Bedienungsanleitung für die SHIMADZU
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1. abgeschlossen ist 23 24 Pumpe auf off Programm mit niedrigerer Flussrate w hlen Purge Ventil am Ger t wieder schlie en Wenn Sie vergessen das Purge Ventil an der Pumpe nach dem Purgen zu schlie en geht der gesamte Laufmittelstrom direkt in den Abfall und nicht ber die S ule Erkennt man daran dass sich kein Druck aufbaut Falls Sie Ihr Laufmittel ber Nacht im Ger t belassen durften sollte trotzdem am n chsten Tag der Purge Vorgang durchgef hrt werden um das alte Laufmittel aus dem Ger t zu entfernen es k nnten sich Luftblasen gebildet haben S ULE SP LEN Zum Sp len der S ule muss nach dem Purgen extra ein kurzes Programm mit niedrigerer Flussrate ca 0 8 ml min durchgef hrt werden F r das Verh ltnis zwischen Laufmittel A und B verwenden Sie die Startbedingungen Ihres sp teren Laufs z B Anthranilzucker startet mit 95 A und 5 B und sp len Sie ca 10 Minuten berlegen Sie woran Sie erkennen k nnen ob das 30 ige Methanol schon vollst ndig aus der S ule entfernt ist LAUF STARTEN Der erste Lauf des Tages muss immer ein Leerlauf sein das hei t es wird Wasser anstatt der Probe injiziert gt Run control gt Sample Info Ordner angeben wohin der Lauf gespeichert werden soll Name angeben muss immer mit D enden gt Run method es erscheint Waiting for Trigger gt Probeschleife mindestens 3x mit Wasser sp len gt Probe injizieren Spritze stecken2. oben gr n und schaltet auf ready siehe unten Erst dann kann es mit den L ufen los gehen 22 23 EEE O een an eres EMG DEFAULT D en ai Zn FE ri FI E data k 1 1 60 hee ys i 5 zu Figure 11 Turning on the HPLC Module Agilent Technologies Serie 1200 Benutzerhandbuch 34H ARB 2ER Pumpe anklicken gt gt Set up pump gt Flow rate eingeben gt Startbedingungen Laufmittel eingeben gt Gradient eingeben gt Stop time eingeben gt gt Control gt Pumpe auf on gt Periodic seal wash auf 2 min every 30 min stellen Detektor anklicken gt gt Set up VWD variable wavelength detector FLD Fluoreszenzdetektor gt Wellenl nge n eingeben gt gt Control gt Detektor auf on PURGEN Wenn Sie das Ger t bernehmen ist es in verd nnter alkoholischer L sung 30 Methanol in Wasser gelagert Sobald Sie Ihre ben tigten Laufmittel angeschlossen haben wird das Aufbewahrungsreagens durch ein kurzes Programm mit einer hohen Flussrate meist 5 ml min aus den Schl uchen und der Pumpe gesp lt NICHT aus der S ule Zu diesem Zweck ffnet man an der Pumpe das Purge Ventil ca 180 Drehung und startet das Purge Pumpenprogramm Sp len der S ule siehe n chster Absatz Pumpe anklicken Pumpe soll auf off sein Purgeventil am Ger t ffnen Programmauswahl PURGE M Programm kontrollieren Pumpe auf on schalten Sobald der Vorgang
3. Teil 2 Bedienungsanleitung f r die Agilent HPLC Anlagen 15 Bedienungsanleitung f r die Agilent HPLC Diese kurze bersicht soll helfen die HPLC Anlage fehlerfrei zu bedienen Zuerst wird die Bedienung der einzelnen Arbeitsschritte und Ger te erkl rt am Ende gibt es dann Kurzzusammenfassungen f r aufdrehen Lauf starten und abdrehen Es werden hier nicht alle M glichkeiten der Ger te beschrieben sondern nur die die f r den blichen Praktikumsbetrieb relevant sind Bitte keine Experimente mit unbekannten Tasten Manche Bedienungsfehler sind nur durch ein Ger teservice wieder zu beheben und das ist sehr teuer Laufmittelbereitung Alle Laufmittel m ssen partikelfrei filtriert und entgast sein Vorgangsweise 1 Berechnung It Angabe 2a Im K hlraum schauen ob es dieses Laufmittel vielleicht schon gibt Bitte unbedingt vor der Verwendung warten bis das Laufmittel Zimmertemperatur hat Wenn nicht oder nicht genug Laufmittel da ist weiter bei 2b 2b Herstellung des w ssrigen Laufmittels Einwaage des Salzes bei Acetat Puffern der Essigs ure in Becherglas Bei fl ssigen Reagenzien Wasser vorlegen DANN S uren zugeben in RO Wasser l sen nur ca 3 4 der endg ltigen Wassermenge zugeben Magnetkern zugeben pH Wert einstellen r hren L sung in eine Mensur berf hren und bis zum gew nschten Volumen auff llen Filtrationsapparatur zusammenbauen Filter einlegen Filter wei Zwisc
