MutaCHIP Tamox - bei Immundiagnostik
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1. a E cc SS n aa gan j ai Fr m Patent Lam a Pastas Jarl i for ud Pater 5 Pane i gis Tirem lype Erendelbisrur Language Daten ern Es Feld Cea el Step 2 Start the analysis process Click on the Start button to initiate data analysis 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Evaluation and Interpretation of Results 11 Step 3 Quality check of the chi eeere rse8e ee ee e eo o KESET EES Please check the quality of the chipimage If there are dust or dirt particles on the chip surface clean the the bottom of the reaction tube carefully with a cloth and destilled water and click on the Take a new picture button Take anew picture To ensure a correct analysis result the picture quality of the MutaCHIP has to be checked Particles of dust on the bottom side of the MutaCHIP can affect the analysis These can be removed by cleaning with a soft and wet tissue Follow the instructions given in the screen shown here Press Continue analysis if the quality of the picture is comparable to the figure above 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 D er Step 4 Genotyping results Pharriwenerect Dg ric Enc Yyptlem 1 R L kanal Experiment i Eai File mM p end Fanctmecul Phaenienemics F Pres Faber Sun Pa stent 5 xmi P i aheri 7 vri wierd2. Diagnostic R X mm Edit View Favorites Tools Help New tab Ctrl T Duplicate tab Ctrl K New window Ctrl N New session Open Ctrl O Select Printer Add Printer I j PDFC armGenomics GenoChip Tar Save as Ctrl S Close tab Ctrl W Page setup Status Ready Print to file Print Ctrl P Ln eDoc Printer Print preview Sample P Send gt age Range Q Al Number of copies 1 Import and export Type of sample Selection Current Page Properties Draw date Pages 1 Collate 3 3 Work offline Processing date Enter either a single page number or a single 1 2 bit Report date 05 07 2011 ee Results and Interpretation Defective CYP2D6 alleles detected 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 12 Troubleshooting Software Meldung Warnung Die Pr fen Sie das Enzym und oder Substrat Signale des Biotinreferenzmarkers sind zu Wiederholen Sie den Assay mit neuem niedrig Dies kann ein Zeichen f r einen Enzym Substrat fehlgeschlagenen oder nicht ausgef hrten Konjugationsschritt sein oder das Enzym ist nicht mehr funktional Das System muss gestoppt werden Software Meldung keine Fehlerangabe Der Reader ist nicht richtig angeschlossen ErrorCode 3011 Halten Sie Esc f r 3 Sekunden gedr ckt und schlieBen Sie den Reader in der richtigen Art und Weise an bitte wenden Sie sich an
3. muss zunachst die Bildqualit t des MutaCHIPs berpr ft werden Staubpartikel auf der Unterseite des MutaCHIPs k nnen die Analyse beintr chtigen Diese k nnen durch das saubern mit einem weichen und feuchten Tuch entfernt werden Klicken Sie auf die Schaltflache Analyse fortsetzen falls die Bildqualitat der in der oberen Abbildung entspricht 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 ES Schritt 4 Genotypisierungsergebnisse Pharriwenerert Dagro tnc Sytem a x Epenment Extras Hille Preside Anshypemodul Fancetmesdul Fropects T Peri Sai s e i m Patent Gami J PharmGenomics Paisi 7 yrmi iadividualivss rherapieit CYP2D6 Genotypisierungstest f gt Hamszrgot Homo Alle Wi Halen ues talon 3 a4 A E o 7 r3 8 o 8 o 10 o 11 o Anabyseprotakoll 17 e rY Wilkommen beim PharmGenonues rsgnosbe Syste 20 o 2 1 03 2011 14 53 31 41 1 Wechsle Analysemodus gt Rahdatenanalyse Neve Fiohdalen CQ UCONOUC TP 2DOBlderCharga E Begnne Bildanalyse Kane Gen Destebian datakliar gt gt Stone Translormahon Y 55 207 Spots erfasst XH Keine Gen Duplikation detektiert i E 5 i Hahdal Stade hormalisierun x nM gt Erfasse Segnalstake ee re Pa iun g Genolypisaerung abgeschlossen 27 Nomalisiarung abgeschlossen ng 59 Slane Gonabyossierung a m k Nach der vollstandigen Datenanalyse k nnen
