MutaCHIP FOOD - bei Immundiagnostik
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1. For in vitro diagnostics only SN KF391007 N 10 C SN KF390007 wa Immundiagnostik AG Stubenwald Allee 8a 64625 Bensheim Germany www immundiagnostik com Tel 49 0 6251 701900 info immundiagnostik com Fax 49 0 6251 849430 ss Content b Application Introduction Concept of the Assay Components Materials Storage and Shelf life Working Conditions Considerations and Precautions Sample Collection y O O O a a CI A Q CO Test Procedure PCR Product Generatlon e etre esci onu tede eee ete oa eaaa aaa Haiei 7 PCR doloe IRAPERERFSBEFFFERPPPFELREERFTFECBELETEEEPETTERSPEETTETBERFLEFEREFFTECFELFERERTREFFELEFERETETLTCEEFERTRERTFETTFEER 8 Muta CHIP Protocol BERRRESHEREFERERRESFFEHREFFERTERHERPEEBEFERFECREEESEEHFEEEEUEEECEREETEFEESFREEUFEEDEPEEFPEFRELEFEEEEFFR 9 A on O O O N O A A C N Evaluation and Interpretation of Results 10 N Trouble shooting 14 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 Application 3 1 Application The MutaCHIP FOOD Kit is a biomolecular test for the detection of mutations leading to food intolerances For this purpose the genomic DNA is analysed using a MutaCHIP and the MAAT System Macro Array Analyzing Tool The following Markers are covered by the test ADH2 2 Alcohol intolerance ALDH2 2 ALDB 149 Fructose intolerance ALDB 174 ALDB 334 SI 117 Ls SI 340 Sucrase isomaltase deficiency SI 620 SI 1098 Glucose 6 Phosphate Dehyd2. ffentlich Ordner A Dateiname Neues Experiment Dateityp Extended Markup Language Daten xml Ordner ausblenden Schritt 2 Analyseprozess starten eZ Elm S Klicken Sie auf die Schaltfl che Start um die Datenanalyse zu starten 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Auswertung Schritt 3 Qualit tspr fung des MutaCHIPs berpr fen Sie die Bildqualit t E E se 9 Bitte berpr fen Sie die Qualit t des Bildes Falls Staubpartikel auf dem Bild zu erkennen sind entfernen sie diese bitte da sonst m glicherweise die Auswertung beeintr chtigt werden k nnte Um Staubpartikel zu entfernen s ubern Sie bitte die Unterseite des Chips mit einem weichen und feuchten Tuch Dr cken Sie anschlie end auf Bild erneut aufnehmen um den Aufnahmevorgang zu wiederholen Klicken Sie auf Analyse fortsetzen wenn Sie ein qualitativ einwandfreies Bild sehen Neues Bid Um ein einwandfreies Analyseergebnis zu erhalten muss zun chst die Bildqualit t des MutaCHIPs berpr ft werden Staubpartikel auf der Unterseite des MutaCHIPs k nnen die Analyse beintr chtigen Diese k nnen durch das s ubern mit einem weichen und feuchten Tuch entfernt werden Klicken Sie auf die Schaltfl che Analyse fortsetzen falls die Bildqualit t der in der oberen Abbildung entspricht 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 E Schritt 4 Genotypisierung
3. Referenzen e SIMOPOULOS Artemis P Nutrigenetics Nutrigenomics In Annu Rev Public Health 31 2010 Apr S 53 68 e MONTALTO Massimo SANTORO Luca D ONOFRI Ferruccio et al Adverse reactions to food allergies and intolerances In Dig Dis 26 2008 Nr 2 S 96 103 e EDENBERG Howard J The Genetics of Alcohol Metabolism Role of Alcohol Dehydrogenase and Aldehyde Dehydrogenase Variants In Alcohol Research amp Health 30 2007 Nr 1 S 5 13 e WONG D Hereditary fructose intolerance In Molecular Genetics and Metabolism 85 2005 Nr 3 S 165 167 e SWAGERTY Daniel L WALLING Anne D KLEIN Robert M Lactose Intolerance In American Familiy Physician 65 2002 Nr 9 S 1845 1850 e RITZ Valentina ALFALAH Marwan ZIMMER Klaus Peter et al Congenital sucrase isomaltase deficiency because of an accumulation of the mutant enzyme in the endoplasmic reticulum In Gastroenterology 125 2003 Dec Nr 6 S 1678 1685 e BEUTLER Ernest G6PD deficiency In Blood 84 1994 Dec Nr 11 S 3613 3636 3 Testprinzip Zur Analyse der Mutationen werden die variablen Bereiche der jeweiligen Gene mittels PCR amplifiziert wobei frisch extrahierte genomische DNA des Patienten als Matrize dient Das Amplifikationsprodukt wird anschlie end auf den MutaCHIP gegeben und nach mitgeliefertem Protokoll bearbeitet Die Analyse mittels Pr zipitationsreaktion l sst eine eindeutige Genotypisierung aller auf den MutaCHIP g
