Home

Der Einfluss von kalorischer Restriktion und Melatonin auf die

Contents

1. Gensymbol Accession Name Atp5b NM 016774 ATP synthase H transporting mitochondrial F1 Calml NM 009790 calmodulin 1 Calm1 mRNA Calm2 NM 007589 calmodulin 2 Calm2 mRNA Camk2d NM 023813 calcium calmodulin dependent protein kinase II delta Centl NM 009833 cyclin T1 Centl mRNA Cd38 NM 007646 CD38 antigen Cd38 mRNA Cst7 NM 009977 cystatin F leukocystatin Cst7 mRNA Ctsl NM 009984 cathepsin L Ctsl mRNA Eif4ebp2 NM_010124 eukaryotic translation initiation factor 4E binding fatty acid lig AK012088 fatty acid Coenzyme A ligase long chain 3 full insert G6pdx NM 008062 glucose 6 phosphate dehydrogenase X linked G6pdx Gfpt2 NM 013529 glutamine fructose 6 phosphate transaminase 2 Gfpt2 Gjal NM 010288 gap junction membrane channel protein alpha 1 Gjal Gja8 NM 008123 gap junction membrane channel protein alpha 8 Gja8 Gmeb1 NM_020273 glucocorticoid modulatory element binding protein 1 3 Ergebnisse 109 Grpr NM 008177 gastrin releasing peptide receptor Grpr mRNA Insr NM 010568 insulin receptor Insr mRNA LOC214897 NM 173185 casein kinase I gamma 1 LOC214897 mRNA Map2k4 NM 009157 mitogen activated protein kinase kinase 4 Map2k4 Mcsp NM_008574 mitochondrial capsule selenoprotein Mcsp mRNA Mrps18a NM_026768 mitochondrial ribosomal protein 18A Mrps 18a mRNA pmp
2. hipp cDNA 0 69 0 67 0 65 0 70 0 67 0 66 0 62 1 67 L31 Hsp70 4 0 73 0 90 0 86 135 1 22 0 67 1 02 1 10 1 16 Igf2bp3 1 01 0 94 0 63 0 97 1 20 0 81 1 01 0 98 LIT Insrr 1 17 1 24 1 49 1529 1 33 0 83 0 98 1 35 1 24 Itgax 0 64 1 12 0 73 1 61 1 53 0 77 1 55 0 91 1 05 Itgb3 0 90 0 98 0 69 0 99 0 91 0 46 0 74 1 28 0 92 Junb 1 95 0 64 1 75 0 56 0 56 3 18 0 97 0 68 1 06 Mrpl20 0 81 1 48 0 72 0 88 0 87 0 47 0 74 1 07 0 83 Nos2 1 87 0 31 2 00 0 33 0 28 1 25 0 30 0 87 0 85 Pde8a 1 22 0 93 2 60 1 54 1 58 1 26 0 96 1 02 1 21 Png 0 44 0 70 0 31 0 66 0 57 0 32 0 37 1 09 1 11 Ppil2 0 83 1 11 0 69 1 44 1 34 0 80 131 1 39 1 25 Pte2b 0 59 1 02 0 58 1 34 1 26 0 69 1 15 1 42 1 27 Ptgis 0 56 0 85 0 80 1 30 1 14 0 87 1 20 1 12 1 27 Rgs19 2 88 0 59 2 67 0 61 0 48 2 08 0 54 0 71 0 87 Rgs7 2 14 0 65 2 12 0 56 0 57 1 68 0 58 1 00 0 87 Scnla 0 59 1 44 0 70 1 34 1 37 0 81 1 42 1 43 1 29 Slc21a7 1 68 0 63 1 36 0 58 0 52 1 43 0 45 0 91 0 95 S1c26a2 0 57 1 12 0 61 1 06 1 13 1 43 1 69 0 90 1 34 Slc4al0 0 47 1 14 0 51 0 88 1 11 0 87 1 21 1 99 1 65 SIc2al0 1 32 0 88 1 64 0 75 0 64 1 06 0 61 1 03 0 98 Sncb 1 06 1 87 0 73 1 40 1 83 0 59 1 20 0 74 0 53 Tgfb3 0 78 113 0 47 1 13 0 44 0 70 0 83 0 82 Lil Ube2el 0 59 0 98 0 45 0 93 0 69 0 92 1 39 1 16 1 46 Tabelle 3 3 Der Einfluss von KR und MT auf die murine hypothalamische Genexpression fache Expression im Vergleich zu Kontrolltieren Es wurden insgesamt 45 Gene untersucht die
3. Tab 3 2 bersicht von circadian regulierten hypothalamischen Transkripten bei Kontrolltieren Die circadian regulierten Transkripte umfassten eine Vielzahl verschiedener Gengruppen Uhr relevante Gene wie Cry2 und die Casein Kinase 1 wurden reguliert sowie die output Gene der Uhr wie DBP und AVP 3 Ergebnisse 104 Ferner wurden Komponenten des Immunsystems Clsb C4 Hitzeschockproteine Dnajal Hsp70 4 Untereinheiten von Ionenkan len Gjal0 Gja3 und Transportmolek le der Solute carrier Familie circadian reguliert Auf andere Genkategorien sowie einzelne Transkripte wird in der Diskussion eingegangen 3 4 2 Microarray Untersuchung von circadian regulierten Transkripten im Hypothalamus von KR und MT M usen Die vorherigen graphisch und tabellarisch dargestellten circadian regulierten Transkripte wurden ebenfalls mittels Microarrays in den Hypothalami von KR und MT M usen untersucht Hierzu wurden wie bei den Kontrolltieren pro Zeitpunkt und Gruppe die f nf Einzelproben RNAs gemischt fluoreszenzmarkiert und analysiert Der besseren bersicht halber habe ich die Ergebnisse tabellarisch zusammengefasst und auf grafische Darstellung verzichtet Es wurde jeder untersuchte Zeitpunkt jeder Behandlung mit dem korrespondierenden Zeitpunkt der Kontrolltiere verglichen Alle Werte sind bezogen auf die Expressionsniveaus in Kontrolltieren KR Tiere sind gr n MT Tiere rot dargestellt Zus tzlich habe ich die Gene
4. AEH HEU M 1 23 45 6 7 891011121314 15161718M Abb 3 23 Expression einer Splei variante in verschiedenen Geweben der Maus M 100bp Groessenstandard 1 2 Hoden 3 4 Cerebellum 5 6 Olfaktorische Bulbi 7 8 Milz 9 10 Leber 11 12 Lunge 13 14 Hypothalamus 15 16 Herz 17 Niere 18 Negativkontrolle Nach der Hitzeaktivierung der Polymerase wurden 35 Zyklen mit folgenden Parametern amplifiziert 95 C 20s 59 C 30s 72 C 1min Die Amplifikation des mCLOCK Transkriptes mit der Primerkombinaton Clock delta 18 ergab in einigen Geweben eine Doppelbande Die gr ere Bande war 760bp gro und entsprach der berechneten Produktgr e Die kleinere Bande war ca 90 Basen kleiner Die Doppelbanden konnten nur aus neuronalem Gewebe amplifiziert werden In nicht neuronalen Geweben wurde immer nur eine distinkte Bande amplifiziert Entgegen der vorherigen PCR mit einer anderen Primerkombination konnte mit diesen Parametern kein CLOCK Transkript aus der Leber amplifiziert werden Beide PCR Produkte wurden wie im Methodenteil beschrieben gereinigt kloniert und nach Minipr p sequenziert Beide Sequenzen ergaben 100 Homologie zum Eintrag vom murinen CLOCK Transkript NM 007715 Allerdings wurde eine Deletion von 90 Basen gefunden Das Alignment Sequenzvergleich mit der genomischen DNA in der Gendatenbank ergibt folgendes Schema Exon 15 16 17 18 19 20 21 A18 Variante Abb 3 24 mCLOCK A18 Spleissvariante Ausschnitt
5. Abb 3 11 Repr sentatives Aktogramm einer Kontrollmaus im Alter 25 28 Monaten wie auf Abb 3 10 Es herrschte eine Lichtperiode von 06 00 18 00 Uhr DD ab LD A Das obige Bild stellt den Aktivit tsverlauf eines weiteren alten Tieres dar Die schwache Auspr gung des Rhythmus und der Hang zur Fragmentierung ist noch deutlicher zu erkennen als auf Abb 3 10 Der Gruppendurchschnitt der endogenen Periode t lag bei 23 86 0 08 Stunden 3 Ergebnisse 79 3 1 3 Statistische Auswertung der Aktivit tsaufzeichung 3 1 3 1 Einflu von KR und Melatonin substitution auf lokomotorische Aktivit t Lokomotorische Aktivit t von M usen unterschiedlichen Alters Monate unter variierenden Ern hrungs und Beleuchtungsbedingungen 4000 Normal 21 E 1 Normal 14 mum Di t 14 Emm Melatonin 14 30004 u 3 S m 3 2000 TN e NEP V en ee 2 lt 1000 1 H HERE EE E he S S RR RR le T 0 DD 24h LD 24h NachtwertLD Tagwert LD Abb 3 12 Dargestellt ist die Aktivit t der Tiere unterschiedlicher Versuchsgruppen unter LD und DD Bedingungen Es gab N 10 f r Gruppen der 14 Monate alten Tiere und N 6 f r die 21 Monate alten Tiere Standardfehler sind jeweils angezeigt Die Aktivit tseinheiten sind von den Sensoren aufgezeichnete Impulse au activity units Zus tzlich wurde die Aktivit t von 21 Monate alten Tieren mit aufgef hrt Die Aktivit t w hrend der Dunkelphase ist bei allen Versuchsgruppe
6. Kontrolle KR Melatonin k Alt 3 00E 03 2 00E 03 normalisierte Transkriptmenge 1 00E 03 4 0 00E 00 0 6 12 18 0 ZT Abb 3 42 mPer1 Expression im Hypothalamus der Maus Gemessen mittels Realtime PCR Zur besseren graphischen Darstellung wird nach einem kompletten circadianen Zyklus ZT 0 18 ZTO nach ZT18 wiederholt 3 Ergebnisse 111 Die Lichtphase ist unterhalb der X Achse als Balken dargestellt schwarz dunkel grau Licht Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen im Tagesverlauf der Genexpression Die mPerl Expression erreichte bei den Kontrolltieren um ZT12 und bei den KR und MT Tieren scheinbar um ZT18 ihr Maximum Der Expressionsunterschied von ZT 12 zu ZT 18 ist bei den KR und MT Tieren nicht statistisch signifikant Der einzige Unterschied ist der von ZTO zu ZT12 Kontrolltiere und ZTO zu ZT18 bei den KR und MT Tieren F r die Expression in den alten Tieren gab es nur einen Zeitpunkt ZT6 Hier lag die Expression von mPerl im Mittel mit den anderen Gruppen mPer2 Expression im Hypothalamus der Maus 1 00E 01 9 00E 02 8 00E 02 o 2 7 00E 02 E 2 i E 6 00E 02 Kontrolle a i S i kKR 5 00E 02 T i E Melatonin g 4 4 00E 02 A E T E 3 00E 02 S J li 2 00E 02 A 1 00E 02 0 00E 00 0 6 12 18 0 Abb 3 43
7. 4 50E 02 4 00E 02 o o 3 50E 02 ge amp I t 3 E 3 00E 02 te Kontrolle KR 2 50E 02 ir Melatonin A Alt 2 00E 02 2 T E 1 50E 02 o c 1 00E 02 5 00E 03 0 00E 00 0 6 12 18 0 ZT Abb 3 45 mCry2 Expression im Hypothalamus der Maus Gemessen mittels Realtime PCR 3 Ergebnisse 113 mCry2 zeigt eine circadiane Expression mit einer sehr hohen Amplitude bei den MT und KR Tieren Das Maximum wird bei den MT Tieren um ZT12 erreicht Bei den KR Tieren ist zwischen ZT12 und ZT18 kein signifikanter Unterschied zu erkennen Interessant ist hierbei dass die Kontrolltiere eine Doppelschwankung zeigen und ein versetztes Maximum zu ZT18 hin aufweisen Das Minimum um ZT12 ist allerdings nicht signifikant gegen ber dem ZT6 Wert Die Expression bei den alten Tieren ist sehr niedrig um ZT6 Positive Elemente der circadianen Uhr Bmal1 Expression im Hypothalamus der Maus 7 00E 03 6 00E 03 5 00E 03 4 00E 03 Kontrolle Melatonin Alt 3 00E 03 2 00E 03 normalisierte Transkriptmenge 1 00E 03 I 0 00E 00 0 6 12 18 0 ZT Abb 3 46 mBmall Expression im Hypothalamus der Maus Gemessen mittels Realtime PCR Der circadiane Verlauf der Bmall mRNA erreicht um ZT18 sein Maximum Die Amplitude ist nur gering aber vom niedrigsten Wert ZT6 KR MT Tiere bzw ZT12 Kontrolltiere zum h chsten Wert um ZT18 signifikant Bei
8. 4 Diskussion 121 In meinen Experimenten mit 30min Lichtpulsen in DD konnte ich zeigen dass alte M use weniger responsiv auf den Reiz reagieren d h der Effekt der Phasenverschiebung geringer ist als bei jungen M usen Die 24 Stunden Gesamtaktivitit von M usen nimmt mit zunehmendem Alter ab Abb 3 12 13 auch dies wurde von anderen Forschern beobachtet McAuley et al 2002 2004 Der Effekt des Alterns auf die Rate der Resynchronisation k nnte zumindest zum Teil mit der Aktivit t zusammenh ngen Da die durch Dunkelheit induzierte Aktivit tsmenge bei alten Tieren weniger ist k nnte die R ckkopplung an die circadiane Uhr ihrer Synchronisation auch geringer sein Valentinuzzi et al 1997 Das circadiane System k nnte sich w hrend des Alterns gegen ber Zeitgeberreizen desensibilisieren St rkere Lichtpulse k nnten ein desensibilisiertes System besser synchronisieren Die Rate der Phasenverschiebung k nnte auch als Messgr e f r die St rke der Kopplung des internen Zeitmessungssystems an externe Zeitgeber sein Bei starker Kopplung an den LD Zyklus ist die Resynchronisation schnell bei schwacher Kopplung entsprechend langsamer dies ist bei dem von mir untersuchten M usestamm und dem von Valentinuzzi et al 1997 der Fall Bei einer durchgef hrten Phasenverz gerung von 4 Stunden Abb 3 14 3 17 stellte ich fest dass die Resynchronisation an die neuen Lichtverh ltnisse bei den KR und MT Tieren am schnellsten ist Zu
9. Die circadiane Expression der bekannten Uhr Gene entsprach gr tenteils den Beschreibungen in der Literatur Von den Per und Cry Genen ist bekannt dass ihre mRNA in der Lichtphase im SCN ihr Maximum erreicht Kume et al 1999 Shearman et al 2000 Zylka et al 1999 Die Festlegung des circadianen Maximums f r Per2 Cryl Cry2 DBP und AVP sp t am subjektiven Tag ca ZT 12 deckt sich gut mit den Berichten von Oster und Mitarbeitern 2003 Die Expression von Perl ist im SCN in ihrer Phase immer leicht vor der von Per2 und Per3 King et al 2000 Reppert amp Weaver 2001 Dies konnte ich nicht best tigen m glicherweise da der Hypothalamus ein recht heterogenes neuronales Gewebe ist Die Phase von Perl scheint bei den KR und MT Tieren sogar in Richtung ZT18 verschoben zu sein allerdings ist dies gegen ber ZT12 nicht signifikant Die Amplitude der Transkripte von Perl und Per2 ist mit 2 3 fach etwas niedriger als f r den SCN beschrieben o g Autoren Die Expression von Cry2 weist bei den MT Tieren eine sehr hohe circadiane Amplitude ca 15 fach auf Dies ist verwunderlich denn es konnte entweder kein klar definierter Rhythmus Oster et al 2003 oder nur ein schwacher Okamura et al 1999 im SCN nachgewiesen werden Da dies nur ein Effekt bei den MT Tieren war k nnte dies ein Hinweis auf eine st rkere Auspr gung der negativen R ckkopplungsschleife sein Die CRY Proteine sind n mlich mit den PER Proteinen zusammen die
10. hnlich meiner Studie einige der bekannten Uhr Gene in der Microarray Evaluierung Im Vergleich von rhythmischen Genen des SCN 101 Ueda et al 2002 gegen ber 337 Panda et al 2002 wurden nur 23 bereinstimmungen gefunden Auch bei Nutzung derselben Microarray Technologie Affymetrix wurden in demselben untersuchten Gewebe maximal 7 43 bereinstimmungen gefunden Panda et al 2002 Storch et al 2002 Ueda et al 2002 Trotz der niedrigen bereinstimmung einzelner Transkripte gibt es gr ere Gemeinsamkeiten wenn komplexe biochemische Prozesse betrachtet werden Akthar et al 2002 Duffield et al 2002 Das von mir genutzte System Xeotron hat sich sowohl in der Anwendung als auch in der Best tigung der Ergebnisse mittels RT PCR als sehr zuverl ssig erwiesen Auch wenn nur 1000 ausgew hlte Transkripte untersucht wurden so konnte eine F lle von bisher nicht als circadian reguliert bekannten Transkripten identifiziert werden 4 Diskussion 144 5 Zusammenfassung Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Beobachtung von verhaltensbiologischen und molekularbiologischen Ver nderungen in M usen unterschiedlichen Alters und verschiedener Haltungsbedingungen M use des Stammes B6C3F1 wurden in drei Gruppen je 20 Tiere aufgeteilt Kontroll KR Di t und MT Tiere Melatoninsubstituiert und in Einzelhaltung lokomotorisch berwacht Die molekularbiologische Aufgabe war die Untersuchung von Uhr Genen i
11. 1991 In vitro electrical activity in the suprachiasmatic nucleus following splitting and masking of wheel running behavior Brain Res 559 1 94 9 Zylka M J and S M Reppert 1999 Discovery of a putative heme binding protein family SOUL HBP by two tissue suppression subtractive hybridization and database searches Brain Res Mol Brain Res 74 1 2 175 81 Zylka M J L P Shearman et al 1998 Molecular analysis of mammalian timeless Neuron 21 5 1115 22 Zylka M J L P Shearman et al 1998 Three period homologs in mammals differential light responses in the suprachiasmatic circadian clock and oscillating transcripts outside of brain Neuron 20 6 1103 10 6 4 Danksagung in weder emotionaler noch alphabetischer Reihenfolge Hamburg Danke an meine Familie meine Eltern und meinen Bruder Ihr habt mich immer unterst tzt und ermuntert in den letzten Jahren Ihr habt mir Mut gemacht wenn ich verzweifelt war und ward stolz auf mich wenn alles toll klappte Danke vor allem Nils meinem Bruder Big Bro Du warst immer f r mich da nicht nur in geographischer N he danke Danke auch f r Deine Hilfe beim Kampf gegen Word Vielen Dank an Dr James Olcese meinen Doktorvater Mentor und Freund Danke dass Du mich als HiWi aufgenommen hast und mir im direkten Anschluss daran die M glichkeit gegeben hast bei Dir zu promovieren Von allen m glichen Betreuern habe ich echt Gl ck mit Dir gehabt J
12. 1996 Caloric restriction and aging Sci Am 274 1 46 52 Weindruch R 2003 Caloric restriction gene expression and aging Alzheimer Dis Assoc Disord 17 Suppl 2 S58 9 Weindruch R B H Devens et al 1983 Influence of dietary restriction and aging on natural killer cell activity in mice J Immunol 130 2 993 6 Weindruch R S R Gottesman et al 1982 Modification of age related immune decline in mice dietarily restricted from or after midadulthood Proc Natl Acad Sci U S A 79 3 898 902 Weindruch R T Kayo et al 2001 Microarray profiling of gene expression in aging and its alteration by caloric restriction in mice J Nutr 131 3 9185 9238 Weindruch R T Kayo et al 2002 Gene expression profiling of aging using DNA microarrays Mech Ageing Dev 123 2 3 177 93 Weindruch R K P Keenan et al 2001 Caloric restriction mimetics metabolic interventions J Gerontol A Biol Sci Med Sci 56 Spec No 1 20 33 Weindruch R H M K Cheung et al 1980 Modification of mitochondrial respiration by aging and dietary restriction Mech Ageing Dev 12 4 375 92 Weindruch R H and S C Suffin 1980 Quantitative histologic effects on mouse thymus of controlled dietary restriction J Gerontol 35 4 525 31 Welsh D K D E Logothetis et al 1995 Individual neurons dissociated from rat suprachiasmatic nucleus express 6 Anhang 156 independently phased circad
13. 2 4 Bakterienstimme 2 5 Verwendete PCR Oligonukleotide Primer 2 6 Verwendete Vektoren 2 7 Isolierung von Gesamt RNA 2 8 Bestimmung der Integrit t von RNA mit dem Agilent Bioanalyzer 2100 2 8 1 Konzentrationsbestimmung von Nukleins uren 2 9 cDNA Synthese 2 10 Die Polymerase Kettenreaktion PCR 2 10 1 Quantitative Realtime PCR LightCycler iCycler 40 2 11 DNA Auftrennung mittels Agarose Gelelektrophorese 2 12 Reinigung von DNA Fragmenten aus einer PCR Reaktion 2 13 Reinigung von DNA Fragmenten aus dem Gel 2 14 Ligation von DNA in einen bakteriellen Vektor 2 15 Transformation und Ausplattieren der Bakterien 2 16 Plasmid Minipr paration 2 17 Restriktionsverdau von DNA 2 18 DNA Sequenzierung 2 19 Herstellung fluoreszenzmarkierter cDNA Sonden 2 19 1 Synthese Aminoallyl modifizierter cDNA 2 19 2 Kopplung von Fluoreszenzfarbstoffen an modifizierte cDNA 2 19 3 Analyse der fluoreszenmarkierten Sonde mit dem Nano Drop M 2 20 Hybridisierung von Microarrays auf dem Xeotron Chip System 2 21 Auswertung der Microarrays 2 22 Liste der verwendeten L sungen und Reagenzien 2 23 Liste der verwendeten Kits und Reagenzien 2 24 Firmenverzeichnis OOD U Hm m 11 12 14 15 17 17 20 21 23 25 25 2T 28 30 30 34 34 35 37 38 44 45 46 47 48 50 50 51 53 53 57 59 60 63 64 65 66 3 Ergebnisse 67 3 1 Physiologische Daten 67 3 1 1 Entwicklung des K rpergewichts der Versuchstiere 67 3 1 2 Aktiv
14. 2003 Digging deep structure function relationships in the melatonin receptor family J Pineal Res 35 4 221 30 Barrett P C Schuster et al 2003 Sensitization a mechanism for melatonin action in the pars tuberalis J Neuroendocrinol 15 4 415 21 Barzilai N and L Rossetti 1995 Relationship between changes in body composition and insulin responsiveness in models of the aging rat Am J Physiol 269 3 Pt 1 E591 7 Bertoli Avella A M B A Oostra et al 2004 Chasing genes in Alzheimer s and Parkinson s disease Hum Genet 114 5 413 38 Blumenthal H T 1997 Fidelity assurance mechanisms of the brain with special reference to its immunogenic CNS compartment their role in aging and aging associated neurological disease J Gerontol A Biol Sci Med Sci 52 1 B1 9 Boyd F T Jr D W Clarke et al 1986 Insulin inhibits specific norepinephrine uptake in neuronal cultures from rat brain Brain Res 398 1 1 5 Brydon L L Petit et al 1999 Polymorphism and signalling of melatonin receptors Reprod Nutr Dev 39 3 315 24 Butcher G Q H Dziema et al 2002 The p42 44 mitogen activated protein kinase pathway couples photic input to circadian clock entrainment J Biol Chem 277 33 29519 25 Calabrese V T E Bates et al 2000 NO synthase and NO dependent signal pathways in brain aging and neurodegenerative disorders the role of oxidant antioxidant balance Neurochem Res 25 9 10
15. KR und MT Tieren im Alter von 8 und 14 Monaten jeweils signifikant p 0 05 Im Alter von 14 Monaten ist die endogene Periode bei beiden Behandlungsgruppen signifikant p 0 05 langer als bei den Kontrolltieren Es gibt nur zwei Punke der t Bestimmung f r KR und MT Tiere da wie bei den Kontrolltieren eine pr zise Bestimmung der Periode nur bei einer langern Verweildauer im Dauerdunkel gt 3 Wochen durchgef hrt werden kann In den ersten Monaten wurden die KR und MT Tiere aktivit ts berwacht jedoch nicht lange genug unter DD Bedingungen gehalten um t konform mit den Kontrolltieren zu bestimmen 3 Ergebnisse 85 3 2 Molekularbiologische Untersuchungen 3 2 1 Amplifikation der unbekannten 3 Region des murinen Melatonin Rezeptors Typ 2 mMT2 Die PCR Amplifikation des mMT2 Rezeptors wurde mit einer Vielzahl von Primerkombinationen durchgef hrt um den noch unver ffentlichten Teil der Sequenz zu erhalten M 1 2 3 4 5 6 7 8 Abb 3 19 mMT2 Amplifikation aus Cerebellum cDNA einer Kontrollmaus ZT 12 mit verschiedenen Primerkombinationen M 200bp Gr enstandard Smartladder 1 2 Clock delta 18 Kombination 3 4 mMT2 A F amp mMT2 A R 5 6 mMT2AF amp mMT2 3 UTR A 7 8 MT2 A F amp mMT2 3 UTR B Die PCR wurde nach einem Standardprotokoll im Robocycler durchgef hrt Nach der Hitzeaktivierung der Polymerase wurden 35 Zyklen mit folgenden Parametern amplifiziert 95 C 20s 59 C 30s 72
16. QlAquick PCR Purification Kit 250 Kat Nr 28106 Qiagen RNA 6000 Nano Chips 25 RNA 6000 Nano Chips 2 Electrode Cleaners Kat Nr 50654476 Agilent Technologies RNA 6000 Nano Reagents amp Supplies Kat Nr 50654476 RNAlater M 100ml Kat Nr 7020 Rneasy Mini Kit 250 Kat Nr 74106 Qiagen SuperScript M First Strand Synthesis System for RT PCR 50 Rxns Kat Nr 11904018 SuperScript II Reverse Transcriptase 2000Units Invitrogen 18064022 SuperScript Indirect cDNA Labeling Core Kit 30 Rxn Kat Nr L101402 Invitrogen TRIZOL Reagent 200ml Kat Nr 15596018 Invitrogen XeoEX Buffer Kit Kat Nr X3000 Xeotron QuantiTect SYBR Green PCR Kit 200x50ul Rxn Kat Nr 204143 Qiagen 0 2ml Tube Strip 80 strips of 12 Kat Nr 410082 Stratagene 2 Material und Methoden 67 Cap Strip 80 strips of 12 Kat Nr 410086 Stratagene One Shot TOP10 Chemically Competent E coli 10 Kat Nr C 404003 Invitrogen NanoDrop ND1000 UV Vis Spektrophotometer 2 24 Firmenverzeichnis Qiagen Hilden Roth Karlsruhe Sigma Deisenhofen Xeotron Houston USA USA Moleculaer Probes Inc Eugene USA TAKARA BIO INC Otsu Japan Fermentas Life Science Hanover USA Agilent Technologies Waldbronn Merck Darmstadt New England Biolabs Schwalbach Charles River Laboratories Inc Wilmington MA 01887 1000 Roche Mannheim Sarstaedt N rnbrecht Stratagene Heidelberg Invitrogen life technologies TM Carlsbad GibcoBRL Egge
17. homogenisiert Nach Zugabe von 1ml Chloroform 0 2ml Chloroform pro eingesetztem ml Trizol TM wurde die Suspension kr ftig durch Sch tteln gemischt und 3min bei Raumtemperatur inkubiert Es wurde anschlie end f r 30min in einer gro en Eppendorf Zentrifuge bei 4000Upm und 4 C zentrifugiert Der berstand 2 2 5ml wurde in ein frisches Falcon Tube berf hrt mit 2 5ml Isopropanol versetzt und heftig gesch ttelt Nach 10min Inkubation bei Raumtemperatur wurde f r Ih bei 4000Upm und 4 C zentrifugiert Das entstandene RNA Pr zipitat Pellet wurde einmal mit 2 5ml 75 Ethanol gewaschen 15 min 4000Upm 4 C und anschlie end f r 15min an der Luft getrocknet Das getrocknete Pellet wurde dann in 100 ul DEPC behandeltem Wasser resuspendiert 2 8 Bestimmung der Integrit t von RNA mit dem Agilent Bioanalyzer 2100 und RNA 6000 Nano Chips Theorie Da die Qualit t Integrit t der RNA f r alle folgenden molekularbiologischen Untersuchungen sehr wichtig ist muss auf eventuelle Degradationen gepr ft werden Eine g ngige Methode ist eine denaturierende Gelelektrophorese mit Formamid und Formaldehyd haltigem Agarosegel bzw Guanidinium Isothiocyanat Ich hatte f r die Durchf hrung dieser Studie die M glichkeit eine Integrit tsmessung mit einem modernen System dem Agilent Bioanalyzer 2100 durchzuf hren Dieses System hat den Vorteil dass nur sehr geringe Mengen im Mikroliter Bereich giftiger Substanzen verwendet werden ei
18. 1315 41 Cao S X J M Dhahbi et al 2001 Genomic profiling of short and long term caloric restriction effects in the liver of aging mice Proc Natl Acad Sci U S A 98 19 10630 5 Caroleo M C D Frasca et al 1992 Melatonin as mmunomodulator in immunodeficient mice Immunopharmacology 23 2 81 9 Caroleo M C G Nistico et al 1992 Effect of melatonin on the immune system Pharmacol Res 26 Suppl 2 34 7 Choi S L S Wong et al 1998 Hypothalamic ventromedial nuclei amplify circadian rhythms do they contain a food entrained endogenous oscillator J Neurosci 18 10 3843 52 Conway S S J Canning et al 2000 Characterisation of human melatonin mt 1 and MT 2 receptors by CRE luciferase reporter assay Eur J Pharmacol 390 1 2 15 24 Conway S J E Drew et al 2000 Chimeric melatonin mt1 and melatonin related receptors Identification of domains and residues participating in ligand binding and receptor activation of the melatonin mt1 receptor J Biol Chem 275 27 20602 9 Daan S U Albrecht et al 2001 Assembling a clock for all seasons are there M and E oscillators in the genes J Biol Rhythms 16 2 105 16 Daan S and C Berde 1978 Two coupled oscillators simulations of the circadian pacemaker in mammalian activity rhythms J Theor Biol 70 3 297 313 Damiola F N Le Minh et al 2000 Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripher
19. 6 ObRb 7 NPY 8 Bmall M Alle f r die quantitative Realtime PCR eingesetzten Primer wurden entworfen um PCR Produkte mit einer Gr e von 150 250bp zu erhalten Die erwartete Produktgr e wurde f r alle Primerkombinationen best tigt 3 Ergebnisse 88 3 2 3 Amplifikation des mCLOCK Transkriptes 3 2 3 1 Amplifikation des 2 4kB mCLOCK Transkriptes aus verschiedenen peripheren Geweben d WAP WES UND P or qur ow w w v M M1234 5678 91011121314 15 M Abb 3 22 Expression des CLOCK 2 4 kb Transkriptes in verschiedenen Geweben der Maus M 100bp Gr enstandard 1 2 Hoden 3 4 Cerebellum 5 6 Olfaktorische Bulbi 7 8 Hypothalamus 9 10 Leber 11 12 Lunge 13 14 Milz 15 Negativkontrolle Die Amplifikation des mCLOCK Transkriptes mit der Primerkombination mCLOCK Total ergab eine spezifische 2 4kb Bande in allen untersuchten Geweben bis auf Hoden und in einer Probe Milz Nach mehrmaliger Wiederholung mit verschiedenen Hoden und Milz cDNAs konnte das Amplifikat aus Milz in keinem Fall aber aus Hoden amplifiziert werden Die Expression des Transkriptes in der Leber scheint sehr gering zu sein Die PCR wurde nach leicht modifiziertem Protokoll im Robocycler durchgef hrt 95 C 30s 59 C 30s 72 C 2min 35 Zyklen 3 Ergebnisse 89 3 2 3 2 Amplifikation einer Splei variante des mCLOCK Transkriptes aus verschiedenen Geweben
20. Die PAS A codierende Region ist in Exon 7 9 die von PAS B in Exon 12 und 13 Exon 19 befindet sich in einer glutaminreichen Dom ne Glutaminreiche Regionen von Transkriptionsfaktoren werden mit der Transaktivierung von Transkriptions Initiationskomplexen assoziiert Mitchell amp Tjian 1989 In Anbetracht der Tatsache dass Exon 18 nicht in dieser oder irgendeiner anderen essentiellen Dom ne liegt w re es m glich dass sein Fehlen keinen Funktionsverlust bedingt Das offene Leseraster wird durch SpleiBen von Exon 18 unterbrochen Da alle meine Tiere unter DD Bedingungen rhythmisch waren ist es h chstens m glich dass die A 18 Variante mit der nativen Clock Form um E Box Bindungsstellen konkurriert Nat rlich ist es ebenfalls m glich dass die A18 Splei variante nicht oder nur bedingt funktionell ist Da sie aber nur mit der nativen Clock Variante zusammen auftritt w re der Defekt teilweise kompensiert Es gibt wenige Informationen ber die Steuerung der Clock Expression Das Clock Protein wird negativ durch PER CRY und m glicherweise TIM Proteine reguliert Gekakis et al 1998 Sangoram et al 1998 Griffin et al 1999 Wilsbacher und Mitarbeiter 2000 fanden in der Promotorregion von Clock 4 E Box Elemente womit eine positive Autoregulation wahrscheinlich ist Es ist allerdings umstritten ob pauschal von einer circadianen Regulierung von Clock im SCN von Nagetieren gesprochen werden kann In der Ratte wird Clock im SC
21. Theorie Die Polymerase Kettenreaktion PCR ist eine Methode um das Vorhandensein definierter Abschnitte von DNA Molek len genomisch oder aus cDNA in vitro zu pr fen und diese zu vervielf ltigen Die Startnukleotide Primer sind hierbei sequenzspezifisch f r das zu amplifizierende Gen oder Transkript Die Verl ngerung der Primer erfolgt nach deren Hybridisierung mit dem komplement ren DNA Strang durch eine thermostabile DNA Polymerase z B Tag Polymerase Dies geschieht bei 72 C dem Wirkungsoptimum des Enzyms Die L nge des DNA Amplifikates wird durch die Position der 5 und 3 Primer bestimmt es ist von ihnen flankiert Die Syntheseprodukte hybridisieren nach jedem Elongationsschritt gefolgt von einer Denaturierung bei 95 C wieder mit den Primern sodass ein spezifischer DNA Abschnitt durch Wiederholung des PCR Vorgangs Denaturierung Primer bindung und Elongation sehr schnell exponentiell angereichert werden kann Mittlerweile sind die kommerziell erh ltlichen DNA Polymerasen mit ihren Puffern optimiert Einige Parameter k nnen aber die Qualit t der PCR verbessern z B die Modifikationen der Magnesium Konzentrationen Zweiwertige Magnesium Ionen werden als Kofaktor ben tigt Deren Konzentration ist individuell vom DNA Template abh ngig und 2 Material und Methoden 39 kann variiert werden Am entscheidendsten ist die Anlagerungstemperatur der Primer Die optimale Hybridisierungstemperatur ist von ihrer Lange
22. es Interesse an der Funktionsweise der inneren Uhr und ihrer Degeneration w hrend der Seneszenz St rungen des circadianen Systems durch Krankheit oder Alter haben profunde Effekte auf die Physiologie und das Wohlbefinden von Menschen Die therapeutische Anwendung von Melatonin kann bei vielen Krankheitssymptomen helfen Die Melatoninsekretion nimmt bei S ugetieren mit zunehmendem Alter ab Iguchi et al 1981 Einschlafst rungen wie sie bei einem Grossteil der Bev lkerung vorkommen werden oft erfolgreich mit Melatonin behandelt Auch Schichtarbeiter oder Fernreisende profitieren von dem synchronisierenden Effekt von Melatonin Blinde denen die M glichkeit der Synchronisation durch Licht fehlt k nnen ebenfalls h ufig so behandelt werden Au erdem wird Melatonin mit einer Reihe psychiatrischer Krankheitsbilder in Verbindung gebracht Hierzu z hlen jahreszeitliche Gem tsschwankungen Putilov 1999 Schizophrenie und manische Depressionen Bei Patienten mit unipolarer Depression werden niedrige Serum Melatonin Konzentrationen und 1 Einleitung 22 ein gest rter circadianer Melatoninrhythmus berichtet Wirz Justice amp Arendt 1979 M glicherweise kann Melatonin die Entwicklung von altersbedingten Krankheiten verlangsamen oder gar verhindern Kalorische Restriktionsern hrung ist f r den Menschen nicht realistisch anwendbar aber da auch Melatonin erwiesenerma en lebensverl ngernd wirkt k nnte hier eine Anwendung in der Geria
23. welches f r eine Abstumpfung oder Maskierung des circadianen Systems spricht 5 1 Summary The aim of the presented study was the assessment of the influence of melatonin MT and caloric restriction CR on behavioral and molecular biological traits in mice of different ages Mice of the strain B6C3F1 were divided into three groups control CR and MT The animals were housed singly and their locomotor activity was monitored The molecular biological assignment was the examination of clock genes in the hypothalamus of the mouse and the identification of new circadian transcripts The gene expression in the liver was also assessed to evaluate the influence of the applied treatments Diverse chronobiological experiments with different lighting protocols were conducted Following the behavioral studies the mice were sacrificed at four timepoints during the day ZTO 6 12 18 at the age of 14 months Six old mice were 30 months old Brains livers and other tissues were excised for further analysis The body weight of the CR animals was far lower than that of the other groups Compared to the controls the MT animals also displayed a reduced body weight The monitoring of locomotor activity revealed that the endogenous period 1 increases with age in mice under DD conditions This aging effect was not affected by either CR or MT treatment The total locomotor activity in aged mice was also reduced Mice of the CR group displayed a fragmented act
24. 10 20 festgestellt Nukleins uren DNA und RNA absorbieren elektromagnetische Wellen im UV Bereich RNA DNA und freie Nukleotide haben ein Absorptionsmaximum bei 260 nm w hrend die aromatischen Reste der Aminos uren z B Phenylalanin bei 280 nm maximal absorbieren Die Quotienten der Werte von 260 nm und 280 nm sind ein Ma f r die Reinheit der Nukleins uren DNA 1 8 2 0 RNA 2 0 2 2 Eine reine doppelstr ngige DNA L sung hat mit OD269 1 eine Konzentration von 50 ug ml eine einzelstr ngige RNA L sung 40 ug ml und eine Oligonukleotid L sung 33 ug ml Anstatt 2 Material und Methoden 37 die Messung in Wasser durchzuf hren wurde Phosphatpuffer Na2HPO4 NaH PO pH 7 0 verwendet um m glichst reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten M lhardt 2000 Material Spektralphotometer Eppendorff BioPhotometer Phosphatpuffer 10mM pH 7 0 Methode Sul der in DEPC Wasser gel sten RNA wurden mit 495ul 10mM Phosphatpuffer 1 100 verd nnt Nach Ermittlung des Leerwertes mit ausschlie lich Phosphatpuffer wurde aus der Absorption bei so und Joso unter Ber cksichtigung der Verd nnung die Konzentration und Reinheit der RNA bestimmt 2 9 cDNA Synthese Theorie F r PCR und viele Microarray Anwendungen muss aus RNA eine cDNA hergestellt werden Diese wird aus mRNA in Gegenwart von Desoxynukleotiden dem entsprechenden Reaktionspuffer und durch das Enzym Reverse Trankriptase RT synthetisiert Es m ssen zus tzlich
25. 118 Reeth et al 1992 amp 1993 Valentinuzzi und Kollegen 1997 stellten bei alternden M usen des Stammes C57BL 6 auch eine Verl ngerung der Periode fest Der Effekt des Alterns auf die Periode t ist noch nicht einmal im selben M usestamm gleichbleibend erfasst worden Welsch et al 1996 berichteten wie Valentinuzzi 1997 von einer verl ngerten Periode bei alternden C57BL 6 M usen w hrend Teena amp Wax 1975 in diesem Stamm keinen altersbedingten Unterschied der Periode feststellten Diese Heterogenit t der Ergebnisse l sst sich vielleicht durch unterschiedliche Beleuchtungsprotokolle vor oder w hrend der Messung von qt oder durch das unterschiedliche Alter der Versuchstiere erkl ren Auffallend bei den Studien mit Hamstern von Van Reeth 1992 amp 1993 ist dass bei einem nachtaktiven Tier anstatt DD f r Freilauf zu verwenden LL also Dauerlicht verwendet wurde Ich glaube nicht dass es angebracht ist nachtaktive Tiere unter Dauerlicht Bedingungen zu setzen und nat rliche Reaktionen zu erwarten Aschoffs Regel besagt dass unter LL Dauerlicht die endogene Periode t bei nachtaktiven Tieren zunimmt Steinlechner und Mitarbeiter 2002 bewiesen dies eindrucksvoll mit Wildtyp und Perl Per2 mutanten M usen Es wurde gezeigt dass bis auf interessante Ph notypen bei den mutanten M usen LL ab einer bestimmten Lichtst rke zu Arrhythmizit t f hrt Bei DD Bedingungen jedoch bleibt die Periode unter 24h und die Tiere bleiben
26. 2001 Aufgrund ihrer Teilnahme am xenobiotischen Metabolismus wird Mitgliedern der Cytochrom P450 Familie antineoplastisches Potential nachgesagt Das Vorkommen von Hepatoma bei alten Tieren steigt w hrend die Expression dieser Transkripte sinkt Cao et al 2001 Da Cyp3all durch Testosteron induzierbar ist ware anzunehmen dass die KR Tiere hohe Testosteronwerte haben in anderen Studien wurde allerdings festgestellt dass KR Testosteronwerte senkt Dhahbi et al 2004 4 Diskussion 131 Die Cyp3a Isoformen metabolisieren Testosteron und sind auch durch xenobiotische Faktoren induzierbar Hagemeyer 2003 Aus diesem Grund k nnte die Expression auch erh ht sein Cyp2a4 15a Hydroxylase ist essentiell f r die Steroidhormonsynthese Miller und Mitarbeiter berichten ebenfalls von einer starken Induktion gt 10 fach bei KR M usen Auch bei MT Tieren war Cyp2a4 induziert ca 2 fach Das Transkript Cyp2a4 ist besonders interessant da es auch circadian durch DBP D Site Binding Protein reguliert wird Akthar et al 2002 Lavery et al 1999 In der Leber von M usen wird die Detoxifikation zumindest teilweise unter der Kontrolle der inneren Uhr reguliert Nun k nnte man annehmen dass die Cyp2a4 Expression als Folge eines Einflusses von KR auf die innere Uhr gesteigert wird da DBP ein output gen der Uhr darstellt Dies w rde allerdings bedeuten dass auch die DBP Mengen in KR Maus Lebern dramatisch gesteigert w ren Ich halte
27. 4 Waschvorgang 3 wiederholen Durchflu verwerfen 5 S ule zum Trocknen 1min bei 14 000g zentrifugieren dies entfernt alle Ethanolreste die bei der darauffolgenden Elution st ren Durchflu verwerfen 6 50ul DEPC behandeltes Wasser auf die S ule mit gebundener gereinigter cDNA pipettieren und 1min bei RT inkubieren dann 1 min bei 14 000g zentrifugieren 2 Material und Methoden 58 7 Elution mit weiteren 50u1 DEPC behandeltem Wasser wiederholen 8 Eluat 100ul mit 10ul 3 M Natrium Acetat pH 5 2 2ul Glykogen 20mg ml versetzen und mischen durch Pipettieren oder Vortexen 9 300ul 20 C Ethanol 96 hinzuf gen 10 Inkubation bei 20 C zum Fallen f r mindestens eine Stunde ggf ber Nacht 11 Durch Zentrifugieren bei 4 C f r 30 60min Pr zipitieren Ethanol verwerfen 12 Einmal mit 250ul 75 Ethanol 20 C Waschen Ethanol verwerfen 13 Pr zipitierte cDNA f r 10 15 min bei RT an der Luft trocknen 2 19 2 Kopplung von Fluoreszenzfarbstoffen an Aminoallyl modifizierte cDNA Theorie An die Aminoallyl modifizierten cDNA wird durch eine chemische Reaktion der jeweilige Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt Der Farbstoff z B Alexa Fluor 555 liegt als Aminreaktives Carboxyls ure Succinimidyl Ester Dinatrium Salz vor In Gegenwart von Natriumbikarbonat Salz und DMSO kommt es zu einer Veresterung mit dem in der cDNA vorhandenen 5 3 Aminoallyl dUTP Material Pr zipitierte Aminoallyl modifizierte c
