Home

Differentielle Gentranskription bei Hypobiose induzierten und nicht

1. konservierte Dom ne Sequenz L3ni 16 Myosin Schwanz 860 aa pfam01576 95 5 Smc Chromosomen trennende ATPasen 61 4 1163 aa COG1196 nicht charakterisiertes konserviertes Protein Fonte ES BE 22l aa KOG3264 95 5 81 0 683 570 55 2 verschiedene Cu Zn Superoxiddismutasen L3ni 69 92 152 aa pfam00080 96 1 154aa KOG0441 95 5 179 aa COG2032 77 7 L3i 53 FGGY Familie der Karbohydrat Kinasen 100 224 aa pfam02782 Glycerol Kinase 499 aa COG0554 98 8 FGGY Familie der Karbohydrat Kinasen 98 8 245 aa pfam00370 Ribulose Kinase und verwandte Karbo 98 4 hydrat Kinasen 5l6aa KOG2517 Zucker Kinase 502 aa COG1070 95 0 Ribulose Kinase 544 aa COG1069 94 1 Tab 6 Sequenzidentitaten der differentiell transkribierten cDNA Sequenzen mit konservierten Dom nen Ergebnisse 163 konservierte Dom ne Sequenz L3i 75a L3i 75b Patatin hnliche Phospholipase 178 aa 98 9 98 9 pfam01734 vorhergesagte Esterase der alpha beta Hydro 95 4 57 5 lase Superfamilie 306 aa COG1752 intrazellul re membrangebundene Kalzium 739 61 1 unabh ngige Phospholipase Az 326 aa COG1752 vorhergesagte Esterase der alpha beta Hydro 55 8 55 8 lase Superfamilie 292 aa COG4667 Patatin 229 aa COG3621 52 8 52 8 Nikotinamid N Phenylethanolamin N und L3i 82a 101 L3i82b L3i82c L3i82d L3i82e Thioester S Methyltransferase Familie r R 261 aa pfam01234 98 9 75
2. neensenns 67 In der cDNA Synthese verwendete Oligonukleotide uneneeseeesneeennnennesnnennne nennen 67 Formel zur Errechnung der Schmelztemperatur Tm von Oligonukleotiden 69 Adaptersequenzen und in den PCRs verwendete Primer cccecccessseeseeeseeeteeeteeesseesees 83 Schema der Suppression PCR cccecccesssesseesseeeseeeseeeseeeseecseecsaecaeceaeceseceseeseeseeeseeeenseeesees 86 Schematische Darstellung der RACE unnnnnnssennsennsensenneennennnnnenn nennen 106 In der RACE verwendete Oligonukleotide 0 20020nnenneennneennennennnnenne nennen en 107 Prinzip der qPCR mit TaqMan bzw TaqMan MGB Sonden eene 112 Primerkombinationen zur Amplifikation der EF 1a und Tubulin Fragmente 113 In der qPCR verwendete Primer und TaqMan eesensnsnsessensensensnenne 116 In der qPCR verwendete Primer und TaqMan Y MGB Sonden eeene 118 Primer zur berpr fung der Sequenzen daf 12 0 und daf 16A u naeeeeee 123 Bestimmung der optimalen Zyklenzahl mit L3i cDNA und LD PCR 126 Restriktionsenzymspaltung mit Rsal unsensennseenseensnennneeenenennnennnenennse nennen nn 127 Nach Restriktionsenzymverdau aufgereinigte CDNA nennen 128 Analyse der Ligationseffizienz unsssssesensessensnensennnsnennennnnnonneensennnnn onen 129 Suppression PCR