4. Sare ni type Extended Motup Language Daten zen 2 E c Step 2 Start the analysis proces Click on the Start button to initiate data analysis 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Evaluation and Interpretation of Results Step 3 Quality check of the chi ee 9 oe 9 e ee ESEG EE e 9 Ld e Please check the quality of the chipimage If there are dust or dirt particles lon the chip surface clean the the bottom of the reaction tube carefully with a cloth and destilled water and click on the Take a new picture button To ensure a correct analysis result the picture quality of the MutaCHIP has to be checked Particles of dust on the bottom side of the MutaCHIP can affect the analysis These can be removed by cleaning with a soft and wet tissue Follow the instructions given in the screen shown here Press Continue analysis if the quality of the picture is comparable to the figure above 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 uu Step 4 Genotyping results M BE E HE CR prr Experiment Extras Hilfe Procite Acsywemod4 Repotmod PhamGereme er Sa gt 7 H e en _PharmGenomics Patiert Tami individualised therapies Patient Kam Patert Gomi Patent Smi S CYP2D6 Genotypisierungstest Homozygot Homozygot n Wildlyp ewe Mutation 3
5. B Primer Mix B yellow lid PCR H O 2 5 uL PCR Buffer incl Polymerase 12 5 uL MasterMix C PCR H O 2 5 uL PCR Buffer incl Polymerase 12 5 uL MasterMix D is PCR Buffer incl Polymerase 12 5 uL The samples are placed in the Thermocycler and the program described in 10 2 is to be applied 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 10 2 PCR Protocol The PCR protocol has to be established anew for each laboratory as different thermocyclers have different heating rates This establishment can be omitted when using the recommended thermocycler Peglab Primus 25 advanced The following standard protocol can be used to start the establishing process After the PCR 4 uL PCR products from all four tubes 1 4 will be transferred into a new PCR reaction tube 5 U J Start Denaturation 5 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Test Procedure 9 10 3 MutaCHIP Protocol A Preparation of the Hybridisation Buffer If the Hybridisation Buffer is turbid or a precipitate can be seen it has to be heated in a microwave for several seconds 240 W or in a water bath Gently shake the Hybridisation Buffer until it gets clear to homogenise it again Before usage it has to be cooled to room temperature RT B Preparation of DNA samples e Heat up the thermoshaker to 55 C In a 200ul reaction tube add 4 ul of each PCR product A B C and D Denature the
6. DNA at 95 C for 2 min Add 84 ul of Hybridisation Buffer to the sample Load the sample on the MutaCHIP without touching the bottom of the chip C Hybridisation e Perform the hybridisation at 55 C 550 rpm for 30 min D Washing steps after Hybridisation Set the thermoshaker to 50 C Note During the cooling period the MutaCHIP has to be removed from the thermoshaker The Hybridisation Buffer has to remain on the MutaCHIP until the target temperature is reached Caution Pay attention to the correct adjustment of volume e Completely remove the Hybridisation Buffer from step C e Add carefully 500 uL of Washing Buffer onto the MutaCHIP e Wash the MutaCHIP at 550 rpm and 50 C for 5 min E Enzyme conjugation Set the thermoshaker to 21 C Note During the cooling period the MutaCHIP has to be removed from the termoshaker The Washing Buffer has to remain on the MutaCHIP until the target temperature is reached Caution Pay attention to the correct adjustment of volume e Completely remove the Washing Buffer from step D e Add 100 uL of Enzyme Mix to the MutaCHIP e Incubate the MutaCHIP at 550 rpm and 21 C for 15 min F Washing step after Enyzme conjugation Caution Pay attention to the correct adjustment of volume e Completely remove the Enzyme Mix from step E e Add of 500 uL Washing Buffer to the MutaCHIP e Wash the MutaCHIP at 550 rpm and 21 C for 5 min G Precipitation Caution Pay attention to the correct adjustment of volu
7. amp Health 30 2007 Nr 1 S 5 13 e WONG D Hereditary fructose intolerance In Molecular Genetics and Metabolism 85 2005 Nr 3 S 165 167 e SWAGERTY Daniel L WALLING Anne D KLEIN Robert M Lactose Intolerance In American Familiy Physician 65 2002 Nr 9 S 1845 1850 e RITZ Valentina ALFALAH Marwan ZIMMER Klaus Peter et al Congenital sucrase isomaltase deficiency because of an accumulation of the mutant enzyme in the endoplasmic reticulum In Gastroenterology 125 2003 Dec Nr 6 S 1678 1685 e BEUTLER Ernest G6PD deficiency In Blood 84 1994 Dec Nr 11 S 3613 3636 3 Concept of the Assay To analyse the mutations a PCR is performed which amplifies the variable parts of the different gene using freshly extracted genomic DNA as template The amplification product is transferred to the MutaCHIP and is treated following the provided protocol The analysis allows distinct genotyping of all variants of the genes that are spotted onto the MutaCHIP The amplified product binds onto the MutaCHIP to the immobilised probes In a washing step the unspecific fragments are removed from the surface Subsequently the Enzyme Mix is added to the MutaCHIP coupling with the probe target complex After addition of the substrate a precipitate will form This precipitate is then detected by the Image reader and the signals are evaluated by the software 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Conce
