphobilinogen stark erh ht Uro porphyrinogen und Uroporphyrin leicht erh ht Urin bei Lichteinwirkung dunkelrot Ursache Relativer Mangel an Uroporphyrinogen IIl Cosynthetase Isomerase Aktivit tsminderung der Uroporphyrinogen Ill Synthase Sekund re Derepression und Aktivit tssteigerung der ALA Synthase Klinische Symptomatik Lichtdermatosen R tung Blasenbildung Dunkelrosarote Verf rbung und Fluoreszenz von Z hnen Erythrodontie und N geln H molytische An mie Milztumor Abdominelle Koliken Erbrechen Areflexien aufsteigende Paresen u a neurologische Symptome b Cutanea tarda erbliche Disposition Manifestation im 40 60 Lebensjahr Sehr selten ALA oder Porphobilinogen erh ht Uroporphyrin Ill stark erh ht Koproporphyrin leicht Eisenvermehrung in der Leber oft Leber
103. e f r den Herzinfarkt typische Differenz im Anstieg der beiden Trans aminasen schwindet Die Aktivit t der ALT n hert sich oder bersteigt den Wert der AST Die Aktivit t der SDH steigt im Serum an Als Zeichen der abklingenden Herz muskelnekrose fallen die Aktivit ten der muskelspezifischen CPK Normalwerte der wichtigsten Enzymaktivit ten im Serum Enzym Aktivit t Messtemperatur U umol min pro Liter AST bis 22 25 C ALT bis 18 25 C CK 10 70 25 C GLDH bis 4 25 C LDH 120 240 25 C SDH bis 0 4 25 C ALD bis 6 25 C Amylase 4000 37 C 214 Biochemisches Praktikum VI Praktische Aufgaben 1 bis 6 Praktikumsgruppe Namen der Praktikanten Aufgabe 1 Zeitpunkt 0 min 1 min 2 min 3 min 4 min 5 min Extinktion Aktivit t Berechnen Sie die Aktivit t der ALT in U I Serum 1U 1umol min nach der allge meinen Gleichung zur Berechnung von Enzymaktivit ten bei photometrischen Be stimmungsverfahren Den Extinktionskoeffizienten e f r NADH finden Sie auf Seite 184 AE Gesamtvolumen _ AE ml Aktivit t re E lt At e d Volume der Probe min mol cm cm ml Umsatz 10 f r mol in umol Biochemisches Praktikum VI Diskussion der Ergebnisse Aufgabe 2 Leerwert Standard Probe Extinktion Konzentration mmol l Berechnung mittels Dreisatz Die Verd nnungsgren
104. e nur in der Leber und CK die nur in der quergestreiften Muskulatur auch Herz wesentliche Aktivit ten aufweisen Sie werden als organ spezifische Enzyme bezeichnet Zu erw hnen sei noch dass einige Enzyme in den einzelnen Organen deutliche Unterschiede in ihrem Aufbau zeigen Das bekannteste Beispiel hierf r sind die 5 elektrophoretisch trennbaren Isoenzyme der LDH die alle die gleiche Reaktion ka talysieren Hirngewebe besitzt h here CK Aktivit t als Herzmuskel jedoch ist die Blut Hirn Schrank f r CK nicht durchl ssig 208 Biochemisches Praktikum VI Auch die verschiedenen subzellul ren Strukturen unterscheiden sich aufgrund ihrer Enzymausstattung So sind um Beispiele zu nennen die Glutamat Dehydrogenase GLDH und Succinat Dehydrogenase SDH allein in den Mitochondrien LDH und ALT nur im cytoplasmatischen Zellraum anzutreffen Aktivit ten von AST Malat De hydrogenase und Isocitrat Dehydrogenase liegen in beiden Zellr umen vor Infolge der hohen Enzymaktivit ten in den Zellen und den geringen im Plasma be steht ein Konzentrationsgef lle zwischen intra und extrazellul rem Raum Es ist da her nicht verwunderlich dass bereits bei gering ausgepr gten Zellsch den Zell En zyme in das Plasma austreten Je ausgedehnter der besch digte Bezirk ist d h je mehr Zellen gesch digt wurden und je tief greifender und akuter die Sch digung ist desto h here Aktivit tsanstiege von Zell Enzymen im Plasma sind zu er
105. e oben erw hnt besitzen B Lymphozyten einen Antik rper als Antigenrezeptor pr formiert d h ohne jeden Einfluss des Antigens auf der Zellmembran Solche antigenbindenden Zellen sind in einem experimentell nicht mit Ag stimulierten Tier nur zu einem sehr geringen Prozentsatz vorhanden Von den Milzzellen der Maus siehe Aufgabe 1 sind es vor der Immunisierung z B nur 0 001 bis 0 005 f r die meisten anderen Antigene sind es weniger Der Anteil dieser antigenbindenden Zellen nimmt im immunisierten Tier stark zu Sie k nnen mit einem Rosettentest nachgewiesen werden Hydridomzellen befinden sich im Stadium von Plasmazellen bei welchen eigentlich kein membranst ndiger Antik rper nachweisbar ist Dies gilt f r die IgM sezernierenden Hybridomzellen Dagegen k nnen Hybridomzellen wel che Antik rper der Klasse IgG hier anti SRBC sezernieren mit ihrem Antigen SRBC Rosetten bilden Dazu werden die Hybridomzellen mit einer 10 bis 20 fach h heren Konzentration an SRBC gemischt Pipettierschema gt 30 ul SP2 HL Zellsuspension SP2 in 1 5 ml Reaktionsgef Eppis vorlegen gt 30 ul 1 SRBC Suspension gt 200 ul BSS gt vorsichtig mischen bei 1200 rpm 1 min zentrifugieren auf Gegengewicht achten berstand abnehmen und verwerfen Das Pellet in 100 ul BSS vorsichtig resuspendieren abgeschnittene Pipettenspitzen verwenden und Zellsuspension vorsichtig auf Objekttr ger pipettieren mit Deckgl schen abdecken nicht au
106. eas Abb 3 Biosynthese als Biosensor f r die Blutglucose Prozessierung des insulins Konzentration Die Insulinwirkung erfolgt ber den Insulinrezeptor der in der Plasmamembran der Zellen verankert ist Abb 5 Der Insulinrezeptor geh rt zur Klasse der Wachstumsfaktor Rezeptoren Er besteht aus 2 a und 2 B Ketten die ber Disulfidbr cken verbunden sind Die extrazellul ren Dom nen tragen die Insulin Bindungsstelle und die intrazellul ren Dom nen die Tyrosinkinase Aktivit t Die Bindung von Insulin f hrt zu einer Konformations nderung die in der Aktivierung der Tyrosinkinase resultiert was zur gegenseitigen Phosphorylierung der B Ketten f hrt Diese Strukturver nderung des Insulinrezeptors erlaubt dann die Bindung von intrazellul ren Proteinen an den Rezeptor Das wichtigste ist dabei das Insulin Rezeptor Substrat IRS welches durch den Insulinrezeptor an seinen Tyrosinresten 111 Biochemisches Praktikum IV phosphoryliert wird und in dieser aktivierten Form weitere Signalmolek le binden kann Es gibt dann zwei wichtige Signalwege 1 die Verkn pfung mit dem Adaptorprotein GRB2 zum MAP Kinase Signalweg der mitogene Signale vermittelt Wachstumsf rderung und 2 die Aktivierung der Phosphatidylinositol 3 PI3 Kinase die u a zur Aktivierung der Proteinkinase B PKB f hrt und dadurch zur Translokation des Glucosetransporter 4 GLUT 4 und zur Steigerung der Glykolyse und der Glykogensynthese Abb 4 Glucoset
107. edene Arten der Signal bertragung 1 Endokrine Signal bertragung dabei werden Hormone von hormonproduzierenden Zellen ins Blut abgegeben Im Blut k nnen sie zu weit entfernten Zielzellen transportiert werden und dort an spezifische Rezeptoren binden 2 Parakrine Signal bertragung Hormone wirken auf benachbarte Zellen 3 Autokrine Signal bertragung Spezialfall der parakrinen Signal bertragung Hierbei produziert eine Zelle Signalstoffe mit denen sie sich selber stimuliert 232 Biochemisches Praktikum VII paracrine endocrine Abbildung 5 Wege der hormonellen Signal bertragung Aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften kann man Hormone in zwei Gruppen unterteilen die v llig unterschiedliche Wirkungsmechanismen besitzen Gruppe 1 Hydrophile Hormone Peptidhormone Proteine Katecholamine k nnen die Zellmembran nicht passieren Sie dringen nicht in die Zelle ein sondern binden an der Au enseite der Plasmamembran an Membranrezeptoren Die Hormonbindung aktiviert membrangebundene Enzyme die eine Synthese von second messenger Molek len katalysieren diese l sen ber Signalketten die spezifischen Hormoneffekte aus siehe auch Abbildung 4 Die wichtigsten second messenger sind cyclisches AMP cAMP Calcium Ca und aus Membranphospholipiden erzeugtes Inositoltrisphosphat IP3 Diacylglycerin DAG In der Regel handelt es sich hierbei um schnell reagierende Systeme Sekunden bis Stunden die auc
108. ehe Praktikum 4 wird H202 plus ein aromatisches Amin zugegeben Die Peroxidase setzt aus H O atomaren Sauerstoff frei welcher das aromatische Amin hier ABTS oxidiert und dadurch in eine gef rbte Verbindung berf hrt Material e Streifen einer Mikrotiter Platte welcher ber Nacht mit FITC BSA beschichtet wurde Das FITC BSA wird dabei durch elektrostatische Kr fte festgehalten und kann nicht abgewaschen werden e mon Ak 1 enthaltenden Hybridomzellkultur berstand roter Punkt e Peroxidase gekoppeltes Antiserum vom Kaninchen gegen die gesamten Maus Immunglobuline IgG anti IgM e ABTS Substrat zur Entwicklung der Enzymreaktion e PBS mit 0 05 Detergenz Tween Methode e Stellen Sie eine Verd nnungsreihe des mon Ak 1 roter Punkt enthaltenden Kultur berstandes in PBS her 10 entspricht dem unverd nnten Kultur berstand 10 107 10 10 und negative Kontrolle nur PBS Vorgehensweise zur Erstellung der Verd nnungsreihe gt Beschriften Sie Eppis mit 10 10 10 10 entspricht 1 10 1 100 1 1000 1 10000 Verd nnungen gt Legen Sie 450 ul PBS in jedes Eppi vor gt pipettieren Sie 50 ul des entsprechenden konzentrierten monoklonalen Antik rpers in das Eppi 10 5 6x auf und ab pipettieren zus tzlich dabei mit 283 Biochemisches Praktikum VIII der Pipettenspitze mischen Dann entnehmen Sie 50 ul aus dem Eppi 10 und geben es in das Eppi 10 Weitere seri
109. eide komplement re DNA Str nge k nnen als Matrize f r die Synthese dienen wenn man f r jeden Strang einen Primer zusetzt Diese w hlt man f r die PCR so aus dass sie an den Bereichen der DNA angrenzen der vervielf ltigt werden soll und ihre 3 Enden zueinander orientiert sind Die neu synthetisierten DNA Str nge die jeweils an einem Primer beginnen reichen daher ber die Position des Primers 26 Biochemisches Praktikum Il des gegen berliegenden Stranges hinaus Folglich entstehen auf jedem neuen DNA Strang auch wieder neue Primer Bindestellen Nach dem erneuten Erhitzen des Reaktionsgemisches werden die urspr nglichen und auch die neu entstandenen Str nge getrennt und stehen f r weitere Runden der Primer Hybridisierung DNA Synthese und Strangtrennung zur Verf gung Das Endergebnis einer PCR ist ein Reaktionsgemisch das nach n Zyklen ein theoretisches Maximum von 2n doppelstr ngigen DNA Molek len enth lt welche Kopien der ausgew hlten DNA Sequenz zwischen den Primern darstellt Abb 2 Das ist die zweitwichtigste Eigenschaft der PCR sie erm glicht die exponentielle Vervielf ltigung des gew nschten DNA Bereiches Ablauf einer PCR Ausgangsmaterial einer PCR ist DNA welche die gew nschte Sequenz enth lt Man braucht diese Sequenz nicht zu isolieren denn sie wird durch die in der Reaktion verwendeten Primer definiert Dazu werden die beiden Oligonukleotidprimer welche die Startpunkte der DNA Synthese deter
110. eiden ist die Umwandlung in Gallens uren in der Leber Lipoproteinstoffwechsel Im Lipidstoffwechsel spielen die Lipoproteine eine gro e Rolle Die Nahrungslipide werden im Darm mit Gallens uren in Mizellen verpackt und durch die Pankreaslipase hydrolysiert Die Enterozyten nehmen die Lipide aus den Mizellen auf und bauen sie in Chylomikronen ein Diese triglyzeridreichen Lipoproteine werden ber die Lymphe ins Blut transportiert und dort von der endothelst ndigen Lipoprotein Lipase LPL hydrolysiert F r die Lipaseaktivit t ist das Apoprotein C Il als Cofaktor notwendig welches an die Lipoproteine gebunden vorkommt Die dabei entstehenden freien Fetts uren werden in Muskelzellen und Fettzellen aufgenommen Kohlenhydrataufnahme Mit der Nahrung nehmen wir vor allem Polysaccharide auf St rke aus Gem se und Getreide Saccharose aus Obst und Glykogen aus Fleisch Mit Vollkornprodukten und Gem se nehmen wir neben St rke auch Cellulose auf die zu den in unserer Ern hrung wichtigen Ballaststoffen z hlt Die Aufnahme von Mono und Disacchariden den s en Kohlenhydraten ist vor allem durch zuckerhaltige Getr nke in den letzten Jahren gestiegen Wir sollten etwa 50 60 der Energie in 108 Biochemisches Praktikum IV Form von Kohlenhydraten aufnehmen davon sollte der berwiegende Teil aus komplexen Kohlenhydraten und weniger als 20 aus Zucker bestehen Alle Polysaccharide der Nahrung m ssen in Monosaccharide bevorzugt in G
111. eine Pseudo peroxidase Wirkung die zu einem sehr empfindlichen Nachweis verwendet werden kann Der Effekt ist nicht an das Vorhandensein nativen Globins gebunden sondern eine Eigenschaft des H ms Beim Vorliegen eines wirksamen Katalysators werden Benzidin und Benzidinderivate durch H202 zu Diphenochinondiiminen dehydrogeniert dehydrogenierte und nicht dehydrogenierte Molek le bilden tiefblaue 1 1 Molek lkomplexe Dieser sehr empfindliche H moglobin Nachweis wird in der forensischen und in der klinischen Medizin verwendet Blutspuren an Gegenst nden Faeces oder Harn Experimentelle Ausf hrung Man gibt in 4 Reagenzgl ser f 1 Spatelspitze Eisen Il sulfat 3 ml H2O 2 3 ml stark verd nntes H molysat 1 10000 Gesamtverd nnung 3 ml aufgekochtes H molysat Verd nnung 1 10000 3 ml H20 Leerwert und setzt zu jedem Reagenzglas wenige Tropfen ABTS H gt 0 L sung hinzu Frisch angesetzte Reagenzl sung vom Kursassistenten holen und sofort verwenden 155 Biochemisches Praktikum V Aufgabe 3 Isolierung und Bestimmung von Porphobilinogen aus Urin Vorstufen von Eisenporphyrinen Der Nachweis von Porphyrinvorstufen hat klinisch diagnostische Bedeutung vgl Klinischer Anhang S 170 Im Kurs dient die Bestimmung der Vorstufe Porphobilinogen auch zum Kennen lernen der wichtigen Methode der lonenaustauschchromatographie Prinzip Porphobilinogen kann direkt im Urin mit Hilfe eines modifizierten Ehrlich Reagenz salzs
112. einstruktur Aufgabe 5 Polymerase Ketten Reaktion Entwerfen Sie jeweils ein Primer Paar f r eine Polymerase Ketten Reaktion PCR f r humanes Interleukin 6 a Entwerfen Sie ein Primer Paar f r die Detektion von genomischer Interleukin 6 DNA b Entwerfen Sie ein Primer Paar f r die Detektion von Interleukin 6 mRNA mittels Reverser Transkriptase PCR RT PCR Aufgabe 6 Single Nucleotide Polymorphisms SNPs Gibt es Single Nucleotide Polymorphisms SNPs im menschlichen Interleukin 6 bzw gp130 Rezeptor Gen a Wurden solche SNPs bereits mit Krankheiten assoziiert b Wieviel SNPs sind in diesem Gen bekannt c Worin liegt die besondere Bedeutung von SNPs f r die Identifizierung von Krankheitsgenen Biochemisches Praktikum Il BIOCHEMISCHES PRAKTIKUM Il Nukleins uren Aufgabe 1 UV Spektrum von Nukleotiden Aufgabe 2 W rmedenaturierung von nativer DNA Aufgabe 3 Polymerase Kettenreaktion PCR Aufgabe 4 Restriktionsverdau von Plasmid DNA und Gr enbestimmung von DNA Fragmenten durch Agarosegelelektrophorese Aufgabe 5 Transformation von Bakterien mit einem Interleukin 6 Expressionsplasmid Christian Albrechts Universit t zu Kiel Biochemisches Institut In der Medizinischen Fakult t Olshausenstrasse 40 24098 Kiel Biochemisches Praktikum Il Stichworte Vorausgesetztes Wissen e Bausteine der Nukleins uren e Arten von Nukleins uren e Prim r Sekund r Terti rstruktur der Nukleins uren
113. eite eine se heraus Deren Unterseite wird mit der jeweiligen Serumprobe ausreichend benetzt indem sie horizontal ber die Oberfl che eines Serumtropfens gestreift wird Der sensteg darf nicht in das Serum eintauchen Nach dem Benetzen soll die Taste langsam in die Ausgangsstellung zur ckgleiten Der Auftragsstempel wird mit der vorderen Nut in das mit 1 gekennzeichnete Loch der Auftragsbr cke gesetzt danach die Taste erneut gedr ckt so dass das an der se haftende Serum auf den Celluloseacetat Streifen bertragen wird Sofort danach wird die se nur diese mit Aqua bidest gesp lt und mit Filterpapier trockengetupft Nach Beendigung des Auftragens wird die Elektrophoresekammer mit dem Deckel so verschlossen dass seine Markierung mit der der Elektrophoresekammer bereinstimmt Die Zuleitungen werden an die gekennzeichneten Gleichstrombuchsen am Arbeitsplatz angeschlossen rot Anode schwarz Kathode Es liegt dann eine Spannung von 250 V an 40 Minuten nach Anlegen der Gleichspannung wird der Strom unterbrochen und der Streifen in m glichst horizontaler Lage aus der Elektrophoresekammer genommen 81 Biochemisches Praktikum Ill Proteinf rbung 1 Der Streifen wird f r 5 Minuten in F rbel sung 1 gelegt 2 Danach wird er jeweils f r 5 Minuten nacheinander in die beiden Entf rbeb der gebracht 3 Aus dem letzten Bad wird die Folie auf einen Objekttr ger gelegt mit einer Walze leicht angedr c
114. elegentlich Chloroform verwendet erniedrigen die Dielektrizit tskonstante des Wassers vergr ern damit die Dipolattraktion zwischen den Proteinmolek len und st ren zudem als ebenfalls polare Stoffe die Ausbildung der Hydrath llen Da dieses 54 Biochemisches Praktikum Ill Verfahren die Gefahr einer Denaturierung des Proteins birgt nimmt man die F llung meist bei Temperaturen weit unter 0 C vor Die meisten Proteine l sen sich in reinem Wasser schlecht da die Dipolkr fte eine ausreichende Solvatisierung der Molek le nicht erlauben Zusatz geringer Salzmengen zum Wasser f hrt zur teilweisen Abschirmung der Protein Oberfl chenladung durch eine gegensinnig geladene lonenschicht die ihrerseits eine Hydrath lle tr gt Abbildung 2 zeigt einen solchen Einsalzeffekt am Beispiel des Hanfsamenglobulins Edestin Albumin und manche Glycoproteine sind dagegen auch in reinem Wasser l slich Oberhalb eines Optimums nimmt mit steigender lonenst rke im L sungsmittel die L slichkeit der Proteine wieder ab bis es zur Ausf llung kommt Aussalzeffekt Der Wassermantel der Proteine verringert sich mit steigender Salzkonzentration da die lonen des Salzes mit den polaren Aminos ureresten um die Wassermolek le konkurrieren Da verschiedene Proteine je nach ihrer L slichkeit bei verschiedenen lonenst rken ausfallen wird das Aussalzen h ufig zu einer ersten groben Fraktionierung von Proteingemischen verwendet Meistens
115. elle Verd nnung nach dem gleichen Prinzip Schlagen Sie die in den L chern der Mikrotiter Platte befindliche Pufferl sung aus d h die umgedrehte Platte mit Schwung auf ein Papierhandtuch klatschen und waschen Sie 2 x mit 200 ul PBS Tween geben Sie in je zwei L cher Doppelwerte 100 ul einer Verd nnungsstufe 30 min bei RT inkubieren dann 2 x mit 200 ul PBS Tween waschen Zugabe des Kaninchen anti Maus Immunglobulin Peroxidase gekoppelt in 15 ml R hrchen auf Eis 100 ul pro Loch 30 min bei RT inkubieren 3 x mit 200 ul PBS Tween waschen und 100 ul ABTS Substratl sung zugeben wenn in den negativen Kontrollen F rbung anf ngt sichtbar zu werden ist der Test beendet Ergebnis protokollieren die Streifen k nnten zur genaueren Analyse in eine 96 Loch Platte gestellt und in einem ELISA Reader bei 405 nm gemessen werden wird hier weggelassen unverd 101 102 103 104 PBS OO0000000000 284 Biochemisches Praktikum VIII Aufgabe 5 Phagozytose von GFP exprimierenden Bakterien durch Makrophagen Phagozyten und Antigen pr sentierende Zellen k nnen Bakterien aufnehmen phagozytieren um sie zu Iysieren und anschlie end das Immunsystem zu informieren In diesem Versuch soll die Phagozytose von Makrophagen im Vergleich zu Blutstammzellen die diese F higkeit nicht besitzen untersucht werden Dazu wird das Schicksal von green fluorescent protein GFP exprimierenden Bakterien in Anwesenheit von Makrophagen bzw B
116. en Zerlegt man beispielsweise eine Spender DNA mit dem gleichen Restriktionsenzym mit dem man einen Plasmidring aufgeschnitten hat lassen sich die entstandenen DNA Fragmente in das Plasmid einkleben weil die klebrigen Enden zueinander passen Beispiel Das Restriktionsenzym EcoRI erkennt die Sequenz GAATTC wird gespalten in 39 Biochemisches Praktikum Il 5 XXXXXXXG AATTCXXXXXX 3 3 XXXXXXXCTTAA GXXXXXX 5 wobei gilt X beliebige Base G Guanosin A Adenin T Thymidin C Cytosin T7 Terminator Hind IIl 2808 pRSET 5d hu IL 6 Xba 2606 3478 bp hu IL 6 cDNA Nco I 2084 T7 Promotor Plasmidkarte des von uns verwendeten Plasmids Es handelt sich um das Plasmid pRSET 5d hu IL 6 das eine human Interleukin 6 IL 6 cDNA 1100 bp tr gt 40 Biochemisches Praktikum Il Durchf hrung Ben tigte L sungen DNA L sung Plasmid ARE BEN 0 1 ug ul w ssrige Plasmidl sung 1 Restriktionsenzym 33 mM Tris Acetat pH 7 9 at 37 C 10 mM Magnesium Puffer Acetat 66 mM Kalium Acetat 0 1mg mI BSA Restriktionsenzym Lagerpuffer Xba I AV N 10U Ul 10 mM Tris HCI pH 7 5 bei 25 C 100 mM KCI 10mM DTT 0 1 mM EDTA 0 2 mg ml BSA und 50 Glycerin Pro 5er Gruppe In zwei 1 5 ml Reaktionsgef e werden jeweils 10 ul einer 0 1 ug l Plasmidl sung A und B pipettiert Hubkolbenpipette und mit A und B beschriftet Dazu kommen jeweils 10ul 5 Restri
117. en durch Agarosegelelektrophorese Restriktionsenzyme und Verdau Restriktionsenzyme oder Restriktionsendonukleasen sind Enzyme die DNA Molek le zerschneiden k nnen Der Schnitt findet dabei nicht an einer beliebigen Stelle statt sondern an einer spezifischen Nukleotidsequenz die von dem Restriktionsenzym erkannt wird Die Erkennungssequenzen sind normalerweise Palindrome d h symmetrisch und damit in beiden Str ngen gleich siehe unten Jedes Restriktionsenzym hat seine eigene spezifische Erkennungssequenz Ihren Namen haben sie erhalten weil Restriktion in diesem Fall die Beschr nkung der Schneideeigenschaften auf die spezifische DNA Sequenz beschreibt Restriktionsenzyme geh ren zu den wichtigsten molekularen Werkzeugen beim Klonieren von DNA und haben daher in der Molekularbiologie eine enorme Bedeutung erlangt Mit Hilfe von Restriktionsenzymen k nnen rekombinante DNA Molek le hergestellt werden indem zum Beispiel mit ihrer Hilfe der ringf rmigen DNA Strang eines Plasmids an einer bestimmten Stelle geschnitten wird Oft trennen die Restriktionsenzyme die beiden Str nge der Vektor DNA um einige Nukleotide versetzt so dass so genannte klebrige Enden engl sticky ends entstehen Aber es gibt auch Enzyme die die DNA glatt aufschneiden ohne dass solche klebrige Enden entstehen engl blunt ends DNA Fragmente mit komplement ren d h zueinander passenden klebrigen Enden engl sticky ends lassen sich miteinander verkn pf
118. en geschrieben Bei der ersten Klausur werden 30 Fragen bei der zweiten 35 gestellt Jede richtig beantwortete Frage wird mit einem Punkt bewertet so dass insgesamt maximal 65 Punkte erreicht werden k nnen Zur Ausgabe des Leistungsnachweises m ssen dabei mindestens 18 in der ersten und mindestens 21 Punkte in der zweiten Klausur erreicht werden mit der Einschr nkung dass am Praktikum regelm ig und mit Erfolg teilgenommen wurde Die Teilnahme an den Klausuren ist Pflicht Unentschuldigte Nichtteilnahme wird als nicht bestandener Versuch gewertet 3 Wird die Mindestpunktzahl 18 bzw 21 nicht erreicht findet unter der Bedingung dass A die Klausuren geschrieben wurden und B am Praktikum regelm ig und mit Erfolg teilgenommen wurde jeweils eine Wiederholungsklausur mit ebenfalls 30 bzw 35 Fragen statt Zur Ausgabe des Leistungsnachweises m ssen dabei mindestens 18 in der ersten und mindestens 21 Punkte in der zweiten Klausur erreicht werden Die Klausuren d rfen jeweils maximal 3 mal wiederholt werden Es gelten die Bedingungen der Studienordnung 4 Das Direktorium des Biochemischen Institutes beh lt sich vor dass in besonderen H rtef llen Studierende zu einer Nachpr fung zugelassen werden k nnen Veranstaltungsordnung zu den Biochemie Seminaren f r Studierende der Humanmedizin ab SS 2012 1 Seminargruppen und Praktikumsgruppen sind identisch siehe Punkt 1 Praktikumsordung Die Seminarthemen entnehmen Sie bitte den
119. en in den Testans tzen m ssen Sie dann Umrechnen in die Glucose Konzentrationen im Patientenserum In einem zweiten Diagramm tragen Sie diese Serum Glucose Werte gegen die Entnahmezeit Abszisse auf Verwenden Sie dabei alle Werte keine Mittelwerte bilden und zeichnen Sie einen nach Ihren Me werten wahrscheinlichen Kurvenverlauf Ebenfalls 130 Biochemisches Praktikum IV in dieses Diagramm werden die entsprechenden Werte aus der Insulin Bestimmung eingetragen s dort Vergleichen Sie die Ergebnisse mit den Glucose Ausscheidungskurven die von Ihnen und von anderen Gruppen f r fiktive Patienten erstellt wurden Beurteilen Sie ob der Selbstversuch den Normalfall eines Gesunden wiedergibt Aufgabe Um welchen Faktor auf molarer Ebene ist eine Insulin Konzentration von 50 U ml niedriger als eine Glucose Konzentration von 100 mg dl m gliche Normalwerte zwischen den Mahlzeiten Berechnen Sie dazu die molaren Konzentrationen beider Stoffe 1 Internationale Einheit Insulin ist definiert als 1 U 25 mg Molekulargewichte Insulin 5800 g mol Glucose 180 g mol Tabelle 1 Vorbereitung der Patientenproben R hrchen 7A 18A R hrchen 1A 18A je Wasser 500 ul Patientenprobe Glucose 50 ul Standard gt Mischen gt 100ul klarer berstand f r die R hrchen B Tabelle 2 Pipettierschema f r den Glucosestandard und den Patientenproben Nr Probe Vol H2O Reaktion
120. ende Rezeptoren die anderen Leukozyten sind relativ unspezifisch k nnen aber mit den Lymphozyten in verschiedener Weise interagieren Als System sichern die Zellen die beiden Aufgaben des IS 1 Schutz des Selbst gegen mikrobielle Infektionen Viren Bakterien niedere Pilze und 2 Bewahrung des Selbst gegen innere Ver nderungen Verhinderung der Entstehung von Tumoren Das bedeutet dass die spezifischen Zellen also die Lymphozyten das Selbst vom Nicht Selbst unterscheiden m ssen Sie k nnen dies aber nicht aus genetisch fest gelegten Gr nden sondern sie lernen es im Laufe ihrer Entstehung d h sie lernen die Auto Toleranz Die Leukozyten entstehen aus einer gemeinsamen sog pluripotenten Stammzelle des Knochenmarks und differenzieren dann durch den Einfluss von verschiedenen Wachstumsfaktoren zu den jeweiligen auf ihre Funktion spezialisierten Zellen Dabei k nnen drei Differenzierungstypen unterschieden werden W hrend Granulozyten einfach zu solchen nicht weiter zu beeinflussenden Effektorzellen werden k nnen Makrophagen und dendritische Zellen unter dem Einfluss von Mediatoren der Lymphozyten ein Aktivierungsstadium erreichen Lymphozyten reifen in speziellen Organen den prim ren Lymphorganen zu immunkompetenten Zellen heran Danach k nnen sie Fremdstoffe Bakterien oder virusinfizierte Zellen s o erkennen und werden durch diese weiter zu einem Effektorzellstadium aktiviert Im prim ren _Lymphorgan Thymus reifen Zellen
121. ende Stoff entweder selbst absorbiert was z B bei Proteinen oder Nukleins uren im UV Licht der Fall ist oder durch eine chemische Reaktion in ein absorbierendes meist also farbiges Produkt berf hrt werden kann Man nimmt dann ein Absorptionsspektrum dieses Produktes auf d h man misst die Extinktion bei verschiedenen Wellenl ngen Dabei wird man ein oder mehrere Absorptionsmaxima finden Man w hlt eine Wellenl nge in der N he des Maximums je nach vorhandenen Filtern und Lichtquellen f r das Bestimmungsverfahren aus Anschlie end muss noch durch Anlegen einer Eichkurve mit verschiedenen 22 Biochemisches Praktikum Il Konzentrationen der reinen Substanz die Anwendbarkeit des LAMBERT BEERschen Gesetzes nachgepr ft bzw ein passender Konzentrationsbereich ausgew hlt werden Wichtig Abweichungen vom LAMBERT BEERschen Gesetz k nnen besonders bei h heren Konzentrationen auftreten sie beruhen auf gegenseitige Beeinflussung der absorbierenden Molek le und auf Ver nderung ihrer Solvatation mit steigender Konzentration Das LAMBERT BEERsche Gesetz gilt nur bei Verwendung von monochromatischem Licht und in homogenen L sungen 23 Biochemisches Praktikum Il Optische Eigenschaften von Nukleins uren F r die Analytik der Nukleins uren der Nukleotide und ihrer Derivate ist die Absorption von UV Licht durch die Purin und Pyrimidinbasen von gr ter Bedeutung pH nderungen Wasserstoff Br ckenbildung und das
122. endem Cortisol betr gt beim Menschen etwa 70 bis 120min Einen haupts chlichen Metabolisierungsweg stellt die Oxidation durch die 11 Hydroxysteroid Dehydrogenasen 11B HSDs dar Das Vorhandensein des Enzyms hat damit eine herausragende Bedeutung f r den Salz und Wasserhaushalt sowie f r die Blutdruckregulation da Cortisol mit einer im Vergleich zu Aldosteron etwa hundertfach h heren Plasmakonzentration andernfalls den Mineralocorticoid Rezeptor nahezu vollst ndig besetzen w rde Die Ursache der Selektivit t des Mineralocorticoid Rezeptors f r Aldosteron liegt damit haupts chlich in der In aktivierung des Cortisols in den Mineralocorticoid Zielzellen Ben tigte Materialien Transfizierte Zellen cos Zellen transformierte Fibroblasten Zellen aus der Nebennierenrinde Gr ner Meerkatzen Hormonl sungen 1 Hydrocortison 2 Insulin 3 Spironolacton Mineralkortikoidhemmer Versuchsdurchf hrung Die transfizierten Cos7 Zellen befinden sich bereits in 6 Well Zellkulturplatten Beschriften Sie vorsichtig die Platten mit einem Edding Stift Ansatz 1 2 Beschriftung klein und am Rand da die Auswertung sp ter mikroskopisch erfolgt Pipettieren Sie schnell und vorsichtig die jeweils angegebenen Mengen der Behandlungsl sungen in die jeweiligen Ans tze verteilen Sie die L sungen durch leichtes Kreisen der Platte ohne das Kulturmedium zu versch tten geschlossene Deckel Stellen Sie die Platten danach in den Brutschrank be
