Elucigene® CF-EU2v1 Gebrauchsanweisung
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1. Heterozygote 1507del Probe CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 18 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Eine 1507del F508del Probe ergibt einen verschobenen gr nen F508del WT Peak bei ca 164 bp 3 bp weniger als normal einen blauen F508del M Peak bei 166 bp und einen blauen 1507del M Peak bei ca 159 bp Eine 1507del Il507del Probe ergibt einen blauen Peak bei ca 159 bp und einen einzelnen gr nen Peak bei ca 164 bp 3 bp kleiner als der normale F508 Peak der beim Fehlen von 1507del dargestellt wird F508del Bei Vorliegen einer F508del Mutation funktioniert der 1507del WT Primer nicht Daher hat eine Person die f r F508del homozygot ist keinen 1507del WT Peak im WT Gemisch siehe unten LIL Ill 4 j Mh I nn nn TE nn nn nn nen nn m Pi BERN A VORN 3 WB BE A RR RR A BEA A A Uem w sag w SITE aa a a a a p aan TE Ein 1507del WT Peak mit geringerer H he und 2 Peaks im Abstand von 3 bp auf den Positionen 10 und 12 im WT Gemisch siehe unten werden bei einer Person die heterozygot f r F508del ist in den Ergebnissen f r das B Gemisch dargestellt Insertionen und Deletionen Aufgrund der Funktionsweise des CF EU2v1 Kits f hrt das Vorhandensein von Insertionen bzw Deletionen zwischen zwei entgegengesetzten Primern zu einer Gr en nderung aller zwischen diesen beiden Primern erzeugten Amplikons Daher k nnen zus tzlich zu den 50 Mutationen die das CF EU2v1 Kit nachweist eventuell vorhandene Inserti2. 1507del 1717 1G gt A R553X 1811 1 6kbA gt G 1898 1G gt A 2184delA W846X 3272 26A gt G Y1092X 3659delC 3849 10kbC gt T S1251N und N1303K Sechsundvierzig DNA Proben unter denen alle 50 Mutationen vertreten waren die das CF EU2v1 Kit nachweist wurden zu f nf verschiedenen Zeitpunkten amplifiziert Alle Proben erzielten die erwarteten Ergebnisse ohne falsch negative oder falsch positive Ergebnisse was eine klinische Spezifit t und Sensitivit t von 100 bedeutet Fehlersuche Diese Gebrauchsanweisung wird bereitgestellt um die optimale Leistungsf higkeit des Assays zu gew hrleisten Anwender m ssen sich an die beschriebenen Vorgehensweisen halten Jegliche Abweichung davon kann zu einer suboptimalen Leistung und zu Daten von schlechter Qualit t f hren Auf Anfrage ist ein Leitfaden zur Fehlersuche von Elucigene Diagnostics erh ltlich Darin finden sich Beispiele und L sungen f r einige der h ufigsten Beobachtungen beim Elucigene CF EU2v1 Kit u a Keine diagnostischen oder STR Peaks Schwache diagnostische oder STR Peaks Zu starke Durchbruch Hintergrundpeaks Nicht markierte Peaks Schwache FAM Peaks Mutationspeaks Unausgewogenes Profil des A Gemisches Unausgewogenes Profil des B Gemisches Unterteilte Peaks im Profil des B Gemisches Exemplare des Elucigene CF EU2v1 Leitfadens zur Fehlersuche k nnen von unserem Technischen Kundendienst bezogen werden T 44 0 161 669 8122 F 44 0 161 669 8129 E enquirie
3. St rungen werden autosomal rezessiv vererbt Bei Geschwistern einer Person mit zystischer Fibrose liegt die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung bei 25 die Wahrscheinlichkeit asymptomatischer Tr ger zu sein bei 50 und die Wahrscheinlichkeit nicht zu erkranken und kein Tr ger zu sein bei 25 Molekulargenetische Tests auf eine oder mehrere krankheitsverursachende Mutationen im CFTR Gen werden zur Detektion von Tr gern im Rahmen von Screening Programmen in der Bev lkerung verwendet Pr natale Tests sind f r Schwangerschaften mit erh htem Risiko von CFTR bedingten St rungen verf gbar wenn die krankheitsverursachenden Mutationen bereits in der Familie vorgekommen sind Seit der Entdeckung des CFTR Gens 1989 5 wurden ber 1700 Mutationen und Varianten im Gen beschrieben 6 Viele dieser Mutationen sind privat d h sie wurden bisher nur bei einem Patienten und oder einer Familie beschrieben Routinetests auf alle m glichen Mutationen sind weder machbar noch rentabel und so beschr nken sich die Tests auf die h ufigsten Mutationen CF EU2v1 ist ein Testkit f r zystische Fibrose das speziell auf die h ufigsten Mutationen in Populationen europ ischen Ursprungs ausgerichtet ist Der Assay erkennt insgesamt 50 Mutationen und analysiert au erdem den Poly T Trakt des Intron 9 mit einer exakten Messung der benachbarten TG Wiederholung Der polymorphe Thymidintrakt beim bergang von Intron 9 auf Exon 10 beeinflusst die Transkript
4. Umgebung oder aus anderen Proben die die Zielsequenz enthalten Kontamination durch Endprodukte Kontamination der Probe mit Amplikons aus fr heren PCRs mit dem Ergebnis dass sowohl die Zielsequenz als auch die kontaminierenden Amplikons verst rkt werden Labors an denen PCR durchgef hrt wird sollten sich dieser Kontaminationsquellen bewusst sein und entsprechende Vorgehensweisen beachten die das Kontaminationsrisiko signifikant senken Methoden zur Eind mmung von Kontaminationen sind eingehend beschrieben worden 10 und umfassen die physische Anordnung des Labors den Arbeitsfluss die Vorgehensweisen beim Umgang mit Proben sowie chemische und enzymbasierte Ans tze Eine genau definierte gute Laborpraxis ist entscheidend f r die End mmung von PCR Kontaminationen und ist vor dem Testen von klinischen Proben umzusetzen Amplifikationsverfahren Hinweis Um die Gefahr einer Kontamination so gering wie m glich zu halten m ssen die Schritte 3 5 in einem PCR Produkt freien Bereich vorzugsweise einer Sicherheitswerkbank durchgef hrt werden 1 Den Thermocycler auf eine 20 min tigen aus einem Schritt bei 94 C bestehenden Zyklus zur Aktivierung von HotStart Taq in Verbindung mit einem Amplifikationszyklus Programm 30 Zyklen von 1 Minute bei 94 Denaturierung 2 Minute bei 58 C Annealing und 1 Minute bei 72 C Extension programmieren Zus tzlich muss eine 20 min tige Verl ngerung der Extension bei 72 C im letzt
5. bei Extraktion aus Trockenblut siehe Abschnitt Kapillarelektrophorese e Trockenblutprobe erneut extrahieren und in weniger Wasser 50 ul eluieren e Die Anzahl der Trockenblutproben f r die Extraktion auf 4x 3 mm Scheiben steigern Wichtige Gesichtspunkte DNA Qualit t CF EU2v1 ist ein hoch multiplexer Assay und setzt f r die optimale Funktion eine effiziente PCR Amplifikation voraus Die DNA Qualit t kann entscheidend f r die Effizienz des PCR Vorgangs sein Zusammen mit der DNA Probe extrahierte Hemmsubstanzen k nnen zu einer suboptimalen Amplifikation und dadurch zu schwachen und schlecht ausgewogenen Peaks f hren Elucigene Diagnostics hat die Verwendung des QlAamp 96 DNA Blood Kit und des QlAamp DNA Mini Kit QIAGEN GmbH zusammen mit dem CF EU2v1 Kit validiert Andere Kits bzw Methoden zur DNA Extraktion sollten zur Verwendung mit dem CF EU2v1 validiert und optimiert werden Hinweis Weitere Informationen gehen aus dem Elucigene CF EU2v1 Leitfaden zur Fehlersuche hervor CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 9 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Testdurchf hrung Eind mmung der PCR Kontamination Der PCR Vorgang erzeugt eine gro e Anzahl amplifizierter Produkte Amplikons und ist mit einem hohen Kontaminationsrisiko verbunden was zu falschen Ergebnissen f hren kann Kontaminationen k nnen aus zwei Quellen stammen Kreuzkontamination Kontamination der Probe mit nicht amplifiziertem Material aus der
