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1. 3 Glucose extrazellul r E 2 Glutamin extrazellular 0 65 Glutamat extrazellul r 05 N E o4 S x 03 o4 N N 0 2 S 2 48 72 96 120 9 Kultivierungszeit h 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 Kultivierungszeit h a a N 5 Di ka Q Q lt Ka 0 8 2 0 E 0 6 slo Pyruvat Eis ER extrazellul r 44 E 10 d SE N S 02 5 34 5 05 2 a 2 More 2 S 0 0 4 5 0 0 x 0 Krebszyklus B a z N 5 2 x 0 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 Kultivierungszeit h Kultivierungszeit h Abbildung 5 25 Verl ufe von extra und intrazellul ren Metabolitkonzentrationen bei Kultivierung von MDCK Zellen in DMEM mit vier verschiedenen Wachstumssubstraten Medium mit 2 5 mM und 2 mM Medium mit 2 5 mM x Medium mit Gln 2 mM A Medium mit Pyr 2 mM 0 gelb hinterlegt sind extrazellul re Konzentrationen F r Citrat wurde in allen vier Medien ein kontinuierlicher Konzentrationsabfall gemessen Zu bemerken ist dass die Konzentration f r das Medium mit Pyruvat meist ber den Konzentrationen in den anderen Medien lag Weiterhin war die Citratkonzentration insbesondere im Anfangsbereich f r das Medium welches nur Glucose enthielt niedriger als f r die anderen Medien Vergleichbare Konzentrationsverl ufe wurden f r cis Aconitat und Isocitrat gemessen
2. 63 5 1 3 1 Etablierung der Chromatographiemethode mit der Anlage DX320 und Identifikation der Metab llen mussen 63 5 1 3 2 Validierung der Methode und Bestimmung der Standardabweichung unter realen Elia D EE 64 5 1 3 3 Einfluss des pH Wertes auf die Quantifizierung nen 66 5 1 34 Anwendbarkeit der Anlage DX600 67 5 1 4 Zusammenfassung der Etablierung einer Chromatographiemethode 67 Optimierung der Probenvorbereitung 68 5 2 1 Untersuchung von in der Literatur h ufig genutzten Extraktionsmethoden 69 5 2 2 Optimierung zwei unabh ngiger ExtraktionsMethoden 70 5 2 2 1 Fraktioneller faktorieller Versuchsplan zur Optimierumg 70 5 2 2 2 Central Composite Versuchsplan zur weiteren Optimlerung 74 5 2 3 Experimenteller Vergleich der zwei optimierten 77 5 2 3 1 Wiederfindung zugegebener Metaboliten zu Proben ohne 2 1 77 5 2 3 2 Extraktion der Metaboliten aus Zellen 22220020222444040044a0nnBnnsnnannnnnnannannnnnnannn nenn 78 5 2 4 Abschlie ende Modifikation Entwicklung der finalen Methode MeOH CHCI Kochen 81 5 2 5 Bestimmung der Varianz der Methode 5 2 6 Bestimmung der Metabolitkonzentrationen durch Absch tzung des Zellvolum
3. E 3 ZS lt lt 6 By 82 2325 E a E E 5 SSBERE 552835238 a dad X SSLSSESASRCUBEEDSYLES TEE lt ko ee O eo gt 5 lt Zellzahl 5 3 9 4 10 9 7 2 o 3 lz BI Gesamtzellvolumen 3 1 2 7 9 10 0 0 2 8 8 3 9 0 4 3 1 8 Glucose 2 6 3 40 2 3 E 2 2 5 7 8 8 8 5 2 1 1 6 6 Ki Lactat 3 2 6 4 7 5 5 3 8 0 1 0 2 2 6 3 9 1 7 5 5 1 1 2 6 Glutamin 9 1 6 7 5 4 8 1 2 0 4 0 3 5 210 6 7 3 7 1 Glutamat 5 10 6 9 2 3 5 4 5 2 0 0 1 2 2 3 5 5 4 Ammonium 9 9 113 6 5 1 2 3 4 1 3 5 2 8 RSP 1 1 4 2 5 7 4 5 9 2 4 6 1 1 2 5 5 6 8 8 7 0 2 1 2 8 2 G6P 3 3 2 2 3 3 4 5 5 5 0 3 4 9 F6P 5 5 1010 2 0 o o Fio 4 F16bP 3 5 Htoj 9 4 1 2 1 8 7 2 3PG 8 915 2 2 1 1 4 gt 0 BE 5 1 3 2 0 1 0 9 Pyruvat o o 3 1 2 5 1 3 2 1 2 1 1 3 2 762 0 u Citrat 0 4 3 4 4 2 7 8 1 3 4 2 oz 5 cis Aconitat 2 1 3 6 1 2 2 7 5 1 2 6 5 3 0 Isocitrat 2 o 5 5 4 1 1 2 0 2 6 7 0 4 3 4 0 a Ketoglutarat 6 3 2 12 5 3 3 2 3 0 2 6 2 3 1 3 4 z 6 3 Succinat 3 5 0 2 5 5 3 5 8 215 2 2 Z Fumarat 101 7 6 1 3
4. Krebszyklus Nukleotide UDP GalNAc D UDP GICNAc RW UDP Glc Energy Charge ei 7 2 Abbildung 5 23 Darstellung der Differenzen der Korrelationen zwischen den Medien GMEM Z und EpiSerf F r diese Matrix wurden die Korrelationskoeffizienten f r EpiSerf s Abbildung 5 22 von denen f r GMEM Z s Abbildung 5 21 subtrahiert Felder mit starker Farbs ttigung deuten deutliche Unterschiede im Korrelationsverhalten zwischen den beiden Medien an 5 Ergebnisse und Diskussion 133 Diskussion Das grundlegende Problem bei der Interpretation der f r die beiden Medien gezeigten Datens tze ist es eine geeignete Form der Darstellung zu finden Um Details im Konzentrationsverhalten eines Metaboliten zu erkennen war die Auftragung der zeitlichen Verl ufe eine gute M glichkeit Allerdings konnte auf diese Weise nur schwer ein berblick ber die Zusammenh nge zwischen verschiedenen Metaboliten und den weiteren Messgr en erreicht werden Wie bereits bei den weiter oben gezeigten Zusammenfassungen verschiedener Experimente erwies sich auch f r den Medienvergleich die Kreuzkorrelationsanalyse als sehr gute Vorgehensweise um einen berblick ber Unterschiede bzw Gemeinsamkeiten bedingt durch das Medium zu erhalten
5. yoeu UOISSaISOY YOINP pmm Sunyotamqepsepurys uonewrxorddy mz uonyung 18 7 eds 321 JIC AO Iysu dsyus 1 24819238 Aq 31 8 UOSSEIM 2018 y1 syoos SMSS Sap Sunupig Op ap nm Sq Dao POE PUN 47 210 SLI 2 8 UZMU yezuy 8 8 y yyorneyosuy SNE 351 Aq 8 2M SY9IG SIM IYAN xsteoo Alse ge ZL Le Ce O9Z SL 67201 1228 8289 0167 SEr Z v6E An din xgoeoo Al e 06 se 0 8098 oer EU 9912 IIB Geen v6E An 9 CEO 9 00 61 901 EZL ez E BZ evel 86 0 0850 sero voco 9610 cee SN xosoo Al e Es 08 Z LE 60 4109 9606 162 6 91 1220 2150 v6E SN AYNIID dAN 588100 20 0 ve Liv Ir Ov 86 7815 90 8897 29 1 Gen 6610 v6E AN oVNIID dagn ZOEO O XLGOL O AJETL SOL GLE UEL SLL 6 8L ZZSS re 6 yore 6021 8660 L6E SW 219 xgrerio Alos LOL Eet OLE 26 SZL 9 10829 9098 0962 Lt SZL al 219 1 8000 xggg0 0 18 68 GEL BOL ES FI 922 1671 91 1 1890 520 Fon v6E SN AYNIED dAN Fenn xgreoo
6. gt RE eerste S 3 lt d i gt jenn EE kW 7 ZS 8 3 yerewng yereung i d99 Ye eyn Boys LD yesejn Boa 0 L o l THEN N 2 euoqe yeuoqeg eee Le anonern ee a 20 2 yeujoons aWOHEIEW ano jeulsans v SE ES We Y si SCH a Le S wies puoi x peT yeanshd 5 x 18104 2 E yeanskg 2 SI jejsay ejoe S En be T T T ER e n o mm 22 bd o bd p 8 g 8 g 9 I ww e Toe 2 NES srl 161 yay yeno1 uondiosqy uondiosqy lt Zu Beginn genutztes Programm A und C verbesserte Gradientenprogramm B und D Leitf higkeitsdetektion A und B und UV Detektion C und D Die senkrechten gestrichelten Linien in D deuten einen Wellenl ngenwechsel an f r die Anlage DX320 Konzentrationen der einzelnen Substanzen zwischen 3 25 und 104 00 uM s Anhang Tabelle A 6 letzte Spalte 54 5 Ergebnisse und Diskussion Wie im untersten Chromatogramm in Abbildung 5 1 zu erkennen ist wurde w hrend einer Messung die Wellenl nge des UV Detektors dreimal gewechselt Grund hierf r war dass die Detektion einiger organis
7. 20 3 3 1 lonen Austausch Chromatographie 21 3 3 2 Fl ssigchromatographie im Bereich Metabolic Profiling 22 3 3 3 Fl ssigchromatographie kombiniert mit Massenspektrometrie Detektion 22 Probenvorbereitung zur Messung intrazellul rer Metabolten en 23 3 4 1 Abstoppen des Metabolismus AAA 24 3 4 2 aE PREE E EE E e 25 Grundlagen der statistischen Versucheplanung 26 3 5 1 Faktorielle V rsuchspl ne u sen 27 3 5 2 Fraktionelle faktorielle Versuchspl ne nenne 30 3 5 3 Central Composite Versuchspl ne nn 32 3 5 4 Pr fung der Angemessenheit des Modelle 33 3 5 5 Optimierung anhand von Desirability Funktionen 2 33 Korrelationsanalyse von Daten intrazellul rer Metaboliten Material und Methoden Ger te Verbrauchsmaterialien und Chemikalien Z IIKUIUR ee 38 Analytik 4 3 1 Lumineszenzmessung von ATP nuunsessensennannnunaunnnnnnnnnnnnnnnnnnannnnnnnnnnnnnnnannnnnnnnnnnnnnnnannann 38 4 3 2 KETTEN 39 4 3 3 Mikroskopie zur Bestimmung des ZellvolumMens 39 4 3 4 Bestimmung von Glucose Lactat Glutamin Glutamat und Ammonium 40 4 3 5 UV Messung zur Bestimmung von makromolekularen Verunreinigungen 40
8. Energy Charge 0 00 0 00 057 0 00 0 00 00 0 0 0 00 0 00 0 01 0 0 0 00 0 00 0 00 0 00 00 Abbildung 5 15 Korrelationsmatrix f r die Konzentrationen intrazellul rer Metaboliten und der Energy Charge basierend auf den Einzelmessungen aller Experimente Sowohl auf x als auch y Achse sind die unterschiedlichen Metaboliten aufgetragen Grundlage der Korrelationsanalyse waren ca 1500 Einzelmessungen mit MDCK und Vero Zellen unter unterschiedlichsten Kulti vierungsbedingungen durchgef hrt mit der in dieser Arbeit etablierten Methode Felder mit positiven Korrelations koeffizienten r gt 0 5 sind blau gef rbt negative entsprechend rot ab einem Korrelationskoeffizienten von r 0 7 bzw 0 7 ist eine st rkere S ttigung der Farben verwendet zur besseren Veranschaulichung von sehr starken Korrelationen ist zus tzlich bei Werten r gt 0 9 bzw lt 0 9 ein Farbgradient bis hin zur vollst ndigen S ttigung genutzt Der p Wert der jeweiligen Korrelation ist als Zahl in den einzelnen Feldern gegeben Grunds tzlich zeigte sich an den berwiegend blau gef rbten Feldern dass die meisten Metaboliten positiv miteinander korreliert waren Allerdings hat die Mehrheit hiervon einen Korrelationskoeffi zienten lt 0 8 was somit eine nur moderate Korrelation andeutet Folgende Metabolitgruppen waren jedoch sehr stark korreliert Ko
9. 0 00 0 00 0 57 0 000 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 000 00 6 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 o 00 0 00 0 06 Je 000 0 00 6 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 Blo 0 00 017 0 00 0 00 0 00 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 12 0 00 00 0 000 00 0 00 0 90 0 00 0 00 0 17 0 00 6 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 GMP 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 07 0 000 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 00 0 00 0 00 10 00 10 00 Ja 0 00 000 00 0 000 000 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 08 0 00 0 00 UDP 0 00 0 02 0 00 0 00 0 00 0 44 0 00 0 00 0 00 0 01 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 10 00 ADP 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 00 0 00 00 0 00 0 00 000 0 00 0 00 0 0010 00 H 04 GDP0 00 0 01J0 00 00 0 00 0 00 0 00 0 35 0 00 0 000 00 0 06 0 00 000 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0
10. FCS Im Vollmedium IV 25 cm Flasche 5 10 mL 1 mL 1 mL 15 20 mL 75 cm Flasche 10 15 mL 3 mL 3 mL 50 mL Seite 1 von 3 Anhang Z_04_Passagieren_MDCK_200606_SK BPT MPI Magdeburg 175 cm Flasche 15 20 mL 5 mL 5 mL 100 125 mL 850 cm Rollerflasche 40 50 mL 10 mL 10 mL 250 mL 5 0 Faustregeln f r die Anzucht von MDCK Zellen Ausgangskultur 4 bis 6 Tage alte konfluent gewachsene Kultur zu alte Kulturen vermeiden Weiterkultivierung der Zellen in einer Kulturflasche mit gleichem Volumen 1 3tel bis 1 6tel der Zellen in die neue Flasche geben Vermehrung der Zellen f r den Fermenter Ampulle T75 T175 Rollerflasche jeweils die gesamten Zellen in das naechstgroessere Kulturgefaess ueberfuehren Ampulle mit 2 5x10 Zellen mL wenn weniger Zellen oder alte Zellen Zwischenstufe ber T25 Zellen nicht untereinander austauschen bei Kontaminationsgefahr nicht mehr genau nachvollziehbar woher diese stammt fuer eine Reaktorkultivierung Zellen aus einer Passagierung kleiner 20 verwenden stets eine T 75 Flasche parallel zur Fermentation als back up laufen lassen 6 0 Einsaat 6 1 Ermittlung des Einsaatvolumens ermittelte Zellzahl der trypsinierten Flasche Z z B 1 2 x 10 Zellen mL Tage in denen die Zellen bis zur Konfluenz wachsen sollen z B 4 d empirisch ermittelte Einsaatdichte E bei der die Zellen nach T Tagen in dem verwendeten Kulturgefa
11. Nukleotide Abbildung 5 37 Korrelationsmatrix f r die Metabolitkonzentrationen f r MDCK Zellen nach zweist ndiger Inkubation in PBS und anschlie ender Zugabe von neuem Zellkulturmedium DMEM mit verschiedenen Supplementen Die Zahlen in den Feldern entsprechen dem p Wert der entsprechenden Korrelation F r eine weitere Erl uterung sei auf Abbildung 5 15 verwiesen Zusammenfassend lie sich f r die Kurzzeitexperimente ein einheitliches Muster f r die Konzen trationsverl ufe erkennen Bei den Korrelationsanalysen traten durchwegs die gleichen Gruppierungen auf und die Dynamik dieser Gruppen war f r die drei unterschiedlichen Versuchs bedingungen durchwegs sehr hnlich Diskussion Durch die Zugabe von Medien welche sich nur gering unterschieden sollten die individuellen Effekte der einzelnen Supplemente auf die intrazellul ren Metabolitkonzentrationen berpr ft werden Ganz deutlich konnte der Einfluss der Glucose auf die intrazellul ren Konzentrationen der Hexosephosphate nachgewiesen werden F r die Konzentration von G6P wirkte sich die im Serum enthaltene Glucose deutlich schw cher aus als f r die Fl6bP Konzentration Die Tatsache dass allerdings nahezu keine Unterschiede in den Konzentrationsverl ufen f r den folgenden 5 Ergebnisse und Diskussion 165 Metaboliten 3PG f r die Medie
12. a S 22 5 _ SEF 23 6 a Ses ees nae sa2323E2 3 3185892255 evs eEsSSSSARAASEREBAS SB ISDTDL LTOo rsads sarr 55 IH TO 5 AU 5555 Zellzahl 10 10 10 0 10 2 10 10 10 10 10 10 1010 10 Gesamtzellvolumen SES 10 dk 10 10 10 10 10 9 Lag 10 10 10 10 Glucose 10 10 3 10 10 10 10 10 M 10 10 10 10 1010 0 10 10 10 10 1089 10 z 1 10 10 10 2 10 10 10 10 10 0 10 10 10 10 10 10 Lig 10 10 1010 10 Glutamin 10 10 10 1040 10 10 10 210 10 10 g Glutamat 1 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 5 10 10 10 10 10 21010 10 10 10 10 10 10 Lid 10 10 Lag 10 RSP 10 IL 10 10 10 10 0 10 10 1010 10819 10 1 10 81910 1 BS 10 10 0 2 10 410 10 10 0 10 10 2 10 10 10 G6P 2 5 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 g F6P 10 1 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 F16bP 10 10 10 10 10 10 1010 10 100 10 10 10 2 20 10 10 10 10 10 10 10 0 10 10 Big 10 10 10 10 10 H10 4 10 10 10 10 PEP 10B 10 10 10 10 10 10 0 10 10 0 1010 10 10 6 10 0 10 Pyruvat 10 10 10 10 10 10 10 10 2 10 10 10 10 10 10 1010 10 10 10 10 10 9 0 10 10 u 10 10 10 1010 10 10 5 1 10 10 EI cis Aconitat 1o 10 1 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 gt Isocitrat 10 10 10 10 2 10 10 10 10 10 10 10 1002 5 10 10210 D a Ketoglutarat 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
13. ADP ATP CMP CDP CTP GMP GDP GTP UMP UDP UTP UDP GlcNAc UDP GalNAc und UDP Glc Grund hierf r war dass diese Metaboliten unter normalen Bedingungen nicht im Zellkultur berstand auftraten und somit ein gutes Ma f r die Solubilisierung von intrazellul ren Metaboliten darstellten 2 Die Energieladung Energy Charge ADP ATP ADP AMP sie wurde gew hlt da Zellen in einem physiologisch gutem Zustand laut Literatur einen Wert zwischen 0 8 und 1 aufweisen DT F r den Fall eines niedrigeren Wertes w rde das eine Umsetzung von ATP zu ADP und AMP w hrend der Extraktion andeuten 3 Der Wert f r Fructose 1 6 Bisphosphat F 6bP Gehalt da gem der Literatur z 1138 Zuckerphosphate schwierig zu extrahieren bzw wiederzufinden sind 4 Die Absorption bei 280 nm Absorption 280 nm wie bei der Untersuchung g ngiger Extraktionsmethoden sollte so gew hrleistet werden dass kein hoher Verunreinigungsgrad der Proben durch Proteine oder Nukleins uren vorlag Auf diesem Wege sollte eine schnelle Degradation der analytischen S ule der AAC vermieden werden W hrend die ersten drei Zielgr en bei der Optimierung zu maximieren waren sollte die vierte Variable minimiert werden Zur statistischen Auswertung der Experimente wurden die gemessenen Werte auf den Mittelwert des Experiments normalisiert Optimierung der Methode MeOH Kochen Fraktioneller faktorieller Ansatz Das Extraktionsschema in Ab
14. DCH EEIFT EEIFT LOLOT ert LOESI ert LOEM LOTOT p BD an 9 9 a 9 unpa A A A A A WW W W W W W W IW IW W PWZ aqesn7Z 2 Lu zu zu zu gu gu gu gu gu gu gu pu pu gu u posda WAWD uawLadxq sZunge 9 sourds saute uoy ur uonyung uspusye 3 Lou Sunsseduy nz usdundumpag uspusyao dsyus u p 8 Uap 8 Jap SunssejJuswwesnz Y APLL sueyuy Anhang Tabelle A 6 Validierungstabelle f r die Chromatographiemethode geordnet nach Retentionsverhalten Peak Detektor Var Reg Detektionslimit Bereich R Konz Fig 1 niedrig hoch uM uM uM uM Lactat Acetat H ECD h p 0 487 7 1 300 40 300 0 996 33 80 Pyruvat F ECD nh 1 0 246 7 1 000 31 000 0 997 26 00 ECD h 1 0 781 6 3 000 15 500 0 992 13 00 Nitrat F ECD h 1 0 545 6 3 000 15 500 0 996 13 00 Succinat F ECD h 0 188 6 3 000 15 500 0 999 13 00 Malat CMP F ECD h 0 149 6 8 250 42 625 0 999 35 75 CMP F UV h 0 060 7 0 125 3 875 1 000 325 Sulfat a Ketoglutarat F ECD nh 1 0 827 7 4 500 139 50 0 999 117 00 a Ketoglutarat F UV h 1 0 623 6 3 000 15 500 0 995 13 00 G6P F ECD h 1 0 221 6 1 050 5 425 0 996 27 30 Fumarat F UV nh t 0 133 7 0 500 15 500 1 000 13 00 F6P F ECD h p 0 018 1 050 5 425 0 998 4 55 AMP RSP F ECD h 0 185 6 6 00
15. Eine Kreuzkorrelation bedeutet dass eine zeitliche Verschiebung der Zeitreihen erlaubt wird wodurch eine Deckungs gleichheit der Verl ufe erreicht werden kann was in einem h heren Korrelationskoeffizienten resultiert Schematisch ist dies in Abbildung 3 7 dargestellt Z Verschiebung a der schwarzen 5 Kurve um gt gt Zeit Zeit Abbildung 3 8 Schematische Darstellung der zeitlichen Verschiebung von Verlaufskurven f r die Verwendung im Rahmen der Kreuzkorrelation Die Verl ufe der beiden Kurven hneln sich sehr aber durch den Zeitversatz w ren die beiden Verl ufe nur minimal miteinander korreliert durch Verschiebung der Kurven um wird eine ann hernde Deckung erreicht was in einer hohen positiven Korrelation resultiert Dieses Verfahren kam in der Vergangenheit unter anderem zum Einsatz um Verl ufe von Konzentrationsmessungen verschiedener Metaboliten miteinander zu korrelieren 282821 Basierend auf den Korrelationen wurden R ckschl sse auf Stoffwechselnetzwerke und Regulation gezogen Die Berechnung der Korrelationskoeffizienten erfolgt gem rule Boas 3 10 mit GH Et D 31 wobei die spitzen Klammern den zeitlichen Durchschnitt repr sentieren F r jede Zeitverschiebung t wird somit ein Korrelationskoeffizient errechnet Aus diesen Werten wird die maximale Korrelation bei entsprechendem ausgew hlt Auf diese Weise kann eine Korrelationsmatrix mit maximalen Korrelationskoeffizi
16. 149 Eppert GJ 1997 Fliissigchromatographie Braunscheig Wiesbaden Friedr Vieweg amp Sohn Verlagsgesellschaft 323 p 150 Meyer VR 1999 Praxis der Hochleistungs Fliissigchromatographie Frankfurt am Main Otto Salle Verlag 293 151 Unger KK Weber 1995 Handbuch der HPLC Teil 1 Leitfaden f r Anf nger und Praktiker Darmstadt GIT VERLAG 466 p 152 Fritz JS Gjerde DT 2000 Ion Chromatography Weinheim Wiley VCH 254 p 153 Rocklin RD Pohl CA Schibler JA 1987 Gradient elution ion chromatography Journal of Chromatography 411 107 119 154 Lee YC 1996 Carbohydrate analyses with high performance anion exchange chromatography Journal of Chromatography A 720 137 149 189 155 Pohl CA Stillian JR Jackson PE 1997 Factors controlling ion exchange selectivity in suppressed ion chromatography Journal of Chromatography A 789 29 41 156 Haddad PR Nesterenko PN Buchberger W 2008 Recent developments and emerging directions in ion chromatography Journal of Chromatography A 1184 1 2 456 473 157 Small H Stevens TS Bauman WC 1975 Novel ion exchange chromatographic method using conductimetric detection Analytical Chemistry 47 11 1801 1809 158 Cataldi TRI Angelotti M D Erchia L Altieri G Renzo GCD 2003 Ion exchange chromatographic analysis of soluble cations anions and sugars in milk whey European Food Research and Technology 216 1 75 82 159 Hajos P Nagy L 1998 Retention behavi
17. diesem Fall eine Koelution der identifizierten Substanzen mit Nukleotiden nicht auszuschlie en ist Eine deutliche Steigerung der qualitativen Ergebnisse in der hier vorliegenden Arbeit konnte durch die Kopplung des MS Detektors erreicht werden da so die Zusammensetzung von einzelnen Peaks genauer berpr ft werden konnte Hierbei zeigte sich dass der Gro teil der Peaks den richtigen Metaboliten zugeordnet war Ein bestehendes Problem unabh ngig vom MS Detektor ist die eingeschr nkte Sensitivit t der Analyse da mit sehr gro er Wahrscheinlichkeit zahlreiche Metaboliten zwar in den Extraktionsproben vorhanden sind aber nicht detektiert werden weil sie 64 5 Ergebnisse und Diskussion unter dem Detektionslimit liegen So gibt es in der Literatur Annahmen von bis zu 200 000 Metaboliten in Pflanzen 122 und bis zu 10 000 Metaboliten in tierischen Zellen 125 1 gt 261 Aber selbst bei Metaboliten die detektiert werden k nnen ist zu berpr fen ob diese Substanzen zu quantifizieren sind Falls dies nicht der Fall ist w re trotz Identifizierung des entsprechenden Metaboliten die Information nur qualitativ und so nur eingeschr nkt interpretierbar Dar ber hinaus w re es bei einer Identifikation einer gr eren Anzahl von Metaboliten f r eine Quantifizierung unverzichtbar die Qualit t der Methode mit Standards der jeweiligen Metaboliten zu beurteilen Da allerdings bei dieser Arbeit das Interesse auf der Analyse des Zentralstoffwe
18. 109 Birch JR Boraston RC Metcalfe H Brown ME Bebbington CR Field RP 1994 Selecting and designing cell lines for improved physiological characteristics Cytotechnology 15 1 3 11 16 110 Elias CB Carpentier E Durocher Y Bisson L Wagner R Kamen A 2003 Improving glucose and glutamine metabolism of human HEK 293 and Trichoplusia ni insect cells engineered to express a cytosolic pyruvate carboxylase enzyme Biotechnology Progress 19 1 90 97 111 Irani N Wirth M van den Heuvel J Wagner R 1999 Improvement of the primary metabolism of cell cultures by introducing a new cytoplasmic pyruvate carboxylase reaction Biotechnology and Bioengineering 66 4 238 246 112 Fell DA 1992 Metabolic control analysis a survey of its theoretical and experimental development Biochemical Journal 286 Pt 2 313 330 113 Hofmeyr JH 1995 Metabolic regulation a control analytic perspective Journal of Bioenergetics and Biomembranes 27 5 479 490 114 Carvalhal AV Santos SS Calado J Haury Carrondo MJT 2003 Cell growth arrest by nucleotides nucleosides and bases as a tool for improved production of recombinant proteins Biotechnology Progress 19 1 69 83 115 Kochanowski N Blanchard F Cacan R Chirat F Guedon E Marc A Goergen JL 2008 Influence of intracellular nucleotide and nucleotide sugar contents on recombinant interferon gamma glycosylation during batch and fed batch cultures of CHO cells Biotechnology and Bioengineering 100
19. F r den weiteren Verlauf der Arbeit wurde zur Bestimmung der intrazellul ren Konzentrationen wie folgt verfahren Zellen wurden mindestens 30 min trypsiniert dann wurden mittels ViCell XR Zellzahl und Zelldurchmesser der einzelne nicht der mittlere gemessen Anschlie end wurde aus den einzelnen Durchmessern der mittlere Durchmesser einer Messung berechnet Durch Multiplikation des mittleren Durchmessers mit der Zellzahl der entsprechenden Probe wurde das Gesamtvolumen der Probe errechnet 88 5 Ergebnisse und Diskussion Dieses so bestimmte Gesamtvolumen schwankt aber um den wahren Wert der extrahierten Proben zu diesem Zeitpunkt da sowohl die Zellzahlbestimmung und die Volumenbestimmung fehlerbehaftet sind als auch weil durch die biologische Variabilit t nicht die exakt gleiche Zellzahl und das gleiche Volumen sich in jedem Well befinden Da der typische Verlauf des Volumens aber bekannt ist wurde eine N herung des Zellvolumens durchgef hrt indem eine sigmoide Funktion an die gemessenen Daten angepasst wurde Die so ermittelten Volumina wurden anschlie end f r die Berechnungen der intrazellul ren Konzentrationen verwendet da angenommen wurde dass diese Volumina den tats chlichen Wert der extrahierten Proben besser widerspiegeln als die eigentlichen Messdaten Um eine Redundanz zu vermeiden sei hier bereits auf Abbildung 5 18 verwiesen Dort sind beispielhaft die sigmoiden Funktionen und die dazugeh renden Messdaten f r zwei
20. Genzel Y Konig S Reichl U 2004 Amino acid analysis in mammalian cell culture media containing serum and high glucose concentrations by anion exchange chromatography and integrated pulsed amperometric detection Analytical Biochemistry 335 1 119 125 Genzel Y Olmer RM Sch fer B Reichl U 2006 Wave microcarrier cultivation of MDCK cells for influenza virus production in serum containing and serum free media Vaccine 24 35 36 6074 6087 Genzel Y Ritter JB Konig S Alt R Reichl U 2005 Substitution of glutamine by pyruvate to reduce ammonia formation and growth inhibition of mammalian cells Biotechnology Progress 21 1 58 69 Sidorenko Y Wahl A Dauner M Genzel Y Reichl U 2008 Comparison of metabolic flux distributions for MDCK cell growth in glutamine and pyruvate containing media Biotechnology Progress 24 2 311 20 Wahl A Sidorenko Y Dauner M Genzel Y Reichl U 2008 Metabolic flux model for an anchorage dependent MDCK cell line characteristic growth phases and minimum substrate consumption flux distribution Biotechnology and Bioengineering 101 1 135 52 Bardeletti 1977 Respiration and ATP level in BHK21 13S cells during earliest stages of Rubella virus replication Intervirology 8 2 100 109 Burgener A Coombs K Butler M 2006 Intracellular ATP and total adenylate concentrations are critical predictors of reovirus productivity from Vero cells Biotechnology and Bioengineering 94 4 667 679 El Bacha T Menezes MM
21. Hierbei zeigte sich dass der ATP Gehalt der Zellen deutlich erniedrigt war wenn die Glutaminkonzentration im Medium reduziert war Auch in den Zellen im glucosefreien Medium waren signifikant geringere ATP Mengen zu finden Allerdings waren die Zellen nicht w hrend der kompletten Kultivierungsdauer den Medien ausgesetzt sondern nur f r eine Periode von 24h am Ende der Zellwachstumsphase Somit ist zwar ein exakter Vergleich der dort erzielten Ergebnisse mit der hier vorliegenden Arbeit schwierig aber die grundlegende Tendenz dass in Vero Zellen mitunter ein sehr variabler ATP Gehalt vorliegen kann best tigt Die Verl ufe von UDP GlcNAc zeigten ganz deutlich die Abh ngigkeit dieser Metabolitkonzen tration von der extrazellul ren Glucosekonzentration Die beiden Medien ohne Zugabe von Glucose wiesen nur zu Beginn der Kultivierung erh hte Werte dieses Metaboliten auf Grund hierf r war sicherlich die durch das Serum eingebrachte Menge an Glucose bzw die noch aus der Vorkultur vorhandene intrazellul re Konzentration von UDP GlcNAc Scheinbar ist aber keine direkte Korrelation zwischen der extrazellul ren Glucosekonzentration und der intrazellul ren UDP GlcNAc Konzentration vorhanden da die intrazellul re Konzentration von UDP GIcNAc relativ konstant war wohingegen die extrazellul re Konzentration von Glucose f r die beiden Medien mit Glucose ber die Kultivierungsdauer bis auf relativ niedrige Werte abnahm Ein deutlicher Zusam me
22. Sprachen Privates Ehrenamt Freizeit MS Office Excel Word PowerPoint Origin Chromeleon Chromatographiesoftware JMP Statistiksoftware AutoCAD Englisch sehr gut in Wort und Schrift Franz sisch Grundkenntnisse Latinum Vertreter der Doktoranden des Max Planck Institutes Magdeburg 2005 2007 im Doktorandennetzwerk der Max Planck Gesellschaft u a Organisation von Softskill Seminaren Basketball Wandern Malerei des Impressionismus Lebenslauf Joachim B Ritter Publikationen Ritter J B Wahl S A Freund S Genzel Y Reichl U Metabolic effects of influenza virus infection in cultured animal cells Intra and extracellular metabolite profiling submitted Ritter J B Genzel Y Reichl U Metabolite Analysis in Mammalian Cells How to generate reliable data sets Proceedings of the 20th ESACT meeting Cells amp Culture Dresden Germany Ed T Noll Springer in press Ritter J B Genzel Y Reichl U Simultaneous extraction of several metabolites of energy metabolism and related substances in mammalian cells Optimization using experimental design Anal Biochem 2008 373 349 369 Drouin H Ritter J B Gorenflo V M Bowen B D Piret J M Cell Separator Operation within Temperature Ranges To Minimize Effects on Chinese Hamster Ovary Cell Perfusion Culture Biotech Progr 2007 23 1473 1484 Ritter J B Genzel Y Reichl U Monitoring of Extracellular
23. Zahlreiche hnliche Experimente wurden zur Untersuchung des Glucosestoffwechsels von Asziten Tumor Zellen durchgef hrt 89 29 303 3091 Aber auch f r andere Zelllinien wurden diverse Untersuchungen des Zentralstoffwechsels und der regulatorischen Zusammenh nge durchgef hrt 1881 Bei diesen Arbeiten stand der Crabtree Effekt im Vordergrund der Untersuchungen Durch die Anwendung von verschiedenen Bedingungen und Stoffwechselinhibitoren wurde der Abfall der ADP und P Konzentration bzw ein Absinken des pH Wertes als Ursache f r die verminderte Atmung nach Zugabe von Glucose ausgemacht 6 8 91 Es wurde gezeigt dass nach Zugabe von Glucose zu den Zellen ein deutlicher Konzentrationsabfall von ATP innerhalb von einer Minute stattfindet Synchron dazu stieg ADP in seiner Konzentration deutlich an Die zeitliche Dauer der erniedrigten Werte war allerdings f r die verschiedenen Arbeiten unterschiedlich 90 290 303 309 3101 Zus tzlich zu den Konzentrations nderungen der Nukleotide war f r Hexosephosphate ein erheblicher Anstieg zu verzeichnen Die hier vorliegende Arbeit stimmt mit diesen Ergebnissen bez glich des Konzentrationsanstieges der Hexosephosphate berein F r Nukleotide konnten jedoch keine solch deutlichen Konzentrations nderungen wie in der Literatur beschrieben gemessen werden Als Erkl rung k nnte in Frage kommen dass diese kurzzeitigen Konzentrations nderungen durch eine zu niedrige Probenahmefrequenz nicht geme
24. Zellen Well einges t und anschlie end f r drei Tage kultiviert wodurch eine durchschnittliche Zellzahl von 4 29 x 10 Zellen Well erreicht wurde Vero Zellen wurden mit 1 60 x 10 Zellen Well einges t und erreichten nach zweit giger Kultivierung 6 40 x 10 Zellen Well F r jede Zelllinie wurden je f nf Sechs Well Platten mit einer Extraktionsmethode behandelt Der absolute Wert f r jede Zelllinie wurde aus insgesamt zehn Wells aus f nf verschiedenen Platten bestimmt Die Wiederfindung f r sowohl 30 uL als auch 70 uL Standardzugabe wurde ebenfalls jeweils aus zehn Wells aus f nf Platten bestimmt Im Detail wurde wie folgt verfahren F r jede Platte wurde zu den Wells 1 und 2 vor der Extraktion kein Standard zugegeben zu den Wells 3 und 4 wurden 30 uL der Metabolitstandardl sung hinzupipettiert und zu den Wells 5 und 6 wurden 70 uL des Standards gegeben Nach der Probenvorbereitung und dem Messen wurden von den Werten der Proben mit Standardzugabe die Werte der Proben ohne Standardzugabe subtrahiert Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 4 in den ersten beiden Spalten zusammengefasst 5 Ergebnisse und Diskussion 79 Tabelle 5 4 Vergleich der beiden optimierten Extraktionsmethoden bez glich Metabolitgehalt pro Zelle und Wiederfindung f r MDCK A und Vero B Zellen und zus tzlich der im weiteren Verlauf der Arbeit genutzten finalen Methode MeOH CHClIyKochen s Abschnitt 5 2 4 f r MDCK Zellen A MDCK
25. abc bc I A AB BC ABC b 4 ZC t E abc Ee ab ES f 12 bc e 1 Abbildung 3 5 Graphische Darstellung der zwei halben Fraktionen eines 2 faktoriellen Versuchsplans A tabellarische Form mit den Kontrastkoeffizienten Plus und Minuszeichen f r die acht Experimente eines 2 Versuchsplans B Aus der Tabelle in Abbildung 3 5 ist die Berechnung einfach zu ermitteln indem man in der 1 Fraktion den Kontrast f r A mit den entsprechenden Koeffizienten Plus bzw Minuszeichen der Spalte A ermittelt und mit multipliziert Gleichung 3 5 Der Faktor Un s Gleichung 3 1 entf llt typischerweise bei fraktionellen faktoriellen Experimenten da keine Wiederholungs experimente durchgef hrt werden 1 CB 3 5 Durch die Reduktion der Einzelexperimente ist allerdings diese Berechnung mit der Berechnung des Interaktionseffektes BC identisch was hei t dass 3 5 eigentlich den Effekt von A wiedergibt Bei Effekten die nicht zu trennen sind spricht man von Aliassen was eine Vermengung der Effekte dieser Faktoren gleichkommt Dementsprechend sind die Effekte von B bzw C mit den Interaktionseffekten von AC bzw AB vermengt 32 3 Theoretische Grundlagen Die zweite alternative Fraktion besitzt die Definitionsbeziehung ABC In diesem Fall werden die Effekte von A BC B AC C AB gesch tzt
26. per manueller Eingrenzung der Zellfl chen in jeder Ebene und anschlie ender Aufsummierung der einzelnen Volumina jeder Ebene Schichtdicke 0 5 um x Fl che der Ebene zum Gesamtvolumen der Zelle F r die drei unter 5 2 6 beschriebenen Zeitpunkte wurden je 50 Zellen ausgewertet 40 4 Material und Methoden 4 3 4 Bestimmung von Glucose Lactat Glutamin Glutamat und Ammonium Die Bestimmung der extrazellul ren Metaboliten Glucose Lactat Glutamin Glutamat und Ammonium erfolge mit dem Ger t Bioprofile entsprechend der Arbeitsanweisung G_22_Bedienungsanweisung_Bioprofile doc mit folgenden Modifikationen Jede Konzentration des Standards wurde in einer Messsequenz mindestens dreifach bestimmt wobei je eine Messung zu Beginn und am Ende der Messsequenz durchgef hrt wurde Bei Kultivierungsverl ufen in Sechs Well Platten wurden f r jeden Zeitpunkt Proben aus mindestens drei Wells entnommen Die Proben wurden in randomisierter Reihenfolge gemessen Die Arbeitsbereiche f r die verschiedenen Metaboliten sind in der folgenden Tabelle aufgef hrt Tabelle 4 1 Validierte Messbereiche und relative Verfahrensstandardabweichung f r das Ger t Bioprofile f r die mit diesem Ger te quantifizierten extrazellul ren Metaboliten Validierungs messungen vom 13 06 2006 Konzentration mM rel Verfahrensstandardabweichung Glucose 3 9 41 0 1 9 Lactat 8 4 33 3 6 4 Glutamin 0 25 2 60 3 9 Glutamat 0 29 2 60 21 Ammonium 0
27. 0 003 0 7328 Kochen ja xPuffer HO 0 011 0 1922 0014 0 1151 0 043 0 4706 0 017 0 147 B Zielgr e Nukleotidgehalt Energy Charge F16bP Gehalt Absorp 280 nm R 0 980 0 995 0 996 1 000 Anova p Wert 0 2608 0 1266 0 1138 0 0319 Term Schdtz wert p Wert Schdatz wert p Wert Schnittpunkt 1 000 0 0103 1 000 0 0041 1 000 0 0163 1 000 0 0024 Vol CHCI 0 02810 3370 0 002 0 7894 0 052 0 2943 0 047 0 0502 Verh lmis Puffer 0 060 0 1693 0 002 0 7970 0 044 0 3343 0 141 0 0167 Ultras Behandlunglja 20 054 0 1873 20 048 0 0863 0 261 0 0623 0 021 0 1133 Puffer H50 0 021 0 4157 0 066 0 0620 0 291 0 0560 0 13510 0174 Anzahl der Extraktionen 1x 0 072 0 1415 0 006 0 5020 0 111 0 1442 0 080 0 0295 Vol CHCI x Verh ltnis MeOH 7 Puffer 20 014 0 5468 20 049 0 0836 20 085 0 1872 0 001 0 8574 Anhang Tabelle A 11 Zusammenfassung der Anpassung Summe der Fehlerquadrate f r die Ergebnisse der Optimierung gem dem Central Composite Versuchsplan f r die Methoden MeOH Kochen A und B MeOH Kochen Zielgr e Nukleotidgehalt Energy Charge F16bP Gehalt Absorp 280 nm transformiert transformiert 0 789 0 750 0 686 0 339 Anova p Wert lt 0001 lt 0001 0 0845 lt 0001 Sch tz p Wert Sch tz p Wert Sch tz p Wert Sch tz p Wert Schnittpunkt 0 825 lt 0001 1 798 l
28. 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 7 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 101 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10110 1010 10 10 1010 1010 10 16 10 10210 10 D 10 1010 10 10 10 10 0 10110 10 10 1 1010 10 10 1010 1010 10 10 Abbildung 5 22 Kreuzkorrelationsmatrix f r Kultivierungen von MDCK Zellen in EpiSerf Zur Erl uterung s Abbildung 5 21 Grunds tzlich zeigten sich somit in beiden Medien einige gemeinsame Korrelationen Insbesondere die extrazellul ren Konzentrationen die Zellzahl und das Gesamtzellvolumen wiesen in beiden Medien bereinstimmende Muster auf Weiterhin waren die Korrelationen im Block der Zucker phosphate in beiden Medien ausgepr gt Die organischen S uren Citrat cis Aconitat und Isocitrat korrelierten ebenfalls in beiden Medien sowie auch Succinat und Fumarat Einen weiteren in beiden Medien ausgepr gten Block bildeten CDP UDP und ADP sowie CTP und UTP Auch die beiden Zuckernukleotide UDP GlcNAc und UDP GalNAc waren in beiden Medien gut korreliert 132 5 Ergebnisse und Diskussion Um deutliche Unterschiede zwischen den beiden Medien klarer darstellen zu k nnen wurde von den Korrelationskoeffizienten der Kultivierungen in GMEM Z die der Kultivierungen in EpiSerf subtrahiert Diese Matrix Abbildung 5 23 enth lt keine Werte mit konkreter Bedeutung wie z B Korrela
29. 1994 Catabolic Control of Hybridoma Cells by Glucose and Glutamine Limited Fed Batch Cultures Biotechnology and Bioengineering 44 7 808 818 Martinelle K Doverskog M Jacobsson U Chapman BE Kuchel PW Haggstrom L 1998 Elevated glutamate dehydrogenase flux in glucose deprived hybridoma and myeloma cells evidence from 1H ISN NMR Biotechnology and Bioengineering 60 4 508 517 Reitzer LJ Wice BM D K 1979 Evidence that glutamine not sugar is the major energy source for cultured HeLa cells Journal of Biological Chemistry 254 2669 2676 Zielke HR Ozand PT Tildon JT Sevdalian DA Cornblath M 1978 Reciprocal regulation of glucose and glutamine utilization by cultured human diploid fibroblasts Journal of Cellular Physiology 95 1 41 48 Ibsen KH 1961 Crabtree Effect a Review Cancer Research 21 7 829 841 Sussman I Erecinska M Wilson DF 1980 Regulation of cellular energy metabolism The Crabtree Effect Biochimica Et Biophysica Acta 591 2 209 223 Wu R Racker E 1959 Regulatory Mechanisms in Carbohydrate Metabolism 4 Pasteur Effect and Crabtree Effect in Ascites Tumor Cells Journal of Biological Chemistry 234 5 1036 1041 Barnett JA Entian KD 2005 A history of research on yeasts 9 regulation of sugar metabolism Yeast 22 11 835 894 Chapman AG Fall L Atkinson DE 1971 Adenylate energy charge in Escherichia coli during growth and starvation Journal of Bacteriology 108 3 1072 1086 Atkinson DE 1968 Energ
30. 5 Ergebnisse und Diskussion 59 graphie ohne MS Detektor s 5 1 1 2 berpr ft sondern es wurde eine Sch tzung der Varianz basierend auf Mehrfachbestimmungen aus verschiedenen Messsequenzen durchgef hrt s 5 1 1 5 und 5 2 5 Tabelle 5 2 Zusammenfassung der mittels SIM Kanal detektierten Metaboliten mit den entsprechenden charakteristischen m z Fragmenten den entsprechenden chromatographischen Zeit fenstern und den f r den MS Detektor verwendeten Konusspannungen Detektierter Metabolit Zeitfenster min Konusspannung V 87 0 Pyruvat 5 5 7 5 40 115 3 Fumarat 26 0 32 0 40 117 4 Succinat 13 0 22 0 45 133 4 Malat 14 0 23 0 45 145 0 a Ketoglutarat 23 0 29 0 35 167 0 42 5 47 5 40 169 0 Fructose 1 6 bP 50 0 54 0 45 173 0 cis trans Aconitat 42 5 49 5 35 185 0 3PG 36 5 42 0 50 191 0 Isocitrat 39 0 45 0 50 229 0 Ribose 5 P 30 0 34 0 45 259 0 Hexose Phosphate z B G6P F6P 22 0 33 0 60 282 0 UDP Glc UDP Gal 46 0 49 5 45 302 5 UDP Glc NAc UDP Gal NAc 40 0 46 0 45 323 0 UMP 45 0 49 0 70 346 0 AMP 30 0 34 0 70 362 0 GMP 49 0 56 0 70 402 0 CDP 39 5 44 0 70 5 1 1 5 Bestimmung der Standardabweichung der Chromatographiemethode unter realen Messbedingungen Im Laufe der Arbeiten zeichnete sich ab dass f r insbesondere die mittels MS Detektor aber auch einige mithilfe der anderen beiden Detektoren quantifizierten Metaboliten keine homogene Varianz ber den genutzten Messbereich vorlag Typischerweise
31. Dieses Niveau wurde bis zum Ende des Experiments nahezu konstant gehalten Der Verlauf von Pyruvat erschien relativ konstant Die Metaboliten Citrat cis Aconitat nicht gezeigt und Isocitrat nicht gezeigt verhielten sich wiederum sehr hnlich Der Anfangswert entsprach dem Minimum Nach 0 5 min war ein leichter Anstieg zu verzeichnen Danach fand eine relativ rasche Konzentrationszunahme statt und es wurde ein Maximum bei etwa 10 min erreicht Bis 20 min fiel die Konzentration wieder und ein leichter Anstieg folgte bis zum Ende des Versuchs F r o Ketoglutarat fand bis etwa 2 min ein leichtes Absinken der Konzentration statt wonach sich ein deutlicher Anstieg bis 60 min anschloss Die Konzentration von Succinat nicht gezeigt stieg ber die ersten 1 2 min an danach war der Verlauf 5 Ergebnisse und Diskussion 155 bis 10 min relativ konstant woraufhin die Konzentration bis zum Ende des Versuchs weiter anstieg Die Konzentrationsverl ufe von Fumarat nicht gezeigt und Malat hnelten auch in diesem Versuch einander stark Zwar schien bei Fumarat vom Anfangswert bis zur ersten Probe ein leichtes Abfallen stattzufinden was f r Malat nicht zu erkennen war aber im weiteren Verlauf fand f r beide Metaboliten zuerst ein Anstieg der Konzentration bis zu einem Maximum bei etwa 5 min statt Anschlie end fielen die Konzentrationen bis bei 20 min ein lokales Minimum erreicht wurde Daraufhin stiegen die Konzentrationen wieder bis zum Ende des
32. Isynth 7 MALAT j gt PHOSPHOENOLPYRUVAT Synthase A 1 ADP Pyruvat Kinase Se _ OXALACETAT sy j ACETYL CoA St j lh PYRUVAT NAD e 1 Lactat L Bere Ne NADP4 j Dehydrogenase z Ht CO2 H C0 F NADH H PYRUVAT lt 4 22 j NAD falatenzym 1 3 wh MITOCHONDRIUM SPESSA Malatenzym LAT er NADH Phosphoenolpyruval 0 ADP R Tice 1 x 1 e CITRAT en Ge LACTAT PYRUVAT Abbildung 3 2 Schema wichtiger Stoffwechselwege des Zentralstoffwechsels fiir tierische Zellen in Kultur Schwarze Schrift farblich hinterlegt Stoffwechselintermediate mit Ausnahme von Nukleotiden griin in dieser Arbeit gemessene Metaboliten rote Schrift kursiv Enzyme blaue Schrift zus tzliche reaktionsteilnehmende Metaboliten fette dunkelgraue Pfeile Reaktionen der Glykolyse des Krebszyklus und der Glutaminolyse d nne schwarze Pfeile anaplerotische Reaktionen d nne gestrichelte schwarze Pfeile Zusammenfassung mehrerer Reaktionen Punktpfeile von oder zu diversen Reaktionen unidirektionale Pfeile Reaktionen welche zum Gro teil in eine Richtung stattfinden bidirektionale Pfeile Reaktionen welche in zwei Richtungen ablaufen 3 Theoretische Grundlagen 11 3 1 1 Glucosestoffwechsel Der Abbau von Glucose in kultivierte
33. Kultivierungszeit Kultivierungszeit Abbildung 3 1 Schema des Zellwachstums von adh renten Zellen in A bei linearer Darstellung der Zellzahl und B bei logarithmischer Auftragung Die vertikalen blauen Linien deuten die Grenzen der entsprechenden Wachstumsphasen an Lag Lag Phase Exp Exponentielle Phase Stat Station re Phase Typischerweise erfolgt die Einsaat von adh renten Zellen nach Abl sung der Zellen aus der Vorkultur in suspendiertem Zustand Je nach Kultursystem und Zelllinie heften sich die Zellen anschlie end mit unterschiedlicher Effizienz an Nach der Anheftung erfolgt meist eine Lag Phase mit einer niedrigen Wachstumsrate Diese Phase ist durch die Anpassung der Zellen an die neuen Kultivierungsbedingungen gepr gt Anschlie end folgt das exponentielle Wachstum mit der 3 Theoretische Grundlagen 9 maximalen Teilungsrate Der zeitliche Bereich dieser Phase ist typischerweise bei logarithmischer Auftragung als linearer Bereich zu erkennen s Abbildung 3 1 B Nach dem exponentiellen Wachstum schlie t sich ein Bereich mit eingeschr nktem Wachstum an Hauptursache f r diese Einschr nkung ist bei adh renten Zellen die Limitation der Wachstumsfl che Abschlie end wird die station re Phase durchlaufen Die Zellen sind in dieser Phase im konfluenten Zustand und keine weitere Vermehrung findet statt W hrend Suspensionszellen gegen Ende einer Batch Kultivierung die Absterbephase durchlaufen ist f r adh rente Z
34. Werte wurden auf die Methode MeOH CHCI normiert die Fehlerbalken deuten den Standardfehler des Mittelwertes an die Sterne indizieren signifikante Unterschiede zwischen den Methoden entsprechend einem t Test p lt 0 05 Signifikante Unterschiede zwischen den beiden Methoden sind f r einige Metaboliten zu erkennen t Test p lt 0 05 gekennzeichnet mit einem Stern Trotzdem waren die Ergebnisse f r beide Methoden sehr hnlich und die Gr enordnungen f r die jeweiligen Metaboliten f r beide Methoden gleich Es ist zu erkennen dass nur drei Metaboliten sich bei den unterschiedlichen Zelltypen in ihren Tendenzen gleich verhielten d h die Werte f r GDP und UDP waren f r die 5 Ergebnisse und Diskussion 81 Methode MeOH Kochen f r beide Zelllinien niedriger als f r die Methode MeOH CHC F r CDP war das Verhalten umgekehrt Auf der rechten Seite in Abbildung 5 10 A und B sind die in den vorangehenden Experimenten genutzten Zielgr en dargestellt Nahezu gleiche Werte wurden f r die beiden Zielgr en Energy Charge und F16bP Gehalt f r MDCK Zellen ermittelt Allerdings waren die Werte f r die Absorption 280 nm und den Nukleotidgehalt f r die Methode MeOH CHCh signifikant besser F r Vero Zellen war f r die Methode MeOH CHC die Absorption 280 nm und die Energy Charge signifikant niedriger und der Nukleotidgehalt und der F16bP Gehalt waren leicht aber nicht signifikant h her Die durchs
35. application to cell pool extracts prepared from Escherichia coli Analytical Biochemistry 232 1 98 106 Vogt AM Ackermann C Noe T Jensen D Kubler W 1998 Simultaneous detection of high energy phosphates and metabolites of glycolysis and the Krebs cycle by HPLC Biochemical and Biophysical Research Communications 248 3 527 532 Lu SB Sun XM Shi CO Zhang YX 2003 Determination of tricarboxylic acid cycle acids and other related substances in cultured mammalian cells by gradient ion exchange chromatography with suppressed conductivity detection Journal of Chromatography A 1012 2 161 168 Groussac E Ortiz M Francois J 2000 Improved protocols for quantitative determination of metabolites from biological samples using high performance ionic exchange chromatography with conductimetric and pulsed amperometric detection Enzyme and Microbial Technology 26 9 10 715 723 Taha TSM Deits TL 1994 Detection of metabolites of Entner Doudoroff pathway by HPLC with pulsed amperometry Application to assays for pathway enzymes Analytical Biochemistry 219 1 1 15 120 Zaldivar J Borges A Johansson B Smits HP Villas Boas SG Nielsen J Olsson L 2002 Fermentation performance and intracellular metabolite patterns in laboratory and industrial xylose fermenting Saccharomyces cerevisiae Applied Microbiology and Biotechnology 59 4 5 436 442 Hanko VP Rohrer JS 2000 Determination of carbohydrates sugar alcohols and glycols in cell cultures and
36. auch dass neben den f r die entsprechenden Substanzen typischen Masse Ladung m z Werten auch nicht zuzuordnende m z Werte in manchen Peaks des Leitf higkeitskanals verborgen waren Dar ber hinaus konnten f r einige bislang unbekannte Peaks des Leitf higkeitskanals charakteristische m z Fragmente identifiziert werden Metaboliten konnten diesen Fragmenten bisher nur zum Teil zugeordnet werden Ein repr sentatives Chromatogramm einer Extraktions probe von MDCK Zellen mit den zugeh rigen m z Werten die in mehreren Proben auftraten ist in Abbildung 5 3 gezeigt A a 3 a g S S P S S LS gt 8 S d bay ope 5 a 5 S ag SZ ass 8 REE ISSARRRS ZS S 5 e S Ros Er 8 ge d ef S We g 9 g 8 Ra N 88388 a sag g vi a 4 1689 3 2 on S a a d 65055 Ban E is S 2 2 2 Saa te SESE 5 a 8 8 g 8 ECK g go Sis gt amp ono 0 53 SEO 8 S BBB te 8 93 38 3 SE 525 g al D2580 E 2 5 ze 5 3 se E 8 5 GO 5 H SE 2 S53 3 S 53343 E 228 H 2 is _ N 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 30 0 325 350 375 400 425 450 47 5 500 525 550 575 60 0 Retentionszeit min Abbildung 5 3 Darstellung eines repr sentativen Chromatogramms des Leitf higkeitskanals einer Extraktionsprobe mit den in mehreren Extraktionsproben auftretende
37. dass eine Anwendbarkeit der Probenvorbereitungsmethode f r diese Zelllinie m glich ist Zus tzlich waren mitunter deutliche Unterschiede zu MDCK Zellen zu erkennen In hnlicher Form wie die Versuche unter 5 3 2 3 wurden auch f r Vero Zellen vier parallele Kultivierungen in Sechs Well Platten in DMEM Medium mit verschiedenen Substraten durchgef hrt 1 Glce 25 mM Gln 2 mM 2 Glc 25 mM 3 Gln 2 mM 4 Pyr 2 mM Eine vollst ndige Beschreibung dieser Experimente erlaubt der Rahmen dieser Arbeit nicht allerdings sind exemplarisch einige Konzentrationsverl ufe in Abbildung 5 27 gezeigt 144 5 Ergebnisse und Diskussion 15 os Fr E kj a 065 in 0 4 N N 5 5 02 5 N 04 0 97 3 0 0 95 4 0 5 5 0 93 20 S 6 lt 5 091 N 10 5 8 5 0 89 00 0 87 24 48 72 96 120 8 72 96 120 2 48 72 96 120 Kultivierungszeit h Abbildung 5 27 Verl ufe von Zellzahl intrazellul ren Metabolitkonzentrationen und der Energy Charge bei Kultivierung von Vero Zellen in DMEM mit vier verschiedenen Wachstumssubstraten Medium mit 25 mM und Gln 2 mM o Medium mit 2 5 mM x Medium mit Gin 2 mM A Medium mit Pyr 2 mM Im Gegensatz zu den Versuchen mit MDCK Zellen mit DMEM wurde f r Vero Zellen eine Start konzentration von Glucose von 25 mM eingesetzt um einen Vergleich zu den voran
38. editor Mammalian cell biotechnology in protein production Berlin u a de Gruyter p 193 225 Glacken MW Fleischaker RJ A J S 1986 Reduction of waste product excretion via nutrient control Possible strategies for maximizing product and cell yields on serum in cultures of mammalian cells Biotechnology and Bioengineering 28 1376 1389 Kurano N Leist C Messi F Kurano S Fiechter A 1990 Growth Behavior of Chinese Hamster Ovary Cells in a Compact Loop Bioreactor 2 Effects of Medium Components and Waste Products Journal of Biotechnology 15 1 2 113 128 Ozturk SS Riley MR Palsson BO 1992 Effects of Ammonia and Lactate on Hybridoma Growth Metabolism and Antibody Production Biotechnology and Bioengineering 39 4 418 431 185 5 52 53 54 55 56 57 58 59 60 6 62 63 64 65 66 67 68 69 70 7 72 73 74 75 Hassell Gleave S Butler 1991 Growth Inhibition in Animal Cell Culture the Effect of Lactate and Ammonia Applied Biochemistry and Biotechnology 30 1 29 41 Chen KQ Liu Q Xie LZ Sharp PA Wang DIC 2001 Engineering of a mammalian cell line for reduction of lactate formation and high monoclonal antibody production Biotechnology and Bioengineering 72 1 55 61 Omasa T Higashiyama K Shioya S Suga K 1992 Effects of Lactate Concentration on Hybridoma Culture in Lactate Controlled Fed Batch Operation Biotechnology and Bioengi
39. lften der Korrelationsmatrix gespiegelt sind Alternativ zu den Zahlenwerten in den einzelnen Feldern kann auch der Korrelationskoeffizient ber eine Farbkodierung zur besseren Visualisierung angegeben werden Durch diese Art der Auswertung kann ein schneller berblick ber m gliche Zusammenh nge zwischen Metaboliten erlangt werden Gerade f r den Fall von gro en Datenmengen hat sich diese Methode der Visualisierung als hilfreich erwiesen Insbesondere im Bereich der Metabolomanalyse f r Pflanzen wurde die Korrelationsanalyse zur Auswertung in zahlreichen Arbeiten eingesetzt 7 Aber auch f r Hefen 4 und E coli wurden Korrelationen zwischen Metaboliten zur Interpretation der Daten herangezogen Der Ursprung von Korrelationen von Metaboliten wird in einigen Publikationen diskutiert 2257 Grunds tzliche Aussagen dieser Ver ffentlichungen waren unter anderem dass Metaboliten die im chemischen Gleichgewicht stehen einen sehr hohen Korrelationskoeffizienten haben Weiterhin wurde festgestellt dass f r den Fall von nderungen im 36 3 Theoretische Grundlagen Korrelationsverhalten zwischen zwei Metaboliten unter unterschiedlichen Zust nden eine nderung in der Regulation andeuten Im Falle der Analyse von Zeitreihen kommen oft zeitliche Verschiebungen zwischen zu korrelierenden Signalen vor Aus diesem Grund wird f r zeitabh ngige Signale h ufig eine Kreuzkorrelation verwendet um Zusammenh nge aufzudecken 1258 259
40. llt auf dass die Werte f r die Proben mit Zellen einen erheblich gr eren Schwankungsbereich aufwiesen Dabei waren Nukleotide am meisten beeinflusst da scheinbar w hrend der Probenvorbereitung Nukleotidkinasen aktiv waren Dass diese Nukleotidkinasereaktionen nicht bei der Optimierung entdeckt wurden deutet auf ein klares Problem der Optimierungsprozedur hin Da diese Reaktionen keine der gew hlten Zielgr en beeinflussten war es nicht m glich diese Umsetzungen bei der Optimierung zu detektieren Somit dr ngt sich die Frage auf ob die gew hlten Zielgr en die richtigen waren Insbesondere zur Energy Charge w ren Alternativen vorhanden gewesen wie z B andere Metabolitverh ltnisse ATP ADP ATP ADP x P Aber auch diese Verh ltnisse bergen gewisse Nachteile So ist es sicher nicht m glich mit einem oder zwei Werten s mtliche chemischen und biologischen m glichen Umsetzungsprozesse aufzudecken Da die Energy Charge sehr gut in der Literatur charakterisiert ist 97 94 115 116 235 280 281 War dieses Nukleotidverh ltnis wahrscheinlich trotzdem eine gute Wahl Grunds tzlich zeigte sich aber auch dass es wichtig und erforderlich ist dass man bei der Auswahl der Probenvorbereitung nicht nur anhand einer Variablen vorgehen sollte sondern diverse kritische Variablen ber cksichtigt 5 Ergebnisse und Diskussion 93 Ziel dieser Arbeit war nicht das Gleichgewichtsverh ltnis der Nukleotidkinasereaktionen aufzu kl ren
41. nde die M glichkeit ber die Methode der Metabolischen Kontroll analyse 13 die flusskontrollierenden Reaktionsschritte in Abh ngigkeit vom Kulturzustand zu identifizieren Eine weitere M glichkeit zur Fortf hrung der Experimente b te sich in der Untersuchung von dynamischen Kulturen Da die blicherweise in der Arbeitsgruppe Bioprozesstechnik f r die Kultivierung im Bioreaktor genutzten Cytodex Mikrocarrier durch ihre positive Ladung ungeeignet sind f r die Analyse von anionischen Metaboliten wurde von Frau Christina Kr mer eine 7 Ausblick 177 Kultivierung auf alternativen Mikrocarriern etabliert Bei diesen Mikrocarriern MicroHex Nunc handelt es sich um aus Polystyrene gefertigte hexagonale Bl ttchen Durch die Optimierung von insbesondere den Anheftungsbedingungen f r MDCK Zellen konnten mit Cytodex Carriern vergleichbare Zellzahlen und Influenza Virustiter erzielt werden DI Durch die erheblichen Unterschiede bei der Zellkultivierung in statischen und dynamischen Kulturen sind auch klare Konzentrationsunterschiede der intrazellul ren Metaboliten zu erwarten Erste Versuche zur Probenvorbereitung mit Mikrocarriern wurden bereits durchgef hrt und eine prinzipielle Anwendbarkeit konnte gezeigt werden Aktuelle zum Teil bereits durchgef hrte Arbeiten befassen sich mit den metabolischen Auswirkungen einer Infektion von MDCK Zellen mit Influenza Virus in hnlicher Form wie von Munger et al f r Cytomegaloviren ber
42. ndert Dieses qnt File wurde dann bei allen Proben eingetragen e Durch Uberlagern der einzelnen Chromatogramme wurden die Retentionszeiten berpr ft Hierzu die Proben im Browser markieren und mit der rechten Maustaste compare ECD aussuchen Typischerweise wurden hierf r Standards vom Anfang und vom Ende der Messsequenz ausgew hlt und bereinander gelegt Auf Decoration klicken gt Peak Calipers zeigt die Zeitfenster der entsprechenden Substanzen an F r jeden Kanal k nnen diese Fenster festgelegt werden Diese Fenster k nnen auch direkt verschoben werden um bei ver ndertem Retentionsverhalten die Auswertung anzupassen Die Fenster wurden so gew hlt dass sie einerseits m glichst klein sind aber andererseits m glichst alle Retentionszeiten der entsprechenden Substanz umfassen Alle auszuwertenden Peaks sollten so behandelt werden Nach dem Anpassen der Retentionszeiten wurden typischerweise s mtliche Substanzen in allen Proben und Standards in allen Kan len berpr ft und u U die Detektionsparameter angepasst so dass m glichst alle Peaks richtig integriert Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 e wurden Die Detektionsparameter k nnen f r jeden Kanal unabh ngig definiert werden e Da sich bei l ngeren Messsequenzen selten gew hrleisten l sst dass alle Peaks g nzlich richtig integriert werden wurden in einem erneuten Zyklus der Begutachtung der Peaks manuelle Modifikationen einge
43. nnen leicht zu einem fehlerhaften Gesamtzellvolumen f hren Dies wiederum resultiert in fehlerhaften Konzentrationsberechnungen Da diese hier genannten Gr nde f r Schwankungen der Konzentrationen f r alle Versuche in gleicher Form aufgetreten sein k nnen wird in den folgenden Abschnitten auf eine explizite Erw hnung dieser Erkl rungen f r die auftretende Variabilit t verzichtet 5 2 8 Zusammenfassung zur Optimierung einer Probenvorbereitungsmethode In dieser Arbeit wurde eine Probenvorbereitung zur Bestimmung intrazellul ren Stoffwechselprodukten des Zentralstoffwechsels f r adh rente Zelllinien entwickelt welche eine anschlie ende Quantifizierung der Metaboliten durch AAC erlaubt Nach einem generellen Vergleich von verschiedenen g ngigen Probenvorbereitungsmethoden basierend auf ihrer Eignung zur Extraktion von ATP Lumineszenzmessung und der Abreicherung von Protein und Nuklein s uren Absorption bei 280 nm wurden zwei Methoden in unabh ngigen Verfahren mit Hilfe von statistischer Versuchsplanung optimiert Hierf r wurden vier Zielgr en verwendet Energy Charge Nukleotidgehalt Fructose 1 6 Bisphosphat Gehalt und die Absorption 280 nm Die Be stimmung der Metabolitkonzentrationen erfolgte anhand der unter Kapitel 5 1 entwickelten Chro matographiemethode In einem Screening der Einflussgr en basierend auf einem fraktionellen faktoriellen Versuchsplan konnten relevante Faktoren f r die beiden Methoden identifiz
44. ob offensichtliche Beziehungen zwischen Metaboliten existieren wurden die Ergebnisse aus verschiedenen Experimenten gemeinsam ausgewertet Das hei t die Metabolitkonz entrationen von ca 1500 einzelnen mit Zellen bewachsenen Wells aus Sechs Well Platten wurden in Streudiagrammen aufgetragen Gegenseitige Abh ngigkeiten von je zwei Metaboliten sollten so aufgedeckt werden Exemplarisch sind zwei dieser Diagramme in Abbildung 5 14 dar gestellt W hrend Citrat und cis Aconitat ein sehr hnliches Verhalten zeigten Korrelationskoeffi zient 0 97 erwiesen sich Pyruvat und F16bP als unkorreliert r 0 05 Insbesondere im Streu diagramm f r Pyruvat und F16bP scheinen zwei Populationen zu erkennen zu sein Ursache hierf r waren unterschiedliche Bedingungen in den Versuchen die dem Diagramm zu Grunde liegen 0 45 0 40 0 35 0 30 0 25 0 20 0 15 0 10 4 0 05 0 00 0 50 0 97 Konz cis Aconitat mM Konz F16bP mM 0 10 20 30 0 10 20 30 Konz Citrat mM Konz Pyruvat mM Abbildung 5 14 Streudiagramme f r die jeweils gleichzeitig gemessenen Konzentrationen von A Citrat und cis Aconitat und B Pyruvat und F16bP Aufgetragen sind die Konzentrationen pro Well f r die jeweiligen Metaboliten f r s mtliche Messungen die nach der Etablierung der Probenvorbereitungsmethode durchgef hrt wurden die Geraden stellen eine lineare Regression dar r entspricht den jeweiligen Korrelationsk
45. ren Metaboliten aus dem Zentralstoffwechsel etabliert werden Einer der Vorteile dieser Probenvorbereitung liegt in der generellen Anwendbarkeit So k nnen die auf diese Weise erzeugten Proben mit unterschiedlichsten analytischen Methoden zur Quantifizierung wie z B AAC oder Gaschromatographie analysiert werden Ein weiterer Vorteil ist dass durch die systematische Optimierung anhand mehrerer Zielgr en unterschiedlichste Metabolitklassen erfolgreich mit dieser Methode extrahiert werden k nnen Aus diesem Grunde ist zu erwarten dass diese Methode auch f r Analysen im Forschungsbereich Metabolomics erfolgreich anzuwenden ist Ein weiterer zu erw hnender Pluspunkt ist dass diese Methode ausf hrlich charakterisiert wurde und f r jeden zu bestimmenden Metaboliten eine realistische Sch tzung der Standardabweichung existiert Laufende Arbeiten deuten an dass eine erfolgreiche Nutzung dieser Methode in leicht modifizierter Form sowohl f r Suspensionszelllinien als auch Bakterien m glich ist 5 3 Untersuchung intrazellul rer Metabolitkonzentrationen tierischer Zellen Neben der Etablierung der Methode zur Bestimmung von intrazellul ren Stoffwechselprodukten war das Ziel der hier vorliegenden Arbeit intrazellul re Konzentrationen in kultivierten tierischen Zellen und deren Verl ufe zu ermitteln Aus diesem Grund wurden zahlreiche Kultivierungs versuche unter diversen Bedingungen und ber verschiedene Zeitr ume durchgef hrt und hier
46. tzung der Abreicherung von insbesondere Proteinen und Nukleins uren liefern Diese Eigenschaft der Proben war ein wichtiges Kriterium im Hinblick auf die Nutzung der AAC da hochmolekulare Verbindungen die Degradierung der Chromatographies ule beschleunigen Die beiden Messgr en wurden gew hlt da sie sowohl einfach als auch relativ unabh ngig von der Probenmatrix bestimmt werden k nnen Gerade der zweite hier erw hnte Grund war bei diesem Experiment wichtig da die verschiedenen Methoden ein weites Spektrum an Matrizes einschlie en F r die einzelnen Experimente wurde mit jeder Methode je eine Sechs Well Platte mit Zellen extrahiert Der ATP Gehalt wurde f r jedes der Einzelexperimente auf den Mittelwert des Experiments normiert um physiologische Unterschiede zwischen den Experimenten zu kompensieren Die Werte aller Wells einer Platte wurden gemittelt und der Standardfehler berechnet Wie in Abbildung 5 6 A zu erkennen ist war die Abreicherung von Substanzen die bei 280 nm absorbieren f r die meisten Methoden relativ gut Nur die Methoden Kochendes D und Zelllyse K lieferten relativ hohe Werte Da bei der Methode Zelllyse K keine Abreicherung sondern nur eine Solubilisierung der Zellbestandteile durchgef hrt wurde sind die Absorptionswerte bei 280 nm f r diese Methode als ein Maximum anzunehmen Die Dauer des Kochvorgangs bei der Methode Kochendes H20 D war h chstwahrscheinlich nicht ausreichend
47. um den Gro teil des Proteins oder der Nukleins uren zu f llen was in hohen Werten der Absorption resultierte Die niedrigsten Werte und somit besten Werte wurde f r die Methode PCS A erzielt gefolgt von den Methoden MeOH CHCE Kochendes EtOH C Ameisens ure E und MeOH Kochen J Es ist 70 5 Ergebnisse und Diskussion anzunehmen dass die F llung der Makromolek le durch die extremen Bedingungen der verschiedenen Methoden bewirkt wurde Die Schwankungen der Ergebnisse zwischen den drei unabh ngigen Experimenten f r die Absorption 280 nm sind bis auf die Methoden Kochendes H20 D und Zelllyse K relativ gering 3 A AU Absoption 280 nm Extraktionsmethode und Mittelwert der Absorption AU Extraktionsmethode und Mittelwert des rel ATP Gehalts Abbildung 5 6 Vergleich verschiedener Extraktionsmethoden zur Bestimmung intrazellul rer Metaboliten aus MDCK Zellen in Sechs Well Platten bez glich A Absorption bei 280 B Relativer ATP Gehalt pro Zelle Normalisiert auf den Mittelwerte aller Extraktionsmethoden eines Experiments Extraktionsmethoden A PCS B Kochendes MeOH Kochendes EtOH D Kochendes 0 F Kaltes ACN Kaltes EtOH Kaltes MeOH I MeOH CHCI J MeOH Kochen K Zelllyse Jeder der drei unterschiedlichen Balken stellt den Wert in einem unabh ngigen Experiment dar Mittelwert aus sechs Wells eine
48. 0 87 7 5 5 0 13 0 01 93 8 42 2 GDP 40 0 09 40 00 137 747 8 119 7 3 7 0 08 0 00 112 143 6 108 2 2 3 0 10 0 00 99 0 1 8 Glucose 6 P 35 0 03 0 01 95 544 8 85 3 5 6 0024000 86 8 1 5 86 6 1 2 0 0220 00 84 6 2 0 GMP 25 0 63 0243 65 2 43 5 0 56 9 3 9 55 5 1 6 0 0120 00 1174 14 79 1 2540 01 97 1 70 92 5 33 1184002 852458 90 1 2 3 1 26 0 02 102 2 3 2 Malat CMP 200 25 0 56 0 05 102 8 68 962 15 0 56 0 01 88 1 42 5 89 6 1 5 0 56 0 02 90 1 43 7 PEP cis Aconitat 25 25 0 07 40 00 731444 73 0 1 7 0 06 0 00 71 7 1 7 75 9 0 8 0 04 0 00 85 5 40 8 Succinat 200 025 001 94 245 4 88 5 0 9 0204001 81 7 42 6 85 3 1 1 0 19 0 01 98 0 9 1 UDP 25 0 04 0 00 233 0 18 1 175 8 15 8 0 03 0 00 179 5 12 2 170 9 8 5 0 03 0 00 88 2 0 7 UDP Gle 70 0 39 40 01 96 082 970 51 0414003 82 6 10 9 906446 0464002 96 0 49 5 UDP GalNAc 60 0 23 0 00 100 6 46 95 3 12 0244000 85 642 6 87 7 41 5 0 22 0 01 100 3 1 1 UDP GIcNAc 200 0 45 0 01 98948 947 08 0444001 87 8222 903 1 5 0 44 0 01 96 3 1 0 UDP GIeNAc Isoc 200 25 0 45 0 01 97 8 49 94 2 0 8 0 45 001 874322 90 2 1 5 0 43 40 01 98 1 0 8 UMP UDP Gle 75 70 067 001 71 3 51 80 0 3 0 0644001 62 5 43 6 69 7 2 3 0 68 0 01 93 0 1 1 UTP 200 1 31 40 01 93 0455 92 6 43 6 1 25 0 02 81 3 45 0 85 2 2 2 1 35 0 02 95 6 1 2 MITTELWERT 103 1 35 4 96 0 23 4 90 0 25 6 91 2 22 0 96 8 7 7 B Vero MeOH CHC MeOH Kochen Konz d Standar
49. 007 007 A T Z s 1 I I I z I s s o 00 0001 0008 I I I I or I I T T I s i o s 005 0001 0001 aan g I I I I oi or 1 I I I I I so I 1 so 5 005 005 005 dIN I I I I I I I I so 50 60 1 005 001 001 5 ol oor I oof oa s 14 I z I s oos 0001 0001 9 oor of soo 500 500 SOO TO TO TO TO 50 TO TO I Belt 07 0 494 sol I or I I I I I I I I s I s T s 007 oos 005 aay I I I I so so en or T I 01 so oor 007 0001 Ida 1 1 I I so so so or I s 0 0 01 001 007 0001 awn 3 I I I I z so I s I T 07 0001 0001 men Ol i O 1 O Dm o I or 0 so so 50 001 0001 0001 gt 1 AJ Im I I I I vo so so en 1 s 001 000 0001 ovneo aan 2 I I T so 1 so so 1 s 001 0005 0001 2VNPID AGn 3 vi O 1 I or I o 1 I s 1 1 or 005 0001 0001 40 5 I I al oT I S0 En 80 I T 1 I s I so 07 0001 0001 mai s s s s 0 10 To TO 1 T I I 0 so I0 TO 07 0001 0001 Ol Ol mm o I ro so so so 1 so 5 00T 005 007 IE gt oor or or s 0 SO To so To so so s 001 001 001 dei e eg I I 0 mm or s s I s 0001 oos oos any 5 I I so I I I I en TO 50 SO 50 0 or 001 001 ung oor 001 1 o T TO IO
50. 100 uL 200 uL 1 mL 5 mL Pipettierhilfen 10 uL 100 uL 200 uL 1 mL 5 mL Reinswasseranlage Milli Q Biocel 10 Rollerflaschenschrank Incudrive Rollerflaschenschrank R2P Sicherheitswerkbank Klasse II Herasafe Sterilwerkbank Hera safe Thermoblock QBT Trockenschrank Vi Cell TM XR Cell Viability Analyzer Vortex Waage PG 5002 S Delta Range Chromatographieanlage DX320 Chromatographieanlage DX600 Luminometer L 940 Ultraschallbad Thermo Scientific Tuttnauer Systec Centroclay Steriliser nova biomedical Hereus Canon Nikkon Mettler Toledo Schott Heraeus Schott Carl Zeiss AG Biosystem Zeiss Zeiss Zeiss WTW Biohit Eppendorf Research Millipore Schiitt Wheaton Heraeus Heaeus Grant Heraeus Beckman Coulter Heidolph Reax Mettler Toledo Dionex Dionex Berthold VWR Tabelle A 2 Liste der genutzten Verbrauchsmaterialien 1 5 mL Kiivetten 6 Well Platten Brand Greiner bio one ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System Chromatographies ule AS11 Serien Nr 003391 003392 003583 003628 003721 003723 003867 003868 Chromatographies ule CarboPac PA 100 Serien Nr 001053 Chromatographievors ule AG11 Serien Nr 003523 003523 004164 004257 Chromatographievors ule CarboPac PA 100G Serien Nr 001021 Einmalspritzen 5 mL 10 mL Eluentengeneratorkartusche EGCII Serien Nr 060572325019 Falconr hrchen 15 mL 50 mL Microtiterplatten 96 Well mit U Boden Microtiterplatten 96We
51. 192 Kultiverungszeit h Kultivierungszeit h Abbildung 5 19 Verl ufe von extra und intrazellul ren Metabolitkonzentrationen bei Kultivierung von MDCK Zellen in GMEM Z schwarz und EpiSerf rot Extrazellul re Metabolitkonzentrationen sind gelb hinterlegt intrazellul re Konzentrationen sind berechnet durch Bezug der pro Well gemessenen Menge auf das zellul re Gesamtvolumen die Anordnung der einzelnen Diagramme erfolgte gem des g ngigen Schemas des Zentralstoffwechsels drei unabh ngige Experimente wurden in Sechs Well Platten durchgef hrt verschiedene Symbole s Abbildung 5 18 Bei den gezeigten Messpunkten handelt es sich um den Mittelwert aus drei unabh ngigen Wells einer Sechs Well Platte Der bersichtlichkeit halber wurde auf die Darstellung der Standardabweichung verzichtet und f r die Pr zision der Messungen sei f r die extrazellul ren Metaboliten auf Tabelle 4 1 und f r die intrazellul ren Messungen auf Tabelle A 12 verwiesen F r die Verl ufe ergab sich folgendes Bild Nach kurzer Verz gerung nahm die Glucosekonz entration in etwa den ersten 70 h der Kultivierung stark ab Im Anschluss war die Aufnahme von Glucose in GMEM Z verringert In EpiSerf war nach ca 70 h die Glucose vollst ndig verbraucht 5 Ergebnisse und Diskussion 117 Die extrazellul re Lactatkonzentration stieg anf nglich lt 12 h langsam und im Zeitraum von etwa 12 h bis 70 h relativ stark an wobei der Verlauf in GMEM Z eine
52. 2443 90 3 2 8 1 05 0 06 89 9 6 0 86 7 4 0 PEP cis Aconitat 25 25 0 06 0 00 61 6 1 5 643 17 0074000 72 8 2 3 74 0 2 0 Succinat 200 0 112 143 0 127 9 13 8 0 119 6 43 3 122 2 6 5 UDP 25 0 09 0 01 229 9 19 0 212 6 17 3 0 05 0 00 256 2 13 9 196 2 15 9 UDP Gle 70 0 97 0 09 94 0 24 5 106 1 12 4 0 93 0 03 130 4 23 6 111 3 8 8 UDP GalNAc 60 0 3140 01 944446 976 36 0 31 0 01 103 544 7 96 0 3 9 UDP GIcNAc 200 0 62 0 02 geng 97 3 2 4 0 64 0 01 103 543 4 98 5 43 1 UDP GlcNAc Isoc 200 25 0 65 0 02 98 1 2 8 98 0 2 3 0 68 0 02 104 943 7 98 7 3 1 UMP UDP Gle 75 70 1 65 0 06 67 3 86 79 3 52 1 63 0 06 70 2 9 1 77 2 5 3 200 1 71 0 05 _ 91 7 5 9 95 6447 1 73 40 05 101 8 7 5 94 3 5 2 MITTELWERT 102 1 33 3 100 5 31 0 109 8 38 7 101 1 27 0 Standardfehler standard error of the mean gegeben f r die einzelnen Metaboliten Standardabweichung f r den Mittelwert der Wiederfindungen Die Messungen wurden mit der oben beschriebenen AAC Methode durchgef hrt In der jeweils ersten Spalte f r jede Methode sind die absoluten Werte pro Zelle gegeben Die zweite und dritte Spalte f r die Methoden MeOH CHCI und MeOH Kochen zeigen die Wiederfindungen nach Zugabe von 30 uL bzw 70 uL Standard Konzentrationen s 1 Spalte in Klammern Die zweite Spalte f r die finale Methode MeOH CHCF Kochen zeigt die Wiederfindung nach Standardzugabe von 30 uL Zus tzlich ist der
53. 4 Zei 3 g4 a i N 1 0 035 1 8 2 1 max 0 039 1 h 0 20 30 40 50 0 0 20 40 0 48 96 144 192 0 48 96 144 192 Kultivierungszeit h Kultivierungszeit h Abbildung 5 18 Verl ufe der Zellzahl A des Gesamtzellvolumens B f r die zwei Medien GMEM Z schwarz und EpiSerf rot F r drei unabh ngige Kultivierungen 1 X 2 A 3 D Zellzahl und Gesamtzellvolumen wurden bestimmt durch die Messung trypsinierter Zellen mit dem Ger t ViCell XR Die durchgezogenen Linien sind das Ergebnis der Anpassung einer sigmoiden Funktion Boltzmann an die Werte der drei Kultivierungen f r jedes Medium Fehlerbalken deuten die Standardabweichung der dreifachbestimmten Proben an die Ausschnitte zeigen die logarithmierten Zellzahlen bzw Volumina im Bereich des exponentiellen Wachstums und die lineare Anpassung zur Bestimmung der maximalen spezifischen Wachstumsrate max DZW Hu max die Datenpunkte aller Experimente sind hier als Kreis dargestellt Deutliche Unterschiede zwischen den beiden Medien sind bei den Verl ufen zu erkennen Die lag Phase war f r die Kultivierungen in EpiSerf eindeutig l nger Die maximale spezifische Wachstumsrate w hrend des exponentiellen Wachstums wurde bestimmt durch Bilden des Logarithmus der Zellzahlen bzw des Gesamtzellvolumens und lineare Regression im Zeitraum von 21 54h f r GMEM Z und war max 0 040 1 h volumenbezogen 6 46h 0 040 l h F r EpiSerf w
54. 4 3 6 Anionen Austausch Chromatographie zur Bestimmung intrazellul rer Metaboliten 40 4 4 4 5 4 6 5 1 5 2 Probenvorbereitung zur Bestimmung intrazellul rer Metaboliten 4 4 1 Untersuchung g ngiger Extraktionsmethoden 4 4 2 Optimierung entsprechend eines fraktionellen faktoriellen Versuchsplans 4 4 3 Optimierung entsprechend eines Central Composite Versuchsplans 4 4 4 Bestimmung der Wiederfindung errereen geesde 46 FUSER TITIES asa ee ce ENEE AAR 48 Ergebnisse und DISKUSSION iis ccccsvescsnissivasisssvssnecedtivensucsesannsedideionsaticsinannnteeussnendersentm sanieren 49 Etablierung einer Chromatographiemethode zur Messung intrazellularer Metaboliten 49 5 1 1 Anionen Austausch Chromatographie mit der Anlage 0 320 49 5 1 1 1 Optimierung des Gradientenprogramms zur Elution der Metaboliten 49 5 1 1 2 Validierung der Chromatograpblemetbode 54 5 1 1 3 Effekte des pH Wertes auf die Quantifizierung der Metaboliten 55 5 1 1 4 Messung von Metaboliten mittels 56 5 1 1 5 Bestimmung der Standardabweichung der Chromatographiemethode unter realen Messbedingungen u see en 59 5 1 2 Anionen Austausch Chromatographie mit der Anlage DX600 sense 61 5 1 3 Diskussion der etablierten Chromatographiemethode
55. 577 146 150 174 Huang D Zhang YH Chen XG 2003 Analysis of intracellular nucleoside triphosphate levels in normal and tumor cell lines by high performance liquid chromatography Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 784 1 101 109 175 Bacallao R Garfinkel A Monke S Zampighi G Mandel LJ 1994 ATP depletion a novel method to study junctional properties in epithelial tissues 1 Rearrangement of the actin cytoskeleton Journal of Cell Science 107 3301 3313 176 Goulard F Diouris M Deslandes E Floc h JY 1999 Nucleotides nucleoside sugars and UDP glucose 4 epimerase activity in the iofa carrageenophytes Solieria chordalis and Calliblepharis jubata Rhodophyceae European Journal of Phycology 34 1 21 25 177 Kochanowski N Blanchard F Cacan R Chirat F Guedon E Marc A Goergen JL 2006 Intracellular nucleotide and nucleotide sugar contents of cultured CHO cells determined by a fast sensitive and high resolution ion pair RP HPLC Analytical Biochemistry 348 2 243 251 190 178 Ryll Wagner 1991 Improved Ion Pair High Performance Liquid Chromatographic Method for the Quantification of a Wide Variety of Nucleotides and Sugar Nucleotides in Animal Cells Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 570 1 77 88 179 Sawada S Ono R Sato T Suzuki S Arakawa O Kasai M 2003 Determination of sugar phosphates and nucleoti
56. 585 Sharfstein ST Tucker SN Mancuso A Blanch HW Clark DS 1994 Quantitative in vivo nuclear magnetic resonance studies of hybridoma metabolism Biotechnology and Bioengineering 43 1059 1074 Bonarius HPJ Ozemre A Timmerarends B Skrabal P Tramper J Schmid G Heinzle E 2001 Metabolic flux analysis of continuously cultured hybridoma cells using CO2 C 13 mass spectrometry in combination with C 13 lactate nuclear magnetic resonance spectroscopy and metabolite balancing Biotechnology and Bioengineering 74 6 528 538 Vriezen N van Dijken JP 1998 Fluxes and enzyme activities in central metabolism of myeloma cells grown in chemostat culture Biotechnology and Bioengineering 59 1 28 39 Donnelly M Scheffler IE 1976 Energy metabolism in respiration deficient and wild type chinese hamster fibroblasts in culture Journal of Cellular Physiology 89 39 51 Gstraunthaler G Seppi T Pfaller W 1999 Impact of culture conditions culture media volumes and glucose content on metabolic properties of renal epithelial cell cultures Are renal cells in tissue culture hypoxic Cellular Physiology and Biochemistry 9 3 150 172 McKeehan WL 1986 Glutaminolysis in Animal Cells In Morgan MJ editor Carbohydrate Metabolism in Cultured Cells New York Plenum Press p 111 150 186 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 99 Street 1 Delort AM B
57. 8 600 06 901 06 8 O OL BLL 0 1 LEOL 85 0 6190 8 60 v6E SW 100 0 0 0 99 69 99 69 69 LL 6891 2160 0020 Coen 0880 v6E Bunysiomgepaepueis 9 IM SM EM ZA LM 9m sm rm em LTD usqoig 1 2 uonyuny Bunyolemqepsepuels eanejay aLemssayy H MJ MIIN Iyezuy euy popowsZunwunsog uSFTpurJsj oA 801730025 ZI AMPQLL UAV me pun u Mjeuy u upzu dueyuy Anhang Z_02_Auftauenzellen_250603_IB Erstellt von Ilona Behrendt 29 05 2010 Arbeitsanweisung Nr Z 02 Auftauen von MDCK Zellen 1 0 Ziel Schonendes Auftauen von in der Gasphase von fl ssigem Stickstoff langzeit gelagerten MDCK Zellen 2 0 Material Zellen in Kryor hrchen im fl ssigen Stickstoff Stickstoffaufbewahrungsbehiilter Schutzkleidung Thermohandschuhe und Schutzschild Wasserbad 37 C Kulturgef T25 besser T75 Vollmedium komplett gemischt mit FCS und Tryptosephosphatboullion oder Pepton oder serumfreies Medium Episerf Optipro Ex Cell auf Raumtemperatur vorgew rmt Werkbank ges ubert Pipettierhilfe Pipetten steril Desinfektionsl sung Descosept AF Cleanisept in Spr hflasche Sterillium fiir H ndedesinfektion 3 0 Methode
58. Abstand des Faktorniveaus f r Sternpunkte im Central Composite Versuchsplan statistische Versuchsplanung Sch tzwert eines Effektes statistische Versuchsplanung E Fehler statistische Versuchsplanung K Exponent zur Gewichtung der Desirability Funktion statistische Versuchsplanung T h min Zeitverschiebung Korrelationsanalyse u Mittelwert statistische Versuchsplanung Umax l h maximale spezifische Wachstumsrate 1 Einleitung 1 1 Einleitung Die Kultivierung von tierischen Zellen au erhalb des nat rlichen Gewebes hatte ihren Anfang vor ber 100 Jahren 31 Eine enorme Vielfalt von Zelltypen Kulturmedien und Kultursystemen kam bis heute zum Einsatz wobei verschiedenste Zwecke mit diesen Zellkultivierungen verfolgt wurden Unter anderem dienten kultivierte Zellen als Versuchsobjekt zur Aufkl rung von Stoffwechselwegen und molekularbiologischen Vorg ngen als Ersatzsystem f r Tierversuche im Bereich der Wirkstoffsuche als Grundlage zur Z chtung von k nstlichen Organen oder auch als Produzenten von pharmazeutisch aktiven Substanzen wie z B Antik rpern rekombinanten Proteinen oder Impfstoffen Die Versorgung der Zellen mit essentiellen N hrstoffen erfolgt au erhalb des Gewebes durch Kultivierung in meist fl ssigen N hrmedien Anfangs wurden h ufig Medienbestandteile tierischen Ursprungs genutzt aber mittlerweile werden Zellkulturmedien mit definierter Rezeptur bevorzugt um das Risiko von Kontami
59. Analysis of the compartmentation of glycolytic intermediates nucleotides sugars organic acids amino acids and sugar alcohols in potato tubers using a nonaqueous fractionation method Plant Physiology 127 2 685 700 134 Wittmann C Kromer JO Kiefer P Binz T Heinzle E 2004 Impact of the cold shock phenomenon on quantification of intracellular metabolites in bacteria Analytical Biochemistry 327 1 135 139 135 Maharjan RP Ferenci T 2003 Global metabolite analysis the influence of extraction methodology on metabolome profiles of Escherichia coli Analytical Biochemistry 313 1 145 154 136 Buchholz A Hurlebaus J Wandrey C Takors R 2002 Metabolomics quantification of intracellular metabolite dynamics Biomolecular Engineering 19 1 5 15 137 Bolten CJ Kiefer P Letisse F Portais JC Wittmann C 2007 Sampling for metabolome analysis of microorganisms Analytical Chemistry 79 10 3843 3849 138 Villas Boas SG Hojer Pedersen J Akesson M Smedsgaard J Nielsen J 2005 Global metabolite analysis of yeast evaluation of sample preparation methods Yeast 22 14 1155 1169 139 Wittmann C Hans M van Winden WA Ras C Heijnen JJ 2005 Dynamics of intracellular metabolites of glycolysis and TCA cycle during cell cycle related oscillation in Saccharomyces cerevisiae Biotechnology and Bioengineering 89 7 839 847 140 Kresnowati MTAP van Winden WA Almering MJH ten Pierick A Ras C Knijnenburg TA Daran Lapujade P Pronk JT H
60. Dennoch ist dieser Wert m glicherweise ein sinnvoller Richtwert f r die Qualit t der Extraktion Literaturwerte hierf r unterscheiden sich jedoch merklich 1222 2827281 Eine gro e Rolle bei der Bestimmung dieses Verh ltnisses spielt neben der Probenvorbereitung der Organismus Dar ber hinaus weisen sicherlich auch verschiedene Kompartimente unterschiedliche Verh ltnisse auf Soboll et al 2221 zeigte dass Adeninnukleotide im Cytosol der Leberzellen von Ratten im Gleichgewicht vorliegen und dass das Verh ltnis ATP ADP in Gewebe haupts chlich durch den cytosolischen Wert bestimmt ist Eine Schlussfolgerung der Arbeiten war dass das Verh ltnis der Adeninnukleotide f r das gesamte Gewebe nahe dem Gleichgewicht liegen m sste Hardie P3 bemerkte in seinem Review dass eukaryontische Zellen eine sehr aktive Adenylatkinase besitzen welche zu allen Zeiten die Adeninnukleotide im Gleichgewicht h lt Wichtige Einflussgr en bei diesem Gleichgewicht sind zudem der pH Wert und die Mg Konzentration wobei dem Zweitgenannten bei der Translokation von ATP und ADP zwischen Cytosol und mitochondrialer Matrix eine wichtige Bedeutung zukommt F r eine detaillierte Diskussion der Zusammenh nge der Nukleotidkinaseaktivit ten mit Nukleotidkonzentrationen und den relevanten Transportsystemen sei auf die Literatur verwiesen 28272841 Die modifizierte Extraktionsmethode konnte gute Wiederfindungen erreichen allerdings sollten diese Wiederfindungswerte
61. Die Konzentration von F16bP war im Medium welches neben Glucose kein Glutamin enthielt deutlich h her als in dem Medium welches zus tzlich zu Glucose Glutamin enthielt Malat als Zwischenprodukt des Krebszyklus zeigte klare Konzentrationsunterschiede in Abh ngigkeit vom Substrat W hrend im Medium mit Glucose und Glutamin ber ca 72h ein relativ hoher Wert und anschlie end ein deutlicher Abfall gemessen wurden war f r das Medium mit Glutamin alleine ein Abfall bereits nach 42h zu verzeichnen Die beiden Medien ohne Glutamin wiesen erheblich geringere Konzentrationen von Malat auf wobei das Pyruvat Medium 5 Ergebnisse und Diskussion 145 eine h here intrazellul re Malatkonzentration bewirkte als das Medium mit Glucose Die ATP Konzentration zeigte einen konstanten Verlauf ber den Kulturverlauf f r alle Medien mit Ausnahme des Glucose Mediums In diesem Medium waren zuerst ein Konzentrationsabfall bis etwa 30h danach ein Anstieg bis etwa 80h und anschlie end ein Abfall bis zum Ende der Kultivierung zu messen Dar ber hinaus lag die Konzentration von ATP f r dieses Medium deutlich niedriger als in den anderen Medien Die h chsten intrazellul ren ATP Konzentrationen wurden f r die Medien mit Pyruvat und Glutamin gemessen ca 3 mM Die Konzentration f r das Medium mit Glucose und Glutamin lag in einem Bereich von 2 2 5 mM Der Verlauf der Energy Charge zeigte f r das Medium mit Glucose und Glutamin einen leichten Anstieg auf
62. Experimente wurden kombiniert und gemeinsam ausgewertet In einem ersten Ansatz zur Auswertung wurden die experimentell ermittelten Ergebnisse an die Gleichung 3 6 angepasst nicht gezeigt Die Begutachtung der Residuen zeigte allerdings eine relativ schlechte Anpassung f r die Zielgr en Nukleotidgehalt und Energy Charge Bei genauerer berpr fung deutete sich an dass diese beiden Zielgr en eine Art S ttigungsverhalten in Abh ngigkeit der Einflussgr en aufwiesen Problematisch hierbei ist dass ein Polynom zweiter Ordnung nicht in der Lage ist dieses Verhalten ad quat nachzubilden Aus diesem Grund wurden die beiden Zielgr en entsprechend der Gleichung 5 1 f r den Nukleotidgehalt und der Gleichung 5 2 f r die Energy Charge transformiert Nukleotidgehaltyansformiert 10810 1 10 Nukleotidgehaltyormatisiert X 1 5 1 Energy Charg transformiert 10810 1 01 Energy Chargenormatisiert max X 1 5 2 Diese beiden Gleichungen sind empirische Transformationen wobei die beiden Konstanten 1 10 und 1 01 die Kr mmung durch die Transformation definieren Nach erneuter Anpassung an Gleichung 3 6 wurden drei nicht signifikante Terme f r alle Zielgr en der urspr nglichen Gleichung entfernt Tricine Konz x Tricine Konz Vol MeOH x Tricine Konz Kochen x Tricine Konz F r eine Zusammenfassung der Ergebnisse der Anpassung sei auf Tabelle A 11 im Anhang verwiesen Insgesamt zeigte sich eine akzeptable Anpassung f r
63. Extraktionsproben abgesch tzt Diese Untersuchung in Kapitel 5 2 5 zeigte eine durchschnittliche relative Standardabweichung von 11 5 Dieser Wert lag deutlich ber der in Abschnitt 5 1 1 5 ermittelten mittleren relativen Standardabweichung von 5 9 welche bei Bestimmung anhand der Messung der Standardverd nnungen ermittelt wurde Nicht nur im Mittel sondern auch f r die einzelnen Metaboliten war die relative Standardabweichung bei Bestimmung anhand von Extraktionsproben h her vgl Tabellen A6 und A9 im Anhang Prinzipiell erscheint dies sinnvoll da die Standardmessungen Wiederholungsmessungen waren und die Mehrfachbestimmungen der Proben die Variabilit t durch individuelle Probenvorbereitung und die biologische Variabilit t unterschiedliche Wells zus tzlich ber cksichtigten Gerade dieser Punkt ist entscheidend f r eine e 1266268 Somit enthielten die realistische Absch tzung der Pr zision einer kompletten Method Standardabweichungen aus Abschnitt 5 1 1 5 nur die ger tebedingte Variabilit t Allerdings ist zu ber cksichtigen dass die Standards nicht den identischen Konzentrationsbereich abdeckten wie die gemessenen Proben Dies bedeutet dass unterschiedliche Konzentrationsbereiche auf ihre Variabilit t untersucht wurden Da aber die relative Standardabweichung in den niedrigeren Konzentrationsbereichen h her war ist ein aussagekr ftiger Vergleich zwischen den beiden unterschiedlich ermittelten Standardabweichungen schwierig
64. F16bP W hrend die beiden Medien welche Glucose enthielten ein nahezu identisches quantitatives Verhalten aufwiesen war auch f r die beiden anderen Medien F16bP nachweisbar wenn auch in deutlich niedrigeren Konzentrationen Die beiden in der Glykolyse vorangehenden Metaboliten G6P und F6P zeigten qualitativ sehr hnliche Konzentrationsverl ufe die Konzentrationen waren aber deutlich niedriger nicht dargestellt F r 3PG wurden schwer zu interpretierende Verl ufe gemessen Die gegl tteten Verl ufe deuteten auf der einen Seite ein hnliches Verhalten f r die beiden Medien mit Glucose und auf der anderen Seite f r die beiden Medien ohne Glucose an Der Verlauf der Konzentration von PEP hnelte dem von 3PG sehr stark nicht dargestellt Der Konzentrationsverlauf von intrazellul rem Pyruvat zeigte f r die drei Medien ohne Pyruvat nach einem anf nglichen Konzentrationsabfall einen leichten Anstieg ber die verbleibende Dauer der Kultivierung Das Medium mit Pyruvat wies einen deutlichen Abfall der intrazellul ren Konzentration innerhalb von etwa 48 h danach wurde ein relativ konstanter Wert in etwa auf dem Niveau der anderen Medien gemessen Zus tzlich ist der Konzentrationsverlauf von extrazellul rem Pyruvat dargestellt Nach anf nglicher relativ konstanter Konzentration folgte eine Phase mit h herer Pyruvataufnahme Ab etwa 72h ist die Konzentration von Pyruvat im Medium nahezu konstant 136 5 Ergebnisse und Diskussion
65. Geweben isoliert und kultiviert Verschiedene permanente Zelllinien wurden etabliert so z B HeLa Zellen BHK Zellen MDCK Zellen und Vero Zellen Parallel begann die Entwicklung von Zellkulturmedien wobei Eagle ein chemisch definiertes Medium etablierte Neben der Impfstoffherstellung kam im Zuge der rekombinanten DNA Technologie die M glichkeit einer Herstellung von komplexen Glykoproteinen als wichtiger Produktionszweig mit kultivierten Zellen hinzu 3 51 Zus tzlich konnten durch die Fusion von Zellen ab den 70er Jahren Hybridoma Zellen gewonnen werden welche zur Herstellung von monoklonalen Antik rpern D 4 5 genutzt wurden Gerade in j ngerer Vergangenheit entstand ein enormer Markt f r monoklonale Antik rper aufgrund des gro en diagnostischen und therapeutischen Wertes dieser 2 1 Einleitung Makromolek le Chim re Antik rper stellen mittlerweile einen gro en Anteil der sogenannten Blockbuster Medikamente H 49 Glykoproteinen in den letzten Jahren sind CHO HEK 293 Hybridoma PER C6 und NSO Zellen P 451 Vorwiegend genutzte Zelllinien zur Produktion von Unabh ngig vom Produkt ist f r den Hersteller ein kosteneffizienter und robuster Prozess wichtig Aus diesem Grund wird eine hohe Produktivit t f r die Upstream Phase angestrebt Dies bedeutet f r einen Prozess mit kultivierten tierischen Zellen dass Zellen mit einer hohen zellspezifischen Produktivit t bevorzugt werden Dar ber hinaus ist typis
66. In der Praxis ist irrelevant ob die erste oder zweite Fraktion genutzt wird da beide Fraktionen zusammen ein komplettes 2 Experiment liefern Beide Fraktionen untersuchen vier der acht Eckpunkte in Abbildung 3 5 Typischerweise werden fraktionelle faktorielle Versuchspl ne auch mittels der sogenannten Aufl sung charakterisiert Das oben gezeigte Beispiel eines 2 Experiment ist ein Versuch mit der Aufl sung was der niedrigsten sinnvollen Aufl sung entspricht In solch einem Experiment sind die Haupteffekte vermengt mit den 2 Faktor Interaktionen aber nicht mit anderen Haupteffekten Aufl sung IV bedeutet dass Haupteffekte keine Aliasse besitzen 2 Faktor Interaktionen allerdings teilweise Aliasse voneinander sind In Aufl sung V Experimenten sind 2 Faktor Interaktionen nur mit 3 Faktor Interaktionen vermengt 2492481 3 5 3 Central Composite Versuchspl ne H ufig schlie t sich an ein Screening der Faktoren eine genauere Charakterisierung der verbleibenden Einflussgr en an Dies bedeutet dass die nun untersuchten Einflussgr en auf meist mehr als zwei Niveaus getestet werden und dadurch eine Beschreibung des wahren Zusammenhangs eher erreicht werden kann Da die tats chliche Abh ngigkeit der Zielgr e von den Einflussgr en sich eher selten durch einen linearen Zusammenhang abbilden l sst werden h ufig quadratische Effekte mit in das Modell aufgenommen k k YM DB x EPG tE 3 6 F r die Erkl rung der Va
67. Korrelationsanalyse bezeichnet Zwei verschiedene Arten von Korrelationsanalysen wurden durchgef hrt Als Korrelationsanalyse wird in den folgenden Abschnitten die Berechnung des Korrelationskoeffizienten entsprechend Gleichung 3 9 bezeichnet Im Falle einer Kreuzkorrelationsanalyse handelt es sich hier um eine 4 Material und Methoden 47 Berechnung entsprechend Gleichungen 3 10 und 3 11 Grunds tzlich entspricht die sogenannte Korrelationsanalyse der Kreuzkorrelationsanalyse f r den Spezialfall von 0 Zur Auswertung der Experimente in den Kapiteln 5 3 1 und 5 3 4 3 wurde eine Korrelationsanalyse verwendet Die Korrelationskoeffizienten und p Werte wurden mithilfe der Matlab Funktion corrcoef ermittelt F r die Kreuzkorrelationsanalysen in Kapitel 5 3 wurde wie folgt verfahren F r die Berechnung der Kreuzkorrelationskoeffizienten w re ein Minimum von quidistanten Messpunkten erforderlich gt 50 Gel Da dieses Kriterium mit den Messdaten in dieser Arbeit nicht erf llt werden konnte wurde auf eine Interpolation durch Splines zur ckgegriffen 126 oder durch eine sigmoide Funktion Bez glich der Splines wurde im Detail verfahren wie von Wahl 2007 1851 beschrieben Zur Berechnung wurde die Funktion e02bec aus der NAG C Library Numerical Algorithms Group LTd Oxford UK verwendet F r eine detaillierte Beschreibung sei auf die erw hnte Literatur verwiesen Grunds tzlich ist bei diesem Verfahren ein Gl ttungsfakto