3. Die gr te Bedeutung bei der Lungenwurmbek mpfung kommt heutzutage den makrozykli schen Laktonen wie Ivermectin Doramectin Eprinomectin und Moxidectin zu welche eine schlaffe Paralyse des Parasiten bedingen UNGEMACH 1994 Diese Substanzen bewirken eine mindestens 99 ige Reduktion der Wurmb rde und zeichnen sich zudem durch eine sehr gute Langzeitwirkung aus GOUDIE et al 1993 JONES et al 1993 WEATHERLEY et al 1993 YAZWINSKI et al 1994 WHELAN et al 1995 HUBERT et al 1995 SCHNIEDER et al 1996c HUBERT et al 1997 STROMBERG et al 1999 EPE et al 1999 CRAMER et al 2000 Das zyklische Depsipeptid PF 1022A ist ein Vertreter einer neuen Stoffklasse mit antiparasi t rer Wirkung und stellt ein Fermentationsprodukt des Pilzes Mycelia sterilia dar SAMSON HIMMELSTJERNA et al 2000 Die Autoren konnten bereits drei Tage nach Gabe von 1 mg kg PF 1022A intraven s respektive 5 mg kg per os eine Reduktion der Lungenwurmlar ven von tiber 99 feststellen Hypobiotische Parasitenstadien weisen eine herabgesetzte Stoffwechselrate auf und sind da her in der Lage lange Perioden zu tiberdauern ARMOUR u BRUCE 1974 EYSKER 1993 Diese geringere metabolische Aktivit t wird mit einer verminderten Suszeptibilitat gegen ber Anthelminthika in Verbindung gebracht ANDERSON et al 1965a MICHEL 1967 AN DERSON 1977 Untersuchungen von WILLIAMS et al 1997 best tigen dies f r Oxfenda zol und Fenbendazol W hrend die Wirksamkeit
4. ELISA in lungworm infection Vet Rec 118 252 BALSINDE J I D BIANCO E J ACKERMANN K CONDE FRIEBOES u E A DENNIS 1995 Inhibition of calcium independent phopholipase A prevents arachidonic acid incorporation and phospholipid remodeling in P388D macrophages Proc Natl Acad Sci USA 92 8527 8531 BALSINDE J u E A DENNIS 1997 Function and inhibition of intracellular calcium independent phospholipase A2 J Biol Chem 272 16069 16072 BARGIEL Z E WASILEWSKA u B A SHISOV 1970 Adrenaline A and noradrenalin NA in tissue of Ascaris suum Goeze 1782 Nematoda Bull Acad Pol Sci Biol 18 287 288 BARGMANN C I u H R HORVITZ 1991 Control of larval development by chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans Science 251 1243 1246 BARTH D u J M PRESTON 1987 Treatment of inhibited Dictyocaulus viviparus in cattle with ivermectin Vet Parasitol 25 61 66 BASCAL Z J M CUNNINGHAM L HOLDEN DYE M O SHEA u R J WALKER 2001 Characterization of a putative nitric oxide synthase in the neuromuscular system of the parasitic nema tode Ascaris suum Parasitology 122 219 231 BASCAL Z A MONTGOMERY L HOLDEN DYE R G WILLIAMS u R J WALKER 1995 Histochemical mapping of NADPH diaphorase in the nervous system of the parasitic nematode Ascaris suum Parasitology 110 625 637 BAUER C T STEINBACH C HERMOSILLA I M DAMRIYASA H H L SASSE u H ZAHNER 2003
5. Tab 5 Sequenzidentit ten und Sequenz hnlichkeiten auf Aminos ureebene 160 Ergebnisse reese Teil Iden Ahn TENIOEDHSCHE Teien bereich tit t lichkeit L3i 75a Kalzium unabh ngige Phospholipase A 546 aa von C elegans 503aa 52 69 NP_500969 1 hypothetisches Protein 546 aa von C briggsae CAE61557 1 548aa 51 66 Weitere signifikante Homologien Kalzium unabh ngigen Phospholipasen A anderer Orga nismen z B H sapiens und M musculus werden hier nicht weiter aufgef hrt