4. B xri aeri bami stieni E xml cw 3 CYP2D6 Genotypisierungstest Homoayqgot Hel Homer e Wilsilyp 2 a Mulatum 3 o 4 da E o 7 m 8 o i o 10 o 11 o Anabyseprotakoll 17 e Willkommen beim PharmCienomies Dragnosbe Syste 20 o ie 17 03 2011 145933 41 a oo Wechsle Analysemodus gt Rahdatenanalyse Neve Fiphdalen C UCONOUC TP ome Bilder Charge E Begone Bildanalyse E Kan Gen Deslebian datakliar gt gt Siani Translormahon z gt 207 Spots erfasst XN Keine Gen Duplikation detektiert Spots nigaardnet gt gt Erlasse Segnalstaike emimere Rahdalen Starie Normalisienang Cenolbypesaerung abgeschlossen Momalisiarung abgeschlossen yp ng 259 miro Gonabyoesierung z L Tm F After the complete data analysis the results can be access in the analysis module genotyping module or in the diagnostic report The used icons are explained in the following table Symbole der Software und ihre Bedeutung The patient carries on both alleles the healthy variant of the investigated genetic variants The patient carries on one allele the healthy and on the other allele the mutated genetic variant The patient carries on both alleles the mutated genetic variation in homozygous form The signal values of the probes for this genetic variation are too weak for a valid result This could be caused by other sequence variations in close proximity to the investigated variant The rem
5. binding oince Tamoxifen is metabolised to its active forms 4 hydroxyTamoxifen and 4 hydroxy N desmethyl Tamoxifen Endoxifen by CYP2D6 the enzymatic activity has direct impact on the success of a Tamoxifen containing therapy Both metabolites have a higher affinity towards the estrogen receptor than Tamoxifen and thus are crucial for an individual s response to chemotherapy Genotyping the CYP2D6 gene prior to initiating Tamoxifen therapy can identify patients with decreased or absent CYP2D6 activity This offers the possibility to treat them with other medications for example aromatase inhibitors at an early stage and in consequence enhance the chances of a successful therapy and eliminating the risk of tumour reoccurrence Genotyping seems especially important as about 50 96 of the Caucasian population carry a variation of the CYP2D6 Gene and do not metabolise Tamoxifen properly Those patients should switch to aromatase inhibitors 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 SE 2 3 Concept of the Assay To analyse the mutations a PCR is performed which amplifies the CYP2D6 gene using freshly extracted genomic DNA as template The amplification product is transferred to the MutaCHIP and is treated following the provided protocol The analysis allows distinct genotyping of all variants of the CYP2D6 gene that are spotted onto the MutaCHIP The amplified product binds onto the MutaCHIP to the immobilised probes In a washing
6. das Benutzerhandbuch des PGDx Systems Schlechte Bildqualit t Reinigen Sie die Bodenunterseite des Arraygef es Benutzen Sie ein weichesTuch das mit Desinfektionsmittel angefeuchtet ist Wiederholen Sie das Foto es kann notwendig sein diesen Schritt mehrfach zu wiederholen Unscharfes Bild Reinigen Sie vorsichtig die Kamera mit einem Tuch oder einem Wattst bchen 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 MutaCHIP Tamox DNA Macroarray Kit for the Examination of Mutations in the Cytochrome P450 2D6 Gene For in vitro diagnostics only SN KF391005 NA 0 SN KF390005 Yo Immundiagnostik AG Stubenwald Allee 8a 64625 Bensheim Germany www immundiagnostik com Tel 49 0 6251 701900 info immundiagnostik com Fax 49 0 6251 849430 EE SS Content h Application Introduction Concept of the Assay Components Materials Storage and Shelf life Working Conditions Considerations and Precautions Sample Collection yJ O O Ci oo A A O OW on a O O O N OO Gi FP C N Test Procedure PCR Product Generation aa 7 PCR Protocol a ai Ana HEHE 8 Mula CHIP PrOtOCOl u nee 9 uch Evaluation and Interpretation of Results 10 oh NO Trouble shooting 14 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 Application 3 1 Application The MutaCHIP Tamox Kit is a biomolecular test for the examination of mutations in the Cytochrome P450 2D6 gene CYP2D6 3