68. Messsequenzen deutlich l nger gt 100 Proben als die Validie rungssequenz Da innerhalb solcher Messsequenzen gelegentlich geringe Druckschwankungen auftraten waren die Retentionszeiten dadurch leicht ver ndert W hrend wie oben erw hnt unter den Bedingungen der Validierung s 5 1 1 2 eine exzellente Reproduzierbarkeit vorlag f hrten die hier erw hnten Ver nderungen zu einer etwas geringeren Reproduzierbarkeit z B zu leicht ungleichen Peakformen was sich negativ auf die Integration der Peaks auswirkte und somit die Quantifizierung verschlechterte Als Anhaltspunkt zur Absch tzung der Messfehler ist die Zusammenfassung in Tabelle 5 3 gezeigt Die Gruppierung ber die acht Standardkonzentrationen ist nur bedingt aussagekr ftig da die verschiedenen Metaboliten in unterschiedlichen Konzentrationsbereichen untersucht wurden Dies hei t dass z B in der niedrigsten Standardkonzentration verschiedene Konzentrationen der einzelnen Metaboliten vorlagen 0 0625 1 0000 uM Somit wurde nicht ber exakte Konzentrationswerte sondern ber Konzentrationsbereiche gemittelt obwohl die Standardab weichung konzentrationsabh ngig war Dennoch ist diese Zusammenfassung hilfreich und f r eine detaillierte Angabe zu jedem Metaboliten sei auf Tabelle A 9 im Anhang verwiesen Die gezeigte Abh ngigkeit der Standardabweichung von der Konzentration ist ein h ufig vorgefundenes Ph nomen weshalb in vielen Kalibrierungsverfahren eine gewichtete Regr
69. Methode den Nachteil dass eine Derivatisierung vieler Metaboliten erfolgen muss da nur fl chtige Substanzen analysiert werden 3 Theoretische Grundlagen 21 k nnen In die Analyse von Metaboliten aus dem Zentralstoffwechsel mit Hilfe von Fl ssig chromatographie insbesondere der sei hier genauer eingef hrt 3 3 1 lonen Austausch Chromatographie 147 151 152 Eine spezielle Art der Fliissigchromatographie ist die Ionen Austausch Chromatographie 156 Das grundlegende Prinzip der Fl ssigchromatographie wie auch der AAC ist dass sich die Probe zwischen einer station ren und einer mobilen fl ssigen Phase verteilt und die Analyten unterschiedlich stark von der station ren Phase zur ckgehalten werden Typischerweise handelt es sich bei der station ren Phase um das S ulenmaterial welches bei der AAC positive Ladungen tr gt Die Wechselwirkungen sind bei der Ionen Austausch Chromatographie im Wesentlichen elektrostatischer Natur Dies setzt voraus dass die Analyten geladen sind also im dissoziierten Zustand vorliegen Ma geblich wird die Retention durch den pH Wert und die Ionenst rke des Elutionspuffers beeinflusst Ein typisches Detektionsprinzip in der AAC ist die UV Absorption F r Substanzen die nur eine geringe UV Absorption aufweisen bietet sich die Leitf higkeit als alternatives Detektionsprinzip an Allerdings f hren ionische Elutionspuffer in der AAC im Falle einer Gradientenelution zu einer anst
70. Methoden der statistischen Versuchsplanung eine Probenvorbereitung f r die Extraktion von intrazellul ren Stoffwechselprodukten ausgew hlt und optimiert Adh rente MDCK Zellen dienten hierbei als Modellorganismus Zuerst wurden anhand eines experimentellen Vergleichs von Methoden aus der Literatur zwei grunds tzlich geeignete Methoden identifiziert Anschlie end wurden diese beiden Methoden in zwei aufeinander folgenden Experimenten optimiert Hierbei dienten vier verschiedene Zielgr en Nukleotidgehalt Fructose 1 6 Bisphosphat Gehalt Energy Charge Absorptionswert bei 280 nm als repr sentative Marker f r ein gutes Extraktionsverhalten Um ein Gesamtoptimum zu finden wurden die vier Zielgr en durch die Verwendung von Desirability Funktionen kombiniert Ein weiterer Optimierungsschritt war erforderlich um schlechte Wiederfindungswerte nach Standardzugabe zu Proben zu vermeiden Hierf r wurden einzelne essentielle Schritte der beiden zuvor optimierten Methoden kombiniert wodurch eine robuste und verl ssliche Methode zur reproduzierbaren Quantifizierung intrazellul rer Metaboliten des Zentralstoffwechsels aus kultivierten tierischen Zellen etabliert werden konnte Im dritten Abschnitt der Arbeit wurden unterschiedliche Kultivierungsbedingungen und Zelllinien MDCK und Vero anhand der intrazellul ren Metabolitkonzentrationen charakterisiert Erhebliche Konzentrations nderungen zahlreicher Metaboliten wurden ber den Verlauf von
71. Methods 13 2 97 101 281 Carvalhal AV Marcelino I Carrondo MJT 2003 Metabolic changes during cell growth inhibition by p27 overexpression Applied Microbiology and Biotechnology 63 2 164 173 282 Gropp T Brustovetsky N Klingenberg M Muller V Fendler K Bamberg E 1999 Kinetics of electrogenic transport by the ADP ATP carrier Biophysical Journal 77 2 714 726 283 Purich DL Fromm HJ 1972 Studies on factors influencing enzyme responses to adenylate energy charge Journal of Biological Chemistry 247 1 249 255 284 Pradet A Raymond P 1983 Adenine Nucleotide Ratios and Adenylate Energy Charge in Energy Metabolism Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 34 199 224 285 Hardie DG 2003 Minireview the AMP activated protein kinase cascade the key sensor of cellular energy status Endocrinology 144 12 5179 5183 286 Ritter JB Genzel Y Reichl U 2006 High performance anion exchange chromatography using on line electrolytic eluent generation for the determination of more than 25 intermediates from energy metabolism of mammalian cells in culture Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 843 2 216 226 287 Ramirez OT Mutharasan R 1990 Cell cycle and growth phase dependent variations in size distribution antibody productivity and oxygen demand in hybridoma cultures Biotechnology and Bioengineering 36 839 848 288 Nielsen LK Reid S Greenfield PF
72. Mittelwert der Wiederfindungen der verschiedenen Metaboliten gegeben 80 5 Ergebnisse und Diskussion Bei Betrachtung der gefundenen Metabolitmengen in den beiden Zelllinien ist Folgendes zu bemerken F r beide Zelllinien konnte kein GMP nachgewiesen werden Succinat konnte nicht in den Extrakten der Vero Zellen gefunden werden und cis Aconitat war nicht in den Extrakten der MDCK Zellen zu detektieren Um einen besseren Vergleich zwischen den beiden Methoden zu erm glichen sind in Abbildung 5 10 A und B die relativen Mengen willk rlich auf die Methode MeOH CHC normiert der Metaboliten dargestellt 1 0 0 9 A as 07 MeOH CHCI Extraktion MeOH Kochen Extraktion 06 Energy Charge 05 Rel Gehalt bez auf MeOH CHCI N N 9 gt a z MeOH CHOI Extraktion Las MeOH Kochen Extraktion r 08 dh 0 6 0 5 F 0 4 F 0 3 Fo2 dh E 445 gt Rel Gehalt bez auf MeOH CHCI Ss SES EN BEE een sl Energy Charge D Y y I CSU sty s EK Zo 9 a LER 0 2 2 amp 9 RA 6 0 SS Lo Lh ho gt x Ki SS EN Qe Abbildung 5 10 Vergleich der beiden Extraktionsmethoden f r MDCK Zellen A und Vero Zellen f r die verschiedenen Metaboliten den Nukleotidgehalt die Absorption 280 nm und die Energy Charge
73. Probepunkt in 5 3 4 1 entsprach Die Probenahmen nach Zugabe des Mediums erfolgten in logarithmisch quidistanten Zeitschritten um die schnellen Konzentrations nderungen der fr hen Zeitpunkte besser aufzul sen Die Verlaufskurven einiger Metabolitkonzentrationen aus Glykolyse und Krebszyklus sind in Abbildung 5 35 dargestellt Die Konzentration von G6P fiel innerhalb der 2 h in PBS auf einen niedrigen Wert ab wie bereits in Kapitel 5 3 4 1 gezeigt und stieg nach Zugabe der Medien nur im Glucose Medium deutlich an Die Medien die mit Serum angereichert waren zeigten einen minimalen Anstieg der G6P Konzentration was auf den geringen Gehalt an Glucose in Serum zur ckzuf hren ist Ein identisches Verhalten konnte bei F6P beobachtet werden nicht gezeigt Die Konzentration von F16bP zeigte ebenfalls ein deutliches Absinken w hrend der 2h in PBS Der Anstieg der Konzentration nach Zugabe der Medien fiel f r F16bP deutlich schneller aus als f r die vorangehenden Metaboliten F r das Glucose Medium wurde nach etwa 18s ein Wert von etwa 12 uM erreicht Diese Konzentration wurde bis zum Ende des Versuchs konstant gehalten Auch in den Medien die Serum enthielten wurde ein Anstieg f r die Fl6bP Konzentration gemessen Dieser war aber schw cher ausgepr gt als im Glucose Medium Dar ber hinaus war das Maximum niedriger 4 uM und wurde erst nach 180 s erreicht Die Konzentration von 3PG stieg w hrend der Limitationsphase an wie schon im Versu
74. Sensitivit t der Detektion gut genug ist und eine zufriedenstellende Reproduzierbarkeit bez glich Retentionszeiten als auch Peakfl chen und hchen gegeben ist Zu Beginn der Arbeit waren von Frau Ralitza Danova erste Optimierungsschritte bez glich des Gradienten durchgef hrt Der anf ngliche Gradient und die Standardmischung sind in Abbildung 5 5 A in einem Chromatogramm zu sehen Zur Elution wurde zum damaligen Zeitpunkt 0 1 M NaOH eingesetzt Auch bei dieser Chromatographieanlage war die Verbesserung des Gradienten und die Anpassung der Standardmischung ein iterativer Prozess Zur Verbesserung der Peaktrennung wurde als weiterer Elutionspuffer 0 05 M NaAcetat eingesetzt Der Gradient ist in 62 5 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 5 5 B gezeigt Als problematisch stellte sich bei der Optimierung des Standards heraus dass Aminos uren ebenfalls detektiert werden Da diese Metaboliten in relativ hohen Konzentra tionen extrazellul r als auch wahrscheinlich intrazellul r auftreten waren in Extraktionsproben Aminos uren die Ursache f r die meisten Peaks in den Chromatogrammen Glucose als weitere hochkonzentrierte Substanz im Zellkulturmedium resultierte im gr ten Peak im Chromatogramm 60 07 Wasser 0 0 A 210 NaOH 100 0 100 0 Anf nglicher Gradient und Standard zu Beginn der Arbeit Glucose 6 P 80 0 60 Ladung nC 30 07 20 0 10 04 Fru
75. Springer 740 p 247 Montgomery DC 2005 Design and Analysis of Experiments Hoboken NJ John Wiley 643 p 248 Scheffler E 1997 Statistische Versuchsplanung und auswertung Wiley VCH Deutscher Verlag f r Grundstoffindustrie 454 p 249 Weihs C Jessenberger J Grize Y L 1999 Statistische Methoden zur Qualit tssicherung und optimierung in der Industrie Weinheim Wiley VCH XI 436 p 250 Draper NR Smith H 1998 Applied regression analysis New York John Wiley 706 p 251 Derringer G Suich R 1980 Simultaneous optimization of several response variables Journal of Quality Technology 12 4 214 219 252 Kessler W 2007 Multivariate Datenanalyse Weinheim Wiley VCH 325 p 253 Zar JH 1999 Biostatistical analysis London u a Prentice Hall International 663 p 254 Martins AM Camacho D Shuman J Sha W Mendes P Shulaev V 2004 A systems biology study of two distinct growth phases of Saccharomyces cerevisiae cultures Current Genomics 5 8 649 663 255 Steuer R 2006 Review on the analysis and interpretation of correlations in metabolomic data Briefings in Bioinformatics 7 2 151 158 256 Camacho D de la Fuente A Mendes P 2005 The origin of correlations in metabolomics data Metabolomics 1 1 53 63 257 Weckwerth W Morgenthal K 2005 Metabolomics from pattern recognition to biological interpretation Drug Discovery Today 10 22 1551 1558 258 Box GEP Jenkins GM Reinsel GC 1994 Time series
76. TCA Cycle Intermediates in Mammalian Cell Culture Proceedings of the 19th ESACT Meeting Cell Technology for Cell Products 2007 Ed Rodney Smith Springer 603 605 Ritter J B Genzel Y Reichl U High performance anion exchange chromatography using on line electrolytic eluent generation for the determination of more than 25 intermediates from energy metabolism of mammalian cells in culture J Chrom B 2006 843 2 216 226 Genzel Y Ritter J B K nig S Alt R Reichl U Substitution of glutamine by pyruvate to reduce ammonia formation and growth inhibition of mammalian cells Biotech Progr 2005 21 1 58 69 Gorenflo V M Ritter J B Aeschliman D S Drouin H Bowen B D Piret J M Characterization and Optimization of Acoustic Filter Performance by Experimental Design Methodology Biotech Bioeng 2005 90 6 746 753 Posier und Vortrage Ritter J B Genzel Y Reichl U Metabolite Analysis in Mammalian Cells How to generate reliable data sets Vortrag 20th ESACT meeting June 17 20 2007 Dresden Germany Ritter J B Genzel Y Reichl U Die Herausforderung der Analyse von intrazellularen Metaboliten in Saugerzellen Poster 24 DECHEMA Jahrestagung der Biotechnologen September 26 29 2006 Wiesbaden Germany Ritter J B Genzel Y Reichl U Monitoring Energy Metabolism The Challenge of Intracellular Metabolite Analysis of Mammalian Cells in Culture Poster Cell C
77. Unterschiede zu MDCK Zellen s Abbildung 5 18 Abbildung 5 19 und Abbildung 5 20 F r DMEM mit Glucose und Glutamin wurden erheblich h here Zellzahlen erreicht als f r MDCK Zellen unter vergleich baren Bedingungen GMEM Z Da Vero Zellen in mehreren bereinanderliegenden Zellschichten wachsen und somit nicht durch die Fl che wachstumslimitiert sind ist dieser Unterschied allerdings nicht berraschend 91 Die Abh ngigkeit eines guten Zellwachstums von den Substraten Glucose und Glutamin ist deutlich durch die Wachstumskurven dokumentiert Dieses Verhalten war in Vero Zellen erheblich st rker ausgepr gt als f r MDCK Zellen Der Konzentrationsverlauf von F16bP f r Vero Zellen war in den glucosehaltigen Medien w hrend des gesamten Kulturverlaufs nahezu konstant was ein vollkommen anderes Bild darstellt als f r MDCK Zellen Scheinbar war die Konzentration von F16bP in Vero Zellen vom Zellwachstum bzw der Zellzahl entkoppelt Auch f r Malat wurde ein g nzlich anderer Konzentrationsverlauf f r Vero Zellen gemessen als f r MDCK Zellen Als Gemeinsamkeit kann allerdings bemerkt werden dass f r die Medien mit 146 5 Ergebnisse und Diskussion Glucose als einzigem zugesetztem Substrat die Konzentration von Malat in beiden Zelllinien am niedrigsten war Das Medium mit Pyruvat konnte ebenfalls in beiden Zelllinien keine mit den glutaminhaltigen Medien vergleichbaren Malatkonzentrationen bewirken Dar ber hinaus sank f r beide Zell
78. Zellen Grund f r die gro e Anzahl verschiedener Methoden ist sicherlich dass eine Anpassung der Methode an die jeweiligen Eigenschaften der Zellen aber auch des Messsystems erforderlich ist aber auch dass verschiedene Metaboliten ein sehr unterschiedliches Extraktionsverhalten haben Dies deutet ganz klar darauf hin dass eine Methode sehr genau an die experimentellen Anforderungen angepasst werden muss um eine verl ssliche Messung zu erm glichen Nichtsdestotrotz stellen Metabolomic bzw Metabolic Profiling Ans tze sehr sensible Verfahren zur Charakterisierung von verschiedenen Kultivierungszust nden dar da sich jeder Zustand in einem ganz individuellen Konzentrationsmuster u ert 6 2 Motivation 2 Motivation Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit war durch eine Quantifizierung intrazellul rer Stoff wechselprodukte einen Grundstein f r einen verbesserten Einblick in die Abl ufe des Metabolismus bzw die Regulation von verschiedenen Stoffwechselwegen in tierischen Zellen zu legen Die Quantifizierung von intrazellul ren Metaboliten erschien als besonders sensibler Indikator f r verschiedene Einfl sse auf Zellen da nicht nur direkte Effekte durch externe Einflussgr en sich in diesen Messgr en niederschlagen sondern auch da Metabolitkonzentrationen ein Resultat s mtliche regulatorische intrazellul re Prozesse darstellen Somit sollten in dieser Arbeit anhand verschiedener Kultivierungszust nde Metabolitmuster
79. Zellen in der Lage sind kurzzeitige Substratlimitationen durch eine Anpassung des Stoffwechsels zu berbr cken Weitere Kurzzeitexperimente untersuchten das Verhalten der intrazellul ren Metabolitkonzen trationen in MDCK Zellen zu welchen nach einer Limitationsphase neues Zellkulturmedium zugegeben wurde Grunds tzlich zeigten die meisten Metaboliten aus Glykolyse und Krebszyklus einen Anstieg wobei wiederum die Konzentrationen von Hexosephosphaten schnellere nderungen durchliefen als die von organischen S uren Eine Ausnahme bildeten wiederum 3PG und die in ihrer Konzentration abfielen Somit waren die Zusammenh nge der Konzentrationsverl ufe die gleichen wie in den Experimenten der Limitation Der Anstieg der organischen S uren Malat und Citrat waren wiederum biphasisch und die Konzentration von Malat lief der von Citrat voraus Somit best tigten diese Versuche die vorangegangenen Hypothesen zur Dynamik der intrazellul ren Metabolitkonzentrationen nach Pulsexperimenten Die Energy Charge fiel bis auf einen Wert von unter 0 9 ab was wahrscheinlich die Beobachtung der Kultivierungsexperimente widerspiegelt dass die Energy Charge zu Beginn der Kultivierung in Medium mit Glucose stark erniedrigt war Als generelles Muster der Korrelationsanalysen der Kurzzeitexperimente war eine gleichartiges Verhalten von Zuckerphosphaten zu erkennen Weiterhin waren einige organische S uren relativ stark miteinander korreliert Auch zahlre
80. Zellgewebe oder kultivierten tierischen Zellen Auch hier sei wiederum auf die 234 umfangreiche Methodensammlung von Bergmeyer verwiesen In weiteren Untersuchungen zu den Konzentrationen von organischen S uren kam wiederum h ufig PCS zum Einsatz aber auch organische L sungsmittel Hi 186 188 243 Einige Arbeiten untersuchten aber auch mehrere Stoffklassen mit dem Ziel der Charakterisierung des Energiestoffwechsels von tierischen Zellen So wurden z B organische S uren Zucker phosphate und Nukleotide in Herzgewebe nach einer ACN Extraktion gemessen P und in HeLa 86 Zellen nach einer Extraktion mit PCS In einer Studie zur Untersuchung des Metaboloms in Gewebe wurde mit einer Extraktion basierend auf Methanol Chloroform MeOH CHC gearbeitet 241 K rzlich analysierte Hofmann 12 Zuckerphosphate und organische S uren inklusive der Isotopenverteilung nach Pulsexperimenten in Leberzellen mit dem Ziel einer Metabolischen Stoffflussanalyse Die Extraktion erfolgte hierbei mit hei em Wasser Dieser Abschnitt zeigte dass eine Vielzahl von Methoden zur Probenvorbereitung f r eine Messung intrazellul rer Stoffwechselprodukte in der Literatur zu finden ist Je nach Ziel der Analyse bzw je nachdem an welchen Metaboliten ein Interesse besteht finden unterschiedliche Methoden Anwendung Dar ber hinaus ist besonders die Art der Probe von zentraler Bedeutung f r die Auswahl einer geeigneten Probenvorbereitung Dies bedeute
81. al TO SO EN 7 001 0 ol aa oor 001 1 1 I AJ T0 TO I 70 50 10 SO SO SO 500 T 001 AE os oo 001 01 sI Dm s 00 500 10 TO IO SOO TO 10 50 10 10 TO 001 01 ol aa 6 I Dm oo so I I I I I I I I or so or 001 001 e mmm 5 Ol 01 o a 001 0001 0001 am I I I I so 5 s s s I I I I so al I AEN 60 or os os rw amp 1 o 0 T s s s s T a I I alo 50 01 or 007 001 ans D Dm ai sl Dm D OL Dm I z I so o 0 0001 001 E 81 001 001 e was w rs wss w rs WSIS WSIS 40E or I or 001 001 8 001 001 OL 5 001 OOI O 1 m w3 w3s OT w rs OT w rs w rs S 001 001 oor w rs 00 w rs 001 wars 01 w rs 01 OI ws was w rs w rs 001 001 001 OOT wars 001 001 QT WSIs w rs w rs 00 o was w rs S S 001 001 wy 8 wes 00I w rs was m r TO Io Ws w rs w rs was 00 was I w rs w rs I 001 001 wz gl 8 YSZI 8 VIZ VIZ 861 861 861 APO mm URI s Q gt um o mm 01 o 01 or ol or up S OZI SIT SIT SIT je 16 16 IZI IZI 6 L6 o D 761 Zei yaunda 8 ayundy z a o A o A A A o A Z m 2 AA A ua Or Lr Lr EE Mat pe SDP mx we ope A mee
82. alle Zielgr en Bei der Begutachtung der Residuen fielen keine offensichtlichen Probleme auf Wie auch in den vorangegangenen Experimenten wurde hier eine Optimierung mittels der Desirability durchgef hrt Grunds tzlich wurden die gleichen Funktionstypen f r die einzelnen Desirabilities gew hlt wie im vorangegangenen Experiment Abschnitt 5 2 2 1 auch wenn die Funktionen der transformierten Zielgr en ver ndert erscheinen F r die Zielgr e Absorption 280 nm wurde eine st rker gekr mmte Funktion gew hlt um diese Variable geringer zu gewichten Typischerweise ist es ausreichend wenn ein Gro teil der Verunreinigungen aus der Probe entfernt ist und ein unterdurchschnittlicher Absorptionswert erreicht wird Dar ber hinaus absorbieren auch Nukleotide bei 280 nm und eine Minimierung der Absorption w re kontraproduktiv zur Maximierung des Nukleotidgehalts Abbildung 5 9 A zeigt die gew hlten Desirability Funktionen graue Spalte wie auch die ermittelte Abh ngigkeit zwischen Faktoren und Messgr en Die gestrichelten vertikalen Linien deuten den empfohlenen Arbeitspunkt an was einem MeOH Volumen von 1094 uL einer Konzentration des Tricine von 3mM und einer Kochdauer von 7 4 min entspricht Diese Werte f hren gem den Vorhersagen des Programms zu einer Overall Desirability von 0 84 F r die einzelnen Zielgr en sollte dies entsprechend der Pr diktionen des Modells zu folgenden Werten normalisiert auf das gemessenen Maxi
83. das Cytosol Oxidation zu Oxalacetat und zuletzt durch Decarboxylierung durch die Phosphoenolpyruvat Carboxykinase EC 4 1 1 32 Der Schritt von 1 zu F6P wird durch die Fructose 1 6 Bisphosphatase EC 3 1 3 11 katalysiert Der letzte Schritt erfolgt im Endoplasmatischen Retikulum wobei G6P zu Glucose durch die Glucose 6 Phosphatase 3 1 3 9 umgesetzt wird Die Gluconeogenese ist in allen Lebewesen zu finden In Tieren l uft sie haupts chlich in Lebergewebe statt wurde aber auch in geringerem Ma e im Cortex der Niere nachgewiesen Im Falle einer Kultivierung von tierischen Zellen unter g ngigen Bedingungen also bei ausreichender Versorgung mit Glucose spielt die Gluconeogenese keine Rolle im Stoffwechsel Die Pyruvat Carboxykinase konnte nicht in kontinuierlichen Zelllinien nachgewiesen werden H Wie bereits erw hnt findet in Nierengewebe mitunter die Neusynthese von Glucose statt allerdings ist der Stoffwechsel dieser Zellen stark ver ndert was bedeutet dass sie von Atmung und Gluconeogenese auf einen stark glykolytischen Stoffwechsel umschalten 1 3 1 2 Glutaminstoffwechsel Ein wichtiges Wachstumssubstrat fiir viele kultivierte tierische Zellen aber auch krebsartiges Gewebe ist Glutamin 5 751 Neben der Funktion der Energiegewinnung werden durch den Glutaminstoffwechsel auch verschiedene Vorl ufermetaboliten f r Synthesereaktionen gebildet Der Abbau von Glutamin kann ber diverse Stoffwechselwege erfolgen Die A
84. das Probenkarussell stellen 5 2 Log in sample ausw hlen dann im Untermen eingeben Pobenposition im Karussell angeben falls n tig Probenbezeichnung eingeben Zelltyp ausw hlen Standard MDCK 50 Dilution factor berpr fen f r unverd nnte Proben 1 0 f r sehr wichtige Proben Save images ausw hlen Speicher 1 MB Bild Speichern der Ergebnisse als eigene Excel Datei oder als Zeile in Multi run file bpt_datensammlung xlIs als Standarddatei ausw hlen zum Messen OK oder n chste Probe eingeben Next sample 5 3 Start der Messung Start queue Dauer einer Messung 3 Minuten 5 4 Ger t reinigt sich selbst ndig Probengef wird ausgeworfen 5 5 das Karussell wird nach weiteren Proben durchsucht die dann mit fortlaufender Nummerierung gemessen werden sofern nicht anders eingelogt 5 6 Speicherort f r gez hlte Proben in Excel Dateien lokal und im Netzwerk c daten ViCell Excell h bio daten vicellxr Excell Wenn auf der lokalen Festplatte c kein Speicherplatz mehr vorhanden ist miissen die lokalen Dateien in den gleichen Ordner auf dem Laufwerk h kopiert werden Nach der Sicherung k nnen die lokalen Dateien gel scht werden Die Ordner d rfen nicht gel scht oder umbenannt werden Bei Problemen mit dem Speichern auf Spiegellaufwerk Software neu starten 6 Aufzeichnung von Bioprozessen Um Zellz hlungen verschiedener Proben einer Zeitreihe zusammen
85. den Hexosephosphaten erheblich langsamer stattfand k nnte eine l nger andauernde Aktivit t des Krebszyklus bestanden haben Es k nnten aus abgebauten Proteinen Aminos uren in den Krebszyklus eingeschleust worden sein Zus tzlich zum m glichen Katabolismus von endogenen Makromolek len fand wahr scheinlich eine Regulation der energieverbrauchenden Reaktionen statt Der Konzentrationsabfall der organischen S uren fand erst nach einem anf nglichen Anstieg und in zwei Phasen statt wobei aber die einzelnen Phasen je nach Metabolit zeitlich verschoben waren Die Konzentration von Malat sank bereits nach etwa 0 5 min wohingegen f r Citrat der Konzentrationsabfall erst bei etwa 2 min einsetzte Auch der zweite Konzentrationsabfall war f r Malat bei etwa 30 min den anderen organischen S uren ab etwa 50 min vorgeschalten Eine m gliche Erkl rung f r den biphasischen Konzentrationsabfall k nnte eine unterschiedliche Art der Regulation sein W hrend der erste Abfall h chstwahrscheinlich durch eine metabolische Regulation vermittelt wurde k nnte der zweite Abfall durch eine Regulation auf Enzymebene oder Transkriptionsebene erfolgt sein Ursachen f r die zeitliche Verschiebung der Verl ufe k nnte in einem sequenziellen Abbau der Metaboliten liegen Des Weiteren kann eine unkontrollierte Diffusion der organischen S uren aus den Zellen aufgrund des Konzentrationsgradienten als Grund f r das Absinken nicht ausgeschlossen werden Allerdings er
86. den beiden Medien ohne Glucose ist die essentielle Bedeutung von Glucose f r das Wachstum zu erkennen Ein m glicher Ersatz von Glucose kann allerdings durch andere Zucker erreicht werden Z B konnte mit Fructose anstelle von Glucose ein vergleichbares Wachstum von MDCK Zellen gezeigt werden S 7 gt 391 Dennoch vermehrten sich die Zellen auch in den Medien ohne Glucosezugabe Hierzu ist allerdings zu bemerken dass in Serum typischerweise minimale Mengen von Glucose ca 5 mM vorliegen was bedeutet dass nicht von einem vollst ndig glucosefreien Medium ausgegangen werden konnte sondern dass eine Startkonzentration von etwa 0 5 mM vorlag Abbildung 5 25 zeigt die Konzentrationsverl ufe einiger intra und extrazellul rer Metaboliten Die eben erw hnte Glucose war in den beiden glucosehaltigen Medien innerhalb etwa 48 h vollst ndig verbraucht Als m gliche Erkl rung f r den vom Nullwert abweichenden Konzentrationsverlauf der Glucose nach 48 h f r das Medium mit Glucose und Glutamin kann ein systematischer Messfehler angegeben werden da diese Konzentrationen nicht im validierten Bereich der Messmethode lagen Tabelle 4 1 Der qualitative Verlauf ist dem f r das Medium mit Glucose nahezu identisch Ein offensichtlicher Zusammenhang zwischen dem Verbrauch der Glucose und einem eingeschr nkten Zellwachstum konnte nicht erkannt werden Wie schon f r die Experimente mit GMEM Z bzw EpiSerf wurde auch in diesem Experiment die Glucose gro te
87. der Uberflussstoffwechsel von Zellkulturen insbesondere f r Produktionszwecke ein Problem dar Gerade an dieser Stelle sind weitere experimentelle Untersuchungen erforderlich um die regulatorischen Hintergr nde aufzukl ren und basierend auf rationalen Ans tzen eine Optimierung der Kultivierungsbedingungen bzw Zelllinien zu erreichen 4 1 Einleitung Auch die Forderung nach einer gleichbleibenden Produktqualit t ist entscheidend vom Metabolismus der Zellen abh ngig Deshalb ist neben der genauen Charakterisierung des Produktes auch eine detaillierte Untersuchung der Kultivierungszust nde die zu den entsprechenden Produktformen f hren n tig Im Bereich der Bioprozesstechnik mit tierischen Zellen beschr nken sich die analytischen Verfahren zur Charakterisierung der Kulturen neben den Online Sonden f r Sauerstoff und den pH Wert h ufig auf die Bestimmung ausgew hlter Metaboliten im Zellkultur berstand Typischerweise werden die wichtigsten Substrate Glucose und Glutamin sowie die Hauptabbauprodukte Lactat und Ammonium bestimmt Eine Erweiterung dessen stellt die Analyse von Aminos uren im Zellkulturmedium dar Basierend auf solchen Messungen k nnen z B direkt Limitationszust nde der Zellen aufgrund von Substratmangel w hrend der Kultivierung erkannt werden bzw m gliche Inhibierungseffekte durch Abbauprodukte ermittelt werden Allerdings geben diese Daten nur bedingt Aufschluss ber die tats chlichen Stoffwechselvorg nge
88. des Autosamplers bot sich aber ein Messbetrieb von 24h f r 7 Tage in der Woche weshalb eine k rzere Messdauer bisher nicht erforderlich erschien 53 5 Ergebnisse und Diskussion 100 0 _ i T ES m a gt 3 e S 8 8 ng din d 9 3 a 2 g dad dad a g a 91145 685 3 S d wo Ka 2 a dan dan SZ 412 vn ALO 419 d19 S da 999 A aa 2 jeyuooy sue4 dav aa dav Je 39 dan N aer d dann 98 219 dan S 8 yeuooy sio dad o19 dan dwn J an ann S i wpuooy so L S SYNieD dan 2 Pig 5 OVNID 1 12111205 SR E A dao 1 SE Ode dao Wi ei S I 5 9094 S a Ol yeydsoud E 8 9 E Daz S g S 5 2 ES 5 5 dE 5 ED 5 S Ek S gs S a GL oft 2 bd gt D D reg S 5 5 o gt vo S S S s lt 5 23 SE D erssejexo 2 5 5 3 yeye0e exXO EE Le 2 H ai Ye 2s cue gt any SG any et A 2 lt S dSu S L2 2 Eo y g
89. die Glucose enthielten der Abfall verz gert bzw die Konzentration stieg bis 24 h zu einem Maximum an F r die beiden glucosefreien Medien war nach Beginn der Kultivierung direkt ein Abfall zu messen wobei f r das glutaminhaltige Medium noch eine Unterbrechung des Konzentrationsabfalls bei etwa 30 h vorzufinden war 0 3 021 0 1 Konz ATP mM 5 4 3 2 1 0 Konz UDP GIcNAc mM 0 0 Kultivierung szeit h Abbildung 5 26 Verl ufe der intrazellul ren Konzentrationen von ATP UDP GIcNAc und der Energy Charge bei Kultivierung von MDCK Zellen in DMEM mit vier verschiedenen Wachstumssubstraten Medium mit 2 5 mM und 2 mM 0 Medium mit 2 5 mM x Medium mit Gln 2 mM A Medium mit Pyr 2 mM Auch f r diese Kultivierungen wurden Kreuzkorrelationsanalysen durchgef hrt nicht dargestellt Tendenziell zeigten sich vergleichbare Muster in den Kreuzkorrelationsmatrizen wie in Abbildung 5 16 Das hei t es waren die gleichen Gruppen gut korrelierender Metaboliten unabh ngig vom 138 5 Ergebnisse und Diskussion Substrat zu finden z B korrelierten Zuckerphosphate gut Die vorgefundenen Unterschiede zwischen den Kultivierungen mit unterschiedlichen Substraten sind im Grunde in den Verlaufs kurven wiedergegeben weshalb auf die Darstellung der Korrelationsmatrix hier verzichtet wurde Diskussion Diese Versuche wurden durchgef hrt um einen Zusammenhang zwischen E
90. die Nukleotide GTP UTP und CTP hnlich gew hlt werden k nnen wie f r ATP Der Grund f r die Auswahl des Bereichs erfolgte aber anhand der in den Extraktionsproben vorgefundenen Mengen so dass h here Konzentrationen nicht von Interesse waren Die in dieser Arbeit ermittelten Detektionslimits erwiesen sich als vergleichbar mit der Literatur 8 321 Dabei war die Herkunft der auftretenden Unterschiede der minimal zu bestimmenden Konzentrationen durch verschiedene Methoden sowohl der Chromatographie als auch der Berechnung der Detektionslimits schwierig auszumachen Aus diesem Grund wird hier von einer weiteren Diskussion abgesehen Wie oben beschrieben war es im Laufe der Arbeit erforderlich eine Anpassung der Kalibrier funktionen durchzuf hren Die Nutzung der durch die Validierung ermittelten Funktionen war im Routinebetrieb zum Gro teil nicht anwendbar Bei der Anpassung der Kalibrierfunktion mussten einige weitere rationale Gesichtspunkte ber cksichtigt werden Zwar wurden die Standardkonzentrationen an die in Extraktionsproben vorgefundenen Metabolitkonzentrationen angepasst allerdings befanden sich trotzdem die 5 Ergebnisse und Diskussion 65 Konzentrationen mancher Metaboliten am unteren Ende des Messbereichs Gerade f r diese Metaboliten war es wichtig dass die niedrig konzentrierten Kalibrierstandards st rker gewichtet wurden um auf diese Weise eine bessere Bestimmung der Konzentration zu erzielen Im Routinebetrie
91. die Nukleotide f r die 160 5 Ergebnisse und Diskussion beiden unterschiedlichen Versuchsszenarien zu Beginn der Versuche hnliche Konzentrationen aufwiesen lagen f r die intrazellul re Citratkonzentration deutliche Unterschiede vor s Abbildung 5 28 und Abbildung 5 31 Da in beiden Versuchen aber eine hohe Aktivit t der Phosphofructokinase vorgefunden wurde scheint Citrat in der gemessenen Konzentrationsspanne keinen gro en Einfluss auf die Aktivit t gehabt zu haben Um eine eindeutige Aussage treffen zu k nnen w ren allerdings weitere Experimente erforderlich GLUCOSE SEET Korrelationskoeffizient A 1 Glucosephosphat Isomerase FRUGTOSE S PHOSPHAT J Phosphotructokinase ER ad Dehydrogenase SUCCINYL CoA Succinyl CoA Synthethase DIHYDROXYACETON PHOSPHAT Aldolase Trosephesphat Isomerase 1 1 GLYCERINALDEHYD 3 PHOSPHAT Isocitrat Dehydrogenase zl Dehydrogenase 1 3 BISPHOSPHOGLYCERAT I Deh I Kinase Phosphoglycerat J Ak dite tong OXALACETAT Mutase Synthase 2 PHOSPHOGLYCERAT Enolase iva ze CoA Dehydrogenase Pyruvat Abbildung Schemata von Glykolyse und Krebszyklus und den farbkodierten Korrelationskoeffizienten zu den jeweiligen Metabolitpaaren f r MDCK Zellen basierend auf den Resultaten der Kurzzeitexperimente Darge
92. die Quantifizierung von intrazellul ren Metaboliten in tierischen Zellen war die Etablierung einer geeigneten Methode zur Messung der entsprechenden Substanzen Aufgrund der anionischen Eigenschaften vieler intrazellul rer Metaboliten aus dem Zentralstoffwechsel unter physiologischen Bedingungen wurden vor Beginn der Arbeit f r die Messungen zwei AAC Anlagen bezogen Hierbei handelte es sich um die Anlagen DX320 und DX600 beide Dionex wobei die chromatographische Trennung bei beiden Anlagen auf S ulen mit quatern rem Ammonium als funktionelle Gruppe vollzogen wurde Ansonsten unterschieden sich die Anlagen aber deutlich in ihren Komponenten und chromatographischen Eigenschaften 5 1 1 Anionen Austausch Chromatographie mit der Anlage DX320 Die Chromatographieanlage DX320 wurde urspr nglich gew hlt um organische S uren und anor ganische Ionen zu messen Zentrale Bestandteile der Anlage sind die analytische S ule AS11 und die Detektoren Leitf higkeit und UV Die grunds tzliche Eignung dieser Anlage f r die Analyse von organischen S uren und anorganischen Ionen wurde im Vorfeld vom Hersteller der Anlage gezeigt Erste Optimierungsschritte des Gradientenprogramms wurden bereits von Frau Ralitza Danova durchgef hrt was hei t dass bereits diverse potentiell intrazellul r auftretende Metaboliten bez glich ihres Vorkommens in Extraktionsproben und ihres Retentionsverhaltens getestet wurden Die Standardmischung die zu Beginn der Arbei
93. einen Wert von etwa 0 96 bis ca 70 h woran sich ein leichter Abfall bis zum Ende der Kultivierung anschloss Bei den Kultivierungen in den anderen Medien fand zuerst ein leichter Abfall der Energy Charge statt bis etwa 24h danach stieg der Wert an bis etwa 70 h Anschlie end blieb f r die beiden Medien mit Pyruvat bzw Glutamin der Wert relativ konstant bei 0 93 Das Glucose Medium zeigte nach 70 h einen deutlichen Abfall der Energy Charge bis auf einen Wert von etwa 0 88 In Abbildung 5 27 ist zus tzlich noch der Verlauf der Konzentration von UDP GlcNAc dargestellt Ganz klar zu erkennen war der Einfluss von Glucose auf diesen Metaboliten W hrend die Startkonzentration f r alle Zellen sehr hnlich war sank f r die glucosefreien Medien der Wert innerhalb von 24 h auf sehr niedrige Konzentrationen und f r die glucosehaltigen Medien fand ein Anstieg statt Nach einem Maximum der Konzentration folgte ein Abfall der Konzentration ein Minimum wurde durchlaufen und gegen Ende der Kultivierung stieg die Konzentration wieder an Zusammenfassend ist zu bemerken dass somit auch f r Vero Zellen verschiedene Metaboliten unterschiedliche Konzentrationen und Konzentrationsverl ufe w hrend einer Batch Kultivierung aufwiesen Zus tzlich war klar zu erkennen dass unterschiedliche Medien klare Effekte auf die intrazellul ren Metabolitkonzentrationen haben Diskussion Die gezeigten Daten zu Vero Zellen Abbildung 5 27 verdeutlichen die gro en
94. fermentation broths using high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection Analytical Biochemistry 283 2 192 199 Stroop CJM Bush CA Marple RL LaCourse WR 2002 Carbohydrate analysis of bacterial polysaccharides by high pH anion exchange chromatography and online polarimetric determination of absolute configuration Analytical Biochemistry 303 2 176 185 Glacken MW 1988 Catabolic Control of Mammalian Cell Culture Bio Technology 6 9 1041 1050 H ggstr m L 2000 Cell Metabolism Animal In Spier RE editor Encylopedia of cell technology New York Wiley p 392 411 Schneider M Marison IW vonStockar U 1996 The importance of ammonia in mammalian cell culture Journal of Biotechnology 46 161 185 McKeehan WL 1982 Glycolysis glutaminolysis and cell proliferation Cell Biology International Reports 6 7 635 650 Morgan MJ Faik P 1981 Carbohydrate metabolism in cultured animal cells Review Bioscience Reports 1 669 686 Newland M Greenfield PF Reid S 1990 Hybridoma Growth Limitations the Roles of Energy Metabolism and Ammonia Production Cytotechnology 3 3 215 229 Morgan MJ editor 1986 Carbohydrate Metabolism in Cultured Cells New York Plenum Press 514 p Medina MA Decastro IN 1990 Glutaminolysis and Glycolysis Interactions in Proliferant Cells International Journal of Biochemistry 22 7 68 1 683 Wagner R 1997 Metabolic Control of Animal Cell Culture Processes In Hauser H
95. gro e Anzahl von detektierten Substanzen wurde das Problem verst rkt Die eingeschr nkte Reproduzierbarkeit der Messungen war sicherlich zum Teil darauf zur ckzuf hren dass die Eluenten im Gegensatz zur Chromatographieanlage DX320 manuell angesetzt wurden Dabei treten typischerweise gewisse Schwankungen in der Qualit t der Eluenten auf und insbesondere bei den Hydroxid Eluenten wird h ufig die Qualit t des Eluenten durch aus der Luft adsorbiertes Kohlendioxid beeintr chtigt Die bessere Qualit t von chromatographischen Messungen durch die Nutzung eines Eluentengenerators wurde bereits in der Literatur gezeigt 1272 2731 Eine erfolgreiche Kombination von zwei hnlichen Chromatographieanlagen wie die in der hier 80 Hierbei wurden verwendeten Arbeit genutzten Systemen ist in der Literatur beschrieben anorganische Ionen und organische S uren auf einer AS11 S ule und Zuckerphosphate Nukleotide und Zuckernukleotide auf einer CarboPac PA1 Sdule analysiert Eine m gliche Verbesserung der Nutzbarkeit der Anlage DX600 in der hier vorliegenden Arbeit h tte durch ein anderes S ulenmaterial oder wie f r die Anlage DX320 geschehen ein selektivere Detektion erreicht werden k nnen In der Literatur konnte eine erfolgreiche Anwendung einer Kombination von Amperometrischer und MS Detektion gezeigt werden 79 5 1 4 Zusammenfassung der Etablierung einer Chromatographiemethode Im Zuge dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Chromat
96. hier aber nicht beschrieben werden Basierend auf den Erfahrungen dieser Vorversuche wurde ein systematischer vierstufiger Auswahl und Optimierungsprozess f r eine geeignete Extraktionsmethode durchgef hrt Abschnitt 5 2 Grunds tzlich wurde bei den in Abschnitt 5 2 beschriebenen Experimenten wie folgt vorgegangen MDCK Zellen 2 5 4 5 x 10 Zellen Well bzw Vero Zellen 3 5 6 5 x 10 Zellen Well wurden direkt in den Wells der Sechs Well Platten extrahiert wobei eine Extraktionsmethode bei allen Wells einer Platte angewendet wurde F r den Fall eines Waschschrittes wurde der Zellkultur berstand schnellst m glich abgegossen und jedes Well mit 1 mL PBS 4 C gewaschen 42 4 Material und Methoden Direkt nach dem Abgie en der Waschfl ssigkeit wurden die Wells extrahiert Alle Zentrifugationsschritte wurden bei 16000 g 0 C f r 10 min durchgef hrt Zentrifugationsschritte der Trockenvorgang und die Aufbewahrung der Proben erfolgten immer in 2 2 mL Probenr hrchen Greiner Bio One Falls nicht explizit erw hnt wurden die getrockneten Proben vor dem Messen in 600 uL Milli Q Wasser gel st Im Zusammenhang mit verschiedenen Experimenten werden im Verlauf der hier vorliegenden Arbeit verschiedene Konzentrations bzw Mengenangaben gemacht Tabelle 4 2 soll dies erl utern Je nach Experiment erschien die eine oder andere Angabe der Metabolitmenge oder konzentration sinnvoller bzw hilfreicher Zur Bestimmung des Gesamtzellvolum
97. identifiziert werden welche als charakteristische metabolische Fingerabdr cke dienen k nnten Um eine m glichst individuelle Antwort f r verschiedene Stoffwechselzust nde zu erhalten erschien es erforderlich nicht nur einen oder wenige Metaboliten zu bestimmen sondern mehrere Metaboliten mit zentraler Funktion im Stoffwechsel Aus diesem Grund sollte ein Metabolic Profiling anhand von Intermediaten aus Glykolyse und Krebszyklus sowie von Nukleotiden erfolgen Der erste zwingend erforderliche Meilenstein f r die hier vorliegende Arbeit war die Etablierung einer Messmethode f r die Quantifizierung von Stoffwechselprodukten aus dem Zentralstoff wechsel Hierbei sollten m glichst viele Metaboliten aus dem Zentralstoffwechsel mit einer einzigen Methode simultan quantifiziert werden aber diese Methode sollte trotzdem einen robusten anwenderfreundlichen Routinebetrieb zulassen Anhand von in der Literatur beschriebenen 18184 sollte Methoden mit der in dieser Arbeit zu nutzenden Chromatographies ule AS11 Dionex ein Verfahren basierend auf Anionen Austausch Chromatographie AAC f r die Bestimmung von organischen S uren Nukleotiden und verwandten Metaboliten entwickelt werden s Abschnitt 4 3 6 Es sollte hierf r eine Chromatographieanlage vom Typ Bio LC DX320 Dionex s Abschnitt 4 3 6 verwendet werden Als komplement re Methode sollte eine Analyse von Zuckern Zuckerphosphaten und verwandten Metaboliten auf einer Carbo
98. in biological extracts by using solid phase extraction and anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection Analytical Biochemistry 261 1 36 42 186 Lu SB Sun XM Zhang YX 2005 Insight into metabolism of CHO cells at low glucose concentration on the basis of the determination of intracellular metabolites Process Biochemistry 40 5 1917 1921 187 Markuszewski MJ Otsuka K Terabe S Matsuda K Nishioka T 2003 Analysis of carboxylic acid metabolites rom the tricarboxylic acid cycle in Bacillus subtilis cell extract by capillary electrophoresis using an indirect photometric detection method Journal of Chromatography A 1010 1 113 121 188 Schmid G Keller T 1992 Monitoring hybridoma metabolism in continuous suspension culture at the intracellular level 1 Steady state responses to different glutamine feed concentrations Cytotechnology 9 1 3 217 229 189 Niessen WMA 2006 Liquid chromatography mass spectrometry Boca Raton CRC Taylor amp Francis 608 p 190 Kebarle P 2000 A brief overview of the present status of the mechanisms involved in electrospray mass spectrometry Journal of Mass Spectrometry 35 7 804 817 191 Fenn JB Mann Meng CK Wong SF Whitehouse CM 1990 Electrospray Ionization Principles and Practice Mass Spectrometry Reviews 9 1 37 70 192 Lu X Zhao XJ Bai CM Zhao CX Lu G Xu GM 2008 LC MS based metabonomics analysis Journal of Chromatography B Analytical Technologies in t
99. in den Zellen Ein stark wachsender Bereich der Analytik auch in der Bioprozesstechnik ist die Metabolomanalyse Im Falle von tierischen Zellkulturen w re hierbei das Ziel s mtliche intrazellul re Metaboliten der Zellen zu quantifizieren Da die unterschiedlichen Stoffwechsel intermediate ein konkretes metabolisches Abbild des Zustandes einer Zelle inklusive aller externen Einfl sse aber auch der molekularbiologischen und biochemischen Effekte liefern stellt die Gruppe dieser Biomolek le hochsensible Messgr en zur Beurteilung der Physiologie einer Zellkultur dar F r die Bestimmung von intrazellul ren Metaboliten kommen unterschiedliche analytische Verfahren zum Einsatz wie z B Kernresonanzspektroskopie enzymatische Verfahren oder chromatographische Methoden h ufig gekoppelt an Massenspektrometrie Detektoren Die apparatetechnische Herausforderung liegt hier in einer simultanen Bestimmung von m glichst vielen Metaboliten welche zum Teil sehr stark unterschiedliche physikalisch chemische Eigenschaften besitzen W hrend die Einstellungen von Messger ten anhand von kommerziell beziehbaren Standards der Metaboliten erfolgreich optimiert werden k nnen stellt die dem analytischen Assay vorangehende Probenvorbereitung eine erheblich h here experimentelle H rde dar Mit Ausnahme von nicht invasiven Methoden greifen alle anderen Verfahren auf einen Probenvorbereitung zur ck Eine Herausforderung stellt hierbei die schnelle Umsetzung de
100. ist Ohne Vorkenntnis wird h ufig empirisch vorgegangen und eine Transformation gew hlt die eine Stabilisierung der Varianzen erm glicht 3 5 5 Optimierung anhand von Desirability Funktionen F r den Fall dass ein Prozess anhand mehrerer Zielvariablen nicht nur charakterisiert sondern auch optimiert werden soll bietet sich ein objektives Verfahren basierend auf Desirability Funktionen W nschbarkeitsfunktionen an 2 249 251 Hierbei wird f r jede Zielgr e y eine individuelle Desirability Funktion d definiert die sich in einem Bereich 0 lt d lt 1 bewegt Der optimale Bereich f r die Zielgr e y wird 1 zugeordnet und dem inakzeptablen Bereich 0 F r die Optimierung werden die einzelnen Desirability Funktionen d ber das geometrische Mittel kombiniert zu einer Overall Desirability D d X dz dall wobei m die Anzahl der Zielvariablen ist Bei der Optimierung werden die Einflussgr en so gew hlt dass die Overall Desirability maximiert wird Die einzelnen Desirability Funktionen sind normalerweise kontinuierlich ansteigende oder abfallende Funktionen je nachdem ob die Zielgr e maximiert oder minimiert werden soll Die Transformation von y zu d wird h ufig bei zu maximierenden Zielgr en wie in Gleichung 3 7 und bei zu minimierenden Zielgr en wie in Gleichung 3 8 realisiert 34 3 Theoretische Grundlagen 0 f r y lt N 1 f r y lt Z K K N H a 2 N f r N lt y lt z dl f r Z lt y l
101. konnte keine ausf hrliche Untersuchung zur Standardabweichung bzw Varianz wie hier durchgef hrt gefunden werden Aus diesem Grund kann hier kein Vergleich mit der Literatur erfolgen Basierend auf diesen Ergebnissen sollte eventuell eine ver nderte Kalibrierungstrategie zum Einsatz kommen Im Laufe der Arbeit deutete sich bereits die Inhomogenit t der Varianzen an insbesondere f r die MS Detektion so dass eine Gewichtung Konzentration f r einige Metaboliten genutzt wurde 119 2501 Eine Tabelle der zuletzt genutzten Kalibrierungen ist im Anhang Tabelle A 8 gegeben Eine weitere Diskussion hierzu ist im Zusammenhang mit der Bestimmung der Standardabweichung der Extraktionsproben unter 5 2 7 gegeben 5 1 3 3 Einfluss des pH Wertes auf die Quantifizierung In Abbildung 5 2 konnte klar eine Abh ngigkeit des Detektorsignals vom pH Wert der Probe gezeigt werden Da beide Detektoren in nahezu gleicher Art beeinflusst waren kann angenommen werden dass es sich weniger um ein Detektionsproblem als vielmehr um ein chromatographisches Problem handelte M glicherweise f hrt ein niedriger pH Wert durch einen hohen Anteil protonierter Analyten zu einem ver nderten Retentionsverhalten eines Teils der Analyten und somit zu einer Elution zu einem fr heren Zeitpunkt oder sogar im Totvolumen In der Literatur konnten speziell zu diesem Effekt keine konkreten Hinweise gefunden werden Dennoch beschreibt Jandik et al 2000 deutliche Einfl sse des Pr
102. lberserum und 2 g L Pepton und 4 g L NaHCO statisch in T Flaschen oder dynamisch in Rollerflaschen kultiviert Fiir alle in Kapitel 5 2 im Detail beschriebenen Versuche zur Extraktion wie auch s mtliche statische Kultivierungen in Abschnitt 5 3 die genauer charakterisiert wurden wurden die Zellen in Sechs Well Platten kultiviert F r diese Versuche wurde eine maximale Passagenzahl von 20 nach dem Auftauen der Arbeitszellbank verwendet 4 3 Analytik 4 3 1 Lumineszenzmessung von Zur Bestimmung des ATP Gehalts von Zellen wurde alternativ zur Chromatographie ein Lumineszenz Test ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System Perkin Elmer verwendet Zur Kalibrierung wurden sieben quidistante Verd nnungen von in Milli Q Wasser gel stem ATP im Bereich von 1 bis 100 uM erstellt F r Standards und Proben wurden 90 uL PBS in 96 Well Platten Greiner pipettiert Ein Volumen von 10 uL der Probe oder des Standards wurden hinzugef gt Die Platte wurde f r 1 min bei 750 rpm gesch ttelt und anschlie end wurden 50 uL der Enzyml sung zugegeben und wiederum f r 1 min gesch ttelt Abschlie end wurde jedes Well f r 1s mit dem Luminometer Mithras L 940 Berthold gemessen F r Proben die Perchlors ure PCS enthielten wurde eine getrennte Kalibrierung aufgenommen wobei 10 uL von neutralisierter PCS zu 80 uL PBS hinzugegeben wurden um den Einfluss der Salzl sung zu kompensieren Basierend auf den mehrfach bestimmten Proben aus Abs
103. neues Medium allerdings erst bei mehrmaliger Passagierung Grund f r die nicht durchgef hrte Adaptation war dass ein identisches Zellausgangsmaterial f r die zu vergleichenden Medien verwendet werden sollte Die beiden untersuchten Medien wiesen neben dem unterschiedlichen Serumgehalt weitere deutliche Unterschiede in ihren Zusammensetzungen auf wie z B in der Konzentration der Glucose oder von Aminos uren Durch die Verwendung von Medien mit deutlichen Unterschieden in der Zusammensetzung sollte ein m glichst weites Spektrum von intrazellul ren Metabolitkonzentrationen bei gutem Zellwachstum erzielt werden Da diese Medien bereits mit guten Erfahrungen f r die Kultivierung von MDCK Zellen eingesetzt wurden lag die Verwendung dieser Medien nahe Diese positiven Erfahrungen bez glich des Zellwachstums konnte auch f r alle hier gezeigten Kultivierungen best tigt werden so waren die erreichten maximalen spezifischen Wachstumsraten und Zellzahlen pro Well in dem f r adh rente Zellen erwarteten Bereich s Abbildung 5 18 A Dennoch waren auch klare Unterschiede zwischen den 114 5 Ergebnisse und Diskussion einzelnen Versuchen zu erkennen Mehrere Ursachen kamen f r diese Differenzen in Frage Als erstes waren wahrscheinlich die unterschiedlichen Startzellzahlen s Seite 112 von gro er Bedeutung f r den Verlauf der Wachstumskurven Ob grunds tzlich ein Einfluss der Startzellzahlen auf die maximale Zellzahl besteht kann hier nic
104. nicht dargestellt Dieses hier beschriebene unterschiedliche quantitative Verhalten der Medien wurde auch in der Kon zentration von a Ketoglutarat wiedergefunden Auch hier war gerade zu Beginn der Kultivierung im Pyruvat Medium die Konzentration am h chsten und im Glucose Medium am niedrigsten F r alle Medien wurde bei etwa 40h ein kleines lokales Maximum durchschritten Die Konzentrationsverl ufe f r Malat deuten klare Unterschiede f r die vier Medien an W hrend f r die beiden Medien welche Glutamin enthielten ein quantitativ nahezu identischer Verlauf zu er kennen war war zu dem Glucose Medium nur eine qualitative bereinstimmung zu erkennen Die Konzentrationsverl ufe in diesen drei Medien hatten einen niedrigen Startwert und bei etwa 36h 5 Ergebnisse und Diskussion 137 wurde ein Maximum durchlaufen Einen deutlich hiervon abweichenden Verlauf zeigte die Malat konzentration f r das Pyruvat Medium Hier lag zu Beginn die h chste Konzentration vor Diese fiel innerhalb der ersten 24 h stark ab Im weiteren Verlauf war ein leichtes Abfallen der Konzen tration zu verzeichnen Die beiden Metaboliten Succinat und Fumarat nicht dargestellt zeigten ein hnliches Konzentrationsverhalten wie Malat was hei t dass etwa bei 30 40 h ein Maximum erreicht wurde Allerdings waren die Verl ufe f r diese Metaboliten nicht so stark unterschiedlich ausgepr gt wie das f r Malat zu sehen war Besonders auff llig war f r Succinat dass
105. nur als grober Richtwert angesehen werden Grund hierf r ist dass die Standards nicht dem intrazellul ren Volumen zugegeben werden konnten Somit wurden die zugegebenen Standards nicht dem eigentlichen Solubilisierungsprozess aus den Zellen unterzogen Unter diesem Problem leiden aber alle Methoden die eine Probenvorbereitung ben tigen und intrazellul re Metaboliten messen wollen Dennoch kann das oben beschriebene Vorgehen zur Bestimmung der Wiederfindung Probleme und Schwachstellen der Extraktionsmethoden aufdecken wie in Abschnitt 5 2 3 angedeutet Ein Vergleich mit der Literatur zeigt dass f r die hier untersuchten Metaboliten auch in anderen Arbeiten hnliche Werte f r die Wiederfindung erzielt wurden Nukleotide konnten z mit 60 110 wiedergefunden nachdem Standard zu Gewebe oder Zellpellets gegeben wurde und eine Extraktion folgte P 171 177 178 225 227 236 Allerdings wird nirgends von solch hohen Wiederfindungen f r Nukleosiddiphosphate berichtet wie sie in der hier vorliegenden Arbeit f r die beiden unter 5 2 2 2 optimierten Methoden auftraten Hierzu kann nur erw hnt werden dass die exakte Durchf hrung wie z B der Zeitpunkt der Zugabe des Standards bei der Bestimmung der Wiederfindung von gro er Bedeutung ist und zu unterschiedlichen Ergebnissen f hren kann Letztendlich konnte die Frage nicht gekl rt werden warum derart hohe Wiederfindungen f r Nukleosiddiphosphate nicht in der Literatur berichtet sind Org
106. r die g ngige Vorgehensweise eine Untersuchung jeder Einflussgr e zu jeweils einem Zeitpunkt Ein Faktor zu einem Zeitpunkt Experimente Alternativ kann ein Experiment basierend auf statistischer Versuchsplanung wie z B ein faktorieller Versuchsplan genutzt werden Bei solch einem Versuchsplan werden in einem vollst ndigen Versuch alle m glichen Kombi nationen der Faktoren und deren Niveaus Levels getestet Die Faktoren werden somit in Abh ngigkeit von einander untersucht Allgemein ist zwischen Fix und Zufallsfaktoren zu unter scheiden W hrend Fixfaktoren frei vom Experimentator zu w hlen und fixieren sind werden bei Zufallsfaktoren die Proben zuf llig aus einer gr eren Population m glicher Niveaus gew hlt In der hier beschriebenen Arbeit handelt es sich ausschlie lich um Fixfaktoren weshalb sich auch die theoretischen Betrachtungen auf diese Art von Faktoren beschr nken Als weitere Unterscheidung sind kontinuierliche und diskrete Faktoren zu erw hnen W hrend erstere quantitative Faktoren sind und prinzipiell unendlich viele Niveaus einer kontinuierlichen Skala annehmen k nnen z B Temperatur Volumen k nnen diskrete Faktoren hingegen nur ganz bestimmte Werte annehmen Man spricht hier auch mitunter von qualitativen Einflussgr en z B Hersteller Batch Ger tetyp 3 5 1 Faktorielle Versuchspl ne H ufig genutzt werden faktorielle Versuchspl ne Ein Prinzip der faktoriellen Versuchsplanung ist die Ortho
107. sicherlich keine Ausnahme und bei entsprechender Untersuchung weiterer Metaboliten w rden wahrscheinlich zus tzlich Koelutionen zu finden sein Des Weiteren ist es nicht m glich alle erdenklichen Metaboliten auf ihr Retentions verhalten zu testen sofern sie berhaupt kommerziell zu beziehen sind Allerdings waren mitunter die Konzentrationsunterschiede zwischen den Metaboliten in den Extraktionsproben sehr gro weshalb manche Metaboliten bei Koelutionen sicherlich vernachl ssigt werden k nnten Eine gute M glichkeit zur qualitativen Unterscheidung lieferte in dieser Arbeit die Nutzung des UV Detektors wodurch insbesondere Nukleotide selektiv bei 260 nm detektiert wurden Lu et al Di untersuchten intrazellul re organische S uren von CHO Zellen mit einer hnlichen AAC Anlage und verzichteten auf die UV Detektion was eine hohe Gefahr f r eine Fehlinterpretation birgt da organische S uren teilweise mit Nukleotiden koeluieren Wie in Tabelle 5 1 gezeigt trat in den hier durchgef hrten Arbeiten z B f r die Metaboliten Citrat Isocitrat und cis Aconitat eine Koelution mit anderen Stoffwechselprodukten auf Eine weitere Voraussetzung zur Aufkl rung von Koelutionen ist dass m glichst viele potentiell auftretende Metaboliten auf ihr Retentionsverhalten untersucht werden Gerade bei Metabolic Profiling Studien wurde auf diese Tatsache nicht 34 zwingend geachtet so setzten Groussac et al ihrem Standard keine Nukleotide zu weshalb in
108. u ist der Mittelwert aller Messungen x stellt die skalierten Level der Faktoren dar j sind die zu sch tzenden Haupteffektwerte und fj sind die zu sch tzenden Inter aktionseffektwerte und ist der Fehler Die Skalierung der Level bedeutet dass das niedrige Level als 1 und das hohe Level als 1 definiert sind Die graphische Darstellung der Gleichung 3 3 f hrt zu einer Antwortoberfl che wobei die beiden Faktoren auf der x und y Achse und die Zielgr e auf der z Achse aufgetragen sind Als Vorteil von faktoriellen Versuchspl nen im Gegensatz zu Ein Faktor zu einem Zeitpunkt Experimenten wird die h here relative Effizienz aufgef hrt Zum Beispiel erh lt man f r ein 2 Faktor 2 Level Experiment mit vier Einzelexperimenten f r beide Faktoren je zwei Sch tzwerte F r zwei Sch tzwerte bei zwei Faktoren in einem Ein Faktor zu einem Zeitpunkt Versuchsplan sind sechs Einzelexperimente n tig Mit zunehmender Zahl von zu testenden Einflussgr en nimmt die relative Effizienz von faktoriellen Designs deutlich zu F r den Fall dass eine Interaktion zwischen den beiden Faktoren besteht kann dies mit einem faktoriellen Versuchsplan erkannt werden Ein Ein Faktor zu einem Zeitpunkt Versuchsplan w rde hier h ufig zu Fehlinter pretationen f hren bzw die Interaktion nicht aufdecken Die Analyse von faktoriellen Experimenten schlie t neben verschiedenen graphischen Methoden wie z B Kastendiagramme Box Plots oder Streudiagrammen Scatterp
109. used for various purposes like the generation of organ transplants toxicity studies or the production of biopharmaceuticals Cells from many organs and organisms have been isolated since the early beginnings of cell culture technology A general property of many cultured animal cells is the fairly inefficient metabolism compared to cells in the tissue Despite the long history of research on this topic further investigations are needed to elucidate the biological reasons for the metabolic alteration of cellular metabolism after isolation from organs The aim of this work was to characterize animal cell cultures according to intracellular concentrations of metabolites from central metabolism In such a metabolic profiling approach external factors and global cellular regulatory mechanisms are reflected Thus a unique pattern of every distinct physiological status is obtained Therefore it was necessary to establish an analytical assay for the detection of intracellular metabolites In the first stage of this work an anion exchange chromatography method for the separation and detection of organic acids sugar phosphates and nucleotides was established Main focus was on a high chromatographic resolution of analytes robust quantification and convenient applicability Using an on line electrolytic eluent generation two serial analytical columns and two detectors conductivity and UV allowed a highly reproducible quantification of more than 25 i
110. von MDCK Zellen GMEM Z 129 dung 5 22 Kreuzkorrelationsmatrix f r Kultivierungen von MDCK Zellen in 131 dung 5 23 Darstellung der Differenzen der Korrelationen zwischen den Medien GMEM Z und EpiSerf dung 5 24 Verl ufe der Zellzahlen A und Zusammenfassung der Startzellzahlen der maximalen spezifischen Wachstumsraten und maximalen Zellzahlen bei Kultivierungen von MDCK Zellen in DMEM mit vier verschiedenen Wachstumssubstraten wee 185 dung 5 25 Verl ufe von extra und intrazellul ren Metabolitkonzentrationen bei Kultivierung von MDCK Zellen in DMEM mit vier verschiedenen 136 dung 5 26 Verl ufe der intrazellul ren Konzentrationen von ATP UDP GIcNAc und der Energy Charge bei Kultivierung von MDCK Zellen in DMEM mit vier verschiedenen Wachstumssubstraten 137 dung 5 27 Verl ufe von Zellzahl intrazellul ren Metabolitkonzentrationen und der Energy Charge bei Kultivierung von Vero Zellen in DMEM mit vier verschiedenen Wachstumssubstraten 144 dung 5 28 Konzentrationsverl ufe intrazellul rer Metaboliten aus Glykolyse und Krebszyklus in MDCK Zellen in einem Zeitraum von 2 h nach dem Ersetzen des Zellkulturmediums durch PBS 148 dung 5 29 Verl ufe der intrazellul ren Konzentrationen von ATP und UDP GIcNAc sowie der Energy Charge in MDCK Zellen in einem Zeitraum von 2 h n
111. wie z B der Glucosekonzentration oder auch den Konzentrationen von Aminos uren Dadurch sollte das zu erwartende Spektrum der physiologischen intrazellul ren Metabolitkonzentrationen ausgel st durch N hrmedien m glichst weit ausgesch pft werden Es wurde eine gemeinsame Vorkultur in GMEM Z f r beide Kulti vierungsans tze verwendet um von identischem Zellmaterial f r die Einsaat ausgehen zu k nnen 112 5 Ergebnisse und Diskussion Zellwachstum Es wurden je drei Kultivierungen in Sechs Well Platten durchgef hrt Die drei verschiedenen Versuche wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit unterschiedlichen Vorkulturen gestartet Einsaatzelldichten waren f r Experiment GMEM Z1 0 66 10 Zellen Well EpiSerfl 0 64 x 10 Zellen Well GMEM Z2 0 45 x 10 Zellen Well EpiSerf2 0 43 x 10 Zellen Well GMEM Z3 0 74 x 10 Zellen Well EpiSerf3 0 71 x 10 Zellen Well Neben den Zellzahlen wurden wie in Abschnitt 5 2 6 beschrieben auch die Zelldurchmesser durch das Ger t ViCell XR bestimmt Daten nicht gezeigt Somit konnte durch Multiplikation der Zellzahlen mit den errechneten Einzelzellvolumina das bereits oben erw hnte Gesamtzellvolumen der Zellen in einem Well ermittelt werden Die Verl ufe der Zellzahlen und der Gesamtzellvolumina der Zellen der verschiedenen Kultivierungen f r GMEM Z und EpiSerf sind in Abbildung 5 18 dargestellt 12 5 10 4 mi 44 84 5 eh 3
112. wurden Zu Beginn der Kultivierung lag eine hohe Konzentration vor Anschlie end fand ein Abfall statt und daran schloss sich eine Phase in welcher eine relativ konstante Konzentration bis zum Ende der Versuche gehalten wurde Unterschiede zwischen den Metaboliten und den Medien bestand in der unterschiedlichen Dauer dieser drei Phasen Grunds tzlich war dieses einheitliche Verhalten bereits durch die Kreuzkorrelationsanalyse aller mit MDCK Zellen durchgef hrten Kultivierungen Abbildung 5 16 zu erkennen was sich in den berwiegend positiven Korrelations koeffizienten widerspiegelte Generell k nnte als Erkl rung f r das dreiphasige Verhalten der Konzentrationen ein Zusammenhang zu den typischen Wachstumsphasen von adh renten Zellen s Abbildung 3 1 erw hnt werden So wird normalerweise in die drei oben erw hnten Phasen Lag Exp und Stat Phase eingeteilt Wie aber aus der Abbildung deutlich wird existieren weitere Wachstumsphasen insbesondere der bergang von exponentiellem Wachstum zur station ren Phase und eine klare Zuordnung ist oft schwierig Dar ber hinaus traten die drei Phasen der Meta bolitkonzentrationen nicht synchron auf sondern unterschieden sich in ihren zeitlichen Abl ufen mitunter deutlich vgl z F16bP und Malat Abbildung 5 19 Eine klare Interpretation der Konz entrationsverl ufe im Zusammenhang mit den Wachstumsphasen erscheint somit nicht m glich Intermediate der Glykolyse Bei Betrachtung der K
113. zu speichern und auszuwerten ist es sinnvoll diese als Bioprocess zu sammeln und in einer Datei abzulegen Anhang 7 File gt New Bioprocess Bezeichnung f r den Prozess vergeben z B Fermentation 100 Zelltyp ausw hlen Speicherdatei ausw hlen Daten werden im Unterordner data abgelegt in der linken Men leiste wird ein Icon hinzugef gt Symbol Erlenmeyerkolben Messen der Proben des Prozesses Icon anw hlen und Probe eingeben Log in sample Messen von infizierten Zellproben Mit dem ViCell k nnen auch Zellz hlungen von infizierten Kulturen gemacht werden Dabei sind folgende Besonderheiten zu beachten 8 Vor dem Messen die Schale mit gebrauchten Probengef en innen sowie die Abfallflasche entleeren Probengef e unter der Virusbank bef llen Nach dem Messen Schale in den Probengef Virusabfall entleeren und desinfizieren Inhalt der Abfallflasche in fl ssigen Virusabfall geben Enfernung von Microcarriern aus der Flusskammer Die Flusskammer hat eine H he von ca 100 um Daher k nnen sich Microcarrier die sich in den Proben befinden in der Kammer festsetzen Das kann zu ver nderten Messwerten f hren Um Microcarrier aus der Kammer zu entfernen folgende Prozedur durchf hren Probengef mit 2 5 mL verd nnter Natriumhypochlorid L sung 10 ig Sigma f llen und in die erste Position des Probentellers stellen 1 10 verd nnen 0 250 mL Natriumhypochlorid L sung 2 2
114. zur Bestimmung der intrazellul ren Metaboliten genommen Dieser Messpunkt entsprach somit dem letzten Probezeitpunkt aus dem vorangehenden Versuch in Kapitel 5 3 4 1 Anschlie end wurde PBS durch neues Zellkulturmedium GMEM Z ersetzt und die weiteren Proben genommen Auch f r dieses Experiment wurde eine logarithmisch skalierte Zeitachse zur Darstellung gew hlt da sich auch hier herausstellte dass die Dynamik zu Beginn des Experiments am h chsten war Abbildung 5 31 zeigt die Verl ufe der Konzentrationen einiger Metaboliten aus Glykolyse und Krebszyklus Die ersten drei Metaboliten der Glykolyse verhielten sich sehr hnlich Der erste Messwert noch vor der Medienzugabe lag sehr niedrig wobei der erste Messwert nach Zugabe des Medium bereits deutlich erh ht war W hrend G6P und F6P nicht gezeigt zwischen 0 5 min und etwa 5 min einen weiteren Anstieg zeigten war bei F16bP bereits nach 0 5 min der h chster Wert erreicht und es folgte ein konstanter Konzentrationsverlauf bis 30 min wonach ein minimales Abfallen der Konzentration eintrat F r die Konzentrationen von G6P und F6P schien sich direkt nach Erreichen des Maximums bei 5 min ein leichter Abfall bis zum Ende des Experiments anzuschlie en Wie bereits in Kapitel 5 3 4 1 waren die Verl ufe von 3PG und PEP nicht gezeigt entgegengesetzt zu den vorangehenden Metaboliten Der erste Messpunkt in PBS lag relativ hoch und bereits nach 0 5 min war die Konzentration deutlich abgefallen
115. zwei unterschiedliche Methoden der Bestimmung Adh rente Zellen mikroskopisch schwarz und trypsinierte Zellen mittels ViCell XR rot 87 dung 5 14 Streudiagramme f r die jeweils gleichzeitig gemessenen Konzentrationen von A Citrat und cis Aconitat und Pyruvat und F16bP nennen 101 dung 5 15 Korrelationsmatrix f r die Konzentrationen intrazellul rer Metaboliten und der Energy Charge basierend auf den Einzelmessungen aller Experimente 102 dung 5 16 Kreuzkorrelationsmatrix f r die Zusammenfassung der einzelnen Kreuzkorrelationsanalysen f r verschiedene Kultivierungen mit 4 106 dung 5 17 Schemata von Glykolyse und Krebszyklus und den farbkodierten Korrelationskoeffizienten zu den jeweiligen Metabolitpaaren f r Kultivierungen von 2 109 dung 5 18 Verl ufe der Zellzahl A des Gesamtzellvolumens B f r die zwei Medien GMEM Z Schwarz und Epse eee NH een Rea ME a aera cle 112 dung 5 19 Verl ufe von extra und intrazellul ren Metabolitkonzentrationen bei Kultivierung von MDCK Zellen in GMEM Z schwarz und EpiSerf ron 116 dung 5 20 Verl ufe der intrazellul ren Konzentrationen ausgew hlter Nukleotide und der Energy Charge bei Kultivierung von MDCK Zellen in GMEM Z schwarz und EpiSerf rot 122 dung 5 21 Kreuzkorrelationsmatrix f r Kultivierungen
116. 0 1 99 a KG 0 39 1 71 0 08 0 68 0 1 2 020 120 0 1 0 3 191 0 5 9 on 4 5 5 8 1881 Mal 0 38 2 57 0 06 1 78 0 55 0 85 85 1 110 0 35 45 191 PEP 0 00 0 06 0 01 0 02 0 333 129 0 50 2 00 0 05 0 84 17 800 02 02 04199 50 2 05 0 0 1 0 75 1191 R5P 0 00 0 16 0 04 0 08 0 647 ro Suc 0 11 1 28 0 07 0 81 0 1 0 3 1391 0 326 1291 lt 0 72 1881 UMP 0 39 1 44 0 15 0 43 0 03 171 171 UDP 0 01 0 12 0 03 0 09 Petes 8 E UDP 0 14 0 41 0 28 0 46 1 0 71 1 52 1237 GalNAc 0 1 2 196 178 UDP 191071 1 37 18 6 0 98 1 87 7 GleNAc 0 32 0 94 0 68 1 12 02 65 2 13 6 98 UDP Gle 0 33 1 22 0 43 1 03 0 13 1 64 27 02 2115 0 06 0 36 FA 171 ke um 1 26 2 88 199 UTP 0 89 3 80 1 15 4 35 032 266 1212 47 90 0 54 2 31 178 0 5 5 1191 0 98 2 78 50 0 75 0 95 T 1235 Energy 0 86 0 97 0 94 0 96 0 88 0 99 27 0 5 0 8771 nam um 0341096 Charge 0 4 0 95 151 0 96 Der Wertebereich der hier vorliegenden Arbeit entspricht dem Bereich zwischen den Maxima bzw Minima aus gegl tteten Werten von Batch Kultivierungen F r MDCK Zellen wurden die Versuche in GMEM Z und EpiSerf und f r Vero Zellen der Versuch in DMEM Glc Gln verwendet Um zellspezifische Mengen angeben zu k nnen erfolgte eine R ckrechnung aus den intrazellul ren Konzentrationen F r einige Literaturstellen wurden die Werte aus Diagrammen ausgelesen 5 Ergebnisse und Diskussion 169 Burgener et al bestimmten mehrere Nukleotide in einer Vero Zellkultur in Abh ngigkeit der Kul
117. 0 31 000 0 999 26 00 UV nh 1 0 014 6 0 750 19 500 0 999 19 50 Oxalacetat F ECD nh 1 0 100 7 0 500 15 500 0 989 13 00 3PG F ECD nh 1 0 137 7 0375 11 625 0 999 9 75 2PG F ECD nh 1 0 101 7 0 125 3 875 0 997 3 25 Citrat H ECD h 1 334 6 9 750 50 375 0 999 42 25 UV nh 1 0 046 6 0 125 3 250 0 999 325 UDP GalNAc F UV nh 1 0 036 7 0 250 7 750 1 000 6 50 Tsocitrat UDP GlcNAc F ECD nh 1 0 215 7 0 625 19 375 0 999 16 25 UDP GlcNAc F UV nh 1 0 072 7 0 500 15 500 1 000 13 00 PEP cis Aconitat F ECD nh t 0 109 7 0 250 7 750 0 999 6 50 cis Aconitat F UV h 1 0 044 7 0125 3 875 0 999 3 25 UMP UDP Glc F UV nh 1 0 046 7 0 375 11 625 1 000 9 75 UDP Glc H UV nh 1 0 137 7 0 250 7 750 0 999 6 50 trans Aconitat H ECD nh 1 0 108 7 0 125 3 875 0 995 325 ADP F UV nh 1 0 132 7 1 000 31 000 1 000 26 00 GMP H UV nh 1 0 019 7 0 125 3 875 0 999 3 25 F1 6bP F ECD nh 1 0 143 7 0375 11 625 0 999 9 75 H UV nh 0 038 7 0 125 3 875 0 999 325 UDP H UV nh 1 0 055 7 0 125 3 875 0 999 3 25 ATP F UV nh 1 0 249 7 1 250 38 750 1 000 32 50 GDP H UV nh 1 0 045 7 0 125 3 875 0 999 3 25 UTP F UV nh 0 043 7 0250 7 750 1 000 6 50 GTP F UV nh 1 0 026 7 0 125 3 875 1 000 3 25 20 uL Injektionsvolumen 8 Injektionen f r jede Standardkonzentration Daten berechnet aus der Peakfl che F oder Peakh he P Detektorsignal benutzt f r die Validierung lt Varianz f r den Bereich der Quantifizierung homogen h nicht homogen nh 4 genutzte Regressi
118. 00 0 00 0 00 10 2 CTP 0 00 0 00 o 52 0 00 0 000 00 0 00 0 00 0 00 0 00 00 0 00 0 00 1 00 0 00 00 o 09 000000000 000 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 81 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 000 00 0 00 0 00 7 0 Nukleotide 0 00 0 00 0 00 0 00 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 08 0 00 6100 000 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 UDP GalN Ado 200 00 0 00 0 00 0 00 0 20 0 00 6 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 009 0 00 0 00 000 290 000 0 38 000 000 0 00 0 00 0 00 0 00 foao 00 0 00 0 00 0 000 00 0 00 000 1 00 foio 0 00 0 000 00 0 00 0 00 1
119. 1 tration in die intrazellul re Probe bertragen w rden die tats chliche intrazellul re Konzentration deutlich h her gewesen als die der Kultivierungen in den anderen Medien Der Verlauf der intrazellul ren Citratkonzentration erschien vergleichsweise hnlich f r die verschiedenen Medien Allerdings waren insbesondere zu Beginn der Kultivierung h here Kon zentrationen f r die Medien mit Pyruvat und Glutamin gemessen worden als f r die beiden anderen Medien Eine m gliche Erkl rung w re dass diese beiden Substrate da sie ber den Krebszyklus abgebaut werden k nnen einen Anstieg der Citratkonzentration bewirken Somit w re die Erh hung des Flusses durch den Krebszyklus mit einem Konzentrationsanstieg von Citrat korreliert Allerdings sind die Unterschiede zwischen den Medien eher gering und es w re in weiteren Versuchen zu berpr fen ob hier eine Signifikanz vorliegt Ab etwa 24h lag die Citrat konzentration im Glutaminmedium unter der Konzentration in den beiden Medien mit Glucose Im Pyruvatmedium traten in dem Zeitraum zwischen etwa 30 70 h h here Konzentrationen als in den anderen Medien auf Auch f r diese Phase des Experiments k nnten die Substrate eine ent scheidende Rolle bei der Konzentration der intrazellul ren Zwischenprodukte gespielt haben Die Verl ufe von a Ketoglutarat und Malat zeigten wie auch f r Citrat die h chsten Anfangskonzentrationen f r das Medium mit Pyruvat Diese Beobachtung st t
120. 1 5 o2 A en 03 M 3 80 2 i Zeit min Zeit min Abbildung 5 28 Konzentrationsverl ufe intrazellul rer Metaboliten aus Glykolyse und Krebszyklus in MDCK Zellen in einem Zeitraum von 2 h nach dem Ersetzen des Zellkulturmediums durch PBS Aufgetragen sind relative Konzentrationen normiert auf den Anfangswert des jeweiligen Experiments Experiment 1 A Experiment 2 a Experiment 3 Um eine logarithmische Darstellung zu erm glichen wurde der erste Messpunkt vor dem Austausch des Mediums durch PBS auf einen Zeitpunkt t 0 03 min positioniert Wiederum ein anderes Verhalten im Konzentrationsverlauf war f r Citrat zu erkennen Ausgehend von einem relativ hohen Anfangswert fand innerhalb der ersten 2 min ein leichter Anstieg statt Danach fiel die Konzentration bis 5 min stark ab und es schloss sich ein Bereich mit nahezu konstanter Konzentration an Ein leichtes lokales Maximum war bei etwa 45 min zu erkennen Ein fast identisches Verhalten zeigten die Metaboliten cis Aconitat und Isocitrat Die beiden Metaboliten a Ketoglutarat und Succinat hnelten sich im Konzentrationsverlauf stark allerdings war der Verlauf von Succinat nicht gezeigt etwas verz gert verglichen mit a Ketoglutarat F r a Ketoglutarat war ein anf nglicher Abfall der Konzentrationen bis etwa 0 5 min zu verzeichnen gefolgt von einem Anstieg bis etwa 2 min Danach fiel der Wert bis 5 min wonach sich ein Plateau anschloss Nach 50min schien ein erneu
121. 1 1 y 0 0137x 0 0760 PEP MS 75 92 13 5 10 0 10 5 10 2 81 9 6 0 0905x 0 0122 PEP cis Aconitat LF 89 58 26 20 20 14 14 1 2 y 0 0110x 0 0179 Pyruvat MS 84 59 95 81 68 11 8 92 7 8 y 0 0880x 0 0036 Ribose 5 P MS 14 7 11 3 112 95 94 88 53 8 3 y 0 0707x 0 0192 Succinat MS 15 4 153 93 86 11 5 15 0 80 81 y 0 0903x 0 1422 UDP UV 103 26 09 09 13 07 0 6 0 9 y 0 0067x 0 0038 UDP GalNAc UV 32 6 26 1 10 1 68 43 40 4 7 4 8 y 0 0379x 0 0776 UDP GalNAc MS 22 3 21 1 19 7 14 0 13 0 14 2 11 2 13 2 y 0 1215x 0 0644 UDP Glc LF 50 20 13 1 6 1 2 1 0 08 056 0 0065 0 0143 UDP Glc MS 39 47 92 71 86 80 60 4 3 y 0 0525x 0 0540 UDP GIcNAc UV 30 12 06 1 0 10 08 0 9 0 4 y 0 0056x 0 0261 UDP GIcNAc MS 39 40 89 67 64 76 70 7 0 y 0 0702x 0 0044 UMP MS 45 41 91 89 102 76 68 7 5 y 0 0728x 0 0111 UMP UDP G UV 40 19 08 10 11 08 10 0 7 0 007 x 0 0156 UTP UV 15 14 06 08 10 08 1 0 0 8 0 0090x Die angegebene relative Standardabweichung entspricht dem Median der Werte der verschiedenen Messsequenzen f r jede Standardverd nnung Die relative Standardabweichung ist aus Gr nden der Anschaulichkeit gegeben Die letzte Spalte zeigt die Funktion zur Approximation der Standardabweichung Diese Funktion wurde durch lineare Regression nach dem minimalen fehlerquadrate Verfahren ermittelt Anhang Tabelle A 10 Zusammenfassung der Anpassung Summe der Fehlerquadrate f r die Ergebnisse der Optimierung gem dem fraktionellen f
122. 10 10 10 10 10 10 10 10 vo 10 10 10 10 10 10 10 anlag 10 10 3 Succinat 3 0 10 10 10 10 10 10 10 10 H10 1010 10 Ko 10 10 10 Ze Fumarat 10 10 10 10 10 bp 10 lun Sp 10 10 BB 10 10 10 10 10 Hol 7 10 4 10 10 10 10 10 6 10 Malat 10 10 10 10 10 1010 10 10 10 10 10 4 10 10 10 10 10 10 10 7 IRE 10 9 10 10 10 10 10 10 10 10 9 10 10 10 10 10 10 10 10 6 10 10 10 10 10 10 10 3 1010 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 hol EH 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 1 10 5 10 410 10 10 3 10 10 10 10 10 10 10 GMP 10E 10 10 10 10 10 10 8 10 10 0 0 10 10 10 0 10 1010 0 10 10 10 CDP 10 10 10 1010 10 10 10 10 10 UDP 10 10 10 10 10 10 10 10 210 10 10 10 ADP 10 10 10 1010 10 10 8 GDP H10 10 10 2 10 10 10 10 10 10 10 9 10 10 10 10 3 UTP 9 ATP Lag GTP UDP GalNAc UDP GIcNAc UDP Gic Energy Charge F10 10 10 Abbildung 5 21 Kreuzkorrelationsmatrix f r Kultivierungen von MDCK Zellen in GMEM Z Auf sowohl x als auch y Achse sind die Variablen aufgetragen welche miteinander kreuzkorreliert wurden Die Farben rot und blau deuten negative bzw positive Korrelationen an die Farbs ttigung deutet entsprechend der unter Abbildung 5 15 aufgef hrten Farbkodierung den Korrelationskoeffizienten r an die Zahlen in den entsprechenden Feldern stehen f r den zeitlichen Versatz h Dre
123. 10 2008 296 Quesney 2001 Characterization of Vero cell growth and death in bioreactor with serum containing and serum free media Cytotechnology 35 115 125 297 Kurano N Leist C Messi F Gandor C Kurano S Fiechter A 1990 Growth Kinetics of Chinese Hamster Ovary Cells in a Compact Loop Bioreactor 3 Selection and Characterization of an Anchorage Independent Subline and Medium Improvement Journal of Biotechnology 16 3 4 245 258 298 Aunins JG Henzler H J 1993 Aeration in Cell Culture Bioreactors In Stephanopoulos G editor Bioprocessing 2nd ed Weinheim u a VCH p 219 281 195 299 Stevens KM 1965 Oxygen requirements for liver cells in vitro Nature 206 980 199 300 Bock A 2009 Dissertation in Vorbereitung p 301 Lynch RM Balaban RS 1987 Energy Metabolism of Renal Cell Lines A6 and MDCK Regulation by Na K ATPase American Journal of Physiology 252 2 C225 C231 302 Kr mer 2007 Wachstum und Infektion adh renter Zellkulturen auf 2DMicroHex Microcarriern zur Influenzavirusproduktion Bachelorarbeit K then Hochschule Anhalt FH 303 Glaser G Giloh H Kasir J Gross M Mager J 1980 On the Mechanism of the Glucose Induced Atp Catabolism in Ascites Tumor Cells and Its Reversal by Pyruvate Biochemical Journal 192 3 793 800 304 Somsen OJG Hoeben MA Esgalhado E Snoep JL Visser D van der Heijden RTJM Heijnen JJ Westerhoff HV 2000 Glucose and the ATP paradox in yeast Bio
124. 15 5 20 4 5 4 3 5 UV Messung zur Bestimmung von makromolekularen Verunreinigungen Zur Bestimmung des Absorptionswertes der Extraktionsproben bei 280 nm wurde wie folgt vorgegangen Die nach der Probenvorbereitung getrockneten Proben wurden in Milli Q Wasser gel st und entweder unverd nnt oder verd nnt mit Milli Q Wasser je nach erwartetem Absorptionswert in 1 5 mL K vetten bei 280 nm gemessen Zum Nullwertabgleich wurde entweder mit Wasser verd nnter PCS angepasst an die Proben oder Zelllysereagenz des Lumineszenztests ebenfalls angepasst an die Proben gemessen Proben der Versuche in Kapitel 5 2 2 wurden vor den Messungen 1 4 verd nnt 4 3 6 Anionen Austausch Chromatographie zur Bestimmung intrazellul rer Metaboliten Alle chromatographischen Messungen wurden mit einer Anlage des Typs DX320 Dionex gem der gruppeninternen Arbeitsanweisung BioLC Anlage DX320 s Anhang durchgef hrt Kurz beschrieben wurde wie folgt gemessen Grunds tzlich wurde in zwei verschiedenen Konfigura tionen der Chromatographieanlage gemessen d h entweder mit oder ohne MS Detektor MSQ Plus Mass Detector Thermo Scientific F r beide Aufbauten war der Gebrauch der S ulen identisch Dabei fand die chromatographische Trennung auf einer Vors ule 11 und zwei analytischen S ulen in Serie AS11 statt Die Pumpe wurde mit einem Fluss von 0 35 mL min und der Suppressor bei einem Strom von 60 70 mA betrieben Die Temperatur des S ulenofen
125. 180 85 0 0090 9270 0820 0910 v6E AN da LLOL O XZ9LZ O Z LL ple Y6 28 88 ELL 891 98 0 9690 ESEO pezo L t SN p ewn4 sooo xgeiroo Alos z SE 09 EL 66 gcse 96 0 0650 SSE0 62 0 v6E AN 900 0 0 0 EOL BnL 96 ZOL 0 09 20 6010 800 9900 Je YSE SW d 9 esojom4 so90 0 xgso 0 Al6 6 28 OO 28 06 yez 96911 8 89 LIES 91 0 ZOZO LSE SN dP 9 esojon4 8900 19 29 9v 001 S ZE 98 01 86565 og 6 99 0 900 Bee 51 dp 9 esojom4 xezeo o Alo g ve de ve 92 Up 889 088 6022 2822 Gest 0260 v6E AN 9900 0 8910 091 91 gzz oZ get 0 8 8670 9980 6920 86 0 ZELKO 1800 L t AN 99 0 0 20 0 08 ve Ov Zr vs 6880 929 Z9LS 9098 LIZZ Loi v6E ddd INI 8820 0 xzosoo Aloo 88 98 26 26 81 9GrEL 6681 very 098 860 v6E SN aeo xsrrio klrs ESL STL 911 9 0L 602 620 900 gr n 1600 9100 9000 6 SW 5 2 000 0 xzszro Alrie Z LL zer ver LL 6190 OELLO 6800 900 9 00 1600 496 SN 4000 xzegoo Alrs Oo Eet OLL Oort ESL 820 oun 8ELO on 1600 Long P AN 1780 0 11200 06 ve SZ Le ES AS 8SE 09 819 16 OZZ 6Z ZrO ll 6982 v6E AN div xzerrio Alog LYLE O L 01 EZL 9890 op 9880 ZIEO 8610 v6E SN 9200 0 060 0 06 rot ot ZZL 88 1760 peso 6070 Coen 90 v6E AN seroo xrzsoo Ales 29 01 v9 99 Ar 865 Geer oer 16r 8 1 6880 v6E AN dav 1000
126. 1997 Cell cycle model to describe animal cell size variation and lag between cell number and biomass dynamics Biotechnology and Bioengineering 56 4 372 379 289 Frame KK Hu WS 1990 Cell volume measurement as an estimation of mammalian cell biomass Biotechnology and Bioengineering 36 2 191 197 290 Hess B Chance B 1961 Metabolic control mechanisms VI Chemical events after glucose addition to ascites tumor cells Journal of Biological Chemistry 236 239 246 291 Sonderhoff SA Kilburn DG Piret JM 1992 Analysis of mammalian viable cell biomass based on cellular ATP Biotechnology and Bioengineering 39 8 859 864 292 Iida Tanaka N Namekata I Tamura M Kawamata Y Kawanishi T Tanaka H 2008 Membrane labeled MDCK cells and confocal microscopy for the analyses of cellular volume and morphology Biological amp Pharmaceutical Bulletin 31 4 73 1 734 293 Rothen Rutishauser B Kramer SD Braun A Gunthert M Wunderli Allenspach H 1998 MDCK cell cultures as an epithelial in vitro model Cytoskeleton and tight junctions as indicators for the definition of age related stages by confocal microscopy Pharmaceutical Research 15 7 964 971 294 Erlinger S Saier MH 1982 Decrease in Protein Content and Cell Volume of Cultured Dog Kidney Epithelial Cells during Growth Importance for Transport Measurements In Vitro Journal of the Tissue Culture Association 18 3 196 202 295 BRENDA www brenda enzymes org Zugegriffen am 24
127. 2 Messungen von Extraktionsproben Handschuhe benutzen Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 e Die Messungen schlie en sich blicherweise an die Extraktion an d h nach dem L sen der Proben in 600 ul H20 Zentrifugieren und Pipettieren von 120 ul in kleine 150ul Vials werden die Proben in den Autosampler gestellt e Vor dem Starten einer Messsequenz wurde im Panel die Konzentration des Eluenten f r ca 5 min auf 100 mM gesetzt anschlie end f r weitere 5 min auf 0 mM um die S ule zu sp len e Zur rein optischen berpr fung der Qualit t der Messung f r sowohl Retentionszeiten als auch die Sensitivit t des MS Detektors wurden im Jahr 2007 meist vor und nach einer Messsequenz mehrere 005 und 055 Standards gel st in H20 gemessen e F r die Quantifizierung von Proben wurde eine Standardverd nnung angefertigt Dazu wurden 11 5 ml H20 0 5 ml PBS 0 5 ml Tricine 250 mM gemischt Davon 845 ul in jedes Vial gro e Vials 1500 ul pipettiert Anschlie end folgende Mengen an Standard Stockl sung zugegeben 0025 gt 2 5 pl 005 gt 5 030 gt 30 ul 055 gt 55 ul 080 gt 80 ul 105 gt 105 ul 130 gt 130 ul 155 gt 155 ul Anschlie end wurden alle Vials auf 1000 ul mit aufgef llt d h entsprechend der Differenz H20 zugegeben gt 152 5 150 125 e Proben im Programm eintragen 1 1 Vorgehen nach der Messung Datamanagement Die Messungen werden lokal auf die
128. 4 721 733 116 Barnabe N Butler M 1994 Effect of Temperature on Nucleotide Pools and Monoclonal Antibody Production in aMouse Hybridoma Biotechnology and Bioengineering 44 10 1235 1245 117 Grammatikos SI Tobien K Noe G Werner RG 1999 Monitoring of intracellular ribonucleotide pools is a powerful tool in the development and characterization of mammalian cell culture processes Biotechnology and Bioengineering 64 3 357 367 118 Wiechert W 2001 C metabolic flux analysis Metabolic Engineering 3 3 195 206 119 Zupke C Sinskey AJ Stephanopoulos G 1995 Intracellular flux analysis applied to the effect of dissolved oxygen on hybridomas Applied Microbiology and Biotechnology 44 1 2 27 36 120 Hofmann U Maier K Nicbel A Vacun G Reuss M Mauch K 2008 Identification of metabolic fluxes in hepatic cells from transient C 13 labeling experiments Part I Experimental observations Biotechnology and Bioengineering 100 2 344 354 121 Kell DB 2004 Metabolomics and systems biology making sense of the soup Current Opinion in Microbiology 7 3 296 307 122 Fiehn O 2002 Metabolomics the link between genotypes and phenotypes Plant Molecular Biology 48 1 2 155 171 123 Khoo SH Al Rubeai M 2007 Metabolomics as a complementary tool in cell culture Biotechnology and Applied Biochemistry 47 Pt 2 71 84 124 Oldiges M Lutz S Pflug S Schroer K Stein N Wiendahl C 2007 Metabolomics current state and evolving methodol
129. 5 1 1600 20 5 5 MeOH CHCI Level MeOH Vol uL Tricine Konz mM Kochen min 1 250 8 500 1 550 20 1100 Die verbleibenden Niveaus der Sternpunkte und des Zentrumspunktes 1 68 0 1 68 wurden berechnet wie in Abschnitt 3 5 3 erkl rt 4 4 4 Bestimmung der Wiederfindung F r die Ermittlung der Wiederfindung wurden entweder Sechs Well Platten ohne Zellbewuchs oder mit Zellen verwendet Erstgenannter Versuchsaufbau sollte zur Bestimmung der reinen chemisch physikalischen Verluste dienen Die Wiederfindungsbestimmung mit Zellen sollte die Frage kl ren ob s mtliche enzymatische Aktivit t w hrend und nach der Extraktion inhibiert ist Bei einigen Experimenten wurden zwei verschiedene Volumina der Standardl sung eingesetzt um zu berpr fen ob eine Konzentrationsabh ngigkeit der Wiederfindung besteht F r die Versuche ohne Zellen wurde der Standard direkt in die leeren Wells der Sechs Well Platten pipettiert Daran schloss sich die vollst ndige Probenvorbereitung an F r die Versuche mit Zellen wurde der Standard nach dem Waschschritt zu den Wells zugegeben und direkt mit der Extraktionsprozedur begonnen 4 5 Korrelationsanalyse In dieser Arbeit wurde das Korrelationsverhalten von verschiedenen Variablen untersucht Dies fand zum Teil in Form von Streudiagrammen statt aber der Gro teil dieser Auswertung wurde auf die Berechnung des Korrelationskoeffizienten beschr nkt Diese Berechnungen werden im weiteren Verlauf als
130. 5 3 3 E Malat a zloslels 1 1 5 6 alils CMP o 10 2 7 5 6 2 5 0 2 1 ala 5 5 2 6 7 7 2 4 6 4 2 8 7 8 2 3 5 1 4 3 5 2 5 7 2 0 2 1 3 5 1 3 0 6 1 5 6 25 Sl ofso 91 2 1 2 1 3 2 3 3 2 2 6 6 0 3 4 2 3 6 6 0 2 1 1 3 1 a 8 a 5 s 2 3 2 gt 7 2 5 10 10 4 5 1 2 51 7 5 10 9 2 3 5 3 3 1 9 o 5 2 4 2 1 3 GTP 1 2 1 7 3 3 2 2 o 0 1 0 3 2 UDP GalNAc 6 4 1 1 1 5 5 4 1 3 0 2 1 2 7 4 6 4 7 7 3 UDP GIcNAc 5 3 1 2 1 5 5 3 2 4 0 1 1 0 6 2 5 3 6 7 3 UDP GIc 4 6 8 4 gt e Biel 2 0 3 4 4 5 7 Energy Charge 7 ma s 6 4 3 8 6 2 s a 7 4 0 0 0 1 8 4 Abbildung 5 16 Kreuzkorrelationsmatrix f r die Zusammenfassung der einzelnen Kreuzkorrelationsanalysen f r verschiedene Kultivierungen mit MDCK Zellen Auf sowohl x als auch y Achse sind die Variablen extra und intrazellul re Metabolitkonzentrationen Zellzahl Gesamtzellvolumen und Energy Charge aufgetragen In den Feldern zwischen den Variablen sind die Kreuz korrelationskoeffizienten r farbkodiert blau positiv rot negativ s in Abbildung 5 15 und der Zeitverschiebungen h Zahl aufgetragen Die Werte f r r und t wurden so bestimmt dass der g
131. 5 mL Wasser Befehl Decontaminate im Men Instrument ausf hren dabei Anweisungen befolgen Die Reinigung dauert ca 13 Minuten Anschliessend kontrollieren ob die Flusskammer frei ist Instrument gt Live Image Die Option Live Image wieder deaktivieren Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 Arbeitsanweisung BioLC Anlage DX 320 Ms Ziel E 2 2 Verantwortliche 3 Messprinzip 4 Materialien dh _ BIOLEDX 320 nennen en ee 2 AD Weitere EE 5 3 DX 320 EE 5 5 1 Falls die Anlage lange Zeit au er Betrieb 5 5 2 Starten die DX 320 Anlage nach 7 DX 320 Anlage ausschalten ee 8 6 1 1 Anlage f r 2 bis 5 Stunden ausschalten 8 6 2 Anlage f r lange Zeit ausschalten mehr als 5 Stunden e 8 7 T gliche Pflepe det DX 320 Anl ge unesassnene nn sn 9 KE Typischer Routinebetrieb zasseasnneln sn anne na 9 Billy e 9 8 9 SAUEN OERE namen 10 835 Gradienten 10 84 Beitieb desIMS Detekt rs u sen eneuenens ae 11 5 Erstellen emer 12 8 6 Messungen von Estrakt onsproben ni iae 12 8 7 Vorgehen nach der Messing aretor
132. 500 mL 24h d h bei kompletter F llung 61 k nnen ca 10 Tage gemessen werden Ausreichend Wasser in der Flasche zur Regeneration des Suppressors Ausreichend MeOH H O f r Cone Wash vorhanden Ausreichend Fl ssigkeit in den Vials Druck an der Pumpe berpr fen ca 1900 bis 2800 psi am Anfang einer Probemessung Volumen der immer wieder verwendeten Standards und Wasser kontrollieren T glich Autosampler Probenst nder Kondenswasser entfernen Backup auf das Netz durchf hren Entsorgen der Probenflaschen von der gemessenen Sequenz 2 Typischer Routinebetrieb Handschuhe und Schutzbrille benutzen 2 1 Eluent Der Eluent wird automatisch durch den Eluentengenerator hergestellt D h es muss ausschlie lich nachgef llt werden Dazu gibt es eine 5 Liter Flasche Glas die ein Volumen von ca 6 l fasst Wenn die Flasche voll ist sind bei einem Volmenstrom von 0 35 ml min bis zu einem Restvolumen von ca 1 1 ca 10 Messtage m glich Die Flasche wird filtriertem H2O Milli Q 0 2 um bef llt Dies kann w hrend laufender Messungen erfolgen allerdings nur wenn das Restvolumen gt 11 ist da sonst die Gefahr besteht dass die Pumpe Luftblasen zieht Bei einem Restvolumen von lt 11 in der Flasche sollte die Pumpe gestoppt werden also nicht w hrend einer Messung Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 e Etwa einmal im Monat sollte das Wasser in der Flasche komplett gewechselt werden Dabei w