L3i 82a Phenylethanolamin N Methyltransferase 283 aa von C elegans 254aa 61 74 L3i 101 NP_505563 1 Phenylethanolamin N Methyltransferase Homolog 315 aa 227aa 39 56 von C elegans S27784 bei dieser Isoform nicht signifikant Mitglied der Phenylethanolamin N Methyltransferase Familie 248 aa 36 56 273 aa von C elegans NP_498914 1 bei dieser Isoform nicht signifikant L3i 88a _Guanylyl Cyclase gcy 34 686 aa von C elegans 18laa 53 67 NP_506319 1 gcy 32 646 aa l sliche Guanylyl Cyclase 684 aa und ein 177aa 49 67 hypothetisches Protein 699 aa von C elegans NP_506452 3 CAC35530 1 und T18984 Weitere signifikante Homologien mit Guanylyl Cyclasen von C elegans und anderen Orga nismen z B M musculus mit hnlichen Identit ts und hnlichkeitsverh ltnissen werden an dieser Stelle nicht weiter aufgef hrt L3i 88 2 Guanylyl Cyclase gcy 36 663aa und ein hypothetische
6. ber 41 bp Letztgenannte Identit t fand sich auch mit dem Cosmid bei welchem sich die bereinstimmungen jeweils auf den Folgestrang bezogen Weitere hnlich signifikante ber einstimmungen mit Paramyosinsequenzen anderer Organismen wie D immitis C briggsae B malayi und W bancrofti werden an dieser Stelle nicht n her beschrieben Auf einer L nge von 173 bp war die Sequenz L3ni 51 zu 78 identisch mit der mRNA f r den Vorl ufer eines exkretierten sezernierten Proteins sowie einem Cosmid von C elegans NM _070441 1 bzw CEY73F8A Mit denselben Sequenzen bestand des Weiteren eine 88 ige sowie 85 ige bereinstimmung ber 53 bp bzw 49 bp hinweg wobei sich die ge nannten Identit ten bei dem Cosmid auf den Folgestrang bezogen Eine 84 ige Teilidentit t ber einen 77 Nukleotide umfassenden Sequenzbereich zeigten die zusammengesetzten Sequenzen L3i 75a und L3i 75b mit einer Kalzium unabh ngigen Phos pholipase A von C elegans NM _068568 1 F r die Sequenzen L3i 100a und L3i 100b ergab sich mit einem Mitglied der Calmodulin Familie von C elegans NM_073746 1 eine 82 ige bereinstimmung welche 131 bp um fasste Mit einem Cosmid desselben Organismus CEE02A10 bestand ber 104 Nukleotide eine Teilidentit t von 82 Mit der Sequenz L3i 100c konnten keine signifikanten Identit ten festgestellt werden 4 9 5 2 Sequenzidentit tsvergleich auf Aminos ureebene Die mit dem Programm Align Plus bersetzte
7. und der sich anschlie enden Verifizierung als differentiell transkribiert angesehen werden L3i Position auf Klon der Membran 2 A2 8 A8 10 Al0 14 B2 18 B6 19 B7 25 Cl 26 C2 29 C5 33 C9 46 D10 51 E3 53 E5 L3i Position auf Klon der Membran 64 F4 68 F8 69 F9 71 F11 75 G3 82 G10 86 H2 88 H4 90 H6 94 H10 99 13 100 14 101 I5 L3ni Position auf Klon der Membran 7 A7 16 B4 18 B6 19 B7 20 B8 22 B10 28 C4 32 C8 41 D5 51 E3 54 E6 56 ES 57 E9 L3ni Position auf Klon der Membran 63 F3 67 F7 69 F9 75 G3 80 G8 83 Gill 91 H7 92 H8 103 17 Tab 2 Klone mit differentiell transkribierten Inserts 144 Ergebnisse 4 8 1 Darstellung der Inserts Alle Klone mit differentiell