8. aus Schritt F vollst ndig entfernen e 100 uL Substrate in den MutaCHIP geben und f r 5 min bei 21 C inkubieren Dazu den MutaCHIP in den Thermoshaker berf hren keine Sch ttelfunktion aktivieren e Danach das Substrate wieder vollst ndig entfernen Pipette und umgehend 500 ul Washing Buffer hinzugeben e MutaCHIP in den Imagereader berf hren auf korrekte Platzierung achten Bild erstellen und mit der Analyse Auswertung beginnen siehe folgendes Kapitel 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 11 Auswertung Die Auswertung erfolgt ber das MAAT und die NutriGenomics Software Die Ergebnisse werden mit Hilfe der Software in einem Report zusammengestellt F r die Auswertung des Chips folgen Sie der folgenden kurzen Anleitung F r weitere und detailliertere Informationen sehen Sie bitte im NutriGenomics Software Handbuch nach Schritt 1 Ein neues Projekt erstellen Klicken Sie auf die Schaltfl che Neues Experiment Vergeben Sie einen beliebigen Namen f r das Experiment und speichern Sie es anschlie end indem Sie auf die Schaltfl che Speichern klicken Neues Projekt an ege Je L PGDxSystem gt PGDSProjede wae e pl E E Ansichten yp Neuer Ordner Name Anderungsdatum Typ Patient 1 xml jM Computer Patient 2 xml E Dokumente E Bilder Patient 5 xml I Musik Zuletzt ge ndert Patient 3 xml Patient 6 xml Patient 7 xml m Suchvorg nge d
9. the lack of the enzyme lactase which usually splits the lactose in galactose and glucose Symptoms are flatulence stomach cramps nausea vomiting and or diarrhea Saccharose intolerance results from the reduced activity of the enzyme sucrase isomaltase localised in the brush border membrane of the small intestine The consumption of saccharose by intolerant subjectsgives rise to diarrhea abdominal pain and or vomiting Glucose 6 phophate dehydrogenase deficiency is the deficit of the enzyme glucose 6 phosphate dehydrogenase which protects the erythrocytes from oxidative damages Groceries and medicaments which act oxidatively can lead to 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 infantile hyperbilirubinemia and acute or chronic hemolysis Hemochromatosis is a autosomal recessive disease leading to increased deposition of excessive iron This leads to multiple organ failure if a early diagnosis is absent Celiac disease is a food intolerance in which the gluten as part of the wheat leads to a autoimmune References e SIVOPOULOS Artemis P Nutrigenetics Nutrigenomics In Annu Rev Public Health 31 2010 Apr S 53 68 e MONTALTO Massimo SANTORO Luca D ONOFRI Ferruccio et al Adverse reactions to food allergies and intolerances In Dig Dis 26 2008 Nr 2 S 96 103 e EDENBERG Howard J The Genetics of Alcohol Metabolism Role of Alcohol Dehydrogenase and Aldehyde Dehydrogenase Variants In Alcohol Research
10. ALDB 174 ALDB 334 SI 117 SI 340 Saccharoseintoleranz SI 620 SI 1098 Glucose 6 Phosphat Dehydrogenase G6PD Mediterranean S188P Defizienz d H63D H mochromatose C282Y Laktoseintoleranz 13910 T C Z liakie HLA DQ2 DQA1 0501 DQB1 0201 2 Einleitung Nutrigenetik und Nutrigenomik Studien liefern Erkenntnisse ber die Mechanismen der N hrstoff Gen Wechselwirkungen und k nnen zur Entwicklung von neuen Strategien zur individualisierten Behandlung ern hrungsbedingter Krankheiten wie z B enzymatisch bedingter Nahrungsmittelintoleranzen beitragen Eine enzymatisch bedingte Nahrungsmittelintoleranz ist die Unf higkeit eines Organismus bestimmte Nahrungsbestandteile zu metabolisieren Ursache hierf r sind Mutationen in jenen Genen die f r die entsprechenden Enzyme codieren Zu diesen Nahrungsmittelintoleranzen geh ren Alkohol Fruktose Laktose Saccharoseintoleranz heredit re H mochromatose Z liakie und Glucose 6 Phosphat Dehydrogenase Defizienz Alkoholintoleranz resultiert aus einem gest rten Abbau von Ethanol wenn die Enzyme Alkohol Dehydrogenase und Aldehyd Dehydrogenase durch Mutationen ver ndert sind Durch Gef erweiterungen bedingt treten Symptome wie Gesichtsr te Flushing Herzrasen Muskelschw che gesteigerte Herzfrequenz oder Hitzegef hl im Magen auf Fruktoseintoleranz resultiert aus der reduzierten Aktivit t des Enzyms Aldolase B so dass Fruktose nicht richtig verdaut werden kann Wird diese unverdaut