4. eagens 30 Methanol in Wasser mit Startbedingungen bei einer Flussrate von 0 8 ml min heraussp len ca 10 min Leerlauf starten am Computer Name w hlen Start Wasser injizieren Trigger umlegen Nach ca 1 Minute Injektorhebel wieder in Ausgangsstellung bringen Gleich danach Injektionsnadel aus dem Injektor entfernen und gut sp len Start einzelner L ufe Schritte 9 11 wiederholen anstatt Wasser die zentrifugierte Probe injizieren Arbeitsschritte am Ende der Arbeit ABDREHEN 12 13 14 15 16 17 18 19 29 26 Probenschleife 2 3 mal mit dest Wasser sp len Schutzspitze hineinstecken Pumpe auf off stellen Beide Laufmittelschl uche in Aufbewahrungslaufmittel f r die meisten S ulen 30 Methanol in Wasser stecken Purge Ventil ffnen 180 nach links Purgen starten Purge Ventil schlie en S ule sp len Das Laufmittel muss durch 30 Methanol in Wasser ersetzt werden Flussrate 0 8 ml min ca 20 Minuten Den Inhalt der Abfallflaschen in den entsprechenden Entsorgungskanister leeren Standards und jene Proben die Sie noch brauchen im Tiefkuhlfach HPLC lagern Tisch zusammenr umen Sch nen Abend 26
5. henblatt blau filtrieren durch Anlegen eines Unterdrucks Vakuumschlauch der Pumpe kann einfach in den Auslass der Saugflasche gesteckt werden Kein Schliffzwischenst ck n tig 15 16 Trichter Glasunterteil Stopfen Federklammer hier Filter einlegen tl fl 1 2 3 4 Saugflasche Befeuchten des Filters und Ausspulen der Saugflasche ca 20 50 ml in den Trichter f llen Pumpe anschlie en und filtrieren Vakuumschlauch entfernen vorsichtig Saugflasche schwenken ausleeren Portionsweise das gesamte Laufmittel filtrieren In saubere trockene Vorratsflasche berf hren Beschriften Art des Puffers Konzentration Name des Herstellers Datum Flasche auf die HPLC stellen Laufmittelschlauch A bzw A1 rein 3 Herstellung eines Laufmittels mit organischem Anteil nur L sungsmittel verwenden die speziell f r das HPLC Beispiel bereitgestellt werden da nur sie den hohen Anforderungen entsprechen W ssriger Teil muss wie oben vorbereitet werden filtrieren dann Gew nschte Menge in der Mensur abmessen und in Vorratsflasche geben Organischen Anteil Methanol bzw Acetonitril in Mensur abmessen und ebenfalls in die Vorratsflasche f llen ACHTUNG Nach dem Vereinigen darf nicht mehr filtriert werden da die Filter nicht losungsmittelresistent sind Die organischen L sungsmittel sind schon vom Hersteller vorfiltriert Flasche auf die HPLC stellen Laufmittelschla
6. ine Stunde um auf 60 70 C aufzuheizen Die Einstellung und Steuerung erfolgt wie bei allen anderen Ger ten ber die Software am Computer Software Einstellungen und Starten Diese Kurzanleitung wir der Software nicht gerecht Nat rlich gibt es viele viele weitere Einstellungen und M glichkeiten Hier werden nur die einfachsten Schritte zum Starten und Bedienen beschrieben Wenn Sie Daten generieren wollen ZUERST Steckdosenleiste der Anlage einschalten kurz warten bis alle Lampen an den Ger ten jeweils links unten auf gr n sind DANN erst den Computer einschalten Die T r von den Fraktionssammlern muss korrekt geschlossen sein sonst geht es nicht weiter HPLC L ufe durchf hren 21 22 Mit Doppelklick den on line Modus w hlen Sie erhalten folgendes Bild System status Der LE A DEF LES DEFAULT D 