123. ender Reihenfolge pipettieren Markierung der j Leerwert Standard Probe Reagenzgl ser verd nnter Harn 10 ul H20 10 ul Standard 10 pl F rbereagenz 1 1 ml 1ml 1 mli Urease 10l 10l 10l Nach 5 min bei 37 C F rbereagenz 2 1ml dazugeben Nach weiteren 5 min bei 37 C messen bei 578 nm 187 Biochemisches Praktikum VI Aufgabe 3 Aktivit tsbestimmung von Xanthinoxidasse und Uricase Allopurinolwirkung Biochemische Grundlagen und Prinzip Xanthinoxidase XOD katalysiert zwei aufeinander folgende Reaktionsschritte des Purinabbaus Fig 3 XOD ist eine Oxidoreduktase mit hohem MG 300 000 Dalton und einer komplizierten prosthetischen Gruppe die 2 Mol FAD 8 Mol nicht H m Eisen und 1 Mol Molybd n pro Mol Enzym enth lt XOD wird vor allem aus Leber und aus Milch gewonnen Ihre Substratspezifit t ist relativ gering z B werden viele Aldehyde und viele Purinanaloge oder Purinderivate oxidiert Das mit Hypoxanthin isomere Allopurinol wird anstelle von Hypoxanthin an XOD gebunden langsam zu Alloxanthin oxidiert dieses jedoch nicht weiter zu Harns ure Allopurinol ist daher kompetitiver Inhibitor f r die Reaktionen I und Il die Hemmung der Reaktion Il stellt eine dead end inhibition dar Harns ure ist bei Primaten das Endprodukt des Purinabbaus Bei den anderen S ugern wird sie durch Uricase Urat Oxidase zu Allantoin abgebaut Uricase ist ein Cuproproteid
124. ene und Gestagene neben geringen Mengen an Androgenen gebildet 247 Biochemisches Praktikum VII Die folgende Skizze gibt eine bersicht ber die Hauptsynthesewege Cholesterin us Steroidbiosynthese Progesteron CH OH CH 3 OH Desoxycorticosteron 170 Hydroxycortison CH OH CHOH ki ER HO Androstendion Corticosteron Desoxycortison CHOH OH O CH OH Testosteron Cortisol HO Aldosteron OH Ea H Die Analyse der Steroide soll mit Hilfe der D nnschichtchromatographie erfolgen eines einfachen Verfahrens zur Auftrennung von Gemischen kleinster Substanzmengen Das Trennprinzip beruht auf Adsorptionsvorg ngen an pulverisierten festen Sorbentien hier Kieselgel SiO die in d nner Schicht auf eine Platte Glasplatte alternativ auch auf Aluminium oder Kunststofffolie m glich aufgetragen sind Steht ein solches Adsorbens mit der L sung einer Substanz in Ber hrung so kommt es zur Adsorption der Molek le an dessen Oberfl che Dabei ist die Affinit t des polar aufgebauten Kieselgels zu polaren Substanzen besonders gro so dass polare Molek le besser an der Oberfl che haften als unpolare Wird ein Substanzgemisch am unteren Ende der Platte aufgetragen und die Platte daraufhin in ein mehr oder weniger unpolares L sungsmittel gestellt so wird das 248 Biochemisches Praktikum VII L sungsmittel durch Kapillarkr fte hochgesogen und wandert ber die aufgetragene
125. ennzeichneten Gleichstrombuchsen am Arbeitsplatz angeschlossen rot Anode schwarz Kathode Es flie t dann ein Strom mit 250 V Spannung Ca 60 Minuten nach Anlegen der Gleichspannung wird der Strom unterbrochen und wie nachfolgend beschrieben gef rbt Nachweis der LDH Isoenzyme wird vom Praktikums Laboranten durchgef hrt Die Streifen werden nach unten folgendem Rezept entwickelt 1 Das F rbereagenz bestehend aus Tris Puffer mit Lacta NADH H Phenazinmethosulfat und Nitroblau Tetrazoliumchlorid wird auf ein Uhrglas gegossen Eine unbenutzte Acetatfolie wird mit der Reaktionsmischung getr nkt Nach Abtropfen des bersch ssigen Reagenzes wird die Folie in eine Aluminium Schale gelegt Nun wird der Elektrophorese Streifen Puffer abtropfen lassen mit der Auftragsseite so auf die Reagenzfolie gelegt dass keine Luftblasen zwischen den Streifen eingeschlossen werden Dann wird die Schale sofort mit einer Glasplatte verschlossen an deren Unterseite sich feuchtes Filterpapier befindet An dieser Stelle wird Ihnen die Schale f r die weitere Inkubation zur ckgegeben Die zugedeckte Schale wird nun f r 30 Minuten bei 37 C im Brutschrank inkubiert Anschlie end wird der gef rbte Celluloseacetatstreifen f r 10 Minuten in das Fixierbad gelegt 120 Biochemisches Praktikum IV Aufgabe 4 Qualitativrer Nachweis der Succinat Dehydrogenase Aktivit t in Rattenlebermitochondrien Die Succinat Dehydrogenase ein mitoc
126. entrifugation wird der klare berstand innerhalb von 2 h vom R ckstand abgetrennt und f r die HDL Cholesterinbestimmung mit dem Cholesterin Reagenz s Bestimmung des Gesamt cholesterins eingesetzt 202 Biochemisches Praktikum VI Dazu wird in entsprechend beschriftete Reagenzgl ser mit 1 cm Innendurchmesser nach folgendem Schema einpippetiert Reagenzien Leerwert Probe Aqua dest 100 ul berstand 100 ul Cholesterin Reagenz 1000 ul 1000 ul Nach Mischen werden Reagenzien Leerwert und Probe 10 min bei 20 25 Raumtemperatur inkubiert Nach der Inkubation werden die Ans tze durch Zugabe von 1000 ul Wasser verd nnt Innerhalb 1 h wird die Extinktion der Probe Eprove bei 546 nm gegen den Reagenzien Leerwert wie bei der Bestimmung des Gesamtcholesterins gemessen Reagenzien 1 Cholesterin Reagenz s Bestimmung des Gesamtcholesterins 2 Reagenz zur F llung der Nicht HDL Lipoproteine 0 44 mM Phosphowolframs ure 20 mM Magnesiumchlorid Auswertung Bestimmen Sie die Konzentration des HDL Cholesterins in der Probe in mg dl und mmol l Ccrnoi mmol l 16 82 Eprobe 546 nm 203 Biochemisches Praktikum VI Bestimmung des LDL Cholesterins In ein 1 5 ml Eppendorf Gef werden 20 ul Serum und 100 ul F llungsreagenz LDL C pipettiert Nach Mischen werden die Ans tze 15 min bei 20 25 C inkubiert und anschlie end bei 10 000 g f r 2 min zentrifugiert Nach Zentrifugieren wird der berstand vom R
127. er Ver nderung der Struktur von Enzymproteinen Punkt 3 und mit der Regulation der Enzymmenge Punkt 4 Bei der bermittlung von Regulationssignalen spielen Hormone eine besonders wichtige Rolle In vielen F llen wird das von Hormonen als first messenger ausgel ste Signal durch eine Signalkette bernommen und _ intrazellul r weitergeleitet in der verschiedenartige second messenger wirksam sind In diesem Praktikum werden Aufgaben zum Vergleich von Hormonen und zu einem second messenger durchgef hrt 225 Biochemisches Praktikum VII A Regulation durch Ver nderung der Struktur des Enzymproteins rasche oder Kurzzeit Regulation l Allosterische Beeinflussung der Enzymaktivit t F r die Funktion der lebenden Zellen ist die Regulation der Enzymaktivit t durch feed back R ckkopplungs Kontrolle unerl sslich Hier wirken Metaboliten als Aktivatoren oder Inhibitoren die in den meisten F llen keine sterische hnlichkeit mit dem Substrat des regulierten Enzyms besitzen allosterische Effektoren Sie werden reversibel an spezielle allosterische Bindungsorte gebunden und die Spezifit t der allosterischen Enzyme f r ihre Effektoren ist oft ebenso gro wie ihre Substratspezifit t In fast allen Stoffwechselketten wurden allosterisch regulierbare Schl sselenzyme gefunden Die Effektoren dieser Enzyme sind meistens Endprodukte der Stoffwechselkette Ein Beispiel ist die Aspartat Transcarbam
128. erielle Expressionsvektoren enthalten in aller Regel einen induzierbaren Promotor lac tac T7 sowie eine Multiple Cloning Site Signale der Translation ATG TAG TAA TGA befinden sich entweder auf der zu exprimierenden cDNA oder sind im Vektor enthalten und m ssen beim Einklonieren beachtet werden Leseraster Zur Expression von rekombinanten IL 6 wurde die kodierende IL 6 Sequenz in einen pRSET Vektor kloniert und unter Kontrolle des T7 Phagen Promoters gestellt Abb 3 30 Biochemisches Praktikum Il T7 Terminator Hind Ill 2808 pRSET 5d hu IL 6 Xba 2606 3478 bp hu IL 6 cDNA Nco I 2084 T7 Promotor Abb 3 Das bakterielle Expressionsplasmid PRSET 5d hu IL 6 Das Gen f r die RNA Polymerase des Phagen T7 wiederum ist im Genom des E coli Stammes BL 21 integriert worden und wird von dem Promotor des Galaktosidasegens lacZ kontrolliert Wird den transformierten Bl 21 Zellen ein Galaktoseanalogon zugesetzt das den Repressor bindet aber nicht durch Galaktosidase hydrolysiert werden kann kommt es zur kontinuierlichen Expression des dahintergeschalteten Gens in diesem Fall der Phagen T7 RNA Polymerase Diese besitzt eine hohe Transkriptionseffizienz und transkribiert nun die rekombinante IL 6 CDNA in hoher Menge Abb 4 31 Biochemisches Praktikum Il E col Zelle BL21 7 i P Jo T7Polym Promotor R hu IL 6 pRSET 5d Bakteriengenom hu IL 6 i Regulator Ge
129. erophosphat wirkt wie ein kompetitiver Inhibitor da es reversibel an das aktive Zentrum gebunden wird und mit p Nitrophenylphosphat konkurriert Dabei ist gleichg ltig dass auch das Glycerophosphat selbst umgesetzt wird denn die dabei entstehenden Produkte werden nicht gemessen 94 Biochemisches Praktikum Ill A LER Sol Berechnen Sie die Dissoziationskonstanten Kop f r die inhibierte und nicht inhibierte Reaktion Was ist Vmax Welche Bedeutung hat Ku Was ndert sich bei einer reversiblen Hemmung Vmax oder Km 95 Biochemisches Praktikum IV BIOCHEMISCHES PRAKTIKUM IV Kohlenhydrate und Lipide Aufbau Eigenschaften und Funktionen Aufgabe 1 Aufgabe 2 Aufgabe 3 Aufgabe 4 Aufgabe 5 Aufgabe 6 Chemische und enzymatische Hydrolyse von St rke Nachweis der Blutgruppendeterminanten des ABO Systems mit Glycosidasen Trennung der Isoenzyme von Lactat dehydrogenase LDH durch Elektrophorese Qualitativer Nachweis der Succinat Dehydrogenase Aktivit t in Rattenleber mitochondrien Aktivierung der Pankreaslipase durch Gallen s uren Bestimmung von Glucose und Insulin vor und nach oraler Glucose Belastung Christian Albrechts Universit t zu Kiel Biochemisches Institut In der Medizinischen Fakult t Olshausenstrasse 40 24098 Kiel 96 Biochemisches Praktikum IV Stichworte Kohlenhydrate e Struktur von Monosacchariden Aldosen Ketosen Glucose Gala
130. eroxid oxidiert 2 Das entstandene Wasserstoffperoxid bildet mit den Farbreagenzien 4 Aminophenazon und Phenol unter katalytischer Wirkung der Peroxidase den roten Farbstoff 4 p Benzochinonmono imino phenazon 3 dessen Farbintensit t der Cholesterinkonzentration proportional ist Die Auswertung erfolgt ber einen vom Hersteller f r die jeweiligen Bedingungen ermittelten Faktor s Auswertung 1 Cholesterin Esterase Reaktion I Cholesterinester H2O Cholesterin Fetts uren 2 Cholesterin Oxidase Reaktion Cholesterin O2 A Cholestenon H202 3 Peroxidase Reaktion H202 Farbreagenz Farbstoff 2 H2O 200 Biochemisches Praktikum VI Zur Bestimmung des HDL Cholesterins wird das zu untersuchende Serum mit Phosphowolframs ure und Magnesiumchlorid versetzt Dadurch werden die Chylomikronen VLDL und LDL pr zipitiertt Nach Zentrifugation verbleiben im berstand berwiegend die HDL deren Cholesterinkonzentration enzymatisch in Analogie zur Bestimmung des Gesamtcholesterins bestimmt wird Zur Bestimmung des LDL Cholesterins werden die Lipoproteine geringer Dichte LDL aus dem Serum gef llt Aus der Differenz der Cholesterinwerte im Serum Gesamtcholesterin und im Pr zipitations berstand l t sich die Konzentration des LDL Cholesterins errechnen Versuchsdurchf hrung Bestimmung des Gesamitcholesterins Das Cholesterin Reagenz wird auch zur Bestimmung des HDL Cholesterins und des
131. ert Diese Eluate werden in einem Reagenzglas mit 10 ml Markierung gesammelt Nach dem Ausflie en wird 2 x mit 1 mi 0 2M Essigs ure nachgesp lt und das Eluat mit 0 2M Essigs ure auf 5 ml aufgef llt 3 Zu 2 mi der L sung werden 2 ml Ehrlich Reagenz GIFTIG Achtung Hierbei Nitril 158 Biochemisches Praktikum V Handschuhe tragen lila gegeben Bei Vorhandensein von Porpho bilinogen bildet sich ein roter Farbstoff 4 Nach 15 min wird die Extinktion bei 546 nm im Eppendorf Photometer gegen einen Leerwert aus 2 mil Ehrlich Reagenz und 2 mi 0 2 M Essigs ure abgelesen Die Farbe ist danach nur ca 15 min stabil 5 Aus einer aush ngenden Eichkurve wird die Konzentration abgelesen und die 24 h Ausscheidung ausgerechnet Durchschnittliche Menge 1 5 1 24 h Normalwerte 6 2 7 5 umol 24 h 1 4 1 7 mg 24 h Erh hte Ausscheidung bei akuter Porphyrie Anmerkung Es ist leicht m glich auch die Aminol vulins ure die in dem von uns jetzt verworfenen Eluat vorliegt durch eine anschlie ende zweite Chromatographie mit einem Kationenaustauscher zu isolieren dies aufgrund ihrer prim ren protonisierten Aminogruppe 159 Biochemisches Praktikum V Aufgabe 4 Bestimmung der Eisenkonzentration im Plasma Zum Eisenstoffwechsel Prinzip Bei dem gebr uchlichsten hier verwendeten Verfahren werden zun chst die tr ben fetthaltigen Bestandteile des Plasmas mit Detergens in L sung gebracht und gleichzeitig durch nde
132. ertiefungen zur Eichung mit definierten Insulinmengen bef llt Die Messwerte f r Ihren fiktiven Patienten wegen besserer bersichtlichkeit Extinktion x 1000 also z B 345 statt 0 345 erhalten Sie eingetragen auf einem besonderen Blatt auf welchem Sie auch die berechneten Insulin Werte notieren Die Auswertung k nnen Sie an der von Ihnen gezeichneten Eichkurve vornehmen Tragen Sie dann die Insulin Konzentrationen zusammen mit den oben bestimmten Glucose Konzentrationen in das Zeit Diagramm ein Diskutieren Sie den zeitlichen Verlauf der Glucose und Insulin Konzentrationen bei Ihrem Patienten und versuchen Sie eine Diagnose zu stellen F r welchen der folgenden F lle sprechen die experimentellen Befunde 134 Biochemisches Praktikum IV Praktische Aufgaben 1 bis 6 Praktikumsgruppe Namen der Praktikanten Aufgabe 1 Beobachtungen hydrolysiert nicht hydrolysiert Versuch 1 a Jod Trommer nicht erhitzter Speichel erhitzter Speichel Versuch 1 b Jod Trommer Diskussion der Ergebnisse Aufgabe 2 Ansatz Enzym Enzym Agglutination Geben Sie die Struktur der B determinanten Gruppe an und erl utern Sie die Wirkungsweise der a Galactosidase darauf 135 Biochemisches Praktikum IV Was m ssten Sie tun um ausgehend von Blut der Blutgruppe A das gleiche Ergebnis zu bekommen Aufgabe 3 Zeichnen Sie die Lage und Intensit t der angef rbten Banden ab und vers
133. erungsweise den Titer Welche Antik rperkonzentration w rde man zur Bestimmung variabler Mengen des Antigens FITC BSA einsetzen Vergleichen Sie die verschiedenen Antik rpernachweise der Aufgaben 1 4 und vergleichen Sie die Eigenschaften der mon Aks 1 2 3 4 287 Biochemisches Praktikum VIII Aufgabe 5 Beschreiben Sie die Ergebnisse indem sie f r jede Zellart das Bild im Fluoreszenzmikroskop grafisch darstellen Bestimmen Sie welche Zellart die F higkeit zur Phagozytose besitzt Diskutieren Sie die Ergebnisse im Hinblick auf die immunologische Abwehr 288 Anhang Anhang 289 Anhang Biochemisches Praktikum f r Mediziner und Zahnmediziner Im medizinischen Alltag wird mit einer Vielzahl von Stoffen und Zubereitungen umgegangen die aufgrund toxikologischer bakteriologischer chemischer oder physikalischer Eigenschaften als Gefahrstoffe zu bezeichnen sind Zu den Lernzielen eines Biochemischen Praktikums geh rt deshalb nicht zuletzt der sichere und ordnungsgem e Umgang mit Gefahrstoffen Der sichere Umgang ist u a durch das Chemikaliengesetz ChemG und die Gefahrstoffverordnung GefStoffV geregelt Verst e gegen diese Gesetze sind strafbar Alle Besch ftigten die mit Gefahrstoffen umgehen m ssen nach 20 GefStoffV ber die auftretenden Gefahren sowie ber die Schutzma nahmen im Umgang mit Gefahrstoffen unterwiesen werden Geb rf hige Mitarbeiterinnen sind zus tzlich ber die f r werdende M tte
134. ery Ogiut F2 siehe Seite 151 unterscheidet Diskussion der Ergebnisse Aufgabe 2 Welche Beobachtung haben Sie bei den einzelnen Ans tzen gemacht Ansatz Beobachtung 1 2 3 4 Diskussion der Ergebnisse 169 Biochemisches Praktikum V Aufgabe 3 Probe Leerwert Messwert Porphobilinogen Konzentration Menge 24h Bitte ber cksichtigen sie die Verd nnung im Verlaufe des Expermimentes Diskussion der Ergebnisse Aufgabe 4 Leerwert Standard Analyse Messwert Fe Konzentration ng mi Fe Konzentration mmol l Die Berechnung der Eisenkonzentration im Serum erfolgt mit Hilfe des Lambert Beer schen Gesetzes bei Ber cksichtigung der Plasmaverd nnung um den Faktor F in der Form E Standard zn c Standard F 3 E Analyse C Plasma 170 Biochemisches Praktikum V Die Eisenkonzentration des Standards betr gt 166 ug 100 ml Das entspricht 1660 ug ml oder 1660 55 85 umol l Molmasse Fe 55 85 Bitte geben Sie den Gehalt des Plasmas an Eisen in mol l an Die Normalwerte sind geschlechtsabh ngig M nner 14 3 26 9 umol l Frauen 10 7 25 1 umol l Berechnen Sie bitte ferner mit Hilfe der Konzentration und der Extinktion des Standards den Extinktionskoeffizienten des Lambert Beer schen Gesetzes E e c d d 1 cm Bedenken Sie dabei dass der Standard im Laufe des Messansatzes mit Detergens verd
135. es Agarosegel aufgetragen Wenn elektrischer Strom durch das Gel flie t wandern die negativ geladenen Fragmente mit einer Geschwindigkeit die abh ngig von der L nge der Fragmente ist in Richtung Pluspol Je k rzer ein Fragment ist umso schneller wandert es Die Mobilit t eines DNA Fragmentes ist im Agarosegel proportional zum Logarithmus seiner Molmasse Diese Gesetzm igkeit gilt aber nur f r bestimmte Molmassenbereiche und f r lineare Molek le Plasmide in der supercoiled Form zeigen z B ein ver ndertes Laufverhalten Die Fragmente k nnen im Agarosegel durch Ethidiumbromid einen Fluoreszenzfarbstoff der mit DNA Komplexe bildet unter UV Licht sichtbar gemacht werden ACHTUNG Vorsicht 1 ige Ethidiumbromid ist giftig Hautkontakt mit dem Agarosegel oder dem Elektrophoresepuffer vermeiden Vorbereitung Ein fertiges 1 iges Agarosegel wird bereitgestellt Um es zu gie en wurde 1 5 g Agarose in 135 ml Aqua bidest gegeben und zum Kochen gebracht Nach Abk hlen auf 55 C wurden 15 ml 10 fach TAE Puffer 400 mM Tris Acetat 20 mM EDTA und 15 ul 1 ige Ethidiumbromidl sung hinzugef gt und das Gel auf dem mit Tesafilm abgedichteten horizontalen Schlitten mit eingeh ngem Kamm f r die Auftragstaschen gegossen Nach Erkalten ist das Gel einsatzbereit Das Gel wurde in die mit 1 fachem TAE 10 fach TAE 1 10 verd nnt gef llte Elektro phoresekammer gestellt und der Kamm vorsichtig entfernt 37 Biochemisches P
136. ese SNPs sind die molekulare Grundlage der Biochemisches Praktikum Unterschiede zwischen Individuen Dar ber hinaus k nnen SNPs als genetische Marker verwendet werden um sogenannte Krankheitsgene zu identifizieren Krankheitsgene Krankheitsgene sind Gene die in mutierter Form f r den Ausbruch von verschiedenen Krankheiten verantwortlich sind Hierbei sind Krankheitsgene zu nennen die alleine f r den Ausbruch oder den Verlauf von Krankheiten verantwortlich sind Beispiele f r solche Krankheiten sind die Sichelzellenan mie die zystische Fibrose oder die Phenylketonurie Wesentlich komplexer und schwieriger zu definieren sind Gruppen von Genvarianten die zusammen f r den Ausbruch oder den Verlauf von Krankheiten verantwortlich sind Beispiel hierf r ist die entz ndliche Darmerkrankung Morbus Crohn Mit den gleichm ig ber das gesamte Genom verteilten SNPs gibt es jetzt nach der Sequenzierung des humanen Genoms die M glichkeit Kopplungen zwischen einzelnen SNPs und der Segregation von Krankheiten zu identifizieren Dies f hrt heutzutage zu einer vermehrten Identifizierung von neuen Krankheitsgenen So wurde im M rz 2005 von der Kieler Arbeitsgruppe um Prof Dr S Schreiber das Gen das die Krankheit Sarkoidose Morbus Boeck verursacht erkannt und in der renommierten Fachzeitschrift Nature Genetics publiziert Ein weiteres Beispiel ist die Identifizierung des ATG16L1 Gens welches mit Morbus Crohn assoziiert ist Hampe et
137. ette des Lysins und die Guanidinogruppe in der des Arginins Asparagins ure Glutamins ure Lysin Arginin pK Wert 4 0 pK Wert 4 3 pK Wert 10 8 pK Wert 12 5 H NZH A H NZH i H NZH a H N H 2 H C c H C c H C c H C c ia ia Ja ia C H C H H C H H C H u C H C H H C H Xo O O H 6 lt H NH H N gt H G N i Fia H H Durch die Anordnung dieser Ladungen auf der Oberfl che werden viele Eigenschaften des Proteins festgelegt wie z B auch die katalytische Wirkung im aktiven Oberfl chenbereich der Enzyme dem aktiven Zentrum Entsprechend dem pK Wert der jeweiligen Gruppe ndert sich die Ladung mit dem pH Wert der L sung In saurer L sung berwiegen die positiven Ladungen in alkalischer L sung die 52 Biochemisches Praktikum Ill negativen Der pH Wert bei dem ein Protein gleichviel positive und negative Ladungen tr gt wird als Isoelektrischer Punkt IEP bezeichnet Er ist eine Naturkonstante f r das entsprechende Protein L slichkeit F llung Denaturierung von Proteinen Die L slichkeit der Proteine kann durch mehrere Parameter beeinflusst werden a Durch die Anwesenheit von Fremd nicht Peptid Anteilen im Protein Hier wirken sich insbesondere Lipidanteile von Lipoproteinen vermindernd Kohlenhydratanteile in Glycoproteinen siehe Praktikum Ill hingegen verbessernd auf die L slichkeit aus b Durch die Anzahl und Verteilung der Ladungen auf der Proteinoberfl ch
138. f Gestrichelte Linien zeigen die Positionen f r enzymatische Spatung an und die Numern geben die Aminos urest Position an C Konstante Region CHO Kohlenhydrat COOH Carboxylende H Schwere Kette heavy chain L Leichte Kette light chain NH aminoterminales Ende V Variable Region In den variablen Regionen beider Ketten gibt es je drei hypervariable oder auch CDR complementarity determining region genannte Regionen und zwischen den CDR sind relativ konstante Bereiche Durch die besondere Sekund rstruktur der lg Dom nen als doppeltes Faltblatt und die Assoziation der Vp mit der VL Dom ne kommen die CDR beider Ketten in eine Richtung zu liegen und bilden zusammen das 271 Biochemisches Praktikum VIII Paratop welches die antigene Determinante Epitop bindet Zwischen der ersten CH1 und der zweiten CH2 Region der H Kette befindet sich die Scharnier oder hinge Region welche dem Molek l eine gewisse Flexibilit t verleiht was f r die Bindungsm glichkeiten der Antik rper ans Antigen wichtig ist F r die Strukturaufkl rung der Antik rper war wichtig da man das Molek l enzymatisch in Fragmente zerlegen konnte Papain spaltet die beiden H Ketten auf der N terminalen Seite der Disulfidbr cken welche beide Ketten zusammenhalten dadurch entstehen 2 F ab Fragmente die monovalent an das Antigen binden k nnen und 1 Fc Fragment welches keine Antigenspezifit t besitzt Pepsin spaltet auf der C ter
139. f die doppelten Objekttr ger mit Klebeband aus Versuch 1 und mikroskopisch beurteilen 279 Biochemisches Praktikum VIII Aufgabe 3 Agglutinierende Antik rper Antik rper besitzen also zwei oder mehr Valenzen mit denen sie an ihr Ag binden k nnen Da Antigene seien sie l sliche Molek le oder Zellen ebenfalls in der Regel multivalent sind k nnen sie sich mit Ak zu Strukturen h herer Ordnung zusam menlagern Die Reaktion von l slichem Ag mit Ak f hrt zur Pr zipitation Handelt es sich um ein zellul res Antigen f hrt die Reaktion mit einem Antiserum zu einer Vernetzung Agglutination der Zellen Sowohl bei der Pr zipitation als auch der Agglutination wird das Ph nomen der Prozone beobachtet d h im berschuss des Antik rpers kommt es nicht zur Pr zipitat Bildung Finden Sie eine Erkl rung Die Menge eines Ak in einem Antiserum wird meistens relativ angegeben Das Antiserum wird verd nnt und jede Verd nnungsstufe l sst man mit einer konstanten Menge Ag reagieren Die h chste Verd nnungsstufe bei der noch eine Reaktion zu beobachten ist gibt den Ak Titer eines Antiserums an In dieser und der folgenden Aufgabe werden neben Antik rpern gegen SRBC monoklonale Antik rper mon Ak gegen das Hapten Fluoreszein Isothiocyanat FITC eingesetzt Diese Hybridome wurden hergestellt indem M use mit humanem Immunglobulin ein starkes Immunogen immunisiert wurden an welches FITC gekoppelt worden war Die Lymp
140. g aus Organismen die sie nat rlicherweise exprimieren kann h chst aufwendig 29 Biochemisches Praktikum Il oder ganz unm glich sein In solchen F llen kann man sich die heterologe Expression in Bakterienzellen zu Nutze machen Die folgende Tabelle gibt eine bersicht ber die Vor und Nachteile der verschiedenen erh ltlichen Expressionssysteme Die angegebenen Werte sind nur Orientierungshilfen und k nnen im Einzelfall um mehrere Gr enordnungen ber bzw unterschritten werden Tab 1 Vergleich verschiedener Expressionssysteme Bakterien Hefe Insektenzelle Pflanzen S ugetierzell Ausbeute 10 1000 mg lit 10 100 mgj lite 10 100 mgj lite 10 100 mg kg 0 1 1 mg liter Disulfidbr cke nein ja Sekretion ja Sekretion ja ja Sekretion Aufwand niedrig mittel mittel niedrig hoch Preis niedrig niedrig mittel niedrig hoch Industriema s ja ja ja ja theoretisch nein aufwend Probleme Faltung Sekretion Handhabung Gesetzgebung Handhabung Faltung nein ja ja ja ja Transfekt 106 Kol ug 15 10 Kollug Sehrhoch Abh ngig 1 100 Kol pg Effizienz DNA DNA Virales Syste Pflanzenart DNA Die Expressionskassette der kodierende Bereich der zu exprimierenden cDNA wird meist unter Verwendung von PCR Technologie hinter einen entsprechenden Promotor kloniert Hierbei ist darauf zu achten dass f r die verschiedenen Expressionssysteme verschiedene Promotor erforderlich sind Bakt
141. g eine Standardsubstanz mit genau bekannter Konzentration gemessen und aus dem Verh ltnis der Extinktion und der bekannten Konzentration die unbekannte Konzentration errechnet Zum anderen kann eine unbekannte Konzentration mit Hilfe des Lambert Beer schen Gesetzes bei Kenntnis des molaren Extinktionskoeffizienten direkt ohne eine zus tzliche Messung ermittelt werden 161 Biochemisches Praktikum V Aufgabe 5 Versuche zur Gerinnung a Beteiligung des Calciums Prinzip Versetzt man Blutplasma das die Gerinnungsfaktoren Fibrinogen Il Prothrombin V Proaccelerin VII Proconvertin und X Stuart Faktor enth lt mit Gewebsthromboplastin Faktor Ill so wird sehr schnell ein Gerinnungsprozess eingeleitet wenn Ca2 in gen gender Menge zur Verf gung steht Sind die Ca2 lonen jedoch wie im Falle des Citrat Plasma komplex gebunden so dauert der Gerinnungsprozess sehr lange Ausf hrung In zwei aufeinander folgenden Ans tzen wird auf den Boden von zwei Plastikr hrchen nacheinander pipettiert Ansatz 1 Ansatz 2 Citratplasma 10 ul 10 ul Gewebsthromboplastin i 200 ul 200 ul Hepato Quick 2 Min im Wasserbad bei 37 C inkubieren dann 0 01 M CaClz 37 C 100 pl 2 H20 dest 37 C 100 yl Sofort nach Ca oder HzO Zugabe wird eine Stoppuhr oder der Sekundenzeiger der Armbanduhr gestartet und eine vorher ausgegl hte und abgek hlte Metall se 1 2 mal sec durch
142. g von Puffer 3 Die Reagenzien wird vorbereitet gestellt Auswertung Als Ma f r die Aktivit t der Lipase wird die Geschwindigkeit der Extinktionsabnahme durch verminderte Streuung an den Tr pfchen der Emulsion w hrend der Inkubation gew hlt Die Anlagerung der Lipase an die Lipidtr pfchen verl uft in Abwesenheit von Desoxycholat erheblich langsamer Daher beobachtet man am Beginn der Inkubation in Ansatz B zun chst eine konstante oder sogar leicht ansteigende Extinktion Die gemessenen Extinktionen von Ansatz A E A bzw Ansatz B E B werden gegen die Zeit aufgetragen und die Steigungen f r den linear abfallenden Teil der Kurven in Ansatz B erst nach Erreichen der Phase konstanter Reaktionsgeschwindigkeit ermittelt Das Verh ltnis der Lipaseaktivit t in Gegenwart und Abwesenheit von Gallens uren Desoxycholat ergibt sich aus dem Quotienten der Steigungen von Kurve A und Kurve B 126 Biochemisches Praktikum IV Aufgabe 6 Bestimmung von Glucose und Insulin vor und nach oraler Glucose Belastung Versuch A Glucose Belastungstest Jeweils 1 n chterner Student einer Gruppe wird mit Glucose belastet und unterzieht sich einem verk rzten Test bei dem 3 Blutentnahmen mit Teststreifen ausgewertet werden In diesem Teil des Praktikums wollen wir die Glucose Messung so vornehmen wie sie viele Diabetes Patienten selbst durchf hren n mlich mit Teststreifen Auch hier wird die hohe Spezifit t von Enzymen zur Erfassung