11. als of the assay are not influenced 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Evaluation and Interpretation of Results 13 Step 5 Diagnostic report To evaluate the results open the diagnostic Report Main Therefore click on the button Report Additionally a pdf document can be created or the report can be directly printed SE http localhost PGDx System diag Rep Tamox Rep O B C X BE PGDx System Diagnostic R X jum DE Edit View Favorites Tools Help New tab Ctrl T New window CtrleN New session General Options Open Ctrl 0 Select Printer Edit with Notepad i Add Printer H i PDFCresto J rmGenomics GenoChip Ta EPDE Crestor Save as Ctrl S Close tab Ctrl W reg S Result Se Reody El Pitto tie Location Print Ctrl P Comment eDoc Printer Print preview 7 Sample Page Range Al Number of copies 1 Import and export Type of sample Selection Current Page Properties Draw date Pages 1 poss 3 3 Work offline Processing date Enter either 2 angle page number ora single P PF Exit Report date 05 07 2011 CETE Results and Interpretation Defective CYP2D6 alleles detected 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 12 Trouble shooting en en Software Message Warning The Check enzyme and or substrate signals of the biotin reference markers Repeat the assay with new enzyme are too low This co
12. bridisierung e Hybridisieren der Probe bei 55 C 550rpm f r 30 min D Waschschritte nach der Hybridisierung Den Thermoshaker auf 50 C temperieren Achtung W hrend des Herunterk hlens des Thermoshakers muss der MutaCHIP unbedingt aus dem Shaker entnommen werden Der Hybridisation Buffer muss auf dem MutaCHIP verbleiben bis die Zieltemperatur erreicht ist Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten e Den Hybridisation Buffer aus Schritt C vollst ndig entfernen e 500 uL Washing Buffer vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren e Waschen des MutaCHIPs bei 50 C 550 rpm f r 5 min E Enzymkonjugation Den Thermoshaker auf 21 C temperieren Achtung W hrend des Runterk hlens des Thermoshakers muss der MutaCHIP unbedingt aus dem Shaker entnommen werden Der Washing Buffer muss auf dem MutaCHIP verbleiben bis die Zieltemperatur erreicht ist Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten e Den Washing Buffer aus Schritt D vollst ndig entfernen e 100 pL Enzyme Mix vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren e Konjugation des MutaCHIPs bei 21 C 550 rpm f r 15 min F Zweiter Waschschritt Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten e 500 uL Washing Buffer vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren e Waschen des MutaCHIPs bei 21 C 550 rpm f r 5 min G F rbung Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten Der Chip darf w hrend und nach dem F rben nicht gesch ttelt werden e Den Washing Buffer
13. ce of the MutaCHIPs with a pipette Use only substances that are mentioned in the protocol 8 Considerations and Precautions The guidelines and principles for working in a biomolecular laboratory have to be followed The test is suitable for genomic DNA freshly extracted from whole EDTA blood as starting material Only then optimal results are guaranteed Do not mix reagents from different lots The MutaCHIPs are o for single use only o only for in vitro diagnostics Do not let the MutaCHIP dry out while performing the analysis The MutaCHIP is designed for the use with the MAAT and the software provided by PharmGenomics Perform all steps in a timely manner Keep all stock solutions cooled while working Always open the MutaCHIP with both hands Do not apply pressure to the tube 9 Sample Collection The template for PCR amplification is genomic DNA from EDTA whole blood The DNA concentration should be between 15 and 30 ng uL The minimum DNA purity A260 A280 ratio should be higher than OD 260 280 1 8 For the assay high molecular freshly extracted DNA has to be used 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Sample Collection 10 Test Procedure 10 1 PCR Product Generation The table shows the workflow for a amplification of the different genes in a 25 uL reaction For the PCR four different tubes are required one tube per PCR Mix MasterMix A us PCR Buffer incl Polymerase 12 5 uL MasterMix
