MycAssay™ Pneumocystis
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1. 0 25 0 Positivkontrolle akzeptabel Ergebnisse der Patientenproben sind valide Positivkontrolle lt 20 0 oder gt 25 0 Positivkontrolle fehlgeschlagen Gesamten Lauf wiederholen Patientenprobe 39 0 oder Nicht Im Bereich 29 3 33 3 Probe ist negativ f r Ergebnis speichern detektiert Pneumocystis oder ausdrucken Ergebnis 1 Patientenprobe lt 39 0 _ Positiv f r Ergebnis speichern Pneumocystis oder ausdrucken Ergebnis 2 Patientenprobe 39 0 oder Nicht lt 29 3 oder gt 33 3 Amplifikation der IAC Analyse der Probe detektiert in der Probe wiederholen fehlgeschlagen Ergebnis 3 Siehe den Abschnitt Klinische Befundung bei Ergebnis 1 2 oder 3 030 163 Version 1 2 24FEB12 Deutsch 8 Nur f r In vitro Diagnostik MycAssay Pneumocystis Respiratorische Proben Stratagene Mx3000 Serie Hinweise zur Fehlersuche 4 1 Die Negativkontrolle ergab ein positives Signal im FAM Kanal gt Beim Ansetzen kam es zu einer Kontamination Die Ergebnisse des gesamten Analysenlaufs k nnen nicht als zuverl ssig angesehen werden Wiederholen Sie den gesamten Lauf gehen Sie dabei mit besonderer Sorgfalt vor wenn Sie die Templates vor allem die Positivkontrolle R hrchen 4 zugeben um sicherzustellen dass es nicht zu einer Kreuzkontamination kommt Vergewissern Sie sich dass der Arbeitsbereich sowie Ger te und Hilfsmittel vor und nach Gebrauch2. Deckeln von Agilent Technologies Kat Nr 401428 und 401425 validiert Der Gebrauch anderer Kunststoff Materialien oder von Artikeln anderer Hersteller k nnte zu anderen Schwellenwerten und daher zu anderen Leistungsmerkmalen als den in dieser Gebrauchsanleitung angegebenen f hren Bei Verwendung von Kunststoff Verbrauchsmaterialien anderer Hersteller wird empfohlen eine laborinterne Validierung mit den Positiv und Negativkontrollen durchzuf hren 030 163 Version 1 2 24FEB12 Deutsch 2 Nur f r In vitro Diagnostik MycAssay Pneumocystis Respiratorische Proben Stratagene Mx3000 Serie Kit Inhalt Beschreibung Der Kit enth lt f nf Folienbeutel mit jeweils drei verschlossenen Kompartimenten die Beutel k nnen separat verwendet werden Jeder Beutel enth lt genug Reagenzien f r acht Reaktionen Volumen R hrchen 1 dNTPs 66 uL oranger Deckel MgCl Gepufferte L sung mit DNA Polymerasekomplex R hrchen 2 lt 0 01 Primer 66 uL blauer Deckel lt 0 01 Molecular Beacons lt 0 0001 interne Amplifikationskontrolle IAC Die interne Amplifikationskontrolle ist ein rekombinantes DNA Plasmid das eine nicht infekti se Sequenz enth lt die mit keiner Pneumocystis Zielsequenz bereinstimmt Tris HCI Puffer R hrchen 3 Negativkontrolle 25 ul farbloser Deckel Wasser R hrchen 4 Positivkontrolle 25 uL schwarzer Deckel lt 0 0001 Positivkontroll DNA Die Positivkontroll DNA ist ein rekombinantes Plasmid da
3. entwickelt wurde dass PCR Inhibitoren entfernt werden sind nicht alle Medikamente oder Patientenpopulationen daraufhin evaluiert worden Das Verfahren ist weder umfassend mit Sputum Proben noch mit induzierter Kochsalzl sung oder mit Proben von Kindern evaluiert worden Von au en eingetragene Kontaminationen der Originalprobe oder der Kit Reagenzien k nnen zu falsch positiven Testergebnissen f hren Derartige Kontaminationen k nnen durch mit P jirovecii verunreinigte Luft unsaubere experimentelle Arbeitstechnik beim Umgang mit der Positivkontrolle oder durch eine u erliche Kontamination insbesondere durch Pipetten mit P jirovecii DNA verursacht werden Da ein richtig positives Ergebnis bei Proben von Patienten die vor bergehend oder dauerhaft mit P jirovecii kolonisiert sind erhalten werden kann ist bei der Interpretation des Testergebnisses unbedingt eine klinische Beurteilung notwendig LIZENZIERUNG TopTaq Hot Start wird von QIAGEN bezogen QIAGEN ist ein eingetragenes Warenzeichen der Qiagen GmbH Hilden Deutschland SmartCycler ist ein eingetragenes Warenzeichen von Cepheid 904 Caribbean Drive Sunnyvale CA 94089 USA Dieses Produkt wird unter der Lizenz des Public Health Research Institute Newark New Jersey USA verkauft und darf gem den PHRI Patentrechten nur f r die humane in vitro Diagnostik verwendet werden Mx3000P und Mx3005P sind eingetragene Warenzeichen von Stratagene MxPro ist
4. hat Dennoch kann es zu einem Ausbruch kommen und Personen die nicht wissen dass sie HIV positiv sind k nnen an AIDS mit PCP erkrankt sein PCP tritt auch bei anderen abwehrgeschw chten Patienten auf darunter auch bei Empf ngern eines Spenderorgans nach Organtransplantationen sowie bei Patienten mit Hypogammaglobulin mie oder chronischer Leuk mie Gegenw rtig st tzt sich die Diagnose von PCP auf mikroskopische Methoden da P jirovecii nicht in mikrobiologischen Routinelabors kultiviert werden kann Bronchoalveol re Lavage BAL ist die bevorzugte Methode der Probengewinnung Zu den g ngigen diagnostischen Verfahren geh ren die Immunfluoreszenz IF oder die direkte Fluoreszenz sowie die histologische Anf rbung der Proben MycAssay Pneumocystis ist ein molekulardiagnostischer Kit f r den Nachweis von P jirovecii der auf der sogenannten Molecular Beacon PCR Technologie basiert Der gesamte Test kann inklusive der DNA Extraktion aus der klinischen Probe innerhalb von vier Stunden oder falls die extrahierte DNA bereits vorliegt in nur zwei Stunden durchgef hrt werden Dieser Assay weist den unmittelbaren Vorteil der verbesserten Nachweisbarkeit im Labor auf was in Kombination mit der schnellen Testdurchf hrung sehr wahrscheinlich einen klinischen Nutzen mit sich bringt Die diagnostische Genauigkeit des Assays h ngt in hohem Ma e von der Qualit t der Ausgangsprobe Prim rprobe ab Testprinzip Nach dem Mischen der Rea