7. den im Protokoll erw hnten Substanzen verwendet werden 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 ss MMM 8 Hinweise und Vorsichtsma nahmen Die Vorschriften und Grunds tze f r molekularbiologisches Arbeiten m ssen eingehalten werden e Der Test ist zur Verwendung mit frisch extrahierter genomischer DNA aus EDTA Vollblut als Ausgangsmaterial geeignet Nur dann k nnen optimale Ergebnisse sichergestellt werden e Mischen Sie keine Reagenzien aus unterschiedlichen Lots e Die MutaCHIPs sind o nur f r den Einmalgebrauch bestimmt o nur zur in vitro Diagnostik zu verwenden e Der MutaCHIP darf w hrend den Arbeitsschritten nicht austrocken e Der MutaCHIP ist f r den Gebrauch mit dem MAAT und der dazugeh rigen Software von PharmGenomics ausgelegt e Die Arbeitsschritte z gig durchf hren e Alle Ausgangsl sungen w hrend des Arbeitens k hlen e Das MutaCHIP GefaB mit zwei H nden ffnen Dabei ist darauf zu achten dass kein Druck auf den MutaCHIP ausge bt wird 9 Probengewinnung Als Matrize f r die PCR Amplifikation dient genomische DNA aus EDTA Vollblut Die DNA Konzentration sollte zwischen 10 50 ng uL liegen Die Reinheit OD560 280 der DNA sollte h her als 1 8 sein F r den Assay darf nur hochmolekulare frisch extrahierte DNA verwendet werden 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Probengewinnung 10 Testdurchfuhrung 10 1 PCR Produktherstellung Zur Amplifikation d
8. homogenise it again Before usage it has to be cooled to room temperature RT B Preparation of DNA samples e Ina 200yl reaction tube add 60 ul of Reaction Optimization Mixture ROM Add 3 ul of each PCR product A B and C and vortex briefly Denature the DNA at 95 C for 2 min Add 100 ul of Hybridization Buffer to the sample Load the sample on the MutaCHIP without touching the bottom of the chip C Hybridisation e Perform the hybridisation at 55 C 550 rpm for 60 min D Washing steps after Hybridisation Set the thermoshaker to 50 C Note During the cooling period the MutaCHIP has to be removed from the thermoshaker The Hybridisation Buffer has to remain on the MutaCHIP until the target temperature is reached Caution Pay attention to the correct adjustment of volume e Completely remove the Hybridisation Buffer from step C e Add carefully 500 uL of Washing Buffer onto the MutaCHIP e Wash the MutaCHIP at 550 rpm and 50 C for 5 min E Enzyme conjugation Set the thermoshaker to 21 C Note During the cooling period the MutaCHIP has to be removed from the termoshaker The Washing Buffer has to remain on the MutaCHIP until the target temperature is reached Caution Pay attention to the correct adjustment of volume e Completely remove the Washing Buffer from step D e Add 100 uL of Enzyme Mix to the MutaCHIP e Incubate the MutaCHIP at 550 rpm and 21 C for 15 min F Washing step after Enyzme conjugation Caution Pay att
9. 11 17 29 41 and xN from genomic DNA This test is based on a DNA MutaCHIP technology The investigated variations are connected to a decreased or absent CYP2D6 enzyme activity which in turn leads to non responsiveness to Tamoxifen therapies Following alleles and variations are detected by the kit e CYP2D6 3 11 e CYP2D6 17 e CYP2D6 29 e CYP2D6 41 e CYP2D6 xN 2 Introduction Next to environmental factors like age gender nutrition and co medications there are important genetic factors influencing the metabolic activity of enzymes It is known that patients who have no or significantly decreased enzymatic activity of the Cytochrome P450 2D6 CYP2D6 enzyme do not respond to therapies containing Tamoxifen Tamoxifen is a Selective Estrogen Receptor Modulator that is applied in the treatment of estrogen receptor positive ER breast cancer In addition it is used as an adjuvant to prevent the relapse of a successfully treated carcinoma for example after surgical removal and as a prophylaxis in individuals that are at higher risk of developing breast cancer The binding of estrogen to its receptor has impact on the DNA replication rate and leads to an increased cell proliferation in the affected tissue An ER breast cancer shows over expression of the estrogen receptor which in consequence causes a higher number of mutations and tumour formation Tamoxifen acts as an antagonist to the estrogen receptor blocking it against estrogen