14. darf w hrend den Arbeitsschritten nicht austrocken Der MutaCHIP ist f r den Gebrauch mit dem MAAT und der dazugeh rigen Software von PharmGenomics ausgelegt Die Arbeitsschritte z gig durchf hren Alle Ausgangsl sungen w hrend des Arbeitens k hlen Das MutaCHIP Gef B mit zwei H nden ffnen Dabei ist darauf zu achten dass kein Druck auf den MutaCHIP ausge bt wird 9 Probengewinnung Als Matrize f r die PCR Amplifikation dient genomische DNA aus EDTA Vollblut Die DNA Konzentration sollte zwischen 15 30 ng ul liegen Die Reinheit OD5 9 280 der DNA sollte h her als 1 8 sein Fur den Assay darf nur hochmolekulare frisch extrahierte DNA verwendet werden 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Probengewinnung 10 Testdurchf hrung 10 1 PCR Produktherstellung Die unten stehenden Tabellen zeigen die Zusammensetzung f r eine Analyse der verschiedenen Gene pro 25 uL respektive 25 5 uL Reaktionsansatz Um die PCR f r alle Targets durchzuf hren ben tigt man pro Probe vier PCR Reaktionsgef e f r jeden MasterMix eines MasterMix A Bestandteil Volumen pro 25 5 uL Reaktionsansatz PCR Buffer inkl Polymerase 12 5 uL MasterMix B MasterMix C MasterMix D PCR Buffer inkl Polymerase 12 5 uL Die Proben in den Thermocycler stellen und das in 10 2 beschriebene PCR Protokoll verwenden 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 10 2 Probenzusamme
15. e Fruktose aufgenommen kommt es zu Symptomen wie Unterleibsschmerzen Appetitlosigkeit und belkeit Bei einer Laktoseintoleranz wird der mit der Nahrung aufgenommene Milchzucker Laktose nicht mehr verdaut Ursache hierf r ist das Fehlen des Enzyms Laktase das den Milchzucker normalerweise in Galaktose und Glukose spaltet Symptome sind Bl hungen Bauchkr mpfe belkeit Erbrechen und oder Durchfall Saccharoseintoleranz resultiert aus der reduzierten Aktivit t des in der B rstensaummembran des D nndarms lokalisierten Enzyms Sucrase Isomaltase Der 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Verzehr von Saccharose f hrt bei Betroffenen zu Symptomen wie Durchfall Bauchschmerzen und oder Erbrechen Glucose 6 Phosphat Dehydrogenase Defizienz f hrt zu einem Mangel des Enzyms Glucose 6 Phosphat Dehydrogenase welches die Erythrozyten vor oxidativen Sch den sch tzt Lebensmittel und Medikamente die oxidativ wirken k nnen zu fr hkindlicher Hyperbilirubin mie und einer akuten bzw chronischen H molyse f hren H mochromatose ist eine autosomal rezessive Krankheit bei der bersch ssiges Eisen im K rper angereichert wird und letztendlich bei fehlender Diagnostik zu Multiorganversagen f hren kann Z liakie ist eine solche Nahrungsmittelunvertr glichkeit bei der das im Weizen enthaltene Gluten eine Autoimmunreaktion im K rper hervorruft Diese Reaktion u ert sich durch Symptome wie Durchfall Verstopfung und M digkeit
16. eA Number of copies Selection Current Page Pages 1 Collate Bn Enter either a single page number or a single 12 page range For example 5 12 9m Boot Defective CYP2D6 alleles detected 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 12 Troubleshooting Software Meldung Warnung Die Pr fen Sie das Enzym und oder Substrat Signale des Biotinreferenzmarkers sind zu Wiederholen Sie den Assay mit neuem niedrig Dies kann ein Zeichen f r einen Enzym Substrat fehlgeschlagenen oder nicht ausgef hrten Konjugationsschritt sein oder das Enzym ist nicht mehr funktional Das System muss gestoppt werden Software Meldung keine Fehlerangabe Der Reader ist nicht richtig angeschlossen ErrorCode 3011 Halten Sie Esc f r 3 Sekunden gedr ckt und schlie en Sie den Reader in der richtigen Art und Weise an bitte wenden Sie sich an das Benutzerhandbuch des PGDx Systems Schlechte Bildqualitat Reinigen Sie die Bodenunterseite des ArraygefaBes Benutzen Sie ein weiches Tuch das mit Desinfektionsmittel angefeuchtet ist Wiederholen Sie das Foto es kann notwendig sein diesen Schritt mehrfach zu wiederholen Unscharfes Bild Reinigen Sie vorsichtig die Kamera mit einem Tuch oder einem Wattstabchen 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 mmun Eu MutaCHIP FOOD DNA Macroarray Kit for the Detection of genetically conditioned Food Intolerances
17. espotteten Allele zu Das amplifizierte Produkt wird auf den MutaCHIP gegeben und bindet an den dort immobilisierten Sonden Durch einen Waschschritt werden unspezifisch gebundene Fragmente wieder entfernt Im Anschluss wird das Enzym hinzugegeben welches an den Sonden Fragment Komplex bindet Nach Zugabe des Substrats tritt eine F llungsreaktion an den Stellen an denen noch DNA gebunden ist auf Das farbige Pr zipitat wird mit dem Imagereader detektiert und von der dazugeh rigen Software ausgelesen und bewertet 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Testprinzip 5 4 Kitbestandteile Jedes Testkit enth lt die folgenden Reagenzien zur Durchf hrung von 10 bzw 20 MutaCHIP FOOD Assays sowie eine Gebrauchsanweisung memkung Gere Menge 5 Erforderliche Materialien Ben tigte Ger te von PharmGenomics erh ltlich e Macroarray Analysing Tool MAAT o Notebook NutriGenomics Software MutaCHIP Imagereader Thermocycler f r PCR Peglab Primus 25 advanced Thermomixer mit K hlfunktion BIOR Mixing Block MB 102 O00 Ben tigte Ger te und Verbrauchsmaterialien nicht mitgeliefert e Pipetten o 0 1 2 pL o 0 5 10 uL o 10 200 uL o 100 500 uL e 0 2 ml PCR Gef e steril 6 Lagerung und Haltbarkeit e Alle Komponenten sind bei 2 8 C zu lagern e Das Substrat ist unbedingt vor Lichteinwirkung zu sch tzen e Im Inneren des Beutels befinden sich 5x MutaCHIPs mit jeweils ge ffnetem Deckel Wen