5. independent of highly active antiretroviral therapy Thorax 2006 61 716 21 3 Kovacs JA Gill VJ Meshnick S Masur H 2001 New insights into transmission diagnosis and drug treatment of Pneumocystis carinii pneumonia JAMA 286 2450 60 4 Huang L Morris A Limper AH Beck JM ATS Pneumocystis Workshop Participants An Official ATS Workshop Summary Recent advances and future directions in pneumocystis pneumonia PCP Proc Am Thorac Soc 2006 3 655 64 Tyagi S Kramer FR 1996 Molecular beacons Probes that fluoresce upon hybridization Nature Biotechnology 14 303 308 Deutsch 1 030 163 Version 1 2 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Nur f r n vitro Diagnostik Stratagene Mx3000 Serie Respiratorische Proben w hrend das Ende des anderen Arms ebenfalls ber eine kovalente Bindung ein Quencher Molek l tr gt das die Fluoreszenz des Fluorophors unterdr ckt solange es sich in unmittelbarer N he befindet Die Molecular Beacons fluoreszieren nicht wenn sie frei in der L sung vorliegen Wenn sie jedoch mit einem Nukleins urestrang hybridisieren der eine Zielsequenz enth lt erfolgt eine Konformations nderung die ihre Fluoreszenz erm glicht Der Umfang der Fluoreszenz d h die Intensit t des Signals in irgendeinem bestimmten Zyklus oder nach der Beendigung der Zyklen h ngt von der Menge der spezifischen Amplicons ab die zu diesem Zeitpunkt vorhanden sind Das Stratagene Real Time PCR System detektiert in Echtzeit die
6. selbst wenn sie aus derselben Charge stammen Verwenden Sie Reagenzien oder Kontrollen niemals nach Ablauf des Verfallsdatums Nach dem Offnen sollten die Reagenzien und Kontrollen nicht wieder eingefroren oder wiederverwendet werden Beim Umgang mit den Reagenzien des Kits sind Schutzkleidung und Einmal Handschuhe zu tragen Vermeiden Sie mikrobielle und Desoxyribonuklease DNase Kontaminationen der Reagenzien bei der Entnahme von Aliquoten aus den R hrchen Die Verwendung von sterilen DNase freien Low Retention Einmal Filterpipettenspitzen oder Pipettenspitzen f r Positive Displacement Pipetten wird empfohlen Benutzen Sie f r jede Probe und jedes Reagenz eine neue Pipettenspitze Entsorgen Sie ungebrauchte Reagenzien und Abf lle gem den geltenden Bundes Landes oder rtlichen Vorschriften Zur Vermeidung von Kontaminationen mit Pneumocystis oder IAC Amplicons sollten die Reaktionsgef e nach der Amplifikation nicht mehr ge ffnet werden In Arbeitsbereichen in denen mit Proben oder Kit Reagenzien gearbeitet wird darf nicht gegessen getrunken oder geraucht werden L sungen mit einer niedrigen DNA Konzentration k nnen bei unsachgem er Lagerung instabil sein Es wird empfohlen die extrahierte DNA bei 80 C zu lagern um die DNA Integrit t zu erhalten Wenn m glich sollte wiederholtes Auftauen und Wiedereinfrieren vermieden werden Dieser Kit wurde mit optischen 8er PCR R hrchen Streifen 0 2 ml und
7. von jedem Beacon emittierte Fluoreszenz Vorsichtsma nahmen Der Kit ist f r den in vitro diagnostischen Gebrauch vorgesehen Dieser Kit darf nur von Laborfachpersonal verwendet werden Es werden Testverfahren f r die aerosolfreie Handhabung der Proben ben tigt Die Standard Vorsichtsma nahmen und die Labor Richtlinien sollten bei der Bearbeitung s mtlicher Proben beachtet werden Ein Material Sicherheitsdatenblatt kann von Myconostica Ltd bezogen werden Dieser Test ist ausschlie lich f r die Anwendung mit der Stratagene Mx3000 Serie und der MxPro Software Version 4 10 bestimmt W hrend der Validierungsstudien wurde Folgendes speziell bei diesem Ger t festgestellt o Wenn das Ger t kurz zuvor verwendet wurden sollten Sie die Lampe mindestens 1 Stunde abk hlen lassen bevor Sie einen MycAssay Pneumocystis Lauf vorbereiten da es andernfalls zu einer Beeintr chtigung der Empfindlichkeit kommen kann die zu falsch negativen Ergebnissen f hrt o Bei niedrigen Konzentrationen um den klinischen Cut off Wert herum ist eine geringere Pr zision im Vergleich zu anderen von uns getesteten Ger ten festzustellen Verwenden Sie keine Reagenzien oder Kontrollen deren Schutzbeutel bei der Lieferung ge ffnet oder besch digt sind Reagenzien und Kontrollen k nnen nicht zwischen Kits mit unterschiedlichen Chargennummern ausgetauscht werden Vereinigen Sie niemals Reagenzien oder Kontrollen aus unterschiedlichen R hrchen