6. im A Gemisch kreuzreagiert mit mutierter R347H DNA Sequenz und f hrt zu einem Mutationspeak auf der R347P Position mit geringerer H he im Vergleich zum echten R347P Peak 5 Das Vorhandensein des F508C Polymorphismus 1655T gt G f hrt zu einer Verringerung der H he des 1507 del Peaks im CF EU2v1 B Gemisch 6 Das Vorhandensein von R117H f hrt zu einer Verringerung der H he des R117C Peaks im CF EU2v1 B Gemisch In einer f r R117H homozygoten Probe fehlt der R117C Peak 7 Das Vorhandensein von G85E f hrt zu einer Verringerung der H he des 394delTT Peaks im CF EU2v1 B Gemisch In einer f r G85E homozygoten Probe fehlt der 394delTT Peak 8 Bei einer f r F508del heterozygoten Probe und insbesondere bei einer f r F508del homozygoten Probe kann in den Ergebnissen bisweilen ein sehr kleiner Artefaktpeak auf der 1507del Position beobachtet werden 9 Die folgenden Mutationen wurden aufgrund mangelnder Verf gbarkeit entsprechender Proben nicht auf eine m gliche Kreuzreaktivit t getestet und k nnen Interferenzen der Testfunktion verursachen R117P R117L 1717 2A gt G 621 2T gt C 621 2T gt G R553G R553Q R347L I506T 1506S 1506V und die seltene Kombination aus 1507del mit dem Polymorphismus 1651A G Leistungsmerkmale Einhundertzehn DNA Proben aus fl ssigem Vollblut EDTA wurden mit Elucigene CF EU2v1 blind getestet F nf Proben schlugen nach der PCR aufgrund einer zu geringen DNA Konzentration unter 1 5 ng ul fehl
7. ml Fl schchen mit einer Temperaturgenauigkeit von mindestens 1 C im Bereich von 33 C bis 100 C und einer statischen Gleichf rmigkeit der Temperatur von 1 C CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 7 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Hinweis Der Thermocycler muss regelm ig gem den Anweisungen des jeweiligen Herstellers gewartet und kalibriert werden um die genaue Einhaltung des PCR Zyklus und optimale Leistungsf higkeit zu gew hrleisten Der Elucigene CF EU2v1 Assay wurde auf Thermocyclern des Modells 9700 von Applied Biosystems entwickelt Andere Modelle bzw Ger te anderer Hersteller m ssen umfassend auf optimale Leistungsf higkeit getestet und evaluiert werden bevor Ergebnisse mit dem CF EU2v1 gemeldet werden Kapillarelektrophorese ABl 3130 3500 Gen Analysator mit GeneMapper Fragmentanalyse Software 36 cm oder 50 cm ABI3500 Kapillararray optische Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen Abdeckungen f r 96 Vertiefungen Cassetten f r 96 Vertiefungen Hinweis Die f r die Kapillarelektrophorese verwendeten Ger te m ssen regelm ig gem den Anweisungen des jeweiligen Herstellers gewartet und kalibriert werden um die optimale Leistungsf higkeit zu gew hrleisten Entnahme und Lagerung der Proben Vollblut EDTA konserviert und Trockenblutproben wurden evaluiert und sind mit diesem Test kompatibel Wie gelegentlich beobachtet k nnen sich Probenentnahmehilfen nachteilig auf die Unvers
8. sind f r die GeneMapper und GeneMarker Software auf der Elucigene Diagnostics Webseite erh ltlich www elucigene com products Die Ergebnisse des A Gemisches Mutationsgemisches bestimmen ob eine Person Tr ger einer Mutation ist was durch einen blauen Peak angezeigt wird Das Mutationsgemisch enth lt auch Primer f r das normale F508 Allel daher kann mit diesem Gemisch bestimmt werden ob eine Person normal f r F508 nur gr ner Peak homozygot f r die Mutation F508del nur blauer Peak oder heterozygot f r F508del blauer und gr ner Peak ist Wird eine andere Mutation beobachtet k nnen die Ergebnisse des B Gemischs Wildtyp Gemisch analysiert werden um den homozygoten oder heterozygoten Status zu bestimmen Das Vorhandensein eines gr nen Peaks f r das spezielle Allel im Wildtyp Gemisch bedeutet dass die Person heterozygot ist und das Fehlen des gr nen Peaks zeigt an dass die Person f r die spezielle Mutation homozygot ist Hypervariable STR Marker rot sind in beiden Gemischen enthalten So k nnen die mit dem Mutationsgemisch amplifizierte Probe und die mit dem Wildtyp Gemisch amplifizierte Probe verglichen werden um die Gefahr einer Probenverwechslung zu reduzieren ein unterschiedliches STR Profil in beiden Gemischen bedeutet eine Probenverwechslung Das Fehlen dieser STR Marker bedeutet eine fehlgeschlagene Probe Das Vorhandensein der STR Marker bei sehr niedrigen RFU bedeutet dass es sich um eine schwache Pr
9. 2 Bei einer Person die heterozygot f r den Polymorphismus rs4148721 Deletion von AT in Intron 22 ist werden zwei Peaks im Abstand von 2 bp auf den Positionen 45 3659delC WT 49 R1162X WT und 50 R1158X WT in den Ergebnissen f r das B Gemisch dargestellt Bei einer Person die homozygot f r den Polymorphismus rs4148721 ist werden Peak 45 49 und 50 auf der erwarteten H he aber mit verschobener und um 2 bp kleinerer Gr e als erwartet in den Ergebnissen dargestellt CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 22 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Weitere Beobachtungen V520F Polymorphismus 1584G gt A in Exon 12 Der 1584G gt A Polymorphismus ist als St rfaktor f r die Amplifikation der V520F Sequenz Mutation und Wildtyp identifiziert worden Bei einer Person die heterozygot f r den 1584G gt A Polymorphismus ist werden reduzierte Peakh hen bei Position 12 V520F in den Ergebnissen f r das B Gemisch dargestellt Bei einer Person die homozygot f r den 1584G gt A Polymorphismus ist f llt Peak 12 aus den Ergebnissen f r das B Gemisch heraus Bei einer Person die sowohl heterozygot f r die F508del Mutation als auch heterozygot f r die 1584G gt A Mutation ist erscheint nur ein einzelner Peak 12 im B Gemisch anstelle der zu erwartenden zwei Peaks bei Position 12 die normalerweise bei f r F508del heterozygoten Personen auftreten Siehe nachstehendes Beispiel Bei einer Person die heterozygot f r die V520F Mutation und d