143. genommen haben Die T Zell Rezeptoren zytotoxischer Zellen Tc erkennen zusammen mit CD8 und Stabilisierung durch CD3 antigenpr sentierende MHC I Proteine auf infizierten Zellen die das entsprechende Antigen somit selbst endogen produzieren 276 Biochemisches Praktikum VIII Aufgabe 1 Nachweis einzelner Antik rper bildender Zellen mittels eines Plaque Tests Prinzip M use wurden mit Schaferythrozyten sheep red blood cells SRBC immunisiert Die Milzzellen dieser M use von denen ein Teil Antik rper gegen SRBC produziert hatten wurden mit einer Myelomzellinie fusioniert Die entstehenden Zelllinien Hybridome wurden auf Antik rperbildung gegen SRBC getestet Solche Hybridome sezernieren monoklonale Antik rper s u Die Hybridomzellen werden in diesem Versuch mit dem Antigen gemischt und in Kammern gef llt W hrend einer anschlie enden Inkubationszeit geben die Hybridomzellen die synthetisierten Antik rper in die Umgebung ab Die in der unmittelbaren N he dieser Zellen liegenden SRBC werden mit den Ak beladen sensibilisiert Erst in Anwesenheit von Komplement tritt Lysis der SRBC auf H molyse wobei ein Loch oder plaque in der roten Erythrozytenschicht rund um die einzelnen Ak bildenden Zellen plaque forming cells PFC entsteht Die in dieser Weise sichtbar gemachten Ak sezernierenden Zellen scheiden Immunglobuline der Klasse IgM aus s S 9 5 Man spricht in diesem Fall von direkten PFCs IgG und je
144. gewebe in das Serum kommt Um ein Beispiel zu zeigen ist in Fig 8 der zeitliche Ablauf der Enzymaktivit ten beim Herzinfarkt dargestellt Es m ssen erst einige Stunden vergangen sein ehe man berhaupt mit einem deutlichen Enzymanstieg rechnen kann In den ersten 6 48 Stunden ist die Messung von CK AST und LDH in dieser Reihenfolge am aussichtsreichsten um einen Herzin farkt zu sichern oder auszuschlie en nach dem 3 Tag die Messung der LDH Die H he der Enzymaktivit t steht in Korrelation zur Gr e des gesch digten Bezirks Durch den schnellen Anstieg der Enzymaktivit t im Serum ist die CK f r die Fr hdia gnostik des Herzinfarkts wertvoll Aufgrund ihrer Muskelspezifit t gewinnt sie Be deutung f r die Differentialdiagnose besonders gegen ber der Lungenembolie Hohe CK Aktivit ten werden insbesondere bei anderen Muskelerkrankungen myogenen Ursprungs pro gressiver Muskeldystrophie Erb Polymyositis Dermatomyositis akute Myoglobin urie gemessen Wichtig ist es zu beachten dass auch verschiedene sekund re Sch digungen der Skelettmuskulatur zur Erh hung der CK im Serum f hren z B Unf lle chirurgische Eingriffe intramuskul re Injektion von Tetracyclinen u a Medikamente Schlafmitte und Alkoholvergiftungen cardiogener Schock Kr mpfe ungewohnte k rperliche An strengung Hypothyreose B Bei anderen Krankheiten z B der akuten Hepatitis erkennt man zwar leicht die Leber als Herkunftsorgan der Enzyme
145. gmente Wie liegt die ringf rmige Plasmid DNA in L sung vor Denken Sie sich mindestens f nf Erkennungssequnzen von Restriktionsenzymen aus und schreiben Sie sie auf Wie lautet der biochemische Fachbegriff f r das Einkleben von DNA Fragmenten 48 Biochemisches Praktikum Il Aufgabe 5 Wie funktioniert die Transformation von Bakterien Was bedeutet kompetent in diesem Zusammenhang Diskutieren Sie warum es sinnvoll ist Plasmide in Bakterien einzubringen Was ist cDNA wodurch unterscheidet sie sich von genomische DNA 49 Biochemisches Praktikum Ill BIOCHEMISCHES PRAKTIKUM Ill Proteine Aufbau Eigenschaften und Funktionen Aufgabe 1 Produktion rekombinanter Proteine in Bakterien Aufgabe 2 pK Wert Bestimmung eines Puffersystems Aufgabe 3 pH Optimum einer Phosphatase Aufgabe 4 Elektrophoretische Auftrennung von mensch lichem Serum Aufgabe 5 Ku und Vmax einer sauren Phosphatase f r p Nitrophenylphosphat Kompetitive Hemmung Christian Albrechts Universit t zu Kiel Biochemisches Institut In der Medizinischen Fakult t Olshausenstrasse 40 24098 Kiel 50 Biochemisches Praktikum Ill Stichworte Vorausgesetztes Wissen e pH Wert e pK Wert e Puffer Berechnung des pH Wertes von Puffern e Einfluss des pH Wertes auf die Struktur und den S urecharakter von Aminos uren und Proteinen e soelektrischer Punkt von Aminos uren und Proteinen e Ladungsverteilung hydrophile und hydrophobe Berei
146. gro er Fleck bewirkt eine Vergr erung w hrend des Laufes durch die die Substanzen ineinander laufen und die Identifizierung erschweren k nnten Tragen Sie bitte die Substanzen nach dem unten gezeigten Schema auf Bitte die Gef e sofort wieder schlie en Kieselgel DC Platte c e m Do D e c O Re E O 72 ko oO p ge ge e C re c pen P lt e o m Z oO o o 2 2 o D o o n a En Br O 2 x T nn 8 a x X 2 2 Ss 5 S O 5 Ss O S a D pas i 7 gt 7 Her je O O x B x D X Fr lt oOo Oo U a lt Wo A uw b so sv Oo N 99 r r ei c c c c c c c c c c c Kam c c c c c c c c m m m m m m m m m m m o oO oO oO oO oO oO oO o o o E o O a 251 Biochemisches Praktikum VII Entwickeln Das Laufmittel ist ein Gemisch aus Chloroform und Essigethylester 6 4 Zur Erzielung einer gleichm igen S ttigung der Kammer mit den D mpfen des Gemisches ist die Innenseite mit Filterpapier belegt Da die L sungsmittel unterschiedlich schnell verdampfen darf der Tank nur ganz kurz zum Einstellen und Herausnehmen der Platte ge ffnet werden W hrend des Laufes muss die Kammer auf jeden Fall geschlossen sein Die Platte wird herausgenommen wenn das Laufmittel die Begrenzung bei 12 5 cm ber die gesamte Breite erreicht hat Keinesfalls darf die Platte l nger in der Kammer stehen da die Flecke sonst durch
147. h schnell wieder abgeschaltet werden k nnen 233 Biochemisches Praktikum VII Gruppe 2 Lipophile Hormone k nnen durch die Zellmembran diffundieren und somit an intrazellul re Proteine binden Die Hormone interagieren zun chst mit einem cytoplasmatischen Rezeptor und der Hormon Rezeptor Komplex wird in den Zellkern transportiert wo er sich gemeinsam mit weiteren Proteinen Transkriptionsfaktoren an spezifische DNA Abschnitte Enhancer Silencer bindet und als Transkriptions modulator wirkt Hormone dieses Typs sind Steroidhormone und Schilddr senhormone T3 T4 In der Regel handelt es sich um langsamer reagierende Systeme Stunden bis Tage mit lang anhaltenden Wirkungen 234 Biochemisches Praktikum VII Aufgabe 1 Allosterische Beeinflussung und kooperative Wechselwirkung bei dem Enzym Pyruvatkinase E C 2 7 1 40 Prinzip des Tests Phosphoenolpyruvat PEP wird durch die Pyruvatkinase PK in Pyruvat umgesetzt Die angekoppelte Indikatorreaktion der Lactatdehydrogenase LDH berf hrt den Pyruvat zuwachs in eine Abnahme von NADH H Phosphoenol pyruvat Pyruvat Lactat oO O O Lactat O X o Pyruvatkinase Ne dehydrogenase Nr 008 0 0 0 HOCH CH O CH CH ADP ATP NADH H NAD Die Extinktionsabnahme von NADH H l sst sich photometrisch bestimmen siehe Praktikum V Fructose 1 6 bisphosphat FBP ist ein allosterischer Effektor dieser Reaktion 235 Ben tigte L sungen Bioc
148. he Teilnahme an Praktikum und Seminar wird von dem jeweiligen Praktikumsleiter Seminarleiter auf diesem Laufzettel bescheinigt Der Laufzettel gilt als Nachweis f r die erfolgreiche Teilnahme an den Praktika und Seminaren Der die Student in haftet selber f r seinen Laufzettel 3 Das Praktikum beginnt p nktlich um 13 30 Uhr Zu sp t Kommende werden nicht mehr eingelassen Das Tragen eines Kittels als Schutzbekleidung ist obligatorisch eine Teilnahme am Praktikum ohne Kittel ist nicht gestattet Rauchen Essen und Trinken in den Kursr umen ist untersagt Auf die dringende Einhaltung der Sicherheitsbestimmungen beim Umgang mit Chemikalien und Experimentiermaterial wird hingewiesen 4 Jeder Teilnehmer muss nach Beendigung seiner Aufgaben den Arbeitsplatz s ubern und aufr umen 5 Jeder Kursteilnehmer f hrt ein Protokoll in dem die Versuchsergebnisse eingetragen werden Ein ordnungsgem es Protokoll ist Voraussetzung f r das Bestehen der praktischen Testate Testatordnung und Bestehensgrenze f r das Biochemiepraktikum f r Studierende der Human und Zahnmedizin 1 Das Testat wird unmittelbar im Anschluss an die Durchf hrung der praktischen bung durch den zust ndigen Gruppenassistenten erteilt Die Teilnahme am Biochemischen Praktikum gilt als regelm ig und erfolgreich wenn alle Testate erteilt wurden und nicht mehr als ein Termin entschuldigt vers umt wurde 2 Zur Erfolgskontrolle werden zwei Multiple choice Klausur
149. hemisches Praktikum VII werden im Eisbad das am Photometer mit Papierschreiber steht bereitgestellt Testpuffer 25 mM Tris 225 mM KCI 23 mM MgCl2 eingestellt auf pH 8 0 Coenzym L sung 40 mM ADP 48 mM NADH angesetzt in Testpuffer PEP L sung 20 mM Phosphoenolpyruvat angesetzt in Testpuffer LDH L sung 100 U ml Lactatdehydrogenase angesetzt in Testpuffer FBP L sung 50 mM Fructose 1 6 bisphosphat angesetzt in Testpuffer Pyruvatkinase PK Homogenisierte Rattenleber wurde bei 100 000 g zentrifugiert und der berstand der die l slichen cytoplasmatischen Enzyme enth lt wurde mit Testpuffer so eingestellt dass die PK eine Aktivit t von 0 6 U ml hat Versuchsdurchf hrung 1 In einem Wasserbad 25 C werden 4 Reagenzgl ser mit folgendem Inhalt f r ca 10 Minuten temperiert R hrchen Nr L sungen 1 Puffer 5 ml Testpuffer 2 Enzyml sung 500 ul Coenzyml sung NADH ADP 500 ul LDH L sung Enzyml sung 500 ul Pyruvatkinase berstand 3 Substrat 800 ui PEP L sung 4 Effektor 150 ul FBP L sung 236 Biochemisches Praktikum VII 2 Vor der Messung wird das 366 nm Filter in das Photometer eingesetzt Durch Senken des Schreiberstifts und Einschalten des Papiervorschubs wird der zeitliche Verlauf der Extinktionswerte aufgezeichnet Die Vorschubgeschwindigkeit kann an der Seite des Schreibers abgelesen werden Sie ist auf 2 cm min voreingestellt W hrend der folgenden 7 Ve
150. henylphosphat phosphat L sung in Acetatpuffer p NPP Gliycerophosphat 20mM Gilycerophosphat in Acetatpuffer Natronlauge 1 M NaOH in Aqua bidest Phosphatase Konzentration wird vom Betreuer mitgeteilt Die Enzyml sung muss w hrend der gesamten Versuchsdauer auf Eis aufbewahrt werden Durchf hrung 1 17 Kunststoff R hrchen werden nach folgender Tabelle beschickt e a r eaaa Pur __ mie ep E ID Glycerophosphat mi 2 Die Kunststoff R hrchen werden f r 3 Minuten bei 30 C im Wasserbad temperiert 3 Dann wird in allen R hrchen bis auf den Leerwert LW die Reaktion in Abst nden von genau 30 Sekunden durch Zugabe von je 1 ml Phosphatase gestartet Das Reaktionsgemisch muss dazu sofort mit je einem Plastikspatel gut durchmischt werden 86 Biochemisches Praktikum Ill Jeweils nach 10 Minuten bei 30 C wird die Reaktion durch Zugabe von je 4 ml Natronlauge gestoppt Je 1 ml der Mischungen werden in Kunststoff K vetten bei 405 nm gegen den Leerwert gemessen Sollte die gemessene Extinktion gr er als 1 0 sein muss die entsprechende Probe verd nnt und die Messung wiederholt werden 87 Biochemisches Praktikum Ill Anhang Die Glaselektrode Zwischen der inneren und u eren Oberfl che einer aus einem d nnwandigen Spezialglas Einstabmesskette Glasmembran hergestellten Glaskugel die mit einer L sung bekannten pH Wertes meist HCV KCI pH 2 gef llt ist entsteht eine Potentialdifferenz deren G
151. hondriales Flavin Enzym katalysiert die Dehydrierung von Succinat Bernsteins ure zu Fumarat Fumars ure Die Elektronen werden auf das Cytochromsystem der Atmungskette bertragen Es ist jedoch auch m glich im Modellversuch den Elektronentransport ber das Cytochromsystem mit Kaliumcyanid zu hemmen und als Ersatz den Farbstoff 2 6 Dichlorphenol indophenol DCPIP als Wasserstoff und Elektronen Akzeptor anzubieten Durch Elektronenaufnahme Reduktion entf rbt sich der dunkelblaue Farbstoff und geht in seine farblose Form ber Die Dehydrierung von Succinat zu Fumarat durch die Succinat Dehydrogenase wird durch Malonat Malons ure kompetitiv gehemmt Die Strukturformeln von Malonat und Succinat zeigen die chemische hnlichkeit HOOC CH Malons ure COOH Bernsteins ure Hemmung Fumars ure Er Succinat Dehydrogenase H C COOH 7 HC COOH FADH 2H i 2 Cytochrome der O N OH Endoxidation Cytochrom d unkelblau are CI 1 2 6 Dichlorphenol indophenol cI en T farblos Cyanid Hemmung O OH H CI 121 Ben tigte L sungen Puffer Biochemisches Praktikum IV 0 1 M Tris HCI pH 7 4 Succinat L sung 0 3 M Suceinat in Tris Puffer Malonat L sung 0 03 M Malonat in Tris Puffer DCPIP L sung 2mM 2 6 Dichlorphenol indophenol in Tris Puffer KCN L sung 60mM Kaliumcyanid in Tris Puffer Lebermitochondrien 5g ml Rattenleber Mitochondrien in Tris Puffer
152. hozyten dieser M use wurden fusioniert und die entstandenen Hybridome wurden auf Antik rperbildung gegen FITC getestet d h Positivit t f r FITG BSA bovines Serumalbumin und Negativit t f r BSA allein Material e BSS balanced salt solution in 50 ml R hrchen e Kultur berst nde monAK 1 roter Punkt 2 blauer Punkt 3 gr ner Punkt bzw 4 schwarzer Punkt produzierender Hybridomzellen e 1 ige Suspensionen von FITC SRBC und SRBC in 15 ml R hrchen e Rundboden Mikrotiter Platten R hrchen Eppendorf Pipetten 280 Biochemisches Praktikum VIII Methode pro Zweiergruppe soll ein mon Ak getestet werden e stellen Sie von jedem mon Ak 1 2 3 und 4 eine 1 3 Verd nnungsreihe her also unverd nnt 1 3 1 9 1 27 1 81 BSS als Leerwert gehen Sie dazu folgenderma en vor gt Beschriften 1 5 ml Reaktionsgef e Eppis mit 1 3 1 9 1 27 1 81 gt Legen Sie 400 ul BSS in jedes Eppi vor gt pipettieren Sie 200 ul des entsprechenden unverd nnten monoklonalen Antik rpers in das Eppi 1 3 5 6x auf und ab pipettieren mischen Dann entnehmen Sie 200 ul aus dem Eppi 1 3 und geben es in das Eppi 1 9 Mischen durch auf und ab pipettieren und weitere serielle Verd nnung nach dem gleichen Prinzip e geben Sie in eine Reihe der 96 Loch Mikrotiterplatten 12x 50 ul der SRBC und in die n chste Reihe 12x 50 ul FITC SRBC Suspension s Pipettierschema unten e geben Sie na
153. hriftete Reagenzgl ser Volumen in ml Kalibrieren Sie Ihr Photometer bei einer Wellenl nge von 450 nm gegen Wasser Referenz Messen Sie dann die Extinktionen der Substratmischungen vor Zugabe der Lipase Starten Sie die Reaktion durch Zugabe der Lipase Colipase L sung sorgf ltig mischen aber nicht sch tteln und verfolgen Sie die Extinktionsentwicklung bei 37 C in den beiden Ans tzen A und B Dazu lesen Sie die Extinktion beider Ans tze ber einen Zeitraum von 15 min alle 60 s ab Reagenzien Referenz Ansatz A Ansatz B Angabe in ml mit ohne Desoxycholat Desoxycholat Wasser 1 00 Substratmischung 6 1 00 mit Triolein ohne Desoxycholat Substratmischung 7 1 00 mit Triolein mit Desoxycholat Lipase 1000 U 5 0 04 0 04 Colipase 50 ug ml 0 08 0 08 125 Biochemisches Praktikum IV Reagenzien 1 Triolein L sung 1 in absolutem Ethanol 2 Tris Calciumcarbonat Puffer pH 9 15 51 4 mM Tris 0 064 mM Calciumcarbonat 3 8 06 mM Desoxycholat in Puffer 2 4 Rinderserumalbumin L sung 0 05 in Wasser BSA 5 De N I E ZEN Pankreaslipase Sigma Colipase Sigma mit Rinderserumalbumin 4 auf geeignete Aktivit t verd nnt 6 Substratmischung zu 25 ml Puffer 2 pipettiert man unter rotierender Bewegung tropfenweise 1 ml Triolein L sung 1 7 Substratmischung mit Gallens uren GC Zusatz von 1 ml Triolein L sung 1 wie unter 6 jedoch unter Verwendun
154. hts Universit t zu Kiel Biochemisches Institut In der Medizinischen Fakult t Olshausenstrasse 40 24098 Kiel Biochemisches Praktikum Stichworte Datenbanken e Allgemeine Informationen e Literatur e Sequenzdatenbanken e Strukturdatenbanken Sequenzanalyse e DNA Humanes Genom SNP s Krankheitsgene e RNA cDNA rekombinante Proteine rekombinante Proteine e Proteine Sequenzen Strukturvorhersage Terti rstruktur Primerdesign PCR Primerdesign Schmelztemperatur eines Primerpaars Biochemisches Praktikum Einleitung Datenbanken a Allgemeine Informationen Die moderne Biochemie und Molekularbiologie kann auf immense Datenmengen zugreifen die in verschiedenen Datenbanken niedergelegt sind Daten k nnen ber das Internet ber Stichw rter Namen oder Zugangsnummern abgerufen werden Diese Datenbanken m ssen eingerichtet organisiert und gepflegt werden Dar ber hinaus m ssen diese Datenbanken t glich aktualisiert werden Daher ist h ufig die Benutzung von Online Datenbanken mit Geb hren in oft nicht unerheblichem Ausma verbunden Wir geben Ihnen im folgenden Adressen von Datenbanken deren Nutzung umsonst ist da sie von Universit ten oder nationalen Gesundheitseinrichtungen getragen werden Hier k nnen neueste Berichte ber Forschungsergebnisse DNA Sequenzen Protein Sequenzen Protein Strukturen und vieles andere abgerufen werden Diese Daten geben Wissenschaftlern rzten und interessierten Laien die
155. i 37 C und 5 CO zur ck Ansatz 1 10ul L sungsmittel Kontrollansatz Ansatz 2 10ul Hydrocortisonl sung Ansatz 3 10ul Insulin Ansatz 4 10ul Hydrocortisonlosung 10ul Spironolactonl sung Mineralokortikoidhemmer 257 Biochemisches Praktikum VII Beobachten Sie die Zellen mikroskopisch Fluoreszenzmikroskop im Praktikumssaal ca 1 Stunde nach Stimulationsbeginn und protokolliereen Sie genau Ihre Beobachtungen Praktische Aufgaben 1 bis 4 Praktikumsgruppe Namen der Praktikanten Aufgabe 1 Die Aktivit t der PK AEses At ohne und mit allosterischem Effektor FBP ist als Funktion der PEP Menge in ul in einer Michaelis Menten Darstellung aufzutragen AEs At Meng e Phosphoenolpyruvat ul 258 Biochemisches Praktikum VII Wie wirkt der allosterische Effektor bei den verschiedenen Substratkonzentrationen des PEP Diskussion der Ergebnisse Aufgabe 2 Reagenzglas 1 2 3 4 5 6 7 8 Extinktion Theophyllin Konzentration mol l Bitte tragen Sie in einem Diagramm die Extinktion bei 546 nm gegen die Konzentration an Theophyllin f r die ersten 6 Reagenzgl ser auf Die Extinktion in R hrchen 7 gibt Ihnen ein Ma f r die Basalreaktion ohne Phosphodiesterase die im R hrchen 8 ein Ma f r die Basalreaktion ohne ATP Konzentrationsberechnung z B f r 50 ul Reagenzglas 2 Ausgangskonzentration 5 mM Verd nnung auf 900 ul Theophyllin 5 5 1
156. iagnostische Be deutung f r die Art des Ikterus Gelbsucht s Abb 6 Ad I Pr hepatische Phase Von der Globinabspaltung erfolgt Oxidation zu Meth moglobin Spezifisches Sub strat der mikrosomalen mischfunktionellen Oxigenase ist H matin welches an das Protein H mopexin oder an Albumin gebunden ist Die a Methinbr cke zwischen Ring I und Il wird als Kohlenmonoxyd eliminiert Ad Il Die intrahepatische Phase zerf llt in 3 Abschnitte Ila Einschleusung von Bilirubin in die Leberparenchymzellen und Transport zu den Mikrosomen Wahrscheinlich existieren 2 verschiedene Transportpro teine x und y Il b Konjugation mit Glucurons ure Es entsteht haupts chlich Bilirubin Diglucuro nid neben wenig Monoglucuronid Ilc Exkretion des wasserl slichen Bilirubin Diglucuronids in die Gallenkan lchen Ad Ill Posthepatische Phase Die Abspaltung der Glucurons ure von den Gallenfarbstoffen und die weitere Re duktion findet im Ileum und Colon durch bakterielle Enzyme statt die Reoxidation der farblosen Endprodukte Uro bzw Stercobilinogen zu den gef rbten Stoffen Uro bzw Stercobilin geschieht spontan durch Luftsauerstoff Stercobilinogen wird aus dem unteren Colon direkt in den gro en Kreislauf aufge nommen und gelangt st ndig in geringer Menge in den Harn daher ist die Reaktion von Harn mit Ehrlich s Reagenz 4 Dimethylamino benzaldehyd normalerweise in der W rme schwach positiv Ein Teil des Urobilinogens und S
157. ibt noch 1 000 Treffer USW USW Sequenzdatenbanken Nicht nur das humane Genom wurde vollst ndig sequenziert auch das Genom anderer Organismen wurde inzwischen vollst ndig entschl sselt oder ist zurzeit Gegenstand aktueller Sequenzierungen Solche sehr aufwendigen Arbeiten werden immer von vielen Arbeitsgruppen aus aller Welt in enger Kooperation durchgef hrt Es gibt verschiedene Datenbanken in denen diese Ergebnisse bzw Sequenzen zusammengef hrt werden Eine davon ist http www sanger ac uk Hier finden sie die vollst ndig sequenzierten Genome des Menschen der Maus aber z B auch vom Zebrafisch und vielen anderen Andere Datenbanken enthalten die Aminos uresequenzen der Proteine Zugriff auf alle diese Datenbanken hat man ber http www ncbi nlm nih gov entrez query fcegi CMD search amp DB protein Strukturdatenbanken Die Funktion der Proteine ist unmittelbar mit ihrer dreidimensionalen Struktur verkn pft Die Terti rstruktur vieler Proteine ist bereits aufgekl rt worden Diese Strukturen werden in der Protein Data Bank PDB gesammelt Auf diese Datenbank haben sie Zugriff unter http www rcsb org pdb Biochemisches Praktikum Dort k nnen sie sich die Koordinaten der Protein DNA oder RNA Strukturen herunterladen Sie werden allerdings auch sehr viele Links zu anderen Datenbanken finden So z B den Link zu SCOP Structural classification of Proteins http scop berkeley edu In dieser Datenbank sind
158. icher Kontakt mit dem menschlichen K rper ist zu vermeiden Bei Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen 294 Anhang Gesundheitssch dlich Gesundheitssch dlich sind Stoffe die bei Einatmen Verschlucken oder Ber hrung mit der Haut Gesundheitssch den hervorrufen k nnen z B Butanol Hydrochinon Vorsicht Jeglicher Kontakt mit dem menschlichen K rper ist zu vermeiden Krebserzeugende erbgutver ndernde und fortpflanzungsgef hr dende Stoffe werden ebenfalls mit den Gefahrensymbolen T und Xn gekennzeichnet Beim Umgang mit diesen Stoffen ist u erste Vorsicht geboten 295 Anhang tzend tzend sind Stoffe die zu einer ausgepr gten Sch digung von Haut Augen und Schleimh uten f hren k nnen z B konzentrierte S uren und Laugen Vorsicht Jeglicher Kontakt mit Augen Haut und Kleidung ist zu vermeiden D mpfe nicht einatmen Bei Unfall oder Unwohlsein sofort den Arzt hinzuziehen Glasbeh lter nur in Kunststoffgef en z B Eimer transportieren 296 Anhang Reizend Reizend sind Stoffe die bei Ber hrung mit Haut Augen oder Schleimh uten R tungen oder Entz ndungen hervorrufen k nnen z B Verd nnte S uren Laugen Desinfektionsmittel Vorsicht Gefahr der Sensibilisierung bei Hautkontakt Ber hrung mit Augen und Haut ist zu vermeiden D mpfe nicht einatmen Umweltgef hrlich Umweltgef hrlich sind Stoffe die im Falle eines Eintritts in die Umwelt die Natu
159. icher Ladungen wirksam werden fortfallen Die L slichkeit erreicht daher am IEP ein Minimum Viele Proteine fallen aus Die Ausf llbarkeit verschiedener Proteine bei verschiedenen pH Werten kann zur Auftrennung von Proteingemischen benutzt werden Bei extremen pH Werten sind alle Ladungen eines Proteins gleichsinnig Das Molek l vergr ert sein Volumen durch intramolekulare elektrostatische Absto ung c Durch die r umliche Verteilung von hydrophoben und hydrophilen Aminos uren im Proteinmolek l Die Behandlung von nativen Proteinen mit S ure Alkali organischen L sungsmitteln konzentrierten Harnstoff oder Gwuanidinl sungen sowie Behandlung mit Hitze oder UV Strahlen f hren zur Denaturierung der Proteine Als Denaturierung bezeichnet man die Auffaltung der charakteristisch gefalteten Struktur der Polypeptidkette eines globul ren Proteinmolek ls zu einer ungeordneten Struktur Dabei treten die bislang ins Molek linnere hineinragenden berwiegend hydrophoben Seitenketten an die Oberfl che Die L slichkeit sinkt daher Allgemein ndern sich bei der Denaturierung die chemischen und physikalischen Eigenschaften d Durch die Ver nderung der Zusammensetzung des L sungsmittels z B durch Beimengung von organischen Fl ssigkeiten oder von lonen Die Ausf llung von Proteinen nahe dem IEP kann unterst tzt werden durch Zusatz von organischen L sungsmitteln zum Wasser Derartige Stoffe am h ufigsten werden Alkohole und Aceton g
160. ichert ber die Glycolyse zur Acetyl CoA abgebaut durch direkte Oxidation in Pentosephosphat ber f hrt Fetts uren werden ans Blut abgegeben nach Aktivierung in Leberfette oder Plasmalipopro teine eingebaut zu Acetyl CoA abgebaut Cholesterin wird zu Gallens uren abgebaut und in den Darm ausge schieden Purine werden zu Harns ure oxidiert Aus Acetyl CoA werden Fetts uren Ketonk rper oder Steroide synthetisiert CO und H20 bei der Atmung gebildet Aus Oxalacetat wird Glucose synthetisiert Die Leber entnimmt dem Plasma ferner u a Steroide Bilirubin sowie k rperfremde Substanzen die sie durch Hydroxylie rung und anschlie ende Veresterung wasserl slich und harnf hig macht Entgiftung sie produziert dabei auch die f r die Verdauung wichtigen Gal lens uren 177 Biochemisches Praktikum VI Fast alle diese Prozesse sind durch verschiedenste Steuerungsmechanismen siehe Praktikum Ill so untereinander verkn pft dass der Stoffwechselsituation des Gesamtorganismus in jedem Augenblick Rechnung getragen werden kann Im Praktikum k nnen nur einige Bereiche des Leberstoffwechsels ber cksichtigt werden Es werden Aufgaben aus dem Aminos ureabbau dem Purinabbau dem H mabbau und der Entgiftungsfunktion sowie eine Cholesterin und Lipoproteinbestimmung durchgef hrt Bestimmungen von Enzymaktivit ten im Serum die von gro er klinischer Bedeutung sind vgl Klini
161. ickelt um mit dem Sauerstoff der Umgebungsluft ein Gemisch zu bilden das sich beim Ann hern einer Z ndquelle entz ndet Explosionsgef hrlich Explosionsgef hrlich sind Stoffe die auch ohne Luftsauerstoff durch Hitze Schlag oder Reibung zur Explosion gebracht werden k nnen 300 Anhang z B Pikrins ure Ammoniumperchlorat Vorsicht Schlag Sto Reibung Funkenbildung Feuer und Hitzeeinwirkung vermeiden Bei mechanischer Bearbeitung k hlen Gef e niemals offen stehen lassen 301 Anhang Achtung Auch nicht gekennzeichnete Substanzen k nnen gef hrlich wirken gef hrlich reagieren oder gef hrliche Stoffe freisetzen Aus diesem Grunde sollte auch jede nicht gekennzeichnete und unbekannte Chemikalie wie ein Gefahrstoff behandelt werden og 302 3 Anhang Gefahren f r Mensch und Umwelt Der Umgang mit Gefahrstoffen und Apparaturen im chemischen Labor und Praktika ist mit zahlreichen Gefahren f r die Gesundheit der dort t tigen verbunden 3 1 3 2 3 3 3 4 3 5 Gef hrdung durch Einatmung Gase D mpfe St ube und Aerosole entfalten ihre gef hrliche Wirkung wenn sie ber die Atemluft in die Lunge gelangen Gef hrdung durch Hautkontakt Hautresoptive Stoffe Stoffe die leicht die Haut durchdringen k nnen h ufig auch ohne Warnsymptome lebensgef hrliche Vergiftungen verursachen Gef hrdung durch Verschlucken Gefahrstoffe niemals i
162. ie Regulation der Blutglucose erfolgt prim r ber das Peptidhormon Insulin das in den beta Zellen der Langerhans Inseln des Pankreas synthetisiert wird Die beta Zellen des Pankreas sind auch Sensor f r die Blutglucosekonzentration Abb 2 Beim Ansteigen der Glucosekonzentration wird die Glucose ber Glucosetransporter GLUT2 in die beta Zellen aufgenommen und dann ber die Glykolyse den Citratcyclus und die Atmungskette verstoffwechselt Das dabei vermehrt entstehende ATP hemmt einen K Kanal und die Plasmamembran depolarisiert Diese Depolarisation f hrt zur ffnung von spannungsabh ngigen Ca Kan len so dass Ca Ionen ins Cytosol einstr men k nnen die dann zur Exozytose der Insulin enthaltenden Granula f hren Abb 2 109 Biochemisches Praktikum IV 88 Gegenregulation durch Anstieg der Sekretion won Insulin vermehrter Glucoseverbrauch durch Glykogensynthese Triacylglycerinsynthese Hemmung der wirkung von Glucagon Katecholaminen Glucocorticoiden physiologische Schwankungshieie 55 Blutglucose mmol l Gegenregulation durch Abfallder Sekretion von Insulin 337 Steigerung der Sekretion von Katecholaminen Glucagon Slucocorticolden Be vermehrte endogene Glucoseproduktion durch Glykogenolyse und Gluconeogenese Hemmung der Wirkung von Insulin Abb 1 Regulation der Blutglucose Konzentration L ffler Petrides Biochemie und Pathobiochemie Synthese und Wirkung von Insulin Das Insulin wird
163. ieren 311 Anhang Erste Hilfe Auf Selbstschutz achten Arzt verst ndigen Benetzte Kleidungsst cke sofort ausziehen Mit Gefahrstoffen in Ber hrung gekommene K rperstellen sind sofort gr ndlich mind 10 min unter flie endem Wasser abzusp len Betroffene Personen aus der Gefahrenzone entfernen Nach Einatmen von gesundheitsgef hrdenden Stoffen umgehen f r Frischluftzufuhr sorgen Nach verschlucken von Gefahrstoffen viel Wasser trinken lassen Bei tzenden Substanzen erbrechen vermeiden Vorsicht Gesundheitsgefahren k nnen auch erst nach Stunden auftreten 312 Anhang 6 Sachgerechte Entsorgung Es ist verboten Chemikalien und L semittel auch Kleistmengen oder Beh lter mit Restanhaftungen ber den Hausm ll oder das Abwasser zu entsorgen Zur sachgerechten Entsorgung nur Originalbeh lter z B Merck Sigma oder bereitgestellte Entsorgungskanister verwenden Spitze scharfe oder zerbrechliche Gegenst nde d rfen nur in stich und formfeste Beh ltnisse gegeben werden Sammelbeh lter f r Gefahrstoffe sind im Arbeitsbereich so aufzubewahren dass sie die bliche Arbeit nicht beeintr chtigen Fragen zur sachgerechten Entsorgung sind mit dem Sicherheitsbeauftragten Tel 2220 abzusprechen 313 Anhang Bedienungsanleitung f r Eppendorf Pipetten 1 Bedienknopf Erster Anschlag Messhub das aufge nommene Volumen wird abgegeben Zweiter Anschlag berhub der i
