LM DNA Kit Product Insert
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1. Die Chargenmatrize ist auf der Website bereitgestellt und erh lt in diesem Fall die Bezeichnung Nulli xxxxxx Chargennr e Bitte beachten Sie dass die Matrizenversionen Chargenbezeichungs spezifisch sind und den Chargenbezeichnungen der Sondenmischungen entsprechen Folgen sie den schrittweisen Instruktionen die f r das Erzeugen von Chargen auf dem Bildschirm erscheinen Bei der Bezeichnung der Charge sollte die Bezeichnung keine Kommas enthalten da die nach einem Komma stehenden Informationen nach dem Datenexport verloren gehen Weitere Instruktionen ber die Erzeugung von Chargen und Multichargen finden Sie im Luminex Benutzerhandbuch b Durch Anklicken des Ausschubsymbols wird der Plattenhalter ausgeschoben Setzen Sie die 96 Kavit ten Thermalcyclerplatte mit den Proben in den auf dem Plattenhalter befindlichen XYP Hitzeblock c Klicken Sie auf das Einzugssymbol Die Proben sind nun bereit f r die Analyse Ein Primerschritt sollte vor Starten des Durchgangs durchgef hrt werden d Nachdem die Proben das Ger t durchlaufen haben sollte ein Sanitationsschritt mit 70 Isopropanol bzw 20 Haushaltsbleichmittel gefolgt von zwei Waschschritten durchgef hrt werden Das Ger t kann an diesem Punkt abgeschaltet werden falls es im Laufe des Tages nicht ein weiteres Mal gebraucht wird Nachdem eine Charge fertig gestellt ist werden die Daten als kommagetrennte csv Datei exportiert Diese Dateien haben die Bezeichnung OUTPUT CSV und2. 2 ul 1 U Nucleasefreies Wasser Zu 20 ul finalem Volumen Tabelle 2 Thermalcyclerbedingungen f r die Amplifikation R Thermalcycler Modus Anlaufgeschwindigkeit GeneAmp PCR System 9700 MAA Non 3 9 C s Veriti 96 Kavit ten 9700 MAX Modus Thermalcycler 3 9 C s Tabelle 3 Thermalcyclerbedingungen f r die Amplifikation Schritt Temperatur und Inkubationszeit Anz Zyklen 1 95 C f r 3 min 1 95 C f r 15 s 2 60 C f r 30 s 12 72 C f r 30 s 95 C f r 10 s 3 63 C f r 30 s 28 72 C f r 30 s 72 C f r 2min 1 4 C f r immer 1 Seite 4 von 8 LC1437CEDE 3 05 15 Anmerkung Um genaue Ergebnisse bei der Probenamplifizierung sicherzustellen sehen Sie unter Gel Elektrophorese nach Anhang A C Hybridisierung Sorgen Sie daf r dass die Hybridisierungspuffer Komponenten der LIFECODES Sondenmischung aufgel st und die Beads vollst ndig suspendiert sind Luminex Instrumentarium und XY Plattform einschalten um ein 30 min tiges Anw rmen zu erm glichen Sondenmischung in einem 55 60 C Hitzeblock mindestens 5 10 Minuten anw rmen um die Komponenten in der Sondenmischung vollst ndig aufzul sen Kurz beschallen 15 Sek dann Sondenmischung etwa 15 Sekunden vortexen um die Beads vollst ndig zu suspendieren 5 ul der geeigneten Probenmischung mit 5 ul des Locus spezifischen PCR Produkts in jeder Kavit t einer Thermalcy
3. DES VERFAHRENS Die beschriebenen PCR Bedingungen und Assay Bedingungen erfordern sorgf ltige Kontrolle Abweichungen von diesen Parametern k nnen zum Versagen des Produkts f hren S mtliche Ger te m ssen gem den Empfehlungen des Herstellers kalibriert sein und im Rahmen der vom Hersteller beschriebenen Parameter betrieben werden 1 Die Beads m ssen vor Gebrauch vorgew rmt und gut suspendiert werden Dies gew hrleistet dass die Hybridisierungspuffer Komponenten vollst ndig gel st sind 2 47 C und 56 C Inkubationen erfordern ein hohes Ma an Genauigkeit 0 5 C Ein Thermalcycler sollte zum Einsatz kommen Die Temperatur in den Kavit ten der 96 Kavit ten Thermalcyclerplatte unter Einsatz eines Thermoelements z B Bio Rad Modell VPT 0300 bzw ein entsprechendes anderes Modell sollte berpr ft werden Die Temperatur in den Kavit ten sowie um die Kavit ten herum sollte um nicht mehr als 0 5 C schwanken 3 Bei 56 C ist die Zeit entscheidend und sollte nicht ber insgesamt 13 Minuten liegen Das schlie t die 8 min tige Inkubation plus im H chstfall 5 Minuten ein um s mtliche Proben mit Verd nnungsl sung PE Streptavidinmischung zu verd nnen 4 Nach der Verd nnung muss die Probenanalyse innerhalb von 1 Stunde abgeschlossen werden vor Licht sch tzen 5 Komponenten von verschiedenen Sets und Chargen nicht miteinander vermischen Wegen der Komplexit t der HLA Typisierung sollte nur geschultes Person