133. 59x 0 0271 AMP UV 46 30 18 15 1 6 1 3 17 1 8 0 0163 0 0008 AMP MS 80 79 93 82 78 80 67 8 2 y 0 0760x 0 0155 ATP UV 15 14 08 07 11 06 0 6 0 5 y 0 0054x 0 0379 CDP UV 114 60 22 20 14 13 1 6 1 1 0 0109 0 0080 CDP MS 80 10 9 84 7 4 10 0 122 98 11 1 y 0 1111x 0 0135 cis Aconitat MS 71 80 93 71 83 89 82 8 1 y 0 0827x 0 0002 Citrate MS 13 2 9 7 12 2 98 11 4 11 9 12 1 10 0 y 0 1092x 0 0557 Citrate CDP LF 37 27 12 14 13 10 1 2 1 0 y 0 0103x 0 0403 CMP UV 13 3 106 93 43 33 37 3 1 2 0 y 0 0200x 0 0262 CTP UV 84 64 15 09 1 1 08 08 1 0 y 0 0076x 0 0079 Fructose 1 6 bP LF 30 21 12 12 16 07 07 0 7 y 0 0065x 0 0436 Fructose 1 6 bP MS 41 62 86 77 74 67 69 9 2 y 0 0786x Fructose 6 P MS 61 76 90 76 78 87 64 7 7 0 0738x 0 0068 Fumarat UV 12 0 102 27 18 17 1 1 1 2 1 1 y 0 0083x 0 0235 Fumarat MS 91 86 84 11 1 97 97 64 5 4 0 0615x 0 0588 GDP UV 52 34 20 26 16 19 2 1 1 7 0 0175x 0 0054 Glucose 6 P LF 70 75 28 20 26 19 2 2 2 2 0 0204x 0 0061 Glucose 6 P MS 98 108 72 76 66 77 5 9 644 y 0 0626x 0 0127 GMP UV 88 80 16 14 1 2 06 11 0 7 0 0061x 0 0081 GMP MS 141 80 93 67 90 96 7 5 8 2 y 0 0820x 0 0031 GTP UV 58 36 09 06 1 0 08 07 0 5 y 0 0049 0 0136 Isocitrat MS 10 4 126 90 74 81 11 9 14 0 3 4 y 0 0055x 0 0177 a Ketoglutarat MS 72 77 79 83 10 3 12 3 84 7 1 y 0 0838x 0 0433 Malat MS 7 8 10 8 10 0 9 6 10 8 13 3 14 0 11 0 y 0 1214x Malat CMP LF 88 59 25 27 18 19 2 2
134. 70 Abbildung 5 7 Schema zur Optimierung der Methoden MeOH Kochen A und MeOH CHCI B mit den kritischen Schritten die genauer untersucht wurden 72 Abbildung 5 8 Optimierung der Methoden MeOH Kochen A und MeOH CHCI B gem der fraktionellen faktoriellen Versuchspl ne mit Hilfe des Prediction Profilers s a Tabelle 4 3 73 Abbildung 5 9 Optimierung der Methoden A und MeOH CHCI B gem des Central Composite Versuchsplans mit Hilfe des Prediction Profiler s a Tabelle 4 4 76 Abbildung 5 10 Vergleich der beiden Extraktionsmethoden f r MDCK Zellen A und Vero Zellen B f r die verschiedenen Metaboliten den Nukleotidgehalt die Absorption 280 nm und die Energy Charge 80 Abbildung 5 11 Schema der abschlieBend genutzten Methode der Probenvorbereitung nach den erforderlichen Modifikationen zur Vermeidung enzymatischer Aktivit ten 82 180 Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi Abbi dung 5 12 Beispielhafter Verlauf des mittleren Zelldurchmessers von MDCK Zellen nach Beginn der Trypsinierung A und w hrend der Kultivierung in Sechs Well Platten in GMEM Z B 86 dung 5 13 Histogramme f r Zellvolumina zu den Zeitpunkten 7 h 30 h und 55 h nach Zelleinsaat f r
135. AL 1998 Prinzipien der Biochemie Heidelberg u a Spektrum Akad Verl 1223 p Stryer L 1996 Biochemie Heidelberg u a Spektrum Akad Verl 1125 p Tree JA Richardson C Fooks AR Clegg JC Looby D 2001 Comparison of large scale mammalian cell culture systems with egg culture for the production of influenza virus A vaccine strains Vaccine 19 25 26 3444 3450 Audsley JM Tannock GA 2008 Cell based influenza vaccines progress to date Drugs 68 11 1483 91 Genzel Y Behrendt I Konig S Sann H Reichl U 2004 Metabolism of MDCK cells during cell growth and influenza virus production in large scale microcarrier culture Vaccine 22 17 18 2202 2208 Genzel Y Fischer M Reichl U 2006 Serum free influenza virus production avoiding washing steps and medium exchange in large scale microcarrier culture Vaccine 24 16 3261 3272 Robertson JS Cook P Attwell AM Williams SP 1995 Replicative advantage in tissue culture of egg adapted influenza virus over tissue culture derived virus Implications for vaccine manufacture Vaccine 13 16 1583 1588 Kistner O Barrett PN Mundt W Reiter M Schober Bendixen S Dorner F 1998 Development of a mammalian cell Vero derived candidate influenza virus vaccine Vaccine 16 9 10 960 968 Pau MG Ophorst C Koldijk MH Schouten G Mehtali M Uytdehaag F 2001 The human cell line PER C6 provides a new manufacturing system for the production of influenza vaccines Vaccine 19 17 19 2716 2721
136. ATP zeigte f r die beiden Medien leicht unterschiedliche Verl ufe wobei die Konzentration in GMEM Z insbesondere zu Beginn aber auch sonst ber weite Bereiche der Kultivierung unter der Konzentration in den Zellen in EpiSerf lag Allerdings war gerade am Anfang der Kultivierungen f r EpiSerf ein gro er Schwankungsbereich f r die drei einzelnen Versuche zu finden d h innerhalb der ersten 24 h wurden Konzentrationswerte von etwa 3000 bis 4500 uM gemessen Somit ist der anf ngliche Verlauf der ATP Konzentration in EpiSerf schwer zu 5 Ergebnisse und Diskussion 123 interpretieren Trotzdem scheint im Durchschnitt ein leichter Anstieg der Konzentration bis etwa 80h auf ca 4200 uM und im Anschluss ein Abfall auf etwa 3200 zum Ende der Kultivierungen stattgefunden zu haben F r die Kultivierung in GMEM Z zeigte sich zu Beginn ein klarer Anstieg der ATP Konzentration von etwa 2000 uM auf etwa 3500 uM bei etwa 78h Daraufhin folgte ein relativ konstanter Konzentrationsverlauf Als weiteres Triphosphonukleosid ist in Abbildung 5 20 CTP dargestellt Der Konzentrationsverlauf von CTP unterschied sich deutlich von ATP und war f r beide Medien relativ hnlich Nach einem anf nglichen Anstieg bis etwa 30 h wurde ein Maximum GMEM Z 450 uM EpiSerf 350 uM erreicht In den folgenden 40 50 h schloss sich ein Konzentrationsabfall bis auf einen Wert von 150 uM an Diese Konzentration war bis zum Ende der Kultivierungsdauer f r beide Medien relat
137. Abbildung 5 4 Standardabweichung A und relative Standardabweichung B f r die Metaboliten ATP gemessen per UV Detektion und Pyruvat gemessen per MS Detektion ber die Konzentration im Standard Die Punkte repr sentieren den Median der Standardabweichungen aus 16 Messsequenzen der jeweiligen Variablen bei der entsprechenden Standardkonzentration die jeweiligen Standardabweichungen wurden aus den 3 7 fach bestimmten Messungen jeder Sequenz ermittelt die Geraden in A deuten die lineare Absch tzung der Standardabweichung an 20 40 Konzentration uM In Tabelle A 9 im Anhang sind die relativen Standardabweichungen f r jede Standardkonzentration jeden Metaboliten und die entsprechenden Detektoren zusammengefasst Wie bereits in Abbildung 5 4 A beispielhaft angedeutet zeigten die meisten Metaboliten eine konzentrationsabh ngige Standardabweichung Dies u erte sich in einer vergleichsweise konstanten relativen Standardab weichung Abbildung 5 4 B F r die meisten Metaboliten wurde eine lineare positive Korrelation zwischen Standardabweichung und Konzentration gefunden Der Mittelwert der relativen Standardabweichung f r alle Konzentrationen alle Detektoren und alle Metaboliten war 5 9 Zur genaueren Analyse der Fehler kann eine Aufteilung nach Konzentrationen bzw Detektoren erfolgen In Tabelle 5 3 ist dies dargestellt Bei Betrachtung der relativen Standardabweichungen f r die einzelnen Detektoren zeigen sich klare Unter
138. Alge eg ce 8r LOL lors 091 281 6 0 9 0 ZOLO v6E An OVNIED ddn 6000 1600 89 80L 8L ZZL OSL S ZL Joren open ru on 1800 Er0 0 v6E An dan 6290 0 xssso o Alzi est 80L rt 89L 025 6906 sit LEI 1660 01 0 9220 v6E SN 800 0 6811 0 61 091 LZE 8 6 O 9E 8 08 9870 ZIZO EELO 2800 90 0 100 62 SN d S 98soqiy x szrio Alez OSL HEL IZL UEL 86 Cp 9609 L t GZ0 0801 6990 v6E SN 8600 0 500 11 26 6 9 8L 8890 98 0 9880 zen gen 6600 6 EN 1211009 5 2 49 2900 0 x9v60 0 001 ESL ger rr cat 80E 9890 0820 0 ZOO 2900 100 6E SN dad 9800 0 190 0 29 v9 99 29 91 vZ 1189 168 444Z Apel 2860 ron LSE 49000 XLELL O 80L ESL GLE 26 on 0898 ug ege 1022 Gel 1990 768 SN PPN xzozro Alez PLL YZL LEE GZ 86 21821 99 8962 1661 EE 6960 286 SN xrrzro Algis EZL ZZL 2 61 Cat eg 960 ELZO 90 EOLO troo 6000 6E SN 5 00 000 ge Of EE SE Sr 1 7098 E994 6295 E9ze EOSL v6E AN 9100 0 X60600 A 26 06 EL ESL ZOL SIL OLLO sun 600 400 Con 00 v6E SW 9000 6620 0 leg 08 EL ZZL FAL FOE 1610 6800 9900 Con 6800 zeng 06 An 2100 0 8260 0 A LOL ent et gu t ESZ Iert n ren LYLO 6 00 z0 0 09 SW d 9 8s09n 5 9110 0 2900 9 GOL YZL HLL 2 6560 9080 oun Soo Gr n ZL0 0 09 51 d 9 8s09n 5 41000 xessoo Al 9a Ov 29 29
139. Batch Kultivierungen gemessen Weiterhin konnte eine deutliche Abh ngigkeit verschiedener intrazellul rer Konzentrationen vom Zellkulturmedium festgestellt werden In Pulsexperimenten konnte ein deutlich unterschiedliches Antwortverhalten der intrazellul ren Konzentration f r verschiedene Metaboliten beobachtet werden Insbesondere die Zwischenprodukte der Glykolyse wiesen eine sehr schnelle Reaktion auf nderungen der Glucosekonzentration im Zellkultur berstand auf Anhand einer Korrelationsanalyse wurden Zusammenh nge zwischen den Konzentrationen verschiedener Metaboliten ermittelt Hierbei zeigte sich ganz deutlich dass f r jeden experimentellen Zustand ein individuelles Korrelationsmuster existierte Dennoch waren einige Metaboliten auch unter unterschiedlichen Bedingungen stets stark korreliert wie z B Zucker phosphate oder einige organische S uren Bei diesen Metabolitgruppen schien somit eine gemeinsame Regulation vorzuliegen Somit konnte mit dieser Arbeit durch die Entwicklung einer robusten und einfach anwendbaren Methode zur Quantifizierung von intrazellul ren Metabolitkonzentrationen ein wichtiger Beitrag zur Analyse des Stoffwechsels von adh renten tierischen Zellen geleistet werden Dar ber hinaus konnte mit dieser Methode eine Charakterisierung von MDCK und Vero Zellen anhand von Konzentrationen verschiedener Stoffwechselintermediate des Zentralstoffwechsels erreicht werden Abstract Animal cell cultures are
140. Bereich f r die Konusspannung von 35 70 V untersucht Nicht f r alle zu messenden Substanzen wurden SIM Kan le erzeugt da insbesondere f r Nukleotide mit h herer Konzentration die Quanti fizierung mittels UV Detektor deutlich robuster und genauer war Optimale Spannungen f r die jeweiligen Substanzen sowie die Zeitfenster in welchen die verschiedenen m z Werte gemessen wurden sind in Tabelle 5 2 zu sehen Trotz der ausgezeichneten Selektivit t des MS Detektors resultierten einige Metaboliten in den gleichen m z Fragmenten wie z GIP F6P FIP u a Da die hier genannten Metaboliten allerdings unterschiedliche Retentionszeiten auf der genutzten Chromatographies ule hatten war dieses Ph nomen f r m z 259 unproblematisch UDP Gle und UDP Gal hingegen besitzen die gleiche Masse und eluieren zur gleichen Zeit weshalb hier nicht unterschieden werden konnte Unabh ngig davon wurden in manchen SIM Kan len mehrere Substanzen detektiert wie aus Tabelle 5 2 ersichtlich ist Wie bereits oben erw hnt waren die Retentionszeiten der unterschiedlichen Substanzen im Langzeitbetrieb nicht konstant Daher musste der Gradient gelegentlich geringf gig ver ndert werden um eine Elution in dem aufgef hrten Fenster sicherzustellen In seltenen F llen wurden auch die Zeitfenster minimal an ein ver ndertes Retentionsverhalten angepasst Die Qualit t der Messungen mit dem MS Detektor wurde nicht mit Standards in Wasser wie f r die Chromato
141. Charakterisierung tierischer Zellkulturen anhand einer Quantifizierung intrazellul rer Metaboliten aus dem Zentralstoffwechsel Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktoringenieur Dr Ing von Diplom Ingenieur Joachim Bernhard Ritter geboren am 23 05 1977 in M nchen genehmigt durch die Fakult t f r Verfahrens und Systemtechnik der Otto von Guericke Universit t Magdeburg Gutachter Prof Dr Ing Udo Reichl Prof Dr Thomas Noll eingereicht am 11 08 2009 Promotionskolloquium am 07 04 2010 Forschungsberichte aus dem Max Planck Institut f r Dynamik komplexer technischer Systeme Band 27 Joachim Ritter Charakterisierung tierischer Zellkulturen anhand einer Quantifizierung intrazellul rer Metaboliten aus dem Zentralstoffwechsel Shaker Verlag Aachen 2010 Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie detaillierte bibliografische Daten sind im Internet ber http dnb d nb de abrufbar Zugl Magdeburg Univ Diss 2010 Copyright Shaker Verlag 2010 Alle Rechte auch das des auszugsweisen Nachdruckes der auszugsweisen oder vollst ndigen Wiedergabe der Speicherung in Datenverarbeitungs anlagen und der bersetzung vorbehalten Printed in Germany ISBN 978 3 8322 9197 6 ISSN 1439 4804 Shaker Verlag GmbH Postfach 101818 52018 Aachen Telefon 02407 9596 0 Te
142. Charge zeigte einen deutlichen Abfall ber die Zeit 156 5 Ergebnisse und Diskussion 50 En 0 95 z zo z d 5 093 50 5 lt 20 9 2 8 5 8 2 D 2 10 Si 5 0 so 0 89 r H 0 03 0 3 3 30 0 03 3 30 om 3 30 Zeit min Abbildung 5 32 Verl ufe der Konzentrationen von ATP und UDP GIcNAc sowie der Energy Charge in MDCK Zellen nach zweist ndiger Inkubation in PBS und anschlie ender Zugabe von neuem Zellkulturmedium GMEM Z Aufgetragen sind Konzentrationen im Well kein Bezug auf Zellzahl oder Zellvolumen um eine logarithmische Darstellung zu erm glichen wurde der erste Messwert direkt vor Zugabe des Mediums auf einen Zeitpunkt t 0 03 min positioniert a 5 ZS a EL Geese 5 2a 38028 T3 23553355 Geer EE EE 5 RSP E za2do2d 0 20 0 08 0 20 0 20 0 20 0 21 EI aal F1P 0 20 ig 0200 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 K929 0 20 0 20 0 G6P 20 0 200 20 0 20 0 20 0 2d 0 2010 20 0 2 g F6P 020Lo 2 200 20 L0 2d 0 201 0 20 0 20 0 20 0 201 EE 20 0 20 0 F16bP E 20 0 20 0 200 20 See E 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 0 20 x 3PG 020 0 SE ate E 2 gt 200 20 0 20 0 20 0 20 0 ER 20 0 20 0 200 20 0 20 0 0 2 Pyruv
143. DMEM mit verschiedenen 163 Abbildung 5 37 Korrelationsmatrix f r die Metabolitkonzentrationen f r MDCK Zellen nach zweist ndiger Inkubation in PBS und anschlie ender Zugabe von neuem Zellkulturmedium DMEM mit verschiedenen Supplementen EEN 164 182 Tabellenverzeichnis Tabelle 3 1 Exemplarische Tabelle f r die Varianzanalyse ANOVA f r einen Versuch mit einem fixen EE 30 Tabelle 3 2 Schematischer Aufbau einer Korrelationsmatrix rnnsrnnnennennnnennnnnnnnnnnnnennnnnnnnnnnsnnennnen 35 Tabelle 4 1 Validierte Messbereiche und relative Verfahrensstandardabweichung f r das Ger t Bioprofile f r die mit diesem Ger te quantifizierten extrazellul ren Metaboliten Validierungsmessungen vom 13 06 2006 23H SERA A A 40 Tabelle 4 2 Erl uterung der verschiedenen Angaben zu Metabolitmengen und konzentrationen 42 Tabelle 4 3 Zusammenfassung der Faktoren und Niveaus Level f r die fraktionellen faktoriellen Versuchspl ne zur Optimierung der Methoden MeOH Kochen A und MeOH CHClg 45 Tabelle 4 4 Zusammenfassung der Faktoren und Niveaus Level 1 und 1 f r den Central Composite Versuchsplan zur Optimierung der Methoden MeOH Kochen 1 Experiment A 2 Experiment B ee peter EDER 46 Tabelle 5 1 Zusammenfassung der ch
144. Die Dokumentation erfolgt ueber Tabellen mit den jeweiligen Farbcode und Kennnummern die in einem Ordner im Raum N 1 06 abgeheftet sind 8 0 Arbeitsblaetter 01 M 02 M 04 M 07 Z 107 Seite 3 von 3 Anhang Version 1 5 Erstellt am 29 03 2006 Aktualisiert am 08 08 2008 Autor J Schulze Horsel Kurzanleitung Zellz hlger t ViCell XR 1 Im Vorfeld zu beachten e Das Ger t darf nur nach Einweisung durch die daf r zust ndige Person bzw nach Absprache durch eine andere eingewiesene Person benutzt werden e Die zu messende Probe darf auf keinen Fall Microcarrier enthalten da sonst das Ger t verstopft wird e Validierter Messbereich f r Zelltyp 100 9 6 10 bis 1 0 10 Zellen mL Gesamtzellzahl 2 Material Originalprodukte von Beckman Coulter Nr 383260 Single Pack 250 Messungen Reagenzien plus Probengef e ca 240 Euro Nr 383194 Quad Pack 1000 Messungen 4x Single Pack ca 845 Euro Nr Probengef e ViCell Cups Die Probengef e k nnen gesp lt und mehrmals verwendet werden Die Komponenten des Reagenzienpacks sind entweder bereits vorhanden oder k nnen selbst hergestellt werden e Trypanblaul sung 0 4 Trypanblau und 0 15 mol L Natriumchlorid in vollentsalztem Wasser VE Wasser mit Papierfilter vorfiltriert anschliessend 0 45 um filtriert e Desinfektionsmittel Isopropanol 2 Propanol 90 e Reinigungsmittel Beckman Coulter Clenz Nr 8448222 5 Liter e Puf
145. Die gezeigten Kreuzkorrelationsmatrizen f r die beiden Medien Abbildung 5 21 und Abbildung 5 22 wiesen zahlreiche bereinstimmungen auf Grunds tzlich berwogen f r beide Medien die positiven Korrelationen blaue F rbung Wie bereits oben erw hnt s Abschnitt 5 3 2 1 schien das gleichartige Verhalten dieser korrelierenden Metaboliten durch einen bergeordneten Parameter wie z B die Stoffwechselaktivit t oder die Zellteilungsaktivit t reguliert gewesen zu sein Diese beiden Parameter sind typischerweise zu Beginn der Kultivierung hoch und am Ende niedrig Die f r beide Medien gleichartig korrelierenden Metaboliten sind gut in Abbildung 5 23 zu erkennen Ungef rbte Felder deuten Metabolitpaare an welche in beiden Medien ein sehr hnliches Korrelationsverhalten zeigten Grunds tzlich zeichnete sich dieses gleichartige Korrelationsverhal ten einiger Stoffwechselprodukte bereits in den zusammenfassenden Korrelationsmatrizen Abbildung 5 15 und Abbildung 5 16 ab Die dort nur gering korrelierenden Metaboliten wie 7 Pyruvat oder ATP wiesen auff lligen Differenzen zwischen den beiden Kultivierungen in GMEM Z und EpiSerf Abbildung 5 23 auf Da dort somit ein unterschiedliches Verhalten auftrat war ein uneinheitliches Verhalten bei der Zusammenfassung der Kultivierungen ein logischer Effekt Die Differenz der Kreuzkorrelationsanalysen der beiden Medien Abbildung 5 23 lieferte einen deutlichen berblick dar ber welche Metabo
146. Dieses Ph nomen wurde in der Vergangenheit f r Krebszellen beobachtet 18 29 3931 Allerdings fand dies in einem Zeitraum von wenigen Minuten statt Des Weiteren ist f r Hefen ein Ph nomen namens ATP Paradox bekannt welches besagt dass bei Glucose berschuss die intrazellul re ATP Konzentration erniedrigt ist verglichen mit einem Zustand der Glucoselimitation 1140 212 3041 142 5 Ergebnisse und Diskussion Besonders auff llig im Verlauf der Energy Charge war dass f r die beiden Medien mit Glucose die Werte der ersten drei Probenahmezeitpunkte deutlich unter den Werten der beiden Medien ohne Glucose lagen Der im Zusammenhang mit ATP erw hnte Aspekt der Phosphorilierung von Glucose als erster Schritt der Glykolyse k nnte zwar eine Rolle f r das Absinken in den Glucose Medien gespielt haben allerdings ist der Zeitraum ber welchen sich die erniedrigte Energy Charge erstreckte sehr lang gt 12 h Somit scheint ein regulatorischer Effekt deutlich plausibler Bis 24 h stieg die Energy Charge f r die Medien mit Glucose auf ein Niveau welches deutlich ber dem der beiden glucosefreien Medien lag Scheinbar wurde bis dahin das initiale Absinken der Energy Charge kompensiert Der Verlauf der Energy Charge ab etwa 70 h ist nahezu unbeeinflusst vom Medium Auch trotz des vollst ndigen Verbrauchs von Glucose und Glutamin f r die ent sprechenden Medien war kein Absinken der Energy Charge zu verzeichnen Als Ursache wird hier eine vermi
147. Einbau der S ulen ist auf die vorgegebenen Flussrichtung zu achten e F r den Fall eines unkontrollierten Druckanstieges kann es hilfreich sein nach gewisser Zeit die Fritten vor den S ulen zu wechseln Falls ein Wechsel der Fritte vor der Vors ule keine Verbesserung bringt empfiehlt es sich weitere Fritten der Logik entsprechend zu tauschen Zu beachten ist dass die S ulen vor dem Ausbau der Fritten gek hlt werden um ein Herausquellen des S ulenmaterials zu vermeiden e ATC S ulen Die ATC 3 S ule wurde im Verlauf der letzten 4 Jahre nie gewechselt oder gereinigt Die ATC HC S ule wurde mit NaOH 2M gegen die Laufrichtung gesp lt Dies kann durchgef hrt werden wenn die Basislinie nicht mehr stabil bleibt sondern zum Ende des Chromatogramms mit der KOH Konzentration im Eluenten ansteigt 1 2 Gradient e Die Entwicklung des Gradienten zur Messung von Proben f r die intrazellul ren Metabolite war ein iterativer Prozess aus der Identifizierung von Metabolitpeaks und der Ver nderung des Gradienten zur Verbesserung der Trennung Prinzipiell ist der Gradient steil in Bereichen des Chromatogramms in dem wenige keine oder uninteressante Substanzen eluieren und flach in Bereichen wo Substanzen sehr eng beieinander eluieren Zu ber cksichtigen ist hier allerdings dass die Totzeit bei der beschriebenen Anordnung ca 5 min betr gt d h dass nach ca 5 min die ersten Substanzen von der S ule eluieren im Ausschlussvolumen Somit g
148. Eine Absch tzung der Unterschiede zwischen den beiden Verfahren unter 5 1 1 5 basierend auf Standards und 5 2 5 basierend auf Extraktionsproben kann mithilfe der aus der Regression ermittelten Sch tzwerte erfolgen da dadurch gleiche Konzentrationswerte verglichen werden k nnen Entgegen den Erwartungen zeigte sich dass allerdings nicht grunds tzlich ein h herer Wert f r die mit Extraktionsproben ermittelte Standardabweichung s 5 2 5 vorzufinden war als f r die Werte der Bestimmung mit Standardmessungen s 5 1 1 5 Als m glicher Grund kann hier das Vorgehen zur Sch tzung der Standardabweichung angegeben werden Das hei t die einfache lineare Regression k nnte aus verschiedenen Gr nden fehlerbehaftet sein Eine Diskussion der Sch tzung der Varianz basierend auf einer Regression und alternativer Verfahren zur linearen Regression ist von Thompson bzw Stanley gegeben 1266 7671 Au erdem wurde f r die Extraktionsproben ein engerer Konzentrationsbereich niedrige Konzentrationen untersucht weshalb in diesem Bereich die Regression besser war Unabh ngig von diesen Aspekten kann angenommen werden dass eine realistische Sch tzung der Standardabweichungen f r die verschiedenen Metaboliten f r Extraktionsproben von in Sechs Well Platten kultivierten adh renten Zellen mit der in 5 2 5 ermittelten Gleichung erreicht wurde s Tabelle A 12 im Anhang Die ger tespezifische Variabilit t welche auch die Schwankungen von Tag z
149. Eine Tabelle mit der Angabe zur Art der Interpolation Spline oder Boltzmann Sigmoid und den Werten f r die Glattungsfaktoren 5 f r die gezeigten Versuche ist im Anhang gegeben Tabelle A 5 Weitere Details hierzu werden bei den einzelnen Experimenten im Abschnitt 5 3 gegeben Die erzeugten Konzentrationsverl ufe f r die unterschiedlichen Metaboliten wurden anschlie end kreuzkorreliert s Abschnitt 3 6 Es wurde somit f r jede Zeitverschiebung eine Korrelationskoeffizientenmatrix berechnet Aus diesem Satz von Matrizen wurde anschlie end f r jede Kombination der Metaboliten der Korrelationskoeffizient mit dem h chsten Betrag gesucht Diese Werte und die 48 4 Material und Methoden dazugeh renden Zeitverschiebungen wurden f r die Kreuzkorrelationsmatrizen in Abschnitt 5 3 verwendet F r die Zeitverschiebung r wurde ein maximaler Wert von 10 der Gesamtdauer des Versuchs erlaubt Die Verschiebung der Verl ufe erfolgte in diskreten Schritten Z B war f r die Kultivierungsversuche eine maximale Zeitverschiebung von 10h erlaubt und ein Verschiebungs schritt betrug 1 h 4 6 Pulsexperimente Die Kurzzeitexperimente wurden mit MDCK Zellen in Sechs Well Platten durchgef hrt Die Einsaatzelldichte betrug ca 2 x 10 Zellen Well Die Zellen wurden anschlie end bis in die sp te exponentielle Wachstumsphase in dem Medium GMEM Z kultiviert Das eigentliche Experiment wurde nicht unter sterilen Bedingungen durchgef hrt was bed
150. EpiSerfl Nach dem Erreichen des Maximalwertes folgte ein Abfall der Konzentrationen auf ca 250 uM GMEM Z bzw ca 50 uM EpiSerf nach etwa 70h Der im Schema der Glykolyse n chste gemessene Metabolit war 3PG Grunds tzlich waren sich die Konzentrationsverl ufe in beiden Medien wiederum sehr hnlich und beschrieben so wie die Stoffwechselintermediate vorher einen anf nglichen Anstieg der Konzentration und danach einen Abfall Allerdings wurde das Maximum f r beide Medien ca 120 uM deutlich sp ter erreicht ca 46 h als bei den Vorl ufermetaboliten Der Konzentrationsabfall war f r beide Medien etwa nach 78h abgeschlossen In beiden Medien war die Konzentration von 3PG zu diesem Zeitpunkt bei etwa 50 uM W hrend die Konzentration in GMEM Z im weiteren Verlauf konstant erschien fand in EpiSerf ein weiterer leichter Abfall der Konzentration statt Nach 198 h war die Konzentration auf etwa 30 uM abgesunken Die Konzentrationen von PEP zeigten eindeutig unterschiedliche Verl ufe verglichen mit vorangehenden Metaboliten Zwar fand zu Beginn der Kultivierung in beiden Medien ein Konzentrationsanstieg statt allerdings wurde das Maximum GMEM Z 18 uM EpiSerf 30 uM erst nach 60 70 h erreicht und insbesondere bei GMEM Z folgte daraufhin ein minimaler Abfall der Konzentration Ein Wert von etwa 15 uM lag zum Ende der Kultivierung vor F r die Kultivierung in EpiSerf folgte nach dem Erreichen des Maximums ein steter Abfall der Konzentration bi
151. Extraktion haben Erstens wurden s mtliche zu pipettierende Volumina aufgerundet so dass der Einsatz einer Multipipette m glich war Zweitens wurde f r die Methode MeOH CHC h das Volumen MeOH abgerundet da einerseits die Optimierung mittels des fraktionellen faktoriellen Versuchsplans ein niedriges Verh ltnis aus MeOH Puffer empfahl andererseits h tte ein h heres Volumen MeOH nicht mehr in dem zuvor untersuchten Bereich gelegen d h man h tte basierend auf einer Extrapolation diese Einstellung bernommen Drittens wurde f r die Methode MeOH Kochen die Kochdauer auf 5 5 min reduziert da sich in vorangegangenen Experimenten ein deutlicher negativer Einfluss der Kochdauer auf die Energy Charge gezeigt hatte die anderen Zielgr en aber nur geringf gig von der Kochdauer beeinflusst waren Somit wurden f r die Methode MeOH Kochen folgende Einstellungen f r die Einflussgr en genutzt 1100 uL MeOH 2 mM Tricine 900 uL Kochdauer von 5 5 min bei 90 C F r die Methode MeOH CHC wurden folgende Werte eingesetzt 700 uL 600 uL MeOH 4 mM Tricine 500 uL Zun chst wurde die Wiederfindung von Metaboliten f r beide Methoden getestet indem Metabolitstandards zu Wells ohne Zellen zugegeben wurde und anschlie end die beiden Extraktionsprozeduren durchgef hrt wurden Im einem folgenden Experiment wurden Zellen parallel mit beiden Methoden extrahiert und die Werte verglichen Zus tzlich wurden Zellen ext
152. Festplatte aufgezeichnet D h im Falle einer physikalischen Zerst rung der Festplatte w ren die Daten verloren Deshalb ist es wichtig nach Beendigung einer Messsequenz die Daten auf das Gruppenlaufwerk zu kopieren Die Rohdaten zu den Messungen ab September 2006 liegen in dem Ordner bio daten chromel dx320 die entsprechende Datenbank hei t dx320 net Zur Bearbeitung der Daten wurden auf einem lokalen Arbeitsplatzrechner einer weitere Datenbank erstellt Somit wurden die Rohdaten dann vom Netz Datenbank dx320 net in die lokale Datenbank auf dem Rechner 532 kopiert Datenbank 2007_05_dx320_local und dort bearbeitet Um bearbeitete Sequenzen von Rohdaten zu unterscheiden wurden an bearbeitete Dateien das K rzel _bearb angeh ngt Nach Abschluss der Bearbeitung wurden die bearbeiteten Dateien zus tzlich zu den Rohdaten in die Netzdatenbank dx320 net gespeichert Die lokale Auswertung wurde durchgef hrt um die Arbeitsg nge zu beschleunigen und den Datenverkehr im Netz zu minimieren Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 Auswertung der gemessenen Proben F r die Auswertung sind die meisten der Funktionen in der Werkzeugleiste n tig Folgende Abbildung gibt einen berblick Printer Layout Next Channel Baseline Full Size Integration Trend Next Sample Automatic Insert Pea Unzo
153. Gle 0 45 0 034 2 55 Gin 0 47 0 036 2 05 P Pyr 0 50 0 026 1 77 f r den Zeitraum von 22h 54h 0 24 48 be 120 5 Mittelwert der letzten drei Probenahmezeitpunkte Kultivierungszeit h Abbildung 5 24 Verl ufe der Zellzahlen A und Zusammenfassung der Startzellzahlen der maximalen spezifischen Wachstumsraten und maximalen Zellzahlen B bei Kultivierungen von MDCK Zellen in DMEM mit vier verschiedenen Wachstumssubstraten Medium mit 2 5 mM und 2 mM 0 Medium mit 2 5 mM x Medium mit Gln 2 mM A Medium mit Pyr 2 mM Sowohl maximale spezifische Wachstumsrate als auch maximale Zellzahl waren in dem Medium mit Glucose und Glutamin am h chsten F r die Kultivierungen mit den einzelnen Substraten Glucose und Glutamin waren die maximalen spezifischen Wachstumsraten nur gering unter schiedlich wobei aber die maximalen erreichten maximalen Zellzahlen im glucosehaltigen Medium deutlich h her lagen als in dem Medium mit Glutamin Die niedrigste maximale spezifische Wachstumsrate und maximale Zellzahl wurde in dem Medium mit Pyruvat erreicht In Abbildung 5 25 sind einige Verl ufe extra und intrazellul rer Metabolitkonzentrationen dargestellt Am Verlauf von Glucose ist zu erkennen dass dieses Substrat in den beiden glucosehaltigen Medien innerhalb von etwa 48 h verbraucht wurde Der Verlauf nach 48 h wird weiter unten diskutiert Der n chste dargestellte Verlauf zeigt die Konzentration von
154. Hypothese ist die niedrigere gemessene zellspezifische Lactatausscheidungsrate f r die Kultur in EpiSerf Medium Intermediate des Krebszyklus Die Metaboliten Citrat cis Aconitat und Isocitrat zeigten in beiden Medien ein vergleichbares Verhalten Interessanter Weise war der Konzentrationsabfall dieser Metaboliten im EpiSerf Medium gr er als in GMEM Z und dieser Abfall zog sich auch ber einen l ngeren Zeitraum hin Auffallend f r EpiSerf war dass eine hohe bereinstimmung der Konzentrationsverl ufe dieser Metaboliten mit dem von Pyruvat bestand Ob diese bereinstimmung mit einem gr eren Fluss von Pyruvat in den Krebszyklus bzw einer gemeinsamen Regulation dieser Metaboliten erkl rt werden kann bliebe in weiteren Versuchen zu kl ren Ebenso eine hohe hnlichkeit in den Ver laufskurven bestand f r Citrat cis Aconitat und Isocitrat mit der extrazellul ren Glutaminkon zentration f r beide Medien M glicherweise deutet dies einen regulatorischen Zusammenhang an Die Konzentrationen von a Ketoglutarat und Succinat zeigten wiederum f r beide Medien qualitativ hnliche Verl ufe Interessant sind die Konzentrationsverh ltnisse dieser Metaboliten in der Anfangsphase in den beiden Medien W hrend die Konzentration von a Ketoglutarat in EpiSerf ber der in GMEM Z lag war die Konzentration von Succinat in GMEM Z h her als in EpiSerf Diese Abh ngigkeit dieses Konzentrationsverh ltnisses deutet einen durch das Medium bedingten r
155. J oO E Abbildung 5 17 ae von Glykolyse und Krebszyklus und den farbkodierten Korrelations koeffizienten zu den jeweiligen Metabolitpaaren f r Kultivierungen von MDCK Zellen Dargestellt sind nur die Korrelationen zwischen aufeinanderfolgenden Metaboliten vgl Abbildung 5 16 Weiterhin zeigte sich dass einige Metaboliten aus demselben Stoffwechselweg ein berein stimmendes Verhalten ihrer Konzentrationsverl ufe aufwiesen Dies war grunds tzlich nicht berraschend da Metaboliten aus demselben Stoffwechselweg mitunter auch gemeinsam oder hnlich reguliert werden Zur Veranschaulichung der Ergebnisse sind in Abbildung 5 17 die Korrelationen f r die aufeinander folgenden Stoffwechselprodukte von Glykolyse und 5 und Krebszyklus gezeigt Insbesondere f r die Glykolyse wurde ein zweigeteiltes Verhaltensmuster vorgefunden W hrend der obere Abschnitt dieses Stoffwechselweges Hexosephosphate und R5P stark positiv miteinander korreliert waren konnte f r die Metaboliten des unteren Abschnitts kein 110 5 Ergebnisse und Diskussion einheitliches Korrelationsverhalten nachgewiesen werden Im Krebszyklus waren diejenigen Metaboliten stark korreliert welche wie bereits oben erw hnt entsprechend der Literatur durch sehr aktive Enzyme Aconitase Fumarase im Gleichgewicht stehen Besonders auff llig ist in Abbildung 5 16 das Korrelationsverhalten der Metaboliten 3PG PEP und Pyruvat Diese Stoffwechselprodukte wiesen fa
156. Kultivierungen dargestellt Bei Betrachtung der verschiedenen M glichkeiten der Darstellung f r die Metabolitbestimmung Metabolitkonzentration pro Well zellspezifische Metabolitmenge intrazellul re Konzentration ist zu erkennen dass die intrazellul re Konzentration im Well gemessene Metabolitmenge bezogen auf das Gesamtzellvolumen die beste Reproduzierbarkeit lieferte d h die Konzentrationen der Metaboliten bei verschiedenen Kultivierungen unter gleichen Bedingungen verhielten sich auch quantitativ hnlich Daten nicht gezeigt 5 2 7 Diskussion der etablierten Probenvorbereitungsmethode Wie sich in Vorversuchen zeigte Konnte keine in der Literatur beschriebene Methode zur Probenvorbereitung f r die Bestimmung intrazellul rer Metaboliten direkt f r die hier vorliegenden Versuchsbedingungen bernommen werden Aus diesem Grund war die Auswahl Adaption und Optimierung einer Methode zur Probenvorbereitung Voraussetzung f r die Charakterisierung von tierischen Zellen anhand intrazellul rer Stoffwechselprodukte Die zahlreichen Erkenntnisse aus Vorversuchen wurden als Grundlage f r eine systematische Untersuchung der Probenvorbereitung genutzt und es wurde ein mehrstufiger Prozess zur Identifizierung einer optimalen Probenvor bereitung unter den gegebenen Bedingungen durchgef hrt Das iterative Vorgehen der Versuchs planung und Auswertung erwies sich als u erst sinnvoll da so auf die erzielten Ergebnisse und die daraus gewon
157. MP UDP Glc UDP GalNAc 42 26 0 14 j j UDP Glc 43 01 0 15 j j UMP UDP Gal UDP GlcNAc 46 44 j j Isocitrat UMP 46 44 1 1 UDP Gal UDP Glc UTP 53 36 0 02 j j 52 5 Ergebnisse und Diskussion ad Tabelle 5 1 Mittlere Retentionszeit min aller Validierungsmessungen 56 ungef hre Retentionszeit f r alle Peaks die nicht validiert wurden eine Messung Fragm mehr als ein Peak wurde f r diese Substanz gefunden Fragmentierung H Standardabweichung min der Retentionszeit aus den Validierungsmessungen UV Absorption bei der entsprechenden Wellenl nge n nein j ja nicht getestet d Grund warum nicht in der Standardmischung nd nicht detektiert ns nicht stabil unter den chromatographischen Bedingungen ns nicht stabil unter alkalischen Bedingungen entsprechend 4 ko Koelution sq schlechte Quantifizierung verglichen mit anderen Methoden k rzlich identifiziert und bisher nicht dem Standard hinzugef gt Chemikalien die der Standardmischung zugesetzt sind In Tabelle A 7 im Anhang ist das Gradientenprogramm in Zahlen zusammengefasst Wie bereits oben erw hnt konnte keine vollst ndige Trennung aller Substanzen erreicht werden Allerdings konnten durch die Verwendung eines UV Detektors die Peakpaare getrennt quantifiziert werden bei welchen eine Substanz im UV absorbiert und eine nicht Um eine eindeutige Aussage bez glich der Peakreinheit zu erhalten wurde zu einem sp teren Zeitpunkt der Arbeit zu
158. MeOH Dennoch konnten unter den angelegten Kriterien der Optimierung anhand von vier Zielgr en Extraktionsbedingungen gefunden werden welche in weiteren Versuchen in guten Werten dieser Zielgr en resultieren sollten 5 Ergebnisse und Diskussion 77 Die hier gezeigten Versuche erlaubten eine detaillierte Charakterisierung der beiden Extraktionsmethoden bez glich ihrer Abh ngigkeit von den jeweils drei untersuchten Einflussgr en Basierend darauf wurden optimale Einstellungen f r beide Methoden gew hlt Grunds tzlich sollten somit zwei unabh ngig entwickelte gute Methoden f r die Extraktion von intrazellul ren Metaboliten aus adh renten Zellen bereitstehen Zur berpr fung dieser Hypothese wurde ein Vergleich der beiden Methoden vorgenommen 5 2 3 Experimenteller Vergleich der zwei optimierten Methoden Ein Vergleich der beiden optimierten Extraktionsmethoden basierend auf den bisherigen Ergebnissen erschien nicht zul ssig da insbesondere biologische Schwankungen zwischen den Versuchen h chstwahrscheinlich zu einer Fehlinterpretation gef hrt h tten F r den hier durchgef hrten Vergleich wurden die Einstellungen der Faktoren der beiden Methoden entsprechend den Ergebnissen der vorangegangenen Versuche genutzt Dabei wurden allerdings einige kleinere Ver nderungen aufgrund rationaler Entscheidungen eingef hrt Hierbei wurde davon ausgegangen dass diese Ver nderungen keinen signifikanten Einfluss auf das Ergebnis der
159. MeOH CHC MeOH Kochen Finale Methode Konz d Standards Gehalt pro Wiederfind SEM Gehaltpro Wiederfind SEM 9 Gehalt pro ee Zelle SEM Zelle ag Zelle asp EM IR 30 pl 70 wl fmol 30 pl 70 pl fmol 30 pl Standard Standard Standard Standard Standard 3PG 25 0 09 0 00 103 8 4 9 1023 12 0004001 91 4436 954 27 0 09 0 00 90 9 2 0 ADP 200 0 68 0 02 173 8 7 9 146 9 42 5 0 6640 01 1416454 131 1 2 7 0 5140 02 98 1 41 3 AMP 100 0 02 0 00 1032462 97 5 43 0034000 87 341 7 914 16 0 08 0 00 111 2 1 0 AMP Ribose 5 P 100 25 0 10 0 01 88449 82 844 2 0134000 748419 81 5 1 6 0 15 0 01 105 1 1 5 ATP 400 7 06 0 09 741461 73 7 27 6794008 655457 714 24 7 2240 10 98 3 43 7 CDP 25 0 02 0 00 153 847 6 1256443 0 06 0 00 126 146 0 121 9 3 5 0 02 0 00 98 4 1 9 cis Aconitat 25 0 104 8 4 7 95 4 1 4 0 90 4 1 9 90 6 0 9 0 94 5 3 8 Citrat CDP 335 25 0 89 0 03 1011 47 958 11 0864002 89 0 42 1 91 3 1 6 0 70 0 03 95 2 0 7 CMP 25 0 01 0 00 4890 60 7 43 8 0024000 512350 57 7 42 3 0 05 0 01 109 3 6 0 CTP 40 0 46 0 01 100 3 58 957 22 0444001 83 544 7 916 22 0 4420 01 96 4 4 7 Fructose 1 6 bP 228 0 43 0 02 94 3 44 7 95 041 1 0454003 818226 87 5 1 3 0 41 40 02 89 8 1 3 Fructose 6 P 35 0 02 0 00 90 6 43 73 8 27 0 0640 01 85 643 6 79 9 41 6 0 0340 00 84 0 11 Fumarat 50 0 12 001 101 445 0 94 5 67 0114000 98 8 11
160. Methoden untersucht 4 Bhattacharya et al 1995 charakterisierte Extrakte von coli mit einer AAC Methode DL Gewebeextrakte wurden von Vogt et al 1998 auf ihren Metabolitgehalt mittels AAC getestet wobei etwa 25 verschiedene Metaboliten wie z B Zuckerphosphate Nukleotide und organische S uren in einem 70 min tigen Chromatographielauf getrennt wurden Di Die Literatur zeigt dass die AAC eine Aufl sung von Extraktionsproben liefert die eine Analyse der wichtigsten und auch relativ hoch konzentrierten intrazellul ren Metaboliten erlaubt 3 3 3 Fl ssigchromatographie kombiniert mit Massenspektrometrie Detektion Wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben ist eine Analyse von relativ hoch konzentrierten Metaboliten aus dem Zentralstoffwechsel durch HPLC Methoden mit UV bzw Leitf hig keitsdetektion m glich Allerdings zeigte sich im Zuge der allgemeinen Verbesserung der Analytik 3 Theoretische Grundlagen 23 dass eine Vielzahl von Metaboliten die deutlich niedriger konzentriert in Extraktionsproben vorliegen nicht zu analysieren ist Insbesondere Probleme der Koelution aber auch der Sensitivit t der Methoden sind hierf r ausschlaggebend Aus diesem Grund finden mittlerweile MS Detektoren gro e Anwendung in der Analyse solch komplexer Probengemische Insbesondere im Feld Metabolomics scheint eine Analyse ohne MS Detektor nahezu unm glich 125 14 145 Eine h ufig eingesetzte Methode ist LC MS auch in Kombination mit e
161. NAc Gal XQOff XLOff x UDP NAc Glc QOff x Isocitrat XQuad x x PEP XQuad x x cis Aconitat XQuad x x UMP UDP G x XLOff x UMP XLOff x x UDP Glc XQOff x x ADP x LOff x GMP XQuad XQOff x Fructose 1 6 bP XQOff x Quad CTP x LOff x UDP x LOff x ATP x LOff x GDP x LOff x UTP x Lin x GTP x LOff x Lin lineare Regressionsfunktion durch den Ursprung LOff lineare Regressionsfunktion nicht durch den Ursprung XLOff lineare Regressionsfunktion nicht durch den Ursprung Gewichtung Konzentration Quad quadratische Regressionsfunktion durch den Ursprung QOff quadratische Regressionsfunktion nicht durch den Ursprung XQuad quadratische Regressionsfunktion durch den Ursprung Gewichtung 1 Konzentration XQOff quadratische Regressionsfunktion nicht durch den Ursprung Gewichtung 1 Konzentration Anhang Tabelle A 9 Sch tzung der Standardabweichung der chromatographischen Bestimmungsmethode f r die einzelnen Analyten und die verschiedenen Detektoren basierend auf den mehrfachbestimmten Messungen der Kalibrierstandards aus 16 Messsequenzen f r die einzelnen Standardverd nnungen 2 5 uL 25 155 0 uL 1550 auf 1000 0 uL Analyt Detektion Relative Standardabweichung Funktion zur Sch tzung 25 50 300 550 800 1050 1300 1550 der Standardabweichung 3PG LF 99 89 25 26 22 20 1 8 1 9 y 0 0167x 0 0081 3PG MS 71 73 95 92 10 8 11 2 81 7 4 y 0 0821x 0 0148 ADP UV 13 11 11 10 1 1 0 8 0 7 0 6 y 0 00
162. Nukleosiddiphosphate ca 70 h Im Anschluss war f r die meisten Kultivierungen ein konstantes Konzentrationsniveau bzw ein leichter Anstieg zu verzeichnen Das Beispiel von GDP deutet den eigentlichen Weg der Datenana lyse f r die durchgef hrten Experimente an Zuerst wurde die Korrelationsanalyse genutzt um eine Gruppierung der Konzentrationsverl ufe zu erm glichen bzw einen generellen berblick der Konzentrationsabl ufe zu erhalten Anschlie end wurden die einzelnen Gruppen auf die eigentlichen Verl ufe untersucht Beim Vergleich der beiden Medien bez glich ihrer zeitlichen Verschiebungen sind einige bereinstimmungen zu finden Unter anderem folgte in beiden Medien der Verlauf der Zellzahl dem Gesamtzellvolumen um 10 h Die Korrelationen der Zellzahl mit Glucose negativ und Lactat positiv hatten allerdings ihr Optimum bei einer zeitlichen Verschiebung von 10 h f r EpiSerf im Gegensatz zu 10 h f r GMEM Z Bei den Zuckerphosphaten zeigte sich wiederum ein hnliches Bild bei den Verl ufen f r die beiden Medien Allerdings durchlief der Metabolit FIP vor den anderen Zuckerphosphaten den f r diese Gruppe charakteristischen Verlauf bei Kultivierung in EpiSerf Weiterhin folgten F6P G6P F16bP und RSP Somit ging im Gegensatz zu GMEM Z der Verlauf von G6P dem von F16bP voraus 5 3 2 3 Kultivierung in DMEM Medium mit unterschiedlichen Substraten Nachdem in Abschnitt 5 3 2 2 der Einfluss von zwei stark unterschiedlichen Medie
163. P und GTP zeigten nur geringe Korrelationskoeffizienten zu anderen Metaboliten Grund hierf r k nnte die relativ konstante Konzentration dieser beiden Metaboliten ber die Kultivierungsdauer sein w hrend die meisten anderen Metaboliten deutliche Konzentrations nderungen durchliefen Insgesamt berwogen in dieser Matrix jedoch die positiven Korrelationen was sich besonders auff llig f r die intrazellul ren Metabolitkonzentrationen zeigte Grunds tzlich schien somit ein bergeordneter Parameter diese Konzentrationen ma gebend zu beeinflussen Mehrere m gliche Gr nde hierf r k nnen genannt werden Erstens k nnten die unterschiedlichen Metabolit konzentrationen direkt mit der metabolischen Aktivit t der Zellen korreliert gewesen sein Dies bedeutet dass zu Beginn der Kultivierungen eine hohe Stoffwechselaktivit t vorlag und im Laufe der Versuche diese Aktivit t sank So waren die zellspezifische Glucose und Glutaminaufnahmeraten stark negativ und die Lactat und Ammoniumausscheidungsrate stark positiv mit vielen Metaboliten insbesondere den Zuckerphosphaten und einigen organischen S uren korreliert nicht gezeigt Somit waren diese Raten hoch wenn auch die intrazellul ren Konzentrationen hoch waren Zweitens k nnte durch die unterschiedliche Zellzyklusphasenverteilung ber die Kultivierungs dauer ein f r alle Metaboliten einheitlicher Einfluss auf die Konzentrationen ber die Kultivierung bedingt gewesen sein F r Hef
164. Pac PAl S ule Dionex mit gepulster amperometrischer Detektion etabliert werden wie schon mehrfach in der Literatur beschrieben 34 38 Anlage ist ein Typ Bio LC DX600 Dionex s Abschnitt 4 3 6 Die hierf r genutzte Durch die Kombination der beiden Chromatographiemethoden sollte eine Aufkl rung der intrazellul ren Konzentrationen eines Gro teils der Metaboliten aus der Glykolyse und dem Krebszyklus sowie von Nukleotiden in kultivierten tierischen Zellen realisiert werden Der zweite notwendige Meilenstein dieser Arbeit war die Identifizierung einer geeigneten Methode zur Probenvorbereitung f r die Messung von intrazellul ren Metaboliten Trotz der zahlreichen Untersuchungen zur Extraktion von unterschiedlichen Stoffklassen aus verschiedenen Organismen s Abschnitt 3 4 konnte in der Literatur keine detaillierte Studie zur Probenvorbereitung f r kultivierte tierische Zellen zu den Metaboliten des Zentralstoffwechsels gefunden werden Wie aber die Literatur zu Hefen und Prokaryonten zeigte ist eine genaue Charakterisierung und Optimierung 2 Motivation 7 der Probenvorbereitung unerl sslich wenn zuverl ssig intrazellul re Daten f r Metabolic Profiling oder Metabolomics Studien gemessen werden sollen Zus tzlich waren f r die hier durchgef hrte Arbeit spezielle Anforderungen zu ber cksichtigen Da das Interesse auf den Metaboliten des Zentralstoffwechsels lag war die Probenvorbereitung f r ein weites Feld von unterschi
165. Platten in GMEM Z B Bestimmung mit Hilfe des Ger tes ViCell XR der mittlere Durchmesser ist ein direktes Resultat der Zellzahlbestimmung mit dem Ger t ViCell XR und wird durch Berechnung des Mittelwertes der einzelnen gemessenen Zelldurchmesser ermittelt f r den Kultivierungsverlauf B wurde eine Trypsinierungsdauer von 30 min verwendet Da nicht auszuschlie en war dass durch die Trypsinierung der Zellen ein systematischer Fehler bei der Volumenbestimmung gemacht wurde sollte mittels Membranf rbung und konfokaler Mikroskopie ein Vermessen der Zellen im adh renten Zustand erfolgen Parallel dazu wurde f r identisch kultivierte Zellen mit Hilfe des ViCellXR das Volumen im trypsinierten Zustand bestimmt Mikroskopisch konnten nur die Zeitpunkte 7 h 30h und 55 h ausgewertet werden da sp tere Zeitpunkte im konfluenten Zustand keine Unterscheidung der Membranen unterschied licher Zellen zulie en F r jeden dieser drei Zust nde wurden 50 Zellen mikroskopisch vermessen 5 Ergebnisse und Diskussion 87 Die hieraus ermittelte Volumenverteilung wie auch die mittels des ViCell XR ermittelte Verteilung sind in Abbildung 5 13 dargestellt 40 7h m trypsiniert 30 10 o _ 40 30h 30 L 10 m 40 55 30 20 0 1 3 5 T 9 11 13 15 17 Zellvolumen in Klassen um x 1000 Anteil der Zellen der jeweiligen Volumenklasse Abbildung 5 13 Hi
166. Suppressor mit dem chromatographischen System verbinden Bei starken Verschmutzungen den Suppressor mit Isopropanol verd nnt 1 10 sp len e Stark verschobene Retentionszeiten gt Ist der Gradient der richtige gt Funktioniert der Eluentengenerator gt Ist der Druck konstant gt Falls dies Punkte ok sind ist wahrscheinlich die S ule ver ndert Somit muss wahrscheinlich der Gradient ver ndert werden um zu gew hrleisten dass insbesondere die entsprechenden Metabolite in den zugeordneten Fenstern f r die MS Detektion eluieren e Basislinie bei Leitf higkeit steigt entsprechend des Gradienten an Anhang 01 07 2008 zech D gt Ca 2 3x H20 oder Blank oder Std messen gt Ver ndererung Falls ja weitere ca 10 Proben messen da Suppressor richtig eingefahren werden muss Falls nein AXP S ulen mit 2M NaOH oder KOH sp len 50 100 ml evtl aber auch Suppressor defekt e Schwankungen in der Basislinie im UV gt Evtl defekte UV Lampe gt Diagnostic Test am Detektorpanel durchf hren Pumpendruck zu hoch gt Fritten vor S ulen wechseln zuerst Vors ule usw e Druck nicht konstant gt evtl Luft injeziert evtl Injektionsvolumen nicht richtig ausgelitert evtl Probe verunreinigt kontaminiert e Leck am Suppressor gt Druck nach S ulen berpr fen Suppressor ist auf der Niederdruckseite und max 30 psi sollten anliegen manchmal geht der Suppressor aber einfach kaputt Files abspeich
167. T Silva MCAE Sola Penna M Da Poian AT 2004 Mayaro virus infection alters glucose metabolism in cultured cells through activation of the enzyme 6 phosphofructo 1 kinase Molecular and Cellular Biochemistry 266 1 2 191 198 184 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 Olejnik AM Czaczyk K Marecik R Grajek W Jankowski T 2004 Monitoring the progress of infection and recombinant protein production in insect cell cultures using intracellular ATP measurement Applied Microbiology and Biotechnology 65 1 18 24 Zamaraeva MV Sabirov RZ Maeno E Ando Akatsuka Y Bessonova SV Okada Y 2005 Cells die with increased cytosolic ATP during apoptosis a bioluminescence study with intracellular luciferase Cell Death and Differentiation 12 11 1390 1397 Munger J Bajad SU Coller HA Shenk T Rabinowitz JD 2006 Dynamics of the cellular metabolome during human cytomegalovirus infection PLoS Pathogens 2 12 e132 Munger J Bennett BD Parikh A Feng XJ McArdle J Rabitz HA Shenk T Rabinowitz JD 2008 Systems level metabolic flux profiling identifies fatty acid synthesis as a target for antiviral therapy Nature Biotechnology 26 10 1179 86 Bhattacharya M Fuhrman L Ingram A Nickerson KW Conway T 1995 Single run separation and detection of multiple metabolic intermediates by anion exchange high performance liquid chromatography and
168. TP stattfand Der entscheidende Schritt war die Zugabe von MeOH CHCI 2 1 V V zu einem fr hen Zeitpunkt wodurch f r Nukleotide die Wiederfindungen deutlich n her bei 100 lagen als bei den beiden zuvor optimierten Methoden s Abschnitt 5 2 3 Tabelle 5 4 Weiterhin war es wichtig dass keine zu hohen CHC Konzentrationen Verh ltnis von MeOH CHCI gt 2 1 V V eingesetzt wurden da so eine Phasentrennung in den Wells vermieden werden konnte Andernfalls fand ein L sungsmittel vermitteltes Aufl sen der Sechs Well Platte statt Der Kochschritt war n tig da bei diesen Proben 5 Ergebnisse und Diskussion 83 eine weitere jedoch andere enzymatische Aktivit t bemerkt wurde Diese Aktivit t bewirkte eine deutliche Umsetzung von ATP zu ADP und AMP und tauchte nach dem L sen der Proben also in w ssriger Phase w hrend der Wartezeiten im Autosampler bei 4 C auf In Vorversuchen war diese Aktivit t bereits aufgefallen Da aber solch eine Umsetzung die Energy Charge vermindert und eine maximale Energy Charge als Optimierungskriterium eingesetzt wurde wurde darauf kein besonderes Augenmerk gelegt Es wurde davon ausgegangen dass die Optimierung automatisch zu einer Methode f hrt die diesbez gliche nicht anf llig ist In den beiden unter 5 2 2 2 optimierten Methoden konnte diese Enzymaktivit t nicht nachgewiesen werden Aber nach der fr heren Zugabe von CHCl trat diese Aktivit t wieder auf Durch den Kochschritt
169. TP und UTP auff llig Der detaillierte Vergleich von Kultivierungen von MDCK Zellen in verschiedenen Medien serumhaltig und serumfrei Medium mit unterschiedlichen Substraten Glc Glc Gln Gln Pyr zeigte deutliche qualitative und quantitative Unterschiede in sowohl Zellwachstum als auch extra und intrazellul ren Konzentrationsverl ufen Die unterschiedliche Medienzusammensetzung resultierte somit in einem voneinander abweichenden Stoffwechsel der Zellen F r Medien mit Glucose konnte gezeigt werden dass die ersten Zwischenprodukte der Glykolyse G6P F6P und F16bP ein qualitativ hnliches Konzentrationsverhalten aufwiesen F r 3PG PEP und Pyruvat allerdings wurden hiervon deutlich unterschiedliche Konzentrationsverl ufe gemessen Dies deutet auf eine Regulation im Anschluss an die Phosphofructokinase hin Auch f r die Intermediate des Krebszyklus waren unabh ngig vom Medium grunds tzlich hnliche qualitative Tendenzen in den Verl ufen zu erkennen Allerdings waren die Konzentrationen mitunter deutlich verschieden so schien die intrazellul re Malatkonzentration unter anderem von der extrazellul ren Glutaminkon zentration abh ngig zu sein F r den Vergleich von serumhaltigem zu serumfreien Medium war auff llig dass einige Konzentrationsverh ltnisse zwischen auf einander folgenden Metaboliten eine Abh ngigkeit vom Medium zeigten wie z B Succinat und Fumarat Auch dies deutet auf einen ver nderten Stoffwechsel hin Des Weiteren
170. UDP aktivierten Hexosen dienen Im n chsten Schritt der Glykolyse wird F6P unter dem Verbrauch von ATP in Fructose 1 6 Bisphosphat 1 umgesetzt Diese Reaktion wird katalysiert durch das Enzym Phospho fructokinase EC 2 7 1 11 und ist thermodynamisch nahezu irreversibel F r viele Gewebearten 12 3 Theoretische Grundlagen und Zelllinien spielt dieses Enzym eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Glykolyse UI Die Phosphofructokinase wird durch ATP allosterisch gehemmt wobei dieser Effekt durch hohe Konzentrationen an Adenosinmonophosphat AMP aufgehoben werden kann Ein weiterer regulatorischer Effekt ist die pH Abh ngigkeit dieses Enzyms was bedeutet dass bei einem niedrigen pH Wert die Aktivit t des Enzyms vermindert ist Durch Citrat wird eine Hemmung der Phosphofructokinase bewirkt Als Aktivator ist Fructose 2 6 Bisphosphat zu nennen Dieser Metabolit erh ht durch einen allosterischen Effekt die Affinit t der Phosphofructokinase zu dem Substrat F6P In diversen Untersuchungen mit schnell proliferierenden Zellen konnte die Phosphofructokinase durch unterschiedlichste Formen der Stimulation aktiviert werden wie z B Infektion mit Tumorviren oder die Zugabe von Serum bzw Wachstumsfaktoren 1871 Im n chsten Schritt der Glykolyse wird F16bP in einer reversiblen Reaktion durch das Enzym Aldolase EC 4 1 2 13 in Dihydroxyaceton Phosphat DHAP und GAP gespalten Diese beiden C3 K rper k nnen durch das E
171. UTP ATP GTP 5 0 0 0 00 0 00 F1Ploo0 GEP o00 o 19 0 000 00 0 00 o 23 000 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 000 0 00 0 00 0 00 o 00 0 00 0 00 0 00 0 67 8 0 00 0 00 0 00 000 5 100 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 01 0 77 0 01 0 00 0 00 0 13 0 00 0 00 0 00 0 02 0 00 0 01 0 00 0 00 0 00 0 00 0 06 0 12 0 05 FGP 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 87 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 o 00 0 00 0 00 0 00 o 00 0 00 0 00 0 00 0 00 00000 0 00 16 0 03 0 00 o 00 0 00 0 00 0 00 0 00 10 00 0 00 0 00 00 0 00 0 00 0 000 00 0 00 0 00 0 00 0 00 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 57 0 12 0 07 0 00 0 44 0 00 0 00 0 00 Glykolyse 0 67 0 0 0 57 00 0 00 0 00 0 00 o 00 0 03 f
172. Versuchs an Aa Konz F16bP uM gt a o N o o D D a D 0 8 Konz G6P uM 0 4 p o u D oSAIOO IEN Konz a KG uM a N a 1 0 Krebs zyklus 05 0 5 Konz 3PG uM Konz Mal uM 0 0 1 2 0 8 Konz Citr uM Konz Pyr uM 0 4 a3 f 0 0 f 0 03 0 3 3 30 0 03 30 Zeit min OF eit min Abbildung 5 31 Verl ufe von intrazellul ren Metabolitkonzentrationen aus Glykolyse und Krebszyklus in MDCK Zellen nach zweist ndiger Inkubation in PBS und anschlie ender Zugabe von neuem Zellkulturmedium GMEM Z Aufgetragen sind Konzentrationen im Well kein Bezug auf Zellzahl oder Zellvolumen um eine logarithmische Darstellung zu erm glichen wurde der erste Messwert direkt vor Zugabe des Mediums auf einen Zeitpunkt t 0 03 min positioniert Abbildung 5 32 zeigt die Verl ufe der Konzentrationen von ATP UDP GlcNAc und der Energy Charge Die Konzentrations nderungen f r Nukleotide und Zuckernukleotide waren geringer als f r die in Abbildung 5 31 gezeigten Metaboliten W hrend ATP einen leichten gleichm igen Konzentrationsabfall aufwies war bei den anderen Nukleotiden ein Anstieg der Konzentration zu verzeichnen F r Nukleosidmonophosphate nicht gezeigt schien dabei in den ersten 2 min der Wert relativ konstant zu sein Anschlie end nahmen die Konzentrationen bis zum Ende des Versuchs zu Die Energy
173. Werkbank 15min vor Arbeitsbeginn einschalten desinfizieren Pipetten Pipettierhilfe und Medium desinfizieren und in die Sterilbank stellen Handschuhe anziehen und desinfizieren unter Sterilbank Medium in die Zellkulturflasche pipettieren oder gie en 20 ml in eine T25 Flasche 50 ml in eine T75 Flasche Zellen aus dem Stickstoffbeh lter holen mit Schutzkleidung und schnell auftauen Gefriermittel DMSO ist toxisch Die Zellen m ssen m glichst schnell aufgetaut werden und in das Medium zur Verd nnung berf hrt werden Kryor hrchen nicht ber Kopf sch tteln Kontaminationsgefahr Kryor hrchen sofort nach dem Schmelzen des letzten Eiskl mpchen von au en desinfizieren und unter die Werkbank stellen den Inhalt mit einer geeigneten Pipette in die Kulturflasche berf hren die Kulturflasche sollte mind 20 ml Medium enthalten um das DMSO ausreichend zu verd nnen bei Problemen w hrend der Anzucht 1 nach dem Anheften der Zellen ca 4 12 h einen Mediumwechsel durchf hren um das DMSO aus der Kultur zu entfernen siehe Arbeitsanweisung Z 03 oder 2 gerade aufgetaute Zellen in ein mit 40 ml Medium 37 C gef lltes 50 ml Falkongef berf hren in der Zentrifuge bei 500 x g Zellen 5 min bei Raumtemperatur abzentrifugieren Medium abpipettieren und Zellen in einem geeigneten Volumen Bsp 50 ml Medium aufnehmen und in die Zellkulturflasche berf hren Bsp T75 Seite 1 von 1 Anhang Z_04_Passagi
174. Zusammenfassend kann festgehalten werden dass einige Bl cke von Metaboliten auftraten die auch in vermeintlichen metabolischen Bl cken zusammen gefasst sind Z B korrelierten die Intermediate des Eingangsabschnittes der Glykolyse Hexosephosphate miteinander oder auch einige Stoffwechselprodukte des Krebszyklus waren miteinander verkn pft Dar ber hinaus waren auch die Metabolitpaare die in Abbildung 5 15 stark korrelierten f r die hier gezeigte Kreuzkorrelationsanalyse der Kultivierungen mit MDCK Zellen gut korreliert Allerdings berstiegen mitunter die Korrelationskoeffizienten der paarweisen 108 5 Ergebnisse und Diskussion Korrelation aus 5 3 1 ADP GDP r 0 92 ATP GTP r 0 91 die Werte der Korrelations koeffizienten dieser Auswertung ADP GDP r 0 75 ATP GTP r 0 77 Diskussion Diese Art der Auswertung wurde durchgef hrt um allgemein g ltige Aussagen zu Zusammen h ngen zwischen Metabolitkonzentrationen f r Batch Kultivierungen mit MDCK Zellen treffen zu k nnen Bei der vorangegangenen Korrelationsanalyse ohne Zeitverschiebung aller Einzel messungen aus Abschnitt 5 3 1 wurden nur wenige hohe Korrelationen zwischen Metaboliten gefunden s Abbildung 5 15 Wie oben bereits erw hnt war ein m glicher Grund dass mitunter sehr unterschiedliche Experimente und Kultivierungszust nde zusammengefasst wurden weshalb auch kein einheitliches Korrelationsverhalten f r eine gr ere Anzahl von Metaboliten zu erwart
175. a eii aii E a 13 NNEN 15 10 Files abspeichern und auf CD brennen usrsersessssenssonsnonnesnenonnonnuonsnonseronsnnnenenennn 16 10 1 Files als cmb abspeichern zum Verschicken zu 1 16 10 2 Piles als xls abspei Chern ria 16 10 3 Daten auf RTE E 16 Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 1 Ziel Chromatographischen Trennung von organischen S uren und anionischer Salze in Mediumproben sowie Bestimmung der intrazellul ren Konzentrationen von organischen S uren Zuckerphosphaten und Nukleotiden in tierischen Zellen und Mikroorganismen 2 Verantwortliche Dr Yvonne Genzel Joachim Ritter Susanne K nig 3 Messprinzip Entsprechend ihrer Ladung werden Anionen unterschiedlich lange auf der Chromatographies ule zur ckgehalten Die Elution erfolgt mit KOH bis max 100 mM Die Leitf higkeitsdetektion erm glicht die Detektion von Anionen aller Art wohingegen bei UV Detektion vor allem Nukleotide aber auch einige organische S uren gemessen werden k nnen Details zur Detektion werden weiter unten gegeben Zus tzlich besteht die M glichkeit mit Hilfe eines MS Detektors molek lspezifische Ionen zu detektieren 4 Materialien 4 1 BioLC DX 320 Die DX 320 Anionenaustauschchromatograph besteht aus Autosampler DX AS50 Thermoofen DX AS50 UV Detektor DX AD25 Konduktometrische Messz
176. ach 92 h f r EpiSerf und von ca 1000 uM auf etwa 500uM nach 48h f r GMEM Z Danach fanden f r beide Medien keine merklichen nderungen der Citratkonzentration statt Ein qualitativ nahezu identisches Verhalten zeigten die Konzentrationsverl ufe f r cis Aconitat und Isocitrat Quantitativ war zu erkennen dass f r diese drei Intermediate die Anfangskonzentration f r EpiSerf h her und die Endkonzentration niedriger waren als zu gleichen Zeitpunkten in GMEM Z Der im Krebszyklus auf Isocitrat folgende Metabolit ist a Ketoglutarat Die Konzentrationsverl ufe dieses Intermediates waren relativ stark unterschiedlich f r die einzelnen Versuche Zwar stimmten die Verl ufe f r die jeweils gleichen Bedingungen zu Beginn der Kultivierungen gut berein allerdings ist ab etwa 70h eine deutliche Diskrepanz zwischen den Versuchen 1 und 2 und dem Versuch 3 zu erkennen Im dritten Versuch wurden erheblich h here Konzentrationen ab 70h gemessen als in den vorangegangenen Experimenten 1 und 2 Grunds tzliche Unterschiede zwischen den beiden Medien zeigten sich in den ersten 48h der Kultivierung wobei hier die Konzentration von a Ketoglutarat f r EpiSerf h her 500 uM lag als f r GMEM Z 200 uM W hrend in diesem Zeitraum die Konzentration f r die Kultivierung in EpiSerf einen leichten Anstieg bis zu einem Maximum bei etwa 32h zeigte fand in GMEM Z ein deutlich st rker ausgepr gter Anstieg statt der sein Maximum 500 uM bei etwa 60 h erreichte Nac
177. ach dem Ersetzen des Zellkulturmediums durch dung 5 31 Verl ufe von intrazellul ren Metabolitkonzentrationen aus Glykolyse und Krebszyklus in MDCK Zellen nach zweist ndiger Inkubation in PBS und anschlie ender Zugabe von neuem Zellkukurnediim ae lan elle ln 155 dung 5 32 Verl ufe der Konzentrationen von ATP und UDP GIcNAc sowie der Energy Charge in MDCK Zellen nach zweist ndiger Inkubation in PBS und anschlie ender Zugabe von neuem Zellk lt rmedium es ah cea lari een 156 181 Abbildung 5 33 Kreuzkorrelationsmatrix f r MDCK Zellen nach zweist ndiger Inkubation in PBS und anschlie ender Zugabe von neuem Zellkulturmedium 2 156 Abbildung 5 34 Schemata von Glykolyse und Krebszyklus und den farbkodierten Korrelationskoeffizienten zu den jeweiligen Metabolitpaaren f r MDCK Zellen basierend auf den Resultaten der On nel ee ner A 160 Abbildung 5 35 Konzentrationsverl ufe intrazellul rer Metaboliten aus Glykolyse und Krebszyklus in MDCK Zellen nach zweist ndiger Inkubation in PBS und anschlie ender Zugabe von neuem Zellkulturmedium DMEM mit verschiedenen 162 Abbildung 5 36 Verlaufe der Konzentrationen von ATP und UDP GIcNAc sowie der Energy Charge in MDCK Zellen nach zweist ndiger Inkubation in PBS und anschlie ender Zugabe von neuem Zellkulturmedium
178. ahren F r Vero Zellen wurde dementsprechend eine durchschnittliche relative Standardabweichung von 6 5 ermittelt 4 3 3 Mikroskopie zur Bestimmung des Zellvolumens Zur Bestimmung des zellul ren Volumens im adh renten Zustand wurden die Zellen wie oben beschrieben in Sechs Well Platten kultiviert F r jeden Probenzeitpunkt wurden drei Wells als Vergleichsmessung mit dem Ger t ViCell XR gez hlt Zum gleichen Zeitpunkt wurden die Zellen wie folgt gef rbt Nach dem Abgie en des Mediums wurden die Zellen dreimal gewaschen Daraufhin wurde ein Volumen von 100 uL des Farbstoffes 5 Hexadecanoylaminofluorescein Molecular Probes gel st in Ethanol EtOH 5 g L mit einer Konzentration von 25 mg L in Milli Q Wasser zu den Zellen gegeben und f r einen Zeitraum von 5 20 min inkubiert Anschlie end wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und ein ebenes St ck des Bodens der Sechs Well Platte wurde mechanisch herausgebrochen Dieses St ck wurde auf ein Mikroskopiedeckgl schen gelegt und mit dem Laserscanningmikroskop LSM 510 Zeiss mit 400 facher Vergr erung limersion mikroskopiert Hierzu wurde mit einer Laserwellenl nge von 488 nm angeregt und bei 520 530 nm detektiert Es wurde eine horizontale Schichtdicke von 0 5 um eingestellt und je nach Grad der F rbung der Zellen unterschiedliche Beleuchtungszeitr ume und Detektorverst rkungen gew hlt Die Auswertung erfolgte mit der Software LSM Image Browser Version 4 2 0 121 Zeiss
179. ahrscheinlich auf methodische Unterschiede der verschiedenen Arbeiten zur ck zuf hren ist Ein weiterer Grund hierf r k nnten die nderungen sowohl der Metabolitmengen in Zellen als auch der Zellvolumina ber den Verlauf von Batch Kultivierungen sein und somit die Abh ngigkeit vom Zeitpunkt der Probenahme Weitere Quellen zu Metabolitmengen f r aus Geweben isolierte tierische Zellen sind f r insbeson dere Tumor oder Carcinoma Zellen in der Literatur zu finden 86 89 9 172 174 290 303 309 310 Cor Metabolitkonzentrationen in tierischem Gewebe sei auf die Arbeiten von Williamson und Brosnan verwiesen DI Eine detaillierte Erw hnung w rde den Rahmen dieser Arbeit sprengen F r MDCK Zellen wurden von Nash et al ATP Gehalte bestimmt DI Zellspezifische ATP Mengen lagen bei 10 25 fmol also h her als die in der hier vorliegenden Arbeit bestimmten Mengen ca 6 13 fmol Als m gliche Erkl rung f r diese Diskrepanz sind Unterschiede im Ursprung der Zellen andere Kultivierungsbedingungen oder auch die Probenvorbereitung aufzuf hren Nash et al konnten in ihrer Arbeit eine deutliche inverse Abh ngigkeit des zellspezifischen ATP Gehalts von Grad der Konfluenz bzw der Zelldichte zeigen was die grunds tzliche Tendenz der hier vorliegenden Arbeit n mlich die Abh ngigkeit des Volumens und somit auch des ATP Gehaltes von der Kultivierungsdauer widerspiegelt Zus tzlich untersuchten Nash et al die Abh ngigkeit des ATP Geh
180. aktoriellen Versuchsplan f r die Methoden MeOH Kochen A und MeOH CHC B A MeOH Kochen Zielgr e Absorp 280 nm R 0 992 0 986 0 999 ANOVA p Wert 0 0555 0 0539 0 0904 0 0086 Term prs p Wert eee p Wert Sehin p Wert Schnittpunkt 1 000 lt 0001 1 000 lt o001 1 000 0 0023 1 000 lt 0001 Waschen ja 0 031 0 0327 0 014 0 1269 0 186 0 0613 0 167 0 0020 Kochen ja 0 017 0 1009 0 047 0 0127 0 448 0 0114 0 034 0 0449 Ultras Behandlung ja 0 020 0 0785 0 007 0 3199 0 043 0 4696 0 015 0 1738 Puffer 0 009 0 2627 0 015 0 1127 0 098 0 1806 0 103 0 0052 Temp MeOH 0 003 0 6285 0 009 0 2516 0 039 0 5064 0 017 0 1500 Volumen MeOH 0 060 0 0094 0 040 0 0177 0 093 0 1936 0 198 0 0014 Waschen ja xKochen ja 0 014 0 1347 0 009 0 2399 0 003 0 9560 0 006 0 5084 a ljalxUltras Behandlung 4993 0 6494 0 010 0 2054 0 041 0 4883 0051 0 0205 Waschen Lafe Puffer 0 035 0 0272 0 005 0 4823 0 136 0 1059 0 012 0 2428 Waschen ja xTemp MeOH 0 001 0 9335 0 044 0 0146 0 166 0 0755 0 005 0 5839 Waschen ja x Vol MeOH 0 029 0 0386 0 002 0 7451 0 103 0 1666 0 031 0 0530 wi L ja xUltras Behandlung 0 003 0 6902 0 007 0 3076 0 020 0 7164
181. als auch im Cytosol ablaufen F r den ersten Fall muss cytosolisches Glutamat ber einen Glutamattransporter Aspartat Glutamat Antiporter oder Glutamat Carrier in die Mitochondrien gelangen Beide Transporter sind an einen Protonentransport gekoppelt so dass aufgrund des Protonengradienten der Fluss von Glutamat in die Mitochondrien berwiegt Wenn Glutamat ber den Aspartat Glutamat Antiporter in die Mitochondrien transportiert wird ist es erforderlich dass Glutamat ber das Enzym Aspartat Transaminase EC 2 6 1 1 abgebaut wird Dabei wird Ammonium auf Oxalacetat bertragen und f r jedes importierte Glutamat wird ein Aspartat produziert Nur so kann weiterhin ein Antiport stattfinden F r den Fall des Imports von Glutamat ber den Glutamat Carrier kann eine Desaminierung durch die Glutamat Dehydrogenase ablaufen oder eine Transaminierung durch die Alanin Transaminase EC 2 6 1 2 bzw die Aspartat Transaminase 9 Bei der Transaminierung von Glutamat im Cytosol kommen haupts chlich die cytosolischen Varianten der beiden oben genannten Transaminasen zum Einsatz was bedeutet dass Ammonium auf Oxalacetat oder Pyruvat bertragen wird Welches Substrat hierf r verwendet wird ist abh ngig von der Verf gbarkeit In jedem Fall sind bei dem Abbau von Glutamin neben den hier genannten Enzymen der Desaminierung bzw Transaminierung und denen aus dem Krebszyklus weitere Enzyme involviert Bei diesen anaplerotischen Reaktionen sind insbesonde
182. alted carbohydrate hydrolysates Journal of Mass Spectrometry 33 4 334 341 194 275 Bruggink C Maurer R Herrmann H Cavalli S Hoefler F 2005 Analysis of carbohydrates by anion exchange chromatography and mass spectrometry Journal of Chromatography A 1085 1 104 109 276 Tewari YB Goldberg RN Advani JV 1991 Thermodynamics of the disproportionation of adenosine 5 diphosphate to adenosine 5 triphosphate and adenosine 5 monophosphate II Experimental data Biophysical Chemistry 40 3 263 276 277 Letisse M Rozieres M Hiol A Sergent M Comeau L 2006 Enrichment of EPA and DHA from sardine by supercritical fluid extraction without organic modifierl Optimization of extraction conditions Journal of Supercritical Fluids 38 1 27 36 278 Gonzalez M Mendez J Carnero A Lobo MG Afonso A 2002 Optimizing conditions for the extraction of pigments in cochineals Dactylopius coccus Costa using response surface methodology Journal of Agricultural and Food Chemistry 50 24 6968 6974 279 Gullberg J Jonsson P Nordstrom A Sjostrom M Moritz T 2004 Design of experiments an efficient strategy to identify factors influencing extraction and derivatization of Arabidopsis thaliana samples in metabolomic studies with gas chromatography mass spectrometry Analytical Biochemistry 331 2 283 295 280 Yang MS Gupta RC 2003 Determination of energy charge potential in the C6 glioma and the HepG 2 cell culture Toxicology Mechanisms and
183. altes von der Sauerstoffversorgung wobei mit abnehmender Sauerstoffkonzentration der ATP Gehalt ebenfalls sank 168 5 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 5 7 Zusammenfassung intrazellul rer spezifi vorliegenden Arbeit im Vergleich mit ausgew hlten Literaturstellen scher Metabolitmengen fmol der hier vorliegende Arbeit Literatur MDCK Vero MDCK Vero CHO BHK HepG2 Hybridoma 3PG 0 07 0 35 0 07 0 21 0 738 1201 1 10 281 0 41 171 0 5 1 7 312 0 41 0 57 235 ADP 0 43 1 53 0 40 0 73 02 307 3 02 1701 013 0278 1 3 115 0 5 4 281 0 057 0 2 1 6 8121 0 07 0 15 12351 0 04 0 35 0 04 0 12 2420 1 62 1201 0 03 0 05 179 0 1 4 15 5 30 281 0 8 6 3 1171 1 68 6 29 251 u 0 94 6 75 51 ae 1313 _7 on 13121 1120 gt ATP 6 46 13 16 4 20 7 42 10 25 05 09 24 a 5 20 21 08 242 5515 1 13 197 CDP 0 01 0 07 0 01 0 05 0 007 133 0 00 0 04 0 00 0 02 hee 133 Citr 0 45 3 54 0 45 1 93 Es 4 11861 2 280 027 lt 0 4 1 12 0239 0 03 0 13 0 03 0 09 0 03 7 0 05 071 05 140 0 4 0 79 51 CTP 0 25 1 39 0 28 1 53 0 26 3 39 87 siog re 0 43 0 88 9 0 22 0 92 173 om 0 63 1 17 9 F16bP 0 03 4 51 0 79 1 34 FoP 0 01 0 10 0 02 0 08 1 070 D Fum 0 06 0 37 0 01 0 36 0 495 027 0 65 0 95 188 071 GDP 0 08 0 18 0 07 0 20 w i Sc 1 0 04 0 08 Im G6P 0 01 0 30 0 07 0 19 0 965 701 GMP 0 01 0 04 0 79 1 34 0 00 874 0 08 171 0 73 1 21 89 GTP 0 97 2 01 1 03 1 68 2 24 8 35 09 346 spam Isoc 0 01 0 10 0 01 0 08 0 01
184. analysis forecasting and control Upper Saddle River Prentice Hall International 598 p 259 Chatfield C 2000 Time series forecasting Boca Raton Chapman amp Hall CRC 267 p 260 Arkin A Ross J 1995 Statistical Construction of Chemical Reaction Mechanisms from Measured Time Series Journal of Physical Chemistry 99 3 970 979 261 Arkin A Shen PD Ross J 1997 A test case of correlation metric construction of a reaction pathway from measurements Science 277 5330 1275 1279 262 Wahl SA Haunschild MD Oldiges M Wiechert W 2006 Unravelling the regulatory structure of biochemical networks using stimulus response experiments and large scale model selection Systems Biology Stevenage 153 4 275 285 263 Le Belle JE Harris NG Williams SR Bhakoo KK 2002 A comparison of cell and tissue extraction techniques using high resolution H 1 NMR spectroscopy NMR in Biomedicine 15 1 37 44 264 Dierckx P 1975 An algorithm for smoothing differentiation and integration of experimental data using spline functions Journal of Computational and Applied Mathematics 1 3 165 184 265 Wahl SA 2007 Entwicklung von biologisch motivierten Methoden zur Vereinfachung kinetischer Modelle Dissertation Siegen Universitat Siegen 266 Stanley CR Lawie D 2008 Thompson Howarth error analysis unbiased alternatives to the large sample method for assessing non normally distributed measurement error in geochemical samples Geochemistry Exploration E
185. anische S uren konnten von Lu et al 83 mit Werten von 87 95 nach Extraktion mit PCS wiedergefunden werden Haas et al erreichte nach einer Extraktion von organischen S uren mit ACN aus Blut Wiederfindungen von 31 114 mit Ausnahme von Oxalacetat 14 In der Literatur wird von Wiederfindungen zwischen 58 232 f r verschiedene Zuckerphosphate nach Extraktion aus unterschiedlichen Proben berichtet 1 2 Durch das Abstoppen des Metabolismus mit hei er Luft und Extraktion mit hei em Wasser wurden von Hofmann et al Wiederfindungen 94 5 Ergebnisse und Diskussion von organischen S uren und Zuckerphosphaten im Bereich von 20 190 f r HepG2 Zellen erzielt 1120 Nach einer PCS Extraktion wurden Zuckerphosphate Nukleotide und organische S uren aus Lebergewebe mit Wiederfindungswerten von 90 105 gemessen 12 Ein hnliches Spektrum von Metaboliten untersuchte Vogt et al 82 Dabei wurden Wiederfindungen von 99 bei einer Extraktion aus Herzgewebe mit ACN erreicht In einer gro angelegten Studie untersuchten Villas Boas et al unterschiedliche Extraktionsmethoden f r Hefen 1138 Dabei wurden auch Wiederfindungen f r verschiedene Metabolitklassen ermittelt Beste Werte wurden f r die Extraktion mit reinem MeOH erzielt wobei allerdings Zuckerphosphate g nzlich nicht wiedergefunden wurden Die einzige Methode die eine Wiederfindung von Zuckerphosphaten erm glichte war die Extraktion mit MeOH CHC Somit kann
186. ann Neben der zeitlichen Abh ngigkeit ist aber h ufig auch die Abh ngigkeit der Messgr en voneinander von Interesse 1245 9 252 2531 Zur berpr fung von Abh ngigkeiten zweier Messgr en bietet sich die M glichkeit Streudiagramme zu erzeugen indem man je eine Variable auf x und y Achse auftr gt Auf diese Weise k nnen Korrelationen zwischen zwei Messgr en direkt erkannt werden Allerdings ist ab einer gr eren Zahl von untersuchten Messgr en eine genaue Begutachtung von Streudiagrammen m hevoll Alternativ bietet sich eine Vereinfachung durch die Berechnung des Korrelationskoeffizienten r 3 9 3 Theoretische Grundlagen 35 Hierbei sind x bzw die einzelnen Werte und x bzw die Mittelwerte aus Messungen der zu korrelierenden Variablen Der Korrelationskoeffizient charakterisiert die St rke des linearen Zusammenhangs zwischen den beiden Variablen x und y und kann Werte von 1 bis 1 annehmen F r r 0 besteht kein Zusammenhang zwischen den beiden Variablen F r r 1 besteht eine vollst ndige positive und f r r 1 eine vollst ndig negative Korrelation Somit kann anhand des Korrelationskoeffizienten r eine Aussage ber den Grad der Verhaltens hnlichkeit zweier Variablen getroffen werden Als Einschr nkung ist zu betonen dass dieser Wert nur den linearen Zusammenhang widerspiegelt Dies bedeutet dass unter Umst nden der wahre Zusammenhang zwischen den beiden Variablen durch eine andere Funktion deu
187. ar die meisten der gew nschten Metaboliten mit der Chromatographieanlage DX320 zu messen wurden die Anlage DX600 im weiteren Verlauf der Arbeit nicht mehr genutzt 5 Ergebnisse und Diskussion 63 5 1 3 Diskussion der etablierten Chromatographiemethode Eine Etablierung einer chromatographischen Methode zur Analyse von intrazellul ren Stoffwechselprodukten war f r die hier vorliegende Arbeit zwingend erforderlich Hierf r wurden zwei verschiedene AAC Anlagen auf ihre Nutzbarkeit untersucht bzw optimiert 5 1 3 1 Etablierung der Chromatographiemethode mit der Anlage DX320 und Identifikation der Metaboliten Um eine aussagekr ftige Analyse von intrazellul ren Stoffwechselprodukten mit der AAC zu erreichen mussten zu Beginn der Arbeit m glichst viele Metaboliten in den Extraktionsproben identifiziert werden und den entsprechenden Peaks in den Chromatogrammen zugeordnet werden Durch das unter 5 1 1 1 beschriebene Verfahren konnte aber keine vollst ndige Zuordnung bzw Identifikation erreicht werden da typischerweise zum einen erhebliche Konzentrationsunterschiede der Substanzen in den Proben auftraten und zum anderen verbunden mit Koelutionen manche Substanzen g nzlich verborgen blieben Ein grunds tzliches Problem bei der Identifizierung von Metaboliten anhand von Retentionszeiten ist dass auch bei langen Chromatographiel ufen Koelutionen von verschiedenen Substanzen auftreten Die in Tabelle 5 1 aufgef hrten Koelutionen sind
188. asierend auf diesen Daten k nnte eine berarbeitung des Stoffwechselnetzwerkes stattfinden Basierend auf der in dieser Arbeit entwickelten Methode zur Probenvorbereitung f r die Messung intrazellul rer Stoffwechselprodukte w re eine C Stoffflussanalyse m glich 1 Dazu m ssten Versuche mit isotopenmarkiertem Substrat durchgef hrt werden Nach der Probenvorbereitung w rde eine Messung der Proben entweder mit einer LC MS oder GC MS Methode stattfinden um die Isotopenverteilung f r die einzelnen Metaboliten aufzukl ren Auf diese Weise k nnte die Flussverteilung genauer bestimmt werden als dies in den bereits durchgef hrten Arbeiten basierend auf ausschlie lich extrazellul ren Daten der Fall war Hi 231 Die prinzipielle Eignung der Probenvorbereitung f r eine GC MS Messung konnte in einigen Vorversuchen bereits demonstriert werden Besonders interessant w re sicherlich eine Kombination der in dieser Arbeit genutzten Bestimmung der intrazellul ren Metabolitkonzentrationen mit Messungen des Proteoms der Enzymaktivit t oder auch des Transkriptoms 14 da solche Arbeiten bereits in der Arbeitsgruppe Bioprozesstechnik durchgef hrt werden Eine Aufkl rung der Zeitskalen bzw der Hierarchie von Regulationsmecha nismen k nnte so erreicht werden Bei genauerer Untersuchung der Regulation w re u U auch eine Beschreibung der Zusammenh nge in Form von mathematischen Modellen denkbar vergleichbar mit Arbeiten zu Prokaryont
189. at 10 20 0 10 20 0 20 0 20 200 20 0 20 Citrat 20Pe 10 20 0 20 0 20 200 20 2 3 cis Aconitat 20 0 200 20 0 20 0 20 0 200 20 200 20 E Leochtrat gata 0 20 0 20 0 20 0 20 200 20 ai S a Ketoglutarat 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 10 20 0 20 3 224020 EE 0 20 0 29 0 00 0 20 0 20 0 20 Z Fumarat 20 0 20 0 200 20 0 20 0 20 0 200 200 20 20 0 20 0 20 0 20 0 00 fo2do 0 00 0 20 0 00 0 00 0 29 0 00 0 00 E Malat 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 14 0 18 0 14 0 00 0 20 0 00 0 02 0 001 0 20 0 20 0 20 0 20 10 20 0 00 0 12 0 201 0 290 04 0 00 0 2010 00 020 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 2 33 0 20 0 20 D 0 20 E 210 20 2200 0 20 0 20 5 0 20 0 0 20 2 _ 0 20 E 0 20 SG 20 0 200 00 0 0 20 0 2010 2010 201 0 20 0 201 0 201 0 20 0 20 0 0 20 0 20 0 18 0 2 UDP GalNA c gt 9 00 0 0 20 0 20 0 20 1 0 20 0 20 10 20 2 UDP Glcj 20 2 020 E 2 220 0 18 Energy 20 02020 e 020 Abbildung 5 33 Kreuzkorrelationsmatrix f r MDCK Zellen nach zweist ndiger Inkubation in PBS und anschlie ender Zugabe von neuem Zellkulturmedium GMEM Z Zur genauen Erl uterung sein auf Abbildung 5 21 verwiesen die Zahlen in den einzelnen Feldern entsprechen dem Zeitversatz in log min 5 Ergebnisse und Diskussion 157 Grunds tzlich zeigten sich in Abbildu
190. at Kinase EC 2 7 4 3 Diese beiden Reaktionen sind exemplarisch f r eine ganze Reihe von Enzymreaktionen bei welchen Phosphatgruppen von Nukleotiden durch Transferasen bzw Kinasen EC 2 7 4 x bertragen werden Somit sind neben den Adenosinnukleotiden auch die weiteren an vielen Reaktionen beteiligten Guanosin GMP GDP GTP Cytidin CMP CDP CTP und Uridinnukleotide UMP UDP UTP von gro er Bedeutung f r den Stoffwechsel Zuckernukleotide spielen einerseits eine wichtige Rolle als Vorl ufer f r die Glykosylierung von Proteinen D So ist z die Verzweigung von Glykosylierungsstrukturen durch die Konzentrationen der Zuckernukleotide beeintr chtigt Andererseits konnte f r kultivierte tierische Zellen ein direkter Zusammenhang zwischen Ammoniumkonzentration im Zellkultur berstand und den intrazellul ren Konzentrationen der Zuckernukleotide UDP N Acetyl Glucosamin UDP GlcNAc und UDP N Acetyl Galactosamin UDP GalNAc festgestellt werden Durch die Erh hung der intrazellul ren Konzentration dieser beiden Zuckernukleotide k nnte auch der wachstumsinhibitorische Effekt von Ammonium vermittelt sein da diese Metaboliten auch regulatorische Proteine im Cytosol beeinflussen 195 96 Metaboliten ist F6P Durch das Enzym UDP N Acetylglucosamin Epimerase EC 5 1 3 14 stehen UDP GlcNAc und UDP GalNAc im Gleichgewicht Ausgangspunkt der Synthese dieser 3 1 7 Experimentelle Strategien zur Verbesserung der Effizienz des Zentralsto
191. ationen f llt auf dass die mehrfach bestimmten Werte deutlich st rker schwankten s Abbildung 5 19 als dies f r die extrazellul ren Metaboliten der Fall ist Zu erkl ren ist dies mit der erheblich aufwendigeren Probenvorbereitung bzw mit der Messmethode Wie in Abschnitt 5 2 5 gezeigt lagen die relativen Standard abweichungen f r die Messungen gem der etablierten Methode mit dem MS Detektor bei etwa 12 Auch f r die anderen Detektoren ist mit einer relativen Standardabweichung von 7 zu rechnen Eine weitere Erkl rung kann auch die biologische Varianz zwischen den einzelnen Versuchen sein Zwar ist die biologische Varianz innerhalb eines Experiments bei der Absch tzung der Standardabweichung ber cksichtigt aber f r unabh ngig voneinander durchgef hrte Experi mente kann keine Aussage zu den biologischen Schwankungen gegeben werden Diese Schwan kungen schlugen sich auch in den extrazellul ren Messgr en nieder allerdings ist ganz offensicht lich die Geschwindigkeit der intrazellul ren Konzentrations nderungen deutlich h her so dass sich geringe Unterschiede in z B der Einsaatzelldichte oder der Vorkultur st rker auswirken k nnen Unabh ngig von den Schwankungen zwischen den einzelnen Messwerten waren klare Tendenzen der Konzentrationsverl ufe zu erkennen Ein qualitativ hnlicher Konzentrationsverlauf zeigte sich f r viele intrazellul re Metaboliten unabh ngig vom Medium in sofern als dass drei Phasen durch laufen
192. ationen im Well kein Bezug auf Zellzahl oder Zellvolumen Die Zeit nach Zugabe des Mediums ist logarithmisch dargestellt um eine logarithmische Darstellung zu erm glichen wurde der Zeitpunkt t 0 auf den Wert 1 8 s und die Kontrolle auf 0 18 s gelegt zur besseren Visualisierung wurden die einzelnen Messpunkte mit Linien verbunden F r Citrat zeigte der Konzentrationsverlauf nach 2 h in PBS sein Minimum Anschlie end fand f r alle Medien ein Konzentrationsanstieg statt wobei dieser f r DMEM ohne Serum deutlich schw cher ausfiel als f r die anderen Medien F r das Glucose Medium war der Anstieg am steilsten und endete in der h chsten Konzentration ca 17 uM F r a Ketoglutarat zeigte sich in PBS ein starker Konzentrationsabfall Nach Zugabe der Medien folgte f r die serumhaltigen Medien ein konstantes Verhalten bis 180 s Anschlie end war ein erheblicher Konzentrationsanstieg zu verzeichnen welcher am st rksten f r das Medium mit Glutamin und am schw chsten f r das Medium mit ausschlie lich Serum ausfiel In der Kultur in DMEM ohne Zus tze stieg die Konzen tration von a Ketoglutarat bereits nach 180 s leicht an und dieser Anstieg setzte sich bis 1800 s fort Dies bedeutete dass die intrazellul re Konzentration von o Ketoglutarat f r DMEM ohne Zus tze zum Ende des Versuchs niedriger war als f r die mit Serum supplementierten Medien Die Konzen tration von Malat zeigte einen erheblichen Abfall w hrend der Inkubation in PBS Ans
193. aturstellen 40H nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 168 183 Literaturverzeichnis Ne LA E on 10 11 12 13 15 16 1 SI 18 19 20 21 22 23 24 25 26 14 Freshney RI 1994 Culture of animal cells a manual of basic technique New York Wiley Liss 486 p Kretzmer G 2002 Industrial processes with animal cells Applied Microbiology and Biotechnology 59 2 3 135 42 Spier RE 2000 History of Animal Cell Technology In Spier RE editor Encylopedia of cell technology New York Wiley p 853 872 Merten OW 2006 Introduction to animal cell culture technology past present and future Cytotechnology 50 1 3 1 7 Butler M 2005 Animal cell cultures recent achievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals Applied Microbiology and Biotechnology 68 3 283 291 Wurm FM 2004 Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells Nature Biotechnology 22 11 1393 1398 Storhas W 2003 Bioverfahrensentwicklung Weinheim Wiley VCH 759 p Moore A Mercer J Dutina G Donahue CJ Bauer KD Mather JP Etcheverry Ryll 1997 Effects of temperature shift on cell cycle apoptosis and nucleotide pools in CHO cell batch cultures Cytotechnology 23 1 3 47 54 Butler M 2006 Optimisation of the cellular metabolism of glycosylation for recombinant proteins produced by mammalian cell systems Cytotechnology 50 1 3 57 76 Lehninger
194. auftretende Ph nomen einer nicht homogenen Varianz ber den Messbereich wird selten kommentiert Dennoch wurde von z B Luo et al eine Gewichtung J Konzentration verwendet Basierend auf Erfahrungswerten wird angenommen dass die in der hier vorliegenden Arbeit ermittelten Standardabweichungen eine realistische Absch tzung des tats chlichen Fehlers f r die vollst ndige Methode inklusive der Probenvorbereitung darstellt 5 2 7 6 Absch tzung des Zellvolumens F r einen Vergleich der Daten aus verschiedenen Experimenten bzw f r unterschiedliche Probennahmezeitpunkte aber auch f r einen Vergleich mit der Literatur ist es sinnvoll von einer Angabe der Metabolitmengen in Werten pro Well einer Sechs Well Platte abzur cken Wie bereits oben beschrieben Abschnitt 5 2 6 ist der Bezug der gemessenen Metabolit konzentration auf entweder die Zellzahl oder das Zellvolumen wichtig wenn eine nderung der Zellzahl oder des Volumens w hrend eines Versuches stattfindet F r Versuche die innerhalb eines kurzen Zeitraums erfolgten lt 6h wurde in den Versuchen aus Kapitel 5 2 ausgegangen dass keine signifikante Zellzahl nderung stattfindet Da diese Versuche am Ende der exponentiellen Wachstumsphase durchgef hrt wurden mag diese Annahme akzeptabel sein da zu diesem Zeit punkt bereits ein verlangsamtes Wachstum auftrat F r weitere Versuche wurde aber der Zeitraum in dem eine konstante Zellzahl angenommen wurde auf lt 3 h ver
195. b zeigte sich dass die unter 5 1 1 2 durchgef hrte Validierung kein realistisches Szenario darstellte Da diese Validierung mit Standards in Wasser und innerhalb einer Messsequenz durchgef hrt wurde waren diese Bedingungen nicht mit typischen Messsequenzen zu vergleichen In typischen Messsequenzen wurden die Standards in einem PBS Tricine Gemisch angesetzt um die Probenmatrix zu imitieren und meist war die Dauer einer Messsequenz zwischen vier und zehn Tage Dar ber hinaus wurde keine Validierung f r den Betrieb der Chromatographieanlage mit MS Detektor durchgef hrt Aus diesem Grund wurde unter 5 1 1 5 die Standardabweichung der Messungen der einzelnen Standardverd nnungen aus 16 verschiedenen Messsequenzen ermittelt Dadurch sollte der reale in einer Messsequenz auftretende Fehler ermittelt werden Es zeigte sich dass im Gegensatz zu der im Vorfeld durchgef hrten Validierung die Varianz f r keinen der Metaboliten ber den gesamten Messbereich homogen sondern relativ deutlich Konzentrationsabh ngig war Dar ber hinaus waren die Messfehler deutlich gr er als bei der Validierung bestimmt Dies lag mitunter sicherlich daran dass der Messbereich zum Teil niedriger gew hlt wurde als in der Validierung um grunds tzlich eine Messung zu erm glichen Weiterhin waren die Bedingungen bei den Messungen von Proben ver ndert Dem Standard wurden um die Probenzusammensetzung zu imitieren PBS und Tricine zugesetzt Zus tzlich waren typische
196. be ist nicht auszuschlie en dass MDCK Zellen unter Glucoselimitation Glykolyseintermediaten aus Pyruvat zu synthetisieren Die Konzentrationsverl ufe von 3PG Abbildung 5 25 und PEP nicht dargestellt waren sehr hnlich und es traten erhebliche nderungen auf Verglichen mit vorangegangenen Experimenten bzw Versuchen unter 5 3 2 2 war dieses Verhalten u erst untypisch f r diese Metaboliten denn normalerweise waren eindeutige l ngerfristige Tendenzen im Verlauf der Konzentration dieser Metaboliten zu erkennen Da sich diese Schwankungen auf 3PG und PEP beschr nkten und andere Metaboliten keine derartigen Konzentrations nderungen zeigten erscheinen experimentelle Fehler bei der Durchf hrung dieses Versuches als Erkl rung unwahrscheinlich Allerdings ist das gleichartige Verhalten von 3PG und PEP f r die vier verschiedenen Kultivierungen ber einen l ngeren Zeitraum z B letzte drei Punkte der Kultivierung anhand des Stoffwechsels schwierig zu erkl ren Dennoch k nnte argumentiert werden dass die gro en Schwankungen im Konzentrationsverlauf von 3PG ein Resultat von regulatorischen Effekten darstellte So k nnte die niedrige Glucosekonzentration Effekte auf die Regulation der Glykolyse bewirkt haben und da die Pyruvat Kinase einen regulierten Schritt der Glykolyse ist k nnten sich in dem Konzentrations verlauf von 3PG und PEP regulatorische Effekte verschiedener Ebenen z B metabolische translatorische transkriptorische Re