164. ieren Sie Unterschiede in der Lipaseaktivit t in den beiden Ans tzen 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 Ee a a NEA N ENS eN e N aN ae a eR O0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 min Extinktion 15 Biochemisches Praktikum IV Aufgabe 6 Versuch A Glucose Belastungstest Ermittelte K rperoberfl che des Studierenden 44444400000nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn Menge an zu sich zunehmender Glucose Q 4444444004nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn Menge ml an zu trinkender 28 iger Glucosel sung uu 4444424442200nn nennen 0 min 30 min 60 min 90 min mg dl mmol l 138 Biochemisches Praktikum IV Tragen Sie die Messwerte ins Diagramm ein und diskutieren Sie die Glucosetoleranz 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 mg dl 0 min 30 min 60 min 90 min Versuch B Diagramm zur Erstellung der Glucose Standardgeraden Tragen Sie die abgelesenen Extinktionswerte der berechneten Glucosestandards Ans tzen 1 6 ein 139 Biochemisches Praktikum IV uonyunxg 0 oO 100 150 200 250 300 350 4 50 Glucose mg dl Tragen Sie hier nochmals die abgelesenen Extinktionswerte der Ans tze 7 18 und die daraus errechneten Glucosekonzentrationen mg dl ein 18 17 180min 16 15 120min 14 13 90 min
165. iger Weise physiologische und pathologische Ver nderungen der K rperorgane wider Dieser Umstand verbunden mit der M glichkeit dem K rper durch einfache Verfahren Blut zu entnehmen und es der Untersuchung zuzuf hren erkl rt die gro e Bedeutung die der Diagnostik des Blutes in der Medizin zukommt Je nach Fragestellung erweist es sich als notwendig die Analysen am Vollblut Plasma Serum oder an isolierten Blutzellen durchzuf hren H moproteine H moproteine sind zusammengesetzte Proteine die aufgrund ihrer Farbstoffnatur zu den Chromoproteinen geh ren Stoffwechselrelevante Vertreter dieser Stoffklasse sind beispielsweise das H moglobin das Myoglobin die Cytochrome der Atemkette sowie die H minenzyme Katalase und Peroxidase In den Eisenporphyrinproteinen sind die Porphyrine als prosthetische Gruppe mit Proteinen assoziiert Als Katalysatoren vielf ltiger Reaktionen des Stoffwechsels sind die H mverbindungen alle direkt oder indirekt an der Verwertung des Sauerstoffs f r biologische Oxidationsvorg nge beteiligt wobei immer der Eisenporphyrinring das aktive Zentrum der katalytischen Funktion darstellt die in der Bindung von 145 Biochemisches Praktikum V Sauerstoff im Sauerstofftransfer auf Substrate oder im Elektonentransport bestehen kann H moglobin in Erythrozyten Der rote Blutfarbstoff das H moglobin Hb ist das Hauptprotein des Erythrozyten Es erf llt im menschlichen Organismus folgende Funkti
166. iler Diabetes und Diabetes mellitus Typ 2 Altersdiabetes sind mit Defekten bei der Bildung oder Wirkung des Insulins verkn pft Abh ngig von der Art und der Schwere des Diabetes ist bereits der N chternblutzucker deutlich erh ht gt 130 mg dl Das Vorliegen eines Typ 2 Diabetes kann bei normaler N chternglucose durch den oralen Glucose Toleranztest OGTT diagnostiziert werden Eine Glukosurie tritt erst bei einer Hyperglyk mie mit Werten ber 10 mmol l 180 mg dl auf Oraler Glucose Toleranztest OGTT Diese in der Klinik h ufig durchgef hrte Methode zur Fr herkennung des Diabetes ist wichtig da bei einem latenten Diabetes der N chtern Blutzucker noch normal lt 100 mg dl sein kann In dem OGTT werden 75 g Glucose ca 1g kg K rpergewicht in Form eines Getr nkes gegeben und die Glucosekonzentration nach 30 und 60 min gemessen Die Plasmakonzentration steigt dadurch auf das 1 6 1 8 fache an und sollte nach 3 Stunden wieder auf dem Ausgangswert sein Durch eine berschie ende Insulinsekreion kann es zu einer Unterschreitung des Ausgangswertes kommen posthyperglyk mische Hypoglyk mie Bei erh hten N chternzuckerwerten gt 130 mg dl sollte kein OGTT durchgef hrt werden sondern zur weiteren Diagnostik die Insulinwerte oder andere Stoffwechselparameter gemessen werden Dies ist der Fall beim Typ 1 Diabetes bei dem die Pankreaszellen kein Insulin synthetisieren und es bereits im Kindesalter zu sehr hohen Glucosewerten
167. im N chternplasma kommt Die Bewertungskriterien des OGTT nach der European Association for the Study of Diabetes EASD sind in Tabelle 1 aufgef hrt 113 Biochemisches Praktikum IV Die charakteristischen Verl ufe des OGTT bei einem gesunden Probanden und einem Patienten mit einer gest rten Glucosetoleranz sind in Abb 5 dargestellt Beim Typ 2 Diabetes liegt als Ursache in der Regel eine gest rte Insulinsensitivit t vor d h es wird vor allem in der fr hen Phase der Erkrankung ausreichend Insulin produziert das Insulin kann jedoch auf zellul rer Ebene nicht richtig wirken Diese Insulinresistenz wird ber l ngere Zeit durch eine gesteigerte Insulinproduktion Hyperinsulin mie ausgeglichen und es kommt in dieser Phase klinisch noch nicht zu einem erkennbaren Typ 2 Diabetes Erst wenn es zu einer Erm dung der Pankreaszellen kommt kann die reduzierte Insulinwirkung nicht mehr ausgeglichen werden und es tritt eine Glucoseerh hung auf und ein Diabetes mellitus Typ 2 Um die Entstehung des Diabetes zu verhindern ist es sehr wichtig die Insulinresistenz fr hzeitig mit dem OGTT zu erkennen Die wichtigsten einfach erkennbaren Risikofaktoren f r die Entwicklung einer Insulinresistenz sind bergewicht und das Auftreten von Typ 2 Diabetes in der Familie genetische Pr disposition In diesen F llen und beim Vorliegen eines N chternglucosewertes zwischen 100 und 130 mg dl sollte unbedingt ein OGTT durchgef hrt werden
168. ipette abnehmen und verwerfen 500 ul Guanidin HCI zum Sediment geben resuspendieren und in Dialyse Eppi berf hren Dialyse in Redoxpuffer I f r 20 min Gel Dialyse in Redoxpuffer II f r 20 min ja Probe Zentrifugation full speed 1 min 3 NLE E ANAL ANNL 10 ul von berstand abnehmen und in ein neues Eppi berf hren 10 ul L mmli Puffer zu den Gelproben 1 2 amp 3 geben und Gelproben dem Betreuer geben 73 Biochemisches Praktikum Ill Die Bakterien werden durch das mehrfache Einfrieren und Auftauen Iysiert Das zu inclusion bodies aggregierte Expressionsprotein wird dabei nicht gel st und kann durch Zentrifugieren von den l slichen Komponenten des Zelllysates getrennt werden Durch das Waschen in Lysispuffer bzw Waschpuffer werden unter anderem Membranproteine entfernt Die gewaschenen inclusion bodies werden nach Zusatz einer 6 M Guanidinhydrochlorid L sung disaggregiert solubilisiert Dabei liegt das Interleukin 6 Protein zwar gel st jedoch weiterhin im denaturierten Zustand vor Die Renaturierung des Proteins inklusive der Ausbildung der intramolekularen Disulfidbr cken erfolgt mittels Dialyse und wird durch ein Glutathion Redoxsystems unterst tzt Evtl pr zipitierte Proteine werden durch Zentrifugation sedimentiert Zur berpr fung der erfolgreichen Expression sowie Renaturierung von Interleukin 6 werden die Gelproben 1 2 amp 3 mittels SDS Polyacrylamidgel Elektrophorese analysiert Betreuer
169. itere Regulation der Glykogenphosphorylase b erfolgt durch 5 AMP das ein allosterischer Aktivator des Enzyms ist Da die Aktivierung mit der 5 AMP Konzentration korreliert kann dieser Effekt zur Bestimmung von 5 AMP eingesetzt werden Diese Regulation hat nichts mit der durch cAMP in Gang gesetzten Reaktions Kaskade zu tun Die cAMP vermittelte Reaktions Kaskade kann in den Versuchsans tzen nicht erfolgen da gewaschene Membranen verwendet werden und somit die f r die Phosphorylierung notwendigen cytosolischen Enzyme entfernt worden sind 238 Biochemisches Praktikum VII Unter normalen Bedingungen katalysiert die Glykogenphosphorylase die Hydrolyse von Glykogen zu Glucose 1 phosphat Bei der Nachweisreaktion wird jedoch durch eine hohe Konzentration von Glucose I Phosphat aufgrund des Substratdrucks die Glucose in Glykogen eingebaut Da eine lineare Kettenverl ngerung erfolgt k nnen Jod Atome in das neu synthetisierten Glykogen unter Bildung eines braunen Komplexes eingelagert werden Dieser Komplex hat ein Absorptionsmaximum bei 546 nm hat und somit leicht photometrisch bestimmt werden kann Ben tigte L sungen HEPES Pfferr 10 mM N 2 hydroxyethylipiperazin N 2 ethansulfon s ure HEPES 12 mM MgCl eingestellt auf pH 7 4 ATP L sung 1 mM ATP in HEPES Puffer Theophyllin L sung 5 mM Theophyllin in HEPES Puffer Glykogenphosphorylaseb ca 0 5 mg ml Enzymprotein in HEPES Puffer Phosphorylase Reagenz
170. izienz Ur mie zugleich Erh hung des Harnstoffs im Serum bei vermehrtem Nukleins ureumsatz Leuk mie Polycyth mie und vor allem bei den Stoffwechsel erkrankungen Gicht und kongenitale Hyperuric mie Lesch Nyhan Bei letzterer Er krankung liegt ein Defekt der Hypoxanthin Phosphoribosyltransferase vor die die Resynthese von Inosin und Guanosinmonophosphat aus den im Abbau anfallenden freien Basen katalysiert daher sind die Purinsynthese de novo und damit auch der Purinabbau mit Harns urebildung gesteigert Ursache der Gicht kann sowohl Purin Synthesesteigerung durch Regulationsdefekt als auch eine verminderte tubul re Ausscheidung von Harns ure sein Der XOD Hemmer Allopurinol ist das wichtigste Therapeuticum gegen Hyperuric mien Bei vielen Gichtkranken wird die Purin synthese und damit die Purinausscheidung normalisiert bei kongenitaler Hyper uric mie steigt die Xanthinausscheidung um einen quivalenten Betrag an nicht je doch der Blut Xanthinspiegel da Xanthin von der Niere wesentlich rascher ausge schieden wird als Harns ure Bei Xanthinurie fehlt XOD in der Leber anstelle von Uraten werden Hypoxanthin und Xanthin ausgeschieden es kommt zur Bildung von Xanthinkonkrementen in den Harnwegen 191 Biochemisches Praktikum VI Abbau von H moproteiden Gallenfarbstoffe Der Abbau des Porphyrinringes geht von der eisenhaltigen Form aus Der H moglo binabbau besitzt in allen Phasen hohe klinische und medizinisch d
171. k lstruktur zumindest teilweise hneln k nnen Ein Antiserum muss also immer erst durch Absorption spezifisch gemacht werden Selbst wenn ein Antiserum dann spezifisch mit seinem Antigen reagiert stellt es ein einmaliges Gemisch verschiedener Antik rper dar verschiedene Erkennungsstrukturen diotypen verschiedene Klassen und Subklassen Isotypen und verschiedene Typen der L Ketten Dies bedeutet dass ein Antiserum mit keinem zweiten identisch sein kann Heute gewinnt man meistens sog monoklonale Antik rper die zwar auch nicht grunds tzlich spezifisch sind es werden aber die f r das Antigen spezifischen Antik rper selektioniert Monoklonale Antik rper sind von h chstm glicher Reinheit und in der Menge und zeitlich unbegrenzt verf gbar Monoklonale Antik rper gewinnt man von einer Hybridzellinie oder Hybridom die durch Fusion von normalen aktivierten Lymphozyten mit einer Tumorzelllinie welche sich im Plasmazellstadium Myelom oder Plasmocytom befindet hergestellt wurden Durch diese Zellfusion 273 Biochemisches Praktikum VIII werden die Eigenschaften beider Elternzellen einmal einen gew nschten Antik rper zu synthetisieren und zum anderen die F higkeit potentiell unsterblich zu sein miteinander verschmolzen In der Praxis geschieht folgendes Versuchstiere M use oder Ratten werden mit einem Antigen immunisiert Das Antiserum wird aber nur f r Kontrollzwecke gewonnen w hrend f r diese Methode die Plasma
172. k nnen Die Bezeichnung des Stoffes und die Gefahrensymbole m ssen auf den Gef en angebracht werden Warnetiketten bestellen 305 4 3 4 4 4 5 4 6 Anhang In Arbeitsbereichen in denen mit Gefahrstoffen umgegangen wird darf nicht gegessen getrunken geraucht oder geschnupft werden Lebensmittel aufbewahren ist strengstens untersagt Beim Umgang mit Gefahrstoffen muss ein Schutzkittel eine Schutzbrille geschlossenes festes und ftrittsicheres Schuhwerk und geeignete Schutzhandschuhe getragen werden S ure Lauge best ndige Schutzhandschuhe Camprene im Fertig vorrat bestellen K nnen Gefahrstoffe in gef hrlicher Konzentration unerwartet auftreten sind geeignete Atemschutzmasken bereitzuhalten Zu beziehen beim Sicherheitsbeauftragten Tel 2220 Defekte oder besch digte Ger te bzw Apparaturen sind sofort au er Betrieb zu nehmen und als unbrauchbar zu kennzeichnen bzw die Reparatur zu veranlassen Um Absetzungsantrag f r zu entsorgende Altger te an das Dez 190 schicken Auf Pr fnachweise z B T V Plaketten ist zu achten Abgelaufene T V Plaketten sofort der Medizintechnik Tel 4004 melden Die einwandfreie lufttechnische Funktion eines Abzuges muss durch eine selbstt tig wirkende Einrichtung berwacht sein Im Fehlerfall muss eine 306 Anhang optische und eine akustische Alarmierung erfolgen Gr ne Kontrollleuchte und z B Wollfaden Bei
173. keit vorliegen Durchf hrung Elektrophorese Zur elektrophoretischen Trennung benutzen wir im wesentlichen die gleiche Technik wie im Praktikum l 118 Biochemisches Praktikum IV Der wei e Celluloseacetat Streifen wird an einer Ecke mit einem Kugelschreiber mit dem Namen versehen und 5 cm von einem Streifenende entfernt markiert man am Rand vorsichtig die Startliniie mit einem Kugelschreiber Danach wird der Streifen an einem Ende erfasst und mit dem freien Ende voran vorsichtig auf die Pufferl sung gelegt wobei keinesfalls Luftblasen zwischen dem Streifen und dem Puffer bleiben d rfen Nach mindestens 10 Minuten ist der Streifen ausreichend mit Puffer vollgesogen Er wird dann mit Hilfe der Pinzetten kurz zwischen zwei Filterpapieren von bersch ssigem Puffer befreit und danach ber die u eren Falze der Elektrophoresekammer gespannt siehe Praktikum I Figur 3 Fixiert werden die Streifen rechts und links durch zwei kleine Magnete Die Folienenden m ssen unbedingt in die Pufferl sung in beiden Teilkammern eintauchen Die Elektrophoresekammer wird nach Einlegen des Streifens bis zum Auftragen des Serums durch den Deckel der Kammer geschlossen gehalten um ein Austrocknen des Celluloseacetat Streifens zu vermeiden Sobald alle Arbeitsgruppen eines Tisches ihre Streifen in die Elektrophoresekammer gebracht haben werden die Serumproben unmittelbar nacheinander auf jeden Streifen aufgetragen Hierzu wird eine Auftragsbr cke
174. kt der Untereinheiten die Bindung von Substrat oder Effektor an einer Untereinheit ver ndert die Affinit t f r das Substrat oder den Effektor der anderen Untereinheit Die Voraussetzung hierf r ist jedoch eine intakte Kopplung zwischen den Untereinheiten So f hrt eine Dissoziation des Oligomers zur Messung von hyperbolischen anstatt von sigmoidalen Kurven vergleiche hierzu auch die O2 Bindungskurven von tetramerem H moglobin und von monomerem Myoglobin Den gleichen Effekt hat auch die partielle Denaturierung z B durch Hitze oder Quecksilber 228 Biochemisches Praktikum VII Il Substrathemmung Liegt Substrathemmung vor so ergeben sich in der doppelt reziproken Auftragung nach Lineweaver Burk keine Geraden sondern Kurven des in Abbildung 3 gezeigten Typs Diese Enzyme besitzen mindestens einen zweiten Substratbindungsort allosterisch Das an diesem allosterischen Bindungsort gebundene Substrat kann nicht in Produkt umgesetzt werden wirkt aber als Inhibitor der katalytischen Aktivit t Die Bindungskonstante K des aktiven Zentrums muss kleiner als die des allosterischen Zentrums sein da sonst das Enzym praktisch immer gehemmt w re lt AN Ku Sol Abbildung 3 Substrathemmung der Phosphofructokinase durch ATP Hemmstoff und Substrat 229 Biochemisches Praktikum VII III Beeinflussung der Enzymaktivit t durch kovalente Modifikation Zahlreiche Enzyme werden durch reversible Phosphorylierung an Tyrosin Serin
175. kt und anschlie end f r 10 Minuten in einen 60 C warmen Trockenschrank gelegt 4 Sobald der Streifen transparent geworden ist wird er im Photometer Eppendorf ausgewertet Auswertung Bestimmen Sie die Verteilung der einzelnen Serumproteine Versuchen Sie anhand der unten aufgef hrten Beispiele das Proteinprofil einer Erkrankung zuzuordnen 82 Biochemisches Praktikum Ill Diagnostische Bedeutung der Serumproteine Die Elektrophorese des Serums Gesunder ergibt unter den Bedingungen des Versuches 4 bei der photometrischen Auswertung des Streifens das folgende typische Bild Extinktion Auftragstelle GO Abbildung 14 Elektropherogramm von humanem Normalserum Die meisten Serumproteine au er Serumalbumin sind Gilykoproteine Die isoelektrischen Punkte liegen vorwiegend zwischen 4 und 6 der IEP des Serumalbumins ist 4 9 Das Albumin ist die hier am schnellsten wandernde Serumproteinfraktion Das noch rascher wandernde Pr albumin ist bei dieser Technik meist nicht erkennbar Alle brigen Fraktionen die bei der Elektrophorese langsamer als das Albumin wandern werden als Globuline bezeichnet Sie werden blicherweise in a at2 B und y Globuline unterteilt Alle Globulinfraktionen sind inhomogen d h bestehen aus jeweils mehreren unterschiedlichen Proteinen Die y Globulin Fraktion setzt sich fast ausschlie lich aus Immunglobulinen zusammen In der klinischen Chemie kann lediglich das makrochemische Bild der Bl
176. ktionsenzym Puffer Hubkolbenpipette In die Reaktionsgef e werden 20ul H20 pipettiert In beide Reaktionsgef e werden 10ul Xbal pipettiert Beide Reaktionsgef e werden 10 Sekunden bei 14 000 rpm in einer Tischzentrifuge zentrifugiert und danach f r 0 5 h im Wasserbad bei 37 C inkubiert In jedes Reaktionsgef werden jeweils 10 ul Auftragspuffer Xylencyanol 0 25 Bromphenolblau 0 25 Ficoll 400 20 in Aqua bidest pipettiert durch auf und abpipettieren gemischt und kurz zentrifugiert 30 sec 14 000 rpm rounds per minute damit sich die gesamte L sung am Boden des Reaktionsgef es befindet Die Proben sind nun fertig und k nnen auf das Agarosegel aufgetragen werden Zusammen mit den Proben aus Versuch Nr 3 41 Biochemisches Praktikum Il Auswertung Siehe Anhang 42 Biochemisches Praktikum Il Aufgabe 5 Transformation von Bakterien mit einem _ Interleukin 6 Expressionsplasmid Bakterienzellen k nnen fremde DNA Molek le aus dem Medium aufnehmen und diese k nnen sich in der Bakterienzelle replizieren Die Bakterien wurden vor einer Transformation durch eine Behandlung mit eiskaltem CaClz aufnahmef higer gemacht man spricht dann von kompetenten Zellen E coli Bakterien werden im Rahmen des Praktikums mit dem pRSET 5d hulL 6 und H2O als Kontrolle transformiert Zu jeweils 50 ul der auf Eis aufgetauten kompetenten Bakterien werden jeweils 10 ul Plasmid DNA pRSET 5d hu IL 6 Plasmid aus Aufgab
177. ktrophorese Nach Beendigung der Trennung werden die getrennten Fraktionen durch Anf rben sichtbar gemacht Der Anf rbung folgt in vielen F llen eine Entf rbung um berfl ssigen Farbstoff zu entfernen Durch das F rben von Agarosegelen mit Ethidiumbromid gelingt es geringe Mengen wie 1 10 ng DNA oder RNA sichtbar zu machen Das so erhaltene Elektropherogramm kann photometrisch ausgewertet werden Polymerase Ketten Reaktion Die Methode der Polymerasekettenreaktion polymerase chain reaction PCR hat die Molekularbiologie revolutioniert Sie erlaubt die _in vitro Vermehrung Amplifikation einer spezifischen DNA Sequenz aus wenigen Ausgangs DNA Molek len Die PCR ist eine DNA Synthese im Reagenzglas katalysiert durch eine DNA abh ngige DNA Polymerase genau wie in vivo auch Um aktiv sein zu k nnen ben tigt das Enzym e Eine Einzelstrang DNA als Matrize f r die Synthese eines neuen komplement ren Stranges In der PCR erh lt man diese Einzelstr nge durch thermische Trennung Denaturation oder Schmelzen doppelstr ngiger DNA e Ein kurzes St ck doppelstr ngiger DNA um die Synthese zu beginnen Primer Man kann also den Startpunkt der DNA Synthese festlegen indem man ein Oligonukleotidprimer hinf gt der sich an der gew nschten Stelle an die Matrize anlagert Das ist die erste wichtigste Eigenschaft der PCR man kann die DNA Polymerase gezielt zur Synthese eines speziellen DNA Bereiches einsetzen B
178. kum VI Emulsion aus der sich das Chloroform nur langsam oder gar nicht abscheidet Das Chloroform sinkt nach unten und bildet eine blau gef rbte Schicht 207 Biochemisches Praktikum VI KLINISCHER ANHANG Vorbemerkung Man orientiere sich ber die Stoffwechselfunktion der behandel ten Enzyme Im normalen menschlichen Serum l sst sich eine Vielzahl von Enzymen nachweisen die verschiedenen Quellen entstammen Geordnet nach dem Wirkungsbereich las sen sich 2 gro e Gruppen von Enzymen trennen Sekret Enzyme Gerinnungsen zyme Pseudocholinesterase Diastase Lipase und Zell Enzyme Transaminasen ALT synonym GPT AST synonym GOT Creatin Kinase CK Glutamat Dehydro genase GLDH Succinat Dehydrogenase SDH Lactat Dehydrogenase LDH Sorbit dehydrogenase SDHG Aldolase ALD F r die medizinische Diagnostik ist die Bestimmung der Zell Enzyme von Bedeutung Diese sind an den Grundstoffwechsel Ketten der Zellen beteiligt und sind daher prin zipiell in fast allen Zellen des Organismus vorhanden Die einzelnen Organe sind aber entsprechend ihren verschiedenen Funktionen mit diesen Enzymen unter schiedlich gut ausgestattet Jedes Organ hat sein typisches Enzym Muster Bei manchen Enzymen sind die Aktivit tsunterschiede zwischen den Organen so gro dass sie im Extremfall nur in einem Organ in h herer Aktivit t vorliegen in den bri gen nur in Spuren Zu diesen Enzymen z hlen z B SDHG und Fruktose 1 phosphat Aldolase di
179. l Abb 2 Ein PCR Ansatz enth lt von vornherein sehr viele Primermolek le ca 10 Oligonukleotidmolek le von einer Sorte So ist es nicht erforderlich nach jedem Zyklus f r das Annealing erneut Primer zuzusetzen 3 Zen Minuton Abb 2 Typischer Temperaturverlauf einer PCR Urspr nglich benutzte man f r die PCR die DNA Polymerase aus E coli welche bei hohen Temperaturen zerst rt wird Ein wichtiger methodischer Fortschritt wurde durch den Einsatz von DNA Polymerasen aus Bakterien die in hei en Quellen leben erreicht Heute wird in der Regel die Polymerase von Thermus aquaticus Taq Polymerase verwendet die ein Temperaturoptimum von 72 C besitzt und selbst bei 94 C noch recht stabil ist Weil dieses Enzym den DNA Denaturierungsschritt bersteht muss man im Gegensatz zu fr her heute nicht mehr f r jede Kettenverl ngerungsphase erneut Enzym zugeben Diese Entwicklung hat die Automatisierung der PCR mit Hilfe von Temperaturwechselger ten thermal cycler erm glicht Diese sind Heizbl cke die man so programmieren kann dass die Zeit und Temperaturzyklen f r eine PCR automatisch ablaufen k nnen 28 Biochemisches Praktikum Il Abb 3 Ein Temperaturwechselger t wie es im Praktikum verwandt wird Die hohe Temperaturresistenz der Tag Polymerase bringt einen weiteren Vorteil mit sich Die Bindung des Primers an die Zielsequenz das Annealing sowie die anschlie ende Synthese k nnen bei hohen
180. l H20 zur Bestimmung der Bakteriendichte wird nach 10 20 30 40 50 und 60 Minuten wie unter den Punkten 4 bis 6 beschrieben wiederholt Der Rest der Kulturen wird schlie lich in der bereitstehenden Detergenz L sung vernichtet Bestimmung der Bakterienzahl 1 2 Der f r die Messung notwendige Leerwert wird aus 0 5 ml Kulturmedium klar ohne Bakterien 0 5 ml H2O in einer dritten K vette angesetzt Diese Referenzk vette kann f r alle Messungen benutzt werden Zur Messung der optischen Dichte OD werden die K vetten mit den verd nnten Bakteriensuspensionen 0 5 ml H2O 0 5 ml Bakteriensuspension sofort nach Entnahme bei 578 nm vermessen Die verd nnten Suspensionen werden nach der Messung in die Detergensl sung gegeben Eine OD von 1 0 entspricht einer Bakterienzahl von ca 8x 10 Bakterien ml Bestimmung der Galaktosidase Aktivit t 1 Nach Entnahme aller Proben in die R hrchen No Neo und Io Iso mit je 1 ml Bakteriensuspension wird jeweils 1 ml NPG L sung zugesetzt Dann l sst man die enzymatische Reaktion in den R hrchen unter h ufigem Sch tteln bei 37 C in den Wasserb dern auf den Labortischen ablaufen wobei durch die Galactosidase das Substrat in p Nitrophenol und Galactose gespalten wird 245 Biochemisches Praktikum VII Nach 30 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 2 ml Carbonat L sung beendet Durch 5 min tige Zentrifugation auf h chster Stufe werden die Bak
181. l des berstandes in die Reagenzgl ser mit der Jod Jodkalium L sung pipettiert 8 Die Reagenzgl ser werden mit dest H2O auf genau 10 ml aufgef llt 9 Die Extinktion der violetten Farbe wird bei 546 nm im Photometer gemessen Der dunkelste Messwert sollte dazu eine Extiuktion zwischen 0 1 haben ist das nicht der Fall sind weitere Verd nnungen notwendig Als Leerwert dient eine Verd nnung von 400 ul Jod Jodkalium L sung in 10 ml H20 240 Biochemisches Praktikum VII Aufgabe 3 Induktion der Galactosidase in Escherichia coli Theoretische Grundlagen In diesem Versuch soll in einer Bakterienkultur von Escherichia coli E coli Wildtypstamm K12 die Synthese des Enzyms Galactosidase induziert werden Die von Jacob und Monod zur Regulation der Genexpression entwickelten Vorstellungen sind zwar vereinfacht vermitteln aber dennoch einen Eindruck davon welche Mechanismen bei der Aktivierung von Genen durch Hormone oder ihre Folgeprodukte in der Zelle wirksam sein k nnten Bakterien eignen sich f r den Versuch besser als Zellen h herer Organismen da sie eine kurze Generationszeit haben und die Produkte der Genaktivierung leicht zu isolieren sind E coli Bakterien k nnen mit Lactose als einziger Kohlenstoffquelle wachsen Dabei wird Galactosidase die die Spaltung von Lactose in Galactose und Glucose katalysiert zu einem Schl sselenzym des bakteriellen Stoffwechsels Wachsen E coli auf anderen C Quellen so werden nur seh
182. ladenes Teilchen wandert im elektrischen Feld umso schneller je gr er seine Ladung Q und je geringer sein Radius r ist 2 Die elektrophoretische Beweglichkeit ist eine Stoffkonstante die zur Charakterisierung von Proteinen dienen kann sofern alle brigen Parameter konstant gehalten werden Die Wanderungsgeschwindigkeit wird dar ber hinaus von der lonenst rke des Elektrophoresepufferss beeinflusst Hohe lonenst rke f hrt zu gro er W rmeentwicklung kleinen Wanderungsstrecken aber scharfen Banden Niedrige lonenst rke hingegen f hrt zu geringer W rmeentwicklung gro en Wanderungsstrecken allerdings zu unscharfen Banden Die Wahl eines Puffersystems erfolgt weitesgehend empirisch Bei pH Werten oberhalb des isoelektrischen Punktes bewegen sich Proteinmolek le zur Anode bei pH Werten unterhalb des isoelektrischen Punktes zur Kathode Elektrophoresen werden blicherweise auf Tr germaterialien die mit einer Pufferl sung getr nkt sind durchgef hrt Als Tr ger dienen Filterpapier Cellulose Celluloseacetat St rkegel Kieselgel Agarosegel und Polyacrylamidgel Die Enden des Tr gers tauchen in je eine von zwei voneinander getrennten Abteilungen einer Elektrophoresekammer die mit Elektrodenpuffer gef llt sind 25 Biochemisches Praktikum Il Bei der elektrophoretischen Trennung sammeln sich die einzelnen Komponenten der aufgetragenen Probe in Banden oder Querzonen Daher r hrt auch die Bezeichnung Zonenele
183. largewicht von je ca 35 kDa Diese Untereinheiten werden durch nicht kovalente Bindungen zusammengehalten Sie lassen sich daher z B durch Harnstoffzusatz extreme pH Verschiebung oder Ver nderung der lonenst rke von einander trennen Die Untereinheiten sind jedoch nicht v llig gleichartig sondern geh ren entweder einem H Herz oder einem M Typ Muskel an Die beiden Typen unterscheiden sich durch ihre Aminos urezusammensetzung und die elektrophoretische Beweglichkeit Die Kom bination dieser beiden Monomeren zu einem Tetrameren ergibt die 5 LDH Isoenzyme Isoenym __ Untereinheiten LDH 1 HHHH migriert bei pH 8 6 am schnellsten zur Anode LDH 2 HHHM LDH 3 HHMM LDH 4 HMMM LDH 5 MMMM migriert bei pH 8 6 am langsamsten zur Anode Die verschiedenen Isoenzyme sprechen unterschiedlich auf allosterische Effektoren z B Pyruvat an Ihr Verteilungsmuster in den verschiedenen Organen weist eine Korrelation zu deren O Versorgung auf Gut versorgte Organe wie das Herz und 104 Biochemisches Praktikum IV das Gehirn enthalten haupts chlich LDH 1 und LDH 2 man spricht daher vom H Typ w hrend Gewebe die einen berwiegend anaeroben Stoffwechsel aufweisen wie die Skelettmuskeln oder maligne Tumoren aber auch die Leber in erster Linie LDH 4 und LDH 5 den M Typ enthalten Beim Herzinfarkt Leber und Blutkrankheiten sowie malignen Tumoren gelangt LDH aus dem Zytoplasma gesch digter Zellen ins Serum