4. HLA Typisierung wird ein anschlie endes Nachweisverfahren angewendet um die Eigenschaften der amplifizierten DNA zu bestimmen Verschiedene Typen von Nachweisverfahren wie etwa SSP 1 direkte SSOP 2 RFLP 3 und reverses SSOP Dot Blotting 4 wurden bei der HLA Typisierung verwendet Ebenso wie SSOP und reverse Dot Blotting Methoden verwenden LIFECODES HLA SSO Typisierungssets sequenzspezifische Oligonukleotide SSOs zum Nachweis welche HLA Allele in einer PCR amplifizierten Probe vorliegen Bei der Bestimmung der F higkeit die verschiedenen bei der PCR Amplifikation vorliegenden Allele voneinander zu unterscheiden kommt es auf das Set der eingesetzten SSOs nicht auf die Methodik an W hrend reverse Dot blotting und SSOP Methoden mit Enzymmarkierungen und kolorimetrischen Substraten arbeiten bei denen eine anschlie ende Entwicklung erforderlich ist handelt es sich bei dem LIFECODES Nachweisverfahren um ein homogenes Mehrfachsystem Das bedeutet alle SSOs werden gleichzeitig analysiert und der gesamte Nachweis wird in einem einzigen Reaktionsgef unter Zusatz eines einzigen Reagenzes durchgef hrt VERFAHRENSPRINZIPIEN Das LIFECODES HLA SSO T ypisierungsverfahren basiert auf der Hybridisierung von markierten einstr ngigen PCR Produkt zu SSO Sonden Bei der Amplifikation von DNA unter Verwendung von PCR werden normalerweise quimolare Mengen von Vorw rts und R ckw rtsprimern verwendet um ein doppelstr ngiges DNA Produkt zu erz
5. aufgef hrten Materialien verwendet Luminex H llstromfl ssigkeit 1x Lifecodes Kat Nr 628005 e Thermowell klares Polyethylenband Costar Nr 6524 LIFECODES Nucleasefreies Wasser Lifecodes Kat Nr 757003 20 ml Kat Nr 888635 PCR Gef e und Kappen Corning Thermowell Gef streifen e _R Phycoerythrin konjugiertes Streptavidin SA PE 1mg ml Costar Kat Nr 6542 LIFECODES Kat Nr 888640 oder LIFECODES Kat Nr 628511 B Corning Thermowell PCR 96 Kavit tenplatten Kat Nr CLS6551 e Luminex Kalibrierungssets Luminex 100 200 Kalibrierungsset Luminex 100 200 Leistungsverifizierungsset LIFECODES Kat Nr i ig uni oder Thermoscientific AB Gene Superplate 96 Kavit ten PCR 628018 bzw 628019 Platte Kat Nr AB 2100 e Costar platte Costar Kat Nr 6509 LIFECODES Kat Nr 888630 Vom Benutzer bereitzustellende Materialien e Vortex Mischer Silikon Kompressionsmatte Axygen Scientific NR CM FLAT oder gleichwertig e Wasserbad Sonikator e Mikrozentrifuge Barrier Filterspitzen e Pipettierhilfen Mehrkanalpipettierhilfen und Wattest bchen 1 20 ul 20 200 ul 1000 ul e Tabellenkalkulationsanalysesoftware e Hitzeblock e 70 Isopropanol oder 20 Bleichmittel e Halterungstablett Applied Biosystems Nr 403081 nur f r den Gebrauch mit dem 9700 Thermalcycler Seite 3 von 8 LC1437CEDE 3 05 15 GEBRAUCHSANWEISUNG ANMERKUNGEN Sondenmischungen und PE Streptavidin
6. glich Gels mit 20 ul von 10 mg ml Ethidiumbromid an Stelle von GelStar Nukleins ure Farbmarker zu verwenden Bandenintensit t der Produktbanden ist in Gels auf Ethidiumbromid Basis geringer als in Gels mit GelStar VORSICHT BEI DER VERWENDUNG Ethidiumbromid ist als krebserregend bekannt 3 Gel im Dunkeln aufbewahren und fest werden lassen 4 Eine Mischung von 2 5 ul jedes PCR Produkts und 2 5 ul 2X Ladepuffer mit sichtbarem Farbstoff pro Probe pro Amplifikation Gel im Dunkeln bei etwa 160 Volt 45 Minuten laufen lassen bzw bis die Probe weit genug l uft dass verschiedene Banden f r ein und doppelstr ngige Produkte sichtbar werden Bromphenolblau Bande oder andere Farbmarker wandern 2 5 bis 5 cm von den Kayvit ten 5 Unter Verwendung eines UV Transilluminators mit einem gelben fotografischen GelStar Filter Lonza Group Ltd Nr 50536 fotografieren VORSICHT Beim Hantieren mit GelStar Nukleins ure Farbmarker bzw Ethidiumbromid sowie beim Fotografieren von Gel mit dem UV Transilluminator Schutzausr stung tragen 6 Gelanalyse 210 180 280 280 Doppelstr ngig bp Einstr ngig bp Gel Interpretation Amplifikation Nicht Amplifikation Kavit t ei L Doppelstr ngige DNA Hell Einstr ngige DNA Weniger hell Primerbande Seite 8 von 8 LC1437CEDE 3 05 15
7. sind lichtempfindlich Vor Licht sch tzen und nicht einfrieren Beads bei 55 60 C mindestens 5 10 Minuten anw rmen um die Komponenten vollst ndig in der Sondenmischung aufzul sen Kurz beschallen 15 Sek dann Sondenmischung etwa 15 Sekunden vortexen um die Beads vollst ndig zu suspendieren Lassen Sie bei der Aliquotierung u erste Vorsicht walten indem Sie kalibrierte Pipetten verwenden Bei Nichtbeachtung droht Verlust der Reagenzien und Versagen der Probe Alle Temperaturvorgaben m ssen genau eingehalten werden Schon Fluktuationen in einer Gr enordnung von 0 5 C k nnen die Ergebnisse beeintr chtigen Im Hybridisierungsstadium sollten die Proben nicht l nger als 5 Minuten bei 56 C in verd nntem Zustand verbleiben siehe Abschnitt Ergebnisse Es ist empfehlenswert die amplifizierten Proben so bald wie m glich zu analysieren Falls die Proben nicht noch am selben Tag den Luminex Instrumentarium durchlaufen k nnen kann das amplifizierte Produkt vor dem Gebrauch bis zu 3 Tage bei 2 8 C aufbewahrt werden Eine l ngere Lagerung bis zur Durchf hrung des Nachweisverfahrens ist bei 20 C f r einen Zeitraum von bis zu einer Woche m glich Das amplifizierte Produkt darf nur einmal eingefroren und aufgetaut werden Wiederholtes Einfrieren und Auftauen f hrt zum Abbau der amplifizierten Proben und liefert unzureichende Ergebnisse beim Assay A Reinigung der genomischen DNA durch Anwendung einer Methode ei