197. ben durchgef hrt MeOH Kochen Extraktion Fraktionelles faktorielles Design Abbildung 5 7 s S 72 zeigt die sechs Einflussgr en Waschen Temperatur MeOH Volumen MeOH Ultraschallbehandlung Puffer und Kochen deren Effekt auf die Zielgr en in diesem Experiment gekl rt werden sollte Eine Zusammenfassung der Niveaus der verschiedenen Faktoren ist in Tabelle 4 3 A gegeben F r dieses Experiment wurde ein 2 Versuchsplan mit der Aufl sung IV ausgew hlt Zur Reduktion des Designs wurden folgende Generatoren gew hlt I Temperatur MeOH x Kochen x Ultraschall Behandlung x Puffer I Volumen MeOH x Waschen x Ultraschall Behandlung x Puffer Somit waren 16 Sechs Well Platten unter unterschiedlichen Bedingungen zu extrahieren MeOH CHO Extraktion Fraktionelles faktorielles Design Ein berblick ber die zu testenden Einflussgr en dieser Methode Volumen CH CT Verh ltnis MeOH Puffer Ultraschallbehandlung Puffer und Anzahl der Extraktionen ist in Abbildung 5 7 B s S 72 gegeben Die Niveaus der Faktoren sind in Tabelle 4 3 B zusammengefasst 4 Material und Methoden 45 Tabelle 4 3 Zusammenfassung der Faktoren und Niveaus Level f r die fraktionellen faktoriellen Versuchspl ne zur Optimierung der Methoden MeOH Kochen A und MeOH CHCI A MeOH Kochen Temperatur Volumen Level Waschen Kochen Ultraschallbehandlung Puffer MeOH MeOH 1x Waschen 2 Kochen 5 min vor und nach d
198. berstand gezeigt F r beide Medien wurde ein klarer Anstieg gemessen Das Diagramm zeigt f r GMEM Z einen relativ kontinuierlichen Anstieg der Konzentration Gegen Ende des Versuchs lag die Konzentration bei 2mM F r die EpiSerf Kultivierung wurde in den ersten 70h ein steilerer Konzentrationsanstieg gemessen und anschlie end war der Anstieg etwas vermindert Bei 198 h wurde einen Wert von ca 3 mM erreicht Zur genaueren Charakterisierung der beiden Kultivierungen wurden die Verh ltnisse von Lactat zu Glucose und Ammonium zu sowohl Glutamin als auch den beiden Aminos uren Glutamin und Glutamat gebildet Tabelle 5 6 Alle drei Verh ltnisse unterschieden sich deutlich f r die zwei Medien F r EpiSerf waren die Verh ltnisse h her insbesondere f r das Verh ltnis von Ammonium zu Glutamin Tabelle 5 6 Zusammenfassung der Verh ltnisse von Produkten zu Edukten des Energiestoffwechsels f r das Zellwachstum von MDCK Zellen in Sechs Well Platten in GMEM Z bzw EpiSerf YraciGle Yammk Gin x 2 Yamm Gin x 2 Glu GMEM Z 2 64 0 67 0 53 EpiSerf 2 81 2 70 0 94 da bei vollst ndigem Abbau von Gln 2 mol Amm freigesetzt werden ist hier der Faktor 2 eingef gt Die Berechnung erfolgte anhand der Differenzbildung des ersten und des letzten Wertes der gegl tteten Werte Diskussion Die in Abbildung 5 19 gezeigten Verl ufe der extrazellul ren Metabolitkonzentrationen wiesen erhebliche Unterschiede f r die beiden Medien auf Dies ist unte
199. bil 49 172 8254088 geboren am 23 05 1977 in M nchen verheiratet zwei Kinder Berufspraxis seit 05 09 NBx Bioprozessentwicklung Novartis Pharma AG Basel Schweiz Laborleiter 12 03 04 09 Arbeitsgruppe Bioprozesstechnik Prof U Reichl Max Planck Institut Magdeburg Wissenschaftlicher Mitarbeiter Doktorand Dissertationsthema Charakterisierung tierischer Zellkulturen anhand einer Quantifizierung intrazellul rer Metaboliten aus dem Zentralstoffwechsel 01 03 08 03 University of British Columbia Prof J Piret Vancouver Kanada Diplomarbeit Characterization of Acoustic Cell Filter Performance for a CHO Cell Perfusion Culture using Experimental Design Methodology 04 02 10 02 Firma Alpha Bioverfahrenstechnik Kleinmachnow Studienarbeit Optimierung eines Verfahrens zur Immobilisierung von tierischen Zellkulturen 08 99 09 99 Universit tsklinikum Charite Berlin Praktikum 03 98 04 98 Brauerei Glossner Neumarkt i d Opf Praktikum Lebenslauf Joachim B Ritter Ausbildung 10 97 11 03 10 00 04 01 07 96 05 97 1983 1996 Studium der Biotechnologie Technischen Universitat Berlin Abschluss Diplom Ingenieur Note 1 5 Auslandssemester Dongseo Universitat Pusan S dkorea Wehrdienst Hauptgefreiter Fernmeldeeinheit P cking bei M nchen Grundschule und Gymnasium in Neumarkt i d Opf Abschluss Abitur Note 2 0 Weitere Kenntnisse EDV
200. bildung 5 7 A zeigt die f r relevant erachteten Verfahrensschritte die in diesem Experiment genauer untersucht werden sollten Eine Zusammenfassung der untersuchten Einflussgr en und Niveaus ist in Tabelle 4 3 gegeben F r die Auswertung wurden die Effekte der Einflussgr en auf die jeweilige Zielgr e mit Hilfe eines Regressionsmodells wie unter 3 5 1 beschrieben dargestellt Die Messwerte wurden nach dem Minimalen Fehlerquadrate Verfahren an ein Polynom erster Ordnung angepasst 72 5 Ergebnisse und Diskussion Verwerfen des berstandes Verwerfen des Uberstandes MeOH CHCI A MeOH Kochen B Waschen ja nein Volumen ee L Ultraschall Behandlung Ie Zugabe von Wasser Wasser Puffer IT Zugabe von MeOH Temperatur Volumen Ultraschall Behandlung dk Zugabe von Wasser Wasser Puffer je d Ultraschallbehandlung Hitzebehandlung Zentrifugation ja nein Zweite Extraktion sammeln der w ssrigen Phase Zentrifugation gt Sammeln des berstandes Abbildung 5 7 Schema zur Optimierung der Methoden MeOH Kochen A und MeOH CHCI mit den kritischen Schritten die genauer untersucht wurden ja nein Graue Pfeile deuten den Arbeitsverlauf an schwarze Pfeile und kursiv geschriebene Worte die alternativen Schritte die getestet wurden Die Ergebnisse der Anpassung der gemessenen Daten an d
201. boliten wurden ermittelt Da die Kultivierung von MDCK Zellen aber typischerweise im Batch Verfahren abl uft und somit keine station ren Bedingungen w hrend einer Kultivierung vorherrschen war auch bei den Metabolitkonzentrationen mit Ver nderungen zu rechnen Aus diesem Grund wurden eine Reihe von Kultivierungen in Sechs Well Platten durchgef hrt um typische Konzentrationsverl ufe von den unterschiedlichen Metaboliten w hrend des Wachstums aufnehmen zu k nnen 5 3 2 1 Zusammenfassung der Ergebnisse verschiedener Kultivierungen Da der Rahmen der Arbeit keine Beschreibung der vollst ndigen Ergebnisse aller Kultivierungen erlaubt ist hier eine Zusammenfassung der Daten aller durchgef hrter Kultivierungen mit MDCK Zellen in Form einer Kreuzkorrelationsmatrix gegeben Abbildung 5 16 Dar ber hinaus kann auf diese Weise ein generelles Bild f r Batch Kultivierungen von MDCK Zellen gegeben werden Bei dieser Korrelationsanalyse handelt es sich allerdings nicht wie in Abbildung 5 15 um eine Korrelationsanalyse ohne Zeitverschiebung sondern wie in 4 5 beschrieben um eine Kreuzkorrelation wobei ein Zeitversatz zwischen den verschiedenen Metaboliten bzw Variablen erlaubt ist Diese Zeitverschiebung war allerdings nur m glich indem eine Interpolation der Verl ufe zwischen den gemessenen Datenpunkten erfolgte Grund hierf r ist dass ein Minimum an Datenpunkten mit quidistantem Abstand vorhanden sein muss um eine sinnvolle zeitliche V
202. bzw 14h EpiSerf ein Maximum erreicht wurde Anschlie end wurde ein klarer Abfall der Konzentrationen gemessen der bis ca 60 h dauerte In der Folge blieb die Konzentration relativ konstant bei ca 10 uM Die Konzentration des in der Glykolyse folgenden Metaboliten F6P beschreibt einen hnlichen Verlauf wie G6P allerdings lagen die gemessenen Konzentrationen f r F6P geringf gig unter denen f r G6P Die Verl ufe der Konzentration von F6P in beiden Medien stimmten qualitativ gut berein wenn auch die Konzentrationen f r EpiSerf zu Beginn der Kultivierung minimal ber denen in GMEM Z zu liegen schienen Nach etwa 14h wurden Konzentrationsmaxima f r F6P erreicht und nach ca 48h war der darauf folgende Konzentrationsabfall beendet Danach pendelten sich die Konzentrationen bei etwa 8uM ein Deutlich ist in diesem Diagramm zu erkennen dass die Konzentrationsunterschiede zwischen den einzelnen Experimenten gr er waren als zwischen den verschiedenen Medien Kultivierung 3 zeigte im Maximum die h chsten Konzentrationen von etwa 70 uM wohingegen f r Kultivierung 1 eine maximale Konzentration von ca 20 uM gemessen wurde Der Konzentrationsverlauf von F16bP hnelte wiederum den Verl ufen der vorangehenden Metaboliten allerdings waren die Konzentrationen deutlich h her als bei G6P und F6P Im Maximum f r beide Medien bei ca 14 h wurde f r die Kultivierung in GMEM Z ein Wert von etwa 1700 uM GMEM Z3 gemessen und f r EpiSerf von 1100 uM
203. ccinyl CoA Fluka 85985 Trichloressigs ure Merck 1 00807 Trypanblau Merck 111732 Trypsin 2 5 porcine 0 5 mg mL Gibco 27250 018 TTP Sigma Aldrich T 0251 UDP Sigma Aldrich U 4125 UDP Gal Sigma Aldrich U 4500 UDP GalNAc Sigma Aldrich U 5252 UDP Glc Sigma Aldrich U 4625 UDP GlcNAc Sigma Aldrich U 4375 UMP Sigma Aldrich U 6375 UTP Sigma Aldrich U 6625 a Ketoglutarat Sigma Aldrich K 1750 Tabelle A 4 Zur Zellz hlung mit dem Ger t ViCell XR genutzte Zelltypen mit den entsprechenden Ger teparametern Parameter MDCK_100 MDCK_big 100 Threshold 85 85 85 CenterThreshold 90 90 75 MinimumDiameter 8 8 8 MaximumDiameter 25 50 50 MinimumCenterSize 4 4 5 Frames 100 100 100 FocusParameter 80 80 100 SampleFlushCycles 3 3 3 TrypanBlueMixingCycles 3 3 3 MinimumCircularity 0 0 0 DeclusterDegree 8 8 8 uaryngnzyoinp Sunsseduy IOYJEFSFUNYITMIH sje Sunysamqepsepur s uzmu Sunsseduy ssep ue jomnep y 0 NVd 81 mag uyo pun 2000 WANA IN UesseyD 1 1 unyepssungjpajsiog 8 7 WAIND 9 NIPIN OBA AOAN N UOZ q Su pu gu uoyuswmodxg uastromof sne Sunssejusunuesnz Si x 1 or z I or I I I I I t s s I SOT 001 005 008 ey drug g To T w 10 I T so so 7 0 I I I so s 005 005 005 dio I I I I 1 I I 4 so so 50 60 1 s 001
204. ch eine hohe Aktivit t in vielen untersuchten Zellen aus 58 5 65 681 Lactat wird anschlie end ber einen Diffusionsprozess aus der Zelle geschleust Alternativ zu den ersten Schritten der Glykolyse kann die Glucose einen Abbau ber den Pentose Phosphat Weg durchlaufen Hierbei wird f r die Biosynthese wichtiges NADPH H phosphory Form des Nicotinamid Adenin Dinukleotids erzeugt Zus tzlich wird ber diesen Stoffwechselweg Ribose 5 Phosphat R5P gebildet welches zur Synthese von Nukleotiden und Nukleins uren dient 0 42 41 Verglichen mit der Glykolyse wird allerdings f r viele Zelllinien nur ein sehr geringer Anteil der aufgenommenen Glucose ber diesen Stoffwechselweg abgebaut 22 57 59 69 701 In einigen Arbeiten mit Hybridoma und Myeloma Zellen konnte jedoch gezeigt werden dass deutliche Anteile der aufgenommenen Glucose ber den Pentose Phosphat Weg abgebaut werden 171 721 Das durch die Glykolyse erzeugte Pyruvat kann ber Pyruvat Carrier in die Mitochondrien transportiert werden Dort wird Pyruvat durch die Pyruvat Dehydrogenase EC 1 2 4 1 zu Acetyl CoA umgesetzt Eine Inhibierung dieses Enzymkomplexes kann durch ATP Acetyl CoA NADH und langkettige Fetts uren erfolgen Dementsprechend findet eine Aktivierung durch AMP NAD und CoA statt Eine weitere Ebene der Regulation stellt die M glichkeit der Phosphorilierung dieses Enzyms dar In kultivierten tierischen Zellen ist die Aktivit t dieses Enzyms allerd
205. ch in Abschnitt 5 3 4 2 im Detail gezeigt wurde Nach Zugabe der Medien sank in allen Ans tzen die Konzentration von 3PG F r DMEM ohne Zusatz war aber nach 18 s noch ein Anstieg der Konzentration des 3PG zu verzeichnen und erst ab 180 s begann die Konzentration zu fallen Einen sehr hnlichen Konzentrationsverlauf zeigte PEP nicht dargestellt Die Konzentration von Pyruvat wies innerhalb von 2 h in PBS einen extremen Abfall auf Unabh ngig vom Medium konnte nach der Zugabe der Medien keine st rkere nderung der Konzentration gemessen werden 162 5 Ergebnisse und Diskussion 12 3 gt O E 08 4 2h PBS 047 CH 2 S O 0 0 lt 12 0 Na gt 80 2h ms 3 0 ere ais X gz N g 20 5 NV 5 2 1 0 PSV 2 5 SZ on 60 N 20 S 3 40 15 pe K b 43 2h CG De reps N PBS 4 04 201 5 x gt 2 055 Ion Zy LUS PBS 0 0 0 0 20 3 0 i i 15 25 P m E 2h 3 2 0 10 PBS 5 15 H x wl 5 N d 2h 2 d 58 0 5 PBS 0 0 kon 0 18 180 1800 0 18 180 1800 Zeit s Zeit s Abbildung 5 35 Konzentrationsverl ufe intrazellul rer Metaboliten aus Glykolyse und Krebszyklus in MDCK Zellen nach zweistiindiger Inkubation in PBS und anschlieBender Zugabe von neuem Zellkulturmedium DMEM mit verschiedenen Supplementen DMEM 0 DMEM FCS x DMEM FCS Glc DMEM FCS Gin A aufgetragen sind Konzentr
206. chemical Journal 352 593 599 305 Dietzsch C 2007 Influenza Impfstoffherstellung mit adh renten Vero Zellen Diplomarbeit Dresden Technische Universit t Dresden 306 van den Brink J Canelas AB van Gulik WM Pronk JT Heijnen JJ de Winde JH Daran Lapujade P 2008 Dynamics of glycolytic regulation during adaptation of Saccharomyces cerevisiae to fermentative metabolism Applied and Environmental Microbiology 74 18 5710 5723 307 Feliu JE Diazgil JJ Garciacanero R Gosalvez M 1975 Interconvertible Forms of Class a Pyruvate Kinase from Ehrlich Ascites Tumor Cells Febs Letters 50 3 334 338 308 Wolf J Passarge J Somsen OJG Snoep JL Heinrich Westerhoff HV 2000 Transduction of intracellular and intercellular dynamics in yeast glycolytic oscillations Biophysical Journal 78 3 1145 1153 309 Ibsen KH Coe EL Mckee RW 1958 Interrelationships of Metabolic Pathways in the Ehrlich Ascites Carcinoma Cells 1 Glycolysis and Respiration Crabtree Effect Biochimica Et Biophysica Acta 30 2 384 400 310 Overgaard Hansen K 1965 Metabolic regulation of the adenine nucleotide pool I Studies on the transient exhaustion of the adenine nucleotides by glucose in Ehrlich ascites tumor cells Biochimica Et Biophysica Acta 104 2 330 347 311 Williamson DH Brosnan JT 1974 Concentrations of Metabolites in Animal Tissues In Bergmeyer HU editor Methods of Enzymatic Analysis 3rd ed Weinheim Verlag Chemie p 2266 2302 312 Car
207. chende Verl ufe der Energy Charge gemessen Eine Verallgemeinerung der Zusammenh nge zwischen Energy Charge und Medium scheint allerdings nicht m glich zu sein da in der Literatur unterschiedliche Zelllinien untersucht wurden aber davon ausgegangen werden muss dass das Verhalten der Energy Charge auch vom untersuchten Organismus abh ngig ist Auch andere Verh ltnisse von Nukleotiden und Zuckernukleotiden wurden auf ihr Potenzial zur Charakterisierung von Zellkulturen w hrend des Zellwachstums berpr ft 8 95 96 117 180 219 170 5 Ergebnisse und Diskussion Kernaussage dieser Publikationen ist dass das Ende des exponentiellen Wachstums durch den zeitlich vorangehenden signifikanten Anstieg des Verh ltnisses von NTP Ratio U Ratio ATP GTP x UDP GNAc UTP CTP x UTP vorhergesagt werden kann Grunds tz lich wurden in den Versuchen der hier vorliegenden Arbeit vergleichbare Verl ufe dieses Verh ltnisses erzielt nicht dargestellt Allerdings war der Anstieg des Verh ltnisses dem Ende der exponentiellen Wachstumsphase nicht oder nur minimal vorgeschaltet so dass hier keine Vorhersage des Endes des exponentiellen Wachstums erfolgen h tte k nnen Als Erkl rung f r den Unterschied zur Literatur kann angegeben werden dass die zitierten Arbeiten gro teils mit Suspensionszelllinien arbeiteten und in der hier vorliegenden Arbeit adh rente Zellen untersucht wurden W hrend das Ende des exponentiellen Wachstums bei Su
208. cher S uren bei 220 nm m glich war z B Pyruvat Fumarat Allerdings schwankte die Basislinie bei dieser Wellenl nge relativ stark w hrend sie bei 260 nm vergleichs weise stabil war Der Nachteil der Wellenl nge 260 nm war dass fast ausschlie lich die Detektion von Nukleotiden m glich war Somit sollte also die Option einer Detektion von organischen S uren nicht verloren gehen aber trotzdem eine qualitativ hochwertige Quantifizierung von Nukleotiden erreicht werden Aus diesem Grund wurde bei einer Wellenl nge von 220 nm gestartet und zur Detektion von CMP wurde auf 260 nm gewechselt Anschlie end wurde f r die Detektion von Fumarat wieder die Wellenl nge 220 nm eingestellt Vor der Elution von AMP wurde zuletzt wieder auf 260 nm gewechselt was die Detektionswellenl nge bis zum Ende des chromatographischen Laufs war Kurz 0 1 min nach dem Wellenl ngenwechsel wurde zus tzlich ein automatischer Nullabgleich autozero durchgef hrt Bei Betrachtung des Chromatogramms in Abbildung 5 1 ist zu erkennen dass die zu Beginn eluierenden Substanzen lt 5 min verglichen mit dem Rest des Chromatogramms deutlich schlechter getrennt wurde Grund hierf r ist dass in diesem Bereich des Chromatogramms in Extraktionsproben sehr gro e Matrixpeaks Chlorid Lactat auftraten weshalb keine Quantifizierung in diesem Bereich m glich erschien Deshalb wurde auf die chromatographische Trennung von Lactat Pyruvat Formiat und Acetat kein Wert ge
209. cherweise die Produktivit t des Prozesses direkt mit der Anzahl der Zellen korreliert Normalerweise wird zus tzlich das Zellkulturmedium an die Bed rfnisse der gew hlten Zelle angepasst Das Screening zur Auswahl von Zellklonen und Medien erfolgt meist in kleinen Ma st ben und im Anschluss wird eine Ma stabsvergr erung in Bioreaktoren durchgef hrt Anschlie end werden verfahrens technische Parameter optimiert Die urspr nglich genutzten Batch Betriebsweisen wurden in den letzten Jahren gro teils durch Fed Batch Verfahren ersetzt Weiterhin bietet sich bei Perfusions verfahren die M glichkeit die Zellen kontinuierlich mit N hrstoffen zu versorgen und zus tzlich das Produkt und metabolische Abfallprodukte zu entfernen Einen wichtigen Aspekt f r viele Zellkulturprozesse stellt die Apoptose dar da der programmierte Zelltod h ufig das Ende der jeweiligen Prozesse bedeutet Hl Durch das verbesserte Verst ndnis des Wachstums der Molekularbiologie und des Stoffwechsels von tierischen Zellkulturen konnten die Ausbeuten dieser Prozesse erheblich gesteigert werden Insbesondere f r die Produktion von Antik rpern konnte in den letzten 20 Jahren die Produktivit t um das 100fache verbessert werden 6 Neben den quantitativen Aspekten der Produktion von pharmazeutisch genutzten Wirkstoffen spielt die Qualit t dieser Molek le eine entscheidende Rolle W hrend die Aminos uresequenz eines Proteins durch die Expression des entspreche
210. cherweise identische Einstellungen f r verschiedene Sequenzen genutzt werden empfiehlt es sich eine neue Sequenz durch Kopieren einer alten Sequenz zu erstellen e Vorbemerkung Die einzelnen Sequenzen sind nur in Chromeleon zu bearbeiten Die Sequenzen kann man nicht mit dem Total Commander bzw Windows Explorer kopieren verschieben oder l schen e Erstellen einer Sequenz basierend auf einer alten Sequenz Im Browser die alte Sequenz markieren Im Men File gt Save as die Sequenz unter dem gew nschten Namen im Ordner des aktuellen Monats speichern dabei werden die gemessenen Rohdaten nicht mitgespeichert Proben auf single setzen Messprogramm pgm ausw hlen Auswertungsprogramm qnt ausw hlen Injektionsvolumen berpr fen Position der Proben berpr fen e In der Vergangenheit wurden die Messungen der Sequenzen randomisiert d h die Proben wurden in zuf lliger Reihenfolge injiziert Die Randomisierung wurde in einem Excel Dokument 030904Random_ExtrM_N_2 auf dem Desktop durchgef hrt Dies vereinfacht das Eintragen der Proben Kopierfunktionen und Ziehen von Zahlenreihen in Excel e wenn die oben genannten Schritte ber cksichtigt sind dann e im DX 320 Controll Panel Batch gt Start gt Add Chromeleon Local gt DX320 die entsprechende Sequenz ausw hlen gt Open Ready Check wenn alles in Ordnung ist kommt die Meldung Ready Check OK gt Start 1
211. chiedlichen Laufzeiten der Versuche war es aber n tig die Daten vor der Gl ttung zu gewichten um artifizielle Spr nge in den Verl ufen zu vermeiden Dies erkl rt das mitunter deutliche Abweichen der Interpolationskurve von den Messwerten in Abbildung 5 19 Bei Betrachtung des Verh ltnisses von produziertem Lactat zu verbrauchter Glucose ist auff llig dass das theoretische Maximum von 2 mol Lactat zu 1 mol Glucose f r beide Medien deutlich 40 50 84 297 berschritten wurde Verglichen mit der Literatur im Allgemeinen aber auch mit 19 21 48 78 Sind diese Werte erh ht Dies w rde bedeuten dass Versuchen mit der gleichen Zelllinie neben Glucose auch andere Substrate zu Lactat abgebaut wurden Zum Teil k nnte dieses Ergebnis durch die Verdunstung aus Sechs Well Platten w hrend der Kultivierung beeinflusst gewesen sein Da durch diesen Volumenverlust die gemessene Konzentrationsdifferenz von Glucose verringert und f r Lactat erh ht worden w re w re der Ausbeutekoeffizient von Lactat zu Glucose verst rkt dadurch beeintr chtigt Bei Kultivierung in einem befeuchteten Brutschrank wurde die durchschnittliche Verdunstung pro Tag in verschiedenen Versuchen abgesch tzt Daten nicht gezeigt wobei sich ein Wert von 2 75 uL h Well ergab Somit w rde ber die gesamte Kultivierungsdauer von z B 192h ein Volumen von 528 uL von dem Anfangsvolumen von 4000 uL verdunsten Dies w rde bedeuten dass das reale Verh ltnis von La
212. chlie end lie en sich die Verl ufe wieder f r die Medien mit Serum gruppieren In den ersten 18s nach Zugabe des Mediums wurden nur minimale Konzentrations nderungen gemessen Anschlie end fand bis 180 s ein Anstieg auf ein Maximum statt und bis zum Ende des Versuchs schloss sich wieder ein leichter Abfall der Konzentration an F r DMEM ohne Zus tze war die Konzentration 5 Ergebnisse und Diskussion 163 von Malat nach Zugabe des Mediums relativ konstant ber den untersuchten Zeitraum Abbildung 5 36 zeigt die Konzentrationsverl ufe von und UDP GlcNAc Zus tzlich ist der Verlauf der Energy Charge dargestellt 4 Base 5 50 0 97 2h PBS 3 gt d 1 Energy Charge Konz ATP WM n Konz UDP GIcNAc uM 4 d 0 89 Kontr 0 18 180 1800 Kontr 0 18 180 1800 Kontr 0 18 180 1800 Zeit s Abbildung 5 36 Verl ufe der Konzentrationen von ATP und UDP GIcNAc sowie der Energy Charge in MDCK Zellen nach zweist ndiger Inkubation in PBS und anschlie ender Zugabe von neuem Zellkulturmedium DMEM mit verschiedenen Supplementen DMEM 0 DMEM FCS DMEM FCS Glc DMEM FCS Gln A aufgetragen sind Konzentrationen im Well kein Bezug auf Zellzahl oder Zellvolumen Die Zeit nach Zugabe des Mediums ist logarithmisch aufgetragen eine logarithmische Darstellung zu erm glichen wurde der Zeitpunkt t 0 auf den Wert 1 8 s und die Kontrolle auf 0 18 s gelegt zur besseren Visualisierung wu
213. chnitt 5 2 7 1 wurde eine mittlere relative Standardabweichung von 6 2 ermittelt 4 Material und Methoden 39 4 3 2 Zellz hlung Die Zellzahlbestimmung erfolgte mit dem Ger t ViCellXR Beckman Coulter gem der Kurzanleitung Zellz hlger t ViCell XR s Anhang Hierzu wurde das Medium der adh renten Zellen abgenommen 3x mit PBS gewaschen Anschlie end wurden die Zellen mit 1x konzent riertem Trypsin f r ca 30 min behandelt F r Sechs Well Platten betrug das Trypsinvolumen 1 mL pro Well Das Abstoppen der Trypsinaktivit t wurde mit dem gleichen Volumen Zellkulturmedium durchgef hrt Bei Kulturen lter als sechs Tage wurde die Zellsuspension mehrmals auf und abpipettiert um ein komplettes Abl sen der Zellen zu gew hrleisten MDCK Zellen wurden mit den Zelltypen MDCK_100 Abschnitt 5 2 bzw MDCK_big Abschnitt 5 3 und Vero Zellen mit dem Zelltyp Vero_100 gez hlt s Anhang Tabelle A 4 Grunds tzlich wurden bei Versuchsreihen in Sechs Well Platten mindestens drei Wells f r einen Probenahmezeitpunkt zur Zellzahl bestimmung genutzt Details zu jedem Experiment sind den entsprechenden Abschnitten zu entnehmen Basierend auf den mehrfach bestimmten Zellz hlungen der Kultivierungsexperimente wurde eine durchschnittliche relative Standardabweichung bei der Zellz hlung von MDCK Zellen von 5 6 ermittelt Dies bezieht sich auf die Kultivierung von MDCK Zellen in Sechs Well Platten und einer Zellz hlung nach dem beschriebenen Verf
214. chnittliche Wiederfindung lag f r alle untersuchten Bedingungen bei 90 wobei die Standardabweichung bei etwa 30 lag Die meisten Metaboliten wiesen eine vollst ndige oder leicht erniedrigte Wiederfindung auf Beide Methoden zeigten f r beide Zelllinien die gleichen Probleme f r Nukleotide W hrend die Wiederfindung f r Tri und Monophosphate grunds tzlich unter 100 war waren Diphosphatwerte deutlich ber 100 Da die Summe aus Mono Di und Triphosphaten allerdings zu nahezu 100 wiedergefunden wurde lag die Vermutung nahe dass es zu einer Umsetzung von Mono und Triphosphaten zu Diphosphaten kam Da dies eine durch Kinasen katalysierte Reaktion darstellt wurde angenommen dass aktive Enzyme nach der Zugabe des Standards bis zur Zugabe des Extraktionsmittels hier aktiv sind In einem Folgeexperiment konnte diese Hypothese jedoch widerlegt werden Daten nicht gezeigt denn die Umsetzung der Nukleotide erfolgte auch wenn der Standard nach der Extraktionsl sung zugegeben wurde In einem weiteren Experiment wurde die Wiederfindung bei Zugabe des Standards nach der kompletten Probenvorbereitung also nach dem L sen der Proben direkt vor der chromato graphischen Messung getestet und es zeigte sich dass f r diesen Weg nahezu 100 der einzelnen Nukleotide wiedergefunden werden konnte nicht gezeigt Weitere Untersuchungen deuteten an dass eine Umsetzung der Nukleotide w hrend der Extraktion stattfand Bei n herer Betrachtung aller chromat
215. chsels lag wurden nach der Untersuchung der Analyten aus Tabelle 5 1 weitere Bem hungen zur Analyse von Metaboliten niedrigerer Konzentrationen unterlassen Die Metaboliten deren Auftreten in Proben bekannt war wurden durch Nutzung des SIM Modus anhand ihrer charakteristischen m z Verh ltnisse detektiert Dieses Vorgehen garantiert die Reinheit des quantifizierten Peaks Insgesamt gesehen erwies sich das oben beschriebene iterative Vorgehen bei der Entwicklung des Gradientenprogramms der Identifikation von Metaboliten und der Zusammensetzung der Mischung aus Standards als erfolgreich So konnte eine relativ gute Trennung der meisten Substanzen erreicht werden die sp tere berpr fung der Peaks auf ihre Zusammensetzung mittels des MS Detektors best tigte die vermuteten Substanzen Zus tzlich wurden die Konzentrationsbereiche identifiziert in welchen die verschiedenen intrazellul ren Metaboliten nach einer Probenvorbereitung typischerweise auftreten 5 1 3 2 Validierung der Methode und Bestimmung der Standardabweichung unter realen Messbedingungen Die Validierung der Methode zeigte dass f r die untersuchten Standards in Wasser gute Analysenergebnisse erzielt werden konnten F r einige Substanzen existierte auch eine Linearit t ber einen gr eren Konzentrationsbereich und der Messbereich zur Quantifizierung h tte zu h heren Konzentrationen hin erweitert werden k nnen Z B h tten sicherlich die maximalen Konzentrationen f r
216. chselschemas zwar den Stand des Wissens wider ob aber alle dargestellten Stoffwechselwege tats chlich wie beschrieben f r tierische Zellen in Kultur ablaufen kann im Detail nicht beantwortet werden GLUCOSE GLUTAMAT GLUTAMIN een nn Bere JEN GLUTAMAT lt zaa YTOSOL GLUCOS Pentose LUCOSE ee Phosphat Weg PIR A UDP GALNAC 56 Y app Transaminase GLUCOSE 6 PHOSPHAT PHOSP ALANIN 264 ASPARTAT 7 Epimerase Glucosephosphat 1 2 NADP 2 VERSAN a KETOGLUTARAT re FRUCTOSE 6 PHOSPHAT L AH 1 Phosphofnuctokir Ba 1 9 nase Ge E GLUTAMAT UCTOSE 1 6 BI 1 4 1 ERUSTSSENSBISEHOSEHAT een Me Glutamat j i 3 Transaminase hydrogenase 4 DIHYDROXYACETON 1 PHOSPHAT i 5 H Nit Triosephosphat Isomerase a KETOGLUTARAT Aueren E 4 Isocitrat d GLYCERINALDEHYD 3 PHOSPHAT lt ee en EN 1 5 Glycerinaldehyd 3 Phosphat f_ nan P ER Dehydrogenase 1 Dehydrogenase Nabi H ISOCITRAT Isocitrat Lyase SUCCINYL CoA 1 5 1 3 BISPHOSPHOGLYCERAT 2 de roseg za Phosphoglycerat Kinase en Em S e 3 PHOSPHOGLYCERAT cis ACONITAT Krebszyklus cn i Phosphoglycerat Mutase 1 Aconitase AA Dehydrogenase F ADH 1 FUMARAT 2 PHOSPHOGLYCERAT CITRAT 1 ger Se Watt Fumarase mF
217. chspl ne vor allem dann Anwendung wenn limitierte Ressourcen vorhanden sind bzw um den Versuchsaufwand einzuschr nken Bei der Reduktion der Einzelexperimente muss allerdings gewissen Richtlinien gefolgt werden Normalerweise werden fraktionelle faktorielle Versuchspl ne gem der Gleichung 2 deklariert W hrend ein volles faktorielles Design mit drei Faktoren 2 also acht Einzelexperimente erfordert sind f r 2 fraktionelles faktorielles Design nur vier Einzelexperimente n tig Bei p 1 handelt es sich um eine halbe Fraktion bei p 2 eine viertel Fraktion usw Generell spricht man bei 2 Designs von der 1 2 Fraktion eines 2 vollen fraktionellen Versuchsplans Beispielhaft sind in Abbildung 3 5 die zwei halben Fraktionen eines 2 faktoriellen Versuchsplan in A graphisch und B tabellarisch gezeigt Die Auswahl der ersten halben Fraktion erfolgte dadurch dass man nur die Einstellungen w hlte die in der Spalte ABC ein Pluszeichen haben Somit wird die Spalte ABC Designgenerator dieses fraktionellen faktoriellen Experiments genannt F r diese Einstellungen gilt J was auch als Definitionsbeziehung bezeichnet wird Generell gilt dass alle Spalten die gleich der Identit tsspalte sind die Definitionsbeziehung darstellen F r das oben gezeigte 2 Experiment werden die drei verbleibenden Freiheitsgrade genutzt um die drei Haupteffekte A B C zu sch tzen A B Einstellung Faktorieller Effekt
218. chtes PBS in die sterile Abfallflasche abgiessen dazwischen die T Flaschen immer zuschrauben und schwenken Trypsin EDTA Loesung zupipettieren ein duenner Fluessigkeitsfilm genuegt s Volumentab II und die Zellen bei 37 C fiir ca 20 min inkubieren in der Zwischenzeit neue Kulturflasche mit entsprechender Menge Medium befuellen s Volumentab nach 10 min Trypsininkubation die Flasche zum erstenmal leicht schuetteln dann Zellen weiterinkubieren insgesamt ca 20 bis 30 min bis sich die Zellen nach erneutem kraeftigen Schuetteln vom Boden abloesen optische Kontrolle und oder unterm Mikroskop angucken zum Abstoppen der enzymatischen Reaktion FCS s Volumentab III zu den abgeloesten Zellen geben durch mehrmaliges ca 2 3x Aufziehen des Inhaltes der Flasche in eine Pipette erfolgt eine Zellvereinzelung um Schaum zu vermeiden Pipetteninhalt am Flaschenboden oder an der Innenseite der Flasche auslaufen lassen von dieser Zellsuspension entnimmt man 1 3tel bis 1 6tel bei Inkubation in Flaschen mit gleichem Volumen und pipettiert dieses jeweils in eine der vorbereiten Flaschen Berechnung der Einsaatdichte siehe unter Punkt 5 oder 6 Beachte Fuer Zellkultivierung Deckel mit Membran benutzen CO durchlaessig bei Arbeiten mit Virus in den T Flaschen geschlossenen Deckel ohne Membran nehmen Flaschen im Brutschrank bei 37 C und 5 CO inkubieren 4 0 Volumentabelle PBS zum Waschen I Trypsin EDTA
219. ckstoff oder die Methode des Freeze Clamping Einklemmen der Probe zwischen zwei Metallplatten zum schnellen Abk hlen genutzt 22 200 214218 Allerdings ist hier keine Trennung von extra und intrazellul rer Fl ssigkeit m glich Das Abstoppen des Metabolismus von kultivierten tierischen Zellen wurde in der Vergangenheit h ufig durch einen schnellen K hlvorgang der Zellsuspension auf Eis oder einen Waschschritt mit kaltem Puffer durchgef hrt 17 188 215 219 Eine neue Methode zum schnellen Abk hlen von Zellen basierend auf einem W rme bertrager wurde von Wiendahl et al 2007 entwickelt 2201 Nach dem Abk hlen erfolgt typsicherweise die Abtrennung der suspendierten Zellen vom Medium mittels Zentrifugation Von Hofmann et al 2008 wurde f r Hepatozyten HepG2 Zellen ein Abstoppen des Metabolismus durch hei e Luft bewirkt 1201 K rzlich wurde f r CHO Zellen ein erfolgreiches Abstoppen des Stoffwechsels durch Infusion der Probe in gek hltes 40 C 60 Methanol supplementiert mit Ammoniumbicarbonat 0 85 erreicht 2211 Eine weitere M glichkeit w re die Extraktion direkt nach der Probenahme was aber keine Unterscheidung zwischen extra und intrazellul ren Metabolitkonzentrationen erm glicht Dar ber hinaus sind gerade bei tierischen Zellen in Suspension die Zellkonzentrationen relativ niedrig was Schwierigkeiten bei der Quantifizierung durch die gro en Konzentrationsunterschiede zwischen den intra und extrazellul ren M
220. ctat zu Glucose in GMEM Z anstelle von 2 64 bei 2 11 lag und f r EpiSerf anstelle von 2 81 bei 2 43 Diese Werte erscheinen deutlich plausibler Dennoch liegen auch diese Werte deutlich ber dem theoretischen Maximum von 2 Ursache hierf r kann sein dass auch Glutamin und anderen Aminos uren zu 40 42 was ein Verh ltnis von gt 2 zur Folge haben kann Eine Lactat umgesetzt werden k nnen generelle Antwort auf die Frage unter welchen Bedingungen und f r welche Zellen eine solche metabolische Umsetzung stattfindet kann damit nicht gegeben werden Allerdings spielt sicherlich das Kultivierungssystem und die Versorgung der Zellen mit Sauerstoff eine Rolle W hrend ein Gro teil der Literatur die sich auf st chiometrische Ausbeutekoeffizienten bezieht von Studien in Bioreaktoren oder Rollerflaschen berichtet fanden die in der hier vorliegenden Arbeit 5 Ergebnisse und Diskussion 119 durchgef hrten Kultivierungen in Sechs Well Platten also statischen Kulturen statt Es kann davon ausgegangen werden dass sich die Kultivierungsbedingungen unterscheiden insbesondere bez glich der Versorgung mit Sauerstoff Bei einem Volumen von 4 mL Medium pro Well in Sechs Well Platten kann eine Limitation der Sauerstoffversorgung auftreten da die Diffusion des Sauerstoffs durch die Fl ssigkeit eine Beschr nkung darstellt 2 9 Grunds tzlich ist die H he der Fl ssigkeit ber dem Zellrasen von entscheidender Bedeutung Bei Annahme eines zell
221. ctose 1 6 bP Fructose 6 P eo Bu Glucose 3 Verbesserter Gradient und angepasster Standard B 60 07 50 07 65 0 UDP GalINAc Glucose 6 P Cys Fructose 6 P 4 Ribose 6 P 20 07 Pyruvat Ladung nC EI gt 5 9 2 Gin Pro 10 07 5 Fructose Ser 5 E 5 gt LA 0 10 mol L NaOH 0 0 5 07 T T 0 0 5 0 10 0 15 0 20 0 25 0 30 0 35 0 40 0 45 0 50 0 55 0 60 0 65 0 Retentionszeit min Abbildung 5 5 Gradientenprogramme und entsprechende Chromatogramme der gepulsten amperometrischen Detektion der jeweils aktuellen Standardmischung f r die Anlage DX600 Zu Beginn genutztes Programm A verbessertes Gradientenprogramm B Konzentrationen der einzelnen Substanzen zwischen 10 5 und 41 0 uM Durch die Peaks von Glucose und Aminos uren gab es diverse Koelutionen mit den Analyten die von Interesse waren Insbesondere der Bereich des Chromatogramms am Anfang war schwer aufzul sen so dass unklar blieb welche Substanzen mit Glucose eluierten Die Verwendung einer AminoTrap S ule die Aminos uren st rker zur ckhalten sollte als andere Analyten brachte keine merkliche Besserung da alle Aminos uren nur um wenige Minuten sp ter eluierten Auch eine Modifikation des Spannungsverlaufs am amperometrischen Detektor f hrte nicht zu einer selektiven Detektion der gew nschten Metaboliten Da es m glich w
222. culture via manipulation of sugar transport Journal of Biotechnology 131 2 168 176 Liebl Muckter H Doklea E Fichtl Forth W 1995 Reversal of Oxophenylarsine Induced Inhibition of Glucose Uptake in Mdck Cells Fundamental and Applied Toxicology 27 1 1 8 Liebl B M ckter H Doklea E Fichtl B Forth W 1995 Influence of 2 3 dimercaptopropanol and other sulfur compounds on oxophenylarsine mediated inhibition of glucose uptake in MDCK cells Analyst 120 3 771 774 Gstraunthaler G Pfaller W Kotanko P 1985 Biochemical characterization of renal epithelial cell culture LLC and MDCK American Journal of Physiology 248 4 F536 F544 Newsholme P Curi R Gordon S Newsholme EA 1986 Metabolism of Glucose Glutamine Long Chain Fatty Acids and Ketone Bodies by Murine Macrophages Biochemical Journal 239 1 121 125 Morgan MJ Faik 1986 The Utilization of Carbohydrates by Animal Cells In Morgan MJ editor Carbohydrate Metabolism in Cultured Cells New York Plenum Press p 29 75 Ardawi MSM Newsholme EA 1982 Maximum Activities of Some Enzymes of Glycolysis the Tricarboxylic Acid Cycle and Ketone Body and Glutamine Utilization Pathways in Lymphocytes of the Rat Biochemical Journal 208 3 743 748 Mancuso A Sharfstein ST Tucker SN Clark DS Blanch HW 1994 Examination of primary metabolic pathways in a murine hybridoma with carbon 13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Biotechnology and Bioengineering 44 563
223. d einen niedrigen Absorptionswert Die hier erw hnten Experimente erfolgten ausschlie lich mit MDCK Zellen Die in den n chsten Unterpunkten beschriebene Ultraschall behandlung erfolgte auf Eiswasser und dauerte 5 min Perchlors ure Extraktion PCS Methode A Diese Methode orientierte sich dem von Ryll und Wagner HUTH beschriebenen Verfahren Es wurden 1000 uL einer 0 5 M PCS 4 C auf den Zellrasen pipettiert Daraufhin wurden die Sechs Well Platten mit Ultraschall behandelt Der berstand wurde in ein Probengef transferiert und danach zentrifugiert Der berstand wurde abgenommen und das Pellet erneut mit 0 5 M PCS extrahiert danach zentrifugiert Anschlie end wurden die berst nde vereinigt und mit 600 uL 4 Material und Methoden 43 2 5 KOH in 1 5 K HPO neutralisiert Es folgte eine weitere Zentrifugation Der berstand wurde bei 70 C bis zur Messung aufbewahrt Extraktion mit kochendem MeOH Kochendes MeOH Methode B kochendem EtOH Kochendes EtOH Methode und kochendem Wasser Kochendes H20 Methode D Diese Methoden wurden bernommen von Shryock et al 61 Kochendes MeOH Gonzalez et al 211 Kochendes EtOH bzw Bhattacharya et al 1 Kochendes Nach dem Abgie en des berstandes wurde f r Methode B MeOH in H2O 80 2 mL 70 C f r Methode C EtOH in HO 75 2 mL 80 C und f r Methode D 2 mL 95 C auf den Zellrasen pipettie
224. d glutamine levels in baby hamster kidney cell culture Applied Microbiology and Biotechnology 51 579 585 102 Maranga L Goochee CF 2006 Metabolism of PER C6 cells cultivated under fed batch conditions at low glucose and glutamine levels Biotechnology and Bioengineering 94 1 139 150 187 103 Europa AF Gambhir A Fu PC Hu WS 2000 Multiple steady states with distinct cellular metabolism in continuous culture of mammalian cells Biotechnology and Bioengineering 67 1 25 34 104 Gambhir A Korke R Lee JC Fu PC Europa A Hu WS 2003 Analysis of cellular metabolism of hybridoma cells at distinct physiological states Journal of Bioscience and Bioengineering 95 4 317 327 105 Korke R Gatti MD Lau ALY Lim JWE Seow TK Chung MCM Hu WS 2004 Large scale gene expression profiling of metabolic shift of mammalian cells in culture Journal of Biotechnology 107 1 1 17 106 Altamirano C Paredes Caro JJ G dia F 2000 Improvement of CHO cell culture medium formulation simultaneous substitution of glucose and glutamine Biotechnology Progress 16 1 69 75 107 Hassell T Butler M 1990 Adaptation to Nonammoniagenic Medium and Selective Substrate Feeding Lead to Enhanced Yields in Animal Cell Cultures Journal of Cell Science 96 501 508 108 Bell SL Bebbington C Scott MF Wardell JN Spier RE Bushell ME Sanders PG 1995 Genetic engineering of hybridoma glutamine metabolism Enzyme and Microbial Technology 17 2 98 106
225. de anhand dieser Zielgr en basierend auf einem Central Composite Versuchsplans eine genaue Charakterisierung der beiden Probenvorbereitungsmethoden durchgef hrt Ein Optimum f r die Methoden entsprechend allen Zielgr en konnte durch die Verwendung von Desirability Funktionen erreicht werden Bei der berpr fung der Methoden wurden Probleme bez glich der Wiederfindungswerte f r einige Metaboliten festgestellt weshalb im letzten Schritt der Optimierung wichtige Teilschritte der beiden vorab optimierten Methoden kombiniert wurden Die abschlie end ausgew hlte Probenvorbereitungsmethode konnte zuverl ssig Wiederfindungswerte von nahe 100 f r alle Metaboliten gew hrleisten Weiterhin waren die aus MDCK und Vero Zellen extrahierten zellspezifischen Metabolitmengen vergleichbar mit Literaturwerten Eine Absch tzung der relativen Standardabweichung der Methode f r die einzelnen Metaboliten aus mehrfachbestimmten Proben zeigte eine deutliche Abh ngigkeit dieses Wertes vom genutzten Detektor Leitf higkeit 10 2 UV 7 8 MS 14 0 F r die meisten Metaboliten war die relative Standardabweichung ber den untersuchten Messbereich konstant Somit konnte eine zuverl ssige Methode zur simultanen Bestimmung von etwa 30 intrazellul ren Stoffwechselprodukten aus adh renten tierischen Zellkulturen etabliert werden 174 6 Zusammenfassung Die Beobachtung dass MDCK Zellen w hrend einer typischen Batch Kultivierung deutliche Volumen nde
226. de gezeigt werden Diese etablierte Methode wurde im weiteren Verlauf der Arbeit durch die Kopplung eines MS Detektors erweitert um eine bessere Aufl sung der hohen Komple xit t der Metabolitzusammensetzung von Proben zu erreichen Weiterhin wurde in einem systema tischen vierstufigen Prozess basierend auf statistischer Versuchsplanung eine Probenvorbereitung f r die Extraktion von intrazellul ren Stoffwechselprodukten ausgew hlt und optimiert Anhand eines experimentellen Vergleichs von verschiedenen Methoden aus der Literatur wurden im ersten Schritt zur Optimierung der Probenvorbereitung zwei gut geeignete Methoden ausgew hlt Mit diesen Methoden konnte ATP gut extrahiert und Makromolek le in der Probe gut abgereichert werden Weiterhin erlaubten beide Methoden dank fl chtiger Extraktionsmittel eine Verwendung der genutzten Anionen Austausch Chromatographieanlage Im zweiten Schritt des Optimierungs prozesses konnte mit Hilfe eines fraktionellen faktoriellen Versuchsplans der Einfluss mehrerer potentiell relevanter Faktoren auf die Qualit t der Extraktion untersucht werden Um eine m glichst gut geeignete Probenvorbereitung f r die unterschiedlichen Extraktionsverhaltensweisen der verschiedenen Metabolitklassen und Probenzusammensetzungen zu finden wurden vier repr sen tative Zielgr en genutzt Nukleotidgehalt Fructose 1 6 Bisphosphat Gehalt Energy Charge Absorptionswert bei 280 nm Im dritten Schritt des Optimierungsprozesses wur
227. dem entsprechenden Kalibranten sind im Routinebetrieb nicht angeschlossen und somit kann der Kalibrant nicht am Detektor ankommen Zus tzlich ist f r das Autotune ein Fluss MeOH H20 50 50 n tig der den Kalibranten transportiert Dies kann ber die Cone Wash Pumpe erm glicht werden F r das Autotune m ssen folgende Schritte durchgef hrt werden MS Detektor Klappe ffnen Schwarze Kapillare vom externen Ventil kommend an erster Stelle im MS Detektor abschrauben und die nicht verbundene rote Kapillare vom internen Ventil an dieser Stelle anschlie en so dass der Fluss vom internen Ventil zur ESI Nadel gelangt Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 Kapillare vom Cone Wash rechts am MS Detekor angeschlossen abschrauben und auf der linken Seite des MS Deketors am eigentlichen Eingang des Fl ssigkeitsstroms vor dem internen Ventil anschlie en Mittels Rechtsklick auf das MS Symbol rechts unten in der Task Leiste kann der Autotune gestartet werden e Zus tzlich zum Autotune kann im MSQ Fenster unter Detector Voltage die Spannung erh ht werden Ein Arbeitsbereich von bis zu 3000 V ist vom Hersteller angegeben Typischerweise sollten die Schritte der Erh hung 50 V betragen Normalerweise ist eine Erh hung der Spannung nicht h ufiger als alle 3 4 Monate n tig 1 1 Erstellen einer Sequenz e Das Erstellen einer Sequenz kann mit dem entsprechenden Wizard durchgef hrt werden Da aber typis
228. den Mehraufwand durch Nutzung der Anlage DX600 verzichtet werden Somit konnte in dieser Arbeit eine robuste anwenderfreundliche Chromatographiemethode zur Bestimmung von etwa 30 intrazellul r vorkommenden Stoffwechselprodukten ausgew hlt und optimiert werden Diese Methode wurde im weiteren Verlauf der Arbeit genutzt um eine Optimierung der Probenvorbereitung zur Quantifizierung intrazellul rer Metaboliten durchzu f hren Weiterhin wurden mit dieser Methode kultivierte tierische Zellen entsprechend ihren intrazellul ren Metabolitkonzentrationen unter unterschiedlichen Kultivierungszust nden charakterisiert 5 2 Optimierung der Probenvorbereitung Eine Voraussetzung f r eine sinnvolle chromatographische Quantifizierung intrazellul rer Stoffwechselprodukte ist eine an die Anforderungen angepasste verl ssliche Probenvorbereitung Eine direkte Verwendung von in der Literatur beschriebenen Verfahren erschien nicht plausibel da diese Verfahren auf spezielle Anwendungen zugeschnitten wurden Zahlreiche Vorversuche best tigten diese Annahme was sich in nicht zufriedenstellenden Ergebnissen bez glich der gefundenen Metabolitkonzentrationen und Wiederfindungen u erte nicht gezeigt Aus diesem 5 Ergebnisse und Diskussion 69 Grund wurde in dieser Arbeit ein vierstufiger Optimierungsprozess der Probenvorbereitung durchgef hrt Der erste Schritt hierbei war eine Untersuchung g ngiger Extraktionsmethoden Basierend auf diesen Erg
229. der Einfluss von Adenosinnukleotiden sehr wichtig Verschiedene Verh ltnisse von ATP zu ADP und AMP oder auch P wurden als ma gebend f r die Aktivit t zahlreicher Enzyme nachgewiesen 9 Insbesondere die Energy Charge ATP ADP ATP ADP AMP wurde in der Vergangenheit intensiv untersucht und es konnte gezeigt werden dass dieses Verh ltnis entscheidend die Regulation des Zentralstoffwechsels beeinflusst 12 Ein Gro teil der 18 3 Theoretische Grundlagen biochemischen Prozesse in lebenden Organismen wird durch die Hydrolyse von ATP angetrieben wobei ADP oder AMP entstehen ATP kann unter anderem in der Glykolyse durch Substratkettenphosphorilierung regeneriert werden Weiterhin wird ATP in den Mitochondrien durch Atmung gewonnen Dabei wird intramitochondriales NADH H bzw FADH H oxidiert Durch die Elektronentransportkette werden in einer Reihe von Redoxreaktionen Protonen in den Intermembranraum der Mitochondrien gepumpt Diese Protonen k nnen in der Folge dazu genutzt werden die ATP Synthase EC 3 6 3 14 mit Energie zu versorgen wodurch P auf ADP bertragen wird und so ATP entsteht Durch Nukleosiddiphosphat Kinasen EC 2 7 4 6 kann ebenfalls ATP erzeugt werden Dabei wird von einem anderen Nukleosidtriphosphat z B GTP ein Phosphatrest auf ein ADP bertragen Eine weitere M glichkeit ATP zu regenerieren ist die Reaktion von zwei ADP zu einem AMP und einem ATP Diese Reaktion wird katalysiert durch die Adenyl
230. des Detektors vorgebeugt werden soll Die Anordnung der bestehenden Anlage wurde leicht ver ndert Nach dem UV Detektor wurde ein externes Ventil eingebaut um ein Zu bzw Wegschalten des Eluentenstroms zum MS Detektor zu erm glichen Da in den Chromatogrammen typischer Extraktionsproben mehrere gro e Matrixpeaks bzw Verunreinigungen durch anorganische Salze auftraten sollte so eine unn tige Verschmutzung des MS Detektors durch Wegschalten bei Elution dieser Verunreinigungen vermieden werden Ebenso wie die oben erw hnte Cone Wash Funktion sollte diese Ma nahme ein stabiles Detektionsverhalten des MS Detektors w hrend l ngerer Messreihen unterst tzen Das Ger t wurde im Negativ Modus betrieben was hei t dass negativ geladene Molek le detektiert werden Eine detaillierte Beschreibung der ver nderten Anordnung der Chromatographieanlage ist im Anhang in der Arbeitsanweisung BioLC Anlage DX320 gegeben s Anhang 5 Ergebnisse und Diskussion 57 Identifikation und Verifizierung von Metabolitpeaks Nach Installation und Anpassung grunds tzlicher Parameter des MS Detektors wurden diverse Extraktionsproben im Scan Modus vermessen was bedeutet dass das Vorkommen s mtlicher m z Fragmente von 50 800 ber den gesamten Chromatographielauf aufgezeichnet wurde Entsprechend den Erwartungen konnten in Scan L ufen allen Peaks die vermeintlichen Metaboliten die der Standardmischung zugesetzt waren zugeordnet werden Allerdings zeigte sich
231. des related to photosynthetic metabolism by high performance anion exchange liquid chromatography with fluorometric and ultraviolet detection Analytical Biochemistry 314 1 63 69 180 Schoenherr I Stapp T Ryll T 2000 A comparison of different methods to determine the end of exponential growth in CHO cell cultures for optimization of scale up Biotechnology Progress 16 5 815 821 181 Tomiya N Ailor E Lawrence SM Betenbaugh MJ Lee YC 2001 Determination of nucleotides and sugar nucleotides involved in protein glycosylation by high performance anion exchange chromatography Sugar nucleotide contents in cultured insect cells and mammalian cells Analytical Biochemistry 293 1 129 137 182 Cohn WE 1949 The separation of purin and pyrimidine bases and of nucleotides by ion exchange Science 109 377 378 183 van Dam JC Eman MR Frank J Lange HC van Dedem GWK Heijnen SJ 2002 Analysis of glycolytic intermediates in Saccharomyces cerevisiae using anion exchange chromatography and electrospray ionization with tandem mass spectrometric detection Analytica Chimica Acta 460 2 209 218 184 Jensen NBS Jokumsen KV Villadsen J 1999 Determination of the phosphorylated sugars of the Embden Meyerhoff Parnas pathway in Lactococcus lactis using a fast sampling technique and solid phase extraction Biotechnology and Bioengineering 63 3 356 362 185 Smits HP Cohen A Buttler T Nielsen J Olsson L 1998 Cleanup and analysis of sugar phosphates
232. determination of changes of glycolytic metabolites in yeast on a subsecond time scale using extraction at neutral pH Analytical Biochemistry 204 1 118 123 211 Gonzalez B Francois J Renaud M 1997 A rapid and reliable method for metabolite extraction in yeast using boiling buffered ethanol Yeast 13 14 1347 1355 212 Theobald U Mailinger W Baltes M Rizzi M Reuss M 1997 In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae 1 Experimental observations Biotechnology and Bioengineering 55 2 305 316 213 Wollenberger A Ristau O Schoffa G 1960 Eine einfache Technik der extrem schnellen Abk hlung gr erer Gewebestiicke Pflugers Archiv Fur Die Gesamte Physiologie Des Menschen Und Der Tiere 270 4 399 412 214 Roessner U Wagner C Kopka J Trethewey RN Willmitzer L 2000 Simultaneous analysis of metabolites in potato tuber by gas chromatography mass spectrometry Plant Journal 23 1 131 142 215 Khym JX Bynum JW Volkin E 1977 The co use of retention time and bandwidth measurements in evaluations of nucleotide pools by ion exchange chromatography Analytical Biochemistry 77 2 446 463 216 Mandel P 1964 Free nucleotides in animal tissues Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 3 299 334 217 Riss TL Zorich NL Williams MD Richardson A 1980 Comparison of the efficiency of nucleotide extraction by several procedures and the analysis of nucleotides from extracts of liver and isolated hepatocyte
233. deutlich in positiv und negativ korrelierende Spalten Bei Betrachtung der Abbildung von links oben nach rechts unten fallen einige offensichtliche Korrelationen auf So korrelierte die Zellzahl mit dem Gesamtzellvolumen positiv Bei diesen beiden Variablen ist auch der als Zahl aufgef hrte Zeitversatz einfach nachzuvollziehen So zeigte das Gesamtzellvolumen y Achse einen negativen Zeitversatz 10 h gegen ber der Zellzahl x Achse Dies bedeutet dass die Verlaufskurve der Zellzahl nach links auf der Zeitachse also zu fr heren Zeitpunkten verschoben werden muss um eine Deckung mit der Verlaufskurve des Gesamtzellvolumens zu erreichen Zur besseren Verdeut lichung ist hier auf die zeitlichen Verl ufe der Zellzahl und des Gesamtzellvolumens in Abbildung 5 18 verwiesen Weiterhin waren die Ammoniumkonzentration und die Energy Charge mit den eben erw hnten Variablen Zellzahl und Gesamtzellvolumen positiv korreliert Ein Gro teil der weiteren Variablen ist mit dieser Gruppe allerdings negativ korreliert Auf die zeitlichen Verschie bungen wird an dieser Stelle nur in Einzelf llen eingegangen und auf die Diskussion verwiesen Besonders auff llig ist der Block der Zuckerphosphate welche stark positiv miteinander und auch mit der Glucosekonzentration korreliert war Die Werte f r die Zeitverschiebung f r Glucose deuten einen zeitlich verz gerten Verlauf gegen ber den meisten Zuckerphosphaten an Auch gegen ber der Zellzahl dem Gesamtz
234. die Konzentration in dem Medium mit Glutamin deutlich h her lag als f r die anderen Medien Zus tzlich sind in Abbildung 5 25 die extrazellul ren Konzentrationen von Glutamin Glutamat und Ammonium dargestellt F r die glutaminhaltigen Medien wurde ein Abfall der Glutaminkonzen tration bis etwa 72 h gemessen was einem typischen Verlauf entspricht F r die Konzentration von Glutamat wurde f r alle Medien zu Beginn ein leichter Anstieg gemessen W hrend anschlie end die glucosehaltigen Medien einen Abfall der Konzentration zeigten blieb die Glutamatkonzen tration f r die beiden anderen Medien relativ konstant bis zum Ende der Kultivierung Abbildung 5 26 zeigt die Verl ufe von ATP der Energy Charge und UDP GlcNAc F r ATP ist deutlich zu erkennen dass ber den gesamten Verlauf unabh ngig vom Substrat eine relativ konstante Konzentration vorlag Die Energy Charge zeigte deutliche Unterschiede f r die Medien mit und ohne Glucose in den ersten 24 h W hrend die glucosefreien Medien zu Beginn einen Wert von etwa 0 92 aufwiesen war die Energy Charge f r die glucosehaltigen Medien deutlich niedriger ca 0 88 Ab etwa 24 h bewegte sich der Wert f r die Energy Charge unabh ngig vom Medium in einem Fenster von 0 92 0 96 Repr sentativ f r die Zuckernukleotide ist UDP GlcNAc gezeigt Grunds tzlich war f r alle Substrate die Konzentration zu Beginn der Kultivierung hoch und sank bis etwa 48 h stark ab Allerdings war f r die Medien
235. die Bestimmung von Enzymaktivit ten erreicht z 2 2 65 6 Insbesondere f r die Untersuchung der Regulation von Stoffwechselwegen sind diese Daten von gro er Bedeutung Im Zusammenspiel mit den Ergebnissen zu Enzymaktivit ten erwiesen sich die intrazellul ren Konzentrationen von Stoffwechselintermediaten als erforderlich f r die Bestimmung der Regulationsmechanismen von Enzymen Eine Zusammenf hrung der Daten von Enzymaktivit ten und Metabolitkonzentrationen erfolgte auf mathematischer Ebene in Form der Metabolischen Kontrollanalyse Die Theorie hierzu besagt dass die Kontrolle des Flusses durch einen Stoffwechselweg nicht durch einen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt ausge bt wird sondern die Summe aller Enzyme kontrolliert mit unterschiedlich gro en Kontrollkoeffizienten den Fluss 112 113 Zahlreiche Arbeiten befassten sich mit der Bestimmung von intrazellul ren Nukleotidkonzen trationen in tierischen Geweben Auch f r kultivierte tierische Zellen wurden intrazellul re Nukleotide insbesondere wegen ihres regulatorischen Einflusses bez glich ihrer Konzentrationen und deren zeitlichen Konzentrationsverl ufe untersucht amp 3 141171 20 3 Theoretische Grundlagen Gro en Erkenntnisgewinn zum Stoffwechsel von kultivierten tierischen Zellen brachten zahlreiche Versuche im Zusammenhang mit Metabolischer Stoffflussanalyse Unter der Annahme eines station ren Zustandes kann durch Bilanzierung der extrazellul ren K
236. dings traten f r MDCK Zellen unabh ngig vom Zellkulturmedium und den Kultivie rungszust nden die in dieser Arbeit untersucht wurden keine gr eren qualitativen Unterschiede auf was hei t dass die Hauptkomponenten der Proben die gleichen blieben Da die bis dahin nicht identifizierten m z Fragmente verglichen mit identifizierten Fragmenten in relativ niedriger Intensi t t auftraten wurden nur vereinzelt Versuche unternommen die Herkunft der Fragmente zu kl ren Optimierung der Single lon Monitoring SIM Methode Da einige Substanzen tiberlappende Retentionszeitfenster hatten sollte mittels MS Detektion eine zweifelsfreie Quantifizierung erreicht werden Um eine Quantifizierung mit dem MS Detektor durchzufiihren war es vorteilhaft den Arbeitsbereich der m z Werte auf eine kleinere Anzahl von Werten zu beschr nken So k nnen die einzelnen m z Werte mit einer h heren Wiederholungsrate und somit ber einen l ngeren Zeitraum gescannt werden Dies f hrt letztlich zu einer verbesserten Sensitivit t da eine h here Anzahl eines bestimmten m z Fragmentes am Ionendetektor eintrifft Da in diesem Fall die Substanzen die gemessen werden sollten bekannt waren konnte eine Optimierung der Konusspannung des MS Detektors f r die verschiedenen Substanzen mit Standards durchgef hrt werden Dazu wurde die Signalgr e der unterschiedlichen Substanzen in Abh ngigkeit der unterschiedlichen Einstellungen begutachtet nicht gezeigt Es wurde ein
237. ds Gehalt pro __Wiederfind 5 Gehaltpro __Wiederfind SEM Zelle SEM 30 ul 70 pl Zelle SEM 30 ul 70 ul fmol Standard Standard fmol Standard Standard 3PG 25 0 13 40 01 109 346 0 1142442 0144001 112 3 14 0 112 1 5 4 ADP 200 0 62 0 06 138 046 3 132 6 5 0 0 50 0 02 165 243 9 141 0 5 6 AMP 100 0 10 0 02 113 043 2 107 2 2 5 0 04 0 00 103 6 2 6 98 0 3 3 AMP Ribose 5 P 100 25 0 10 0 02 97 5 23 92 0 2 7 0034001 933 28 91 0 3 1 ATP 400 4 49 0 12 89 9380 89 3 43 5 4 5840 08 93 9 7 1 86 2 4 2 CDP 25 0 04 0 00 138 843 7 140 9 4 3 0 05 0 00 146 7 4 0 140 3 6 3 cis Aconitat 25 0 02 0 00 104 243 0 94 9 27 0 02 0 00 92 1424 93 4 2 1 Citrat CDP 335 25 2 05 0 07 104 3 4 5 104 1 43 5 2 08 0 05 108 645 5 101 7 3 8 CMP 25 0 04 0 00 Jenni 56 2 2 2 0 03 0 00 48 5 2 0 54 4 6 5 CTP 40 0 50 0 02 104 348 6 105 9 5 8 0 50 0 01 109 6 9 3 99 4 5 6 Fructose 1 6 bP 228 1 25 40 07 1003449 102 743 0 1 2440 03 107 8 37 100 5 3 6 Fructose 6 P 35 0 06 0 01 68 9 2 8 47 6 4 3 0 06 0 00 85 8 30 77 8 1 7 Fumarat 50 0 20 0 01 90 443 6 83 2 11 3 0 1920 01 947462 95 1 4 4 GDP 40 0 12 40 01 119 845 9 112 9 4 1 0 08 0 00 137 044 0 112 6 4 7 Glucose 6 P 35 0 23 0 03 118 047 9 91 2 10 4 0204001 1409491 103 1 5 7 GMP 25 0 69 342 7 64 8 1 7 0 67 1 2 5 66 8 43 2 GTP 79 1 03 0 03 109 7 48 8 108 5 4 8 1 05 0 02 116 948 0 104 7 5 5 Malat CMP 200 25 1 02 0 05 90
238. e Untersuchung zu dieser Einflussgr e folgte Optimierung der Methode MeOH CHCI Fraktioneller faktorieller Ansatz F r die Methode MeOH CHC wurden f nf relevante Schritte analog zur Methode MeOH Kochen berpr ft s Abbildung 5 7 B Die getesteten Niveaus f r die unterschiedlichen Faktoren sind in Tabelle 4 3 zusammengefasst Nach Durchf hrung der Extraktionen unter den acht f r dieses Experiment erforderlichen Bedingungen wurden die Ergebnisse an die Gleichung 3 3 angepasst Die Ergebnisse der statistischen Auswertung sind in Tabelle A 10 im Anhang dargestellt Folgende optimale Arbeitspunkte konnten nach der Auswertung identifiziert werden Das Volumen an CHCl sollte gro sein das Verh ltnis aus MeOH Puffer sollte klein sein eine Ultraschall Behandlung war nicht n tig Tricine sollte als Puffer dienen und eine zweite Extraktion sollte durchgef hrt werden s gestrichelte horizontale Linien in Abbildung 5 8 F r die weiteren Experimente mit der Methode MeOH CHC wurde somit kein Ultraschall genutzt und es wurde jede Probe zweimal extrahiert Mit diesen Experimenten konnten durch den Einsatz von fraktionellen faktoriellen Versuchspl nen mit einem berschaubaren Aufwand eine gro e Anzahl von Einflussgr en untersucht werden Die Effekte von einer Reihe von Einflussgr en auf die verschiedenen Zielgr en konnte gekl rt werden F r andere Faktoren konnten die Effekte jedoch nicht klar eingeord
239. e diese rausnehmen Im Browser gt DX 320 im entsprechenden Monat kann man feststellen wo die Anlage nach dem Stromausfall stehen geblieben ist Alle Proben die mit Finished bezeichnet sind sind schon gelaufen Die die mit Single bezeichnet sind m ssen noch laufen Die Anlage kann wieder gestartet werden s Sequenz starten 1 DX 320 Anlage ausschalten 1 1 1 Anlage f r 2 bis 5 Stunden ausschalten e Im DX 320 ControlPanel Suppressor auf 0 mA einstellen UV Lampe aus Autosampler disconnect Pumpe disconnect e Pumpe aus e Die Anlage komplett ausschalten 1 2 Anlage f r lange Zeit ausschalten mehr als 5 Stunden e Im DX 320 ControlPanel Suppressor auf einstellen UV Lampe ausschalten Autosampler disconnect Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 Pumpe disconnect Suppressor ausbauen Eluent In und Eluent Aus bzw Regen In und Regen Aus mit Zwischenst ck zusammenverbinden Den Suppressor mit dest Wasser sp len und mit Blindstopfen verschlie en Die S ule und Vors ule ausbauen und im K hlschrank lagern Die Kapillaren mit Zwischenst cken verbinden Das System ca 2 Tage mit Wasser laufen lassen In den Eluentenflaschen ein bisschen NaAzide dazugeben Die Anlage komplett ausschalten 1 T gliche Pflege der DX 320 Anlage Handschuhe und Schutzbrille benutzen Ausreichend Wasser in der Eluentenflasche vorhanden Verbrauch
240. e eine lineare Regression zur Absch tzung der Standardabweichung gew hlt Hierbei ist der y Achsenabschnitt als konzentrationsunabh ngiger ger tebedingter Messfehler zu interpretieren Die Gr e dieses Wertes ist ausschlaggebend f r den Anstieg der relativen Standardabweichung bei niedrigen Konzentrationen Je gr er der Wert des y Achsenabschnittes im Verh ltnis zur Konzentration desto gr er ist bei niedrigen Messwerten die relative Standardabweichung F r Metaboliten deren Regression einen negativen Wert f r den y Achsenabschnitt aufgewiesen h tte wurde die Gerade durch den Ursprung gezwungen da eine negative Standardabweichung keinen Sinn ergibt Die Steigung der Regressionsgeraden entspricht dem konzentrationsabh ngigen Fehler 5 1 2 Anionen Austausch Chromatographie mit der Anlage DX600 Die Chromatographieanlage DX600 war konzipiert f r die Analyse von Zuckern phosphorylierten Zuckern und hnlichen Molek len Somit wurde eine S ule des Typs CarboPac und die Detektion mittels Gepulster Amperometrie gew hlt Die Elution sollte durch die Anwendung von Natriumacetat und Natronlauge realisiert werden Die grunds tzliche Nutzbarkeit dieser Anlage war vom Hersteller gezeigt worden allerdings war die Frage offen ob eine Anwendung f r die Analyse von intrazellul ren Metaboliten m glich ist Somit musste z B gekl rt werden ob die Trennleistung der Anlage f r die Komplexit t des Probengemischs ausreichend ist die
241. ebnissen wurden im zweiten Schritt f r zwei Methoden verschiedene Einflussgr en auf ihre Effekte untersucht Der dritte Schritt wurde konzipiert um eine genaue Charakterisierung von wichtigen Einflussgr en zu erreichen Auf diese Weise wurden zwei gute Methoden zur Probenvorbereitung entwickelt Diese wurden anschlie end miteinander verglichen Im vierten Schritt wurden durch eine Kombination von beiden Methoden neu entdeckte Probleme durch Enzymaktivit ten behoben 5 2 1 Untersuchung von in der Literatur h ufig genutzten Extraktionsmethoden Wie oben erw hnt finden unterschiedlichste Methoden f r die Extraktion von intrazellul ren Stoffwechselprodukten des Energiestoffwechsels Anwendung Daher erschien es notwendig die Eignung der jeweiligen Methoden f r die Extraktion der Metaboliten unter den hier vorliegenden Bedingungen zu berpr fen bzw eine Vergleichbarkeit der Methoden zu best tigen In drei unabh ngig durchgef hrten Experimenten sollte eine m gliche Nutzung der verschiedenen Methoden best tigt bzw widerlegt werden Zur Beurteilung der Qualit t der unterschiedlichen Extraktionsmethoden wurden einerseits die Menge extrahiertem ATP gemessen per Lumineszenz Methode und andererseits die Verunreinigungen die bei einer Wellenl nge von 280 nm absorbieren quantifiziert Ersteres sollte als Ma f r die Extraktion und die Solubilisierung von niedermolekularen Metaboliten dienen Die zweite Messgr e sollte eine Absch
242. edium durch PBS war dass die verschiedenen Stoffwechselzwischenprodukte nach dem Entzug der N hrstoffquelle in ihren Konzentrationen abfallen Als offene Frage galt zu kl ren mit welcher Geschwindigkeit dieser Abfalls in Abh ngigkeit vom Metabolit bzw der Metabolitklasse ausf llt bzw ob manche Meta boliten in den kurzen Zeitr umen dieser Experimente keinen Konzentrationsabfall zeigen Die experimentellen Zeitfenster die hier beobachtet wurde waren je nach Experiment zwischen 6 min und 2 h F r diese Zeitr ume wurde angenommen dass die Zellzahl konstant ist F r Versuche die sich ber etwa 30 min erstreckten war diese Annahme sicherlich gerechtfertigt da keine Bedingungen gew hlt wurden die eine direkte Zerst rung der Zellen zur Folge gehabt h tten ber einen Zeitraum von 2h in PBS wurden zur berpr fung in mehreren Versuchen Zellz hlungen durchgef hrt und es waren keine signifikanten nderungen festzustellen nicht gezeigt Drei unabh ngige Versuche wurden durchgef hrt Die Konzentrationsverl ufe jedes Metaboliten wurden f r jeden Versuch auf den Startwert normiert um m gliche Unterschiede aus den vorangehenden Kulturen zu kompensieren F r viele Metaboliten erwies sich diese Ma nahme durchaus als sinnvoll so dass eine gute bereinstimmung der Verl ufe in den berlappenden Zeitfenstern der verschiedenen Versuche erreicht wurde Als negatives Beispiel ist hier der Verlauf von G6P zu nennen W hrend der Verlauf b
243. edlichen Stoffwechselprodukten zu optimieren Weiterhin war die Methode insbesondere auf die Kultivierung adh renter Zellen anzupassen Ein weiterer relevanter Punkt f r die Auswahl der Probenvorbereitung war der hohe Proteingehalt des Zellkulturmediums aufgrund des darin enthaltenen Serums Explizit zu erw hnen ist als zus tzlicher kritischer Aspekt die Nutzung der AAC zur Quantifizierung der Metaboliten Diese Chromatographiemethode setzt f r eine l ngerfristige Nutzung einen relativ hohen Reinheitsgrad der Proben voraus Weiterhin war der Einsatz der h ufig genutzten Probenvorbereitungsmethode mit Perchlors ure PCS s Abschnitt 3 4 2 in Kombination mit einer AAC nicht m glich da die vergleichsweise hohe Perchlorat konzentration in den Proben nach der Probenvorbereitung die Elution und Detektion erheblich st ren Zus tzlich waren f r die spezielle Anwendung mehrere Fragen zur Durchf hrung offen wie z B die Anpassung an das Kultursystem oder die Volumenverh ltnisse der Extraktionsmittel Da aufgrund der zahlreichen Einflussgr en von einem erheblichen experimentellen Aufwand auszugehen war erschien es erforderlich die Untersuchungen systematisch durchzuf hren Eine Versuchsplanung entsprechend statistischen Methoden erschien als eine plausible Vorgehensweise Dar ber hinaus bot die objektive Optimierung anhand von Desirability Funktionen eine sinnvolle Vorgehensweise bei der Auswahl einer Extraktionsmethode an Im dritten Meile
244. egulatorischen Effekt an Ebenso war scheinbar die Reaktion von Succinat zu Fumarat durch die beiden Medien unterschiedlich beeinflusst da gerade bis 48 h die Verh ltnisse der Konzentrationen in den Medien verschieden waren Zum Ende der Kultivierungen lag aber f r Succinat und Fumarat die Konzentration in EpiSerf deutlich unter der in GMEM Z Ein m glicher Einfluss an dieser Stelle k nnte das Redoxverh ltnis FAD FADH gespielt haben Dadurch k nnte bei dieser Reaktion das Konzentrationsgleichgewicht von Succinat zu Fumarat verschoben worden sein Malat zeigte einen vergleichbaren Konzentrationsverlauf wie Fumarat Ein identisches Verhalten dieser beiden Metaboliten wurde auch in der Korrelationsanalyse f r alle Experimente Abbildung 5 15 gefunden Wie bereits oben bemerkt ist die durch die Fumarase katalysierte Reaktion scheinbar sehr aktiv und wahrscheinlich st ndig im Gleichgewicht 12951 Nukleotide Die gezeigten Konzentrationen von Nukleotiden und Zuckernukleotiden Abbildung 5 20 wiesen zum Teil sehr hnliche aber auch mitunter deutlich unterschiedliche Verl ufe auf Im Bezug auf medienbedingte Unterschiede ist besonders ATP zu nennen Zwar sind die exakten Verl ufe zu Beginn der Kultivierungen durch die vergleichsweise breite Streuung schwer zu beurteilen Die 5 Ergebnisse und Diskussion 127 dennoch deutlich h here Konzentration in Episerf innerhalb der ersten etwa 100h ist jedoch offensichtlich Grunds tzlich waren d
245. ehlerquadratsumme POS Freiheitsgrade Mittl Fehlerquadrate MFQ Fo FQScruppe m 1 MFQoruppe Fo MFQarppe MFQrenier n m MFQrehter FQScesame 1 Anzahl der Proben Anzahl der Gruppen m Schwankungsquelle Zwischen den Gruppen Innerhalb der Gruppe Gesamt 245 247 250 F r eine detaillierte Beschreibung sei auf die Literatur verwiesen Im Falle eines Experiments mit mehreren Faktoren wie zum Beispiel das oben erw hnte 2 Faktor 2 Level Experiment wird jeder Faktor auf Signifikanz getestet Dies bedeutet dass f r Faktor A Faktor B und die Interaktion aus A und B je eine Fehlerquadratsumme berechnet wird Neben vielen verschiedenen M glichkeiten f r faktorielle Versuchspline kommt 2 faktoriellen Designs eine besondere Bedeutung zu da sie besonders h ufig in der Forschung und Entwicklung angewendet werden Weiterhin bilden sie oft die Grundlage f r weitere Arten von Versuchspl nen Screeningexperimente werden h ufig gem 2 Versuchsplinen durchgef hrt Diese Versuchspl ne erm glichen die geringste Anzahl von Einzelexperimenten f r k Faktoren Da f r jeden Faktor nur zwei Niveaus untersucht werden wird angenommen dass eine lineare Abh ngigkeit der Zielgr e vorliegt F r Screeningexperimente ist das h ufig eine akzeptable Annahme In der einfachsten Form eines 2 faktoriellen Designs werden zwei Faktoren k 2 wie in Abbildung 3 4 als zwei dimensionales Rechteck dargestellt untersuc
246. eht der Gradient dem Chromatogramm ca 5 min voraus Da durch einen sehr flachen Gradienten die Elutionszeit stark verl ngert wird wurden vor den Bereichen mit einem sehr flachen Gradienten ein KOH Peak gegeben Dadurch konnte die Retentionszeit verk rzt werden aber die Qualit t der Trennung aufrecht gehalten werden Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 e Dasich allerdings die Qualit t der S ulen von Batch zu Batch unterscheiden und auch ber den Nutzungszeitraum einer S ule qualitative Ver nderungen der S ule auftreten muss der Gradient durchaus gelegentlich ver ndert werden um eine optimale Trennung zu gew hrleisten Anhand der hier gegebenen Empfehlungen l sst sich dies aber problemlos durchf hren Weiterhin ist bei der Elution der Substanzen zu bemerken dass die Metabolite bei stark abweichenden Retentionszeiten nicht mehr in den entsprechenden Fenstern zur Detektion f r vor allem mittels MS aber auch UV f r CMP Fumarat AMP wegen des Wechsels zw 260 und 220 nm eluieren 1 1 Betrieb des MS Detektors e Bei Betrieb des MS Detektors endet der Eluentenfluss im MS Detektor so dass ein getrennter Regenerationsfluss f r den Suppressor betrieben werden muss Dazu steht auf der Anlage eine 41 Kunststoffflasche die mit H2O bef llt werden muss Auch diese Flasche kann w hrend des Betriebs bef llt werden aber es ist ebenfalls darauf zu achten dass ein Restvolumen von 1 nicht unterschritten wi
247. eigenden Basislinie Eine deutliche Verbesserung der Leitf higkeitsdetektion wurde durch die Einf hrung von Suppressoren erreicht Eine rasche Weiterentwicklung dieser Ger te und 153 auch f r die Analyse von organischen S uren 11581811 Diese zahlreiche Anwendungen folgten Ger te sind normalerweise zwischen analytischer S ule und Detektor positioniert Bewirkt wird die Ionensuppression durch einen Austausch der Kationen des Eluenten mit Protonen welche sich mit den Hydroxidionen zu Wasser verbinden Durch Wasser wird kein Signal am Leitf higkeitsdetektor 162 weshalb der Eluent keinen Einfluss auf die Detektion hat Als weiteres erzeugt Detektionsprinzip in der Ionen Chromatographie gewann in den letzten Jahren besonders die Gepulste Amperometrische Detektion an Popularit t 11631691 Gerade f r organische Molek le wie Zucker oder Aminos uren erwies sich diese Art der Detektion als besonders n tzlich 19 166 171 Neben den verbesserten Detektoren war die Einf hrung der elektrochemischen Eluentengeneration in der Ionen Chromatographie ein gro er Fortschritt in Bezug auf Anwenderfreundlichkeit und Reproduzierbarkeit 16 1691 Zur Erzeugung eines Eluenten f r die AAC wird durch einen stark sauren Kationen Austauscher Wasser gepumpt und an den Enden dieser Austauschers ule eine Spannung angelegt wobei Anode am S uleneingang und Kathode am S ulenausgang positioniert sind Durch elektrolytische Reaktion wird das Wasser an de
248. eigt Auf die Verl ufe der weiteren Metaboliten kann durch die Kreuzkorrelationsmatrix Abbildung 5 30 r ckgeschlossen werden Als erster Metabolit der Glykolyse zeigte G6P nach dem Substratentzug nach kurzer Verz gerung einen deutlichen Abfall der Konzentration F r Experiment 2 lagen die Werte nach ca min deutlich h her und schwankten relativ stark Einen sehr hnlichen Verlauf wies die Konzentration von F6P auf nicht dargestellt Ein eindeutiges Verhalten zeigte der Verlauf von F16bP Nach einer konstanten Konzentration in etwa den ersten 0 5 min fiel innerhalb 1 min die Konzentration auf einen nicht nachweisbaren Wert Die Konzentration des n chsten gemessenen Metaboliten der Glykolyse 3PG verhielt sich dem entgegengesetzt Nach einem relativ konstanten Niveau zu 148 5 Ergebnisse und Diskussion Beginn der Experimente bis etwa 3 min erfolgte in den folgenden 30 40 min ein Anstieg der Konzentration auf etwa das Dreifache des Startwertes Danach schloss sich ein leichter Konzentrationsabfall an Der Verlauf der Konzentration von PEP war dem von 3PG nahezu identisch nicht gezeigt Die gemessene Pyruvatkonzentration fiel ber den gesamten Verlauf ab Ein leichtes Wellenverhalten war zu erkennen wobei die lokalen Maxima bei etwa 1 5 min bzw 30 min lagen Rel Konz G6P lt OS lt 2 8 oO 2 5 2 N z Do 5 1 ER 1 0 ir N S 506 2 xX 04
249. eijnen JJ Daran JM 2006 When transcriptome meets metabolome fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation Molecular Systems Biology Article Nr 49 1 16 141 van der Werf MJ Overkamp KM Muilwijk B Coulier L Hankemeier T 2007 Microbial metabolomics toward a platform with full metabolome coverage Analytical Biochemistry 370 1 17 25 142 Dunn WB 2008 Current trends and future requirements for the mass spectrometric investigation of microbial mammalian and plant metabolomes Physical Biology 5 1 11001 143 Ramautar Demirci A de Jong GJ 2006 Capillary electrophoresis in metabolomics Trends in Analytical Chemistry 25 5 455 466 144 Dunn WB Bailey NJC Johnson HE 2005 Measuring the metabolome current analytical technologies Analyst 130 5 606 625 45 Villas Boas SG Mas S Akesson M Smedsgaard J Nielsen J 2005 Mass spectrometry in metabolome analysis Mass Spectrometry Reviews 24 5 613 646 146 Wilson ID Plumb R Granger J Major H Williams R Lenz EM 2005 HPLC MS based methods for the study of metabonomics Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 817 1 67 76 147 LaCourse WR 2002 Column liquid chromatography Equipment and instrumentation Analytical Chemistry 74 28 13 2832 148 Dorsey JG Cooper WT Siles BA Foley JP Barth HG 1998 Liquid chromatography Theory and methodology Analytical Chemistry 70 591R 644R
250. eise bedingt durch 139 308 Oszillationen der Glykolyseintermediate vorlagen w re durch weitere Experimente und komplement re Messverfahren zu berpr fen Die in Abbildung 5 31 gezeigten organischen S uren aus dem Krebszyklus wiesen relativ starke Konzentrationszunahmen auf Aufgrund des hnlichen Konzentrationsverlaufs von Citrat und Malat 158 5 Ergebnisse und Diskussion ist anzunehmen dass diese Stoffwechselprodukte gemeinsam reguliert werden Dem gegen ber verlief die Konzentration von a Ketoglutarat deutlich anders was wiederum darauf schlie en l sst dass zwischen diesen Stoffwechselprodukten ein regulatorisch relevanter Schritt liegen muss Die intrazellul re Konzentration von ATP sank im Verlauf des Experiments um etwa 20 Die Energy Charge die direkt mit ATP verkn pft ist sank auf einen Wert unter 0 9 was einem Wert entspricht der unter typischen Kultivierungszust nden nur in Ausnahmen auftritt s Abschnitt 5 3 2 2 und 5 3 2 3 Hierf r urs chlich war nicht nur der Abfall der ATP Konzentration sondern ein gleichzeitig stattfindender Anstieg von ADP und AMP Eine genauere Diskussion dieses Ergebnisses wird weiter unten im Zusammenhang mit der Literatur gegeben Die Konzentration von UDP GlcNAc stieg um mehr als 10 an Grund hierf r k nnte in der essentiellen Bedeutung der extrazellul ren Glucosekonzentration f r die intrazellul re Konzentration der UDP aktivierten Aminohexosen liegen gt
251. eits durchgef hrt 29 301 Verglichen mit einer Scheininfektion konnten in einer mit Influenza Virus infizierten Kultur nach einer anf nglichen Periode unver nderter Konzentrationen deutlich h here Werte f r Zuckerphosphate und einige organische S uren beobachtet werden wohingegen z B ATP eine erniedrigte Konzentration zeigte Eine genauere Untersuchung von verschiedenen Virusst mmen k nnte Zusammenh nge zwischen der Replikationsf higkeit der Viren in Zellkultur der Dynamik des Infektionsverlaufs der Apoptose und dem Zentralstoffwechsel aufdecken Z B konnte von Burgener et al 2 ein Zusammenhang zwischen der Energy Charge zum Zeitpunkt der Infektion und der Produktion von Reoviren nachgewiesen werden Aber nicht nur eine Verbindung der Infektion zu Nukleotiden sondern auch zu Glykolyse oder Krebszyklus w re denkbar angesichts der Tatsache dass die Vermehrung des Influenza Virus eine Zerst rung der Mitochondrien zur Folge hat wodurch der Zentralstoffwechsel wahrscheinlich stark beeintr chtigt ist Im Zusammenhang mit diesen Versuchen k nnten Inhibitoren der Zellatmung genutzt werden um die Effekte einer Virusinfektion auf die Aktivit t der Mitochondrien vergleichen zu k nnen Wie schon in den gezeigten Experimenten mit Vero Zellen m ssen mitunter erhebliche Unterschiede f r verschiedene Zelllinien erwartet werden Aus diesem Grund k nnte im Zusammenhang mit einem Impfstoffherstellungsprozess eine genauere Untersuchung
252. ektiven Detektor sollte eine zweifelsfreie Zuordnung der Metabolitpeaks erreicht werden Die MS Detektion wurde optimiert und die Betriebsbedingungen wurden angepasst Die vorangegangene Zuordnung der Metabolitpeaks konnte mit Hilfe des MS Detektors anhand des f r jeden Metaboliten charakteristischen Masse Ladungs Verh ltnisses best tigt werden Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde der MS Detektor im Single Ion Monitoring SIM Modus genutzt um eine selektive Quantifizierung der Metaboliten von Interesse durchzuf hren und die Reinheit der quantifizierten Peaks der AAC garantieren zu k nnen Basierend auf mehrfachbestimmten Verd nnungen des Kalibrierstandards von 16 Messsequenzen wurde eine Varianzsch tzung der Messmethode f r 29 Metaboliten und die drei Detektoren unter realen Messbedingungen durchgef hrt Die relative Standardabweichung bewegte sich f r die unterschiedlichen Metaboliten f r die Detektion mit LF und UV bei etwa 3 und mit MS bei etwa 9 F r die Chromatographieanlage DX600 konnte eine Methode etabliert werden die eine Trennung von zahlreichen Stoffwechselprodukten erlaubte Allerdings war diese Methode bez glich der Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten der Peaktrennung und der Quantifizierung der Methode welche f r die Anlage DX320 etabliert wurde unterlegen Des Weiteren war kein wesentlicher Informationsgewinn durch eine parallele Analyse mit den beiden Chromatographieanlagen zu erreichen Aus diesem Grund konnte auf
253. elle Isokratische Pumpe DX IC25 Suppressor DX ULTRA 2 mm P N 53947 Eluentenflasche H20 Flasche f r Regenerationsstrom H20 bei Betrieb des MS Detektors Flasche f r Cone Wash MeOH H20 50 50 bei Betrieb des MS Detektors Abfallbeh lter PC mit Steuer und Auswertesoftware Vors ule IonPac AG11 DX 2x50mm ProduktNr 44079 zwei analytische S ulen in Reihe 2 x IonPac AS11 DX 2x250 mm ProduktNr 44077 EluGen EGC KOH Kartusche DX EG40 ProduktNr 053921 Entgaser ATC HC S ule Traps ule ATC 3 S ule Traps ule Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 Inline Filter externes Ventil I Valve f r MS Detektor externe AXP Pumpe f r Cone Wash f r MS Detektor externe AXP Pumpe f r Regenerationsstrom bei Betrieb des MS Detektors MSQ MS Detektor Aufbau der Chromatographieanlage Juli 2008 H O f r Eluenten H20 f r MeOH H O f r Wash P Generation Suppressor Cone Wash en zer A Regeneration Suppressor Ventil f r d no Se Sp len MS Regenerations Injektionsspritze Pumpe gt LE E UV Detektor Autosampler Injektionsventil MS Detektor I ATC S ulen Pumpe S ulenofen Suppressor Steuerelement ECD Pumpe ECD Detektor KOH Kartusche Euente
254. ellen diese Phase meist nicht in gro em Ausma bzw sehr sp t zu verzeichnen Je nach Phase des Zellwachstums ist typischerweise der Stoffwechsel angepasst Dies bedeutet dass z B w hrend des exponentiellen Wachstums eine h here Aktivit t vorliegt als in der station ren Phase Auf eine generelle Erl uterung des Zentralstoffwechsels sei hier verzichtet und auf die Literatur verwiesen 110 IT Der spezielle Fall des Stoffwechsels von kultivierten tierischen Zellen wird in den folgenden Abschnitten kurz erkl rt 9 45 471 Da der Stoffwechsel von kultivierten tierischen Zellen dem von krebsartigen Zellen stark hnelt wurde auf einige Literaturstellen zum Stoffwechsel von Krebszellen zur ckgegriffen Ein Schema einiger wichtiger Stoffwechselwege des Zentralstoffwechsels f r tierische Zellen in Kultur ist in Abbildung 3 2 gegeben G ngige Energiequellen f r tierische Zellen in Kultur sind Zucker und Aminos uren wobei in Zellkulturmedium am h ufigsten Glucose und Glutamin zum Einsatz kommen Der Abbau der Glucose erfolgt typischerweise ber den Stoffwechselweg der Glykolyse wobei Pyruvat das Endprodukt der Glykolyse von vielen kultivierten Zelllinien zum Gro teil in reduzierter Form als Lactat abschlie end ausgeschieden wird Der Abbau von Glutamin erfolgt h ufig durch Desaminierung bzw Transaminierung und anschlie end kann die resultierende organische S ure a Ketoglutarat zum Teil oder vollst ndig zu und H20 abgebaut werde
255. ellvolumen Lactat und der Energy Charge waren die Verl ufe der Zuckerphosphate zeitlich vorgelagert jedoch bestanden hier negative Korrelationen Besonders auff llig waren die Metaboliten 3PG PEP und Pyruvat welche durchwegs nur schwache Korrelationen vorwiesen Einen Block gut korrelierender Metaboliten bildeten Citrat cis Aconitat und Isocitrat wobei hier minimale Zeitvers tze vorhanden waren Gewisse bereinstimmung in den Verl ufen f r diese Metaboliten waren f r einige Zuckerphosphate und einige Nukleotide zu finden wohingegen eine negative Korrelation zu der Zellzahl dem Gesamtzellvolumen und der Energy Charge auftrat Eine erkennbare positive Korrelation war f r die weiteren organischen S uren aus dem Krebszyklus a Ketoglutarat Succinat Fumarat und Malat vorzufinden Mehrere Nukleosidmono und diphosphate waren einer weiteren positiv korrelierenden Gruppe zuzuordnen Von den Nukleosidtriphosphaten sind CTP und UTP als miteinander positiv korrelierende Metaboliten zu erw hnen wobei der Verlauf von UTP dem von CTP voranging Weiterhin korrelierten die Konzentrationen der beiden Zuckernukleotide UDP GlcNAc und UDP GalNAc miteinander sehr stark und quasi ohne Zeitversatz Grunds tzlich traten unter den intrazellul ren Metaboliten keine starken negativen Korrelationen auf Dementgegen waren bei den anderen Variablen einige stark negativ sowohl untereinander als auch mit den Konzentrationen der intrazellul ren Metaboliten korreliert
256. en gewesen w re Um eine Differenzierung der unterschiedlichen Versuchsbedingungen bzw Kultivierungszust nde zu erreichen wurden die Experimente einzeln ausgewertet Um eine zeitliche Verschiebung von Verlaufskurven ber cksichtigen zu k nnen wurde f r diese Auswertung eine Kreuzkorrelations analyse verwendet F r zw lf unterschiedliche Kultivierungen mit MDCK Zellen wurden die einzelnen Korrelationskoeffizienten und Zeitverschiebungen anschlie end gemittelt Dadurch sollte eine Generalisierung bez glich der Korrelation von Metabolitkonzentrationen f r Batch Kultivierungen mit MDCK Zellen erreicht werden Die entsprechende Kreuzkorrelationsmatrix Abbildung 5 16 zeigt deutlich dass durch den hier erlaubten Zeitversatz zwischen den einzelnen Metabolitverl ufen eine gr ere Anzahl starker Korrelationen auftraten als in Korrelationsanalyse ohne Zeitversatz f r alle Experimente Abbildung 5 15 Dieser Effekt ist ein logisches Ph nomen der Zeitverschiebung bei der Kreuzkorrelation Typischerweise steigt der maximale Korrelations koeffizient durch den erlaubten Zeitversatz Besonders zu betonen ist aber auch dass bei dieser Auswertung nur Kultivierungen mit MDCK Zellen verwendet wurden d h die Bedingungen der Versuche waren einander deutlich hnlicher als f r die in Abbildung 5 16 zusammengefassten Versuche wo Experimente unterschiedlichster Bedingungen mit zwei Zelllinien MDCK Vero gemeinsam ausgewertet wurden Bei der In
257. en Somit sind die verschiedenen Medien die Ursache f r die unterschiedliche Energy Charge Wie gro der regulatorische Einfluss in der Folge ist kann basierend auf den hier gewonnenen Daten nur schwer beurteilt werden F r Cytidinnukleotide zeigte der Vergleich der beiden Medien keine deutlichen Tendenzen was darauf schlie en l sst dass diese Metaboliten nur vergleichsweise schwach vom Medium beeinflusst waren Die beiden in Abbildung 5 20 dargestellten Zuckernukleotide wiesen stark vom Medium beein flusste Konzentrationsverl ufe auf Grund hierf r k nnte die unterschiedliche Ammoniumkon zentration im Zellkultur berstand der beiden Medien gewesen sein Ein solcher Zusammenhang ist aus der Literatur bekannt Des Weiteren wurde von Ryll und Wagner D gezeigt dass die Konzentration von Glucose im Medium relevant f r den Ammonium bedingten Anstieg der Zucker nukleotide ist Bei Betrachtung der Verl ufe der intrazellul ren Metaboliten stellt sich die Frage nach dem Verhalten der Konzentrationen in den ersten sechs Stunden nach Inokulation Dabei ist zu ber cksichtigen in welchem metabolischen Zustand die Vorkultur war Da von der Vorkultur keine Probe der intrazellul ren Metaboliten genommen wurde kann keine direkte Aussage getroffen werden Allerdings war die Vorkultur vier Tage alt und da diese Kultur auch statisch bzw in Rollerflaschen war kann davon ausgegangen werden dass hnliche intrazellul re Metabolitk
258. en f hrt F16bP AMP und das Substrat PEP selbst zu einer Beschleunigung der Umsetzung zu Pyruvat Auch eine Inhibierung durch Acetyl CoA ist bekannt Dieser letzte Schritt wird allgemein neben der Hexokinase und der Phosphofructokinase als weiterer den Fluss der Glykolyse regulierender 68 Schritt betrachtet Allerdings scheint bei Lymphocyten und auch verschiedenen kontinuierlichen 58 59 65 gt Zelllinien die Pyruvat Kinase deutlich aktiver vorzuliegen als die beiden anderen regulierten Enzyme Hexokinase und die Phosphofructokinase Um eine dauerhafte Glykolyset tigkeit aufrecht zu erhalten ist eine Oxidation des durch die Glykolyse entstandenen NADH H reduzierte Form des Nicotinamid Adenin Dinukleotid erforderlich Theoretisch k nnte cytosolisches NADH ber einen der m glichen Shuttle Systeme Glycerin Phosphat Malat Aspartat Malat Citrat in die Mitochondrien transportiert 3 Theoretische Grundlagen 13 werden um dort ber die Atmungskette oxidiert zu werden F r kontinuierliche Zelllinien findet dieser Weg allerdings nur in geringem Ma e statt Dies ist aber vermutlich nicht auf eine fehlende Aktivit t der Shuttle Systeme zur ckzuf hren Stattdessen wird insbesondere f r kultivierte tierische Zellen oder Tumorzelllinien ein Gro teil des in der Glykolyse erzeugten Pyruvats und NADH H durch die Lactat Dehydrogenase EC 1 1 1 27 zu Lactat und umgesetzt Dieses Enzym zeichnet sich dur
259. en getestet 28 2621 Theoretisch k nnten auf diese Weise neue Zusammenh nge im Stoffwechsel entdeckt werden Da aber die Anzahl der starken Korrelationen in Abbildung 5 15 sich auf offensichtlich verkn pfte Metaboliten beschr nkte erschien eine derartige Auswertung nicht sinnvoll In sp teren Kreuzkorrelationsanalysen waren die Koeffizienten z T sehr hoch s z B Abbildung 5 22 und die Gefahr erschien gro dass eine berinterpretation durch die Clusteranalyse stattfindet weil starke Korrelationen auch ohne offensichtliche Verbindung zwischen den Metaboliten auftreten k nnen falsch positive Somit konnten bei keiner der Korrelationsanalysen aus einer weiteren 1260 261 Auswertung entsprechend dem Verfahrens von Arkin weitere Erkenntnisse gewonnen werden Deshalb wurde auf eine Darstellung dieser Ergebnisse verzichtet Bei den gefundenen starken positiven Korrelationen in Abbildung 5 15 handelt es sich durchwegs um Metabolitpaare die entsprechend der Literatur durch eine schnelle reversible enzymatische Reaktion in Verbindung stehen Glucosephosphat Isomerase Aconitase Fumarase Nukleosid diphosphat Kinase UDP GNAc Epimerase s Abbildung 3 2 bidirektionale Pfeile bzw 10 1 2951 Dies entspricht den theoretischen berlegungen dass das in allen Experimenten auftretende Gleichgewicht zwischen den Metabolitpools einen biologischen Hintergrund hat Dies bedeutet dass auch in den hier durchgef hrten Experimenten mit MDCK und Ve