28. 40 C abgek hlt sodass alle PCR Produkte als doppelstr ngige DNA vorliegen und maximale Fluoreszenz emittieren Anschliessend wird die Temperatur in Inkrementen bis 95 C erh ht w hrend die emittierte Fluoreszenz permanent gemessen wird Hierbei trennen sich bei einer f r die Gr e und Zusammensetzung des jeweiligen PCR Produktes charakteristischen Temperatur die DNA Doppelstr nge und entlassen den Fluoreszenzfarbstoff Die Folge ist ein beinahe schlagartiges Absinken der gemessenen Fluoreszenz genannt der Schmelzpunkt Stringente PCRs haben nur einen Schmelzpunkt d h ein PCR Produkt Eine gelelektrophoretische Auftrennung der PCR Produkte erm glicht es dann zus tzlich zu pr fen ob die antizipierte Gr e des PCR Produktes stimmt 2 Material und Methoden 42 File CALightCycler33 Users LC_User Data David RP27 Spl 210103 ABT Program cycling Run By LC User Run Date Jan 21 2003 16 03 Print Date January 21 2003 11 0 10 0 9 0 8 0 Tom 6 0 5 0 Fluorescence F1 Cycle Number Abb 2 3 Darstellung des Amplifikationsverlaufes einer Standardkurve und Proben wie beschrieben am LightCycler hergestellt Es wurden 7 Verd nnungen eines PCR Produktes benutzt von 1ng Ansatz bis 1fg Ansatz Es wurden zwei Proben in Duplikaten gemessen File C LightCycler33 Users LC_User Data David RP27 Spl 210103 ABT Program melt Run By LC_User Run Date Jan 21 20
29. 5 g 250 mM KCI 10 ml mit H20 auf 900 ml auff llen pH auf 7 0 einstellen mit H2O auf 990 ml auff llen autoklavieren dann 10 ml einer sterilen Glukose L sung 2 M hinzugeben 50x TAE Liter Tris Base 2M Eisessig 57 1 ml EDTA 0 1 M H20 auf 11 pH auf 8 5 einstellen autoklavieren 10x TBE Liter Tris Base 0 89 M Bors ure 0 89 M EDTA 20 mM autoklavieren 2 Material und Methoden 66 2 23 Liste der verwendeten Kits und Reagenzien Alexa Fluor amp 555 and Alexa Fluor 647 reactive dye pacs je 10 Reaktionen Kat Nr A32755 Moleculare Probes Ares Alexa Fluor 488 DNA Labeling Kit 10 Reaktionen Kat Nr A 21665 Moleculaer Probes Ares Alexa Fluor 594 DNA Labeling Kit 10 Reaktionen Kat Nr A 21669 Moleculaer Probes cDNA Labeling Purification Module 30 RXN Invitrogen Kat Nr 450042 DNA Polymerase TaKaRa Ex Taq Hot Start Version 10x PCR Buffer dNTP Mixture for PCR Kat Nr RR006A TAKARA BIO INC Expression XeoChip Custom made Microarrays Xeotron GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus ready to use Kat Nr SM0323 Fermentas IQ BIO RAD SYBR Green Supermix 2x Mix for Real Time PCR 500x50u1 Rxn Kat Nr 1708882 Optical Tape Box of 100 Kat Nr 2239444 BIO RAD iCycler PCR Plates 96 Well Kat Nr 2239441 BIO RAD iCycler QIAGEN PCR Cloning Kit 10 Kat Nr 231122 Qiagen OlAprep Spin Miniprep Kit 50 Kat Nr 27141 Qiagen QlAquick Gel Extraction Kit 50 Kat Nr 28704 Qiagen
30. B Bmall Clock steht uneingeschr nkt in seiner nativen Form als positiver Aktivator der Transkription zur Verf gung 4 Diskussion 128 Im SCN konkurriert Clock mit der A18 Spleissvariante um die Bindung an E Boxen im eigenen Promotorbereich und den von Clock gesteuerten Transkripten Per Cry etc Dies f hrt zu einer geringeren Transkription von Clock und einer geringeren Aktivierung der Clock gesteuerten Transkripte In peripheren Geweben ist nur die native Form von Clock vorhanden also kann es seine volle Aktivierungskapazit t als Dimer mit Bmall aus ben Die Amplitude von sowohl Clock als auch aller Clock gesteuerten Transkripte w re in peripheren Geweben also h her als in neuronalen Geweben Ahnliches wurde beobachtet ohne bisher erkl rt werden zu k nnen In der Bauchspeicheldr se von Ratten hat Per ein Maximum welches 13 fach h her als der Minimalwert ist Per2 schwankt 4 3 Cry 10 fach Das output Gen DBP hat einen 28 fach h heren circadianen Maximal als Minimalwert M hlbauer et al 2004 Auch in Organen wie Leber Niere Muskel Lunge und Herz zeigen Uhr Gene vor allem DPB eine hohe circadiane Expression Young et al 2001 Oishi et al 2000 Damiola et al 2000 Im SCN ist die circadiane Amplitude wesentlich geringer DBP variiert beispielsweise nur 2 3 fach ber den circadianen Tag Ripperger et al 2000 Per und Per2 zeigen im Ratten SCN eine 2 4 fache circadiane Schwankung Sumova et al 2003 Asai et
31. Du bist der beste Zuh rer und Berater den ich mir vorstellen kann Ich werde alle Kollegen aus dem IHF vermissen Das Leben geht weiter f r uns alle Denn Tempus fugit Danke an Herrn Prof Dr Seitz vom GRK 336 Ihr Einsatz f r junge Doktoranden ist bewundernswert Ich danke Ihnen Danke an die DFG dessen finanzielle Unterst tzung auch ber das GRK 336 mafgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat Tallahassee USA First of all I d like to thank Dr James Olcese again you were in Germany and now in the States I just keep following you around thanks for everything again It was is great working with you Holly well thanks for everything Dr Curtis Altmann Curtis you are one of the most amazing scientists I have met In particular thanks for your help with the Xeotron Microarrays Dr Yoichi Kato It was a real pleasure meeting you Thank you for guiding me through the indirect labeling the scanning and the data acquisition You were a great help Thanks for everything And last but not least thanks to Trent and Malcolm and everyone else in the department who has helped me 6 Anhang 158
32. Expression dieses Transkriptes vorzuliegen Alle weiteren Ergebnisse werden immer auf ZTO bezogen also relativ zu ZTO innerhalb der untersuchten Gruppe dargestellt Microarray Daten m ssen normalisiert werden Dies ist notwendig falls unterschiedliche Mengen Sonde benutzt wurden die gew hlten Farbstoffe unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaften haben oder es bei der Markierung der Sonden unterschiedliche Effizienzen gibt Eine Normalisierung der Daten durch das Lowess Verfahren erm glicht es einen so genannten MA Plot darzustellen Beim Lowess Locally weighted scatter smoothing wird eine lokal begrenzte quadratische Regression ber den gesamten Datensatz gefahren Hierf r ist extreme Rechnerleistung erforderlich 3 Ergebnisse 98 Die Methode hat den Vorteil dass eine Parameter unabh ngige Regression von Daten gemacht werden kann deren Verlauf sich nicht anhand von Regressionsformeln beschreiben l sst Da die Wahl der Fluoreszenzfarbstoffe konsistent war ZT 0 6 12 18 immer Alexa 555 594 647 488 konnte folgender Zusammenhang zwischen gew hltem Fluorophor und Effizienz der Fluoreszenzmarkierung festgestellt werden Maus Hypothalmus MA Lowess Kontrolltiere ZT 6 zu ZT 24 555nm 488nm 1 00 17 00 M 1 00 M Lowess 2 00 3 00 4 00 Abb 3 32 MA Plot von Alexa 555 zu Alexa 488 hybridisierten Sonden Der abgebildete MA Plot stellt die Differenz
33. Fluoreszenzmarkierte cDNA mit 20ul 3 M Natriumacetat pH 5 2 und 500u1 Ladepuffer mit Isopropanol versetzen und durch Vortexen mischen 2 Material und Methoden 60 2 Probe auf S N A P TM S ule laden und 1 min bei 14 000g zentrifugieren Durchfluss verwerfen die markierte cDNA ist nun an der Membran der S ule gebunden 3 700ul Waschpuffer mit Ethanol auf S ule pipettieren und 1min bei 14 000g zentrifugieren Durchfluss verwerfen 4 Waschvorgang 3 wiederholen Durchfluss verwerfen 5 S ule zum Trocknen 1min bei 14 000g Zentrifugieren dies entfernt alle Reste Ethanol die bei der darauf folgenden Elution st ren Durchfluss verwerfen 6 50ul DEPC behandeltes Wasser auf die S ule mit fluoreszenzmarkierter cDNA pipettieren und 1 min bei RT inkubieren dann 1min bei 14 000g zentrifugieren 7 Eluat 50ul mit 10ul 3 M Natrium Acetat pH 5 2 2ul Glykogen 20mg ml versetzen und mischen durch Pipettieren oder Vortexen 6 300p1 20 C Ethanol 96 hinzuf gen 7 Nun werden alle vier unterschiedlich fluoreszenzmarkierten Sonden vereinigt 8 Inkubation bei 20 C zum Fallen f r mindestens eine Stunde ggf ber Nacht 9 Durch Zentrifugieren bei 4 C f r 30 60min pr zipitieren Ethanol verwerfen 10 Einmal mit 250u1 75 Ethanol 20 C Waschen Ethanol verwerfen 11 Pr zipitierte fluoreszenzmarkierte cDNA f r 10 15 min bei RT an der Luft trocknen im Dunkeln an dieser Stelle werden 2ul jeder fluoreszenzmark
34. Hypothalamische Genexpression 132 4 6 1 Expression bekannter Uhr Gene 132 4 6 2 Circadiane Expression im Hypothalamus Microarrays 134 4 7 Microarray Technologie und Chronobiologie eine Evaluierung 142 5 Zusammenfassung 143 5 1 Summary 145 6Anhang iB 6 1 Abk rzungen 148 6 2 Glossar 150 6 3 Literaturverzeichnis 150 6 4 Danksagung 157 Tempus Fugit die Zeit fliegt 1 Einleitung 1 1 Biologische Rhythmen eine bersicht In der Chronobiologie griech Chronos Zeit wird nach sich periodisch wiederholenden biologischen Mustern oder Rhythmen gesucht Biologische Rhythmen sind allgegenw rtig und haben sich wahrscheinlich seit den ersten Urspr ngen allen Lebens entwickelt Sie stellen eine Anpassung eines Lebewesens an eine sich ver ndernde Umwelt dar Alle Lebewesen dieser Erde vom primitiven Einzeller bis hin zum komplexen S ugetier sind einer Vielzahl von chronobiologischen Einfl ssen ausgesetzt Der Wechsel von Tag und Nacht und die variierende Tagesl nge im Rahmen der Jahreszeiten sind nat rliche Zyklen unserer Erde sowie die Mondphasen und die Tiden Je nach der L nge des Zyklus also seiner Frequenz definierte ihn der Begr nder der Chronobiologie Aschoff 1981 als circadian etwa einen Tag lang circalunar etwa eine Mondphase lang circannual etwa ein Jahr lang oder circatidal etwa einen Gezeitenzyklus lang Wenn man die biologische Rhythmik auf circadiane Ph nomene basierend betrachtet kann man ein
35. M usen nahm die Anpassung an Hell Dunkel Verh ltnisse ab und die Fragmentierung der Aktivit t zu Ebenfalls dauerte eine Anpassung an neue Lichtverh ltnisse mit zunehmendem Alter l nger Einige Tiere zeigten unter DD Bedingungen einen biphasischen Aktivit tsrhythmus rhythm splitting mit zwei auseinanderweichenden Aktivit tsmaxima Die Wiederherstellung von LD eliminierte eine Aktivit tskomponente und stellte den urspr nglichen Rhythmus wieder her Dieses Ph nomen trat bei den MT Tieren am h ufigsten auf Die Expression des Uhr Gens Clock wurde in diversen neuronalen und peripheren Geweben wie z B Cerebellum olfaktorische Bulbi Hypothalamus Milz Leber Lunge Herz und Niere 5 Zusammenfassung 143 nachgewiesen es gab keinen Hinweis auf seine Expression im Hoden der Maus Es wurde festgestellt dass eine Variante des Genes als Spleissvariante nur in neuronalen Geweben der untersuchten M use vorkommt Ein hypothetisches Modell wurde entworfen indem diese Variante eine regulative Funktion an der Feinsteuerung der molekularen inneren Uhr hat Eine zu Beginn dieser Arbeit unbekannte Teilsequenz des Typ 2 Melatoninrezeptors wurde sequenziert Hierbei wurde ein Polymorphismus entdeckt der den Austausch einer Aminos ure Threonin gt Glutamat verursacht Ob dies die Bindungsf higkeit des Rezeptors f r Melatonin beeinflusst ist ungewiss Die Untersuchung der Genexpression in der Leber von Kontroll KR und MT Tieren mittels Micr
36. Melatoninrezeptoren anderer Spezies wie S ugetieren und V geln 1 Einleitung 11 Die Melatoninrezeptoren geh ren alle zur Familie der G Protein gekoppelten Rezeptoren GPCR Sie besitzen sieben alpha helicale Transmembrandom nen und einige Sequenzmotive die f r sie charakteristisch und hochkonserviert sind Zwei Rezeptortypen sind in S ugetieren vorhanden MT1 und MT2 bei V geln gibt es zus tzlich den Mellc Rezeptor aber keinen MT2 Rezeptor Ein weiterer Rezeptor mit 40 Sequenzhomologie mit den anderen Mitgliedern dieser Familie wurde kloniert allerdings bindet dieser Subtyp kein Melatonin und wird als MRR melatonin related receptor bezeichnet Basierend auf Bindungsstudien mit I 2 Iodomelatonin wurde ein zus tzlicher Melatoninrezeptor vorhergesagt Molinari et al 1996 neuere Studien haben allerdings ergeben dass es sich hierbei um eine Chinon Reductase 2 handelt die kein Mitglied der GPCR Superfamilie ist und ungewisse Funktion hat Die kodierende Region von allen drei bekannten Melatoninrezeptoren besteht aus zwei Exons jeweils getrennt durch ein gro es Intron 1 2 4 Verteilung der Melatoninrezeptoren Die Gewebeverteilung der Melatoninrezeptoren ist f r jede Spezies sehr spezifisch In niederen Vertebraten sind sie im ZNS weit verbreitet Dies ist bei V geln offensichtlich wo zwei Subtypen von Rezeptoren MT1 und Mellc zwar distinkt aber berlappend exprimiert werden Sie k nnten also wichtige neuro
37. Nutr 118 3 286 9 Oishi K H Fukui et al 2000 Rhythmic expression of BMAL1 mRNA is altered in Clock mutant mice differential regulation in the suprachiasmatic nucleus and peripheral tissues Biochem Biophys Res Commun 268 1 164 71 Oishi K K Miyazaki et al 2003 Genome wide expression analysis of mouse liver reveals CLOCK regulated circadian output genes J Biol Chem 278 42 41519 27 Okamura H S Miyake et al 1999 Photic induction of mPer1 and mPer2 in cry deficient mice lacking a biological clock Science 286 5449 2531 4 Oldani A L Ferini Strambi et al 1994 Melatonin and delayed sleep phase syndrome ambulatory polygraphic evaluation Neuroreport 6 1 132 4 Oster H S Baeriswyl et al 2003 Loss of circadian rhythmicity in aging mPer1 mCry2 mutant mice Genes Dev 17 11 1366 79 Oster H C Werner et al 2003 GMP dependent protein kinase Il modulates mPer1 and mPer2 gene induction and influences phase shifts of the circadian clock Curr Biol 13 9 725 33 Panda S M P Antoch et al 2002 Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock Cell 109 3 307 20 Pang S F F Tang et al 1984 Negative correlation of age and the levels of pineal melatonin pineal N acetylserotonin and serum melatonin in male rats J Exp Zool 229 1 41 7 Pappolla M A M Sos et al 1997 Melatonin prevents death of neuroblastoma ce
38. Primer Molek le vorliegen an denen das Enzym mit der Synthese beginnt Als Matrize dient die zuvor isolierte totale RNA in dieser ist zu einem Teil mRNA vorhanden Verwendeter Primer ist wahlweise ein Oligo d T Primer oder kurze Oligonukleotide variierender Sequenz meist Hexamere Ich verwendete einen Oligo d T Primer Den Vor und Nachteil von der einen ber die andere Methode habe ich an anderer Stelle untersucht Resuehr amp Spiess 2003 Material SuperScript M First Strand Synthesis System for RT PCR Invitrogen Oligo d T Primer im Kit enthalten 10 x Erststrang Puffer im Kit enthalten 0 1 M DTT im Kit enthalten dNTP Mix 10mM im Kit enthalten Superscript II Reverse Transkriptase im Kit enthalten 2 Material und Methoden 38 RNAse OUT im Kit enthalten Methode Je 2ug Gesamt RNA wurden mit 1 ul Oligo d T Primern versetzt mit DEPC Wasser auf 9ul aufgef llt f r 5 min auf 75 C erhitzt und dann bei Raumtemperatur 5min inkubiert Folgende Reagenzien wurden hinzupipettiert Reagenz Menge ul 10x RT Buffer 2 0 1M DTT 2 SS2 1 RNase Out 1 dNTPs 10mM 1 25mM MgCl 4 Der Reaktionsansatz wurde f r eine Stunde bei 42 C im Wasserbad inkubiert gefolgt von einer 15 min tigen Inaktivierung des Enzyms bei 75 C Abschliessend wurde der Ansatz durch Zugabe von 80ul DEPC Wasser auf 100 ul aufgef llt 2 10 Die Polymerase Kettenreaktion PCR Saiki et al 1988
39. Rolle Interessanterweise nehmen restriktiv gef tterte M use gegen ber ad libitum gef tterten nicht weniger sondern mehr Kalorien pro Gramm K rpergewicht und Lebensdauer auf Weindruch et al 1996 Dennoch leben sie l nger M glicherweise liegt dies daran dass KR M use ihre Nahrung und die daraus beziehbare Energie einfach optimaler nutzen als Kontrolltiere Bei Ratten und Rhesusaffen wurde beobachtet dass KR die K rpertemperatur senkt welches den Sauerstoffverbrauch reduziert Parallel dazu sind Triiodthyronin und growth hormone GH Konzentrationen verringert M glicherweise f hrt also ein hypometabolischer Zustand des K rpers zu der Verl ngerung der Lebensspanne Dies wird dadurch bekr ftigt dass poikilotherme Tiere und berwinternde S ugetiere ebenfalls l nger leben wenn die Umgebungstemperatur k lter ist Lane et al 1996 Sohal et al 1996 KR verlangsamt die Akkumulation oxidativer Sch den an DNA und Proteinen welche ma geblich an altersbedingen Erkrankungen und Degeneration beteiligt sein sollen Barja 2002 Auch bei der Unterdr ckung der Tumorentwicklung scheint KR eine Rolle zu spielen denn die Zellproliferation in vielen Geweben wird verz gert Lok et al 1988 Weindruch et al 1982 sehen eine wichtige Rolle in der St rkung des Immunsystems bei alternden Tieren mit Restriktionsf tterung 1 Einleitung 18 50 Ad libitum Control 40 S9 85 kcal wk SO 36 50 kc
40. Skalpell oder einem anderen geeigneten Gegenstand ausgeschnitten Nun kann das Gel aufgel st und die DNA unter Hochsalzbedingungen an eine Silica Matrix gebunden werden Agarose Reste werden weggewaschen und mit einem Niedrigsalzpuffer TE oder Wasser wird die DNA von der Matrix eluiert Material QlAquick Gel Extraction Kit 50 Kat Nr 28704 Heizblock Fisher Eppendorf Tischzentrifuge Methode Die ausgeschnittenen DNA Banden wurden gewogen mit 2 Vol 200ul 100mg Gel des Diffusionspuffers versetzt und f r 30min bei 50 C im Heizblock inkubiert Es wurde 1min bei 14 000Upm zentrifugiert und der berstand in ein frisches Mikrozentrifugenr hrchen berf hrt Der berstand wurde mit 3 Vol des Puffers QG versetzt gemischt und auf ein Zentrifugens ulchen pipettiert Nach 1min Zentrifugation bei 14 000Upm und Verwerfen des berstandes wurde mit 750ul Puffer PE gewaschen Das Zentrifugens ulchen wurde zum Trocknen erneut Imin bei 14 000Upm zentrifugiert Die DNA wurde in ein frisches Mikrozentrifugenr hrchen mit 50u1 RNAse freiem Wasser eluiert und dessen Konzentration photometrisch bestimmt Die Lagerung erfolgte bis zur Verwendung bei 20 C 2 Material und Methoden 48 2 14 Ligation von DNA in einen bakteriellen Vektor Theorie Um DNA Fragmente durch Bakterien zu vermehren k nnen diese in Plasmide kloniert werden die mit dem exponentiellen Wachstum der Bakterienzellen vervielf ltigt werden Mit dieser Methode
41. a thermostable DNA polymerase Science 239 4839 487 91 Sandyk R P G Anastasiadis et al 1992 Is postmenopausal osteoporosis related to pineal gland functions Neurosci 62 3 4 215 25 Sandyk R and G Awerbuch 1994 Pineal calcification and its relationship to the fatigue of multiple sclerosis Neurosci 74 1 4 95 103 Sandyk R and G I Awerbuch 1994 The relationship between melatonin secretion and serum cholesterol in patients with multiple sclerosis Int J Neurosci 76 1 2 81 6 Sangoram A M L Saez et al 1998 Mammalian circadian autoregulatory loop a timeless ortholog and mPer1 interact and negatively regulate CLOCK BMAL1 induced transcription Neuron 21 5 1101 13 Schwartz W J 1991 Further evaluation of the tetrodotoxin resistant circadian pacemaker in the suprachiasmatic nuclei J Biol Rhythms 6 2 149 58 Schwartz W J R A Gross et al 1987 The suprachiasmatic nuclei contain a tetrodotoxin resistant circadian pacemaker Proc Natl Acad Sci U S A 84 6 1694 8 Sharman E H K G Sharman et al 2004 Age related changes in murine CNS mRNA gene expression are modulated by dietary melatonin J Pineal Res 36 3 165 70 Sharman E H N D Vaziri et al 2002 Reversal of biochemical and behavioral parameters of brain aging by melatonin and acetyl L carnitine Brain Res 957 2 223 30 Sharman K G E H Sharman et al 2002 Dietary melatonin selectively rever
42. and retards aging in yeast Faseb J 14 14 2135 7 Jin X L P Shearman et al 1999 A molecular mechanism regulating rhythmic output from the suprachiasmatic circadian clock Cell 96 1 57 68 Jin X C von Gall et al 2003 Targeted disruption of the mouse Mel 1b melatonin receptor Mol Cell Biol 23 3 1054 60 Jockers R L Petit et al 1997 Novel isoforms of Mel1c melatonin receptors modulating intracellular cyclic guanosine 3 5 monophosphate levels Mol Endocrinol 11 8 1070 81 King D P and J S Takahashi 2000 Molecular genetics of circadian rhythms in mammals Annu Rev Neurosci 23 713 42 King D P M H Vitaterna et al 1997 The mouse Clock mutation behaves as an antimorph and maps within the W19H deletion distal of Kit Genetics 146 3 1049 60 King D P Y Zhao et al 1997 Positional cloning of the mouse circadian clock gene Cell 89 4 641 53 Klein D C M A Namboodiri et al 1981 The melatonin rhythm generating system developmental aspects Life Sci 28 18 1975 86 6 Anhang 152 Kolker D E H Fukuyama et al 2003 Aging alters circadian and light induced expression of clock genes in golden hamsters J Biol Rhythms 18 2 159 69 Kopp M H Meissl et al 1997 The pituitary adenylate cyclase activating polypeptide induced phosphorylation of the transcription factor CREB CAMP response element binding protein in the rat suprachiasm
43. aus dem genomischen Aufbau des murinen CLOCK Transkriptes Exon 18 wird im M usestamm B6C3F1 alternativ gesplei t 3 Ergebnisse 90 Die identifizierte A18 Spleissvariante habe ich in der Genbank unter folgendem Eintrag ver ffentlicht AY118227 Mus musculus CLOCK mRNA partial cds alternatively spliced Resuehr amp Olcese 2002 Als Referenzsequenz diente NM 007715 Mus musculus circadian locomoter output cycles kaput Clock mRNA Wilsbacher et al 2000 3 2 4 Kontroll PCR mit Haushaltsgen Primern Abb 3 25 Kontroll PCR mit HPRT Primern in verschiedenen Geweben der Maus M 200bp Gr enstandard 1 2 Hoden 3 4 Cerebellum 5 6 olfaktorische Bulbi 7 8 Hypothalamus 9 10 Leber 11 12 Lunge 13 Milz In allen mit Haushaltsprimern getesteten cDNAs lief sich eine spezifische Bande von 180bp HPRT Primer amplifizieren Bei der Nutzung von RP27 Primern ICycler wurde entsprechend ein 300bp Produkt amplifiziert Weitere Gelelektrophoresen mit Haushaltsgen PCRs und Negativkontrolle wurden durchgef hrt auf die Darstellung weiterer Ergebnisse dieser Art wird verzichtet da sie keinen weiteren explikativen Wert haben die Negativkontrollen waren immer negativ 3 Ergebnisse 91 3 3 Microarray Untersuchungen an der Leber der Maus Die gewonnen Daten beziehen sich nur auf einen Zeitpunkt des circadianen Tages ZT 6 Die Microarray Untersuchung an der Leber von M usen diente zum Test der Methode Alle Graphen werden von mir
44. beachten hier ist wieder die KR Gruppe denn nach der Phasenverz gerung gibt es einen berschuss an Aktivit t Abb 3 16 dritte bis f nfte Nacht dargestellt Ich w rde dies als berkompensation bzw erh hte Erregbarkeit nach dem ver nderten Zeitgeber Stimulus werten Ferner ist aus Abb 3 14 ersichtlich dass die Variabilit t an Gesamtaktivit t von Nacht zu Nacht bei dieser Gruppe recht hoch ist Au erdem ist das Verh ltnis von Tag zu Nachtaktivit t bei dieser Gruppe am schlechtesten Die Menge an Aktivit t am ersten Tag ist fast so hoch wie die in der ersten Nacht nach der Phasenverz gerung welches ein Ausdruck der starken Fragmentierung ist Die MT Tiere zeigen ebenfalls eine schnelle Anpassung an die neuen Lichtverh ltnisse ohne einen folgenden berschuss an Aktivit t wie bei den KR Tieren Auch bei anderen Nagetieren wurde ein positiver Effekt von Melatonin auf die Anpassung an neue Lichtverh ltnisse beschrieben Van Reeth et al 2001 Ein weiteres Ph nomen des untersuchten M usestammes ist das so genannte rhythm splitting das Aufspalten der Aktivit t in zwei Maxima ber den circadianen Tag Abb 3 7 Es gibt die Theorie dass die circadiane Uhr in nachtaktiven Nagetieren von zwei Oszillatoren gesteuert wird Abe et al 2001 Daan et al 1978 2001 beobachteten dies zuerst bei Hamstern unter LL Bedingungen Dauerlicht 4 Diskussion 122 Die lokomotorische Aktivit t spaltet sich hierbei in zwei Kom
45. den alten Kontrolltieren ist die Bmall Expression um ZT6 verglichen mit den anderen Gruppen sehr niedrig 3 Ergebnisse 114 CLOCK Expression im Hypothalamus der Maus 2 00E 06 1 80E 06 1 60E 06 1 40E 06 1 20E 06 1 00E 06 Kontrolle KR 8 00E 07 ji Melatonin 6 00E 07 normalisierte Transkriptmenge k Alt 4 00E 07 2 00E 07 0 00E 00 eo o 5 u e ZT Abb 3 47 mCLOCK Expression im Hypothalamus der Maus Gemessen mittels Realtime PCR Das mCLOCK Transkript zeigt scheinbar eine circadiane Schwankung mit einem Maximum um ZT 12 18 Allerdings sind die Standardabweichungen so gro dass nicht eindeutig von einer circadianen Rhythmik gesprochen werden kann Melatoninrezeptoren MT1 R Expression im Hypothalamus der Maus 6 00E 03 5 00E 03 4 00E 03 Kontrolle 3 00E 03 SE i Melatonin Alt 2 00E 03 normalisierte Transkriptmenge 1 00E 03 0 00E 00 0 6 12 18 0 ac ZT Abb 3 48 mMT1 Rezeptor Expression im Hypothalamus der Maus Gemessen mittels Realtime PCR 3 Ergebnisse 115 MT2 R Expression im Hypothalamus der Maus 6 00E 03 5 00E 03 4 00E 03 Kontrolle H KkR t Melatonin A Alt 3 00E 03 2 00E 03 normalisierte Transkriptmenge 1 00E 03
46. dies f r sehr unwahrscheinlich denn Cyp2a4 und andere P450 Enzyme werden auch durch andere Mitglieder der PAR Familie von Transkriptionsfaktoren wie TEF thyroid embryonic factor und HLF hepatic leukemia factor induziert Lavery et al 1999 Ferner wird die Fetts uresynthetase auch circadian gesteuert Oishi et al 2003 welche bei KR Tieren herabgeregelt wird Die reduzierte Expression von Fasn Fetts uresynthetase und Fabpl Fetts urebindendes Proteinl deuten auf eine reduzierte Kapazit t zur Fetts urebiosynthese Die Reduktion von Fasn und Fabpl durch KR wurden ebenfalls berichtet Dhahbi et al 2004 Cao et al 2001 Das Transkript Thrsp SPOT14 welches durch KR stark 4 fach herabgeregelt wird ist durch das Schilddr senhormon induzierbar Wenig ist bisher ber dieses Transkript bekannt es wird jedoch angenommen dass es eine Rolle in der Lipogenese spielt Grillasca et al 1997 Da die Niveaus an Schilddr senhormon durch KR gesenkt werden Herlihy et al 1990 kann die niedrige Thrsp Transkription so erkl rt werden Best rkt wird dies weiter durch Beobachtungen von Dhahbi et al 2004 hier wurden auch abregulierte Thral thyroid hormone receptor alpha I und Ttr ein Transportmolek l f r T3 in Nagetieren Expressionen in der Leber von KR M usen festgestellt Das Molek l Slc2lal ist am Transport von organischen Anionen durch die Hepatozytenmembran und an der Bildung von Gallensalzen beteiligt Wolters et al
47. ersten dargestellt also in der Reihenfolge 1 2 2 3 3 4 Diese Darstellungsmethode wurde auch bei der Anfertigung dieser Arbeit verwendet Das circadiane System ist sehr flexibel es passt sich einem starken exogenen Zeitgeber Licht an und ver ndert seine Phase entsprechend Appliziert man w hrend eines Freilaufes einen Lichtpuls so wird je nachdem wann dieser erfolgt das System vor oder zur ckgestellt Abb 1 1 Phasenbeschleunigung oder Phasenverz gerung Die Richtung und St rke einer Phasenverschiebung h ngt davon ab zu welcher Zeit innerhalb der endogenen Phase ein Zeitgeberreiz appliziert wird Abb 1 1 1 Einleitung 2 1 Freilauf unter Tage Dauerdunkel 10 245h Synchronisation mit einem Zeitgeber 20 T 24 0h 30 Phasenverschiebung des Zeitgebers 40 Freilauf unter Dauerdunkel gt on gt s lt _ Phasenbeschleunigung ig eme SUL Ta Phasenverz gerung 0 24 48 Zeit Std Abb 1 1 Darstellung eines typischen Aktogramms mit Beispielen diverser Zeitgeber Ver nderungen Die ersten 10 Tage befindet sich das Tier im Freilauf mit einer endogenen Periode Tau von 24 5 h Es folgen 10 Tage Synchronisation unter 12h LD Licht Dunkel Zyklus Eine Phasenbeschleunigung wird durch Umstellung der Lichtperiode erreicht gefolgt von Freilauf unter DD Dauerdunkel W hrend des Freilaufes kommt es zuerst durch einen Lichtpuls zu einer Phasenbeschleunig
48. et al 1991 Niere Leber Abb 1 3 Schema der Interaktionen von Master und Slave oscillators Nach Reppert amp Weaver 2002 ver ndert 1 Einleitung 5 Die wichtigsten Mechanismen f r die Kommunikation des SCN mit seiner Umgebung bilden Natrium abh ngige Aktionspotentiale Blockiert man diese durch Tetrodotoxin oder Barbiturate wird die Uhr auDer Kraft gesetzt und die Tiere werden f r die Zeit der Behandlung im Dauerdunkeln DD arrhythmisch Schwarz et al 1987 amp 1991 Es wird davon ausgegangen dass circadiane Rhythmen bei S ugetieren durch ein hierarchisch aufgebautes Multioszillatorsystem gesteuert werden Der Hauptoszillator ist hierbei der paarige SCN mit seinen Uhr Zellen Aber auch andere Hirnareale wie Cerebellum Cortex olfaktorische Bulbi und periphere Organe wie Leber Milz und Niere besitzen circadiane Oszillatoren slave oscillators die das Verhalten und die Physiologie eines Lebewesens mitsteuern Lavery et al 1999 Die Phase der slave oscillators ist hierbei um einige Stunden gegen ber der Phase des SCN versetzt Scheaman et al 1997 Zylka et al 1998 Alle diese peripheren Oszillatoren unterliegen der Kontrolle des SCN und werden von diesem synchronisiert Die Natur des SCN abh ngigen Signals dass zur Synchronisation beitr gt ist bis heute unklar Dass es sich hierbei um Melatonin handelt ist unwahrscheinlich denn auch bei Melatonin defizienten Mausst mmen gibt es neuronale
49. k nnen binnen kurzer Zeit ber Nacht sehr viele Kopien eines gew nschten DNA Fragmentes hergestellt werden mehr als in einer PCR Dies ist f r einige Anwendungen wie z B das Herstellen von Sonden notwendig Das Verkn pfen von DNA Fragmenten mit dem Enzym DNA Ligase versteht man als Ligation DNAs mit komplementiren einzelstr ngigen Enden k nnen ber diese eine Basenpaarung eingehen Sie werden deshalb als koh siv oder klebrig sticky ends bezeichnet ber diese Enden k nnen DNAs durch die DNA Ligase fest verbunden werden Die DNA Ligase katalysiert die Bildung neuer Phosphodiesterbr cken Eine Eigenschaft der Tag Polymerase ist es an die 5 Enden der PCR Produkte ein zus tzliches Adenin Nukleotid anzuh ngen Bringt man ein solches Produkt in Anwesenheit einer Ligase mit einem geeigneten Vektor mit T berhang bei pDRIVE ein U berhang wird das Fragment in den Vektor ligiert DNA Ligationen haben in vivo eine wichtige Bedeutung bei der DNA Replikation und Reparatur In vitro werden verschiedene DNA Fragmente durch die Ligation zu gr eren Molek len verkn pft Die T4 DNA Ligase ligiert sowohl berlappende Enden sticky ends als auch glatte Enden blunt ends Der Vektor ist vor der Klonierung linear durch das Einsetzen eines DNA Fragmentes wird er rezirkularisiert T7 promoter 4 BamHI EccRI pDrive Cloning Vector 3 85 kb U er Ecol Sall Accl Hin cll Hin dlll 4 E Xho ino Avrll Styl PIC Fy Nhel SP
50. k nnte die Sensitivit t f r Zeitgeberreize ber das Glutamat PACAP System erh hen und somit schnellere Anpassungen an Phasenverschiebungen beg nstigen 4 Diskussion 137 Die alten Tiere hatten um ZT6 von allen Gruppen die h chste Expression des Glutamatrezeptors zeigen aber eine schlechtere Anpassung an wechselnde Lichtverh ltnisse Da im alternden Tier die Sehfahigkeit abnimmt k nnte dies also eine Kompensation des verminderten photopischen Einganges sein Natriumabh ngige Aktionspotentiale bilden das prim re Signal mit dem der SCN circadiane output Signale an andere Hirnregionen vermittelt und sind f r seine Rolle als Schrittmacher essentiell Repper amp Weaver 2001 Mindestens zwei ionische Mechanismen sind unter der Kontrolle des SCN ein L type Ca und ein K Strom der essentiell f r die Aufrechterhaltung des Membranpotentials ist Pennartz et al 2002 Die summierte Aktivit t dieser Str me k nnte zur starken Entladungsrate in den SCN Neuronen beitragen Welsch et al 1995 Wie die circadiane Variation in der SCN Entladung zustande kommt ist bisher unklar Reppert 2002 schl gt vor dass Untereinheiten von Ionenkan len rhythmisch reguliert sein k nnten und somit die tags ber hohe nachts niedrige Entladungsrate beeinflussen Die Regulierung der Untereinheiten Gja3 GjalO und des spannungsabh ngigen Natriumkanals Scnla im Hypothalamus k nnte diese Annahme festigen Ein Teil der Signalmolek le aus SCN Ef
51. mPer2 Expression im Hypothalamus der Maus Gemessen mittels Realtime PCR Das Transkript mPer2 erreicht in allen untersuchten Gruppen seine maximale circadiane Expression um ZT 12 Zwischen den Gruppen konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden Bei den alten Tieren wurde an ZT 6 weniger Transkript festgestellt als bei den anderen Gruppen Ob dies ein Effekt verringerter Amplitude im Altern oder einfach durch eine m gliche Verschiebung der Phase bedingt wird ist unklar 3 Ergebnisse 112 1 20E 01 1 00E 01 8 00E 02 6 00E 02 4 00E 02 normalisierte Transkriptmenge 2 00E 02 0 00E 00 Cryptochrome1 Expression im Hypothalamus der Maus T 9 Kontrolle li KR t Melatonin k Alt 6 12 18 0 ZT 0 Abb 3 44 mCry1 Expression im Hypothalamus der Maus Gemessen mittels Realtime PCR Das Transkript mCry1 erreichte in allen Gruppen um ZT12 seine maximale Expression Die hohen Standardabweichungen und der flache circadiane Verlauf bei den Kontrolltieren lassen keine signifikante Rhythmik erkennen Die h chste circadiane Amplitude scheint bei den MT Tieren vorzuliegen ist jedoch nur an ZT18 signifikant gegen ber den anderen Gruppen Die alten Tiere weisen an ZT 6 weniger Cry Transkript auf als die Vergleichstiere 5 00E 02 Cryptochrome2 Expression im Hypothalamus der Maus
52. rliche Mutation im sibirischen Hamster Liu et al 1997 ist der MT2 Rezeptor nicht funktionell Dennoch zeigen diese Tiere eine ungest rte saisonale Reproduktion und circadiane Rhythmik als Reaktion auf Melatoningaben Weaver et al 1996 Dieses l sst vermuten dass der MT2 Rezeptor f r die Vermittlung dieser Reaktionen irrelevant ist Der MT2 Rezeptor ist berhaupt sehr niedrig exprimiert seine physiologische Rolle ist noch nicht vollst ndig gekl rt Zu Beginn dieser Arbeit 2001 gab es noch keine vollst ndige murine MT2 Sequenz Erst letztes Jahr wurde die vollst ndige Sequenz ver ffentlicht und eine Studie mit MT2 KO M usen vorgestellt Jin et al 2003 Demnach ist der MT2 Rezeptor funktionell relevant und vermittelt Melatonineffekte bei einer h heren Konzentration als f r MT1 notwendig MT2 KO M use sind fertil und zeigen einen normalen circadianen Ph notyp unter LD und DD Bedingungen Die Inhibierung der SCN Entladungsraten durch Melatonin ist in MT2 KO M usen nicht beeintr chtigt im Gegensatz zum MTI Rezeptor KO Beide Rezeptortypen tragen zur Regulierung der CREB Phosphorylierung bei Melatonin reduziert schon in niedrigen Konzentrationen die PACAP induzierte CREB Phosphorylierung Kopp et al 1997 Von Gall et al 1998 In Wildtyp Tieren reichen physiologische Konzentrationen von Melatonin 1nM aus um die Menge an phosphoryliertem CREB um 70 zu reduzieren In MTI KO M usen fehlt dieser Effekt nur bei h her
53. und periphere circadiane Oszillationen der Genaktivit t Zylka et al 1998 Als synchronisierende Faktoren werden auch arginines Vasopressin AVP und GABA aus dem SCN in Erw gung gezogen AVP aus dem SCN k nnte in die Steuerung der Hypothalamus Hypophysen Nebennieren Achse bei Ratten involviert sein und somit die Korticosteronaussch ttung aus den Nebennieren bedingen hnlich k nnte AVP zur Aktivierung der HPG Achse Hypothalamische Hypophysen Gonaden Achse beitragen der die Fertilit t unterliegt GABA Freisetzung aus dem SCN scheint die Melatoninsynthese zu regulieren indem es den stimulatorischen Effekt der paravertrikul ren Nuclei inhibiert Letztendlich gibt es noch eine unbekannte diffundierbare Substanz des SCN Silver et al 1996 die bei SCN l sionierten Hamstern Rhythmizit t wiederherstellen kann 1 1 2 Die molekulare innere Uhr Das bisher vollst ndigste Bild ber die Funktionsweise der molekularen circadianen Uhr wurde am Modell der Fruchtfliege Drosophila melanogaster erreicht Williams et al 2000 Es gibt zwischen der Fruchtfliege und der Maus gro e bereinstimmungen in den Kernkomponenten der inneren Uhr 1 Einleitung 6 Das molekulare Netzwerk der innern Uhr besteht aus einer transkriptionellen translationalen R ckkopplungsschleife feedback loop Diese R ckkopplungsschleifen interagieren miteinander auf positive und negative Art Abb 1 4 Grundlegende Elemente der circadianen
54. unterschiedlichen Fluorophoren zeitgleich markiert um die vier Zeitpunkte des Tages oder ggf andere experimentelle Fragestellungen zu untersuchen Material SuperScript M Indirect cDNA Labeling Core Kit Invitrogen Ca 20ug Total RNA guter Integrit t pro zu untersuchender Probe Oligo dT 29 Primer im Kit enthalten 10 mM dNTP mix incl Amino modifizierten Nukleotiden im Kit enthalten 5X Erst Strang Puffer im Kit enthalten 0 1 M DTT im Kit enthalten RNaseOUT im Kit enthalten SuperScript II Reverse Transkriptase im Kit enthalten DEPC behandeltes Wasser im Kit enthalten NNaOH NHCI 3M Natrium Acetat pH 5 2 Wasserbad oder Inkubator auf 46 C und 70 C gestellt Eis 0 5 ml RNAse freie Reaktionsgef e 2 Material und Methoden 56 Methode Die RNA wird durch Ethanol Natriumacetat F llung pr zipitert gewaschen und an der Luft bei RT getrocknet Auf die getrocknete RNA im 1 5ml Reaktionsgefa werden folgende Reagenzien pipettiert 16ul DEPC behandeltes Wasser 2ul Oligo dT 29 Primer Das Reaktionsgef wird f r 5 min bei 70 C inkubiert anschlie end f r mindestens 1 min auf Eis gestellt Folgende Reagenzien werden in das Reaktionsgef pipettiert Reagenz Menge ul 5X Erst Strang Puffer 6 0 1 M DTT 1 5 10 mM dNTP mix 1 5 RNaseOUT 40U ul 1 SuperScript III 400U ul 2 Endvolumen 30ul Der Inhalt des Reaktionsgef es wird du