8. werden in einem Verzeichnis mit der Chargenbezeichnung gespeichert die in die Luminex IS eingetragen wird Diese Daten sind anschlie end verf gbar um Typisierungszuweisungen wie unten beschrieben vorzunehmen Im Luminex IS Benutzerhandbuch finden Sie Informationen ber die Bedienung der Ger te einschlie lich der Vorgehensweise beim t glichen Hochfahren der Kalibrierung der Wartung sowie dem Abschalten Seite 5 von 8 LC1437CEDE 3 05 15 ERGEBNISSE Die Probentypisierung kann folgenderma en durchgef hrt werden Die erzeugten CSV Dateien k nnen ge ffnet und die Daten mit gebr uchlichen Tabellenkalkulationsprogrammen wie Microsoft Excel Lotus 123 Corel Quattro Pro oder hnlicher Software verarbeitet werden Die Analyse umfasst die folgenden Schritte 1 Verifizieren dass die Anzahl der Ereignisse f r jede SSO in jeder Probe bei mindestens 60 liegt Diese Information ist im Abschnitt DataType Count der CSV Datei aufgef hrt 2 Feststellen dass die Werte f r die konsensuellen Sonden f r jede Probe ber dem Minimum ihrer mittleren Fluoreszenzintensit t bzw MFI liegen Die Mindestnachweisgrenzwerte sind chargenspezifisch und sind in der Grenzwerttabelle aufgef hrt Vorsicht e Um verl ssliche Ergebnisse zu erhalten muss eine ausreichende Datenmenge durch das Luminex Instrumentarium gesammelt werden e Sammeln Sie f r jede SSO mindestens 60 Ereignisse 3 Der Hintergrundkontrollwert f r jede Sonde wird von den Probenwe
9. LIFECODES Immucor Transplant Diagnostics Inc 550 West Avenue Stamford Connecticut 06902 USA Tel 1 203 328 9500 oder 888 329 0255 geb hrenfrei in den USA und Kanada Fax 1 203 328 9599 WWW IMMUCOR COM Produktdokumentation und bersetzungen erh ltlich unter www Immucor com PRODUKTBEILAGE LIFECODES SSO HLA Nullallel Typisierungsset F r in vitro Diagnose INHALTSVERZEICHNIS Definition der Symbole Sets Reagenzien nach Katalognummer Zweckbestimmung Zusammenfassung und Erl uterung Verfahrensprinzipien Reagenzien A Identifizierung B Sicherheits und Warnhinweise C Anweisungen f r die Aufbewahrung D Reinigung bzw Vorbereitung f r den Gebrauch E Instabilit tshinweise Erforderliche Ger te Gewinnung und Aufbereitung der Proben Verfahren A Mitgelieferte Materialien B Ben tigte aber nicht mitgelieferte Materialien Reagenzien und Ausr stung C Vom Benutzer bereitzustellende Materialien Gebrauchsanweisung A Reinigung der genomischen DNA B Amplifizierung C Hybridisierung D Analyse der Probe mit Luminex Instrumentarium Ergebnisse Qualit tskontrolle Grenzen des Verfahrens Fehlerbeseitigung Erwartete Werte Besondere Leistungsmerkmale Literatur Eingeschr nkte Lizenzen Herstellerinformationen Verwendete Warenzeichen Anhang A Gel Elektrophorese Gel Interpretation DEFINITION DER SYMBOLE Produktetiketten und zus tzliche Dokumente Zul ssiger Temperatur Temperat
10. Sondenmischungen und R Phycoerythrin konjugiertes Streptavidin sind lichtempfindlich VOR LICHT SCH TZEN NICHT EINFRIEREN 3 Komponenten nach Ablauf des Verbrauchsdatums nicht mehr verwenden D Reinigung bzw Vorbereitung f r den Gebrauch Siehe Gewinnung und Aufbereitung der Proben E Instabilit tshinweise 1 Falls Salze w hrend Versand oder Lagerung aus der L sung pr zipitiert haben sollten m ssen sie vor Gebrauch durch Vortexen bei Zimmertemperatur 18 bis 30 C wieder vollst ndig aufgel st werden 2 Verwenden Sie kein R Phycoerythrin konjugiertes Streptavidin das w hrend des Transports oder w hrend der Lagerung gefroren war ERFORDERLICHE GER TE 1 Luminex Instrumentarium und XY PLATFORM Produkt Nummer 888300 888310 2 Die folgenden Thermalcycler wurden validiert 96 Kavit ten GeneAmp PCR System 9700 auf MAX Modus eingestellt Base Katalog Nr N8050200 Gold Block Kat Nr 4314878 Veriti 96 Kavit ten Thermalcycler auf 9700 MAX Modus eingestellt Kat Nr 4375786 Maximale Anlaufgeschwindigkeiten sind Tabelle 2 zu entnehmen Vorsicht _ andere Thermalcycler und Anlaufgeschwindigkeiten wurden nicht validiert GEWINNUNG UND AUFBEREITUNG DER PROBEN A Menschliche DNA kann mit einer validierten Methode die die nachfolgenden Kriterien erf llt aus Vollblut Buffy Coats und Wangenabstrichen gewonnen werden DNA die aus in EDTA und ACD Acid Citrate Dextrose konserviertem Blut gewonnen wurde wurde getestet und e