10. 5 ul des Gemisches in die 96 Vertiefungen der optischen Mikrotiterplatte geben 2 Je 3 ul amplifiziertes PCR Produkt von Gemisch A und B in separate Vertiefungen geben in denen sich bereits das Gr enstandard Formamid Gemisch aus Schritt 1 befindet 3 Das in die PCR Platte gef llte PCR Produkt auf einem Thermocycler mit folgenden Parametern denaturieren 3 Minuten bei 94 C in Verbindung mit 30 Sekunden bei 4 4 Die Mikrotiterplatte kurz zentrifugieren damit sich der Inhalt am Boden der R hrchen sammelt und Bl schen aus den Vertiefungen entfernt werden Dann die Mikrotiterplatte in den Gen Analysator laden Hinweis Die Einstellungen f r die Probeninjektion k nnen dabei je nach der in der PCR erzeugten Amplikonmenge die von der eingesetzten Genom DNA abh ngt ge ndert werden Durch Reduktion der Injektionszeit bzw spannung kann der S ule weniger Amplikon zur Analyse zugef hrt werden Umgekehrt bedeutet eine l ngere Injektionszeit bzw spannung eine gr ere der S ule zugef hrte Amplikonmenge Zuvor amplifizierte Proben k nnen zur erneuten Analyse mehrfach erneut injiziert werden Weitere Informationen gehen aus dem Elucigene CF EU2v1 Leitfaden zur Fehlersuche hervor CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 12 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung ABI 3130 Ger te Es muss ein CF EU2 Durchlaufmodul mit Protokoll erstellt werden das dann f r jeden CF EU2 Durchlauf verwendet werden kann Das CF EU2 Durchl
11. 9C gt T p Ara117Cvs R117H c 350G gt A p Ara117His Y122X c 3661 gt A p Tvr122X 621 1G gt T c 489 1G gt T 711 1G gt T c 579 1G gt T L206W c 617T gt G p Leu206Tro 1078delT c 948del c 948delT p Phe316LeufsX12 R334W c 1000C gt T p Ara334Tro R347P c 1040G gt C p Ara347Pro R347H c 1040G gt A p Ara347His A455E c 13640 gt A p Ala455Gilu 1507del c 1519 1521del c 1519 1521delATC p lle507del F508del c 1521 1523del c 1521 1523delCTT p Phe508del 1677delTA c 1545 1546del c 1545 1546delTA p Tvr515X V520F c 1558G gt T p Val 520Phe 1717 1G gt A c 1585 1G gt A G542X c 1624G gt T D GIv542X S549R T gt G c 1647T gt G p Ser549Ara S549N c 1646G gt A p Ser549Asn G551D c 1652G gt A p Glv551Asp R553X c 1657C gt T p Ara553X R560T c 1679G gt C p Ara560Thr 1811 1 6kbA gt G c 1680 886A gt G 1898 1G gt A c 1766 1G gt A 2143delT c 2012del c 2012delT p Leu671X 2184delA c 2052del c 2052delA D Lvs684AsnfsX38 2347delG c 2215del c 2215delG p Val739TvrfsX16 W846X c 2538G gt A p Tro846X 2789 5G gt A c 2657 5G gt A Q890X c 26680 gt T 0 GIn890X 3120 1G gt A c 2988 1G gt A CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 2 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Herk mmlich Nach den HGVS Richtlinien cDNA name Protein name 3272 26A gt G c 3140 26A gt G R1066C c 3196C gt T p Ara1066Cvs Y1092X C gt A c 3276C0 gt A D Tvr1092X M1101K c 3302T gt A p Met1101Lvs D1152H c 3454G gt C 0 Asp1152His
12. Amplikons nach ihrer Gr e und Einf rbung Elucigene CF EU2v1 ist ein hoch multiplexer Assay der aus zwei PCR Reaktionen A und B besteht F nfzig Mutationssequenzen innerhalb des CFTR Gens werden im A Gemisch nachgewiesen und als blaue Amplikon Peaks dargestellt Die entsprechenden nicht mutierten Normalsequenzen Wildtyp Sequenzen werden im B Gemisch nachgewiesen und als gr ne Amplikon Peaks dargestellt Das A Gemisch weist au erdem die Normalsequenz der am h ufigsten beobachteten Mutation nach die bei Wei en zystische Fibrose ausl st der sogenannten F508del Mutation Diese wird als gr ner Amplikon Peak dargestellt Dar ber hinaus werden Poly T Wiederholungssequenzen im A Gemisch nachgewiesen und als schwarze Amplikon Peaks dargestellt Sowohl A als auch B Gemisch enthalten nicht f r zystische Fibrose spezifische interne Amplifikationskontrollmarker um die wirksame Probenamplifikation zu berwachen Diese werden als rote Amplikon Peaks dargestellt CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 4 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Warnhinweise und Vorsichtsma nahmen 1 Die in diesem Kit enthaltene DNA Kontrolle ist menschlicher Herkunft und hat sich in unabh ngigen Tests auf PCR Basis als negativ auf Hepatitis B Virus HBV Hepatitis C Virus HCV und das Humane Immundefizienzvirus 1 HIV1 erwiesen Bei der Arbeit mit Humanmaterial vorsichtig vorgehen Alle Proben sind als potenziell infekti s zu betrachten Keine
13. Das CF EU2 Protokoll in der Protocol Manager Protokollverwaltung erstellen Darauf achten dass Folgendes ausgew hlt wird e Type Regular Typ Normal e Run Module Durchlaufmodul CF EU2 siehe Durchlaufmodul oben e Dye Set Farbstoffset G5 F r einen Durchlauf mit den Proben mit der Plate Manager Plattenverwaltung ein Probenblatt erstellen und darauf achten dass im Instrumentenprotokoll das richtige Protokoll f r CF EU2v1 ausgew hlt wird siehe oben Hinweis Weitere Informationen zu Einrichtung Betrieb und Fehlersuche f r das Instrument gehen aus dem Benutzerhandbuch f r den Gen Analysator 3130 von Applied Biosystems hervor CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 13 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung ABI 3500 Ger te Es muss ein CF EU2 Instrument Protocol Instrumentenprotokoll erstellt werden das dann f r jeden CF EU2v1 Durchlauf verwendet werden kann Das CF EU2 Instrument Protocol Instrumentenprotokoll ber die Instrumenten protokoll Bibliothek des 3500 erstellen Darauf achten dass Folgendes ausgew hlt wird e Run Module Durchlaufmodul FragmentAnalysis50_POP7 e Die in der nachstehenden Abbildung beschriebenen Einstellungen Ed butiument Protocat CEU em Setup on instrument Protocol 7 Application Tepe Fragment spdarn Length 5 cm Payme POP jys Set G5 Instrument Protocol Propertie m Module Fragment nahsu e POP p IN CFEL npt Tom s F tag it A tag It 5 bys i
14. Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Elucigene Diagnostics Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Best Nr CF2EUB2 50 Tests CF2EUBX 10 Tests F r die In vitro Diagnostik ln von Elucigene Diagnostics Elucigene Diagnostics Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ Vertrieb Kundendienst und Technischer Kundendienst T 44 0 161 669 8122 F 44 0 161 669 8129 E enquiries elucigene com E techsupport elucigene com Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics UK Limited a company registered in England and Wales registration number 8696299 CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 1 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Elucigene CF EU2v1 Verwendungszweck F r den gleichzeitigen qualitativen in vitro Nachweis der folgenden CGFTR Genmutationen Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator im Menschen in DNA die aus Vollblut EDTA konserviert und Trockenblutproben extrahiert wurde Herk mmlich Nach den HGVS Richtlinien cDNA name Protein name CFTRdele2 3 c 54 5940_273 1025del c 54 5940_273 10250del21080 E60X c 178G gt T D Glu60X P67L c 200C gt T p Pro67Leu G85E c 254G gt A p Gly85Glu 394delTT c 262 263del 0 262 263delTT p Leu8 llefsX22 444delA c 313del c 313delA p lle105Serfsx2 R117C c 34