8. Nur f r In vitro Diagnostik MycAssay Pneumocystis sfi Stratagene Mx3000 Serie my conosjica Respiratorische Proben MycAssay Pneumocystis Stratagene Mx3000 Serie Respiratorische Proben REF 080 035 Vorgesehener Verwendungszweck MycAssay Pneumocystis ist vorgesehen f r die Verwendung durch qualifiziertes Laborfachpersonal zum qualitativen Nachweis genomischer DNA von Pneumocystis jirovecii die aus Patientenproben des unteren Respirationstrakts z B BAL oder Bronchialaspiratproben zur Abkl rung der Diagnose bei erwachsenen Patienten bei denen eine durch Pneumocystis jirovecii verursachte Lungenentz ndung vermutet wird MycAssay Pneumocystis wurde f r den Gebrauch mit den Real Time PCR Thermocyclern der Modellreihe Mx3000 Mx3000P oder Mx3005P von Stratagene in Verbindung mit der MxPro Software Version 4 10 validiert Informationen zum Test Die durch Pneumocystis jirovecii fr her carinii ausgel ste Pneumonie PCP ist eine verbreitete opportunistische Pneumonie in abwehrgeschw chten Patienten insbesondere solchen mit fortgeschrittener HIV Infektion und AIDS Sie ist typischerweise ambulant erworben stellt sich subakut dar und f hrt wenn sie unbehandelt bleibt zu progressivem Lungenversagen und zum Tod Die Prophylaxe mit Trimethoprim Sulfamethoxazol Bactrim oder Septrin wird routinem ig vielen Risikopatienten verabreicht eine Vorgehensweise welche die H ufigkeit von PCP grundlegend verringert
9. aminiert wird Verschlie en Sie die Deckel der anderen R hrchen bzw Reaktionsgef e bevor Sie R hrchen 4 ffnen dies tr gt dazu bei das Risiko von Kreuzkontaminationen zu reduzieren Vergewissern Sie sich dass die Deckel aller Reaktionsgef e fest verschlossen sind Notieren Sie sich die Positionen der Proben im PCR R hrchen Streifen Beschriften Sie das erste R hrchen eines Streifens falls mehr als ein R hrchen Streifen verwendet wird Zentrifugieren Sie die Reaktionsgef e f r 10 Sekunden in einer Mikrozentrifuge mit passendem Adapter f r 0 2 mL PCR Reaktionsgef e um den Inhalt am Boden der R hrchen zu sammeln berzeugen Sie sich durch visuelle Kontrolle dass keine Blasen in den Reaktionsans tzen vorhanden sind Fahren Sie unverz glich mit Abschnitt 2 fort Die angesetzten MycAssay Reaktionen zum Nachweis von Pneumocystis sind f r bis zu 60 Minuten stabil Stellen Sie sicher dass der gesamte Arbeitsbereich im Anschluss an das PCR Setup gr ndlich mit DNA Dekontaminationsl sung gereinigt wird Durchf hrung des Laufs ffnen Sie die MxPro Software Version 4 10 Legen Sie die MycAssay Pneumocystis Protokoll CD ROM von Myconostica in das Laufwerk ein W hlen Sie im New Options Men die erste Option Real time Quantitative PCR Multiple Standards und klicken Sie auf OK siehe Abb Deutsch 5 030 163 Version 1 2 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Nur f r n vitro Diagnostik Stra
10. apitatus Candida albicans C glabrata C parapsilosis C tropicalis Cladosporium spp Cryptococcus neoformans Doratomyces microsporus Fusarium solani Rhizomucor pusillus Rhodotonila rubra Saccharomyces cerevisiae Scedosporium apiospermum S prolificans Sporothrix schenkii Trichosporon capitatum Auch f r die folgenden Bakterienspezies wurde kein positives Ergebnis erhalten Bordetella pertussis Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli Haemophilus influenzae Lactobacillus plantarum Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae S pyogenes S salivarius Humane genomische DNA ergibt in diesem Assay ebenfalls kein positives Ergebnis Interferierende Substanzen Gegenanzeigen f r die Anwendung Die folgenden Substanzen wurden in klinisch relevanten Konzentrationen getestet f r keine von ihnen wurde eine Inhibition des Assays festgestellt Acetylcystein Amphotericin Beclometason Dipropionat Budesonid Natrium Colistimethat Fluticasonpropionat Formoterolfumarat Dihydrat Ipratropiumbromid Lidocain Mannitol Salbutamolsulfat Salmeterol Septrin Trimethoprim Sulfamethoxazol Natriumchlorid Natrium Cromoglicat Terbutalin und Tobramycin Leistungsbewertung Der klinische Cut off bei einem Ct Wert von 39 0 wurde anhand der Analyse eines Set von klinischen Proben die aus verschiedenen Patientenpopulatio
11. auf korrekte Art und Weise dekontaminiert werden Die Negativkontrolle befand sich nicht an der richtigen Position im Ger t Achten Sie darauf allen Reaktionsans tzen in der Software die korrekte Bezeichnung zuzuweisen und die PCR R hrchen Streifen in der richtigen Orientierung in das Ger t zu stellen Es wurden eventuell nicht empfohlene PCR R hrchen oder Platten verwendet Die Schwellenwerte sind nur bei Verwendung der empfohlenen PCR R hrchen Streifen und Deckel von Agilent Technologies Kat Nr 401428 und 401425 g ltig 4 2 Der Ct Wert der IAC in der Negativkontrolle liegt au erhalb des akzeptablen Bereichs gt Die PCR wurde inhibiert Stellen Sie sicher dass die Arbeitsfl che sowie Ger te und Hilfsmittel nach der Anwendung von Dekontaminationsl sungen und vor dem PCR Setup v llig trocken sind Die Bedingungen unter denen der Kit gelagert wurde entsprachen nicht den Angaben im Abschnitt Aufbewahrung dieser Gebrauchsanweisung oder das Verfallsdatum des Kits ist abgelaufen berpr fen Sie bitte dass der Kit unter korrekten Bedingungen gelagert wurde berpr fen Sie das Verfallsdatum der Reagenzien siehe Kit Schachtel oder Etikett auf Reagenzienbeuteln und wiederholen Sie den Lauf ggf mit einem Kit dessen Verfallsdatum noch nicht abgelaufen ist Entweder wurde das Reagenz aus R hrchen 1 oder 2 nicht zur PCR Reaktion gegeben oder die doppelte Menge des Reagenzes aus R hrchen 2 wurde pipettiert Wied