11. al kann au erdem verwendet werden um das Signal der allelspezifischen Sonden zu normalisieren und korrigierend bei Variationen der Menge amplifizierten Produkts bei der Hybridisierungsreaktion zu wirken Die Analyse der durch die SSO Typisierung erzielten Ergebnisse kann verwendet werden um Vorliegen oder Fehlen von bestimmten DNA Sequenzen in amplifizierter DNA festzustellen und um die eventuell in der Probe befindlichen Allele zu identifizieren F r das LIFECODES HLA SSO T ypisierungsverfahren werden die Sonden mit Luminex Mikrosph ren verbunden die zur Anwendung mit dem Luminex Instrumentarium vorgesehen sind Bis zu 100 unterschiedliche Populationen Luminex Mikrosph ren k nnen mit Hilfe des Luminex Instrumentariums miteinander vermischt und analysiert werden da jede Mikrosph renpopulation durch ihre charakteristische Fluoreszenzsignatur bzw farbe unterschieden werden kann Mit jeder Farbmikrosph re kann eine unterschiedliche SSO Sonde verbunden werden Bei einer Mischung verschiedener Sonden k nnen diese durch ihre Verkn pfung mit bestimmten Farbmikrosph ren voneinander unterschieden werden Mit dem Luminex Instrumentarium ist es ebenfalls m glich die relativen Mengen markierter zu jeder Luminex Mikrosph re hybridisierter PCR Produkte zu quantifizieren Daher kann das mit den SSO Sonden in dem LIFECODES Nachweisverfahren erhaltene relative Signal wie im Falle anderer SSOP Methoden eingesetzt werden um den Sonden die Eigenschaft positiv
12. al mit der berpr fung der Dateninterpretation und den Typisierungszuordnungen betraut werden Seite 6 von 8 LC1437CEDE 3 05 15 FEHLERBESEITIGUNG Niedrige Beadzahl Sondenmischung nicht ausreichend suspendiert Sondenmischung vorw rmen beschallen und vortexen und Assay wiederholen Ger t funktioniert nicht Nicht kalibriert Ger t kalibrieren Siehe Luminex IS Benutzerhandbuch einwandirei Proben Flusspfad blockiert Nadel entfernen und beschallen R cksp lung ausf hren Falls sich das Problem nicht beseitigen l sst bei Immucor Transplant Diagnostics Inc anrufen 32 3 385 47 91 CON Grenzwertfehler Probe wurde nicht oder DNA Konzentration und Reinheit berpr fen nur unzureichend amplifiziert Mastermix 5 Minuten bei 37 C halten vorsichtig vortexen ausreichend gel st und kurz drehen Validierte Taq verwenden Sie LIFECODES Taq Polymerase Katalog Nr 628075 verwenden Amplifizierungsbedingungen nicht innerhalb der spezifischen Thermalprofil auf Thermalcycler laufen lassen um zu Parameter berpr fen ob die Parameter sich innerhalb der spezifischen Werte befinden Niedriger Wert f r die mittlere Fluoreszenzintensit t MFI Verd nnungsl sung vor Gebrauch 5 Minuten bei 45 C warm halten und vortexen Bei Zimmertemperatur aufbewahren Streptavidin PE ersetzen Mehrfaches SSO Allel spezifische Amplifizierungsbedingungen Thermalprofil auf Thermalcycler laufen lassen um zu Versagen Amplifikation befinden si
13. ch nicht innerhalb der berpr fen ob die Parameter sich innerhalb der oder Probe bringt spezifischen Parameter spezifischen Werte befinden Typisierungs DNA wieder von der Blutprobe isolieren ergebnis DNA teilweise zerfallen Evaporation w hrend des Hybridisierungsschrittes Falls Sie nicht die vollst ndige Platte nutzen lassen Sie auf jeder Seite der auszuwertenden Proben eine Reihe frei damit die Platte fest versiegelt werden kann PCR Amplifikation kann mittels Gel Elektrophorese verifiziert werden siehe Anhang A ERWARTETE WERTE Jeder Locus hat eine CON Sonde und zwei SSO Sonden Falls eine Probe einen der zu testenden Loci enth lt sollte die konsensuelle Sonde und mindestens eine der SSO Sonden f r diesen Lokus positiv sein Sondenwerte k nnen in der Regel in positive und negative Werte aufgeteilt werden In einigen wenigen F llen kann ein Wert zwischen die positiven und negativen Cutoff Werte fallen und gilt dann als nicht determiniert Falls eine Probe nicht determinierte Werte f r eine bestimmte SSO Sonde enth lt sollte die Probe zun chst mit der negativ bewerteten Sonde und anschlie end mit der positiv bewerteten Sonde typisiert werden Falls zwei SSO Proben f r einen Locus nicht determiniert sind kann die Probe nicht typisiert werden und sollte erneut getestet werden e Wie im Abschnitt Grenzen des Verfahrens beschrieben ist es entscheidend dass das Protokoll genau eingehalten wird Jede Abweichung kann V