260. en C Kammermeier H Fischer Y 1996 Luminometric measurement of subnanomole amounts of key metabolites in extracts from isolated heart muscle cells Analytical Biochemistry 239 1 41 46 233 Leese HJ Biggers JD Mroz EA Lechene C 1984 Nucleotides in a single mammalian ovum or preimplantation embryo Analytical Biochemistry 140 2 443 448 234 Bergmeyer HU 1989 Methods in Enzymatic Analysis Bergmeyer HU Bergmeyer J Gra l M editors Weinheim VCH 235 Barnabe N Butler M 2000 The effect of glucose and glutamine on the intracellular nucleotide pool and oxygen uptake rate of a murine hybridoma Cytotechnology 34 1 2 47 57 236 Grob MK O Brien K Chu JJ Chen DDY 2003 Optimization of cellular nucleotide extraction and sample preparation for nucleotide pool analyses using capillary electrophoresis Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 788 1 103 111 237 Casazza JP Veech RL 1986 The measurement of xylulose 5 phosphate ribulose 5 phosphate and combined sedoheptolose 7 phosphate and ribose 5 phosphate in liver tissue Analytical Biochemistry 159 2 243 248 238 Swezey RR 1995 High performance liquid chromatographic system for separating sugar phosphates and other intermediary metabolites Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 669 2 171 176 239 Veech RL Veloso D Guynn R 1972 Time course of effects of ethanol on redox and p
261. en DIS Somit bietet die hier durchgef hrte Arbeit eine aussichtsreiche Grundlage f r zahlreiche weitere interessante Forschungsarbeiten 179 Verzeichnisse Abbildungsverzeichnis Abbildung 3 1 Schema des Zellwachstums von adh renten Zellen in A bei linearer Darstellung der Zellzahl und B bei logarithmischer Auftragung 204400440440nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 8 Abbildung 3 2 Schema wichtiger Stoffwechselwege des Zentralstoffwechsels f r tierische Zellen in Kultur E e e EEN 10 Abbildung 3 3 Schema f r den Ablauf einer typischen Probevorbereitung f r die Bestimmung von intrazellul ren Stoffwechselprodukten in kultivierten tierischen Zellen f r jeden Schritt existieren mehrere m gliche DBehandlungsmetbocden nn 24 Abbildung 3 4 Darstellung der Faktoreinstellungen f r die vier durchzuf hrenden Versuche bei einem 2 Faktor 2 Level faktoriellen Experiment A Graphisch B Design 28 Abbildung 3 5 Graphische Darstellung der zwei halben Fraktionen eines 2 faktoriellen Versuchsplans A tabellarische Form mit den Kontrastkoeffizienten Plus und Minuszeichen f r die acht Experimente eines 2 VPS OCIS IANS EE 31 Abbildung 3 6 Graphische Darstellung eines Central Composite Versuchsplans mit zwei Faktoren und Abbildung 3 7 Graphische Darstellung der verschiedenen M
262. en Kontraste d h lineare Kombinationen von Parametern So ist z B f r 3 1 der Kontrast ab a b 1 Die Tabelle in Abbildung 3 4 B zeigt die Koeffizienten der Kontraste in den Spalten d h die Tabelle erm glicht eine einfache Berechnung der Kontraste Die verschiedenen Experimente und deren Einstellungen sind in den Zeilen und die faktoriellen Effekte in den Spalten dargestellt Alle weiteren Spalten werden durch Multiplikation der enthaltenen Haupteffekte berechnet In dem hier gezeigten Fall ist der Effekt AB durch berechnet Bei Z spricht man auch vom Identit tselement Diese Spalte zeichnet sich dadurch aus dass sie nur Pluszeichen enth lt Jede andere Spalte dieser Tabelle besitzt gleich viele Plus und Minuszeichen Die Tabelle stellt also 3 Theoretische Grundlagen 29 grunds tzlich dar was in den Gleichungen 3 1 und 3 2 gezeigt ist wobei die Vorzeichen in den Gleichungen den Eintr gen in der Tabelle entsprechen Die tabellarische Form der Darstellung ist insbesondere bei Versuchen mit vielen Faktoren hilfreich Typischerweise folgt der Berechnung der Effekte der Einflussgr en und Interaktionen eine Visualisierung dieser Ergebnisse Daf r k nnen Diagramme erstellt werden in welchen die Zielgr e ber die Faktoren aufgetragen ist Eine andere Form der Darstellung f r kontinuierliche quantitative Faktoren beinhaltet ein Regressionsmodel der Form k Y U EP re 3 3 Hierbei ist y die Zielgr e
263. en MDCK Zellen in GMEM Z bis in das Stadium des sp ten exponentiellen Wachstums kultiviert ca 3 Tage Der Versuch wurde durchgef hrt indem das Medium entfernt und nach einem Waschschritt mit PBS durch PBS ersetzt wurde Diese schlagartige Limitierung bez glich s mtlicher Substrate sollte klare nderungen in den intrazellul ren Metabolit konzentrationen hervorrufen Da urspr nglich nur geringe Vorkenntnisse zur Geschwindigkeit der Ver nderungen in den Metabolitpools vorhanden waren wurde dieses Experiment mehrmals allerdings mit unterschiedlichen Probenahmezeitpunkten und Experimentzeitr umen durchgef hrt Das erste Experiment umfasste eine Dauer von 90 min das zweite 120 min und das dritte 6 min Dementsprechend wurden zu deutlich unterschiedlichen Zeitpunkten Proben genommen W hrend die Zeitpunkte der Probenahmen der ersten beiden Experimente auf einer linearen Zeitskala geplant wurden wurde f r das dritte Experiment in logarithmisch quidistanten Zeitabst nden Probe genommen Ursache hierf r war die unzureichende Aufl sung der Konzentrationsverl ufen mancher Stoffwechselprodukte in der Anfangsphase der Experimente 1 und 2 Abbildung 5 28 zeigt die Verl ufe der normierten Metabolitkonzentrationen auf einer logarithmisch skalierten Zeitachse Da sich wie in den Kultivierungsexperimenten Verl ufe verschiedener Metaboliten hnlich verhielten und somit eine Gruppierung m glich war sind nur einige exemplarische Verl ufe gez
264. en an Es war schwer zu gew hrleisten dass die eluierten Peaks auch ausschlie lich bzw zumindest zum Gro teil den vermeintlichen Substanzen entsprachen Insbesondere bei Metaboliten die nicht ber den UV Detektor zu messen waren schien das Risiko einer Fehlinterpretation hoch Als eine Option zur Verbesserung der selektiven Detektion bot sich die Anschaffung eines MS Detektors an Mit diesem Ger t sollten die Proben besser charakterisiert werden die Reinheit der Peaks gekl rt werden und eventuell durch Nutzung von selektiven Ionenkan len SIM Single Ion Monitoring eine getrennte Quantifizierung von koeluierenden Metaboliten erm glicht werden Von zentraler Wichtigkeit war hier allerdings die Integration des Ger ts in die genutzte Chromatographiesoftware sowie eine robuste Arbeitsweise des Ger ts um einen Routinebetrieb zu gew hrleisten Kopplung eines MS Detektors an die Chromatographieanlage Als Anschaffung bot sich ein Single Quadrupol Massenspektrometer aufgrund der relativ hohen Verl sslichkeit im Betrieb Von der Firma Dionex wurde ein entsprechender Detektor bezogen Dieser konnte in die Chromatographiesoftware eingebunden werden wodurch auch eine Steuerung des MS Detektors m glich war Weiterhin besitzt dieser MS Detektor eine Option namens Cone Wash was bedeutet dass der Einlasskonus des MS Detektors kontinuierlich durch ein MeOH Wasser Gemisch gesp lt wird wodurch Verschmutzungen und somit einem Sensitivit tsverlust
265. en dieses Enzym Auf diese Reaktion folgt eine Umsetzung von Succinyl CoA und GDP zu Succinat und 14 3 Theoretische Grundlagen GTP Katalysiert wird diese reversible Reaktion von der Succinyl CoA Synthetase EC 6 2 1 4 In den n chsten drei Schritten wird Succinat zuerst durch die Succinat Dehydrogenase EC 1 3 5 1 zu Fumarat umgesetzt anschlie end erfolgt die durch die Fumarase EC 4 2 1 2 katalysiert Addition von Wasser an Fumarat wobei Malat entsteht Abschlie end wird Malat durch die Malat Dehydrogenase EC 1 1 1 37 zu Oxalacetat oxidiert Der tats chliche Ablauf der hier beschriebenen vollst ndigen Oxidation von Glucose durch den Krebszyklus konnte zwar f r einige kultivierte Zellen gezeigt werden dennoch wird f r viele kontinuierliche Zellen der Gro teil des aus der Glykolyse stammenden Pyruvats als Lactat ausgeschieden 2 48 57 59 70 731 Weiterhin zu erw hnen ist der Stoffwechselweg der Gluconeogenese 0 Dieser Weg erm glicht die Neusynthese von Glucose aus Substraten wie Pyruvat Oxalacetat oder DHAP Im Grund entspricht dieser Weg nahezu einer Umkehrung der Glykolyse Der Gro teil der Enzyme der Gluconeogenese ist identisch mit der Glykolyse mit Ausnahme der regulierten Enzyme Hexokinase Phosphofructokinase und Pyruvat Kinase Die Bildung von PEP aus Pyruvat erfolgt durch die mitochondriale Synthese von Oxalacetat durch die Pyruvat Carboxylase EC 6 4 1 1 anschlie ender Reduktion zu Malat Transport in
266. en eine Bestimmung ohne physikalische Zerst rung der Zellen erm glichen m ssen f r z B alle chromatographischen Verfahren die Zellen einer Probenvorbereitung unterzogen werden Da in der hier durchgef hrten Arbeit eine invasive Methode zum Einsatz kam werden auch die theoretischen Betrachtungen darauf beschr nkt Ziel der Probenvorbereitung ist typischerweise die relevanten Metaboliten quantitativ aus den Zellen zu gewinnen und s mtliche Kontaminationen also alle Substanzen die nicht von Interesse sind g nzlich aus der Probe zu entfernen Je nach Art Anzahl und Konzentration der Metaboliten die gemessen werden sollen sind diese Anspr che zu realisieren oder mitunter unm glich In den meisten F llen m ssen Kompromisse bei den Methoden eingegangen werden da die Stoffwechselprodukte die analysiert werden sollen in ihren biologischen chemischen bzw physikalischen Eigenschaften zu unterschiedlich sind oder die Kontaminanten den Metaboliten von Interesse zu hnlich sind Neben der Extraktionsmethode muss meist auch eine zur Probenvorbereitung passende Methode zur Quantifizierung der Metaboliten gefunden werden 24 3 Theoretische Grundlagen Probe 2 adh rente Zellen oder Suspensionszellen Abstoppen des Metabolismus 2 B Inaktivierung durch Hitze oder K lte Abtrennen der Zellen vom berstand 2 B Zentrifugation oder Filtration z B mit saurem basischem oder organischem Extraktionsmittel Extraktion Q
267. en ist eine Korrelation zwischen Zellzyklus und Metabolitkonzen trationen bekannt 13 Dies k nnte bedeuten dass bei einer hohen Wachstumsrate hohe Konzen 5 Ergebnisse und Diskussion 111 trationen der Stoffwechselintermediate vorl gen und wenn die Zellen sich nicht mehr teilen w ren die Konzentrationen entsprechend niedrig Wie weit die Stoffwechselaktivit t und die Zellteilungsaktivit t sich gegenseitig beeinflussten kann basierend auf den durchgef hrten Experimenten nicht beurteilt werden Drittens kann theoretisch als Ursache der qualitativen bereinstimmung der Konzentrationsverl ufe ein systematischer Fehler bei der Bestimmungsmethode nicht komplett ausgeschlossen werden Allerdings sprechen die Ergebnisse der verschiedenen Kurzzeitexperimente s Abschnitt 5 3 4 dem deutlich entgegen da dort ein weitgehend entkoppeltes Verhalten der Metaboliten gezeigt werden konnte Grunds tzlich lie sich erkennen dass eine starke Korrelation unabh ngig davon ob negativ oder positiv nicht zwingend mit einer direkten Verbindung der Variablen zueinander erkl rt werden kann So k nnen hohe Korrelationswerte auch schlichtweg durch ein zuf llig gleiches oder entgegengesetztes Verhalten der Variablen herr hren Bei der Interpretation des zeitlichen Versatzes von Konzentrationsverl ufen ist Folgendes zu beachten Ein zeitlicher Versatz von mehreren Stunden f r die Verl ufe zweier im Stoffwechsel aufeinander folgender Metabo
268. end bei Klasse 6 je ein weiterer Wert zugeordnet F r jede Klasse wurden der Mittelwert des Messwertes und der Median der Standardab weichung bestimmt Anschlie end wurde eine lineare Funktion angepasst Mit Hilfe dieser Funktion sollte die Standardabweichung in Abh ngigkeit vom Messwert gesch tzt werden Tabelle 12 im Anhang zeigt die Ergebnisse f r alle Metaboliten die drei Detektoren und die sechs Klassen Eine Zusammenfassung in Form einer Gruppierung ber die Detektoren bzw Klassen ist in Tabelle 5 5 gegeben Tabelle 5 5 Zusammenfassung der Analyse der relativen Standardabweichungen f r mehrfach bestimmte Extraktionsproben in Abh ngigkeit von der Konzentrationsklasse bzw des Detektors Klasse Detektor Mittelwert aller Klassen KL1 KL2 KL3 KL4 PR KL6 LF 10 2 18 8 1152 9 3 751 7 4 7 0 UV 7 8 10 0 7 8 7 4 79 6 2 5 8 MS 14 0 30 1 12 1 11 9 11 9 11 5 11 5 Mittelwert aller Detektoren 11 5 21 3 10 4 9 9 9 8 9 0 88 S mtliche mehrfach bestimmte Probenahmezeitpunkte aus Experimenten nach Etablierung der finalen Extraktions methode wurden f r die Bestimmung der Standardabweichung verwendet Die Standardabweichungen wurden entsprechend der Gr e der jeweiligen Mittelwerte der Messwerte geordnet Eine Gruppierung in sechs gleich gro e Klassen Kl 1 Kl wurde vorgenommen gleiche Anzahl an Proben 1 eine detaillierte Zusammenfassung f r die einzelnen Metaboliten ist im Anhang in Tabelle A 12 gegeben Der Mit
269. enn somit der Wert Absorption 280 nm m glichst klein sein soll ist die Konse quenz dass auch Nukleotide nur in geringem Ma extrahiert werden In Testmessungen zeigte sich allerdings dass die Absorption 280 nm nur minimal durch Nukleotide beeinflusst war Daten nicht gezeigt Die Zielgr e ATP die hier noch genutzt wurde ist nur eine von einer ganzen Reihe von Metaboliten die von Interesse waren ATP mag zwar repr sentativ f r einige Nukleotide sein allerdings ist fraglich wie weit eine gute Extraktion von ATP mit der Extraktion von Zuckerphos phaten oder organischen S uren korreliert Da aber ein identisches Verfahren zur Quantifizierung aller Proben genutzt werden sollte bot sich keine gute Alternative Au erdem diente dieser Vergleich der verschiedenen Extraktionsmethoden nur als Vorauswahl f r weitere Optimierungs schritte Die Ergebnisse der drei unabh ngigen Experimente erwiesen sich als aussagekr ftig so dass klare Unterschiede zwischen den Methoden identifiziert werden konnten Grunds tzlich waren die meisten Methoden relativ gut geeignet die beiden Ziele zu erreichen Mit Ausnahme der Extraktion mit Ameisens ure waren f r die Menge an extrahiertem ATP die Unterschiede zwischen den Methoden etwa 25 Dieses tendenziell positive Ergebnis war auch zu erwarten da entsprechend den Referenzen diese Methoden f r die Extraktion geeignet waren 31 3 176 178 211 226 236 2631 Auch die Abreicherung der bei 280 nm absorbie
270. ens 5 2 7 Diskussion der etablierten Probemvorbereitungsmeibode A 88 5 2 7 1 Vergleich der Methoden aus der 88 5 3 5 2 7 2 Fraktioneller faktorieller Versuchsplan 5 2 7 3 Central Composite Versucheplan 91 5 2 7 4 Vergleich der optimierten Methoden und abschlie ende Modifikationen 5 2 7 5 Bestimmung der Varianz der vollst ndigen Methode 95 5 2 7 6 Absch tzung des Zellvolumens 5 2 8 Zusammenfassung zur Optimierung einer Probenvorbereitungsmethode 99 Untersuchung intrazellul rer Metabolitkonzentrationen tierischer Zellen 100 5 3 1 Generelles Korrelationsverhalten von intrazellul ren Metabolitkonzentrationen 101 5 3 2 Kultivierung von MDCK Zellen 105 5 3 2 1 Zusammenfassung der Ergebnisse verschiedener 105 5 3 2 2 Kultivierung in GMEM Z bzw EpiSerf Medium 111 5 3 2 3 Kultivierung in DMEM Medium mit unterschiedlichen Substraten 134 5 3 3 Kultivierung von Vero Zellen vi cuccdsiscsccccpstnpiesszanspainschasensaacseatsanendpenagues sahansyenaeaneqenecdoaneaeds 143 5 3 4 Pulsexperimente mit MDCK Zellen AAA 147 5 3 4 1 Austausch von Medium durch PDS 147 5 3 4 2 Zugabe von Medium nach Limitation nennen 154 5 3 4 3 Zugabe von verschiedenen Subst
271. ens sei auf Kapitel 5 2 6 verwiesen Tabelle 4 2 Erl uterung der verschiedenen Angaben zu Metabolitmengen und konzentrationen Metabolitkonzentration pro Well Gemessene Konzentration der Probe in dem Volumen in dem gel st wurde Zellspezifische Metabolitmenge Metabolitkonzentration pro Well multipliziert mit dem Volumen in dem gel st wurde geteilt durch die Zellzahl pro Well Intrazellul re Metabolitkonzentration pro Well multipliziert mit dem Volumen in Metabolitkonzentration dem gel st wurde geteilt durch das Gesamtzellvolumen eines Wells 4 4 1 Untersuchung g ngiger Extraktionsmethoden Der erste Schritt des Optimierungsprozesses war der Vergleich von Methoden die in der Literatur h ufiger erw hnt sind Die einzelnen Methoden zur Extraktion von intrazellul ren Metaboliten sind hier n her beschrieben Da die verschiedenen Methoden zu Ende der Probenvorbereitung in stark unterschiedlichen Probenmatrizes resultieren war eine chromatographische Bestimmung der Metaboliten nicht f r alle Methoden m glich Aus diesem Grund wurden als Messgr en f r die Auswahl eines geeigneten Verfahrens die ATP Konzentration bestimmt durch Lumineszenz messung und der Absorptionswert der Probe bei einer Wellenl nge von 280 nm verwendet Absorption 280 nm Dieser Absorptionswert wurde als Richtwert f r eine Abreicherung von makromolekularen Verunreinigungen genutzt Eine gute Methode war charakterisiert durch einen hohen ATP Wert un
272. enten f r jedes Paar von Signalen ermittelt werden Zus tzlich kann eine Matrix mit den dazugeh renden Werten f r die zeitliche Verschiebung erstellt werden Der Kreuzkorrelationskoeffizient f r den Spezialfall 0 zwischen zwei Variablen entspricht dem zuvor erw hnten Korrelationskoeffizienten bei einer Korrelationsanalyse Zus tzlich kann eine Autokorrelation errechnet werden wobei eine Variable mit sich selbst bei verschiedenen Werten f r korreliert wird Dies kann interessant sein wenn ein periodisches Schwingungsverhalten der Variablen vorliegt F r die hier vorliegende Arbeit ist die Autokorrelation allerdings nicht relevant da kein periodisches Verhalten vorgefunden wurde oder die Zeitreihen zu kurz waren Als geeignetes Vorgehen bei der Auswertung einer gro en Anzahl von z B Konzentrations verl ufen bietet sich an zuerst entsprechend den Korrelationskoeffizienten einer Kreuzkorrelations 3 Theoretische Grundlagen 37 matrix eine Gruppierung von Verl ufen durchzuf hren Anschlie end k nnen dann repr sentative Verl ufe aus den einzelnen Gruppen genauer begutachtet werden Von Arkin 128 2611 wurde auf Kreuzkorrelationen basierend eine sogenannte Correlation Metric Construction CMC durchgef hrt Dabei wurden die ermittelten Korrelationen in Distanzwerte transformiert womit anschlie end eine multidimensionale Skalierung und eine Clusteranalyse durchgef hrt wurden Auf diese Weise konnten basierend auf Konz
273. entrationsmessungen Vorhersagen zu komplexen Reaktionsnetzwerken gemacht werden Grunds tzlich eignet sich somit sowohl eine konventionelle Korrelationsanalyse als auch eine Kreuzkorrelationsanalyse zur Untersuchung multivariater Datens tze Auf diese Weise k nnen Zusammenh nge zwischen den einzelnen Variablen aufgekl rt werden 38 4 Material und Methoden 4 Material und Methoden 4 1 Ger te Verbrauchsmaterialien und Chemikalien Eine Liste der in dieser Arbeit genutzten Ger te in im Anhang in Tabelle A 1 gegeben Die verwendeten Verbrauchsmaterialien sind im Anhang in Tabelle A 2 angegeben Eine Zusammen fassung der in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien ist in der Tabelle A 3 im Anhang aufgef hrt F r zahlreiche Arbeitsschritte wurde in dieser Arbeit eine Phosphat gepufferte Salzl sung mit folgender Zusammensetzung eingesetzt 8 0 g L NaCl 0 2 g L KCI 0 20 g L KH 2PO 1 15 g L Na HD 4 2 Zellkultur Die Zellkultur wurde anhand der in der Arbeitsgruppe Bioprozesstechnik etablierten Arbeitsanweisungen durchgef hrt Das Auftauen der Zellen erfolgte gem der Arbeitsanweisung Nr Z 02 s Anhang Passagiert wurden die Zellen entsprechend der Arbeitsanweisung Nr Z 04 s Anhang Kurz zusammengefasst ist hier die Kultivierung beschrieben Vorkulturen aller Versuche von MDCK ECACC Nr 841211903 und Vero Zellen ECACC Nr 88020401 wurden bei 37 C und 5 in GMEM Z mit 10 FCS f tales K
274. er mit PBS bei 100 C Zugabe des Puffers 7076 1000 HL 12 1 SC kein Kochen keine Behandlung 25 ES 0 C 1600 uL MeOH CHCI Level Ultraschallbehandlung Puffer en L1 1 600 uL 1 1 5 ER 1 12 1 1000 pL 3 1 keine Behandlung gt aM 2 Puffer Zum Screening der Faktoren wurde ein 222 Versuchsplan ausgew hlt Aufl sung Die Reduktion der Anzahl der Einzelexperimente wurde anhand folgender Generatoren vorgenommen I Puffer x Volumen x Verh ltnis MeOH Puffer x Ultraschallbehandlung I Anzahl der Extraktionen x Verh ltnis MeOH Puffer x Ultraschallbehandlung Der Versuchsplan erforderte acht Einzelexperimente 4 4 3 Optimierung entsprechend eines Central Composite Versuchsplans Nachdem einige Faktoren durch die Screening Experimente festgelegt werden konnten waren f r beide Methoden MeOH Kochen und MeOH CHC je drei kontinuierliche Einflussgr en genauer zu charakterisieren da sie ein Optimumverhalten vermuten lie en Dazu wurde ein Central Composite Versuchsplan gew hlt MeOH Kochen Extraktion Central Composite Versuchsplan Die drei Einflussgr en Volumen MeOH Tricine Konzentration und Kochdauer wurden in diesem Experiment untersucht Tabelle 4 4 A zeigt fiir das erste Experiment die skalierten Niveaus 1 und 1 die entsprechenden realen Niveaus Die weiteren in einem Central Composite enthaltenen Niveaus der Sternpunkte und des Zentru
275. eren_MDCK_200606_SK BPT MPI Magdeburg Arbeitsanweisung Nr Z 04 Datum 14 04 2000 Autor Dr Annett Kiesel geprueft geaendert am 09 07 2003 Autor Ilona Behrendt geprueft geaendert am 20 06 2006 Autor Susanne Koenig geprueft geaendert am 11 09 2006 Autor Nancy Schlawin gerpueft Passagieren von MDCK Zellen in serumhaltigem Medium 1 0 Ziel Langzeitkultivierung und Vermehrung von Zellen zur Beimpfung mit verschiedenen Virusarten und spaeteren Aufarbeitung 2 0 Materialien Kultur mit konfluent gewachsenen Zellen 25 cm 75 cm 175 cm Flasche oder 850 cm Rollerflasche MDCK Zellen 4 bis 6 Tage alte konfluent gewachsene Kultur Trypsin EDTA Loesung 0 05 Trypsin 0 02 EDTA 37 C 1 10 Verduennung aus Stammloesung siehe Arbeitsanweisung M 07 Vollmedium GlasgowMEM komplett gemischt mit 10 FCS und Tryptosephosphatboullion Pepton siehe Arbeitsanweisungen M 02 oder M 04 PBS Raumtemperatur siehe Arbeitsanweisung 01 foetales Kaelberserum FCS auf Raumtemperatur vorwaermen Firma Gibco Best Nr 10270106 3 0 Methode Kulturflaschen aus dem Brutschrank nehmen und desinfizieren unter die Werkbank stellen Kulturflaschen aufschrauben Deckel mit Oeffnungen nach oben legen Deckel nach hinten legen so dass man nicht darueber fasst beim Arbeiten altes Medium in eine sterile Abfallflasche abgiessen nicht den Rand beruehren die Zellen mit PBS Loesung 2x waschen s Volumentab I gebrau
276. erf r kann sein dass im serumfreien Medium die Anhef tungsfaktoren fehlten die eine st rkere Ausbreitung der Zellen im serumhaltigen Medium f rderten Eine experimentelle Best tigung dieser Hypothese kann nicht gegeben werden Bei Kultivierung auf Mikrocarriern sind in der Literatur diesbez glich widersprechende Ergebnisse zu finden So wurden f r Vero und MDCK Zellen in serumfreien Medien niedrigere Zellkonzentrationen gefun den 20 298 Allerdings herrschen typischerweise deutlich unterschiedliche Bedingungen f r die Kultivierung im Bioreaktor im Vergleich mit statischer Kultur insbesondere die Zellanheftung betreffend Beim Vergleich der einzelnen Versuche f r ein Medium erwies sich das Gesamtzellvolumen als ein besser reproduzierbarer Wert als die Zellzahl Dies zeigte sich insbesondere bei EpiSerf in dem signifikanten Unterschied der Reststandardabweichungen der sigmoiden Anpassung an die Verl ufe von Zellzahl und Gesamtzellvolumen Ein Grund f r die bessere Reproduzierbarkeit des Verlaufs des Gesamtzellvolumens verglichen mit dem Verlauf der Zellzahl k nnte sein dass f r den Fall einer hohen Zellzahl das Gesamtzellvolumen der einzelnen Zellen kleiner und f r eine niedrige Zellzahl das Volumen der einzelnen Zellen entsprechend gr er war Somit scheint ein maximaler Wert des Gesamtzellvolumens f r jedes Medium zu existieren Konzentrationsverl ufe extrazellul rer Metaboliten Eine Zusammenfassung von Konzentrationsverl ufen
277. eriment dependent individual correlation pattern concentrations of metabolites within certain metabolic clusters like sugar phosphates or some organic acids appeared to be generally correlating well within the cluster This indicates a joint regulation of metabolic blocks Taken together a powerful method for the analysis of intracellular metabolites was established in this work Applying this procedure for the characterization of cultured cells to various experimental scenarios allowed a clear distinction between different cell lines and cultivation conditions and additionally metabolic key points in the central metabolism could be identified Inhaltsverzeichnis 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 4 1 4 2 4 3 Einleitung Motivation Theoretische Grundlagen Stoffwechsel tierischer Zellen in Kultur 3 1 1 Glucosestoffwechsel 3 1 2 Glutaminstoffwechsel 3 1 3 e a R 16 3 1 4 Weitere 16 3 1 5 Gegenseitiger Einfluss der Glykolyse und der Glutaminolyse nennen 17 3 1 6 E aussi Herten 17 3 1 7 Experimentelle Strategien zur Verbesserung der Effizienz des Zentralstoffwechsels 18 M glichkeiten zur experimentellen Untersuchung des Zentralstoffwechsels 19 Chromatographische Analyse von intrazellul ren Stoffwechselprodukten
278. ern und auf CD brennen 1 1 Files als cmb abspeichern zum Verschicken zu Dionex e Sequenz ausw hlen oder bestimmte Proben aus einer Sequenz e File gt Export Back up gt Back up auf Browse anklicken gt Ordner aussuchen wo die Dateien gespeichert werden m ssen gt Dateiname geben Speichern gt Start gt OK 1 2 Files als xls abspeichern e Bestimmte Probe aus einer Sequenz ausw hlen e In QNT Editor die Chromatogramme auswerten e Auf Printer Layout klicken File gt Save As hier das File als Excel File speichern 1 3 Daten auf CD brennen e Im Browser mit der rechten Maustaste auf Backup anklicken gt Dismount Datebase OK CD einlegen gt Daten CD erstellen gt Daten CD projekt e Quelledatenverzeichnis H daten Chromeleon_Double kopieren Datainame ndern e CD aufzeichnen starten Schreibgeschwindigkeit z B 32x Session abschlie en gt CD fertig stellen File mdb und ini wichtig e Aufzeichnung auf CD fertig gt OK mit der Maus auf nein anklicken e File Mount Datasource gt Browse gt H Daten Chromeleon_Double Back up Chromeleon_double cm local mdb ffnen mit der Maus auf nein anklicken Back up ist wieder zu sehen G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 Lebenslauf Joachim B Ritter Joachim Bernhard Ritter Im Sandacker 1 D 79576 Weil am Rhein E Mail joachim b ritter web de Tel 49 07621 5107240 Mo
279. erschiebung zu erm glichen Eine genauere Erkl rung der Vorgehensweise ist in Abschnitt 3 6 gegeben F r die hier gezeigte Kreuzkorrelationsmatrix wurde jedes einzelne Experiment unabh ngig von den anderen Experimenten ausgewertet Die daraus resultierenden Korrelations wie auch Zeitversatzmatrizen wurden anschlie end gemittelt Zw lf verschiedene Kultivierungen mit MDCK Zellen wurden hierf r verwendet 4x GMEM Z 3x EpiSerf 1x EpiSerf 2mM Pyruvat 4x DMEM Dulbecco s Modified Eagle s Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen Glucose Pyruvat und Glutamin F r die experimentellen Details und die Interpolation durch Splines bzw Boltzmann Funktionen sei auf Tabelle A 5 im Anhang verwiesen Es wurde die gleiche Farbkodierung gew hlt wie in Abbildung 5 15 Zus tzlich zu den in Abbildung 5 15 gezeigten Metaboliten wurden in dem hier vorliegenden Diagramm einige weitere f r Kultivierungen charakteristische Kenngr en aufgenommen Hierbei handelt es sich unter anderem um die Zellzahl pro Well Zellzahl das Gesamtzellvolumen pro Well und die Konzentrationen wichtiger Metaboliten aus dem Zellkultur berstand 106 5 Ergebnisse und Diskussion
280. es Grunds tzlich empfiehlt sich aber das Zellvolumen als sinnvolle Bezugsgr e Grund hierf r ist dass bei der Bestimmung von intrazellul ren frei suspendierten Metaboliten das Interesse in den Konzentrationen dieser Stoffwechselprodukte liegt da die Konzentrationen ein entscheidender Faktor im Bezug auf enzymatische Reaktionsgeschwindigkeiten sind Als Einschr nkung ist allerdings zu ber cksichtigen dass die Berechnung des Zellvolumens basierend auf den u eren Strukturen der Zellen nur eine grobe N herung darstellt Des Weiteren liegen in Eukaryonten keine homogenen Konzentrationen vor was mit der Kompartimentierung der Zellen zu begr nden ist In der Literatur erfolgte die Bestimmung des Volumens von Zellen z B nach dem Coulter Prinzip 87 289 291 oder mikroskopisch 17 188 281 292 2931 F r MDCK Zellen wurde das Zellvolumen in einem Bereich von 500 10700 um bestimmt 222 Von Rothen Rutishauser et al DT wurde zu Beginn der Kultivierung 1 Tag nach Einsaat das gr te Zellvolumen nachgewiesen Mit weiterer Kultivierungszeit nahm das Zellvolumen ab In hnlicher Form konnten Erlinger und Saier eine negative Korrelation zwischen dem zellul ren Volumen und der Zellzahl Fl che zeigen 2 Dies entspricht den Beobachtungen der hier vorliegenden Arbeit Grunds tzlich zeigten aber die verschiedenen Arbeiten dass je nach Bestimmungsmethode mit deutlichen Unterschieden beim ermittelten Volumen zu rechnen ist Da in der hier v
281. es w rde eine nicht invasive Methode erfordern die eine absolute Quantifizierung erlaubt 5 3 6 Zusammenfassung der Untersuchungen intrazellul rer Metabolitkonzentrationen Basierend auf den in den vorangehenden Abschnitten entwickelten Methoden zur Quantifizierung von intrazellul ren Stoffwechselprodukten wurden in diesem Kapitel die Konzentrationen und Konzentrationsverl ufe wichtiger Metaboliten aus dem Zentralstoffwechsel unter verschiedenen Bedingungen untersucht Der Gro teil dieser Versuche wurde mit MDCK Zellen durchgef hrt einige Experimente befassten sich mit Vero Zellen Durch Korrelationsanalysen konnten generelle Zusammenh nge von Metabolitkonzentrationen aber auch Zusammenh nge unter speziellen Bedingungen aufgekl rt werden So waren z Fumarat und Malat oder auch UDP GlcNAc und UDP GalNAc unter allen getesteten Zust nden sehr stark miteinander korreliert was auf sehr aktive Enzyme zur Umsetzung dieser Metaboliten ineinander hindeutet Durch eine Zusammenfassung von Kultivierungsexperimenten mit MDCK Zellen in Form einer Kreuzkorrelationsmatrix konnte 5 Ergebnisse und Diskussion 171 ein berblick ber das Korrelationsverhalten der gemessenen Parameter wie z B Zellzahl extra und intrazellul re Metabolitkonzentrationen erm glicht werden Zuckerphosphate bildeten eine Gruppe stark korrelierender Metaboliten Weiterhin war das gleichartige Konzentrationsverhalten von Citrat cis Aconitat und Isocitrat bzw C
282. ess konfluent sind z B 0 8 x 10 Zellen pro 175 cm werden benoetigt um in 4 Tagen eine konfluente Kultur in einer 175 cm Flasche zu erhalten Rechnung E Z Volumen mL Bsp 0 8 x 10 Zellen 1 2 x 10 Zellen mL 6 7 mL In eine 175 cm Flasche muessen 6 7 mL einer Zellsuspension die 1 2x 10 Zellen mL ent haelt pipettiert werden um nach 4 Tagen eine konfluente Kultur zu erhalten 6 2 Bestimmung der Einsaat Einsaat Zellen pro cm Einsaatvolumen x Zellzahl Oberflaeche Bsp 6 7mLx 1 2 10 Zellen mL 175 cm 4 6 x 10 Zellen cm 6 7 mL der Zellsuspension mit 1 2 x 10 Zellen ml ergeben in einer 175 cm Flasche eine Einsaat von 4 6 x 10 Zellen cm Was ist ein guter Richtwert pro cm z B 3 3 x 10 cells cm2 fuer Bioreaktor 3 0 x 10 cells ml 2 9 x 10 cells cm fuer Rollerflaschen in 4 Tagen oder 1 5 x 10 cells cm fuer Rollerflaschen in 7 Tagen 7 6 x 10 cells cm fuer T 175 1 6 gesplittet 4 3 x 10 cells cm fuer T175 5ml in Rollerflasche 850 cm 7 0 Lagerung Zellen wachsen in T Flaschen bei 37 C im CO Brutschrank im N1 06 Rollerflaschen im 37 C Rollerflaschenschrank im N1 06 oder im 37 C Brutraum auf den Rollerflaschengestell Spinner cei 37 C im Brutraum auf einen Ruehrer Seite 2 von 3 Anhang Z_04_Passagieren_MDCK_200606_SK BPT MPI Magdeburg Die eingefrorenen Zellen werden im Fluessigstickstoffbehaelter im N1 12 gelagert
283. ession zum Einsatz kommt 130 331 66 5 Ergebnisse und Diskussion Bei Betrachtung der relativen Standardabweichungen der einzelnen Detektoren ist zu erkennen dass UV und Leitf higkeitsdetektion eine hnliche Variabilit t aufweisen ca 3 s Tabelle 5 3 Dem entgegen ist beim MS Detektor ein deutlich h herer Wert zu finden Als m glicher Grund sind hier sicherlich prinzipielle Quantifizierungsschwierigkeiten der ESI durch z B Matrixeffekte 29 204 aber auch durch ger teabh ngige Schwankungsquellen wie z B nicht konstante Ionisierung Verunreinigungen am Einlasskonus oder Schwankungen am Elektronenmultiplier zu nennen 270 Die Abh ngigkeit der absoluten Standardabweichung von der Konzentration u erte sich in einer nahezu konstanten relativen Standardabweichung f r alle Detektoren im h heren Konzentrations bereich Bei niedrigeren Konzentrationen stieg die relative Standardabweichung f r die meisten Metaboliten an Dies deutet darauf hin dass zwar ein linearer Zusammenhang zwischen Konzentration und Standardabweichung vorliegen mochte aber auch bei einer Konzentration von bereits ein Fehler auftrat was sich bei der Sch tzung der Standardabweichung mittels linearer Regression in einem positiven y Achsenabschnitt u erte Die Validierung unter 5 1 1 2 ber cksichtigte nicht die Schwankungen die von Tag zu Tag auftraten Diese Art des Messfehlers wurde zwar in der Literatur gelegentlich untersucht allerdings
284. etaboliten nach sich ziehen kann 3 4 2 Extraktion Verglichen mit dem relativ berschaubaren Feld der Abstopp Methoden findet sich in der Literatur eine gro e Zahl verschiedener Vorgehensweisen zur Extraktion der Metaboliten F r Bakterien und Hefen wurden in der Vergangenheit zur Extraktion unterschiedlichste Extraktionsmittel eingesetzt wie z B Perchlors ure PCS Ameisens ure Natronlauge verschiedene Detergenzien und organische L sungsmittel Di 18 187 196 202 208 2121 Aufgrund des gro en Umfangs dieses Feldes sei hier nur explizit auf die Arbeiten von Maharjan und Ferenci 2003 und Villas Boas et al 2005 198 verwiesen die mit dem Fokus einer Analyse des Metaboloms verschiedene Methoden zur Extraktion entsprechend f r E coli und Hefen untersuchten Ein berblick ber verschiedene Vorgehensweisen zur Metabolitextraktion f r Pflanzen ist von Fiehn 2002 122 gegeben Aufgrund der offensichtlichen Unterschiede zwischen Pflanzen und tierischen Zellen sei hier nicht weiter auf dieses Themengebiet eingegangen sondern nur eine detailliertere Beschreibung der f r tierische Zellen angewendeten Methoden gegeben Ein grundlegender Unterschied zwischen pro und eukaryontischen Zellen ist dass Eukaryonten kompartimentiert sind Typischerweise sind die Metabolitkonzentrationen in den unterschiedlichen Kompartimenten auch verschieden aber aufgrund von technischen Schwierigkeiten berichten die meisten Arbeiten in der Literatur und a
285. eutet dass au erhalb der Sterilwerkbank gearbeitet wurde Zellkultur berst nde wurden f r diese Ver suche abgegossen um ein z giges Arbeiten zu gew hrleisten Die Zugabe von Fl ssigkeiten erfolgte mit einer Multipipette ebenfalls um schnelles Arbeiten zu erm glichen Im Falle einer hohen Frequenz von Probenahmen wurden die Sechs Well Platten zeitlich versetzt bearbeitet was bedeutet dass sich der eigentliche Zeitpunkt t 0 unterschied Allerdings betrug dieser Unterschied maximal etwa 1 h F r diesen Zeitraum wurden eine konstante Zellzahl und ein konstantes Zell volumen angenommen 5 Ergebnisse und Diskussion 49 5 Ergebnisse und Diskussion Dieser Abschnitt wurde den Meilensteinen dieser Arbeit entsprechend untergliedert In Kapitel 5 1 werden zuerst die Ergebnisse zur Etablierung einer Chromatographiemethode beschrieben und anschlie end werden in einem Unterpunkt diese Ergebnisse diskutiert In Kapitel 5 2 werden die Ergebnisse der Auswahl und Optimierung der Probenvorbereitung beschrieben und in einem Unterpunkt folgt die Diskussion dieser Ergebnisse Der letzte Abschnitt dieser Arbeit Kapitel 5 3 befasst sich mit der Untersuchung von Metabolitkonzentrationen unter verschiedenen Kulti vierungszust nden wobei in diesem Kapitel aus Gr nden der Verst ndlichkeit die Diskussion bei den Unterpunkten eingearbeitet ist 5 1 Etablierung einer Chromatographiemethode zur Messung intrazellul rer Metaboliten Voraussetzung f r
286. f hrt Dadurch wurden die Peaks die nicht automatisch korrekt integriert wurden richtig ausgewertet werden konnten e Im gnt File wird die Art der Integration H he oder Fl che festgelegt Dies kann f r jeden Kanal unabh ngig festgelegt werden e Im gnt File wird die Kalibration definiert Dies kann f r jeden Kanal unabh ngig festgelegt werden e Wenn alle Peaks richtig ausgewertet waren wurde ein rdf File geladen welches der gew nschten Darstellung der Messwerte entsprach Dazu Im Men Workspace gt Load Report Definition klicken und das gew nschte rdf File z B 071204_Kult_n6 laden Nicht in allen Proben sind s mtliche Metabolite nachzuweisen Trotzdem kann als weitere Kontrolle ob eine vollst ndige Integration aller Metabolitpeaks durchgef hrt wurde die Anzahl der n a Felder entsprechend logischer Gesichtspunkte berpr ft werden z B ATP ist eigentlich in allen Proben vorhanden d h wenn in der Spalte von ATP mehrere n a auftreten ist hier wahrscheinlich ein Fehler unterlaufen 1 Troubleshooting Peakh he bzw fl che zu klein gt S ule und Detektoren berpr fen e Peakform stark unsymmetrisch gt S ule berpr fen e Peaks klein und Trennung nicht in zufriedenstellend gt Suppressor mit 200 mN H2SO4 sp len Hierzu mit Plastikspritze ca 3 ml 200mM H2SO4 in ELUENT OUT langsam und vorsichtig spritzen 5 ml 200mM H2SO4 in REGEN IN spritzen Den Suppressor 20 min stehen lassen Den
287. f r die intrazellul ren Konzentrationen ermittelt Es wurden zwei adh rente Zelllinien MDCK und Vero und mehrere Medien untersucht Diese Versuche erstreckten sich typischerweise ber vier bis zu acht Tage Zus tzlich wurden Kurzzeitexperimente mit MDCK Zellen durchgef hrt in welchen die Metabolitkonzentrationen in kurzen Zeitr umen nach ver nderten Bedingungen z B Medienaustausch bestimmt wurden W hrend in den Kultivierungsexperimenten grunds tzlich die physiologischen Metabolitkonzentrationen unter typischen Kultivierungsbedingungen ermittelt werden sollten war das Ziel der Kurzzeitexperimente die Geschwindigkeit der nderungen der Metabolitpools aufzukl ren Im m glichen Rahmen dieser Arbeit werden hier wesentliche Er gebnisse dieser Experimente beschrieben und diskutiert Da dieser Abschnitt einer besonders ausf hrlichen Diskussion bedurfte die Ausf hrungen f r den Leser bestm glich nachzuvollziehen sein sollten aber Redundanzen bei der Beschreibung der Versuche vermieden werden sollten wurde in diesem Teil der Arbeit die Diskussion direkt bei den einzelnen Unterpunkten mit eingearbeitet 5 Ergebnisse und Diskussion 101 5 3 1 Generelles Korrelationsverhalten von intrazellul ren Metabolitkonzentrationen Zur Kl rung der Frage welche Stoffwechselprodukte sich in ihren Mengen grunds tzlich also unter verschiedensten Bedingungen unterschiedliche Zellen Medien Kultivierungsbedingungen gleich verhalten bzw
288. f r Vero Zellen stattfinden aber auch weitere adh rente Zellen unabh ngig von ihrer Verwendung k nnten durch die in dieser Arbeit entwickelte Methode charakterisiert werden Mit gewissen Modifikationen w re die Probenvorbereitung ebenso f r Suspensionszellen zu ver wenden wie in ersten Versuchen mit einer avi ren bzw humanen Suspensionszelllinie gezeigt wurde Der entscheidende Schritt w re hier die Abtrennung der Zellen vom Zellkulturmedium Verglichen mit adh renten Zellen kann kein schnelles Abgie en des Mediums stattfinden sondern eine Zentrifugation oder Filtration muss der Probenahme folgen Da diese Verfahrensschritte allerdings sich in einem zeitlichen Rahmen von mindestens 3 5 min bewegen findet u U trotz Abk hlung der Zellen auf etwa 0 C eine weitere metabolische Aktivit t statt Insbesondere w hrend der Zentrifugation k nnten auch bei niedrigen Temperaturen Limitationen am Boden des Zentrifugationsgef es im Pellet auftreten Weitere Arbeiten zur berpr fung der Effekte durch die Zellabtrennung bzw eine Verbesserung der aus der Literatur bekannten Methoden sollten erfolgen 178 7 Ausblick Mittelfristig w re es wichtig bei der Analyse der intrazellul ren Metaboliten eine Trennung der verschiedenen Zellkompartimente zu erreichen Insbesondere f r Modellierungsans tze basierend auf st chiometrischen Stoffwechselmodellen w re eine Unterscheidung der cytosolischen und intramitochondrialen Metabolitkonze
289. f r jeden Zustand individuellen einzigartigen Metabolit Fingerabdruck 176 7 Ausblick 7 Ausblick Basierend auf der in dieser Arbeit erfolgreich etablierten analytischen Methode und den damit generierten Daten zur Charakterisierung von MDCK und Vero Zellen w ren diverse fortf hrende Versuche denkbar Grundlegend w re eine weitergehende Aufkl rung der Einfl sse des Zellkultur mediums auf die intrazellul ren Stoffwechselproduktkonzentrationen u erst interessant Durch eine systematische Untersuchung der Zusammenh nge zwischen Medienzusammensetzung Zell wachstum und intrazellul ren Metabolitkonzentrationen in Kultivierungsexperimenten w re mittel fristig ein rationaler Ansatz der Medienentwicklung oder Prozessentwicklung basierend auf Markern in Form von Metabolitkonzentrationen oder Metabolitverh ltnissen vorstellbar 1117 19 Eine weitere Untersuchung in Form von Kurzzeitexperimenten k nnte erfolgen Eine verl ngerte Limitationsperiode der Zellen gt 2h k nnte aufkl ren wie lange eine Kompensation des N hstoffmangels aufrecht gehalten werden kann Bei zus tzlicher Messung der Abbauprodukte im Zellkultur berstand k nnten R ckschl sse gezogen werden ob und wenn ja welche intrazellul ren Makromolek le w hrend einer Limitationsperiode zur Kompensation des N hstoffmangels im Zellkultur berstand abgebaut werden Im Falle von Pulsexperimenten sollten nur einzelne Substrate zum Einsatz kommen und auf Serum verzic
290. ferl sung dH 0 z B MilliQ Wasser Das ben tigte Reagenzienvolumen pro 250 Messungen ist Trypanblaul sung ca 110 mL allen anderen Reagenzien ca 220 mL ben tigt Auff llen der Reagenzien Wenn das aktuelle Reagenzienpack leer ist im Men Instrument Replace reagent pack ausw hlen und den schrittweisen Anweisungen folgen Anstelle eines neuen Reagenzienpacks werden die Flaschen des vorhandenen Packs mit dem entsprechend ben tigten Volumen 110 bzw 220 mL aufgef llt Die Abfallflasche wird in eine Schottflasche umgegossen autoklaviert und anschliessend in den Trypanblau Abfall entsorgt Anhang 3 Einschalten und Ausschalten der Ger te Einschalten e ViCell einschalten Schalter auf der R ckseite e Computer einschalten e Software XR 2 03 starten Ausschalten Software schlie en Rechner herunterfahren ViCell ausschalten 4 Zellz hlung Anforderungen an die Zellsupension Probenvolumen minimal 0 5 mL maximal 1 5 mL im Probengef Konzentrationsbereich Herstellerangaben 1 0 10f bis 1 0 10 Zellen mL Proben mit einer Konzentration gt 1 0 10 Zellen mL m ssen vorverd nnt werden Proben die Carrier enthalten k nnen m ssen filtriert werden lt 100 um z B mit Partec Celltrics 100 um Nr 04 0042 2318 Becton Dickinson Bioscience Discovery Labware Cell strainer 70 um Nr 352235 Messung 5 1 Probe in Original Probengef pipettieren und in
291. ffwechsel der genutzten MDCK bzw Vero Zellen wobei intensiv extrazellul re Stoffwechselprodukte in Konzentrationsverl ufen von Batch 04 15 192 Des Weiteren wurde mittels Metabolischer Stoff q 22 231 Prozessen untersucht wurden flussanalyse der Metabolismus von MDCK Zellen genauer charakterisier Trotz dieser Arbeiten sind zahlreiche Fragen zum Stoffwechsel von Zellen und mit Virus infizierten Zellkulturen offen Grunds tzlich ist unklar wie weit der Stoffwechsel der tierischen Zellen durch die Replikation des Influenza Virus beeintr chtigt ist und ob eine Limitation der Virusreplikation auf metabolischer Ebene existiert Generell besteht der Verdacht f r solch eine Beeintr chtigung des Wirtszellstoffwechsels denn es konnten diverse Arbeiten in der Literatur metabolische Auswirkungen von viralen Infektionen auf den Stoffwechsel tierischer Zellen nachweisen 230 Neben dieser speziellen Problematik beim Upstream der Impfstoffherstellung existieren generell f r kultivierte tierische Zellen zahlreiche offene Fragen zum Stoffwechsel wie z B nach der Ursache des stark ver nderten Stoffwechsels von kultivierten tierischen Zellen verglichen mit dem Stoffwechsel im Gewebe Die meisten kultivierten Zellen weisen eine ineffiziente Nutzung der Wachstumssubstrate Glucose und Glutamin auf Da deswegen Abbauprodukte im Zellkultur berstand akkumulieren und diese Abfallprodukte Zellwachstum bzw Produktion einschr nken k nnen stellt
292. ffwechsels Wie in den vorangegangenen Abschnitten beschrieben nutzen verschiedene Zelllinien zwar mitunter unterschiedliche Stoffwechselwege ein einheitliches Muster zeigen aber nahezu alle industriell relevanten Zelllinien im Bezug auf eine starke Glykolyse und Glutaminolyset tigkeit Da die Glucose nur ineffizient genutzt wird was bedeutet dass keine vollst ndige Oxidation zu CO und HO erfolgt sind gro e Mengen an Glucose und Glutamin erforderlich um den Energiebedarf zu decken Beide Abbauprodukte Lactat und Ammonium sind f r viele Prozesse nachteilig weshalb in der Vergangenheit zahlreiche Strategien angewendet wurden um die Akkumulation dieser Metaboliten im Zellkultur berstand zu vermeiden Mit Hilfe von verfahrenstechnische Ans tzen wie z B Fed Batch oder Perfusionsstrategien konnten die Konzentrationen der Abbauprodukte niedrig gehalten werden 97 Neben dem Verd nnen bzw 3 Theoretische Grundlagen 19 dem Entfernen der Abfallprodukte besteht die M glichkeit den Stoffwechsel der Zellen positiv zu beeinflussen Durch kontinuierlich niedrige Konzentrationen von Glucose im Medium konnte die Effizienz des Glucoseabbaus erh ht werden was zur Folge hatte dass weniger Lactat ausge schieden wurde und ein gr erer Anteil der Glucose vollst ndig zu und H20 oxidiert wurde 42 48 84 100 104 Diese Adaption des Metabolismus zeigte Effekte auf sowohl transkriptorischer als auch translatorischer Ebene 191 Andere St
293. ft eine Verfeinerung des Modells durchgef hrt indem nicht signifikante Faktoren entfernt werden 3 Theoretische Grundlagen 33 Sternpunkt Zentrumspunkt Abbildung 3 6 Graphische Darstellung eines Central Composite Versuchsplans mit zwei Faktoren x und Jeder Faktor wird f r f nf verschiedene Niveaus untersucht a 1 0 1 a wobei unterschiedliche Kombinationen der beiden Faktoren vorliegen 3 5 4 Pr fung der Angemessenheit des Modells Wie oben beschrieben wird mit Hilfe der Varianzanalyse statistisch berpr ft ob ein Modell z B entsprechend den Gleichungen 3 3 oder 3 6 die Daten beschreiben kann Voraussetzungen f r die Varianzanalyse sind allerdings dass die Fehler Abweichung der Messwerte vom Modell normal und unabh ngig verteilt sind mit einem Mittelwert 0 und konstanter Varianz Eine berpr fung dieser Voraussetzung erfolgt h ufig in der Form von Diagrammen wobei die Residuen ber verschiedene Gr en in Streudiagrammen aufgetragen werden Grunds tzlich sollten die Residuen keine Muster aufweisen F r den Fall dass die Residuen jedoch erkennbare Strukturen aufweisen wird h ufig eine Transformation der Zielgr e durchgef hrt die die Varianzen stabilisieren soll Daraufhin erfolgt eine Varianzanalyse mit den transformierten Werten Verschiedenste M glichkeiten der Transformation bestehen z B Quadratwurzel Logarithmus wenn bereits Wissen zu der Verteilung der Beobachtungen vorhanden
294. gegangenen Experimenten in GMEM Z zu haben Beide Medien resultierten in sehr hnlichen Verl ufen von sowohl Zellzahlen als auch extra und intrazellul ren Metabolitkonzentrationen nicht gezeigt Der Verlauf der Zellzahlen zeigte eindeutig dass sowohl Glucose als auch Glutamin essentiell f r ein gutes Wachstum von Vero Zellen ist Der Verbrauch dieser beiden Substrate nicht gezeigt entsprach den typischen Verl ufen was bedeutet dass Glucose bis zum Ende der Kultivierungen nahezu vollst ndig aufgebraucht war Glutamin war bereits nach etwa 80 h verbraucht Die daraus resultierenden Abfallprodukte Lactat und Ammonium wurden ausgeschieden Lactat wurde ausschlie lich von den Kulturen in glucosehaltigen Medien freigesetzt Ammonium wurde von allen Kulturen ausgeschieden wobei die h chste Konzentration im Medium mit Glutamin erreicht wurde 2 mM gefolgt vom Medium mit Glucose und Glutamin 1 5 mM Auch in den glutaminfreien Medien wurde Ammonium freigesetzt Pyr 1 mM 0 6 mM Zus tzlich wurde von allen Kulturen Glutamat ausgeschieden Von den intrazellul ren Metabolitkonzentrationen sind insbesondere die in Abbildung 5 27 dargestellten zu erw hnen F r F16bP zeigte sich deutlich dass nur in den Medien in welchen Glucose vorhanden war auch signifikante intrazellul re Konzentrationen dieses Intermediates auftraten Dabei waren die gemessenen Konzentrationen ber den gesamten Kulturverlauf relativ konstant
295. glichkeiten der Gewichtung der Zielgr en durch den Exponenten f r zu maximierende A und zu minimierende Zielgr en 34 Abbildung 3 8 Schematische Darstellung der zeitlichen Verschiebung von Verlaufskurven f r die Verwendung im Rahmen der Kreuzkorrelation 22202004000000000nnnnannnunnannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 36 Abbildung 5 1 Gradientenprogramme und entsprechende Chromatogramme einer Standardmischung f r die Anlage DEE deet EENEG ch 53 Abbildung 5 2 Einfluss des pH Wertes der Probe auf die relativen Peakfl chen Chromatogrammen 55 Abbildung 5 3 Darstellung eines repr sentativen Chromatogramms des Leitf higkeitskanals einer Extraktionsprobe mit den in mehreren Extraktionsproben auftretenden m z Fragmenten 57 Abbildung 5 4 Standardabweichung A und relative Standardabweichung B f r die Metaboliten ATP gemessen per UV Detektion und Pyruvat gemessen per MS Detektion ber die Konzentration im ee ce ee Pe EN 60 Abbildung 5 5 Gradientenprogramme und entsprechende Chromatogramme der gepulsten amperometrischen Detektion der jeweils aktuellen Standardmischung f r die Anlage DX600 62 Abbildung 5 6 Vergleich verschiedener Extraktionsmethoden zur Bestimmung intrazellul rer Metaboliten aus MDCK Zellen in Sechs Well Platten bez glich A Absorption bei 280 nm Relativer ATP Geh ltpro Zell amp c r Au rn rn EES EE
296. gonalit t Dies bedeutet dass jede Faktorstufenkombination gleich h ufig untersucht wird wodurch gew hrleistet wird dass der Versuchsplan ausgewogen ist Dies ist f r die Auswertung der entsprechenden Versuche wichtig Beispielhaft ist ein Schema der durchzuf hrenden Experimente eines 2 Faktor 2 Level Versuchs in Abbildung 3 4 A und B in graphischer und tabellarischer Matrix der unabh ngigen Variablen Form gezeigt F r beide Faktoren gibt es in diesem Beispiel zwei zu untersuchende Niveaus hoch bzw und niedrig bzw und jedes Niveau des einen Faktors wird f r beide Niveaus des anderen Faktors getestet steht f r den Durchschnittswert des Experiments A und B f r die Haupteffekte und AB f r den Interaktionseffekt Die Plus und Minuszeichen werden in diese Tabelle eingegeben indem man entsprechend den Niveaus ein Plus f r das hohe und ein Minus f r das niedrige Niveau einsetzt 28 3 Theoretische Grundlagen b ab band Experiment Einstellung Faktorieller Effekt A Experimente B I A B AB 3 1 1 2 niedrig hoch 3 b Level Faktor 4 ab Abbildung 3 4 Darstellung der Faktoreinstellungen f r die vier durchzuf hrenden Versuche bei einem 2 Faktor 2 Level faktoriellen Experiment A Graphisch Design Matrix Der Effekt einer Einflussgr e auf die Zielgr e ist definiert als die nderung der Zielgr e bedingt durch die nderung des Niveaus de
297. gulation widergespiegelt haben Detaillierte Zusammenh nge k nnen aber basierend auf diesen Daten nicht gegeben werden Der Konzentrationsverlauf des intrazellul ren Pyruvats zeigte deutlich den Einfluss des extrazellul ren Pyruvats auf die intrazellul r gemessene Konzentration Hierbei stellte sich allerdings die Frage in wie weit der Messwert f r die intrazellul re Konzentration durch eine berschleppung des extrazellul ren Pyruvats verf lscht wird Dazu wurde ein Versuch mit Phenolrot als extrazellul rer Marker durchgef hrt nicht gezeigt Es wurden ca 0 2 der Ausgangskonzentration von Phenolrot im Zellkultur berstand in der Probe nach einer vergleich baren Probenvorbereitung gemessen F r die gemessenen intrazellul ren Pyruvatkonzentrationen bedeutet dies dass der Wert sich aus zwei etwa gleich gro en Anteilen zusammensetzt wobei der eine die wahre intrazellul re Konzentration wiedergibt und der andere die berschleppung aus dem Zellkultur berstand In Zahlen bedeutet dies dass bei einem Messwert von 7 uM nach dem L sen der Proben ein Anteil von etwa 3 uM aus der extrazellul ren Konzentration von Pyruvat f r 2000 uM resultiert Da dies aber nur eine grobe Absch tzung ist und weitere Einflussgr en ber cksichtigt werden sollten w re eine genaue Untersuchung dieses Problems noch durch zuf hren Dennoch w re selbst f r den schlechten Fall dass 0 25 der extrazellul ren Konzen 5 Ergebnisse und Diskussion 14
298. h den Maxima sanken beide Konzentrationsverl ufe in hnlicher Form ab Eine konkrete Endkonzentration f r die beiden Medien zu nennen f llt aufgrund der schon oben erw hnten starken Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchen schwer So lagen die gemessenen Konzentrationen bei etwa 100h f r GMEM Z zwischen etwa 230 und 500 uM und f r EpiSerf zwischen 170 und 530 uM Der n chste aus dem Krebszyklus gemessene Metabolit ist Succinat Hier zeigten sich f r die beiden unterschiedlichen Medien klare in allen Versuchen auftretende Unterschiede Tendenziell war bei beiden Medien die Konzentration von Succinat zu Beginn der Kultivierung am h chsten hielt in den ersten 48 h ein konstantes Niveau und fiel anschlie end innerhalb kurzer Zeit bis 78 h auf einen Wert der bis zum Ende der Kultivierung gehalten wurde In GMEM Z war allerdings noch ein leichtes Peak Verhalten kurz vor dem Beginn des Konzentrationsabfalls bei ca 48 h zu erkennen Dar ber hinaus war der Abfall in GMEM Z deutlich steiler 122 5 Ergebnisse und Diskussion F r Fumarat wurde in EpiSerf zu Beginn der Kultivierung eine erheblich h here Konzentration als f r GMEM Z gemessen Anschlie end zeigte der Verlauf f r beide Medien ein Maximum 130 uM bei etwa 46h Im Anschluss fiel die Konzentration ab wobei GMEM Z sich bei etwa 70h auf einen Wert von ca 60 uM einpendelte und bis zum Ende der Kultivierung konstant blieb F r EpiSerf war ein l ngeres Abfallen der Konzent
299. he Biomedical and Life Sciences 866 1 2 64 76 193 Wamelink MMC Struys EA Huck JHJ Roos B van der Knaap MS Jakobs C Verhoeven NM 2005 Quantification of sugar phosphate intermediates of the pentose phosphate pathway by LC MS MS application to two new inherited defects of metabolism Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 823 1 18 25 194 Monkkonen H Moilanen P Monkkonen J Frith JC Rogers MJ Auriola S 2000 Analysis of an adenine nucleotide containing metabolite of clodronate using ion pair high performance liquid chromatography electrospray ionisation mass spectrometry Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 738 2 395 403 195 Luo B Groenke K Takors R Wandrey C Oldiges M 2007 Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis pentose phosphate pathway and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography mass spectrometry Journal of Chromatography A 1147 2 153 164 196 Buchholz A Takors R Wandrey C 2001 Quantification of intracellular metabolites in Escherichia coli K12 using liquid chromatographic electrospray ionization tandem mass spectrometric techniques Analytical Biochemistry 295 2 129 137 197 Oldiges M Kunze M Degenring D Sprenger GA Takors R 2004 Stimulation monitoring and analysis of pathway dynamics by metabolic profiling in the aromatic amino acid pathway Biotechnology Prog
300. he von Reaktionen im Stoffwechsel durch laufen Typisch f r kultivierte tierische Zellen w re die Reduktion zu Lactat und anschlie ender Ausscheidung Die Akkumulation von Lactat war f r die beiden Medien unterschiedlich Zum einen war die Endkonzentration von Lactat in GMEM Z deutlich h her und zum anderen war auch die zellspezifische Lactatausscheidungsrate nicht gezeigt in GMEM Z h her Somit k nnte die intra zellul re Pyruvatkonzentration einen Hinweis auf den Lactatstoffwechsel geben Grund hierf r k nnte eine durch das Medium beeintr chtigte Aktivit t der Lactat Dehydrogenase gewesen sein Allerdings widerspricht die in der Literatur erw hnte hohe Aktivit t dieses Enzyms f r verschiedenste Zust nde dieser Hypothese D 5 5 65 68 223 Auf Grund der nahezu generell hohen 126 5 Ergebnisse und Diskussion 41 wurden in der Vergangenheit die Aktivit t dieses Enzyms in kultivierten tierischen Zellen intrazellul ren Konzentrationen von Pyruvat und Lactat genutzt um das Verh ltnis NAD NADH abzusch tzen 2231 Hierbei wurde bei dieser Reaktion von einem Gleich gewicht gem Pyruvat NADH H Lactat NAD ausgegangen Somit ist das Verh ltnis NADH entscheidend f r die Umsetzung von Pyruvat zu Lactat M glicherweise war dieses Verh ltnis in EpiSerf h her weshalb auch eine h here Konzentration von Pyruvat zu Beginn der Kultivierung vorlag Ein m glicher Beleg f r diese
301. heinander verbraucht wurden Allerdings verhielten sich die beiden folgenden Zwischenprodukte 3PG und PEP deutlich anders Der nach etwa 3 min eintretende Anstieg war h chstwahrscheinlich ein regulatorischer Effekt auf Metabolit ebene Als Erkl rung kommt hier wie bereits oben erw hnt die Aktivierung der Pyruvat Kinase durch F16bP in Frage denn zu dem Zeitpunkt als F16bP verbraucht war begann die Akkumulation von 3PG und PEP Sowohl in vitro als auch f r Hefen und Tumorzellen wurde dieser regulatorische Zusammenhang gezeigt 212 30 306 3071 Dennoch war ein derartiger Anstieg der Kon zentrationen nicht zu erwarten da die Vorl ufermetaboliten bereits sehr niedrige Konzentrationen erreicht hatten und aufgrund der Limitation theoretisch kein Fluss durch die Glykolyse mehr h tte stattfinden d rfen Somit stellte sich die Frage welche Quellen f r die Produktion dieser Zwischen produkte genutzt wurden In wie weit hierf r der Abbau von endogenen Substraten wie Proteinen Fetts uren oder zellul rer Speicherstoffe eine Rolle spielen kann nicht beantwortet werden Auch die Frage ob die Synthese von PEP und 3PG durch die f r die Gluconeogenese wichtigen Enzyme Pyruvat Carboxylase und Phosphoenolpyruvat Carboxykinase erfolgte kann basierend auf den Daten nicht gekl rt werden Neben den aufeinander folgenden Metaboliten 3PG und PEP die beide einen Konzentrationsanstieg zeigten war aus der Kreuzkorrelationsmatrix ein gleichartiges Verhal ten
302. hosphorylation states of rat liver Biochemical Journal 127 2 387 397 240 Huck JHJ Struys EA Verhoeven NM Jakobs C Van der Knaap MS 2003 Profiling of pentose phosphate pathway intermediates in blood spots by tandem mass spectrometry Application to transaldolase deficiency Clinical Chemistry 49 8 1375 1380 241 Jensen UG Brandt NJ Christensen E Skovby F Norgaard Pedersen B Simonsen H 2001 Neonatal screening for galactosemia by quantitative analysis of hexose monophosphates using tandem mass spectrometry A retrospective study Clinical Chemistry 47 8 1364 1372 242 Zuurbier CJ Eerbeek O Goedhart PT Struys EA Verhoeven NM Jakobs C Ince C 2004 Inhibition of the pentose phosphate pathway decreases ischemia reperfusion induced creatine kinase release in the heart Cardiovascular Research 62 1 145 153 243 Haas RH Breuer J Hammen M 1988 High performance liquid chromatographic measurement of selected blood citric acid cycle intermediates Journal of Chromatography 425 1 47 57 244 Yang L Kasumov T Yu L Jobbins KA David F Previs SF Kelleher JK Brunengraber H 2006 Metabolomic assays of the concentration and mass isotopomer distribution of gluconeogenic and citric acid cycle intermediates Metabolomics 2 2 85 94 245 Box GEP Hunter WG Hunter JS 1978 Statistics for Experimenters New York John Wiley 653 p 193 246 Dean A Voss D 1999 Design and Analysis of Experiments New York
303. ht Mit jedem zus tzlichen Faktor kommt eine weitere Dimension hinzu Typischerweise untersucht man mit 2 Versuchspl nen die Gr enordnung und Richtung des Effektes der Faktoren um festzustellen welche Faktoren f r den Prozess relevant sind Mit der Varianzanalyse werden die Hypothesen auf statistische Signifikanz berpr ft 3 5 2 Fraktionelle faktorielle Versuchspl ne Mit zunehmender Anzahl von Faktoren die in einem 2 faktoriellen Experiment untersucht werden sollen nimmt die Anzahl der Experimente f r ein komplettes Experiment stark zu Z B w ren bei sechs Faktoren bereits 64 Einzelexperimente erforderlich wobei nur ein Teil der Freiheitsgrade notwendig ist um die Haupteffekte und die Effekte der 2 Faktor Interaktionen zu sch tzen Im Falle der h ufig gerechtfertigten Annahme dass der zu untersuchende Prozess haupts chlich durch Haupteffekte und Interaktionseffekte niedriger Ordnung beeinflusst wird kann anstelle eines kompletten faktoriellen Versuchsplans nur ein Teil der Einzelexperimente durchgef hrt werden Hierbei spricht man von einem fraktionellen faktoriellen Versuchsplan Diese Versuchspl ne werden vor allem dann genutzt wenn viele Faktoren zu untersuchen sind aber nur von einigen ein ma geblicher Einfluss auf den Prozess erwartet wird In Folgeexperimenten k nnen dann die als wichtig erkannten Faktoren genauer charakterisiert werden Dar ber hinaus finden fraktionelle 3 Theoretische Grundlagen 31 Versu
304. ht beantwortet werden Als zweite Einflussgr e ist sicherlich die Kultivierungsbedingung der Vorkultur relevant Aus logistischen Gr nden war es f r diese Versuche nicht m glich identische Vorkulturen einzusetzen Dies hatte zur Folge dass f r die Kultivierungen 1 und 2 T Flaschen verwendet wurden f r Kultivierung 3 Rollerflaschen Auch das Alter der Vorkulturen war nicht einheitlich 1 6 Tage 2 3 Tage 3 4 Tage Gerade auf das maximale erreichte Gesamtzellvolumen schien die Vorkultur einen Einfluss zu haben Mit zunehmendem Alter der Vorkultur war das maximal erreichte Volumen w hrend einer Kultivierung geringer Zus tzlich schienen die maximalen Zellvolumina bei Vorkultur in T Flaschen gr er gewesen zu sein als in Rollerflaschen Dies wurde auch in weiteren Experimenten beobachtet nicht gezeigt Eine systematische Untersuchung dieses Ph nomens bleibt durchzuf hren Als dritte Ursache f r unterschiedliches Zellwachstum kommen sicherlich eine Variabilit t des Serums bzw des Hydrolysates in Frage Verschiedene Medienchargen kamen zum Einsatz da diese Versuche in einen Zeitraum von mehreren Monaten nacheinander durchgef hrt wurden Die maximalen spezifischen Wachstumsraten f r die beiden Medien waren nicht signifikant unterschiedlich Hierbei ist allerdings zu ber cksichtigen dass sich die maximalen spezifischen Wachstumsraten f r das gleiche Medium aber f r verschiedene Versuche mitunter deutlich unter schieden Aus diese
305. ht n tig Weiterhin sollte Tricine als Puffer benutzt werden und ein MeOH Volumen von 1600 uL bei 70 C eingesetzt werden Diese Extraktionsbedingungen sind in Abbildung 5 8 A durch die gestrichelten senkrechten Linien gekennzeichnet 5 Ergebnisse und Diskussion 73 Nukleotid 0 996 lt es gehalt Charge Absorp 280nm Zielgr e F16bP Gehalt 0 852 JEE Overall i i Desirability i Waschen Kochen Ultraschall Puffer Behandlung Faktor 184 B Nukleotid 1 25 Ar ees d gehalt e 034 144 Energy 1 16 z F te 2 4 a SE Charge 07 4 pen Gehalt 1 76 dE E DE Zielgr e Absorp 280 Overal 0 87 Desirability icine ____ 1x J g I Vol CHCl Vol MeOH Ultraschall Puffer Anzahl Desirability Behandlung Extraktionen Faktor Abbildung 5 8 Optimierung der Methoden MeOH Kochen A und MeOH CHCI B gem der fraktionellen faktoriellen Versuchspl ne mit Hilfe des Prediction Profilers s a Tabelle 4 3 Die verschiedenen Zielgr en und die Overall Desirability sind auf der Ordinate aufgetragen Die fett gedruckten Werte entsprechen der erreichten Werten der jeweiligen Zielgr e bei den optimalen Einstellungen s a gestriche
306. htet werden Auf diese Weise k nnten eindeutige Zusammenh nge zwischen Mediuminhaltsstoffen und einzelnen intrazellul ren Metabolit konzentrationen gefunden werden Weitere Kurzzeitexperimente k nnten dazu dienen die Aktivit t einiger Enzyme in vivo zu ermitteln Dazu w re aber auch die zus tzliche Messung der extra zellul ren Konzentrations nderungen der entsprechenden Substrate und Abbauprodukte erforder lich Um die geringen Konzentrations nderungen im Zellkultur berstand messen zu k nnen m sste hierbei wahrscheinlich eine Messmethode mit einer h heren Sensitivit t und niedrigen Bestimmungsgrenzen zum Einsatz kommen als das im Verlauf dieser Arbeit verwendete Ger t Bioprofile Plus Dar ber hinaus w re f r solche Studien auch der Einsatz von spezifischen Enzyminhibitoren denkbar Da auf diese Weise eine Weiterreaktion der Stoffwechselprodukte an definierten Stellen des Metabolismus verhindert w rde w re eine Bilanzierung m glich ohne die Abbauprodukte des vollst ndigen Stoffwechsels zu messen Auf diese Weise k nnten weitere wichtige Parameter f r eine kinetische Modellierung des Zentralstoffwechsels gesch tzt werden Aus den in dieser Arbeit gezeigten Konzentrations nderungen verschiedener Metaboliten im Verlauf einer Kultivierung kann geschlossen werden dass sich auch die Regulation verschiedener Stoffwechselwege ndert Bei Kenntnis der Metabolitkonzentrationen und Enzymaktivit ten zu verschiedenen Zeitpunkten best
307. i unabh ngige Experimente wurden durchgef hrt anschlie end wurden die Daten der drei Experimente gemeinsam gegl ttet Spline bzw Boltzmann Sigmoid s durchgezogene Verlaufskurven in Abbildung 5 19 F r eine weitere Erkl rung zur Interpretation sei auf Abbildung 5 16 verwiesen Grunds tzlich zeigt die Matrix mehr positive Korrelationen als negative Die bereits in Abbildung 5 19 gut korrelierenden Metabolitgruppen sind auch in diesem Diagramm wiederzufinden Die starke Farbs ttigung deutet eine gro e Anzahl von hohen Korrelationskoeffizienten an Eine Gruppe stark positiv korrelierender Variablen bildete ein Gro teil der extrazellul ren Konzentrationen einige Glykolyseintermediate verschiedene organische S uren und einige Nukleotide Repr sen tativ f r diese Verl ufe sind die gemessenen Zuckerphosphate die zu Beginn eine hohe Konzen tration sp ter einen Konzentrationsabfall und gegen Ende einen konstanten Wert zeigten Die zu 130 5 Ergebnisse und Diskussion diesen Metaboliten positiv korrelierten Variablen wiesen somit einen hnlichen wenn auch even tuell zeitversetzten Verlauf auf Die mit den Zuckerphosphaten negativ korrelierten Variablen zeigten einen entgegengesetzten Konzentrationsverlauf d h zuerst waren die Werte niedrig und im Verlauf der Kultivierung stiegen diese Werte an Einige der stark negativ korrelierten Variablen waren z B die Zellzahl das Gesamtzellvolumen Lactat Ammonium Die hier erw hnten Kor
308. iche der gemessenen Nukleotide verhielten sich hnlich Zum Gro teil spiegelten diese Ergebnisse auch das Korrelationsverhalten f r die Kultivierungs experimente wider Ein bedeutender Unterschied zwischen den Kultivierungsexperimenten und den Kurzzeitexperimenten war das Verhalten von 3PG und PEP Die starken negativen Korrelationen die in den Kurzzeitexperimenten auftraten waren in den Kultivierungen nicht zu finden Somit war es mit den hier durchgef hrten Versuchen m glich eine Beschreibung der intra zellul ren Metabolitkonzentrationen von MDCK Zellen unter typischen Kultivierungsbedingungen f r verschiedene Zellkulturmedien und in kurzen Zeitr umen nach dem Entfernen oder der Zugabe von Zellkulturmedium zu erhalten Ebenso konnte der Einfluss einiger Mediumkomponenten auf die intrazellul ren Metabolitkonzentrationen in Vero Zellen beschrieben werden 6 Zusammenfassung 173 6 Zusammenfassung In der hier vorliegenden Arbeit wurde eine Methode zur Messung intrazellul rer Metabolitkonzen trationen etabliert und verschiedene Zellkulturen und Kultivierungszust nde anhand der intra zellul ren Metabolitkonzentrationen charakterisiert Nach der Entwicklung einer AAC Methode mit Leitf higkeits und UV Detektion zur Trennung und Quantifizierung von mehr als 25 potentiell intrazellul r auftretenden Metaboliten konnte anhand einer Validierung mit Standards in Wasser die gute Reproduzierbarkeit und Linearit t dieser Messmetho
309. icher systematischer Fehler auftreten Um dies aufzukl ren wurde die oben erw hnte Mikroskopie der adh renten Zellen durchgef hrt Eine routinem ige mikroskopische Bestimmung der Zellvolumina w re aufgrund des gro en Aufwandes zwar nicht m glich aber idealerweise sollte ein Abgleich zwischen den mikroskopisch und den mittels ViCell XR ermittelten Volumina erfolgen Im Falle einer konstanten ber oder Untersch tzung der einen Methode h tte eine Anpassung durch einen empirischen Faktor stattfinden k nnen Allerdings h tte auch auf diese Weise keine Bestimmung des wahren Zellvolumens erfolgen k nnen da nicht nur die Methoden mittels des ViCell XR sondern auch die mikroskopische Methode fehlerbehaftet ist Auch mikroskopisch war kein eindeutiges Ergebnis zu ermitteln da kein Abgleich bzw keine Kontrolle der Ergebnisse m glich war Dies bedeutet dass das auf diese Weise ermittelte Volumen durch die Art der Zellf rbung und besonders durch die Vermessung der Zellen die der Subjektivit t des Experimentators unterliegt beeinflusst war Im Grunde zeichneten sich zwar gleiche Tendenzen bei den beiden Verfahren zur Volumenbestimmung ab aber auch deutliche Unterschiede sowohl in der Verteilung als auch in den absoluten Werten waren vorhanden Ein Problem beim Abgleich der Daten k nnte dadurch aufgetreten sein dass in der Software des ViCell XR ein Zelltyp f r die Auswertung benutzt wurde der einen maximalen Zelldurchmesser von 25 um zul
310. iden stark unterschiedlichen Medien GMEM Z und EpiSerf zeigen dass die intrazellul ren Konzentrationen zahlreicher Metaboliten erheblich durch das Zellkulturmedium beeinflusst waren was ganz deutlich die Komplexit t der Regulation des Zentralstoffwechsels andeutet Kreuzkorrelationsanalyse der Konzentrationen Zellzahlen und Zellvolumina Eine vollst ndige Beschreibung s mtlicher gemessener Stoffwechselproduktkonzentrationen ist im Rahmen dieser Arbeit nicht m glich Um allerdings das Verhalten der Konzentrationen zumindest qualitativ wiederzugeben und um einen besseren berblick ber die hnlichkeiten im Verlaufs verhalten zu erhalten wurde eine Kreuzkorrelation der verschiedenen Verlaufskurven der Metaboliten durchgef hrt Zwar sind die Kreuzkorrelationsmatrizen in diesem Abschnitt nach den bereits gezeigten einzelnen Verl ufen der Metabolitkonzentrationen aufgef hrt typischerweise wurden die Korrelationsmatrizen allerdings bei der Auswertung von Experimenten zuerst begut achtet um einen berblick ber die Gruppierungen der Konzentrationsverl ufe zu erhalten Anschlie end wurden dann einzelne charakteristische Verl ufe begutachtet Um ein besseres Verst ndnis zu erreichen wurde die Reihenfolge dieser Abbildungen hier vertauscht Da sich die Konzentrationsverl ufe mancher Metaboliten stark hnelten aber einen Zeitversatz aufwiesen wurde ein gegenseitiges Verschieben der Kurven um bis zu 10h zugelassen F r eine detaillie
311. ie was in vorangegangenen Experimenten nicht gezeigt als ausreichend definiert wurde Es zeigte sich aber in sp teren Versuchen dass typischerweise gerade im fr hen Stadium einer Kultivierung zwischen 8 und 40 h auch deutlich gr ere Zellen in Kulturen existieren Auch mikroskopisch war dies nachzuweisen Bei Ber ck sichtigung dieser gro en Zellen w re das durchschnittliche Zellvolumen insbesondere bei t 30h gr er ausgefallen Allerdings kann durch diesen Fehler keine vollst ndige Erkl rung der Unterschiede zwischen mikroskopischen und mittels ViCell XR ermittelten Werten erfolgen Die Absch tzung der Fl che bei mikroskopischer Vermessung war sicherlich relativ gut Allerdings traten bei der Vermessung der H he der Zellen Probleme auf So konnte nicht gekl rt werden wie weit eine bersch tzung des Volumens aufgrund eines Durchscheinens der F rbung in der Z Ebene stattgefunden hat Da der Rahmen dieser Arbeit eine genauere Untersuchung der Zellvolumina nicht zulie und keine Hinweise vorlagen dass das mikroskopisch bestimmte Volumen einen realis tischeren Wert widerspiegelt wurde aus Gr nden der Durchf hrbarkeit das Zellvolumen mittels Trypsinierung und Bestimmung durch das Ger t ViCellXR ermittelt Die Absch tzung des 98 5 Ergebnisse und Diskussion tats chlichen Volumenverlaufs durch die Anpassung eines sigmoiden Kurvenverlaufs wird in Abschnitt 5 3 2 2 diskutiert Als Bezugsgr e f r intrazellul re Metab
312. ie Gleichung sind im Anhang in Tabelle A10 zusammengefasst Gem der Varianzanalyse war nur das Modell f r die Zielgr e Absorption 280 nm signifikant Die Modelle f r die anderen Zielgr en wiesen p Werte auf die knapp ber der Signifikanzgrenze von 0 05 lagen Eine Verfeinerung der Modelle also ein Entfernen nicht signifikanter Faktoren wurde nicht durchgef hrt Die ermittelten Regressionsmodelle wurden im Anschluss genutzt um Vorhersagen bez glich des Einflusses der Faktoren auf die Zielgr e machen zu k nnen Dazu wurde der Prediction Profiler eine Funktion der Software JMPin eingesetzt Abbildung 5 8 Zus tzlich war es mit dem Programm m glich eine kombinierte Optimierung f r alle vier Zielgr en mit Hilfe von Desirability Funktionen 251 durchzuf hren In Abbildung 5 8 A sind in der u erst rechten Spalte die individuellen Desirability Funktionen dargestellt grau hinterlegt Die unterste Zeile deutet die Abh ngigkeit der Overall Desirability von den einzelnen Faktoren an grau hinterlegt Die wei en Diagramme stellen die Abh ngigkeit der unterschiedlichen Zielgr en von den verschiedenen Einflussgr en dar Wie aus Abbildung 5 8 A zu erkennen ist sollten entsprechend den Berechnungen folgende Extraktionsbedingungen gew hlt werden um den maximalen Wert der Overall Desirability zu erreichen Die Zellen sollten gewaschen und die Extrakte gekocht werden Eine Ultraschall Behandlung ist nic
313. ie Verl ufe ab ca 48 h relativ konstant f r beide Medien Da ab etwa 120 h nur f r Kultivierung 3 Proben genommen wurden sollte in weiteren Experimenten gepr ft werden ob die Konzentration von ATP in Episerf gegen Ende der Kultivierung tats chlich signifikant niedriger war F r ADP und AMP schienen die Konzentrationen ab etwa 48 h in Episerf deutlich niedriger zu sein als f r GMEM Z Diese drei Adenosinnukleotide flie en in die Berechnung der Energy Charge ein Aus den beschriebenen Konzentrationen ergibt sich zwangsl ufig ein h herer Wert f r EpiSerf als f r GMEM Z In der Vergangenheit zeigten zahlreiche Arbeiten in vitro den regulatorischen Einfluss der Adenosinnukleotide auf verschiedenen Enzyme 89 93 94 283 In diesen Arbeiten konnte nachgewiesen werden dass schon geringe nderungen der Energy Charge einen Einfluss auf die Aktivit ten vieler Enzyme haben k nnen Insbesondere einige Enzyme der Glykolyse und des Krebszyklus werden durch eine hohe Energy Charge inhibiert P Somit k nnte die h here Energy Charge der in EpiSerf kultivierten Zellen den etwas langsameren Abbau der Glucose erkl ren Die Zusammenh nge in vivo sind allerdings deutlich komplexer als bei den oben erw hnten Untersuchungen zu Enzymaktivit ten in vitro da der vollst ndige Metabolismus ber cksichtigt werden muss Grunds tzlich muss bei den Kultivierungsversuchen die Ursache des unterschiedlichen Stoffwechsels in den Kultivierungs bedingungen lieg
314. iert werden Zur Optimierung wurden die vier Zielgr en mittels Desirability Funktionen vereint wodurch auf objektive Weise ein Gesamtoptimum f r jede der Methoden gefunden werden konnte Im folgenden Versuch wurde anhand eines Central Composite Versuchsplans eine genaue Charakterisierung der beiden Methoden in Abh ngigkeit von drei kontinuierlichen Einflussgr en durchgef hrt Auch f r diese Versuche wurde eine Optimierung durch Nutzung von Desirability Funktionen durchgef hrt Die beiden auf diese Weise unabh ngig voneinander entwickelten Methoden wurden in der Folge verglichen Hierzu wurden die Methoden auf ihr Potential getestet intrazellul re Metaboliten quantitativ zu extrahieren und nach Standardzugabe eine Wiederfindung von 100 zu erzielen In diesen Versuchen wurde eine Enzymaktivit t entdeckt die w hrend der Probenvorbereitung eine Umsetzung von Nukleotiden bewirkte Aus diesem Grund wurde eine Methode entwickelt welche 100 5 Ergebnisse und Diskussion auf einzelnen Schritten der zuvor optimierten Methoden basierte Diese Methode war in der Lage s mtliche Enzymaktivit ten zu unterbinden und somit mit der Literatur vergleichbare absolute Metabolitkonzentrationen zu erzielen Die Wiederfindungen dieser Methode waren f r fast alle untersuchten Metaboliten zwischen 90 und 110 Somit konnte eine verl ssliche und robuste Methode zur Probenvorbereitung f r die gleichzeitige Bestimmung von 30 verschiedenen intrazellul
315. ies wird auf den aktivierenden Effekt von F16bP auf das Enzym Pyruvat Kinase zur ckgef hrt Als eine hohe Kon 5 Ergebnisse und Diskussion 161 zentration von F16bP vorlag war die Pyruvat Kinase aktiv und setzte PEP und damit auch das im Gleichgewicht befindliche 3PG um Nach dem Verbrauch von F16bP war die Pyruvat Kinase inaktiv und es fand eine verminderte Umsetzung von PEP und 3PG statt weshalb diese Metaboliten akkumulierten Nach Zugabe von Glucose wurde innerhalb kurzer Zeit F16bP gebildet wodurch die Pyruvat Kinase aktiviert wurde und PEP und 3PG wieder verarbeitet wurden Diese Beobachtungen spiegeln den bekannten Mechanismus der Regulation der Pyruvat Kinase wider 19 1 5 3 4 3 Zugabe von verschiedenen Substraten nach Limitation In diesem Experiment sollten die unmittelbaren Auswirkungen einer Zugabe der Medienzus tze Serum Glucose und Glutamin auf die intrazellul ren Metabolitpools untersucht werden F r dieses Experiment wurden MDCK Zellen in GMEM Z bis in das sp te exponentielle Wachstum kultiviert anschlie end wurde das Medium durch PBS ersetzt Nach zweist ndiger Inkubation wurde das PBS durch verschiedene Medien ersetzt Vier verschiedene Medien wurden eingesetzt DMEM DMEM FCS DMEM FCS Glc DMEM FCS Gln Probenahmen erfolgten zu f nf Zeitpunkten wobei der erste Punkt vor dem Austausch des Mediums durch PBS stattfand Kontrolle und der zweite nach der zweistiindigen Inkubation in PBS und somit dem letzten
316. igma Al Gibco Merck Roth IOL Instruments Sigma Al Sigma Al Sigma Al PAN Merck Merck Sigma Al Sigma Al Sigma Al Sigma Al Sigma Al Merck Merck Gibco Sigma Al Sigma Al Sigma Al Sigma Al Roth Merck Merck Sigma Al Sigma Al Sigma Al Roth Sigma Al Sigma Al drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich drich Sigma Aldrich Sigma Aldrich Roth Roth Merck Merck Produktnummer P 0257 P 8877 71185 A 8509 4722 2 1031 A 2754 8 22254 A 1752 AA S 18 A 2383 208291 A3262 C 9755 7331 1 3412 C 1909 C 1006 C 1506 D 6500 D 4635 D 4010 D 7137 1 06586 E15 079 D 5288 E 0377 10732 022 8 18755 9065 4 F0877 F 3627 F 6625 3302 P280703 1 06443 F 2752 G 7000 G 7772 G 5152 G 7127 04074 00291 22100 093 G 8377 G 8877 6689 8 1 1252 CP41 2 04935 04877 L 7022 G 3126 M 0875 4627 5 N 1636 N 4505 N 5755 N 5130 3957 1 6885 1 1 08482 1 05537 Anhang Natriumsulfat Merck 1 06637 Oxalacetat Sigma Aldrich 0 4126 Sigma Aldrich P 0564 Perchlors ure Merck 100518 Phenolrot Sigma Aldrich P 3532 PP Sigma Aldrich 221368 Pyruvat Sigma Aldrich P 8574 RSP Sigma Aldrich R 7750 Salzs ure Roth 4625 1 Schwefels ure Merck 1 00731 Succinat Sigma Aldrich S 0141 Su
317. igt bei Glucoselimitation Weiterhin wirkte sich die extrazellul re Glutaminkonzentration positiv auf die intrazellul re Malatkonzentration aus Die Dynamik des Zentralstoffwechsels und die damit verbundene metabolische Regulation wurden in Kurzzeitexperimenten untersucht Hierf r wurde Zellen entweder die N hrstoffquelle entzogen 6 Zusammenfassung 175 oder es wurde nach einer Limitation Substrat zugegeben Deutlich konnten unterschiedlich schnelle Antworten der verschiedenen intrazellul ren Metabolitkonzentrationen auf die ver nderten Bedingungen beobachtet werden Die schnellste Konzentrations nderung durchlief Glucose 6 Phosphat Bereits nach wenigen Sekunden wurde ein leichter Konzentrationsabfall gemessen F r alle Kurzzeitexperimente waren die Konzentrationsverl ufe der Zuckerphosphate stark positiv untereinander korreliert wohingegen 3 Phosphoglycerat und Phosphoenolpyruvat negativ mit den Zuckerphosphaten korreliert waren Dieses Verhalten kann durch die Aktivierung der Pyruvat Kinase durch Fructose 1 6 Bisphosphat erkl rt werden Die meisten organischen S uren aus dem Krebszyklus zeigten ein biphasisches Verhalten als Antwort auf die Ver nderungen im Zellkultur berstand Dies deutet auf eine Regulation auf zwei Ebenen hin Der Gro teil der Nukleotide war von den ver nderten Umst nden unbeeinflusst Dies l sst im Fall der Limitation der N hrstoffe auf eine schnelle Regulation des Stoffwechsels schlie en da ei
318. igt waren Um einen berblick ber das Korrelationsverhalten f r die beiden beschriebenen Kurzzeitversuche zu geben wurden die Korrelationskoeffizienten gemittelt und sind in Abbildung 5 34 anhand eines Schemas von Glykolyse und Krebszyklus farbkodiert dargestellt Die dunkelblau gef rbten Felder deuten Metabolitpaare an welche ein stark korreliertes Konzen trationsverhalten zeigten Das hei t die entsprechenden Enzyme stellten wahrscheinlich keinen Regulationsschritt dar Der Gro teil der stark korrelierten Reaktionspartner waren bereits bei der Zusammenfassung aller Experimente durch die Korrelation ohne Zeitversatz in Abbildung 5 15 durch einen hohen Korrelationskoeffizienten charakterisiert bzw als durch eine sehr schnelle reversible Reaktion Glucosephosphat Isomerase Aconitase Fumarase umgesetzte Metaboliten aus der Literatur bekannt 1 5 Zus tzlich war f r F6P und F16bP ein hoher Korrelations koeffizient zu finden Diese Umsetzung wird durch die Phosphofructokinase katalysiert und dieses Enzym wird allgemein als ein regulierter irreversibler Schritt der Glykolyse beschrieben Die Tatsache dass F6P und F16bP f r diese Experimente sehr stark korreliert waren deutet an dass f r den beschriebenen Fall keine ma gebende Regulation von diesem Enzym ausgegangen sein kann da scheinbar eine unmittelbare Umsetzung von F6P zu F16bP stattgefunden hat M gliche Effektoren dieser Reaktion sind ATP ADP AMP und Citrat W hrend
319. ils zu Lactat abgebaut was im 5 Ergebnisse und Diskussion 139 Verlauf von Lactat zu erkennen war Dies bedeutet dass auch bei niedriger Glucosekonzentration der Abbau von Glucose nicht effizienter stattfand als in Medien mit hoher Glucosekonzentration GMEM Z Zu bemerken ist dass f r das Medium mit Glucose nach etwa 48 h die Lactatkon zentration wieder leicht abfiel was auf eine Aufnahme und einen Verbrauch von Lactat durch die Zellen schlie en lie Ebenso konnte kein klarer Zusammenhang des Zellwachstums mit der extra zellul ren Glutamin oder der Glutamatkonzentration nachgewiesen werden Im Verlauf der Glutamatkonzentration war zu erkennen dass ein Verbrauch von Glutamat nur dann stattfand wenn Glucose in dem Medium vorhanden war Ein deutlicher Verbrauch von Glutamat setzte allerdings erst ein als die Glucose gro teils verbraucht war Eine Erkl rung auf Grundlage des bekannten Stoffwechsels kann allerdings nicht gegeben werden Einen weiteren interessanten Aspekt deutete der Konzentrationsverlauf von Ammonium an Nicht nur die Medien in welchen Glutamin vorlag zeigten eine signifikante Ausscheidung von Ammonium Auch in dem Medium mit Pyruvat in welchem kein Glutamin enthalten war und kein Verbrauch von Glutamat gemessen wurde war die finale Konzentration von Ammonium bei etwa 1 5 mM Dies deutete ganz klar an dass signifikante Mengen weiterer Aminos uren abgebaut worden sein m ssen Der Verlauf der extrazellul ren Py
320. in EpiSerf Dies deutet darauf hin dass die Konzentrationen von G6P und F6P gegen Ende der Kultivierungen nicht von der extrazellul ren Glucosekonzentration beeinflusst war w hrend dies bei F16bP der Fall zu sein schien F r 3PG wurde in den ersten 100 h ein nahezu identisches Verhalten f r beide Medien gemessen aber in der verbleibenden Zeit der Kultivierung sank die Konzentration von 3PG in Episerf deutlich unter die von GMEM Z Dies k nnte einen Zusammenhang mit dem Konzentrationsverlauf von F16bP andeuten Der Verlauf von PEP zeigte deutliche Unterschiede f r die beiden Medien Bei etwa 60 70 h trat f r beide Medien ein Maximum der Konzentration auf wobei dieses Maximum f r die Kultur in EpiSerf erheblich deutlicher ausgepr gt war Der Zeitraum entspricht relativ genau der Phase der Kultur in welcher die Konzentration von F16bP sein Minimum erreichte Somit kommt an dieser Stelle eine metabolische Regulation in Frage Die Aktivierung der Pyruvat Kinase durch F16bP k nnte zu diesem Zeitpunkt weggefallen sein was zu einer Akkumulation von PEP gef hrt haben k nnte Die Tatsache dass in GMEM Z keine solch niedrigen Konzentrationen f r F16bP wie in EpiSerf erreicht wurden und dem entsprechend auch die Akkumulation von PEP nicht so drastisch ausfiel unterstreicht diese Hypothese Erhebliche Unterschiede in den Konzentrationsverl ufen in Abh ngigkeit vom Medium zeigten sich f r Pyruvat Grunds tzlich kann Pyruvat eine ganze Rei
321. in so bedingter Abfall stattgefunden haben Die gezeigten Konzentrationsverl ufe f r organische S uren konnten ganz klar nach dem Serumgehalt gruppiert werden Die drei Medien denen Serum zugesetzt wurde wiesen sehr hnliche Verl ufe auf und es konnten keine deutlichen Unterschiede in Abh ngigkeit von der Supplementierung mit Glucose oder Glutamin erkannt werden Grunds tzlich erscheint es unwahr scheinlich dass Glucose und Glutamin keinen Einfluss auf diese intrazellul ren Metabolitkonzen trationen hatten Allerdings k nnte es der Fall sein dass die geringen durch Serum eingetragenen Konzentrationen von Glucose ca 0 5 mM und Glutamin ca 0 05 mM bereits ausreichten um einen vergleichbaren Konzentrationsverlauf der intrazellul ren organischen S uren wie f r die entsprechend supplementierten Medien zu erzeugen Die Konzentrationsverl ufe von DMEM ohne Zugabe von Serum unterschieden sich deutlich Der erheblich langsamere Anstieg von Citrat verglichen mit den serumhaltigen Medien war m glicherweise auf den Mangel an entweder Glucose oder Glutamin zur ckzuf hren Das Gleiche traf sicherlich f r die Konzentrationen von Malat zu Eine Erkl rung f r die Tatsache dass a Ketoglutarat kurz nach Zugabe des Mediums in DMEM ohne Supplemente ber den Konzentrationen lag die in den serumhaltigen Medien gemessen wurde kann nicht gegeben werden Die Konzentrations nderungen f r ATP waren relativ gering Da sich in diesem Wert auch deut
322. iner Elektrospray Ionisierung ESI 189 1921 Es kamen Reversed Phase S ulen 7 12319 Nucleodex OH S ulen 16 19 191 und auch HILIC Chromatographie zum Einsatz DI Auch AAC gekoppelt MS Detektoren wurde genutzt 183 200201 Ein grunds tzliches Problem welches bei der Quantifizierung mit Hilfe eines ESI MS Detektors auftritt ist die Ionensuppression die direkt verbunden ist mit einer nicht linearen Antwort des Detektors auf die Menge der Analyten Dies bedeutet dass typischerweise die Methode ESI MS den Nachteil einer schlechten Quantifizierung 120320 in sich birgt Unabh ngig davon ist h ufig die MS Detektion bei sehr komplexen Proben die einzige M glichkeit selektiv einzelne Metaboliten zu detektieren Wie in diesem Abschnitt beschrieben existieren zwar zahlreiche chromatographische Methoden die eine Quantifizierung von intrazellul ren Metaboliten erm glichen jedoch bergen alle Methoden diverse Nachteile bzw sind nur beschr nkt einsetzbar Insbesondere die speziellen experimentellen Voraussetzungen sind bei der Auswahl einer Methode zu ber cksichtigen und diesbez glich spielt die Probenvorbereitung eine gro e Rolle 3 4 Probenvorbereitung zur Messung intrazellul rer Metaboliten Zur Untersuchung von intrazellul ren Stoffwechselproduktkonzentrationen bieten sich wie oben erw hnt diverse M glichkeiten Generell muss man zwischen invasiven und nicht invasiven Methoden differenzieren W hrend z B NMR Method