transkribierten Insert Sequenzen wurden nach einer Midiprep einem EcoRI Verdau unterzogen Neben der verdauten Plasmid DNA wurden als Kontrolle jeweils auch die entsprechenden auf die Nylonmembranen aufgebrachten cDNA Proben mit tels 2 iger Agarosegele elektrophoretisch aufgetrennt Befanden sich infolge einer vorhan denen Erkennungssequenz von EcoRI in der Insertsequenz zwei Banden im Agarosegel ent sprach die Summe der Fragmentl ngen der Bandenl nge der jeweiligen cDNA Probe War im Insert keine EcoRI Schnittstelle vorhanden lagen die Banden der Inserts und der zugeh rigen cDNA Probe stets auf gleicher H he Somit konnte davon ausgegangen werden dass die Klone tats chli
8. 5 9 berpr fung der Hypobiosef higkeit des Laborstammes Suppression Subtractive Hybridization Subtrahierte cDNA Banken Differential Screening und Southern dot blotting Charakterisierung ausgew hlter differentiell transkribierter Genfragmente Uberpr fung der genspezifischen Primer Rapid Amplification of cDNA Ends RACE Komplettierung der differentiell transkribierten cDNA Sequenzen Transkriptvarianten Translation der differentiell transkribierten Sequenzen Differentiell transkribierte Gene bei D viviparus L3ni assoziierte Gene L3i assoziierte Gene berpr fung der differentiellen Transkription mittels konventioneller PCR Quantitative real time PCR qPCR daf und age 1 spezifische PCR Zusammenfassende Beurteilung und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 9 1 Genspezifische Primer der RACE und SL1 PCR 9 2 Accession Nummern differentiell transkribierten Sequenzen 9 3 Identit ten und hnlichkeiten der Aminos ure Isoformen 9 4 Aminos ure Alignments der differentiell transkribierten Sequenzen 9 4 1 Alignment der L3ni 22 Sequenzen 9 4 2 Alignments der Aminos ure Isoformen 9 5 Primer und Annealingtemperaturen der daf und age 1 spezifischen PCR 9 6 Verzeichnis der verwendeten Abk rzungen 9 7 Abbildungs und Tabellenverzeichnis 178 179 180 182 183 184 184 184 185 187 188 189 190 192 198 199 202 204 206 208 210 246 246 248 249 250 251 260 263 266 Ein
9. Kopien Ansatz als 25 ul Reaktionen Komponentenzusammensetzung s 3 15 6 eingesetzt Die Messung der Fluoreszenz erfolgte jeweils in der kombinierten Annealing und Extensi onsphase der unten aufgef hrten two step PCR Aktivierung der Polymerase 95 C 10 Minuten Ab l Denaturierung 94 C 20 Sekunden x Primerannealing und extension 52 C 1 Minute 3 15 6 qPCR mit TaqMan MGB Sonden Da sich die qPCR mit TaqMan Sonden als schlecht reproduzierbar herausstellte wurden zur weiteren Durchf hrung TaqMan MGB Sonden eingesetzt Als Reporterfarbstoff am 5 Ende der Sonden diente FAM Am 3 Ende der Sonden befand sich neben einem nicht fluo reszierenden Quencher NFQ respektive dark Quencher auch der MGB Das Design dieser Sonden und der zugeh rigen Primer erfolgte mit dem Softwareprogramm Primer Express der Firma APPLIED BIOSYSTEMS Die Synthese der