14. cler 96 Kavit tenplatte Costar Nr 6509 kombinieren Beim Aliquotieren der Sondenmischung in mehr als 10 Kavit ten die Sondenmischung nach jedem Satz von 10 vorsichtig vortexen Die Platte mit Polyethylenband versiegeln Costar No 6524 Die Silikon Kompressionsmatte vor der Hybridisierung auf die Platte geben Proben unter folgenden Inkubationsbedingungen hybridisieren Tabelle 4 2 Minuten lang bei 97 C Thermalcyclerbedingungen 10 Minuten lang bei 47 C f r die Hybridisierung 8 Minuten lang bei 56 C 56 C HALTEN Stellen Sie sicher dass der Detektionslaser am Luminex Instrument mindestens 30 Minuten vor Ende der Hybridisierung eingestellt wird W hrend die Proben hybridisieren bereiten Sie eine 1 200 PE Streptavidinmischung Verd nnungsl sung auf Kombinieren Sie 170 ul Verd nnungsl sung DS und 0 85 ul 1 mg ml PE Streptavidin SA PE pro Probe Es ist empfehlenswert ausreichend Verd nnungsl sungs mischung f r n 1 Proben herzustellen um Pipettierverluste auszugleichen Siehe Tabelle 5 Verd nnungsl sung PE Streptavidinmischung im Dunkeln bei Zimmertemperatur aufbewahren PE Streptavidin ist lichtempfindlich Die Verd nnungsl sung kann 5 Minuten bei 45 C gew rmt werden und beim Eintreffen gevortext werden um sicherzustellen dass s mtliche Komponenten gel st sind Die Verd nnungsl sung muss Zimmertemperatur 18 30 C haben bevor die Mischung hergestellt wird Vor Gebrauch aufbereiten und bersch s
15. er oder negativer Reaktivit t mit der amplifizierten DNA Probe zuzuordnen siehe Kapitel Ergebnisse Dies liefert wiederum die f r die Bestimmung des HLA Ph notyps der Probe erforderlichen Informationen Aufl sung des LIFECODES HLA A HLA B HLA C Tests verwendet und beseitigt die Allelenambiguit t zwischen A 24 02 24 09N B 51 01 51 11N und C 04 01 04 09N Null 2 wird als ein komplement rer Test zur Erh hung der Aufl sung des LIFECODES HLA DRB3 4 5 Tests verwendet und beseitigt die Allelenambiguit t zwischen DRB4 01 03 DRB4 01 03 01 02N und DRB5 01 02 DRB5 01 08N Die Vereinigung der Informationen aus dem Null 1 oder Null 2 Test mit den Ergebnissen des entsprechenden locusspezifischen LIFECODES SSO Typisierungsset Tests zur Erstellung eines Typisierungsvorschlags f r eine Probe kann mittels manueller Analyse oder Softwareanalyse erfolgen F r die manuelle Analyse wird durch das Ergebnis der Null 1 oder Null 2 Tests das Vorhandensein oder Fehlen spezifischer Nullallelen identifiziert Das Ergebnis des entsprechenden locusspezifischen LIFECODES SSO Typisierungssets kann Ambiguit ten bez glich dieser Nullallelen enthalten z B A 24 02 24 09N B 51 01 51 11N C 04 01 04 09N DRB4 01 03 DRB4 01 03 01 02N oder DRB5 01 02 DRB5 01 08N Wenn das Nullallel mit dem Null Produkt identifiziert wird k nnen alle Allelkombinationen die das Nullallel nicht enthalten aus den mit dem entsprechenden locusspezifischen LIFECODES SSO Typisie
16. ersagen bei der Probentypisierung zur Folge haben BESONDERE LEISTUNGSMERKMALE Bei Verwendung der LIFECODES HLA SSO Nullallel Typisierungssets in bereinstimmung mit dem in der Produktbeilage beschriebenen Verfahren kann der HLA Typ Klasse I und Klasse II der DNA Proben bestimmt werden Der HLA Nullallel Klasse I Null1 Test zeigt eine bereinstimmung von 100 97 4 der unteren Grenze des 95 igen Konfidenzintervalls f r Locus A eine bereinstimmung von 100 97 4 der unteren Grenze des 95 igen Konfidenzintervalls f r Locus B und eine bereinstimmung von 100 97 4 der unteren Grenze des 95 igen Konfidenzintervalls f r Locus C f r 139 untersuchte Proben bei einem Vergleich mit den mit bidirektionaler Sequenzierung erhaltenen Ergebnissen Der HLA Nullallel Klasse Il Null2 Test zeigt eine bereinstimmung von 97 1 92 7 der unteren Grenze des 95 jigen Konfidenzintervalls f r Locus DRB 4 und eine bereinstimmung von 98 5 94 8 der unteren Grenze des 95 igen Konfidenzintervalls f r Locus DRB5 B f r 137 untersuchte Proben bei einem Vergleich mit den mit bidirektionaler Sequenzierung erhaltenen Ergebnissen LITERATUR 1 Olerup O et al 1992 Tissue Antigens 39 225 3 Maeda M et al 1989 Tissue Antigens 34 290 2 Saiki RK et al 1986 Nature 324 163 4 Bugawan TL et al 1990 Immunogenetics 32 231 EINGESCHR NKTE LIZENZEN Taqg Polymerase wird f r Immucor Transplant Diagnostics von Promega Corp her