12. ein Warenzeichen von Stratagene al Lab21 184 Cambridge Science Park Cambridge CB4 OGA United Kingdom Telephone 44 0 1638 552 882 Facsimile 44 0 1638 552 375 Email productsupport lab21 com Deutsch 13 030 163 Version 1 2 24FEB12
13. eitsbereich mit DNA Dekontaminationsl sung gereinigt und vollst ndig trocken ist vermeiden Sie w hrend des Ansetzens der Reaktionen die Verwendung dieser L sung da sie die PCR Reaktionen inhibieren k nnte 1 3 Ein Beutel enth lt jeweils eines der R hrchen 1 2 3 und 4 Die Reagenzien in einem Beutel reichen f r die Durchf hrung von acht Reaktionen Mindestens eine Positivkontroll Reaktion und eine Negativkontroll Reaktion m ssen pro Lauf mit durchgef hrt werden wobei die Reagenzien aus einer einzigen Kit Charge stammen m ssen Daher k nnen 6 Testproben mit einem Beutel analysiert werden Falls mehr als sechs Patientenproben untersucht werden m ssen k nnen mehrere Beutel verwendet werden wobei die verwendeten Beutel aus derselben Kit Charge stammen m ssen Maximal k nnen 38 Patientenproben mit den f nf Beuteln eines Kits analysiert werden 1 4 Berechnen Sie unter Ber cksichtigung der folgenden Tabelle die Anzahl der ben tigten Reaktionsans tze Anzahl Beutel Maximale Anzahl an Patientenproben 6 1 5 Nehmen Sie die entsprechende Anzahl der Packungen aus dem Tiefk hlschrank Einen Beutel der nicht mehr dicht verschlossen ist sollten Sie nicht verwenden Falls die aus den Patientenproben gewonnenen DNA Proben nach der Extraktion eingefroren wurden entnehmen Sie auch sie aus dem Tiefk hlschrank 1 6 ffnen Sie die ben tigte Anzahl an Beuteln und entnehmen Sie die R hrchen Wenn insgesamt mehrere Reagenzie
14. en k nnen Auswertung der Daten und Interpretation der Ergebnisse Nach Ende des Analysenlaufs k nnen Sie die Ergebnisse betrachten indem Sie auf die Schaltfl che Analysis oben rechts auf dem Bildschirm klicken und anschlie end die Results Registerkarte anklicken Bei ausgew hlter Amplification Plots analysis area stellen Sie die Schwellenwerte Thresholds f r jeden Kanal auf folgende Werte ein und sichern Sie diese durch Anklicken des Vorh ngeschloss Symbols PNE 500 IAC 100 Die Option Adaptive Baseline sollte aktiviert sein ist bei dieser Software in der Regel voreingestellt Speichern Sie die nderungen Sie k nnen jeden Kanal einzeln betrachten indem Sie die K stchen im Bereich Assays Shown unten links auf dem Bildschirm aktivieren oder deaktivieren Zur Weiterverarbeitung k nnen die Daten nach Excel exportiert werden W hlen Sie dazu im File Men die Option Export Text Report und anschlie end Export Text Report to Excel Nur die Ergebnisse der markierten Wells Farbstoffe werden exportiert Stellen Sie deshalb sicher dass alle relevanten erforderlichen Wells Farbstoffe markiert sind ffnen Sie die gespeicherte csv Datei mit Excel oder einem vergleichbaren Tabellenkalkulationsprogramm Werten Sie mit den Kontrollen beginnend jede Probe wie im folgenden Flussdiagramm gezeigt aus weitere Details k nnen auch der Tabelle unter dem Flussdiagramm entnommen werden D
15. erholen Sie den Lauf f hren Sie dabei das Ansetzen der Reaktionen mit gro er Sorgfalt durch Derartige Pipettier Fehler kann man an einem h heren oder niedrigeren Fl ssigkeitsstand in einem der Reaktionsgef e im Vergleich zu den anderen Gef en erkennen Es wurden eventuell nicht empfohlene PCR R hrchen oder Platten verwendet Die Schwellenwerte sind nur bei Verwendung der empfohlenen PCR R hrchen Streifen und Deckel von Agilent Technologies Kat Nr 401428 und 401425 g ltig 4 3 Das Ergebnis der Positivkontrolle ist negativ oder au erhalb des akzeptablen Bereichs gt Die Bedingungen unter denen der Kit gelagert wurde entsprachen nicht den Angaben im Abschnitt Aufbewahrung dieser Gebrauchsanweisung oder das Verfallsdatum des Kits ist abgelaufen berpr fen Sie bitte dass der Kit unter korrekten Bedingungen gelagert wurde berpr fen Sie das Verfallsdatum der Reagenzien siehe Kit Schachtel oder Etikett auf Reagenzienbeuteln und wiederholen Sie den Lauf ggf mit einem Kit dessen Verfallsdatum noch nicht abgelaufen ist Es kam zu einem Fehler beim Ansetzen der Reaktion und die Template DNA der Positivkontrolle R hrchen 4 wurde in das falsche Reaktionsgef pipettiert Wiederholen Sie den Lauf f hren Sie dabei das Ansetzen der Reaktionen mit gro er Sorgfalt durch Derartige Pipettier Fehler kann man an einem h heren Fl ssigkeitsstand in einem Reaktionsgef und einem niedrigeren Fl ssigkeitssta