323. ings typischerweise niedrig und der Fluss gering 22 27 Auch f r krebsartige Zellen scheint die Aktivit t der Pyruvat Dehydrogenase vermindert zu sein 2 7 Mitochondriales Acetyl CoA kann ber den Krebszyklus vollst ndig oxidiert werden und tr gt so f r viele Lebewesen essentiell zur Energiegewinnung bei Der Krebszyklus liefert au erdem eine ganze Reihe von wichtigen Vorl ufermetaboliten f r unterschiedliche Synthesereaktionen Im ersten Schritt des Krebszyklus wird die Acetyl Gruppe mit Oxalacetat durch die Citrat Synthase EC 4 1 3 7 verkn pft wobei das Gleichgewicht dieser Reaktion klar auf der Seite von Citrat liegt Inhibiert wird dieses Enzym unter anderem durch ATP NADH Acetyl CoA und Citrat F r verschiedene kontinuierliche Zelllinien konnte eine deutliche Aktivit t dieses Enzyms nach gewiesen werden 58 59 72 Anschlie end wird Citrat reversibel durch die Aconitase EC 4 2 1 3 zuerst in cis Aconitat und danach in Isocitrat umgesetzt Im n chsten Schritt des Krebszyklus wird Isocitrat durch das Enzym Isocitrat Dehydrogenase EC 1 1 1 41 oxidativ decarboxyliert wobei a Ketoglutarat entsteht Diese Reaktion ist durch ATP und NADH inhibiert und durch ADP allosterisch aktiviert Eine zweite oxidative Decarboxylierung folgt In dieser durch die a Ketoglutarat Dehydrogenase EC 1 2 4 2 katalysierten Reaktion wird a Ketoglutarat zu Succinyl CoA umgesetzt Auch diese Reaktion ist stark reguliert Succinyl CoA und NADH hemm
324. ird der Suppressor auf 0 mA gestellt die Pumpe gestoppt die UV Lampe ausgeschalten und das Restvolumen in der Flasche verworfen Anschlie end die Flasche mit 200 ml gesp lt 200 ml rein Flasche horizontal halten stark schwenken ausgie en Dies soll m gliche mikrobielle Verunreinigungen vermeiden bzw auswaschen Anschlie end wird die wei e Fritte am Schlauchende durch eine neue ersetzt und die Flasche mit filtriertem wieder bef llt Anschlie end wird bei laufender Pumpe mit der 50 ml Spritze zweimal ein Volumen von ca 50 ml aus dem Pumpenkopf gezogen Priming e F r den Fall dass der MS Detektor nicht in Betrieb ist wird die Anlage im Rezirkulationsmodus betrieben D h der Eluent flie t nachdem den Leitfahigkeitsdetektor und den UV Detektor passiert hat durch die Regenerationskammer des Suppressors 1 1 S ulen e Im Routinebetrieb wurden die Chromatographies ulen Vors ule Trenns ule 1 Trenns ule 2 nach etwa sechs Monaten ausgetauscht Typischerweise war nach dieser Zeit das Trennverhalten der S ule verschlechtert was sich insbesondere bei den Peakpaaren Succinat Malat und Citrat UDP GlcNAc niedergeschlagen hat Diese Substanzen waren somit schlechter zu trennen F r den Fall der Nutzung der Anlage zur Messung von Pyruvat spielt diese verschlechterte Trennung keine Rolle Da Pyruvat nie im Routinebetrieb gemessen wurde kann bez glich der Nutzungsdauer keine Empfehlung gegeben werden Beim
325. is etwa min keine gro en Schwankungen f r die unterschiedlichen Experimente zeigte waren im weiteren Verlauf gro e Diskrepanzen zu erkennen Ursache hierf r waren nicht die Konzentrationsschwankungen in diesem Zeitraum sondern deutlich unterschiedliche Startwerte Die gemessenen Konzentrationen im Well bewegten sich ab etwa 1 min in einem Bereich von 0 0 2 uM wobei die Startwerte zwischen 0 3 und 0 7 uM lagen 152 5 Ergebnisse und Diskussion Deshalb f hrte die Normierung auf den Startwert zu einer Spreizung der folgenden Werte der verschiedenen Versuche Als Ursache f r die unterschiedlichen Startwerte ist die nicht identische Kultur zu nennen Wie aus den Kultivierungsexperimenten gut zu erkennen war durchl uft G6P typischerweise gegen Ende der exponentiellen Wachstumsphase einen starken Konzentrationsabfall s Abbildung 5 19 So kann ein Zeitfenster von ca 12h den eben genannten Konzentrations unterschied bedingen Zwar sind auch andere Metaboliten durch den Zustand der Kultur beeinflusst allerdings waren diese Effekte bei diesen Metaboliten weniger stark ausgepr gt weshalb die Normierung auf den Anfangswert f r die meisten anderen gezeigten Konzentrationsverl ufe gut geeignet war Der Konzentrationsabfall der Glykolyseintermediate bis einschlie lich F16bP war ein zu erwarten des Ph nomen Nachdem keine Glucose im berstand vorhanden war erschien es logisch dass die in der Glykolyse folgenden Stoffwechselprodukte nac
326. ist die L sung solch eines Problems eine Transformation oder eine gewichtete Regression 1220 7531 Aus praktischen Gr nden wurde eine gewichtete Regression verwendet Eine direkte Bestimmung der Gewichtungsfaktoren war nicht m glich allerdings war eine deutliche Abh ngigkeit der Standardabweichung von der Konzentration zu erkennen Aus diesem Grund wurde die Annahme getroffen dass die Standardabweichung proportional zur Konzentration ist und es wurde f r die Kalibrierungen einiger Substanzen eine Gewichtung der Form J Konzentration eingef hrt 79 20 Diese Art der Gewichtung war bereits in der Chromatographiesoftware implementiert und konnte so direkt im Routinebetrieb Anwendung finden Eine weitere Modifikation der Kalibrierung war dass eine zus tzliche Standardverd nnung 2 5 uL auf 1000 uL der Kalibrierung hinzugef gt wurde so dass acht Standardkonzentrationen f r jede Kalibrierung genutzt wurden Des Weiteren wurde f r einige Metaboliten die Regressionsgerade durch den Ursprung gezwungen All diese Ma nahmen wurden eingef hrt um f r niedrig konzentrierte Metaboliten eine bessere Quantifizierung zu erreichen Eine Zusammenfassung der im Normalfall genutzten Kalibrierungstypen ist im Anhang in Tabelle A 8 gegeben Eine Diskussion der Kalibrierung ist im Abschnitt 0 gegeben Um eine bessere Beurteilung der Qualit t der Methode zu erhalten wurde eine Absch tzung der Standardabweichung der Messmethode hnlich wie von Thomps
327. it Ultraschall behandelt Der berstand wurde in Probenr hrchen berf hrt und 600 uL CHCl 100 wurden zugegeben AnschlieBend wurden die Proben fiir 30 60s gevortext und danach zentrifugiert Ein Volumen von 1000 uL wurde von der w ssrigen Phase entnommen und eine zweite Extraktion wurde mit der verbleibenden organischen Phase durchgef hrt Dazu wurden 500 uL Methanol zur CHC Phase gegeben danach wurde gevortext und daraufhin wurden 500 uL des Tricine Puffers zugegeben Wieder wurde gevortext danach zentrifugiert Die w ssrige Phase wurde mit der w ssrigen Phase der ersten Extraktion vereint und anschlie end getrocknet MeOH Kochen Extraktion MeOH Kochen Methode J Diese Methode wurde in vorangegangenen Experimenten nicht gezeigt entwickelt und lieferte grunds tzlich gute Ergebnisse Hierf r wurden 1200 uL MeOH 100 4 C auf den Zellrasen pipettiert Daran schloss sich die Ultraschallbehandlung an Anschlie end wurden 800 uL Tricine 44 4 Material und Methoden Puffer 25 mM 4 C zugegeben eine weitere Ultraschallbehandlung folgte Der berstand wurde danach in Probengef e berf hrt und f r 2 min bei 100 C gekocht Hierauf wurden die Proben auf Eis gek hlt zentrifugiert und getrocknet Zelllyse Methode K Diese Methode ist das f r den Lumineszenz Test Perkin Elmer empfohlene Verfahren Ein Volumen von 1000 uL des Zelllysereagenz mit dem Lumineszenz Test geliefert wurde auf den Zellrasen
328. it Literaturwerten abgesehen und auf die Diskussion im Abschnitt 5 3 5 verwiesen Dort werden minimale und maximale zellspezifische Metabolitmengen f r typische Batch Kultivierungen von MDCK und Vero Zellen angegeben Grunds tzlich zeigte sich aber bereits anhand der bei den Extraktionsversuchen gemessenen Werten dass mit der Literatur vergleichbare Metabolitmengen f r kultivierte tierische Zellen bestimmt wurden Der gro e Vorteil der hier durchgef hrten Arbeiten zur Etablierung einer Probenvorbereitung ist sicherlich dass nicht nur Methoden verglichen wurden sondern dass auch eine systematische Charakterisierung bzw Optimierung und zwar anhand von vier Zielgr en stattfand H ufig wurden in der Vergangenheit bei der Auswahl von Probenvorbereitungsmethoden nur verschiedene alternative Verfahren verglichen 115 13 173 176 217 226 230 263 Da die genauen experimentellen Umst nde einen gro en Einfluss auf die Leistungsf higkeit einer Probenvorbereitungsmethode haben k nnen sollte eine Anpassung an exakt die vorliegenden Bedingungen nicht ausbleiben 5 Ergebnisse und Diskussion 95 wenn quantitative Daten erhoben werden sollen Gerade das gezeigte Ph nomen der Nukleotid kinaseaktivit t s 5 2 4 w hrend der Extraktionen deutet an welche Gefahren bei der bertragung von Methoden existieren 5 2 7 5 Bestimmung der Varianz der vollst ndigen Methode Die Pr zision der Messung wurde anhand der mehrfachbestimmten
329. iv konstant Die Verl ufe von ADP CDP AMP und CMP hnelten einander qualitativ sehr Der Anfangswert war tendenziell am h chsten und es folgte ein Konzentrationsabfall bis etwa 70h wonach ein konstantes Konzen trationsniveau gehalten wurde Grunds tzlich lagen die Anfangskonzentrationen dieser Metaboliten f r EpiSerf ber denen von GMEM Z mit Ausnahme von CDP Dem entgegen lagen die Endkon zentrationen f r EpiSerf f r alle diese Metaboliten unter denen von GMEM Z Quantitativ war bei diesen vier Metaboliten ADP mit einer Anfangskonzentration von ca 600 uM am h chsten konzentriert gefolgt von AMP 150 uM CDP 30 uM und CMP 60 uM lagen in einem hnlichen Konzentrationsbereich Sehr deutliche Unterschiede f r die beiden Medien sowohl qualitativ im Verlauf als auch quantitativ zeigten die Metaboliten UDP GlcNAc und UDP Glc Die Konzentration von UDP GlcNAc stieg in GMEM Z von Beginn der Kultivierung bis zu einem Maximum 300 uM bei 60 h an Anschlie end fiel die Konzentration auf etwa 190 uM bis 130 h Danach blieb der Wert nahezu konstant In EpiSerf hingegen fiel die Konzentration von einem Anfangswert von etwa 220 uM innerhalb der ersten 70 h der Kultivierung auf einen Wert von etwa 150 uM ab und blieb bis zum Ende der Kultivierung nahezu konstant Die gemessenen Konzentrationen waren f r die Kultivierungen in GMEM Z in einer schmaleren Bandbreite als f r die Kultivierungen in EpiSerf f r welche z B bei etwa 70 80 h
330. je nach Versuch 100 210 uM zu messen waren Die Konzentration von UDP Glc beschrieb in EpiSerf einen hnlichen Verlauf wie UDP GlcNAc wenn auch ein scheinbar st rker ausgepr gtes Verhalten vorlag Nach etwa 20h bei einer konstanten Konzentration 400 uM sank der Wert bis ca 80 h auf einen Wert von etwa 150 uM Danach schloss sich ein Bereich mit nahezu konstanter Konzentration an Hiervon deutlich abweichend war das Verhalten von UDP Glc in GMEM Z In den ersten 24 h der Kultivierung stieg die Konzentration von etwa 250 uM auf ca 400 uM an Nach diesem Maximum fiel der Wert auf etwa die Anfangskonzentration bis 130 h ab wonach sich ein konstantes Verhalten anschloss Diskussion Ziel dieses Versuchs war den Einfluss des Zellkulturmediums auf die intrazellul ren Metabolitkon zentrationen aufzukl ren Hierbei sollte ein gutes Zellwachstum gew hrleistet sein um f r Bioprozesse relevante Daten zu generieren Zus tzlich sollte der zeitliche Verlauf der Metabolitkon 124 5 Ergebnisse und Diskussion zentrationen aufgenommen werden um das Spektrum der physiologisch normalen Konzentrationen aufzudecken Insbesondere f r einen Vergleich mit Literaturwerten wobei die genauen Kulti vierungszust nde nicht immer vollst ndig nachzuvollziehen sind ist es erforderlich zu wissen in welchem Bereich sich die Metabolitkonzentrationen unter normalen Bedingungen bewegen k nnen Bei Betrachtung der intrazellul r gemessenen Metabolitkonzentr
331. k nnen wurde im weiteren Verlauf der Arbeit eine Zeitspanne von mindestens 30 min nach Beginn der Trypsinierung abgewartet und fr hestens dann die Zellz hlung gestartet Im Verlauf von mehreren Kultivierungen stellte sich heraus dass sich das durchschnittliche Zellvolumen w hrend des Wachstums ver nderte Weiterhin war das Volumen f r Kultivierungen unter vermeintlich gleichen Bedingungen nicht zwingend gleich Die in Abbildung 5 12 B dargestellten Verl ufe der Zelldurchmesser verdeutlichen dieses Ph nomen W hrend f r Kultivierung 1 und 2 der anf ngliche Durchmesser bei etwa 17 um das Maximum etwa bei 20 um und der Endwert bei etwa 16 um lag war f r Kultivierung 3 ein Startwert von ca 14 um das Maximum bei ca 17 um und der Endwert bei 14 um zu finden Die Vorkultur f r Kultivierungen 1 und 2 wurden in T 175 Flaschen durchgef hrt wobei f r Kultivierung 3 eine Rollerflasche genutzt wurde 17 5 217 o J A Kultivierung 1 A 5 ki B AfD o Kultivierung 2 5 AA 5 19 4 A Kultivierung 3 164 o 184 4 o oO D Avg A 174 A E A aA oP 5 A 5 164 Raser 5 154 E 34 5 5 5 le 5 Z KE 5 144 09564 14 13 4 0 30 60 90 0 24 48 72 96 120 Trypsinierungszeit min Kultivierungszeit h Abbildung 5 12 Beispielhafter Verlauf des mittleren Zelldurchmessers von MDCK Zellen nach Beginn der Trypsinierung A und w hrend der Kultivierung in Sechs Well
332. k rzt um sicher zu gehen dass diesbez glich keine Fehler unterlaufen F r l ngere Kultivierungen wurden die ermittelten Meta bolitkonzentrationen pro Well wie oben beschrieben durch das Gesamtzellvolumen pro Well subtrahiert um Metabolitkonzentrationen zu erhalten Allerdings wurden bei dem beschriebenen Verfahren zur Ermittlung des Gesamtzellvolumens einige Annahmen getroffen Die Zellzahl wurde durch Trypsinierung der Zellen und anschlie ender Z hlung mithilfe des Ger tes ViCell XR bestimmt Insbesondere bei der Trypsinierung stellt sich die ob alle Zellen abgel st wurden Hier 5 Ergebnisse und Diskussion 97 scheint das Alter der Kultur das Medium und vor allem die Zelllinie eine gro e Rolle zu spielen Eine weitere Diskussion zur Zellzahlbestimmung und der Absch tzung des Zellzahlverlaufs in Sechs Well Platten ist unter Punkt 5 3 2 2 gegeben Als erheblich problematischer als die Zellzahl bestimmung stellte sich die Zellvolumenbestimmung heraus Der Effekt der Volumen nderung nach Beginn der Trypsinierung s Abbildung 5 12 A wurde vereinheitlicht indem eine minimale Wartezeit von 30 min nach Beginn der Trypsinierung eingef hrt wurde Allerdings konnte die Frage nicht gekl rt werden welches Volumen dem tats chlichen Volumen im adh renten Zustand entspricht F r den Fall dass das maximal erreichte Volumen ca 10 min nach Beginn der Trypsinierung s Abbildung 5 12 A dem tats chlichen Volumen entspricht w rde ein erhebl
333. kann Chromeleon Symbol rechts gestartet werden f r den Fall dass Chromeleon vor XCalibur gestartet wird wird automatisch das Tune Men f r XCalibur gestartet da der die Chromeleon Serverkonfiguration dies so festlegt e Anschlie end kann das Chromeleon Panel DX320_ms pan unter in der Datenbank PC478_local im Ordner Panels_with_AXP MS gestartet werden e Die Zwischenverbindungen ausbauen und die S ule und Vors ulen einbauen Flussrichtung beachten e Der Suppressor mit den entsprechenden Kapillaren verbinden Flussrichtung und Anschl sse beachten e Milli Q Wasser in der Eluentenflasche ersetzten Vorher die Flasche mindestens 6x sp len Empfehlung da auf diese Weise keine negativen Erfahrungen gemacht wurden e Milli Q Wasser f r Regeneration ersetzen 6x die Flasche sp len MeOH H20 ersetzen e Autosampler Pumpe und Detektoren Vakuumvorpumpe f r MS nacheinander einschalten Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 Aufbau des Panels Juli 2008 K lle P Kontrolle onirolle Pumpe Suppressor Anzeige Kontrolle UV Pumpendruck Detektor Kontrolle Kontrolle ECD Autosampler Audit Trail Was passiert Tome sine zum Aktuelles Kontrolle Kontrolle Chromatogramm Aktuelles Cone Wash Eluentengenerators ECD UV Massenspektrum Pumpe Anzeige des Anzeige des Kon
334. kfl che zur Quantifizierung benutzt Zur Beurteilung ob die Varianz im Messbereich homogen war wurde ein F Test P 99 f r die Varianzen des oberen und unteren Konzentrationsbereich durch gef hrt Im Falle einer nicht homogenen Varianz wurde eine gewichtete Kalibrierung genutzt Um 5 Ergebnisse und Diskussion 55 zu entscheiden ob eine lineare oder quadratischen Regression genutzt werden sollte wurde der Test nach Mandel P 99 angewendet F r den Fall dass eine gewichtete Kalibrierung bei quadratischer Regression n tig gewesen w re wurde der Messbereich eingeengt um komplexe Matrizenberechungen zu vermeiden Das Detektionslimit 3 3 x Standardfehler der Steigung war f r die meisten Substanzen unterhalb des mikromolaren Bereichs Das niedrigste Detektionslimit wurde f r AMP 0 014 uM erreicht Das Bestimmtheitsma R war f r die meisten Substanzen gr er als 0 99 was eine gute Anpassung durch die Regression andeutet 5 1 1 3 Effekte des pH Wertes auf die Quantifizierung der Metaboliten Da je nach Probenvorbereitung unterschiedliche pH Werte in den Proben vorherrschen war eine Untersuchung des Einflusses auf die Stabilit t der Metaboliten in Abh ngigkeit vom pH Wert erforderlich Es wurden Verd nnungen des Standards sowohl in Wasser als auch in PBS erstellt und wiederholte Messungen der Proben durchgef hrt Dabei wurde ein pH Bereich von 2 12 untersucht Hierbei konnte weder in Wasser noch in PBS eine signifika
335. konnte diese Umsetzung von ATP zu ADP und AMP aber vermieden werden F r den in Abbildung 5 11 gezeigten Extraktionsprozess wurden somit gute Wiederfindungswerte erreicht Die Werte f r Nukleosiddiphosphate waren nahe 100 wobei Monophosphate Werte leicht ber 100 erreichten Dies k nnte sich auf eine chemische Zersetzung zur ckf hren lassen Zur berpr fung der neuen modifizierten Methode wurde diese mit den beiden unter 5 2 2 2 optimierten Methoden in einer parallelen Extraktion von identisch kultivierten Sechs Well Platten verglichen Die rechte Spalte f r MDCK Zellen in Tabelle 5 4 fasst die Ergebnisse der neuen modifizierten Methode zusammen Die im selben Experiment parallel ermittelten Ergebnisse der beiden unter 5 2 2 2 optimierten Methoden sind nicht gezeigt da diese Ergebnisse den Werten der beiden linken Spalten aus Tabelle 5 4 nahezu vollst ndig entsprachen Der Vergleich der absoluten Werte f r MDCK Zellen zwischen den beiden unter 5 2 2 2 optimierten Methoden und der neuen modifizierten Methode zeigte nur minimale Unterschiede Dabei sind f r die neue modifizierte Methode die Werte f r die Monophosphate h her und Diphosphate niedriger was auch den besseren Werten f r die Wiederfindungen entspricht Die Berechnung von K ATP x AMP ADP lieferte einen Wert von K 2 5 2 5 Bestimmung der Varianz der Methode In Abschnitt 5 1 1 2 wurde eine Validierung fiir die Chromatographiemethode beschrieben Zur Verbesse
336. ksichtigen dass auch Metaboliten welche nur einen geringen Konzentrationsabfall welcher m glicherweise auch nicht signifikant ist einen hohen Korrelations koeffizienten zu Metaboliten mit einem deutlichen Konzentrationsabfall aufwiesen Dies soll noch 154 5 Ergebnisse und Diskussion einmal betonen dass die Kreuzkorrelationsanalyse rein qualitativ ist und sehr wahrscheinlich einige Korrelationen ohne einen direkten metabolischen Zusammenhang auftraten Dennoch eignet sich die Korrelationsmatrix sehr gut einen schnellen berblick ber die verschie denen Konzentrationsverl ufe zu erhalten und wenn ein gleichartiges Verhalten durch eine gemein same Regulation f r zwei Variablen besteht ist dies auch in der Korrelationsmatrix zu erkennen Ein genereller Vergleich dieser Versuche mit der Literatur war nicht m glich da keine Publikationen mit Experimenten unter hnlichen Bedingungen gefunden werden konnten 5 3 4 2 Zugabe von Medium nach Limitation Nachdem im vorangegangenen Abschnitt das Verhalten der Konzentrationen nach dem Entfernen der Substrate aus dem berstand untersucht worden war war es bei diesem Experiment das Ziel die Auswirkungen der Substratzugabe auf die Metabolitkonzentrationen nach einer Limitation zu erfassen Dazu wurden Zellen in Sechs Well Platten bis in die sp te exponentielle Wachstumsphase kultiviert Anschlie end wurde das Medium durch PBS ersetzt Nach zwei Stunden in PBS wurde die erste Probe
337. lefax 02407 95 96 9 Internet www shaker de E Mail info shaker de Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen meiner T tigkeiten in der Arbeitsgruppe Bioprozess technik am Max Planck Institut f r Dynamik komplexer technischer Systeme in Magdeburg in der Zeit von Dezember 2003 bis April 2009 angefertigt Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof Dr Ing Udo Reichl der mir die M glichkeit geboten hat unter au erordentlich guten Bedingungen diese Arbeiten durchzuf hren sowie f r die anregen den fachlichen Diskussionen und den thematischen Freiraum Herrn Prof Dr Thomas Noll danke ich sehr f r die bernahme des Koreferats und sein Interesse an der Arbeit Weiterhin bedanke ich mich ganz herzlich bei Frau Dr Yvonne Genzel f r die Betreuung der Arbeit die generelle Unterst tzung und insbesondere die konzeptionelle und fachliche Hilfe stellung Dr Aljoscha Wahl danke ich ganz besonders f r die interessanten und aufschlussreichen Diskussionen zum Stoffwechsel f r die gro e Hilfe im Zusammenhang mit der Korrelationsanalyse wie auch f r die sehr gute Zusammenarbeit bei gemeinsamen Experimenten Gro er Dank geht an Susanne K nig Claudia Best Ilona Behrendt Felicitas Hasewinkel und Liane Geisler f r die stete Unterst tzung in allen praktischen Belangen Weiterhin m chte ich mich bei Frau Katja Hermann und Frau Christina Kr mer bedanken die durch ihre Experimente wichtige Fragen zu Nebenaspek
338. legt zumal Lactat normalerweise mit einem Bioanalyseger t z B YSI 7100 MBS Yellow Springs Instruments oder Bioprofile Nova Biomedical quantifiziert wird Durch die entsprechende Anpassung des Gradienten programms konnte die Messdauer um einige Minuten reduziert werden Falls allerdings Pyruvat gemessen werden soll bietet sich der von Genzel et al 2005 beschriebene Gradient an en 5 1 1 2 Validierung der Chromatographiemethode Zur Absch tzung der Qualit t der Chromatographiemethode wurde eine Validierung mit Standards in Wasser durchgef hrt Die Ergebnisse sind in Tabelle A6 im Anhang zusammengefasst Es wurden sieben quidistante Verd nnungsstufen zur Kalibrierung gew hlt Von jeder Konzentration wurden jeweils acht unabh ngig verd nnte L sungen in zuf lliger Reihenfolge gemessen Wie bereits oben erw hnt konnten viele der zu messenden Substanzen nur entweder mit dem einen oder dem anderen Detektor gemessen werden Manche Metaboliten jedoch konnten theoretisch in beiden Messkan len detektiert werden Welcher der beiden Kan le bei diesen Metaboliten zum Einsatz kam wurde durch Begutachtung der Homogenit t der Varianzen und der Werte f r das Bestimmt heitsma R entschieden Auch um eine Entscheidung zu treffen ob eine Kalibrierung durch Quantifizierung ber die Peakfl che oder Peakh he erfolgen soll wurden diese Qualit tskriterien herangezogen Bei gleichwertigen Ergebnissen wurde bevorzugt der UV Kanal und die Pea
339. lich die Zellzahlen widerspiegeln k nnten die aufgetre tenen Schwankungen auch von nicht identischen Zellzahlen der verschiedenen Sechs Well Platten herr hren Der deutliche Unterschied f r DMEM verglichen mit den anderen Medien k nnte wahr scheinlich auf die fehlenden N hrstoffe zur ckzuf hren sein ber die Signifikanz der niedrigeren Konzentrationen von ATP f r das glucosehaltige Medium verglichen mit den beiden ebenfalls serumhaltigen Medien kann keine Aussage getroffen werden Dennoch wurde auch bei dem vorangehenden Versuch der Mediumzugabe ein leichter Abfall der ATP Konzentration gemessen 166 5 Ergebnisse und Diskussion s Abbildung 5 32 Auch der Konzentrationsverlauf von UDP GlcNAc war f r die vier verschiedenen Medien relativ hnlich Alleine in DMEM ohne Supplemente lag scheinbar die Konzentration unterhalb der Konzentrationen in den anderen Medien Neben den bereits oben erw hnten bekannten Inhaltsstoffen von K lberserum sind darin noch zahlreiche nicht n her in ihrer Wirkung bekannte Molek le enthalten Auch dadurch k nnten Unterschiede im Stoffwechsel ausgel st worden sein Die Energy Charge wirft vor allem die Frage auf weshalb sich die Verl ufe bei Kultivierung in DMEM ohne Supplemente und DMEM mit Glucose und Serum bzw bei den anderen beiden Medien derart hneln Wie bereits f r das Experiment bei welchem GMEM Z nach der Limitationsperiode zugegeben wurde fiel f r das glucosehaltige Medium die Energ
340. linien gegen Ende der Kultivierungen die Konzentration auf ein relativ niedriges Niveau ab W hrend bei MDCK Zellen eine gewisse zeitliche bereinstimmung mit dem Verbrauch von Glutamin vorzuliegen schien konnte diese Koinzidenz bei Vero Zellen nicht beobachtet werden Mit Ausnahme von glucosehaltigem Medium war ebenso wie bei MDCK Zellen die intrazellul re ATP Konzentration f r die Medien relativ konstant Der bei MDCK Zellen auftretende leichte Konzentrationsabfall gegen Ende der Kultivierung Konnte aber f r Vero Zellen nicht nachgewiesen werden Die starken Schwankungen in der ATP Konzentration f r das Glucose Medium bei Vero Zellen waren f r MDCK Zellen nicht zu finden und eine Erkl rung basierend auf diesen Experimenten kann nicht abgegeben werden Die Energy Charge war bei Vero Zellen im Medium mit Glucose und Glutamin fast ber den gesamten Kultivierungsverlauf h her als f r die anderen Medien Eventuell besteht bei Vero Zellen ein Zusammenhang zwischen einem hohen Wert der Energy Charge und einem guten Zellwachstum denn die anderen Medien resultierten in deutlich niedrigeren Zellzahlen Der auff llige Einbruch der Energy Charge in den Zellen in glucose haltigem Medium gegen Ende der Kultivierung k nnte darauf zur ckzuf hren sein dass weitere Substrate neben Glucose wie z B Aminos uren verbraucht waren Burgener et al untersuchten die Auswirkungen von verschiedenen Medien auf die intrazellul ren Nukleotidkonzentrationen 25
341. liten aus dem Zentralstoffwechsel sollte mit der vorliegenden Arbeit ein Beitrag zum besseren Verst ndnis des Stoffwechsels von kultivierten Zellen geleistet werden Hierf r war es allerdings zuerst erforderlich eine verl ssliche analytische Methode zur Quantifizierung von intrazellul ren Metaboliten zu entwickeln Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurde eine Anionen Austausch Chromatographiemethode zur Trennung und Detektion von organischen S uren Zuckerphosphaten und Nukleotiden etabliert Das Hauptaugenmerk dieser Methode lag hierbei auf einer hohen chromatographischen Aufl sung einer robusten Quantifizierbarkeit und einer anwenderfreundlichen Bedienbarkeit Die Nutzung eines elektrolytischen On Line Eluentengenerators zweier serieller analytischer S ulen und zweier Detektoren Leitf higkeit und UV erm glichte eine hoch reproduzierbare Quantifizierung von ber 25 Zwischenprodukten des Zentralstoffwechsels von S ugerzellen in einer Messung Die komplexe metabolische Zusammensetzung der Proben erforderte jedoch eine bessere Aufl sung der Chromatogramme Diese Anforderung konnte durch die Kopplung eines Massen Detektors an die bestehende Chromatographieanlage erf llt werden Durch die Nutzung dieses Detektors konnten zus tzlich die bereits zugeordneten Chromatographiepeaks in ihrer Identit t anhand des jeweiligen charakteristischen Masse Ladung Verh ltnisses best tigt werden Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde basierend auf
342. liten kann nicht durch ein verz gertes Einstellen des Gleichgewichts durch die enzymatische Reaktion erkl rt werden Das bedeutet dass man in zeitlich verschobenen Verl ufen nicht das aufeinander folgende Abbauen eines Substrates erkennen kann Vielmehr muss hier eine Regulation auf Ebene der Proteinaktivit t Translation oder Transkription erfolgen und es bestehen zu unterschiedlichen Zeitpunkten verschiedene Gleichgewichte zwischen den Stoff wechselprodukten In den Korrelationsmatrizen konnte zwar ein gleichartiges Verhalten von Metabolitkonzentrationen identifizieren werden aber die konkreten Verl ufe und Konzentrationen sind bei dieser Form der Darstellung nicht auszumachen Aus diesem Grund wird im folgenden Abschnitt der Vergleich Kultivierungen in zwei verschiedenen Zellkulturmedien in detaillierterer Form inklusive der einzelnen zeitlichen Verl ufe beschrieben 5 3 2 2 Kultivierung in GMEM Z bzw EpiSerf Medium Die Gruppierung der Verl ufe einiger Metaboliten war durch die vorangegangenen Korrelations analysen bereits m glich Allerdings ist aus den Korrelationsmatrizen keine Information ber die tats chlichen zeitlichen Verl ufe und die Konzentrationen zu gewinnen Aus diesem Grund erfolgt hier eine detaillierte Beschreibung der Kultivierungen in den Medien GMEM Z serumhaltig und EpiSerf serumfrei Diese beiden Medien unterschieden sich aber nicht nur im Serumgehalt sondern auch in einer ganzen Reihe von Inhaltsstoffen
343. liten sich unterschiedlich verhielten Wie schon oben beschrieben schien Pyruvat ein Metabolit zu sein der sich an einer regulatorischen Schl sselstelle befindet Erhebliche Unterschiede im Korrelationsverhalten traten f r diesen Metabolit auf M gliche Erkl rungen f r dieses unterschiedliche Verhalten sind oben S 125 gegeben Auch f r ATP PEP a Ketoglutarat GDP GTP UDP GlcNAc und UDP GalNAc lag ein unterschiedliches Korrelationsverhalten f r die beiden Medien vor Bis auf GDP und UDP GalNAc sind die einzelnen Konzentrationsverl ufe f r diese Metaboliten gezeigt Abbildung 5 19 und Abbildung 5 20 Das Verhalten der Konzentration von UDP GalNAc war direkt korreliert mit UDP GlcNAc Wie in Abbildung 5 15 zu sehen war dies f r den Gro teil der Versuche der Fall M gliche Gr nde f r das vom Medium abh ngige Konzentrationsverhalten der UDP aktivierten Aminohexosen sind auf Seite 127 gegeben Der Verlauf der Konzentration von GDP zeigte nicht nur in den Versuchen mit GMEM Z und EpiSerf niedrige Korrelationskoeffizienten Abbildung 5 21 und Abbildung 5 22 sondern auch im Mittel f r alle Kultivierungen mit MDCK Zellen war das Konzentrationsverhalten von GDP nur schwach mit anderen Variablen korreliert Abbildung 5 16 Charakteristisch f r den Verlauf von GDP war unabh ngig vom Medium dass der anf ngliche Konzentrationsabfall in 134 5 Ergebnisse und Diskussion deutlich k rzerer Zeit ca 30 h ausfiel als f r die weiteren
344. ll mit Flachboden Pipettenspitzen 10 uL 100 uL 200 uL 1 mL 5 mL Pipettenspitzen 2 mL 5 mL 10 mL 25 mL 50 mL Reaktionsgef e 500 uL 1800 uL 2200 uL Rollerflaschen Sterilfilter 0 22 T Flaschen Cellstar T25 T75 T175 Perkin Elmer Dionex Dionex Dionex Dionex B Braun Dionex Greiner bio one Greiner bio one Greiner bio one Eppendorf Greiner bio one Greiner bio one Greiner bio one Sartorius BBI Greiner bio one Anhang Tabelle A 3 Liste der genutzten Chemikalien Chemikalie 2PG 3PG Acetat Acetoacetat Acetonitril Acetyl CoA ADP Ameisens ure AMP Aspartat ATP Calciumchlorid Dihydrat cAMP CDP Chloroform cis Aconitat Citrat CMP dATP dCTP dGTP DHAP Di Natriumhydrogenphosphat DMEM ohne Glutamin ohne Glucose dTTP E4P EpiSerf Essigs ure Ethanol F M V Pepton FIP F6P FAD FCS Formiat F16bP Fumarat G6P GAP GDP Glucose Glutamat GMEM GMP GTP Hydroxybutyrat Isocitrat Isopropanol Kaliumchlorid Kaliumdihydrogenphosphat Lactat Glutamin Malat Methanol NAD NADH NADP NADPH Natriumchlorid Natriumhydrogencarbonat Natriumhydroxid Natriumnitrat Hersteller Sigma Al Sigma Al Fluka Sigma Al Roth Fluka Sigma Al Merck Sigma Al Sigma Al Sigma Al Merck Sigma Al Sigma Al Roth Sigma Al Sigma Al Sigma Al Sigma Al Sigma Al Sigma Al Sigma Al Sigma Al Merck PAA Laboratories GmbH Sigma Al S
345. llen konnten je nach Verf gbarkeit von Glucose unterschiedliche Verbrauchsraten f r Glutamin nachgewiesen werden Dem entgegen wurde in Medien ohne Glutamin aber mit Pyruvat eine deutlich verminderte Glucoseaufnahmegeschwindigkeit gezeigt P Somit sind die in der hier vorliegenden Arbeit gezeigten ver nderten Aufnahmeraten f r Glucose bzw Glutamin in Abh ngigkeit von der Verf gbarkeit der Substrate durch die Literatur best tigt Bei Betrachtung der intrazellul ren Konzentrationsverl ufe konnten f r einige Metaboliten ganz deutliche Unterschiede erkannt werden Die Glucosekonzentration im Medium wirkte sich erheblich auf die intrazellul re Fl6bP Konzentration aus Aufgrund des linearen Aufbaus der 140 5 Ergebnisse und Diskussion Glykolyse war diese Beobachtung zu erwarten Interessanterweise konnten auch in den beiden Medien ohne Glucose signifikante Mengen von 1 nachgewiesen werden Grund hierf r war h chstwahrscheinlich die durch das Serum eingebrachte Glucose welche zu Beginn des Experiments abgebaut wurde Die Tatsache dass deutliche Mengen an F16bP in den Medien ohne zus tzliche Zugabe von Glucose nachgewiesen wurden k nnte ein Indiz f r die sehr effiziente Aufnahme der Glucose sein Ein weiterer Grund f r die signifikanten Mengen an F16bP in den Medien ohne Glucosezugabe k nnte eine Aktivit t der Enzyme der Gluconeogenese sein Aufgrund der bekannten Aktivit t dieses Stoffwechselweges in Nierengewe
346. lots meistens die Methode der Varianzanalyse ANOVA Analysis of Variance Varianzanalyse ein Durch diese Methode wird getestet ob die Mittelwerte von verschiedenen Verfahren bzw experimentellen Einstellungen signifikant unterschiedlich sind Voraussetzungen hierf r sind dass die Stichprobenvariablen normalverteilt sind und die Varianz homogen ist Im Grunde wird bei diesem Vorgehen die Gesamtschwankung der Daten in einzelne Komponenten zerlegt Gesamt FOScruppe FOS Fenter 3 4 FOScesam steht hier f r den Wert der Quadratsumme der Abweichungen Fehlerquadratsumme der einzelnen Proben vom Gesamtmittelwert des Versuchs FOSgruppe steht f r die Quadratsumme der Abweichungen der Gruppenmittelwerte vom Gesamtmittelwert und FQSrenier steht f r die Quadratsumme der Abweichungen der einzelnen Messungen einer Gruppe vom Gruppenmittelwert Im einfachsten Falle soll entschieden werden ob unterschiedliche Einstellungen eines Faktors 30 3 Theoretische Grundlagen unterschiedliche Gruppen gleiche oder unterschiedliche Ergebnisse bewirken Somit wird untersucht ob die Varianz zwischen den verschiedenen Einstellungen gr er ist als die Varianz innerhalb ein und derselben Einstellung Die Signifikanz wird anhand der F Verteilung berpr ft Eine Tabelle f r eine ANOVA sieht typischerweise wie folgt aus Tabelle 3 1 Exemplarische Tabelle f r die Varianzanalyse ANOVA f r einen Versuch mit einem fixen kontrollierten Faktor F
347. lovic N 1999 An integrated amperometry waveform for the direct sensitive detection of amino acids and amino sugars following anion exchange chromatography Analytical Chemistry 71 14 2774 2781 168 Strong DL Dasgupta PK 1989 Electrodialytic Membrane Suppressor for Ion Chromatography Analytical Chemistry 61 9 939 945 169 Strong DL Dasgupta PK Friedman K Stillian JR 1991 Electrodialytic eluent production and gradient generation in ion chromatography Analytical Chemistry 63 5 480 486 170 Krstulovic AM 1987 Handbook of Chromatography Nucleic Acids and Related Compounds Zweig G Sherma J editors Boca Raton FL CRC Press 190 p 171 Cordell RL Hill SJ Ortori CA Barrett DA 2008 Quantitative profiling of nucleotides and related phosphate containing metabolites in cultured mammalian cells by liquid chromatography tandem electrospray mass spectrometry Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 871 1 115 124 172 Decosterd LA Cottin E Chen X Lejeune F Mirimanoff RO Biollaz J Coucke PA 1999 Simultaneous determination of deoxyribonucleoside in the presence of ribonucleoside triphosphates in human carcinoma cells by high performance liquid chromatography Analytical Biochemistry 270 1 59 68 173 Gebelein M Merdes G Berger MR 1992 Nucleotide preparation from cells and determination of nucleotides by ion pair high performance liquid chromatography Journal of Chromatography
348. lte horizontale Linien Die unterschiedlichen Faktoren und in der letzten Spalte die einzelnen Desirabilities sind auf der Abszisse aufgetragen Hierbei stellen die Werte die m glichen Niveaus der Faktoren dar und die gestrichelten vertikalen Linien den optimalen Wert des jeweiligen Faktors Die wei unterlegten Diagramme zeigen die von den Modellen vorhergesagten Einfl sse der jeweiligen Faktoren auf die einzelnen Zielgr en Die Diagramme in der letzten grau unterlegten Spalte zeigen die vom Experimentator gew hlten Funktionen f r die Desirability Die Fehlerbalken entsprechen dem 95 igen Vertrauensbereich ja 4 Tri Von den hier empfohlenen Arbeitspunkten waren aber einige nicht signifikant besser als das alternative Niveau p lt 0 05 Aus diesem Grund wurden fiir eine Entscheidung in diesen Fallen rationale Gesichtspunkte mit in Betracht gezogen Die Behandlung mit Ultraschall zeigte nur 74 5 Ergebnisse und Diskussion minimale nicht signifikante Effekte auf die Zielgr en Aus diesem Grund wurde auf diesen Schritt im Weiteren verzichtet da so ein zus tzlicher Arbeitsschritt vermieden werden konnte Die Temperatur des MeOH zeigte zwar keine signifikanten Verbesserungen 70 C beeinflusste aber die Energy Charge und den F16bP Gehalt positiv und wurde deshalb f r weitere Experimente verwendet Aus den Ergebnissen zum Faktor Puffer konnten keine klaren Aussagen getroffen werden weshalb in sp teren Versuchen eine weiter
349. luierte Dieser Peak erlaubte zumindest eine getrennte Quantifizierung f r UDP Glc Die Optimierung des KOH Gradienten erfolgte in zahlreichen Schritten Mit der Identifikation von weiteren Metaboliten in den Extraktionsproben wurde der Gradient derart ver ndert dass eine m glichst gute Trennung der vorhandenen Peaks erreicht werden konnte ohne die Dauer des Chromatographielaufs unn tig zu verl ngern Der gesamte Vorgang war ausschlie lich empirisch gepr gt und es wurde ein flacher Gradient verwendet wo eine hohe Trennleistung n tig war und ein steiler Gradient wo keine Substanzen eluierten Die Dauer eines Chromatographielaufs konnte durch die ungew hnliche Ma nahme negative Gradienten abnehmende KOH Konzentration zu verwenden um mehrere Minuten verk rzt werden ohne die Trennung zu verschlechtern Nur durch die Verwendung des Eluenten Generators konnten negative Gradienten genutzt werden da dieses Ger t eine sehr schnelle Einstellung des Gradienten erlaubt Abbildung 5 1 zeigt den KOH Gradient der zu Beginn der Arbeit verwendet wurde die dazugeh rigen Chromatogramme f r Leitfahigkeits und UV Kanal und den verbesserten Gradienten und mit entsprechenden Chromatogrammen 5 Ergebnisse und Diskussion 51 Tabelle 5 1 Zusammenfassung der chromatographisch untersuchten Metaboliten Trennung mittels des verbesserten Gradienten s Abbildung 5 1 UV UV Warum nicht im Analyt Retentionszeit SD 220 260 Standard k
350. lwege die Diskriminierung unterschiedlicher Mutanten bzw Ph notypen oder die Untersuchung der in vivo Kinetik von Enzymen oder Stoffwechselwegen war Der Vorteil der Analyse des Metaboloms ist verglichen mit Untersuchungen zum Genom Transkriptom oder Proteom dass diese Messgr en ein Ausdruck s mtlicher biochemischer und molekularbiologischer Ereignisse sind und deshalb ein u erst detailliertes Abbild des physiologischen Gesamtzustandes einer Zelle widerspiegeln Die gro e Schwierigkeit bei diesen Daten stellt sicherlich die Komplexit t dar was sich in einer eingeschr nkten Interpretierbarkeit u ert 3 3 Chromatographische Analyse von intrazellul ren Stoffwechselprodukten Die Quantifizierung von intrazellul ren Metaboliten kann auf unterschiedlichsten Wegen erfolgen Neben chromatographischen Verfahren kommen h ufig auch enzymatische Methoden Kern resonanzspektroskopie NMR Massenspektrometrie MS Kapillarelektrophorese CE Methoden oder eine Kombination dieser Methoden zum Einsatz Verschiedenste Analysemethoden f r intrazellul rer Metaboliten sind im Zusammenhang mit dem Fachgebiet Metabolomics Metabonomics oder Metabolic Profiling angewendet und verbessert worden II 132 142 1461 Eine sehr potente Methode zur Analyse von Metaboliten ist die Gaschromatographie gekoppelt an MS Detektoren Durch die hohe chromatographische Aufl sung der Proben k nnen viele Substanzen getrennt quantifiziert werden Allerdings birgt diese
351. m Grund waren die Schwankungen f r ein Medium durch die gemeinsame Auswertung der drei verschiedenen Versuche h her als sie tats chlich bei einer Kultivierung aufgetreten w ren Zu bemerken ist dass auch f r jeden einzelnen Versuch die maximale spezifische Wachstumsrate f r GMEM Z h her oder gleichhoch wie in EpiSerf war Auswertung nicht gezeigt Somit mochten zwar bei dieser Auswertung im statistischen Sinne keine signifikanten Unterschiede zwischen den maximalen spezifischen Wachstumsraten in den beiden Medien vorgelegen haben dennoch deutete sich eine zumindest geringf gig h here spezifische Wachstumsrate in GMEM Z an Als Grund hierf r kann sicherlich der Zusatz von Serum in diesem Medium vermutet werden Ein interessanter Aspekt ist der unterschiedliche Zeitraum des exponen tiellen Wachstums f r die beiden Variablen Zellzahl und Gesamtzellvolumen Wie bereits im Zusammenhang mit der Kreuzkorrelationsanalyse aus dem vorangegangenen Abschnitt erw hnt ist eine Erkl rung dass der Zellteilung eine Volumenvergr erung der Zellen vorausgeht Aus den Daten ist zu erkennen dass diese bereits nach 6h in betr chtlichem Ma e erfolgt war Dies bedeutet dass die Zunahme der Biomasse deutlich fr her eintrat als die Abbildung 5 18 A erah nen l sst Diese Ergebnisse stimmen mit den Resultaten aus der Literatur f r Hybridoma Zellen gut berein 287289 21 Wie bereits oben erw hnt war diese Information bez glich des das Gesamtzell volu
352. m Kontext der Literatur In der hier vorliegenden Arbeit wurden intrazellul re Metabolitkonzentrationen unter unterschied lichsten Bedingungen gemessen Anhand der Kultivierungen in den Medien GMEM Z und EpiSerf konnten f r Bioprozesse relevante Konzentrationsverl ufe aufgenommen werden und durch die Kultivierungen in DMEM mit selektiven Energiesubstraten wie auch durch die Kurzzeit experimente sollte ein weiteres Auslenken der normalen Metabolitkonzentrationen zu Extrem werten erreicht werden Wie bereits oben erw hnt wurde bei der Optimierung der Methode darauf geachtet dass die ermittelten Metabolitkonzentrationen in bereinstimmung mit Literaturwerten sind Aus diesem Grund waren in Tabelle 5 4 zellspezifische Metabolitmengen angegeben Wie sich allerdings zeigte sind diese Werte stark vom Kultivierungszustand abh ngig So sind z B f r ein Medium ohne Glucose nur sehr geringe Konzentrationen der Hexose Phosphate in MDCK 5 Ergebnisse und Diskussion 167 Zellen zu erwarten Ebenso wurde erhebliche Konzentrations nderungen einiger Metaboliten ber die Dauer einer Batch Kultivierung gemessen Ein Vergleich mit Literaturwerten ist somit nur bedingt aussagekr ftig da die genauen Kultivierungszust nde nur selten angegeben sind und nur in Ausnahmen oder nur f r einzelne Metaboliten zeitliche Verl ufe aufgenommen wurden Ganz besonderen Einfluss auf die gemessenen zellspezifischen Metabolitmengen hat der Zelltyp wie sich bei dem i
353. mens im Hinblick auf die Bestimmung von intrazellul ren Metabolitkonzentrationen wichtig Beim Vergleich der Medien bez glich der maximal erreichten Zellzahlen pro Well wurden signifikant h here Werte f r EpiSerf Medium gemessen s Seite 113 Hierbei basierte die Pr fung auf signifikante Unterschiede auf den Probenahmen ab 94h Dies bedeutet dass eine konstante 5 Ergebnisse und Diskussion 115 Zellzahl und eine Normalverteilung der Zellzahlen ab 94h angenommen wurden Aus Erfahrungswerten f r Kultivierungen in Sechs Well Platten schien diese Annahme gerechtfertigt Eine Erkl rung f r die unterschiedlichen maximalen Zellzahlen kann nicht gegeben werden Grunds tzlich wurde angenommen dass die maximale Zellzahl von der gebotenen Wachstums fl che und der Grundfl che die eine Zelle einnimmt bestimmt wird Noch offensichtlicher ist der Unterschied des Gesamtzellvolumens f r die beiden Medien Da das Volumen nach Trypsinierung und nach Abstoppen der Trypsinierungsreaktion ermittelt wurde und beide Kultivierungsans tze identisch behandelt wurden scheidet die geringf gig unterschiedliche Osmolalit t der beiden Medien als Ursache f r die Volumenunterschiede aus Als m gliche Erkl rung kann eine unter schiedliche Wachstumsgrundfl che der Zellen angegeben werden Dies w rde bedeuten dass die in EpiSerf kultivierten Zellen eine geringere Fl che bei sogar gr erem Gesamtzellvolumen am Ende der Kultivierung einnahmen Ein Grund hi
354. mspunktes bei den skalierten Werten von 1 68 0 und 1 68 sind daraus zu errechnen nicht gezeigt Der Kochvorgang wurde fiir dieses Experiment bei 90 C durchgef hrt um einem berkochen vorzubeugen Da in Folge dieses Experiments keine eindeutigen Schl sse gezogen werden konnten wurde ein zweites Experiment entsprechend eines Central Composite Versuchsplans durchgef hrt dessen Faktorniveaus leicht ver ndert wurden Tabelle 4 4 B F r beide Experimente wurden die Zellen nach dem Entfernen des Zellkultur berstandes einmal mit 4 C PBS gewaschen das MeOH f r die Extraktion hatte eine Temperatur von 70 C und es wurde keine Ultraschall Behandlung angewendet Erkl rungen hierf r werden in Kapitel 5 2 2 1 gegeben 46 4 Material und Methoden MeOH CHO Extraktion Central Composite Versuchsplan F r dieses Experiment wurden die Einflussgr en Volumen MeOH Tricine Konzentration und Volumen CHCl genauer untersucht Die realen Niveaus entsprechend den skalierten Niveaus 1 und 1 sind in Tabelle 4 4 C gegeben Tabelle 4 4 Zusammenfassung der Faktoren und Niveaus Level 1 und 1 f r den Central Composite Versuchsplan zur Optimierung der Methoden MeOH Kochen 1 Experiment A 2 Experiment B und MeOH CHC A MeOH Kochen 1 Experiment Level MeOH Vol uL Tricine Konz mM Kochen min 1 1000 6 2 1 1600 16 6 B MeOH Kochen 2 Experiment Level MeOH Vol uL Tricine Konz mM Kochen min 1 800 6 1
355. mum f hren Energy Charge 0 99 Nukleotidgehalt 0 99 F16bP Gehalt 0 92 Absorption 280 nm 0 88 s Abbildung 5 9 A Da diese Werte als zufriedenstellend angesehen wurden folgte keine weitere Optimierung 76 5 Ergebnisse und Diskussion A B 23 4 Energy Charge KP St energy charge 0 99 transtormiert transformiert 044 084 124 244 Di 0 94 keck Nukleotid 4 33 gehalt i gehalt transtormiert transtormiert o24 oa D gt 124 i 15 4 ir N Fi6dP 0 92 Fi6dP 0 88 Gehalt Gehalt dk 054 i 02 4 i 134 14 Absorp 0 88 H Absorp 0 62 280 nm 280 nm 02 1 i i i 14 Gesamt 0 04 ee eo D Eege Gesamt 075 w nschenswertigkeit w nschenswertigkeit 04 04 1094 30 74 2 652 3 9 8 673 7 W nschens Ke a W nschens Vol MeOH Tricine Konz Kochen ere Vol MeOH TrieineKonz Vol CHCl wertigkeit mM 0 14 a Faktor Abbildung 5 9 Optimierung der Methoden MeOH Kochen A und MeOH CHCI gem des Central Composite Versuchsplans mit Hilfe des Prediction Profiler s a Tabelle 4 4 Bez glich weiterer Erl uterungen sei auf Abbildung 5 8 verwiesen Optimierung der Methode MeOH CHCIs Central Composite Ansatz Der Einfluss der drei Faktoren Volumen MeOH Volumen CHCl und Konzen
356. n Der Ablauf chemischer und biochemischer Reaktionen ist grunds tzlich von der Thermodynamik bestimmt Je nach Reaktionsgleichgewicht und Konzentration der Substrate und Produkte findet tats chlich eine Umsetzung statt oder die R ckreaktion l uft ab Die in Abbildung 3 2 dargestellten Reaktionsrichtungen spiegeln tendenziell das Lehrbuchwissen wider 1 Dies bedeutet dass Reaktionen mit unidirektionalen Pfeilen zum Gro teil in die angezeigte Richtung ablaufen wobei Reaktionen mit einem bidirektionalen Pfeil in beide Richtungen ablaufen Die Richtung der Pfeile ber cksichtigt sowohl die Reaktionsgleichgewichte als auch die bekannten Konzentrationen der Edukte und Produkte Enzyme in ihrer Funktion als Katalysatoren haben keinen Einfluss auf die Reaktionsrichtung sondern setzen lediglich die Reaktionsgeschwindigkeit herauf Eine weitere Gruppe von funktionellen Einheiten im Stoffwechsel stellen Transporter dar Diese Proteine vermitteln den Austausch oder den mitunter Energie getriebenen Transport von Metaboliten zwischen der Zellumgebung und dem Cytosol aber auch zwischen dem Cytosol und den verschiedenen Zellkompartimenten Der bersichtlichkeit wegen wurde auf die Darstellung von Transportern in Abbildung 3 2 verzichtet 10 3 Theoretische Grundlagen Zu ber cksichtigen ist dass das Wissen zu den dargestellten Stoffwechselwegen aus unter schiedlichsten Geweben bzw Organismen zusammengetragen ist Somit spiegelt dieses Stoff we
357. n Abbildung 5 30 150 5 Ergebnisse und Diskussion Isocitrat a Ketoglutarat Succinat Fumarat Malat Energy Charge F1P G6P F6P F16bP 3PG q Pyruvatla2oro2do a 0 20 0 20 0 2 0 020 020 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 00 0 2010 20 0 00 0 20 Citrat 220 0410 0 20 0 20 0 20 0 20 0 2d EH cis Aconitat 20 0 04 020 0 29 0 20 0 20 0 2 0 20 0 20 0 20 0 200 20 Isocitrat 20 014 0 20 d 0 20 a Ketoglutarat 2219 00 0 20 2010 29 Succinat 020829020 5 d 2040 20 0 20 0 20 0 20 0 20 016 0 Glykolyse Krebszyklus Malat 22 Ze 0029 0 20 0 20 CMP radna odo UMP joad ae GMP S 0 UDP ADP GDP CTP 020 UTP L 10 20 0 20 0 20 0 20 10 20 10 20 0 20 x 20 20020 20 020 L d L F0 04 0 20 0 20 10 20 0 20 0 20 0 20 0 2002070 20 0 2d 0 20 020 020 020 020 02 29 229130 E UDP GIcl 4 Energy Charge 5 20 020 o 200 2d 0 24 0 20j020 020 0 2 Abbildung 5 30 Kreuzkorrelationsmatrix f r MDCK Zellen nach dem Ersetzen des Zellkulturmediums durch PBS Zur genauen Erl uterung sein auf Abbildung 5 21 verwiesen die Zahlen in den einzelnen Feldern e
358. n Zelllinien ist die Abh ngigkeit der intrazellul ren Konzentrationen der UDP aktivierten Aminohexosen von der extrazellul ren Glucosekonzentration zu nennen 172 5 Ergebnisse und Diskussion Zur genaueren Charakterisierung der Dynamik des Stoffwechsels wurden mehrere Kurzzeit experimente mit MDCK Zellen durchgef hrt bei welchen die metabolische Reaktion auf eine schnelle nderung des Mediums beobachtet wurde Das Ersetzen des Zellkulturmediums durch PBS Limitation resultierte f r die meisten Metaboliten der Glykolyse und des Krebszyklus in einem kurz oder mittelfristigen Konzentrationsabfall W hrend die Konzentration von Zucker phosphaten sehr schnell abfiel ab lt 0 25 min sank die Konzentration der organischen S uren in einem zweiphasigen Prozess ab 0 5 2 min und ab 30 60 min Eine Ausnahme bildeten 3PG und PEP welche einen Konzentrationsanstieg zeigten Als Grund wird das Wegfallen der Aktivierung der Pyruvat Kinase durch F16bP angenommen nachdem die Konzentration von F16bP abgefallen war Nukleotide und Zuckernukleotide waren durch den Entzug des Substrats vergleichsweise schwach in ihren Konzentrationen beeinflusst Der Wert der Energy Charge zeigte im Anschluss an einen leichten Abfall innerhalb etwa der ersten Minute einen Anstieg so dass nach etwa 3 min der Ausgangswert wieder erreicht war Dass die Energy Charge die als Indikator f r den Energie zustand der Zellen gilt konstant gehalten wurde deutet an dass MDCK
359. n auf die intrazellul ren Metabolitkonzentrationen untersucht wurde stellte sich die Frage worauf diese Unterschiede im Detail zur ckzuf hren sind Dazu wurden vier verschiedene Kultivierungen in einem Medium durchgef hrt welches sich jeweils in einer Komponente von den anderen unterschied Das hei t es wurde f r alle Kultivierungen das Medium DMEM mit Pepton und FCS aber ohne Glucose und ohne Glutamin eingesetzt Der Grund f r die Wahl des Basismediums DMEM begr ndet sich mit der Tatsache dass dieses Medium auch ohne Glucose zu akzeptablen Preisen bezogen werden konnte und normalerweise ein vergleichbares Zellwachstum wie in GMEM als Basismedium erm glichte Zus tzlich wurden zu den einzelnen Medien folgende Substrate zugegeben 1 Glucose 2 5 mM Glutamin 2 mM 2 Glucose 2 5 mM 3 Glutamin 2 mM 4 Pyruvat 2 mM Auf diese Weise sollten die Effekte der verschiedenen extrazellul ren Substrate auf die intrazellul ren Metabolitpools berpr ft werden Abbildung 5 24 A zeigt die gemessenen Zellzahlverl ufe Deutlich zu erkennen sind die unterschiedlichen maximalen Zellzahlen in Abh ngigkeit von den Wachstumssubstraten Die Tabelle in Abbildung 5 24 fasst die charakteristischen Daten zur Beschreibung der vier verschiedenen Kultivierungen zusammen 5 Ergebnisse und Diskussion 135 g Medium Zellzahl Well WH max beit 0h IK Zellzahl Well gt B a Glc Gln 0 46 0 039 2 72
360. n der Literatur erw hnte Einfluss der Ammoniumkonzentration auf die intrazellul re Konzentration von UDP aktivierten Aminohexosen konnte nicht direkt nachvollzogen werden Ursache hierf r war sicherlich die berlagerung dieses Effektes mit dem Einfluss der Glucose Generell war aber zu erkennen dass f r MDCK Zellen nach dem Verbrauch von Glucose nur geringe Mengen von UDP GIcNAc intra zellul r zu finden waren Die gezeigten Kultivierungsexperimente deuteten sowohl in GMEM Z und EpiSerf als auch in DMEM die Abh ngigkeiten der intrazellul ren Metabolitkonzentrationen vom Medium an Zus tzlich waren ganz klar Konzentrationsunterschiede ber den Verlauf einer Batch Kultivierung zu erkennen Daraus ist zu schlie en dass f r die meisten Metabolitkonzentrationen w hrend einer Batch Kultivierung keine Hom ostase herrscht sondern regulatorische Effekte in den intrazellu l ren Konzentrationen widergespiegelt bzw durch diese Konzentrations nderungen bedingt wer den Dar ber hinaus zeigten die mitunter entgegengesetzten Konzentrationsverl ufe unterschied 5 Ergebnisse und Diskussion 143 licher Metaboliten dass w hrend einer typischen Batch Kultivierung von MDCK Zellen ber die meiste Zeit kein station rer Zustand herrscht Eventuell ist in der Endphase einer Kultivierung gt 120 h ber wenige Stunden ein konstantes Konzentrationsverhalten vorhanden denn in diesem Zeitraum wurden f r die meisten Metaboliten nur geringe Kon
361. n der hier vorliegenden Arbeit gezeigten Vergleich zwischen MDCK und Vero Zellen herausgestellt hat Dennoch wurde ein Vergleich mit Literaturwerten durchgef hrt Da ein Gro teil der Literatur zellspezifische Metabolitmengen beschreibt wurden die in der hier vorliegenden Arbeit ermittelten intrazellul ren Konzentrationen in zellspezifische Metabolitmengen zur ck gerechnet F r die in Tabelle 5 7 gezeigten Werte wurden f r MDCK Zellen das Minimum und das Maximum aus den gegl tteten Datenreihen f r die Kultivierungen in GMEM Z und EpiSerf ermittelt Abschnitt 5 3 2 2 s a Abbildung 5 19 In den weiteren Experimenten wurden zwar zum Teil andere Extremwerte erreicht da dies aber nicht normalen Kultivierungsbedingungen entsprach wurden diese Werte nicht f r den Vergleich herangezogen F r Vero Zellen wurde in gleicher Art das Minimum und das Maximum der gegl tteten Werte der Kultivierung mit DMEM Glc Gln Abschnitt 5 3 2 3 s a Abbildung 5 25 bestimmt W hrend f r Nukleotide eine vergleichsweise gro e Menge an Vergleichsdaten zu finden war wurden nur wenige Referenzen f r organische S uren und Intermediate der Glykolyse f r g ngige Produktionszelllinien gefunden Es zeigt sich dass tendenziell alle Metaboliten im Bereich der Werte aus der Literatur liegen Die Literaturwerte zeigen auch dass selbst f r dieselbe Zelllinie z B CHO mitunter deutliche Unterschiede in den zellspezifischen Metabolitmengen vorzufinden waren was w
362. n m z Fragmenten Schwarze m z Werte stehen f r zugeordnete Werte wobei der erste Werte das Hauption repr sentiert Blaue m z Werte konnten bisher nicht zugeordnet werden Zus tzlich zu den gezeigten Fragmenten traten durchwegs f r Nukleosidtriphosphate die m z Fragmente 79 und 178 auf Hierbei handelt es sich um Phosphat Ionen Monomere und Dimere Anhand der zahlreichen m z Fragmente ist zu erkennen dass eine sehr komplexe Probenzusammen setzung vorlag Allerdings waren die meisten m z Fragmente nur in geringen Mengen nachzuweisen und die berwiegende Anzahl der m z Fragmente r hrte von den bereits bekannten Metaboliten her Insbesondere bei den gro en Peaks in der Leitf higkeit z B ATP ADP Malat Citrat UDP NAc Glc waren zum Gro teil ca gt 90 m z Fragmente der jeweiligen Metaboliten zu finden Von 58 5 Ergebnisse und Diskussion einer detaillierten Beschreibung bzw Diskussion der verschiedenen Fragmente und ihrer Herkunft wird hier abgesehen und auf die entsprechende Literatur verwiesen 17 18 193 195 198 200 240 Auch nach der anf nglichen Anpassungsphase zur Verifizierung von Metabolitpeaks wurden gelegentlich Scan L ufe genutzt um eventuell neu auftretende bzw nur in geringen Mengen und unter beson deren Umst nden auftretende Substanzen identifizieren zu k nnen nicht gezeigt So sollte neben der m glichen quantitativen Beurteilung auch eine qualitative Beurteilung der Proben erhalten werden Aller
363. n mit Serum zu erkennen waren unterstreicht die oben erw hnte Hypothese dass ein stark regulierter Reaktionsschritt hier involviert sein muss Ein weiterer interessanter Aspekt wurde durch den Verlauf der Konzentration von 3PG in DMEM aufgeworfen Zwar stieg nach Zugabe des Mediums diese Konzentration bis zum n chsten Probenahmezeitpunkt an allerdings wurde im Anschluss ein Konzentrationsabfall gemessen Es stellt sich die Frage nach der Ursache dieses Abfalls Wie bereits oben erw hnt und auch f r die anderen Medien dieses Versuchs wahrscheinlich zutreffend wurde durch die Zugabe des Mediums bzw der Glucose in diesen Medien und dem damit einhergehende Konzentrationsanstieg von F16bP die Pyruvat Kinase aktiviert Dies f hrte zu einem Konzentrationsabfall von PEP und 3PG Dies kann aber nicht die Ursache f r den Konzentrationsabfall von 3PG in DMEM gewesen sein da hier keine Glucose enthalten war und auch kein Konzentrationsanstieg von 1 gemessen wurde Eine m gliche Erkl rung k nnte sich aus der Betrachtung des Konzentrationsverlaufs von 3PG w hrend der zweist ndigen Inkubation in PBS ergeben s Abbildung 5 28 Am Ende dieses Versuchs deutete sich ein Abfall der Konzentration an Dies w rde bedeuten dass sich dieser Abfall eventuell bei weiterer Inkubation in PBS verst rken w rde Da das Medium DMEM ohne weitere Supplemente m glicherweise eine hnliche Limitation darstellt wie PBS k nnte auch bei Wechsel in dieses Medium e
364. n steileren Anstieg zeigte Nach 70h war in GMEM Z eine Abflachung des Anstiegs zu erkennen dennoch fand eine weitere Konzentrationszunahme bis zu einem Wert von etwa 50 mM statt F r die Kultivierung in EpiSerf zeigte sich nach 70 h ein Ende der Konzentrationszunahme max ca 20 mM was einherging mit dem Zeitpunkt des kompletten Verbrauchs von Glucose Einen mit Glucose vergleichbaren Konzentrationsverlauf zeigte Glutamin f r beide Medien F r GMEM Z war nach etwa 70 h bei einer Konzentration von ca 0 7 mM eine deutliche Reduktion des Verbrauchs zu verzeichnen und im weiteren Verlauf war ein geringer Abfall der Konzentration zu sehen Der deutliche Unterschied des Glutaminverlaufs in EpiSerf3 verglichen mit EpiSerfl und 2 wird weiter unten diskutiert Die Konzentration von Glutamat war f r beide Medien in den ersten 30h GMEM Z bzw 45 h EpiSerf konstant und fiel anschlie end in einem steilen Verlauf auf einen Wert von etwa null Durch einerseits die h here Anfangskonzentration in EpiSerf aber auch ein l ngeres konstantes Niveau zu Beginn der Kultivierung war Glutamat in EpiSerf erheblich sp ter 120 h verbraucht als f r GMEM Z 60h Wie oben erw hnt dienen typischerweise Glutamin und Glutamat als Energiequellen Nach Desaminierung bzw Transaminierung k nnen beide Aminos uren ber a Ketoglutarat im Krebszyklus teilweise oder vollst ndig abgebaut werden In Abbildung 5 19 ist der Verlauf der Ammoniumkonzentration im Zellkultur
365. n tierischen Zellen erfolgt gro teils durch die Glykolyse 22 57 Neben der Funktion der Energiegewinnung ist die Glykolyse ein wichtiger Lieferant von Bausteinen f r Synthesereaktionen wie z B Aminos uren f r die Proteinsynthese oder Glycerol 3 Phosphat f r die Synthese von Phospholipiden Auch der f r anabole Prozesse wichtige Abbau von Glucose ber den Pentose Phosphat Weg hat seinen Ausgang in Glucose 6 Phosphat G6P und die daraus resultierenden Produkte Fructose 6 Phosphat F6P und Glycerinaldehyd 3 Phosphat GAP flie en wieder in die Glykolyse ein F r viele kultivierte Zelllinien bzw krebsartige Zellen ist der Fluss durch die Glykolyse erh ht was direkt auf eine erh hte Aktivit t der Enzyme der Glykolyse zur ckzuf hren ist H 55 59 Dies wiederum wird begr ndet mit einer erh hten Expression der Enzyme der Glykolyse und einem ver nderten Muster der Isoenzyme Unter anderem wurde auch vermutet dass die Phosphorilierung der Glykolyseenzyme durch mutierte Proteinkinasen beeinflusst ist 47 Der erste Schritt bei dem Abbau von Glucose ist der Transport des Substrates in das Cytosol der Zelle Bei den meisten industriell relevanten Zelllinien handelt es sich hier um einen vermittelten Diffusionsprozess Der Vermittler ist typischerweise einer der Transporter aus der GLUT Klasse 80 61 wobei die treibende Kraft bei der Aufnahme der Glucosegradient ber die Zellmembran ist 163 641 Alternativ kommt ein Auch fii
366. n vorangegangenen Versuchen waren die Korrelationen hier deutlich schw cher was sich in der zum Gro teil ungef rbten Matrix widerspiegelt Die auftretenden Korrelationen waren die auch bereits bekannten Bl cke der Zuckerphosphate die organischen S uren Citrat cis Aconitat und Isocitrat bzw Malat und Fumarat Des Weiteren waren ADP und GDP wie auch die beiden Zuckernukleotide UDP GlcNAc und UDP GalNAc relativ stark korreliert Die hier genannten starken Korrelationen sind entsprechend ihrem p Wert signifikant f r p lt 0 05 164 5 Ergebnisse und Diskussion yruvat a Ketoglutarat cis Aconitat Succinat Isocitrat UDP GalNAc UDP GIcNAc Fumarat UDP ADP GDP 2 GTP 8 Energy Charge a 1 Zeep 8 8 8 00 0 00 0 00 0 00 0 48 0 83 0 00 0 07 0 14 0 22 0 01 0 0 07 0 12 0 08 0 00 1 ae 6 F6P I F16bP1 Pyruvat Citrat cis Aconitat Isocitrat a Ketoglutarat Succinat Fumarat Malat CMP UMP AMP GDPhoss UDP GIcN Ad UDP Glcos Energy Chargen Glykolyse Krebszyklus 0 00 027
367. nationen mit z B Viren zu senken Grunds tzlich wird zwischen prim ren und kontinuierlichen Zellen unterschieden W hrend erstere nach der Entnahme aus dem Gewebe nur mit begrenzter Lebensdauer kultiviert werden k nnen vermehren sich permanente Zellen prinzipiell endlos in Zellkultur Ursache f r diese F higkeit kann z eine spontane oder eine durch Viren induzierte Mutation sein Des Weiteren wird generell zwischen adh renten Zellen und Suspensionszellen differenziert Eine Voraussetzung f r das Wachstum adh renter Zellen ist dass diese Zellen eine geeignete Oberfl che zur Anheftung finden Suspensionszellen hingegen brauchen keine Wachstumsoberfl che und werden durch Sch tteln oder R hren in Suspension gehalten Nat rlicherweise kommen Suspensionszellen in Blut vor allerdings wachsen auch zahlreiche transformierte Zellen und Tumorzellen in Suspension UL Die Historie der Produktion von pharmazeutisch genutzten Wirkstoffen mit kultivierten tierischen Zellen begann in den 40er Jahren des letzten Jahrhunderts Ein Polio Impfstoff wurde in embryonalen Humanzellen vermehrt Nach und nach wurden verschiedene Zelllinien f r die Produktion von viralen Impfstoffen eingesetzt und eine ganze Reihe von Human z B Mumps Masern R teln und Veterin rimpfstoffen z B Maul und Klauenseuche Rinderpest wurde in der Folge in Zellkulturen hergestellt 2 In den folgenden Jahren wurden zahlreiche weitere Zelllinien aus verschiedenen
368. nd by using desirability functions The last step of the optimization procedure was required to overcome deficits regarding poor recoveries for nucleotides when adding standards to samples Therefore combining crucial steps from both optimized procedures yielded a robust and reproducible method for sample preparation for the quantification of all selected intracellular metabolites The third stage of this work comprised the characterization of various cultivation conditions according to the intracellular metabolite concentrations for MDCK and Vero cells Significant changes of intracellular metabolite concentrations were observed over the time course of batch cultivations Many of the metabolites measured showed a clear dependence of the concentration behavior on cell culture media serum containing GMEM Z vs serum free EpiSerf or availability of energy substrates in the media Using pulse experiments differences in the concentration behavior of intracellular metabolites were found Especially intermediates from glycolysis showed very fast responses to changes in glucose content of the supernatant Moreover the regulatory mechanism of activation of pyruvate kinase by fructose 1 6 bisphosphate could clearly be followed after the media pulses The correlation behavior of different metabolite concentrations varied widely depending on experimental conditions resulting in characteristic correlation matrices for every experiment Despite this exp
369. nden Gens determiniert ist ist die Beeinflussung der gebildeten Glykanstrukturen deutlich schwieriger Da die Wirksamkeit eines Proteins h ufig auf diesen Glykanstrukturen basiert ist eine essentielle Aufgabe bei der Produktion von Biopharmazeutika die entsprechend wirksamen Glykosylierungsprofile reproduzierbar herzustellen Zahlreiche Prozessparameter haben einen Einfluss auf die Bildung der Glykanstrukturen Unter anderem unterscheiden sich verschiedene Zelllinien in den von ihnen exprimierten Enzymen die verantwortlich sind f r die Glykosylierung der Proteine Dar ber hinaus spielen z B der pH Wert der Kultur die N hrstoffversorgung die Konzentration von Abfallprodukten oder auch die Temperatur wichtige Rollen f r die Ausbildung der korrekten Zuckerstrukturen Aber auch andere posttranslationale Modifikationen wie z B die Ausbildung von Disulfidbriicken Methylierungen Hydroxylierungen Phosphorylierung einzelner Aminos uren oder vermittelte Proteinfaltungsprozesse beeinflussen die Wirksamkeit von Proteinen 110 11 W hrend die oben genannten Impfstoffe schon seit Beginn der 70er Jahre in Zellkultur hergestellt werden findet die Produktion von Influenza Impfstoffen auch heute noch gro teils in H hnereiern statt Aktuelle Entwicklungen allerdings gehen auch f r Influenza Impfstoffe zu 1 Einleitung 3 zellkulturbasierenden Impfstoffen da diese Prozesse insbesondere wegen ihrer h heren Flexibilit t und Skalie
370. nderte Stoffwechselaktivit t der Zellen gepaart mit dem Verbrauch von nicht gemessenen Energiequellen vermutet Das bedeutet dass wahrscheinlich weitere Medienkomponenten von den Zellen abgebaut wurden oder evtl intrazellul re Speicherstoffe Proteine oder andere Makro molek le abgebaut wurden um den Wert der Energy Charge auf einem hohen Niveau halten zu k nnen Aus der Literatur ist bekannt dass die Energy Charge bei kultivierten tierischen Zellen mitunter l ngere Zeit unter limitierten Zust nden auf einem hohen Niveau gehalten wird 17 1781 Besonders zu erw hnen ist der Konzentrationsverlauf von UDP GlcNAc Erhebliche Unterschiede waren f r die verschiedenen Medien zu erkennen Ein interessanter Aspekt hierbei ist dass die Anfangskonzentrationen bei der ersten Probennahme f r die verschiedenen Medien in einem sehr hnlichen Bereich lagen Grund hierf r k nnte sein dass entweder die Unterschiede der Medien keine Konzentrations nderungen in diesem fr hen Stadium der Kultivierung bewirkten oder dass die Unterschiede sich nicht mit einer entsprechenden Geschwindigkeit in einer Konzentrations nderung dieses Metaboliten niederschlugen und somit zu diesem Zeitpunkt noch die aus der gemeinsame Vorkultur resultierenden gleichen Konzentrationen vorlagen Wie bereits f r die Kultivierungen in GMEM Z und Episerf bemerkt schien im weiteren Verlauf der Kultivierungen die Glucosekonzentration einen signifikanten Einfluss zu haben Der i
371. ne Kompensation der fehlenden N hrstoffe f r die Zellen m glich war Kultivierungsexperimente mit Vero Zellen zeigten dass die etablierte Methode zur Analyse von intrazellul ren Stoffwechselprodukten generell f r adh rente Zellen anwendbar ist Beim Vergleich von intrazellul ren Metabolitkonzentrationen w hrend Batch Kultivierungen f r MDCK und Vero Zellen waren deutliche Unterschiede in den Konzentrationsverl ufen zu erkennen was auf einen erheblich voneinander abweichenden Stoffwechsel hindeutet Somit konnte diese Arbeit einen wichtigen Schritt zur weiteren Aufkl rung des Stoffwechsels von kultivierten tierischen Zellen leisten Eine verl ssliche Methode zur Quantifizierung der Stoffwechselprodukte des Zentralstoffwechsels wurde etabliert und das Konzentrationsverhalten von 30 intrazellul ren Metaboliten wurde unter unterschiedlichen Kultivierungsbedingungen aufgekl rt Zusammenh nge zwischen Metaboliten konnten aufgezeigt werden und basierend auf diesen Ergebnissen wurden erste R ckschl sse auf die Regulation gezogen Der Vorteil dieser auf der Analyse von intrazellul ren Stoffwechselprodukten basierenden Methode liegt im Gegensatz zu Untersuchungen des Genoms oder Proteoms darin dass eine direkte Quantifizierung der Endprodukte biochemischer und molekularbiologischer Prozesse erfolgt Auf diese Weise sind in diesen konkreten Messgr en s mtliche Effekte aller regulatorischer Ebenen ber cksichtigt und man erh lt einen
372. neering 39 5 556 564 Andersen DC Goochee CF 1995 The Effect of Ammonia on the O Linked Glycosylation of Granulocyte Colony Stimulating Factor Produced by Chinese Hamster Ovary Cells Biotechnology and Bioengineering 47 1 96 105 Baggetto LG 1992 Deviant Energetic Metabolism of Glycolytic Cancer Cells Biochimie 74 11 959 974 Moreno Sanchez R Rodriguez Enriquez S Marin Hernandez A Saavedra E 2007 Energy metabolism in tumor cells Febs Journal 274 6 1393 1418 Petch D Butler M 1994 Profile of energy metabolism in a murine hybridoma glucose and glutamine utilization Journal of Cellular Physiology 161 1 71 76 Fitzpatrick L Jenkins HA Butler M 1993 Glucose and Glutamine Metabolism of a Murine B Lymphocyte Hybridoma Grown in Batch Culture Applied Biochemistry and Biotechnology 43 2 93 116 Neermann J Wagner R 1996 Comparative analysis of glucose and glutamine metabolism in transformed mammalian cell lines insect and primary liver cells Journal of Cellular Physiology 166 1 152 169 Joost HG Thorens B 2001 The extended GLUT family of sugar polyol transport facilitators nomenclature sequence characteristics and potential function of its novel members Molecular Membrane Biology 18 4 247 256 Wood IS Trayhurn P 2003 Glucose transporters GLUT and SGLT expanded families of sugar transport proteins British Journal of Nutrition 89 1 3 9 Wlaschin KF Hu WS 2007 Engineering cell metabolism for high density cell
373. nenen Erkenntnisse reagiert werden Konnte Grunds tzlich ist aber zu erw hnen dass eine Messung intrazellul rer Metabolitkonzentrationen mit Hilfe einer Probevorbereitung also einer Extraktion von Metaboliten aus den Zellen immer nur als Anhaltspunkt dienen kann Ursache hierf r ist dass der tats chliche Einfluss der Probenvor bereitung nie vollst ndig berpr ft werden kann Zur Bestimmung der tats chlichen intrazellul ren Konzentrationen also der wahren Werte w re ein nicht invasives absolut quantifizierendes Verfahren erforderlich 5 2 7 1 Vergleich der Methoden aus der Literatur Bei der Untersuchung von in der Literatur beschriebenen Extraktionsverfahren wurden verschieden ste beschriebene Methoden auf ihr Verm gen getestet ATP zu extrahieren und Makromolek le 5 Ergebnisse und Diskussion 89 abzureichern Gr nde f r die Auswahl der Zielgr en sind bereits oben genannt Entscheidend war dass die Messung dieser Zielgr en grunds tzlich m glich war keine Beeinflussung durch die Probenmatrix bestand und dass die Messungen schnell und einfach durchzuf hren waren Dadurch konnte der hohe Probenaufwand bew ltigt werden Beide Messverfahren erwiesen sich als geeignet aber diese Zielgr en bargen auch Nachteile Der Absorptionswert bei 280 nm ist zwar haupts chlich durch die Verunreinigungen der Probe durch Protein und Nukleins uren bestimmt allerdings absorbieren auch Nukleotide bei dieser Wellenl nge W
374. nerator auf 0 2 mM stellen Nach weiteren 5 min f llte das Signal wieder etwa auf den Startwert ab Falls der Suppressor gut arbeitet kann nun die Messung begonnen werden e Grunds tzlich empfiehlt es sich nach l ngeren Betriebsunterbrechungen der Anlage eine Reihe von Standards nach dem einschalten zu messen Somit kann berpr ft werden ob die Trennung der Substanzen wie auch die Sensitivit t der Detektoren den Erwartungen entsprechen e Neue Sequenz starten Im Browser Sequenzen anklicken dann den entsprechenden Monat und neue Sequenz starten s Sequenzen herstellen und starten 1 1 Starten die DX 320 Anlage nach Stromausfall e Computer hochfahren Name cmsrvbio Kennwort chrom212 e Abwarten bis das Netlog script sich ge ffnet hat gt auf ok klicken e Falls MS Detektor benutzt wird kann XCalibur gestartet werden Doppelklick auf Symbol Diagnose erweitertes Men mit zus tzlichen Informationen gt Empfehlung auf der rechten Seite des Bildschirms Es erscheint ein gelber Punkt im task bar rechts unten der bei Doppelklick XCalibur ffnen l sst e Auf dem Bildschirm Chromeleonserver Symbol rechts unten in Taskleiste durch Doppelklick starten e Dann kann Chromeleon Symbol rechts gestartet werden f r den Fall dass Chromeleon vor XCalibur gestartet wird wird automatisch das Tune Men f r XCalibur gestartet da der die Chromeleon Serverkonfiguration dies so festlegt e Anschlie end kann das Ch
375. nergiesubstrat und intrazellul ren Metabolitkonzentrationen aufzukl ren Als Basismedium wurde DMEM verwendet Zu ber cksichtigen bei den hier gezeigten Versuchen ist dass auch f r diese Medien keine Adaption der Zellen an die jeweiligen Medien stattfand Wie bereits oben erw hnt lag aber die Priorit t bei der Versuchsdurchf hrung darin identische Zellen zur Einsaat zu verwenden So sollten direkte Effekte des Mediums ermittelt werden Im Gegensatz zu den Versuchen mit GMEM Z und EpiSerf konnte nicht f r alle hier untersuchten Medien ein gutes Zellwachstum erreicht werden sondern nur f r das Medium mit Glucose und Glutamin Abbildung 5 24 Verglichen mit den Kultivierungen in GMEM Z und EpiSerf konnte mit diesem Medium eine hnliche maximale spezifische Wachstumsrate erzielt werden Die maximale Zellzahl war f r dieses Medium im Vergleich zu GMEM Z und EpiSerf deutlich niedriger was h chstwahrscheinlich am niedrigen Glucosegehalt des Mediums lag Grund f r den Einsatz der vergleichsweise niedrigen Glucosekonzentration war m gliche Indizien f r einen effizienteren Stoffwechsel in den intrazellul ren Metabolitkonzentrationen zu finden Es sollte ein Vergleich mit den vorangegangenen Versuchen mit GMEM Z erfolgen da diese beiden Medien GMEM und DMEM typischerweise ein vergleichbares Zellwachstum f r MDCK Zellen erm glichen wurde angenommen dass eine bertragung valide ist An den deutlich niedrigeren maximalen Zellzahlen in
376. nes Central Composite Versuchsplans h ufig mit einem Polynom 2 Ordnung gut beschrieben werden Aber insbesondere bei der Extraktionsmethode MeOH Kochen resultierte die Anpassung nicht in den erwarteten guten Signifikanzwerten So wurde ein zweites Experiment geplant Die Niveaus f r die Faktoren wurden geringf gig ver ndert s Tabelle 4 4 um die Effekte auf die Zielgr en besser erfassen zu k nnen Erst eine kombinierte Auswertung der Experimente 1 und 2 zeigte akzeptable Signifikanz werte Die Effekte des Puffers waren f r beide Experimente gering Auch in den vorangegangenen Experimenten waren nur relativ schwache Effekte ausgehend vom Puffer zu erkennen Somit hat die Konzentration von Tricine scheinbar keinen erheblichen Einfluss auf die getesteten Zielgr en Deutliche Auswirkungen hatten die zwei weiteren Einflussgr en auf die Zielgr en Trotzdem waren die Effekte nicht zwingend signifikant was bedeutet dass trotz der Bem hungen reprodu zierbar zu arbeiten Schwankungen durch nicht kontrollierte Faktoren auftraten Insbesondere f r den F16bP Gehalt war die Anpassung vergleichsweise schlecht und die Variabilit t gro Der wichtigste Grund hierf r ist sicherlich die biologische Variabilit t Wie weiter unten erkl rt Ab schnitt 5 3 ist besonders F16bP ein sensibler Metabolit welcher schnelle Konzentrations nderun gen durchl uft Die Experimente zur Optimierung der Methode erstreckten sich mitunter ber mehrere S
377. net werden Aus diesem Grund wurde zur genaueren Charakterisierung der Extraktionsverfahren eine Versuchsplanung gem einem Central Composite Design genutzt 5 2 2 2 Central Composite Versuchsplan zur weiteren Optimierung Theoretische Betrachtungen lie en den Schluss zu dass einige kontinuierliche Einflussgr en in dem m glichen Einsatzbereich ein Optimum f r die Extraktion besitzen k nnten z B Volumen MeOH Volumen CHCls Kochdauer Dies w rde bedeuten dass wenn nur die Extremwerte der m glichen Einstellungen 2 faktorieller Versuchsplan getestet werden der optimale Bereich der zwischen diesen Punkten liegt nicht gefunden wird Somit wurde ein daf r geeigneter Versuchsplan Central Composite gew hlt um die Effekte dieser kontinuierlichen Einflussgr en zu bestimmen Jeder Faktor wurde bei diesem Versuchsansatz f r f nf unterschiedliche Niveaus getestet Optimierung der Methode Central Composite Ansatz Die Einflussgr en Volumen MeOH Tricine Konzentration und Kochdauer wurden in diesem Experiment genauer untersucht Es wurden zwei verschiedene Experimente durchgef hrt da das erste Experiment keine signifikanten Resultate lieferte Die realen Niveaus f r die kodierten 5 Ergebnisse und Diskussion 75 Niveaus 1 und 1 sind in Tabelle 4 4 A und gezeigt Die weiteren Niveaus 1 68 0 und 1 68 lassen sich wie unter 3 5 3 beschrieben aus diesen Werten berechnen Die beiden
378. ng 5 33 hnliche Muster wie in den Experimenten in 5 3 4 1 Einen korrelierenden Block bildeten die Zuckerphosphate welche zum Teil auch gut korreliert waren mit der Gruppe um Citrat Pyruvat war in diesem Experiment korreliert mit Citrat G6P F6P und Nukleosiddiphosphaten Fumarat war korreliert mit Citrat cis Aconitat und Isocitrat sowie Malat Diese beiden Metaboliten zeigten sonst nur geringe Korrelationen mit anderen Stoffwechsel produkten 3PG und PEP waren haupts chlich positiv miteinander korreliert aber eine schwache positive Korrelation war auch mit ATP UTP und der Energy Charge zu finden Ansonsten waren 3PG und PEP mit den meisten anderen Metaboliten negativ korreliert wobei diese negativen Korrelationen am st rksten zu der Gruppe der Zuckerphosphate ausgepr gt waren a Ketoglutarat und Succinat waren schwach mit anderen Metaboliten korreliert Einen gro en Block von korrelierenden Metaboliten stellten die Nukleotide und Zuckernukleotide Eine Ausnahme in diesem Experiment bildete GTP das keine st rkeren Korrelationen zu anderen Metaboliten aufwies ATP und UTP zeigten eine starke Antikorrelation mit den restlichen Nukleotiden waren aber positiv mit der Energy Charge korreliert Diskussion Die Hypothese zu diesem Experiment war dass nach dem Abfallen der Konzentrationen der intra zellul ren Metaboliten w hrend der Inkubation in PBS durch die Zugabe von neuem Zellkultur medium ein sequentieller Konzentrationsanstieg der un
379. ng der Metabolitkonzentration und die nderung der Zellzahlen Dies bedeutet dass z B ein Metabolit mit konstanter intrazellul rer Konzentration bei Zellwachstum einen Anstieg der Konzentration pro Well aufwies Somit entstand eine positive Korrelation vieler Metaboliten durch den Effekt des Zellwachstums und m glicherweise wurden einige negative Korrelationen durch diesen Effekt berdeckt Dies erkl rt das fehlende Auftreten von negativen Korrelationen Da nicht f r alle einzelnen Metabolitmessungen auch Zellzahlen bestimmt wurden schloss sich der Bezug auf Zellzahlen oder Zellvolumina aus Unabh ngig von der berlagerung des Effektes durch das Zellwachstum treten generell hohe positive Korrelationen nur auf wenn tats chlich ein sehr hnliches Verhalten der Konzentrationen vorliegt Die Tatsache dass keine negativen Korrelationen zu finden waren deutet an dass sicherlich keine stark ausgepr gten inversen Verhaltensweisen von 104 5 Ergebnisse und Diskussion intrazellul ren Metabolitkonzentrationen vorlagen da sonst zumindest schwache negative Korrelationskoeffizienten gefunden worden w ren Die gew hlte Anordnung der Metaboliten nach Stoffwechselwegen bot sich an da ein Zusammenhang innerhalb dieser Wege erwartet wurde Alternativ wurde auch zur besseren Visualisierung der Ergebnisse eine Clusteranalyse der Metaboliten entsprechend einer auf den Korrelationskoeffizienten basierenden Distanzmatrix wie von Arkin vorgeschlag
380. ngen f r beide Medien nach Normierung der Zellzahlen eines Mediums gem Zellzahlnormierr Zellzahl Zellzahl der Kultivierung SD der Kultivierung zeigte dass die Werte f r die Gesamtzellvolumina in einem engeren Band um die sigmoide N herungsfunktion lagen als f r die Zellzahlen vgl Abbildung 5 18 So wurde f r GMEM Z eine Reststandardabweichung der Zellzahlen s zz 0 274 und f r die Volumina sy va 0 263 kein signifikanter Unterschied gem F Test 0 398 ermittelt F r EpiSerf ergaben sich Werte f r 5 22 0 269 und sy y 0 198 signifikanter Unterschied gem F Test p 0 025 Ein Grund f r die bessere bereinstimmung der Verl ufe der verschiedenen Kultivierungen f r das Gesamtzellvolumen war dass in Kultivierung 3 die Zellzahlen pro Well deutlich h her lagen aber dementgegen waren die Zellvolumina geringer Auf diese Weise wurde die h here Zellzahl durch das niedrigere Volumen kompensiert Wie oben erw hnt wurden die chromatographisch bestimmten Metabolitgehalte in den einzelnen Wells auf die zum gleichen Zeitpunkt ermittelten Gesamtzellvolumina bezogen wodurch eine intrazellul re Konzentration berechnet wurde Diskussion Zu ber cksichtigen ist bei den hier erzielten Ergebnissen dass f r die Kultivierung in EpiSerf Medium keine Adaptation der Zellen an das Medium durchgef hrt wurde Typischerweise ver ndert sich das Wachstumsverhalten von kultivierten Zellen bei Umstellung auf ein
381. ngenerator Suppressor Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 Eine schematische Darstellung ist in der folgenden Abbildung gezeigt Eluent Eluent H O B fi Isokratische Isokratische Autosampler Pumpe Autosampler Pumpe ATC HC ATC HC S ule S ule Eluenten Eluenten Generator Generator Injektions Injektions ven lee Entgaser ventil Entgaser A Si l Abfall Abfall Vorsaule Vors ule Y S ule 1 S ule 1 E S ule 2 S ule 2 HO Suppressor Suppressor Regeneration AXP Pumpe Leitfahigkeits Leitf higkeits detektor detektor UV UV Detektor Detektor Externes Ventil MeOH A MS fash A Detektor Ja AXP Pumpe Abfall In der Ionenchromatographie mit Leitf higkeitsdetektion k nnen die Elektrolyten im Eluenten die Detektion der interessierenden ionischen Analyten beeintr chtigen Grunds tzlich w rde mit steigender Konzentration des Eluenten die Basislinie ansteigen Der Suppressor f hrt einen Austausch von K Ionen durch H Ionen welche elektrolytisch hergestellt wurden du
382. nhang der intrazellul ren Konzentration von UDP GlcNAc zur extrazellul ren Konzentration von Ammonium wie oben diskutiert Konnte auch f r Vero Zellen nicht nachgewiesen werden Somit ist das Konzentrationsverhalten dieses Metaboliten in Vero Zellen dem in MDCK Zellen relativ hnlich 5 Ergebnisse und Diskussion 147 5 3 4 Pulsexperimente mit MDCK Zellen Nach den oben beschriebenen Experimenten die ein Bild von typischen Konzentrationsverl ufen w hrend einer Batch Kultivierung bei Verwendung verschiedener Medien geben sollten war es das Ziel in den in diesem Abschnitt dargestellten Versuchen ein besseres Verst ndnis der Dynamik der Metabolitkonzentrationen zu erreichen Dazu wurden schnelle nderungen in der extrazellul ren Umgebung erzeugt und die darauf folgenden Effekte in den intrazellul ren Metabolitkonzen trationen gemessen W hrend f r die oben erw hnten Kultivierungsexperimente genauestens auf die Unterschiede zwischen Metabolitmengen und Metabolitkonzentrationen und deren Bezug geachtet wurde s Tabelle 4 2 werden diese Begriffe in diesem Abschnitt gleichbedeutend genutzt Grund hierf r ist dass in den Zeitr umen dieser Experimente lt 2h von konstanten Zellvolumina und Zellzahlen ausgegangen wurde Somit waren die Werte f r Metabolitmengen und Metabolitkonzen trationen ber eine Konstante verkn pft und deshalb in ihrem qualitativen Verhalten identisch 5 3 4 1 Austausch von Medium durch PBS Hierf r wurd
383. nnten z B lipophile Metaboliten Eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse ist in Tabelle 5 1 dargestellt Zus tzlich zu den hier erw hnten Aminos uren wurden 16 weitere Aminos uren getestet die allerdings nicht detektiert werden konnten Eine ganze Reihe von Metaboliten war unter den genutzten Chromatographiebedingungen nicht stabil so dass mehrere Fragmente der Substanzen in den Chromatogrammen gefunden wurden Die Metaboliten Acetyl CoA NAD und sind mit der beschriebenen Methode nicht zu quantifizieren da sie unter basischen Bedingungen zerfallen Andere Substanzen sind generell instabil wie z B Erythrose 4 Phosphat NADH Oxalacetat 71 Aus diesem Grund war bereits im Vorfeld der Versuche mit einer eingeschr nkten Quantifizierungsm glichkeit dieser Metaboliten zu rechnen und eine Fragmentierung zu erwarten F r den Fall dass diese Metaboliten quantifiziert werden sollten m sste somit eine andere Methode zum Einsatz kommen Bei Injektion von cis Aconitat wurde auch immer ein Peak f r trans Aconitat gefunden was auf eine Verunreinigung bzw Umsetzung des cis Aconitat hindeutet Dieses Ph nomen wurde aber bereits von Lu et al 2003 berichtet P Als problematisch stellte sich auch die Trennung von UMP UDP Glucose UDP Glc und UDP Galactose UDP Gal heraus Alle drei Substanzen eluierten zur gleichen Retentionszeit wobei allerdings UDP Glc einen zweiten Peak lieferte der unmittelbar nach dem Hauptpeak e
384. nst nur geringe bereinstimmungen mit den Verl ufen anderer Metaboliten auf GTP und CMP waren miteinander korreliert aber nicht mit anderen Metaboliten Ebenso nur geringe Korrelationen mit anderen Stoffwechselprodukten wiesen ATP und CTP auf Die Konzentrationsverl ufe dieser beiden Nukleotide waren miteinander gut korreliert und zus tzlich waren sie mit den Verl ufen von UMP und FIP korreliert Die beiden Zuckernukleotide UDP GleNAc und UDP GalNAc waren stark positiv miteinander korreliert und zeigten schwache Korrelationen zu anderen Metaboliten Auff llig war das Korrelationsverhalten der Energy Charge Zur Mehrzahl der aufgef hrten Stoffwechselprodukte bestand eine negative Korrelation Nur zu 3PG PEP und UTP war eine positive Korrelation vorhanden Insgesamt gesehen wurde durch den in diesem Versuch durchgef hrten Medienentzug f r eine ganze Reihe von Metaboliten ein kurz oder mittelfristiger Abfall der Konzentration ausgel st Eine Ausnahme bildeten die beiden Metaboliten 3PG und PEP deren Konzentration im Verlauf dieser Experimente anstieg Insbesondere Nukleosidtriphosphate wiesen ber den gesamten Versuchs zeitraum eine nahezu konstante Konzentration auf W hrend sich somit einige Metaboliten ber ihre Tendenzen gruppieren lie en waren die Geschwindigkeit der Konzentrations nderungen und der genaue Verlauf aber je nach Metabolit stark unterschiedlich Diskussion Die Hypothese zu den Vorg ngen bei einem Austausch von M
385. nstein dieser Arbeit war das Ziel anhand der etablierten Methoden eine Charakterisierung von Zellkulturen unter verschiedenen Zust nden wie z B bei Kultivierung in unterschiedliche Medien zu erreichen Grunds tzliche Fragen nach dem Verhalten der Metabolit konzentrationen w hrend einer Batch Kultivierung wie z B ob starke nderungen durchlaufen werden oder ob eine Hom ostase vorliegt bzw welche Einfl sse von verschiedenen Medien bzw Medienkomponenten herr hren sollten gekl rt werden Weiterhin sollte die Dynamik des Stoffwechsels anhand der Konzentrationen verschiedener Stoffwechselprodukte genauer untersucht werden Zuletzt waren Konzepte zur Auswertung und Darstellung der gro en Datenmengen zu erarbeiten Somit umfasste die Aufgabenstellung sowohl die Entwicklung einer Chromatographiemethode und einer Probenvorbereitungsmetode die Anwendung der etablierten Methode als auch die Auswertung und Interpretation der gewonnenen Daten 8 3 Theoretische Grundlagen 3 Theoretische Grundlagen In der Arbeitsgruppe Bioprozesstechnik am Max Planck Institut in Magdeburg wird seit Jahren eine detaillierte Charakterisierung und Optimierung von zellkulturbasierten Impfstoffherstellungsver fahren angestrebt Unter anderem werden hierf r MDCK und Vero Zellen eingesetzt Ein Gesichtspunkt mit zentraler Bedeutung f r die untersuchten Prozesse ist der Stoffwechsel dieser Zellen 3 1 Stoffwechsel tierischer Zellen in Kultur Im Vergleich
386. nte Zersetzung der Substanzen ber 4 Tage bei 4 C festgestellt werden Eine Ausnahme bildete Oxalacetat welches unabh ngig von den Bedingungen zerfiel Die beste Stabilit t f r Oxalacetat konnte bei pH 12 festgestellt werden was trotzdem noch zu einem 20 prozentigem Verlust nach 4 Tagen bei 4 C in PBS f hrte Obwohl die Stabilit t der meisten Substanzen bei diesem Versuch gezeigt werden konnte war eine eindeutige Abh ngigkeit des Messsignals vom pH Wert der Probe unabh ngig vom Detektor zu sehen So war eine klare Abnahme von sowohl Peakfl che als auch h he mit sinkendem pH Wert zu erkennen Diese Beobachtung konnte bei unterschiedlichsten Analyten gemacht werden so auch z B bei Nitrat und Sulfat Abbildung 5 2 zeigt die mittlere Peakfl che von sechs Injektionen ber dem pH Wert beispielhaft f r sechs verschiedene Analyten 120 120 7 4 B R R gt 80 60 t 4 40 rel Peakfl che rel Peakfl che 20 0 1 3 5 9 11 13 1 3 5 7 9 11 13 pH pH Abbildung 5 2 Einfluss des pH Wertes der Probe auf die relativen Peakfl chen in Chromatogrammen A X Succinat A Nitrat F16bP Leitf higkeitsdetektion X AMP ADP UV Detektion Konzentration der einzelnen Analyten ist zwischen 3 125 und 100 000 uM gezeigt ist der Mittelwert aus sechs Messungen Fehlerbalken repr sentieren die Standardabweichung Die relative Peakfl che ist berechnet durch Normier