Sonden wurde bei APPLIED BIO SYSTEMS in Auftrag gegeben die Primersynthese erfolgte bei der Firma INVITROGEN 118 Material und Methoden Bezeichnung Sequenz 5 gt 3 Ta Primer SOD MGB for TGG ACG AGC CGT TGT CAT T 59 C Primer SOD MGB rev TTA GGC CTT GGC AGA TCG G 60 C Sonde SOD MGB 6 FAM ATG CCG ATG CAG ATG A MGBNFQ 69 C Primer PNMT MGB for CCA CAA AAT CGC CAA GAG CTA 59 C Primer PNMT MGB rev TTC GAG TTT TGA TTG GTC CCA 59 C Sonde PNMT MGB 6 FAM TGC GGT GGT ATG AGG GA MGBNFQ 70 C Primer EF 1a MGB for GGT GGG ATT GAC AAA AGA AC
10. ttennprkgspssrtglegrsuslqantvnsydivkakcaaekkrleaeg kingietkieddslisaspparkrahtivatdelkeipkvsppnlkekEg Anhang 259 L3i 100a 1 aanstlredlsamaslsarq rgalurnkptektcgkgptmietiklk L3i 100c 1 z L3i 100b 1 47 47 260 Anhang 9 5 Primer und Annealingtemperaturen der daf und age 1 spezifischen PCR Bezeichnung Sequenz 5 3 Annealingtemperatur dap tons ACA GTA CCC CGA CCC TAT CC daf tev GGA CGG AAG CTG CTA CAA oe NEE CCA GGC CCG CAG TCA dafi rev CAG CAC CGT CGC CCA TTG TAA II daB tor TAC CAA TGT GCC GAT GTC TAC TCA daf 1B rev ATC CCG ATC GGT CCA CTC AAT A 27 daf 1C for CGA GCG CCC GTT TCA CC daf IC rev ACT ATC CGC GGA GCA CCA TTT G ES IE ATT GGA GGC CGT TCG CTG ATT daf 2 rev GCC TGC CGT CGC CTT GAT AG RES daf 2A for CGC CCG GTT GTT GTT CGT GTT C daf 2A rev GTT GGA GCC GGT GTG GAT GTG G ur daf 2B for TTC TCT ATC CGC GTG CCA AAA CAT daf 2B rev TGC CGT AGC TCC CAA TCG TCT GC or apie TTG TCA CTT CTG GGT ATC TC dares CGT TCT GGG TAT GCT TCT CC a ee daf 3A for CGC CGC CAC ATC AAC GCT ACC dakie GCA ACT CGG CCC ATT CATBTCC ATA pee daf 3B for AAT TCG CTT TTC CTA CAA dip Bae GAA GCG CGT CTC TGA TGA ee daf 4 for ATG ACG ACA GGC CGT ACT TC daf A tev ATG TAG CGT TTC GTT CCC AC aon daf AA for GCG CCG AGA AAA TTG GTG ATG daf 4A rev AAT AAT TGG CTT CTT TGG GTG TCC ar daf AB for GCC TCG CCC GAA TCT ACA GC daf 4B rev CTC GCG AAC GCA CAT CCAG a Anhang 261 Be
11. 1000 bp 400 bp 250 bp 200 bp 100 bp Oligonukleotide L3i L3ni HSM Abb 17 Restriktionsenzymspaltung mit Rsal 1 2 iges Agarosegel M 250 bp DNA Ladder Low DNA MASS Ladder 1 unverdaute cDNA 2 verdaute cDNA 4 3 4 Gelanalyse der extrahierten und aufgereinigten Proben Die cDNA Aufreinigung mittels S ulenchromatographie bedingte eine Entfernung s mtlicher cDNA Fragmente mit einer L nge von weniger als 100 bp Wie aus Abb 18 ersichtlich ist die in Abb 17 erkennbare Bande der Oligonukleotide nicht mehr vorhanden 128 Ergebnisse 5000 bp 2000 bp 1200 bp 1000 bp 0 400 bp ED 200 bp M L3i L3ni HSM M Abb 18 Nach Restriktionsenzymverdau aufgereinigte cDNA 1 5 iges Agarosegel M 250 bp DNA Ladder Low DNA MASS Ladder 4 3 5 Konzentrationsbestimmung der cDNA Lo sung Durch eine photometrische Konzentrationsmessung konnte best tigt werden dass die L3ni L3i und HSM cDNA nach der Ethanolfallung eine fiir die Adapterligation erforderliche Konzentration von mindestens 300 ng ul aufwies cDNA Konzentration Reinheit L3ni 499 5 ng ul 1 765 L3i 956 5 ng ul 1 798 HSM 323 ng ul 1 753 4 3 6 Analyse der Adapterligationseffizienz Durch Intensit tsvergleich der entstandenen Banden bei Verwendung eines genspezifischen Primerpaares GSP for und GSP rev sowie der Kombination aus genspezifischen R ckw rts Ergebnisse 129 primer GSP rev und dem an die komplement re Adaptersequenz bindenden PCR Pr