16. ert ist umso h her ist die Wahrscheinlichkeit dass eine Erkrankung vorliegt Bei Ct Werten nahe am Cut off Wert von 39 0 ist es eher wahrscheinlich dass eine Kolonisation und keine Infektion vorliegt aber bei einigen Patienten kann die Krankheit vorliegen obwohl nur sehr wenig P jirovecii DNA gemessen wird Dies kann auf eine nicht geeignete Probe oder mangelhafte Probenvorbereitung hindeuten oder die Belastung des betreffenden Patienten mit Pilzorganismen ist unklar oder komplexer Natur Grenzen des Verfahrens Die Grenzen des Verfahrens h ngen in erster Linie von der Qualit t der Prim rprobe ab Ist sehr wenig Probenmaterial vorhanden oder stammt die Probe nicht aus dem betroffenen Lungenbereich so wird der Test weniger sensitiv und kann falsch negative Werte liefern _BAL Proben sollten vor der DNA Extraktion aus dem Pellet zentrifugiert werden Die Daten zeigten auch dass durch eine Volumenreduktion des f r die DNA Extraktion verwendeten berstands wobei die Volumenreduktion durch den Zentrifugationsschritt erreicht wurde die Menge an Inhibitoren die in das Assay System eingeschleppt werden reduziert wird Die Evaluation der klinischen Leistung wurde bisher nicht mithilfe des MX3005P Ger ts best tigt 030 163 Version 1 2 24FEB12 Deutsch 12 Nur f r n vitro Diagnostik MycAssay Pneumocystis Respiratorische Proben Stratagene Mx3000 Serie Obwohl das MycXtra Pilz DNA Extraktionsverfahren so
17. eutsch 7 030 163 Version 1 2 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Stratagene Mx3000 Serie Nur f r In vitro Diagnostik Respiratorische Proben t Kontamination in Probe n des Laufs MASSNAHMF I aif wiadarhnlan Lauf fehlgeschlagen MASSNAHMF auf wiederholen Positiv f r Pneumocystis DNA Probe negativ f r Pneumocystis DNA Negativkontrolle berpr fen Ct Wert beim PNE Test 39 0 bzw Nicht Aataltiart NEIN Lauf fehlgeschlagen MASSNAHME Lauf wiederholen NEIN Negativkontrolle berpr fen Ct Wert der IAC im Bereich 29 3 33 3 Positivkontrolle berpr fen Ct Wert beim PNE Test im Bereich 20 0 25 0 Patientenprobe berpr fen Ct Wert beim PNE Test lt 39 0 NEIN Patientenprobe berpr fen Ct Wert der IAC im Bereich 29 3 33 3 NEIN Amplifikation bei IAC fehlgeschlagen MASSNAHME Probe wiederholen Bei selbem Ergebnis besteht Verdacht auf Inhibitor in Probe Probe Ct Wert PNE Ct Wert IAC Interpretation Weitere Ma nahme MycAssay MycAssay Negativkontrolle 39 0 oder Nicht Im Bereich 29 3 33 3 Negativkontrolle Ergebnisse der detektiert akzeptabel Patientenproben sind valide Negativkontrolle 39 0 oder Nicht detektiert lt 29 3 oder gt 33 3 Negativkontrolle fehlgeschlagen Gesamten Lauf wiederholen Negativkontrolle lt 39 0 Im Bereich 29 3 33 3 Kontamination Gesamten Lauf wiederholen Positivkontrolle Im Bereich 20
18. genzien des MycAssay Pneumocystis Kits mit einer Probe die die Pneumocystis DNA Zielsequenz ein Abschnitt der gro en mitochondrialen Ribosomen Untereinheit von Pneumocystis enth lt erfolgt die DNA Amplifikation im Thermocycler Der Assay enth lt au erdem eine interne Amplifikations Kontrollsequenz IAC ein DNA Fragment das weder in Pneumocystis noch in anderen Pilz oder Bakteriengenomen und auch nicht im menschlichen Genom vorkommt um inhibitorische Substanzen im PCR Ansatz nachzuweisen und die Funktionalit t der Assay Reagenzien zu best tigen Zum Nachweis der amplifizierten DNA Zielsequenzen dienen die Molecular Beacons einzelstr ngige Oligonukleotid Hybridisierungssonden die eine Stamm Schleifen Struktur engl stem and loop structure bilden Die Schleife enth lt eine zu einer Zielsequenz komplement re Sondensequenz und der Stamm Sequenzstrang wird durch die Anlagerung der komplement ren Armsequenzen gebildet die an jeder Seite der Sondensequenz lokalisiert sind Das Ende des einen Arms ist kovalent mit einem Fluorophor der bei Anregung mit Licht geeigneter Wellenl nge fluoresziert verbunden 1 Morris A Lundgren JD Masur H Walzer PD Hanson DL Frederick T Huang L Beard CB Kaplan JE 2004 Current epidemiology of Pneumocystis pneumonia Emerg Infect Dis 10 1713 20 Miller RF Allen E Copas A Singer M Edwards SG Improved survival for HIV infected patients with severe Pneumocystis jirovecii pneumonia is
19. keit halber da die Daten in Tabelle 1 auch Patienten mit unbekanntem HIV Status einschlossen wurde auch die Punktwolke f r diese Gruppe in Abbildung 1 mit aufgenommen siehe S ule 3 Deutsch 11 030 163 Version 1 2 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Nur f r n vitro Diagnostik Stratagene Mx3000 Serie Respiratorische Proben 39 vs Ct Value vo N a be one o 0 il 2 3 4 Kategorie 1 HIV Mikroskopie 2 HIV Mikroskopie 3 HIV Status unbekannt Mikroskopie 4 Alle Mikroskopie Befunde Abbildung 1 Punktwolke Scatter Plot mit den Ct Werten der DNA Proben die aus Patientenproben des Respirationstrakts extrahiert wurden Vier Patientengruppen sind beschrieben Klinische Befundung Der MycAssay Pneumocystis Kit ist als Hilfsmittel zur Diagnose einer Pneumocystis Pneumonie vorgesehen Die Ergebnisse m ssen im Zusammenhang mit dem klinischen Zustand des Patienten und weiteren Ergebnissen diagnostischer Tests gesehen werden Nachfolgend werden Empfehlungen f r Befundungen angegeben wobei jede einzelne von der Interpretation der Assay Ergebnisse abh ngt Ergebnis Ziffer 1 Pneumocystis jirovecii nicht nachgewiesen Ergebnis Ziffer 2 Pneumocystis jirovecii nachgewiesen Positives Ergebnis Ct Wert angeben Ergebnis Ziffer 3 Test fehlgeschlagen Anwesenheit von Inhibitoren oder anderen unbekannten Substanzen Je niedriger der Ct W