55483853388 E11 GO hee ea gt R A 1 On line plot window details window Figure 10 Initial ChemStation screen Method and Run Control Agilent Technologies Serie 1200 Benutzerhandbuch Einige der Komponenten sind grau hinterlegt das hei t nicht im on Modus und links oben ist der Balken rot und es steht not ready Ihre Aufgabe ist es nun die Parameter der Komponenten einzugeben und danach das jeweilige Gerat einzeln einzuschalten Sobald das Ger t arbeitsbereit ist ist der jeweilige Abschnitt gr n Sobald alle Komponenten gr n sind wird auch der Balken links
7. lassen gt Injektorventil umlegen das ist der Trigger nun startet der Lauf gt Nach ca 1 Minute Injektor wieder in Load Position und Spritze aus dem Injektor entfernen und reinigen ANSICHT gt View gt Online signals gt Signals window 1 Auswertung von HPLC L ufen Zur Datenauswertung kann der Computer auch unabh ngig vom Einschalten der Anlage im off line Modus betrieben werden gt Data Analysis links unten Links erscheinen die Ordner dann Single runs jeweiligen Lauf anklicken Nun k nnen Sie die Integrationsparameter so ver ndern dass alle wichtigen Peaks beschriftet werden alle anderen aber nicht Ausdruck Bitte NUR das Chromatogramm Ihrer Probe ausdrucken Die Standardl ufe und Quantifizierungen sollen nicht ausgedruckt werden Diese Daten sollen im Protokoll in einer Tabelle aufgelistet sein 24 gt File Printer setup specific printer PDF complete Print preview report print 23 23 26 Arbeitsschritte zu Beginn der Arbeit AUFDREHEN Guten Morgen 1 2 3 2 oo 9 10 11 Herstellung der Laufmittel einwiegen filtrieren Schlauch A 1 in Laufmittel A Schlauch B 1 in Laufmittel B Steckdosenleiste hinter der HPLC aufdrehen warten bis bei allen Ger ten die gr nen Lampen leuchten Computer einschalten auf on line Modus gehen Purge Ventil ffnen 180 nach links Purgen starten Purge Ventil schlie en S ule sp len Aufbewahrungsr
8. nz besonders zum Veralgen neigt und deshalb die korrekte Lagerung der Anlage in verd nnter alkoholischer L sung extrem wichtig ist Manueller Injektor Die Aufgabe der Probe erfolgt NACH der Pumpe also hochdruckseitig In der Load Position liegt die Probenschleife nicht im L6sungsmittelstrom Abb A Sie ist somit drucklos und man kann sie mittels einer Spritze mit Probe bef llen Das andere Ende der Schleife geht jetzt in den Abfluss In der Inject Position ist die Schleife in die Leitung zwischen Pumpe und S ule integriert Abb B Die Probe wird somit als schmale Zone auf den S ulenkopf gepumpt Beim Umlegen des Hebels wird der Weg zwischen Pumpe und S ule unterbrochen sodass sich sehr rasch Druck aufbaut Das Umschalten muss daher z gig vor sich gehen Sample loop Abb A Load Position Abb B Inject Position Agilent Technologies Serie 1200 Benutzerhandbuch Nach dem Starten des Laufs nach ca 1 Minute den Hebel wieder zur ck in die Load Position stellen da der Computer sonst kontinuierlich ein Startsignal bekommt Detektoren A Fluorimeter Die Fluorimeter werden automatisch mit der Steckerleiste eingeschaltet HPLC 1 und HPLC 3 Wir verwenden eine Xenon Flash Lampe diese ben tigt keine Vorw rmzeit Bitte rekapitulieren Sie das Prinzip der Fluoreszenz Das Einstellen der Wellenl ngen Ex Em und die Kontrolle des Fluorimeters erfolgt ber die Software am Computer B Photometer Die Pho