12. 151 tpecdig eqaerhyaklheyylhlweilkgkyrnfinldetlqqvreftine 201 Linrwngtgtnyqtntkkkydgehpkyrhsnr er A In Richtung verl ngerte L3ni 22 Sequenz ohne Poly A Ende B In Richtung verl ngerte L3ni 22 Sequenz mit Poly A Ende Anhang 251 9 4 2 Alignments der Aminos ure Isoformen L3ni56a 1 trofttkrvvhldhyletcsnpeqistngqrsswmdrsdddaeqgqqaaltsm L3ni 56b L3ni 56c L3ni 56d L3ni 56e pyoacqelilygqsaytfadnipdlerrltglcdpgqstethehd lstslrtgtd 252 Anhang L3i10b 1 wl flselflifvatfytintslycylllpnnmiyltyqinsitnlrasrate L3i 10a Spee oes se reg pees initkiqmnsggsnisntttpsldlqvyllstmpdtakltsltnmkEnstsn Anhang 253 L3i 33a l csn hhhrydovgtpsdaiktarekhrsvsasesaavripeavstgteta L3i 33b L3i 33c elttseldpskvlgsvsrtpyvdpwasrcgqgqwalpptdrpttenpslvddd dnssullkdlekiwatpyygasyishrpapyptsilaptavrttahdtapp ekprotkig egqgqrditkrre 254 Anhang L3i 75a L3i 75b lyvrrnmskiedasarllqkptivqlntrrtdamdgrdyihvdryynly kEy Ewyuclkp Anhang 255 L3i 82a ii fswl LillihiliilElcglekektkirtlamesadgenlEgailde L3i 82b L3i 82d L3i 82c L3i 82e dtfhketnteaylkedftytkvedsanqmyliflpnivariqkikryldtga ifcveyccktydeyknalikni tqqireqqtlwmgqgqileetwestqqrmts clyitkenmminaieeaglriendckcimynidnmtmlcarkantisdnts 256 Anhang L3i 82a L3i 101 Anhang 257 L3i 88b ptlnlgqldenneqlekytkeletertktesayvlusilpptianhlinnehi L3i 88c L3i 88a L3i 88d L3i 88 2 lyerslnksweiigrerdepfmplsngssspshttlt lriwvimduksl 258 Anhang
13. 1990 Recovery of different stages of Dictyocaulus viviparus from cattle lungs by a combination of a perfusion and a Baermann technique Res Vet Sci 49 373 374 220 Literaturverzeichnis EYSKER M E W CLAESSENS T J LAM M J MOONS u A PIJPERS 1994 The prevalence of patent lungworm infections in herds of dairy cows in The Netherlands Vet Parasitol 53 263 267 FERNANDEZ A S C A FIEL u P E STEFFAN 1999 Study on the inductive factors of hypobiosis of Ostertagia ostertagi in cattle Vet Parasitol 81 295 307 FLEMING M W 1993 Catecholamines during development of the parasitic nematode Haemonchus contortus Comp Biochem Physiol C 104 333 334 FRANDSEN J C u L W BONE 1988 Derivatives of epinephrine norepinephrine octopamine and histamine formed by homogenates of Trichostrongylus colubriformis a nematode parasite of ruminants Comp Biochem Physiol C 91 385 387 FRANK G R R P HERD K S MARBURY u J C WILLIAMS 1986 Effects of transfer of Ostertagia ostertagi between northern and southern U S A on the pattern and frequency of hypobiosis Int J Parasitol 16 391 398 FRANK G R R P HERD K S MARBURY J C WILLIAMS u E R WILLIS 1988 Additional investigations on hypobiosis of Ostertagia ostertagi after transfer between northern and southern U S A Int J Parasitol 18 171 177 FREEMAN W M S J WALKER u K E VRANA 1999 Quantitative RT PCR pit