17. eugen Wenn die Menge des einen Primer im Vergleich zum anderen gr er ist erzeugt die Reaktion zus tzlich zu dem doppelstr ngigen Produkt ein einstr ngiges DNA Produkt W hrend der ersten Zyklen der LIFECODES Amplifikationsstufe wird doppelstr ngige DNA erzeugt Sobald der begrenzende Primer ersch pft ist verwendet der verbleibende Primer das doppelstr ngige Produkt als Matrize f r die Generierung von einstr ngiger DNA Diese Methode erzeugt sowohl doppelstr ngige als auch einstr ngige Produkte die nach ihrer Denaturierung beide an der Hybridisierungsreaktion beteiligt sind Jede der verschiedenen Sonden kann einer Sequenz innerhalb der amplifizierten DNA homolog sein die nur mit einem bestimmten Allel bzw einer bestimmten Allelgruppe vorkommt Diese Sonden sind also so gestaltet dass jede Sonde vorzugsweise mit einer komplement ren Region hybridisiert die in der amplifizierten DNA vorliegen kann oder auch nicht Zus tzlich wird die amplifizierte DNA auch mit einer oder mehreren konsens uellen Sonden hybridisiert die zu in allen Allelen eines Locus vorliegenden Sequenzen homolog sind SSO Typisierung kann durch die Art des biologischen Materials die Reinigungsmethode sowie durch die Menge und Integrit t der genomischen DNA beeinflusst werden Daher kann das f r die konsensuelle n Sonde n erhaltene Signal als Indikator f r den Erfolg der Amplifikations und Hybridisierungsverfahren dienen Das bei der konsensuellen Sonde erhaltene Sign
18. gener Wahl die finale Konzentration sollte bei 10 200 ng ul liegen Falls erforderlich mit nucleasefreiem Wasser anpassen S mtliche Proben in hnlichen Konzentrationen halten B DNA Amplifizierung PCR 4 2 3 Den Mastermix bis auf Zimmertemperatur anw rmen 18 bis 30 C Die Reagenzien etwa 10 Sekunden vorsichtig vortexen Dadurch wird sichergestellt dass die Salze gel st sind Kurzzeitig 5 10 Sekunden in Mikrozentrifuge drehen um die Inhaltsstoffe bis auf den Boden des Gef es zu verteilen Gem Tabelle 1 unten unter Verwendung der angegebenen Menge jeder einzelnen Komponente pro Reaktion au er f r DNA die Komponenten zur Verst rkung f r n 1 Reaktionen aufbereiten Zu einem finalen Volumen von 20 ul pro Reaktion mit nucleasefreiem Wasser bringen Vorsichtig vortexen Die geeignete Menge genomischer DNA 40 bis 120 ng in die PCR Gef e pipettieren Den Verst rkungsmix in die PCR Gef e mit der genomischen DNA aliquotieren Das Gesamtvolumen von Mastermix und genomischer DNA sollte f r jede Probenreaktion 20 ul sein Gef e fest mit Kappen verschlie en um Evaporation w hrend der PCR zu verhindern Die Proben in den Thermalcycler geben und das Programm ablaufen lassen siehe Tabelle 2 und Tabelle 3 Tabelle 1 Reaktionskomponenten f r die Amplifikation Komponente Menge pro PCR Probenreaktion LIFECODES Mastermix Genomische DNA 10 200 ng yl Gesamtmenge von 80 ng Taq Polymerase 0
19. gestellt Es ist unter den U S Patentnummern 5 338 671 und 5 587 287 und den entsprechenden ausl ndischen Patenten an Promega lizenziert Der Erwerb dieses Produkts schlie t eine eingeschr nkte nicht bertragbare Lizenz unter dem U S Patent 5 981 180 bzw dessen ausl ndischen im Eigentum der Luminex Corporation befindlichen Entsprechungen zur Durchf hrung von Mehrfachanalysen klinischen Probenmaterials f r die HLA Typisierung ein Hersteller Immucor Transplant Diagnostics Inc 550 West Avenue Stamford Connecticut 06902 USA Tel 1 203 328 9500 oder 888 329 0255 geb hrenfrei in den USA und Kanada Fax 1 203 328 9599 Technischer Dienst innerhalb Europas Tel 32 3 385 4791 Bevollm chtigter Vertreter Dieses Dokument wurde zuletzt ge ndert und ausgegeben am Rev 3 2015 05 15 Seite 7 von 8 LC1437CEDE 3 05 15 VERWENDETE WARENZEICHEN AB Gene AB Gene House Luminex Luminex Corporation Costar Corning Incorporated Gene Amp Roche Molecular System Microseal Bio Rad Laboratories Inc Veriti Applied Biosystem IDNA Agarose Lonza Group Ltd LIFECODES Immucor Inc GelStar Lonza Group Ltd ANHANG A Gel Elektrophorese Die mit den LIFECODES HLA SSO Typisierungssets durchgef hrten PCR Reaktionen sind so beschaffen dass sie sowohl doppel als auch einstr ngige Produkte erzeugen die die vorherrschenden Produkte darstellen die zu SSOs hybridisieren Zur Qualit tssicherung bzw zur Fehlerbeseiti
20. gung bei einem Experiment kann es unter Umst nden erforderlich sein Gel Elektrophorese durchzuf hren um die PCR Reaktion nach dem Vorliegen von amplifizierter DNA zu berpr fen Ben tigtes Material nach Liste bzw entsprechend Elektrophorese Agarose Lonza Group Ltd IDNA Agarose Nr GelStar Nukleins ure Gelfarbstoff Lonza Group Ltd Nr 50535 50170 UV Transilluminator ChromatoVUE UVP Inc Modell TM36 Elektrophorese Ger t Stromversorgung e Fotografisches Abbildungssystem 1X Gelpuffer 40xTAE Promega Nr V4281 Die relative Migration des einstr ngigen Produkts h ngt von der Gel Konzentration sowie dem eingesetzten Puffersystem ab Ungef hre Migrationswerte f r jede Amplifikation sind weiter unten f r Proben aufgef hrt die in 2 igem Agarose Gel in 1X TAE Puffer getestet wurden Elektrophoresebedingungen 1 GelStar Nukleins ure Farbmarker Lonza Group Ltd Nr 50535 zum Auftauen aus dem Gefrierfach nehmen Im Dunkeln aufbewahren 2 Das f r diesen Vorgang verwendete Gel muss bei 2 liegen d h f r ein 200 ml Gelbett sind 4 Gramm Agarose zu 200 ml 1X TAE zu verwenden Verd nnen aus 40X TAE 10 ul GelStar Nukleins ure Farbmarker der geschmolzenen Agarose beif gen Beim Ausgie en des Gels darauf achten dass reichlich Platz bleibt damit der DNA eine ausreichende Distanz 2 5 bis 5 cm zur Verf gung steht VORSICHT BEI DER VERWENDUNG GelStar ist potentiell karzinogen ANMERKUNG Es ist m