55. unverbrauchte dNTPs Primer und Enzyme aus der Reaktion entfernt Eine schnelle zuverl ssige Methode ist das Benutzen des Qiagen PCR Purifikation Kit welches mit Zentrifugens ulchen operiert Hierbei wird die DNA an eine Silikamembran gebunden gewaschen und danach sauber in Wasser oder einem Niedrigsalzpuffer eluiert Material QIAquick PCR Purification Kit Qiagen Methode Zu 50ul PCR Produkt wurden 250ul Puffer PB gegeben und gemischt Die Probe wurde auf ein Qiaquick S ulchen in einem 2ml Sammelgef geladen und 1min bei 14 000 Upm zentrifugiert Nach Verwerfen des Durchflusses wurde mit 750ul Puffer PE gewaschen 1min bei 14 000 Upm Durchfluss verworfen Anschlie end wurde die DNA in einem frischen 1 5ml Mikrozentrifugenr hrchen in 50ul RNAse freiem Wasser eluiert und dessen Konzentration photometrisch bestimmt Die Lagerung erfolgte bis zur Verwendung bei 20 C 2 Material und Methoden 47 2 13 Reinigung von DNA Fragmenten aus dem Gel Theorie Wenn es bei einer PCR dazu kommt dass mehrerer Produkte amplifiziert und sequenziert werden sollen m ssen diese getrennt werden Hierzu ist es notwendig die DNA Fragmente unterschiedlicher Gr e aus dem Agarosegel zu isolieren Im Anschluss an eine Gelelektrophorese vorzugsweise in TAE Puffer weil das Borat im TBE Puffer mit den meisten Reinigungsmethoden interferiert wird das Gel auf einen UV Tisch gelegt und die DNA Banden von Interesse mit einem sterilen
56. zu vergleichen Kategorien von circadian exprimierten Transkripten im Hypothalamus der Maus H Immunsystem E Metabolisch O Uhr OZellzyklus E Hitzeschock El Rezeptoren E Signaltransduktion Ellonenkan le E Transporter Bl Sonstige Abb 4 6 2 1 Kategorien circadian exprimierter Transkripte im Hypothalamus der Maus aus Microarray Experimenten erhalten Von den untersuchten 1000 Genen erf llten nach Datenreduktion noch 4 3 das Kriterium f r circadian reguliert 43 Gene In anderen Microarray Studien werden je nach Spezies 4 Diskussion 136 und Gewebe bis zu 8 8 circadian regulierte Transkripte berichtet Akhtar Reddy et al 2002 es kommen aber auch nur 2 vor Duffield Best et al 2002 Dies ist stark vom untersuchten Gewebe und vor allem von der Art der verwendeten Microarrays abhingig Aus der Kategorie Signaltransduktion werden u a eine Adenylatkinase AK4 und das Oncogen Junb im Hypothalamus rhythmisch exprimiert Diese beiden Transkripte wurden in der M useleber von Oishi und Mitarbeitern 2003 ebenfalls als circadian exprimiert beschrieben f r den Hypothalamus ist diese Information neu Im Promotorbereich von Junb gibt es zwei putative E Boxen ein Hinweis auf eine positive Steuerung durch CLOCK Bmall Ob im Promotor von AK4 ebenfalls E Boxen vorhanden sind ist nicht bekannt Auch das Gen Cyclin T1 besitzt eine E Box und ist im Hypothalamus wie in der Leber rhythmi
57. 0 h her als bei Kontrolltieren Insulin agiert als Mediator in der Kommunikation zwischen dem peripheren endokrinen System und dem Gehirn ber verschiedene Teilschritte der Neuroendokrinen Achse Unger amp Betz 1998 Intracerebroventrikul re oder hypothalamische Infusion von Insulin stoppt die Nahrungsaufnahme anorexigenischer Effekt und verursacht eine Gewichtsreduktion leptogenisch bei Nagetieren und Primaten McGowan et al 1990 Schwartz et al 1992 Es gibt zunehmende Hinweise darauf dass Insulin diverse metabolische neurotrophe neuromodulatorische und neuroendokrine biologische Effekte vermittelt Barbaccia et al 1982 Boyd et al 1986 Duarte et al 2003 Die beobachtete circadiane Insulinrezeptorexpression ist in Antiphase zu der angenommenen Insulinsekretion die erst nach Nahrungsaufnahme steigt Dies w rde bedeuten dass der Insulinrezeptor durch seinen Liganden negativ reguliert wird Eine St rung in der Verf gbarkeit von Hirn Insulin oder der Signal bertragung ber seinen Rezeptor f hrt zu schwerwiegenden Erkrankungen wie z B Diabetes mentale oder reproduktive St rungen und 4 Diskussion 139 schwerem bergewicht St rungen des circadianen Systems k nnten ebenfalls den Insulin Signalweg beeintr chtigen und zu entsprechenden Erkrankungen f hren Diverse Transkripte von Transportmolek len der Kategorie Slco waren im Hypothalamus circadian reguliert Amplitude und Phase waren hierbei variabel In de
58. 0 00E 00 0 6 12 18 0 Abb 3 49 mMT2 Rezeptor Expression im Hypothalamus der Maus Gemessen mittels Realtime PCR F r beide untersuchten Melatoninrezeptoren konnte keine signifikante circadiane Expressionsschwankung ermittelt werden Die flache Amplitude gepaart mit hohen Standardabweichungen erlaubt es nicht eine konkrete Aussage zu machen Auff llig wenn auch nicht signifikant ist die scheinbar h here Rezeptorexpression bei den alten Tieren 3 Ergebnisse 116 Output Gene der circadianen Uhr 1 20E 00 1 00E 00 8 00E 01 6 00E 01 4 00E 01 normalisierte Transkriptmenge 2 00E 01 0 00E 00 AVP Expression im Hypothalamus der Maus Kontrolle E KR ir Melatonin ir Alt ZT Abb 3 50 Expression von arginin Vasopressin Transkript im Hypothalamus der Maus Gemessen mittels Realtime PCR Die Untersuchung von AVP mittels Microarrays Abb 3 36 zeigte eine circadiane Expression mit Maximum an ZT 12 sowie eine Verringerung der Expression bei MT Tieren Tab 3 3 Dies best tigte sich durch die Realtime PCR Untersuchungen Die AVP arginine vasopressin MRNA zeigt bei dem Kontroll und KR Tieren ein Maximum an ZT12 Die circadiane Amplitude scheint bei den KR Tieren etwas h her zu sein als bei den Kontrolltieren Die AVP Expression der MT Tiere verl uft antiphasisch dazu Sie erreicht ein Minimum an ZT12 und ein Maximum an ZTO 3
59. 03 16 03 Print Date January 21 2003 Fluorescence F1 20 0 0 Y 3l T 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Tr 38 0040 0 425 45 0 47 5 500 52 5 55 0 575 60 0 62 5 650 67 5 700 725 750 77 5 800 825 85 0 875 900 925 96 0 Temperature C Abb 2 4 Darstellung einer Schmelzkurve der zuvor gezeigten PCR Produkte Alle Produkte schmelzen bei derselben Temperatur es wurde also ein Amplifikat gebildet Material Hamburg Lightcycler Instrument Roche Lightcycler Kapillaren Roche Lightcycler Software 3 0 Roche QIAGEN SYBR Green oder BioRad Quantitect SYBR Green Mix Kapillar K hlblock Roche 2 Material und Methoden 43 Tallahassee USA BIORAD iCycler Instrument BIORAD iCycler Software IQ BIO RAD SYBR Green Supermix QuantiTect SYBR Green PCR Kit Qiagen PCR Plates 96 Well Kat Nr 2239441 BIO RAD iCycler 2 Material und Methoden 44 Methode Reaktionsansatz Lightcycler Roche und Qiagen Reagenzien Anzahl der Reaktionen 1 n 2x Quantitect Mix 12 ul xnul 5 Primer 10 uM 1 ul xnul 3 Primer 10 uM 1 ul xnul cDNA Template Menge variiert x ul xnul H20 X ul x nul X 25 ul Standard Thermoprofil der PCR im Lightcycler 1x 95 C 15 min Hitzeaktivierung DNA Polymerase Hot Start 95 C 15s 40x lt 60 C 30 s die annealing Temperatur ist Primerspezifisch 72 C 60s 1x Schmelzkurve Nach der PCR wurde der
60. 196 der lediglich als Vehikel diente wurden sowohl die Normal und die KR Tiere ebenfalls mit Alkohol in der gleichen Konzentration im Trinkwasser gef ttert Die Tiere wurden f r die ersten 14 Wochen w chentlich danach 14 t glich gewogen um den Verlauf und Erfolg der applizierten Restriktionsern hrung zu verfolgen und ggf intervenieren zu k nnen Insgesamt wurden zwei wie oben beschriebene Versuchsreihen mit 60 Tieren im Abstand von eineinhalb Jahren durchgef hrt Es wurden insgesamt also 120 Tiere aus diesen Gruppen untersucht auBerdem wurden aus der ersten Versuchsreihe 6 Normaltiere brig behalten und noch einige Monate altern lassen es wurden ein paar Tiere im berschuss gekauft Die 6 Normaltiere aus der ersten Versuchsreihe hatten bei Ende des zweiten Versuchs ein Alter von 30 Monaten Ich beziehe mich in dieser Arbeit allerdings ausschlie lich auf Daten der zweiten Versuchsreihe denn das gewonnene Tiermaterial aus dem ersten Versuch wurde gr tenteils f r die Anfertigung einer anderen Dissertation verwendet Da ein Teil der Ergebnisse in den USA mit anderen technischen Ger ten und Methoden gewonnen wurde als in Hamburg kommt es vor dass Ger te gleicher Funktion oder gleiche Reagenzien anderer Hersteller aufgef hrt werden 2 2 T tung und Gewebeentnahme Die T tung der Tiere erfolgte im Alter von 14 Monaten 6 Tiere hatten ein Alter von 30 Monaten Es wurde zu 4 Zeitpunkten Zeitgeber Zeit ZT 0 6 12 und 18 e
61. 2 und Glucose induzierte Expression von Wachstumsfaktoren McClain et al 1992 Glucosamine die Produkte der GFAT Aktivit t k nnen den Effekt von Glucose mimen Im Hypothalamus von KR Tieren scheinen diese beiden Enzyme des Stoffwechsels eine hervorgehobene Rolle zu spielen denn bei Kontroll und MT Tieren ist bei diesen kaum eine tageszeitliche Variation zu erkennen Dies entspricht einer geringeren Bedeutung dieser metabolischen Wege in neuronalem Gewebe bei diesen Gruppen Die restriktive F tterung scheint also auch in neuronalen Geweben stoffwechselrelevante Transkripte zu beeinflussen blicherweise geh ren zu Effekten des Alterns bei M usen eine Ver nderung der Expression vieler Transkripte aus diversen Kategorien Diese Ver nderungen sind durch KR gr tenteils 4 Diskussion 140 verhinderbar Metabolische Enzyme aus der mitochondriellen Atmungskette sind im Alter erh ht welches zu vermehrter Bildung von Sauerstoffradikalen f hren kann Sohal et al 1996 Einige NADH ubiquinon oxidoreduktasen Cytochrom c Oxidasen und Untereinheiten von ATP Synthasen wurden als erh ht im murinen Hypothalamus beschrieben Jiang et al 2001 Leider existierten zum Zeitpunkt der Anfertigung dieser Arbeit keine Studien in denen mehrere Zeitpunkte und Behandlungen untersucht wurden Ferner wurde wie erw hnt meist nicht einmal die Zeit der Probennahme erw hnt Die meisten der berichteten Effekte sind extrem an den Beobachtungszeitpunkt ge
62. 2 mutant mice in constant light and dynamics of Per1 and Per2 gene expression under long and short photoperiods J Biol Rhythms 17 3 202 9 Stephan F K J M Swann et al 1979 Entrainment of circadian rhythms by feeding schedules in rats with suprachiasmatic lesions Behav Neural Biol 25 4 545 54 Stephan F K J M Swann et al 1979 Anticipation of 24 hr feeding schedules in rats with lesions of the suprachiasmatic nucleus Behav Neural Biol 25 3 346 63 Stokkan K A K O Nonaka et al 1991 Low temperature stimulates pineal activity in Syrian hamsters J Pineal Res 10 1 43 8 Int J Int J 6 Anhang 155 Stokkan K A R J Reiter et al 1991 Food restriction retards aging of the pineal gland Brain Res 545 1 2 66 72 Stokkan K A R J Reiter et al 1991 Endocrine and metabolic effects of life long food restriction in rats Acta Endocrinol Copenh 125 1 93 100 Storch K F O Lipan et al 2002 Extensive and divergent circadian gene expression in liver and heart Nature 417 6884 78 83 Stout R W 1990 Insulin and atheroma 20 yr perspective Diabetes Care 13 6 631 54 Sturner W Q H J Lynch et al 1990 Melatonin concentrations in the sudden infant death syndrome Forensic Sci Int 45 1 2 171 80 Sumova A M Jac et al 2003 Clock gene daily profiles and their phase relationship in the rat suprachiasmatic nucleus are affect
63. 2002 Seine Herabregulierung k nnte mit der ern hrungsbedingt verringerten Gallenproduktion bei KR Tieren zusammenh ngen Unterst tzt wird diese Annahme durch das Fehlen eines signifikanten Einflusses von Melatonin 4 Diskussion 132 Durch Melatonin wurden keine Transkripte sehr stark beeinflusst Induziert wurden u a P4ha2 procollagen prolin 2 oxoglutarat 4 oxygenase S1c25al2 ein mitochondriales Transportmolek l das bereits diskutierte Enzym Cy2a4 Mell eine Monoglyceridlipase und interessanterweise ein Transkript des Zellzyklusses Cyclin M2 Cnnm2 Zu den von KR bekannten Effekten geh rt die Induktion von Genen die mit Apoptose und Zellwachstum assoziiert werden Die Induktion von Cyclin in der Leber als potentiell mitotisches Gewebe w rde ich als positiv deuten denn abgestorbene Hepatozyten k nnten schneller durch neue ersetzt werden Die Herunterregulierung des Transkriptes Slc37 welches das einzige ist dass hnlich stark wie durch KR reguliert wurde muss auf einem ganz anderen Mechanismus beruhen S1c37 transportiert Glycerol 3 Phosphat in die Hepatozyten Es ist von KR bekannt dass die enzymatische Fahigkeit zur Gluconeogenese und zur Verwertung von Nebenprodukten des extrahepatischen Proteinkatabolismus zur Energiegewinnung gesteigert wird Die enzymatische Kapazit t zur Glycolyse wird verringert Cao et al 2001 Es k nnte also bei den KR Tieren sein dass die Repression von Slc37 eine Folge von verringerter
64. 34 AJ006341 for peroxisomal integral membrane protein PMP34 Ppic NM 008908 peptidylprolyl isomerase C Ppic mRNA ProstacyIR D26157 Mouse prostacyclin receptor mRNA Ptel NM_133240 peroxisomal acyl CoA thioesterase 1 Ptel mRNA Scnla NM_018733 sodium channel voltage gated type I alpha Slc4a10 NM_033552 solute carrier family 4 sodium bicarbonate S1c7a12 pending NM 080852 solute carrier family 7 cationic amino acid Sncb NM 033610 synuclein beta Sncb mRNA Tgfb3 NM_009368 transforming growth factor beta 3 Tgfb3 mRNA Timm9 NM_013895 translocase of inner mitochondrial membrane 9 homolog Tab 3 5 Circadian variierende Transkripte im Hypothalamus von KR und MT Tieren In der oben aufgestellten Tabelle wurden alle bei den KR und MT Tieren circadian schwankenden Transkripte aufgelistet Da es bereinstimmungen gibt zwischen entweder allen drei Gruppen oder einer der Behandlungen und den Kontrolltieren habe ich diese wie folgt farblich gekennzeichnet Rot Bei MT und Kontrolltieren rhythmisch Gr n Bei KR und Kontrolltieren rhythmisch Blau Bei allen untersuchten Gruppen rhythmisch Rhythmisch bedeutet in diesem Zusammenhang innerhalb der untersuchten Gruppe circadian schwankend bedeutet jedoch nicht zwangsl ufig synchron mit einer anderen Gruppe Es sind insgesamt 31 Transkripte aufgelistet von denen nur zwei bei allen Gruppen unabh ngig von der Behandlung unter strengen Auswahlkriterien rh
65. 5000 XL Microarray Analysis System Packard Biosciences und ScanArray External Laser System GSI Luminomics Scanarray Software Microsoft Excel GraphPad Prism Methode Der hybridisierte gewaschene Microarray wird gescannt die Fokustiefe betr gt i d R 1789um bei Chips des Xeotron Systems Bei Bedarf muss sie manuell ermittelt werden siehe Benutzerhandbuch Die Aufl sung betr gt 5um Die Einstellungen f r Laserst rke LASER gain und Photomultiplier Verst rkung PMT gain werden beim ersten Lesen automatisch ermittelt Hierzu wird die Option Autogain Laser bzw PMT Autogain gew hlt bevor die eigentliche Datenerfassung des XeoChip erfolgt Das zweite Scannen erfolgt mit um 20 erh hter Laserst rke um eine Maximale Ausbeute auch von schwachen Signalen zu erhalten Die Daten werden als Excel Dateien gespeichert und nach Lowess Verfahren analysiert Dudoit et al 2000 Es wird jeweils der Mittelwert der Duplikate auf dem Microarray gebildet wobei sich die Anzahl der Klone von 2 Material und Methoden 65 2000 Duplikaten auf 1000 reduziert Schwache Signale und Signale von Duplikaten die sich stark unterscheiden werden aus der weiteren Analyse entfernt 2 22 Liste der verwendeten L sungen und Reagenzien LB Medium Liter Trypton 10g Hefeextrakt 5g NaCl 10g H O auf 11 pH auf 7 0 einstellen autoklavieren F r Agar Platten 15 g Agar hinzugeben SOC Medium Liter Trypton 20g Hefeextrakt 5g NaCl 0
66. A Menge f r den MT1 Rezeptor im SCN ab Dieses impliziert einen altersbedingten Verlust an MTI Rezeptoren welches zur Desynchronisierung des circadianen Systems beitragen k nnte 1 2 5 Signaltransduktion der Melatoninrezeptoren Die Melatoninrezeptoren sind an ein inhibitorisches G Protein gekoppelt Gj Ihre Aktivierung f hrt zur Inhibition der Adenylatzyklase ber einen Pertussis Toxin sensitiven Mechanismus Nach Ligandenbindung untergehen die Melatoninrezeptoren wahrscheinlich eine Konformations nderung bei der sie ein inhibitorisches G Protein aktivieren Das aus a y Untereinheiten bestehende Protein bindet GTP und dissoziiert zu Ga GTP und G y Untereinheiten Die Ga GTP Untereinheit hemmt ber die Adenylatzyklase die Neubildung von cAMP aus ATP Reppert et al 1994 amp 1995 Conway et al 2000 In einer humanen Zelllinie f hrt die Aktivierung des MT1 Rezeptors zur Potenzierung der PGF2a vermittelten Phospholipase C Aktivit t und der Freisetzung von Arachidons ure Dieser Effekt k nnte durch die y Untereinheiten des heterotrimerischen G Proteins vermittelt werden Godson et al 1997 Melatonin inhibiert die Induktion des Transkriptionsfaktors PhosphoCREB durch Forskolin in Schaf Hypophysenzellkulturen Dies geschieht wahrscheinlich durch die Inhibition des cAMP Signalweges Melatonin inhibiert ebenfalls die Forskolin stimulierte Induktion der AP 1 Transkriptionsfaktoren c fos und jun B in Schaf Pars tuberalis Ross et a
67. Ansatz zur gelelektrophoretischen Analyse aus den Kapillaren bei 2000g 1min in ein Eppendorf Gef zentrifugiert und auf einem Agarose Gel aufgetrennt Reaktionsansatz iCycler und IQ BIO RAD SYBR Green Supermix Anzahl der Reaktionen 1 n 2x iQ Supermix 12 ul xnul 5 Primer 10 uM 1 ul xnul 3 Primer 10 uM 1 ul xnul cDNA Template Menge variiert x ul xnul HBO Ftd xn X 25 ul 2 Material und Methoden 45 Standard Thermoprofil der PCR im iCycler 1x 95 C 5 min Hitzeaktivierung DNA Polymerase Hot Start 95 C 15s 40x lt 60 C 30 s die annealing Temperatur ist Primerspezifisch 72 C 30s 1x Schmelzkurve Nach der PCR im iCycler konnten die Produkte aus der Mikrotiterplatte 96er Format zur gelelektrophoretischen Analyse weiterverwendet werden 2 11 DNA Auftrennung mittels Agarose Gelelektrophorese Theorie Die Agarose Gelelektrophorese ist die einfachste und effektivste Methode DNA Fragmente von 0 5 25 kb Lange und RNA voneinander zu trennen und zu identifizieren Sie basiert auf der Wanderung der DNA im elektrischen Feld aufgrund der negativen Ladung durch ein Agarosegel zur Anode Abh ngig von der Gr e der DNA wandern die Molek le unterschiedlich schnell und werden so im Gel aufgetrennt Diese Technik wird sowohl zur Identifizierung von DNA Fragmenten analytisch als auch zur Isolierung der DNA pr parativ eingesetzt Insbesondere wenn es mehrere Banden im Agarosegel gibt ist die pr para
68. C Imin In Bahn 1 amp 2 wurde ein Teil des mCLOCK Transkriptes amplifiziert hierauf wird in 3 2 3 eingegangen Es gelang mir in Bahn 7 amp 8 abgebildet ein putatives MT2 PCR Produkt von etwa 800bp zu amplifizieren Dies geschah mit einem 5 Primer aus der bekannten Sequenz MT2 A F zusammen mit einem 3 Primer den ich aus genomischen DNA Informationen konstruiert habe mMT2 3 UTR B Das Produkt wurde wie im Methodenteil beschrieben in den pDRIVETM Vektor kloniert und Bakterien transformiert Anschlie end an die Blau Weiss Selektion bernachtkultur und der Minipr p wurde von 5 und 3 Richtung mit T7 und SP6 Primern sequenziert 3 Ergebnisse 86 Der Sequenzvergleich ergab eine 99 ige bereinstimmung bis auf 2 Basen mit dem entsprechenden Genbankeintrag und ein ca 400bp weiteres offenes Leseraster ORF open reading frame gefolgt von einem putativen TAG Stopcodon Ein Sequenzvergleich ist auszugsweise im Folgenden dargestellt Ala Ser Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Val Val Ala Ile His Phe Leu Majority ee RE LLUUK La LAB eee 200 210 o P M eee Banane 586 Ala Ser Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Val Val Ala Ile His Phe Leu MTZ complete SEQ 586 GCC AGC ACA CAG TAC ACG GCA GCT GTG GTG GCC ATC CAC TTC CTC 163 Ala Ser Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Val Val Ala Ile His Phe Leu MT2 dave SEQ 163 GCC AGC ACA CAG TAC ACG GCA GCT GTG GTG GCC ATC CAC TTC CTC Sass j ied Majority
69. DNA DEPC behandeltes Wasser im Kit enthalten Natriumbikarbonat L sung 25mg ml im Kit enthalten DMSO im Kit enthalten ARES MAJ exa Fluor Farbstoff entweder 488 555 594 oder 647 Methode 1 Die pr zipitierte Aminoallyl modifizierte cDNA wird in 5ul DEPC behandeltem Wasser gel st hierzu ggf f r 5min bei 42 C inkubiert 2 Material und Methoden 59 2 Frischer reaktiver Fluoreszenzfarbstoff wird vorbereitet indem der Inhalt eines 3 Reaktionsgef es mit dem Salz des Farbstoffes in 2ul DMSO gel st wird Zu der gel sten Aminoallyl modifizierten cDNA werden 3ul Natriumbikarbonat L sung 25mg ml und der in DMSO gel ste Fluoreszenzfarbstoff pipettiert Endvolumen 10ul Die Inkubation erfolgt im Dunkeln bei RT f r eine Stunde Reinigung fluoreszenzmarkierter cDNA Theorie Sinn der Reinigung der fluoreszenzmarkierten cDNA ist es nichtinkorporierte Fluorophore und Salze aus der Reaktion zu entfernen da diese bei der Hybridisierung des XeoChip st rende Hintergrundfluoreszenz verursachen Material Fluoreszenzmarkierte cDNA cDNA Labeling Purification Module Invitrogen Aminoallyl modifizierte cDNA Ethanol 96 20 C Merck Ethanol 75 20 C Isopropanol Merck DEPC behandeltes Wasser Diethylpyrocarbonat Sigma Mikrozentrifuge 1 5ml Reaktionsgef im Kit enthalten 3 M Natrium Acetat pH 5 2 im Kit enthalten Glykogen 20mg ml im Kit enthalten Methode
70. Der Einfluss von kalorischer Restriktion und Melatonin auf die circadiane Physiologie der Maus Mus Musculus Linnaeus 1758 Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades des Fachbereichs Biologie der Universitat Hamburg vorgelegt von David Res hr Hamburg Hamburg Juli 2004 Genehmigt vom Fachbereich Biologie der Universit t Hamburg auf Antrag von Herrn Professor Dr K WIESE Weitere Gutachter der Dissertation Herr Professor Dr J OLCESE Tag der Disputation 29 Oktober 2004 Hamburg den 15 Oktober 2004 1 Gutachter Prof Dr Konrad Wiese 2 Gutachter Prof Dr James Olcese Tag der Disputation 29 10 2004 Tempus Fugit die Zeit fliegt 1 Einleitung 1 1 Biologische Rhythmen 1 1 1 Der Sitz des Hauptschrittmachers der SCN 1 1 2 Die molekulare innere Uhr 1 2 Melatonin Das Hormon der Dunkelheit 1 2 1 Grundlegendes ber das Pinealhormon 1 2 2 Synthese von Melatonin 1 2 3 Die Melatoninrezeptoren 1 2 4 Verteilung der Melatoninrezeptoren 1 2 5 Signaltransduktion der Melatoninrezeptoren 1 2 6 Weitere Wirkungen von Melatonin 1 3 Kalorische Restriktion Di t 1 3 1 Effekte von kalorischer Restriktionsern hrung 1 3 2 Altersbedingte Ver nderungen im ZNS von S ugetieren 1 3 3 Kalorische Restriktion und Chronobiologie 1 4 Ziel der Arbeit 2 Material und Methoden 2 1 Tiermaterial M use des Stammes B6C3F1 2 2 T tung und Gewebeentnahme 2 3 Material f r die Aktivit tsaufzeichnung von M usen
71. Ergebnisse 117 1 80E 00 1 60E 00 1 40E 00 1 20E 00 1 00E 00 8 00E 01 6 00E 01 normalisierte Transkriptmenge 4 00E 01 2 00E 01 0 00E 00 DBP Expression im Hypothalamus der Maus Kontrolle KR t Melatonin k Alt 0 6 12 18 0 ZT Abb 3 51 Expression von D site albumin promoter binding protein Dbp mRN Maus Gemessen mittels Realtime PCR im Hypothalamus der Die DBP Expression erreicht bei Kontrolltieren im Microarray sowie in der Realtime PCR um ZTI2 ihr Maximum Zwischen den Gruppen kann mittels Realtime PCR kein signifikanter Unterschied in der circadianen Expression dieses Transkriptionsfaktors ermittelt werden 3 Ergebnisse 118 4 Diskussion 4 1 Entwicklung des K rpergewichtes bei KR MT und Kontrolltieren des Mausestammes B6C3F1 Das Anfangsgewicht der Tiere aller Gruppen war hnlich und betrug zwischen 29 4 0 35g und 28 6 0 32g Nach der Eingew hnung der KR M use and das Spezialfutter wurde die verabreichte Menge graduierlich 14 Taglich um 20 auf 60 der urspr nglichen Menge verringert um den erw nschten Restriktionseffekt zu erreichen Die Kontroll und MT Tiere bekamen weiterhin 100 der Normaldi t Im Verlaufe der Di t nahmen die KR Tiere bis zur 10 Woche ab Abb 3 1 dies blieb bis auf eine geringe Zunahme zum Ende des Versuches hin stabil Der Gewichtsverlust der KR Tiere war
72. J S Armstrong et al 1983 Free running activity rhythms in the rat entrainment by melatonin Science 219 4588 1089 91 Reiter R J 1994 Melatonin suppression by static and extremely low frequency electromagnetic fields relationship to the reported increased incidence of cancer Rev Environ Health 10 3 4 171 86 Reiter R J 1994 Pineal function during aging attenuation of the melatonin rhythm and its neurobiological consequences Acta Neurobiol Exp Wars 54 Suppl 31 9 Reiter R J 1996 Functional aspects of the pineal hormone melatonin in combating cell and tissue damage induced by free radicals Eur J Endocrinol 134 4 412 20 Reiter R J 1996 The indoleamine melatonin as a free radical scavenger electron donor and antioxidant In vitro and in vivo studies Adv Exp Med Biol 398 307 13 Reiter R J 1996 Functional diversity of the pineal hormone melatonin its role as an antioxidant Exp Clin Endocrinol Diabetes 104 1 10 6 Reiter R J L Barlow Walden et al 1996 Twenty four hour urinary excretion of 6 hydroxymelatonin sulfate in Down syndrome subjects J Pineal Res 20 1 45 50 Reiter R J M I Pablos et al 1996 Melatonin in the context of the free radical theory of aging Ann N Y Acad Sci 786 6 Anhang 154 362 78 Reiter R J M N Reiter et al 1994 The pineal melatonin rhythm and its regulation by light in a subterranean rodent the valley pocket gophe
73. Leu Pro Met Ala Val Val Ser Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Majority el CIO MED BOB Fl 337 pol f2E X9 YD ocu Arg Zug Ip IS 220 631 Leu Pro Met Ala Val Val Ser Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val MT2 complete SEQ 631 CTT CCC ATG GCT GTG GTG TCC TTC TGC TAC CTG CGA ATC TGG GTA 208 Leu Pro Met Ala Val Val Ser Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val MT2 dave SEQ 208 CTT CCC ATG GCT GTG GTG TCC TTC TGC TAC CTG CGA ATC TGG GTA E Majority Leu Val Leu Gln Ala Arg Arg Lys Ala Lys Ala Thr Arg Lys Leu Majority Pee 230 240 676 Leu Val Leu Gln Ala Arg Arg Lys Ala Lys Ala Thr Arg Lys Leu MTZ complete SEQ 676 CTG GTG CTC CAG GCC CGA AGG AAG GCC AAG GCT ACG AGG AAG CTG 253 Leu Val Leu Gln Ala Arg Arg Lys Ala Lys Ala Glu Arg Lys Leu MTZ dave S3EQ 253 CTG GTG CTC CAG GCC CGA AGG AAG GCC AAG GCT GAG AGG AAG CTG fs i ST Majority Arg Leu Arg Pro Ser Asp Leu Arg Ser Phe Leu Thr Met Phe Ala Majority II ug ID pol SSR OA eL oum 250 a ee br U H l 721 Arg Leu Arg Pro Ser Asp Leu Arg Ser Phe Leu Thr Met Phe Ala MTZ complete S3EQ 721 CGT CTG AGA CCG AGT GAT TTG CGC AGT TTC CTA ACC ATG TIT GCA 298 Arg Leu Arg Pro Ser Asp Leu Arg Ser Phe Leu Thr Met Phe Ala MT2 dave SEQ 298 CGT CTG AGA CCG AGT GAT TTG CGC AGT TTC CTA ACC ATG TIT GCA Ee i s Majority Val Phe Val Val Phe Ala Ile Cys Trp Ala Pro Leu Asn Cys Ile Majority Se L
74. MP binding cGMP specific phosphodiesterase Pde5a Por NM 008898 P450 cytochrome oxidoreductase Por mRNA Ppia NM 008907 peptidylprolyl isomerase A Ppia mRNA Rora NM 013646 RAR related orphan receptor alpha Rora mRNA Scnnlb NM_011325 sodium channel nonvoltage gated 1 beta Scnn1b Slc13a2 NM_022411 solute carrier family 13 sodium dependent slc17 BC028989 Mus musculus Similar to solute carrier family 17 sodium dependent Slc21al NM 013797 solute carrier family 21 organic anion transporter Slc21al0 NM_020495 solute carrier family 21 organic anion transporter SIc2lal2 NM_148933 solute carrier family 21 organic anion transporter Slc21a14 NM 021471 solute carrier family 21 organic anion transporter Slc21a7 NM 130861 solute carrier family 21 organic anion transporter SIc25al2 NM_172436 solute carrier family 25 mitochondrial carrier slc37 NM 153062 solute carrier family 37 glycerol 3 phosphate Slc38a4 NM_027052 solute carrier family 38 member 4 S1c38a4 mRNA Thrsp NM_009381 thyroid hormone responsive SPOT 14 homolog Rattus Tmod1 NM_021883 tropomodulin 1 Tmod1 mRNA Tst NM_009437 thiosulfate sulfurtransferase mitochondrial Tst Ube213 NM_009456 ubiquitin conjugating enzyme E2L 3 Ube213 mRNA Weel NM_009516 wee 1 homolog S pombe Weel mRNA Tab 3 1 Auflistung der durch KR und Melatonin in der Leber maximal auf oder abregulierten Transkripte Es sind Gensymbol Ge
75. N rhythmisch in Phase mit Per exprimiert Tei et al 1997 Die Amplitude der Oszillation ist allerdings niedrig Abe et al 1999 In meinen Versuchen wurde hnliches beobachtet eine sehr niedrige Amplitude jedoch hnlich der Phase von Perl im Hypothalamus von M usen Kolker und Mitarbeiter 2003 fanden im SCN von Hamstern keinen circadianen Rhythmus der Clock expression In manchen peripheren Geweben wie Herz und Leber wird Clock ebenfalls rhythmisch exprimiert Young et al 2001 Preitner et al 2002 Vielleicht hat die A 18 Spleissvariante von Clock etwas mit der differentiellen Regulierung in neuronalen und peripheren Geweben zu tun M glicherweise ist sie an ihrer eigenen Regulierung beteiligt und beeintr chtigt in neuronalen Geweben die rhythmische Expression nach folgendem hypothetischem Schema 4 Diskussion 127 Clock und Clock 18 konkurrieren um E BOX n CLOCK c un Aktivierung ba Geringe rung anderer Clock Gene Clock und Clock A18 konkurrieren um E BOX AM Aktivierung niedrige circadiane Amplitude Abb 4 3 1 hypothetische Autoregulation von Clock im SCN und neuronalen Geweben C Clock nativ B Bmall CA A18 Spleissvariante Clock konkurriert mit der Spleissvariante um E Boxen B periphere Gewebe Aktivierung Starke ng anderer Clock Gene en Aktivierung Abb 4 3 2 hypothetische Autoregulation von Clock in peripheren Geweben C Clock nativ
76. OS2 induziert wird Was nicht schl ssig ist ist die Tatsache dass NOS2 bei den alten Tieren ebenfalls abreguliert wurde Da aber nur ein Zeitpunkt untersucht wurde k nnte es sein dass dies ein Artefakt des Versuches ist Die Transkripte Rgs7 und RGs19 sind bei MT Tieren an allen Zeitpunkten bis auf ZT18 fast 2 fach abreguliert bei den KR Tieren an allen Zeitpunkten bis auf ZT18 ber 2 fach aufreguliert Beide Transkripte partizipieren als Regulatoren am G Protein gekoppelten Signalweg Melatonin agiert wie schon beschrieben ber G Protein gekoppelte Rezeptoren daher ist diese Beobachtung sehr aufschlussreich Die Regulatoren des G Protein Signalweges RGS regulator of G Protein signaling regulieren die a Untereinheit von G Proteinen negativ indem die intrinsische Guanosin Triphosphatase Aktivit t des G Proteins beschleunigt wird Nagata et al 2001 Der G Protein Signalweg ist die Basis einer der wichtigsten Signalkaskaden um extrazellul re Signale und sensorische Stimuli in eukaryotischen Zellen zu bertragen Angleson et al 1993 Die Isoformen der a Untereinheit des G Proteins werden in vier Subfamilien unterteilt Gai Gas Gag Gal2 Hamm et al 1996 Es wurden bislang 26 verschiedene RGS Proteine in S ugetieren beschrieben die alle wenn aktiviert mit der G a Untereinheit interagieren Die meisten RGS Proteine inhibieren Signalwege die Ga und Ga als Signalvermittler nutzen Der MTI Rezeptor ist an G und G Proteine gekop
77. RIKEN full length Hsp70 4 NM_015765 heat shock protein 70 kDa 4 Hsp70 4 mRNA Igfbp3 NM_008343 insulin like growth factor binding protein 3 Igfbp3 Insr NM_010568 insulin receptor Insr mRNA Itgax NM 021334 integrin alpha X Itgax mRNA Itgb3 NM 016780 integrin beta 3 Itgb3 mRNA Junb NM 008416 Jun B oncogene Junb mRNA Mrpl20 NM 025570 mitochondrial ribosomal protein L20 Mrpl20 mRNA Nos2 NM 010927 nitric oxide synthase 2 inducible macrophage Nos2 Pde8a NM 008803 phosphodiesterase 8A Pde8a mRNA Png NM 008889 phospholipase c neighboring Png mRNA Ppil2 NM 023249 peptidylprolyl isomerase cyclophilin like 2 Ppil2 Pte2b pending NM 134247 peroxisomal acyl CoA thioesterase 2B Pte2b pending Ptgis NM 008968 prostaglandin I2 prostacyclin synthase Ptgis Rgs19 NM 026446 regulator of G protein signaling 19 Rgs19 mRNA Rgs7 NM_011880 regulator of G protein signaling 7 Rgs7 mRNA Scnla NM 018733 sodium channel voltage gated type I alpha Slc4al0 NM_033552 solute carrier family 4 sodium bicarbonate Slc21a7 NM_ 130861 solute carrier family 21 organic anion transporter Slc26a2 NM_007885 solute carrier family 26 sulfate transporter member Slc2a10 NM_130451 solute carrier family 2 facilitated glucose Sncb NM 033610 synuclein beta Sncb mRNA Tgfb3 NM 009368 transforming growth factor beta 3 Tgfb3 mRNA Ube2el NM 009455 ubiquitin conjugating enzyme E2E 1 UBC4 5 homolog
78. Sulfatierung oder Glucoronidierung abgebaut und ber den Harn ausgeschieden Melatonin hat keine toxischen Eigenschaften im Gegenteil es scheint freie Radikale abzufangen und somit vor oxidativem Zellschaden zu sch tzen Reiter et al 1996 1 Einleitung 10 NH2 pe RN COOH TRYPTOPHAN NN n E TRYPTOPHAN 5 HYDROXYLASE NH2 H H2CH COOH 5 HYDROXYTRYPTOPHAN SHTP Nn HW 5 HTP DECARBOXYLASE H H2CH2NH2 S HYDROXYTRYPTAMINE SHT SEROTONIN NN H SEROTONIN N ACETYL TRANSFERASE NAT or AANAT H H2CH2NHCOCH3 N ACETYLSEROTONIN NN NAS H HYDROXYINDOLE O METHYL TRANSFERASE HIOMT CH30 H2CH2NHCOCH3 MN MELATONIN N ACETYL 5S HYDROXYTRYPTAMINE SYNTHESIS OF MELATONIN Abb 1 5 Biosynthese von Melatonin Aus Arendt et al 2002 Melatonin wird in den meisten K rperfl ssigkeiten gefunden wobei seine Konzentration in der Nacht h her ist als am Tag Eine Entfernung der Pinealdr se hat zur Folge dass keine messbaren Mengen Melatonin mehr gebildet werden obwohl es Hinweise gibt dass es auch in der Retina oder der Harderschen Dr se gebildet wird hier aber nur in sehr geringen Mengen 1 2 3 Die Melatoninrezeptoren Der erste klonierte Melatoninrezeptor wurde in Xenopus Melanophoren exprimiert Ebisawa et al 1994 Obwohl sich sp ter herausstellte dass es sich um eine mutierte Form des Wildtyprezeptors handelte Jockers et al 1997 ebnete seine Entdeckung den Weg f r die Klonierung von
79. TGCTCACTTCACAG hsMT2 Hamster Melatonin Rezeptor Typ2 hsMT2 A F 5 hsMT2 A R 3 2 5 2 Realtime PCR Primer Period 1 Perl mPerl LC F 5 mPerl LC R 5 TGTACTACCCTTACCCACTCG AGACAATGGCGTTAAGGCAGC TCCCTGTTTCGTCCTCCACT CTTGAGCCATTGCTGTTTGC 2 Material und Methoden 32 Period 2 Per2 mPer2F 5 mPer2R 3 Cryptochrome 1 Cry1 mCry1_F 5 mCry1_R 3 Cryptochrome 2 mCry2 mCry2_F 5 mCry2_R 3 CLOCK mCLOCK LC F 5 mCLOCK LC R 3 mBMALI mBMALI F 5 mBMALILI antis 3 Melatoninrezeptor Typ 1 mMTI mMT1_LC F 5 mMTI_LC R 3 Melatoninrezeptor Typ 2 mMT2 LCmMT2 F 5 LCmMT2 R 3 Arginine Vasopressin mAVP FW 5 mAVP RV 3 D Site Albumin Binding Protein mDBP FW 5 mDBP RV 3 CGAGAGTGAGGAGAAAGGCAACAT TTCTTCCGAGCACCGTCTAATGTC TCCCCTCCCCTTTCTCTTTA TGAGTCATGATGGCGTCAAT AAGCTGAATTCGCGTCTGTT GTGGTTTCTGCCCATTCAGT GGTTTGATCACAGCCCAACT CCTCCGCTGTGTCATCTTTT CGAAGACAATGAGCCAGACA AAATAGCTGTCGCCCTCTGA GGATATGGGTCCTGGTCCTT ACTAGCCACGAACAGCCACT TTTATGGGCTCCTGAACCAG CCCTGTCGCTCCTCAGTAAG CTTCCAGAACTGCCCAAGAG GGGCAGGTAGTTCTCCTCCT CATTCCAGGCCATGAGACTT TGGCTGCTTCATTGTTCTTG 2 Material und Methoden 33 Cytochrome P450 type 2a4 Cyp2a4 F 5 Cyp2a4 R 3 Cytochrome P450 type 3all Cyp3all FS Cyp3all R 3 Fatty acid synthase mFasn F 5 mFasn R 3 Solute carrier 21 al Slc21al F 5 Slc21al R 3 2 5 3 Primer fiir Haushaltsgene Ribosomal Pr
80. a wir sind ein gutes Team Danke dass du mich mit in die USA genommen hast die Entscheidung war aus multipler Hinsicht absolut richtig Ich freue mich darauf noch eine gute produktive Zeit im sch nen Florida zu verbringen Danke an Dr Andrej Nikolai Spiess Andrej Digger danke danke danke f r Deine guten Vorschl ge und das Korrekturlesen meiner Arbeit Du warst immer eine super Hilfe bei meinen fachlichen Fragen und hattest immer ein Protokoll im Kopf das viel besser als das des Herstellers war Es hat einen riesigen SpaD mit Dir im IHF gemacht der Faktor den ich am meisten vermissen werde ist der Spiess Faktor Thanks Mein ausgesprochener Dank geb hrt Herrn Prof Dr Wiese Vielen Dank dass Sie sich so selbstlos f r mich und das Gelingen meiner Promotion eingesetzt haben Ihr spontaner unb rokratischer und kompetenter Einsatz bei der Anmeldung meiner Dissertation war sehr hilfreich Danke f r die weitere Unterst tzung w hrend meines USA Aufenthaltes 6 Anhang 157 Vielen Dank an alle Mitarbeiter Kollegen und Freunde die ich im Laufe der Zeit gewonnen habe Die Zeit am Grandweg war super Euch allen Nadine Sandra Anja Ralph und Olaf w nsche ich alles Gute f r die Zukunft Danke an unsere netten TA Sch lerinnen insbesondere Jenny Behrens Lena Fischer und Sandra Fredericks die immer sehr gelehrig fleissig und vor allem geduldig waren Dir Roger danke ich daf r dass Du immer ein offenes Ohr f r mich hattest
81. al 2001 Auch im Hirn des Stammes B6C3FI fand ich nur eine sehr geringe nicht signifikante circadiane Schwankung von Clock Die Amplituden von DBP und Per2 waren zwischen 2 und 4 fach Nur Cry2 wies bei den MT Tieren eine recht hohe circadiane Amplitude auf gt 10 fach In anderen Geweben wurden diese Transkripte nicht nach circadianen Aspekten betrachtet Das Fehlen der ClockA 18 Spleissvariante in peripheren Geweben k nnte Ursache f r eine st rkere circadiane Expression sein die entweder nicht oder nur mit geringerer Amplitude im Gehirn vorkommt Ferner w rde hierdurch die Diskrepanz in der Amplitude von Clock gesteuerten Transkripten zwischen neuronalen und peripheren Geweben erkl rt werden Ein Versuch der interessant f r die Aufkl rung des Mechanismus der Steuerung von Clock sein k nnte w re das quantitative Erfassen der Transkriptmenge von A18 zu normalem Clock Transkript Da ich die A18 Spleissvariante nur in neuronalen Geweben identifizieren konnte k nnte dies weiteren Aufschluss ber die Steuerung der Clock Expression in neuronalen und nicht neuronalen Geweben geben 4 4 Die MT2 Rezeptor Sequenz Da zu Beginn dieser Studie nur ein Teil der murinen MT2 Rezeptorsequenz ver ffentlicht war war ein wichtiges Ziel mittels PCR den unver ffentlichten Teil zu amplifizieren 4 Diskussion 129 In mehreren Etappen gelang es ber 700bp der MT2 mRNA zu amplifizieren und in der Gendatenbank zu ver ffentlichen Kurz dara