14. 1992 Genetic analysis of chemosensory control of dauer formation in Caenorhabditis elegans Genetics 130 105 123 VOWELS J J u J H THOMAS 1994 Multiple chemosensory defects in daf 11 and daf 21 mutants of Caenorhabditis elegans Genetics 138 303 316 WALHOUT A J M J REBOUL O SHTANKO N BERTIN P VAGLIO H GE H LEE L DOUCETTE STAMM K C GUNSALUS A J SCHETTER et al 2002 Integrating interactome phenome and transcriptom mapping data for the C elegans germline Curr Biol 12 1952 1958 WALKER R J Z BASCAL A R WHITE S PEDDER C J FRANKS Y MUNEOKA u L HOLDEN DYE 1995 Actions of neuroactive peptides and nitric oxide on Ascaris Achantina and Helix tissues Acta Biol Hung 46 183 193 WANG J u S K KIM 2003 Global analysis of dauer gene expression in Caenorhabditis elegans Development 130 1621 1634 Literaturverzeichnis 243 WANG Y C L LIU J D STOREY R J TIBSHIRANI D HERSCHLAG u P O BROWN 2002 Precision and functional specifity in mRNA decay Proc Natl Acad Sci USA 99 5860 5865 WARD S J N THOMSON J G WHITE u S BRENNER 1975 Electron microscopical reconstruction of the anterior sensory anatomy of the nematode Caenorhabditis elegans J Comp Neurol 160 313 338 WARE R W D CLARK K CROSSLAND u R RUSSEL 1975 The nerve ring of the nematode Caenorhabditis elegans Sensory input and motor output J Comp Neurol 162 71 110 WATKINS
15. 68 69 69 L3i 75b Kalzium unabh ngige Phospholipase A2 Teilbereich 393 aa 546 aa von C elegans NP_500969 1 Identit t 53 Ahnlichkeit 72 hypothetisches Protein 546 aa von C Teilbereich 438 aa briggsae CAE61557 1 Identit t 51 Ahnlichkeit 67 L3i 82b L3i82c L3i82d L3i82e Phenylethanolamin N Methyltransferase Teilbereich 190 aa 191 aa 190 aa 158 aa 283 aa von C elegans NP_505563 1 Identit t 61 61 61 61 Ahnlichkeit 72 72 72 72 Phenylethanolamin N Methyltransferase Teilbereich 185 aa 186 aa 185 aa 135 aa male G13 an baw fami memba lige 40 409 0m 42 NP 498914 1 Ahnlichkeit 56 56 56 57 L3i 88b L3i88c L3i88d Guanylyl Cyclase gcy 34 686 aa von Teilbereich 137 aa 126 aa 112 aa C elegans NP_506319 1 Identit t 57 52 55 Ahnlichkeit 72 69 71 gcy 32 646 aa l sliche Guanylyl Teilbereich 137 aa 126 aa 112 aa crease am umdeimhpoiche denice 38 47 0 NP_506452 3 CAC35530 1 T18984 Ahnlichkeit 70 65 68 L3i 100b L3i 100c calmodulin family member 202 aa von Teilbereich 180 aa C elegans NP_506147 1 Identit t 82 l nicht i signifikant Ahnlichkeit 90 hypothetisches Protein 201 aa von C Teilbereich 180 aa 181 aa briggsae CAE75516 1 Identit t 87 61 Ahnlichkeit 90 69 250 Anhang 9 4 Aminos ure Alignments der differentiell transkribierten Sequenzen 9 4 1 Alignment der L3ni 22 Sequenzen 101 nkfpdlkvvdverntntdcdslknyeeikiisdctkniteierypriftrp