10. CYP2D6 3 11 e CYP2D6 17 e CYP2D6 29 e CYP2D6 41 e CYP2D6 xN 2 Einleitung Neben auBeren Einflussen wie Alter Geschlecht Ernahrung und Komedikation gibt es wichtige genetische Faktoren die die metabolische Aktivitat eines Enzyms beeinflussen Es ist bekannt dass Patienten die keine bzw eine stark reduzierte Aktivitat des Cytochrom P450 2D6 Enzyms C YP2D6 aufweisen schlechter oder gar nicht auf eine Chemotherapie mit Tamoxifen ansprechen Tamoxifen ist ein selektiver Ostrogenrezeptormodulator der zur Behandlung von Ostrogenrezeptorpositiven ER Mammakarzinomen eingesetzt wird AuBerdem kann Tamoxifen als adjuvante Therapie zur Verringerung der R ckfallrate und als Prophylaxe bei Risikopatientinnen verabreicht werden Die Bindung von Ostrogen an seinen Rezeptor hat Einfluss auf die DNA Replikationsrate und f hrt zu einer erh hten Zellproliferation im betroffenen Gewebe Ein ER Mammakarzinom zeigt eine Uberexpression des Ostrogenrezeptors was in der Folge zu einer gr eren Zahl an Mutationen und zur Tumorbildung f hrt Tamoxifen wirkt als ER Antagonist und blockiert den Rezeptor so dass Ostrogen nicht mehr binden kann Da Tamoxifen erst nach der Einnahme durch das CYP2D6 Enzym in seine aktiven Metabolite 4 Hydroxytamoxifen und 4 Hydroxy N desmethyl tamoxifen Endoxifen umgewandelt wird hat die Enzymaktivitat einen direkten Einfluss auf den Erfolg Therapie mit Tamoxifen Beide Metabolite haben eine h here Affinit t zum Ostrog
11. Sie die Ergebnisse im Analysemodul Genotypisierungsmodul oder im Diagnosebericht abrufen Die dabei verwendete Symbole werden in der unten stehenden Tabelle erlautert Symbole der Software und ihre Bedeutung Der Patient tr gt auf beiden Allelen die gesunde Variante der untersuchten genetischen Variation Der Patient tr gt auf einem Allel die gesunde und auf dem anderen Allel die mutierte genetische Variation Der Patient tr gt auf beiden Allelen die mutierte genetische Variation in homozygoter Form Die Signalwerte der Sonden f r diese genetische Variation sind zu gering um ein valides Ergebnis zu erzeugen Dies k nnte auf Sequenzveranderungen in direkter Nahe zur untersuchten Variation hindeuten Die anderen Signale werden jedoch durch den Ausfall nicht beeintrachtigt Beide Sonden f r diese genetische Variation erzeugen ein nicht g ltiges Signal Dies k nnte auf eine Verschmutzung auf der Chipoberfl che zur ckzuf hren sein Die anderen Signale werden jedoch durch den Ausfall nicht beeintr chtigt 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Auswertung 13 Schritt 5 Diagnostischer Report Um die Daten auszuwerten lassen Sie sich den diagnostischen Report anzeigen Klicken Sie hierfur auf die Schaltflache Report Zus tzlich k nnen Sie auch ein pdf Dokument erstellen oder den Report direkt ausdrucken c Bad http localhost PGDx System diag Rep Tamox Rep O BO X ES PGDx System
12. aining signals of the assay are not influenced Both probes for this genetic variant show an invalid signal This might be caused by impurities or dust particles on the MutaCHIP surface The remaining signals of the assay are not influenced 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Evaluation and Interpretation of Results 13 Step 5 Diagnostic report To evaluate the results open the diagnostic Report Main Therefore click on the button Report Additionally a pdf document can be created or the report can be directly printed e Bad http localhost PGDx System diag Rep Tamox Rep O BO X ES PGDx System Diagnostic R X Edit View Favorites Tools Help New tab Ctrl T Duplicate tab Ctrl K New window Ctrl N New session Open Ctrl O Select Printer Eit meth Notepad f Add Printer Save r PDFCreator Save as Ctrl S Close tab Ctrl W Page setup 2 Status Ready Print to file Print Ctrl P TOR Print preview EM Sample Page Range Import and export s we oe Type of sample Selection Current Page Properties Draw date Pages 1 Collate Work offline Processing date Enter either a single page number or a single Bit Report date 05 07 2011 sh ec Results and Interpretation Defective CYP2D6 alleles detected 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 12 Trouble shooting en nn Software Message Warning T