82. al tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus Genes Dev 14 23 2950 61 Dardente H J S Menet et al 2004 Daily and circadian expression of neuropeptides in the suprachiasmatic nuclei of nocturnal and diurnal rodents Brain Res Mol Brain Res 124 2 143 51 Davis F C and N Viswanathan 1998 Stability of circadian timing with age in Syrian hamsters Am J Physiol 275 4 Pt 2 R960 8 6 Anhang 151 de la Iglesia H O J Meyer et al 2000 Antiphase oscillation of the left and right suprachiasmatic nuclei Science 290 5492 799 801 Devlin P F and S A Kay 2001 Circadian photoperception Annu Rev Physiol 63 677 94 Dhahbi J M H J Kim et al 2004 Temporal linkage between the phenotypic and genomic responses to caloric restriction Proc Natl Acad Sci U S A 101 15 5524 9 Dhahbi J M P L Mote et al 1999 Calories and aging alter gene expression for gluconeogenic glycolytic and nitrogen metabolizing enzymes Am J Physiol 277 2 Pt 1 E352 60 Disterhoft J F J R Moyer Jr et al 1994 The calcium rationale in aging and Alzheimer s disease Evidence from an animal model of normal aging Ann N Y Acad Sci 747 382 406 Doolen S D N Krause et al 1998 Melatonin mediates two distinct responses in vascular smooth muscle Eur J Pharmacol 345 1 67 9 Duarte A l M S Santos et al 2003 Insulin affects synaptosomal GABA and glutamate tra
83. aliwk 3 Restricted o 20 e 40 kcalwk 10 C 0 AT MM 100 e Ad libitum 4 B5 kcal wk 9 50 kcal wk 4 40 kcal wk 75 Control Es Restricted 2 50 Maximum 2 ey 2 E o 40 en 4 25 20 Average O Ar pew H r D 40 60 80 100 120 140 Caloric Intake wk 0 2 D 0 10 20 30 40 50 60 0 12 20 30 40 50 Age mol Abb 1 7 Aus Weindruch et al 2003 Interessanterweise gibt es einige bereinstimmende Effekte von KR und Melatoninsubstitution Kalorische Restriktion Melatoninsubstitution Metabolische Effekte Senkt K rpertemperatur Senkt K rpertemperatur Beugt oxidativem Beugt oxidativem Zellschaden vor ber Zellschaden vor ber erh hte Aktivit t von erh hte Aktivit t von Antioxidanten Antioxidanten Immunologische Effekte Induziert Interferone und Induziert Interferone und unterdr ckt Entz ndungs unterdr ckt 5 LOX reaktionen Expression Onkostatische Effekte Verlangsamung des Verlangsamung des Wachstums von durch Wachstums von durch 1 Einleitung 19 radioaktive Strahlung radioaktive Strahlung und verursachten Tumoren Chemikalien ausgel sten Verlangsamung spontanen Tumoren Verlangsamung Tumorwachstums spontanen Tumorwachstums Endokrine Effekte Verlangsamte reproduktive Verlangsamte reproduktive Seneszenz Seneszenz Altersbedingte Effekte Verl ngert die Verl ngert die Lebenserwartung Lebenserwartung Tab 1 2 Vergleich von Mela
84. ammenhang gebracht Bei allen Wirkungen die Melatonin nachgesagt werden darf der objektive Betrachter niemals die Skepsis verlieren Mitte der 90er Jahre wurde Melatonin als Wunderhormon sehr popul r Unter anderem deswegen weil ein extrem popul rwissenschaftliches Buch Pierpaoli und Regelson 1994 erschien in dem die Autoren behaupten dass Melatonin Altern r ckg ngig machen kann Diese Studie bzw die Schlussfolgerungen daraus wurden nicht gut berlegt Es wurden Pinealdr sen von jungen in alte M use transplantiert worauf eine Verl ngerung der Lebensspanne beobachtet wurde der Effekt wurde dem Jugendlichen Melatonin der transplantierten Dr sen zugeschrieben Das Problem hierbei ist dass die verwendeten Mausst mme wie viele Labormausst mme Melatonin defizient waren Die Mutma ung Melatonin h tte das Leben der Versuchstiere verl ngert ist absurd Dennoch zeigten Versuche derselben Autoren dass exogene Melatoningaben bei einigen Mausst mmen die Lebensdauer um etwa 20 verl ngerte Was verschwiegen wurde war dass in einem anderen Melatonin profizienten Mausstamm CH3 die Substitution mit Melatonin zu Zunahme der Tumorinzidenz im reproduktiven System f hrte 1 Einleitung 16 Es gibt keine Wunderdroge gegen das Altern Auch wenn es viele wissenschaftliche Hinweise auf einen profitablen Effekt der Melatoninsubstitution bei alternden Tieren gibt es ist nicht hinl nglich erwiesen ob dies f r den Menschen
85. amp promoter Abb 2 5 pDrive Vektor Aus Qiagen Handbuch 2 Material und Methoden 49 Nach Transformation und Kultur von Bakterien mit dem Plasmid kann die vervielf ltigte DNA durch Pr paration gewonnen und durch Verdau mit einer Restriktionsendonuklease z B EcoRI analysiert werden Danach ist die klonierte vervielf ltigte DNA f r den n chsten geplanten Versuch bereit Material PCR Cloning Kit Qiagen gereinigte dsDNA PCR Produkt oder Gelextrakte SOC Medium Methode Das zu klonierende DNA Fragment wurde wie beschrieben gereinigt und dessen Konzentration photometrisch bestimmt Die folgenden Komponenten wurden in einem 0 5ml Reaktionsgef vereinigt Die zu klonierende DNA wurde im 5 10 Fachen molaren berschuss zum Vektor verwendet Die Ligationen wurden in einem 10 ul Reaktionsansatz durchgef hrt pDRIVE DNA 10 ng ul 1 ul PCR DNA 1 4 ul Ligation Master Mix 2x 2 ul H O variabel ul 2 10 ul Die Reaktionen wurden f r 2 Stunden bei 4 C im K hlschrank inkubiert Im Anschluss an die Ligation wird eine Transformation kompetenter Bakterien durchgef hrt 2 15 Transformation und Ausplattieren der Bakterien Theorie Bei der Transformation handelt es sich um die Einf hrung fremder Plasmid DNA in Bakterienzellen 2 Material und Methoden 50 Diese zentrale Technik in der Molekularbiologie wird immer dann eingesetzt wenn von einer bestimmten DNA gr ere Mengen ben tigt werden Auf
86. ang engl der Sequenz des antisense Stranges entsprechender Primer engl Anordnung engl in Bezug auf Microarray Technologie bertragen von DNA RNA Protein auf Membranen Verl ngerung von DNA mittels Polymerasen lat ansequenzierte cDNAs expressed sequence tags engl Proteine welche andere Proteine in ihrer Konformation stabilisieren engl in einen Plasmidvektor einkloniertes dsDNA Fragment engl gezieltes Ausschalten eines Gens durch homologe Rekombination engl ungepaarte Basen in einer doppelstr ngigen DNA engl Pr zipitat K gelchen engl beim Zentrifugieren entstehende Ansammlung am Boden Oligonukleotid welches als Startermolek l f r DNA Polymerasen dient engl best Art von PCR Maschine der mRNA entsprechende DNA Strang engl der Sequenz des sense Stranges entsprechender Primer engl Matrizen DNA engl z B f r eine PCR PCR Machine engl siehe Robocycler die mRNA eines umgeschriebenen Gens lat Apparatur zum Durchmischen kleiner Reaktionsgef e Abbott C M and C G Proud 2004 Translation factors in sickness and in health Trends Biochem Sci 29 1 25 31 Abe H S Honma et al 1999 Functional diversities of two activity components of circadian rhythm in genetical splitting mice CS strain J Comp Physiol A 184 3 243 51 6 Anhang 150 Abe H S Honma et al 2001 Behavioural rhythm splitting in the CS mouse is related to clock gene expression out
87. ass Tiere des Stammes B6C3F1 mit 14 Monaten nicht sehr alt sind erkl rt dass keine Analyse von altersbedingten Erkrankungen z B Tumorinzidenz gemacht werden kann Adenome Karzinome und andere Alterskrankheiten treten bei diesem Stamm erst sp ter auf ab ca 21 Monaten Dhahbi et al 2004 hier ist die Inzidenz bei KR Tieren geringer 4 Diskussion 117 Interessanterweise gab es zu Versuchsende einen signifikanten Gewichtsunterschied zwischen den MT und Kontrolltieren Dies wurde meiner Kenntnis nach noch nicht berichtet In der umstrittenen Studie von Pierpaoli und Regelson 1991 1994 wurden nicht nur Pinealdr sen von jungen in alte M use transplantiert sondern in einer separaten Gruppe auch Melatonin substituiert Die Substitution mit Melatonin erfolgte bei BALB c Weibchen Melatonin defizient in einer Konzentration von 10ug ml Trinkwasser doppelt so hoch wie in meiner Studie Hierbei gab es zwischen den unbehandelten Kontrolltieren und den Melatonin substituierten keinen signifikanten Gewichtsunterschied Auch zeigten Pierpaoli und Regelson eine lebensverl ngernde Wirkung der Melatoninbehandlung von 23 8 auf 28 1 Monate Da die Versuchstiere meiner Studie erst ein Alter von 14 Monaten hatten kann ein solcher Effekt nicht eingesch tzt werden Zu Beginn dieses Projektes war die maximale Lebensspanne des B6C3F1 Stammes nicht bekannt Neueste Studien allerdings zeigen dass die durchschnittliche Lebensspanne hier 30 7 Monate
88. atic nucleus is inhibited by melatonin Neurosci Lett 227 3 145 8 Koster van Hoffen G C M Mirmiran et al 1993 Effects of a novel melatonin analog on circadian rhythms of body temperature and activity in young middle aged and old rats Neurobiol Aging 14 6 565 9 Kramer A F C Yang et al 2001 Regulation of daily locomotor activity and sleep by hypothalamic EGF receptor signaling Science 294 5551 2511 5 Kume K M J Zylka et al 1999 mCRY1 and mCRY2 are essential components of the negative limb of the circadian clock feedback loop Cell 98 2 193 205 Lahiri D K 1999 Melatonin affects the metabolism of the beta amyloid precursor protein in different cell types J Pineal Res 26 3 137 46 Lahiri D K D Davis et al 1999 Detection of specific protein bands with melatonin like immunoreactivity in different cell lines and human brain regions IUBMB Life 48 1 127 32 Lane M A D J Baer et al 1996 Calorie restriction lowers body temperature in rhesus monkeys consistent with a postulated anti aging mechanism in rodents Proc Natl Acad Sci U S A 93 9 4159 64 Lavery D J L Lopez Molina et al 1999 Circadian expression of the steroid 15 alpha hydroxylase Cyp2a4 and coumarin 7 hydroxylase Cyp2a5 genes in mouse liver is regulated by the PAR leucine zipper transcription factor DBP Mol Cell Biol 19 10 6488 99 Lee C D R Weaver et al 2004 Direct Association be
89. auch gilt Die Indizien f r einen positiven Effekt auch im alternden Menschen sind allerdings nicht zu bersehen Die Behandlung von jet lag Petrie et al 1989 und chronischen Schlafst rungen Oldani et al 1994 ist durchaus erfolgreich Einen Leitfaden f r die Etablierung einer Chronotherapie gibt es aber noch nicht Dies und die weitere Evaluierung der potentiellen Einsatzgebiete von Melatonin gilt es zu erforschen 1 3 Kalorische Restriktion Di t 1 3 1 Effekte von kalorischer Restriktionsern hrung Ein weiterer therapeutischer Ansatz neben Melatoninsubstitution die speziesspezifische Lebensdauer zu erh hen ist eine kalorisch begrenzte Ern hrung Die Gerontologie ist immer damit besch ftigt Interventionsma nahmen gegen altersbedingte Erkrankungen zu finden Selbst wenn es f r den Menschen nicht das Ziel ist die Lebensdauer dramatisch zu erh hen eine Verbesserung der Lebensqualit t im hohen Alter ist erstrebenswert Weindruch et al 1982 1992 2003 haben schon ausgiebige Studien zum Einfluss von kalorischer Restriktionsern hrung KR auf die Lebensspanne und die Physiologie der Maus durchgef hrt Die Art der Ern hrung ist im Bezug auf den Verlauf des Alterns unglaublich wichtig Die Etablierung einer Restriktionsdi t muss sehr genau geplant werden denn es soll keine Mangelern hrung sein Defizite essentieller N hrstoffe m ssen vermieden werden um den Tieren eine ausgewogene Di t zu erteilen Diese Di ten wer
90. bei den Kontrolltieren eine circadiane Variation aufwiesen Der Vergleich der Genexpression in den Gehirnen von KR und MT Tieren zeigt dass beide Behandlungen einige Transkripte gleich Clsb oder umgekehrt beeinflussen NOS2 Ferner wurde die Anzahl der Gene bestimmt die pro verglichenem Zeitpunkt signifikant gegen ber den Kontrolltieren reguliert sind Hiermit sollte festgestellt werden ob ein vermeintlicher Behandlungseffekt an einen Zeitpunkt des circadianen Tages gebunden ist Es sind in jeder Tabellenspalte die Anzahl der auf und abregulierten Transkripte dargestellt Als Schwellenwert wurde wieder lt 0 55 und gt 1 8 gew hlt ZT KR Melatonin Alt 0 06 00 Uhr 7 4 5 3 XXXXX 6 12 00 Uhr 7 6 7 3 12 3 12 18 00 Uhr 4 5 10 2 XXXXX 18 24 00 Uhr 0 42 2 1 XXXXX Tabelle 3 4 Anzahl der pro Zeitpunkt und Behandlung signifikant von den Kontrollen unterschiedlichen Transkripte 3 Ergebnisse 106 Die Anzahl an Transkripten die durch KR und oder MT reguliert werden ist ber den circadianen Tag hinweg nicht konstant Der geringste Effekt der Behandlungen scheint um ZT 18 dem Aktivit tsmaximum der Tiere zu sein Die meisten abregulierten Transkripte sind in der MT Gruppe bei ZT 12 beobachtet worden also direkt nach Einsetzen der Dunkelphase und Konsum von melatoninhaltigem Wasser Die alten Tiere zeigten von allen die meisten abregulierten Transkri
91. berschuss an Aktivit t bis zur vierten Nacht deutlicher anscheinend hatte die Phasenverz gerung hier einen sehr akuten aber nachlassenden Effekt der Aktivit tssteigerung Die Phasenverz gerung hatte bei den Kontroll und MT Tieren einen wesentlich subtileren Effekt 3 1 5 Zunahme der endogenen circadianen Periode Tau in Abh ngigkeit des Alters Um festzustellen ob sich die L nge der endogenen Periode mit a dem Alter und b einer der applizierten Behandlungen ndert habe ich dies graphisch dargestellt 3 Ergebnisse 84 Zunahme der circadianen Periode tau in alternden Mausen 23 9 23 8 23 7 23 6 23 5 circadiane Periode Std 23 4 Di t Tiere Melatonin behandelte Tiere unbehandelte Tiere 23 3 23 2 o RS no os e Alter Monate Abb 3 18 Zunahme der endogenen Periode t mit steigendem Alter i nimmt mit zunehmendem Alter in dem von mir untersuchten M usestamm zu Von einem Durchschnittswert von 23 46 0 07 Sunden bei 4 5 Monate alten Tieren auf 23 86 0 08 Stunden bei 30 Monate alten Tieren Weder KR noch MT als Behandlungen k nnen diese Verlangsamung der inneren Uhr mit zunehmendem Alter aufhalten Allerdings scheint die circadiane Uhr bei KR Tieren 8 und 14 Monate etwas langsamer zu laufen als bei den Kontroll und MT Tieren siehe Kap 3 1 2 Nach t Test Analyse Zweiseitiger t Test Graph Pad Prism jeweils N 10 ist der Unterschied in 1 zwischen Kontroll
92. bunden Ich kann z B den Effekt der Aufregulierung einer ATP Synthase Untereinheit bei 30 Monate alten M usen nicht best tigen ZT6 Allerdings ist der abregulierende Effekt von KR auf die ATP Synthase verglichen mit gleich alten Kontrolltieren an drei von vier untersuchten Zeitpunkten wie in der Literatur beschrieben Synuclein dem eine Rolle in der Alzheimer Erkrankung zugesprochen wird Bertoli Avella et al 2004 ist bei alten M usen erh ht und durch KR an drei von vier Zeitpunkten reduziert Bei MT Tieren ist nur um ZT18 eine Reduktion der Synuclein expression beobachtet worden Altern ist ferner mit der Abregulierung vieler Gene verbunden die eine Rolle in der Synaptischen Informations bertragung im Hypothalamus und Cortex von M usen haben Jiang et al 2000 Calmodulin ist ein Calcium Signalprotein welches eine essentielle Rolle an der Regulierung neuronaler Aktivit t hat Es steuert z B die Verteilung von Neurotransmitter Rezeptoren an Synapsen Masuko et al 1999 Bei den untersuchten 30 Monate alten M usen gegen ber 14 Monate alten ist Calmodulinl im Widerspruch zur Literatur Jiang et al 2001 leicht erh ht Bei KR Tieren ist die Calml Expression um ZTO 6 niedriger und um ZT12 und 18 h her als bei Kontrolltieren Bei den MT Tieren ist Calml um ZTO hoch exprimiert nimmt bis ZT12 ab und bis ZT18 wieder zu Auch Calmodulin2 zeigt einen interessanten circadianen Rhythmus und individuellen Behandlungseffekt M glicherw
93. cht denn der Zeitgebereffekt von Licht ist st rker als der endogene Rhythmus der Uhr unter LD Bedingungen Redlin 2001 Unter LD Bedingungen wird die endogene Uhr im SCN tagt glich durch Licht resynchronisiert ihr eigener Rhythmus kommt nur unter konstanten Bedingungen LL oder DD zum Tragen Die restriktive F tterung f hrt bei den M usen unweigerlich bis zu einem bestimmten Grad auch zu Stress und einer erh hten allgemeinen Erregbarkeit Ich habe bei den tierpflegerischen T tigkeiten festgestellt dass die KR Tiere unglaublich aggressiv und reizbar bissig waren Die kleinste St rung im Tierstall f hrte zu erh hter Aktivit t dieser Gruppe Der Hunger den diese Tiere zwischen den F tterungen versp ren ist vermutlich der Grund f r eine hohe Aktivit t w hrend der Lichtphase und der Suche nach Futter deswegen wurden die F tterungen alternierend im Dunkeln durchgef hrt Der fragmentierte Rhythmus bei den KR Tieren ist also anders als bei alten M usen Hunger nicht altersbedingt Auf Abb 3 9 3 11 l sst sich die zunehmende Fragmentierung des Rhythmus mit dem Alter unter LD und DD Bedingungen erkennen Ferner kann verfolgt werden dass die Zeit zur Resynchronisation an LD nach DD mit dem Alter zunimmt Von Valentinuzzi und Kollegen 1997 wurde hnliches beobachtet n mlich dass nach einer 4 st ndigen Phasenbeschleunigung alte M use wesentlich l nger brauchen um sich an den neuen Lichtzyklus zu gew hnen als junge Tiere
94. circadian clock to a phase shifting stimulus J Biol Rhythms 7 2 187 47 Van Reeth O L Weibel et al 2001 Melatonin or a melatonin agonist corrects age related changes in circadian response to environmental stimulus Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 280 5 R1582 91 Van Reeth O Y Zhang et al 1993 Aging alters the entraining effects of an activity inducing stimulus on the circadian clock Brain Res 607 1 2 286 92 Van Reeth O Y Zhang et al 1992 Aging alters feedback effects of the activity rest cycle on the circadian clock Am J Physiol 263 4 Pt 2 R981 6 Vanecek J and K Watanabe 1998 Melatonin inhibits the increase of cyclic AMP in rat suprachiasmatic neurons induced by vasoactive intestinal peptide Neurosci Lett 252 1 21 4 Viswanathan M J T Laitinen et al 1990 Expression of melatonin receptors in arteries involved in thermoregulation Proc Natl Acad Sci U S A 87 16 6200 3 Vitaterna M H D P King et al 1994 Mutagenesis and mapping of a mouse gene Clock essential for circadian behavior Science 264 5159 719 25 von Gall C G E Duffield et al 1998 CREB in the mouse SCN a molecular interface coding the phase adjusting stimuli light glutamate PACAP and melatonin for clockwork access J Neurosci 18 24 10389 97 von Gall C D R Weaver et al 2000 Melatonin limits transcriptional impact of phosphoCREB in the mouse SCN via the Melia receptor Ne
95. d KR zwar nicht gleichstark jedoch in dieselbe Richtung reguliert zu werden Das prominenteste Beispiel hierf r ist Cyp2a4 f r Aufregulierung oder Thrsp f r Abregulierung 3 3 Best tigung der Microarray Ergebnisse mit Realtime PCR Um die Richtigkeit der Microarray Ergebnisse zu best tigen wurden ein paar ausgew hlte Transkripte mit Realtime PCR postevaluiert Expression des Transkriptes Solute carrier family 21 in der Leber der Maus 3 50E 00 3 00E 00 2 50E 00 2 00E 00 1 50E 00 1 00E 00 Normalisierte Genexpression au 5 00E 01 0 00E 00 Kontrolltiere Melatonin KR Behandlungsgruppe Abb 3 28 Realtime PCR Expression des Transkriptes Slc21a1 NM_013797 solute carrier family 21 organic anion transporter in der Leber der Maus N 4 pro Gruppe ZT6 Die Richtung der Beeinflussung des abgebildeten Transkriptes stimmte mit den Microarray Ergebnissen berein Zwischen Melatonin substituierten und Kontrolltieren konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden Die KR Tiere hingegen wiesen eine noch viel geringere Expression dieses Transkriptes auf als durch das Microarray Ergebnis zu erwarten gewesen w re Die Expression lag verglichen zu den Kontrolltieren mehr als 11 14 Fach niedriger Verglichen zu den Melatonin substituierten Tieren aufgrund der hohen Standardabweichung bei der MT bei 7 26 fach niedriger 3 Ergebnisse 94 Exp
96. d qRT PCR revealed a strong change of the hepatic transcriptome by CR less severe by MT The most upregulated genes by CR were P450 cytochrome oxidases the most reduced transcripts belonged to the fatty acid metabolism MT induced transcripts for instance belonged to the cell cycle and detoxification most of the downregulated transcripts belonged to the solute carrier family There was only little consensus in the gene expression profile of CR and MT treated animals The analysis of the hypothalamic gene expression with microarrays and qRT PCR yielded a multitude of circadian regulated genes The expression of the canonical clock genes was mostly as described in the literature Old mice 30 months displayed a reduced expression of many of these genes at ZT6 Otherwise there were only few age related changes in gene expression CR and MT treatments showed little effects on the well studied core components of the circadian system However microarray analysis of the circadian gene expression revealed a complex network of differential regulation All newly identified rhythmical transcripts were also rhythmical in the hypothalami of CR and MT mice although there were group dependent variations in the phase and amplitude of circadian expression Some rhythmic components have previously been identified in other tissues such as liver for others this finding is novel The occurrence of E Box elements in the promoter regions of some of the identified transcr
97. den mit Mineralien Vitaminen und Proteinen angereichert enthalten aber weniger Fett Man unterscheidet verschiedene Arten von Di ten Nicht aufgereinigte Di ten nonpurified diets NPD halbaufereinigt semipurified diets SPD und aufgereinigt purified diets Nichtaufgereinigte Di ten enthalten weniger veredelte Inhaltsstoffe wie z B Weizensamen Getreideschrot und Fisch l Aufgereinigte und halbaufgereinigte Di ten sind sehr sorgf ltig zusammengesetzt Sie enthalten unter anderem Sucrose Getreide le Laktalbumin und Casein Pugh et al 1999 Die Starke der kalorischen Restriktion wird immer in Prozent zur durchschnittlichen ad libitum Nahrungsaufnahme von Kontrolltieren bezogen 1 Einleitung 17 Wie aus Abb 1 7 ersichtlich konnten Weindruch et al 1996 2003 einen direkten Zusammenhang von aufgenommener Kalorienmenge und maximaler Lebensspanne beobachten Die durchschnittliche Lebensspanne von 27 Monaten bei Kontrolltieren konnte auf 45 Monate bei starker kalorischer Restriktion 40 50kcal Woche erh ht werden Aber auch schon eine geringere Restriktion 85kcal Woche hatte einen lebensverl ngernden Effekt auf die M use Wie KR den Alterungsprozess verlangsamt ist noch nicht klar M glicherweise spielen hormonelle Ver nderungen eine niedrige K rpertemperatur und Metabolismusrate Verringerung der freien Radikalbildung Verringerung des K rperfettanteils und St rkung des Immunsystems eine entscheidende
98. die gleiche Uhrzeit restriktiv gef ttert werden nimmt 2 4 Stunden vor diesem Zeitpunkt die Aktivit t zu Mistlberger 1994 Diese Nahrungs antizipatorische Aktivit t FAA food anticipatory activity ist sogar dann vorhanden wenn der Sitz der molekularen Uhr der SCN l sioniert wurde Stephan et al 1979 Deswegen wird der FAA als SCN unabh ngiger Rhythmus betrachtet Molekularbiologisch ist dies noch interessanter denn Wakamatsu et al 2001 haben festgestellt dass auch der Rhythmus der Uhr Gene mPer und mPer2 durch diese zeitlich definierte F tterung in ihrer Phase verschoben wird Allerdings gilt dies nur f r den Cortex und den Hippocampus im SCN bleibt der mPer und mPer2 Rhythmus klar an Licht als Zeitgeber gekoppelt Es ist also m glich dass die Expression der mPer Gene au erhalb des SCN den SCN unabh ngigen Aktivit tsrhythmus steuert als sekund rer Schrittmacher Es ist wenig ber die Mechanismen die zu diesem Ph nomen f hren bekannt Choi et al 1998 M glicherweise werden in vielen peripheren Geweben Uhrgene entsprechend flexibel reguliert Falls dies der Fall ist k nnte es bedeuten dass die Komponenten der circadianen Uhr f r sehr weitl ufige metabolische Funktionen notwendig sind und sich n tigenfalls vom vorgegebenen Rhythmus des SCN abkoppeln 1 4 Ziel der Arbeit Das Verst ndnis um die Bedeutsamkeit der Chronobiologie nimmt rapide zu Insbesondere in der Alternsforschung gibt es ein gro
99. dings gab es hier gruppenabh ngige Variationen in der Phase und Amplitude des circadianen Expressionsverlaufes Einige rhythmische Komponenten wurden bisher in anderen Geweben wie z B der Leber identifiziert andere sind v llig neu Das Vorkommen von E Box Elementen in den Promotorbereichen einiger der identifizierten Transkripte spricht f r eine direkte Steuerung durch die positiven Elemente Clock Bmal1 der inneren Uhr 5 Zusammenfassung 144 Es wurden neue Transkripte identifiziert die eine Beteiligung von Untereinheiten von Ionenkan len wie derzeit von der wissenschaftlichen Gemeinschaft angenommen an der Etablierung des circadianen Rhythmus wahrscheinlich macht Ferner gab es beim Vergleich der Genexpression mit anderen Studien sowohl f r KR als auch f r MT Behandlung bereinstimmungen Die Mechanismen durch die KR und MT Behandlungen wirken sind gemessen an den Expressionsprofilen v llig unterschiedlicher Natur KR ver ndert u a die Expression metabolischer Transkripte aus der Gluconeogenese und Glycolyse MT beeinflusst viele Transkripte der G Protein gekoppelten Signaltransduktion RGS Camk2d Calmodulin Melatonin scheint einige Komponenten aus Signalwegen der circadianen Uhr zu beeinflussen aus der eine Sensitivierung des Zeitmessungssystems resultiert Dies k nnte den positiven Effekt von Melatonin auf das murine circadiane System erkl ren KR hatte in einigen F llen den gegens tzlichen Effekt von Melatonin
100. dominanten negativen Regulatoren der circadianen R ckkopplungsschleife Kume et al 1999 Ferner k nnte ein Zusammenhang mit dem beobachteten phase splitting bestehen Daan und Mitarbeiter 2001 erweiterten die Duale Oszillatoren Hypothese und stellten die These auf dass die innere Uhr im SCN aus einem nicht redundanten Doppelkomplex circadianer Gene besteht Hierbei bilden die Proteine PERI und CRY1 die schon erw hnte Morgen Komponente und PER2 und CRY2 die Abendkomponente morning amp evening oscillators Der M Oszillator PER1 CRY1 w rde durch Licht beschleunigt und durch Dunkelheit gebremst werden Der E Oszillator PER2 CRY2 w rde durch Licht gebremst und durch Dunkelheit beschleunigt werden 4 Diskussion 134 Da das Per2 Transkript nicht ver ndert war gegen ber unbehandelten Tieren bleibt nur Cry2 als Teil der E Komponente dessen st rkere Expression den Abendoszillator so sehr kr ftigen k nnte dass er sich wie auf den entsprechenden Aktogrammen sichtbar vom Morgenoszillator abkoppelt Die Expression von Bmall ist wie beschrieben Oster et al 2003 antiphasisch zu der von Per und Cry mit einem Minimum in der Lichtphase zwischen ZT6 und ZT12 und einem Maximum gegen ZT18 Die Amplitude von Bmall im Hypothalamus ist sehr gering es gibt recht hohe Standardabweichungen Je nach berichtender Forschergruppe gibt es Diskrepanzen zwischen den Phasen der Uhr Gene Per Cry Bmal etc Da h ufig unterschiedliche St
101. e Ans tze wurden in den auf 95 C vorgeheizten PCR Block gestellt Der Robocycler verf gt ber einen beheizbaren Deckel der das berschichten der PCR Reaktion mit Mineral l um Evaporation zu vermeiden unn tig macht Die PCR wurde standardm ig unter folgenden Bedingungen durchgef hrt 1 95 C 5 min Hitzeaktivierung DNA Polymerase Hot Start 2 95 C 15s Denaturierung 3 60 C 30s Primer Hybridisierung je nach Primer variabel 4 72 C 1 min Elongation 5 95 C 2 min finale Elongation Die PCR Zyklen bestanden aus einer Wiederholung der Schritte 2 4 35x Die Anlagerungstemperatur der Primer war individuell abh ngig von der Schmelztemperatur Sul Aliquote der PCR Produkte wurden auf ein 1 1 5 iges analytisches Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt 2 10 1 Quantitative Realtime PCR LightCycler iCycler Theorie Die bisher beschriebene PCR Methode ist nichtquantitativ d h man kann keinen R ckschluss auf die Menge an amplifiziertem Transkript in der untersuchten Probe ziehen Allerdings ist dies genau der zu untersuchende Faktor in dieser Arbeit Es sollten die Genexpressionen von verschiedenen Proben unterschiedlichen Zeitpunkten oder Behandlungen untersucht werden Der Verlauf einer PCR Amplifizierung hat sigmoidalen Charakter d h sie hat S ttigungsverhalten Eine PCR verl uft meist nur innnerhalb von 6 8 Zyklen exponentiell Nur w hrend dieses Bereichs kann eine quantitative Aussage g
102. e feinere Einteilung vornehmen K rzer als einen Tag sind ultradiane Rhythmen l nger sind infradiane Rhythmen Typische ultradiane Rhythmen reichen vom Bruchteil einer Sekunde z B der elektrischen Aktivit t von Neuronen ber Sekunden dem Herzschlag und der Atmung bis zu mehreren Stunden z B der pulsatilen Sekretion einiger Hormone Der prominenteste circadiane Rhythmus ist der Wach Schlaf Rhythmus Infradiane Rhythmen von mehr als 24 Stunden sind z B der Menstruationszyklus Arendt 1995 oder der saisonal bedingte Fellwechsel bei einigen Tieren Wie lassen sich circadiane Rhythmen am besten definieren Circadiane Rhythmen sind der u ere Ausdruck eines internen Zeitmessungssystems welches die Tageszeit misst Circadiane Uhren werden von sich periodisch wiederholenden Reizen der Umwelt gestellt bzw synchronisiert wobei das Licht den st rksten synchronisierenden Stimulus Zeitgeber darstellt Da diese Rhythmen endogen generiert werden laufen sie auch nach Ausschluss aller zeitgebenden Einfl sse vor allem Licht weiter Biologische Uhren werden deshalb auch als Schrittmacher pacemaker bezeichnet 1 Einleitung 1 In S ugetieren ist der dominante Schrittmacher master circadian clock in den suprachiasmatischen Nuclei SCN des anterioren Hypothalamus lokalisiert Reppert amp Weaver 2001 Der unter nat rlichen Bedingungen vorgegebene Rhythmus ist f r alle Lebewesen dieser Erde gleich seine Ursache liegt i
103. e im Hypothalamus von KR Tieren eine circadiane Variation aufweisen Einige der in der KR Gruppe circadian regulierten Transkripte weisen zum selben Zeitpunkt wie bei der Kontrollgruppe ein Maximum bzw Minimum auf Hierzu geh ren an ZT 6 die Transkripte Insr und Grpr oder an ZT 12 das Transkript Eif4ebp2 Der circadiane Verlauf dieser Transkripte ist im Vergleich zu den Kontrolltieren kaum beeinflusst Daten nicht gezeigt Andere Transkripte die bei den Kontrolltieren nicht als circadian auffielen werden in der KR Gruppe rhythmisch exprimiert Einige dieser Transkripte sind an ihrem circadianen Minimum und Maximum getroffen worden dies bedeutet dass es sich hierbei um die Transkripte mit der gr ten circadianen Amplitude handelt Hierzu geh ren ein gap junction Ionenkanalprotein ein ribosomales Protein und eine Map Kinase Map2k4 3 Ergebnisse 108 3 5 3 0 2 5 2 0 1 5 1 0 0 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 Expressionsratio zu ZT 0 e o Scnia Calm2 Circadian regulierte Transkripte im Hypothalamus von MT Mausen a MT EMT ZT 6 0 Gja1 Calm1 Cent1 Insr Tgfb3 ZT 12 0 ZT 18 0 ogsWwN x aa 02 a o 2go aeons 5 E 238 o co t ox FC Gar Br EZ EX boc oO E E ooo o o o E r oO oO c a a c n 9 n o0 5 iu 62 o an N 2 Gensymbol o Mcsp Eif4ebp2 Abb 3 41 Transkripte die im Hypothalamus von MT Tieren eine circadiane Variation aufweisen
104. e und erscheint auf einigen anderen Aktogrammen ebenfalls Hierbei wird immer graphisch in der n chsten Zeile fortgefahren der Ausfall der Datenaufzeichnung betrug nur wenige Stunden t F TE FIETMFLTFRERFEDSEBEREFFEFDEEERRBEEBELERTLE diii n pd 2 242411 0112 1 311 E en E 7 rer Abb 3 3 Repr sentatives Aktogramm einer Kontrollmaus im Alter von 7 10 Monaten Es herrschte eine Lichtperiode von 06 00 18 00 gefolgt von DD bis zur Wiederherstellung der urspr nglichen Lichtperiode A Das Lichtregime f r das oben gezeigte Aktogramm war identisch mit dem aus Abb 3 2 Das Versuchstier zeigte ebenfalls einen resoluten Tag Nacht Rhythmus unter LD und einen Freilauf unter DD Die endogene Periode t betrug 23 3 Stunden Der Gruppendurchschnitt betrug 23 47 0 08 Stunden 3 Ergebnisse 71 zl IE ar Mn a Na Ae uan uad wb Lei ww x Abb 3 4 Repr sentatives Aktogramm einer Kontrollmaus im Alter von 11 14 Monaten Es herrschte eine Lichtperiode von 10 00 22 00 Uhr gefolgt von einer 4 Stunden Phasenverz gerung auf 14 00 02 00 Lichtperiode Anschlie end DD bis zur Wiederherstellung der 14 00 02 00 Uhr Lichtperiode A Bei dem oben gezeigten Aktogramm wurde zus tzlich zu den LD und DD Experimenten eine Phasenverz gerung durchgef hrt Hierzu wurde die elektronisch gesteuerte Beleuchtung vier Stunden nach hinten sp ter versetzt c Nach einer Eingew hnung von etwa drei Tagen zeigte das Tier eine gu
105. ebliebene Menge gewogen wurde Der Mittelwert des gefressenen Futters betrug pro Tag 4 3g und wurde als 100 festgelegt Die Tiere wurden 3 Mal die Woche gef ttert Montags und Mittwochs bekamen sie 2 7 ihrer w chentlichen Nahrung Freitags 3 7 Gef ttert wurde w hrend der Aktivit tsphase der Tiere um keinen zus tzlichen Zeitgeber Stimulus zu setzen Zus tzlich wurde die F tterungszeit regelm ig ver ndert ebenfalls um eine Gew hnung zu verhindern Die Tiere der KR Gruppe bekamen f r die ersten 2 Wochen dieselbe Menge Normalfutter wie die Tiere der anderen beiden Gruppen F r die n chsten 2 Wochen bekamen die KR Tiere 100 der Restriktionsdi t um sie an das neue Futter zu gew hnen Nach weiteren 14 Tagen wurde die angebotene Futtermenge auf 80 dann auf die finalen 60 des t glichen Bedarfwertes reduziert 2 6g Tag Die 20 Melatonin substituierten Tiere bekamen nebst der gleichen Di t wie die Normaltiere 5ug ml Melatonin ber das Trinkwasser verabreicht die verwendeten Trinkflaschen wurden aufgrund der photolabilen Eigenschaften von Melatonin schwarz lackiert und das Wasser zweimal die Woche ersetzt Da Melatonin an sich nicht wasserl slich ist wurden Stockl sungen von 5mg ml in 96 Ethanol hergestellt Um einen Liter melatoninhaltiges Wasser herzustellen wurde entsprechend 1ml Melatonin Stockl sung ben tigt 2 Material und Methoden 26 2 Material und Methoden 27 Da nun Alkohol im Wasser enthalten war 0
106. ed by photoperiod J Biol Rhythms 18 2 134 44 Teena and Wax M A 1975 Runwheel acticvity patterns in mature young and senescent mice the effect of constant lighting conditions J Geriontol 30 22 27 Tei H H Okamura et al 1997 Circadian oscillation of a mammalian homologue of the Drosophila period gene Nature 389 6650 512 6 Ueda H R W Chen et al 2002 A transcription factor response element for gene expression during circadian night Nature 418 6897 534 9 Unger J W and M Betz 1998 Insulin receptors and signal transduction proteins in the hypothalamo hypophyseal system a review on morphological findings and functional implications Histol Histopathol 13 4 1215 24 Valentinuzzi V S K Scarbrough et al 1997 Effects of aging on the circadian rhythm of wheel running activity in C57BL 6 mice Am J Physiol 273 6 Pt 2 R1957 64 van der Horst G T M Muijtjens et al 1999 Mammalian Cry1 and Cry2 are essential for maintenance of circadian rhythms Nature 398 6728 627 30 van der Knaap M S P A Leegwater et al 2002 Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor elF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter Ann Neurol 51 2 264 70 Van Reeth O 2001 Biological rhythm and man s environment work and jet lag Rev Med Interne 22 Suppl 1 26s 28s Van Reeth O and F W Turek 1992 Changes in the phase response curve of the
107. edene Messenger RNAs mRNAs Die mRNAs spiegeln den momentanen Zustand der Zelle wider ihre Gesamtheit wird als Transkriptom bezeichnet Jedes Gewebe wenn nicht sogar jede Zelle hat ihr spezifisches Genexpressionsmuster in Form von mRNAs je nachdem was ihre Funktion im Organismus ist Die isolierte Gesamt RNA ist Ausgangsmaterial f r diverse molekularbiologische Methoden wie cDNA Synthese Northern Blot RNAse Protection Assay RPA etc RNAs sind sehr labil und werden bei Kontamination mit endo oder exogenen RNAsen die abundant sind abgebaut Um die RNA bei der cDNA Synthese zu sch tzen kann ein Ribonuklease Inhibitor verwendet werden der in den Reaktionsansatz hinzupipettiert wird Material RNA Later Ambion Trizol Invitrogen Chloroform Merck Isopropanol Merck DEPC Wasser UltraTurrax Janke amp Kunkel 2 Material und Methoden 35 Ethanol Merck Methode Die langfristige Lagerung der Gewebeteile erfolgte bei 80 C Die Gehirne die zur Bearbeitung in die USA geschickt wurden waren zus tzlich in RNALater konserviert nachdem sie in fl ssigem Stickstoff schockgefroren wurden Die Isolierung von RNA erfolgte mit Hilfe einer Fl ssig Extraktionsmethode Trizol Invitrogen die eine Modifikation der Methode nach Chomczynski amp Sacchi 1987 darstellt 5 ml Trizol M L sung wurden zu je 50 100 mg Gewebe gegeben Die Gewebepr parate wurden in 15ml Falcon Tubes mit einem UltraTurrax
108. ee OP on oom 260 270 re a H H WE 766 Val Phe Val Val Phe Ala Ile Cys Trp Ala Pro Leu Asn Cys Ile MT2 complete SEQ 766 GTG TIT GTG GTT TIT GCC ATA TGC TGG GCC CCC CTC AAC TGT ATC Abb 3 20 Auszug aus der Sequenz AY078982 Mus musculus strain B6C3F1 MT2 melatonin receptor mRNA partial cds Resuehr amp Olcese 2002 verglichen mit der sp ter komplett ver ffentlichten Sequenz AY145850 Mus musculus Mellb melatonin receptor mRNA complete cds Jin et al 2003 3 Ergebnisse 87 In der isolierten Sequenz gibt es einen Basenaustausch von ACG gt GAG der einen Aminos ureaustausch von Threonin zu Glutamat verursacht Das offene Leseraster ist bis zum Stopcodon intakt 3 2 2 PCR Amplifikation von Uhr Genen im Hypothalamus der Maus Alle in dieser Studie verwendeten PCR Primer wurden unter Standard und Realtime PCR Bedingungen getestet Die PCR Produkte wurden gelelektrophoretisch analysiert um die korrekte Gr e des Produktes festzustellen und das Vorhandensein von st renden Nebenprodukten auszuschlieBen Exemplarisch stelle ich folgende PCR Produkte vor Abb 3 21 PCR Amplifikation von Uhr genen im Hypothalamus der Maus Es wurde als zu amplifizierende Matrize cDNA eines unbehandelten Kontrolltieres vom Zeitpunkt ZT 12 genommen Amplifikation erfolgte im I Cycler nach Standard PCR Protokoll bei 60 C Annealingtempereatur M 100bp Gr enstandard 1 CLOCK 2 MTI 3 MT2 4 Perl 5 Per2