387. ntermediates from energy metabolism Metabolic complexity of samples from cells however required further resolution of chromatograms This methodological improvement was accomplished by expanding the chromatography system with a mass spectrometry detector This detection also allowed a confirmation of identity of metabolites in samples according to their individual mass charge ratio In the second stage of this work a suitable sample preparation for the measurement of intracellular metabolites was identified in a four step optimization process applying statistical methods for the design of experiments Adherent MDCK cells cultivated in six well plates served as biological samples In the first step a comparison of several methods common in literature was performed According to these results two appropriate procedures were selected and in the second step these two methods were independently screened for factors influencing extraction quality based on a fractional factorial experimental design Four different response variables nucleotide content fructose 1 6 bisphosphate content energy charge and absorption of samples at 280 nm were chosen as representative marker variables for the assessment of extraction quality In the third step of this optimization process a detailed characterization and optimization of the two methods was realized by a central composite experimental design An overall optimum with respect to all response variables was fou
388. ntitative Unterschiede zwischen den Methoden aufdecken zu k nnen als auch im Falle auftretender Probleme einer Methode einen alternativen Weg zu haben 5 2 2 1 Fraktioneller faktorieller Versuchsplan zur Optimierung Diese Serie an Experimenten sollte dazu dienen die Effekte einiger Einflussgr en der Methoden auf die Extraktionsqualit t aufzukl ren Dazu wurden die beiden Methoden MeOH Kochen und 5 Ergebnisse und Diskussion 71 MeOH CHC in unabh ngigen Versuchspl nen untersucht Ein wichtiger Schritt bei der Optimierung der Extraktion ist die Auswahl einer oder mehrerer geeigneter Zielgr en z B Metabolitkonzentration Anzahl der Metaboliten Verh ltnisse aus Metabolitkonzentrationen Im Idealfall sollten alle Metaboliten an denen man interessiert ist f r die Optimierung quantifiziert werden und diesen Werten entsprechend die Extraktionsmethode optimiert werden Abh ngig von der Anzahl der Stoffwechselprodukte kann dies aber ein nahezu unm gliches Ziel sein Des Weiteren sind aber auch die chemischen und physikalischen Eigenschaften der einzelnen Metaboliten sehr unterschiedlich was zu einem uneinheitlichen Verhalten w hrend der Extraktion f hrt Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit vier Marker Zielgr en gew hlt anhand derer die Optimierung der Extraktionsprozeduren durchgef hrt wurde 1 Die Summe der Werte aller Nukleotide Nukleotidgehalt die mittels der gemessen werden konnten
389. ntrationen sehr w nschenswert Allerdings ist hier zu ber cksichtigen dass Mitochondrien wiederum zwei Kompartimente besitzen und auch von keiner Homogenit t der Metabolitkonzentrationen im Cytosol ausgegangen werden kann Eine weitere methodische Erweiterung mit gro em zus tzlichen Informationsgewinn k nnte die Bestimmung des Redoxverh ltnisses NAD P NAD P H H darstellen Verschiedene Methoden k nnten daf r genutzt werden Bei zus tzlicher Bestimmung entweder der intrazellul ren Lactatkonzentration oder der extrazellul ren Pyruvatkonzentration h ufig wird f r Lactat und Pyruvat ein Gleichgewicht zwischen intra und extrazellul ren Konzentrationen angenommen k nnte bei Annahme einer sehr aktiven Lactat Dehydrogenase das Redoxverh ltnis abgesch tzt werden 1231 Auch ber Fluoreszenzmessungen k nnte dieses Verh ltnis ermittelt werden P 3151 Bei einer getrennten Probenvorbereitung k nnte auch ber eine enzymatische Bestimmung das Verh ltnis NAD P NAD P H H ermittelt werden 234 Aufgrund des enormen Einflusses 11 dieses Metabolitverh ltnisses auf den gesamten Stoffwechsel w re der Aufwand einer weiteren Methodenentwicklung wahrscheinlich gerechtfertigt Fortf hrende Arbeiten zur Identifikation von weiteren Metaboliten w ren denkbar Bei Nutzung einer komplement ren Chromatographiemethode z GC MS pHPLC MS k nnten wahrscheinlich weitere Stoffwechselprodukte quantifiziert werden B
390. ntsprechen dem Zeitversatz in log min Nukleotide 0 20 Besonders auff llig in Abbildung 5 30 war das Verhalten von 3PG und PEP Wie sich schon in den einzelnen Verl ufen in Abbildung 5 28 angedeutet hat war der Konzentrationsverlauf dieser beiden Metaboliten entgegengesetzt zu dem Verlauf der meisten anderen Stoffwechselprodukte Zus tzlich war mit diesen beiden Metaboliten UTP relativ gut korreliert Einen weiterer Block von hnlichen Konzentrationsverl ufen bildeten Zuckerphosphate Die meisten organischen S uren Mono und Diphosphonukleoside befanden sich in einer Gruppe von korrelierenden Metaboliten Besonders hohe Korrelationskoeffizienten wurden f r Citrat cis Aconitat und Isocitrat a Ketoglutarat und Succinat wie auch Malat und Fumarat errechnet Weiterhin waren Nukleosidmonophosphate und diphosphate mit Ausnahme von CMP sehr stark korreliert Auch diese Metaboliten zeigten einen Konzentrationsabfall im Verlauf des Experiments nicht dargestellt aber verglichen mit Zuckerphosphaten und organischen S uren die um bis zu 90 der Ausgangskonzentration fielen handelte es sich hier um etwa 20 30 Der Verlauf der Konzentration von Pyruvat war schwach mit 5 Ergebnisse und Diskussion 151 einigen Metaboliten aus der Glykolyse korreliert und wies so
391. nur minimal Dies kann f r die beiden Methoden an tats chlich auftretenden ungleichen Extraktionseffizienzen liegen Zu ber cksichtigen ist dass die gr te Schwankungsbreite bei Metaboliten mit niedrigen Konzentrationen auftrat Eine m gliche Erkl rung kann mit der Auswertung der Chromatogramme gegeben werden Durch geringf gige Unterschiede in der Probenzusammensetzung k nnen Abweichungen in der automatischen Peakintegration f r die beiden Zelllinien oder Methoden aufgetreten sein die sich bei kleinen Peaks besonders stark ausgewirkt haben Grunds tzlich sind kleine Peaks immer st rker durch Schwankungen welcher Art auch immer beeintr chtigt als gr ere Peaks Auch f r diese Versuche k nnte sicherlich die biologische Variabilit t Ursache f r Schwankungen gewesen sein Nichts desto trotz waren die bereinstimmungen der Metabolitmengen f r alle Substanzklassen erstaunlich hoch f r die zwei unterschiedlichen Methoden Eine Erkl rung k nnte sein dass zwei gute Methoden gew hlt wurden die pr zise Ergebnisse liefern welche dem wahren Wert relativ nahe liegen Eine andere Erkl rung ist sicherlich dass beiden Probenvorbereitungsmethoden letztlich auf einem Metabolitextraktionsschritt mit gepuffertem MeOH beruhen Somit h tten die beiden Methoden hnliche Vorteile und Defizite bei der Solubilisierung der Metaboliten was letztlich zu hnlichen Ergebnissen f hren w rde Beim Vergleich der Wiederfindungen mit und ohne Zellen f
392. nvironment Analysis 8 173 182 267 Thompson M 1988 Variation of Precision with Concentration in an Analytical System Analyst 113 10 1579 1587 268 Thompson M Howarth RJ 1976 Duplicate Analysis in Geochemical Practice 1 Theoretical Approach and Estimation of Analytical Reproducibility Analyst 101 1206 690 698 269 Gomase VS Changbhale SS Patil SA Kale KV 2008 Metabolomics Current Drug Metabolism 9 1 89 98 270 Cole RB 1997 Electrospray ionization mass spectrometry fundamentals instrumentation and applications New York N Y Wiley 577 p 271 Jandik P Cheng J Jensen D Manz S Avdalovic N 2000 New technique for increasing retention of arginine on an anion exchange column Analytical Biochemistry 287 1 38 44 272 Liu Y Kaiser E Avdalovic N 1999 Determination of trace level anions in high purity water samples by ion chromatography with an automated on line fluent generation system Microchemical Journal 62 1 164 173 273 Lu ZQ Liu Y Barreto V Pohl C Avdalovic N Joyce R Newton B 2002 Determination of anions at trace levels in power plant water samples by ion chromatography with electrolytic eluent generation and suppression Journal of Chromatography A 956 1 2 129 138 274 Torto N Hofte A van der Hoeven R Tjaden U Gorton L Marko Varga G Bruggink C van der Greef J 1998 Microdialysis introduction high performance anion exchange chromatography ionspray mass spectrometry for monitoring of on line des
393. nzym Triosephosphat Isomerase EC 5 3 1 1 reversible ineinander berf hrt werden DHAP kann zu Glycerin 3 Phophat umgesetzt werden und ist somit ein wichtiger Vorl ufer f r die Synthese von Phospholipiden GAP wird in der n chsten Reaktion der Glykolyse unter Verwendung von anorganischem Phosphat zu 1 3 Bisphosphoglycerat umgesetzt Diese reversible Reaktion wird durch die Glycerinaldehyd 3 Phosphat Dehydrogenase EC 1 2 1 12 katalysiert wobei die oxidierte Form des Nicotinamid Adenin Dinukleotid NAD reduziert wird Durch das Enzym Phosphoglycerat Kinase EC 2 7 2 3 wird ein Phosphatmolek l von 1 3 Bisphosphoglycerat auf ADP bertragen wobei 3 Phosphoglycerat 3PG und ATP entstehen Der Metabolit 3PG dient auch als Ausgangspunkt f r die Synthese der Aminos uren Serin und Glycin Durch die Phosphoglycerat Mutase EC 5 4 2 1 wird 3PG reversibel in 2 Phosphoglycerat 2PG umgesetzt Anschlie end wird 2PG durch Abspaltung von Wasser in Phosphoenolpyruvat PEP umgesetzt Auch bei dieser durch die Enolase EC 4 2 1 11 katalysierten Reaktion handelt es sich um eine reversible Umsetzung Im abschlie enden Schritt der Glykolyse wird von PEP eine Phosphatgruppe auf ADP durch das Enzym Pyruvat Kinase EC 2 7 1 40 bertragen In dieser regulierten Reaktion entsteht das Endprodukt der Glykolyse Pyruvat und ATP Verschiedene Effektoren beeinflussen die Aktivit t der Pyruvat Kinase W hrend ATP und Alanin die Reaktionsgeschwindigkeit herabsetz
394. oben pH Wertes auf die Analyse von Aminos uren Unter anderem wird dort eine Zersetzung der Aminos uren durch den Einfluss des pH Wertes beschrieben was mit einem Auftreten von weiteren Peaks einherging Da aber in der hier vorliegenden Arbeit das Messsignal durch Erh hung des pH Wertes auf den urspr nglichen Wert wieder hergestellt werden konnte kann eine Zersetzung der Analyten ausgeschlossen werden Um Probleme bei der Quantifizierung zu umgehen wurde im weiteren Verlauf der Arbeit darauf 5 Ergebnisse und Diskussion 67 geachtet dass der pH Wert der Proben am Ende der Probenvorbereitung zwischen 6 8 und 7 5 lag was sich f r die Messung als relativ robuster Bereich auszeichnete 5 1 3 4 Anwendbarkeit der Anlage DX600 Durch die hervorragende Eignung der Chromatographieanlage DX320 f r die Quantifizierung nahezu aller relevanter Metaboliten des Zentralstoffwechsels erwies sich die Nutzung der Chromatographieanlage DX600 nicht als sinnvoll Nachteile der Anlage DX600 gegen ber der Anlage DX320 waren dass diverse Koelutionen von vermeintlich interessanten Metaboliten mit Substanzen der Probenmatrix auftraten Weiterhin bestand eine eingeschr nkte Reproduzierbarkeit der Messungen Insbesondere bei l ngeren Messsequenzen war es durch Schwankungen in den Retentionszeiten mitunter schwierig Peaks zuzuordnen und eine gleichbleibende Qualit t der Peakintegration zu gew hrleisten Durch die hohe Komplexit t der Proben und somit die
395. oeffizienten Die Zusammenh nge zwischen den Metaboliten sind in diesen Diagrammen gut zu erkennen Da aber mehr als 30 Variablen hier untersucht werden sollten war weder eine geeignete Darstellung noch war eine detaillierte Analyse der Diagramme m glich Aus diesem Grund wurde eine Auswertung ohne Darstellung in Diagrammform durchgef hrt Diese wird im weiteren Verlauf als Korrelationsanalyse bezeichnet Hierf r wurden die einzelnen Variablen miteinander korreliert und auf diese Weise f r jede Kombination zweier Variablen der Korrelationskoeffizient r errechnet s a Abschnitt 3 6 Dies entspricht einer Kreuzkorrelation ohne Zeitverschiebung zwischen den beiden korrelierten Variablen Abbildung 5 15 stellt das Ergebnis in Form einer Korrelationsmatrix dar wobei der Grad der F rbung blau positiv rot negativ die St rke der Korrelation andeutet Die in den Feldern aufgef hrte Zahl repr sentiert den p Wert der entsprechenden Korrelation Die Metaboliten in Abbildung 5 15 wurden nach Stoffwechselwegen gruppiert So bilden die Stoffwechselprodukte aus der Glykolyse einen Block eine weitere Gruppe bilden die Metaboliten aus dem Krebszyklus und wiederum einen weiteren Block repr sentieren Nukleotide 102 5 Ergebnisse und Diskussion Isocitrat a Ketoglutarat Succinat Fumarat UDP GalNAc UDP GIcNAc Energy Charge Pyruvat 8 8 Malat 5 1 G6P F6P 3PG PEP cis Aconitat CMP UMP GMP CDP UDP ADP GDP
396. oeluierend mit 2PG 38 80 0 07 n n 3PG 3PG 38 60 0 07 n n 2PG Acetat 5 15 n n Lactat Hydroxybutyrat Acetoacetat 5 30 j ko Acetyl CoA Fragm j j ns nd ADP 48 94 0 03 j j AMP 30 94 0 09 j j RSP Asp 11 72 n n sq ATP 54 01 0 02 j j cAMP 16 25 j j nd CDP 41 56 0 15 j j Citrat Chlorid 6 92 0 01 n n cis Aconitat 45 15 0 07 j j PEP Citrat 41 34 n n CDP CMP 19 26 0 20 j j Malat CTP 51 62 0 02 j j dATP 53 70 j j nd dCTP 50 60 j j nd dGTP 58 00 j j nd DHAP Fragm ns nd dTTP 55 10 j j nd E4P Fragm ns FIP 23 20 j n hinzuzufiigen F1 6bP 50 95 0 04 n n F6P 28 18 0 08 n n FAD Fragm j j ns nd Formiat 5 50 n n Fumarat 27 52 0 07 j j GAP Fragm n n ns GDP 55 42 0 02 j j Glu 11 05 n n sq GIP 10 80 j n nd G6P 26 51 0 11 n n GMP 50 57 0 02 j j PPi GTP 58 40 0 02 j j Hydroxybutyrat 5 18 n n ko Acetat Lactat Tsocitrat 42 96 n n UDP GlcNAc a Ketoglutarat 24 95 0 17 j n Sulfat Lactat 5 09 n n Acetat Hydroxybutyrat Malat 18 43 0 20 j n Succinat CMP NAD Fragm j j ns nd NADH 39 00 j j nd NADP Fragm j j ns nd NADPH Fragm H j ns nd Nitrat 10 36 0 02 j n Oxalacetat 32 22 0 06 H j PEP 44 97 0 08 n n cis Aconitat Phosphat 35 84 n n PP 50 50 n n GMP Pyruvat 5 81 0 01 1 RSP 30 88 n n AMP S1 7bP 51 95 n n nd Succinat 17 75 0 22 j n Malat Sulfat 24 43 0 21 n n a Ketoglutarat trans Aconitat 47 61 0 04 H H TTP 55 20 1 1 UDP 53 36 0 02 1 1 UDP Gal 46 44 1 1 U
397. ogies and tools Applied Microbiology and Biotechnology 76 3 495 511 125 Mashego MR Rumbold K De Mey M Vandamme E Soetaert W Heijnen JJ 2007 Microbial metabolomics past present and future methodologies Biotechnology Letters 29 1 1 16 126 Nielsen J Oliver S 2005 The next wave in metabolome analysis Trends in Biotechnology 23 11 544 546 127 Weckwerth W Fiehn O 2002 Can we discover novel pathways using metabolomic analysis Current Opinion in Biotechnology 13 156 160 128 Steuer R Kurths J Fiehn Weckwerth W 2003 Interpreting correlations in metabolomic networks Biochemical Society Transactions 31 1476 1478 188 129 Steuer Kurths J Fiehn Weckwerth W 2003 Observing and interpreting correlations in metabolomic networks Bioinformatics 19 8 1019 1026 130 Kose F Weckwerth W Linke Fiehn 2001 Visualizing plant metabolomic correlation networks using clique metabolite matrices Bioinformatics 17 12 1198 1208 131 Roessner U Luedemann A Brust D Fiehn O Linke T Willmitzer L Fernie AR 2001 Metabolic profiling allows comprehensive phenotyping of genetically or environmentally modified plant systems The Plant Cell 13 1 11 29 132 Fernie AR Trethewey RN Krotzky AJ Willmitzer L 2004 Innovation Metabolite profiling from diagnostics to systems biology Nature Reviews Molecular Cell Biology 5 1 7 133 Farre EM Tiessen A Roessner U Geigenberger P Trethewey RN Willmitzer L 2001
398. ographieanlagen DX320 und DX600 basierend auf dem Prinzip der AAC auf ihre Anwendbarkeit zur Quantifizierung von intrazellul ren Stoffwechselprodukten getestet Die beiden Chromatographieanlagen unterschieden sich im Wesentlichen in der analytischen S ule DX320 511 DX600 CarboPac PAl und den Detektoren DX320 Leitf higkeit und UV Detektion DX600 Gepulste Amperometrische Detektion Unterschiedliche Chromatograpieeluenten und gradienten wurden untersucht und mehr als 60 potentiell intrazellul r vorkommende Stoffwechselzwischenprodukte bzw Komponenten des Zellkulturmediums auf ihr Retentions und Detektionsverhalten f r die beiden Chromatographie anlagen berpr ft Anhand dieser Daten und mit Hilfe der Methode der Standardzugabe konnten zahlreiche Metabolitpeaks in Extraktionsproben aus kultivierten tierischen Zellen zugeordnet 68 5 Ergebnisse und Diskussion werden F r die Chromatographieanlage DX320 konnte eine Methode etabliert werden die eine simultane Analyse von ber 30 verschiedenen intrazellul r auftretenden Metaboliten erlaubt Diese Messmethode wurde mit Standards in Wasser validiert um die Qualit t der Messungen beurteilen zu k nnen Da sich die Proben aus der Zellkultur als u erst komplex in ihrer Zusammensetzung erwiesen wurde im weiteren Verlauf der Arbeit zus tzlich zu den bestehenden Detektoren Leitf higkeit und UV ein Massenspektrometer an die Chromatographieanlage DX320 gekoppelt Durch diesen sel
399. ographisch vermessenen Proben war zu erkennen dass die Konzentrationen von ATP ADP und AMP f r alle Proben sehr nahe bei dem Gleichgewicht mit einer Gleichgewichtskonstante von Keg ATP x AMP ADP 0 9 lagen Dieses Gleichgewicht wurde im Detail von Tewari et al 1991 untersucht wobei verschiedenste Bedingungen getestet wurden und sich Gleichgewichts konstanten von 0 3 bis 1 4 ergaben 276 In den Ergebnissen der hier vorliegenden Arbeit Tabelle 5 4 ist zu erkennen dass sich auch bei Proben mit Standardaddition in etwa dieses Gleichgewicht einstellte w hrend dies bei Proben ohne Zellen nicht stattfand 5 2 4 Abschlie ende Modifikation Entwicklung der finalen Methode MeOH CHCIs Kochen Um die erw hnte Enzymaktivit t zu unterbinden die eine Umsetzung von ATP und AMP zu ADP katalysierte wurden weitere Experimente durchgef hrt und kleinere Modifikationen der Methoden eingef hrt Das ver nderte Extraktionsschema ist in Abbildung 5 11 dargestellt Hierf r wurden wichtige Schritte aus den beiden unter 5 2 2 2 optimierten Methoden kombiniert F r die berpr fung der Extraktion mit der modifizierten Methode wurden MDCK Zellen mit einer Dichte 82 5 Ergebnisse und Diskussion von 2 22 x 10 Zellen Well einges t und f r zwei Tage kultiviert Dies resultierte in einer Zelldichte von 4 21 x 10 Zellen Well Verwerfen des berstandes Finale Methode HE _ Waschen 1 mL PBS 4 C MeOH CHCI Kochen Z
400. olitdaten wird in der Literatur h ufig die Zellzahl verwendet 25 95 96 115 117 120 177 186 219 235 281 Wie bereits oben beschrieben stellt hier aber eine Ver nderung der Zellgr e ein Problem dar In einigen F llen kann wahrscheinlich angenommen werden dass keine nderung des durchschnittlichen Zellvolumens auftritt Allerdings ist gerade bei Kultivierungen im Batch Verfahren aufgrund der unterschiedlichen Wachstumsphasen eine Ver nderung des Zellvolumens zu erwarten Dies ist damit zu begr nden dass Zellen in den unter schiedlichen Phasen des Zellzyklus eine unterschiedliche Gr enverteilung besitzen So ist die S Phase typischer Weise mit einem gr eren Volumen verbunden als in den verbleibenden Phasen Dies bedeutet dass schnell teilende Zellen auch ein h heres durchschnittliches Zellvolumen auf weisen 1287 2891 Somit f nde bei Bezug auf die Zellzahl eine berlagerung der Konzentrations nderungen mit den Volumen nderungen statt Trotz dieses Problems ist die Zellzahl normaler weise die erste Wahl als Bezugsgr e insbesondere bei Suspensionszellen da die Zellzahl meist den wichtigsten zu bestimmenden Parameter darstellt und deshalb nahezu immer ermittelt wird Zwei weitere M glichkeiten die h ufig bei der Bestimmung von Metabolitmengen in Geweben eingesetzt wurden sind der Bezug auf Zellprotein 2 175 181 216 218 224 89 222 225 237 263 290 oder auf Frischgewicht der Zellen oder des Geweb
401. om Dura TER f EZAR Detection QNT Editor Calibration Curve Previous Channel Parameter Autoscalg Report Previous Sample Delimiter Zoom Decoration e Beim Doppelklick auf eine gemessenen Probe wird diese normalerweise im Integrationsmodus s Abbildung ge ffnet Definiert ist dies allerdings im rdf File Falls eine Sequenz nicht ge ffnet wird kann dies daran liegen dass das preferred rdf file Rechtsklick auf Sequenz gt Optionen gt General nicht geladen werden kann weil nicht vorhanden oder lokal auf einem anderen Computer e Zur Ver nderung der Detektionsparameter muss auf den QNT Editor s Abbildung geklickt werden In den verschiedenen Registrierkarten k nnen diverse Parameter eingestellt werden e Die chromatographischen Messungen werden unabh ngig vom qnt File gemacht Ausschlie lich das pgm File ist daf r n tig Chromeleon ben tigt aber schon zum Start der Messungen ein eingetragenes qnt File Da Messung und Auswertung an unterschiedlichen Computern durchgef hrt wurden und von den Sequenzen verschiedene Kopien vorlagen war das qnt File am Mess Computer nie aktuell Nach dem Kopieren der Sequenz wurde die aktuellste Version des qnt Files in die Sequenz kopiert und danach f r die Proben eingetragen e Anschlie end wurde eine Probe ge ffnet und das qnt File neu gespeichert auf QNT Editor klicken dann File 2 Save as unter einem neuen Namen z B Datum ge
402. on zentrationen vorlagen wie nach 96 h in den gezeigten Versuchen mit GMEM Z gleiches Medium vgl Abbildung 5 19 Somit waren die Konzentrationen am Ende der Vorkultur tendenziell relativ niedrig s z B G6P F6P F16bP Citrat ADP AMP Abbildung 5 19 Vor der Einsaat in das neue Kultursystem wurde mit PBS gewaschen und anschlie end trypsiniert Da in diesem Zeitraum keine Versorgung mit N hstoffen gegeben war kann wahrscheinlich von einer weiteren Abnahme der 128 5 Ergebnisse und Diskussion intrazellul ren Konzentrationen ausgegangen werden Um also die intrazellul ren Konzentrationen welche 6h nach Inokulation gemessen wurden erkl ren zu k nnen muss in dem Zeitraum nach Suspendierung der Zellen in neuem Zellkulturmedium bis zur Probenahme bei 6 h ein deutlicher Konzentrationsanstieg stattgefunden haben Als Ursache hierf r kommt die enorme Umstellung der Kulturbedingungen in Frage Dies bedeutet dass die Zellen welche in der Vorkultur nach vier Tagen typischerweise bereits stark wachstumsinhibiert waren nach Umsetzung in das neue Kultur medium und bei ausreichender Wachstumsoberfl che in den Zustand eines schnellen Zellwachs tums bergingen Auch die mitunter deutlichen Unterschiede im ersten Probenahmezeitpunkt zwischen den beiden Medien sind ein Indiz f r die starken nderungen der Konzentrationen in den ersten Stunden der Kultivierung da dieselbe Vorkultur genutzt wurde Insgesamt konnten die Versuche mit den be
403. on die mittels des Tests nach Mandel ermittelt wurde linear 1 polynomisch zweiter Ordnung Anzahl der quidistanten Punkte die f r die Kalibrierung eingesetzt wurden Bereich der Quantifizierung P Bestimmtheitsma Anhang Tabelle A 7 Optimiertes Gradientenprogramm f r die Chromatographieanlage DX320 zur Analyse von Metaboliten aus Zellextrakten Zeit min KOH Konzentration mM Kurve 0 0 0 2 5 4 0 9 0 7 6 5 3 0 1 6 8 9 0 5 7 0 9 0 5 9 5 33 2 16 0 3 5 17 0 759 9 22 5 6 0 1 25 0 8 0 3 29 0 10 0 7 30 0 22 0 5 32 0 17 5 1 36 5 17 5 5 42 0 20 0 5 45 5 36 0 5 50 0 55 0 7 52 0 61 0 3 56 0 78 0 5 56 1 100 5 62 0 100 5 62 1 0 2 5 68 0 0 2 5 Die Kr mmungen der Kurven des Gradienten sind in der Bedienungsanleitung zur Pumpe Dionex definiert Kurve 5 entspricht einer Geraden wohingegen Werte gt 5 einen konkaven Kurvenverlauf beschreiben und Werte lt 5 einen konvexen Verlauf Anhang Tabelle A 8 Liste der abschlie end genutzten Kalibrierungsfunktionen Detektor MS UV LF Pyruvat Quad x x Succinat XQOff x x Malat Quad x x Malat CMP x x QOff CMP x x LOff Ketoglutarat XQOff x x Fructose 1 P QOff x x Sulfat Ketoglutarat x x Glucose 6 P XQOff x XQOff Fumarat XQuad XLOff x Fructose 6 P QOff QOff XQOff 259_2 QOff x x AMP XLOff LOff Ribose 5 P XQuad LOff Quad Phosphat x x LOff 3PG XQuad x QOff Citrat CDP x x QOff Citrat XQOff x x CDP XQuad QOff x UDP
404. on und Howarth 1976 60 5 Ergebnisse und Diskussion durchgef hrt 266 281 Im Laufe der Versuche aus Abschnitt 5 3 wurden f r 16 Messsequenzen die acht verschiedenen Standardkonzentrationen der Kalibrierung mehrfach bestimmt drei bis siebenfach So konnte f r jede Standardkonzentration jeder Messsequenz ein Mittelwert mit Standardabweichung berechnet werden F r jede Standardkonzentration wurde der Median der Standardabweichungen aller Messsequenzen ermittelt Hierbei zeigte sich f r die meisten Metaboliten ein linearer Zusammenhang zwischen Konzentra tion und Standardabweichung Zur Veranschaulichung sind der Median der Standardabweichungen f r jede Konzentration ber die gemessene Konzentration in Abbildung 5 4 A f r die Metaboliten ATP und Pyruvat exemplarisch dargestellt Entsprechend sind in Abbildung 5 4 B die relativen Standardabweichungen ber die Konzentrationen aufgetragen Die Standardabweichungen zeigten eine relativ deutliche Abh ngigkeit von der Konzentration und dementsprechend resultierten relativ konstante Standardabweichungen f r die beiden Metaboliten Die in Abbildung 5 4 A gezeigten Ausgleichsgeraden entsprechen der linearen Regression zur Sch tzung der Standardabweichung 3 _14 59 45 225 APyruvat B 2 4 A Pyruvat S 2 105 x 2 Seah K 515 6 A ER 5 8 205 5 2 E E o_o 0 60 0 60 20 40 Konzentration uM
405. onzentrationen und basierend auf einem st chiometrischen metabolischen Netzwerk die intrazellul re Flussverteilung zum Teil errechnet werden 122 23 190 118 119 Rine Erweiterung dieser Art der Stoffwechselanalyse stellt die 3C Metabolische Stoffflussanalyse dar Durch die Bereitstellung eines isotopenmarkierten Substrates kann bei der Analyse von intrazellul ren Metaboliten auch im Fall von z B parallelen Stoffwechselwegen oder R ckreaktionen eine Flussverteilung ermittelt werden 7 118 1201 Ein gerade in k rzerer Vergangenheit stark wachsendes Forschungsfeld umfasst die Methoden Metabolic Profiling Metabolomics bzw Metabonomics W hrend bei Studien zum Metabolic Profiling die Bestimmung von einigen Stoffwechselprodukten im Vordergrund steht setzen sich die Arbeiten im Bereich des Metabolomics oder Metabonomics die Bestimmung aller in einem Organismus einem Gewebe oder einer K rperfl ssigkeit vorkommenden Metaboliten zum Ziel 7 126 Aus verschiedenen Gr nden wird eine Analyse des Metaboloms angestrebt Ein Einsatz zum Auffinden von Biomarkern als diagnostisches Werkzeug im Zusammenhang mit diversen Krankheiten ist m glich Auch f r toxikologische Studien oder Untersuchungen zur Wirksamkeit von Arzneimitteln wurden Metabolomanalysen eingesetzt 1211 Insbesondere bei Pflanzen 7 aber auch Prokaryonten 4 7 und Hefen 113841 wurden zahlreiche Studien ver ffentlicht wobei die Ziele unter anderem die Aufkl rung unbekannter Stoffwechse
406. onzentrationsverl ufe der Intermediate aus der Glykolyse f llt auf dass die ersten drei Metaboliten G6P F6P und F16bP ein sehr hnliches Muster aufwiesen unabh ngig 5 Ergebnisse und Diskussion 125 vom Medium W hrend F6P und F16bP nahezu vollst ndig synchron f r beide Medien verliefen schien bei G6P zwar in EpiSerf der zeitliche Verlauf gut mit den anderen beiden Hexosephosphaten bereinzustimmen allerdings war in GMEM Z das Konzentrationsmaximum deutlich verz gert Ob die extrazellul re Konzentration von Glucose als Ursache hierf r in Frage kommt konnte basierend auf diesen Ergebnissen nicht gekl rt werden Interessant ist dass die erheblichen Unterschiede der extrazellul ren Glucosekonzentration nur geringe Auswirkungen auf die intrazellul ren Konzentra tionen der ersten drei Glykolyseintermediate hatten Zwar schien ein Konzentrationsunterschied von F6P f r die beiden Medien zu existieren allerdings waren die Werte f r die einzelnen Kultivie rungen stark unterschiedlich weshalb hier nicht von Signifikanz ausgegangen werden kann Im Falle von F16bP waren die Konzentrationsunterschiede deutlicher Wie auch f r F6P liegt die Vermutung nahe dass hier ein Zusammenhang mit der extrazellul ren Glucosekonzentration bestand W hrend die beiden vorangehenden Metaboliten G6P und F6P gegen Ende f r beide Medien gleiche Konzentrationen zeigten lagen f r F16bP in GMEM Z bis zum Ende der Versuche die Werte deutlich ber denen
407. orliegenden Arbeit ganz deutliche Volumen nderungen der Zellen durchlaufen wurden erschien das Gesamtvolumen als sinnvollste Bezugsgr e Abschlie end ist zu bemerken dass sich diese hier etablierte Methode zur Konzentrationsmessung intrazellul rer Stoffwechselprodukte als robust und gut reproduzierbar erwies und dar ber hinaus 5 Ergebnisse und Diskussion 99 sehr gut charakterisiert werden konnte allerdings traten im weiteren Verlauf der hier vorliegenden Arbeit gelegentlich nicht zu erkl rende Schwankungen der Messwerte vermeintlich gleicher Proben auf Dies zeigte sich unter anderem in den Konzentrationsverl ufen der folgenden Abschnitte dieser Arbeit Als genereller Grund f r diese Schwankungen wird vor allem eine zuf llige biologische und experimentelle Variabilit t verantwortlich gemacht Dies bedeutet z B dass normalerweise ein nahezu identisches Wachstumsverhalten von Zellen in Sechs Well Platten vorgefunden wurde dennoch gab es auch Ausnahmen wobei kein vollst ndiger Bewuchs von Wells auftrat Diverse experimentelle aber auch materialtechnische Probleme k nnen hierf r ein Grund gewesen sein So wurde z B ein in der hier durchgef hrten Arbeit aufgetretenes Wachstumsproblem vom Hersteller als Fertigungsfehler der entsprechenden Sechs Well Platten Charge best tigt Auch die oben erw hnte Absch tzung des Zellvolumens ist mitunter fehlerbehaftet und gerade niedrige Zellzahlen pro Well zu Beginn einer Kultivierung k
408. ors Abschnitt 0 wurde die Kalibrierungsstrategie im Lauf der Arbeit modifiziert um den Bedingungen der MS Detektion gerecht zu werden So wurde f r die meisten Metaboliten welche mit dem MS Detektor quantifiziert werden sollten eine gewichtete Regression der Form 1 Konzentration zur Kalibrierung verwendet 19 231 Eine Beschreibung der Vorgehensweise ist in Abschnitt 0 gegeben Die chromatographischen Messungen mit der Chromatographieanlage DX600 wurden durchgef hrt wie hier kurz beschrieben Die chromatographische Trennung erfolgte auf einer Vors ule CarboPac PA 100G 2 x 50 mm und einer analytischen S ule CarboPac PA 100 2 x 250 mm bei 30 C Die Gradientenpumpe DX GS50 wurde mit einem Fluss von 0 25 mL min betrieben Das Injektionsvolumen betrug 20 uL und die Proben wurden mit einem Autosampler des Typs DX AS50 bei 4 C injiziert S mtliche Eluenten wurden mit Milli Q Wasser angesetzt Vakuum filtriert und anschlie end weitere 5 min entgast Detektiert wurde nach dem Prinzip der gepulsten amperometrischen Detektion mit einem Ger t des Typs DX ED50 mit einer Gold Arbeitselektrode und einer Ag AgCl Referenz Elektrode 4 4 Probenvorbereitung zur Bestimmung intrazellularer Metaboliten Wie bereits oben beschrieben wurde die Probenvorbereitung f r die Messung von intrazellul ren Stoffwechselprodukten in dieser Arbeit genauer untersucht und optimiert Verschiedenste Methoden kamen im Laufe von Vorversuchen zum Einsatz die
409. osse o r oo o oo 0 20 0 36 00 0 00 0 00 0 01 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 omg 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 cis Aconitat 0 00 0 77 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 200 0 00 o 00 1 00 1 00 0 00 0020010001000 000 Isocitrat 9 00 0 01 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 000 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 a Ketoglutarat 000 0 12 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 01 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 000 0 00 0 00 2 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 57 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 90 0 00 o 00 0 00 0 00 0 06 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 02 Krebszyklus 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 49 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 Mallat 0 00 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 63 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00
410. ours and separation of carboxylic acids by ion exchange chromatography Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 717 27 38 160 Koswig S Hofsommer H J Wei J Jensen D 1997 Spurenanalytische Bestimmung von Ionen Kettrup A editor Landsberg Ecomed 9 p 161 Qiu JS Jin XH 2002 Development and optimization of organic acid analysis in tobacco with ion chromatography and suppressed conductivity detection Journal of Chromatography A 950 1 2 81 88 162 Liu Y Srinivasan K Pohl C Avdalovic N 2004 Recent developments in electrolytic devices for ion chromatography Journal of Biochemical and Biophysical Methods 60 3 205 232 163 Polta JA Johnson DC 1983 The Direct Electrochemical Detection of Amino Acids at a Platinum Electrode in an Alkaline Chromatographic Effluent Journal of Liquid Chromatography 6 10 1727 1743 164 Austin Harrison DS Johnson DC 1989 Pulsed Amperometric Detection Based on Direct and Indirect Anodic Reactions a Review Electroanalysis 1 3 189 197 165 Ozkan SA 2007 LC with electrochemical detection recent application to pharmaceuticals and biological fluids Chromatographia 66 S3 S13 166 Jandik P Cheng J Avdalovic N 2004 Analysis of amino acid carbohydrate mixtures by anion exchange chromatography and integrated pulsed amperometric detection Journal of Biochemical and Biophysical Methods 60 3 191 203 167 Clarke AP Jandik P Rocklin RD Liu Y Avda
411. pipettiert die Platten wurden kurz gesch ttelt und anschlie end wurde die Fl ssigkeit in Probengef e berf hrt 4 4 2 Optimierung entsprechend eines fraktionellen faktoriellen Versuchsplans Dieser Versuchsplan wurde gew hlt da sich ein fraktionelles faktorielles Versuchsdesign besonders gut eignet eine gro e Anzahl an m glichen Einflussgr en bei berschaubarem Aufwand zu untersuchen Es wurde f r die beiden Methoden MeOH Kochen und MeOH CHC je eine unabh ngige Optimierung durchgef hrt Grundlagen f r die Auswahl dieser beiden Methoden waren einerseits die Ergebnisse der Untersuchung g ngiger Extraktionsmethoden s 5 2 1 andererseits wurden die analytischen Grundvoraussetzungen z B Anwendbarkeit in Kombination mit der AAC wie auch Erkenntnisse aus weiteren nicht gezeigten Vorversuchen ber cksichtigt Das experimentelle Design und die Auswertung dieser Experimente wurde mit dem Programm JMPin Version 4 0 3 SAS Institut durchgef hrt Es wurden 2 Level fraktionelle faktorielle Versuchspl ne gew hlt Die Auswahl der Niveaus wurde in dieser Arbeit anhand vorangegangener Experimente getroffen F r diese Experimente wurden vier verschiedene Zielgr en untersucht der Nukleotidgehalt die Energy Charge der Fructose 1 6 Bisphopshat Gehalt und die Absorption bei 280 nm Eine detaillierte Erkl rung ist in Abschnitt 5 2 2 1 gegeben Eine Optimierung wurde mit Desirability Funktionen wie in Abschnitt 3 5 5 beschrie
412. r te Betrag f r r innerhalb des erlaubten Zeitversatzes gesucht wurde Die Werte f r bewegen sich somit zwischen 10 und 10h Bei den Werten f r r und handelt es sich jeweils um die Mittelwerte der verschiedenen Kultivierungen 4x GMEM Z 3x EpiSerf 1x EpiSerf 2mM Pyruvat 4x DMEM mit unterschiedlichen Konzentrationen Glucose Pyruvat und Glutamin W hrend die Korrelationskoeffizienten r in den beiden H lften oberhalb und unterhalb der Diagonalen von links oben nach rechts unten gespiegelt sind sind die Werte f r den Zeitversatz aus einer der beiden H lften mit 1 zu multiplizieren um eine Spiegelung zu erreichen zur Interpretation der Zeitverschiebung wird die auf der y Achse aufgetragene Variable fixiert und die auf der x Achse aufgetragenen Variable um den Wert f r in dem jeweiligen Feld auf der Zeitachse verschoben um die maximale Korrelation zu erreichen Da in der Diagonalen von links oben nach rechts unten die Korrelation jeder Variablen mit sich selbst aufgef hrt ist sind hier alle Felder mit maximaler blauer S ttigung gef rbt und enthalten einen Wert f r 0 als zeitlichen Versarz Grunds tzlich berwiegen auch in dieser Abbildung die positiven Korrelationen Ein Gro teil der intrazellul ren Metaboliten war positiv miteinander korreliert wenn auch nur schwach Die 5 Ergebnisse und Diskussion 107 weiteren Variablen wie z B Zellzahl oder extrazellul re Metabolitkonzentrationen gruppierten sich
413. r zu w hlen F r einen Gl ttungsfaktor 5 mit gro em Wert wird eine gro e Abweichung zwischen den gemessenen und den gegl tteten Werte zugelassen was einer starken Gl ttung der Daten entspricht W hlt man einen kleinen Wert f r S wird entsprechend weniger gegl ttet und die Splines werden durch die Messwerte gezwungen Auf diesen Berechnungen basierend wurden Splines an die Daten der verschiedenen Messungen angepasst Dazu wurde die von Wahl 2007 programmierte Benutzeroberfl che verwendet 28 Die Auswahl von 5 erfolgte durch optische berpr fung der Anpassung und wurde f r jeden Metaboliten und jedes Experiment separat durchgef hrt F r einige Variablen wurden keine Splines zur Interpolation verwendet sondern es wurden mit der Software Origin 8 SRI Origin Lab Corporation sigmoide Boltzmann Funktionen entsprechend der Gleichung 4 1 an die Daten angepasst T 14 e077 dx 4 1 Hierbei ist A der Anfangswert der Endwert ist der Zentrumswert und dx ist eine Zeitkonstante Diese N herung wurde grunds tzlich f r die Interpolation der Zellzahl und des Zellvolumens verwendet In einigen F llen wurden auch die Verl ufe von extrazellul ren Metaboliten durch ein Boltzmann Sigmoid interpoliert Ein Minimum von 100 quidistanten Konzentrationswerten wurde auf den Splines bzw der Funktion des Boltzmann Sigmoides basierend generiert Diese dienten als Grundlage f r die Kreuzkorrelationsanalyse
414. r Stoffwechselintermediaten im Organismus dar Dies bedeutet dass eine Probennahme ebenfalls sehr schnell stattfinden muss und anschlie end s mtliche Stoffwechselaktivit ten schlagartig unterbunden werden m ssen Nur so k nnen artifizielle intrazellul re Metabolitkonzentrationen vermieden werden Die n chste erhebliche Schwierigkeit bei der Probenvorbereitung ist die Extraktion der Metaboliten aus dem Organismus Da kein Standard zum intrazellul ren Raum zugegeben werden kann ist es nicht m glich zu berpr fen ob das Herausl sen der Metaboliten aus den Zellen durch die Probenvorbereitung vollst ndig erfolgte Somit kann nur basierend auf einem Vergleich von verschiedenen Methoden beurteilt werden welche tats chliche Konzentration wahrscheinlich vorliegt 1 Einleitung 5 Eine weitere Herausforderung bei der Bestimmung von intrazellul ren Metabolitkonzentrationen ist die h chstwahrscheinlich inhomogene Verteilung der Metaboliten im Zellinneren Zwar kann durch aufwendige Methoden eine Unterscheidung zwischen der Konzentration im Cytosol und dem Mitochondrien unterschieden werden aber weitere Kompartimente existieren und dar ber hinaus besteht die M glichkeit dass selbst im Cytosol Konzentrationsgradienten vorliegen Unabh ngig von den hier beschriebenen Schwierigkeiten existieren in der Literatur unz hlige verschiedene Methoden zur Probenvorbereitung f r eine Messung intrazellul rer Metaboliten in kultivierten tierischen
415. r chtliche Menge an Glutamat bei den Kultivierungen in EpiSerf verbraucht wurde ist in Tabelle 5 6 auch das Verh ltnis von Ammonium zu Glutamin x 2 und Glutamat gezeigt Theoretisch kann hier ein maximaler Wert von 1 erreicht werden f r den Fall dass nur die beiden aufgef hrten Aminos uren abgebaut werden und dabei der komplette Stickstoff in Form von Ammonium freigesetzt wird Bei Ber cksichtigung der Verdunstung f r dieses Verh ltnis ergeben sich Werte von 0 40 GMEM Z und 0 71 EpiSerf Auch diese Werte sind relativ hoch verglichen mit Werten aus der Literatur f r MDCK Zellen H 48 781 was auf eine hohe Desaminierungsaktivit t in MDCK Zellen unter den untersuchten Bedingungen hindeutet Zu erw hnen ist hier allerdings dass die thermisch bedingte rein chemische Abspaltung von Ammo nium von Glutamin vernachl ssigt wurde Konzentrationsverl ufe intrazellul rer Metaboliten Glykolyse Als erstes intrazellul res Zwischenprodukt der Glykolyse wurde G6P in seinem Konzentrations verlauf verfolgt s Abbildung 5 19 Im Gegensatz zu den extrazellul ren Metaboliten zeigte sich dass die intrazellul r gemessenen Werte einen deutlich gr eren Schwankungsbereich aufwiesen Grunds tzlich waren dennoch klare Tendenzen zu erkennen F r beide Medien war zu Beginn der Kultivierung ein deutlicher kurzer Anstieg der intrazellul ren Konzentration zu erkennen wobei 120 5 Ergebnisse und Diskussion nach ca 24h GMEM Z
416. r Anode zu Protonen und Sauerstoff zersetzt und an der Kathode zu Hydroxidionen und Wasserstoff gespalten Auf ihrem Weg durch den Kationenaustauscher verdr ngen die Protonen die Kationen des Austauschers und diese Kationen verbinden sich anschlie end an der Anode mit den Hydroxidionen zu einer Lauge ber die angelegte Spannung l sst sich letztlich die Konzentration der Lauge einstellen 22 3 Theoretische Grundlagen 3 3 2 Fl ssigchromatographie im Bereich Metabolic Profiling In den letzten Jahren kamen Methoden der Fl ssigchromatographie beim Metabolic Profiling h ufig zum Einsatz Dabei wurden besonders zwei Ziele verfolgt Zum einen sollten intrazellul re Nukleotide bestimmt werden um z B regulatorische Einfl sse dieser Metaboliten auf zellul re Vorg nge zu ermitteln Zum anderen waren die Zwischenprodukte der Glykolyse oder des Krebszyklus im Fokus der Analysen F r zahlreiche Organismen und Zust nde wurde die Zusammensetzung der Nukleotidpools charakterisiert s z B 1 Einige k rzlich ver ffentliche Arbeiten befassten sich mit CHO Zellen um Carcinoma Zellen 172 173 174 verschiedenen normalen oder Tumor Zelllinien oder auch mit Epithelzellen 751 Als Erweiterung der Analyse von Nukleotiden wurden gelegentlich zus tzlich Zuckernukleotide mit erfasst Gerade f r tierische Zellen sind diese Metaboliten von Bedeutung als Vorl ufer f r die Glykosylierung von Proteinen Mit unterschiedlichen Methoden und f r
417. r Einflussgr e Dieser Effekt wird auch Haupteffekt genannt Berechnet wird der Haupteffekt durch Summenbildung der Werte der Zielgr en bei dem hohen Level und ebenso bei dem niedrigen Level und anschlie ender Differenzbildung dieser beiden Summen So wird f r dieses Beispiel der Effekt von Faktor A berechnet nach A ab a b 3 1 Hierbei entspricht A dem Effekt von Faktor A n ist die Anzahl der Wiederholungen bei diesen Einstellungen 1 a b ab stehen f r die Summe der Werte der Zielgr e aller Wiederholungen bei den jeweiligen Einstellungen s Abbildung 3 4 Durch den Faktor wird ber cksichtigt dass der Mittelwert f r zwei Niveaus des anderen Faktors berechnet wird Eine entsprechende Gleichung gilt f r den Faktor F r die Berechnung des Durchschnittswerts wird den Pluszeichen entsprechend die Summe aller Einzelwerte gebildet und anschlie end durch vier Anzahl der Versuche geteilt Gelegentlich zeigen sich aber unterschiedliche Effekte auf die Zielgr e in Abh ngigkeit von anderen Faktoren In solch einem Fall spricht man von Interaktionseffekten Der Effekt der Interaktion AB berechnet sich wie in 3 2 gezeigt Aba ab 1 a b 3 2 2 Diese Berechnung ergibt sich aus der Summenbildung der Werte der Zielgr e f r die in Abbildung 3 4 A diagonal gegen berliegenden Experimente und anschlie ender Differenzbildung In den Gleichungen 3 1 und 3 2 sind die in den Klammern aufgef hrten Berechnung
418. r Hybridoma Zellen wurden f r Malat Werte von etwa 4 5 fmol Zelle und Fumarat 0 7 fmol Zelle ermittelt 8 Diese Werte liegen im selben Bereich wie die in dieser Arbeit bestimmten Metabolitwerte W hrend die von Hofmann et al 20 bestimmten Mengen f r organische S uren und Zuckerphosphate f r HepG2 Zellen durchwegs h her lagen als die in der hier vorliegenden Arbeit waren die Metabolitgehalte f r einige Zuckerphosphate und Nukleotide wie sie f r HeLa Zellen ermittelt wurden in einem hnlichen Wertebereich 8 Die Werte f r die Energy Charge f r MDCK Zellen und Vero Zellen wie sie in der hier vorliegenden Arbeit bestimmt wurden waren ber 0 86 Diese Werte f r das Verh ltnis der Adeninnukleotide stimmten gut mit der Literatur berein auch wenn eine gr ere Bandbreite an Werten ca 0 40 0 99 f r typische Kultivierungsbedingungen zu finden ist 115 120 177 178 235 281 312 In einigen der hier genannten Arbeiten wurden die Auswirkungen von verschiedenen Medien bzw Medienzusammensetzungen auf die Nukleotidpools berpr ft Barnabe und Butler konnten f r Hybridoma Zellen eine positive Korrelation zwischen der Glucosekonzentration des Mediums und der Energy Charge zeigen 231 Kochanowski et al verglichen zwei Medien auf ihre Einfl sse auf die Glykosylierung von Interferon wobei zus tzlich ein Zusammenhang zur Energy Charge untersucht wurde 1 F r die beiden unterschiedlichen Medien wurden auch deutlich von einander abwei
419. r MDCK Zellen werden diese Transporter beschrieben Symportprozess Na beim Import der Glucose f r manche Zelllinien vor 9 Typischerweise ist der Transportprozess der Glucose in die Zelle aber nicht der limitierende Prozess fiir die Glykolyserate 0 5 591 Nach dem Transport der Glucose in die Zelle findet die Phosphorylierung zu G6P durch das Enzym Hexokinase Enzyme Commission EC Nummer 2 7 1 1 statt wobei Adenosintriphosphat ATP zu Adenosindiphosphat ADP umgesetzt wird Fiir viele Zelllinien weist diese Enzymreaktion eine niedrige Aktivit t auf und stellt somit einen der limitierenden bzw regulierten Schritte der Glykolyse dar Hi 5 59 65 67 Dieses Enzym scheint bei kontinuierlichen Zelllinien eine wichtigere Rolle bei der Regulation der Glykolyse zu spielen als f r Prim rkulturen DT Die Regulation dieses Enzyms auf metabolischer Ebene findet durch eine R ckkopplungshemmung durch das Produkt G6P statt Insbesondere eine an Mitochondrien gebundene Variante der Hexokinase scheint bei Tumorzelllinien und auch anderen kontinuierlichen Zellen eine wichtige Rolle zu spielen Der darauf folgende Reaktionsschritt der Glykolyse ist die Isomerisierung von G6P zu F6P durch das Enzym Glucosephosphat Isomerase EC 5 3 1 9 Dieses Enzym wurde allgemein als sehr aktiv und die Reaktion als reversibel beobachtet Sowohl G6P als auch F6P spielen eine wichtige Rolle f r die Glykosylierung von Proteinen da diese Metaboliten als Vorl ufer von
420. r Sechs Well Platte Fehlerbalken deuten den Standardfehler des Mittelwertes an Die Zahlen unter den Buchstaben repr sentieren den Mittelwert aus allen drei Experimenten Das beste Ergebnis h chster Wert f r die ATP Menge wurde f r die Methode Zelllyse ermittelt Des Weiteren erwiesen sich die Methoden MeOH Kochen J und MeOH CHC 1 als geeignete Methoden um ATP zu extrahieren Die gr ten Schwankungen zwischen den drei Experimenten f r diese Messgr e traten bei den Methoden PCS A und Ameisens ure E auf was eventuell Probleme der Robustheit dieser Methoden andeutet Diese Ergebnisse zeigen dass es unterschiedliche Methoden gibt die die beiden Ziele des Experiments niedrige Absorption 280 nm und hoher Wert f r ATP nahezu quivalent erreichen k nnen 5 2 2 Optimierung zwei unabh ngiger Extraktionsmethoden F r den weiteren Verlauf der Arbeit war es wichtig dass die Extraktionsmethode mit der Analyse mittels AAC kombiniert werden kann Dies bedeutete dass die Methode PCS aufgrund der Restlast an Perchlorionen nach der Neutralisierung nicht nutzbar war Somit wurden die Methoden MeOH Kochen J und MeOH CHC I da sie die besten Ergebnisse im vorangegangenen Experiment lieferten und kombinierbar mit der AAC sind im weiteren Verlauf genauer untersucht Diese zwei verschiedene Methoden zur Probenvorbereitung wurden optimiert um sowohl m gliche qualitative und qua
421. r anderem auf die unterschiedlichen Anfangskonzentrationen der Hauptsubstrate Glucose Glutamin und Glutamat zur ckzuf hren Des 118 5 Ergebnisse und Diskussion Weiteren lagen die Konzentrationen der meisten weiteren Aminos uren in EpiSerf deutlich h her als in GMEM Z nicht gezeigt wovon der Stoffwechsel h chstwahrscheinlich auch beeinflusst war Die Verl ufe der extrazellul ren Metabolitkonzentrationen erwiesen sich als relativ gut reproduzierbar wie die drei unabh ngigen Experimente zeigten Die Ursache f r die Unterschiede der Konzentrationsverl ufe von Glucose und Lactat zwischen den einzelnen Versuchen bei gleichem Medium waren h chstwahrscheinlich bedingt durch die biologische Variabilit t die sich z auch in den nicht identischen Zellzahlen widerspiegelte Die Verl ufe von Glutamin und Glutamat waren im jeweils gleichen Medium qualitativ sehr hnlich Allerdings wurden zum Teil deutliche Unterschiede in der Startkonzentration gemessen die bis zum Ende der Kultivierungen bestehen blieben Als Ursache wird hier ein systematischer Messfehler vermutet der durch eine nicht konstante Arbeitsweise der Enzymmembranen des Ger tes Bioprofile verursacht worden sein k nnte Nichtsdestotrotz wurde davon ausgegangen dass durch die gemeinsame Gl ttung und Interpolation der drei Datens tze anhand der Boltzmann Funktion bzw des Splines ein relativ guter repr sentativer Verlauf der Daten wiedergegeben wurde Durch die unters
422. r hier vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnissen berein Von einer tiefergehenden Interpretation der Konzentrationsverl ufe der gezeigten organischen S uren wird hier abgesehen da im Gegensatz zu den Zwischenprodukten der Glykolyse bei den Intermediaten des Krebszyklus eine sehr hohe Vernetzung mit anderen Stoffwechselwegen vorliegt Allerdings geben die gezeigten Ergebnisse einen Aufschluss ber das grunds tzliche Verhalten der Metabolitkonzentrationen und durch die Kreuzkorrelationsanalyse konnten generelle Zusammen h nge zwischen Metaboliten aufgekl rt werden Zum Teil sehr hnliche Verl ufe insbesondere f r Glykolyse und Krebszyklusintermediate wurden f r die Konzentrationen intrazellul rer Metabo liten in Hefen nach einem Glucosepuls gemessen 114 2121 Ein interessanter Aspekt aus den gezeigten Kurzzeitexperimenten ist dass die Versuche zur Erzeugung des Limitationszustandes Abschnitt 5 3 4 1 und der Zugabe von Medium nach einem Limitationszustand Abschnitt 5 3 4 2 ein sehr hnliches Korrelationsmuster aufwiesen s Abbildung 5 30 und Abbildung 5 33 Eine Hypothese hierzu w re dass das Prinzip dieser Regulation auf metabolischer Ebene f r diese beiden Versuchsszenarien identisch war Dies w rde bedeuten dass es sich hier um eine schnelle reversible und von den Versuchsbedingungen unab h ngige Regulation handelt und durch die zweist ndige Limitationsphase keine neuen Regulations mechanismen ma geblich beteil
423. raddock PSH Brindle KM 1993 A H 1 N 15 NMR Study of Nitrogen Metabolism in Cultured Mammalian Cells Biochemical Journal 291 485 492 McDermott RH Butler M 1993 Uptake of glutamate not glutamine synthetase regulates adaptation of mammalian cells to glutamine free medium Journal of Cell Science 104 Pt 1 51 58 Imamura T Crespi CL Thilly WG Brunengraber H 1982 Fructose as a Carbohydrate Source Yields Stable Ph and Redox Parameters in Microcarrier Cell Culture Analytical Biochemistry 124 2 353 358 Butler M Imamura T Thomas J Thilly WG 1983 High Yields from Microcarrier Cultures by Medium Perfusion Journal of Cell Science 61 351 363 Reitzer LJ Wice BM Kennell D 1980 The Pentose Cycle Control and Essential Function in Hela Cell Nucleic Acid Synthesis Journal of Biological Chemistry 255 12 5616 5626 Zielke HR Sumbilla CM Sevdalian DA Hawkins RL Ozand PT 1980 Lactate a major product of glutamine metabolism by human diploid fibroblasts Journal of Cellular Physiology 104 3 433 441 Miller WM Wilke CR Blanch HW 1989 The transient responses of hybridoma cells to nutrient additions in continuous culture II Glutamine pulse and step changes Biotechnology and Bioengineering 33 4 487 499 Miller WM Wilke CR Blanch HW 1989 Transient responses of hybridoma cells to nutrient additions in continuous culture I Glucose pulse and step changes Biotechnology and Bioengineering 33 4 477 486 Ljunggren J H ggstr m L
424. rahiert zu welchen vor Beginn der Extraktion Standard zugegeben wurde wodurch hierf r ebenfalls die Wiederfindung der Metaboliten bestimmt werden konnte 5 2 3 1 Wiederfindung zugegebener Metaboliten zu Proben ohne Zellen Um Verluste zu quantifizieren die durch rein chemisch physikalische Ursachen w hrend der Extraktionsvorg nge auftreten wurden zwei unabh ngige Experimente durchgef hrt Jeweils drei Wells f r jede Methode und jede Standardmenge 30 uL und 70 uL Konzentrationen s Tabelle 78 5 Ergebnisse und Diskussion 5 4 erste Spalte Werte in Klammern wurden hierf r verwendet F r den Gro teil der Metaboliten wurde unabh ngig von der Methode oder der Menge an zugegebenem Standard eine Wiederfindung von 100 erreicht So lag bei Proben ohne Zellen f r die Methode MeOH CHC die durchschnittliche Wiederfindung bei 100 6 7 2 f r 30 uL Standardzugabe und 98 6 3 9 f r 70 uL Standardzugabe Daten nicht gezeigt F r die Methode MeOH Kochen waren die entsprechenden Werte bei 98 4 7 0 und 94 7 5 6 Daten nicht gezeigt Grunds tzlich zeigten diese Ergebnisse dass nur minimale physikalische oder chemische Verluste bei der Extraktion mit den beiden optimierten Methoden auftraten 5 2 3 2 Extraktion der Metaboliten aus Zellen F r diesen Versuch wurden Metaboliten von zwei unterschiedlichen Zelltypen MDCK und Vero aus Sechs Well Platten extrahiert MDCK Zellen wurden mit einer Zelldichte von 0 67 x 10
425. raphy electrospray mass spectrometry Rapid Communications in Mass Spectrometry 17 3 202 206 204 Taylor PJ 2005 Matrix effects The Achilles heel of quantitative high performance liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry Clinical Biochemistry 38 4 328 334 205 Tang L Kebarle P 1993 Dependence of Ion Intensity in Electrospray Mass Spectrometry on the Concentration of the Analytes in the Electrosprayed Solution Analytical Chemistry 65 24 3654 3668 206 Bottcher C Roepenack Lahaye EV Willscher E Scheel D Clemens S 2007 Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time of flight mass spectrometry Analytical Chemistry 79 4 1507 1513 207 Avery MJ 2003 Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods Rapid Communications in Mass Spectrometry 17 3 197 201 208 Tweeddale H Notley McRobb L Ferenci T 1998 Effect of slow growth on metabolism of Escherichia coli as revealed by global metabolite pool Metabolome analysis Journal of Bacteriology 180 19 5109 5116 209 Castrillo JI Hayes A Mohammed S Gaskell SJ Oliver SG 2003 An optimized protocol for metabolome analysis in yeast using direct infusion electrospray mass spectrometry Phytochemistry 62 6 929 937 210 de Koning W van Dam K 1992 A method for the
426. rategien befassten sich mit einer Medienoptimierung 1 77 78 106 1071 Ty j ngerer Vergangenheit wurden molekularbiologische Methoden verwendet um eine 62 108 111 Verbesserung des Stoffwechsels zu erreichen So wurde z B der Zuckertransport optimiert 6 oder die Pyruvat Carboxylase erfolgreich 1110 1111 Grunds tzlich ist bei der Optimierung des zellul ren Metabolismus ein empirisches Experimen tieren m glich allerdings ist biochemisches und molekularbiologisches Wissen f r ein gezieltes Vorgehen hilfreich Grundlage hierf r ist die genaue Untersuchung und Charakterisierung des Stoffwechsels der genutzten Zelllinie 3 2 M glichkeiten zur experimentellen Untersuchung des Zentralstoffwechsels Die in den vorangegangenen Abschnitten beschriebenen Kenntnisse zum Zentralstoffwechsel von kultivierten tierischen Zellen wurden durch unterschiedlichste Methoden gewonnen Zahlreiche fr he Versuche wurden mit Zellextrakten oder Gewebeextrakten durchgef hrt Auf diese Weise wurden viele zentrale Stoffwechselwege aufgekl rt und Stoffwechselintermediate identifiziert In vielen Experimenten mit kultivierten tierischen Zellen wurden radioaktive Substrate eingesetzt und die Radioaktivit t in den unterschiedlichen Stoffwechselprodukten bzw Endprodukten verfolgt z 168 73 86 81 Ein weiterer essentieller Bestandteil der Aufkl rung des Stoffwechsels von kultivierten tierischen Zellen wurde durch
427. raten nach Limitation 161 5 3 5 Diskussion der intrazellul ren Metabolitkonzentrationen f r MDCK und Vero Zellen im Kontext der E 166 5 3 6 Zusammenfassung der Untersuchungen intrazellul rer Metabolitkonzentrationen 170 Zusammenfassung Ausblick Abk rzungen 2PG 3PG AAC ACN ADP AMP ANOVA Asn Asp ATP cAco cAMP CDP CE CHC CHO Citr 2 Phosphoglycerat 3 Phosphoglycerat Anionen Austausch Chromatographie Acetonitril Adenosindiphosphat Adenosinmonophosphat Varianzanalyse Asparagin Aspartat Adenosintriphosphat cis Aconitat Cyclisches Adenosinmonophosphat Cytidindiphosphat Kapillarelektrophorese Chloroform Chinese Hamster Ovary Citrat Correlation Metric Construction Cytidinmonophosphat Coenzym A Cytidintriphosphat Cystein Desoxyadenosintriphosphat Desoxycytidintriphosphat Desoxyguanosintriphosphat Dihydroxyaceton Phosphat Dulbecco s Modified Eagle s Medium Desoxythymidintriphosphat Erythrose 4 Phosphat Enzyme Commission European collection of animal cell cultures Elektrospray Ionisierung Ethanol Fructose 1 6 Bisphosphat Fructose 1 Phosphat Fructose 6 Phosphat Flavin Adenin Dinukleotid F tales K lberserum Fumarat Glucose 1 Phosphat Glucose 6 Phosphat Glycerinaldehyd 3 Phosphat Guanosindiphosphat Glucose Glutamin Glutamat Glasgow Minimum Essential Medium Guanosinmonophosphat Guanosintriphospha
428. ration bis 90 h auf 45 uM zu verzeichnen wobei hier im weiteren Verlauf deutliche Schwankungen der Werte zu verzeichnen waren Einen sehr hnlichen Verlauf wie Fumarat zeigte die Konzentration von Malat allerdings waren die Werte deutlich h her Im Maximum bei ca 46 h lagen die Werte bei ca 900 uM f r beide Medien Nach dem Abfall der Konzentrationen waren die Werte etwa 400 uM GMEM Z bzw 200 uM EpiSerf Konzentrationsverl ufe intrazellul rer Metaboliten Nukleotide Neben den Metaboliten des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels Glykolyse Krebszyklus k nnen durch die oben beschriebene Analysemethode auch diverse Nukleotide und Zuckernukleotide bestimmt werden Abbildung 5 20 zeigt die Verl ufe einiger ausgew hlter Metaboliten und der Energy Charge Konz ATP mM Konz CTP mM Energy Charge Oe P Konz ADP mM gt Konz UDP GicNAc mM gt a Konz UDP Gic mM 0 48 96 144 192 0 48 96 144 192 Kultivierungszeit h Abbildung 5 20 Verl ufe der intrazellul ren Konzentrationen ausgew hlter Nukleotide und der Energy Charge bei Kultivierung von MDCK Zellen in GMEM Z schwarz und EpiSerf rot Drei unabh ngige Experimente wurden in Sechs Well Platten durchgef hrt verschiedene Symbole s Abbildung 5 18 F r eine weitere detaillierte Erkl rung sei auf Abbildung 5 19 verwiesen Die Konzentration von
429. razellul ren Metaboliten die Standardabweichungen dar wie sie mit der in diesem Kapitel bestimmten Gleichung gesch tzt wurden 5 Ergebnisse und Diskussion 85 5 2 6 Bestimmung der Metabolitkonzentrationen durch Absch tzung des Zellvolumens Im bisherigen Verlauf der Arbeit wurde grunds tzlich die Metabolitkonzentration in Wells von Sechs Well Platten bestimmt Unter Bedingungen in denen sich die Zellzahl im Well w hrend des Versuchsverlaufs nicht ndert kann man aus diesen Konzentrationen aussagekr ftige Informationen erhalten F r Bedingungen unter denen Zellwachstum oder eine Reduktion der Zellzahl stattfindet z B Infektion mit Virus ist zur Ermittlung von nderungen zellspezifischer Metabolitmengen oder konzentrationen eine Bezugsgr e erforderlich Typischerweise bietet sich hier die Zellzahl der Probe als Bezugsgr e an Die Bestimmung der Anzahl der Zellen die extrahiert wurden ist mit dem oben etablierten Extraktionsprotokoll nicht m glich da die Probevorbereitung mit adh renten Zellen durchgef hrt wird In der hier vorliegenden Arbeit wurde allerdings davon ausgegangen dass unter identischen Bedingungen der Zelleinsaat von Sechs Well Platten auch identische Zellzahlverl ufe auftraten d h dass alle Wells zum gleichen Zeitpunkt w hrend einer Kultivierung auch gleiche Zellzahlen enthielten Somit wurde die Zellzahl zu einem Zeitpunkt einer Kultivierung bestimmt indem drei parallel angesetzte Wells trypsiniert
430. rbarkeit Vorz ge bieten gt Il F r diese Prozesse kommen vor allem MDCK H gt 1161 Vero 7 und PER C6 Zellen zum Einsatz Der Upstream Prozess eines typischen Herstellungsprozesses von Influenza Impfstoffen mittels MDCK Zellkulturen umfasst zwei Phasen In den ersten 72 96 h findet das Zellwachstum statt Anschlie end wird die Kultur mit aktivem Virus infiziert so dass in den folgenden 48 96 h die Replikation des Virus stattfindet Ebenso findet die Virusproduktion mit anderen Zelllinien meist zweiphasig statt 7 181 Unabh ngig von der vergleichsweise langen Geschichte der Impfstoffherstellung in tierischen Zellen sind die Produktivit ten bei diesen Prozessen in der Regel deutlich niedriger als f r Herstellungsprozesse von vielen Antik rpern oder rekombinanten Proteinen Ein Grund hierf r ist dass deutlich mehr Forschungsarbeit in den Herstellungsprozess von Glykoproteinen investiert wurde als f r die Impfstoffproduktion Eine weitere Ursache k nnte sein dass der intrazellul re Replikationsprozess von Viren deutlich komplexer ist als die Expression von Proteinen Aus diesem Grund wird von der Arbeitsgruppe Bioprozesstechnik am Max Planck Institut in Magdeburg seit einigen Jahren intensiv an einer genaueren Aufkl rung der relevanten biologischen und verfahrenstechnischen Parameter f r die auf Zellkultur basierenden Influenza Impfstoff Produktion geforscht Eines der Arbeitsgebiete befasst sich mit dem Sto
431. rch Das so entstehende Wasser ist neutral und erzeugt kein Signal am Leitf higkeitsdetektor Der Eluentgenerator dient zur Herstellung des KOH Eluents mittels deionisiertem Wasser zum Zeitpunkt des Gebrauchs Die EluGen KOH Kartusche bestehet aus einer Kammer zur Erzeugung der KOH Konzentrationen und einem K Ionenreservoir Zur Herstellung der KOH wird deionisiertes Wasser durch die Kammer gepumpt Durch den angewandten Strom an der Kammer finden elektrolytischen Prozesse statt die zur Erzeugung der Konzentrationen von KOH f hren Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 1 1 Weitere Materialien Probenfl schchen 1 5ml Vials mit Drehverschluss und perforierten Septen 50 ml Plastikspritze dest Wasser Milliporeanlage Gradient MeOH f r Cone Wash bei MS Betrieb 2 DX 320 Anlage einschalten 2 1 Falls die Anlage lange Zeit au er Betrieb war e Computer hochfahren Name cmsrvbio Kennwort chrom212 e Abwarten bis das Netlog script sich ge ffnet hat gt auf ok klicken e Falls MS Detektor benutzt wird kann XCalibur gestartet werden Doppelklick auf Symbol Diagnose erweitertes Men mit zus tzlichen Informationen gt Empfehlung auf der rechten Seite des Bildschirms Es erscheint ein gelber Punkt im task bar rechts unten der bei Doppelklick XCalibur ffnen l sst e Auf dem Bildschirm Chromeleonserver Symbol rechts unten in Taskleiste durch Doppelklick starten e Dann
432. rd Voraussetzung f r das Wachstum der Zellen ist allerdings eine ausreichende Versorgung mit Glutamin oder Pyruvat 3 Theoretische Grundlagen 17 Die Rolle von Fructose ist insbesondere f r anabole Prozesse erforderliches 5 zu liefern da dies aus z B Glutamin oder Pyruvat nicht gebildet werden kann 80 1 3 1 5 Gegenseitiger Einfluss der Glykolyse und der Glutaminolyse Die Stoffwechselwege der beiden wichtigsten Substrate Glucose und Glutamin beeinflussen sich gegenseitig Insbesondere f r Hybridomazellen wurden zahlreiche metabolische Zust nde nachgewiesen unter welchen entweder der Abbau der Glucose von der Glutaminkonzentration abh ngig war oder auch der Glutaminabbau beeinflusst war durch die Glucosekonzentration 82851 Aber auch zahlreiche andere Zelllinien wurden auf die gegenseitigen Einfl sse von Glucose und Glutaminstoffwechsel untersucht gt 71 H ufig ist bei Glucoselimitation eine Stimulierung der Glutaminoxidation aufgetreten 72 BT Ferner konnte f r verschiedene Zelllinien gezeigt werden dass in Medien in welchen Glutamin durch Pyruvat ersetzt wurde der Glucoseverbrauch vermindert war 21 Weitere unterschiedliche und mitunter auch gegens tzliche Effekte wurden in der Vergangenheit f r die beiden Substrate Glucose und Glutamin nachgewiesen Ein Grund hierf r ist sicherlich in den unterschiedlichen verwendeten Zelllinien zu suchen 471 Noch zu erw hnen in diesem Zusammenhang ist der Einflu
433. rd Zur Bef llung kann direkt das Wasser der Milli Q Anlage genutzt werden keine Filtration n tig Im gleichen Rhythmus wie die Eluentenflasche sollte auch bei dieser Flasche das Wasser ca monatlich getauscht werden und dabei die Flasche 6x gesp lt werden Die externe AXP Pumpe wird bei einem Fluss von 0 2 ml min betrieben was eine Messdauer von ber 10 Tagen gew hrleistet e Des weiteren ist bei Betrieb des MS Detektors die 2 Liter Flasche mit MeOH regelm ig zu bef llen Dies dient dem Betrieb der Cone Wash Option beim MS Detektor Diese Pumpe l uft mit einem Fluss von 0 15 l min Die Flasche kann auch w hrend des Betriebs bef llt werden jedoch ist wiederum darauf zu achten dass die Pumpe keine Luft zieht Idealerweise sollte das Restvolumen nicht 0 51 unterschreiten Zum Bef llen der Flasche sollte ein 0 2 um filtriertes Gemisch 1 1 MeOH H20 verwendet werden welches im Anschluss an die Filtration Vakuumfiltration noch weitere 5 min entgast werden sollte e Beim Betrieb des Cone Wash ist es wichtig dass die Nadel sich m glichst nahe am Konus befindet um einer Tropfenbildung vorzubeugen dies w rde eine diskontinuierliche Sp lung zur Folge haben e Autotune Ein Autotune am MS Detektor sollte durchgef hrt werden f r den Fall dass die Sensitivit t des Detektors nicht mehr zufrieden stellend ist Zum Autotune m ssen die Kapillaren anders verbunden sein als im normalen Messbetrieb Die Beh lter mit
434. rden die einzelnen Messpunkte mit Linien verbunden Die ATP Konzentration fiel w hrend der zweist ndigen Inkubation in PBS leicht ab Anschlie end war ein uneinheitliches Verhalten in den verschiedenen Medien zu erkennen W hrend die ATP Konzentration im DMEM ohne Zus tze weiterhin leicht sank war f r die anderen Medien ein vergleichsweise konstantes Verhalten zu messen Die Konzentration von UDP GlcNAc stieg w hrend der Inkubation in PBS an Nach Zugabe der Medien war f r DMEM ohne Zus tze ein leichter Abfall bis 18 s zu erkennen anschlie end war die Konzentration konstant F r das Glucose Medium blieb die Konzentration relativ konstant ber den weiteren Zeitraum F r die beiden weiteren Medien konnte kein eindeutiges Verhalten der Konzentration von UDP GlcNAc nachge wiesen werden Die Verl ufe der Energy Charge zeigten eine auff llige Gruppierung W hrend die Medien mit Serum und mit Serum und Glutamin in einem relativ konstanten Wert resultierten war f r DMEM und das mit Serum und Glucose supplementierte Medium nach 180s ein Abfall der Energy Charge zu verzeichnen Aufgrund der wenigen Datenpunkte f r die einzelnen Verl ufe in diesem Experiment erschien es nicht sinnvoll die Daten durch Splines zu interpolieren Aus diesem Grund wurde hier keine Kreuzkorrelationsanalyse durchgef hrt sondern eine wie zuvor in Abschnitt 5 3 1 genutzte Korrelationsanalyse Das Ergebnis ist in Abbildung 5 37 dargestellt Verglichen mit de
435. re das Malat Enzym EC 1 1 1 40 und die bereits im Zusammenhang mit der Gluconeogenese erw hnten Enzyme Phosphoenolpyruvat Carboxykinase und Pyruvat Carboxylase zu nennen Grunds tzlich ist beim Abbau durch die Desaminierung mehr Energie f r die Zelle zu gewinnen als bei der Transaminierung Allerdings zeigte sich dass der Gro teil des ausgeschiedenen Ammoniums im Zellkultur berstand f r verschiedene kontinuierliche Zelllinien aus der Reaktion der Glutaminase stammt und somit die meisten Zellen eine Transaminierung durchlaufen 76 Auch wenn f r einige Zelllinien eine Aktivit t der Glutamat Dehydrogenase gezeigt werden konnte wurde jedoch meist kein Fluss durch diesen Stoffwechselweg detektiert 0 761 Auch f r MDCK Zellen konnte eine Aktivit t dieses Enzyms nachgewiesen werden auch wenn die Enzyme der Transaminierung eine deutlich h here Aktivit t aufwiesen 81 Allerdings wurde f r MDCK Zellen weder f r Aspartat noch f r Alanin ein merklicher Anstieg der extrazellul ren Konzentrationen 21 w hrend der Zellkultivierung gemessen lt was andeutet dass diese Aminos uren keine End produkte der Glutaminolyse darstellen Signifikante Fl sse durch sowohl den Desaminierungsweg 16 3 Theoretische Grundlagen als auch die Transaminierungswege konnten f r MDCK Zellen per Metabolischer Stoffflussanalyse nachgewiesen werden HI F r verschiedene Zellen konnte insbesondere unter Glucoselimitation eine erh hte Aktivit t der En
436. rela tionen beinhalten offensichtliche bzw bekannte Zusammenh nge wie z B Zellzahl und Gesamt volumen und negative Korrelationen wie z B Glucose und Lactat Aber auch eine ganze Reihe weiterer Korrelationen die nicht offensichtlich sind So korrelieren in diesem Block unter anderem CDP UDP und ADP gut miteinander allerdings sind diese Metaboliten negativ korreliert mit der Zellzahl bzw dem Gesamtvolumen Die Metaboliten PEP und Pyruvat korrelierten fast ausschlie lich stark miteinander Zus tzlich zeigte vor allem PEP eine positive Korrelation zum Gesamtzellvolumen ATP und GTP Wie schon in Abbildung 5 19 zu erkennen war verhielten sich die Konzentrationsverl ufe von Citrat cis Aconitat und Isocitrat sehr hnlich was sich hier in einer hohen positiven Korrelation wider spiegelte F r a Ketoglutarat war kein Korrelationskoeffizient lt 0 6 bzw gt 0 6 Succinat und Fumarat korrelierten gut miteinander allerdings gab es noch einige andere Metaboliten die mit diesen organischen S uren korrelierten Mit dem schon erw hnten Block der Diphosphonukleoside waren noch CTP und UTP korreliert Eine positive wenn auch moderate Korrelation war bei ATP und GTP zu erkennen Stark positiv miteinander korreliert waren die beiden Zuckernukleotide UDP GlcNAc und UDP GalNAc UDP Glc war mit diesen beiden Zuckernukleotiden ebenfalls positiv korreliert Bez glich der zeitlichen Verschiebungen dieser Kreuzkorrelationsanalyse zeigte sich das
437. reliert waren die Metaboliten 3 Phosphoglycerat Phospho enolpyruvat und Pyruvat was auf einen je nach Kultivierung unterschiedlichen Konzentrations verlauf hindeutet Best tigt wurden diese Beobachtungen durch eine detaillierte Auswertung der zeitlichen Verl ufe von einzelnen Kultivierungsexperimenten Ein Vergleich von Kultivierungen in zwei verschiedenen Medien GMEM Z und EpiSerf legte sowohl qualitative als auch quantitative Unterschiede in den Konzentrationsverl ufen intrazellul rer Metaboliten offen obwohl beide Medien sehr gutes Zellwachstum garantierten Die auff lligsten qualitativen Unterschiede traten f r Pyruvat und ATP auf Aber auch f r Phosphoenolpyruvat a Ketoglutarat GDP UDP GlcNAc und UDP GalNAc wurden deutlich unterschiedliche Korrelationsverhalten f r die beiden verschiedenen Medien gefunden Aufgrund der komplexen Zusammensetzung beider Medien konnten jedoch keine eindeutigen R ckschl sse auf die Ursachen des unterschiedlichen Metabolismus gezogen werden Aus diesem Grund wurde eine genauere Untersuchung von verschiedenen Wachstumssubstraten Glc Gln Pyr in Kultivierungs experimenten durchgef hrt Hierbei zeigte das Zellwachstum eine deutliche Abh ngigkeit von der N hrstoffquelle Je nach Substrat unterschieden sich die intrazellul ren Metabolitkonzentrationen mitunter erheblich Insbesondere die intrazellul ren Konzentrationen von Zuckerphosphaten aber auch Zuckernukleotiden waren deutlich erniedr
438. renden Substanzen z Protein und Nukleins uren war f r die meisten Methoden gut auch wenn dieser Parameter in keiner der genannten Referenzen untersucht wurde Allerdings bedingt in den meisten F llen eine gute Extraktion eine Abreicherung von Proteinen Enzymen um eine weitere Stoffwechselaktivit t zu vermeiden Aus diesem Grund sind viele der erw hnten Methoden indirekt auf diesen Parameter optimiert worden Somit konnte bei diesem Versuch gezeigt werden dass die getesteten Methoden zum Gro teil entsprechend den angelegten Kriterien geeignet sind als Probenvorbereitung zu dienen Dennoch wurden Unterschiede zwischen den Methoden gefunden Allerdings sollen diese Versuche nicht die oben zitierte Literatur in Frage stellen sondern vielmehr darauf aufmerksam machen dass methodisch Feinheiten mitunter einen gro en Einfluss auf das Ergebnis haben k nnen Besonders der untersuchte Organismus oder die Art der Probe ist hier sicher von gro er Relevanz Aufgrund der gro en experimentellen Unterschiede zwischen der hier vorliegenden Arbeit und den 31 32 176 178 211 226 236 263 und auch da dieser Versuch nur einen entsprechenden Referenzen Zwischenschritt bei der Optimierung darstellte sei hier auf einen weiterf hrenden Vergleich mit der Literatur verzichtet und auf Abschnitt 5 2 7 4 verwiesen 90 5 Ergebnisse und Diskussion 5 2 7 2 Fraktioneller faktorieller Versuchsplan Der Einsatz von statistischen Methoden
439. ress 20 6 1623 1633 198 Bajad SU Lu W Kimball EH Yuan J Peterson C Rabinowitz JD 2006 Separation and quantitation of water soluble cellular metabolites by hydrophilic interaction chromatography tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 1125 1 76 88 191 199 Tolstikov VV Fiehn O 2002 Analysis of highly polar compounds of plant origin Combination of hydrophilic interaction chromatography and electrospray ion trap mass spectrometry Analytical Biochemistry 301 2 298 307 200 Sekiguchi Y Mitsuhashi N Kokaji T Miyakoda H Mimura T 2005 Development of a comprehensive analytical method for phosphate metabolites in plants by ion chromatography coupled with tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 1085 1 131 136 201 Mashego MR Wu L Dam JCV Ras Vinke JL Winden WAV Gulik WMV Heinen JJ 2004 MIRACLE mass isotopomer ratio analysis of U C 13 labeled extracts A new method for accurate quantification of changes in concentrations of intracellular metabolites Biotechnology and Bioengineering 85 6 620 628 202 Lange HC Eman van Zuijlen Visser van Dam JC Frank J de Mattos MJT Heijnen JJ 2001 Improved rapid sampling for in vivo kinetics of intracellular metabolites in Saccharomyces cerevisiae Biotechnology and Bioengineering 75 4 406 415 203 Shi GE 2003 Application of co eluting structural analog internal standards for expanded linear dynamic range in liquid chromatog
440. rgebnisse und Diskussion 131 Korrelationen der Zellzahl mit Glucose negativ und Lactat positiv hatte ihr Optimum bei einer zeitlichen Verschiebung von 10 h Weiterhin zu erw hnen ist dass der Metabolit FIP vor den anderen Zuckerphosphaten den f r diese Gruppe charakteristischen Verlauf durchlief gefolgt von F6P G6P F16bP und R5P Somit ging der Verlauf von G6P dem von F16bP voraus c 5 w au S t B S 8 82 e Ben 25 0 E EES opgaar gt ee ee 5 850 8o5ee rs S238 3322285259528 55505555 Zellzahl 10 10 10 10 10 10 10 10 10 D Gesamtzellvolumen BI 10 BI BI Glucose BC 10 10 Lid E Lactat m Glutamin 10 L 10 10 10 1010 10 10 10 10 10 10 10 10 1 10 10 10 10 on 10 1010 1010 10 10 Lag 10 10 10 5 1 10 10 10 10 G6P 4 10 10 F6P 10 10 F16bP 2 3PG 10 10 10 10 10 10 10 10 10110 10 10 10 10 10 10 10 PEP 10 10 10L10 10 10 10 10 1010 8 10 nm Lag 10 10 10 10 Pyruvat D Lio Citrat cis Aconitat Isocitrat a Ketoglutarat 10 10 10 Succinat 10 40 10 Fumarat 10 10 10 Malat 40 10 10 10 10 10 10 10 Krebszyklus 10 10 10 10 10 10 10 gt 10 10 10 10 10 10
441. riablen sei auf Gleichung 3 3 verwiesen Zus tzlich ist hier 8 aufgef hrt was den Sch tzwerten f r die quadratischen Effekte entspricht Um ein solches Modell sinnvoll anpassen zu k nnen sind allerdings mehr als zwei Niveaus f r die Faktoren zu untersuchen Eine g ngige L sung dieses Problems ist die Erweiterung eines 2 faktoriellen Experiments mit 2k Sternpunkten weiter au erhalb des durch die faktoriellen Punkte untersuchten Bereichs und mit einem Zentrumspunkt in der Mitte des untersuchten Bereichs Abbildung 3 6 zeigt die Anordnung der Einzelexperimente f r einen entsprechenden Versuchsplan mit zwei Faktoren Solch ein experimenteller Plan wird Central Composite Design genannt und ist oft genutzt um Modelle 2 Ordnung anzupassen Die Sternpunkte befinden sich jeweils auf den Niveaus 0 f r den einen und o f r den anderen Faktor wobei a idealerweise so gew hlt wird dass die Orthogonalit t des Designs bewahrt wird Zus tzlich ist es empfehlenswert dass eine Drehbarkeit des Versuchsplans m glich ist Dies bedeutet dass alle Versuchspunkte den gleichen Abstand vom Zentrumspunkt haben Diese Eigenschaft ist wichtig da so die Varianz der Sch tzwerte f r alle gleichweit entfernten Punkte als gleich angenommen werden kann Der Wert von a ergibt sich aus der Anzahl der faktoriellen Einzelversuche nr und berechnet sich nach a H ufig sind nicht alle in das Modell aufgenommenen Faktoren signifikant Aus diesem Grund wird o
442. rix and in extramitochondrial space European Journal of Biochemistry 30 3 434 440 225 Reiss PD Zuurendonk PF Veech RL 1984 Measurement of tissue purine pyrimidine and other nucleotides by radial compression high performance liquid chromatography Analytical Biochemistry 140 1 162 171 226 Shryock JC Rubio R Berne RM 1986 Extraction of Adenine Nucleotides from Cultured Endothelial Cells Analytical Biochemistry 159 1 73 81 227 Juengling E Kammermeier H 1980 Rapid assay of adenine nucleotides or creatine compounds in extracts of cardiac tissue by paired ion reverse phase high performance liquid chromatography Analytical Biochemistry 102 2 358 361 228 Khym JX 1975 Analytical system for rapid separation of tissue nucleotides at low pressure on conventional anion exchangers Clinical Chemistry 21 9 1245 1252 229 Brown EG Newton RP Shaw NM 1982 Analysis of the free nucloetide pools of mammalian tissue by high pressure liquid chromatography Analytical Biochemistry 123 2 378 388 230 Brown PR Miech RP 1972 Comparison of cell extraction procedures for use with high pressure liquid chromatography Analytical Chemistry 44 6 1072 1073 231 Wynants J Belle HV 1985 Single run high performance liquid chromatography of nucleotides nucleosides and major purine bases and its application to different tissue extracts Analytical Biochemistry 144 1 258 266 232 Jungling E Timmerman M Aretz A Ionescu I Mertens M Lok
443. ro Zellen unter den verschiedenen Bedingungen eine hohe Enzymaktivit t vorlag so dass ein chemisches Gleichgewicht zwischen den Metaboliten vorherrschte Somit entsprechen die Ergebnisse der in der Literatur existierenden Theorie zu Gleichgewichtsreaktionen 1255 231 Bei der Verallgemeinerung ber alle hier aufgef hrten Versuche ist ferner zu ber cksichtigen dass nicht die gleiche Anzahl an Versuchen f r die jeweiligen unterschiedlichen Bedingungen erfolgte Z B wurden deutlich mehr Experimente mit MDCK Zellen als mit Vero Zellen durchgef hrt Da diesbez glich aber keine Gewichtung eingef hrt wurde spiegeln die Korrelationsdaten zum gr eren Teil die Resultate von MDCK Zellen wider als von Vero Zellen Allerdings besitzen insbesondere die stark blau gef rbten Felder in Abbildung 5 15 Werte f r r gt 0 9 und dies setzt voraus dass die einzelnen Korrelationskoeffizienten der unterschiedlichen Experimente deutlich positive Werte aufwiesen Somit konnten anhand dieser Auswertung generelle Zusammenh nge zwischen Metabolitpaaren identifiziert werden wobei sich zeigte dass diese Ergebnisse gro teils mit der Literatur im Einklang stehen 5 Ergebnisse und Diskussion 105 5 3 2 Kultivierung von MDCK Zellen Im Laufe der Versuche zur Optimierung der Extraktionsmethode wurden bereits etliche Erkenntnisse zu den Metabolitkonzentrationen in MDCK Zellen gewonnen und Gr enordnungen f r die Konzentrationen der unterschiedlichen Meta
444. romatographisch untersuchten Metaboliten Trennung mittels des verbesserten Gradienten s Abbildung 5 1 Tabelle 5 2 Zusammenfassung der mittels SIM Kanal detektierten Metaboliten mit den entsprechenden charakteristischen m z Fragmenten den entsprechenden chromatographischen Zeitfenstern und den f r den MS Detektor verwendeten Konusspannungen uunesssesnesenennnnnnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn t 59 Tabelle 5 3 Zusammenfassung der Analyse der relativen Standardabweichungen f r die drei Detektoren der Chromatographieanlage DX320 und die acht genutzten Standardverd nnungen 61 Tabelle 5 4 Vergleich der beiden optimierten Extraktionsmethoden bez glich Metabolitgehalt pro Zelle und Wiederfindung f r MDCK A und Vero B Zellen und zus tzlich der im weiteren Verlauf der Arbeit genutzten finalen Methode MeOH CHOI Kochen s Abschnitt 5 2 4 f r MDCK Zellen 79 Tabelle 5 5 Zusammenfassung der Analyse der relativen Standardabweichungen f r mehrfach bestimmte Extraktionsproben in Abh ngigkeit von der Konzentrationsklasse bzw des Detektors 84 Tabelle 5 6 Zusammenfassung der Verh ltnisse von Produkten zu Edukten des Energiestoffwechsels f r das Zellwachstum von MDCK Zellen in Sechs Well Platten in GMEM Z bzw EpiSerf 117 Tabelle 5 7 Zusammenfassung intrazellul rer spezifischer Metabolitmengen fmol der hier vorliegenden Arbeit im Vergleich mit ausgew hlten Lter
445. romeleon Panel DX320_ms pan unter in der Datenbank PC478_local im Ordner Panels_with_AXP MS gestartet werden e Die Zwischenverbindungen ausbauen und die S ule und Vors ulen einbauen Flussrichtung beachten e Der Suppressor mit den entsprechenden Kapillaren verbinden Flussrichtung und Anschl sse beachten Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 e Milli Q Wasser in der Eluentenflasche ersetzten Vorher die Flasche mindestens 6x sp len Empfehlung da auf diese Weise keine negativen Erfahrungen gemacht wurden e Milli Q Wasser f r Regeneration ersetzen die Flasche sp len e ersetzen e Autosampler Pumpe und Detektoren Vakuumvorpumpe f r MS nacheinander einschalten Eluentengenerator auf 100 stellen manuelle Aufzeichnung starten Nach ca 5 min kommt ein gro er Peak im Leitf higkeitskanal Verunreinigungen anschlie end pendelt sich das Signal auf einem konstanten Plateau ein Je nach Leistungsf higkeit des Suppressors ist dieses Signal h her oder niedriger Nach ca 10 min Eluentengenerator auf 0 2 mM stellen Nach weiteren 5 min f llte das Signal wieder etwa auf den Startwert ab Falls der Suppressor gut arbeitet kann nun die Messung begonnen werden Im DX 320 Control Panel wird unter Batch Edit angezeigt was alles l uft laufen soll oder gelaufen ist Wenn eine Sequenz gelaufen ist kann man unter Batch Edit entsprechende Sequenz anklicken gt Remov
446. rrelationskoeffizient r gt 0 9 G6P und F6P Citrat und cis Aconitat Malat und Fumarat ADP und GDP ATP und GTP UDP GlcNAc und UDP GalNAc Diese Metabolitpaare verhielten sich somit in s mtlichen f r diese Auswertung genutzten Versuchen sehr hnlich Negative Korrelationen waren nicht zu finden Wie sich an den zum Gro teil niedrigen p Werten lt 0 01 zeigte waren viele der Korrelationen signifikant 5 Ergebnisse und Diskussion 103 Diskussion Um generelle Zusammenh nge zwischen den Konzentrationen verschiedener Metaboliten aufzu kl ren fand eine gemeinsame Auswertung aller Versuche welche mit der etablierten Probenvorbe reitung durchgef hrt wurden statt Die Darstellung anhand der beiden Streudiagramme aus Abbildung 5 14 verdeutlicht die m glichen Zusammenh nge zwischen den Konzentrationen ver schiedener Metaboliten F r beide F lle scheint die lineare Absch tzung der Korrelation valide zu sein Allerdings scheinen sich in Abbildung 5 14 B zwei Populationen anzudeuten Bei zahl reichen Streudiagrammen f r andere Metaboliten traten hnliche Gruppierungen mehrerer Mess werte auf Auch eindeutig nicht lineare Zusammenh nge waren zu finden Dies war allerdings nur mithilfe von Streudiagrammen zu erkennen da die Berechnung des Korrelationskoeffizienten solche Ph nomene nicht ber cksichtigt Der Grund f r die inhomogenen Populationen lag sicherlich in den unterschiedlichen bei dieser Auswertung zusammengefassten E
447. rsucht Hierbei zeigten sich verbesserte Wachstumseigenschaften wie auch eine verminderte Aufnahme von Glucose und Glutamin Dem entgegen war f r MDCK Zellen keine signifikant ver nderte Aufnahme von Glucose oder Glutamin bei Zusatz von Pyruvat zum Zellkulturmedium zu erkennen Bei weiteren Versuche von Genzel et al konnte ein Zellwachstum f r CHO K1 BHK und MDCK Zellen ohne Glutamin erreicht werden indem dem Medium Pyruvat zugegeben wurde Eine Hypothese zu den Effekten des Pyruvats ist dass das Verh ltnis aus NAD zu NADH HI 7 Durch eine Metabolische durch eine Reduktion des Pyruvats verschoben werden k nnte Stoffflussanalyse konnte gezeigt werden dass eine effizientere Nutzung der Wachstumssubstrate vorliegt wenn Glutamin durch Pyruvat im Zellkulturmedium ersetzt wird 221 3 1 4 Weitere Wachstumssubstrate Weitere Wachstumssubstrate neben Glucose Glutamin und Pyruvat kommen in Frage PT Diverse Zucker Aminos uren und organische S uren und andere C Quellen k nnen von vielen Zellen abgebaut werden Insbesondere im Zusammenhang mit MDCK Zellen ist Fructose als Ersatz von Glucose zu nennen was in gleichen maximalen Zellzahlen bei deutlich verminderter Lactataus scheidung resultierte T L Auch erfolgreiche Perfusionskultivierungen konnten mit MDCK Zellen und Fructose als Glucoseersatz durchgef hrt werden TL Fructose wird in erheblich geringeren Mengen abgebaut als Glucose da Fructose nicht als Energiequelle genutzt wi
448. rt Anschlie end wurden die Platten f r 2 min in einem 70 C Kochendes 80 C Kochendes EtOH bzw 95 Kochendes H20 warmen Wasserbad inkubiert Danach erfolgte die Ultraschallbehandlung die berst nde wurden in Probengef e transferiert zentrifugiert und abschlie end getrocknet Ameisens ure Extraktion Ameisens ure Methode E Ameisens ure 1 M 2 mL wurde auf den Zellrasen pipettiert Nach der Ultraschallbehandlung wurden die berst nde in Probengef e transferiert zentrifugiert und getrocknet Diese Methode orientierte sich an der von Goulard et al 7 beschriebenen Extraktion mit kaltem Acetonitril Kaltes ACN Methode F kaltem EtOH Kaltes EtOH Methode und kaltem MeOH Kaltes MeOH Methode Diese Extraktionen erfolgten in Anlehnung an die von Grob et al 236 bzw Vogt et al P beschriebenen Verfahren Ein Volumen von 2mL 4 C kaltes ACN EtOH oder MeOH jeweils 60 in H20 wurde auf den Zellrasen pipettiert Danach folgte die Ultraschallbehandlung Die berst nde wurden in Probengef e transferiert zentrifugiert und getrocknet MeOH CHCl Extraktion MeOH CHCI Methode 1 Diese Methode wurde bernommen von Le Belle et al 21 Dazu wurde ein Volumen von 600 uL MeOH 100 4 C auf den Zellrasen pipettiert und die Platten mit Ultraschall behandelt Daraufhin wurden 600 uL eines 25 mM Tricine Puffers zugegeben und die Platten erneut m
449. rte Beschreibung der Kreuzkorrelationsanalyse sei auf die Abschnitte 3 6 und 4 5 verwiesen Neben den gemessenen intrazellul ren Konzentrationen wurden einige extrazellul re Metabolitkonzentrationen die Zellzahl und das Gesamtzellvolumen in die Kreuzkorrelationsanalyse mit aufgenommen Ein eventueller Zusammenhang zwischen diesen Gr en und den intrazellul ren Metabolitkonzentrationen sollte auf diese Weise aufgekl rt werden Abbildung 5 21 zeigt das Ergebnis der entsprechenden Kreuzkorrelationsanalyse f r die Kultivierung in GMEM Z Von den 38 Variablen die f r die Kreuzkorrelationsanalyse genutzt wurden sind in Abbildung 5 18 Abbildung 5 19 und Abbildung 5 20 nur 29 in ihren Verl ufen dargestellt allerdings l sst sich die Korrelationsmatrix nutzen um die Verl ufe der verbleibenden Variablen zu erahnen Z B ist 5 bei einem Zeitversatz von 5 h stark mit G6P positiv korreliert Dies bedeutet dass bei Verschiebung 5 Ergebnisse und Diskussion 129 des Konzentrationsverlaufs von R5P um 5 h zu sp teren Zeitpunkten eine hohe bereinstimmung mit dem Verlauf von G6P erreicht wird c 5 a