18. me Do not shake the MutaCHIP during the precipitation e Completely remove the Washing Buffer from step F e Add 100 uL of Substrate to the MutaCHIP and incubate for 5 min at 21 C To do so put the MutaCHIP into the thermoshaker Do not activate shaking function e Thereafter remove the Substrate completely pipette and immediately add 500 uL of Washing Buffer e Place the MutaCHIP into the image reader pay attention to the correct orientation take a picture and start with the analysis evaluation of the results see following chapter 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 11 Evaluation and Interpretation of Results The evaluation is performed using the MAAT and the NutriGenomics Software The results are compiled with help of the software into a report For the evaluation of the chip follow the short instructions below For further and detailed information please refer to the NutriGenomics Software handbook Step 1 Create a new project Click on the button New experiment Assign an arbitrary name for the experiment and subsequently save it by clicking on the button save o Creste a mem project ur BU _ SS 2 AL A Local Dak IC Documents P System POMS Projects New foider 2 v Organ gence fe m T Patent tart dC 7 Patient Jami Patest lami ge Pavert Sarmi Patent 6 umi mo wt Patwet mi Ehen File neme Patere
19. mmun Eu MutaCHIP FOOD DNA Macroarray Kit zur Untersuchung von genetisch bedingten Nahrungsmittelintoleranzen Nur f r in vitro Diagnostik EIT N 4o C SN KF390007 wa Immundiagnostik AG Stubenwald Allee 8a 64625 Bensheim Germany www immundiagnostik com Tel 49 0 6251 701900 info immundiagnostik com Fax 49 0 6251 849430 E re Inhaltsverzeichnis Verwendungszweck Einleitung Testprinzip Kitbestandteile Erforderliche Materialien Lagerung und Haltbarkeit Arbeitsbedingungen Hinweise und Vorsichtsma nahmen Probengewinnung N O OO O a a CI A Q 0 Testdurchf hrung PCR Produktherstellurg 1 211i iiiceeee eril ee ana alas 7 Probenzusammenf hrung und Verd nnung eeeeeeeeee nennen nennen nnne nnn 8 MutaChip Protokoll 2 12 2 2222222 oce eic ccc ecco cce ce cue cecececic ee zeeooculepeeliclrellcecIeeionnes reci 9 on O O N O OO A W N Auswertung 10 N Troubleshooting 14 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 Verwendungszweck 3 1 Verwendungszweck Das MutaCHIP FOOD Kit ist ein molekularbiologischer Test zur Untersuchung von Mutationen die zu Nahrungsmittelintoleranzen f hren Hierf r wird die genomische DNA mittels MutaCHIP untersucht Folgende Marker werden durch den Kit detektiert Nahrungsmittelintoleranz Marker ADH2 2 Alkoholintoleranz ALDH2 2 ALDB 149 Fruktoseintoleranz
20. n ein Lichtschutzfolien Beutel ge ffnet wurde m ssen die Deckel der darin verbleibenden MutaCHIPs unbedingt ge ffnet bleiben da das Schutzgas entweicht 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 E Die MutaCHIPs k nnen im wieder lose nicht luftdicht verschlossenen keine Klebestreifen verwenden Lichtschutzfolien Beutel mehrere Wochen bei Raumtemperatur RT gelagert werden Dabei einen dunklen und trockenen vor Feuchtigkeit sch tzen Ort zur Aufbewahrung ausw hlen Um selbst minimale Performanceverluste zu vermeiden empfehlen wir jedoch den Verbrauch eines ge ffneten MutaCHIP Beutels m glichst innerhalb von zwei Wochen Die MutaCHIPs sind gegen direkte Sonneneinstrahlung und Staub zu sch tzen 7 Arbeitsbedingungen Die MutaCHIPs d rfen niemals zentrifugiert werden Die Oberfl che des MutaCHIPs darf nicht mit der Pipettenspitze ber hrt werden Der MutaCHIP darf nur mit den im Protokoll erw hnten Substanzen verwendet werden 8 Hinweise und Vorsichtsma nahmen Die Vorschriften und Grunds tze f r molekularbiologisches Arbeiten m ssen eingehalten werden Der Test ist zur Verwendung mit frisch extrahierter genomischer DNA aus EDTA Vollblut als Ausgangsmaterial geeignet Nur dann k nnen optimale Ergebnisse sichergestellt werden Mischen Sie keine Reagenzien aus unterschiedlichen Lots Die MutaCHIPs sind o nur fur den Einmalgebrauch bestimmt o nur zur in vitro Diagnostik zu verwenden Der MutaCHIP