109. einkinase CKle multimerische Komplexe Anschliessend werden sie von dieser Kinase phosphoryliert Der phosphorylierte CRY PER CKle Komplex ist instabil die Phosphorylierung ist eine Markierung zum Abbau und wird nach Erreichen einer Schwellenkonzentration in den Nukleus transloziert Gekkakis et al 1998 Im Nukleus wirkt der Komplex vor allem aber die mCRY Proteine als negative Regulatoren Sie interagieren direkt mit CLOCK und oder BMALI und inhibieren die von ihnen angetriebene Transkription der mPer und mCry Gene Kume et al 1999 Die mPER und mCRY Proteine hemmen ihre eigene Transkription und bilden somit die negative R ckkopplungsschleife Auch die Transkription des Genproduktes von REV ERBa wird durch die CLOCK und BMAL1 Heterodimere aktiviert Es ist Ligand f r einen nukle ren orphan Rezeptor ROR response element im Promotorbereich von BMAL1 Die Bindung von REV ERBa an dieses Element f hrt zur Inhibition der BMAL1 Transkription Preitner et al 2002 Die steigenden Mengen an mPER und mCRY Proteinen im Nukleus wiederum inhibieren die Transkription von REV ERBo was zu einer Derepression Aktivierung von BMALI1 f hrt REV ERBa agiert quasi als Verbindung zwischen den negativen mPer mCry und den positiven CLOCK BMAL Elementen der R ckkopplungsschleife Seine circadiane Regulation unterliegt den negativen Elementen der Schleife es selber steuert die rhythmische Expression von BMALI einem positiven Element Preitner
110. eise hat die circadiane Expression von Calmodulin auch etwas mit der beobachteten circadianen Expression vom Glutamat oder Gastrin releasing peptide receptor zu tun In vorherigen Studien der Genexpression im Neocortex und Cerebellum Lee et al 2000 wurden nur etwa 146 der untersuchten Gene durch das Altern beeinflusst Es wurden bei den 30 Monate alten Kontrolltieren kaum genetische Ver nderungen entdeckt die offensichtlich pathologischen Ursprungs waren Dies mag daran liegen dass der B6C3F1 Stamm sehr 4 Diskussion 141 langlebig ist Dhahbi et al 2004 und die Tiere erst im fortgeschrittenen Alter ein solches Erscheinungsbild aufweisen Eine interessante Beobachtung war die circadiane Expression der Calcium Calmodulin abh ngigen Proteinkinase II delta Camk2d bei den MT Tieren und die der MAP Kinase Map2k4 bei den KR Tieren Der MAPK Signalweg spielt im SCN eine wichtige Rolle in der Transduktion des photopischen input Signals zum Kern Oszillator Hirota 2004 Die MAPK wird durch Licht phosphoryliert und synchronisiert die Uhr durch Induktion von Perl ber den CREB CRE Transkriptionsweg Andererseits attenuiert die Camk2d die photopische Induktion der MAPK phosphorylierung welches den Camk2d Signalweg als bergeordneten Regulator des MAPK Signalweges impliziert Butcher et al 2002 Mit der MAPK und der Camk2d wurden zwei Komponenten aus dem tiefen Inneren der circadianen Uhr identifiziert die durch die applizierte Behandlung
111. elle multiple cloning site Milligram Milliliter Millimolar Minuten MTI Rezeptor MT2 Rezeptor Mikroliter Boten RNA messenger RNA Melatonin substituierte Tiere Molekulargewicht molecular weight Stoffmenge Natriumacetat Nitroblau Tetrazolium Nanometer Nukleotide Amino Terminus optische Dichte Offener Leserahmen open reading frame pituitary adenylyl cyclase activating peptide Polymerase Kettenreaktion polymerase chain reaction Hydrogenanion Exponent potentia hydrogenii Relative Fluoreszenzeinheiten relative fluorescence units Ribunuklease Raumtemperatur PCR nach reverser Transkription der mRNA in cDNA Sekunden Thymidin Schmelztemperatur Tabelle Tris Acetat EDTA Puffer Tris Borat EDTA Puffer Tris EDTA Puffer Amino Terminus Carboxy Terminus Tris hydroxymethyl aminomethan Einheit unit Umdrehungen pro Minute ber Nacht untranslatierte Region Ultraviolett Volt Volumen Volumen Volumen Masse Volumen Masse Masse 5 Bromo 4 chloro 3 indolyl B D Galactopyranosid Zeitgeberzeit 6 Anhang 149 6 2 Glossar annealing antisense Strang antisense Primer Array blotten Elongation EST heat shock Proteine hsp Insert knock out K O mismatch Pellet Primer Robocycler sense Strang sense Primer Template Thermocycler Transkripte Vortexer 6 3 Literaturverzeichnis Anlagerung eines Primers an sein Template engl zu der mRNA komplement re DNA Str
112. elt eine entscheidende Rolle in der Einleitung der Translation Abbott et al 2004 Mutationen in diesem Gen l sen eine schwere Krankheit aus die Leukoencephalopatie mit schwindender wei er Masse bzw Kindheits Ataxie mit zentraler Hypomyelierung Leegwater et al 2001 2003 genannt wird Tr ger von Mutationen in diesem Gen entwickeln sich erst normal erfahren aber sp ter progressiven neurologischen Verfall in Verbindung mit Ataxien und Spastiken In Kontrolltieren zeigt Eif2b ein circadianes Maximum um ZT6 und Minimum um ZT18 Bei alten Tieren ist die Expression um ZT6 auf etwa 60 gegen ber den Kontrolltieren reduziert Allerdings zeigt die Melatoninsubstitution an ZTO 6 und 12 ebenfalls eine Abregulierung dieses Transkriptes In Anbetracht der gravierenden neurologischen Bedeutung dieses Translationsfaktors w re es sicherlich interessant festzustellen ob eine altersbedingte Ver nderung ebenfalls an Pathologien gekoppelt ist Mit einem beinahe 3 5 fachen Expressionsmaximum an ZT6 ist der Insulinrezeptor Insrr aufgefallen Insulin und sein Rezeptor kommt weit verbreitet im zentralen Nervensystem vor insbesondere in Regionen die an der Regelung der Energie Hom ostase beteiligt sind Gerozissis et al 2004 Eine circadiane Schwankung der Rezeptorexpression wurde in den Hypothalami aller betrachteten Tiere festgestellt Der Zeitpunkt maximaler Expression war um ZT6 Bei den KR Tieren war die Expression zu diesem Zeitpunkt ca 5
113. en Konzentrationen gibt es einen residualen Effekt Von Gall et al 2000 Der MTI MT2 Doppelknockout zeigt noch nicht einmal mehr diesen Effekt Es scheint also dass der MTI Rezeptor bei niedriger Konzentration und der MT2 Rezeptor bei hohen Konzentrationen Reaktionen weiterleitet Dies k nnte dadurch erkl rt werden dass der MT2 Rezeptor eine wesentlich geringere Affinit t zu Melatonin hat als der MT1 Rezeptor MT2 Rezeptor K42199 9 13 4pM MT1 Rezeptor Kg 59 3 18 3pM Jin et al 2003 Es gibt Bindungsstellen fiir Melatonin im hypophys ren Pars tuberalis die mit der Steuerung der Reproduktion in sich saisonal fortpflanzenden Spezies in Verbindung gebracht werden Reppert et al 1994 1 Einleitung 13 Die Rezeptoren im Nucleus paraventricularis des Thalamus k nnten auf die Regulierung limbischer Funktionen wirken z B den sedativen Effekt von Melatonin auf tagaktive S uger vermitteln Rezeptoren in cerebralen Arterien k nnten Einfluss auf die kardiovaskul re Funktion und Temperaturregulation haben Viswanathan et al 1990 Der MT1 Rezeptor ist haupts chlich im SCN und in vielen Spezies auch im Pars tuberalis exprimiert Roca et al 1996 Der MT2 Rezeptor kommt haupts chlich in der Retina vor Andere Hirnregionen wie Hippocampus oder Cortex zeigen sehr niedrige Rezeptor mRNA Expression Es wurden sowohl Spezies als auch Altersunterschiede in der Rezeptorexpression beobachtet In alternden M usen nimmt die detektierbare mRN
114. en um m nnliche M use Mus musculus domesticus L des Stammes B6C3F1 Sie wurden von der Firma Charles River Wilmington MA gekauft Dies ist die Fl Generation eines Hybridstammes Er wurde erzeugt durch Kreuzung des maternalen C57BL 6 mit dem paternalen C3H Stamm Dieser Stamm ist genotypisch und ph notypisch uniform und toleriert Gewebetransplantationen Tumoren Ovarien Haut von M usen jedes parentalen Stammes die haupts chliche Anwendung findet in diesem Bereich und in der Toxikologie statt Die Entscheidung f r diesen Stamm als Tiermodell in meiner Arbeit beruht auf der Tatsache dass der paternale Stamm C3H Melatonin profizient ist Der maternale Stamm C57BL 6 ist Melatonin defizient wie viele andere Labormausst mme auch Die F1 Generation produziert Melatonin aber in sehr geringen Mengen Die Tiere hatten ein Alter von 6 Wochen zu Beginn des Versuches Alle Tiere wurden gewogen und entsprechend ihres K rpergewichtes in 3 Gruppen eingeteilt Normal Melatonin KR dessen mittleres K rpergewicht gleich war Die Tierhaltung erfolgte einzeln in Plexiglask figen die zur berwachung Infrarotsensoren Conrad Elektronik installiert hatten Es herrschte im Tierstall eine relative Luftfeuchtigkeit von 68 bei einer durchschnittlichen Raumtemperatur von 20 2 C Der Lichtzyklus war zu Beginn der Versuchsperiode Licht an von 06 00 Uhr 18 00 Uhr Dunkelheit dementsprechend von 18 00 Uhr bis 06 00 Uhr Modifikationen des Lichtzyk
115. ension 2400 PC 2 2 GHz 80 GB Festplatte 256 MB Arbeitsspeicher bertragen Zur statistischen Evaluierung der Daten wurden die Rohdateien konvertiert und in Excel amp importiert Ein Teil der Exceldaten wurde mit GraphPad Prism weiter statistisch bearbeitet 2 4 Bakterienstamme Escherichia coli TOP10 One Shot Invitrogen Genotyp F acIq Tn 0 Tetr mcrA mrr hsdRMS mcrBC ODF M15 ODFX74 deoR recAl araD139 ara leu 7697 galU galK rpsL Strr endAl nupG 2 5 Verwendete PCR Oligonukleotide Primer Alle Primer wurden bei den Firmen MWG Ebersberg bzw IDT Coralville USA synthetisiert Alle Primer sind in 5 3 Orientierung aufgef hrt 2 5 1 Standard Uhr Gen Primer Cryptochrom 1 mCry 1 mCry1 FW 5 GAGGGCTGGATCCACCATTTAG mCryl1 Rev 3 CTACAGCTCGGGACGTTCTCTC Cryptochrom 2 mCry2 mCry2 FW 5 CCTTGGATTGACGCCATCATGAC mCry2 Rev 3 GAGTCCTTGCTTGCTGGCTCTTG 2 Material und Methoden 31 CLOCK mCIKk Spleissvariante delta 18 mClk FW 5 mClk Rev 3 CLOCK mClk total CDS CLOCK total F 5 CLOCK total R 3 Period 2 mPer2 F 5 mPer2 R 3 Typ 2 Melatonin Rezeptor mMT2 mMT2 A F 5 mMT2 A R 3 mMT2 B F 5 mMT2 B R 3 mMT2_3 UTR_B 3 GCGAGAACTTGGCATTGAAGAG CTGTGTCCACTCATTACACTCTG AGCTGGGGTCTATGCTTCCT CTACTGTGGCTGGACCTTGG GAGGAGTACTACCAGCTGCTAA ATTCTAGGCGCTTCATAGCCCGA TACTGCTGCATCTGTCATAG GCGCAAATCACTCGGTCTCA GGTCTGCAGTCACTGGTATA CACAAACACTGCAAACATGG CCACTC
116. epr sentatives Aktogramm einer KR Maus im Alter von 11 14 Monaten Es herrschte eine Lichtperiode von 10 00 22 00 Uhr gefolgt von einer 4 Stunden Phasenverz gerung auf 14 00 02 00 Lichtperiode c Anschlie end DD bis zur Wiederherstellung der 14 00 02 00 Uhr Lichtperiode A Das hier untersuchte Tier der KR Gruppe zeigte dieselben Auffalligkeiten wie das vorherige j ngere Die endogene Periode t betrug 23 6 Stunden welches unter dem Gruppendurchschnitt von 23 92 0 02 Stunden in diesem Alter liegt Der Rhythmus ist sehr stark fragmentiert allerdings gelingt die Resynchronisation an LD Bedingungen besser 3 Ergebnisse 74 44933041399 Sg poe ten en ue ia cro Abb 3 7 Repr sentatives Aktogramm einer Melatonin substituierten Maus im Alter von 7 10 Monaten Es herrschte eine Lichtperiode von 06 00 18 00 Uhr Anschlie end DD bis zur Wiederherstellung der 06 00 18 00 Uhr Lichtperiode A Die Tiere der Melatonin substituierten Gruppe hatten wie hier exemplarisch dargestellt eine sehr gute Anpassung an LD Bedingungen sowie eine schnelle Resynchonisation auf LD Bedingungen nach einer DD Phase Interessanterweise spaltet sich das Aktivititsmaximum unter DD Bedingungen allm hlich in 2 Komponenten auf dessen Phasenabstand sich zunehmend vergr ert Dieses Ph nomen wurde mit h chster H ufigkeit bei den Melatonin substituierten Tieren beobachtet 5 von 10 und trat bei KR Tieren nicht auf Nur zwei der Kontrollti
117. erden manche Transkripte nur durch eine oder die andere Behandlung rhythmisch exprimiert Werden in unbehandelten Tieren rhythmische Transkripte durch eine meiner Behandlungen in ihrer Periodik beeintr chtigt B Vergleiche zwischen den Gruppen angestellt um zu sehen welche Gene durch die Behandlungen beeinflusst werden M glicherweise gibt es Transkripte die von KR und Melatonin hnlich reguliert werden C Untersucht ob Gene die bekannterma en beim alternden Organismus differentiell 1 Einleitung 23 reguliert werden auf meine Behandlungen ansprechen Werden Gene die erwiesenerma en an neurologischen Erkrankungen beteiligt sind beeinflusst Diese Arbeit beinhaltet zwei sehr unterschiedliche Disziplinen biologischer Forschung die selten im Zusammenhang untersucht werden Verhaltensbiologie und Molekularbiologie Ich habe in Kooperation des IHF Institut f r Hormon und Fortpflanzungsforschung in Hamburg mit dem Department of Biomedical Sciences FSU College of Medicine Tallahassee USA gearbeitet Hierbei war es mir m glich allermodernste Methoden der Molekularbiologie anzuwenden Die Nutzung der Microarray Technologie und quantitativer Realtime PCR wird zunehmend zum Alltag in modernen Forschungslaboratorien F r die biomedizinische Forschung sind diese Methoden ein gro er Schritt vorw rts 1 Einleitung 24 2 Material und Methoden 2 1 Tiermaterial M use des Stammes B6C3F1 Es handelt sich bei den Versuchstier
118. ere wiesen diese Art der Phasenspaltung auf Die endogene Tagesl nge des dargestellten Tieres betrug 1 23 3 Stunden Der Gruppendurchschnitt betrug in diesem Alter 23 43 0 06 Stunden 3 Ergebnisse 75 Abb 3 8 Repr sentatives Aktogramm einer Melatonin substituierten Maus im Alter von 11 14 Monaten Es herrschte eine Lichtperiode von 10 00 22 00 Uhr gefolgt von einer 4 Stunden Phasenverz gerung auf 14 00 02 00 Lichtperiode c Anschlie end DD bis zur Wiederherstellung der 14 00 02 00 Uhr Lichtperiode A Diese Tier zeigt insgesamt etwas weniger Aktivit t als das vorherige j ngere Melatonin substituierte Die Anpassung an die Phasenverz gerung gt sowie die Wiederherstellung des LD Zyklus nach DD A geschah sehr schnell Die Aufspaltung des Aktivit tsrhythmus in zwei Phasen war bei diesem Tier nur sehr gering Die endogene Periode betrug 1 23 6 Stunden Gruppendurchschnitt 23 84 0 03 Stunden Der Zeilenumbruch in der Aktivit tsaufzeichnung bei Wiederherstellung der 14 00 02 00 Uhr Lichtperiode kam durch einen automatischen Neustart des Systems nach kurzem Stromausfall zustande 3 Ergebnisse 76 Abb 3 9 Repr sentatives Aktogramm einer Kontrollmaus im Alter von 15 18 Monaten Es herrschte eine Lichtperiode von 06 00 18 00 Uhr W hren der DD Phase wurde ein 30min Lichtpuls gesetzt 4 Wiederherstellung von LD A Ebenso wie die j ngeren Tiere der Kontrollgruppe zeigte dieses Tier einen robusten circadianen Rhy
119. erenden Effekt auf die Induktion von C4 Melatonin hingegen unterdr ckte die C4 Expression mehr als 2 fach an ZTO und ZT6 geringer an ZT12 und ZT18 Eine M glichkeit warum dieses Ergebnis dem aus dem Neocortex und Cerebellum von Weindruch und Mitarbeitern 2003 widerspricht ist die geringe berlappung einzelner Transkripte zwischen 4 Diskussion 142 untersuchten Geweben die benutzte Microarray Technologie und die elektronische Datenauswertung hierauf wird sp ter eingegangen Die induzierbare Stickoxidsynthetase NOS2 wird durch Melatonin an drei von vier Zeitpunkten ab durch KR aufgeregelt Ein Einfluss von Melatonin auf NOS ist schon in Extrakten von Ratten Cerebellum beschrieben worden Lahiri et al 1999 Es wurde beobachtet dass es w hrend des Altersprozesses im Cortex zu einer Steigerung der NOS Aktivit t und der Menge an Proteinen mit nitrosilierten Tyrosinresten kommt Sharman et al 2002 Nitrosativer Stress wird mit Altern und der Pathogenese diverser neurodegenerativer Erkrankungen in Zusammenhang gebracht Calabrese et al 2000 Die durch Entz ndungsreize induzierbare NOS k nnte eine Hauptrolle beim Alterungsprozess vieler Organsysteme einschlie lich des Gehirns einnehmen McCann et al 1999 Die stark gegens tzliche Beeinflussung von NOS2 durch KR und MT w rde nach bisherigen Erkenntnissen bedeuten dass Melatonin auch in dieser Studie einen neuroprotektiven Effekt hat und KR einen neurodegenerativen Effekt da N
120. erungen durch KR reversibel sind Bei der Untersuchung der Genexpression in verschiedenen Geweben mit Hilfe von Microarrays und Realtime PCR wurde festgestellt dass der Effekt von KR von Gewebe zu Gewebe unterschiedlich sein kann Transkripte die z B in der Leber reguliert werden k nnen im Herzen oder im Gehirn unver ndert sein Weindruch et al 2001 1 Einleitung 20 Zusammenfassend l sst sich sagen dass neuronales Altern in einem Gen Expressionsprofil resultiert welches indikativ f r Entz ndungsreize oxidativem Stress und verringerte neurotrophe Unterst tzung ist Auf transkriptionellem Niveau zeigen sich bei M usen Parallelen zu humanen neurodegenerativen Erkrankungen Eine kalorische Restriktion also eine kalorienreduzierte Di t verlangsamt den Alterungsprozess und verringert in M usen die altersbedingte Induktion von Genen die an der Stress Antwort und entz ndlichen Prozessen beteiligt sind Lee amp Weindruch 2000 Die postulierten Mechanismen des ZNS Alterns beinhalten Instabilit t der nukle ren und mitochondrialen DNA Gaubatz et al 1994 neuroendokrine Dysfunktion McEwen et al 1998 die Produktion reaktiver sch dlicher Sauerstoffspezies Sohal et al 1996 ver ndertem Calzium Metabolismus Disterhoft et al 1994 und entz ndungsvermittelten neuronalen Sch den Blumenthal et al 1997 In der Tat ist eine kalorienreduzierte Ern hrung die einzige Intervention mit der es m glich ist die intri
121. et al 2002 Beide Schleifen sind durch das CLOCK BMALI Heterodimer funktionell verbunden CLOCK und BMAL1 Komplexe bilden also die Kernkomponente der molekularen inneren Uhr Shearman et al 2000 Reppert amp Weaver 2002 Dies wird dadurch deutlich dass in homozygoten Clock Clock KO M usen mit defektem CLOCK Protein die RNA Rhythmen von mPer1 3 und mCry1 2 im SCN deutlich reduziert sind Gekakkis et al 1998 Jin et al 1999 Kume et al 1999 Die Funktion der Caseinkinase Ie ist f r eine intakte biologische Uhr unerl sslich Eine Mutation beim syrischen Hamster f hrt zum Tau Ph notyp einer kurzen endogenen Periode Ralph et al 1988 Young et al 2000 Die Mutation betrifft nur den Austausch einer Aminos ure Cystein zu Arginin aber reduziert die Phosphorylierungsaktivit t der Kinasen erheblich Lowrey et al 2000 1 Einleitung 8 Die Expression von mPer wird durch Lichtexposition zu Beginn oder am Ende der Nacht induziert w hrend die von mPer2 nur am Begin der Nacht induziert wird mPer3 zeigt keine Regulierbarkeit durch Licht Albrecht et al 1997 1 2 Melatonin Das Hormon der Dunkelheit 1 2 1 Grundlegendes ber das Pinealhormon Das prim re Hormon der Pinealdr se ist Melatonin Sein Name r hrt von seiner Endeckung her den Melanophoren aus dem Krallenfrosch Xenopus Laevis Vor mehr als 40 Jahren beobachtet Aaron Lerner dass sich Krallenfrosch Melanophoren durch Kontakt mit Melatonin zusammen
122. etroffen werden Der Lightcycler der iCycler und alle anderen quantitativen PCR Maschinen k nnen die Menge der PCR Produkte in Echtzeit real time bestimmen Hierzu wird nach jedem Zyklus die Fluoreszenz des DNA spezifischen Farbstoffs SybrGreen I gemessen Die Fluoreszenzintensit t ist dabei proportional zur Menge an gebildeter dsDNA Die 2 Material und Methoden 41 Quantifizierung wird anschlie end mit der entsprechenden Software entweder relativ d h ber die Bestimmung des sog crossing points Anzahl der Zyklen die zu einer Fluoreszenz mit 2 Standardabweichungen ber dem Hintergrund f hren oder aber absolut ber Standard Eichkurven durchgef hrt Als Standardkurve kann man entweder ein Plasmid benutzen in das die entsprechende Zielsequenz kloniert ist oder ein aufgereinigtes PCR Produkt Wenn man ein Plasmid benutzt kann man anhand der Gr e des klonierten PCR Produktes und des verwendeten Plasmides ber die photometrische Bestimmung der Konzentration die Kopienzahl festlegen Die Quantifizierung mittels Realtime PCR erfolgt dann in Kopienzahl des zu untersuchenden Transkriptes Ich habe f r jede Primer Kombination ein PCR Produkt benutzt und als Verd nnungsreihe in 1 10 Schritten als Standard Eichkurve gemessen die Quantifizierung erfolgte in ng PCR Reaktion Am Ende einer jeden quantitativen PCR Reaktion ist es angeraten eine Schmelzkurve durchzuf hren Hierbei wird der Reaktionsansatz am Ende der PCR auf
123. ferenzen sind Neurotransmitter und sekretierte Faktoren die inhibitorische oder exzitatorische Wirkungen auf die lokomotorische Aktivitat aus ben TGF a wirkt bei Infusion in den dritten Ventrikel ber dem SCN inhibierend auf die Aktivit t von M usen Kramer et al 2001 Im Hypothalamus wurde eine circadian variierende Expression von TGF 83 beobachtet und zwar bei allen untersuchten Tiergruppen Nur um ZT6 war die Expression von TGF 3 bei den KR Tieren um etwa 53 reduziert ansonsten waren keine eindeutigen Behandlungseffekte erkennbar Die alten Tiere hatten ebenfalls eine niedrigere TGF 03 Expression ZT12 Wird angenommen dass auch das erw hnte Transkript einen inhibitorischen Effekt auf die lokomotorische Aktivit t hat passt sein Expressionsmaximum um ZT6 Mitte der Lichtphase sehr gut ins Bild Ferner ist bekannt dass Tgf 83 als neurotropher Faktor Neuronen vor exitatorischen und metabolischen Defekten sch tzen kann Mattson et al 1997 Die beobachtete Abregulierung bei KR Tieren tags ber steht im Gegensatz zur Aufregulierung im Neocortex Lee et al 2000 Allerdings wurde bei der zuletzt erw hnten Studie nicht nur ein anderes Gewebe sondern auch nur ein Zeitpunkt untersucht der allerdings wie h ufig in solchen Studien nicht genannt wurde 4 Diskussion 138 Die circadiane Transkription von Translationsfaktoren Eif2b Eif4bp2 oder deren Untereinheiten ist aus pathologischer Hinsicht sehr interessant Eif2b spi
124. g der Periode Die endogene Periode n hert 4 Diskussion 119 sich immer mehr der des Zeitgebers an Entkoppelt unter DD Bedingungen ist die Periode n her an 24 Stunden 4 Diskussion 120 Die t gliche wiederkehrende Phasenverz gerung zur Synchronisation unter LD Bedingungen ist also geringer in lteren M usen Vergleichen wir diesen Befund nun mit den Hamstern die jung eine Periode l nger als 24 Stunden haben so verk rzt sich 1 im Alter also n hert sie sich genau wie bei meinem M usestamm der Periode des Zeitgebers an Alte M use meines Stammes zeigen eine Verschlechterung der Rate von Aktivit t zu Ruhephasen ein Indiz f r eine Degeneration der inneren Uhr Dies wird durch Studien mit anderen St mmen unterst tzt Davis et al 1998 Teena et al 1975 Die F higkeit sich an ein LD Regime anzupassen ist bei alten M usen stark eingeschr nkt Der gesamte Aktivit tsrhythmus ist stark fragmentiert Es sind auf den Aktogrammen sichtbar mehr spontane Aktivit ten w hrend der Lichtphase zu beobachten als bei j ngeren Tieren Die Rate von Licht zu Dunkelaktivit t ist bei 14 Monate alten Tieren 3 5 also 3 5 Mal mehr Aktivit t im Dunkeln und verschlechtert sich auf 2 5 bei 21 Monate alten Tieren Das Ph nomen der Fragmentierung ist auch sehr stark bei KR Tieren aller Altersgruppen vorhanden Allerdings muss hierbei sicherlich von einer Maskierung gesprochen werden blicherweise ist der st rkste maskierende Faktor Li
125. g sites Eur J Pharmacol 301 1 3 159 68 Molis T M L L Spriggs et al 1994 Modulation of estrogen receptor mRNA expression by melatonin in MCF 7 human breast cancer cells Mol Endocrinol 8 12 1681 90 Moore R Y and R L Danchenko 2002 Paraventricular subparaventricular hypothalamic lesions selectively affect circadian function Chronobiol Int 19 2 345 60 Moore R Y J C Speh et al 2002 Suprachiasmatic nucleus organization Cell Tissue Res 309 1 89 98 6 Anhang 153 Morioka N Y Okatani et al 1999 Melatonin protects against age related DNA damage in the brains of female senescence accelerated mice J Pineal Res 27 4 202 9 Morrison J H and P R Hof 1997 Life and death of neurons in the aging brain Science 278 5337 412 9 Muhlbauer E S Wolgast et al 2004 Indication of circadian oscillations in the rat pancreas FEBS Lett 564 1 2 91 6 M lhardt C 2000 Der Experimentator Molekularbiologie Spektrum Akademischer Verlag 2 Auflage Gustav Fischer Nagata Y M Oda et al 2001 A novel regulator of G protein signaling bearing GAP activity for Galphai and Galphag in megakaryocytes Blood 97 10 3051 60 Naji L A Carrillo Vico et al 2004 Expression of membrane and nuclear melatonin receptors in mouse peripheral organs Life Sci 74 18 2227 36 Nelson W 1988 Food restriction circadian disorder and longevity of rats and mice J
126. glycolytischer Aktivit t ist Warum auch Melatonin dieses Transkript auf die gleiche Art beeinflusst ist ungewiss Es ist interessant das Thrsp ebenfalls wie bei den KR Tieren reprimiert wird Falls dies mit reduzierten Mengen an Schilddr senhormon T3 zusammenh ngt w re dies ein sehr vorteilhafter Effekt von Melatonin T3 beeinflusst eine Menge von Stoffwechselprozessen in S ugetiergeweben u a die oxidative Phosphorylierung und Sauerstoffverbrauch durch den freie Radikale entstehen k nnen Cao et al 2001 Die von mir gefundenen Effekte der KR Behandlung in der Leber von M usen stimmen weitestgehend mit der Literatur berein Dies ist ein Indiz daf r dass die Applikation der Di t und auch die Analyse der Genexpression mittels Microarray Technologie erfolgreich und verl sslich war Die Melatoninbehandlung hatte im Vergleich zu KR einen wesentlich subtileren Effekt Keine der durch KR induzierten oder reprimierten Transkripte waren hnlich stark durch Melatonin beeinflusst Nur das Transkript slc37 ein Transportmolek l f r Glycerol 3 Phosphat war mit beinahe 3 facher Repression hnlich beeinflusst wie durch KR Da die Mechanismen durch die Melatonin und KR auf die Genexpression in der Leber von M usen wirken sehr unterschiedlich sein m ssen ist es erstaunlich dass es berlappungen in der Beeinflussung einzelner Transkripte gibt 4 Diskussion 133 4 6 Hypothalamische Genexpression 4 6 1 Expression bekannter Uhr Gene
127. grund der Eigenschaften des Plasmides werden in den Wirtszellen viele Kopien davon hergestellt Erfolgreich transformierte Bakterien k nnen aufgrund einer Antibiotika Resistenz selektioniert werden die ihnen ber das Plasmid vermittelt wird Material Kompetente Zellen Top 10 Invitrogen LB Medium LB Antibiotikum Platten mit 100 ug Ampicillin ml Agar Brutschrank Heraeus Sch ttelinkubator Heraeus Ampicillin 100 mg ml Sigma 0 5 M IPTG Sigma 10 w v X Gal Sigma in DMSO 0 5 M B Mercaptoethanol Invitrogen Methode Die kompetenten Top 10 Zellen 100 ul Aliquote wurden auf Eis aufgetaut und sofort mit 0 5 ul B Mercaptoethanol gemischt Jeweils 2 5 ul der Ligationsans tze wurden vorsichtig zu den Zellen pipettiert und vermischt Es wurde 30min auf Eis inkubiert Dann folgte ein Hitzeschock von 45 sec bei 42 C woraufhin die Zellen f r 1 2 min abgek hlt wurden Nach Zugabe von 250 ul SOC Medium wurde f r 1 h bei 37 C und 225 Upm im Sch ttelinkubator inkubiert um die vorliegende Antibiotika Resistenz zu exprimieren W hrenddessen wurden auf LB Amp Platten je 40ul IPTG Stockl sung 100mM und 40ul X Gal Stockl sung 40mg ml ausgestrichen und die Platten f r 30min bei 37 C inkubiert Anschlie end wurden 30 bzw 70ul des Reaktionsansatzes auf einer LB Amp Platte ausgestrichen Die Inkubation erfolgte ber Nacht bei 37 C Am n chsten Tag wurden die rekombinanten Klone wei e Kolonien mit einer
128. h erfolgter Hybridisierung wurden die st rksten und schw chsten Transkripte ausgew hlt und graphisch dargestellt Die Reizschwelle betrug hierbei lt 0 55 bzw gt 1 80 Fach circadian reguliert Ferner wurden die Mittelwerte von allen duplizierten Klonen auf den Microarrays gebildet s Abb 3 31 Nur wenn die Standardabweichung zwischen den Duplikaten geringer als 10 war wurden sie ausgew hlt Eine Tabelle mit Gennamen und Beschreibungen befindet sich am Ende dieses Kapitels Tab 3 2 3 Ergebnisse 100 Hypothalamische Genexpression Kontrolltiere hoch exprimierte Transkripte ZT 6 3 5 o N E 2 5 Centi o z i C4 z 2 a Png 2 m 1 5 Gja3 a f Grpr ui 1 9 Tgfb3 0 5 Insr ZT Abb 3 34 Im Hypothalamus von Kontrolltieren um ZT 6 stark exprimierte Transkripte Zu den am st rksten aufregulierten Transkripten an ZT 6 geh rten ein Insulinrezeptor ein Rezeptor f r das gastrin releasing peptide und Tgf beta 3 ein Wachstumsfaktor Hypothalamische Genexpression Kontrolltiere niedrig exprimierte Transkripte ZT 6 Ptgis H Scnia 0 8 Itgax gt Pde8a 0 6 e Pte2b pending Adir Expressionsratio zu ZT 0 0 4 Hsp70 4 0 2 ZT Abb 3 35 Im Hypothalamus von Kontrolltieren um ZT 6 gering exprimierte Transkripte 3 Ergebnisse 101 Hyp
129. hase shift J Sleep Res 4 S2 74 79 Arendt J 2002 online THE PINEAL GLAND AND PINEAL TUMOURS http www endotext org neuroendo neuroendo15 neuroendo15 htm Asai M Y Yoshinobu et al 2001 Circadian profile of Per gene mRNA expression in the suprachiasmatic nucleus paraventricular nucleus and pineal body of aged rats J Neurosci Res 66 6 1133 9 Aschoff J 1976 Circadian systems in man and their implications Hosp Pract 11 5 51 97 Aschoff J 1981 A survey on biological rhythms Biological Rhythms 4 3 10 Aschoff J U von Saint Paul et al 1971 Lifetime of flies under influence of time displacement Naturwissenschaften 58 11 574 Blask D E C A Leadem et al 1984 Differential responsiveness of the reproductive system of blind or melatonin treated male hamsters to injections of gonadotrophin releasing hormone GnRH and or prolactin J Pineal Res 1 2 149 61 Barbaccia M L D M Chuang et al 1982 Is insulin a neuromodulator Adv Biochem Psychopharmacol 33 511 8 Barja G 2002 Rate of generation of oxidative stress related damage and animal longevity Free Radic Biol Med 33 9 1167 72 Barja G 2002 The quantitative measurement of H2O2 generation in isolated mitochondria J Bioenerg Biomembr 34 3 227 33 Barja G 2002 Endogenous oxidative stress relationship to aging longevity and caloric restriction Ageing Res Rev 1 3 397 411 Barrett P S Conway et al
130. hmen k nnen nur auf exogene Frequenzen synchronisiert werden die gering von der eigenen Frequenz abweichen So ist das System nur in Ma en anpassungsf hig 1 Einleitung 4 1 1 1 Der Sitz des Hauptschrittmachers der SCN Die suprachiasmatischen Nuclei sind eine paarige Struktur im Hypothalamus Sie befinden sich links und rechts vom dritten Ventrikel ber dem Chiasma opticum Jeder Nucleus besteht aus etwa 10 000 Neuronen die strategisch positioniert sind um visuellen Eingang f r die Licht Dunkel Synchronisation ber direkte und indirekte Retina zu SCN Verbindungen zu erhalten Klein et al 1981 Die meisten SCN Neuronen sind GABAerg innerviert Moore et al 2002 Hattar et al 2002 Die stabile Phase der SCN Uhr unter LD Bedingungen ist wahrscheinlich eine Balance zwischen interner Synchronisation via GABA und Phasenverschiebungs Effekte durch Glutamat Reppert amp Weaver 2001 Eine Population der SCN Neuronen ist durch circadian erfolgende spontane Entladungsraten charakterisiert Auch in isolierten Neuronen bleibt diese Rhythmik erhalten weshalb diese Zellen Uhr Zellen clock cells genannt werden Welsch et al 1995 Unabh ngig von der untersuchten Tierart sind die Entladungsraten w hrend des subjektiven Tages hoch w hrend der subjektiven Nacht jedoch niedrig Zwischen den Neuronen jedes SCN und auch zwischen den beiden Nuklei gibt es multiple Zellkontakte durch die Kommunikation erm glicht wird Van den Pol
131. hnungsintervall begann also 240 Intervalle am Tag Die Beleuchtung im Tierstall war zu Beginn des Versuchs von 06 00 Uhr bis 18 00 Uhr wurde aber h ufig experimentell variiert Um elektrostatische St rungen auszuschlie en wurden alle Verbindungen mit abgeschirmten Kabeln Conrad Elektronik Best Nr 606863 3F ausgef hrt und die Abschirmung an beiden Enden mit Masse verbunden IO Karte im PC mit 5V Strom versorgung Masse Pin 13 oder Pol d Stromversorgung der IR Melder 5V DC Signale der IR Melder Pulldown Widerstand hier exemplarisch dargestellt ist ir Ungenutzter jeden Kanal n tig Kanal weitere IR Melder Abb 2 2 Schematische Darstellung der Verkabelung von IR Meldern mit der I O Karte 2 Material und Methoden 30 Zur Aufzeichnung und zur grafischen Darstellung der Aktivit tsdaten wurde ein Quickbasic Computerprogramm verwendet Autor Haiko Dernbach Tiermedizinische Hochschule Hannover In diesem Programm wurden f r jede Messung Parameter wie Licht an aus Intervalldauer Ruhezeit der Melder Namen der einzelnen Kan le Tierk fignummern und Name des Experiments festgelegt Ferner wurde mit diesem Programm die endogene Periode t der Tiere unter DD Bedingungen bestimmt Die prim re Datenaufzeichnung erfolgte auf einem 286er IBM PC 500MB Festplatte 32MB Arbeitsspeicher Die Daten wurden w chentlich auf Diskette gespeichert und zur Bearbeitung auf einen Dell amp Dim
132. ian firing rhythms Neuron 14 4 697 706 Welsh D K and S M Reppert 1996 Gap junctions couple astrocytes but not neurons in dissociated cultures of rat suprachiasmatic nucleus Brain Res 706 1 30 6 Williams D W M Tyrer et al 2000 Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila J Comp Neurol 428 4 630 40 Wilsbacher L D A M Sangoram et al 2000 The mouse Clock locus sequence and comparative analysis of 204 kb from mouse chromosome 5 Genome Res 10 12 1928 40 Wirz Justice A R A Wever et al 1984 Seasonality in freerunning circadian rhythms in man Naturwissenschaften 71 6 316 9 Witting W M Mirmiran et al 1994 The effect of old age on the free running period of circadian rhythms in rat Chronobiol Int 11 2 103 12 Wolters H B M Elzinga et al 2002 Effects of bile salt flux variations on the expression of hepatic bile salt transporters in vivo in mice J Hepatol 37 5 556 63 Young M E P Razeghi et al 2001 Clock genes in the heart characterization and attenuation with hypertrophy Circ Res 88 11 1142 50 Young M W 2000 Life s 24 hour clock molecular control of circadian rhythms in animal cells Trends Biochem Sci 25 12 601 6 Zheng B D W Larkin et al 1999 The mPer2 gene encodes a functional component of the mammalian circadian clock Nature 400 6740 169 73 Zlomanczuk P R R Margraf et al
133. ichtes der Tiere ber die Versuchszeit 3 Ergebnisse 69 Die lteren Tiere die bei Beginn der Gewichtsaufzeichnung ein Alter von 18 Monaten hatten wogen durchschnittlich 35 9 1 48g und verloren bis zur vierzigsten Woche an Gewicht auf 34 23 0 91g 3 1 2 Aktivit tsaufzeichung mittels Aktogrammen In den ersten Wochen der Aktivit tsaufzeichnung herrschte die oben beschriebene Photoperiode Das Versuchstier zeigte einen gut manifestierten Tag Nacht Rhythmus Das Einsetzen der Aktivit t erfolgt sofort nach Anbruch der Dunkelheit um ZT12 18 00 Uhr Nach Etablieren von DD zeigte das Tier einen Freilauf der Aktivit t die in jeder folgenden subjektiven Nacht fr her einsetzte Die endogene Periode t betrug 23 4 Stunden Der Gruppendurchschnitt f r Tiere dieses Alters betrug 23 46 0 07 Stunden Nach Wiederherstellung der urspr nglichen Photoperiode A zeigte das Tier den urspr nglichen LD Aktivititsrhythmus Das gew hlte Tier ist repr sentativ f r die Kontrolltiergruppe a Rel uta a a re ee inii Bae 4 rx X Tk CEEE Abb 3 2 Repr sentatives Aktogramm einer Kontrollmaus im Alter von 3 6 Monaten Es herrschte eine Lichtperiode von 06 00 18 00 gefolgt von DD bis zur Wiederherstellung der urspr nglichen Lichtperiode A 3 Ergebnisse 70 Der horizontale Bildausfall im unteren Drittel des Aktogrammes kam durch den Neustart des Computers nach einer Stromunterbrechung zustand
134. icroarray Untersuchungen in der Leber als signifikant durch KR oder Melatonin regulierten Transkripte notiert Genname Accession Name C9 NM 013485 complement component 9 C9 mRNA Ces3 NM 053200 carboxylesterase 3 Ces3 mRNA Cnnm2 NM 033569 cyclin M2 Cnnm2 mRNA Cyp2a4 NM 009997 cytochrome P450 2a4 Cyp2a4 mRNA Cyp3all NM 007818 cytochrome P450 steroid inducible 3a11 Cyp3all Eif2s3x NM 012010 eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 3 Eif2s3y NM 012011 eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 3 Eif4e NM_007917 eukaryotic translation initiation factor 4E Eif4e Fabpl NM 017399 fatty acid binding protein 1 liver Fabp1 mRNA Fasn F127033 fatty acid synthase mRNA complete cds Gjb3 M 008126 gap junction membrane channel protein beta 3 Gjb3 Hoxa5 M 010453 homeo box A5 Hoxa5 mRNA Mbl1 M 010775 mannose binding lectin liver A Mbll mRNA A N N N Mgll NM 011844 monoglyceride lipase Mgll mRNA N N N N Mirl16 pending M 019580 membrane interacting protein of RGS16 Mir16 pending Mtel pending M_134188 mitochondrial acyl CoA thioesterase 1 Mtel pending NOX alpha M_172203 NADPH oxidase 1 alpha NOX 1alpha mRNA P4ha2 M_011031 procollagen proline 2 oxoglutarate 4 dioxygenase 3 Ergebnisse 96 Pde5a NM 153422 cG
135. ierten Sonde entfernt und mit dem NanoDrop analysiert 2 19 3 Analyse der Fluoreszenmarkierten Sonde mit dem Nano Drop Theorie Um Effizienz der Kopplung von Fluoreszenz an die cDNA zu berpr fen wird spektrophotometrisch gemessen Prinzipiell kann man dazu jedes Photometer nutzen welches ein Abtasten der Wellenl ngen im Bereich des entsprechenden Farbstoffes zul sst Das verwendete Ger t hat den Vorteil eine Voreinstellung f r die Messung von fluoreszenzmarkierter cDNA zu haben bei der Quantit t und Qualit t der DNA und die molare Inkorporationsrate an Fluoreszenzfarbstoff gemessen wird AuBerdem wird nur ein winziges Probenvolumen 1 2ul der Sonde ben tigt um genau zu messen 2 Material und Methoden 61 Material NanoDrop ND1000 UV Vis Spektrophotometer NanoDrop Technologies Fluoreszenzmarkierte Sonde Methode 1 2ul der fluoreszenzmarkierten Sonde werden auf die Messoptik pipettiert und das Ger t wird geschlossen In der Software wird die Anwendung Microarray gew hlt und der entsprechende Fluoreszenzfarbstoff festgelegt Es erfolgt ein Abtasten der Absorptionswellenl ngen von 200nm bis 800nm Absorbtionsmaxima werden graphisch dargestellt sowie Konzentration und Reinheit angezeigt 2 20 Hybridisierung von Microarrays auf dem Xeotron Chip System Theorie Das heterogene Gemisch fluoreszenzmarkierter Sonden soll auf Microarrays hybridisiert werden Dies bedeutet dass die fluoreszenzmarkier