184. lucagon 2 Rezeptor G Protein Adenylatcyclase Proteinkinase A R2Ci2 gt R2Ca2 Phosphorylasekinase b gt a Glykogenphosphorylaseb gt a Phosphodiesterase Abbildung 4 Die Aktivierungskaskade der Glykogenphosphorylase 231 Biochemisches Praktikum VII B Regulation der Enzymsynthese durch nderung der Enzymmenge Langzeit Regulation Einer der wichtigsten Regulationsmechanismen in allen Lebewesen ist die Beeinflussung der Transkription von Enzym Genen durch regulatorische Proteine die ihrerseits durch allosterisch wirkende Kleinmolek le aktiviert werden Hierdurch wird die Synthese von messenger RNA Prokaryonten bzw pr messenger RNA Eukaryonten ver ndert welches im Rahmen der Proteinbiosynthese zu ver nderten Enzymmengen f hrt Im Praktikumsversuch wird die Genaktivierung Enzyminduktion in einem Bakterium durchgef hrt Sie stellt ein Modell der entsprechenden Vorg nge bei Eukaryonten dar die wesentlich komplizierter sind und die Wirkung bestimmter Hormone einschlie en C Hormonelle Regulation Hormone sind Botenstoffe die in spezifischen Dr sen oder Geweben synthetisiert werden Sie werden z B ins Blut ausgesch ttet und wirken in kleinen Mengen an unterschiedlichen Zielzellen des K rper Sie binden an spezifische Rezeptoren ihrer Zielzellen und ver ndern deren Eigenschaften in charakteristischer Weise Je nach Reichweite der hormonellen Wirkung unterscheidet man drei verschi
185. lucose umgewandelt werden um im Energiestoffwechsel relevant zu sein Die Verdauung der St rke und des Glykogen beginnt so schon im Speichel durch die _ Amylase Die dabei entstehenden Oligosaccharide und die Disaccharide aus der Nahrung werden durch verschiedenen Enzyme im B rstensaum der Mucosazellen zu Monosacchariden gespalten Diese werden dann durch die in der Membran der Mucosazellen lokalisierten Transportsysteme aufgenommen Es gibt verschiedene Systeme f r die unterschiedlichen Monosaccharide Am besten charakterisiert ist der natriumabh ngige Glucosetransporter der Hexosen aus dem Darmlumen in die Mucosazellen transportiert solange durch die ATP abh ngige Natrium Kalium Pumpe der intrazellul re Natriumspiegel niedrig gehalten wird Die Darmzellen geben die Glucose dann durch ein weiteres Transportersystem an das Blut ab Regulation der Blutglucose Nach einer kohlenhydratreichen Mahlzeit steigt der Blutglucosewert an Zur Erhaltung der Glucose Hom ostase Abb 1 ist es wichtig dass die erh hten Glucosekonzentrationen erkannt werden und eine entsprechende Regulation einsetzt Die Blutglucose Konzentration liegt normaler Weise im n chternen Zustand zwischen 80 und 100 mg dl das entspricht 4 4 6 6 mmol l Eine zu niedrige Konzentration f hrt zum Ausfall Glucose abh ngiger Zellen wie z B den Erythrozyten oder Neuronen Zu hohe Konzentrationen f hren zu den im Diabetes mellitus bekannten Sp tsch den an den Gef w nden D
186. lutstammzellen mit dem Fluoreszenz mikroskop untersucht Material e Zellkulturen von Makrophagen und Blutstammzellen e Kultur von GFP exprimierenden Bakterien E coli e Fluoreszenzumkehrmikroskop mit Kamera Aufgabe als Demonstrationspraktikum e Es werden am Mikroskop jeweils 10 30 ul der Bakterienkultur in jeweils eine der beiden Zellkulturschalen Makrophagen und Blutstammzellen pipettiert e Beobachten und dokumentieren Sie das Schicksal der Bakterien im Fluoreszenzmikroskop direkt und ca 1 Std nach dem Zusammenbringen von den Bakterien mit den Zellen 285 Biochemisches Praktikum VIII Praktische Aufgaben 1 bis 5 Praktikumsgruppe Namen der Praktikanten Aufgabe 1 Beschreiben Sie die Pr parate und diskutieren Sie die Ergebnisse Durch welche Antik rperklasse ist der Effekt wahrscheinlich vermittelt worden Benennen Sie weitere an dieser Reaktion beteiligte Molek le Aufgabe 2 Beschreiben Sie die Pr parate und nennen Sie m gliche molekulare Mechanismen der Rosettenbildung 286 Biochemisches Praktikum VIII Aufgabe 3 Wo beobachten Sie Agglutination Welche Antik rper erkennen FITC bzw SRBC Antigen Bestimmen Sie den Titer Wo liegt die Prozone Wie kann dieser Test zur Bestimmung von Blutgruppenantigenen genutzt werden Aufgabe 4 Beschreiben Sie die Ergebnisse indem sie f r jede Antik rperkonzentration die Intensit t der F rbung mit usw protokollieren Bestimmen sie n h
187. minalen Seite der Disulfidbr cken welche die beiden H Ketten verbinden und es entsteht dabei 1 bivalentes Ffab Fragment und kleinere Bruchst cke des Fc Teiles des Antik rpers Antik rper Gene Die konstanten Bereiche der Immunglobuline werden durch je ein Gen pro Klasse bzw Subklasse und den Typ der L Kette kodiert Die variablen Regionen der L Kette werden durch Gene f r etwa die ersten 100 Aminos uren der variablen Region V Gene und Mini Gensegmente f r etwa 10 Aminos uren welche die Verbindung zum konstanten Gen C Gen herstellen und deshalb J Gensegmente von engl joining genannt werden kodiert Die H Kette wird ebenfalls durch etwa gleich gro e V Gene und J Gensegmente kodiert zwischen den V und den J Genen werden aber zus tzlich Mini Gensegmente eingef gt welche die Diversit t enorm erh hen und deshalb D Gensegmente hei en Bei der Maus besitzen die meisten Antik rper L Ketten vom Typ F r diese existieren im Genom etwa 350 V Gene und 5 J Gene wo denen aber nur 4 benutzt werden k nnen Daraus errechnet sich dass es etwa 4 x 350 1400 Genkombina tion f r K L Ketten gibt F r die H Kette konnten 100 200 V Gene identifiziert werden einige Befunde zeigen aber da es tats chlich ber 1000 V Gene sein k nnen Jedes von ihnen kann mit einem von 30 D Genen und einem von 6 J Genen assoziieren Mit 500 V Genen w rde sich das Repertoire der H Kette zu 500 x 30 x 6 90 000 ergeben Da man annimmt
188. minieren die DNA Polymerase und eine Mischung aller vier Desoxynucleotid Triphosphate gegeben In dem n chsten Schritt wird das Reaktionsgemisch auf 94 C erhitzt Bei dieser Temperatur trennen sich die DNA Str nge vollst ndig voneinander Sie bilden Einzelstr nge die zu Matrizen f r die Primer und die DNA Polymerase werden Danach senkt man die Temperatur Dadurch wird die Bindung der Oligonukleotidprimer an ihre Zielsequenzen Annealing oder Hybridisierung erm glicht Der erste Primer bindet an die komplement ren Sequenzen des einen DNA Stranges der andere Primer in gewisser Entfernung am Gegenstrang Diese annealing Temperatur bestimmt entscheidend ber die Spezifit t einer PCR Im n chsten Schritt erh ht man die Temperatur auf 72 C Das ist die optimale Temperatur f r die hitzestabile Tag Polymerase Die Temperatur wird bis zu f nf Minuten lang auf 72 C gehalten damit die DNA Synthese ablaufen kann Am Ende dieser Zeitspanne erh ht man die Temperatur wiederum auf 94 C durch dieses erneute Erhitzen des Reaktionsansatzes trennen sich die kurzen doppelstr ngigen DNA Str nge der urspr ngliche und der neu synthetisierte 27 Biochemisches Praktikum Il komplement re Strang voneinander Diese Einzelstr nge werden in einer weiteren Runde der DNA Synthese zu Matrize Der ganze Zyklus Erhitzen zur Trennung der Str nge Binden der Primer Primer Hybridisierung und Kettenverl ngerung wiederholt sich 25 40 ma
189. mmungen sind allerdings nur unter standardisierten Bedingungen m glich b Herstellung von H molysat 1 ml Blut wird in einem graduierten Plastikreagenzglas 12 ml mit 9 ml einer 0 05 igen Detergensl sung versetzt und gut durchgesch ttelt Es muss eine klare rote bis rotbraune L sung entstehen Verd nnungsfaktor des H molysates F3 10 1 1 L sungen sind im Vorbereitungszimmer vorhanden 151 Biochemisches Praktikum V Die H molyse ist erst vollst ndig wenn die Beschriftung des Reagenzglases von der R ckseite durch die L sung hindurch gut gelesen werden kann F r die folgenden Aufgaben ben tigen Sie Aufgabe 1 H moglobin Bestimmung 400 ul H molysat b 2 Peroxidase Wirkung des H molysat b H moglobins weiter auf 1 1000 verd nnt 4 Eisen im Plasma 0 5 ml Citratplasma a 5 Gerinnung 0 1 ml Citratplasma a 152 Biochemisches Praktikum V Aufgabe 1 Quantitative Bestimmung von H moglobin als H moglobin Cyanid Prinzip Zur photometrischen Bestimmung muss H moglobin in ein Derivat berf hrt werden das stabil und dessen Extinktion zeitlich konstant ist Hier hat sich die Cyanid Verbindung des Meth moglobins bew hrt H moglobin wird durch KaFe lll CN g zu Meth moglobin oxidiert und anschlie end mit Hilfe von KCN in die Cyanid Verbindung berf hrt Diese Verbindung hat ein breites Absorptionsmaximum bei 541 nm und kann deshalb mit gro er Empfindlichkeit bestimmt werden Hb Il
190. n B P Lac Promotor Isopropyithio galaktosid O Lac Operator IPTG R Repressor E coli Zeie T7 Polymerase m RNA BL21 i P ofr Polym T7 Promotor P en PTCA pRSET 5d Bakteriengenom hu IL 6 Abb 4 Transkriptionsschema der IL 6 cDNA im pRSET 5d Vektor nach Transformation in E coli BL 21 F r die Transformation des rekombinanten pET Plasmids pRSET 5d IL 6 wurde der E coli Stamm BL 21 verwendet in dessen Genom das Gen f r die RNA Polymerase des Phagen T7 integriert wurde Das T7 RNA polymerasegen ist an den Promoter des Galaktosidasegens lacZ fusioniert und wird von diesem kontrolliert Nach Induktion der Expression von Phagen T7 RNA Polymerase durch das Zuckeranalogon Isopropyl B Thiogalaktosid IPTG wird die hinter einen T7 Promoter geschaltete IL 6 CDNA im Plasmid pRSET 5d IL 6 mit hoher Effizienz transkribiert 32 Biochemisches Praktikum Il Aufgabe 1 UV Spektrum von Nukleotiden In diesem Versuch sollen UV Spektren von Nukleotid L sungen aufgenommen werden Achtung F r die Photometrie im UV Bereich unter 350 nm m ssen spezielle und teure Plastikk vetten verwendet werden Seien Sie daher in der Handhabung sorgsam und r hren Sie nicht mit Glas oder Metallger ten in der K vette Durchf hrung 1 Sie erhalten die K vetten mit den unten angegebenen L sungen wobei K vette 1 mit dem SSC Puffer als Referenz dient un
191. n Lebensmittelgef e abf llen Gef hrdung durch Reaktion mit anderen Stoffen Zusammenlagerungshinweise beachten Gef hrdung durch Umwelteinfluss 303 Anhang Wassergef hrdende und umweltgef hrliche Stoffe k nnen die nat rliche Beschaffenheit unserer Umwelt gef hrlich ver ndern Die wassergef hrdenden Stoffe sind in drei Klassen eingeteilt WGK 1 schwach wassergef hrdend WGK2 wassergef hrdend WGK3 stark wassergef hrdend 304 Anhang 4 Schutzma nahmen und Verhaltensregeln 4 1 4 2 Alle Besch ftigten haben darauf zu achten dass die Sicherheitseinrichtungen im Arbeitsbereich voll funktionst chtig sind Dies sind z B Not und Augenduschen beide an flie endem Wasser angeschlossen Verbandkasten mit _Verbandbuch Feuerl scher L schdecken Not Aus Schalter Abz ge Bindemittel etc Jeder Besch ftigte muss sich mit den Sicherheitseinrichtungen und deren Anwendung vertraut machen Einrichtungen die der Sicherheit dienen auch Notausg nge d rfen nicht unwirksam gemacht oder zweckentfremdet werden Alle Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter habe im Arbeitsbereich f r Ordnung und Sauberkeit zu sorgen Dies beinhaltet v a auch das ordnungsgem e Abf llen und Etikettieren von Chemikalien Das Abf llen von Chemikalien in Lebensmittelbeh ltern ist strengstens untersagt Alle Besch ftigten haben darauf zu achten dass Chemikalien nicht verwechselt werden
192. n Substanzen hinweg Die Molek le haben dann einerseits die Tendenz in L sung zu gehen und mit dem L sungsmittel zu wandern werden aber andererseits durch die Adsorptionskr fte an das Adsorbens gebunden Es bildet sich ein Gleichgewicht zwischen Adsorption und L sung aus das bei polaren Substanzen mehr auf Seiten der Adsorption bei unpolaren mehr auf Seiten der L sung liegt Dieses Gleichgewicht stellt sich w hrend der Wanderung des L sungsmittels unendlich viele Male ein und hat zur Folge dass polare Molek le weniger weit wandern als unpolare Dabei k nnen bereits sehr geringe Unterschiede in den relevanten Eigenschaften zweier Substanzen zu gro en Differenzen der Laufstrecken f hren Das Laufverhalten einer bestimmten Substanz wird durch den Rr Wert beschrieben Dieser ergibt sich als Quotient der Entfernung des Substanzfleckes und der Entfernung der L sungsmittelfront vom jeweiligen Auftragspunkt Wanderungsstrecke der Substanz er Wanderungsstrecke des Laufmittels 249 Biochemisches Praktikum VII Ben tigte Materialien D nnschichtplatte Kieselgel auf Glasplatte Chromatographietank als Laufmittel 6 Teile Chloroform 4 Teile Essigethylester Auftragsschablone Steroidstandard 1 Corticosteron l sungen 2 Cortisol in Chloroform 3 Desoxycorticosteron 4 Aldosteron 5 stradiol 6 Desoxycortisol 7 Testosteron 8 Androstendion Gewebeextrakt 3 Extrakte A B und C aus Nebennier
193. n der Spitze verbliebene Fl ssigkeitsrest wird abgegeben 2 Einstellring Zur Einstellung des Volumens Fix Volumen Pipette Nur zur Justage 3 Abwurfknopf Spitzenabwurf 4 Justage ffnung mit dar berliegendem Kalibriersiegel zum Einstecken des Schl ssels bei der Justage 5 Abwurfh lse Zur Entnahme aus langen Gef en l sst sich die Abwurfh lse bei gedr cktem Abwurfknopf abziehen 314 Biochemisches Praktikum VIII Gentechnologische Arbeiten 51 Betriebsanweisung on Geltungsbereich Biochemie Altbau Raum 17 Projektleiter Prof Dr S Rose John Dr J Scheller Notruf 0 112 BBS Dr Jon Falk Tel 4234 Ersthelfer Veit Lebrecht Tel 2220 Betriebsarzt Dr Ralf Priebe Tel 3731 Erste Hilfe Kasten Praktikumsraum Gentechnische Arbeiten der Sicherheitsstufe S1 Der Sicherheitsstufe 1 sind gentechnische Arbeiten zuzuordnen bei denen nach dem Stand der Wissenschaft und bei Einhalten der in dieser Betriebsanweisung beschriebenen Verhaltensregeln nicht von einer Gefahr f r die Gesundheit von Menschen Tieren Pflanzen sowie der sonstigen Umwelt auszugehen ist T tigkeiten mit gentechnisch ver nderten Organismen der Risikogruppe 1 d rfen nur im gentechnischen Labor der Sicherheitsstufe 1 oder h her und von geeigneten und j hrlich unterwiesenen Personen durchgef hrt werden Weitergehende Vorschriften Gefahrstoffverordnung Mutterschutzgesetz etc k nnen in Raum135 1 OG eingesehen werden Im Labor ges
194. nale Selektion Die Antigenrezeptoren entstehen v llig unabh ngig von einer sp teren Verwendung d h das Repertoire also die Vielfalt der unterschiedlich spezifischen Antigenrezeptoren der T wie der B Zellen entsteht vor dem Auftauchen von Antigenen durch die somatische Rekombination Daraus ergibt sich dass ein Antigen nur eine Immunantwort ausl sen kann wenn Zellen mit entsprechenden Rezeptoren vorhanden sind Die Rezeptor tragenden Lymphozyten werden gleichsam durch das Antigen ausgew hlt was der Inhalt der klonalen Selektion ist Dies erscheint heute selbstverst ndlich w hrend man fr her als man sich nicht vorstellen konnte dass das Immunsystem eine anscheinend unbegrenzte Anzahl von Antigenen erkennen konnte noch meinte dass das Antigen seinen Rezeptor formt und damit passend macht 268 Biochemisches Praktikum VIII Immunantwort Es gibt Antigene welche B Lymphozyten ohne die Mithilfe von T Zellen aktivieren k nnen und es gibt Antigene die B Zellen nur mit Hilfe von T Zellen aktivieren k n nen Die ersten sind die Thymus unabh ngigen oder thymus independent TI Anti gene und die zweiten sind die Thymus abh ngigen oder thymus dependent TD Antigene Zu den TI Antigenen geh ren Polysaccharide w hrend TD Antigene mei stens Proteine sind W hrend die Immunantwort gegen TI Antigene sowohl nach prim rer und auch wiederholter Injektion immer gleich stark ausf llt und nur IgM Antik rper induziert werden i
195. nd durch Zentrifugation geerntet Isolierung und Disaggregation der Inclusion bodies Das zytoplasmatisch exprimierte IL 6 wird in der Bakterienzelle als unl sliches nicht gefaltetes Protein in sogenannten Einschlussk rpern Inclusion Bodies deponiert Um reines und biologisch aktives d h gefaltetes IL 6 zu erhalten m ssen zun chst die Inclusion Bodies von den l slichen bakteriellen Proteinen getrennt werden Daraufhin m ssen die in w ssrigen L sungen unl slichen Proteine in einem chaotropen Reagenz gel st werden Guanidinhydrochlorid als chaotrophes Salz bricht die relativ geordnete Struktur des Wassers auf erh ht also das Chaos und macht das Wasser damit gewisserma en hydrophober Die hydrophoben Interaktionen in Proteinen hingegen werden destabilisiert weil die L slichkeit der hydrophoben Seitenketten im w ssrigen Medium steigt IL 6 enth lt 4 Cysteine welche im nativen Protein zwei Disulfidbr cken ausbilden Die Gegenwart eines Redoxsystems f hrt zur korrekten kovalenten Ausbildung dieser Disufidbr cken des IL 6 71 Biochemisches Praktikum Ill 1 MNSFSTSAFG PVAFSLGLLL VLPAAFPAPV PPGEDSKDVA APHRQPLTSS ERIDKOIRYI 61 LDGISALRKE TCNKSNMCES SKEALAENNL NLPKMAEKDG CFOSGFNEET CILVKIITGLL 121 EFEVYLEYLQ NRFESSEEQA RAVOQMSTKVL IQFLAKKAKN LDAITTPDPT TNASLLTKLQ 181 AQNQWLODMT THLILRSFKE FLQSSLRALR QM Abbildung 12 Aminos uresequenz von IL 6 Renaturierung der Proteine Na
196. nden ist Ein solcher labordiagnostischer Befund kann seine Ursache in einer gest rten Erythropoese z B St rungen der Hb Synthese infolge eine Eisen oder Vitamin B6 Mangels St rungen der Erythrozytenreifung bei Vitamin B12 oder Fols uremangel einer verk rzten Lebensdauer der Erythrozyten bei Membran oder Enzymdefekten der Erythrozyten oder starken Blutverlust haben Die Diagnostik und Verlaufskontrolle einer An mie schlie t die Bestimmung der H moglobin konzentration der Erythrozytenzahl und des H matokrits ein Auch im Zusammenhang mit einer erh hten Anzahl von Erythrozyten Polyzyth mie oder Polyglobulie stellt die H moglobinkonzentration einen wichtigen diagnostischen 148 Biochemisches Praktikum V Parameter dar Eine durch Erythropoietin Epo beschleunigte Bildung und Reifung von roten Blutzellen wird z B durch Sauerstoffmangel bei Lungeninsuffizienz oder in gro en H hen ausgel st Dieser Zusammenhang wird jedoch auch gezielt ausgenutzt um durch H hentraining oder durch die Gabe von Epo die Leistungsf higkeit von Sportlern zu erh hen Referenzbereich der Hb Konzentration Hb mmol l Blut Hb g dl Blut Neugeborene 1 4 Tag 10 0 bis 13 2 16 1 bis 21 3 S uglinge 4 12 Woche 6 5 bis 7 8 10 5 bis 12 6 Kinder 6 8 bis 9 0 11 0 bis 14 5 Frauen 7 4 bis 9 7 11 9 bis 15 6 M nner 8 3 bis 11 0 13 4 bis 17 7 Blutstillung H mostase Blutgerinnung Die Blutstillung ist ein komplexer Vorgang bei dem vask
197. ne l sion endogene Aktivierung Aktivierung min 4 N sec v gt N o 4 Prothrombin gt gt Thrombin 5 i Fibrinogen eE a Fibrin Abb 2 Schematische Ablauf der Blutgerinnung im Plasma 150 Biochemisches Praktikum V BITTE SCHICKEN SIE ZU BEGINN DES PRAKTIKUMS PRO TISCH EINEN PRAKTIKANTEN ZUR BLUTABNAHME INS VORBEREITUNGSZIMMER a Herstellung von Citrat Plasma 9 ml Blut werden in einem graduierten Plastikreagenzglas 12 ml mit 1 ml einer 0 11 M L sung von Na Citrat versetzt und vorsichtig einmal durchgesch ttelt Verd nnungsfaktor des Plasma F 10 9 Die L sung wird sofort in einer Tischzentrifuge bei h chster Geschwindigkeit Stufe 4 10 min lang zentrifugiert GEGENGEWICHT Danach wird das Reagenzglas vorsichtig aus der Zentrifuge genommen und das Citrat Plasma sofort mit einer 1 mi Eppendorfpipette in ein zweites sauberes und trockenes Plastikreagenzglas pipettiert Sie ben tigen mind 5 mi Plasma pro Tisch Bitte notieren Sie sich das Volumen des Erythrozyten Niederschlages am Boden des ersten Reagenzglases Dieses Volumen ben tigen Sie f r sp tere Berechnungen da es Ihnen ungef hr den Anteil des Volumens angibt das die Erythrozyten im Blut einnehmen H matokrit V Beispiel Volumen Ery 3 5 ml Hk we F x 100 ges Die Erythrozyten machen also 39 des Blutvolumens aus der Verd nnungsfaktor des Erythrozytenvolumens durch das Plasma betr gt F2 10 3 9 Genaue Besti
198. ng benutzt wird zeigt Glucose an Die glycosidische Bindung Monosaccharide k nnen mit Alkoholen Vollacetale sogenannte Glycoside bilden Glycosidasen Kohlenhydrat hydrolysierende Enzyme spalten die Voll Acetal Bindung in Glycosiden wieder unter Wasser Freisetzung auf N OR Eu C OH ROH Voll Acetal H O_ Halbacetal Sara H O OH OH OH OH 0 0 oO HO O OH HO OH HO OH HO HO OH HO OH OH HO OH Ist bei der Vollacetalbildung der Reaktionspartner ebenfalls ein Monosaccharid entstehen Disaccharide Man unterscheidet zwei Typen von Disacchariden a Der Maltose Typ Die Acetalisierung erfolgt zwischen der Halbacetalgruppe des einen und einer alkoholischen OH Gruppe des zweiten Monosaccharids Bestimmend f r die chemischen Reaktionen der reduzierendes Vertreter dieser Reihe ist OH OH Ende die Tatsache dass das O O zweite Monosaccharid noch HO O OH seine Halbacetalgruppierung HO OH H OH 101 Biochemisches Praktikum IV enth lt Diese zeigt nat rlich dasselbe Verhalten wie in den Monosacchariden Disaccharide vom Maltose Typ zeigen also Mutarotation d h es sind a und Formen isolierbar Weiterhin ist die Endiolisierung in alkalischer L sung m glich Daraus folgt dass die Reduktionsproben z B die Trommer sche Probe positiv sind Beispiele Maltose Laktose b Trehalose Typ Die Acetalisierung erfolgt zwischen der Halbacetalgruppe des einen und dem halbacetalischen Hydroxyl des zweiten Mo
199. normal jedoch ist die Struktur einer oder mehrerer Ketten ver ndert Bei ca jedem 600 Menschen wird eine Abweichung in der Aminos uresequenz gefunden meist jedoch ohne klinische Symptome da die ver nderte Struktur sich nicht negativ auf den Sauerstofftransport auswirkt Bei der Sichelzellan mie liegt eine Punktmutation 6Glu Val in der B Globinkette vor die zwar ebenfalls den Sauerstofftransport nicht tangiert die aber bei homozygoten Tr gern beide Gene f r die Globinsynthese betroffen unter bestimmten Bedingungen zu einer Struktur nderung des H moglobins und in der Folge des ganzen Erythrozyten f hren kann Diese Sichelzellerythrozyten k nnen sich zusammenlagern und damit zu Verstopfungen von feinen Gef en und damit zu bedrohlichen und teilweise sehr schmerzhaften Organinfarkten besonders in Knochen und Milz f hren Bei quantitativen nderungen der Globinsynthese liegt eine Reduzierung der Synthese der a oder Kette vor Bedingt durch verschiedene Mutationen im betreffenden Gen wird bei der homzygoten Thalass mie Mittelmeeran mie keine oder nur eine geringe Menge der Globin Kette synthetisiert Das H moglobin dieser Patienten ist dadurch sehr stark in seiner Funktion eingeschr nkt so dass eine lebenslange Transfusionsbed rftigkeit besteht An mie Eine Erniedrigung des H moglobingehalts im Blut unter den Normalwert wird als An mie bezeichnet die fast immer mit dem Absinken der Erythrozytenzahl verbu
200. nosaccharids Die verbleibenden Hydroxylgruppen dieses Disaccharid Typs sind alle alkoholisch daher bleiben chemische Reaktionen die an die Halbacetalgruppe gebunden sind aus Disaccharide vom Trehalose Typ zeigen keine Mutarotation und Reduktionsproben sind negativ OH HO OH O HO OH Beispiele Trehalose Saccharose HO 102 Biochemisches Praktikum IV Glycoproteine Glycolipide Mucoide Die Kohlenhydratanteile dieser konjugierten Verbindungen sind meist Oligosaccharide geringer Kettenl nge 2 15 Glieder bei Glycoproteinen 4 7 bei Glycolipiden 2 4 bei Mucoiden Sie enthalten neben Glucose Galactose und Mannose auch N Acetylhexosamine und L Fucose eine 6 Desoxyhexose Als typischer Bestandteil besonders der Ganglioside vieler Glycoproteine und Antigene Blutgruppensubstanzen tritt au erdem die N Acetylneuramins ure das am weitesten verbreitete Mitglied der Familie der Sialins uren Abk rzung Neu5Ac od fr her NANA auf Ihr liegt eine Amino desoxyketulosons ure mit 9 C Atomen zugrunde OH coo N AcetyIneuramins ure MW 309 28 H N nz H Die meisten Proteine enthalten geringf gige Kohlenhydratanteile Echte Glycoproteine gt 3 Gewichtsanteil der Kohlenhydrate sind u a alle Serumproteine au er Albumin sowie manche Hypophysenhormone Das Kohlenhydrat reichste Serumprotein ist das saure a Glycoprotein Orosomucoid des Serums MW 44 kDa das sich teilweise bereits wie ein Mucoid Schleimst
201. nt Verfahren gute Kreuzvalidierungsmethode Die einfachste Methode ist die von Chou und Fasman entwickelte statistische Analyse Jeder Aminos ure wird dabei eine Wahrscheinlichkeit zugeordnet mit der man sie in einer Helix einem sheet oder einem turn findet 10 Biochemisches Praktikum Ist dieser Wert gt 1 0 findet man diese Aminos ure bevorzugt in dem entsprechenden Sekund rstrukturelement So findet man z B die Aminos uren Glu Ala Leu Met Gin Lys Arg und His bevorzugt in Helices siehe nebenstehende Tabelle So kann jeder Aminos ure in einer Sequenz ein Sekund rstrukturelement zugeordnet werden Besitzen nun z B mehrere aufeinanderfolgende Aminos uren das gleiche Sekund rstrukturelement z B H f r Helix ist es sehr wahrscheinlich dass diese Sequenz eine helikale Struktur einnimmt siehe unten EALMOGPSVIY HHHHHTTTBBB Im Laufe der Jahre sind immer kompliziertere Algorithmen auf der Grundlage dieser empirisch ermittelten Wahrscheinlichkeiten entwickelt worden Biochemisches Praktikum Terti rstrukturvorhersage Zur Vorhersage der Terti rstruktur eines Proteins sind in den letzten 10 Jahren eine Reihe von Methoden entwickelt worden Deren Besprechung w rde den Rahmen dieses Skriptes sprengen Erw hnt sei lediglich die Methode des molecular modelling Diese Methode setzt voraus dass die Struktur eines homologen Proteins bereits bekannt ist Zun chst werden die Sequenzen der beiden
202. nter auch ALT im Organ vermindert sind Dies f hrt zu einem relativ st rkeren AST Anstieg im Serum Um zu pr fen inwieweit das Leber hnliche Verh ltnis der beiden Transamina sen auf eine Verschiebung ihrer Aktivit ten im cytoplasmatischen Raum der Leberzelle zugunsten der AST oder auf das Vorliegen von Zellnekrosen zur ckzuf hren ist dient dann die Messung der GLDH im Serum wenn dieses mitochondriale Enzym trotz m igen Transaminase anstiegs im Serum relativ hoch ist spricht das f r eine verst rkte Nekrose Rate in der Leber 600 500 400 o Bilirubin mg 100 mi 300 200 100 e egm Abbildung 11 Enzym Aktivit ten und Bilirubinkonzentration im Serum im Verlauf der akuten Hepatitis 213 Biochemisches Praktikum VI Schwierig kann die Analyse von Serum Enzym Mustern werden wenn eine Erkran kung zum Enzym Austritt aus mehreren Organen f hrt Besonders wichtig f r die Verlaufsbeobachtung werden solche berlagerungen von Enzym Mustern wenn sie im Ablauf von Erkrankungen neu hinzutreten und damit Hinweise auf Komplikationen geben So ist um bei den Enzym Verteilungsmustern in Herz und Leber zu bleiben die berlagerung des typischen Infarkt Musters durch das Auftreten h herer Aktivi t ten von ALT das fr heste Indiz f r eine akute Stauungsleber im Gefolge der cardi alen Sch digung Herzdekompensation Mit dem Auftreten der Leberstauung steigt die Aktivit t Leber spezifischer Enzyme im Serum Di
203. nverse Regulierung von Albumin und Globulin geschlossen werden kann Als Paraprotein mie wird das Auftreten neuartiger bis zu einem bestimmten Zeitpunkt im Organismus nicht vorhandener Proteine definiert In dieser Form ist der Begriff fragw rdig geworden da als Paraproteine bezeichnete Proteine durchaus im Normalfall vorkommen wie beispielsweise alle Immunglobuline Plasmazellen entstammen Im Rahmen einer Paraprotein mie treten Immunglobuline nur deswegen vermehrt auf weil eine Plasmazelle carzinomat s entartet ist sich klonal vermehrt hat was Plasmazellen im Normalzustand wenn keine Entz ndung vorliegt nicht tun und zusammen mit ihren Tochterzellen unabh ngig vom Bedarf Immunglobuline synthetisiert und ins Blut sezerniert Der Zustand der carzinomat sen Vermehrung der Plasmazellen hei t Plasmocytom 84 Biochemisches Praktikum E E UP Y Al a a P y O Normalserum nephrotisches A y Globulin mie Syndrom E A Q R BY akute Entz ndung Leberzirrhose Enteritis mit Eiwei verlust E E E Q2 A 1 B Y N 0 0 3 5 Bisalbumin mie Plasmocytom Doppelplasmacytom Abbildung 15 Elektropherogramme von Serumproteinen bei verschiedenen Erkrankungen A Albumin 85 Biochemisches Praktikum Ill Aufgabe 5 Km und Vmax einer sauren Phosphatase f r p Nitrophenylphosphat kompetitive Hemmung Ben tigte L sungen Acetat Puffer Nitrophenyl E F y 1mM p Nitrop