13. assay high molecular freshly extracted DNA has to be used 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Sample Collection 10 Test Procedure 10 1 PCR Product Generation To amplify the target DNA three reactions have to be prepared They have to be pipetted following the schemes below PCR reaction 1 DNA min 120 ng max 600 ng 12 uL 2D6 PCR Mix A green lid 12 5 uL PCH reaction 2 2D6 PCR Mix B yellow lid 20 5 uL PCR reaction 3 2D6 PCR Mix C blue lid 20 5 uL The samples are placed in the thermocycler and the program described in 10 2 is to be applied 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 10 2 PCR Protocol The PCR protocol has to be established anew for each laboratory as different thermocyclers have different heating rates This establishment can be omitted when using the recommended thermocycler Peqlab Primus 25 advanced The following standard protocol can be used to start the establishing process Temperature C o9 83 ee Final Elongation 72 7 Pase 4 8 j 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Test Procedure 10 3 MutaCHIP Protocol A Preparation of the Hybridisation Buffer If the Hybridisation Buffer is turbid or a precipitate can be seen it has to be heated in a microwave for several seconds 240 W or in a water bath Gently shake the Hybridisation Buffer until it gets clear to
14. em Verwenden muss der Puffer auf Raumtemperatur RT abgek hlt werden B Vorbereitung der DNA Proben e Geben Sie 60yl Reaction Optimization Mixture ROM in ein 200ul Gef F gen Sie 3ul pro PCR Produkt A B und C hinzu und vortexen Sie kurz Denaturieren Sie das Gemisch f r 2 min bei 95 C Nach der Denaturierung f gen Sie 100ul Hybridisation Buffer hinzu Pipettieren Sie das Gemisch ohne den Boden zu ber hren in den MutaCHIP C Hybridisierung e Hybridisieren der Probe bei 55 C und 550 rpm f r 60 min D Waschschritte nach der Hybridisierung Den Thermoshaker auf 50 C temperieren Achtung Wahrend des Herunterk hlens des Thermoshakers muss der MutaCHIP unbedingt aus dem Shaker entnommen werden Der Hybridisation Buffer muss auf dem MutaCHIP verbleiben bis die Zieltemperatur erreicht ist Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten e Den Hybridisation Buffer aus Schritt C vollst ndig entfernen e 500 uL Washing Buffer vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren e Waschen des MutaCHIPs bei 50 C und 550 rpm f r 5 min E Enzymkonjugation Den Thermoshaker auf 21 C temperieren Achtung W hrend des Runterk hlens des Thermoshakers muss der MutaCHIP unbedingt aus dem Shaker entnommen werden Der Washing Buffer muss auf dem MutaCHIP verbleiben bis die Zieltemperatur erreicht ist Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten e Den Washing Buffer aus Schritt D vollst ndig entfernen e 100 uL Enzyme Mix vorsic
15. enrezeptor als Tamoxifen selbst und sind somit entscheidend fur den individuellen Therapieerfolg Durch eine CYP2D6 Genotypisierung k nnten bereits vor Beginn einer Tamoxifen Therapie diejenigen Patientinnen erkannt werden die eine verringerte oder keine Enzymaktivit t aufweisen Dies erlaubt es solche Patientinnen fr hzeitig mit anderen Medikamenten wie Aromatase Inhibitoren zu behandeln die Chancen auf eine erfolgreiche Therapie zu erh hen und das Risiko einer erneuten Tumorbildung zu minimieren Die Genotypisierung ist besonders wichtig da 50 der kaukasischen Bev lkerung eine ver nderte Variante des CYP2D6 Gens tragen und Tamoxifen nicht richtig metabolisieren k nnen Diese Patientinnen sollten zu Aromatase Inhibitoren wechseln Referenzen JAMA October 7 2009 Vol 302 No 13 Breast Cancer Res 2007 9 2 103 Breast Cancer Res Treat 2007 Jan 101 1 113 21 Cancer 2008 Feb 1 112 3 Suppl 695 9 Pharmacogenomics J 2009 Aug 9 4 258 64 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 SE m 3 Testprinzip Zur Analyse der Mutationen wird das gesamte CYP2D6 Gen mittels PCR amplifiziert wobei frisch extrahierte genomische DNA des Patienten als Matrize dient Das Amplifikationsprodukt wird anschlie end auf den MutaCHIP gegeben und nach mitgeliefertem Protokoll bearbeitet Die Analyse mittels Pr zipitationsreaktion l sst eine eindeutige Genotypisierung aller auf den MutaCHIP gespotteten Allele des CYP2D6 Ge