136. in Grad Celsius zyklisches cyclic Adenosin 35 5 monophosphat zyklisches Guanosin 3 5 monophosphat komplement re DNA complementary DNA zyklisches cyclic Guanosin 35 5 monophosphat engl cyclic AMP response element binding protein Desoxyadenosin 5 triphosphat Desoxycytidin 5 triphosphat Dauerdunkel Diethylpyrocarbonat Desoxyguanosin 5 triphosphat Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleins ure deoxyribonucleic acid Desoxyribonuclease I Desoxyribonukleosid 5 triphosphat doppelstr ngig Dithiothreitol Desoxythymidin 5 triphosphat Escherichia coli Ethylendiamintetraacetat Ethidiumbromid Guanosin gamma amino butyric acid Glycerinaldehyphoshat Dehydrogenase Guanylatzyklase guanylate cyclase Guanosin 5 triphosphat Hypothalamo hypohys r gonadale Achse hypopthalamic pituatary gonadal axis engl hypoxanthinephosphoribosyltransferase Guanin nukleotid bindendes regulatorisches Protein Hitzeschockprotein Aeat shock protein Isopropyl B Galactopyranosid Kilobasen RNA Kilobasenpaare DNA Kilodalton kalorisch Restriktiv gefiitterte Tiere Dauerlicht Licht Dunkel Zyklus 6 Anhang 148 LB MCS mg ml mM min MTI R MT2 R ul mRNA MT MW NaAc NBT nm nt N terminus OD ORF PACAP PCR pH RFU RNase RT RT PCR S T Tu Tab TAE TBE TE N Terminus C Terminus Tris U Upm uN UTR UV V Vol v v w v w w X Gal ZT Luria Bertami Molar multiple Klonierungsst
137. in Relation zu Kontrolltieren dargestellt Ein Wert von 1 bzw 1 ist unver ndert gegen ber Kontrolltieren Zur vereinfachten Darstellung habe ich die abregulierten Transkripte negativ eingezeichnet Der Einfluss von KR und Melatonin auf die Genexpression in der Leber der Maus 5 5 5 0 4 5 4 0 3 5 3 0 2 5 2 0 1 5 1 0 0 5 0 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 EKR Melatonin Auf und Abregulierung SIc21a1 Thrsp Fasn slc37 Fabp1 C9 Slc21a7 Ppia Sennib Rora Eif2s3y Tst Slc17 Mbl1 Hoxa5 Ces3 Slc38a4 Tmod1 SIc13a2 Eif2s3x Por Cyp2a4 Cyp3a11 Mir16 pending Abb 3 26 Darstellung von Lebertranskripten die durch KR Maximal auf oder abreguliert wurden Als Schwellenwert habe ich 50 Zu oder Abnahme der Genexpression gew hlt 1 5 Fach Es wurde ebenfalls zu jedem durch die Behandlung KR oder MT beeinflussten Transkript der Effekt der alternativen Behandlung auf dieses Transkript mit dargestellt Die st rksten differentiellen Transkripte in der Leber der Maus sind durch KR gt 5 Fach auf bzw gt 4 5 Fach herabreguliert 3 Ergebnisse 92 Die drei am st rksten durch KR aufregulierten Transkripte in der Leber geh ren zu den mitochondrialen Cytochromoxidasen Eine davon Cyp3all ist induzierbar durch Steroidhormone wie Testosteron Lindberg et al 1988 Am st rksten herabreguliert sind eine Reihe von Transportmolek len die am Transport von organischen Anionen i
138. in der Intensit t der Fluoreszenz zwischen den beiden untersuchten Kan len M in Abh ngigkeit von der Fluoreszenzintensitat A dar Hier konnte festgestellt werden dass es eine sehr starke Kr mmung blau dargestellt bei der Verwendung des Alexa 488 Fluoreszenzfarbstoffes gab Zwar liegt die normalisierte Verteilungswolke rot auf der X Achse es musste aber sehr stark normalisiert werden Dies ist ein Indikator f r eine unterschiedliche Effizienz oder Menge an markierter Sonde Da dies zu falsch positiven oder falsch negativen Resultaten f hren kann entschied ich mich alle bisher Alexa 488 markierten Sonden also immer ZT 18 bei den drei untersuchten Gruppen auf einem separaten Microarray zu wiederholen 3 Ergebnisse 99 Maus Hypothalmus MA Lowess Kontrolltiere ZT 6 zu ZT 24 555nm 555nm 5 00 4 00 3 00 2 00 1 00 M e M Lowess 3 00 4 00 5 00 Abb 3 33 MA Plot von Alexa 555 zu Alexa 555 hybridisierten Sonden vergleich von getrennten Microarray Experimenten Nach Tausch des Fluoreszenzfarbstoffes Alexa 488 gegen einen jeweils anderen und einer Wiederholung der Hybridisierung war festzustellen Abb 3 33 dass die starke Kurvenkr mmung aus Abb 3 32 verschwunden war Diese Daten wurden f r weitere Analysen verwendet 3 4 1 Microarray Untersuchung von circadian regulierten Transkripten im Hypothalamus von Kontrollm usen Nac
139. individuell reguliert wurden Die offensichtlich h here Amplitude von Camk2d bei den MT Tieren bzw der MAPK bei den KR Tieren k nnte Grund f r die beobachtete Sensitivierung des circadianen Systems gegen ber wechselnden Lichtverh ltnissen sein Altern ist mit einer Induktion von Hitzeschockproteinen assoziiert welcher durch Melatonin und KR entgegengewirkt werden kann Sharman et al 2004 Lee et al 2000 Die in der vorliegenden Studie betrachteten Hitzeschockproteine Hsp70 4 und Dnajal wurden nach circadianen Kriterien ausgew hlt nicht nach ihrer Induktion oder Inhibition Daher ist es ist m glich dass weitere Transkripte dieser Kategorie durch den Datenerfassungsfilter geglitten sind Es wurde keine nennenswerte Induktion durch das Altern beobachtet Verglichen mit Kontrolltieren hatte Melatonin zu allen Zeitpunkten einen inhibitorischen Effekt auf die Dnajal Expression KR hatte keinen konsistenten Einfluss in Verlaufe des Tages Auf Hsp70 4 hatten weder Melatonin noch KR einen relevanten Einfluss Die Immunkomponente C4 complement component wurde von Weindruch und Mitarbeitern 2003 als durch das Altern auf und KR abregulierbar beobachtet Proteine dieser Kategorie kommen charakteristischerweise in senilen Plaques von Alzheimer Patienten vor Akiyama et al 2000 Altern l ste an ZT6 untersucht keine C4 Expression aus es wurde eine fast 3 fache Inhibition beobachtet KR hatte je nach Beobachtungszeitpunkt einen auf oder abreguli
140. ingungen DD beobachten Ich w rde dies allerdings dem starken maskierenden Effekt des Hungers und der daraus resultierenden fragmentierten Rhythmik zuschreiben Der Hungerreiz ist wahrscheinlich ein so starker Zeitgeber dass eine Entkopplung der Oszillatoren verhindert wird Anders ist dies bei den MT Tieren Hier waren bis auf die Substitution mit Melatonin dieselben Bedingungen gegeben wie bei den Kontrolltieren Es hat den Anschein dass Melatonin im Stamm B6C3F1 ein rhythm spliting beg nstigt Obwohl manche Kontrolltiere ebenfalls 2 von 10 gegen ber 5 von 10 MT Tieren eine biphasische Aktivit t in DD aufwiesen war die St rke ihrer Auspr gung bei den MT Tieren am deutlichsten Vorausgesetzt es gibt im Gehirn von M usen ein duales Oszillatorensystem w re es m glich dass die R ckkopplung von Melatonin auf die Uhr nur einen SCN Oszillator betrifft W rde ein Oszillator bevorzugt durch die Aufnahme von Melatonin synchronisiert werden k nnte sich der zweite leichter davon abkoppeln Die geringere Auspr gung der M und E Komponenten bei Kontrolltieren k nnte also mit der geringeren endogenen Melatoninmenge zusammenh ngen Es w re interessant diesen Effekt in einer noch l nger angelegten Studie gt 30 Monate zu verfolgen Dann w re es auch m glich einzusch tzen ob Melatonin auch im fortgeschrittenen Alter bei M usen ein rhythm splitting beg nstigt Melatonin ist f r die Anpassung des Organismus an sich ver nde
141. ioaktivit t wird jedoch Fluoreszenz verwendet Zuerst werden DNA Fragmente der Matrize in einer PCR hergestellt 2 Material und Methoden 53 Das Ausgangsmaterial kann in Form doppelstr ngiger Plasmid DNA eines PCR Produktes oder genomischer DNA vorliegen Die DNA Str nge werden vor der eigentlichen Sequenzreaktion denaturiert und es wird eine PCR mit nur einem Primer sequenzspezifisch f r das PCR Produkt dNTPs und fluoreszenzmarkierten ddNTPs gemacht Die Verwendung von dNTPs und ddNTPs hat zur Folge dass nach Einbau eines ddNTP ein Kettenabbruch erfolgt Das fluoreszenzmarkierte Nukleotid ist hierbei endst ndig und kann durch Laseranregung detektiert werden In den meisten Vektoren befinden sich beidseitig die multiple cloning site MCS flankierend Promotorsequenzen an denen g ngige Primer z B T7 und SP6 binden k nnen Beim Sequenzieren von insert tragenden Plasmiden wird also auch ein wenig vom Plasmid sequenziert F r eine Sequenzierung aus 5 und 3 Richtung m ssen dementsprechend je zwei Reaktionen mit 5 und 3 Primern angesetzt werden Die fluoreszenzmarkierten DNA Fragmente werden in einem Acrylamidgel im ABI PRISM 377 DNA Sequencer elektrophoretisch aufgetrennt wobei die Fluoreszenz von einem Detektor gemessen wird Im elektrischen Feld wandern der Gr e entsprechend die unterschiedlich fluoreszierenden DNA Fragmente mit endst ndigem ddATP ddTTP ddGTP oder ddCTP durch das Gel und werden durch Laseran
142. ipts suggests a direct regulation by positive elements Clock Bmall of the molecular clock Transcripts were identified that imply an involvement of subunits of ion channels in the generation of circadian rhythms this has been assumed by 5 Zusammenfassung 146 the scientific community Furthermore a comparison of gene expression in this study with previous ones has revealed some similarities The mechanisms through which CR and MT exert their effect are indeed of a completely different nature CR changes primarily the expression of genes involved in energy metabolism MT influences genes that are involved in G protein coupled signal transduction Melatonin seems to influence components of the circadian system resulting in a sensitization of the inner clock This may help explain the beneficial effect of melatonin on the murine circadian system CR in some instances had the opposite effect of melatonin which may contribute to a desensitization or masking of the circadian system 5 Zusammenfassung 147 6 Anhang 6 1 Abk rzungen A aA NAT Abb AC ATP bp BCIP C C cAMP cGMP cDNA cGMP CREB dATP dCTP DD DEPC dGTP DMSO DNA DNase I dNTP ds DTT dTTP E coli EDTA EtBr G GABA GAPDH GC GTP HPG Achse HPRT G Protein hsp IPTG ROE Adenin Arylalkylamin N Acetyltransferase Abbildung Adenylatzyklase adenylate cyclase Adenosin 5 triphosphat Basenpaare 5 Bromo 4 Chloro 3 Indolyl Phosphat Cytos
143. ist Dhahbi et al 2004 und durch eine 40 ige Kalorienreduktion im Alter von 19 Monaten begonnen auf 35 4 Monate erh ht werden kann Im Alter von 14 Monaten waren meine Versuchstiere also erst mittelalt 4 0 Lokomotorische Aktivitat Die vorliegenden Ergebnisse implizieren einen profunden Effekt des Alterns auf das circadiane System in M usen des Stammes B6C3F1 Einige Parameter des circadianen Rhythmus der lokomotorischen Aktivit t sind gegen ber jungen Tieren ver ndert Auch zeigen die Behandlungen vor allem die kalorische Restriktion Effekte auf die lokomotorische Aktivit t von M usen Altern ver ndert nicht nur die endogene Periode t unter Freilauf DD sondern auch das Aktivit tsmuster unter LD Zeitgeber definierten Bedingungen Ein sehr interessanter Effekt ist dass x mit zunehmendem Alter zunimmt Bei Kontrolltieren von einem Durchschnittwsert von 23 46 0 07 Stunden Alter 4 5 Monate auf 23 86 0 08 Stunden bei 30 Monate alten Tieren Weder KR noch MT verm gen es diesen Verlauf zu beeinflussen Bei den von mir restriktiv gef tterten bzw Melatonin substituierten Tieren nimmt t ebenfalls zu Von 8 zu 14 Monaten verlangsamt sich die innere Uhr von 23 59 0 04 auf 23 92 0 02 Stunden KR bzw 23 43 0 06 auf 23 84 0 03 Stunden bei MT Tieren Diverse Forschergruppen haben das Gegenteil bei Hamstern und Ratten festgestellt Bei alternden Hamstern wurde eine Verk rzung der endogenen Periode t festgestellt Van 4 Diskussion
144. it tsaufzeichung mittels Aktogrammen 68 3 1 3 Statistische Auswertung der Aktivit tsaufzeichung 78 3 1 3 1 Einfluss von KR und Melatoninsubstitution auf die Aktivit t von M usen 78 3 1 3 2 Einfluss des Alterungsprozesses auf die Aktivit t von Kontrollm usen 79 3 1 4 Statistische Auswertung einer Phasenverschiebung 80 3 1 5 Zunahme der endogenen circadianen Periode Tau in Abh ngigkeit des Alters 82 3 2 Molekularbiologische Untersuchungen 84 3 2 1 Amplifikation des murinen Melatonin Rezeptors Typ 2 84 3 2 2 PCR Amplifikation von Uhr Genen im Hypothalamus der Maus 86 3 2 3 Amplifikation des mCLOCK Transkriptes 87 3 2 4 Kontroll PCR mit Haushaltsgen Primern 89 3 3 Microarray Untersuchungen an der Leber der Maus 90 3 3 1 Best tigung der Microarray Ergebnisse mit Realtime PCR 92 3 4 Analyse circadian variierender Transkripte im Hypothalamus der Maus mittels Microarrays 95 3 4 1 Microarray Untersuchung von circadian regulierten Transkripten im Hypothalamus von Kontrollm usen 98 3 4 2 Microarray Untersuchung von circadian regulierten Transkripten im Hypothalamus von KR und MT M usen 103 3 4 3 Postvalidierung von Microarray Ergebnissen mittels quantitativer Realtime PCR 109 4 Diskussion 117 4 Entwicklung des K rpergewichtes bei KR MT und Kontrolltieren des M usestammes B6C3F1 117 4 2 Lokomotorische Aktivitat 118 4 3 Expression von Clock in Geweben der Maus 124 4 4 Die MT2 Rezeptor Sequenz 127 4 5 Genexpression in der Leber 129 4 6
145. ivity rhythm with a lot of activity during the light phase the actual resting phase of nocturnal animals Control and MT animals showed little activity during the light 5 Zusammenfassung 145 phase The adaptation to new lighting conditions due to phase shifts occurred faster in CR and MT animals than in age matched controls Old mice were less well adapted to the light dark phase and needed longer to adjust to a changed photopic environment Some animals most of which were from the MT group displayed a split activity rhythm under DD conditions The split component was abolished after re entrainment to LD conditions The expression of the clock gene Clock was demonstrated in many tissues such as cerebellum olfactory bulbs hypothalamus spleen liver lung heart and kidney There was no evidence for the expression of Clock in testes It was observed that a splice variant of this gene was specific to neuronal tissue A hypothetical model was established in which this variant plays a role in the fine tuning and the regulation of the circadian clockwork A partial sequence of the mouse MT2 melatonin receptor was amplified and sequenced This revealed a polymorphism which leads to the exchange of an amino acid threonine gt glutamate Whether this has an impact on the receptor s ability to bind melatonin needs to be further assessed The analysis of the gene expression in the liver of control CR and MT mice with microarrays an
146. l 1996 Es scheint eine generelle Hemmung der Signaltransduktion in Zellen zu geben die den CAMP pCREB AP 1 Mechanismus benutzen 1 Einleitung 14 1 2 6 Weitere Wirkungen von Melatonin m gliche therapeutische Einsatzgebiete St rungen des circadianen Systems f hren zu einer verk rzten Lebensspanne in vielen Tiermodellen Parallel dazu nimmt die Synthese und Freisetzung von Melatonin im Alter stark ab Pang et al 1984 Es wurde gezeigt dass exogene Melatoningaben die circadiane Kopplung also die Manifestierung geregelter Rhythmen verst rkt D AVERAGE BOOY WEIGHT Ih GRAMS 257 48 281 223 2 203 191 he ihe z225 E i29 ZB JIG xe T lt gt IL us LE LL e m Ly LL a HELATONIH TREATED MT 121 VTA Ei a i i i r i i 14 amp 16 1 amp 20 z2 24 2 zu 3 MELATONIN MIGHT AGE MONTHS gt NUMBER DF MICE Fia 1 Aging postponement and or life prolongation in BALB c female mice consequent to night acdanimistratian af melatonin Abb 1 6 Die Verlangerung der Lebensspanne durch Melatoningaben Aus Pierpaoli amp Regelson 1994 Au erdem haben Pierpaoli et al 1994 festgestellt dass die Lebensspanne von M usen durch Melatoninsubstitution verl ngert werden kann Es k nnen auch weitere altersbedingte Ver nderungen durch diese Substitution verhindert oder zumindest abgemildert werden Koster van Hoffen et al 1993 Reiter et al 1994 Bei Seneszenz besch
147. leunigten SAM P 6 M usen wurde beobachtet dass Melatonin eine neuroprotektive Funktion hat und vor altersbedingten DNA Sch den im Gehirn sch tzt Morioka et al 1999 Ferner st rkt Melatonin das Immunsystem durch die Induktion einer Reihe von Interleukinen und Interferonen Carolleo et al 1992 Weindruch et al 1982 1 Einleitung 15 Circadiane St rungen bedingt durch Alter Blindheit etc Schlafst rungen Jet lag Schichtarbeit etc Fertilit tsregulation Verh tung Inmunologische oder onkologische Intervention Kardiovaskul re Kreislauf Therapie Tab 1 1 m gliche therapeutische Einsatzgebiete von Melatonin Es wurde gezeigt dass Melatonin die Entwicklung von Mammatumoren und von humanen MCF 7 Brustkrebszellen in vitro verlangsamen kann Diese Effekte k nnten zumindest teilweise auf die Unterdr ckung der Expression des Ostrogenrezeptors zur ckzuf hren sein Molis et al 1994 AuBerdem kann Melatonin in hohen Dosen die Expression der 5 Lipoxygenase verringern Dieses Enzym partizipiert an der Biosynthese von Leukotrienen welche allergische und entz ndliche Prozesse begleiten Steinhilber et al 1995 Niedrige Melatoninkonzentrationen wurden mit Krankheiten wie Alzheimer Papolla et al 1997 Multipler Sklerose Sandyk et al 1994 pl tzlichem Kindstod Sturner et al 1990 Epilepsie Maurizi et al 1985 und postmenopausaler Osteoporose Sandyk et al 1992 in Zus
148. lls exposed to the Alzheimer amyloid peptide J Neurosci 17 5 1683 90 Pennartz C M M T de Jeu et al 2002 Diurnal modulation of pacemaker potentials and calcium current in the mammalian circadian clock Nature 416 6878 286 90 Petit L I Lacroix et al 1999 Differential signaling of human Melia and Mel1b melatonin receptors through the cyclic guanosine 3 5 monophosphate pathway Biochem Pharmacol 58 4 633 9 Petrie K J V Conaglen et al 1989 Effect of melatonin on jet lag after long haul flights Bmj 298 6675 705 7 Pierpaoli W 1994 The pineal gland as ontogenetic scanner of reproduction immunity and aging The aging clock Ann N Y Acad Sci 741 46 9 Pierpaoli W A Dall Ara et al 1991 The pineal control of aging The effects of melatonin and pineal grafting on the survival of older mice Ann N Y Acad Sci 621 291 313 Pierpaoli W and W Regelson 1994 Pineal control of aging effect of melatonin and pineal grafting on aging mice Proc Natl Acad Sci U S A 91 2 787 91 Pittendrigh C S 1960 On temporal organization in living systems Harvey Lect 56 93 125 Pittendrigh C S 1960 Circadian rhythms and the circadian organization of living systems Cold Spring Harb Symp Quant Biol 25 159 84 Pittendrigh C S and S Daan 1974 Circadian oscillations in rodents a systematic increase of their frequency with age Science 186 4163 548 50 Possidente B S McEldo
149. logische Funktionen haben derzeit ist allerdings wenig dar ber bekannt In Schafen scheint es noch nicht einmal ein Gen f r den MT2 Rezeptor zu geben Im Frettchen einem sich saisonal fortpflanzenden Tier wurden bisher im Gehirn keine Melatoninrezeptoren entdeckt jedoch in hoher Konzentration im Pars tuberalis der Hypophyse Die Melatoninrezeptoren werden haupts chlich im Gehirn aber auch in peripheren Geweben wie Herz Lunge Niere und Leber exprimiert Naji et al 2004 Der MT1 Rezeptor weist die h chste Dichte im Gehirn au erdem im Pars tuberalis der Hypophyse der meisten S ugetiere auf Uber seine Expression im SCN wird wahrscheinlich die Wirkung von Melatonin auf die innere Uhr vermittelt Reppert et al 1994 Studien mit MTI KO M usen haben gezeigt dass dieser Rezeptor f r den inhibitorischen Effekt von Melatonin auf die neuronalen Entladungsraten im SCN verantwortlich ist Es scheint allerdings dass im Bezug auf die Phasenverschiebungs Eigenschaften von Melatonin die Rezeptoren funktionell redundant sind 1 Einleitung 12 Die MT2 Rezeptorexpression im SCN ist so niedrig dass sie nicht mittels Autoradiogrammen mit gt T_2 Iodomelatonin wie f r MT1 blich detektiert werden kann sondern nur durch RT PCR Dennoch ist bekannt dass MT2 f r den phasenanpassenden Effekt von Melatonin verantwortlich ist Liu et al 1997 Hunt et al 2001 Der MT2 Rezeptor ist nicht bei allen S ugetieren vorhanden Durch eine nat
150. lus werden sp ter beschrieben F tterung Die Nahrung wurde von der Firma TEKLAD Wisconsin AIN 93M adult maintenance precision pellets bezogen Kontrolltiere Normal und Melatonin substituierte Tiere MT bekamen Standardnahrung die kalorisch restringierten KR Tiere bekamen eine speziell zusammengesetzte mineral und vitaminsubstituierte Restriktionsdi t um eine Unter nicht aber Mangelern hrung zu etablieren 2 Material und Methoden 25 Die Nahrung setzte sich wie folgt zusammen Inhalt Normaldi t g kg Restriktionsdi t KR von g kg Normaldia t Kasein 140 233 166 4 L Cystein 1 8 3 166 6 Maismehl 465 7 295 63 3 Dextriniertes Maismehl 155 155 100 Saccharose 100 100 100 Sojabohnen Ol 40 66 7 166 7 Zellulose 50 58 3 116 3 Mineral Mix 35 58 3 166 5 Cholin Bitartrat 2 5 4 2 168 Vitamin Mix 10 16 7 167 beinhalten dibasisches Kalzium Phosphat Kalzium Karbonat Kalium Zitrat Monohydrat Natrium Chlorid Magnesium Chlorid Magnesium Oxid Eisen Citrat Mangan Carbonat Zink Carbonat Carbonat Chrom Kalium Sulfat Kalium Jodat Natrium Selen Ramsey et al 2000 Teklad 40060Madison Wisconsin USA Beide Di ten sind isokalorisch mit 3 6kcal g Pugh et al 1999 Zu Begin des Versuches wurden alle Tiere ad libitum gefiittert Die durchschnittlich pro Tag gefressene Menge Futter wurde ermittelt indem jedem Einzeltier eine definierte Menge angeboten und am folgenden Tag die brig g
151. m Hypothalamus und die Identifizierung anderer circadian aktiver Gene Zus tzlich wurde die Genexpression in der Leber betrachtet um den Einfluss der applizierten Behandlungen einzusch tzen Diverse chronobiologische Experimente mit unterschiedlichen Beleuchtungsprotokollen wurden durchgef hrt Im Anschluss an die verhaltensbiologischen Untersuchungen wurden die Tiere im Alter von 14 Monaten zu jeweils vier Tageszeitpunkten ZTO 6 12 18 get tet und Gehirn Leber und andere Gewebe f r molekularbiologische Experimente pr pariert 6 Tiere hatten bei der T tung ein Alter von 30 Monaten Das K rpergewicht der KR Tiere lag bei Versuchende weit unter dem der anderen Gruppen Im Vergleich mit den Kontrolltieren hatten die MT Tiere ebenfalls ein niedrigeres K rpergewicht Die lokomotorische Aktivit ts berwachung ergab eine altersabh ngige Zunahme der endogenen Periode t im Freilauf unter Dauerdunkel Bedingungen DD Dieser Alterseffekt war weder durch KR noch durch MT aufhaltbar Die Gesamtaktivit t von M usen nahm mit dem Alter ab Tiere der KR Gruppe zeigten einen fragmentierten Aktivit tsrhythmus mit viel Aktivit t w hrend der Lichtphase der eigentlichen Ruhephase von nachtaktiven Tieren Kontroll und MT Tiere zeigten sehr wenig Aktivit t w hrend der Lichtphase Die Gew hnung an neue Lichtverh ltnisse nach einer Phasenverschiebung geschah bei gleich alten Tieren der KR und MT Gruppen schneller als bei den Kontrolltieren Bei alten
152. mme von M usen benutzt werden oder die Tiere verschiedene Alter aufweisen muss davon ausgegangen werden dass es entweder einen Stamm oder altersspezifischen Effekt in der Expression der Uhr Gene gibt Das Transkript AVP zeigt bei den MT Tieren einen interessanten circadianen Verlauf Es scheint im Vergleich zu den Kontroll und KR Tieren antiphasisch zu sein Ver nderungen des AVP arginine vasopressin Gehaltes im SCN und seiner Freisetzung aus der SCN Kultur zeigen eine circadiane Rhythmik Gillette et al 1987 Watanabe et al 2000 Dardete et al 2004 Die dorsomedialen Neuronen im SCN enthalten AVP und vermitteln circadiane Informationen an andere Hirnareale u a die Pinealdr se Die Pinealdr se von S ugetieren erh lt noradrenerge sympathische Efferenzen vom SCN ber das obere Cervicalganglion Melatonin hat eine Funktion an der Synchronisation des zentralen Schrittmachers Redman et al 1983 aber seine Rolle bei der Synchronisation von Neurotransmittern des SCN ist nicht v llig gekl rt Melatonin inhibiert den VIP induzierten vasoactive intestinal peptide Anstieg von cAMP hat aber keinen Effekt auf die basale VIP Konzentration in kultivierten SCN Zellen Vanecek et al 1998 Diese Effekte werden durch die im SCN vorhandenen Melatoninrezeptoren vermittelt Liu et al 1997 Im Zellkultursystem mit Ratten SCN Neuronen wurde durch Isobe und Mitarbeiter 2001 festgestellt dass die AVP Freisetzung durch Melatonin inhibiert wi
153. n bei nachtaktiven jedoch nicht Die gr te Rolle von Melatonin ist seine Funktion als Chronobiotikum seinen Einfluss an der Steuerung circadianer Rhythmen 1 Einleitung 9 1 2 2 Synthese von Melatonin N acetyl 5 methoxytryptamin Melatonin ist ein Indolamin mit einer Molekularmasse von 232 27 Es wird aus Tryptophan synthetisiert welches ber 5 Hydroxytryptophan zu Serotonin konvertiert 5 Hydroxy Tryptamin wird Die beteiligten Enzyme sind die Tryptophanhydroxylase und die aromatische Aminos uredecarboxylase Serotoninspiegel sind in der Pinealdr se tags ber sehr hoch und fallen in der fr hen Nachtphase schnell ab da verschiedene metabolische Prozesse die Serotonin als Substrat benutzen aktiviert werden Das Enzym Arylalkylamin N Acetyltransferase aaNAT konvertiert Serotonin mithilfe von Coenzym A zu N Acetylserotonin dem direkten Vorl ufer von Serotonin In den meisten Spezies nimmt die Aktivit t der aaNAT in der Nacht zu durch Licht kann dieser Effekt allerdings verhindert werden N Acetylserotonin wird durch das Enzym HIOMT Hydroxyindol O Methyl Transferase zu Melatonin konvertiert welches zu erh hten n chtlichen Melatoninspiegeln f hrt Melatonin hat sowohl lipophile als auch hydrophile Eigenschaften deswegen kann es durch Diffusion leicht in Zellen und Gewebe eindringen Arendt et al 1995 Melatonin wird im Blut transportiert und in der Leber ber 6 Hydroxymelatonin und der darauf folgenden
154. n 4 das TAG Stopcodon ist in Exon 23 lokalisiert Das offene Leseraster ORF open reading frame ist 2 5kb gro und codiert f r ein Protein von 855As 96 4 kDa King et al 1997 Clock ist in vielen Geweben der Maus detektierbar King et al 1997 Im Stamm B6C3F1 konnte ich ein 2 4kb Clock Transkript in neuronalen Geweben wie Hypothalamus Cerebellum und olfaktorischen Bulbi nachweisen In peripheren Geweben gelang es mir das Transkript in Leber Lunge Milz und weiteren im Ergebnissteil nicht gezeigten Organen nachzuweisen Entgegen anderer Forschergruppen King et al 1997 fand ich keinen Hinweis auf Clock Expression in den Hoden der Maus Die Amplifikation mit den Clock delta 18 Primern ergab ein hnliches Bild ohne nachweisbare Expression im Hoden Die in 4 Diskussion 125 dieser Studie verwendeten CLOCK deltal8 Primer waren in Exon 15 und Exon 21 lokalisiert 4 Diskussion 126 Die A18 Spleissvariante 30As k nnte von Bedeutung sein denn die Clock Mutante entsteht durch Splei en von Exon 19 51As Es ist nicht bekannt ob der Verlust von Exon 18 ebenfalls zu einem circadianen Ph notyp f hren w rde Die Clock Mutante zeigt einen ausgepr gten Ph notyp Antoch et al 1997 Vitaterna et al 1994 Die homozygote Clock Mutante zeigt unter DD eine sehr lange Periode 1 und einen graduierlichen Verlust der Rhythmizit t Vitaterna et al 1994 Die codierenden Regionen f r das DHLH Motiv von Clock sind in Exon 5 6
155. n COS7 Zellen MTI R Kp 59 3 18 3pM MT2 R Kp 199 9 13 4pM Jin et al 2003 Die Verabreichung von Melatonin im Trinkwasser k nnte die endogene Konzentration so sehr erh ht haben dass der MTI R oder beide Rezeptoren ges ttigt und dadurch maximal aktiviert waren Die ausgepr gte biphasische lokomotorische Aktivit t bei einigen MT Tieren k nnte also mit unterschiedlicher Rezeptoraktivierung zusammenh ngen Es w re sehr interessant Autoradiogramme MTI R bzw in situ Hybridisierungen f r die beiden Rezeptoren bei Tieren durchzuf hren die ein rhythm splitting aufweisen M glicherweise ndert sich auch die Lokalisation einer der Rezeptoren w hrend der biphasischen Aktivit t Da mittlerweile auch k o M use f r beide Rezeptorsubtypen existieren w re es ferner von Interesse zu sehen ob das rhythm splitting an das Vorhandensein des einen oder anderen Rezeptors gebunden ist 4 3 Expression von Clock in Geweben der Maus Spleif variante A 18 ist nur im Gehirn von B6C3F1 M usen detektierbar Das Clock Transkript ist eines der wichtigsten f r eine intakte circadiane Physiologie bei M usen Es kodiert f r einen bHLH PAS Transkriptionsfaktor der als positiver Aktivator innerhalb der circadianen R ckkopplungsschleife agiert King et al 1997 Der Clock Locus berspannt 90kb und besteht aus 23 konventionellen Exons von denen eines Exon la alternativ gespleisst wird King et al 1997a Das ATG Startcodon ist in Exo
156. n an neue Lichtverh ltnisse stelle ich f r die einzelnen Gruppen im Folgenden vor Nachtaktivit t von unbehandelten M usen w hrend einer Phasen Umgew hnung 4 Std Zeitverz gerung c eo ET S E E 2 lt S SS 9 Abb 3 15 Resynchronisationszeit nach 4h Phasenverz gerung bei Kontrolltieren Unbehandelte Kontrolltiere erreichten in der dritten Nacht nach einer vierst ndigen Phasenverz gerung wieder eine f r sie normale Menge an Nachtaktivit t Nachtaktivitat von kalorisch restringierten M usen w hrend einer Phasen Umgewohnung 4 Std Zeitverz gerung Aktivit t Einheiten Abb 3 16 Resynchronisationszeit nach 4h Phasenverz gerung bei KR Tieren 3 Ergebnisse 83 Bei KR Tieren wird die Resynchronisation schon in der zweiten Nacht nach der Phasenverz gerung erreicht Die Aktivit t steigt von der zweiten bis vierten Nacht weiter an und sinkt ab der f nften Nacht wieder ab s Abb 3 14 Nachtaktivit t von Melatonin substituierten ME hrend einer Pi u h 4 Sid Zeitverz a5 a BN Aktivit t Einheiten o Abb 3 17 Resynchronisationszeit nach 4h Phasenverz gerung bei MT Tieren Melatonin substituierte Tiere ben tigten wie die KR Tiere nur eine Nacht zur Resynchronisation Allerdings sind die Aktivit tseinheiten bei den KR und MT Tieren sehr unterschiedlich da es bei der KR Gruppe mehr Tagaktivit t gibt Au erdem wird der
157. n der Dauer der Erddrehung n mlich 24 Stunden Dieser Rhythmus ist schon seit Milliarden von Jahren vorhanden alles sich jemals entwickelnde Leben war und ist ihm ausgesetzt Auch die Bahn der Erde in ihrem Orbit um die Sonne 365 Tage hat einen starken Einfluss auf Lebewesen denn sie ist in den quatorfernen Regionen Ursache f r die Jahreszeiten Ohne die t glich wiederkehrenden regelm igen Zeitgeberreize Licht Temperatur Nahrungsaufnahme oder soziales Umfeld weicht der endogene Rhythmus graduell vom exogenen 24 Stunden Rhythmus ab Aschoff et al 1971 Ein unsynchronisierter Rhythmus wird freilaufend free running genannt Seine endogene Periode wird als t Tau bezeichnet und ist l nger oder k rzer als 24 Stunden abh ngig von der untersuchten Spezies des Individuums und seines physiologischen Zustandes Es kommt also mit der Zeit zu Phasenverschiebungen wobei man je nach Richtung der Verschiebung von einer Phasenverz gerung das Einsetzen der Aktivit t wird verz gert phase delay oder Phasenbeschleunigung das Einsetzen der Aktivit t beginnt fr her phase advance spricht Tagaktive Tiere haben eine endogene Periode 1 von ber 24 Stunden nachtaktive Tiere unter 24 Stunden Aschoff 1981 Die Aktivit t von Versuchstieren wird in der Wissenschaft als Doppelplot Aktogramm dargestellt Hierbei ist die Aktivit t horizontal gegen die Zeit aufgetragen Es werden immer zwei Tage nebeneinander und der zweite Tag unter dem
158. n die Hepatozyten beteiligt sind Der Transporter Slc21al ist an der Bildung von Gallensalzen beteiligt Wolters et al 2002 Au erdem ist eine Fetts uresynthetase Fasn und ein fetts urebindendes Protein Fabpl herabreguliert Ein durch Schilddr senhormon regulierbares Transkript der Leber SPOT14 Grillasca et al 1997 ist ebenfalls stark gt 4 Fach herabreguliert Der Einfluss von Melatonin und KR auf die Genexpression in der Leber der Maus 4 0 3 5 3 0 2 5 2 0 1 5 1 0 i 0 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 EEE 222227 27 ET EEE RET CPLLILITLTTLIDLLITLLTLLILL p 277 EZKR Melatonin Auf und Abregulierung DEED UU p EE ee VEFEFFEFFEFEEFEEFEEEEZ P ee m LLL VEFFEEEEEEFEEEEEEFEEEEEEFEEEFEEFEER 4 0 Gensymbol 4 5 5 0 Mgll Cyp2a4 slc37 SIc25a12 Pde5a NOX1alpha Gjb3 SIc21a10 Slc21a7 SIc21a12 Thrsp SIc21a14 Eif4e Wee1 Ube213 Cnnm2 Mte1 pending P4ha2 Abb 3 27 Darstellung von Lebertranskripten die durch Melatoninsubstitution maximal auf oder abreguliert wurden Die durch Melatonin regulierten Transkripte sind maximal 2 5 fach auf und 3 2 fach abreguliert Zu den am st rksten aufregulierten Transkripten z hlen P4ha22 oxoglutarate 4 dioxygenase und Slc25al2 ein mitochondriales Transportmolek l Sechs der herabregulierten Transkripte kodieren f r Transportmolek le 3 Ergebnisse 93 Einige Transkripte scheinen von Melatonin un
159. n h her als w hrend der Lichtphase Die Nachtaktivit t ist bei den KR Tieren Di t etwas geringer die Tagaktivit t etwas h her als bei den gleichaltrigen Kontroll und MT Tieren Auf Gesamtaktivit t gerechnet gibt es aber keinen signifikanten Unterschied zwischen diesen Gruppen Es ist ferner deutlich dass die Gesamtaktivitit unter LD und DD Bedingungen mit zunehmendem Alter abnimmt vgl Normal 14 Normal 21 Es scheint dass die Gesamtaktivit t unter DD Bedingungen bei den MT Tieren zunimmt 3 Ergebnisse 80 3 1 3 2 Einfluss des Alterungsprozesses auf die lokomotorische Aktivit t von Kontrollm usen Verlauf lokomotorischer Aktivitat wahrend des Alterungsprozesses bei Mausen 4000 3000 LD DD E S 2000 2 lt 1000 0 4 5 8 11 14 21 30 Alter Monate Abb 3 13 Die lokomotorische Aktivit t von unbehandelten Kontrollm usen in einem Zeitraum von 30 Monaten Standardfehler sind angegeben N 10 f r 4 5 14 Monate und N 6 f r 21 30 Monate Wenn man nur die Aktivit t der Kontrolltiere ber einen l ngeren Zeitraum betrachtet ist die Abnahme an Gesamtaktivit t deutlich mit dem Alter korrelierbar Interessanterweise nimmt die Aktivit t bei diesem Stamm B6C3F1 in dem ersten Lebensjahr auf seinen Maximalwert zu um danach stetig abzunehmen 3 Ergebnisse 81 3 1 4 Statistische Auswertung einer Phasenverschiebung Aktivitat von M usen wahrend einer Phasen Umgew hnung nach 4 Std Zeit
160. nbank Nummer Accession number und die Beschreibung des jeweiligen Genes aufgelistet 25 6 dieser Transkripte geh ren in die Klasse der Transportmolek le die z B Anionen oder Kationen ber die Hepatozytenmembran transportieren k nnen 10 2 haben mit dem Fetts urestoffwechsel zu tun und 7 6 geh ren zu den P450 Cytochromoxidasen 3 4 Analyse circadian variierender Transkripte im Hypothalamus der Maus mittels Microarrays Von jeder Gruppe von Tieren wurden pro zu untersuchendem Zeitpunkt die RNA Populationen f nf RNA Proben pro Gruppe und Zeitpunkt gemischt gepoolt Diese wurden wie im Methodenteil beschrieben fluoreszenzmarkiert und auf Xeotron Microarrays hybridisiert Nach Ermittlung der Fluoreszenzdaten durch Laserauswertung war es m glich in Falschfarben dargestellte berlagerungsbilder herzustellen 3 Ergebnisse 97 Abb 3 31 Vergr ssertes Bild eines DNA Microarrays Sichtbare Farbkan le Gr n Kontrollmaus Hypothalamus ZTO 06 00 Uhr Rot Kontrollmaus Hypothalamus ZT6 12 00Uhr Gelbe Punkte sind gr n und rot berlagert also nicht differentiell exprimierte Gene In der obigen Abbildung sind nur 2 der vier gescannten Kan le berlagert dargestellt ZTO wurde gr n ZT6 rot abgebildet Die beiden markierten dominant roten Spots sind Duplikate des Transkriptes Insulin Rezeptor Insr accsession Nummer NM 010568 Es scheint also um ZT6 verglichen mit ZTO eine schon optisch sichtbar h here
161. nde Neuronen berwiegen Die AVP und VIP Rhythmen dissoziieren langsam in SCN Kulturen welches das Vorhandensein der E amp M Oszillatoren in Subregionen des SCN nahe legt Shinohara et al 1995 Abe und Mitarbeiter 2001 stellten fest dass die Genexpression von Per und Per2 in Hirnregionen au erhalb des SCN ebenso wie die Aktivit tsmaxima bei entsprechenden M usen biphasisch ist also zwei Maxima korrespondierend zu den Aktivititsmaxima im Verlaufe des circadianen Tages aufweist Eine alternative Theorie f r das duale Oszillatorenmodell wurde von Daan et al 2001 vorgeschlagen Hierbei sollen mPer und mCry die Hauptelemente des M und mPer2 und mCry2 die Hauptelemente des E Oszillators sein Diese Theorie st tzt sich auf Erkenntnisse ber die circadiane Aktivit t bei knockout M usen jedes der genannten Gene van der Horst et al 1999 Vitaterna et al 1999 Zheng et al 1999 Albrecht et al 2001 Die Mechanismen die f r die Kopplung oder Entkopplung von M amp E Oszillatoren verantwortlich sind sind bislang ungekl rt Es wird auch eine Beteiligung des Alterungsprozesses an der H ufigkeit des rhythm spliting Ph nomens nicht ausgeschlossen McAuley et al 2002 Im B6C3F1 Stamm konnte ich allerdings keinen Zusammenhang zwischen dem Alter und der H ufigkeit des Ph nomens erkennen 4 Diskussion 123 Bei KR Tieren konnte ich im Gegensatz zu den MT Tieren keine ausgepr gte biphasische Aktivit t unter konstanten Bed