21. niert angesehen werden Die Probe sollte zun chst in der Annahme eines negativen Werts und anschlie end in der Annahme eines positiven Werts typisiert werden e Siehe weitere Informationen zu Grenzwerten im Abschnitt ERWARTETE WERTE QUALIT TSKONTROLLE Es wird empfohlen bei jedem Test gleichzeitig eine negative und eine positive Kontrolle durchzuf hren zum Beispiel jeweils eine Leerwertkontrolle mit Wasser oder eine vorher bereits typisierte Probe In der Schwellenwerttabelle enthaltene Konsens SSO Proben hybridisieren zu ihren jeweiligen lokusspezifischen Allelen Aus positiven Kontrollen mit den Konsens SSOs erhaltene Werte sollten ber dem im Arbeitsblatt f r die Schwellenwerttabelle festgelegten Schwellenwert f r SSO liegen Die LIFECODES Sondenmischung en enth lt enthalten eine oder mehrere der in den Arbeitsbl ttern f r das Typisierungsset identifizierten Konsens SSO Proben Diese Konsens Proben hybridisieren zu Allelen und dienen als interne Kontrollen zur Verifizierung der Amplifikation und zur Best tigung dass Hybridisierungen stattgefunden haben Wird der Minimalwert f r diese SSOs nicht erreicht erfolgt m glicherweise keine korrekte Typisierung so dass der Test wiederholt werden sollte Die Assays m ssen entsprechend den Empfehlungen in der Packungsbeilage und unter Einhaltung aller vorgeschriebenen Qualit tskontrollverfahren entsprechend den Vorschriften der jeweiligen Zulassungsbeh rden durchgef hrt werden GRENZEN
22. rbringt nachweislich die in diesem Test erwartete Leistung B DNA aus mit Heparin konserviertem Blut kann in diesem Test nicht verwendet werden Andere Konservierungsmittel wurden nicht getestet C Die isolierte DNA sollte sich in 10 mM TRIS pH 8 0 9 0 bzw in nucleasefreiem Wasser befinden Bei Vorliegen eines Chelatbildners wie etwa EDTA sollte die finale Konzentration des Chelatbildners nicht ber 0 5 mM liegen D Der Kontakt mit Alkohol Detergenzien bzw Salzen kann die DNA Amplifizierung nachteilig beeinflussen E Die finale DNA Konzentration sollte bei 10 200 ng ul liegen F Absorbanzmessungen der DNA Probe bei 260 und 280 nm sollten ein Verh ltnis von 1 65 bis 2 0 ergeben G Die DNA kann nach der Isolation unverz glich verwendet bzw bei 20 C bis zu 1 Jahr lang gelagert werden Wiederholtes Einfrieren Auftauen sollte vermieden werden da dies zu DNA Abbau f hren kann VERFAHREN Vorsicht Abweichungen vom empfohlenen Protokoll und Material wurden nicht validiert A B Bei Mitgelieferte Materialien Siehe Tabellen im Abschnitt Sets Reagenzien nach Katalognummer mit entsprechenden Informationen e Geeignete Mastermix MX e Schwellenwerttabelle Sondentrefferdiagramm e e Geeignete Sondenmischung mischungen BM e LIFECODES Taq Polymerase LIFECODES Kat Nr e Verd nnungsl sung DS 628075 x 2 Ben tigte aber nicht mitgelieferte Materialien der Validierung des Sets wurden die nachstehend
23. rten subtrahiert wodurch sich der f r den Hintergrund korrigierte Datensatz ergibt Die Hintergrundkontrollwerte sind in der Grenzwerttabelle aufgef hrt und sind chargenspezifisch Hintergrundwerte sind durchschnittliche MFI Werte f r jedes Bead zur Kompensation von durch Beadvariation erzeugte Hintergrundger usche 4 F r jede Probe werden die Hintergrund korrigierten Daten f r jede Sonde durch den Hintergrund korrigierten Wert f r die entsprechende konsensuelle Sonde dividiert Sie ergeben so den normalisierten Datensatz MFI Sonde MFI Kontrollleerstelle f r Sonde MFI Konsensus MFI Kontrollleerstelle f r Konsensus 5 F r jede Sonde wird der normalisierte Wert in die Grenzwerttabelle eingetragen 6 Sobald s mtliche Werte zugeordnet worden sind kann das Sondentreffer Muster d h die Kombination s mtlicher positiven und negativen Zuordnungen f r eine bestimmte Probe mit der beigef gten Sondentreffer Tabelle LC1024 auf der Website verglichen werden Vorsicht e F r jeden Locus existiert eine eigene Grenzwerttabelle e Diese Grenzwerttabellen sind chargenspezifisch Uberpr fen Sie ob die Chargennummer auf den Grenzwerttabellen mit der Chargennummer des Typisierungssets bereinstimmt e Falls ein normalisierter Wert f r eine bestimmte Sonde ber dem maximalen Grenzwert f r eine negative Zuordnung und unter dem Mindestwert f r eine positive Zuordnung liegt sollte die Probe als f r diese Sonde nicht determi