20. n Sie Mikroliter Pipetten f r den Transfer von Fl ssigkeiten F r das Ansetzen der Reaktionen sollten separate Mikroliter Pipetten verwendet werden die regelm ig dekontaminiert werden sollten Es wird empfohlen Low Retention Filter Pipettenspitzen zu verwenden um sicherzustellen dass w hrend des Ansetzens keine DNA verloren geht Vorsicht beim Umgang mit R hrchen 4 Dieses enth lt Template DNA Material und eine Kontamination k nnte zu falsch positiven Testergebnissen f hren Tragen Sie w hrend der gesamten Prozedur Einmal Laborhandschuhe Alle R hrchen m ssen nach dem Gebrauch und vor der Entsorgung verschlossen sein Notieren Sie sich sorgf ltig die Probenpositionen wenn mehrere Proben verarbeitet werden Lassen Sie die Lampe bitte nach einem Lauf mindestens 1 Stunde lang abk hlen bevor Sie MycAssayTM Pneumocystis vorbereiten um das Auftreten falsch negativer Ergebnisse m glichst zu vermeiden Nach dieser Abk hlphase ben tigt die Lampe wie in Abschnitt 1 1 weiter unten erw hnt eine 20 minutige Aufw rmphase Testdurchf hrung 1 Ansetzen der Real Time PCR 1 1 Schalten Sie das Real Time PCR System der Stratagene Mx3000 Serie Ger t und zugeh rigen Computer ein und starten Sie die zugeh rige MxPro 4 10 Software Geben Sie falls erforderlich Nutzernamen und Passwort ein Die Lampe ben tigt 20 Minuten zum Aufw rmen Starten Sie den Lauf erst wenn die Lampe bereit ist 1 2 Stellen Sie sicher dass der Arb
21. n bzw Proben sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben Reaktion Reagenz Negativkontrolle Patientenprobe Positivkontrolle R hrchen 1 oranger Deckel 7 5 uL 7 5 uL 7 5 uL R hrchen 2 blauer Deckel 7 5 uL 7 5 uL 7 5 uL R hrchen 3 farbloser Deckel 10 uL Patientenprobe 10 uL R hrchen 4 schwarzer Deckel Gesamtvolumen 25 uL Pipettieren Sie die Reagenzien in derselben Reihenfolge wie sie in obiger Tabelle aufgelistet sind R hrchen 1 dann R hrchen 2 anschlie end die Template DNA Negativkontrolle Testprobe oder Positivkontrolle Entnehmen Sie die Aliquote aus R hrchen 1 vorsichtig die Fl ssigkeit ist etwas viskos und kann eventuell an der inneren Kante des R hrchens anhaften Falls dies geschieht zentrifugieren Sie nochmals kurz um den Inhalt vollst ndig am Boden des R hrchens zu sammeln bevor Sie erneut versuchen das gesamte Aliquot zu entnehmen Benutzen Sie f r jeden Pipettiervorgang eine neue Pipettenspitze Verschlie en Sie nach Gebrauch jedes R hrchen wieder und entsorgen Sie es mitsamt dem eventuell verbliebenen restlichen Inhalt unverz glich in einen verschlie baren Beh lter f r klinische Abf lle Nicht gebrauchte Reagenzien k nnen nicht f r sp tere Verwendung aufbewahrt werden Seien Sie beim Pipettieren der Positivkontroll DNA R hrchen 4 besonders vorsichtig und stellen Sie sicher dass kein anderes R hrchen oder Reaktionsgef damit kont
22. nbeutel f r eine Analyse ben tigt werden aber nur ein Satz Positiv und Negativkontrollen dann brauchen Sie die R hrchen 3 und 4 nur aus einem der Beutel zu entnehmen Mit R hrchen Nr 4 sollten Sie besonders vorsichtig umgehen Es enth lt Positivkontroll DNA Material und eine Kontamination k nnte falsch positive Testergebnisse verursachen Siehe beispielsweise Mifflin T E 2003 Setting up a PCR Laboratory In PCR Primer 2nd Ed eds Dieffenbach and Dveksler Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbour NY USA 030 163 Version 1 2 24FEB12 Deutsch 4 Nur f r In vitro Diagnostik MycAssay Pneumocystis Respiratorische Proben Stratagene Mx3000 Serie 1 7 _ co 1 10 2 1 2 2 2 3 Lassen Sie die R hrchen f r 5 10 Minuten bei Raumtemperatur auftauen vergewissern Sie sich dass der Inhalt jedes R hrchens vollst ndig aufgetaut ist bevor Sie mit dem n chsten Schritt fortfahren Mischen Sie den Inhalt der R hrchen und die Patientenproben kurz auf einem Laborsch ttler Vortex Zentrifugieren Sie anschlie end kurz in einer Mikrozentrifuge um den gesamten Inhalt vor Gebrauch vollst ndig am Boden der R hrchen zu sammeln Setzen Sie die ben tigte Anzahl PCR Reaktionsgef e in den St nder Pipettieren Sie die Negativkontrolle immer zuerst danach die Testproben Als Letztes sollte immer die Positivkontrolle hinzugegeben werden Die zu pipettierenden Volumina der Reagenzien und DNA L sunge
23. nd in einem anderen Gef im Vergleich zu den brigen Gef en erkennen Das Reagenz aus R hrchen 1 oder aus R hrchen 2 wurde nicht zur Reaktion pipettiert Wiederholen Sie den Lauf f hren Sie dabei das Ansetzen der Reaktionen mit gro er Sorgfalt durch Derartige Pipettier Fehler kann man an einem niedrigeren Fl ssigkeitsstand in diesem Reaktionsansatz im Vergleich zu den anderen Gef en erkennen Die Positivkontrolle befand sich nicht an der richtigen Position im Ger t Deutsch 9 030 163 Version 1 2 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Nur f r n vitro Diagnostik Stratagene Mx3000 Serie Respiratorische Proben gt Achten Sie darauf allen Reaktionsans tzen in der Software die korrekte Bezeichnung zuzuweisen und die PCR R hrchen Streifen in der richtigen Orientierung in das Ger t zu stellen Es wurden eventuell nicht empfohlene PCR R hrchen oder Platten verwendet gt Die Schwellenwerte sind nur bei Verwendung der empfohlenen PCR R hrchen Streifen und Deckel von Agilent Technologies Kat Nr 401428 und 401425 g ltig 4 4 Bei Patientenprobe n erscheint IAC failure Wahrscheinlich enth lt die aus der den Testprobe n extrahierte DNA PCR Inhibitoren gt Wir empfehlen die DNA mit dem MycXtra Pilz DNA Extraktions Kit MycXtra Fungal DNA Extraction Kit zu isolieren 4 5 In keinem Kanal wird ein Ergebnis erhalten weder bei einer Probe noch bei den Kontrollen Die Bedingungen unte