162. ne qualitative und quantitative Auswertung in Form eines Elektropherogrammes gemacht wird 2 Material und Methoden 36 und dass die gesamte Analyse mit Vorbereitung in weniger als einer Stunde gemacht werden kann also wesentlich schneller als eine denaturierende Gelelektrophorese Prinzipiell wird eine Kapillarelektrophorese in einem kompakten Chipsystem durchgef hrt Durch F rbung der RNA mit einem Fluoreszenzfarbstoff und Vergleich mit einem internen Standard kann die Gr e der in der Probe vorhandnen RNAs 18s und 28s und ihr Verh ltnis zueinander bestimmt werden Material Agilent Bioanalyzer 2100 RNA 600 Chips RNA 6000 Nano Reagents amp Supplies Methode Es wurde je 1ul RNA untersucht Der Chip wurde wie im Herstellerprotokoll beschrieben mit den Proben beladen und im Agilent Bioanalyzer 2100 untersucht Die Integrit t der Proben wurde mit einem Computer erfasst und zus tzlich zu Dokumentationszwecken ausgedruckt 2 8 1 Konzentrationsbestimmung von Nukleins uren Theorie Zus tzlich zur beschriebenen Integrit tsmessung der RNA wurde die Konzentration spektrophotometrisch gemessen Obwohl auch schon bei der Integrititsmessung eine Quantifizierung stattfand wollte ich die ermittelten Konzentrationen mit einer alternativen Methode best tigen denn die Genauigkeit der f r die folgenden Experimente verwendeten Menge an RNA war sehr wichtig In der Regel wurden zwischen den Methoden Standardabweichungen von
163. nsische Rate des Alterungsprozesses zu verlangsamen Beim Vergleichen der Genexpressionsprofile von alten KR Tieren mit Kontrolltieren wurde festgestellt dass in allen untersuchten Organen KR ein Jugendlicheres Genexpressionsprofil verursacht Bis jetzt wurde der Effekt von KR auf die Genexpression noch nicht im Hypothalamus der Maus untersucht Ferner wurde bei allen Untersuchungen dieser Art ein wichtiger Faktor die Tageszeit der Probennahme nicht beachtet Da viele Gene ein circadianes Expressionsprofil haben k nnte es auch sein dass einige davon durch KR reguliert werden Die ermittelte Expression der Gene wire unterschiedlich je nachdem wann Proben genommen wurden In der von mir angefertigten Arbeit wurde dieser Faktor n her untersucht 1 3 3 Kalorische Restriktion und Chronobiologie Der Zusammenhang von Restriktionsern hrung und circadianer Physiologie ist weit weniger deutlich als der mit Melatonin Es wurden Studien durchgef hrt in denen ein Einfluss der F tterungszeit auf den circadianen Rhythmus festgestellt wurde Die circadiane Schwankung der K rpertemperatur von M usen ist abh ngig vom Zeitpunkt der F tterung Bei der F tterung am Tag der eigentlichen Ruhephase von M usen verschiebt sich das Temperaturmaximum in die Lichtphase Bei F tterung im Dunkeln erreicht die K rpertemperatur ebenfalls im Dunkeln ihr Maximum Nelson et al 1988 1 Einleitung 21 Wenn Ratten Hamster und M use t glich um
164. nsport under oxidative stress conditions Brain Res 977 1 23 30 Dubocovich M L K Yun et al 1998 Selective MT2 melatonin receptor antagonists block melatonin mediated phase advances of circadian rhythms Faseb J 12 12 1211 20 Dudoit S R C Gentleman et al 2003 Open source software for the analysis of microarray data Biotechniques Suppl 45 51 Duffield G E 2003 DNA microarray analyses of circadian timing the genomic basis of biological time J Neuroendocrinol 15 10 991 1002 Duffield G E J D Best et al 2002 Circadian programs of transcriptional activation signaling and protein turnover revealed by microarray analysis of mammalian cells Curr Biol 12 7 551 7 Ebisawa T S Karne et al 1994 Expression cloning of a high affinity melatonin receptor from Xenopus dermal melanophores Proc Natl Acad Sci U S A 91 13 6133 7 Gaubatz J W and B H Tan 1994 Aging affects the levels of DNA damage in postmitotic cells Ann N Y Acad Sci 719 97 107 Gekakis N D Staknis et al 1998 Role of the CLOCK protein in the mammalian circadian mechanism Science 280 5369 1564 9 Gerozissis K 2004 Brain insulin and feeding a bi directional communication Eur J Pharmacol 490 1 3 59 70 Gillette M U and S M Reppert 1987 The hypothalamic suprachiasmatic nuclei circadian patterns of vasopressin secretion and neuronal activity in vitro Brain Res Bull 19 1 135 9 God
165. nstein Heraeus Karlsruhe Invitrogen Leek Niederlande NanoDrop Technologies Rockland MWG Ebersberg Teklad Test Diets Wisconsin USA IDT Integerated DNA Technologies Coralville USA 2 Material und Methoden 68 3 Ergebnisse 3 1 Physiologische Daten 3 1 1 Entwicklung des K rpergewichts der Versuchstiere im Verlaufe der Versuchszeit Die unbehandelten Kontrolltiere N 20 hatten zu Beginn des Versuches ein K rpergewicht von 29 1 0 42g die Melatonin substituierten Tiere N20 wogen im Mittel 29 4 0 35g Bei der letzten Gewichtsbestimmung in der vierzigsten Woche hatten die Kontrolltiere ein Gewicht von 41 04 0 88g und die Melatonin substituierten Tiere ein Gewicht von 35 03x0 85g Der Gewichtsunterschied zwischen den Kontrolltieren und den Melatonin substituierten Tieren ist nach zweiseitigem t Test GraphPad Prism statistisch signifikant p 0 001 Das K rpergewicht der Versuchstiere der KR Gruppe N 20 nahm von durchschnittlich 28 6 0 32g zu Beginn des Versuchs bis zur zehnten Woche kontinuierlich ab 20 5 0 3 g danach bis zur vierzigsten Woche auf 24 07 0 38g zu Entwicklung des K rpergewichtes bei M usen abh ngig von Ern hrung und Substitution 454 Kontrolltiere KR Melatonin lter 404 P 0 0001 354 SL s a 3 5 2 30 o pe 204 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 38 39 40 41 Wochen Abb 3 1 Verlauf des K rpergew
166. ntrikel cc Corpus Callosum Das resultierende Hirnst ck wurde zur Extraktion von RNA verwendet AuDerdem wurden bei der Pr paration m glichst viel Cortexgewebe das Cerebellum und die olfaktorischen Bulbi gewonnen und bei 80 C gelagert 2 3 Material f r die Aktivit tsaufzeichnung von M usen Um die Bewegungen der M use in ihren K figen zu erfassen wurden auf 39 K fige Kan le 0 38 passive IR Bewegungsmelder von Conrad Elektronik Artikel Nr 192236 3F 2 Material und Methoden 29 montiert Da die gleichzeitig erfassbaren Aktivit tssignale nicht f r die gesamte Population an Versuchstieren ausreichten wurden nach jeder Versuchsperiode un berwachte Tiere innerhalb der Gruppen mit berwachten getauscht Die Erfassung der genauen Lichtschaltpunkte erfolgte mittels einer Fotodiode Conrad Elektronik Best Nr 163988 3F angeschlossen an Kanal 39 Die Bewegungen der Tiere wurden als TTL Signale erfasst und ber eine digitale I O Karte Modell PIO 24 48 II Best Nr 968072 22 Conrad Elektronik in einen IBM 286 Computer geleitet TTL Signale sind Spannungen zwischen 0 und 5 Volt Von 0 bis 0 8 Volt wird das Signal als 0 keine Bewegung erkannt von 2 4 bis 5 Volt als 1 Bewegung Nach jedem ausgel sten Bewegungssignal gab es eine Ruhezeit des Melders von 7 Sekunden in der keine weiteren Signale aufgezeichnet werden konnten Die Signale wurden jeweils f r 6 Minuten Intervalle gesammelt bevor ein neues Aufzeic
167. ntspricht als Uhrzeit 06 00 Uhr 12 00 Uhr 18 00 Uhr und 00 00 Uhr get tet pro Zeitpunkt und Gruppe jeweils 5 Tiere Die sechs 30 Monate alten Tiere wurden um ZT 6 12 00 Uhr get tet Die Tiere wurden in einem Exikator ber Trockeneis in CO2 Atmosph re bet ubt und durch cervicale Dislokation get tet Das austretende Blut wurde sofort aufgefangen und zur Serumgewinnung verwendet Folgende Organe wurden pr pariert Gehirn Leber Milz Niere Lunge Herz Hoden Skelettmuskel Nebennieren Schilddr se Augen Penis Nebenhoden und Bauchspeicheldr se Die Gewebe wurden in fl ssigem Stickstoff schockgefroren und anschlie end bis zur RNA Extraktion bei 80 C gelagert 2 Material und Methoden 28 Zur Pr paration des Hypothalamus wurden die Gehirne mit 5ml RNALater berschichtet f r 2h bei 4 C inkubiert und mit einem Skalpell pr pariert Von ventral wurde ein Saggitalschnitt durch das Chiasma opticum gef hrt Ein weiterer Saggitalschnitt wurde ca 3mm kaudal gef hrt und die entstehende Hirnscheibe auf die kaudale Seite gelegt Die weitere Schnittf rung erfolgte wie dargestellt Abb 2 1 Abb 2 1 Darstellung der Pr paration des Hypothalamus aus der Hirnscheibe Schnitte wie abgebildet 1 amp 2 Saggital 3 Horizontal Bild ver ndert aus Mouse Brain Library www mbl org SCN Sprachiasmatische Nuclei 3V dritter Ventrikel D3V dorsaler Teil des dritten Ventrikels cor Cortex CPu Putamen LV laterale Ve
168. oarray Technologie und qRT PCR ergab eine starke Ver nderung des hepatischen Transkriptoms durch KR weniger stark durch MT Die am st rksten durch KR aufregulierten Transkripte geh rten zu den P450 Cytochromoxidasen die am st rksten abregulierten partizipieren am Fetts urestoffwechsel MT induzierte Transkripte geh ren z B zum Zellzyklus und der Detoxifikation die meisten abregulierten Transkripte waren Transportmolek le Es gab in den Genexpressionsprofilen der Lebern zwischen der KR und MT Gruppe wenige bereinstimmungen Die Untersuchung der hypothalamischen Genexpression mittels Microarray Technologie und qRT PCR ergab eine Vielzahl an circadian regulierten Genen ber 40 neue Transkripte mit einer circadianen Expression wurden identifiziert Die Expression der bekannten Uhr Gene entsprach gr tenteils den Beschreibungen in der Literatur Bei alten M usen 30 Monate wurde eine verringerte Expression vieler Uhr Gene ZT6 beobachtet Ansonsten zeigten sie sehr wenige f r M use typische altersbedingte Ver nderungen in der Genexpression KR und MT Behandlungen zeigten wenige Effekte auf die gut untersuchten Kernkomponenten der inneren Uhr Der Vergleich der circadianen Genexpression zwischen den Versuchstiergruppen mittels Microarray Technologie ergab hingegen ein komplexes Bild differentieller Regulation Alle neu identifizierten rhythmischen Transkripte zeigten bei den KR und MT Tieren ebenfalls eine circadiane Regulation Aller
169. odifizierter cDNA Theorie Als Sonden bezeichnet man spezifische einzelstr ngige DNA oder RNA Molek le die eingesetzt werden um eine bestimmte Population von DNA oder RNA Molek len mit komplement rem Strang in Microarrays verschiedenen Blot Typen oder Gewebeschnitten in situ nachzuweisen Diese Sonden werden fluoreszenz radioaktiv oder nicht radioaktiv durch einen ausfallenden Farbstoff wie NBT und BZIP markiert und werden z B in Microarrays Northern Blot Southern Blot oder in situ Hybridisierungen eingesetzt 2 Material und Methoden 55 In dem von mir verwendeten Verfahren wird zuerst f r jede Probenpopulation bis zu 4 in einem Experiment ein cDNA Strang synthetisiert in den Aminoallyl markierte Nukleotide eingebaut werden Dieser Einbau erfolgt in allen Proben gleich sofern die Matrizen RNA dieselbe Qualit t hat es gibt also im Gegensatz zum direkten Einbau eines fluoreszenz markierten Nukleotides keinen Einfluss auf die Ausbeute an fluoreszierender Sonde Der Fluoreszenzfarbstoff vorliegend als Carboxyls ure Succinimidylester wird in einer zweiten Reaktion chemisch an die Aminoallyl modifizierten Nukleotide gekoppelt Diese Markierungsmethode ist wesentlich besser als eine direkte Markierung denn die Fluoreszenzfarbstoffe z B Cy 3 und Cy 5 haben eine unterschiedliche Molek lgr e welche zu erheblichen Diskrepanzen in der Markierungseffizienz f hren kann In dieser Arbeit wurden immer vier Proben mit
170. os ure Die f r G Protein gekoppelte Rezeptoren typischen Motive sind durch den Aminos ureaustausch nicht beeinflusst Hierzu geh ren z B in TM VII ein f r die Melatoninrezeptoren typisches Motiv NA I V I V Y Jin et al 2003 Es gibt keinen profunden Hinweis daf r dass der MT2 Rezeptor im B6C3F1 Stamm nicht funktionell ist berhaupt scheinen die beiden Subtypen MT1 und MT2 bis zu einem gewissen Grad funktionell redundant zu sein Hamster mit einer nat rlichen nonsense Mutation im MT2 Rezeptor zeigen alle normalen circadianen Reaktionen Weaver et al 1996 Auch der murine MT2 Rezeptor knockout zeigt einen sehr unauff lligen circadianen Ph notyp Jin et al 2003 Die Tatsache dass Melatonin in niedriger Konzentration ber MTI in hoher ber MT1 und MT2 wirkt beruht wahrscheinlich nicht auf einer geringeren Affinit t von MT2 sondern auf der geringeren Rezeptorexpression 4 Diskussion 130 Beide MT Rezeptoren hatten in meinen qRT PCR Reaktionen sehr hohe Ct Werte gt 33 Zyklen was auf eine extrem niedrige Expression schliessen l sst Der MT1 Rezeptor ist f r alle autoradiographisch detektierbaren Melatoninbindungen im Gehirn von M usen verantwortlich Liu et al 1997 4 5 Genexpression in der Leber In Nagetieren Primaten und Menschen reduziert KR Blut Glucose Insulin Werte und die H chstkonzentration an Glucose in oralen Glucose Toleranz Tests Weindruch et al 1982 amp 1983 Es gibt einige Hinweise da
171. otein s27 mRP27 F 5 mRP27 R 3 CCAGATATTGAGGCCAAGGTCCAT GCCTCCGTATAGGGCATCTTCATT CTGGATTCTAAGCAGAAGCACCGA GTGATCTCCATGTCAGAAAGGGCT GTGGCTATGATTATGGCCCTCAGT GTGTCCATGAAGGTCACCCAGTTA CTCCAGACACTGAACTTGCAGAGA TCTCCATCGTTCTCGACCTTAGGA CCAGGATAAGGAAGGAATTCCTCCTG CCAGCACCACATTCATCAGAAGG Hypoxanthin Phosphoribosyl transferase mHPRT F 5 mHPRT R 3 2 5 4 Allgemeine Primer Oligo d T T7 Primer 5 SP6 Primer CTGGTGAAAAGGACCTCTCG TTGCGCTCATCTTAGGCTTT d T 30 CGGGATATCACTCAGCATAATG ATTTAGGTGACACTATAGAA 2 Material und Methoden 34 2 6 Verwendete Vektoren pDRIVE Qiagen Der pDRIVE Vektor 3 8 kb ist ein viel erprobtes System fiir die Klonierung von PCR Produkten Er ist durch die Addition von 3 terminalen Uracilen an beiden Enden der Klonierungsstelle pr pariert ein modifizierter T Vektor Die effiziente Ligation von PCR Produkten erfolgt ber eine Anlagerung ihrer 3 Deoxyadenosinreste an die U berh nge des Plasmides Dieser Vektor hat einen fl Replikationsursprung sowie T7 und SP6 RNA Polymerase Promotoren die die multiple Klonierungsstelle 5 und 3 flankieren Inserts k nnen mittels EcoRI herausgeschnitten werden Die Selektion geschieht ber Ampicillin Resistenz und die Unterbrechung der kodierenden Region f r das a Peptid der B Galactosidase Blau Wei Selektion 2 7 Isolierung von Gesamt RNA Theorie Neben ribosomaler RNA existieren in den Zellen viele verschi
172. othalamische Genexpression Kontrolltiere hoch exprimierte Transkripte ZT 12 3 5 Avp 3 E Dbp o H N y nsr R2 2 Itgb3 o 2 S Mrpl20 2 15 5 O Atp5k n 1 Eif4ebp2 0 5 Sncb 0 ZT Abb 3 36 Im Hypothalamus von Kontrolltieren um ZT 12 stark exprimierte Transkripte Hypothalamische Genexpression Kontrolltiere niedrig exprimierte Transkripte ZT 12 2 5 o Fr N 2 SIc26a2 N 2 E Ube2e1 G 515 S Slc4a10 Ed Calm2 a 1 x ul oe Calmi 0 5 12 18 eo o ZT Abb 3 37 Im Hypothalamus von Kontrolltieren um ZT 12 gering exprimierte Transkripte 3 Ergebnisse 102 Hypothalamische Genexpression Kontrolltiere hoch exprimierte Transkripte ZT 18 4 5 Ak4 H C1sb Calm lt Calm2 Dnajat Figf Expressionsratio zu ZT 0 Gja10 Grid2 ZT Abb 3 38 Im Hypothalamus von Kontrolltieren um ZT 18 stark exprimierte Transkripte Hypothalamische Genexpression Kontrolltiere niedrig exprimierte Transkripte ZT 18 Nos2 2 5 Eif2b l C4 Osnkle Slc21a7 Slc2a10 Cry2 Expressionsratio zu ZT 0 Rgs7 Rgs19 Junb hippocam p cDNA zT Abb 3 39 Im Hypothalamus von Kontrolltieren um ZT 18 gering e
173. pelt Seine Aktivierung f hrt zur Inhibition der Adenylatzyklase und zum Sinken von intrazellul rem cAMP Brydon et al 1999 Der MT2 Rezeptor inhibiert ebenfalls die Adenylatzyklase Reppert et al 1995 und zus tzlich die Bildung von cGMP Petit et al 1999 4 Diskussion 143 Die Abregulierung der beiden Ga und Ga inhibierenden RGS Transkripte bei den MT Tieren bedeutet dass Melatonin ungehinderter ber den cAMP Signalweg wirken kann Bei den KR Tieren ist der Effekt umgekehrt ber einen bisher unbekannten Mechanismus f hrt Melatoninsubstitution zur Sensitivierung und KR zur Desensitivierung des CAMP und cGMP Signalweges F r das circadiane System bedeutet dies eindeutig dass die synchronisierende Wirkung von Melatonin bei den MT Tieren erh ht und bei den KR Tieren vermindert ist 4 7 Microarray Technologie und Chronobiologie eine Evaluierung Beim Vergleich von circadian exprimierten Transkripten des SCN und anderer Gewebe durch unterschiedliche Forschergruppen stellte sich heraus dass nur wenige der als circadian eingestuften Transkripte zwischen den Experimenten berlappten Duffield 2003 Nat rlich m ssen hierbei Faktoren wie die benutzte Microarray Technologie Plattform Markierung und vor allem die applizierte Datenanalyse beachtet werden Je stringenter die Kriterien sind um ein Gen als rhythmisch exprimiert einzustufen desto weniger Kandidaten bleiben am Ende brig Diese Aussage unterst tzen
174. ponenten auf biphasisch eine Morgen und eine Abendkomponente M amp E morning amp evening Unter Zeitgeberbedingungen sind die M und E Komponente eng aneinander gekoppelt unter freilaufenden Bedingungen k nnen sie allerdings entkoppelt werden Auch in anderen S ugetieren und V geln wurde dieses Ph nomen beobachtet Abe et al 1999 amp 2001 Gwinner 1974 Pittendrigh 1960 Die genaue Ursache f r das rhythm splitting ist noch unklar In Hamstern k nnten die M amp E Oszillatoren in der linken und rechten SCN Hemisph re lokalisiert sein Unilaterale L sionen des SCN in Hamstern mit gespaltener Aktivit t f hren zum Verlust einer Aktivit tskomponente und der Wiederherstellung nur eines circadianen Aktivit tsmaximums Daan et al 1978 Die Expression eines Uhr Gens Perl im SCN von biphasischen Hamstern ist asymmetrisch und wechselt von Seite zu Seite des SCN De la Iglesia et al 2000 Andererseits gibt es Indizien auf die Lokalisierung der beiden Oszillatoren in derselben Seite des SCN Mason 1991 Zlomanczuk et al 1991 Der SCN besteht aus zwei anatomisch distinkten Subregionen venterolateral und dorsomedial Die letztere bekommt direkte Lichtinformationen ber den RHT Moore et al 2002 Nur in der venterolateralen Region kann das Gen Per durch Licht induziert werden Hamada et al 2001 AuDerdem dominieren in der venterolateralen Region VIP enthaltende Neuronen wobei in der dorsomedialen Region AVP enthalte
175. pte Hierzu geh ren der C4 complement Faktor Immunsystem und Casein Kinase le und Cry2 Komponenten der circadianen Uhr Ein Behandlungseffekt ist h ufig streng an den untersuchten circadianen Zeitpunkt gekoppelt Selbst bei sehr stark beeinflussten Transkripten wie Clsb das bei den KR und MT Tieren stark aufgeregelt ist ist die Amplitude des beobachteten Effektes von der Tageszeit abh ngig Wird beispielsweise ZT 18 als Referenzzeitpunkt gew hlt kann kein Behandlungseffekt festgestellt werden zu allen anderen Zeitpunkten jedoch schon Da bisher nur Transkripte bei den KR und MT Tieren untersucht wurden die in der Kontrolltiergruppe circadian schwankten wurde die gruppeninterne circadiane Genexpression untersucht Gew hlt wurde wie bei den Kontrolltieren der Referenzzeitpunkt ZTO 06 00 Uhr Im Folgenden sind die mini und maximal regulierten Transkripte dieser Gruppen dargestellt Anstatt den gesamten circadianen Verlauf der Transkripte zu demonstrieren ist jeweils ein Zeitpunkt maximaler und minimaler circadianer Expression dargestellt 3 Ergebnisse 107 Circadian regulierte Transkripte im Hypothalamus von KR Mausen 25 L AKHR 2 0 E KR eo R 15 N 1 0 9 S 05 o 5 00 a o 0 5 x 10 m IT 1 5 2 0 ZT 6 0 ZT 12 0 ZT 18 0 C Qa r gt O gt OKANR BANDHAN G TN x WO o 0 20 amp 9 239 DIET SOLL DO AS SEEOATOSRGEO HL ES EOS LO G og EFIE og i u Gensymbol Abb 3 40 Transkripte di
176. r Thomomys bottae J Pineal Res 16 3 145 53 Reiter R J D X Tan et al 1994 Melatonin as a free radical scavenger implications for aging and age related diseases Ann N Y Acad Sci 719 1 12 Reppert S M C Godson et al 1995 Molecular characterization of a second melatonin receptor expressed in human retina and brain the Mel1b melatonin receptor Proc Natl Acad Sci U S A 92 19 8734 8 Reppert S M and I Sauman 1995 period and timeless tango a dance of two clock genes Neuron 15 5 983 6 Reppert S M T Tsai et al 1994 Cloning of a structural and functional homolog of the circadian clock gene period from the giant silkmoth Antheraea pernyi Neuron 13 5 1167 76 Reppert S M and D R Weaver 1995 Melatonin madness Cell 83 7 1059 62 Reppert S M and D R Weaver 2000 Comparing clockworks mouse versus fly J Biol Rhythms 15 5 357 64 Reppert S M and D R Weaver 2001 Molecular analysis of mammalian circadian rhythms Annu Rev Physiol 63 647 76 Reppert S M and D R Weaver 2002 Coordination of circadian timing in mammals Nature 418 6901 935 41 Reppert S M D R Weaver et al 1995 Melatonin receptors are for the birds molecular analysis of two receptor subtypes differentially expressed in chick brain Neuron 15 5 1003 15 Reppert S M D R Weaver et al 1994 Cloning and characterization of a mammalian melatonin receptor that mediates reprod
177. r Leber beobachteten Akhtar und Mitarbeiter 2002 ebenfalls eine Reihe circadianer Transkripte dieser Kategorie Es gab zwischen der von mir durchgef hrten Studie keine bereinstimmungen der spezifischen Transkripte Dies ist aufgrund des unterschiedlichen hepatischen und hypothalamischen Transkriptoms nicht verwunderlich Es scheint plausibel dass der Transport von Glukose Anionen etc dem zellul ren Bedarf im Verlaufe des Tags angepasst wird Ferner wird aufgrund der verschiednen Phasen der Transkripte deutlich dass auch funktionell verwandte Transkripte nicht unbedingt in Phase exprimiert werden Dies legt die Annahme nahe dass funktionelle Kaskaden einer temporalen feink rnigen circadianen Regulation unterliegen Die Glukose 6 Phosphat Dehydrogenase G6pdx weist bei KR Tieren eine besonders starke circadiane Schwankung mit einem Minimum um ZT12 und Maximum um ZT18 auf Sie ist ein Enzym des Pentosephosphat zyklus Ferner ist die Glutamin Fruktose 6 Phosphat Transaminase Glutamine fructose 6 phosphate amidotransferase GFAT circadian reguliert Sie ist das geschwindigkeits bestimmende Enzym in der Synthese von Glucosaminen und Hexosaminen Sayeski et al 1997 Der Hexosamin Biosyntheseweg reguliert eine diverse Anzahl zellul rerer Vorg nge einschlie lich glucose induzierter Insulin Desensibilisierung in Adipozyten Marshall et al 1991 Glycogensynthase aktivitit Crook et al 1993 Pyruvatkinase aktivitit Traxinger et al 199
178. rauf dass Glucose und Insulin eine Rolle in vielen Pathologien des Alterns spielen Hyperglyk mie wird mit neurologischen Komplikationen mikrovaskul ren St rungen Verdickung der Basalmembranen und beeintr chtigter zellul rer Immunit t in Verbindung gebracht Barzilai et al 1995 Hyperinsulin mie ist mit koronarer Herzkrankheit Bluthochdruck und Arteriosklerose assoziiert Stout et al 1990 Alle erw hnten Pathologien gehen mit erh hten Glucosespiegeln einher und werden durch KR vermindert oder gar vermieden Dhahbi et al 1999 Ver nderungen im Kohlehydrate Metabolismus K nnten eine wichtige Rolle in der Vermittlung von anti aging Effekten durch KR spielen Die Untersuchung der Genexpression in der Leber von M usen kann dazu beitragen den Mechanismus wie KR wirkt zu verstehen Die Untersuchung der Genexpression in der Leber von KR M usen ist schon gut charakterisiert Dahabi et al 2004 amp 1999 deswegen war dies auch eine gute Best tigung f r den Erfolg der etablierten Restriktionsern hrung Ferner sollte festgestellt werden ob es Uberlappungen in den Expressionsprofilen von KR und MT Tieren gibt Die am st rksten aufgeregelten Gene in der Leber durch KR waren in meinem Versuch die Cytochromoxidasen Cyp3all Cyp2a4 und Por Sie geh ren zu einer hochkonservierten Superfamilie von Monooxygenasen die eine Vielzahl zellul rer Prozesse katalysieren Hierzu geh ren Steroidhormonsynthese und Detoxifikation Lin et al
179. rch auf und abpipettieren gemischt und f r 2 Stunden bei 46 C Inkubiert Hydrolyse und Neutralisation Es werden 15ul 1 N NaOH in das Reaktionsgef pipettiert und f r 10 min bei 70 C inkubiert 15pl 1 N HCl werden hinzugef gt um den pH Wert zu neutralisieren 20413 M Natriumacetat pH 5 2 werden hinzugef gt 2 Material und Methoden 57 Reinigung der Aminoallyl modifizierten cDNA Theorie Nach der Synthese der Aminoallyl modifizierten cDNA m ssen nicht inkorporierte dNTPs und hydrolisierte RNA aus der Reaktion entfernt werden da sie in den folgenden Schritten st rend wirken Hierzu werden S N A P S ulchen verwendet auf deren Membran die cDNA gebunden wird w hrend alle st renden Anteile in den Durchfluss gehen Material cDNA Labeling Purification Module Invitrogen Aminoallyl modifizierte cDNA Ethanol 96 20 C Ethanol 75 20 C Isopropanol DEPC behandeltes Wasser Mikrozentrifuge 1 5ml Reaktionsgef im Kit enthalten 3M Natrium Acetat pH 5 2 im Kit enthalten Glykogen 20mg ml im Kit enthalten Methode 1 Probe mit 500ul Ladepuffer mit Isopropanol versetzen und durch Vortexen mischen 2 Probe auf S N A P Sdule laden und 1 min bei 14 000g zentrifugieren Durchflu verwerfen die cDNA ist nun an der Membran der S ule gebunden 3 700ul Waschpuffer mit Ethanol auf S ule pipettieren und 1min bei 14 000g zentrifugieren Durchflu verwerfen
180. rd Wie circadiane Informationen vom SCN zur Pinealdr se gelangen ist recht gut gekl rt jedoch ist die reziproke Interaktion der Pinealdr se mit dem SCN unklar Das AVP Transkript zeigt im Hypothalamus der MT Tiere einen reziproken Verlauf im Vergleich mit den KR und Kontrolltieren Dieses Resultat ist in der Tat erstaunlich denn zu erwarten w re eigentlich wie bei den KR und Kontrolltieren ein hoher Tagwert und ein niedriger Nachtwert Durch den AVP inhibierenden Effekt von Melatonin w rde ein sehr niedriger Nachtwert plausibel erscheinen 4 Diskussion 135 Dies ist schwierig zu erkl ren Eine M glichkeit ist dass die circadiane Regulation von AVP nicht ausschlie lich ber Melatonin geschieht Es k nnte sein dass der AVP unterdr ckende Effekt von Melatonin stark zeitversetzt eintritt und daher erst am Ende der subjektiven Nacht zu einer Verringerung der AVP mRNA f hrt Wirklich plausibel ist dieses Resultat nicht da es aber auf Microarray Ebene hnlich war ist es relativ verl sslich 4 6 2 Circadiane Expression von Transkripten im Hypothalamus der Maus Microarray Analyse Die Microarray Analyse von circadian exprimierten Transkripten im Hypothalamus der Maus ergab eine Vielzahl von Transkripten aus unterschiedlichen Genkategorien Da eine vergleichbare Studie an Hypothalami bislang nicht durchgef hrt wurde ist es mir nur m glich meine Ergebnisse mit denen aus hnlichen neuronalen und nicht neuronalen Geweben
181. regung detektiert Der Reihe nach dargestellt ergibt dies die komplement re Sequenz des Matrizenstranges Material ABI PRISM Big Dyerm Terminators v3 0 Cycle Sequence Kit Applied Biosystems Robocycler Stratagene ABI PRISM 377 DNA Sequencer gereinigtes PCR Produkt oder Plasmid Methode Sequenzreaktion Es wurden 500 1000ng Plasmid DNA bzw 50 100ng 100bp gereinigtes PCR Produkt als Matrize benutzt und mit folgenden Reagenzien in einem 0 2ml Eppendorf Gef gut durchmischt 2 Material und Methoden 54 1 5ul genspezifischer Primer bei Plasmid T7 bzw Sp6 Primer 10pmol ul 2ul Big Dye Mix 6ul 6x Puffer add dest Wasser bis zum Endvolumen von 20u1 Thermoprofil im Robocycler 95 C 10s 50 C 5s 25 Zyklen 60 C Amin Zu dem PCR Produkt wurden 2ul 3M NatriumAcetat pH 5 2 und 50ul 96 Ethanol gegeben Es wird f r mindestens 30min bei 20 C inkubiert bei Bedarf auch ber Nacht Anschlie end wird f r 30min bei 4 C und 14 000Upm zentrifugiert Das resultierende Pr zipitat wird zweimal mit 70 Ethanol gewaschen und f r 15min an der Luft getrocknet Das Sequenzieren erfolgte mit Hilfe eines ABI PRISM 377 DNA Sequencer Applied Biosystems im Zentralen Service Labor des Institutes f r Zellbiochemie und Klinische Neurologie des Universit tsklinikums Hamburg Eppendorf gemacht 2 19 Herstellung fluoreszenzmarkierter cDNA Sonden f r eine Microarray Hybridisierung 2 19 1 Synthese Aminoallyl m
182. ression des Transkriptes Cyp2a4 in der Leber der Maus 3 50E 00 3 00E 00 2 50E 00 2 00E 00 1 50E 00 1 00E 00 Normalisierte Genexpression au 5 00E 01 0 00E 00 Kontrolltiere Melatonin Behandlungsgruppe Abb 3 29 Realtime PCR Expression des Transkriptes Cyp2a4 NM 009997 cytochrome P450 2a4 Cyp2a4 mRNA in der Leber der Maus N 4 pro Gruppe Die Postevaluierung des Transkriptes Cyp2a4 ergab dass auch hier die durch Microarray detektierbare Regulierung untersch tzt wird In der Microarray Untersuchung ist das Transkript etwa 3 5 fach KR und 2 fach Melatoninsubstitution heraufreguliert Realtime PCR ergibt eine st rkere Aufregulierung von 6 9 fach KR bzw 2 4 fach Melatoninsubstitution 3 Ergebnisse 95 Expression des Transkriptes Cyp3a11 in der Leber der Maus 1 40E 01 1 20E 01 1 00E 01 8 00E 00 6 00E 00 4 00E 00 Normalisierte Genexpression au 2 00E 00 0 00E 00 Kontrolltiere Melatonin Behandlungsgruppe Abb 3 30 Realtime PCR Expression des Transkriptes Cyp3a11 NM_007818 cytochrome P450 steroid inducible 3a11 in der Leber der Maus N 4 pro Gruppe Das Transkript Cyp3all ist durch KR am st rksten beeinflusst Die durch Realtime PCR ermittelte Expression lag bei 7 13 fach h her bzw 4 6 fach Melatoninsubstitution In der unten abgebildeten Tabelle sind alle durch M
183. rhythmisch M use Hamster und Ratten scheuen Licht es ist sogar ziemlicher Stress f r sie ihm permanent ausgesetzt zu werden Ferner war die endogene Periode der Hamster Mesocricetus auratus l nger als 24 Stunden Im Gegensatz zu meinen M usen m ssen diese Hamster also durch einen t glich pr sentierten Zeitgeber in ihrer Phase gebremst verz gert und nicht beschleunigt werden Der Unterschied in der Periode von 4 5 und 30 Monate alten B6C3F1 M usen von ca 0 4 Stunden ist vergleichbar mit der von Possidente und Mitarbeitern 1995 berichteten Allerdings waren die dort verwendeten M use erstens von anderen St mmen und zweitens waren sie insgesamt j nger als in meiner Studie 1 und 7 5 Monate alt berhaupt habe ich den Verlauf der endogenen Periode bei Kontrolltieren f r eine recht lange Zeit beobachten k nnen lediglich f r die KR und MT Tiere gibt es wie bei andern Studien auch nur 2 Zeitpunkte Die Ver nderung der Periode scheint ein Charakteristikum des alternden circadianen Systems zu sein und es gibt Hinweise dass die Uhr im SCN selber im Alterungsprozess ver ndert wird Witting et al 1994 Der Beginn lokomotorischer Aktivit t unter LD Bedingungen scheint sich im Alter leicht zu verz gern Junge M use Abb 3 2 sind sofort nach Einsetzen der Dunkelheit aktiv Dies scheint bei lteren M usen nachzulassen Abb 3 9 3 11 Das verz gerte Einsetzen um ca 10 25min der Aktivit t ist im Einklang mit der Verl ngerun
184. rnde Lichtverh ltnisse wichtig Ruby und Mitarbeiter 2000 stellten fest dass Hamster mit wenig endogenem Melatonin es nicht schaffen eine 5h Phasenverz gerung zu kompensieren Unter Lichtbedingungen eines langen Tages 16h Licht appliziert verursachte die 5h Phasenverz gerung einen monatelangen Freilauf unter LD Bedingungen Die Kopplung von Licht als starkem Zeitgeber war also nicht ausreichend um die endogene Phase mit der der Umwelt zu synchronisieren Durch die exogene Gabe von Melatonin konnte die Resynchronisation erreicht werden Interessanterweise besitzt Phodopus sungorus der sibirische Hamster keinen MT2 R Weaver et al 1996 Dennoch konnte Melatonin ber MTI R synchronisierend wirken Der MTI R ist als G Protein gekoppelter Rezeptor mit hoher Affinit t zu seinen Liganden charakterisiert worden Barrett et al 2003 Der MTI R ist f r die akute inhibitorische Wirkung von Melatonin auf die Rate der SCN Aktionspotentiale verantwortlich Phasenverschiebungen des circadianen Systems auch in vitro als Aktionspotentiale in SCN Zellkultur kommen bei MTI R knockout M usen dennoch vor Liu et al 1997 Deswegen wird die Vermittlung von Phasenverschiebungen zum Teil dem MT2 R zugesprochen 4 Diskussion 124 Dubocovich et al 1998 Hunt et al 2001 M glicherweise hatte die Substitution von Melatonin zur Folge dass beide Rezeptoren aktiviert wurden Der MT2 R hat eine niedrigere Affinit t zu Melatonin als der MT1 R i
185. roid hormone concentrations in the rat Mech Ageing Dev 53 1 9 16 Hirota T and Y Fukada 2004 Resetting mechanism of central and peripheral circadian clocks in mammals Zoolog Sci 21 4 359 68 Hogenesch J B W K Chan et al 1997 Characterization of a subset of the basic helix loop helix PAS superfamily that interacts with components of the dioxin signaling pathway J Biol Chem 272 13 8581 93 Hunt A E W M Al Ghoul et al 2001 Activation of MT 2 melatonin receptors in rat suprachiasmatic nucleus phase advances the circadian clock Am J Physiol Cell Physiol 280 1 C110 8 Iguchi H 1981 Age dependent changes in the serum melatonin concentrations in healthy human subjects and in patients with endocrine and hepatic disorders and renal failure author s transl Fukuoka Igaku Zasshi 72 7 423 30 Isobe Y J Fujioi et al 2001 Circadian rhythm of melatonin release in pineal gland culture arg vasopressin inhibits melatonin release Brain Res 918 1 2 67 73 Isobe Y T Torii et al 2001 Melatonin inhibits Arg vasopressin release via MT 2 receptor in the suprachiasmatic nucleus slice culture of rats Brain Res 889 1 2 214 9 Jiang C H J Z Tsien et al 2001 The effects of aging on gene expression in the hypothalamus and cortex of mice Proc Natl Acad Sci U S A 98 4 1930 4 Jiang J C E Jaruga et al 2000 An intervention resembling caloric restriction prolongs life span
186. sch Es gibt weitere bereinstimmungen zwischen in der Leber Oishi Miyazaki et al 2003 und im Hypothalamus rhythmischen Transkripten Hierzu geh ren das Hitzeschockprotein Dnajl ein Transkript des Immunsystems complement component C1SB einige Transportmolek le Slco solute carrier und die schon beschriebenen Output Gene AVP und DBP Ferner ist die Casein Kinase le meinen Untersuchungen nach rhythmisch Wie in der Einleitung erw hnt phosphoryliert diese Kinase PER und CRY Proteine mutiert entsteht der t Ph notyp bei Hamstern Ralph and Menaker 1988 Eine circadiane Expression dieses Enzyms w rde in der Tat sinnvoll erscheinen denn seine Zielproteine PER CRY sind ber den Tag verteilt in unterschiedlichen Mengen verf gbar Eine interessante Entdeckung ist die circadiane Regulierung von Untereinheiten von Ionenkan len Gja3 Gjal0 und des Glutamatrezeptors Die Neuronen des SCN empfangen Lichtinformationen ber den RHT Retinohypothalamischer Trakt durch die Neurotransmitter PACAP pituitary adenylyl cyclase activating peptide und Glutamat Reppert amp Weaver 2002 Die hohe Expression um ZT18 der Mitte der Aktivit tsphase k nnte zu einer Sensibilisierung des photopischen Systems gegen ber Licht beitragen Nur die angemessene Reaktion auf eine Ver nderung des Lichtregimes z B ein Lichtpuls kann ein Tier optimal an seine Umwelt anpassen Die hohe Expression dieses Rezeptors bei den MT Tieren zu zwei Zeiten des Tages
187. ses age related changes in cortical cytokine mRNA levels and their responses to an inflammatory stimulus Neurobiol Aging 23 4 633 8 Shearman L P X Jin et al 2000 Targeted disruption of the mPer3 gene subtle effects on circadian clock function Mol Cell Biol 20 17 6269 75 Shearman L P S Sriram et al 2000 Interacting molecular loops in the mammalian circadian clock Science 288 5468 1013 9 Shearman L P M J Zylka et al 1997 Two period homologs circadian expression and photic regulation in the suprachiasmatic nuclei Neuron 19 6 1261 9 Shinohara K S Honma et al 1995 Two distinct oscillators in the rat suprachiasmatic nucleus in vitro Proc Natl Acad Sci U S A 92 16 7396 400 Shinohara K and S T Inouye 1995 Photic information coded by vasoactive intestinal polypeptide and neuropeptide Y Neurosci Biobehav Rev 19 3 349 52 Silver R J LeSauter et al 1996 A diffusible coupling signal from the transplanted suprachiasmatic nucleus controlling circadian locomotor rhythms Nature 382 6594 810 3 Sohal R S and R Weindruch 1996 Oxidative stress caloric restriction and aging Science 273 5271 59 63 Steinhilber D M Brungs et al 1995 The nuclear receptor for melatonin represses 5 lipoxygenase gene expression in human B lymphocytes J Biol Chem 270 13 7037 40 Steinlechner S B Jacobmeier et al 2002 Robust circadian rhythmicity of Per1 and Per
188. side the suprachiasmatic nucleus Eur J Neurosci 14 7 1121 8 Abe H S Honma et al 2001 Clock gene expressions in the suprachiasmatic nucleus and other areas of the brain during rhythm splitting in CS mice Brain Res Mol Brain Res 87 1 92 9 Akhtar R A A B Reddy et al 2002 Circadian cycling of the mouse liver transcriptome as revealed by cDNA microarray is driven by the suprachiasmatic nucleus Curr Biol 12 7 540 50 Akiyama H S Barger et al 2000 Inflammation and Alzheimer s disease Neurobiol Aging 21 3 383 421 Albrecht U 2001 Circadian rhythms a fine c l ocktail Curr Biol 11 13 R517 9 Albrecht U and H Oster 2001 The circadian clock and behavior Behav Brain Res 125 1 2 89 91 Albrecht U Z S Sun et al 1997 A differential response of two putative mammalian circadian regulators mper1 and mpere to light Cell 91 7 1055 64 Albrecht U B Zheng et al 2001 MPer1 and mper2 are essential for normal resetting of the circadian clock J Biol Rhythms 16 2 100 4 Angleson J K and T G Wensel 1993 A GTPase accelerating factor for transducin distinct from its effector cGMP phosphodiesterase in rod outer segment membranes Neuron 11 5 939 49 Antoch M P E J Song et al 1997 Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue Cell 89 4 655 67 Arendt J S Deacon et al 1995 Melatonin and adjustment to p