15. G Mutation ist werden zwei Peaks im Abstand von 1 bp auf den Positionen 39 2184delA WT und 43 2143delT WT in den Ergebnissen f r das B Gemisch dargestellt Bei einer Person die homozygot f r die 2347delG Mutation ist f llt Peak 16 aus den Ergebnissen heraus und die Peaks 39 und 43 werden auf der erwarteten H he aber mit verschobener und um 1 bp kleinerer Gr e als erwartet in den Ergebnissen dargestellt ZU TG wr i Ill u DE UBER E 5i 20 u 2 BuzE HB EX BE a u R CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 21 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung 3905insT Bei einer Person die heterozygot f r die 3905insT Mutation ist werden zwei Peaks im Abstand von 1 bp auf der Position 26 S1251N WT in den Ergebnissen f r das B Gemisch dargestellt Bei einer Person die homozygot f r die 3905insT Mutation ist f llt Peak 24 aus den Ergebnissen heraus und Peak 26 wird auf der erwarteten H he aber mit verschobener und um 1 bp gr erer Gr e als erwartet in den Ergebnissen dargestellt ont WT peab xij simii idl Il w TERJA Bun EMANS NEI E BE SANA KFEHER U H BEN R1158X Bei einer Person die heterozygot f r die R1158X Mutation ist werden reduzierte Peakh hen bei Position 49 R1162X WT in den Ergebnissen f r das B Gemisch dargestellt Bei einer Person die homozygot f r die R1158X Mutation ist f llt Peak 49 aus den Ergebnissen heraus Polymorphismus rs4148721 delAT in Intron 2
16. R Mutationen 2 genetischen Modifikatorren 3 und Umweltfaktoren 4 Die Bandbreite erstreckt sich vom Tod in fr her Kindheit infolge einer progressiven obstruktiven Lungenerkrankung mit Bronchiektasie ber Bauchspeicheldr seninsuffizienz mit allm hlich fortschreitender obstruktiver Lungenerkrankung w hrend der Adoleszenz und einer erh hten Frequenz von Krankenhausaufenthalten aufgrund der Lungenerkrankung im fr hen Erwachsenenalter bis zu rezidivierender Sinusitis und Bronchitis oder Unfruchtbarkeit beim Mann im jungen Erwachsenenalter Am h ufigsten wird die Diagnose einer zystischen Fibrose bei Personen mit einem oder mehreren charakteristischen ph notypischen Merkmalen einer CF plus dem Nachweis einer Anomalie in der CFTR Funktion auf Grundlage einer der folgenden Ursachen gestellt Vorliegen zweier krankheitsverursachender Mutationen im CFTR Gen oder zweier anomaler quantitativer Schwei chloridwerte bei der Pilocarpin Iontophorese gt 60 mEg l oder transepitheliale Messungen der nasalen Potenzialdifferenz NPD mit f r CF charakteristischem Ergebnis Die Nachweisquote f r CFTR Mutationen variiert nach Testmethode und ethnischem Hintergrund Bei einigen symptomatischen Personen ist nur eine oder keine einzige krankheitsverursachende Mutation nachweisbar bei manchen Tr gern ist die krankheitsverursachende Mutation nicht nachweisbar CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 3 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung CFTR bezogene
17. R1158X c 3472C gt T p Ara1158X R1162X c 3484C0 gt T p Ara1162X 3659delC c 3528del c 3528delC p Lvs1177SerfsX15 3849 10kbCO gt T c 3718 24770 gt T S1251N c 3752G gt A o Ser1251Asn 3905insT c 3773dup c 3773dupT p Leu1258PhefsX7 W1282xX c 3846G gt A D Tro1282X N1303K c 39090 gt G p Asn1303Lvs with reference to Mutation Nomenclature in Practice Findings and Recommendations from the Cystic Fibrosis External Quality Assessment Scheme Berwouts S Morris M Girodon G Schwarz M Stuhrmann M and Dequeker E Human Mutation Vol 00 No 0 1 7 2011 CF EU2v1 kann zwischen Personen unterscheiden die f r alle oben aufgef hrten Mutationen und Varianten mit Ausnahme von S549R T gt G heterozygot bzw homozygot sind Siehe Abschnitt Kreuzreaktivit t in diesem Dokument Zusammenfassung und Erl uterung Zystische Fibrose CF Mukoviszidose ist die h ufigste lebensbegrenzende autosomal rezessive St rung in der wei en Bev lkerung Die Inzidenz dieser Krankheit liegt unter Wei en bei 1 3200 Lebendgeburten 1 In der wei en Bev lkerung betr gt die heterozygote H ufigkeit ca 1 25 Zystische Fibrose bef llt das Epithelgewebe in mehreren Organen und f hrt zu einer komplexen Multisystemerkrankung die die exokrine Bauchspeicheldr se den Darm die Atemwege den m nnlichen Genitaltrakt das Leber Gallen System und die exokrinen Schwei dr sen in Mitleidenschaft zieht Der Ausdruck der Krankheit variiert nach Schwere der CFT
18. Sample Name E well Position E lt none gt Suffix File Extension None gt Run Folder Name Format Example PADiagnostics DevelopmentiDiag Dev 3100 ProjectstCF HNCF UK3130 runsteinstr Prefix Name Delimiter _ E Format none Auf dem 3500 sollte die Dateinamenkonvention so eingestellt sein dass die Probenbezeichnung im fsa Dateinamen enthalten ist zZ B CFEU2 TTMMJJJJ_1234 5_A_AO1 Eara Creme Mom bibe hiwi Caeira Satup a Flo Namo Comention Tann n a nenpanmd Beki Provode a iwwapar vabas lt Interpretation der Ergebnisse Bei der Datenerfassung werden die Peaks der PCR Fragmente auf dem Rohdaten Elektropherogramm in den Farben blau Mutant oder gr n Wildtyp dargestellt Ein Mensch besitzt zwei Kopien des CFTR Gens Besitzen diese Kopien an einer bestimmten Stelle die gleiche Sequenz ist die Person an dieser Stelle homozygot Unterscheiden sich die Sequenzen der Kopien an einer bestimmten Stelle ist die Person an dieser Stelle heterozygot Nach Abschluss der Datenerfassung sollte die Gr e der CF EU2v1 PCR Fragmente mithilfe der Fragmentanalysesoftware an den GS600v2 LIZ Gr enstandard angepasst werden CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 15 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Das Dokument Elucigene CF EU2v1 Leitfaden zur Analysesoftware enth lt eine ausf hrliche Anleitung zu Softwareeinstellungen Analyse und Interpretation Leitf den zur Analysesoftware