24. nem Cepheid Smartcycler Real Time PCR System validiert Einige der angegebenen Leistungsmerkmale des Assays wurden mit der Ger teplattform Mx3005P und unter Verwendung optischer PCR R hrchen mit Deckel von Agilent Technologies Kat Nr 401428 und 401425 erneut validiert Diese Untersuchungen sind im Folgenden wiedergegeben Analytische Sensitivit t Unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls Abschnitt Testdurchf hrung und eines bei Myconostica hergestellten rekombinanten Pneumocystis DNA Molek ls wurde eine Nachweisgrenze LoD f r Pneumocystis von lt 50 Kopien bestimmt Dieser Wert wurde mithilfe einer rekombinanten Plasmid DNA in die die Zielsequenz integriert war ermittelt Da die Pneumocystis Zielsequenz aus den Mitochondrien stammt liegen zahlreiche Kopien pro Zelle vor die genaue Anzahl ist aber nicht bekannt Die folgenden Daten zur Leistungscharakteristik wurden unter Verwendung des Cepheid SmartCycler Real Time PCR Systems erhalten Analytische Selektivit t Die analytische Selektivit t wurde mit DNA Proben untersucht die aus einer F lle verschiedener Pilz und Nicht Pilz Spezies extrahiert worden waren Bei folgenden Spezies wurde kein positives Ergebnis erhalten 030 163 Version 1 2 24FEB12 Deutsch 10 Nur f r In vitro Diagnostik MycAssay Pneumocystis Respiratorische Proben Stratagene Mx3000 Serie Alternaria alternata Aspergillus flavus A fumigatus A niger A terreus Blastomyces c
25. nen stammten bestimmt Zur Leistungsbewertung des MycAssay Pneumocystis Kits wurden in zwei Kliniken Proben durch bronchoalveol re Lavage BAL gewonnen Aus diesen wurde dann unter Verwendung des MycXtra Pilz DNA Extraktions Kits die DNA extrahiert die anschlie end gelagert und dann im Assay analysiert wurde Die erhaltenen PCR Ergebnisse wurden mit denen der Immunfluoreszenzmikroskopie verglichen PCR vs mikroskopische Diagnose Mikroskopie positiv Mikroskopie negativ PCR positiv 45 8 0 85 PPW PCR negativ 2 33 0 94 NPW 0 96 0 80 Sensitivit t Spezifit t Tabelle 1 Diagnostische Spezifit t und Sensitivit t des MycAssay Pneumocystis Kits im Vergleich zur Immunfluoreszenzmikroskopie Die in Tabelle 1 wiedergegebenen Daten entstammten Proben die Patienten mit diagnostizierter HIV Infektion Patienten ohne HIV Infektion und Patienten mit unbestimmtem HIV Status entnommen worden waren Bei Patienten mit einer Pneumocystis Pneumonie k nnen stark variierende Mengen an Organismen nachgewiesen werden je niedriger der Ct Wert desto h her die Wahrscheinlichkeit dass eine Erkrankung vorliegt Bei Patienten mit HIV und Pneumocystis Pneumonie wird tendenziell eine h here Anzahl an Organismen nachgewiesen als bei Patienten die nicht mit dem Virus infiziert sind allerdings ist die Uberlappung betr chtlich Die Punktwolke Scatter Plot in der folgenden Abbildung 1 zeigt diese berlappung Der Vollst ndig
26. r denen der Kit gelagert wurde entsprachen nicht den Angaben im Abschnitt Aufbewahrung dieser Gebrauchsanweisung oder das Verfallsdatum des Kits ist abgelaufen gt berpr fen Sie bitte dass der Kit unter korrekten Bedingungen gelagert wurde berpr fen Sie das Verfallsdatum der Reagenzien siehe Kit Schachtel oder Etikett auf Reagenzienbeuteln und wiederholen Sie den Lauf ggf mit einem Kit dessen Verfallsdatum noch nicht abgelaufen ist Das verwendete Ger t arbeitet nicht optimal gt berpr fen Sie bitte dass Ihr Real Time PCR Ger t ber eine regelm ig aktualisierte Wartungs Historie verf gt und vollst ndig kalibriert wurde so wie dies in der zugeh rigen Installations und Wartungsanleitung beschrieben ist Beim Software Setup wurde die falsche Protokolldatei verwendet gt Beachten Sie die Angaben in Abschnitt 2 und w hlen Sie von der Myconostica Protokoll CD ROM die korrekte Protokolldatei die f r die betreffende Software in der jeweiligen Version angegeben wird Nur die Datei die der installierten Software entspricht kann geladen werden Wiederholen Sie den Lauf mit der richtigen Protokolldatei Wenn Sie weitere Fragen haben oder Hilfe bei Problemen ben tigen setzen Sie sich bitte mit unserem Technischen Kundendienst productsupport lab21 com in Verbindung Leistungsmerkmale und Anwendungsgrenzen Analytische Leistungsdaten f r Thermocycler der Modellreihe Mx3000 Dieser Kit wurde urspr nglich mit ei