204. off verh lt es ist z B nicht wie fast alle brigen Proteine durch Trichloressigs ure f llbar Um das Verh ltnis von Kohlenhydrat zu Protein messen zu k nnen muss neben der Bestimmung der Kohlenhydrate auch der Gehalt an Protein in der zu untersuchende L sung bestimmt werden Die Glycolyse Die Glycolyse ist der Hauptabbauweg der Glucose in fast allen Organismen Unter aeroben Bedingungen wird ihr Endprodukt das Pyruvat ber den Citratcyclus und die Atmungskette weiter verbrannt siehe unten In Zellen h herer Organismen in denen nur begrenzt Sauerstoff verf gbar ist z B im intensiv arbeitenden Muskel 103 Biochemisches Praktikum IV wird Pyruvat zu Lactat reduziert Das Enzym Lactatdehydrogenase ist im Cytosol aller Zellen lokalisiert und kommt in Form von verschiedenen Isoenzymen vor Isoenzyme Viele Enzyme des Zellstoffwechsels existieren in multiplen Formen die zwar die gleiche Reaktion katalysieren sich aber in Prim r Sekund r Terti r und oder Quart rstruktur sowie in ihrer Kinetik und eventuell in ihrer Affinit t f r Regulatoren unterscheiden Man nennt diese Formen Isoenzyme Sie k nnen durch bliche Proteintrennungsmethoden voneinander getrennt werden Isoenzyme sind u a bekannt von der Hexokinase der Pyruvatkinase der Creatinkinase und der Lactatdehydrogenase Die LDH Isoenzyme des Menschen Molekulargewicht ca 140 kDa bestehen aus 4 etwa gleich gro en Untereinheiten mit einem Moleku
205. on In einem kleinen Bruchteil der Zellen wird die DNA in das Genom der Zelle eingebaut und dann bei jeder Zellteilung mitvermehrt Dies nennt man dann eine stabile Transfektion Da dieser Einbau sehr selten ist verwendet man dazu Selektionsmarker z B ein Resistenzgen gegen bestimmte Antibiotika Nach Zugabe des Antibiotikums berleben nur jene Zellen die die DNA in ihr Genom integriert haben Im vorliegenden Fall wurden die Zellen transient chemisch transfiziert Da die Transfektion selbst aber l nger dauert werden Ihnen schon fertig transfizierte Zellen bereitgestellt Im folgenden Versuch soll die Lokalisation des Rezeptors vor und nach Hormonbehandlung mikroskopisch analysiert werden Als Stimulanz wird das Glucocorticoid Cortisol verwendet Gilucocorticoide sind vorwiegend an der Regulation des Kohlenhydratstoffwechsels und in geringerem Ma e an der Regulation des Lipidstoffwechsels beteiligt Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Anpassung des Stoffwechsels unter Stressbedingungen In gro en Dosen wirken sie immunsuppressiv und werden therapeutisch zur Unterdr ckung von Immunreaktionen eingesetzt Cortisol stellt den Hauptvertreter der Glucocorticoide dar Allerdings kann Cortisol auch an den Mineralocorticoid Rezeptor binden und diesen aktivieren Der Rezeptor bindet Cortisol mit fast gleicher Affinit t wie das klassische Mineralocorticoid Aldosteron 256 Biochemisches Praktikum VII Die Plasmahalbwertszeit von zirkulier
206. onen Sauerstoff Transport im Blut Beteiligung am Kohlendioxid Transport im Blut Anteil an der Aufrechterhaltung des Blut pH Wertes wichtigstes nicht Bicarbonat Puffersystem H moglobin ist aus 4 Uhntereinheiten aufgebaut Jede Untereinheit enth lt eine Peptidkette Globin und ein H m Protoporphyrin IX mit einem zentralen Eisenatom Nur das zweiwertige Eisen Fe ist in der Lage den im Blut wenig l slichen Sauerstoff unter Bildung eines koordinativen Komplexes HbO reversibel zu binden ohne dabei selbst oxidiert zu werden Dieser als Oxygenierung bezeichnete Vorgang senkt den isoelektrischen Punkt von Hb geringf gig ab was mit der Freisetzung von Protonen verbunden ist Parameter wie Temperatur pH Wert CO3 und O Partialdruck beeinflussen die Anlagerung bzw die Abgabe des Sauerstoffs Die Sauerstoffkapazit t des Blutes wird unter physiologischen Bedingungen nahezu ausschlie lich von der Konzentration des Hb bestimmt Kohlenmonoxid H moglobin COHb und Meth moglobin MetHb H miglobin sind nicht in der Lage Oz zu binden Die Affinit t von CO zum Hb ist gegen ber dem Sauerstoff 200 300 fach h her so dass bereits eine geringe Konzentration des giftigen Gases die O Transportf higkeit des Blutes stark reduziert Au erdem bedingt CO dass die Abgabe des noch am Hb gebundenen O in den Geweben erschwert ist Eine erh hte CO Hb Konzentration 1 15 findet man im Blut von Rauchern oder bei Personen die durch Autoa
207. oteine der HDL jedoch kein Risiko dar Im Gegenteil wurde festgestellt dass zwischen koronarer Herzkrankheit und HDL bzw der HDL Cholesterin Konzentration eine inverse Beziehung besteht Das bedeutet da einer erh hten HDL Konzentration eine Schutzwirkung gegen ber der Entstehung einer Atherosklerose zugeschrieben wird Die Schutzwirkung der HDL beruht auf ihrer F higkeit Cholesterin von den peripheren Zellen in die Leber zu transportieren Einschlie lich der Zellen des Blutgef systems vermindern sie somit den Cholesteringehalt Das von den HDL in die Leber transportierte Cholesterin wird dort zum Teil in Gallens ure umgewandelt und in den Intestinaltrakt ausgeschieden 199 Biochemisches Praktikum VI Tabelle 1 Nicht Behandlungsbed rftig behandlungsbed rftig LIPID Konzentration mg dl Gesamitcholesterin lt 200 gt 300 Triglyceride lt 200 gt 200 HDL Cholesterin gt 35 lt 35 LDL Cholesterin lt 190 gt 190 D wenn HDL Cholesterin lt 35 mg dl 2 wenn Gesamtcholesterin und oder Triglyceride gt 200 mg dl Versuchsprinzip Zur Bestimmung des Gesamtcholesterins im Serum m ssen die in den Lipoproteinen vorhandenen Cholesterinfetts ureester durch Cholesterin Esterase in nichtverestertes Cholesterin und freie Fetts uren hydrolysiert werden 1 In einer enzymatischen Reaktion wird das freie Cholesterin durch Luftsauerstoff unter Mitwirkung von Cholesterin Oxidase zu A Cholestenon und Wasserstoffp
208. prope 546 nm Ccno mmol l 26 54 Eprobe 546 nm Diskutieren Sie die Werte anhand der dazugeh rigen Tabelle 1 Ist eine Behandlung notwendig 220 Biochemisches Praktikum VI Probe 1 Extinktion mg dl mmol l Gesamt Cholest erin Gehalt HDL Cholest erin Gehalt LDL Cholest erin Gehalt Diskussion der Ergebnisse 221 Biochemisches Praktikum VI Aufgabe 6 Diskussion der Ergebnisse 222 Biochemisches Praktikum VII BIOCHEMISCHES PRAKTIKUM VII Regulation des Stoffwechsels Hormone Aufgabe 1 Aufgabe 2 Aufgabe 3 Aufgabe 4 Aufgabe 5 Allosterische Beeinflussung und kooperative Wechselwirkung bei dem Enzym Pyruvatkinase E C 2 7 1 40 Untersuchung einer membranst ndigen Phosphodiesterase Induktion der Galactosidase in Escherichia coli Analyse von Steroidmustern unterschiedlicher Organe Untersuchung zur Stimulierung von Zellen durch Mineralocorticoide Christian Albrechts Universit t zu Kiel Biochemisches Institut In der Medizinischen Fakult t Olshausenstrasse 40 24098 Kiel 223 Biochemisches Praktikum VII Stichworte Regulation der Enzymaktivit t durch Substratkonzentration Produkt und Substrathemmung durch allosterische Effektoren Eigenschaften allosterischer Enzyme R ckkopplung Kooperativit t durch kovalente Modifikation Proteinkinasen Proteinphosphatasen durch Beeinflussung der Transkription
209. ptischen Test wird mit der 1 Aufgabe gegeben Weiterf hrende Literatur Das Basiswissen kann anhand aller Lehrb cher der Biochemie und Pathobiochemie erarbeitet bzw wiederholt werden Die metabolischen Aufgaben des Organs werden in entsprechenden Kapitel Leber behandelt Stichworte Querverweise zu Stoffen Enzymen Stoffwechselwegen im Zusammenhang mit den u g Fragen sind dabei zu beachten Die Pathobiochemie der Leber wird ausf hrlich im L ffler Petrides Biochemie und Pathobiochemie Springer Verlag behandelt F r einige Fragen Themen sollten zus tzlich Lehrb cher der Anatomie Inneren Medizin Physiologie herangezogen werden Weiterf hrende Fragen 1 Beschreiben Sie Zelltypen der Leber intrahepatisches Gef system Gallenwege die anatomisch biochemische Beziehung Pankreas Leber Geben Sie eine bersicht Spezifische Stoffwechselleistungen der Leber anatomische Zonierung der Leber Zonierung der metabolischen Prozesse Beschreiben Sie Verfettung Fibrose Zirrhose Hepatitis Ascites portocavale Anastomosen portaler Hochdruck Zusammen mit Nr 3 Wie werden Ver nderungen bzw Lebersch digung diagnostiziert Beschreiben Sie die typischen Enzyme in der Serumdiagnostik Welche M glichkeiten hat der Mensch Ethanol abzubauen Trinkfestigkeit Unvertr glichkeit Acetaldehyd Syndrom Lebersch digung P4so Induktion bersicht zu Blutproteine die in der Leber bzw ni
210. r e dem Unterschied Einf ll ffnung der pH Werte innerhalb und au erhalb Referenz i lek l unbekannter pH der Messl sung der Kugel e trode ges ttigte KCI L sung proportional ist Zur Messung der Potentialdifferenz werden in die Innen und in die Mess elektrode Au enl sung je eine Ableitelektrode eingetaucht L sung mit ae T konstantem pH Um definierte Potentiale an der u eren Ableitelektrode zu schaffen wird sie in eine ka n w a Diaphragma ges ttigte KCIl L sung getaucht die ber eine Fritte Diaphragma elektrisch leitend mit der Glasmembrah Messl sung verbunden ist KCl L sung wird gew hlt da einerseits die Ableitelektrode davon nicht vergiftet ver ndert wird und andererseits KCI beim Herausdiffundieren durch die Fritte ein ann hernd konstantes elektrisches Diffusionspotential erzeugt bliche Glaselektroden verwenden als Ableitelektroden Ag AgCI Elektroden oder Hg Hg gt Cl gt Kalomel Elektroden F r pH Wert Bestimmungen werden blicherweise Einstabmessketten verwendet bei denen beide Ableitselektroden klein ausgef hrt und in einem doppelwandigen Glasrohr untergebracht sind Die Glasmembran wird aus besonderen Glasarten hergestellt bei denen das Potential allein durch H Ionen bestimmt wird Erst hohe Konzentrationen von Na oder K wirken st rend Alkalifehler Eliminiert man rechnerisch oder apparativ durch Kalibrieren aus der gesamten gemessenen Potenzialdifferenz das Eigenpo
211. r L sung erkl ren sich weitgehend aus der helikalen Sekund rstruktur die gute Wasserl slichkeit der Umfang der Helix ist von Zucker und Phosphatresten besetzt die Rigidit t der Molek le und ihre Empfindlichkeit gegen Scherkr fte im Innern der Helix sind die Basen stapelartig dicht bereinandergeschichtet die im Vergleich zur globul r aufgekn uelten RNA oder Einstrang DNA geringere Dichte u a m Bei Erhitzung w sseriger Nukleins urel sungen werden die H Br cken aufgebrochen die komplement ren Str nge trennen sich die Nukleins ure wird denaturiert sie schmilzt Durch die Aufl sung der Sekund rstruktur ndern sich bei 1 Zwischen den Ebenen benachbarter Basen treten dabei Attraktionskr fte auf sog Stapelkr fte engl stacking _G C aufgrund seiner drei Wasserstoffbr cken tr gt zum stacking erheblich mehr bei als A T mit nur zwei Wasserstoffbr cken 20 Biochemisches Praktikum Il DNA alle oben aufgez hlten Eigenschaften sprunghaft Zur experimentellen Verfolgung des Schmelzens eignet sich am besten der sogenannte hyperchrome Effekt d h der Anstieg des Extinktionskoeffizienten gew hnlich bei 260 nm gemessen bei Denaturierung Der hyperchrome Effekt ist in etwa proportional dem Gehalt an AT Paaren der zwischen 20 und 50 betr gt Das Schmelzen erfolgt bei DNA in einem relativ engen Temperaturbereich Die Temperatur halbmaximaler Extinktionszunahme wird als der Schmelzpunkt Tm des D
212. r Materialausgabe abholen 2 Die beiden Gef e werden 120 Minuten bei 37 C in einem Eppendorf Inkubationsblock inkubiert 3 Nach Beendigung der Inkubation werden je 20 ul des Enzymansatzes und der Kontrolle getrennt auf einen sauberen Glas Objekttr ger getropft 4 Je 20 ul Antiserum Anti B werden dazu gegeben und mit einem R hrspatel gemischt 117 Biochemisches Praktikum IV Aufgabe 3 Trennung der Isoenzyme von Lactatdehydrogenase LDH durch Elektrophorese Die von der LDH katalysierte Reaktion dient dazu die LDH Isoenzyme auf den Celluloseacetatstreifen nach der Elektrophorese sichtbar zu machen Da das gebildete NADH H unsichtbar ist wird es durch eine Farbreaktion angezeigt Der an NADH H gebundene Wasserstoff wird mit dem Katalysator Phenazinmethosulfat auf die organische Base Nitroblau Tetrazoliumchlorid die Formel ist kein Pr fungsstoff bertragen und dadurch zu einem schwerl slichen violetten Farbstoff reduziert Formazin unl slich Phenacinmethosulfat CH s0 A N N Pyruvat qh 6 Q H C C COOH b a l 2Cl O NADH H N 2H Q CH i TEN H CO OCH N H C C COOH AO O O t d N 8 KA CH OSO H Lactat 20 NO NO Nitroblautetrazoliumchlorid NBT l slich Bei der elektrophoretischen Trennung der Serumproteine erh lt man auf dem Tr ger f nf Bereiche mit Lactatdehydrogenase Aktivit t Es m ssen also 5 Enzyme mit unterschiedlicher elektrophoretischer Beweglich
213. r durch Haem Niere Hirn Makrophagen Bilirubin Serum co Biliverdin NADPH N Biliyerdin unkonjugierte Hyperbilirubinaemien NADP Reduktase I Produktions pr hepat Ikterus s gt 2 Bilirubin e E UDP Glucoron Hiruhi i E s ure Bilirubin SILIGHFONYE zellen Ban Transferase 2 8 UDP EEE w PR mikrosomal Er lt Bilirubin Diglucuronifintrazellul r 3 z 5 RN Galle S Bilirubin Diglucuroni Galle 5 _ bacterielle g Q g Glucuronidasen gt a a Be 772 27 0 2 527 S Bilirubin Diglucuronid Br S Baduktasen und S S bakteriell spontane Hydrolyse E ___ Mesobilirubir Diglucuronid _ 3 o SRE EA SEEN nz Darm D 3 Er Mesobilirubinogen E c Se Urobilinogen Urobilin S Ren spontane Oxidation Stercobilinogen gt Stercobilin Harn Faeces Faeces Abbildung 6 bersicht ber den H moglobinabbau 194 Biochemisches Praktikum VI Aufgabe 4 Bestimmung des Gesamt Bilirubins und des konjugierten direkten Bilirubins im Serum mit der Diazoreaktion nach Jendrassik Gr f Prinzip 1 Bildung von Diazonium Chlorid Sulfanils ure bildet mit NaNO in stark salzsaurer L sung Diazonium Chlorid Dieser Stoff ist unbest ndig und muss daher jeweils frisch hergestellt werden Abb 6a 2 Nachdem Sulfanils ure mit Natriumnitrit diazotiert wurde reagiert sie mit Bilirubin zu einem Azofarbstoff in neutraler L
214. r in ihrer Beschaffenheit gef hrlich ver ndern k nnen 297 Anhang z B Anilin Tetrachlorethan Vorsicht Niemals in die Kanalisation den Boden oder die Umwelt gelangen lassen 298 Anhang Brandf rdernd Brandf rdernd sind Stoffe die einen Brand ohne Luftzufuhr unterhalten k nnen und die Heftigkeit eines Brandes betr chtlich erh hen z B Peroxide Chromschwefels ure Vorsicht Jeglichen Kontakt mit brennbaren Stoffen vermeiden Hochentz ndlich Leichtentz ndlich Hochentz ndlich leichtentz ndlich sind Stoffe deren Gase und D mpfe mit der Umgebungsluft explosionsf hige Gemische bilden die bei Anwesenheit einer Z ndquelle z B elektrisch oder mechanisch erzeugte Funken hei e 299 Anhang Oberfl chen offenes Feuer entz ndet werden k nnen Hochentz ndliche Stoffe haben einen Flammpunkt unter 0 C und einen Siedepunkt unter 36 C z B Acetaldehyd Diethylether Leichtentz ndliche Stoffe haben einen Flammpunkt unter 12 C z B Aceton Ethanol Vorsicht Hochentz ndliche und leichtentz ndliche fl ssige Stoffe k nnen sich bei Zimmertemperatur an der Luft auch ohne Energiezufuhr erhitzen und entz nden Sie sind meist leichter als Wasser und bei Raumtemperatur fl chtig Z ndquellen fernhalten m glichst Absaugung vorsehen Gef e niemals offen stehen lassen Der Flammpunkt ist die tiefste Temperatur bei der ein brennbarer Stoff gen gend Gase D mpfe entw
215. r m glichen Gefahren und Besch ftigungsbeschr nkungen zu unterrichten Mutterschutzgesetz Arbeitsmedizinische Vorsorge ist Vorraussetzung f r den Umgang mit Gefahrstoffen Tel Hochschularzt 3731 Nachfolgend wird der Umgang mit Gefahrstoffen im Biochemischen Praktikum erl utert 290 Anhang Umgang mit Gefahrstoffen Inhaltsverzeichnis Was ist ein Gefahrstoff Erkennen von Gefahrstoffen Gefahren f r Mensch und Umwelt Schutzma nahmen und Verhaltensregeln Verhalten im Gefahrfall und Erste Hilfe Sachgerechte Entsorgung R und S S tze Chemikalienliste Betriebsanweisungen er a Be u 1 as E 0 Wichtige Telefonnummern Zusammengestellt wurden diese Unterlagen von Veit Lebrecht Biochemisches Institut Sicherheitsbeauftragter CAU Kiel 291 Anhang 1 Was ist ein Gefahrstoff Zu den Gefahrstoffen geh ren alle festen fl ssigen und gasf rmigen Substanzen die a beim Umgang herstellen verbrauchen lagern transportieren die menschliche Gesundheit gef hrden und oder b die Natur Wasser Boden Luft Klima Pflanzen und Tiere in ihrer Beschaffenheit gef hrlich ver ndern k nnen z B Giftstoffe Farbstoffe Treibgase S uren und Laugen 2 Erkennen von Gefahrstoffen Gefahrstoffe werden nach den jeweils g ltigen Fassungen des Chemikaliliengesetzes sowie der Gefahrstoffverordnung entsprechend der EG Richtlinien gekennzeichnet Die Kennzeichnung ist ein wesentlicher Teil der Informationen
216. r wenige Molek le Galactosidase gebildet w hrend auf Lactose die Synthese des Enzyms durch die Steigerung der Transkription des B Galactosidase Gens massiv induziert wird Neben B Galactosidase ben tigt die Bakterienzelle zur Nutzung der Lactose zus tzlich die Galactosid Permease und die B Galactosid Transacetylase Die Information f r die Prim rstruktur dieser drei Enzyme ist linear in einem Operon auf der DNA angelegt Bei der Transkription dieser Information durch mRNA Synthese lagert sich die RNA Polymerase zun chst an die Promotor Region an Die Transkription der Strukturgene Z Galactosidase Y Galactosid Permeasse und A Galactosid Transacetylase durch die RNA Polymerase kann nur dann beginnen wenn die Operatorregion frei und nicht durch einen Repressor blockiert ist Dieses Repressorprotein ist ein Produkt des Regulatorgens und dient der Zelle als Kontrollinstrument bei der Transkription Die Gesamtheit von Promotorregion Operatorregion und den Strukturgenen wird als Lac Operon bezeichnet 241 Biochemisches Praktikum VII Induktor Substrat Induktion Repressor Substrat T RNA Te NL en Nine 7 4 mRNA Reprassorgn_ BNA Lac Operon Ein Repressor hat zwei Bindungsstellen eine f r den Operator und eine andere f r den Induktor Durch die Bindung des Induktors wird die Konformation des Proteins allosterisch so ge ndert dass die Affinit t zum Operator aufgehoben wird Der Operator ist je
217. raktikum Il Durchf hrung 1 Die Probe kann auf das Gel aufgetragen werden Hierzu wird die Probe mit einer 50 ul Eppendorfpipette mit gelber Spitze aufgezogen Die Spitze wird dann so in die mit Puffer gef llte Geltasche gebracht dass das Ende ungef hr auf halber H he der Tasche ist Dann wird die Spitze langsam bis zum ersten Druckpunkt der Eppendorfpipette entleert Nicht bis zum zweiten Druckpunkt entleeren damit keine Luft in die Tasche gebracht wird Durch das Ficoll ist die Probe schwerer als der Elektrophoresepuffer und sinkt auf den Boden der Tasche Wenn alle Gruppen ihre Probe aufgetragen haben wird die Spannungsquelle vom Praktikumassistent angeschlossen Hierbei muss auf die richtige Polung geachtet werden wie sind DNA Fragmente geladen 4 Das Gel wird mit 140V ca 3 4 Stunde laufen gelassen 5 Nach Ende der Elektrophorese wird vom Gel unter UV Licht bei einer Wellenl nge von 254 nm ein Polaroidfoto durch den Praktikumsassistent angefertigt und Ihnen als Fotokopie ausgeh ndigt Au erdem haben Sie die M glichkeit sich das Agarose Gel auf einem UV Licht emittierenden Tisch anzuschauen Auswertung Siehe Anhang dazu ben tigen Sie dieses Bild des DNA Gr enstandards Hinf fragments of the vector Abb 4 DNA Gr enstandard f r die Agarosegel Elektrophorese 38 Biochemisches Praktikum Il Aufgabe 4 Restriktionsverdau von Plasmid DNA und Gr enbestimmung von DNA Fragment
218. ransport a Proliferation Glycogensynthese HANT gr tetaege age Hi Er Erik I t HLI Hiii i IE Abb 4 Signalwege des Insulinrezeptors Die GLUT 4 sind ohne Insulin in Membranvesikeln in der Zelle lokalisiert und werden durch die Insulinstimulation in die Membran transportiert um die Glucose aufnehmen zu k nnen Die Gilykogensynthese wird ber die Phosphorylierung der Glykogensynthasekinase 3 GSK3 und die Glykolyse ber die Phosphofruktokinase 2 PFK2 beeinflusst Das hei t ber den Insulinrezeptor Signalweg wird die Glucoseaufnahme im Fettgewebe und in den Muskelzellen gesteigert und damit die Plasmakonzentration gesenkt In der Zelle wird die Glucose dann je nach Bedarf in den verschiedenen Geweben entweder als Glykogen gespeichert oder ber die Glykolyse abgebaut und zur Energiegewinnung genutzt F llt die 112 Biochemisches Praktikum IV Glucosekonzentration wird kein Insulin mehr gebildet und bei dem Unterschreiten der physiologischen Untergrenze von 4 4 mmol l werden die Gegenspieler Glucagon die Katecholamine und Glukocorticoide aktiv Gest rter Glucosestoffwechsel im Diabetes mellitus In der Bundesrepublik Deutschland leben ber 3 Millionen Diabetiker von denen 1 Million nichts von ihrer Krankheit wissen Das ist besonders unter dem Gesichtspunkt dass schlecht eingestellter Diabetes die Lebenserwartung deutlich reduziert erschreckend Die Krankheitsbilder des Diabetes mellitus Typ 1 Juven
219. re 0 9 Herzmuskel 0 28 Leber 0 8 Gallens uren spielen w hrend des enzymatischen Abbaus der Nahrunggslipide eine zentrale Rolle Sie besitzen eine polare und unpolare Molek lregion und sind effektive biogene Detergenzien die in der Lage sind durch Bildung von Mizellen Nahrungslipide zu solubilisieren und damit ihre Oberfl che und ihre Angreifbarkeit f r Verdauungsenzyme zu vergr ern Mit den durch enzymatischen Aufschlu der Nahrungslipide entstandenen Abbauprodukten Fetts uren Cholesterin lipidl sliche Vitamine u a bilden die Gallens uren wasserl sliche Komplexe die von den Mucosazellen der Darmschleimhaut resorbiert werden k nnen Ein zweiter unabh ngiger Effekt ist die F higkeit der Gallens uren zur Aktivierung der Pankreaslipase und der Cholesterinesterase Pankreaslipasen Nahrunsstriglyceeride Gemisch aus Fetts uren Monoacylglycerine Glycerin 123 Biochemisches Praktikum IV Medizinische Bedeutung Die klinische Diagnose von Pankreaserkrankungen ist wegen der besonderen Lage Struktur und Funktion der Bauchspeicheldr se schwierig Die Lipase gilt als empfindlicher und spezifischer diagnostischer Parameter f r Pankreaserkrankungen Die Bestimmung der Lipaseaktivit t im Serum kann entscheidend zur Diagnostik der akuten Pankreatitis akutes Abdomen und der chronischen Pankreatitis beitragen Bei akuter Sch digung des Pankreas treten die sonst nach Nahrungsaufnahme in den Darm abgegebenen Enzyme
220. rin Gallens uren e Entgiftungsreaktionen 174 Biochemisches Praktikum VI Einleitung Die Leber als das wichtigste Stoffwechselorgan des Organismus enth lt 60 70 Leberparenchymzellen Hepatozyten und Nicht Parenchymzellen wie Endothelzellen Kupfferzellen und Itozellen Die meisten metabolischen Aktivit ten der Leber sind in den Hepatozyten lokalisiert Sie betreffen insbesondere den Kohlenhydratstoffwechsel vergl auch Praktikum 4 innerhalb dessen die Leber das wichtigste Glykogenspeicherorgan des Organismus ist Da sie dar ber hinaus ber die F higkeit zur Gluconeogenese verf gt spielt sie eine zentrale Rolle im Rahmen der Gilucosehom ostase Auch im Lipidstoffwechsel ist die Leber von ausschlaggebender Bedeutung Sie synthetisiert aus Lipiden und Kohlenhydraten Triacylglycerin reiche Lipoproteine die VLDL Very Low Density Lipoprotein Diese werden von der Leber sezerniet und in den extrahepatischen Geweben metabolisiert Dabei entstehen IDL Intermediate Density Lipoprotein die die Vorstufen der LDL Low Density Lipoprotein bilden In der postresorptiven und besonders in der Hungerphase nimmt die Leber aus dem Blut gro e Mengen an Fetts uren auf die jedoch nur zum Teil zur Deckung des Energiebedarfes herangezogen werden zum Teil dagegen in Acetacetat und y Hydroxybutyrat umgewandelt und wieder abgegeben werden Eine gro e Zahl von Proteinen des Blutplasmas werden in der Leber synthetisiert und von ihr sezerniert
221. rinzip Das Enzym ALT EC 2 6 1 2 synonym GPT Glutamat Pyruvat Transaminase katalysiert die Gleichgewichtsreaktion ALT GPT L Alanin a Ketoglutarat gt L Glutamat Pyruvat Coenzym ist Pyridoxalphosphat Man bestimmt die Aktivit t der ALT aus der Geschwindigkeit der durch diese Reak tion hervorgerufenen Pyruvat Zunahme Das entstehende Pyruvat wird in der gekop pelten durch Lactatdehydrogenase LDH EC 1 1 1 27 katalysierten Indikator Re aktion bestimmt LDH Pyruvat NADH H Lactat NAD 182 Biochemisches Praktikum VI Eyss Abbildung 2 Schema des optischen Tests mit Indikator Reaktion ALT Bestimmung Da das Gleichgewicht weit auf der rechten Seite liegt wird jedes aus Alanin gebil dete Mol Pyruvat durch LDH zu Lactat reduziert Dabei wird 1 Mol NADH zu NAD oxidiert Damit wird der Extinktionsabfall pro min direkt der Geschwindigkeit der Transaminierungs Reaktion proportional Die Reaktionsfolge ist in Abb 2 dargestellt Ausf hrung Biochemica Test Combination ALT In ein Reagenzglas wird folgende L sung pipettiert 1 600 ul Puffer Alanin Konzentration der Reagenzl sung Phosphat Puffer 93 mmol l pH 7 4 L Alanin 933 mmol l LDH gt 1 4 U ml NADH 0 21 mmol l a Ketoglutarat 21 mmol l 2 Man l sst sie f r 5 min bei 25 C im Wasserbad stehen und gie t in eine 1 cm Halbmikrok vette um 3 Man startet die Reaktion mit 100 ul H molyse freiem Serum gr ndlich mischen
222. roduktion eingesetzt f r eine dauerhafte Aufbe wahrung eingefroren und in fl ssigem Stickstoff gelagert In den Versuchen sollen Sie einige Reaktionsm glichkeiten von Antik rpern am Bei spiel von monoklonalen Antik rpern gegen Schaferythrozyten SRBC kennenlernen Nachweisreaktionen f r Antik rper Die Prinzipien der durchzuf hrenden Teste sind folgende Antik rper verbinden sich mit ihrem Antigen und dies kann zu sichtbaren Erscheinungen f hren Ein l sliches Antigen kann dadurch ausgef llt werden d h es entsteht eine Tr bung was man als 274 Biochemisches Praktikum VIII ein Pr zipitat bezeichnet die Reaktion hei t dementsprechend Pr zipitation Zellu l re Antigene k nnen vernetzt z T auch verklumpt genannt werden was man als Agglutination bezeichnet Bei beiden Reaktionen kann es bei berschuss eines der Reaktionspartner zum Ausbleiben der Reaktion kommen man spricht dann von einer Prozone Deshalb m ssen grunds tzlich alle Reaktionen mit abgestuften Konzentrationen einer Verd nnungsreihe meistens des Antik rpers untersucht werden Die h chste Verd nnungsstufe die noch eine positive Reaktion erkennen l sst nennt man den Titer des Antiserums bzw des monoklonalen Antik rpers Eine Titerangabe ist also immer eine Verd nnungsangabe z B 1 128 oder dessen reziproker Wert von 128 Ein moderne empfindliche Nachweisreaktion f r Antik rper bzw Antigen ist der ELISA enzyme linked immuno sorbent as
223. rogramm zum Anschauen von Proteinstrukturen ist das Programm rasmol das man sich von der Adresse http www umass edu microbio rasmol herunterladen kann Man kann sich mit diesem Programm Strukturen ansehen einzelne Aminos uren markieren das Protein am Bildschirm drehen und vieles mehr Primerdesign Polymerasekettenreaktion PCR Die PCR ist eine in vitro Methode zur enzymatischen Amplifikation spezifischer DNA Segmente Sie erm glicht die selektive Vervielf ltigung der DNA Matrize auch aus einem komplexen Gemisch heraus Man kann also ein einziges Molek l amplifizieren Die Reaktion basiert auf der Anlagerung Annealing und Verl ngerung Extension zweier Oligonukleotidprimer die entgegengesetzt die Zielregion in einer Duplex DNA flankieren Die Reaktion besteht aus aufeinanderfolgenden Amplifikationszyklen die jeweils durch drei Phasen unterschiedlicher Temperatur charakterisiert sind In der ersten Phase der Denaturierungsphase wird die doppelstr ngige DNA durch Erhitzen in einzelstr ngige DNA berf hrt Durch das anschlie ende Absenken der Temperatur in der Annealingphase kommt es zur Hybridisierung Anlagerung der Oligonukleotidprimer an die komplement ren Zielregionen der denaturierten Matrizen DNA In der Extensionsphase werden die Primer durch eine thermostabile DNA Polymerase bei hoher Temperatur zur Verminderung unspezifischer Primerhybridisierung komplement r zur Matrize verl ngert In den aufeinanderfolgenden
224. rombinl sung starten Bestimmen Sie wie bei a die Gerinnungszeiten und diskutieren Sie die Unterschiede Um ungeronnene Blutproben zu erhalten kann man Heparin einsetzen oder das Ca durch Komplex Citrat EDTA oder Niederschlagbildung Fluorid entfernen 163 Biochemisches Praktikum V Heparin wird dar ber hinaus auch therapeutisch eingesetzt seine Wirkung kann durch Proteinkationen Protaminchlorid wieder aufgehoben werden Neben Thrombin wird auch Faktor IXa aktivierter Christmas Faktor intravaskul res System und Faktor Xa aktivierter Stuart Faktor gehemmt Mit der Thrombin Gerinnungszeit kann der Plasma Fibrinogen Gehalt erfasst werden wichtig z B bei St rungen der Fibrinogenbildung genetische Defekte Lebersch den bzw erh htem Fibrinogenverbrauch Verbrauchskoagulopathie gesteigerte Fibrinolyse 164 Biochemisches Praktikum V Klinischer Anhang St rungen der Biosynthese von H m Porphyrien Bei den Porphyrien werden Porphyrine Porphyrinogene und ihre Vorstufen vermehrt gebildet und entweder im Gewebe abgelagert oder im Harn bzw Kot ausgeschieden Die meisten Porphyrien sind angeborene und vererbbare Enzymopathien Analog zu den erblichen St rungen des Aminos urestoffwechsels ist nicht die durch Enzymausfall bedingte Minderproduktion von Blutfarbstoff die Krankheitsursache sondern die Giftwirkungen von neu entstehenden falschen Porphyrinisomeren oder von liegen bleibenden Zwischenprodukten