19. Testmethode kann das Vorhandensein von HBV HCV HIV 1 oder anderen infekti sen Erregern mit absoluter Sicherheit ausschlie en Die Handhabung der Proben und Testkomponenten sowie deren Gebrauch Lagerung und Entsorgung muss gem der durch nationale Richtlinien und Verordnungen definierten Verfahren f r infekti ses Material erfolgen Im Einklang mit der aktuellen guten Laborpraxis sollten Labore eigene interne Qualit tskontrollproben bekannten Genotyps in jedem Assay mitf hren damit die Validit t des Verfahrens beurteilt werden kann Bei Sch den an der Kitverpackung kann auch der Inhalt besch digt sein Das Kit nicht verwenden und den Kundendienst verst ndigen CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 5 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Bei der Beschriftung verwendete Symbole Die verwendeten Symbole auf allen Etiketten und Verpackungen entsprechen dem harmonisierten Standard ISO15223 Hersteller Anzahl der Tests DEKE d Gebrauchsanweisung beachten i Unterhalb der angegebenen Temperatur lagern z Nicht mehr nach dem angegebenen Datum verwenden REF Bestellnummer LOT Los oder Chargennummer In vitro Diagnostikum CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 6 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Im Lieferumfang enthaltene Materialien Die Reagenzien sollten in einer Umgebung die frei von kontaminierenden DNA und PCR Produkten ist aufbewahrt werden Alle Reagenzien werden in gebrauchsfertigem Zustand gel
20. Von den Proben mit interpretierbaren Ergebnissen waren 96 normal 5 heterozygot f r F508del 1 heterozygot f r 1717 1G gt A 1 heterozygot f r G551D 1 heterozygot f r 621 1G gt T 1 heterozygot f r G542X und 1 compound heterozygot f r G542X F508del Einundneunzig DNA Proben aus Trockenblut wurden mit Elucigene CF EU2v1 blind getestet Bei f nf Proben schlug die Amplifikation fehl Von den Proben bei denen die Amplifikation erfolgreich war erf llten 20 Proben nach einer 12 sek ndigen Injektion in einen Gen Analysator Modell 3500 die Analysekriterien f r die Interpretation nicht alle fehlgeschlagenen Proben korrelierten mit DNA niedriger Konzentration weniger als 1 5 ng ul Die 20 fehlgeschlagenen Proben wurden 36 Sekunden lang erneut in einen Gen Analysator Modell 3500 injiziert und analysiert Von diesen Proben erf llten 7 die Analysekriterien f r die Interpretation nicht Von den 79 Proben mit auswertbaren Ergebnissen waren 38 normal 5 heterozygot f r F508del 3 heterozygot f r G551D 3 heterozygot f r W1282X 2 heterozygot f r D1152H und 2 heterozygot f r G542X CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 24 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Au erdem wurden vier compound heterozygote Ergebnisse 3120 1G gt A F508del R117H F508del R1162X F508del und R553 X F508del ermittelt Dar ber hinaus traten die folgenden heterozygoten Proben jeweils einmal auf E60X G85E 394delTT Y122X 621 1G gt T 1078delT R334W R347P A4A55E
21. aufmodul in der Module Manager Modulverwaltung der 3130 Datenerfassungssoftware erstellen Darauf achten dass Folgendes ausgew hlt wird e Type Regular Typ Normal e Template Vorlage FragmentAnalysis36_POP7 e Die in der nachstehenden Tabelle beschriebenen Einstellungen eingeben 36 cm Kapillarmodul Bezeichnung des Parameters Wert Bereich 1 Oven Temperature Ofentemperatur 60 18 65 C ganzzahlig 2 Poly_Fill_Vol Polymer F llvolumen 6500 6500 38000 Schritte 3 Current Stability Stromstabilit t 50 0 2000 uA ganzzahlig 4 PreRun_Voltage Vorlaufspannung 15 0 0 15 kV 5 Pre_Run_Time Vorlaufzeit 180 1 1000 s 6 Injection _Voltage Injektionsspannung 3 0 0 15 kV 7 Injection_Time Injektionszeit 12 0 1 600 s 8 Voltage_Number_Of_Steps 20 1 100 nk Spannung Anzahl der Schritte 9 Voltage_Step_Interval Spannungsschrittintervall 15 1 60 s 10 Data_Delay_Time Datenverz gerungszeit 60 1 3600 s 11 Run_Voltage Durchlaufspannung 15 0 0 15 kV 12 Run_Time Durchlaufzeit 1200 300 14000 s F r die Analyse von aus Trockenblut extrahierter DNA die Injektionszeit auf 36 Sekunden erh hen Hinweis Der erforderliche Wert f r Run Time Durchlaufzeit kann je nach der Umgebungstemperatur am Aufstellort des Gen Analysators verschieden sein Weitere Informationen zur Erstellung von Durchlaufmodulen gehen aus dem Benutzerhandbuch f r den Gen Analysator 3130 von Applied Biosystems hervor
22. chen mit je 400ul 75ul PCR Mastermix mit HotStart Taq DNA Polymerase und Desoxynukleotidtriphosphaten in Puffer 404480 450045 1 Fl schchen 50 ul Kontroll DNA mit einer Konzentration von 6 ng ul normal f r die von Elucigene CF EU2v1 nachgewiesenen Mutationen 404489 Erforderliche Materialien nicht im Kit enthalten Labor Verbrauchsmaterial Handschuhe Mikrozentrifugenr hrchen mit Schraub verschluss PCR Gef e von 0 2 mi bzw vom Hersteller des Thermocyclers empfohlene Mikrotiterplatten Pipettenspitzen DNA Isolierung QlAamp DNA Mini Kit Qiagen GmbH Best Nr 51304 51306 oder gleichwertig Kapillarelektrophorese GeneScan 600 LIZ Gr enstandard ABl Best Nr 4366589 GeneScan 600v2 LIZ Gr enstandard ABl Best Nr 4408399 Multikapillar Matrixstandard DS 33 Farbstoffset G5 ABl Best Nr 4345833 POP 7 Polymer ABI Best Nr 4352759 10x Puffer f r Gen Analysator ABl Best Nr 402824 und Hi Di Formamid ABI Best Nr 4311320 Hinweis Sicherstellen dass alle verwendeten Materialien das vom jeweiligen Hersteller angegebene Stabilit tsdatum noch nicht berschritten haben Erforderliche Ausr stung Laborausstattung Pr zisionspipetten 2 S tze je 1 f r Pr und Postamplifikations bereich Schutzkleidung Vortex Mischer Mikrozentrifuge Zentrifuge f r Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen PCR Amplifikation Thermocycler f r Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen oder 0 2
23. d 44 E60X WT in den Ergebnissen f r das B Gemisch dargestellt Bei einer Person die homozygot f r die 394delTT Mutation ist f llt Peak 34 aus den Ergebnissen heraus und die Peaks 35 42 und 44 werden auf der erwarteten H he aber mit verschobener und um 2 bp kleinerer Gr e als erwartet in den Ergebnissen dargestellt a4 11T WT pomt mir L CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 20 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung F508del CFTRdele2 3 Bei einer Person die heterozygot f r die CFTRdele2 3 Mutation ist werden geringere Peakh hen auf den Positionen 34 394delTT 35 G85E WT 41 CFTRdele2 3 WT 42 P67L WT und 44 E60X WT in den Ergebnissen f r das B Gemisch dargestellt Bei einer Person die homozygot f r die CFTRdele2 3 Mutation ist fallen die Peaks 34 35 41 42 und 44 aus den Ergebnissen heraus a4 WT pe l Emi IM lt il 444delA Bei einer Person die heterozygot f r die 444delA Mutation ist werden zwei Peaks im Abstand von 1 bp auf den Positionen 30 R117H WT 31 R117C WT 33 Y122X WT und 47 621 1 WT in den Ergebnissen f r das B Gemisch dargestellt Bei einer Person die homozygot f r die 444delA Mutation ist f llt Peak 27 aus den Ergebnissen heraus und die Peaks 30 31 33 und 47 werden auf der erwarteten H he aber mit verschobener und um 1 bp kleinerer Gr e als erwartet in den Ergebnissen dargestellt 2347delG Bei einer Person die heterozygot f r die 2347del