450. rung der Sch tzung des ger tebedingten Messfehlers wurden unter 5 1 1 5 die Standardabweichungen der Verd nnungen des Kalibrationstandards aus Messsequenzen gemeinsam ausgewertet 266 2681 Diese Daten lieferten aber nur Hinweise zu den ger tebedingten Messfehlern Zur Absch tzung der gesamten Standardabweichung die sowohl die biologische Variabilit t die Variabilit t durch die Probenvorbereitung und die Variabilit t der chromatographischen Messung beinhaltet wurde die Standardabweichung der Mehrfachbestimmungen der Extraktionsproben verwendet Wiederum wurde entsprechend der Methode von Thompson und Howarth verfahren 28 2681 In den Versuchen zur Charakterisierung von kultivierten tierischen Zellen unter verschiedenen Zust nden s Abschnitt 5 3 wurde f r jeden Probenahmezeitpunkt Mehrfachbestimmungen in Sechs Well Platten zwischen dreifach und zw lffach durchgef hrt Aus den Schwankungswerten dieser Bestimmungen wurde im Anschluss die Standardabweichung der Methode f r die jeweiligen Metaboliten gesch tzt Dazu wurden die Standardabweichung f r die jeweiligen Metaboliten von 84 5 Ergebnisse und Diskussion zwischen 175 und 394 mehrfach bestimmten Proben entsprechend dem Mittelwert jedes Probe nahmezeitpunktes aufsteigend geordnet und in sechs etwa gleich gro e Klassen eingeteilt Hierzu wurde die Gesamtzahl der Werte 175 394 durch die Anzahl der Klassen 6 geteilt und je nach Anzahl der Restwerte den einzelnen Klassen beginn
451. rungen durchlaufen machte es erforderlich das Volumen durch Bestimmung des Zelldurchmessers nach Trypsinierung abzusch tzen Durch den Bezug der gemessenen Metabolit mengen pro Zelle auf das so ermittelte Volumen pro Zelle konnten im weiteren Verlauf intra zellul re Metabolitkonzentrationen bestimmt werden Mit der entwickelten Methode zur Bestimmung der intrazellul ren Metabolitkonzentrationen wurden verschiedene Kultivierungszust nde von MDCK und Vero Zellen untersucht Um generelle Zusammenh nge zwischen intrazellul ren Metabolitkonzentrationen aufzukl ren wurde eine Korrelationsanalyse der gemessenen Werte aus verschiedensten Versuchen durchgef hrt Unter allen untersuchten Zust nden zeigten nur einige Metaboliten sehr starke Korrelationen Korrelationskoeffizient gt 0 9 G6P und F6P Citrat und cis Aconitat Malat und Fumarat ADP und GDP ATP und UDP GlcNAc und UDP GalNAc Dieses gleichartige Konzentrationsver halten kann mit generell sehr aktiven Enzymen die diese Metaboliten ineinander umsetzen begriindet werden Eine deutlich gr ere Anzahl von hohen Korrelationskoeffizienten wurde f r eine Zusammen fassung von Kultivierungsexperimenten nur mit MDCK Zellen vorgefunden Der Kreuz korrelationsmatrix Mittelwert der Kreuzkorrelationsanalysen der einzelnen Experimente ent sprechend waren jeweils Zuckerphosphate organische S uren und einige Nukleotide untereinander sehr stark korreliert Auff llig gering kor
452. ruvatkonzentration zeigte ein deutlich negativ korreliertes Verhalten zum Verlauf der Zellzahl Dies bedeutet dass bei hohem Zellwachstum auch eine hohe Pyruvataufnahme zu verzeichnen war Allerdings scheinen die Konzentrations nderungen von Pyruvat eine Folge des Zellwachstums zu sein da n mlich die Wachstumsrate nach 72 h deutlich zur ckging aber zu diesem Zeitpunkt noch signifikante Mengen an Pyruvat im Medium vorlagen Somit ist davon auszugehen dass die Wachstumsinhibierung durch Limitierung eines anderen Substrates ausgel st wurde Wie oben angedeutet dienten wahrscheinlich Aminos uren zus tzlich als Substrat und nach dem Verbrauch dieser Aminos uren war kein Zellwachstum mehr m glich Zwar wurden keine zellspezifischen Verbrauchsraten f r die Substrate gezeigt aber allein aus den Diagrammen k nnen gewisse R ckschl sse auf diese Raten gezogen werden Der zellspezifische Glucoseverbrauch schien in dem Medium mit Glucose und Glutamin niedriger gewesen zu sein als f r das Medium mit Glucose Ebenso war f r das Medium mit Glucose und Glutamin der zellspezifische Glutaminverbrauch scheinbar niedriger als f r das Medium mit Glutamin allein Eine Stimulierung der Glutaminoxidation bei Glucoselimitation wurde in der Vergangenheit bereits f r verschiedenen andere Zellen gezeigt gt BT Ebenso ist f r zahlreiche Zelllinien bekannt dass die Glutaminoxidation vermindert ist wenn Glucose im berschuss vorliegt 183 87 Auch f r MDCK Ze
453. s tzlich ein MS Detektor als weitere Option hinzugef gt Eine detailierte Beschreibung der Anordnung und der Verwendung des MS Detektors wird in Punkt 0 gegeben Zus tzlich zur Anpassung des Gradienten zur verbesserten Peaktrennung wurde der Sp lschritt am Ende des Gradientenprogramms auf ca 6 min verl ngert um eine m glichst lange S ulenlebensdauer zu erreichen Wie sich im Lauf der Arbeit herausgestellt hat fand aber trotzdem eine kontinuierliche Verschlechterung der Trenneigenschaften der S ule statt was laut Hersteller ein normales Verhalten darstellt Dies bedeutet dass grunds tzlich die Retentionszeiten mit dem Alter der S ule k rzer werden Im Normalfall stellte das kein Problem dar da durch geringf gige Anpassungen des Gradienten geringere KOH Konzentrationen die Retentionszeiten wieder verl ngert werden konnten so dass bei kontinuierlichem Betrieb der Chromatographieanlage eine S ule etwa 6 8 Monate genutzt wurde was ca 4000 Injektionen entsprach Grunds tzlich besteht hier wahrscheinlich ein Zusammenhang zwischen der Probenreinheit bez glich Verunreinigungen mit Nukleins uren bzw Protein und der m glichen Nutzungsdauer einer S ule Die Dauer von Injektion einer Probe zu Injektion der n chsten Probe entsprach ca 70 min Die gro e Anzahl von Metaboliten die in einem Lauf analysiert werden sollten erlaubte keine k rzere Laufdauer da sonst die Trennung der Substanzen deutlich verschlechtert worden w re Bei Nutzung
454. s Volumen zu Beginn der Kultivierungen niedrige Werte aufwiesen und f r viele intrazellul re Metaboliten zu Beginn eher hohe Konzentrationen vorlagen Im weiteren Verlauf kehrte sich dieser Zustand um F r ein besseres Verst ndnis sei hier auf z B Abbildung 5 19 und Abbildung 5 20 in den folgenden Abschnitten verwiesen wo diese Verlaufskurven im Einzelnen dargestellt sind Bei Untersuchun gen von Kultivierungen liegen naturgem zu Beginn des Versuchs niedrige Zellzahlen und gegen Ende entsprechend h here Zellzahlen vor Somit kann ber eine biologische Ursache der negativen Korrelation der Zellzahl bzw des Gesamtzellvolumens mit den intrazellul ren Metaboliten keine Aussage getroffen werden da kein alternatives Szenario untersucht werden kann Theoretisch kann hier ebenso eine zuf llige Koinzidenz vorliegen was bedeutet dass kein Zusammenhang bestehen muss GLUCOSE Korrelationskoeffizient wa RIBOSE 5 1 Seege 1 PHOSPHAT 1 Zu i KETOGLUTARAT Isocitrat DIHYDROXYACETON Dehydrogenase skate PHOSPHAT Aldolase hydrogenase Triosephesphat lsomerase egener SUCCINYL CoA Succinytcoa Synthothase Dehydrogenase 1 3 BISPHOSPHOGLYCERAT GLYCERINALDEHYD 3 PHOSPHAT lt Glycerinaldehyd ct Succinat Dehydrogenase Phosphoglycerat Kinase ame tf Ee 1 EA Hoener 2 PHOSPHOGLYCERAT OXALAGETAT Enolase eg Deeg
455. s auf einen Wert von etwa 10 uM Somit ist PEP ein Metabolit der f r die beiden Medien sowohl im Verlauf als auch in den Konzentrationen klare Unterschiede zeigte Noch deutlichere Unterschiede in Abh ngigkeit vom Medium wurden f r die Konzentrationsverl ufe f r Pyruvat beobachtet W hrend sich die Konzentration von Pyruvat in GMEM Z sehr hnlich wie die Konzentration von PEP verhielt unterschied sich die Pyruvatkonzentration bei Kultivierung mit EpiSerf deutlich vom Verlauf der PEP Konzentration Hier fand von Beginn an bis ca 78h ein Abfall der Konzentration von ca 1000 uM bis ca 400 uM statt Danach blieb die Konzentration 5 Ergebnisse und Diskussion 121 konstant F r die Kultivierung in GMEM Z hingegen stieg die Pyruvatkonzentration von ca 300 uM bis auf 600 uM bis 70 h an Im Anschluss war ein leichter Abfall bis auf etwa 500 uM zu verzeichnen Pyruvat wird in MDCK Zellen typischerweise fast vollst ndig zu Lactat reduziert und anschlie end ausgeschieden Konzentrationsverl ufe intrazellul rer Metaboliten Krebszyklus In einem alternativen Weg zur Ausscheidung von Lactat kann Pyruvat in den Krebszyklus eingeschleust werden Dies kann z B nach Decarboxylierung des Pyruvats in Form von Acetyl Coenzym A Acetyl CoA erfolgen Dabei werden durch die Citrat Synthase aus Acetyl CoA und Oxalacetat Citrat gebildet Die intrazellul re Konzentration von Citrat sank nach Beginn der Kultivierung von ca 1500 uM auf etwa 250 uM n
456. s by HPLC Journal of Liquid Chromatography 3 1 133 158 218 Soboll S Werdan K Bozsik M Muller M Erdmann E Heldt HW 1979 Distribution of metabolites between mitochondria and cytosol of cultured fibroblastoid rat heart cells Febs Letters 100 1 125 128 219 Ryll Wagner 1992 Intracellular ribonucleotide pools as a tool for monitoring the physiological state of in vitro cultivated mammalian cells during production processes Biotechnology and Bioengineering 40 8 934 946 220 Wiendahl C Brandner JJ Kuppers C Luo B Schygulla U Noll T Oldiges M 2007 A microstructure heat exchanger for quenching the metabolism of mammalian cells Chemical Engineering amp Technology 30 3 322 328 221 Sellick CA Hansen R Maqsood AR Dunn WB Stephens GM Goodacre R Dickson AJ 2009 Effective quenching processes for physiologically valid metabolite profiling of suspension cultured Mammalian cells Analytical Chemistry 81 1 174 183 192 222 Soboll S Scholz R Heldt HW 1978 Subcellular metabolite concentrations Dependence of mitochondrial and cytosolic ATP systems on the metabolic state of perfused rat liver European Journal of Biochemistry 87 2 377 390 223 Williamson DH Lund Krebs HA 1967 Redox State of Free Nicotinamide Adenine Dinucleotide in Cytoplasm and Mitochondria of Rat Liver Biochemical Journal 103 2 5 14 527 224 Heldt HW M M Klingenberg M 1972 Differences between ATP ADP ratios in mitochondrial mat
457. s war 25 C die des Autosamplers 4 C Das Injektionsvolumen betrug 20 uL Die Wellenl nge des UV Detektors wurde wie weiter unten im Detail beschrieben zwischen 220 nm und 260 nm variiert Bei Betrieb des MS Detektors wurde der Regenerationsstrom durch eine externe AXP Pumpe oder 4 Material und Methoden 41 mittels Kopfdruck auf der Reservoirflasche realisiert so dass ein minimaler Fluss von etwa 0 2 mL min nicht unterschritten wurde F r die Cone Wash Funktion des MS Detektors wurde ein 50 50 Gemisch MeOH Milli Q Wasser mit einer weiteren AXP Pumpe bei einem Fluss von 0 15 mL min gef rdert Die Entwicklung des Gradientenprofils und die Zusammensetzung des Standards sind in Abschnitt 5 1 1 beschrieben F r die chromatographischen Messungen im weiteren Verlauf der Arbeit wurde zur Kalibrierung eine Verd nnungsreihe der Standardl sungsmischung aus sieben quidistanten Verd nnungen 5 155 uL auf 1000 uL Konzentration der Standardl sungsmischung s Tabelle 5 4 erste Spalte Zahlen in Klammern pipettiert und als externer Standard in randomisierter Reihenfolge zwischen den Proben gemessen In der Summe einer Sequenz wurde dabei ein Verh ltnis von Standard Probe von 1 4 nicht unterschritten was bedeutet dass mindestens ein Standard pro vier Proben gemessen wurde Des Weiteren wurde die Peakfl che f r die Kalibrierung verwendet und zur Regression entweder ein Polynom 1 oder 2 Ordnung verwendet Nach Installation des MS Detekt
458. s z B der Verlauf der Zellzahl dem des Gesamtzellvolumens folgte F r die Zuckerphosphate stellte sich heraus dass ein positiver Zeitversatz in der Reihenfolge F1P F6P F16bP G6P und RSP existierte Dies bedeutet dass die Konzentration von PIP den weiteren Zuckerphosphaten vorausging Der Verlauf der Konzentration von Citrat folgte dem von cis Aconitat und Isocitrat In Abbildung 5 22 ist das Ergebnis der Kreuzkorrelation f r die Kultivierungen in EpiSerf dargestellt Grunds tzlich traten viele Korrelationen auf die auch f r die Kultivierungen in GMEM Z zu finden waren Insbesondere der Block extrazellul rer Metaboliten und deren nderungen zeigte in beiden Medien ein sehr hnliches Muster Eine Ausnahme bildeten Glutamin und Ammonium die gering mit anderen Stoffwechselprodukten korreliert waren In dem gro en Block der stark korrelierenden Metaboliten waren die Gruppe von Zuckerphosphaten die meisten organische S uren aus dem Krebszyklus und der Gro teil der gemessenen Nukleotide mit Ausnahme von GDP GTP und ATP Wie bei diesen drei Nukleotiden wurden f r 3PG PEP und Malat nur geringe Korrelationen mit anderen Stoffwechselprodukten gefunden Dennoch war Malat mit den organischen S uren a Ketoglutarat Succinat und Fumarat korreliert Bei Betrachtung der zeitlichen Verschiebungen f r die Kultivierungen mit EpiSerf f llt auf dass z der Anstieg im Verlauf der Zellzahl dem des Gesamtzellvolumens um 10h folgte Die 5 E
459. scheint dieser Effekt eher unwahrscheinlich da aufgrund der sehr hnlichen physikalisch chemischen Eigenschaften dieser Molek le ein synchroner Verlauf zu erwarten w re Die Konzentration von UDP GlcNAc war ber die Versuchsdauer konstant Dies ist in sofern interessant als dass in den vorangegangenen Versuchen eine deutliche Abh ngigkeit dieser Konzentration von der Glucosekonzentration zu sehen war Als Ursache k nnte hier eine zeitliche Verz gerung in Frage kommen was bedeutet dass nur bei einer l ngeren Versuchsdauer dieser Effekt zum Tragen gekommen w re Die Kreuzkorrelationsanalyse Abbildung 5 30 zeigte zum Gro teil positive Zusammenh nge auf was auf einen kurz bis mittelfristigen Konzentrationsabfall vieler Metaboliten zur ckzuf hren ist Ein Konzentrationsabfall f r Stoffwechselintermediate unter Limitationsbedingungen ist ein zu erwartendes Ph nomen da ein sequenzieller Verbrauch von Stoffwechselprodukten eines Stoff wechselweges auftreten sollte F r jede einzelne Reaktion des Stoffwechselweges w re ein Fortlauf der Reaktion bis zum Gleichgewicht der Reaktion zu erwarten Da die nderung der freien Energie f r die Glykolyse von Glucose bis Lactat negativ ist 1 Lactat ausgeschieden wird und somit keine Akkumulation stattfindet k nnen die Glykolysezwischenprodukte abgebaut werden In hnlicher Form w rde ein Abbau anderer Stoffwechsel erwartet werden Allerdings ist bei der Kreuzkorrelationsanalyse zu ber c
460. schiede zwischen den Detektoren Insbesondere der MS Detektor lieferte eine mittlere relative Standardabweichung von ber 9 was erheblich h her ist als f r die beiden anderen Detektoren ca 3 Die Mittelwerte der relativen Standardabweichungen f r die einzelnen Standardverd nnungen zeigten ab Standard 300 einen relativ konstanten Wert von etwa 5 Die 5 Ergebnisse und Diskussion 61 niedrigeren Konzentrationen 25 und 50 wurden mit erheblich h heren relativen Standardabweichungen 8 4 und 7 3 bestimmt wobei dieses Ph nomen beim UV Detektor am st rksten und beim MS Detektor am schw chsten ausgepr gt war Tabelle 5 3 Zusammenfassung der Analyse der relativen Standardabweichungen f r die drei Detektoren der Chromatographieanlage DX320 und die acht genutzten Standardverd nnungen Mittelwert aller Standardverd nnung Detektor Verd nnungen 25 50 300 550 800 1050 1300 1550 LF 2 7 6 6 5 0 20 19 18 14 1 5 153 UV 3 0 8 2 5 8 2 5 1 8 ke 1 3 15 12 MS 9 1 9 2 9 1 99 86 93 103 84 80 Mittelwert aller Detektoren 5 9 8 4 7 3 60 52 54 5 7 48 46 Konzentrationen der Stamml sung des Standards s Tabelle 5 4 1 Spalte in Klammern der angegebene Wert jeder Verd nnung entspricht dem Volumen 10 in uL der Stamml sung welches zu 1000 uL zugegeben wurde um die Verd nnung herzustellen entsprechend des angegebenen Wertes Da eine relativ gute lineare Abh ngigkeit von Standardkonzentration zu Standardabweichung bestand wurd
461. sirability Gesamtw nschbarkeit statistische Versuchsplanung d Desirability Funktion W nschbarkeitsfunktion statistische Versuchsplanung dx Zeitkonstante Boltzmann Funktion Fo Pr fgr e f r den F Test Fehlerquadratsumme ANOVA H H chster Wert der Zielgr e statistische Versuchsplanung I Identit tselement bzw Mittelwert der Zielgr e des gesamten Experiments statistische Versuchsplanung k Anzahl der Faktoren bei einem 2k faktoriellen Versuchsplan statistische Versuchsplanung m Masse m Anzahl der Gruppen statistische Versuchsplanung MFO Mittlere Fehlerquadratsumme ANOVA N Niedrigster Wert der Zielgr e statistische Versuchsplanung n Anzahl p Grad der Fraktionierung bei einem 2k p fraktionellen faktoriellen Versuchsplan statistische Versuchsplanung Le Korrelationskoeffizient Korrelationsanalyse Sy Reststandardabweichung S Gl ttungsfaktor Spline Gl ttung t h min Zeit s V m Volumen x skaliertes Niveau einer Einflussgr e statistische Versuchsplanung x Zeit Boltzmann Funktion Mittelwert aller Messungen der Variablen Korrelationsanalyse Zentrumswert Boltzmann Funktion Yi Werte der Variablen Korrelationsanalyse y zu interpolierende Variable Boltzmann Funktion mol mol Ausbeutekoeffizient Vi Zielgr e statistische Versuchsplanung z Ladung Z Zielwert der Zielgr e statistische Versuchsplanung a
462. sofortige Unterbrechung der Stoffwechselaktivit ten zu gew hrleisten um eine Umsetzung von Metaboliten nach der Probennahme zu vermeiden Solch eine Umsetzung w rde zu einem artifiziellen Abbild der Metabolitkonzentrationen f hren Ein besonders h ufig angewendetes Verfahren zum Abstoppen des Metabolismus insbesondere bei Bakterien und Hefen ist die Probennahme direkt in ein Gemisch aus gek hltem Methanol und Puffer 40 bis 50 C e 2111 In den letzten Jahren wurde allerdings in einigen Arbeiten der Verdacht ge u ert dass diese Methode des Abstoppens zu einem Verlust von Metaboliten f hren kann insbesondere bei Prokaryonten 125 134 137 Dass bei einer Probenahme in gepuffertes Methanol Metaboliten herausgel st werden belegen die Arbeiten von Maharjan und Ferenci 2003 die diese Methode als Extraktionsprotokoll f r intrazellul re Metaboliten f r coli empfohlen Dies deutet an dass h chstwahrscheinlich eine Permeabilisierung der Zellwand von E coli durch gepuffertes Methanol stattfindet Als alternatives Verfahren zum Abstoppen des Metabolismus wurde auch eine schnelle Zentrifugation genutzt 1 37 Im Falle von tierischen Zellen ist eine Anwendung von gepuffertem 3 Theoretische Grundlagen 25 Methanol zum Abstoppen des Metabolismus nicht m glich da diese Zellen nur eine Zellmembran besitzen die durch die Methode sofort zerst rt w rde F r tierisches und pflanzliches Gewebe wird typischerweise fl ssiger Sti
463. sowohl extrazellul rer und intrazellul rer Metaboliten ist in Abbildung 5 19 gegeben Bei den extrazellul ren Stoffwechselprodukten handelt es sich um die wichtigsten Substrate Glucose Glutamin Glutamat und Abfallprodukte Lactat Ammonium Die Verl ufe der Substrate zeigen deutliche Unterschiede in der Medienzusammen setzung W hrend in GMEM Z ein Anfangswert von Glucose von ber 30 mM vorlag war in EpiSerf eine Startkonzentration von etwa 8 mM zu finden Ebenso lag die Konzentration von Glutamin in GMEM Z deutlich h her 1 7 mM als in EpiSerf 0 6 mM Im Gegensatz dazu war die Konzentration von Glutamat in EpiSerf 1 4 mM erheblich h her als in GMEM Z 0 5 mM 116 5 Ergebnisse und Diskussion 35 Glucose extrazellular 30 25 gE 5 0 15 GI a 0 10 0 gt Glutamat extrazellul r 48 96 144 192 Kultivierungszeit h E Ja 5 310 2 2 0 5 a S 15 205 om 0 0 aaa oan e 48 96 144 192 g Kultivierungszeit h E g 0 5 2 0 0 4 0 Ammonium extrazellul r 0 48 96 144 192 Q Kultivierungszeit h D 2 e 5 5 0 10 2 CD 0 08 A 0 06 e 2 on 506 8 5 0 02 N 2 ZS 5 04 0 00 x g 302 o Konz cAco mM Konz PEP mM Konz Suc mM Konz Pyr mM Konz Citr mM Konz Fum mM Konz Mal mM Konz Lac mM 0 48 96 144 192 0 48 96 144
464. spensionszellen wahrscheinlich metabolische Ursachen hat sind adh rente Zellen schon vorher durch eine Limitation der Wachstumsfl che in ihrer maximalen spezifischen Wachstumsrate beeintr chtigt Scheinbar wirkt sich diese Einschr nkung nur gering auf das oben erw hnte Nukleotidverh ltnis aus Eine Theorie zu dem regulatorischen Einfluss der Metaboliten UDP GlcNAc und UDP GalNAc besagt dass durch diese Stoffwechselprodukte der wachstumsinhibitorische Effekt von Ammonium vermittelt wird So wird argumentiert dass hohe extrazellulire Ammoniumkonzentrationen in hohen intrazellul ren Konzentrationen UDP GlcNAc und UDP GalNAc resultieren Diese Metaboliten wirken wachstumsinhibierend F r die in dieser Arbeit durchgef hrten Versuche konnten aber keine direkten Zusammenh nge zwischen der Wachstumsrate und der intrazellul ren Konzentration der UDP aktivierten Aminohexosen gefunden werden Somit zeigt sich f r sowohl die spezifischen Metabolitmengen als auch f r die Metabolit verh ltnisse dass mitunter deutliche Unterschiede nicht nur zwischen verschiedenen Zelllinien sondern auch zwischen verschiedenen Arbeiten mit gleichen Zelllinien existieren Grunds tzlich kann basierend auf einem Vergleich mit der Literatur keine Bewertung der systematischen Ab weichung der hier etablierten Messmethode gegeben werden Ursache hierf r ist dass die tats ch lichen Metabolitmengen also die wahren Werte bisher nicht ermittelt wurden Di
465. spezifische Sauerstoffverbrauchs f r MDCK Zellen zwischen 8 35 x 1074 mol Zelle h und 15 60 x 107 mol Zelle h und einer maximalen Zellzahl pro Fl che von 4x 10 Zellen cm erg be sich eine maximale Fl ssigkeitsh he von 0 68 bis 0 36cm bei welcher eine Sauerstoffversorgung der Zellen gew hrleistet w re Dies w rde bedeuten dass im schlechtesten Falle dieser Berechnung keine ausreichende Sauerstoffversorgung der Zellen f r die gezeigten Versuche mehr gegeben gewesen w re Gstraunthaler et al f hrte Versuche in statischen Systemen durch wobei die Auswirkungen unterschiedlicher Glucosekonzentrationen und Mediumvolumina auf den Metabolismus von kultivierten Nierenzellen aus Schwein bzw Opossum untersucht wurden 7 Unter anderem wurden dort Verh ltnisse von Lactat zu Glucose gt 2 insbesondere bei gr eren Fl ssigkeitsh hen beobachtet Auch das Verh ltnis von Ammonium zu Glutamin war verglichen mit der Literatur erh ht 4 40 48 781 Typische Werte bewegen sich hier zwischen 0 2 0 5 bei Ber cksichtigung des Faktors 2 f r Glutamin bei einem theoretischen Maximum von 1 wenn neben Glutamin keine weiteren Amino s uren abgebaut werden Ebenso wie f r den Ausbeutekoeffizienten f r Lactat zu Glucose ist das Verh ltnis von Ammonium zu Glutamin durch die Verdunstung beeinflusst Bei Ber cksichtigung der oben erw hnten Verdunstung erg be sich f r GMEM Z ein Wert von 0 50 und f r EpiSerf von 1 92 Da aber auch eine bet
466. ss von Glucose auf die oxidative Phosphorilierung in einem kurzen Zeitraum lt 1 h nach einem Glucosepuls In Tumorzellen konnte eine bergangsweise verminderte Zellatmung als Folge eines Glucosepulses gezeigt werden Als Ursache wurde eine durch die hohe Glykolysegeschwindigkeit ausgel ste niedrige Konzentration von ADP und P ausgemacht Durch diesen Mangel kann mitochondrial kein ATP erzeugt werden Dieses Ph nomen wurde in zahlreichen Arbeiten untersucht und ist unter dem Namen Crabtree Effekt beschrieben 56 8590 F r Hefen und Bakterien wurde ein hnliches Ph nomen beobachtet und ebenfalls Crabtree Effekt benannt allerdings wurde eine andere Ursache ermittelt Es handelt sich hierbei um eine Katabolitrepression was bedeutet dass die Expression von gewissen katabolen Enzymen durch Glucose unterdr ckt wird P 3 1 6 Nukleotidstoffwechsel Nukleotide sind intrazellul re Metaboliten mit au erordentlich wichtiger Bedeutung f r den Stoffwechsel Viele von ihnen nehmen an zahlreichen Stoffwechselreaktionen entweder als Substrat und oder als Effektor der Reaktion teil HU In ihrer Funktion als Cofaktoren in Redoxreaktionen sind vor allem NAD NADP und Flavin Adenin Dinukleotid FAD bzw die entsprechenden reduzierten Formen zu nennen Ein weiteres Nukleotid von essentieller Bedeutung f r alle lebenden Organismen ist ATP Dieser Metabolit dient als Energie bertr ger bzw Energiedonor aber auch in regulatorischer Hinsicht ist
467. ssen wurden oder solch starke Konzentrations nderungen unter den getesteten Bedingungen nicht auftraten Der mittelfristige Abfall von ATP und der Anstieg von ADP und AMP der sich im Abfall der Energy Charge widerspiegelte schien ein anderes Ph nomen zu sein als die in der Literatur beschriebenen kurzzeitigen Konzentrations nderungen innerhalb von 1 2 min Allerdings war dieser l ngerfristige Abfall der Energy Charge auch in den ersten Stunden der Kultivierungsexperimente zu beobachten wodurch diese Beobachtung best tigt wurde Bez glich der Konzentrationsverl ufe der Hexosephosphate ist besonders hervorzuheben dass von Sussman et al wie auch Wu und Racker ein qualitativ identisches Verhalten f r G6P und Fl6bP gemessen wurde wie in der hier vorliegenden Arbeit 8 DI Dies bedeutet dass auch in den dort untersuchten Tumorzellen der Konzentrationsanstieg von F16bP deutlich schneller erfolgte als f r G6P 5 Ergebnisse und Diskussion 159 Die Konzentrationen von organischen S uren aus dem Krebszyklus wurden bei den hier erw hnten Arbeiten selten untersucht Von Glaser et al 1980 wurden die Konzentration von Citrat nach einer Glucosezugabe gemessen um den regulatorischen Einfluss dieses Metaboliten auf die Aktivit t der Phosphofructokinase zu untersuchen 01 Zum Zeitpunkt der Glucosezugabe konnte kein Citrat gemessen werden und nach 5 min wurde ein klarer Konzentrationsanstieg verzeichnet Qualitativ stimmt dies gut mit den in de
468. st ausschlie lich schwache oder keine Korrelationen zu anderen Metaboliten auf Der Grund liegt hier sicherlich in der Tatsache dass f r diese Metaboliten deutlich unterschiedliche Verl ufe in Abh ngigkeit insbesondere vom Medium auftraten Grunds tzlich deutet dies auf eine Schl sselstelle im Metabolismus der Zellen hin da dort scheinbar regula torische Unterschiede in Abh ngigkeit von den gew hlten Versuchsbedingungen auftraten was sich letztlich in unterschiedlichen Konzentrationsverl ufen u erte 255 2561 Neben den positiven Korrelationen der Zuckerphosphate und einiger Metaboliten aus dem Krebszyklus waren einige relativ hohe positive Korrelationswerte f r Nukleotide zu finden Grund hierf r K nnte sein dass Nukleotide durch schnelle Gleichgewichtsreaktionen ineinander umgewandelt werden k nnen Nukleosiddiphosphat Kinase Nukleotidkinasen Dh Gerade bei Triphosphaten war eine klare Unterscheidung zwischen den Pyrimidinnukleotiden CTP und UTP und den Purinnukleotiden ATP und GTP zu erkennen die sich entsprechend gruppieren lie en Dies stimmt mit der Literatur berein so haben bereits Ryll und Wagner 1992 eine entsprechende Gruppierung dieser Metaboliten bei der Charakterisierung von Produktionszelllinien eingef hrt um das gleichartige Verhalten gemeinsam zu beschreiben DI Diphosphate hingegen lie en sich nicht derart gruppieren Mit Ausnahme von ATP und GTP waren alle Nukleotide positiv untereinander korreliert AT
469. stellt sind nur die Korrelationen zwischen aufeinanderfolgenden Metaboliten Der gr ne Pfeil deutet die Aktivierung der Pyruvat Kinase durch F16bP an der rote Pfeil die m gliche Inhibierung der Phosphofructokinase durch Citrat Weiterhin waren R5P und F16bP stark korreliert obwohl diese beiden Metaboliten durch eine Reihe von Reaktionsschritten verbunden sind Wie sich in der Zusammenfassung aller Experimente Abbildung 5 15 erkennen l sst waren RSP und F16bP in der Mehrzahl der hier durchgef hrten Experimente positiv korreliert Somit ist eine gemeinsame Regulation unter den untersuchten Bedingungen m glich Ein weiteres stark korrelierendes Metabolitpaar ist 3PG und PEP Auch in der Zusammenfassung aller Experimente Abbildung 5 15 waren diese beiden Glykolyse intermediate positiv korreliert wenn auch nicht sehr stark Diese beiden Metaboliten sind ber die zwei Enzyme Phosphoglycerat Mutase und Enolase miteinander verbunden Diese beiden Enzyme sind aus der Literatur als sehr aktiv und reversibel bekannt so dass das hier vorgefundene Korrelationsverhalten zu erwarten war Eine weitere positive Korrelation war f r Citrat und Malat zu finden wobei aber der Verlauf von Malat dem von Citrat in beiden Experimenten vorausging Allerdings ist besonders hier das metabolische Netzwerk zu komplex als dass eine Interpretation basierend auf den Daten sinnvoll erschiene Wie in Abbildung 5 34 zu erkennen waren F16bP und 3PG negativ korreliert D
470. stogramme f r Zellvolumina zu den Zeitpunkten 7 h 30 h und 55 h nach Zelleinsaat f r zwei unterschiedliche Methoden der Bestimmung Adh rente Zellen mikroskopisch schwarz und trypsinierte Zellen mittels ViCell XR rot Zahlen an der x Achse repr sentieren den Mittelwert der jeweiligen Klasse Durchf hrung in Sechs Well Platten die Trypsinierungszeit betrug 30 die Summe der Zellen in jedem Histogramm und f r beide Methoden ergibt 100 per definitionem mikroskopische Bestimmung nach F rbung der Zellen entsprechend Abschnitt 4 3 3 Bei beiden Methoden der Bestimmung der Zellvolumina zeigte sich dass bei 7h eine enge Verteilung der Volumina mit kleinem durchschnittlichen Volumen ViCell XR 2500 um Mikroskop 4100 um vorlag Bei 30 h war die Verteilung f r beide Methoden etwas breiter und das mittlere Volumen gr er als bei 7h ViCell XR 3000 um Mikroskop 7200 um Zum Zeitpunkt 55h nach Inokulation war das mittlere Volumen wieder etwas kleiner ViCell XR 2700 um Mikroskop 2600 um und insbesondere die mikroskopisch bestimmten Volumina der adh renten Zellen zeigten eine sehr schmale Verteilung Deutliche Unterschiede sind f r die beiden Methoden zu erkennen So war das durchschnittliche Zellvolumen bei 30 h bei mikroskopischer Bestimmung doppelt so gro wie bei Bestimmung mittels ViCell XR Der qualitative Verlauf der Zellvolumina war dennoch gleich und entsprach dem in Abbildung 5 12 B gezeigten Verhalten
471. t Histidin High Performance Liquid Chromatography Isoleucin Isoc Lac LF LSM Mal MDCK MeOH Met MS NAD H PBS PCS PEP PP Pro Pyr Rap rp S17bP SEM Ser Suc TCS Thr Trp TTP Tyr UDP UDP Gal UDP GalNAc UDP Glc UDP GIcNAc UDP GNAc UMP UTP a KG Isocitrat Lactat Leitf higkeit Laser Scanning Microscope Malat Madin Darby canine kidney Methanol Methionin Massenspektrometrie Nicotinamid Adenin Dinukleotid Nicotinamid Adenin Dinukleotid Phosphat Nukleosiddiphosphat Nukleosidmonophosphat Kernresonanzspektroskopie Nukleosidtriphosphat Phosphat gepufferte Kochsalzl sung Perchlors ure Phosphoenolpyruvat Pyrophosphat Prolin Pyruvat Ribose 5 Phosphat reversed phase Sedoheptulose 1 7 Bisphosphat Standardfehler des Mittelwertes Serin Succinat Trichloressigs ure Threonin Tryptophan Thymidintriphosphat Tyrosin Uridindiphosphat Uridindiphosphat Galactose Uridindiphosphat N Acetyl Galactosamin Uridindiphosphat Glucose Uridindiphosphat N Acetyl Glucosamin Summe von UDP GlcNAc und UDP GalNAc Uridinmonophosphat Uridintriphosphat Ultraviolett a Ketoglutarat Symbole Symbol Einheit Beschreibung Effekt statistische Versuchsplanung a b charakteristische Versuchseinstellung statistische Versuchsplanung A Anfangswert Boltzmann Funktion Endwert Boltzmann Funktion D Overall De
472. t bernommen wurde enthielt folgende Substanzen Fluorid Phosphat Chlorid Nitrat Sulfat Formiat Pyruvat Succinat Malat a Ketoglutarat Fumarat Citrat Isocitrat GAP 2PG 3PG PEP ADP und ATP Da sich allerdings die Chromato gramme der Extraktionsproben deutlich von denen der Standardmischung unterschieden war im weiteren Verlauf sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Anpassung n tig Da zum da maligen Zeitpunkt noch keine verl ssliche Extraktionsmethode gefunden war war es erforderlich der Entwicklung der Extraktionsmethode zu folgen und dementsprechend das Gradientenprogramm und den Standard immer wieder der Zusammensetzung der Extraktionsproben anzupassen 5 1 1 1 Optimierung des Gradientenprogramms zur Elution der Metaboliten Die Voraussetzung f r die Quantifizierung von Metaboliten war die Identifizierung der ent sprechenden Substanzen in den Extraktionsproben Dies sollte durch den Vergleich von Retentions 50 5 Ergebnisse und Diskussion zeiten im Leitf higkeits und UV Kanal und durch Standardzugabe zu Extraktionsproben erfolgen In diesem Prozess wurden im Verlauf der Arbeit ber 60 verschiedene potentiell intrazellul r auftretende Metaboliten chromatographisch auf ihre Retentionszeit getestet Die Auswahl der getesteten Metaboliten wurde anhand der Literatur getroffen wobei Metaboliten ausgeschlossen wurden die grunds tzlich auf der entsprechenden Chromatographieanlage nicht analysiert werden ko
473. t 0001 0 814 lt 0001 0 734 lt 0001 Vol MeOH 0 150 lt 0001 0 061 0 1325 0 041 0 0221 0 124 lt 0001 Tricine Conc 0 019 0 2363 0 038 0 2491 0 026 0 0672 0 045 0 0026 Kochen 0 010 0 6988 0 276 0001 0 021 0 3463 0 054 0 0163 Vol MeOH x Kochen 0 008 0 7067 0 111 0 0169 0 003 0 8811 0 006 0 7425 Vol MeOH x Vol MeOH 0 057 0 0004 0 096 0 0026 0 016 0 2061 0 017 0 1661 Kochen x Kochen 0 010 0 6394 0 141 0 0027 0 019 0 2896 0 022 0 2248 B MeOH CHCI Zielgr e Nukleotidgehalt Energy Charge F16bP Gehalt Absorp 280 nm transformiert 0 970 0 936 0 982 0 829 Anova p Wert lt 0001 lt 0001 0 0047 lt 0001 Term Sch tz p Wert Sch tz p Wert Sch tz p Wert Sch tz p Wert Schnittpunkt 1 465 lt 0001 0 951 lt 0001 0 751 lt 0001 0 810 lt 0001 Vol CHCl 0 316 lt 0001 0 051 lt 0001 0 039 0 2614 0 192 lt 0001 Vol MeOH 0 258 lt 0001 0 045 lt 0001 0 171 0 0005 0 115 lt 0001 Tricine Conc 0 054 0 1878 0 005 0 1496 0 010 0 7643 0 059 0 0033 Vol CHCl x Vol MeOH 0 084 0 1258 0 025 0 0003 0 137 0 0110 0 071 0 0051 Vol CHCl x Vol CHCl 0 123 0 0166 0 012 0 0089 0 012 0 7378 0 074 0 0015 Vol MeOH x Vol MeOH 0 031 0 4767 0 014 0 0038 0 076 0 0650 0 074 0 0015 oyu
474. t dass f r eine verl ssliche Quantifizierung von intrazellul ren Metaboliten eine Anpassung der Methode an die vorliegenden experimentellen Bedingungen erforderlich ist Aufgrund der gro en Anzahl an Einflussgr en auf den Prozess der Probenvorbereitung ist eine systematische Vorgehensweise sinnvoll um auf effizientem Wege eine geeignete Probenvorbereitung zu etablieren In der hier vorliegenden Arbeit wurde hierf r auf statistische Versuchsplanung zur ckgegriffen 3 5 Grundlagen der statistischen Versuchsplanung Eine Methode zur effizienten Planung von Experimenten basiert auf statistischer Versuchsplanung 45 2491 Ein Vorteil der statistischen Versuchsplanung ist dass im Vergleich zu herk mmlichen 3 Theoretische Grundlagen 27 Arten der Versuchsplanung Ein Faktor zu einem Zeitpunkt weniger Ressourcen erforderlich sind um Aussagen zur Signifikanz der Effekte von Einflussgr en zu erhalten Bei statistischer Versuchsplanung gibt es drei wichtige Prinzipien Wiederholung Randomisierung und Blockbildung Bei der Auswertung kommen h ufig graphische Methoden zum Einsatz Weiterhin werden die Zusammenh nge zwischen Einfluss und Zielgr en oft durch empirische Modelle beschrieben Basierend auf diesen Resultaten werden anschlie end praktische Schlussfolgerungen gezogen und meist Folgeexperimente durchgef hrt In vielen Experimenten sollen zwei oder mehrere Einflussgr en Faktoren untersucht werden H ufig ist hierf
475. t H Z N 3 7 H Z 3 8 1 f r y Z 0 f r y gt H Desirability Funktion d Niedrigster Wert der Zielgr e N Zielwert der Zielgr e 2 Zielgr e y H chster Wert der Zielgr e H Exponent zur Gewichtung x Eine Gewichtung der verschiedenen Zielgr en kann ber den Exponenten x erfolgen W hrend Werte f r gt 1 ein gr eres Gewicht verleihen ist bei O lt x lt 1 die entsprechende Zielgr e weniger wichtig Graphisch dargestellt sind die verschiedenen M glichkeiten in Abbildung 3 7 ber das geometrische Mittel werden somit die einzelnen Zielgr en im Anschluss kombiniert und durch den Exponenten x in den Gleichungen 3 7 und 3 8 kann jede Zielgr e individuell gewichtet werden Somit bietet dieses Verfahren eine gute M glichkeit zur simultanen Optimierung anhand mehrerer Zielgr en A 1 A CL aan gt 1 gt 0 gt 2 0 2 H Abbildung 3 7 Graphische Darstellung der verschiedenen M glichkeiten der Gewichtung der Zielgr en durch den Exponenten f r zu maximierende A und zu minimierende Zielgr en y stellt die Zielgr e d die Desirability dar N ist der niedrigste Werte Z der angestrebte Wert und H der h chste Wert 3 6 Korrelationsanalyse von Daten intrazellul rer Metaboliten Ein typisches Vorgehen bei der Auswertung von Messdaten ist die Darstellung der Messgr e ber die Zeit wodurch das zeitliche Verhalten der Messgr e dokumentiert werden k
476. telwert der relativen Standardabweichung ber alle Klassen alle Metaboliten und die drei Detektoren betrug 11 5 F r die einzelnen Detektoren zeigte sich dass ber alle Klassen und alle entsprechend ausgewerteten Analyten die gr te relative Standardabweichung bei der MS Detektion auftrat 14 0 gefolgt von Leitf higkeitsdetektion 10 2 und UV Detektion 7 8 Die Mittelwerte der relativen Standardabweichung ber alle Detektoren und Metaboliten f r die unterschiedlichen Klassen waren mit Ausnahme der ersten Klasse niedrigster Messwert bei ca 10 wohingegen die relative Standardabweichung der ersten Klasse 21 3 betrug Auch bei Be gutachtung der relativen Standardabweichungen der einzelnen Detektoren ber die verschiedenen Klassen zeigte sich dass durchwegs der erste Wert deutlich gr er war als f r die f nf weiteren Klassen Grunds tzlich war auch f r die meisten einzelnen Analyten das hier beschriebene Verhal ten der relativen Standardabweichung zu beobachten Des Weiteren waren relative Standardab weichungen von niedrig konzentrierten Metaboliten tendenziell h her So lag beispielsweise der Mittelwert der relativen Standardabweichung ber alle Klassen f r CMP UV bei ca 18 2 bei einem mittleren Messwert von 0 26 uM F r ATP UV wurde hier eine relative Standardab weichung von 2 4 bei einem mittleren Messwert von 34 1 uM bestimmt Im weiteren Verlauf der Arbeit stellen Fehlerbalken bei Konzentrationsverl ufen von int
477. ten dieser Doktorarbeit kl ren konnten Allen weiteren Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Bioprozesstechnik danke ich ganz herzlich f r die sch ne Zeit und die am santen aber auch interessanten Gespr che w hrend gemeinsamer Kaffee oder Mittagspausen Allen voran waren f r mich die anderen Doktoranden der ersten Stunde unersetzbare Wegbegleiter ohne die ich diese Arbeit wahrscheinlich nicht zu Ende gebracht h tte Meinen Eltern danke ich von ganzem Herzen f r die Unterst tzung in allen Lebenslagen wie auch f r den charakterlichen Grundstein der mich zu dem Menschen hat werden lassen der ich bin Der gr te Dank gilt aber meiner Frau Anett die mir die Perspektive f r ein sinnerf lltes Leben bietet Kurzfassung Tierische Zellkulturen werden zu verschiedensten Zwecken eingesetzt wie z B f r Toxizit ts studien oder auch zur Herstellung von Biopharmazeutika Seit den Anf ngen der Zellkultur wurden Zellen aus unterschiedlichsten Organen und Organismen isoliert Ein nahezu generell vorgefundenes Ph nomen bei tierischen Zellkulturen ist der ineffiziente Abbau der Energiesubstrate verglichen mit Zellen im Gewebe Trotz jahrzehntelanger Forschung zu diesem Thema ist die Ursache dieses ver nderten Stoffwechsels weiterhin unklar und zus tzliche Arbeiten sind erforderlich um diese Fragestellung zu kl ren Anhand einer Charakterisierung tierischer Zellkulturen basierend auf den intrazellul ren Konzentrationen von Metabo
478. ter Abfall der Konzentration einzutreten Die Konzentrationen der im Krebszyklus folgenden Metaboliten Fumarat nicht gezeigt und Malat waren einander sehr hnlich Nach einem Konzentrationsanstieg bis zu einem Maximum bei etwa 0 5 min sanken die Werte bis ca 7 min auf etwa die H lfte des Ausgangswertes Daraufhin folgte 5 Ergebnisse und Diskussion 149 ein Bereich mit relativ konstanter Konzentration bzw einem leichten Anstieg Nach etwa 40 min setzte ein erneutes Abfallen der Konzentration bis zum Ende der Experimente ein Somit zeigten alle Metaboliten aus Glykolyse und Krebszyklus mit Ausnahme von 3PG und PEP sp testens 30 min nach dem Entfernen des Zellkulturmediums einen deutlichen Konzentrations abfall Allerdings waren in den Verl ufen erhebliche Unterschiede zu sehen W hrend bei den Zuckerphosphaten ein relativ schnelles Abfallen der Konzentration gemessen wurde fand bei den meisten organischen S uren zuerst ein leichter Anstieg statt Abbildung 5 29 zeigt die Verl ufe ATP UDP GlcNAc und der Energy Charge Im Allgemeinen waren die nderungen der Nukleotide und Zuckernukleotide nach dem Entfernen des Mediums deutlich geringer als bei den Metaboliten aus Glykolyse und Krebszyklus Insbesondere ATP CTP nicht gezeigt und UDP GlcNAc waren nahezu konstant ber den untersuchten Zeitraum Alle Nukleosidmonophosphate und diphosphate verhielten sich hnlich nicht dargestellt Bis ca 0 5 min fand ein leichter Anstieg sta
479. terpretation der Kreuzkorrelationsmatrix empfiehlt sich hier die gut bekannten Parameter wie Zellzahl Gesamtzellvolumen und extrazellul re Metabolitkonzentrationen zuerst zu begutachten Zellzahl und Gesamtzellvolumen waren bei einem Zeitversatz von 10h stark positiv miteinander korreliert Dieser Zusammenhang zwischen Volumen und Zellzahl ist seit langem bekannt und rechnerisch sind diese Variablen durch den Faktor des Einzelzellvolumens miteinander verkn pft Wie oben beschrieben erfolgte normalerweise zuerst eine Volumenzunahme der Zellen bevor der erste nachweisbare Anstieg der Zellzahl zu verzeichnen war Dieses Ph nomen entspricht den Angaben aus der Literatur dass nach der Einsaat der Anteil der Zellen in der S Phase des Zellzyklus zunimmt was mit einer Volumenzunahme direkt in Verbindung steht 78778 291 293 294 Ein weiterer gut bekannter Zusammenhang bestand zwischen den extrazellul ren Konzentrationen von Glucose und Lactat Da Glucose von MDCK Zellen typischerweise zum Gro teil in Lactat 5 Ergebnisse und Diskussion 109 umgesetzt wird war die negative Korrelation zwischen diesen beiden Variablen leicht nachzu vollziehen Ebenso ist die wenn auch schwache negative Korrelation zwischen Glutamin und Glutamat mit Ammonium ein gut bekanntes Ph nomen Zellzahl und Volumen waren mit relativ vielen intrazellul ren Metabolitverl ufen negativ korreliert Im Grunde spiegelt dies die Tatsache wider dass die Zellzahl und da
480. terschiedlichen Metaboliten stattfindet Auf diese Weise sollten Einblicke in die Dynamik der Substrataufnahme bzw des Abbaus der Substrate erzielt werden In diesem Experiment konnten f r die meisten Metaboliten deutliche Konzentrations nderungen gemessen werden Auff llig bei den Verl ufen in Abbildung 5 31 ist dass der Konzentrations anstieg von G6P langsamer erfolgte als f r F16bP Ein Grund hierf r k nnte sein dass G6P direkt zu F16bP weiterverarbeitet wird und erst dort ein metabolischer Engpass existiert der anschlie end zu einer Art R ckstau der Stoffwechselprodukte f hrt Dies hie e dass der geschwindigkeitsbe stimmende Schritt die Umsetzung von F16bP darstellt Weiterhin ist der Konzentrationsabfall von 3PG im Anschluss an die Zugabe des Mediums ein interessanter Aspekt Grunds tzlich war hier wieder ein inverses Verhalten zu Hexosephosphaten zu erkennen Wie bereits oben erw hnt war wahrscheinlich die Funktion von F16bP als Aktivator der Pyruvat Kinase von entscheidender Bedeutung Jedoch fiel hier verglichen mit Abbildung 5 28 die Konzentrations nderung von 3PG deutlich schw cher aus Die Ursache f r die relativ starken Schwankungen der Pyruvatkonzen tration konnte nicht gekl rt werden In wie weit hier von zuf lligen Schwankungen bedingt durch Messfehler oder die biologische Variabilit t ausgegangen werden muss oder ob hier tats chliche starke Schwankungen der intrazellul ren Pyruvatkonzentration m glicherw
481. tionskoeffizienten verdeutlicht aber ganz klar wo das Korrelationsverhalten zwischen Metaboliten in Abh ngigkeit vom Medium stark ver ndert war Insbesondere f r die extrazellul ren Metaboliten die Zellzahl und das Volumen wie auch die Zuckerphosphate zeigten sich keine Unterschiede zwischen den beiden Medien Besonders auff llige Differenzen waren f r Pyruvat und ATP ist zu erkennen Weniger offensichtlich waren die Unterschiede f r die Metaboliten a Ketoglutarat GDP UDP GlcNAc und UDP GalNAc Grunds tzlich spiegeln diese Unterschiede die schon im Zusammenhang mit Abbildung 5 19 und Abbildung 5 20 bemerkten klaren Unterschiede in den Verl ufen wider Gesamtellvolumen Glucose Lactat a Ketoglutarat Succinat Energy Charge cis Aconitat Isocitrat Zellzahl Glutamin Glutamat Ammonium RSP 1 G6P F6P F16bP 3PG PEP Pyruvat Citrat Fumarat Malat CMP UMP AMP GMP CDP UDP ADP GDP CTP UTP UDP GalNAc UDP GIcNAc UDP Glc GTP Zellzahl Gesamtzellvolumen Glucose Lactat Glutamin Glutamat Ammonium RSP FIP G6P F6P F16bP 3PG PEP Pyruvat IW F 40 5 Citrat cis Aconitat Isocitrat a Ketoglutarat Succinat Fumarat Maat A UMP e H 1 05 AMP GMP UDP a ADP GDP ei DW ER UTP CR Ca 15 Extrazell E ate A Glykolyse
482. tivierungsbedingungen bzw des Zellkulturmediums DT Es konnte eine klare Abh ngigkeit des intrazellul ren Nukleotidgehalts vom Medium gezeigt werden Die meisten Nukleotide lagen in vergleichbaren Bereichen wenn auch z B UTP Mengen bis 26 6 fmol pro Zelle von Burgener et al bestimmt wurden Zum Teil wurden also erheblich h here Werte ermittelt als in der hier vorliegenden Arbeit Weiterhin ist der Bereich f r GTP f r die Arbeit von Burgener et al etwas h her als der Bereich der GTP Werte f r Vero Zellen der hier vorliegenden Arbeit Als Erkl rung f r die Diskrepanzen kann auch hier wiederum der unterschiedliche Ursprung der Zellen wie auch die Probenvorbereitung aufgef hrt werden Die von El Bacha 2 bestimmten Werte f r ATP in Vero Zellen lagen deutlich unter den in der hier vorliegenden Arbeit Als Ursache f r diese Diskrepanz werden methodische Unterschiede angenommen F r eine Vielzahl von weiteren Zelllinien wurden zellspezifische Nukleotidmengen im femto molaren Bereich bestimmt Typischerweise wurden f r ATP die h chsten Mengen und f r Nukleosidmonophosphate die niedrigsten Mengen bestimmt H7 181 226 236 2801 Organische S uren wurden von Lu et al 2003 2005 f r CHO Zellen gemessen P 9 Die zellspezifischen Werte lagen f r Citrat und Malat in den unteren Bereichen der Werte die in der hier vorliegenden Arbeit gemessen wurden Cis Aconitat jedoch wurde von Lu et al vergleichsweise hoch konzentriert vorgefunden F
483. tlich besser zu beschreiben w re Auch k nnen Korrelationskoeffizienten erheblich durch Ausrei er beeinflusst sein Beide hier genannten Probleme k nnen in Streudiagrammen erkannt werden Wichtig zu erw hnen ist dass der Korrelationskoeffizient keine Aussagen zu Ursache und Wirkung zul sst da es sich bei einer hohen Korrelation z B auch um eine rein zuf llige Koinzidenz handeln kann F r mehr als zwei Variable bietet sich die Darstellung der Korrelationskoeffizienten in Form einer Korrelationsmatrix an wobei sowohl auf der x als auch y Achse die Variablen aufgetragen sind Die einzelnen Korrelationskoeffizienten f r die verschiedenen Kombinationen der Metaboliten sind in den ent sprechenden Feldern eingetragen Ein Schema einer Korrelationsmatrix ist in Tabelle 3 2 gezeigt Tabelle 3 2 Schematischer Aufbau einer Korrelationsmatrix X o Xn x 1 Tr F s F Tin X2 r12 1 F23 2 Van X3 113 123 1 73 Tr 1 Xn Fin Yan 3n Tn 1 x bis x entsprechen den zu korrelierenden Variablen in den Matrixfeldern zwischen den Variablen sind die verschiedenen Korrelationskoeffizienten eingetragen in der Diagonalen von links oben nach rechts unten ist immer r 1 da dieser Wert die perfekte positive Korrelation der jeweiligen Variablen mit sich selbst wiedergibt diese Diagonale stellt auch die Spiegelachse dar an welcher die beiden identischen H
484. tration Tricine wurden in diesem Versuch genauer berpr ft Die untersuchten Niveaus sind in Tabelle 4 4 C gezeigt Wiederum erfolgte eine Anpassung der Daten an eine Gleichung des Typs der Gleichung 3 6 Die Zielgr e Nukleotidgehalt konnte nicht zufriedenstellend angepasst werden weshalb eine Transformation gem 5 2 durchgef hrt wurde Eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse ist im Anhang in Tabelle A 11 angegeben Wie auch bei der Optimierung der Methode MeOH Kochen wurden f r diese Optimierung der Methode MeOH CHC die gleichen Desirability Funktionen wie f r das vorangegangene fraktionelle Experiment gew hlt Die Optimierung mit Hilfe der Desirability Funktionen lieferte folgende Arbeitsbedingungen Volumen MeOH 652 uL Volumen 1 673 uL Konzentration Tricine 3 9 mM Diese Werte korrespondieren mit einer Overall Desirability von 0 75 F r die Zielgr en sollten sich bei diesen Extraktionsbedingungen folgende Werte auf das gemessenen Maximum normiert ergeben Energy Charge 0 99 Nukleotidgehalt 0 96 F16bP Gehalt 0 88 Absorption 280 nm 0 62 Der relativ niedrige Wert f r die Overall Desirability kann mit einem Blick auf die wei en Diagramme in Abbildung 5 9 B erkl rt werden Manche Faktoren hatten einen gegens tzlichen Einfluss auf die Zielgr en So lag z B das Maximum der Energy Charge bei hohen Volumina f r MeOH das Maximum f r den Nukleotidgehalt hingegen fand sich bei niedrigen Volumina f r
485. trolle MS Aktuelles Gradienten Autosamplerplans Detektor Chromatogramm TIC e im DX 320 Control Panel Autosampler connect auf Tray 4 C klicken um auf die Temperatur von 4 zu kommen Ofentemperatur auf 25 C einstellen in DX 320 Control Panel gt Command Sampler gt Column Temperature auf 25 C execute Pumpe connect Eluent A auf 100 einstellen und mit der Spritze entgasen Flussrate 0 35 ml min Bevor die Pumpe eingeschaltet wird m ssen die S ulen auf 25 C hochheizen Anhang 01 07 2008 G_6_Arbeitsanweisung_DX320_090123_jr6 ie Pumpe ca 30 min laufen lassen Suppressor auf 50 mA ansetzen und 15 min laufen lassen bis die Basislinie sich stabilisiert Die Reihefolge und die Wartezeiten sind unbedingt einzuhalten um die Lebensdauer des Suppressors zu erh hen und die Sensivit t der Messung zugew hrleisten Lampe anschalten Es wird bei A 220 nm oder 260 nm absorbiert MS Detektor connect Pumpe AXP f r Cone Wash on Fluss auf 0 15 ml min AXP Pumpe fiir Regeneration starten Fluss mindestens 0 3 ml min Eluentengenerator auf 100 stellen manuelle Aufzeichnung starten Nach ca 5 min kommt ein gro er Peak im Leitf higkeitskanal Verunreinigungen anschlie end pendelt sich das Signal auf einem konstanten Plateau ein Je nach Leistungsf higkeit des Suppressors ist dieses Signal h her oder niedriger Nach 10 min Eluentenge
486. tt danach fiel die Konzentration dieser Metaboliten langsam ab Weiterhin ist die Energy Charge gezeigt allerdings fand bei dieser Variablen keine Normierung auf den Anfangswert statt Nach einem relativ hohen Anfangswert sank die Energy Charge bis etwa 0 5 min wonach ein Anstieg folgte der sein Maximum nach etwa 40 min hatte Anschlie end deutete sich ein Abfall der Energy Charge an Der Anstieg der Energy Charge trotz Abfall der ATP Konzentration kann durch den Abfall der Konzentrationen von sowohl ADP als auch AMP erkl rt werden 8 Energy Charge Ei lt gt 4 Rel Konz Rel Konz UDP GicNAc 0 3 3 30 0 03 0 3 3 30 Zeit min Abbildung 5 29 Verldufe der intrazellul ren Konzentrationen von ATP und UDP GIcNAc sowie der Energy Charge in MDCK Zellen in einem Zeitraum von 2 h nach dem Ersetzen des Zellkulturmediums durch PBS Aufgetragen sind relative Konzentrationen normiert auf den Anfangswert des jeweiligen Experiments f r die Energy Charge erfolgte keine Normierung Experiment 1 A Experiment 2 o Experiment 3 Um eine logarithmische Darstellung zu erm glichen wurde der erste Messpunkt vor dem Austausch des Mediums durch PBS auf einen Zeitpunkt t 0 03 min positioniert Wie schon bei den Kultivierungsexperimenten erw hnt ist f r einen besseren berblick des Verhaltens der verschiedenen Metaboliten die Darstellung in Form einer Kreuzkorrelationsmatrix gew hlt worde
487. tunden was tats chlich vorhandene Unterschiede in den Metabolitkonzentrationen erkl ren kann s Abbildung 5 19 Auch andere als nicht relevant erachtete oder nicht bedachte Einflussgr en Zufallsgr en k nnten Ausl ser f r eine erh hte Variabilit t gewesen sein Da allerdings alle in Erw gung gezogenen Zufallsgr en so gut wie m glich konstant gehalten wurden k nnen hier keine weiteren Variablen genannt werden die f r diese Erkl rung in Frage k men 5 2 7 4 Vergleich der optimierten Methoden und abschlie ende Modifikationen Der Vergleich der Methoden bez glich der Wiederfindung ohne Zellen konnte klar zeigen dass chemische und physikalische Verluste nur sehr gering ausfallen Die geringf gig niedrigeren Werte 92 5 Ergebnisse und Diskussion f r die Methode MeOH Kochen k nnten eventuell auf eine thermische Zersetzung einiger Metaboliten hindeuten Eine alternative Erkl rung w re dass die zweite Extraktion die bei der Methode MeOH CHC durchgef hrt wurde eine bessere Wiederfindung bewirkte Beide Theorien wurden in fr heren Versuchen untersucht nicht gezeigt Konnten dort aber nicht best tigt werden Eine Erkl rung f r die niedrigere Wiederfindung f r die gr ere Menge an zugegebenem Standard kann au er m glichen Fehlern beim Pipettieren nicht gegeben werden Die Unterschiede der zellspezifischen Metabolitmengen zwischen den beiden Methoden wie sie in 5 2 3 2 beschrieben wurden sind
488. u Tag und von langen Messsequenzen bis zehn Tage ber cksichtigt kann gut mit der unter 96 5 Ergebnisse und Diskussion 5 1 1 5 ermittelten Gleichung gesch tzt werden s Tabelle A 9 im Anhang Diese Pr zision d rfte bei der Beurteilung der Qualit t von Messungen von z Suspensionszellen als Anhaltspunkt dienen bevor eine intensivere Untersuchung der Varianz f r die spezielle Probenvorbereitung erfolgen kann Weiterhin k nnte basierend auf dieser Sch tzung der Standardabweichung eine gewichtete Kalibration eingef hrt werden Verglichen mit den g ngigen Verfahren zur Bestimmung der Pr zision im Bereich des Metabolic Profiling stellt dieses Verfahren wahrscheinlich eine Verbesserung der Einsch tzung der tats chlichen Messgenauigkeit dar Typische Verfahren basieren auf einer Validierung im oben beschriebenen Sinne s Abschnitt 5 1 1 2 wobei unter relativ artifiziellen Bedingungen eine Kalibrierung bzw Wiederholungsmessungen durchgef hrt wurden 3 177 18 195 196 286 Dies bedeutet dass h ufig eine Messung der Validierungsproben direkt hintereinander stattfindet wodurch die Schwankungen naturgem vergleichsweise klein sind Gerade im Falle einer Messung mit einem ESI MS Detektor treten im Laufe von l ngeren Messsequenzen typischerweise Schwankungen des Messsignals durch ger tebedingte instabile Parameter oder Verschmutzung verschiedener Bauteile des MS Detektors durch Probenablagerungen auf H Das wahrscheinlich h ufig
489. uantifizierung der Metaboliten 2 B chromatographisch oder enzymatisch Abbildung 3 3 Schema f r den Ablauf einer typischen Probevorbereitung f r die Bestimmung von intrazellul ren Stoffwechselprodukten in kultivierten tierischen Zellen f r jeden Schritt existieren mehrere m gliche Behandlungsmethoden Bei der Etablierung einer Extraktionsmethode ist neben den Eigenschaften der zu analysierenden Metaboliten die Art und der Zustand der Probe von gro er Bedeutung Allen voran m ssen die Charakteristika des zu untersuchenden Organismus ber cksichtigt werden aber auch das Kulturmedium oder die Art der Kultivierung Unterschiedlichste Proben wurden in der Vergangenheit in Metabolic Profiling Studien des Zentralstoffwechsels untersucht So wurden unter 31 184 187 196 208 Hefen 202 209 212 oder Pflanzen 131 176 200 anderem Prokaryonten analysiert F r alle diese Proben wurden individuelle Probenvorbereitungen genutzt wobei generell die zwei Hauptabschnitte Abstoppen des Metabolismus Extraktion der Metaboliten der Probenvorbereitung ber cksichtigen wurden welche in den n chsten Abschnitten n her beschrieben werden 3 4 1 Abstoppen des Metabolismus Ein entscheidender Schritt bei der Probenvorbereitung zur Analyse intrazellul rer Metaboliten ist das Abstoppen des Stoffwechsels metabolisches Quenching Da verglichen mit dem Genom oder Proteom eine sehr hohe Dynamik im Metabolismus vorliegt ist nach der Probennahme eine
490. uch die hier vorliegende Arbeit von Metabolitmengen die den Durchschnitt der gesamten Zelle widerspiegeln Bei einigen Arbeiten jedoch sollten Unterschiede zwischen den Kompartimenten gekl rt werden 1 218 22224 Viele der fr hen Studien befassen sich mit Konzentrationen von 26 3 Theoretische Grundlagen 216218 222 225 231 F r die Extraktion wurde 234 Nukleotiden in Geweben oder auch Gewebekulturen h ufig PCS eingesetzt 1225 2292331 Ein Standardwerk der Metabolitbestimmung schl gt f r einen Gro teil der intrazellul ren Nukleotide aber auch anderer Metaboliten eine Extraktion mit PCS vor was die Qualit t dieser Methode unterstreicht In vergleichenden Studien wurden mehrere Methoden untersucht 217 2 2281 In k rzerer Vergangenheit wurden zu Produktionszwecken kultivierte tierische Zellen h ufiger mit PCS oder Trichloressigs ure TCS extrahiert um Nukleotide zu quantifizieren 25 11 116 177 181 219 2351 Grob et al 236 hingegen schl gt als optimale Extraktionsl sung organische L sungsmittel mit einem w ssrigen Anteil vor Die Analyse von Zuckerphosphaten aus tierischen Geweben oder kultivierten Zellen wurde in der Vergangenheit h ufig mit PCS TCS 377 oder Acetonitril ACN gt 042 durchgef hrt Verschiedene Methoden zur Bestimmung von Zuckerphosphaten sind von Bergmeyer beschrieben 1234 Der Fokus einiger Arbeiten war auf der Bestimmung der Konzentration von organischen S uren in tierischem
491. uch Einflussgr en mit vermeintlich geringem Einfluss untersucht werden konnten wie z B die Ultraschallbehandlung Dadurch konnte entschieden werden dass dieser Verfahrensschritt nicht notwendig ist In der Literatur wurde eine Ultraschall Behandlung mitunter eingesetzt ohne den Einfluss tats chlich zu berpr fen so z B 5 Ergebnisse und Diskussion 91 f r die Extraktion von Metaboliten aus Gewebe des Gehirns und anschlie ender Messung mittels NMR 291 Da vergleichbare Versuche zur Untersuchung von Einflussgr en auf die Probenvorbereitungsbe dingungen f r die Bestimmung von intrazellul ren Metaboliten in der Literatur nicht gefunden werden konnten kann an dieser Stelle kein Abgleich mit der Literatur erfolgen Dieser experimen telle Abschnitt stellte aber auch nur eine Vorstufe zur endgiiltigen Auswahl einer Probenvorbe reitung dar weshalb erst die final genutzte Methode mit anderen Methoden aus der Literatur verglichen wird 5 2 7 3 Central Composite Versuchsplan Wie oben erw hnt kann eine Konsequenz von nicht signifikanten Ergebnissen die Entscheidung fiir Folgeexperimente sein Mit Hilfe eines Central Composite Versuchsplans sollten die Einfl sse von je drei kontinuierlichen Variablen gekl rt werden Da kein lineares Verhalten der Zielgr en in Abh ngigkeit von diesen Einflussgr en zu erwarten war wurden f nf Niveaus f r jeden Faktor untersucht Wie in Abschnitt 3 5 3 erw hnt k nnen die Ergebnisse ei
492. ufnahme von Glutamin erfolgt ber eines der Transportsyteme A ASC beide Na Symport oder L Methionin Antiport Transformierte Zellen zeigen h ufig eine erh hte Aktivit t des Systems A Nach dem Import von Glutamin in die Zelle findet ein Transport in die Mitochondrien ber einen neutralen Uniport Carrier statt wobei dieser Schritt vermutlich keine Limitation beim Abbau von Glutamin darstellt HI Der erste Schritt im Stoffwechsel von Glutamin ist eine Desaminierung durch das Enzym Glutaminase Phosphat Aktivierte Glutaminase EC 3 5 1 2 welches ausschlie lich 3 Theoretische Grundlagen 15 mitochondrial vorliegt Diese Reaktion resultiert in Glutamat und Ammonium Die Aktivit t der Glutaminase ist in vielen transformierten Zellen erh ht und wird durch die extrazellul re Glutaminkonzentration beeinflusst Glutamat kann in der Folge entweder eine Transaminierung sreaktion oder eine oxidative Desaminierung durchlaufen Die Desaminierung die ausschlie lich in Mitochondrien stattfindet wird durch die Glutamat Dehydrogenase EC 1 4 1 3 katalysiert und hat als Produkte a Ketoglutarat und Ammonium Zus tzlich wird NAD zu NADH H reduziert bzw NADP zu NADPH H Ammonium wird ausgeschieden und a Ketoglutarat kann in unterschiedliche Stoffwechselwege einflie en z B ber den Krebszyklus vollst ndig abgebaut oder auch nach Decarboxylierung als Lactat ausgeschieden werden Die Transaminierung kann sowohl in Mitochondrien
493. ugabe MeOH CHCI 2 1 600 uL 4 C zu Well Transfer von 500 pL der Extraktionsl sung in Probenr hrchen welches CHCI 500 uL 4 C enth lt Zugabe von 900 uL MeOH Tricine 9 10 Tricine 3 8 mM 4 C zu Well Transfer der fl ssigen Phase zu Probenr hrchen welche enthalten Mischen 5 min Zentrifugation 16000 g 0 C Sammeln der w ssrigen Phase Zugabe von 800 uL MeOH Tricine 9 10 Tricine 3 8 mM 4 C zu Well 5 min Inkubation bei 4 C Transfer der fl ssigen Phase zu Probenr hrchen mit organischer Phase der 1 Extraktion Mischen 5 min Zentrifugation 16000 g 0 C Vereinigen der w ssrigen Phasen Kochen bei 85 5 min Zentrifugation 16000 g 0 C 10 min Sammeln der w ssrigen Phase Trocknung der Proben Abbildung 5 11 Schema der abschlie end genutzten Methode der Probenvorbereitung nach den erforderlichen Modifikationen zur Vermeidung enzymatischer Aktivit ten Durch die fr hzeitige Zugabe von MeOH CHCI 2 1 V V konnte eine Umsetzung von Nukleosidtri und Nukleosidmonophosphaten zu Nukleosiddiphosphaten wie sie f r die zwei oben beschriebenen optimierten Methoden stattfand s Abschnitt 5 2 3 vermieden werden Das Kochen der Proben nach der Vereinigung der w ssrigen Phasen konnte verhindern dass eine enzymkatalysierte Hydrolyse von A
494. ulture Engineering X April 23 28 2006 Whistler Canada Ritter J B Genzel Y Reichl U Monitoring Energy Metabolism The Challenge of Intracellular Metabolite Analysis of Mammalian Cells in Culture Vortrag 1st Max Planck Workshop on Metabolomics April 4 5 2006 Magdeburg Germany Ritter J B Genzel Y Reichl U Monitoring of Extracellular TCA Cycle Intermediates in Mammalian Cell Culture Poster 19th ESACT meeting June 5 8 2005 Harrogate United Kingdom Ritter J B Genzel Y Reichl U Optimizing the Extraction of Key Molecules from Energy Metabolism in Mammalian Cell Culture Poster Bioperspectives May 10 12 2005 Wiesbaden Germany Ritter J B Danova R Genzel Y Reichl U High Performance Anion Exchange Chromatography for the Quantitative Analysis of Energy Metabolism in Mammalian Cells Poster IICS September 20 23 2004 Trier Germany Ritter J B Danova R Genzel Y Reichl U Identification of parameters relevant for the quantification of intracellular metabolites in mammalian cell culture Poster ESBES 5 September 8 11 2004 Stuttgart Germany Ritter J B Danova R Genzel Y Reichl U Quantitative Analysis of Energy Metabolism in Mammalian Cells Poster Bioperspectives June 4 6 2004 Wiesbaden Germany
495. und gez hlt wurden Allerdings kann die zellspezifische Metabolitmenge zu Fehlinterpretationen f hren wenn sich das Volumen der Zellen ndert Somit wurde in dieser Arbeit der Versuch unternommen das Zellvolumen zu bestimmen Prinzipiell bieten sich zwei M glichkeiten der Bestimmung des Zellvolumens Entweder werden die Zellen in adh rentem Zustand oder nach Trypsinierung vermessen Eine Vermessung der Zellen nach Trypsinierung wurde direkt neben der Zellzahlbestimmung mit dem Ger t ViCell XR durch gef hrt Hierbei wird f r jede Messung von dem Ger t ein durchschnittlicher Durchmesser der gez hlten Zellen ermittelt Aus dem durchschnittlichen Durchmesser der Zellen kann man ber die Annahme einer Kugelform mit der Gleichung V 43 r ein durchschnittliches Volumen berech nen Da das Volumen proportional zum Durchmesser ist f hrt die Berechnung des durchschnitt lichen Volumens aus dem durchschnittlichen Durchmesser allerdings zu einem fehlerhaften Mittelwert weil die Verteilung der einzelnen Durchmesser hier von Bedeutung ist Dar ber hinaus nderte sich die Verteilung der Durchmesser w hrend der Kultivierung Typischerweise war zu Beginn die Verteilung schmal nahm w hrend der exponentiellen Wachstumsphase an Breite zu und wurde zum Ende der Kultivierung wieder schmaler Daten nicht gezeigt Zur Vermeidung der fehlerhaften Absch tzung des Volumens wurden aus den Rohdatendokumenten des ViCell XR txt Dokumente die ein
496. ung der Peakfl chen auf die Peakfl che bei pH 7 2 jeweils f r jede Substanz So wies z B ATP eine starke Abh ngigkeit der Messgr e vom pH auf was in etwa in einer Halbierung des Signals bei einem pH von 2 verglichen mit pH 7 resultierte Von pH 6 bis 12 war das Signal hingegen relativ stabil Etwas weniger empfindlich zeigten sich die Substanzen ADP Nitrat und F16bP deren Signal nur bei einem pH lt 5 beeintr chtigt war Die Metaboliten AMP und Succinat hingegen waren unbeeinflusst vom pH Wert Grunds tzlich zeigte sich f r alle Nukleotide 56 5 Ergebnisse und Diskussion ein hnliches Bild Triphosphate waren am st rksten von niedrigen pH Werten beeinflusst Diphosphate etwas geringer und Monophosphate zeigten einen nahezu konstanten Messwert ber den getesteten pH Bereich Das Signal der untersuchten organischen S uren war nur geringf gig abh ngig vom pH Wert der Probe wie man am Beispiel von Succinat erkennen kann Diese Beobachtung musste insbesondere bei der Entwicklung einer geeigneten Probenvorbereitung Beachtung finden 5 1 1 4 Messung von Metaboliten mittels Massenspektrometrie Im Verlauf der Arbeit insbesondere bei verbesserter Probenvorbereitung zeigte sich dass die Zusammensetzung der Extraktionsproben von hoher Komplexit t gepr gt ist Dies bedeutete dass die chromatographische Trennung der Probe mit dem oben erw hnten Aufbau der Anlage zwar relativ gut war trotzdem deuteten sich mehrere Koelution
497. urde ein Zeitraum von 27 54h f r die Ermittlung der maximalen spezifischen Wachstumsrate genutzt und ein 0 035 1 h ermittelt 6 46 h u max 0 039 1 h Basierend auf diesen Regressionen wurde eine Kovarianzanalyse zur Pr fung der Parallelit t der Regressionsgeraden durchgef hrt Hierbei zeigte sich dass kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Geradensteigungen existiert t Test zellzahlbezogen p 0 24 volumenbezogen p 0 41 Zu bemerken ist hier dass keine identischen Zeitr ume f r das exponentielle Wachstum gew hlt werden konnten da sonst keine Linearit t gegeben gewesen w re 5 Ergebnisse und Diskussion 113 Insbesondere war auff llig dass f r das Gesamtzellvolumen der lineare Bereich bereits bei der ersten Probennahme nach ca 6h begann wohingegen bei der Zellzahl erst nach etwa 20h das exponentielle Wachstum anfing Die erreichten maximalen Zellzahlen waren f r EpiSerf h her ca 4 4 x 10 Zellen Well Mittelwert der Zellzahlen ab 94h als f r GMEM Z 4 0 x 10 Zellen Well Bei den Zellzahlen zeigte sich allerdings dass f r GMEM Z3 und EpiSerf3 erheblich h here Werte erzielt wurden als f r die beiden vorhergehenden Kultivierungen Beim Vergleich der beiden Medien bez glich der mittleren Zellzahl im Zeitraum nach 94 h durch einen gepaarten t Tests konnte ein signifikanter Unterschied 0 0043 nachgewiesen werden Ein Vergleich der Reststandardabweichungen s der sigmoiden Anpassu
498. valhal AV Coroadinha AS Alves PM Moreira JL Hauser H Carrondo MJT 2002 Metabolic changes during cell growth inhibition by the IRF 1 system Enzyme and Microbial Technology 30 1 95 109 313 Nash RW McKay BS Burke JM 1994 The response of cultured human retinal pigment epithelium to hypoxia a comparison to other cell types Investigative Ophthalmology amp Visual Science 35 6 2850 2856 314 Grammel H Ghosh R 2008 Redox state dynamics of ubiquinone 10 imply cooperative regulation of photosynthetic membrane expression in Rhodospirillum rubrum Journal of Bacteriology 190 14 4912 4921 315 Kasischke KA Vishwasrao HD Fisher PJ Zipfel WR Webb WW 2004 Neural activity triggers neuronal oxidative metabolism followed by astrocytic glycolysis Science 305 5680 99 103 316 Bettenbrock K Fischer S Kremling A Jahreis K Sauter T Gilles ED 2006 A quantitative approach to catabolite repression in Escherichia coli Journal of Biological Chemistry 281 5 2578 2584 Anhang Anhang Tabelle A 1 Liste der genutzten Ger te Autoklav Autoklav 5075 ELVC Autoklav CV EL 12L Bioprofile 100 plus Analyzer CO Brutschrank Hera cell 240 Digitalcamera Digitalkamera Feinwaage Flaschen 0 2 1 0 5 1 1 1 Kiihlzentrifuge Biofuge primo R Laborflaschen 0 1 5 0 L Laser Scanning Mikroskop 510 Magnetr hrer VarioMag Mikroskop Axiovert 40C Mikroskop Axiovert S 100 Mikroskop HAL 100 pH Meter inoLab Pipettierhilfen 10 uL
499. verschiedene Organismen wurden Nukleotide und Zuckernukleotide analysiert 95 96 115 135 176 181 Der Einsatz der AAC fand bei der Analyse von Nukleotiden mit Cohn 1949 71 seinen Anfang und zahlreiche Anwendungen folgten Neben der Nukleotidbestimmung wurde h ufig ein Metabolic Profiling von Metaboliten aus Glykolyse und Krebszyklus durchgef hrt Konzentrationen von Glykolyseintermediaten wurden mit unterschiedlichen Methoden ermittelt unter anderem auch mittels AAC 136 183 185 Andere Arbeiten befassten sich mit der Bestimmung von organischen S uren aus dem Krebszyklus 18 186188 Da aber in typischen Zellextrakten unterschiedlichste Metabolitklassen vorliegen ist es sicherlich sinnvoll keine Gruppierung einzuf hren sondern m glichst alle Metaboliten hnlicher Konzentrationsbereiche zu ber cksichtigen Gerade f r den Fall dass die Detektion nicht selektiv ist z B Leitf higkeitsdetektion besteht ansonsten eine gro e Gefahr der Fehlinterpretation der Chromatogramme Extraktionsproben f r die Analyse von intrazellul ren Metaboliten sind in ihrer Zusammensetzung besonders komplex und somit stellt sich die Frage wie gut die genutzte Analysemethode dies komplexe Probengemisch aufl sen kann Im Falle der AAC konnte Wittmann et al 2005 sowohl organische S uren als auch Zuckerphosphate in Hefen analysieren 1139 Zus tzlich zu diesen Metaboliten wurden von Groussac et al 2000 noch Nukleotide mit zwei verschiedenen AAC
500. von UTP und der Energy Charge zu erkennen Der Konzentrationsverlauf von UTP zeigte einen Anstieg allerdings war dieser Anstieg deutlich schw cher als f r die beiden Metaboliten PEP und 3PG Da kein direkter Zusammenhang auf metabolischer Ebene zwischen den beiden Glykolyse intermediaten und UTP bekannt ist wird bei diesem gleichartigen Verhalten von einer zuf lligen Koinzidenz ausgegangen Im Verlauf der Energy Charge kann man einen Anstieg erkennen Dieser Anstieg war eine Folge des Abbaus von ADP und AMP Dies deutet an dass die Zellen w hrend der Limitationsperiode scheinbar keine erheblichen Schwierigkeiten bei der Energieversorgung hatten da ansonsten ein Einbruch der Energy Charge zu erwarten gewesen w re Grund hierf r k nnte sein dass wie bereits oben erw hnt ein endogenes Substrat wie z B Glycogen in diesem Zeitraum abgebaut wurde Da allerdings die Konzentrationen der Hexosephosphate sehr niedrig waren verglichen mit dem Kontrollzustand ist anzunehmen dass keine gro e Glykolyseaktivit t vorlag Dies ist 5 Ergebnisse und Diskussion 153 allerdings nur ein Indiz da ein direkter R ckschluss von der Metabolitkonzentration auf den Stofffluss nicht m glich ist Weiterhin k nnte ein Abbau von Proteinen oder Fetts uren stattgefunden haben wobei aber diesbez glich anhand der Daten keine klare Aussage getroffen werden kann Da allerdings der Konzentrationsabfall der Intermediate des Krebszyklus im Vergleich zu
501. waren klare Unterschiede in Abh ngigkeit vom Medium f r die gemessenen Zuckernukleotide und ATP zu erkennen Auch die Energy Charge lag f r das serumfreie Medium ber den gesamten Kultivierungsverlauf ber dem Wert des serum haltigen Mediums Grunds tzlich schien die Energy Charge zu Beginn der Kultivierungen lt 24 h umso niedriger zu sein je h her die Glucosekonzentration im Medium war Eine Hypothese zum regulatorischen Einfluss der Energy Charge w re dass der Abbau der Glucose durch einen erh hten Wert der Energy Charge verlangsamt stattfand Die Konzentration der Zuckernukleotide zeigte eine klare Abh ngigkeit von der extrazellul ren Glucosekonzentration Um ein von der Zelllinie unabh ngiges Abbild des Verhaltens intrazellul rer Metabolitkonzen trationen ber einen Kultivierungsverlauf in tierischen Zellen zu erhalten wurden Kultivierungs experimente mit Vero Zellen durchgef hrt Dort zeigte sich dass ein mitunter vollkommen von MDCK Zellen verschiedenes Verhalten vorliegt So waren die Konzentrationen der Hexose phosphate ber den Verlauf der Kultivierung in Medien mit Glucose relativ konstant Die Kon zentration von Malat erwies sich als stark abh ngig von der extrazellul ren Glutaminkonzentration aber auch die Glucosekonzentration hatte einen Einfluss Die ATP Konzentration unterschied sich merklich in Abh ngigkeit vom Wachstumssubstrat was ein deutlicher Unterschied zu MDCK Zellen ist Als Gemeinsamkeit der beide
502. xperimenten So ist leicht verst ndlich dass f r Vero Zellen s 5 3 3 andere Verh ltnisse der Metaboliten vorlagen als f r MDCK Zellen s 5 3 2 Ebenso ist einfach nachzuvollziehen dass nach dem schlagartigen Entfernen von Medium s 5 3 4 1 stark ver nderte Bedingungen auftraten verglichen mit einer typischen Batch Kultivierung s 5 3 2 Bei der Berechnung der Korrelationskoeffizienten ist die genannte Inhomogenit t der Populationen s Abbildung 5 14 grunds tzlich irrelevant kann aber zu einer Fehlinterpretation des Korrelationskoeffizienten f hren Eine korrekte statistische Pr fung auf Signifikanz setzt jedoch eine Normalverteilung voraus Da dies nicht f r alle Kombinationen gegeben war sind die angegebenen p Werte nur nach berpr fung durch ein Streudiagramm g nzlich zu akzeptieren Ein berblick ber die Korrelationen zwischen den einzelnen Metabolitkonzentrationen die unter unterschiedlichen Bedingungen gemessen wurden ist in Abbildung 5 15 gezeigt Auff llig ist hierbei dass entweder keine Korrelationen oder positive Korrelationen vorlagen Entscheidender Grund hierf r war sicherlich dass in dem hier verwerteten Datensatz eine ganze Reihe von Kulti vierungsexperimenten zusammengefasst wurde Da hierbei aber die Metabolitkonzentration pro Well genutzt wurde nicht pro Zelle war logischerweise mit dem Wachstum ein Anstieg der Konzentration pro Well zu verzeichnen Somit berlagerten sich hier der Effekt der nderu
503. y Charge was die Aussagekraft dieser Ergebnisse best rkt Dennoch k nnte der nahezu identische Verlauf f r jeweils die beiden Kultivierungen welche auf einer Sechs Well Platte stattfanden auf m gliche Probleme in der Durchf hrung der Versuche hindeuten Da aber die Verl ufe von ATP ADP nicht gezeigt und AMP nicht gezeigt unterschiedlich waren erscheint solch eine Erkl rung als unwahrscheinlich Die Zusammenfassung der Experimente mit vier verschiedenen Medien in Form der Korrelationsanalyse Abbildung 5 37 zeigte vergleichsweise wenige sehr starke Korrelationen Eine Ursache war sicherlich dass Kultivierungen mit stark unterschiedlichen Medien verschiedene Substrate gemeinsam ausgewertet wurden Weiterhin war f r diese Korrelationsanalyse kein Zeit versatz mit ber cksichtigt Grunds tzlich traten sehr hnliche Korrelationsmuster auf wie f r die Zusammenfassung aller Experimente auf s Abbildung 5 15 Einige Unterschiede sind dennoch zu bemerken Insbesondere das Auftreten von negativen Korrelationen in Abbildung 5 37 ist hervor zuheben Besonders 3PG und PEP wie auch UTP und die Energy Charge fielen hier auf Dies spiegelt letztlich die Ergebnisse aus den vorangegangenen Kurzzeitexperimenten wider da auch dort die Metaboliten 3PG PEP und UTP wie auch die Energy Charge mit zahlreichen anderen Metaboliten negativ korreliert waren 5 3 5 Diskussion der intrazellul ren Metabolitkonzentrationen f r MDCK und Vero Zellen i
504. y Charge of Adenylate Pool as a Regulatory Parameter Interaction with Feedback Modifiers Biochemistry 7 11 4030 4034 Atkinson DE 1969 Regulation of Enzyme Function Annual Review of Microbiology 23 47 68 Valley U Nimtz M Conradt HS Wagner R 1999 Incorporation of ammonium into intracellular UDP activated N acetylhexosamines and into carbohydrate structures in glycoproteins Biotechnology and Bioengineering 64 4 401 417 Ryll Valley U Wagner 1994 Biochemistry of Growth Inhibition by Ammonium Ions in Mammalian Cells Biotechnology and Bioengineering 44 2 184 193 Konstantinov KB 1996 Monitoring and control of the physiological state of cell cultures Biotechnology and Bioengineering 52 2 271 289 Voisard D Meuwly F Ruffieux PA Baer G Kadouri A 2003 Potential of cell retention techniques for large scale high density perfusion culture of suspended mammalian cells Biotechnology and Bioengineering 82 7 751 765 Xie LZ Wang DIC 1997 Integrated approaches to the design of media and feeding strategies for fed batch cultures of animal cells Trends in Biotechnology 15 3 109 113 100 Nadeau I Sabatie J Koehl M Perrier M Kamen A 2000 Human 293 cell metabolism in low glutamine supplied culture interpretation of metabolic changes through metabolic flux analysis Metabolic Engineering 2 4 277 292 101 Cruz HJ Ferreira AS Freitas CM Moreira JL Carrondo MJT 1999 Metabolic responses to different glucose an
505. z entsprechend einem fraktionellen faktoriellen Versuchsplan konnten f r die beiden Methoden f nf bzw sechs Einfluss gr en mit zu rechtfertigendem Versuchsaufwand untersucht werden F r ein anderes experimen telles Vorgehen h tte eine gr ere Anzahl von Einzelversuchen stattfinden m ssen Dies h tte bedeutet dass der gesamte Versuch l nger gedauert h tte und somit eine konstante Zellzahl ber den Versuchszeitraum nicht gew hrleistet h tte werden k nnen Die fraktionellen faktoriellen Versuchspl ne zur Untersuchung von potentiellen Einflussgr en konnten einige offene Fragen bez glich der Effekte auf die Probenvorbereitung kl ren Ein Problem bei den Versuchen zur Untersuchung der beiden Methoden MeOH Kochen und MeOH CHCE war allerdings dass die Modelle nur zum Teil signifikant waren Auch waren nur einige Faktoren signifikant Um die Aussagekraft dieser Modelle zu verbessern h tte es verschiedene M glich keiten gegeben 124 248 F r die gezeigten Experimente wurde kein Versuch unternommen die Signifikanzen zu verbessern sondern es wurde basierend auf den Ergebnissen ber einige Faktorniveaus entschieden Von diesen Faktoren gingen in den untersuchten Bereichen nur geringe Effekte aus und da mit Ausnahme der Temperatur MeOH die Einflussgr en kategorische Gr en waren wurde das bessere wenn auch nicht signifikante bessere Niveau gew hlt Der Vorteil der statistischen Versuchsplanung war dass a
506. zelnen Durchmesser aller gemessenen Zellen verwendet um hieraus das ent sprechende Volumen jeder einzelnen gemessenen Zelle zu bestimmen Aus den einzelnen Volumina wurde dann der Mittelwert gebildet der im weiteren Verlauf als durchschnittliches Volumen der Zellen der Probe genutzt wurde Zur Ermittlung des Gesamtzellvolumens eines Wells einer Sechs Well Platte wurde das durchschnittliche Volumen mit der zu diesem Well geh rigen Zellzahl multipliziert Als weiteres Problem bei der Bestimmung des Volumens zeigte sich eine Abh ngigkeit des ermittelten Durchmessers von der Zeitdauer nach Beginn der Trypsinierung Exemplarisch ist in Abbildung 5 12 A das Verhalten der mittleren Zelldurchmesser nach Beginn der Trypsinierung 86 5 Ergebnisse und Diskussion ber die Zeit dargestellt Grunds tzlich kann eine Z hlung erst nach dem vollst ndigen Abl sen der Zellen erfolgen Somit muss eine minimale Dauer bis zur Abl sung abgewartet werden In dem dar gestellten Versuch wurden die Zellen mit zehnfach konzentrierter Trypsinl sung behandelt um eine m glichst schnelle Messung zu erlauben Deutlich zu erkennen ist dass nach etwa 15 min ein maxi maler Zelldurchmesser zu verzeichnen war Daraufhin fand bis ca 40 min eine deutliche Verringerung des Zelldurchmessers statt wonach ein relativ konstantes Verhalten des Durch messers gemessen wurde Um die Schwankungen die durch diesen Effekt bedingt sind in folgenden Experimenten gering halten zu
507. zentrations nderungen gemessen Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse zu Batch Kultivierungen von MDCK Zellen lassen den Schluss zu dass je nach physiologischem Zustand also in Abh ngigkeit von z B der Wachstumsphase oder dem Zellkulturmedium ein charakteristisches Konzentrationsmuster der intrazellul ren Metaboliten des Zentralstoffwechsels existiert Anhand der gezeigten Versuche konnte man sich ein relativ gutes Bild der Metabolitkon zentrationen und deren Verl ufe in typischen Batch Kultivierungen f r MDCK Zellen machen Grunds tzlich stellt sich aber die Frage wie weit MDCK Zellen repr sentativ f r andere Zelllinien sind bzw welche Unterschiede f r verschiedene Zelllinien auftreten Aus diesem Grund erfolgten im Rahmen dieser Arbeit einige Versuche mit Vero Zellen 5 3 3 Kultivierung von Vero Zellen Neben MDCK Zellen sind auch Vero Zellen eine wichtige Produktionszelllinie f r die Impfstoffherstellung Da auch diese Zellen den typischen Stoffwechsel von kontinuierlichen Zelllinien zeigen besteht hier ebenfalls ein Interesse an der genaueren Charakterisierung des metabolischen Verhaltens dieser Zellen Diese Zelllinie w chst ebenso wie MDCK Zellen adh rent weshalb eine direkte bertragung der Probenvorbereitung m glich schien F r mehrere Kultivierungsversuche wurden intrazellul re Metabolitkonzentrationen bestimmt Eine erste Kultivierung fand im Medium GMEM Z statt nicht gezeigt wobei best tigt werden konnte
508. zt die Hypothese dass die Aktivit t des Krebszyklus durch das Substrat beeinflusst ist Insbesondere f r Malat wurde in Abh ngigkeit vom Medium ein charakteristischer Verlauf gemessen Die beiden Medien die Glutamin enthielten verhielten sich sehr hnlich Scheinbar beeinflusste Glutamin erheblich die intrazellul re Konzentration von Malat Grunds tzlich zeigte sich f r die Intermediate des Krebszyklus ein vergleichbares Konzentrations verhalten f r die beiden Medien die Glutamin enthielten W hrend das Medium mit Pyruvat gerade zu Beginn der Kultivierung h here Konzentrationen der Krebszyklusmetaboliten bewirkte waren f r das Medium mit ausschlie lich Glucose die Konzentrationen ber den Verlauf des Versuchs niedriger als f r die anderen Medien Diese gleichartigen Tendenzen f r mehrere Metaboliten in Abh ngigkeit vom Medium weisen auf m gliche Unterschiede im Stoffwechsel hin die mit Metabolitkonzentrationen assoziiert sind Ein weiterer erw hnenswerter Aspekt sind die sehr hnlich verlaufenden ATP Konzentrationen Insbesondere ab etwa 60 h sind nahezu keine Unterschiede zwischen den Konzentrationen von ATP in den verschiedenen Medien auszumachen In dem Zeitraum bis etwa 48h lagen die Konzentrationen der Medien mit Glucose unter den Konzentrationen in den anderen beiden Medien ber einen kurzen Zeitraum k nnte das Absinken der ATP Konzentration aufgrund der bertragung von Phosphat von ATP auf Glucose in Frage kommen
509. zu Zellen in Geweben ist der Stoffwechsel von kultivierten tierischen Zellen deutlich ver ndert D I Dies u ert sich meist in einer hohen Aktivit t der Glykolyse Auch unter vollst ndig aeroben Bedingungen f hrt dies zu einem hohen Verbrauch von Glucose und einer Freisetzung gro er Mengen Lactat Au erdem dient Glutamin oft nicht nur als Stickstoff sondern auch als zus tzliche Energiequelle wodurch hohe Konzentrationen des Abbauproduktes Ammonium im Zellkultur berstand akkumuliert werden Beide hier genannten Endprodukte haben 41 4851 und zus tzlich werden f r viele Zelllinien einen negativen Effekt auf das Zellwachstum Produktivit t 8 32 531 und Qualit t der Produkte oft negativ durch diese Abbauprodukte beeinflusst 54 Als urs chlich f r den ver nderten Stoffwechsel bei schnell proliferierenden Zellen werden verschiedene Mutationen im Genom dieser Zellen angesehen 1 5 59 Ob ein Zweck des ver nderten Stoffwechsels existiert oder wie weit es sich hier nur um einen Nebeneffekt der ver nderten Zellbiologie handelt ist bisher jedoch unklar Da das Zellwachstum u erst eng mit dem Stoffwechsel verkn pft ist wird hier kurz eine f r adh rente Zellen wie in dieser Arbeit verwendet typische Wachstumskurve erl utert Abbildung 3 1 zeigt schematisch eine Wachstumskurve bei linearer A und logarithmischer Auftragung der Zellzahl A B 4 Stat ZS Lag Exp Stat m S 8 N E r
510. zur Versuchsplanung ist in ingenieurwissenschaftlichen Disziplinen sehr popul r findet aber auch nach und nach Einzug in die Biowissenschaften 124247 249 2531 Anwendungen im Bereich der Probenvorbereitung biologischer Proben sind allerdings eher selten Zur Charakterisierung bzw Optimierung einerseits der Extraktion von Pigmenten bzw Fetts uren und andererseits f r die Derivatisierung von Metabolom Proben vor einer GC MS Analyse wurden Methoden der statistischen Versuchsplanung eingesetzt In allen drei F llen erwies sich das Vorgehen anhand statistischer Methoden als effizienter Prozess und es konnten erfolgreich relevante Einflussgr en identifiziert werden 777 Andere Arbeiten gingen typischerweise mit einer Ein Faktor zu einem Zeitpunkt Strategie vor wobei mitunter ein erheblicher experimenteller Aufwand bew ltigt wurde 1135 138 171 176 211 2361 In der hier vorliegenden Arbeit sollte einerseits eine m glichst gute Charakterisierung der untersuchten Probenvorbereitungsmethoden erfolgen andererseits sollte dies in einem berschau baren zeitlichen Rahmen stattfinden weshalb eine effiziente Vorgehensweise entsprechend statistischer Versuchsplanung gew hlt wurde Nachdem in dem Vergleich der Methoden aus der Literatur eine erste Auswahl von grunds tzlich geeigneten Probenvorbereitungsmethoden erfolgt war sollten die Effekte von zahlreichen Einfluss gr en auf die Extraktionsqualit t berpr ft werden Nur durch den Ansat
511. zusammenfassend bemerkt werden dass es keine klaren Richtwerte f r die Wiederfindungen von Metaboliten oder Metabolitklassen gibt Sehr unterschiedliche Werte werden in der Literatur angegeben was sowohl auf eine fehlende einheitliche Methodik der Bestimmung der Wiederfindung als auch auf unterschiedliche Arten von Proben zur ckzuf hren ist Neben der Wiederfindung sind die absoluten Mengen oder Konzentrationen der extrahierten Metaboliten ein Kriterium f r die Qualit t der Extraktion Der Vergleich mit der Literatur wird hier allerdings auf die Werte f r kultivierte tierische Zellen beschr nkt da aus biologischen Gr nden gro e Unterschiede zu den Werten f r Gewebe Hefen oder Prokaryonten zu erwarten sind Allerdings birgt auch der Vergleich mit anderen kultivierten Zellen Probleme da aufgrund von unterschiedlichen Zelllinien Kultivierungsbedingungen Medienzusammensetzungen und physiologischen Zust nden die gemessenen Konzentrationen einen weiten Bereich abdecken k nnen Schon die in der hier vorliegenden Arbeit gezeigten Konzentrationen f r MDCK und Vero Zellen deuten klare Unterschiede zwischen verschiedenen Zelllinien an Zus tzlich war im weiteren Verlauf der hier vorliegenden Arbeit eine klare Abh ngigkeit der zellspezifischen Metabolitmengen vom Kultivierungszustand bzw dem Zeitpunkt der Probenahme w hrend einer Batch Kultivierung festgestellt worden Aus diesem Grund wird an dieser Stelle von einem detaillierten Vergleich m
512. zyme Glutaminase und Glutamat Dehydrogenase gezeigt werden D I Grunds tzlich gibt es zahlreiche M glichkeiten f r den Abbau von Glutamin wobei verschiedene Zelllinien unterschiedliche Reaktionswege bevorzugen Zus tzlich k nnen viele Zellen flexibel auf die Kultivierungsbedingungen reagieren und die Abbauwege dementsprechend anpassen Ein weiteres Enzym im Glutaminstoffwechsel ist die Glutamin Synthetase EC 6 3 1 2 Dieses Enzym erm glicht die Synthese von Glutamin aus Glutamat F r zahlreiche kontinuierliche Zelllinien konnte eine Aktivit t dieses Enzyms nachgewiesen werden auch wenn diese Aktivit t meist deutlich niedriger war als bei prim ren Zellen P gt 7 7 W hrend trotz Aktivit t der Glutamin Synthetase Hybridoma Zellen nicht in glutaminfreiem Medium wachsen konnten 5 konnten sich HeLa Zellen ohne nachweisbare Aktivit t dieses Enzyms in glutaminfreiem Medium vermehren Auch CHO und BHK Zellen zeigten Wachstum in Zellkulturmedium ohne Glutamin wobei bei diesen Zellen zumindest eine niedrige Aktivit t der Glutamin Synthetase zu finden war 3 1 3 Pyruvatstoffwechsel Neben den g ngigen Substraten wie Zucker oder Aminos uren wird vielen Zellkulturmedien auch Pyruvat zugesetzt F r ein Wachstum auf verschiedenen Zuckern ist der Zusatz von Pyruvat f r viele Zellen essentiell TL F r normale und transformierte embryonale Hamster Fibroblasten wurde der Einfluss von Pyruvat auf das Zellwachstum und den Metabolismus unte

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