225. ropolar gebundenen austauschbaren lonen werden als Gegen lonen bezeichnet 156 Biochemisches Praktikum V Bei Kationenaustauschern bestehen die Ankergruppen oder Fest lonen meist aus Sulfons ureresten SO3 bzw SO3H stark sauer oder CGarboxylgruppen COO bzw COOH schwach sauer Anionenaustauscher tragen meist prim re sekund re oder terti re Aminogruppen Je nach Art der Gegen lonen liegt ein Austauscherharz entweder in S ure Basen oder Salzform vor Je nach pH und Zusammensetzung der L sung mit der das Harz in Ber hrung kommt erfolgt ein Austausch dieser Gegen lonen Die Korngr en der lonenautauschermateriallen werden in mm oder im angels chsischen Sprachraum nach genormten Siebgr en in mesh Zahlen angegeben Aus der Kapazit t eines Ionenaustauschers kann abgelesen werden wie viel Gegen lonen ein Austauscher aufzunehmen vermag Sie wird in mmol g angegeben Ist das Aufnahmeverm gen des Austauschers ersch pft kann dieser regeneriert werden Dies geschieht im Falle eines Kationenaustauschers durch Auswaschen mit verd nnter Salzs ure wobei Na oder andere Kationen in L sung gehen der Austauscher geht dabei von der Salz in die S ureform ber Entsprechend k nnen Anionenaustauscher durch Sp len mit verd nnten Alkalien regeneriert werden Versuchsanordnung Zur Chromatographie dient ein Plastikrohr von 0 7 x 30 cm mit etwas Glaswolle eingestopft Darin befinden sich ca 2 ml eines Anionenaustaus
226. rsuchsans tze kann der Schreiber eingeschaltet bleiben F r die im folgenden Pipettierschema aufgef hrten Versuche 1 bis 7 wird entsprechend den Punkten 3 bis 5 verfahren Versuch Nr Puffer ul 1 Enzyml sung ul 2 PEP L sung ul 3 IFBP L sung ul 4 2 700 150 10 10 3 150 4 150 5 150 6 150 7 3 Puffer 1 und Enzyml sung 2 werden in einer verj ngten Halbmikro K vette gemischt und in das Photometer gestellt Damit die Extinktion im Versuchsverlauf hinreichend abnehmen kann muss sie nun durch Einstellen der Skala am Photometer jeweils in den Bereich zwischen 0 75 und 1 0 gebracht werden Die Abnahme der Extinktion f r den Leerwert wird nun f r ca 2 Minuten bestimmt 4 Die Enzymreaktionen werden jeweils durch Zugabe der entsprechenden PEP Menge 3 direkt in die K vette gestartet dabei kann mit der Pipette die L sung gleichzeitig gemischt werden Die Reaktion wird f r ca 2 Minuten verfolgt so dass anhand einer Geraden auf dem Schreiberpapier durch die Extinktions nderung AE366 mit der Zeit AT die Aktivit t des Enzyms bestimmt werden kann 5 Anschlie end werden 10 ul des allosterischen Effektors die FBP L sung 4 wieder direkt in die K vette zugegeben Nach erneutem Mischen wird wieder ber einen Zeitraum von ca 2 Minuten die Extinktions nderung bestimmt 237 Biochemisches Praktikum VII Aufgabe 2 Untersuchung einer membranst ndigen Phosphodiesterase Der Zusammenh
227. rtlich Cholesterin ist ein essentieller Bestandteil von Zellmembranen Dar berhinaus ist es Vorstufe von Steroidhormomen Gallens uren und Vitamin D In Zellmembranen beeinflu t es die Fluidit t der Membranen deren Regulation f r ein berleben der Zelle unverzichtbar ist Um den Cholesterinstoffwechsel verstehen zu k nnen muss man die Funktion von Lipoproteinen kennen Es gibt vier verschiedene Lipoproteine die Chylomikronen die VLDL die LDL und die HDL high density Lipoproteine Chylomikronen werden in den Mucosazellen des Darms gebildet Sie geben zun chst ber die Lipoproteinlipase Triglyceride an die extrahepatischen Gewebe vor allem Fettgewebe und Muskel ab und transportieren anschlie end als Chylomikronenremnants die briggebliebenen Lipide insbesondere Cholesterin und Cholesterinester in die Leber VLDL transportieren Lipide aus der Leber in andere Organe Dabei geben sie ebenfalls ihren Triglyceridanteil mit Hilfe der Lipoproteinlipase an die extrahepatischen Gewebe ab und verwandeln sich anschlie end im Blut in LDL die vor allem Cholesterinester transportieren ber den LDL Rezeptor gelangen die LDL in jede K rperzelle Das von den Zellen aufgenommene Cholesterin kann in die Zellmembranen eingebaut werden Unabh ngig von der Versorgung mit Cholesterin ber die LDL kann Cholesterin vom Organismus auch selbst synthetisiert werden Cholesterin ist nicht essentiell HDL transportiert das Cholesterin aus diesen Zellen zur
228. rung des pH Wertes das 3 wertige Eisen von seinem Transportprotein dem Transferrin gel st Durch Zugabe des Chromogens wird ein Farbkomplex gebildet dessen Extinktion bei 578 nm gemessen wird Da der Farbkomplex des 2 wertigen Eisens stabiler ist als der des 3 wertigen wird vor der Zugabe des Chromogens mit Ascorbins ure Vitamin C reduziert gt Abb 6 Struktur des Eisenkomplexes dessen Konzentration photometrisch bestimmt wird z B Bathophenanthrolin 4 7 diphenyl 1 10 phenanthrolin disulfat oder Analoga 160 Biochemisches Praktikum V Ausf hrung Drei Plastikk vetten werden folgenderma en beschickt Leerwert Standard Analyse Detergens Puffer pH 5 5 mit 1 0 ml 1 0 ml 1 0 ml Ascorbins ure dest Wasser 0 1 ml Eisen Standard 0 1 ml Citratplasma 0 1 mi Man l sst es 10 min bei Raumtemperatur stehen setzt 200ul Chromogen je K vette zu mischt und misst innerhalb einer Minute die Extinktion des Standards und der Analyse gegen den Leerwert Leerwert auf Null abgleichen im Eppendorf Photometer bei 578nm Da die Methode sehr empfindlich ist sollt jeder Ansatz mit einem anderen Plastikspatel gemischt werden Dieser Versuch Eisen Bestimmung im Plasma und Versuch 1 H moglobin Bestimmung zeigen 2 M glichkeiten auf die bei der Konzentrationsbestimmung mit Hilfe der Absorptionsphotometrie angewandt werden k nnen Zum einen wird gleichzeitig mit der unbekannten L sun
229. rwertung von Nucleosiden bersicht zu Abbaust rungen 17 Bilanz des Harnstoffzyklus wozu Arginin Enzymdefekte amp Orotatacidurie 18 Funktion der Leber f r den Kupferhaushalt des K rpers Vorkommen und Funktion von Kupfer Wilsonsche Krankheit 19 Leber und Eisen H mosiderose H mochromatose hepatische Porphyrien 20 Unterst tzen Sie Nr 6 St rungen bei Bildung und Export von Lipoproteinen in der Leber Auswirkungen Namen der Krankheitsbilder 21 Prinzip der Biotransformationsreaktionen beteiligte Enzyme Beispiele f r Endobiotica und Xenobiotica Entsorgung mit Nr 5 22 Welche Rolle spielt die Leber f r den Kreatinstoffwechsel Bei der Calciferol Bildung Als Vitaminspeicher 23 Lokalisation und Ablauf der Ketogenese Ketoacidose Metabolische Acidose Rolle der Leber im S ure Basen Haushalt 181 Biochemisches Praktikum VI Aufgabe 1 Bestimmung der Aktivit t der Alanin Amino Transferase ALT im Serum Die Aminotransferasen auch als Transaminasen bezeichnet sind eine Gruppe von Enzymen die eine reversible Umwandlung von alpha Ketos uren in Aminos uren katalysieren durch bertragung einer Amniogruppe Die diagnostisch wichtigsten Aminotransferasen sind die Alanin Aminotransferase ALT und die Aspartat Aminotransferase AST Die Bestimmung der Serumaktivit ten beider Enzyme wird insbesondere zur Diagnostik Differenzierung Verlaufs und Therapiebeurteilung von Erkrankungen der Leber verwendet P
230. s Extinktion Glucose Glucose gemisch Konz im Konz Testansatz ul ul pi 365 mg dl mg dl 1 Leerwert 100 900 2 Glucose 10 90 900 3 Standard 25 75 900 4 1 10 50 50 900 5 Verd nnung 75 25 900 6 40 mg dl 100 900 131 Biochemisches Praktikum IV 132 Biochemisches Praktikum IV Patient Nr Nr Probe Vol H O Reaktions Extinktion Glucose Glucose gemisch Konz im Konz im Testansatz Serum pi ul pl 365 mg dl mg dl 7 Probe vor 100 900 8 Glucose 1001 900 einnahme 9 Probe nach 100 900 10 30min 100 900 11 Probe nach 100 900 12 60min 100 900 13 Probe nach 100 900 14 90min 100 900 15 Probe nach 100 900 16 120min 100 900 17 Probe nach 100 900 18 150min 100 900 Der h ufigste Messfehler entsteht durch unsaubere optische Fl chen der K vette Daher bitte beim Ausgie en der K vette auf Sauberkeit achten Versuch C Insulin Bestimmung Auswertung gegebener ELISA Daten Die Serumkonzentrationen von Hormonen sind um mehrere Gr enordnungen niedriger als die von Stoffwechselprodukten wie Glucose Die Quantifizierung von derart niedrigen Konzentrationen erfordert besondere Messmethoden In der medizinischen Diagnostik haben sich dazu immunologische Verfahren etabliert dabei nutzt man die hohe Spezifit t und vor allem Affinit t
231. s Lambert Beer sche Gesetz Berechnen Sie die spezifische Aktivit t Definition 1 U ist gleich 1 umol umgesetztes Substrat pro Minute 91 Biochemisches Praktikum Ill Rechenweg und Diskussion der Ergebnisse 92 Biochemisches Praktikum Ill Aufgabe 4 Elektrophoretische Auftrennung von menschlichem Serum Zeichnen Sie die Verteilung der einzelnen Serumproteine Versuchen Sie anhand der in der Einleitung aufgef hrten Beispiele das Proteinprofil einer Erkrankung zuzuordnen Welches Profil trifft am ehesten das ihrer Probe 93 Biochemisches Praktikum Ill Aufgabe 5 Km und Vmax einer sauren Phosphatase f r p Nitrophenylphosphat Kompetitive Hemmung Messwerte Ansatz Extinktion Mittelwerte Produktkonz Nach Bildung der Mittelwerte 1 2 3 4 usw berechnen Sie mit Hilfe des molaren Extinktionskoeffizienten von p Nitrophenolat e 18200 mol cm die Produktkonzentration P in mol l der Ans tze auch hier wieder mit Lambert Beer Nachfolgend wird die Geschwindigkeit der Reaktion einbezogen Als Geschwindigkeit v dient die pro Minute im Ansatz 10 ml gebildete Menge des Produktes also a P mol 1 10ml 10min Die Substratkonzentration S berechnen Sie aus der Konzentration der p Nitrophenyl phosphat L sung 1mM der Reaktionsansatz entspricht 10 ml In der Auftragung nach Lineweaver und Burk m ssen sich die Messpunkte zu zwei Geraden ordnen Gilyc
232. s herstellen Ben tigte L sungen Dihydrogenphosphat 0 1 M KH PO L sung ad 1000 ml mit Aqua bidest Hydrogenphosphat 0 1 M NaHPO L sung ad 1000 ml mit Aqua bidest 76 Biochemisches Praktikum Ill Durchf hrung 1 11 markierte Plastik Reagenzr hrchen werden nach folgendem Schema gef llt R hrchen mit Zahlen markieren Anatz N BR B Ja 5 6 7 Js a hoi Dihydrogenphosphat 8 0 7 5 7 0 16 0 15 0 14 0 13 0 1230 1 0 105 L sung ml Hydrogenphosphat 0 5 1 0 2 0 13 0 4 0 5 0 6 0 17 0 7 5 8 0 L sung ml 2 Die L sungen werden gemischt indem man die R hrchen mit einem Stopfen verschlie t und dreimal kippt 3 Anschlie end wird der pH Wert potentiometrisch gemessen Elektrode nach jeder Messung mit Aqua bidest absp len 77 Biochemisches Praktikum Ill Aufgabe 3 pH Optimum einer Phosphatase Phosphatasen genauer Phosphomonoester Hydrolasen sind h ufig auch gegen ber einfachen synthetischen Substraten wie z B p Nitrophenylphosphat aktiv Die Hydrolyse dieses Substrates kann sehr leicht gemessen werden da das entstehende Nitrophenol in alkalischer L sung gelb gef rbt ist Absorbtionsmaximum bei ca 400 nm Ben tigte L sungen Puffer L sungen p Nitrophenyl 1mM p Nitrophenylphosphat phosphat L sung in Acetatpuffer Natronlauge 1 M NaOH in Aqua bidest Phosphatase Konzentration wird vom Betreuer mitgeteilt Die Enzyml
233. say bei dem der sekund re Antik rper mit einem Enzym gekoppelt ist Die Umsetzung eines Substrates f hrt dann bei all diesen Testen zur Bildung eines farbigen Produktes welches einfach visuell oder auch photometrisch bestimmt werden kann Dies sind nur Beispiele es k nnen sehr viel kompliziertere Versuche in Form eines ELISA durchgef hrt werden T Lymphozyten T Lymphozyten sind durch den T Zell Rezeptor CD3 genannten Molek lkomplex gekennzeichnet welcher f r die Aktivierung der Zellen nach Erkennung des Antigens s u entscheidend ist T Zellen haben zwei prinzipiell verschiedene Aufgaben entweder sie wirken regu lierend auf B Zellen und andere T Zellen oder sie erkennen ver nderte eigene Zellen Die T Zellen welche B Zellfunktionen regulieren k nnen einmal Helferfunktion haben T Helferzellen T oder sie k nnen die Aktivierung von B Zellen unter dr cken Regulatorische T Zellen T Reg fr her auch T Suppressorzellen genannt Ts diese Wirkung ist aber indirekt und l uft ber die Suppression der T4 Die T4 Zellen tragen als charakteristischen Marker das CD4 genannte Membranmolek l w hrend die heterogene Gruppe von Treg Zellen verschiedene Oberfl chenproteine tragen kann je nach Untergruppe Au er diesen regulatorischen T Zellen gibt es T Zellen welche die zellul re Effektorfunktion aus ben die also zytotoxisch wirken da sie beispielsweise 275 Biochemisches Praktikum VIII ver nderte eigene Zellen
234. scher Anhang werden oft mit Hilfe eines sog optischen Tests ausgef hrt Im Folgenden werden die Prinzipien erl utert und ein Beispiel aus dem Aminos urestoffwechsel gegeben Prinzip des optischen Tests Die Bestimmung der enzymatischen Aktivit t mittels des optischen Tests beruht darauf dass die reduzierten Pyridin Adenin Dinucleotide NADH NADPH im Ge gensatz zu ihren oxidierten Formen NAD NADP Licht absorbieren im Bereich von 300 400 nm Absorptionsmaximum bei 340 nm L sst man eine solche Reaktion in der K vette ablaufen kann in einfacher Weise durch Messung der Extinktion bei einer geeigneten Wellenl nge 340 nm oder 360 nm direkt die Oxidation von NADH bzw Reduktion von NAD verfolgt werden In der Regel misst man die Extinktion bei der Wellenl nge des Extinktionsmaximums Emax 340 nm Dies ist jedoch keine unbedingte Voraussetzung Wichtiger ist dass die Wellenl nge immer genau repro duzierbar ist und dass es sich um monochromatisches Licht handelt Genaue Er gebnisse werden deshalb mit Photometern erhalten bei denen zur Messung isolierte monochromatische Linien z B durch Quecksilberdampf Lampe Filter verwendet werden Da im Photometer Eppendorf bei 340 nm nicht photometriert werden kann wird mit diesem Ger t die Extinktion bei 366 nm der n chstgelegenen Emissions bande des Quecksilbers bestimmt 178 Biochemisches Praktikum VI Abbildung 1 NADH NADPH O NAD NADP l OE
235. sg rot in alkalischer blau Fig 6b Direktes Bilirubin reagiert direkt mit diazotierter Sulfanils ure Die Bestimmung des direkten Bilirubin erfasst nur das wasserl sliche Diglucuronid Nach Aufbrechen der mittleren a Methinbr cke reagiert der eine Dipyrrolrest direkt mit Diazonium Chlorid der zweite nach Umlagerung es entstehen isomere Azofarbstoffe an Albumin gebundenes Bilirubin reagiert erst in Anwesenheit von Coffein Accelerator Katalysator Zur Bestimmung des Gesamtbilirubins muss das wasserunl sliche Pigment deshalb durch Zusatz von Akzeleratoren Methanol Benzoat Coffein oder Diphyllin aus der Eiwei bindung freigesetzt werden bevor sich Azo Farbstoffe bilden k nnen wie unter a beschrieben Abbildung 7a Diazotierung SOH 3 SOH HCI SOH NaNO HCI NaCl 2H 0 NH NH CI N ci Sulfanils ure I diazotierte Sulfanils ure 195 Biochemisches Praktikum VI Abbildung 7b Entstehung von Azo Farbstoffen SO zH c N Bilirubin Ni coo HC NS Ho N N N N SO3H H Azo Pigment coo HC O Formaldehyd 196 Reagenzien Biochemisches Praktikum VI 1 29 mM Sulfanils ure 0 17 M Salzs ure 2 29 mM Natriumnitrit 3 130 mM Coffein 260 mM Natriumbenzoat Akzelerator 4 930 mM M Kalium Natrium Tartrat 1 9 M Natronlauge 5 Bilirubin Standardl sung 10 mg 100 ml 6 Natriumchlorid L sung 0 9 ig Ausf hrung Man pipettiert na
236. sogenannte 2 haben erheblichen die Ankn pfung von Ribose bzw Desoxyribose base stacking und deren Phosphate an die Basen dagegen nur unwesentlichen Einfluss auf die Absorption Das Nukleins urespektrum ist daher ein Mischspektrum aus den Spektren der 5 vorkommenden Basen Figur 1 16 16 N Purine Pyrimidine 14 14 12 12 gt molarer Extinktionskoeffizi amp rfimot cnf 10 d 0 T T 1 T 220 240 260 280 300 220 240 260 280 300 Wellenl nge nm Figur 1 UV Absortionsspektren der Purin und Pyrimidinbasen von Nukleins uren bei einem pH Wert 7 Zwischen den Ebenen benachbarter Basen treten Attraktionskr fte auf Das resultierende bereinanderschichten der Basen wird als base stacking engl to stack stapeln bezeichnet 24 Biochemisches Praktikum Il Elektrophorese Die auf ein geladenes Molek l im elektrischen Feld ausge bte Kraft K ist der elektrischen Ladung Q des geladenen Teilchens und der Feldst rke E direkt proportional K Q E Die Teilchen erfahren eine gleichf rmig beschleunigte Bewegung Der Kraft K wirkt die Reibung R entgegen die der Geschwindigkeit v der Teilchen ihrem Radius r und der Viskosit t n des L sungsmittels proportional ist R 6n n v r Kurz nach Anlegen des elektrischen Feldes geht die gleichm ig beschleunigte in eine gleichm ige Bewegung ber K R Es gilt dann __QE 6n n r Daraus folgt 1 Ein ge
237. st die sekund re Immunantwort gegen TD Antigene meistens st rker und l nger anhaltend als die Prim rantwort was zeigt da das Immunsystem ein Ged chtnis hat Dies beruht auf einer Vermehrung der Zellen des oder der Zellklone die beim Erstkontakt mit dem Antigen aktiviert wurden Dadurch ist das Prinzip der aktiven Schutzimpfung erkl rt W hrend der prim ren Immunantwort gegen ein TD Antigen werden in den ersten Tagen wie bei der Tl Antwort IgM Antik rper gebildet dann findet ein Klassen wechsel engl switch zu einer anderen Immunglobulinklasse s u meistens IgG Antik rpern statt Au erdem zeigt die Immunantwort gegen TD Antigene eine Immunreifung Darunter versteht man dass die Antik rper im Laufe der Immunantwort also nach der prim ren sekund ren oder terti ren Injektion des Antigens immer besser auf die antigene Determinante passen d h die Affinit t der Bindung zwischen Epitop und Paratop steigt und zwar bis zum tausendfachen Dieses bessere Passen erkl rt sich durch die somatische Mutation oder weil diese in einem so starken Ma e geschieht auch somatische Hypermutation genannt Dabei werden in die Gene welche die variablen Regionen der Antik rper kodieren Mutationen eingef gt wodurch sich die Spezifit t der Antik rper ndert Diejenigen B Zellen deren Rezeptor durch solche somatischen Mutationen verbessert wird werden nach der n chsten Injektion des Antigens dieses bevorzugt binden und da
238. stark beeintr chtigt Viele F lle allosterischer Hemmung siehe Praktikum VII Leber geh ren diesem kinetischen Hemmungstypus an Bei der allosterischen Hemmung haben im allgemeinen Hemmstoff und Substrat keine gemeinsamen Strukturmerkmale 68 Biochemisches Praktikum Ill Beispiele allosterischer Inhibition Feedback Inhibition Hemmung des Verdauungsenzym Trypsin durch Kallikrein A Hemmung von Glycerinaldehyd 3 phosphat Dehydro genase durch D Threose 2 4 di phosphat Endprodukt hemmung Dabei wird ein Enzym in der Zellatmung die Citratsynthetase allosterisch durch das Endprodukt ATP gehemmt Endprodukthemmung der Threonindesaminase im Aminos urestoffwechsel indem das Enzym allosterisch durch das Endprodukt Isoleucin gehemmt wird Abbildung 11 Endprodukthemmung Feedback Hemmung der Citratsynthetase durch ATP c Irreversible Hemmung Modifizierung des Enzyms Bestimmte Hemmstoffe werden kovalent und irreversibel an Enzyme gebunden In diesem Falle versagt die quantitative Michaelis Menten Kinetik da sie reversible Bindung aller Reaktionsteilnehmer voraussetzt Beispiele irreversibler Inhibition Diisopropylfluorophosphat DIFP hemmt irreversibel Serin Proteasen und andere Enzyme Sogenannte Alkylphosphate z B auch als Kampfgase wie Sarin und in Insektiziden vorhanden binden sich kovalent an die Acetylcholinesterase Dieses Enzym sorgt f r die Weiterleitung von Nervenimpulsen Die Organismen
239. sung muss w hrend der gesamten Versuchsdauer auf Eis aufbewahrt werden Durchf hrung 1 Je 4 5 ml der ausgestellten Pufferl sungen von pH 2 bis 8 werden mit je 4 ml p Nitrophenylphosphat L sung vermischt und etwa 3 Minuten bei 37 C temperiert Zum Mischen werden die R hrchen mit Stopfen verschlossen und dreimal gekippt 2 Dann wird in Abst nden von genau 30 Sekunden je 500 ul Enzyml sung zupipettiert erneut dreimal gekippt und sofort wieder in das 37 C Bad gestellt 3 Nach genau 10 Minuten Reaktionszeit werden dann wieder im Abstand von 30 Sekunden den Ans tzen je 1 ml Natronlauge zugemischt und wieder dreimal gekippt wodurch die enzymatische Reaktion beendet und ein einheitlicher alkalischer pH Wert erzeugt wird Bei richtiger Ausf hrung betr gt die Inkubationszeit mit dem Enzym bis zum Stop der Reaktion mit der Natronlauge in jedem Ansatz genau 10 Minuten 4 F r den Leerwert werden in einem weiteren R hrchen 4 5 ml Puffer pH 7 0 500 ul Aqua bidest 4 ml p Nitrophenylphosphat L sung und 1 ml Natronlauge gemischt Der Leerwert wird nicht bei 37 C inkubiert 78 Biochemisches Praktikum Ill 5 Je 1 ml der Mischungen werden in Kunststoff K vetten bei 405 nm gegen den Leerwert gemessen Sollte die gemessene Extinktion gr er als 1 0 sein muss die entsprechende Probe verd nnt und die Messung wiederholt werden Aufgabe 4 Elektrophoretische Auftrennung von menschlichem Serum In diesem Praktikum sollen
240. t daran gekoppelt ist DNA die f r das Fluoreszenzprotein YFP Yellow Fluorescence Protein kodiert Dadurch kann die Lokalisation des Rezeptors oder jedes anderen Proteins welches an das YFP fusioniert wurde innerhalb der Zelle mikroskopisch lokalisiert werden Das Einbringen genetischen Materials in eukaryotische Zellen nennt man Transfektion Dies kann auf verschiedene Arten erfolgen chemische Transfektion dabei wird Fremd DNA in das Kulturmedium der Zellen zugegeben Durch Bildung eines Niederschlags aus Kalzium Kristallen Kalzium Pr zipitat Methode oder durch Aggregation der DNA mit Lipidmolek len verschiedene firmeneigene Lipidmischungen unterschiedlicher Hersteller nehmen die Zellen die DNA auf 255 Biochemisches Praktikum VII Elektroporation durch einen Stromimpuls wird die Zellmembran vor bergehend permeabilisiert virale Infektion das Transgen wird zun chst in einen rekombinanten Virus eingebaut Dieser infiziert anschlie end aktiv die Zellen Meist werden dabei die Viren so modifiziert dass sie zwar das Transgen in die Zielzellen bringen sich dort aber nicht weiter vermehren k nnen Retroviren sorgen z B f r eine effiziente und stabile Integration des Transgens in das Wirtsgenom w hrend Adenoviren h ufig f r hohe transiente Expressionsraten verwendet werden Bleibt die eingebrachte DNA f r einige Tage bis Wochen in der Zelle geht aber mit der Zeit verloren spricht man von transienter Transfekti
241. tc Biochemisches Praktikum Aufgabe 2 cDNA und Restriktionskarte von Interleukin 6 Wie lautet die Sequenz der mRNA f r humanes Interleukin 6 und den humanen gp130 Rezeptor a Konstruieren Sie eine Restriktionskarte f r die entsprechenden cDNAs was ist eine cDNA Verwenden sie dazu bitte das Programm pDRAW32 b Wie w rden Sie die Interleukin 6 cDNA in Bakterien oder in S ugetierzellen exprimieren Worauf muss man achten Welche genetischen Elemente braucht man c Wer hat die Ratten Insulin cDNA rat insulin gene zuerst kloniert Wann war das Welche Position hat diese Person heute Aufgabe 3 Aminos uresequenzen von Interleukin 6 und gp 130 Stellen Sie die Aminos uresequenz von humanem Interleukin 6 und humanem gp130 im 1 Buchstaben Code dar 2 Welches Molekulargewicht hat das Protein Interleukin 6 und der gp130 Rezeptor oO Wie sieht die Hydrophobizit t aus O Bestimmen Sie den isoelektrischen Punkt was ist das Finden Sie ein Bild mit der dreidimensionalen Proteinstruktur von Interleukin 6 9 Q x w S Nn Identifizieren Sie hydrophile und hydrophobe Aminos uren RASMOL Biochemisches Praktikum Aufgabe 4 Sequenzvergleich verschiedener Insuline Vergleichen Sie die Proteinsequenzen von Insulin von Mensch Schwein Maus und Huhns a Fertigen sie ein Alignment an Schriftart Courier b Identifizieren Sie die Unterschiede zwischen menschlichem und Schweineinsulin in der Prot
242. te die Rr Werte von Cortisol stradiol Testosteron Geben Sie bitte an aus welchen Organen die Extrakte A B und C stammen k nnten und bezeichnen Sie die Steroide anhand derer die Identifizierung erfolgte Entspricht die Reihenfolge in der Hydrophobie Ihren Erwartungen wenn Sie die Strukturen der Steroidhormone unter diesem Gesichtspunkt betrachten Aufgabe 5 Beschreiben und interpretieren Sie Ihre Beobachtungen 263 Biochemisches Praktikum VIII BIOCHEMISCHES PRAKTIKUM VIII Biochemie des Immunsystems Aufgabe 1 Aufgabe 2 Aufgabe 3 Aufgabe 4 Aufgabe 5 Nachweis einzelner Antik rper bildender Zellen mittels eines Plaque Tests Darstellung von Antigenrezeptor tragenden B Zellen als Rosetten Agglutinierende Antik rper Bestimmung von Antik rpern mit der ELISA Technik Phagozytose von GFP exprimierenden Bakterien durch Makrophagen Christian Albrechts Universit t zu Kiel Biochemisches Institut In der Medizinischen Fakult t Olshausenstrasse 40 24098 Kiel 264 Biochemisches Praktikum VIII Stichworte Prim re und sekund re Lymphorgane zellul re und humorale Immunit t somatische Rekombination und klonale Selektion Antigene antigene Determinante Epitop Hapten Immunogenit t Adjuvantien Monozyten Makrophagen Antigen verarbeitende prozessierende Zellen und Antigen pr sentierende Zellen bei der Induktion einer Immunantwort Effektorzellen f r die humorale Immunit t
243. te in Doppelbestimmung Es werden also 18 Plastik Zentrifugen R hrchen entsprechend von 1A bis 18A durchnummeriert F r die photometrische Bestimmung m ssen alle Proben 1 10 verd nnt werden Von dieser Verd nnung werden je 100 ul inneue R hrchen pipettiert Nachdem nun alle R hrchen 1B bis 18B mit 100 ul Glucose Standard bzw 100 ul Probe beschickt worden sind werden der Reihe nach 900 ul Reaktionsgemisch dazugegeben und sofort gr ndlich durchmischt Die Ans tze bleiben 15 min bei Raumtemperatur bis zur photometrischen Auswertung stehen Diese wird bei 365 nm am Eppendorf Photometer gegen Luft durchgef hrt d h die Nullstellung des Ger tes erfolgt ohne K vette Die Extinktionswerte werden auf der logarithmischen Skala abgelesen und in Tabelle 2 eingetragen Zun chst wird die Glucose Eichkurve konstruiert Ans tze 1B bis 6B Berechnen Sie dazu die Glucose Konzentrationen in den jeweiligen Testans tzen Sie lassen sich aus der oben angegebenen Glucose Konzentration der verwendeten Standard L sung errechnen Zeichnen Sie dann die Eichgerade Y Achse Extinktion X Achse Konzentration und ermitteln mit ihrer Hilfe die Glucose Konzentrationen in den Ans tzen Nr 7B bis 18B Das kann durch optisches Ablesen an der Eichgeraden geschehen oder eleganter durch Errechnen nach der Formel Probenextinktion minus y Achsenabschnitt Leerwert Glucose Konz Steigung der Eichgerade Die so erhaltenen Glucose Konzentration
244. tential der Ableitelektroden so bekommt man die an den Glasoberfl chen auftretende Potenzialdifferenz Sie kann auf der Skala des Voltmeters direkt in pH Einheiten abgelesen werden Benutzen Sie die Glaselektroden erst nach einer Einweisung durch einen Assistenten 88 Biochemisches Praktikum Ill Praktische Aufgaben 1 bis 5 Praktikumsgruppe Namen des Praktikanten Aufgabe 1 Produktion rekombinanter Proteine in Bakterien Diskussion der Ergebnisse Aufgabe 2 pK Wert Bestimmung eines Puffersystems Messwerte Ansatz pH Wert W S E BE Da E E E Zeichnen Sie die gemessenen pH Werte Ordinate gegen die relative Konzentration an HPO Abszisse im folgenden Diagramm auf pH Wert 1 27 84 7 8 39 a HPO 89 Biochemisches Praktikum Ill Bestimmen Sie aus der Kurve den pK Wert von HzPO Was ist ein Puffer Was ist ein pK Wert Diskussion der Ergebnisse Aufgabe 3 pH Optimum einer Phosphatase Messwerte pH Wert 2 3 4 5 6 7 8 Mess wert 90 Biochemisches Praktikum Ill Die erhaltenen Extinktionen Ordinate werden graphisch gegen die pH Werte E405 Abszisse aufgetragen Berechnen Sie die Enzymaktivit t pro ml der gemessenen Phosphatase im pH Optimum Der molare Extinktionskoeffizient des p Nitrophenolat ist amp 405 18200 1 mol cm Verwenden Sie zur Berechnung der Konzentrationen das Lambert Beer sche Gesetz Formel von Seite 58 verwenden Wann gilt da