27. roben extrahiert wurde F r diesen Zweck werden der im Folgenden genannte DNA Extraktions Kit sowie die Adapterplatte f r einen Laborsch ttler Vortex empfohlen Beides ist von Myconostica Ltd erh ltlich und wurde bei der Validierung verwendet MycXtra Pilz DNA Extraktions Kit REF Nr 080 005 bei Myconostica erh ltlich Laborsch ttler Vortex Genie 2 von Scientific Industries Inc New York USA Deutsch 3 030 163 Version 1 2 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Nur f r n vitro Diagnostik Stratagene Mx3000 Serie Respiratorische Proben Adapterplatte f r Vortex Laborsch ttler REF Nr 080 015 bei Myconostica erh ltlich Hinweise zur Durchf hrung Lesen Sie das gesamte Protokoll bevor Sie mit der Durchf hrung beginnen Die Durchf hrung des MycAssay Pneumocystis Tests dauert ohne DNA Extraktion ungef hr zwei Stunden je nach Anzahl der zu analysierenden Proben Das Ansetzen der Reaktionen f r den Test sollte in einer PCR Workstation oder in einem Labor das r umlich vom PCR Labor getrennt ist durchgef hrt werden Falls eine PCR Workstation nicht zur Verf gung steht sollte das Ansetzen der Reaktionen in einem f r PCR geeigneten Bereich des Labors6 der regelm ig mit DNA Dekontaminations Reagenzien gereinigt wird erfolgen W hrend des Ansetzens der Real Time PCR Reaktionen sollten Sie allerdings keine DNA Dekontaminationsl sungen verwenden da sie die Reaktionen hemmen k nnten Verwende
28. rogramm f r diesen Assay zu importieren W hlen Sie dazu unter Thermal Profile Design die Option Custom und importieren Sie dann ber den Import Befehl dieselbe Datei wie unter 2 4 beschrieben Im Anschluss daran sollte die Einstellung des Temperaturprofils Thermal Profile Setup wie im folgenden Beispiel aussehen Thermal Profile Fe _ une r rammal pocite conma Pasgen 030 163 Version 1 2 24FEB12 Deutsch 6 Nur f r In vitro Diagnostik MycAssay Pneumocystis Respiratorische Proben Stratagene Mx3000 Serie 2 7 2 8 2 9 3 1 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 Benennen Sie auf der Plate Setup Registerkarte die Wells R hrchen entsprechend Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das zuvor markierte Well oder bei Wiederholproben auf eine Gruppe von Wells R hrchen und w hlen Sie Well Information aus der Liste der verf gbaren Optionen Tippen Sie den Namen der jeweiligen Probe im Eingabefeld Name ein Wenn alle Wells R hrchen ad quat benannt sind speichern Sie den Lauf unter einem geeigneten Dateinamen der das Datum und das Bedienerk rzel enth lt ab und starten Sie den Lauf durch Anklicken der Run Schaltfl che oben rechts auf der Registerkarte Instrument und anschlie enden Mausklick auf Start unten rechts auf dem Bildschirm Denken Sie daran dass das Ger t mindestens eine 1 Stunde lang abk hlen muss bevor Sie wieder mit Schritt 1 1 beginn
29. s die Pneumocystis Zielsequenzen enth lt Tris HCI Puffer Der Kit enth lt au erdem Mwyconostica Protokoll CD ROM f r den MycAssay Peumocystis Test Gebrauchsanweisung Analysenzertifikat Aufbewahrung Der Kit sollte bis zum Verfallsdatum das auf dem Etikett der Schachtel angegeben ist eingefroren 15 bis 25 C gelagert werden Danach sollte er gem den rtlichen Bestimmungen entsorgt werden Sobald eine Verpackung ge ffnet worden ist ist der Inhalt unmittelbar zu verwenden und darf nicht nochmals eingefroren oder erneut verwendet werden Erforderliche Ausstattung Materialien nicht im Lieferumfang enthalten Stratagene Real Time PCR System der Modellreihe Mx3000 inklusive Benutzerhandbuch angeschlossenen Computers und MxPro Software Version 4 10 Optische PCR R hrchen Streifen Agilent Technologies Kat Nr 401428 Deckel f r optische PCR Streifen Agilent Technologies Kat Nr 401425 Mikrozentrifuge mit passendem Adapter f r 0 2 mL PCR Reaktionsgef e Laborsch ttler Vortex Rack f r PCR Reaktionsgef e Mikroliter Pipetten Volumenbereich 7 5 20 uL Sterile Low Retention Filter Pipettenspitzen Einmal Handschuhe puderrfrei Anwendereigene DNA Dekontaminationsl sung Permanent Markerstift f r wasserfeste Beschriftung DNA Extraktions Kit siehe unten Probe Als Ausgangsprobe f r den MycAssay Pneumocystis Assay wird Gesamt DNA verwendet die aus klinischen Patientenproben BAL P
30. tagene Mx3000 Serie Respiratorische Proben New Options Select experiment project type Real time Quantitative PCR Multiple Standards Comparative Quantitation Calibrator C SYBR Green with Dissociation Curve EvaGreer with Dissociation Curve Allele Discrimination SNP s Real Time C Molecular Beacon Melting Curve Plate read Quantitative Plate Read C Plate Read Allele Discrimination Project type Multiple Experiment Analysis R Turm lamp on for warm up I Don t show this again 2 4 Klicken Sie in der Registerkarte Plate Setup auf die Import Schaltfl che am rechten Bildschirmrand W hlen Sie aus der Drop down Liste unter Look In die Option MycAssay PNE Myconostica Protocol CD ROM Importieren Sie dann die Datei mit dem Namen MycAssay Pneumocystis v3_1 mxp Klicken Sie auf Finish Im Anschluss daran sollte das Plate Setup wie im folgenden Beispiel aussehen ee ors Ponie soap un an mn meren ra oc 2 5 Es wird empfohlen f r leere Wells R hrchen den Well Typ auf Leer lt blank gt in der Drop down Liste Well Type einzustellen um Interferenzen mit den Signalen aus den Wells R hrchen in denen sich die Reaktionsans tze befinden durch Lichtbrechungen hervorgerufen durch den Kunststoff zu vermeiden 2 6 Wiederholen Sie den Import Vorgang auf der Thermal Profile Setup Registerkarte um das PCR P
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