24. delT 446 450 5 44 E60X 453 5 460 5 45 3659delC 461 465 5 46 3272 26A gt G 470 476 47 621 1G gt T 485 5 491 5 CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 17 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Marker Nr Marker bp Gr enbereich des Produkts 3130 POP7 Daten 48 A455E 496 503 49 R1162X 506 512 50 R1158X 516 5 524 5 5T IVS8 5T 110 130 7T IVS8 7T 140 160 9T IVS8 9T 175 195 S549R T gt G Peak 20 ist nur im A Gemisch vorhanden ST Allel Gr enbereich bp Gr enbereich des Marker Produkts 3130 POP7 Daten 5T 9 117 25 118 75 5T 10 119 25 120 75 5T 11 121 25 122 75 5T 12 123 25 124 75 5T 13 125 25 126 75 HINWEIS Die Markergr en k nnen abh ngig vom verwendeten Ger t und Polymer schwanken Interpretationsbeispiele I507del Aufgrund der Lage der I507del Deletion im GFTR Gen ist es m glich das Vorhandensein dieses Markers ber eine 3 bp Verschiebung in der Gr e des F508del Peaks sowie ber einen speziellen 1507del Mutationspeak nachzuweisen Wenn ein einzelnes mutiertes I507del Allel vorhanden ist wird der I507del Mutationspeak als blauer Peak bei ca 159 bp dargestellt Ein Wildtyp Peak f r F508 ist zwar zu sehen ist aber nur etwa halb so hoch wie ein normaler homozygoter Wildtyp Genotyp er erscheint als gr ner Peak bei ca 167 bp Au erdem ist ein weiterer gr ner Peak bei ca 164 bp dargestellt
25. ehrtheit bestimmter Analyte auswirken und einige Verfahrenstechnologien beeintr chtigen 9 Es wird daher jedem Anwender empfohlen sicherzustellen dass das gew hlte Instrument gem den Anweisungen des Herstellers verwendet wird und dass Probenentnahmehilfen mit diesem Test kompatibel sind Blutproben sollten vor der DNA Pr paration bei 20 C gelagert werden Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden DNA Isolierung aus Vollblutproben EDTA Einheitliche Ergebnisse werden erzielt wenn die DNA mithilfe des QlAamp 96 DNA Blood Kit oder des QlAamp DNA Mini Kit mit Proteinase K nach dem im QlAamp Handbuch beschriebenen Protokoll extrahiert wird Dabei wird mit 200 pl fl ssigem Vollblut begonnen und in 200 ul molekularbiologisch reinstem Wasser eluiert DNA Isolierung aus Trockenblutproben Einheitliche Ergebnisse werden erzielt wenn die DNA mithilfe des QlAamp DNA Mini Kit nach dem im QlAamp Handbuch beschriebenen Protokoll extrahiert wird Hier wird allerdings mit 2 x 3 mm gro en Pl ttchen aus Trockenblut beginnen und in 100 l molekularbiologisch reinstem Wasser eluiert Es wird empfohlen alternative DNA Extraktionsverfahren und Probentypen auf die Verwendung mit dem Elucigene CF EU2v1 Test gr ndlich zu pr fen bevor die Ergebnisse f r diagnostische Zwecke genutzt werden Wichtige Gesichtspunkte DNA Einsatz Unter optimalen PCR Bedingungen und unter Verwendung der empfohlenen Einstellungen f r die Probeninjektion s
26. elta Diagnostics UK Ltd CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 28 von 28
27. en 1584G gt A Polymorphismus auf dem gleichen Allel ist f llt Peak 12 aus den Ergebnissen f r das A Gemisch heraus Dieses Ergebnis wurde bisher nicht beobachtet und stellt wahrscheinlich eine seltene Kombination dar CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 23 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Kreuzreaktivit t W hrend der Testentwicklung wurden alle Anstrengungen unternommen Interferenzen der Testfunktion durch andere im CFTR Gen vorkommende berichtete Polymorphismen und Mutationen zu vermeiden Die seltene Mutation R1283M wurde auf Kreuzreaktivit t untersucht und wurde nicht vom Elucigene CF EU2vi1 Kit nachgewiesen Au erdem wurden die folgenden Polymorphismen vom Test nicht nachgewiesen 1655T G F508C 1651A G Die Beurteilung bekannter Mutationen und Polymorphismen im CFTR Gen hat folgende Effekte auf Ergebnisse mit dem Elucigene CF EU2v1 Kit herausgestellt 1 Der Primer f r die G551D Mutation im A Gemisch weist auch die S549RT gt G Mutation nach Die Analysesoftware kennzeichnet diese als Peak 20 Einen zugeh rigen Wildtyp Peak gibt es im B Gemisch nicht 2 Der Primer f r die 2184delA Mutation im A Gemisch kreuzreagiert mit mutierter 2183AA gt G DNA Sequenz und f hrt zu einem Mutationspeak auf der 2184delA Position 3 Der Primer f r die 1078delT Mutation im A Gemisch kreuzreagiert mit mutierter F316L DNA Sequenz und f hrt zu einem Mutationspeak auf der 1078delT Position 4 Der Primer f r die R347P Mutation
28. en Zyklus eingegeben werden Bei jedem PCR Durchlauf muss eine negative Kontrolle mitlaufen 3 Die Primergemische und den PCR Mastermix auftauen und kurz zentrifugieren damit sich der Inhalt am Boden der Fl schchen sammelt Vorsichtig im Vortex Mischer durchmischen und die Fl schchen erneut kurz zentrifugieren Eine f r die Anzahl der zu testenden Proben und Kontrollen ausreichend Menge Reaktionsgemisch zubereiten Tabelle 1 Hinweis Der PCR Mastermix ist viskos Es ist darauf zu achten dass das korrekte Volumen eingesetzt wird Es wird empfohlen den PCR Mastermix zu den zuvor dispensierten Primergemischen zu geben um sicherzustellen dass die Fl ssigkeit restlos aus der Pipette in das Primergemisch abgegeben wird Hinweis Gemische oder Komponenten aus verschiedenen Chargen des CF EU2v1 Kits d rfen nicht zusammen verwendet werden CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 10 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Enzymaktivier Zyklen Abschlie ende ung Extension x 20 Min 1 Min amp a 58 C a Gr Umgebungs 2 Min temperatur 4 30 Zyklen gt Tabelle 1 Rezeptur Reaktionsgemisch Anzahl der zu testenden Proben 1 10 25 50 Primergemisch pl 4 5 45 112 5 225 PCR Mastermix ul 7 5 75 187 5 375 Insgesamt ul 12 120 300 600 4 Jeweils 10 ul Reaktionsgemisch in den Boden des entsprechend beschrifteten 0 2 ml PCR R hrchens bzw de
29. iefert Verschlossene und ge ffnete Reagenzien bei 20 C lagern Ge ffnete Reagenzien k nnen bis zu 3 Monate aufbewahrt werden Das mitgelieferte Material reicht f r 50 10 Tests aus 2 Fl schchen mit je 120ul 50ul CF EU2v1 Primergemisch A mit Primern zur Amplifikation der folgenden mutierten Allele R347H R347P 2789 5G gt A 3120 1G gt A 711 1G gt T R334W 1507del F508del 3849 10kbC gt T 1677delTA 1078delT V520F L206W W1282X R560T 2347delG Q890X R553X G551D S549N M1101K G542X 3905insT Y1092X C gt A S1251N 444delA 1811 1 6kbA gt G 1717 1G gt A R117H R117C N1303K Y122X 394delTT G85E R1066C 1898 1G gt A W846X 2184delA D1152H CFTRdele2 3 P67L 2143delT E60X 3659delC 3272 26A gt G 621 1G gt T A455E R1162X und R1158X Dieses Gemisch enth lt au erdem Wildtyp Primer f r den Nachweis des normalen F508del Allels Primer f r den Nachweis der Polythymidinvarianten IVS8 5T IVS8 7T und IVS8 9T und Primer f r die Identifikation zweier hypervariabler Short Tandem Repeat STR Marker 404473 450043 2 Fl schchen mit je 120ul 50ul CF EU2v1 Primergemisch B mit Wildtyp Primern zur Amplifikation der normalen Allele der vom Primergemisch A amplifizierten Mutationen mit Ausnahme von F508del dem normalen Allel das von im Primergemisch A enthaltenen Primern amplifiziert wird Dieses Gemisch enth lt au erdem Primer zur Identifikation zweier hypervariabler STR Marker 404474 450044 2 Fl sch