245. tercobilinogens nicht des Bilirubins wird aus dem Ileum r ckresorbiert und durch die V portae zur Leber gef hrt enterohepatischer Kreislauf Bei Leberparenchymerkrankungen oder Ver nderungen der Leberdurch blutung besonders Rechtsinsuffizienz des Herzens mit Stauungsleber ist die 192 Biochemisches Praktikum VI Reabsorption von Urobilinogen durch die Leber mangelhaft Urobilinogen im Harn wird stark erh ht gefunden Wegen der Autoxidation ist eine positive Ehrlich sche Reaktion nur zu erwarten wenn der Harn nicht zu alt ist Eine Differenzierung zwi schen der Rotf rbung durch Uro bzw Stercobilinogen und der durch Porphobilino gen ist durch Aussch tteln der Farbe mit Chloroform m glich Dies gelingt nicht bei dem st rker polaren Phorphobilinogen Aldehyd Kondensationsprodukt St rungen im H moglobinabbau Alle praktisch bedeutsamen St rungen des H moglobinabbaus f hren zur Erh hung des Serumbilirubinspiegels Krankheitserscheinungen und Prognosen sind unter schiedlich je nachdem ob ausschlie lich oder vorwiegend unkonjugiertes oder konjugiertes Bilirubin vermehrt ist F r die Differentialdiagnose der ikterischen Er krankungen sind daher die klinisch chemischen Befunde Blut Urin Faeces wichtig 193 Biochemisches Praktikum VI Haemoglobin Abbau Haemaglobin Fe Il Globin Haematin Fe Ill R E S O NADP Haemopexin Milz mikrosomal indu Knochenmark mikrosomal induzier Leber NADP ba
246. terien abzentrifugiert 1 mi des klaren berstands werden in Plastikk vetten gegeben und gegen einen Leerwert bei 405 nm gemessen Der Leerwert soll 0 5 ml MEA Puffer 0 5 ml Kulturmedium klar ohne Bakterien 0 5 ml NPG L sung und 1 ml Carbonat L sung enthalten und muss vor der Messung gut gemischt werden 246 Biochemisches Praktikum VII Aufgabe 4 Analyse von Steroidmustern unterschiedlicher Organe Theoretische Grundlagen Die Steroidhormone werden aus der Vorstufe Cholesterin in der Nebennierenrinde im Ovar und in Hoden sowie w hrend der Schwangerschaft in der Plazenta gebildet Es werden die den Elektrolyt und Wasserhaushalt regulierende Mineralocorticoide u a Aldosteron Desoxycorticosteron die den Kohlenhydrat Stoffwechsel regulierende Glucocorticoide u a Cortisol Cortison die zu den m nnlichen Geschlechtshormonen z hlenden Androgene Testosteron Androstendion sowie die weiblichen Geschlechtshormone der strogene stradiol und der Gestagene u a Progesteron unterschieden Die Synthese der Steroidhormone in Hoden und Ovar steht unter dem stimulierenden Einfluss der hypophys ren Hormone LH und FSH in der Nebennierenrinde unter dem Einfluss von ACTH In der Nebennierenrinde entstehen dabei haupts chlich Mineralocorticoiide und Glucocorticoide daneben Gestagene strogene und Androgene Im Hoden werden ber Gestagene als Zwischenstufen vor allem Androgene neben wenig strogenen im Ovar vor allem strog
247. tive state Beginning of helix formation and collapse catalytically active Er Entropy He addition of urea and mercapto ethanol Unfolded state inactive Disulfide cross links reduced to Percentage of residues yield Cys residues Energy of protein in native conformation removal of urea and mercapto ethanol Discrete folding intermediates Y gt _ 100 Native Native catalytically aa active state Disulfide cross links correctly re formed Biochemisches Praktikum Ill Durchf hrung Sie erhalten zwei Proben zwei 1 5 ml Eppendorf Gef e mit sedimentierten Bakterien welche aus einer Expressionskultur vor sowie 3 h nach Induktion der Expression entnommen wurden Diese sollen nach dem folgenden Schema behandelt werden A Eppendorf Gef Eppi mit Bakteriensediment gt 500 ul Lysis Puffer in Eppis zugeben amp resuspendieren mittels Pipette NUR die Probe 3 h nach Expression 10 ul von Bakteriensuspensionen Restliche Bakteriensuspension in fl ssigem abnehmen und in neue Eppis berf hren Stickstoff einfrieren und bei 37 C auftauen AUFBEWAHREN Betreuer Gel rA Ya Probe 1 amp 2 Frier Tau Prozess 2x wiederholen Zentrifugation full speed 1 min berstand mit Pipette abnehmen und verwerfen 1 ml Lysispuffer zum Sediment resuspendieren mittels Pipette Zentrifugation full speed 1 min die letzten vier Schritte mit 1 ml Waschpuffer wiederholen berstand mit P
248. tratkonzentration Ku l uft die Reaktion mit halbmaximaler Geschwindigkeit und das Enzym ist zur H lfte mit Substrat ges ttigt Ku bestimmt sich aus dem zur halbmaximalen Geschwindigkeit geh renden Abszissenwert Wenn Gleichung 17 umgeformt wird erh lt man Diagramme aus denen Km mit gr erer Genauigkeit abgelesen werden kann 62 20 21 Biochemisches Praktikum Ill Kyu M vea tV E Vaia gt v K TS 1 Vmax b Sl Wenn v gegen v So aufgetragen wird erh lt man eine Darstellung nach Eadie Hofstee Abbildung 5 Lineweaver und Burk verwendeten die reziproke Form von Gleichung 17 l Ku 1 1 su NS max max und bildeten 1 v gegen 1 So ab siehe Abbildung 6 Die Eadie Hofstee Abbildung hat den Vorteil dass die Messgr e v linear aufgetragen wird Dies vereinfacht statistische Korrekturen 63 Biochemisches Praktikum Ill Steigung Km Abbildung 5 Darstellung nach Eadie und Hofstee Abbildung 6 Darstellung nach Lineweaver und Burk 64 Biochemisches Praktikum Ill II Hemmung der Enzymaktivit t Als Hemmstoffe Inhibitoren werden Substanzen bezeichnet welche die katalytische Umsatzrate eines Enzyms herabsetzen Inhibitoren regulieren Enzymaktivit ten in der lebenden Zelle zusammen mit Aktivatoren siehe Praktikum VII Leber Als Pharmaka oder Gifte sind sie aber auch f r die Medizin wichtig und als Hilfsmittel der biochemischen Forschung dienen sie der Aufkl r
249. tzt frei und die mRNA kann durch die RNA Polymerase synthetisiert werden hnlich wie die beschriebene Substratinduktion des Lac Operons die im Praktikum durchgef hrt wird l sst sich auch die Repression anaboler Enzyme durch ihre Syntheseprodukte erkl ren Auch hier hat der Repressor zwei Bindungsstellen von denen diejenige f r den Operator jedoch zun chst eine unpassende Konformation besitzt H uft sich aber im Stoffwechsel das Endprodukt der enzymatischen Reaktion an so kann es sich an die zweite Bindungsstelle als Korepressor anlagern Durch die dadurch induzierte allosterische Umwandlung besitzt der Repressor jetzt die erforderliche Affinit t zum Operator und blockiert die Transkription Korepressor Endprodukt Repression Endprodukt RNA Poly ER merase iian at Be Repressorgen OO DNA _ sen Gen2 cens Operon Diesen Versuch f hren 3 oder 4 Praktikanten gemeinsam durch Dabei muss steril gearbeitet werden d h Gegenst nde wie Pipettenspitzen die mit der Bakteriensuspension in Kontakt kommen d rfen weder mit den H nden noch mit 242 Biochemisches Praktikum VII anderen Gegenst nden ber hrt werden Die Arbeit sollte daher so eingeteilt werden dass ein Praktikant bei Entnahme von Bakteriensuspension vorsichtig den Stopfen abnimmt ein anderer die Suspension ohne Ber hrung der Glasinnenwand mit einer 1000 ul Eppendorfpipette abpipettiert ein dritter die optische Dichte der Suspension am Photometer misst
250. uchen Sie anhand der Angaben im Abschnitt Isoenzyme der Einleitung siehe Seite 8 festzustellen aus welchen Organen die LDH Isoenzyme in den benutzten Seren vermutlich stammen Aufgabe 4 Ordnen Sie die folgenden Versuchbeobachtungen Ihren entsprechenden Ans tzen zu Es ist kein Substrat f r die Succinat Dehydrogenase zugegeben worden Eine Abnahme der Farbintensit t des DCPIP ist auf endogenes Succinat aus den Mitochondrien oder auf unspezifische Reaktionen zur ckzuf hren Die Enzymreaktion wird durch Malonat gehemmt 136 Biochemisches Praktikum IV Die Farbintensit t nimmt nur langsam ab weil der normale Weg des Elektronentransportes ber die Cytochromoxidase nicht durch KCN gehemmt worden ist Es l uft keine Enzymreaktion ab weil keine Mitochondrien zugegeben worden sind Dieser Ansatz dient als Bezugswert er zeigt die urspr ngliche Farbintensit t des DCPIP DCPIP wird durch die Enzymreaktion reduziert die Farbintensit t nimmt daher am schnellsten ab ci Die kompetitive Malonat Hemmung wird durch eine h here Succinat Konzentration aufgehoben bzw vermindert Diskussion der Ergebnisse Aufgabe 5 Tragen Sie die abgelesenen Extinktionswerte 450nm f r die Ans tze A mit Desoxycholat und B ohne Desoxycholat im Diagramm ein und ermitteln Sie die Kurvenverl ufe f r beide Ans tze Ermitteln Sie die jeweilige Steigung des linear abfallenden Teils der Kurve A und B Beschreiben und diskut
251. ul re zellul re und plasmatische Vorg nge eng zusammen spielen Im Plasma wird die endg ltige Blutstillung oder die Blutgerinnung nach einer Gewebeverletzung auf dem exogenen Wege extravaskul res oder extrinsisches System durch Freisetzung von Gewebethromboplastin oder durch das endogene System intrinsisches oder intravaskul res System mit Aktivierung durch Freilegung von Fremdoberfl chen oder Kollagenfasern in verletztem Endothel ausgel st Das extravaskul re System reagiert sehr schnell das langsamere intravaskul re System beinhaltet einen komplexen Kaskadenmechanismus bei dem verschiedene Gerinnungsfaktoren aus einer inaktiven Form Proenzym Form in eine aktive Form berf hrt werden Gemeinsame Endstrecke ist die Umwandlung von Prothrombin in die hochaktive Protease Thrombin die aus Fibrinogen letztendlich das vernetzbare Fibrin als Endprodukt der Blutgerinnung bereitstellt Der biochemische Nutzen einer Enzymkaskade liegt in der schnellen Verst rkung des Signals und der vielf ltigen Regulierbarkeit 149 Biochemisches Praktikum V Das fibrinolytische System Antikoagulation kann Blutgerinnsel wieder aufl sen und steht im Plasma des Normalgesunden mit der Gerinnung im Gleichgewicht Blutgerinnung und Fibrinolyse sind lebenswichtige Mechanismen die bei vielen Krankheiten beeintr chtigt sind und durch viele Medikamenten beeinflusst werden k nnen weitere Einzelheiten siehe Lehrb cher der Biochemie Gewebe exoge
252. ung von Reaktionswegen des Stoffwechsels und in neuerer Zeit von Mechanismen der enzymatischen Katalyse Inhibitoren ndern die Substratabh ngigkeit der Umsatzrate in spezifischer Weise sodass sich verschiedene kinetische Hemmungstypen abgrenzen Einige sind in den Abbildungen 8 und 10 in doppelt reziproker Auftragung Lineweaver Burk dargestellt Eine eindeutige Zuordnung von kinetischem Hemmungstyp und enzymatischem Mechanismus ist nicht m glich da mehrere Reaktionsmechanismen das gleiche kinetische Verhalten zeigen Substrat Fa kompetitiv i inhibitor reversibel Substrat hA M A a Inhibition nichtkompetitiv f A inhibitor O Substrat irreversibel l Inhibitor Abbildung 7 Hemmung der Enzymaktivit t 65 Biochemisches Praktikum Ill a Kompetitive Hemmung Der Inhibitor wird in einer Gleichgewichtsreaktion reversibel an das aktive Zentrum des Enzyms gebunden Es besteht Konkurrenz engl competition zwischen Inhibitor und Substrat um den Substratbindungsort im katalytischen Zentrum des Enzyms Analog der Substrat Bindungskonstante K wird als Inhibitorkonstante K definiert le 22 Ei Abbildung 8 Kompetitive Inhibition Der Inhibitor bindet vV an das aktive Zentrum des u gt 0 Enzyms Steigung 1 i kompetitiver Substrat Inhibitor Bei einer gegebenen Inhibitorkonzentration I und kleinem S liegt das Enzym berwiegend als El vor E LAN ES gt E P Km ist erh
253. utproteine erfasst werden Bei der Beurteilung dieses Blutproteinbildes ist es wichtig erstens 83 Biochemisches Praktikum Ill die Gesamtproteinkonzentration normal 5 5 8 0 g9 100 ml Serum und zweitens den relativen Anteil der einzelnen Serumproteinfraktionen zu ber cksichtigen Ver nderungen des Gesamtproteingehaltes im Blut werden bezeichnet mit a Hyperprotein mie ber 8 0 g Protein 100 ml Serum b Hypoprotein mie unter 5 5 g Protein 100 ml Serum Eine echte Vermehrung aller Serumproteine ber die Norm wird nicht beobachtet Bei pathologischen Hyperprotein mien sind stets nur eine oder wenige Proteinkomponenten z B y Globulin vermehrt Hyperprotein mien sind daher stets auch Dysprotein mien oder Paraprotein mien Hypoprotein mien kommen durchaus vor Sie f hren ber eine Abnahme des kolloidosmotischen Druckes zur dembildung Besteht gleichzeitig Mangel an spezifischen Proteinen k nnen Funktionsausf lle auftreten z B Infektneigung bei Immunglobulinmangel H ufigste Ursache einer Hypoprotein mie ist ein vermehrter Verlust von Protein Seltene Ursachen einer Hypoprotein mie sind genetisch bedingte Defekte Diese stellen gleichzeitig Dysprotein mien dar Der Begriff Dysprotein mien definiert eine verschobene Mengenrelation normaler Proteine Allen Dysprotein mien ist gemeinsam dass bei Vermehrung einer oder mehrerer Globulinfraktionen die Albuminfraktion relativ abnimmt woraus auf eine einseitig i
254. verabreicht Auch das Produkt der Reaktion wirkt kinetisch in der Regel als kompetitiver Inhibitor da es den Substratbindungsort des Enzyms besetzt Bei gro em P findet daher neben verst rkt ablaufender R ckreaktion eine kompetitive Produkthemmung statt 67 Biochemisches Praktikum Ill b Allosterische Hemmung nicht kompetitive Hemmung Der Inhibitor kompetiert nicht mit dem Substrat um die Bindungsstelle im aktiven Zentrum sondern wird reversibel an einer anderen Stelle des Enzyms gebunden Es kann sich ein tern rer Komplex EIS bilden Von allosterischer Hemmung spricht man wenn gem dem nebenstehenden Schema die Bildung von P aus EIS nicht m glich ist oder langsamer abl uft als aus ES Dadurch kann Vmax auch bei gro em S nicht erreicht werden In der Auftragung nach Lineweaver Burk liegt der Schnittpunkt der Geraden f r ungehemmte und gehemmte Reaktion nicht auf der Ordinate sondern ES gt E P j f es S EI EIS Substrat Substrat nicht kompetitiver 1 So Inhibitor Kur Abbildung 10 Allosterische Inhibition Der Inhibitor bindet an einer eigenen Bindungsstelle ausserhalb des aktiven Zentrums auf der Abszisse Abbildung 10 deshalb bleibt Km unver ndert d h die Substratbindung im EIS Komplex ist ebenso stark wie im ES Komplex Diese reine allosterische Hemmung ist selten verwirklicht Meistens ist auch die Substratbindung durch die Gegenwart des Inhibitors mehr oder weniger
255. verschiedenen Ketten einer schweren H Kette von engl heavy und einer leichten L Kette von engl light Je eine L Kette wird durch eine Disulfidbr cke mit der H Kette verbunden und beide H Ketten sind ebenfalls durch eine je nach Klasse s u unterschiedlichen Zahl von Disulfidbr cken miteinander verbunden Jede Kette enth lt je eine N terminale variable und je eine oder mehrere C terminale konstante Regionen oder Dom nen die L Kette aus den Dom nen V und C die H Kette aus Vu und entweder drei oder vier C Regionen was sich nach der Antik rper oder Immunglobulinklasse richtet Es gibt die f nf verschiedenen Klassen gM IgG IgD IgA und_ gE deren Einteilung sich nach den konstanten Regionen der H Kette richtet Die H Ketten selbst werden mit griechischen Buchstaben also u my y gamma delta a alpha und e epsilon bezeichnet Von IgG und IgA gibt es zus tzlich noch Subklassen Die konstanten Regionen der L Ketten werden als Typen bezeichnet und kommen entweder als lambda oder x kappa vor 270 Biochemisches Praktikum VIII Die Klassen Subklassen und Typen der Immunglobuline werden zusammen als Isotypen bezeichnet Ban Heavy chain ombinin site NH Combining N site Lieht ui 5 chain a pain Pepsin 446 COOH COOH Abb 1 Diagramm eines menschlichen Immunoglobulin G Molek ls Die dicken Linien zeigen die Polypetidkette die d nnen Linien die Positionen der Disulfidbr cken au
256. warten Bei der akuten schweren Sch digung eines gro en enzymreichen Organs ist es m glich schon am Anstieg der Serumaktivit t nur eines organspezifischen Enzyms den Ort der Sch digung zu erkennen so z B die Leber an der hohen Succinat De hydrogenase SDH bei der akuten Hepatitis Am sichersten l sst sich jedoch eine Sch digung in einem bestimmten Organ lokalisieren wenn man im Serum mehrere Enzyme also ein Enzym Muster misst und es mit den Enzym Mustern der in Frage kommenden Organe vergleicht Die Bestimmung von 2 3 Enzymaktivit ten im Serum ist nach Erhebung der Anamnese und des klinischen Befundes gew hnlich ausrei chend um zu einer Entscheidung zu gelangen 209 Biochemisches Praktikum VI A Stellt man die Enzym Muster der gro en Organe den Enzym Mustern die im Serum bei Erkrankungen dieser Organe entstehen gegen ber so findet man in manchen F llen z B beim Herzinfarkt oder dem Schub einer progressiven Muskel dystrophie eine frappierende hnlichkeit Bei der akuten kurz dauernden noch dazu kleine Gewebsteile erfassenden Zellsch digung beim Herzinfarkt ist es U I 400 Aldolase U I 300 22 20 18 200 14 12 Frl 10 100 80 eo o F A BE 4 Be nn 50 0 E e a 1 2 3 4 5 p i Tage Abbildung 9 210 Biochemisches Praktikum VI besonders wichtig die Enzymaktivit ten im Serum zeitgerecht zu bestimmen da es ja nur zum Austritt kleiner Enzymmengen aus dem Herzmuskel
257. www science co il Biomedical Primer Tools asp Erstellen von Primern http frodo wi mit edu primer3 Schmelztemperatur eines Primerpaars Die Schmelztemperatur Tm eines Oligonukleotids Primers kann nach einer empirischen Formel die sowohl den relativen G C Gehalt GC als auch die L nge der Oligonukleotide ber cksichtigt berechnet werden Biochemisches Praktikum Tu C 69 3 0 41 x GC amp n n L nge des Oligonukleotids Die optimale Annealing Temperatur Ta f r eine Polymerasekettenreaktion berechnet sich nach _ TMI TM2 a i 2 3 C Wobei Tm und Tu die Schmelztemperaturen der beiden Primer sind N tzliche Adressen NCBI http www ncbi nIm nih gov NCBI PubMed http www ncbi nlm nih gov entrez query fcgi db PubMed Google http www google de Google Scholar http scholar google com Expasy Proteomics http www expasy org tools Molecular Biology Tools http www biophys uni duesseldorf de local Biolnfo html Protein Tools http www scripps edu cdputnam protcalc html Genome http www sanger ac uk Proteinstrukturen http www rcsb org pdb Strukturelle Klassif http scop berkeley edu Aufgabe 1 Allgemeine Information zu Interleukin 6 Bitte finden Sie einschl gige Informationen ber das Zytokin Interleukin 6 und den gp130 Rezeptor jeweils eine halbe Seite mit Hilfe von Datenbanken s o Gefragt sind Informationen wie Stoffklasse Expressionsprofile Krankheitsbezug e
258. xtinktion 293 nm notieren e Sofort nach Ablesung des 4 Minuten Wertes 20 ul Allopurinoll sung 2 in die K vette geben gut mischen und weiterhin jede halbe Minute ablesen bis die Extinktion nicht mehr steigt f Wenn die Extinktion nicht weiter ansteigt 20 ul Uricase zugeben mischen Uhr starten und jede Minute Extinktion ablesen und notieren Abbildung 5 i or UV Spektren von Xanthin en und Harns ure 02 f Harns ure 240 260 280 300 Wellenl nge nm 190 Biochemisches Praktikum VI Klinische Bedeutung der Oxopurine Normalwerte Serum Harn Harns ure 2 5 7 0 mg 100 ml 250 750 mg Tag Xanthin Hypoxanthin 0 1 0 3 mg 100 ml 5 15 mg Tag Harns ure kann in w ssriger L sung max 2 Protonen abdissoziieren pK 5 75 pK2 10 3 W hrend Diurate pH gt 10 3 leicht l slich sind l sen sich Harns ure und Monourate schlecht in Wasser ca 6 mg 100 ml Daher ist der Harn stets das Serum ab ca 6 mg 100 mi an Harns ure bers ttigt Erh hte Harns urewerte im Serum f hren zur Kristallisation von Monourat in mucopolysaccharid und kollagen reichen Geweben z B Gelenken erh hte Urinwerte oder vermehrte Kristallisa tionskeime abgeschilferte Epithelien Bakterien zur Harnsteinbildung Xanthin ist schlechter Hypoxanthin jedoch 30 mal besser wasserl slich als Harns ure Erh hung der Harns urekonzentration im Serum Hyperuric mie kommt vor bei Nieren insuff
259. yl hydroxyliert ber aktives Sulfat mit Schwefels ure verestert und als IndoxyIschwefels ure Harnindikan mit dem Urin ausgeschieden t glich 1 30 mg Indikan kommt in geringen Mengen auch im normalen Harn vor Die Indikanausscheidung ist vermehrt bei Darmverschluss lleus Darml hmung paralytischer Ileus z B bei Peritonitis st rkerer Obstipation und anormaler Darmf ulnis Abbildung 8 Darmbakterien Leber NH 0 CH CH COOH O OH Tryptophan Indol Indoxyl Indoxylschwefel s ure Harnindikan Durchf hrung Der Versuch wird am Abzug durchgef hrt Handschuhe und Schutzbrille tra gen Zur Bestimmung des Indikans werden ca 10 ml Harn mit 7 ml Bleiacetat in einem Becherglas zusammengegeben Der entstandene dicke wei e Niederschlag von Proteinen Bleisulfat Bleichlorid u a wird durch ein Faltenfilter gegeben Schwer metallabfall bitte inklusive Filter im Abzug sammeln 10 ml des klaren kaum ge f rbten Filtrates werden in einem Schraubdeckelgef mit 10 ml FeCl in konz Salz s ure VORSICHT versetzt und 1 Minute stehen gelassen durch die Salzs ure wird dabei Indoxyl freigesetzt und durch das 3 wertige Eisen zu Indigo oxydiert Die ser wird mit Chloroform ausgesch ttelt Dann gibt man 2 ml Chloroform hinzu ver schlie t mit dem Schraubdeckel und sch ttelt 1 min lang vorsichtig Gummihand schuhe und Schutzbrille verwenden nicht zu heftig sch tteln sonst bildet sich eine 206 Biochemisches Prakti
260. ylase ein Enzym der Pyrimidinbiosynthese mit dem Endprodukt Hemmstoff Cytidintriphosphat CTP F r dieses Enzym ist der Aufbau aus regulatorischen und katalytischen Untereinheiten mit den Bindungsstellen des Subtratanalogons PALA und des Effektors CTP schematisch in Abbildung 1 gezeigt e sche Untereinhei Repa latorische Umterginhen Substrat Analogon Inhibitor katalytische Untereinheit Abbildung 1 Anordnung der Untereinheiten der Aspartat Transcarbamylase A Anordnung der Untereinheiten in der katalytisch aktiveren Form und Bindung des Substratanalogons PALA B Anordnung der Untereinheiten in der katalytisch inaktiveren Form und Bindung des Inhibitors CTP 226 Biochemisches Praktikum VII Eine Beeinflussung der katalytischen Aktivit t des Enzyms durch allosterische Effektoren kann nur durch nderung der sterischen Konformation des Enzyms bei der Effektorbindung erkl rt werden Die Konformations nderung kann die katalytische Wirkung behindern oder erh hen Es resultiert dann eine nicht kompetitive Kinetik Beim Beispiel der Aspartat Transcarbamylase bewirkt der Inhibitor CTP die Stabilisierung der katalytisch inaktiveren Konfomationsanordnung Abbildung 1B Die Hemmung durch CTP und die Denaturierung der inhibitorischen Eigenschaften ist in Abbildung 2 dargestellt Ein gemeinsames kinetisches Charakteristikum vieler allosterischer Enzyme ist das Auftreten sigmoider anstelle von hyperbolischen Kurven bei Auftragung von S
261. ze liegt bei 6 66 mmol l Bei h heren Konzentrationen muss die Probe verd nnt werden und das Ergebnis mit dem Verd nnungsfaktor korrigiert werden Die Normalwerte liegen bei 333 583 mmol 24 h im Harn und bei 1 7 8 3 mmol l im Serum Diskussion der Ergebnisse Biochemisches Praktikum VI Aufgabe 3 Die Aktivit t von XOD und von Uricase kann aus den jeweiligen graphisch zu ermit telnden Anfangsgeschwindigkeiten der geeigneten Phase des Reaktionsablaufs und aus 23 f r Harns ure 11 6 10 mol cm berechnet werden Diskussion der Ergebnisse 217 Biochemisches Praktikum VI 218 Biochemisches Praktikum VI Aufgabe 4 Gesamt direktes ee Standard Leerwert 1 Leerwert 2 Bilirubin Bilirubin Bilirubingehalt Die Bestimmungsmethode ist bis 25 mg 100 ml linear Berechnung Easa 10 _ ng Bilirubin 100 ml E Standard Diskussion der Ergebnisse 219 Biochemisches Praktikum VI Aufgabe 5 a Bestimmen Sie die Konzentration des Cholesterins in der Probe in mg dl und mmol l Ccnc mg dl 852 8 Eprobe 546 nm Ccno mmol l 22 06 Eprobe 546 nm Bestimmen Sie die Konzentration des HDL Cholesterins in der Probe in mg dl und mmol l Ccno mmol l 16 82 Eprobe 546 nm Bestimmen Sie die Konzentration des LDL Cholesterins in der Probe in mg dl und mmol l Die Cholesterin Konzentration im berstand berechnet sich nach Ccono mg dl 1024 E
262. zellen welche die Antik rper sezerniert haben wichtig sind Sie werden mit Zellen des Maus Myeloms X63 Ag8 653 fusioniert Die Namen von Zelllinien leiten sich von den Experimenten zu ihrer Etablierung ab Die Plasmazelle wird also durch die Fusion unsterblich und kann ihren Antik rper unter guten Bedingungen unbegrenzt synthetisieren Methodisch muss man nat rlich daf r sorgen da die Myelomzellen selbst nicht weiterwachsen Dies wird erreicht indem man das Ge misch der fusionierten Zellen in HAT Selektionsmedium wachsen l sst Das A steht f r Aminopterin welches als Fols ureantagonist den Hauptsyntheseweg der Purin und Pyrimidin Nukleotide und damit die DNS Synthese blockiert Wenn aber Hypo xanthin H und Thymidin T dem Medium zugesetzt werden k nnen die Zellen einen Nebensyntheseweg benutzen Sie ben tigen dazu die Enzyme Hypoxanthin Guanosyl Phosphoribosyl Transferase HGPRT f r H und Thymidinkinase TK f r T Da die Myelomzelle HGPRT negativ ist kann sie im HAT Medium nicht wachsen Die normalen Lymphozyten Plasmazellen k nnen ebenfalls unter diesen Bedingun gen nicht wachsen denn sonst brauchte man nicht zu fusionieren Die Hybridzellen werden aber durch die Normalzellen f r HGPRT komplettiert und k nnen wachsen Unter den Hybridomen werden diejenigen durch geeignete Tests bestimmt welche f r das jeweilige Problem den geeignetsten Antik rper synthetisieren Diese Hybridzell linie wird kloniert zur Antik rper P
263. zirrhose Aktivit tsverminderung der Uroporphyri nogen Decarboxylase 167 Licht dermatose mit ekzemat sen Ver nderungen berpigmentierung Lebervergr erung Biochemisches Praktikum V Praktische Aufgaben 1 bis 6 Praktikumsgruppe Namen der Praktikanten Aufgabe 1 Probe 1 Probe 2 Leerwert Messwert Hb Konzentration Zu berechnen Die Konzentration des H moglobins im Blut in g 100 ml Das Molekulargewicht des H moglobins betr gt 64500 Tetramer Berechnungsgrundlage ist das Lambert Beer sche Gesetz E e c d d stellt die Schichtdicke der K vette dar 1 cm Der molare Extinktionskoeffizient edes CN Hb Ill bei 546 nm betr gt 44000 L cm mol Tetramer Es muss ber cksichtigt werden dass das H molysat durch die Transformationsl sung um den Faktor F4 5 2 0 2 und das Blut zur Herstellung des H molysats um den Faktor F3 verd nnt wurde au erdem ist die Umrechnung von der molaren Konzentration in g 100 ml vorzunehmen ER R e d l Gi ERR e e d 10 00ml Normalwerte M nner 2 2 2 8 mmol l 14 18 g 100 ml Frauen 1 9 2 5 mmol l 12 16 g 100 ml Aus dem H moglobingehalt ergibt sich gleichzeitig der Eisengehalt der Erythrocyten Bitte vergleichen Sie Erythrocyten Eisengehalt in mmol l mit dem Plasma 168 Biochemisches Praktikum V Eisengehalt Aufgabe 4 Ber cksichtigen Sie dabei dass sich das Volumen der Erythrocyten um den Faktor C
264. zum Kochen erhitzt 2 Nach dem Erhitzen wird das Reagenzglas 5 Minuten auf Raumtemperatur abgek hlt 3 Als Kontrolle werden 1 ml St rkel sung mit 1 ml Aqua bidest Gemischt und jeweils iml f r die Jod St rkereaktion und die Trommer sche Probe bereitgehalten Je 1 ml der Hydrolysemischung und der Kontrolle werden f r die Jod St rkereaktion herangezogen und je 1 ml f r die Reduktionsprobe nach Trommer verwendet 4 F r die Jod St rkereaktion werden die Proben mit 50yul Jod Jodkaliuml sung versetzt und durchmischt 115 Biochemisches Praktikum IV 5 F r die Trommer sche Probe werden 1 mi Probel sung in einem Reagenzglas kein Kunstoff R hrchen mit 0 5 mi Natronlauge und 20 ul Kupfersulfat L sung versetzt und anschlie end ber der Flamme erhitzt Tragen Sie eine Schutzbrille und halten Sie die R hrchen ffnung nicht auf sich oder andere Bei Gegenwart reduzierender Substanzen entsteht eine Gelb bis Rotf rbung Versuch b Spaltung von St rke mit Speichelamylase Ptyalin 1 Zwei Reagenzgl ser werden mit ungef hr je 500 ul Speichel von der gleichen Person versehen Die eine Speichelprobe wird nun ca 1 Minute ber dem Bunsenbrenner erhitzt und anschlie end abgek hlt Kontrolle 2 Zwei Kunststoff R hrchen werden mit je 500 ul St rkel sung beschickt und werden auf je 10 ml mit Aqua bidest verd nnt 3 Die verd nnte St rkel sung des einen R hrchens wird zum nicht erhitzten Speichel gege
265. zymsubstratkomplex gebundene Substrat zum Produkt P umgesetzt Das Produkt verl sst das aktive Zentrum und gibt das Enzym wieder frei Es kann so erneut mit einem Substrat reagieren F r den Enzymsubstratkomplex ES gilt Bildungsgeschwindigkeit v E S k w Spaltungsgeschwindigkeit v1 Vv2 k ES k2 ES Im station ren Flie gleichgewicht wird ES mit gleicher Geschwindigkeit gebildet und gespalten d h ES h uft sich nicht an Daher ist 4 V1 V 14 V2 sodass aus den beiden vorausgegangenen Gleichungen folgt 5 k1 k2 ES E SI gt k Da wir die Einwaagekonzentrationen Eo und So und nicht die augenblicklichen Konzentrationen E und S kennen m ssen wir folgende Substitutionen vornehmen Eo E ES So S ES Die G ltigkeit der GI 6 und 7 beruht auf dem Massenerhaltungsprinzip S amp Gleichung 7 k nnen wir noch vereinfachen da normalerweise die Substratkonzentration viel gr er als die Enzymkonzentration ist sodass ES klein gegen ber S wird 60 Biochemisches Praktikum Ill 8 So S wenn Eo Sol Durch Substitution von Gleichung 6 und 8 in 5 erh lt man 9 k1 k2 ES Eo ES gt Sol gt k Nach ES aufgel st folgt E lE S0 k Eo 10 k k k S kK rtk 1 k So oder unter Zusammenfassung der Geschwindigkeitskonstanten zur Michaeliskonstante Ku _k tk M 1

biochemisches praktikum i - Christian-Albrechts

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