21. nf hrung und Verd nnung Das PCR Protokoll muss f r jedes Labor erneut etabliert werden da die verschiedenen Thermocycler unterschiedliche Heizraten haben Diese Etablierung entf llt wenn der empfohlene Thermocycler verwendet wird Peqlab Primus 25 advanced F r die Etablierung kann mit dem folgenden Standard Protokoll begonnen werden I Tremors s ferns 120 30 30 30 420 Start 95 1x Denaturierung mmwews fae 36 x Annealing 58 e e J Finale Elongation Nach Ablauf der PCR wird aus allen vier Reaktionsgef en 1 4 jeweils 4 uL PCR Produkt entnommen und in ein neues PCR Reaktionsgef 5 berf hrt o o Uy V v VJ te 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Testdurchf hrung 9 10 3 MutaChip Protokoll A Vorbereitung des Hybridisierungspuffers Falls der Hybridisation Buffer tr b oder flockig geworden ist kann dieser f r wenige Sekunden in der Mikrowelle 240 W oder in einem Wasserbad erw rmt und durch Schwenken homogenisiert werden bis er wieder klar ist Vor dem Verwenden muss der Puffer auf Raumtemperatur RT abgek hlt werden B Vorbereitung der DNA Proben e Die vorbereitete Probe f r 2 min bei 95 C im Thermocycler denaturieren e Anschlie end wird die denaturierte Probe mit Hybridisation Buffer auf 100 uL aufgef llt 16 HL Probe 84 uL Hybridisation Buffer e Das Gemisch vollst ndig in den MutaCHIP pipettieren ohne dabei den Boden zu ber hren C Hy
22. o 4 A 6 o 7 a 3 9 o 10 o 1 o Analyseprotokoll 7 o gt gt Waxommen bem PharmGenomcs D agnosbc Syste 29 o 2011 145933 emodus Rohdatenanalyse 41 9 ONO CYP2DE Bider Charge E 5 Keine Gen Delebon detekbert gt Stan formaton E gt gt 207 Spots erfasst N Keine Gen Duplikation detektiert Spots zugeordnet gt gt Erfasse Signalstarke gt gt Genenere Rohdaten gt gt Starie Normalisierung Genolypisierung abgeschlossen schlossen I gt gt Starte Ge pesierung M Analysefortschritt After the complete data analysis the results can be access in the analysis module genotyping module or in the diagnostic report The used icons are explained in the following table Symbole der Software und ihre Bedeutung The patient carries on both alleles the healthy variant of the investigated genetic variants The patient carries on one allele the healthy and on the other allele the mutated genetic variant The patient carries on both alleles the mutated genetic variation in homozygous form The signal values of the probes for this genetic variation are too weak for a valid result This could be caused by other sequence variations in close proximity to the investigated variant The remaining signals of the assay are not influenced Both probes for this genetic variant show an invalid signal This might be caused by impurities or dust particles on the MutaCHIP surface The remaining sign
23. pt of the Assay 5 4 Components Each test kit contains the following components for 10 or 20 MutaCHIP FOOD assays and the instruction manual Description Size of Reaction Tube or Flask Number wmmemmma 1 5 Materials Required materials that can be ordered separately from PharmGenomics e Macroarray Analysing Tools MAAT o Notebook NutriGenomics Software o MutaCHIP image reader o Thermocycler Peglab Primus 25 advanced o Thermoshaker with cooling function BIOR Mixing Block MB 102 Required Materials not provided e pipettes o 01 25uL o 05 10yuL o 10 200 uL o 100 500 uL e 0 2 mL PCR tubes sterile 6 Storage and Shelf life e All components are stored at 2 8 C e The substrate has to be strictly protected against light exposure e The bags contain each 5x MutaCHIPs with open lids After unsealing a bag the lids of the remaining MutaCHIPs have to remain open as the protection gas escapes 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 er The MutaCHIPs can be stored in the loosely not airtight closed do not use tape light protection bag up to several weeks and room temperature RT For storage choose a dry and dark place To avoid even minimal loss of performance we recommend using up one bag of MutaCHIPs within two weeks The MutaCHIPs have to be protected against direct exposure to sunlight and dust 7 Working Conditions Never centrifuge the MutaCHIPs Do not touch the surfa