30. iehe Hinweis im Abschnitt Kapillarelektrophorese in den Kapillars ulen Durchlaufmodulen sind routinem ig akzeptable Ergebnisse mit DNA erzielt worden die mithilfe der oben genannten Verfahren bei Konzentrationen zwischen 1 5 ng ul und 25 ng ul extrahiert wurde Die Quantifizierung der DNA ist sehr wichtig Daher sollte die Konzentration aller zu testenden DNA Proben gemessen werden um optimale Ergebnisse zu gew hrleisten Akzeptable Methoden sind z B PicoGreen Fluoreszenz oder UV Absorbanz Wegen der Unterschiede zwischen den Methoden zur DNA Quantifizierung sollte der Anwender folgende Hinweise beachten CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 8 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Bei einem sehr hohen DNA Einsatz ist die Wahrscheinlichkeit h her dass die Analysesoftware Hintergrund Peaks markiert Die folgenden Ma nahmen k nnen ergriffen werden um diese Wahrscheinlichkeit zu senken e DNA Probe verd nnen und erneut amplifizieren e Injektionszeit senken siehe Abschnitt Kapillarelektrophorese e Einen h heren Peak Amplituden Schwellenwert w hlen siehe Elucigene CF EU2v1 Leitfaden zur Analysesoftware Bei einem niedrigen DNA Einsatz ist die Wahrscheinlichkeit h her dass die diagnostischen Peaks schwach sind und nicht von der Analysesoftware markiert werden Die folgenden Ma nahmen k nnen ergriffen werden um ein st rkeres Signal zu erhalten e Injektionszeit auf 36 Sekunden erh hen dringend empfohlen
31. ion Die Anzahl der Thymidinreste 5T 7T oder 9T hat Einfluss auf die Effizienz beim Splicen von Exon 10 bei einem 5T Allel fehlt ein Teil der Exon 10 Transkripte was zu einem funktionslosen Protein und variablen CF Symptomen f hrt Berichten zufolge kann die Anzahl an TG Wiederholungen 5 am Polythymidintrakt auch das Splicen von Exon 10 beeinflussen 7 Bei Vorhandensein auf demselben Allel wie die 5T Variante fehlt bei einem gr eren Teil der CFTR Transkripte das Exon 10 je l nger die Anzahl der TG Wiederholungen ist Die Anzahl der TG Wiederholungen kann mithilfe von CF EU2v1 durch eine Gr enbestimmung der 5T Amplikonpeaks bestimmt werden Testprinzipien Die Methode des Elucigene CF EU2vi Kit basiert auf der fluoreszierenden allelenspezifischen Amplifikationstechnologie ARMS Amplification Refractory Mutation System mit der Punktmutationen Insertionen oder Deletionen in der DNA nachgewiesen werden k nnen 8 Das Prinzip des ARMS beruht darauf dass Oligonukleotide mit einer 3 Fehlpaarung unter speziellen Bedingungen nicht als Primer f r die Polymerasekettenreaktion PCR funktionieren Die Auswahl entsprechender Oligonukleotide erm glicht die Amplifikation und den Nachweis von spezifischen mutierten oder normalen DNA Sequenzen Amplifizierte Sequenzen Amplikons werden mittels Kapillarelektrophorese auf einem Gen Analysator von Applied Biosystems separiert Die Analysesoftware erlaubt die Identifikation und Markierung der
32. obe handelt die mit Vorsicht analysiert werden sollte Hinweis Weitere Informationen gehen aus dem Leitfaden zur Fehlersuche hervor CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 16 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Nachgewiesene Marker In der nachstehenden Tabelle sind die vom CF EU2v1 Gemisch nachgewiesenen Marker zusammengefasst Die Marker sind nach dem Gr enbereich des dargestellten PCR Produkts aufgef hrt Nachgewiesene Marker Marker Marker bp Gr enbereich des Peak Nr Produkts 3130 POP7 Daten 01 R347H 110 5 116 5 02 R347P 117 123 03 2789 5G gt A 124 130 04 3120 1G gt A 132 5 138 5 05 711 1G gt T 141 5 147 5 06 R334W 147 5 154 07 1507del 156 162 5 08 F508del 163 169 09 3849 10KbC gt T 172 178 10 1677delTA 180 188 5 11 1078delT 193 199 12 V520F 206 211 5 13 L206W 215 220 14 W1282X 224 5 230 5 15 R560T 234 5 240 5 16 2347delG 242 246 17 Q890X 250 252 18 R553X 255 5 261 5 19 G551D 265 267 20 S549R T gt G 267 5 269 5 21 S549N 275 280 22 M1101K 282 288 23 G542X 289 295 5 24 3905insT 297 303 5 25 Y1092X C gt A 308 314 26 S1251N 315 321 27 444delA 323 326 28 1811 1 6kbA gt G 332 338 29 1717 1G gt A 341 5 347 5 30 R117H 349 355 31 R117C 357 360 32 N1303K 360 366 5 33 Y122X 367 373 34 394delTT 377 383 35 G85E 384 390 36 R1066C 391 397 37 1898 1G gt A 398 5 404 5 38 W846X 406 411 39 2184delA 413 418 40 D1152H 423 429 41 CFTRdel2 3 433 439 42 P67L 439 5 445 5 43 2143
33. onen bzw Deletionen innerhalb der amplifizierten Zielsequenzen durch eine nderung der erwarteten Amplikongr e im Wildtyp Gemisch B Gemisch nachgewiesen werden Ein separates Dokument mit diesen Insertionen und Deletionen in Tabellenform ist auf der Elucigene Diagnostics Webseite erh ltlich www elucigene com products Beispiele f r die durch das Kit nachgewiesenen Insertionen und Deletionen und ihre Auswirkungen auf das Profil des B Gemisches sind nachstehend abgebildet CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 19 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung F508del 1677delTA Bei einer Person die heterozygot f r die F508del 1677delTA Mutationen ist werden zwei Peaks im Abstand von 1 bp auf der Position 12 V520F WT in den Ergebnissen f r das B Gemisch dargestellt IGT deiTA WT pesk V520F Bei einer Person die heterozygot f r die V520F Mutation ist wird ein Wildtyp Peak mit geringerer H he auf Position 10 1677delTA WT in den Ergebnissen f r das B Gemisch dargestellt da dadurch der 1677delTA WT Primer nicht funktioniert Die Peaks 10 und 12 fallen bei einer Person die homozygot f r die V520F Mutation ist aus den Ergebnissen heraus ws2or wt peab fi UNI AMT Ei ERU EEEE EEEE Taa A T BA Hwa wana a a a MT EN a al a a a Ma AL MEN ME a Mm Aa Die 394delTT Bei einer Person die heterozygot f r die 394delTT Mutation ist werden zwei Peaks im Abstand von 2 bp auf den Positionen 35 G85E WT 42 P67L WT un