24. rungsset erhaltenen Ergebnissen eliminiert werden Wenn das Nullallel basierend auf dem Null Produktergebnis fehlt k nnen alle Allelkombinationen die das Nullallel enthalten aus den mit dem entsprechenden locusspezifischen LIFECODES SSO Typisierungsset erhaltenen Ergebnissen eliminiert werden In der Produktbeilage und Software wird dieses Verfahren zur Kombination der Ergebnisse der zwei Produkte als Zusammenschluss der Ergebnisse bezeichnet Seite 2 von 8 LC1437CEDE 3 05 15 REAGENZIEN A Identifizierung Siehe Tabellen im Abschnitt Sets Reagenzien nach Katalognummer mit der vollst ndigen Auflistung der Katalognummern B Sicherheits und Warnhinweise 1 F r in vitro Diagnose 2 Besondere Pipetten sollten f r die Pr PCR Verfahren sowie f r die Post PCR Verfahren vorgesehen werden 3 Biogefahr S mtliche Proben biologischen Materials sowie Blutproben sollten als potentiell infekti s behandelt werden Wenden Sie allgemeine Vorsichtsma nahmen bei der Handhabung an 4 Verd nnungsl sung Sondenmischungen TAQ Polymerase und R Phycoerythrin konjugiertes Streptavidin enthalten gef hrliche Verbindungen Vermeiden Sie Kontakt mit Haut und Augen und S mtliche Materialien nach Gebrauch gem den lokal geltenden Vorschriften entsorgen Siehe zus tzliche Informationen im Sicherheitsdatenblatt C Anweisungen f r die Aufbewahrung 1 Die jeweils geeignete Lagertemperatur ist auf dem Packungsetikett der Setkomponente verzeichnet 2 _
25. sige Anteile beseitigen Verd nnungsl sung DS PE Streptavidin SA PE o 12T 7 7 O Tabelle 5 Aufbereitungsvolumen O 170 ul Verd nnungsl sung BEE 7 7 717 DE BE 7 77 77 25 i O 1700 ul oo 3400W O 8500 ul Anmerkung HYBRIDISIERUNGSPROGRAMM NICHT ABBRECHEN BEVOR DAS TABLETT VOM THERMALCYCLER ENTFERNT WURDE 8 9 Bei 56 C halten w hrend sich das Tablett auf dem Thermalcycler befindet Jede Probe mit 170 ul der aufbereiteten Verd nnungsl sung PE Streptavidinmischung verd nnen Alle Proben m ssen innerhalb von 5 Minuten verd nnt werden im Anschluss an den 8 Minuten dauernden Pausenschritt bei 56 C Das Probentablett vom Thermalcycler entfernen und in das Luminex Instrumentarium stellen D Analyse der Probe mit Luminex Instrumentarium Zur Erzielung der besten Ergebnisse sollten die Proben sofort mit Hilfe des Luminex Instrumentariums ausgewertet werden Proben k nnen bis zu 30 Minuten nach erfolgter Verd nnung abgelesen werden Falls nicht sofort abgelesen wird Proben vor Licht sch tzen 1 2 3 Das Luminex Instrumentarium zwischen 30 Minuten und 4 Stunden vor Auswertung der Proben einschalten Vor der Analyse der Proben auf dem Luminex Instrumentarium einen Chargendurchgang durchf hren bei dem die Proben analysiert werden a Fme neue Charge erzeugen aus dem Men Datei ausw hlen Beispiel Wenn Sie f r Null Klasse analysieren f gen Sie eine Charge f r Null Klasse hinzu
26. ur obergrenze Ausreichend f r N Ans tze h Chargen ILOT Bestell REF bezeichnung nummer REF Vor Licht i V Verwendbar bis Z ehtiizen NN Achtung Gebrauchs Fe an beachten beachten Seite 1 von 8 bereich Nicht einfrieren Hersteller LC1437CEDE 3 05 15 REAGENZIEN NACH KATALOGNUMMER LCT N LIFECODES SSO HLA Nullallel Typisierungsset Produkt Nr 628939 LIFECODES a zur ne mit Luminex Nr 629100 50 MX N1 Var NDNAIEN NASSE 629001 870 uL 2 bis 8 C Ausreichend f r 50 Proben MX N2 var Bra le NASSE 2 629002 870 uL 2t08 Tr Ehen LIFECODES Nullallel 2 bis 8 C Sondenmischung en nu Vor Licht sch tzen 0088 Ds Verd nnungsl sung 628515 19 7 mL 18 bis 30 C TAQ LIFECODES Tag Polymerase 628075 25 uL x 2 10 C bis 30 C tSondenmischungen sind lichtempfindlich Lichteinwirkung auf ein Minimum beschr nken VORSICHT Komponenten nach Ablauf des Verbrauchsdatums nicht mehr verwenden VORSICHT Abweichungen vom empfohlenen Protokoll und Material einschlie lich LIFECODES Tag Polymerase wurden nicht validiert ZWECKBESTIMMUNG DNA Typisierung von Klasse I und Klasse Il Allelen mit den LIFECODES HLA SSO Typisierungssets ZUSAMMENFASSUNG UND ERL UTERUNG DNA basierte HLA Typisierung unter Verwendung von PCR amplifizierter DNA ist ein verbreitetes Laborverfahren PCR Amplifikation von DNA wird als Mittel zur Anreicherung einer ausgew hlten DNA Region eingesetzt F r
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