24. rogenase G6PD Mediterranean S188P deficiency H63D Hemochromatosis C282Y Lactose intolerance 13910 T C Celiac disease HLA DQ2 DQA1 0501 DQB1 0201 2 Introduction Nutrigenetic and nutrigenomic studies provide knowledge about the mechanisms of nutrient gene interactions and can contribute to the development of new strategies for the individualised treatment of diet related diseases like for example enzymatic related food intolerances Enzymatic related food intolerance is the inability of an organism to metabolise specific nutritional components Reasons for this are mutations in those genes coding for the corresponding enzymes Part of these food intolerances are alcohol fructose and lactose intolerance sucrase isomaltase and glucose 6 phophat dehydrogenase deficiency hereditary hemochromatosis and celiac disease Alcohol intolerance results from a disturbed degradation of ethanol if the enzymes alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase are altered by mutation Due to the vascular dilation symptoms like flushing tachycardia muscle weakness increased heart rate or sensation of heat in the stomach occur Fructose intolerance results from a reduced activity of the enzyme aldolase B causing an inability to correctly digest fructose The undigested fructose gives rise to symptoms like abdominal pain loss of appetite and nausea In case of lactose intolerance the milk sugar ingested with the food is not digested Basis for this is
25. sergebnisse ir PharmGencersci Degnoiti System TR Ep E er et See Experiment Extras Hilfe en Procite Anamo Reportmod Pram nnemen Ir J N Pavert Sani e zz 5 E zs Homes PharmGenomics Patert Tl individualised therapies Paket Sam Papert Gam Patent Earl EN S CYP2D6 Genotypisierungstest Homozygot Homozygot e Wildlyp Mutation 3 o 4 A 6 o 7 L3 3 9 9 o 10 o n 9 Analyseprotokoll 7 o men bem PharmGenomics D agnosbc Syste 29 o 11145933 Analysemodus Rohdatenanalyse 4 o ohdaten Q JCONO CYP2D6 B deriCharge 5 Keine Gen Delebon detekbert N Keine Gen Duplikation detektiert Genotypisierung abgeschlossen Analysefortscheitt Nach der vollst ndigen Datenanalyse k nnen Sie die Ergebnisse im Analysemodul Genotypisierungsmodul oder im Diagnosebericht abrufen Die dabei verwendete Symbole werden in der unten stehenden Tabelle erl utert Symbole der Software und ihre Bedeutung Der Patient tr gt auf beiden Allelen die gesunde Variante der untersuchten genetischen Variation Der Patient tr gt auf einem Allel die gesunde und auf dem anderen Allel die mutierte genetische Variation Der Patient tr gt auf beiden Allelen die mutierte genetische Variation in homozygoter Form Die Signalwerte der Sonden f r diese genetische Variation sind zu gering um ein valides Ergebnis zu erzeugen Dies k nnte auf Sequenzver nderungen in direkter N he zur un
26. tersuchten Variation hindeuten Die anderen Signale werden jedoch durch den Ausfall nicht beeintr chtigt Beide Sonden f r diese genetische Variation erzeugen ein nicht g ltiges Signal Dies k nnte auf eine Verschmutzung auf der Chipoberfl che zur ckzuf hren sein Die anderen Signale werden jedoch durch den Ausfall nicht beeintr chtigt 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012 Auswertung 13 Schritt 5 Diagnostischer Report Um die Daten auszuwerten lassen Sie sich den diagnostischen Report anzeigen Klicken Sie hierf r auf die Schaltfl che Report Zus tzlich k nnen Sie auch ein pdf Dokument erstellen oder den Report direkt ausdrucken DE http localhost PGDx System diag Rep Tamox Rep Ov BGX JD Edit View Favorites Tools Help Bm PGDx System Diagnostic R X m New tab Ctrl T Duplicate tab Ctrl K New window Ctri N New session Open Ctrl O Edit with Notepad Save Save as Ctrl S Close tab Ctrl W Page setup Print Ctrl P Print preview Send gt Import and export Properties Work offline Exit rmGenomics GenoChip Ta S Result Sample Type of sample Draw date Processing date Report date 05 07 2011 Results and Interpretation gem Print General Options Select Printer B Add Printer let PDFCreator Status Ready Location Comment ElPinttofle Freerences eDoc Printer Page Range
27. uld be a sign of a substrate failed or missed conjugation step Alternatively the enzyme could be degraded The system will be stopped Software Message Warning The Please read paragraph 11 1 signals of the DNA probes indicate a failed amplification However there might be a homozygous deletion of the CYP2D6 gene Please refer to the handbook under section Detection of 5 homozygous Software Message No error The reader is not plugged in properly description ErrorCode 3011 Keep Esc pressed for 3 seconds and plug in the reader in the right manner please refer to the user manual of the PGDx System Poor image quality Clean the bottom side of the MutaCHIP using a cotton swab or a cloth wet with disinfectant Repeat the photograph it can be necessary to repeat this procedure several times Blurred picture Carefully clean the camera with a cotton swab 2012 Immundiagnostik AG Version 2 0 06 12 2012
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