16. ention to the correct adjustment of volume e Completely remove the Enzyme Mix from step E e Add of 500 uL Washing Buffer to the MutaCHIP e Wash the MutaCHIP at 550 rpm and 21 C for 5 min G Precipitation Caution Pay attention to the correct adjustment of volume Do not shake the MutaCHIP during the precipitation e Completely remove the Washing Buffer from step F e Add 100 uL of Substrate to the MutaCHIP and incubate for 5 min at 21 C To do so put the MutaCHIP into the thermoshaker Do not activate shaking function e Thereafter remove the Substrate completely pipette and immediately add 500 pL of Washing Buffer e Place the MutaCHIP into the image reader pay attention to the correct orientation take a picture and start with the analysis evaluation of the results see following chapter 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 11 Evaluation and Interpretation of Results The evaluation is performed using the MAAT and the CYP2D6 Software The results are compiled with help of the software into a report For the evaluation of the chip follow the short instructions below For further and detailed information please refer to the CYP2D6 Software handbook step 1 Create a new project Click on the button New experiment Assign an arbitrary name for the experiment and Subsequently save it by clicking on the button save nnn SST So epaia anes pre 7 es bee C Jj 1 a E Local Dnk C Document e Pai riem Pai Pret
17. er Ziel DNA werden drei PCR Ans tze ben tigt Diese werden wie im Folgenden beschrieben pipettiert PCR Ansatz 1 Bestandteil Volumen pro 25 uL Reaktionsansatz DNA min 120 ng max 600 ng 12 uL 2D6 PCR Mix A gr ner Deckel 12 5 uL PCH Ansatz 2 2D6 PCR Mix B gelber Deckel PCR Ansatz 3 Bestandteil Volumen pro 25 uL Reaktionsansatz 2D6 PCR Mix C blauer Deckel 20 5 uL Die Proben in den Thermocycler stellen und das in 10 2 beschriebene PCR Protokoll verwenden 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 10 2 Probenzusammenf hrung und Verd nnung Das PCR Protokoll muss f r jedes Labor erneut etabliert werden da die verschiedenen Thermocycler unterschiedliche Heizraten haben Diese Etablierung entf llt wenn der empfohlene Thermocycler verwendet wird Peglab Primus 25 advanced F r die Etablierung kann mit dem folgenden Standard Protokoll begonnen werden Temperatur c Zetimn Primer Hybridisation 68 05 Elongation 66 45 Final Elongation 72 7 Pase 4 J 8 j 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Testdurchfuhrung 10 3 MutaChip Protokoll A Vorbereitung des Hybridisierungspuffers Falls der Hybridisation Buffer tr b oder flockig geworden ist kann dieser f r wenige Sekunden in der Mikrowelle 240 W oder in einem Wasserbad erw rmt und durch Schwenken homogenisiert werden bis er wieder klar ist Vor d
18. ergeben Sie einen beliebigen Namen f r das Experiment und speichern Sie es anschlie end indem Sie auf die Schaltfl che Speichern klicken Je Neues Projekt anlegen LT Organisieren saa Ansichten i Neuer Ordner Name Anderungsdatum Patient 1 xml i Computer Patient 2 xml E Dokumente ous z E Bilder Patient 5 xml Patient 3 xml Eg Musik Patient 5 xml i Zuletzt ge ndert Patient 7 xml E Suchvorg nge js ffentlich Ordner A Dateiname Neues Experiment Dateityp Extended Markup Language Daten xml Ordner ausblenden Schritt 2 Analyseprozess starten Klicken Sie auf die Schaltfl che Start um die Datenanalyse zu starten 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Auswertung 11 Schritt 3 Qualit tspr fung des MutaCHIPs m berpr fen Sie die Bildqualit t euo 0 9 5 Bitte berpr fen Sie die Qualitat des Bildes Falls Staubpartikel auf dem Bild zu erkennen sind entfernen sie diese bitte da sonst m glicherweise die Auswertung beeintr chtigt werden k nnte Um Staubpartikel zu entfernen s ubern Sie bitte die Unterseite des Chips mit einem weichen und feuchten Tuch Dr cken Sie anschlie end auf Bild erneut aufnehmen um den Aufnahmevorgang zu wiederholen Klicken Sie auf Analyse fortsetzen wenn Sie ein qualitativ einwandfreies Bild sehen Neues Bid Um ein einwandfreies Analyseergebnis zu erhalten
19. he Check enzyme and or substrate signals of the biotin reference markers Repeat the assay with new enzyme are too low This could be a sign of a substrate failed or missed conjugation step Alternatively the enzyme could be degraded The system will be stopped Software Message Warning The Please read paragraph 11 1 signals of the DNA probes indicate a failed amplification However there might be a homozygous deletion of the CYP2D6 gene Please refer to the handbook under section Detection of 5 homozygous Software Message No error The reader is not plugged in properly description ErrorCode 3011 Keep Esc pressed for 3 seconds and plug in the reader in the right manner please refer to the user manual of the PGDx System Poor image quality Clean the bottom side of the MutaCHIP using a cotton swab or a cloth wet with disinfectant Repeat the photograph it can be necessary to repeat this procedure several times Blurred picture Carefully clean the camera with a cotton swab 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012