189. son C and S M Reppert 1997 The Melia melatonin receptor is coupled to parallel signal transduction pathways Endocrinology 138 1 397 404 Griffin E A Jr D Staknis et al 1999 Light independent role of CRY1 and CRY2 in the mammalian circadian clock Science 286 5440 768 71 Grillasca J P M Gastaldi et al 1997 Cloning and initial characterization of human and mouse Spot 14 genes FEBS Lett 401 1 38 42 Gwinner E 1974 Endogenous temporal control of migratory restlessness in warblers Naturwissenschaften 61 9 405 Gwinner E 1974 Testosterone induces splitting of circadian locomotor activity rhythms in birds Science 185 4145 72 4 Hagemeier C H S Shima et al 2003 Coenzyme F420 dependent methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase Mtd from Methanopyrus kandleri a methanogenic enzyme with an unusual quarternary structure J Mol Biol 332 5 1047 57 Hamada T J LeSauter et al 2001 Expression of Period genes rhythmic and nonrhythmic compartments of the suprachiasmatic nucleus pacemaker J Neurosci 21 19 7742 50 Hamm H E and A Gilchrist 1996 Heterotrimeric G proteins Curr Opin Cell Biol 8 2 189 96 Hattar S H W Liao et al 2002 Melanopsin containing retinal ganglion cells architecture projections and intrinsic photosensitivity Science 295 5557 1065 70 Herlihy J T C Stacy et al 1990 Long term food restriction depresses serum thy
190. sstation Cleaning XeoChips geladen Puffer EX2 mit Triton durch die Hybridisierungsstation pumpen Vorbereiten der fluoreszenzmarkierten Sonde f r die Hybridisierung l Folgende Reagenzien werden zur pr zipitierten fluoreszenzmarkierten Sonde pipettiert Reagenz uL 20X SSPE 15 2 Material und Methoden 63 Formamid 12 5 Triton X 100 10 2 Control Spike 2 2 Nuklease freies Wasser 18 5 Endvolumen 50ul Die n chsten Schritte werden alle vor Licht gesch tzt durchgef hrt 2 Die Sonde wird gut gemischt f r 3min bei 94 C inkubiert und anschliessend f r eine Minute auf Eis gestellt Die denaturierte Sonde wird nun f r eine Minute bei 12 000g durch einen mit 5Oul Puffer EX 3 angefeuchteten Costar 0 22 uM Filter zentrifugiert In den Deckel eines 0 5ml Reaktionsgef es werden mit einer 20gauge Infusionsnadel 2 L cher gestochen die als Ein und Auslass ffnungen der Schl uche der M 2 Manual Microfluidic Station dienen die filtrierte Sonde wird nun in dieses Gef pipettiert Das Reaktionsgef mit der Sonde wird in den entsprechenden Halter der Station gestellt der Ein und Auslassschlauch werden durch die L cher im Deckel gesteckt sodass sie in die Hybridsierungsl sung tauchen Hierbei ist zu beachten dass der Einlassschlauch bis zum Boden der Auslassschlauch ein wenig dar ber zu liegen kommt Der Bereich der Hybridisierungsstation mit dem Reaktionsgef wird mit Alufolie abgedeckt um die fl
191. sterilen Pipettenspitze aufgenommen und in ein 15ml Falcon R hrchen mit 5 ml LB Fl ssigmedium mit Ampicillin 100 ug ml berf hrt Es wurde ber Nacht bei 37 C 225 rpm im Sch ttelinkubator inkubiert 2 Material und Methoden 51 2 16 Plasmid Minipr paration Theorie Die meisten Plasmidpr parationen sind Modifikationen des klassischen Protokolls von Birnboim et al 1979 Es wird eine Alkali Lyse der Bakterien durchgef hrt gefolgt von einer Pr zipitation von Zelltrimmern und chromosomaler DNA Anschlie end wird die Plasmid DNA s ulen chromatographisch gereinigt Material Transformierte Bakterienkulturen QIAprep M Spin Miniprep Kit Qiagen Methode Die Bakterienkultur wurde 10min bei 4 000Upm zentrifugiert Nach der Zentrifugation wurde das Bakterienpr zipitat Pellet in 250ul Puffer P1 resuspendiert und in ein Mikrozentrifugenr hrchen berf hrt Es wurden 250ul Puffer P2 hinzugef gt und durch Invertieren gemischt Dann wurden 350ul Puffer N3 hinzugef gt gemischt und 10min bei 14 000Upm zentrifugiert Der berstand wurde auf ein QiaPrep M Zentrifugens ulchen berf hrt und f r 1min zentrifugiert Der Durchfluss wurde verworfen danach wurde die gebundene Plasmid DNA auf der S ule mit 750ul Puffer PE gewaschen lmin bei 14000Upm zentrifugiert Der Durchfluss wurde verworfen und es wurde ein weiteres Mal um die Membran zu trocknen 1min bei 14000Upm zentrifugiert Zur Elution der Plasmid DNA wurden 50
192. suprachiasmatic circadian clock Neuron 19 1 91 102 Liu C D R Weaver et al 1997 Cellular construction of a circadian clock period determination in the suprachiasmatic nuclei Cell 91 6 855 60 Lok E E A Nera et al 1988 Dietary restriction cell proliferation and carcinogenesis a preliminary study Cancer Lett 38 3 249 55 Lowrey P L and J S Takahashi 2000 Genetics of the mammalian circadian system Photic entrainment circadian pacemaker mechanisms and posttranslational regulation Annu Rev Genet 34 533 562 Mason R 1991 The effects of continuous light exposure on Syrian hamster suprachiasmatic SCN neuronal discharge activity in vitro Neurosci Lett 123 2 160 3 Mason R S M Biello et al 1991 The effects of GABA and benzodiazepines on neurones in the suprachiasmatic nucleus SCN of Syrian hamsters Brain Res 552 1 53 7 Masuko N K Makino et al 1999 Interaction of NE dlg SAP 102 a neuronal and endocrine tissue specific membrane associated guanylate kinase protein with calmodulin and PSD 95 SAP90 A possible regulatory role in molecular clustering at synaptic sites J Biol Chem 274 9 5782 90 Mattson M P S W Barger et al 1997 Cellular signaling roles of TGF beta TNF alpha and beta APP in brain injury responses and Alzheimer s disease Brain Res Brain Res Rev 23 1 2 47 61 Maurizi C P 1985 Could supplementary dietary tryptophan and taurine preven
193. t epileptic seizures Med Hypotheses 18 4 411 5 McAuley J D J P Miller et al 2002 Age related disruptions in circadian timing evidence for split activity rhythms in the SAMP8 Neurobiol Aging 23 4 625 32 McAuley J D J P Miller et al 2004 Age related changes in the spontaneous motor rhythms of the senescence accelerated mouse SAMP8 Exp Aging Res 30 1 113 27 McCann S M J Licinio et al 1998 The nitric oxide hypothesis of aging Exp Gerontol 33 7 8 813 26 McEwen B S 1998 Stress adaptation and disease Allostasis and allostatic load Ann N Y Acad Sci 840 33 44 McGowan M K K M Andrews et al 1990 Effects of chronic intrahypothalamic infusion of insulin on food intake and diurnal meal patterning in the rat Behav Neurosci 104 2 373 85 Miller R A Y Chang et al 2002 Gene expression patterns in calorically restricted mice partial overlap with long lived mutant mice Mol Endocrinol 16 11 2657 66 Mistlberger R E 1994 Circadian food anticipatory activity formal models and physiological mechanisms Neurosci Biobehav Rev 18 2 171 95 Mitchell P J and R Tjian 1989 Transcriptional regulation in mammalian cells by sequence specific DNA binding proteins Science 245 4916 371 8 Molinari E J P C North et al 1996 2 125l iodo 5 methoxycarbonylamino N acetyltryptamine a selective radioligand for the characterization of melatonin ML2 bindin
194. te Anpassung an die neuen Beleuchtungsverh ltnisse In DD gesetzt zeigte das Tier einen Freilauf mit endogener Periode t von 23 5 Stunden Gruppendurchschnitt 23 74 0 05 Stunden W hrend der LD Phase und vor allem w hrend des Freilaufes unter DD Bedingungen scheint es zwei Aktivit tsmaxima zu geben am Anfang und am Ende der subjektiven Nacht 3 Ergebnisse 72 odium Sense un er n Abb 3 5 Repr sentatives Aktogramm einer KR Maus im Alter von 7 10 Monaten Es herrschte eine Lichtperiode von 6 00 18 00 Uhr Anschlie end DD bis zur Wiederherstellung der urspr nglichen Lichtperiode A Das untersuchte Tier zeigte die generelle Verhaltensauffalligkeit der KR Gruppe Der Aktivit tsrhythmus war sowohl unter LD als auch unter DD Bedingungen stark fragmentiert wobei die Fragmentierung unter DD zunahm Die Menge an Gesamtaktivit t nahm w hrend der DD Phase augenscheinlich zu Die endogene Periode t betrug 23 2 Stunden bei einem Gruppendurchschnitt von 23 59 0 04 Stunden Die Wiederherstellung der LD Rhythmik gelang nur sehr langsam und innerhalb des dargestellten Datenbereiches nicht vollst ndig vgl Abb 3 3 Kontrolltier im selben Versuchszeitraum 3 Ergebnisse 73 uuu w 71 m mh nu a jam ME m ret 7 PEG VER PEDIS Lj m ur M i an ll ll tili Eua mum err Lama da MEME EEE 4 ee iAd h M ricus eciam i MM dnih a imi le et A mE oT ae eee a m ae en I Abb 3 6 R
195. ten cDNA Str nge an den entsprechenden komplement ren Oligonukleotiden auf dem Microarray binden Das Design der Microarrays f r diese Studie habe ich selber vorgenommen Es wurden spezifische Sequenzen von 1000 Transkripten der Maus ausgew hlt die von der Herstellerfirma in situ in Duplikaten auf den Chips synthetisiert wurden Die verwendeten Microarrays waren also speziell f r die Fragestellung meiner Studie zusammengestellt Material Fluoreszenzmarkierte Sonde E XEOTRON EXPRESSION ARRAY XeoChip XeoEX Buffer Kit Xeotron M 2 Manual Microfluidic Station Xeotron 2 Material und Methoden 62 Xeotron cDNA Labeling Kit Xeotron 1 5 mL Reaktionsgef e Eppendorf 0 5 mL ReaktionsgefaBe Eppendorf 16 gauge needle Cleaning XeoChip Costar Centrifuge Tube Filter 0 22 uM 1096 Triton X 100 L sung Methode Die M 2 Manual Microfluidic Station wird wie folgt vorbereitet Alle verwendeten Waschpuffer m ssen frisch hergestellt werden es werden jeweils 1 5ml des entsprechenden Puffers mit 30u 10 Triton X 100 versetzt Wasch und Vorbereitungsschritte werden mit dem EinlaBschlauch im Puffer und dem AuslaBschlauch in einem Auffanggef durchgef hrt der Durchfluss wird verworfen Hybridisierung erfolgt mit Ein und Ausla schlauch im selben Reaktionsgef Standardzeit ist 18 Stunden bei 32 C Reinigen der M 2 Manual Microfluidic Station Es werden in beide Kammern der Hybridisierung
196. thmus Unter DD Bedingungen kam es zum Freilauf nach Wiederherstellung vom LD Regime zur Anpassung an dieses Ferner habe ich w hrend der DD Phase einen 30 min tigen Lichtpuls gesetzt der zu einer Phasenverz gerung f hrte X Der Lichtpuls wurde fr h in der subjektiven Nacht etwa 1h nach Einsetzen der Aktivit t des Tieres verabreicht und verursachte eine Phasenverz gerung von etwa 2 2 5 Stunden In diesem Alter hatten die Kontrolltiere eine durchschnittliche endogene Periode von 23 78 0 03 Stunden 3 Ergebnisse 77 E TESTI i E d b tae Ge 4 22 1 ut nn Abb 3 10 Repr sentatives Aktogramm einer Kontrollmaus im Alter von 25 28 Monaten Es herrschte eine Lichtperiode von 06 00 18 00 Uhr W hren der DD Phase wurde ein 30min Lichtpuls gesetzt Xx Wiederherstellung der Lichtperiode A Auffallig ist dass es nur einen sehr schwach ausgepr gten allgemeinen Rhythmus verglichen zu j ngeren Tieren gibt Dennoch l sst sich das circadiane System noch entkoppeln durch DD Phasenverz gern durch einen Lichtpuls und Resynchronisieren durch LD 3 Ergebnisse 78 purs Fer ith shea hae Haas amnium rub unir ao Peete mm tere bocas wrt ds m men ld mman nl a le ia Pause nhuretweier 4oves H ud ve W visse fea B e uulnere umts VU ailll sapaa bad aaa iate etaim time e an Qpu ua It See m i a A e m he aa Alain aad a A LM aa merita 9 Pampa dd aal Le ane mna anda Seah Feeney wer ok
197. tive Nutzung wertvoll Die Nukleins uren werden durch den interkalierenden Farbstoff Ethidiumbromid EtBr im Gel unter UV Licht sichtbar gemacht Material 10x TBE 50x TAE 6x Ladepuffer Fermentas bzw Promega Ethidiumbromid 10 mg ml in Wasser Roth Fischer DNA L ngenstandards GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus Fermentas Smartladder Eurogentec Agarose Elektrophoresis Grade Gibco BRL Fischer Elektrophoresekammer und Zubeh r Biorad MWG Biotech Methode Je nach antizipierter Fragmentgr e 150 bp 2 4kb wurden 1 2 ige Agarosegele hergestellt 2 Material und Methoden 46 Es wurden f r 1 ige Gele 1g Agarose in 100ml 1x TBE analytisch oder 1x TAE pr parativ in einem Mikrowellenherd erhitzt abgek hlt und mit Ethidiumbromid 10 ug 100 ml Gelvolumen vermischt Das Gel wurde in einen Geltr ger gegossen der Kamm eingesetzt und bei Raumtemperatur polymerisieren lassen etwa 20min Die zu untersuchenden PCR Produkte wurden mit 1 6 Volumen des Ladepuffers 6x versehen und bei 100 120V aufgetrennt Zur Ermittlung der Fragmentl ngen wurden geeignete Langenstandards parallel aufgetragen Unter UV Licht wurden die DNA Fragmente sichtbar gemacht fotografiert und digital gespeichert 2 12 Reinigung von DNA Fragmenten aus einer PCR Reaktion Theorie Um PCR Produkte f r weitere Anwendungen wie Klonierung oder Sequenzierung verwenden zu k nnen m ssen diese aufgereinigt werden Hierbei werden
198. tonin und KR Effekten Weitere Literaturverweise Stokkan et al 1991 Nordito et al 1989 Blask 1984 1 3 2 Altersbedingte Ver nderungen im ZNS von S ugetieren W hrend des Alterungsprozesses bei S ugetieren kommt es zu Verschlechterungen der kognitiven und motorischen F higkeiten Dies ist der gr te Risikofaktor f r diverse neurologische Erkrankungen wie zum Beispiel Alzheimer Lee amp Weindruch 2000 Studien haben erwiesen dass normales Altern des Gehirns mit subtilen morphologischen und funktionellen Ver nderungen in spezifischen neuronalen Schaltkreisen einhergeht im Gegensatz zum gro fl chigen Absterben von Neuronen Morrison et al 1997 Tats chlich gibt es auch ber diverse S ugetierspezies hinweg Gemeinsamkeiten im Alterungsprozess des ZNS wie z B Atrophie der pyramidalen Neuronen synaptische Atrophie Verringerung der Dopaminrezeptoren im Striatum Akkumulation fluoreszenter Pigmente Abnormalit ten des Zytoskelettes und reaktive Astrozyten und Mikroglia Lee et al 2000 Bisher wurden noch keine Studien ver ffentlicht in denen altersbedingte Ver nderungen des Hypothalamus bzw des hypothalamischen Transkriptoms von M usen gezeigt wurden Die meisten Informationen ber den Einfluss von KR auf die Genexpression wurden in der Leber im Muskel Weindruch et al 2001 oder im Herzen Lee et al 2002 von M usen gesammelt Hier wurde festgestellt dass ein Grossteil der altersbedingten genetischen Ver nd
199. transkriptionellen R ckkopplungsschleife einer Zelle der inneren Uhr bei S ugetieren Positiv wirkende Elemente sind mit d nnen gr nen Pfeilen dargestellt negative mit dicken roten Ver ndert aus Reppert amp Weaver 2002 Zusammenfassend l uft die transkriptionelle Kaskade wie folgt ab Die negative R ckkopplungsschleife beinhaltet die dynamische Regulierung von drei Period Per Genen in der Maus mPerl 3 genannt und zwei Cryptochrome Genen mCryl und mCry2 in der Maus Die rhythmische Transkription der mPer und mCry Gene wird von den basic helix loop helix bHLH PER ARNT SIM PAS Protein enthaltenden Transkriptionsfaktoren CLOCK und BMALI getrieben PAS ist ein Akronym f r die ersten drei Proteine die diese Protein dimerisierungs Dom ne gemeinsam haben Drosophila Per der humane aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator ARNT und das Drosophila single minded Protein PAS Dom nen enthaltende Proteine repr sentieren eine vielf ltige Familie Hogenesch et al 1997 und sind auch h ufige Merkmale von Uhr relevanten Proteinen diverser Organismen Pflanzen Pilze Insekten und S ugetiere 1 Einleitung 7 CLOCK und BMALI Heterodimere aktivieren die Transkription von mPer und mCry Genen durch die Bindung an E Box Verst rker enhancer DNA Elemente im Promotorbereich der jeweiligen Gene und agieren somit als positive Elemente Nach ihrer Translation im Zytoplasma bilden mPER und mCRY Proteine miteinander und einer Cas
200. trie praktikabel sein In dieser Arbeit habe ich sowohl verhaltensphysiologische als auch molekularbiologische Untersuchungen angestellt um den Einfluss von Melatonin und kalorischer Restriktionsern hrung auf M use zu untersuchen Ich betrachtete den Effekt der Behandlungen auf die circadiane Physiologie indem ich die lokomotorische Aktivit t aufgezeichnet habe und verschiedene chronobiologische Phasenverschiebungen DD Experimente durchf hrte Durch einen Vergleich der Reaktionen auf die gegebenen Stimuli sollte erkannt werden ob die Behandlungen sich positiv auf das murine circadiane System auswirkten Molekularbiologisch legte ich meinen Schwerpunkt auf den Hypothalamus der Maus in dem der SCN liegt Es war meine Aufgabe dass komplexe Genexpressionsprofil im Hypothalamus und den Einfluss der von mir applizierten Behandlungen auf diese Expression zu untersuchen In Bezug auf kalorische Restriktion wird meistens nur ein Tageszeitpunkt untersucht ferner hat noch niemand die Genexpression bei KR Tieren im Hypothalamus untersucht Betrachtet wurden drei Gruppen von Tieren Kontroll melatoninsubstituiert und KR zu vier verschiedenen Zeitpunkten jeweils 6 Stunden auseinander Parallel dazu wurden A Jeweils alle exprimierten Gene pro Gruppe in einem circadianen Zusammenhang betrachtet um zu erkennen welche Gene einen circadianen Rhythmus aufweisen Ziel war es zus tzliche putativ Uhr regulierte Transkripte zu identifizieren W
201. tween Mouse PERIOD and CKlepsilon Is Critical for a Functioning Circadian Clock Mol Cell Biol 24 2 584 94 Lee C K D B Allison et al 2002 Transcriptional profiles associated with aging and middle age onset caloric restriction in mouse hearts Proc Natl Acad Sci U S A 99 23 14988 93 Lee C K R Weindruch et al 2000 Gene expression profile of the ageing brain in mice Nat Genet 25 3 294 7 Leegwater P A J C Pronk et al 2003 Leukoencephalopathy with vanishing white matter from magnetic resonance imaging pattern to five genes J Child Neurol 18 9 639 45 Lerner A B J D Case et al 1959 Melatonin in peripheral nerve Nature 183 1821 Lerner A B J D Case et al 1960 Isolation of melatonin and 5 methoxyindole 3 acetic acid from bovine pineal glands J Biol Chem 235 1992 7 Lin J H and A Y Lu 2001 Interindividual variability in inhibition and induction of cytochrome P450 enzymes Annu Rev Pharmacol Toxicol 41 535 67 Lindberg R B Burkhart et al 1989 The structure and characterization of type P 450 15 alpha gene as major steroid 15 alpha hydroxylase and its comparison with type II P 450 15 alpha gene J Biol Chem 264 11 6465 71 Liu C and S M Reppert 2000 GABA synchronizes clock cells within the suprachiasmatic circadian clock Neuron 25 1 123 8 Liu C D R Weaver et al 1997 Molecular dissection of two distinct actions of melatonin on the
202. uctive and circadian responses Neuron 13 5 1177 85 Resuehr D and A N Spiess 2003 A real time polymerase chain reaction based evaluation of cDNA synthesis priming methods Anal Biochem 322 2 287 91 Ripperger J A L P Shearman et al 2000 CLOCK an essential pacemaker component controls expression of the circadian transcription factor DBP Genes Dev 14 6 679 89 Roca A L C Godson et al 1996 Structure characterization and expression of the gene encoding the mouse Melia melatonin receptor Endocrinology 137 8 3469 77 Ross A W P Barrett et al 1996 Melatonin suppresses the induction of AP 1 transcription factor components in the pars tuberalis of the pituitary Mol Cell Endocrinol 123 1 71 80 Ross A W P Barrett et al 1996 Melatonin regulated gene expression in pars tuberalis cells of the ovine pituitary investigated by differential display Biochem Soc Trans 24 2 2278 Ruby N F M L Dubocovich et al 2000 Siberian hamsters that fail to reentrain to the photocycle have suppressed melatonin levels Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 278 3 R757 62 Saiki R K C A Chang et al 1988 Diagnosis of sickle cell anemia and beta thalassemia with enzymatically amplified DNA and nonradioactive allele specific oligonucleotide probes N Engl J Med 319 9 537 41 Saiki R K D H Gelfand et al 1988 Primer directed enzymatic amplification of DNA with
203. uf ver ffentlichten Jin et al 2003 nicht nur die komplette Rezeptorsequenz sondern hatten auch transgene Tiere generiert die diesen Rezeptor nicht mehr besaBen Der MT2 Rezeptor der Maus besteht dementsprechend aus 1095bp 365As Die von mir ver ffentlichte Sequenz stimmt im berlappenden Bereich bis auf 2 Basenpaare mit der von Jin und Mitarbeitern ver ffentlichten berein Es gibt offensichtlich einige Spezies spezifische Variationen in der Sequenz des MT2 Rezeptors Bei einigen Spezies von Hamstern ist der MT2 Rezeptor nicht funktionell Weaver et al 1996 Es ist durchaus m glich dass es zwischen verschiedenen M usest mmen Unterschiede in der Sequenz aufgrund von Polymorphismen gibt Jin et al 2003 dies ist im von mir untersuchten Stamm der Fall In der von mir ver ffentlichten Sequenz sind die Transmembrandom nen TM IV VII enthalten Der Aminos ureaustausch von Threonin zu Glutamat befindet sich in der intrazellul ren Schleife abgeleitet von der humanen MT2 Struktur Reppert et al 1995 zwischen TM V und VI ICHSTTYHRVCSHWYTPIYISLVWLLTLVALVPNFFVGSLEYDPRIYSCTFIQTASTQY TAAVVAIHFLLPMAVVSFCYLRIWVLVLQARRKAKAERKLRLRPSDLRSFLTMFAVFV VFAICWAPLNCIGLAVAINPEAMALQVPEGLFVTSYFLAYFNSCLNAIVYGLLNONFRR EYKRILLAIWNTRRCIQHASKHCLTEERQGPTPPAARATVPVKEGAL Abb 4 4 1 Auszug aus der Aminos uresequenz des MT2 Rezeptors im Stamm B6C3F1 Transmembrandom nen sind unterstrichen beginnend bei TM IV Rot und Fett ist die ausgetauschte Amin
204. ul DEPC Wasser auf die Membran pipettiert und f r Imin bei 14000Upm zentrifugiert Die Konzentrationsbestimmung erfolgte photometrisch 2 17 Restriktionsverdau von DNA Theorie Restriktionsenzyme sind bakterielle Endonukleasen die spezifische Muster Sequenzen auf einem doppelstr ngigen DNA Molek l erkennen und die DNA an dieser Stelle spalten 2 Material und Methoden 52 Die meisten Restriktionsendonukleasen vom Typ II erkennen Tetra Penta oder Hexanukleotidsequenzen Durch die hydrolytische Spaltung der beiden DNA Str nge entstehen entweder glatte Enden blunt ends oder versetzte 5 bzw 3 berstehende Enden sticky ends Das 5 Ende der DNA tr gt dabei immer eine Phosphatgruppe das 3 Ende eine Hydroxylgruppe Die durch Restriktion entstandenen DNA Fragmente k nnen f r eine Ligation und zur Herstellung einer Sonde verwendet werden Material EcoRI New England Biolabs Wasserbad Heraeus Methode Es wurden entweder nsert tragende Plasmide dsDNA Fragmente oder genomische DNA wie folgt eingesetzt Verdau DNA ca 500 ng H O variabel yl 10x Puffer 1 ul EcoRI 10 U ul 1 ul 2 10 ul Die Restriktionsverdaue wurden f r 1 h bei 37 C im Wasserbad inkubiert Anschliessend wurden 5ul des Ansatzes gelelektrophoretisch analysiert 2 18 DNA Sequenzierung Theorie Das in dieser Studie verwendete Verfahren ist eine Variation des urspr nglichen Sequenzierverfahrens von Sanger 1977 Anstatt Rad
205. und dem G C Gehalt abh ngig Die Elongationszeit richtet sich nach der L nge der Amplifikate Je l nger das Amplifikat desto mehr Zeit braucht die DNA Polymerase f r die Elongation Die Taq Polymerase ist in der Lage etwa 1000 Nukleotide pro Minute einzubauen Heutzutage werden sogenannte HotStart Polymerasen immer h ufiger angeboten Diese haben den Vorteil erst nach einer initialen Hitzeaktivierung ihre enzymatische Aktivit t zu erlangen Dadurch wird w hrend des Vorbereitens der Reaktion keine unspezifische Synthese ausgef hrt was sonst zu unspezifischen Amplifikationen f hren kann Material DNA Polymerase TaKaRa Ex Taq Hot Start Version SU ul 10x Taq Puffer TaKaRa 2 5mM dNTPs TaKaRa Robocycler Stratagene 0 2ml Tube Strip Stratagene Cap Strip Stratagene Methode Alle PCR Ans tze wurden in einem Volumen von 50 ul durchgef hrt Folgender Ansatz wurde in einem 0 2 ml Reaktionsgef eines Reaktionsgef Streifens 0 2ml Tube Strip Stratagene zusammenpipettiert Anzahl der Reaktionen 1 n 10x Reaktionspuffer 5 ul xnul dNTP Mix 10 2 5uM 4 ul xnul 5 Primer 10 uM 1 ul xnul 3 Primer 10 uM 1 ul xnul TaKaRa ExTaq 5U ul 02 ul xnul cDNA Template Menge variiert X ul xnul H20 X ul xnul 2 Material und Methoden 40 x 50 ul F r multiple Ans tze werden die Reagenzien mit der Anzahl der durchzuf hrenden Reaktionen 2 wegen Negativkontrolle Pipettierfehler multipliziert Di
206. ung danach zu einer Phasenverz gerung Ver ndert von AG Wollnik Universit t Stuttgart Eine Phasen Antwort Kurve Phase Response Curve stellt die Richtung und Magnitude der Antwort der endogenen Uhr auf eine Ver nderung der Lichtverh ltnisse z B eines Lichtpulses im Dauerdunkel dar Wird der Zeitgeberreiz am Ende der Aktivit tsphase pr sentiert erfolgt eine Phasenbeschleunigung phase advance Erfolgt der Stimulus am Anfang der Aktivit tsphase gibt es eine Phasenverz gerung phase delay 1 Einleitung 3 uspunJs Bungs yosisausseyd Subjektive Nacht Subjektiver Tag Subjektive Nacht Abb 1 2 Darstellung einer Phasen Antwort Kurve PRC Phase Response Curve Je nachdem zu welcher Zeit innerhalb der PRC w hrend des Freilaufes ein Lichtreiz pr sentiert wird resultiert eine Phasenverschiebung nach vorne oder nach hinten Ver ndert nach Devlin 2001 Die Magnitude der Phasenverschiebung ist hierbei deutlich von dem Zeitpunkt der Applikation abh ngig Die st rkste Verschiebung der endogenen Phase erfolgt am Anfang und am Ende der subjektiven Nacht Mit zunehmendem Alter ver ndert sich das endogene circadiane System Die Umstellung auf eine neue Lichtphase dauert l nger der hell dunkel Aktivit tsrhythmus ist fragmentierter als in jungen Tieren und die endogene Periode ver ndert sich sie wird entweder k rzer Pittendrigh und Daan 1974 oder l nger McAuley et al 2002 Endogene Rhyt
207. uoreszenzmarkierte Sonde vor Ausbleichen zu sch tzen Auf der Hybridisierungsstation wird die Option Hybridize ausgew hlt die Hybridisierung ist nach 18 Stunden abgeschlossen Waschen des XeoChip Nach erfolgter Hybridisierung wird der XeoChip in der Hybridisierungsstation gewaschen um ungebundene Reste der Fluoreszenzsonde zu entfernen Der Einlassschlauch der Hybridisierungsstation wird herausgezogen und die Option Prime ausgew hlt Nun wird die restliche Sonde aus dem Kreislaufsystem entfernt und in dem Reaktionsgef f r eine etwaige zweite Hybridisierung aufgefangen Puffer EX3 mit Triton X 100 wird durch den XeoChip gepumpt Puffer EX2 mit Triton X 100 wird durch den XeoChip gepumpt 2 Material und Methoden 64 4 Puffer EX4 mit Triton X 100 wird durch den XeoChip gepumpt 5 Puffer EX2 ohne Triton X 100 wird durch den XeoChip gepumpt Gescannte Bilder der 4 Fluoreszenzkan le werden als TIFF und BMP Dateien gespeichert 2 21 Auswertung der XeoChip Microarrays Theorie Der XeoChip wird nun mit einem geeigneten Microarray Scanner ScanArray 5000 XL Microarray Analysis System Packard Biosciences und ScanArray External Laser System GSI Luminomics gelesen Hierbei werden die verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe nacheinander in ihrer jeweiligen Wellenl nge angeregt Die ermittelten Intensititen werden elektronisch zur weiteren Auswertung gespeichert Material ScanArray
208. uroreport 11 9 1803 7 Wakamatsu H Y Yoshinobu et al 2001 Restricted feeding induced anticipatory activity rhythm is associated with a phase shift of the expression of mPer1 and mPer2 mRNA in the cerebral cortex and hippocampus but not in the suprachiasmatic nucleus of mice Eur J Neurosci 13 6 1190 6 Watanabe K J Vanecek et al 2000 In vitro entrainment of the circadian rhythm of vasopressin releasing cells in suprachiasmatic nucleus by vasoactive intestinal polypeptide Brain Res 877 2 361 6 Weaver D R C Liu et al 1996 Nature s knockout the Mel1b receptor is not necessary for reproductive and circadian responses to melatonin in Siberian hamsters Mol Endocrinol 10 11 1478 87 Weaver D R and S M Reppert 1996 The Melia melatonin receptor gene is expressed in human suprachiasmatic nuclei Neuroreport 8 1 109 12 Weaver D R S A Rivkees et al 1989 Localization and characterization of melatonin receptors in rodent brain by in vitro autoradiography J Neurosci 9 7 2581 90 Weindruch R 1992 Effect of caloric restriction on age associated cancers Exp Gerontol 27 5 6 575 81 Weindruch R 1995 Interventions based on the possibility that oxidative stress contributes to sarcopenia J Gerontol A Biol Sci Med Sci 50 Spec No 157 61 Weindruch R 1996 The retardation of aging by caloric restriction studies in rodents and primates Toxicol Pathol 24 6 742 5 Weindruch R
209. verz gerung Ez Di t EU Melatonin EE Normal 30 25 8 20 E E lt 15 10 5 0 xU x9 x x S S S S S S S S S QU HK KK KX uw KF KF SK SK oe ues uA a XU QUU ek VP ae VIP OP iu VM AU S Q6 NV v wv y x FF SF PP PO OM FS FS SF SF SF D a V V LM LM LK Abb 3 14 Tag und Nachtaktivit t bei M usen im Alter von 11 Monaten vor und nach einer Phasenverz gerung Die von mir applizierte Phasenverz gerung siehe Abb 3 4 3 6 amp 3 8 wurde f r alle Gruppen statistisch ausgewertet um festzustellen ob eine der Behandlungen zu einer schnelleren Resynchronisation beitr gt Es wird zuerst die Durchschnittsaktivit t w hrend der Lichtphase Tag vorher gebildet Diese ist wie bereits demonstriert bei den KR Tieren h her als bei den anderen Es folgt die Durchschnittsaktivit t der drei N chte vor der Verz gerung 3 2 1 Nacht vorher Nach der Phasenverz gerung ist die Tagaktivit t bei allen Gruppen nicht signifikant bei den KR Tieren h her und nimmt an den darauffolgenden Tagen bei den MT und Kontrolltieren ab Tag1 5 danach Bei der Nachtaktivit t Nacht 1 5 danach verh lt es sich umgekehrt sie ist erst geringer als die der Durchschnittsnacht nimmt aber ebenfalls bis auf den urspr nglichen Wert zu Die KR Tiere bertreffen in Nacht 3 5 die normale Durchschnittsaktivitat 3 Ergebnisse 82 Die Dauer bis zur Wiederherstellung der durchschnittlichen Nachtaktivit t Resynchronisatio
210. wie zu erwarten und wurde in dieser Art auch von anderen Forschergruppen berichtet Pugh et al 1999 Weindruch et al 1980 amp 1986 Gemessen an der Kalorienmenge die i d R in Restriktionsexperimenten gef ttert wird war die von mir applizierte Restriktion mit 65 8 kcal Woche etwas weniger streng als von anderen Forschern 58kcal Woche Lee et al 2002 52 5 kcal Woche Dhahbi et al 2004 Verf ttert wurde eine halbaufgereinigte Di t SPD semipurified diet f r Nagetiere AIN 93M die f r kalorische Restriktion bis zu 40 geeignet ist Pugh et al 1999 und auch h ufig bei Restriktionsexperimenten zur Anwendung kommt Lee et al 2002 Dhahbi et al 2004 In Anbetracht der Tatsache dass fast alle KR Tiere einen uDerlich gesunden Eindruck und entsprechendes Verhalten zeigten kann davon ausgegangen werden dass die Di t f r den Versuch optimal zusammengesetzt war Nur eines der KR Tiere erlitt eine Art Schlaganfall nach 10 Monaten und zeigte halbseitige L hmungserscheinungen Das Aktogramm dieses Tieres zeigt den Zeitpunkt des Anfalls hinterher war das Tier arhythmisch Daten im Ergebnisteil nicht gezeigt Dies war ein Einzelfall alle anderen Tiere der KR und anderer Gruppen waren im Versuchsverlauf gesund Das betreffende Tier wurde da es stark in seiner Bewegung eingeschr nkt war get tet ZT6 und die Organe wie im Methodenteil beschrieben pr pariert Es gab keine auff lligen organischen Ver nderungen Die Tatsache d
211. wney et al 1995 Aging lengthens circadian period for wheel running activity in C57BL mice Physiol Behav 57 3 575 9 Preitner N F Damiola et al 2002 The orphan nuclear receptor REV ERBalpha controls circadian transcription within the positive limb of the mammalian circadian oscillator Cell 110 2 251 60 Pugh T D R G Klopp et al 1999 Controlling caloric consumption protocols for rodents and rhesus monkeys Neurobiol Aging 20 2 157 65 Pugh T D T D Oberley et al 1999 Dietary intervention at middle age caloric restriction but not dehydroepiandrosterone sulfate increases lifespan and lifetime cancer incidence in mice Cancer Res 59 7 1642 8 Putilov A A G S Russkikh et al 1999 Phase of melatonin rhythm in winter depression Adv Exp Med Biol 460 441 58 Ralph M R and M Menaker 1988 A mutation of the circadian system in golden hamsters Science 241 4870 1225 7 Ramsey J J R J Colman et al 2000 Dietary restriction and aging in rhesus monkeys the University of Wisconsin study Exp Gerontol 35 9 10 1131 49 Ramsey J J J L Laatsch et al 2000 Age and gender differences in body composition energy expenditure and glucoregulation of adult rhesus monkeys J Med Primatol 29 1 11 9 Redlin U 2001 Neural basis and biological function of masking by light in mammals suppression of melatonin and locomotor activity Chronobiol Int 18 5 737 58 Redman
212. xpression in den Hypothalami von 30 Monate alten Kontrollm usen ZT6 untersucht ZT 0 ZT 0 ZT 6 ZT 6 30 Mon Alt ZT 12 ZT 12 ZT 18 ZT 18 KR N MT N KR N MT N Alt N KR N MT N KR N MT N Gensymbol MW MW MW MW MW MW MW MW MW Adir 0 72 0 98 122 1 50 1 60 1 01 1 38 1 05 0 93 Ak4 1 57 0 99 1 95 1 12 1 66 2 06 1 38 1 14 1 04 Atp5k 0 62 LI 0 59 0 86 0 97 0 37 0 74 0 86 0 67 Avp 1 00 0 70 1 08 0 62 0 91 0 65 0 46 0 65 0 76 Clsb 4 44 1 95 3 36 1 92 1 90 4 14 6 08 1 03 0 93 C4 1 23 0 46 1 18 0 40 0 36 2 02 0 62 0 61 0 92 Calm1 0 69 1 53 0 81 1 28 1 64 1 21 2 34 1 75 1 29 Calm2 0 60 1 10 0 70 0 91 1 10 0 92 1 39 2 07 1 83 Centl LI 0 80 0 99 0 85 0 54 1 68 0 97 0 84 0 97 Cry2 1 10 0 36 1 26 0 39 0 52 0 94 0 36 1 02 1 14 Csng 1 75 1 30 1 72 1 23 1 13 1 14 0 89 0 93 1 23 Csnkle 1 25 0 52 1 74 0 44 0 39 0 99 0 47 0 76 0 97 Dbp 1 25 1 02 1 25 1 13 1 35 0 56 0 84 0 87 0 97 Dnajal 0 77 1 13 0 57 0 84 1 07 0 86 1 22 1 42 1 29 Eif2b 1 12 0 61 1 28 0 64 0 58 0 69 0 45 0 71 0 90 Eif4ebp2 1 31 1 73 1 20 LIT 2 14 0 85 LSS 0 94 0 47 Figf LET 1 14 1 04 1 10 1 30 1 16 1 01 1 11 0 98 GjalO 0 74 1 40 0 89 2 13 1 84 0 66 1 56 1 08 1 14 Gja3 1 49 0 91 1 03 0 61 1 17 1 04 0 57 1 13 0 95 Grid2 1 63 2 99 1 76 1 99 2 92 1 19 1 51 1 29 0 92 Grpr 1 02 1 09 0 75 0 88 0 63 0 70 0 82 0 88 0 95 3 Ergebnisse 105
213. xprimierte Transkripte 3 Ergebnisse 103 Gensymbol Accession Name Adir NM 023141 ATP dependant interferon responsive Adir mRNA Ak4 NM_009647 adenylate kinase 4 Ak4 mRNA Atp5k NM_007507 ATP synthase H transporting mitochondrial FIFO Avp NM 009732 arginine vasopressin Avp mRNA Clsb NM_173864 complement component C1SB Clsb mRNA C4 NM_009780 complement component 4 within H 2S C4 mRNA Calml NM 009790 calmodulin 1 Calm1 mRNA Calm2 NM 007589 calmodulin 2 Calm2 mRNA Centl NM 009833 cyclin T1 Centl mRNA Cry2 NM 009963 cryptochrome 2 photolyase like Cry2 mRNA Csnkle NM 013767 casein kinase 1 epsilon Csnkle mRNA Dbp NM_016974 D site albumin promoter binding protein Dbp mRNA Dnajal NM_008298 DnaJ Hsp40 homolog subfamily A member 1 Dnajal Eif2b NM_010122 eukaryotic translation initiation factor 2B Eif2b Eif4ebp2 NM_010124 eukaryotic translation initiation factor 4E binding Figf NM_010216 c fos induced growth factor Figf mRNA Gjal0 NM 010289 gap junction membrane channel protein alpha 10 Gja3 NM 016975 gap junction membrane channel protein alpha 3 Gja3 Grid2 NM 008167 glutamate receptor ionotropic delta 2 Grid2 mRNA Grpr NM_008177 gastrin releasing peptide receptor Grpr mRNA hippocamp cDNA AK049931 adult male hippocampus cDNA
214. ythmisch zu sein scheinen Es gibt sieben bereinstimmungen zwischen der MT und eine zwischen der KR und Kontrolltiergruppe Zu den bei allen Gruppen bereinstimmenden Transkripten z hlt ein Transkriptionsfaktor Bindungsprotein Eif4ebp2 und ein Insulinrezeptor der in allen Gruppen um ZT 6 in der Hellphase sein Maximum erreicht 3 Ergebnisse 110 3 4 3 Postvalidierung von Microarray Ergebnissen mittels quantitativer Realtime PCR Einige der a als circadian regulierten und b durch KR und oder MT beeinflussten Transkripte wurden zu Postevaluierungszwecken mittels quantitativer Realtime PCR untersucht Ferner wurden eine Reihe an bekannten Transkripten untersucht die an der Steuerung der circadianen Uhr beteiligt sind Diese waren auf Microarray Ebene entweder nicht eindeutig als circadian erkennbar oder nicht als Klone auf dem Array vorhanden Hierbei ist von Vorteil dass pro untersuchtem Zeitpunkt und Gruppe ein N von 5 vorliegt sodass auch eine statistische Signifikanz erwogen werden kann Da bei den Microarray Untersuchungen gepoolte RNA verwendet wurde waren keine Tier zu Tier Standardabweichungen ermittelbar welches die Genauigkeit der Ergebnisse beeinflussen kann Alle Realtime PCRs wurden gegen das Haushaltsgen RP27 normalisiert Standardabweichungen sind ebenfalls eingezeichnet Negative Elemente der circadianen Uhr mPeri Expression im Hypothalamus der Maus 6 00E 03 5 00E 03 4 00E 03
215. ziehen ein Tonus also Es hat Melanin aggregierende Wirkung Daher der Name MelaTonin Substanz die in Melanozyten einen Tonus ausl st Melatonin besitzt eine wichtige Rolle in der Steuerung einer Vielzahl biologischer Prozesse Es steuert saisonale Fortpflanzung beeinflusst die Phase circadianer Rhythmen bei S ugetieren und moduliert retinale Funktionen Tiere die an die jahreszeitliche Variation der Umweltbedingungen angepasst sind tun dies durch Ver nderungen der t glichen Melatoninproduktion In diesen Tieren dient Melatonin als zeitliches antizipatorisches Signal der h rteren Umweltbedingungen des herannahenden Winters Barrett et al 2003 Die h heren und l ngeranhaltenden Melatoninkonzentrationen f hren zu adaptiven Ver nderungen Es werden reproduktive Kompetenz Fell oder Federwachstum und Metabolismus ver ndert um einen maximalen Vorteil f r das Individuum und sein berleben zu gew hrleisten Doolen et al 1998 Melatonin dient nicht nur als Signal von Nacht und Tag sondern kodiert auch f r die Tagesl nge somit f r die Jahreszeit Es gibt auch Hinweise auf einen Effekt von Melatonin auf vascul re renale und gonadale Funktion Interessanterweise hat Melatonin in verschiedenen Spezies ganz unterschiedliche Effekte In Hamstern wirkt es antigonadotrop wobei es in Schafen progonadotrop wirkt Au erdem wird Melatonin in allen S ugetieren nachts ausgesch ttet Es verringert die K rpertemperatur bei tagaktiven Tierarte

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

TWISTED PAIR TRANSMISION SYSTEM  canoë-kayak information  800262    Sony VGC-LS20E Startup Guide  ASTAT XT - Manual de Usuario  Bâtie pour gagner  SCD - Monosem  取扱説明書 - 三菱電機  PC-Logger 2100  

Copyright © All rights reserved. Failed to retrieve file