34. r Vertiefung pipettieren 5 Mit neuen Pipettenspitzen jeweils 2 5 ul der zu testenden DNA Probe in jedes R hrchen pipettieren und die R hrchen verschlie en Keine DNA Probe in das R hrchen f r die Negativkontrolle geben sondern stattdessen 2 5 ul steriles entionisiertes Wasser verwenden 6 Die PCR R hrchen kurz zentrifugieren damit sich der Inhalt am Boden der R hrchen sammelt 7 Die R hrchen fest in den Block des Thermocyclers einsetzen Den aus einem Schritt bei 94 C bestehenden Zyklus sowie das anschlie ende Amplifikationszyklus Programm starten 8 Nach Abschluss des Amplifikationszyklus Programms k nnen die Proben entweder bei Raumtemperatur ber Nacht oder bis zu 7 Tage lang bei 2 8 C gelagert werden bevor die Kapillarelektrophorese durchgef hrt wird Kapillarelektrophorese Jedem Anwender wird empfohlen die gew hlte Kapillarelektrophoreseausr stung entsprechend der Gebrauchsanweisung des jeweiligen Herstellers zu bedienen und sich davon zu berzeugen dass sie mit diesem Test kompatibel ist In diesem Zusammenhang sind insbesondere das Polymer und das Kapillararray wichtig Optimale CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 11 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Ergebnisse lassen sich mit den folgenden Bedingungen f r die Kapillarelektrophorese erziel 1 6 8 ul GS600v2 LIZ Gr enstandard und 250 ul Hi Di Formamid kombinieren und gr ndlich vermischen Gemisch ausreichend f r 16 Vertiefungen Je 1
35. s elucigene com E techsupport elucigene com CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 25 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Grenzen des Verfahrens 1 Die mit diesem Kit erzielten Ergebnisse sind ebenso wie die aller anderen diagnostischen Tests stets im Kontext des klinischen Allgemeinbildes zu verwenden und auszuwerten Elucigene Diagnostics bernimmt keine Verantwortung f r klinische Entscheidungen 2 Das Fehlen einer von diesem Kit erfassten Mutation schlie t andere Mutationen des CFTR Gens nicht aus Andere Mutationen die dieses Kit nicht nachweisen kann sind m glich 3 Mutationen treten je nach Population in unterschiedlicher H ufigkeit auf Daten ber die H ufigkeit des Auftretens von Mutationen in einer Population sind beim Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium erh ltlich 6 Der Anwender dieses Kits sollte bei der Meldung von Ergebnissen an den diagnostizierenden Arzt Genetiker ausdr cklich auf diese Punkte hinweise Haftungsausschluss Die Ergebnisse dieses Tests sowie anderer diagnostischer Assays sind zusammen mit anderen dem Arzt vorliegenden Labordaten und klinischen Befunden auszuwerten Diese Elucigene Reagenzien werden f r Testzwecke im Rahmen der In vitro Diagnostik geliefert Weitere Einzelheiten zur Dateninterpretation finden sich im Elucigene CF EU2v1 Leitfaden zur Analysesoftware wwwr elucigene com products CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 26 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsan
36. tay Ir xk Run T PreRun T Injection Time be Dat l Ady av ed Options F r die Analyse von aus Trockenblut extrahierter DNA die Injektionszeit auf 36 Sekunden erh hen F r einen Durchlauf mit den Proben durch Klicken auf Create Plate from Template Platte nach Vorlage erstellen unter Dashboard eine Probenplatte erstellen und darauf achten dass das richtige Instrumentenprotokoll f r CF EU2v1 ausgew hltwird siehe oben Einrichtung des Probenblattes f r GeneMarker Mit der GeneMarker Software ist ein direkter Vergleich zwischen den A und B Daten derselben Person m glich Daf r ist es wichtig dass die Bezeichnung der Rohdaten Ausgabedatei fsa Datei f r alle Proben und Gemische einheitlich ist Das Probenblatt sollte den eindeutigen Probennamen f r jede zu testende Probe mit dem Suffix _A bzw _B enthalten je nachdem welches Gemisch getestet wird Soll der fsa Name die Platten ID enthalten sollte immer dasselbe Format verwendet werden z B CFEU2 TTMMJJJ Auf dem 3130 sollten die Parameter f r Results Destination Ergebnisziel so eingestellt sein dass die Probenbezeichnung im fsa Dateinamen enthalten ist z B CFEU2 TTMMJJJJ_1234 5_A_AO1 CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 14 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung Sample File Name Format Example 123456789_Sample3_A12 lt ext gt Filename is greater than 13 characters Prefix l g Name Delimiter _ E Format Plate ID E
37. tory Mutation System ARMS Nucleic Acid Res 17 2503 2516 1989 9 Satsangi J et al Effect of heparin on polymerase chain reaction Lancet 343 1509 1510 1994 10 PCR Primer A Laboratory Manual 2 edition ColdSpring Harbour Laboratory Press Section 1 ELUCIGENE is a trademark of Delta Diagnostics UK Ltd ARMS ist eine Marke von AstraZeneca UK Ltd QIAAMP ist eine Marke der Qiagen GmbH PICOGREEN ist eine Marke von Molecular Probes Inc GENEMARKER ist eine Marke der SoftGenetics Corporation GENEMAPPER NED VIC PET POP 7 LIZ und HI DI sind Marken der Life Technologies Corporation HINWEIS F R DEN K UFER BEGRENZTE LIZENZ Mit den Farbstoffen VIC NED und PET markierte Polynukleotide und oder ihre Anwendung unterliegen eventuell einem oder mehreren Patenten im Besitz von Life Technologies Corp Im Kaufpreis f r dieses Produkt sind begrenzte nicht bertragbare Rechte aufgrund bestimmter Anspr che in bestimmten Patenten im Besitz von Life Technologies Corp enthalten die die Anwendung nur der betreffenden Produktmenge und ausschlie lich zum Zwecke des Target Nachweises in der Humanmedizin durch den CF2EUBYDE 002 Sep 2014 Seite 27 von 28 Elucigene CF EU2v1 Gebrauchsanweisung K ufer gestatten Dar ber hinaus werden keine weiteren Rechte gew hrt Weitere Informationen zum Erwerb von Lizenzen bez glich der oben erw hnten Farbstoffe erteilt der Director of Licensing outlicensing lifetech com Copyright 2014 D
38. weisung Literaturangaben 1 Rosenstein BJ Cutting GR The diagnosis of cystic fibrosis a consensus statement Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel J Pediatr 1998 132 589 95 2 De Braekeleer M Allard C Leblanc JP Simard F Aubin G Genotype phenotype correlation in cystic fibrosis patients compound heterozygous for the A455E mutation Hum Genet 1997 101 208 11 3 Drumm ML Konstan MW Schluchter MD Handler A Pace R Zou F Zariwala M Fargo D Xu A Dunn JM Darrah RJ Dorfman R Sandford AJ Corey M Zielenski J Durie P Goddard K Yankaskas JR Wright FA Knowles MR Genetic modifiers of lung disease in cystic fibrosis N Engl J Med 2005 353 1443 53 4 Goss CH Newsom SA Schildcrout JS Sheppard L Kaufman JD Effect of ambient air pollution on pulmonary exacerbations and lung function in cystic fibrosis Am J Respir Crit Care Med 2004 169 816 21 5 Kerem B Rommens JM Buchanan JA Markiewicz D Cox TK Chakravarti A Buchwald M and Tsui LC Identification of the Cystic Fibrosis Gene Genetic Analysis Science 1989 245 4922 1073 8 6 Cystic Fibrosis Mutation Database www genet sickkids on ca cftr app 7 Joshua D Groman et al Variation in a Repeat Sequence Determines Whether a Common Variant of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene Is Pathogenic or Benign Am J Hum Genet 2004 74 1 176 179 8 Newton CR et al Analysis of any point mutation in DNA The Amplification Refrac
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