20. htig auf den MutaCHIP pipettieren e Konjugation des MutaCHIPs bei 21 C und 550 rpm f r 15 min F Zweiter Waschschritt Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten e Den Enzym Mix aus Schritt E vollst ndig entfernen e 500 uL Washing Buffer vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren e Waschen des MutaCHIPs bei 21 C und 550 rpm f r 5 min G F rbung Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten Der Chip darf wahrend und nach dem Farben nicht gesch ttelt werden e Den Washing Buffer aus Schritt F vollst ndig entfernen e 100 uL Substrate in den MutaCHIP geben und f r 5 min bei 21 C inkubieren Dazu den MutaCHIP in den Thermoshaker berf hren keine Sch ttelfunktion aktivieren e Danach das Substrate wieder vollst ndig entfernen Pipette und umgehend 500 ul Washing Buffer hinzugeben e MutaCHIP in den Imagereader berf hren auf korrekte Platzierung achten Bild erstellen und mit der Analyse Auswertung beginnen siehe folgendes Kapitel 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 11 Auswertung Die Auswertung erfolgt ber das MAAT und die CYP2D6 Software Die Ergebnisse werden mit Hilfe der Software in einem Report zusammengestellt F r die Auswertung des Chips folgen Sie der folgenden kurzen Anleitung F r weitere und detailliertere Informationen sehen Sie bitte im CYP2D6 Software Handbuch nach Schritt 1 Ein neues Projekt erstellen Klicken Sie auf die Schaltfl che Neues Experiment V
21. ks and room temperature RT For storage choose a dry and dark place e To avoid even minimal loss of performance we recommend using up one bag of MutaCHIPs within two weeks e he MutaCHIPs have to be protected against direct exposure to sunlight and dust 7 Working Conditions e Never centrifuge the MutaCHIPs e Do not touch the surface of the MutaCHIPs with a pipette e Use only substances that are mentioned in the protocol 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 sss 8 Considerations and Precautions The guidelines and principles for working in a biomolecular laboratory have to be followed e The test is suitable for genomic DNA freshly extracted from whole EDTA blood as starting material Only then optimal results are guaranteed e Do not mix reagents from different lots e The MutaCHIPs are o for single use only o Only for in vitro diagnostics e Do not let the MutaCHIP dry out while performing the analysis e The MutaCHIP is designed for the use with the MAAT and the software provided by PharmGenomics e Perform all steps in a timely manner e Keep all stock solutions cooled while working e Always open the MutaCHIP with both hands Do not apply pressure to the tube 9 Sample Collection The template for PCR amplification is genomic DNA from EDTA whole blood The DNA concentration should be between 15 and 30 ng uL The minimum DNA purity A260 A280 ratio should be higher than OD 260 280 1 8 For the
22. mmun Ins MutaCHIP Tamox DNA Macroarray Testkit f r die Untersuchung von Mutationen des Cytochrom P450 2D6 Gens Nur f r in vitro Diagnostik C SN KF391005 Win SN KF390005 WY on Immundiagnostik AG Stubenwald Allee 8a 64625 Bensheim Germany www immundiagnostik com Tel 49 0 6251 701900 info immundiagnostik com Fax 49 0 6251 849430 eh PL Inhaltsverzeichnis m Verwendungszweck Einleitung Testprinzip Kitbestandteile Erforderliche Materialien Lagerung und Haltbarkeit Arbeitsbedingungen Hinweise und Vorsichtsma nahmen Probengewinnung yJ O O Ci oo FL HP O OW mk Testdurchfuhrung PCR ProduktTierstellung us ii E GOO 7 Probenzusammenf hrung und Verdunnung ccceceececeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeneeeenseeenseseeseeeesnees 8 MutaChiIp ProtoKOl eria vae eoe ee 9 on a O O O N OO Gi A C N h Auswertung 10 NO Troubleshooting 14 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 Verwendungszweck 3 1 Verwendungszweck Der MutaCHIP Tamox Kit ist ein molekularbiologischer Test zur Untersuchung von Mutationen des Cytochrom P450 2D6 Gens aus genomischer DNA Der Test basiert auf der MutaCHIP Technologie Die untersuchten Genvarianten stehen im Zusammenhang mit fehlender oder verminderter Aktivit t des CYP2D6 Enzyms und in Folge dessen mit der Unwirksamkeit einer Tamoxifen Therapie Folgende Allele und Variationen werden durch den Test detektiert e