9. ss beim Aufziehen in die Spritze kein Pellet mitgeht 17 18 TECHNIK Solvent cabinet Vacuum degasser Control module Autosampler Column compartment Detector Agilent Technologies Serie 1200 Benutzerhandbuch Eine Anlage besteht aus Laufmittel Pumpe Ventil das die Laufmittelkonzentrationen steuert Mischzone Injektor Automatischer Probengeber S ule ev S ulenofen Detektor Photometer Refraktometer Fluorimeter Fraktionskollektor Computer SIE m ssen sich um die Herstellung des Laufmittels die richtigen Einstellungen der Pumpe des jeweiligen Detektors und des Computers k mmern WIR schrauben an der Anlage herum Sowohl bei der Elektronik als auch S ulenwechsel wenn n tig 18 19 Pumpe So sieht sie aus A Z Pumpenkopf A umpenkopf B gt Lecksensor Agilent Technologies Serie 1200 Benutzerhandbuch Eingeschalten Die Pumpe wird automatisch mit der Steckerleiste eingeschaltet Purge Ventil offen 180 nach links drehen Laufmittel geht direkt nach der Pumpe in den Abfall geschlossen Laufmittel geht ber die S ule Das Einstellen der Parameter und die Kontrolle der Pumpe erfolgt ber die Software am Computer 19 20 Entgaser Bei dem Entgaser handelt es sich um einen Vakuumentgaser der Ihnen das Begasen der Laufmittel mit Helium erspart Sie m ssen an dem Ger t nichts einstellen nur immer bedenken dass dieses aufgrund der engen Kapillaren ga
10. tometer werden automatisch mit der Steckerleiste eingeschaltet Jedes der vorhandenen Photometer hat unterschiedliche F higkeiten HPLC 1 Multi Wavelength Detector HPLC 2 Single Wavelength Detector HPLC 3 Diodenarray Detector die Sie aber im Rahmen der bungen nicht voll aussch pfen werden Bitte rekapitulieren Sie was Sie ber die verschiedenen Wellenl ngenbereiche wissen In welchem Bereich ist UV Wo ist sichtbares Licht Was ist dar ber was darunter 20 21 Die Lampe braucht eine Aufw rmzeit von ca 10 Minuten bis sie stabil ist Das Einstellen der Wellenl nge n und die Kontrolle des Photometers erfolgt ber die Software am Computer C Refraktometer Das Refraktometer HPLC 2 wird automatisch mit der Steckerleiste eingeschaltet Im Ger t gibt es eine Messzelle durch die kontinuierlich Laufmittel beziehungsweise Probe flie t und eine Referenzzelle die zu Beginn der Arbeiten mit der Referenzl sung normalerweise das Laufmittel OHNE Probe bef llt ist Bitte achten Sie darauf dass die Referenzzelle immer das richtige Laufmittel enth lt Bei der Verwendung des Refraktometers sind Gradienten nur sehr eingeschr nkt m glich Das Waste Gef darf nach dem Refraktometer nicht zu tief am Boden stehen sondern muss auf gleiche H he Tisch gebracht werden sonst kommt es zu unerw nschten Sog Effekten Das Refraktometer hat einen integrierten Ofen um die Temperatur konstant zu halten Es dauert ca e
11. uch B bzw B1 rein 4 Ein kurzes Beispiel Laufmittel A 0 1 M NaAc pH 4 0 500 ml Laufmittel B 30 MeOH in Wasser 300 ml 1 3g Essigs ure einwiegen MW 60 in ca 300 ml Wasser geben mit verd nnter NaOH auf pH 4 0 einstellen in Mensur berf hren auff llen auf 500 ml filtrieren aufstellen 2 250 ml RO Wasser Messraum filtrieren davon 200 ml 500 ml Mensur in Vorratsflasche f llen 100 ml 100ml Mensur Methanol zugeben aufstellen 16 17 Probenvorbereitung Die Probe muss partikelfrei sein Probenvorbereitung laut Vorschrift zum Beispiel Vor dem unmittelbaren Auftragen auf die HPLC MUSS zentrifugiert werden In Eppendorfh tchen 3 Minuten mit 8000 rpm zentrifugieren L ngeres Zentrifugieren kann empfindliche Bestandteile z B Vitamine beeintr chtigen da die Zentrifuge nicht k hlt Nicht vergessen genau gegen ber muss auch ein H tchen in den Rotor Genaues Austarieren der Volumina ist nicht erforderlich Zentrifuge Gegen ber der HPLC Power Schalter auf der R ckseite des Ger ts geschwindigkeit Zeit gt gt einstellen einstellen AV AY gt E gt Kurzlauftaste A solange der Knopf gedr ckt ist l uft der Rotor Deckel auf a Start Geschwindigkeit und Zeit vorher einstellen a Not Aus wenn m glich vermeiden Den berstand gleich auf die HPLC auftragen Aufpassen da
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