23. ns ZU Das amplifizierte Produkt wird auf den MutaCHIP gegeben und bindet an den dort immobilisierten Sonden Durch einen Waschschritt werden unspezifisch gebundene Fragmente wieder entfernt Im Anschluss wird das Enzym hinzugegeben welches an den Sonden Fragment Komplex bindet Nach Zugabe des Substrats tritt eine Fallungsreaktion an den Stellen an denen noch DNA gebunden ist auf Das farbige Pr zipitat wird mit dem Imagereader detektiert und von der dazugeh rigen Software ausgelesen und bewertet 4 Kitbestandteile Jedes Testkit enth lt die folgenden Reagenzien zur Durchf hrung von 20 MutaCHIP Tamox Assays sowie eine Gebrauchsanweisung Being Gor ngr de Menge 2D6 PCR MA gr ner Decke 2ml Schraube 1 206 PORMeB gelver Decke 2mbSewab e 1 206 PoRMcC oiauerDecke 2mLScwab he 1 Poynerse 2mbShabhe 3i Hybrdisaion Butler SomLPmeeshe 1 Reaction Opimisaton Mi ROM 2mLScwabte 1 o e Washing Buffer GOmLPlstklasce 1 EmymeMx 4mtPlastikfiasche 1 Substrate 2miSchraubr hre braun 2 DNA Ret 1 2mLSchraubr he 1 DNARef G4i 2mLSchraubr he 1 a PB 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Kitbestandteile 5 5 Erforderliche Materialien Ben tigte Ger te von PharmGenomics erh ltlich e Macroarray Analy
24. sing Tool MAAT Notebook CYP2D6 Genotyping Software o MutaCHIP Imagereader o Thermocycler f r PCR Peglab Primus 25 advanced o Thermomixer mit K hlfunktion BIOR Mixing Block MB 102 O Ben tigte Ger te und Verbrauchsmaterialien nicht mitgeliefert e Pipetten o 0 1 25yuL o 0 5 10yL o 10 200 uL o 100 500 uL e 0 2 mL PCR Gef e steril steril 6 Lagerung und Haltbarkeit e Alle Komponenten sind bei 2 8 C zu lagern e Das Substrat ist unbedingt vor Lichteinwirkung zu sch tzen e Im Inneren des Beutels befinden sich 5x MutaCHIPs mit jeweils ge ffnetem Deckel Wenn ein Lichtschutzfolien Beutel ge ffnet wurde m ssen die Deckel der darin verbleibenden MutaCHIPs unbedingt ge ffnet bleiben da das Schutzgas entweicht e Die MutaCHIPs k nnen im wieder lose nicht luftdicht verschlossenen keine Klebestreifen verwenden Lichtschutzfolien Beutel mehrere Wochen bei Raumtemperatur RT gelagert werden Dabei einen dunklen und trockenen vor Feuchtigkeit sch tzen Ort zur Aufbewahrung ausw hlen e Um selbst minimale Performanceverluste zu vermeiden empfehlen wir jedoch den Verbrauch eines ge ffneten MutaCHIP Beutels m glichst innerhalb von zwei Wochen e Die MutaCHIPs sind gegen direkte Sonneneinstrahlung und Staub zu sch tzen 7 Arbeitsbedingungen e Die MutaCHIPs d rfen niemals zentrifugiert werden e Die Oberfl che des MutaCHIPs darf nicht mit der Pipettenspitze ber hrt werden e Der MutaCHIP darf nur mit
25. step the unspecific fragments are removed from the surface Subsequently the Enzyme Mix is added to the MutaCHIP coupling with the probe target complex After addition of the substrate a precipitate will form This precipitate is then detected by the Image reader and the signals are evaluated by the software 4 Components Each test kit contains the following components for 20 MutaCHIP Tamox assays and the instruction manual Washing Buffer 60 mL Plastic Flask 4 mL Plastic Flask 20 Substrate 2 mL Reaction Tube brown 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Components 5 5 Materials Required materials that can be ordered separately from PharmGenomics e Macroarray Analysing Tools MAAT o Notebook CYP2D6 Genotyping Software o MutaCHIP image reader o Thermocycler Peqlab Primus 25 advanced o Thermoshaker with cooling function BIOR Mixing Block MB 102 Required Materials not provided e pipettes o 0 1 2 5uL o 05 10uL o 10 200 uL o 100 500 uL e 0 2 mL PCR tubes sterile 6 Storage and Shelf life e All components are stored at 2 8 C e The substrate has to be strictly protected against light exposure e he bags contain each 5x MutaCHIPs with open lids After unsealing a bag the lids of the remaining MutaCHIPs have to remain open as the protection gas escapes e The MutaCHIPs can be stored in the loosely not airtight closed do not use tape light protection bag up to several wee
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