16. A R u M A FERNANDO 1984 Arrested development of the rabbit stomach worm Obeliscoides cuniculi manipulation of the ability to arrest through processes of selection Int J Parasitol 14 559 570 WEATHERLEY A J C HONG T J HARRIS D G SMITH u N C HAMMET 1993 Persistent efficacy of doramectin against experimental nematode infections in calves Vet Parasitol 45 50 WELFORD S M J GREGG E CHEN D GARRISON P H SORENSEN C T DENNY u S F NELSON 1998 Detection of differentially expressed genes in primary tumor tissues using representational difference analysis coupled to microarray hybridization Nucleic Acids Res 26 3059 3065 WELSH J K CHADA S S DALAL R CHENG D RALPH u M McCLELLAND 1992 Arbitrarily primed PCR fingerprinting of RNA Nucleic Acids Res 20 4965 4970 WELSH J J P LIU u A EFSTRATIADIS 1990 Cloning of PCR amplified total cDNA construction of a mouse oocyte cDNA library Genet Anal Tech Appl 7 5 17 WELSH J u M McCLELLAND 1990 Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers Nucleic Acids Res 18 7213 7218 WELSH J u M McCLELLAND 1991 Genomic fingerprinting using arbitrarily primed PCR and a matrix of pairwise combinations of primers Nucleic Acids Res 19 5275 5279 WHELAN N C W A G CHARLESTON W E POMROY u A M ALEXANDER 1995 Evaluation of the efficacy of doramectin against an artificial infection of Dictyocaulus vivipar
17. Annealingtemperatur daf 18A for GAG TCG GTG GTC CAT TTG AGA TAC daf 18A rev ATG CCA GAT TGC CGA ACA CTT une daf 8B for AAG GTG AAG CCG GCA ACT GAA GAC daf 18B rev CCG GCC GTA TTT GGA TGGG TAT GA EL daf 18C for AAA AGC CTT CGT TGA CCA GTT G daf 18C rev CTT TGC CAG TTT CTT TCA CCA TTT E daf 19 for ACT ACT ATG GCA TCC GTC TGA AGG daf 19 rev CGG TAG CTG CAT TGG CGG AGT GT ee daf 9A for AAC AAC GCC TTC AAG CAT AAC C daf 19A rev ATC GGC CAG CAA CCT AAT CAG AGT Da SEE GAA AAT GGA GCA AGG ATA GGC age 1 rev CAC GAT CAG TCC ACA CAA ATG Pee En daf 23 for CGA AAT TAG AGC TCC ACG GCA CTT daf 23 rev CGG GCA CGA TTC ACC AAC A ane daf 23A for CGC TGG CAT CAA AAT CTA CAA CAA daf 23Arev CGG CAT TCG AAC TCT ACC ACC ATA Se daf 23B for ACG TCC GTT AAT GCT TCA CTG daf 23B rev ACT GCG TAC GGG TTC AAA DF nach RICKLING 1999 Anhang 263 9 6 Verzeichnis der verwendeten Abk rzungen A aa Abb Aqua bidest AP BLAST BSA bp bzw C C C 1 bzw C2R C a ca cDNA CDS Primer cAMP cGMP C l cm Ct CV daf dATP dCTP dd DEPC dGTP DNA dNTP dTTP Adenin Aminos ure n engl amino acid Abbildung lat Aqua bidestillata zweifach destilliertes Wasser alkalische Phosphatase basic local alignment search tool bovines Serumalbumin Basenpaar e beziehungsweise Grad Celsius Cytosin Kontroll DNA 1 bzw Kontroll DNA 2 Kalzium circa komplement re DNA engl complementary DNA
18. BAUER et al 2003 In England und Wales wurden 1993 vermehrt Diktyokauloseausbriiche verzeichnet wobei eine hohe Zahl erkrankter lterer Tieren registriert wurde DAVID 1993 Auch PLOEGER 2002 stellt einen Wechsel von K lbern hin zu erwachsenen Tieren bez glich der Inzidenz der Ausbr che fest was mehrere Autoren mit einer unzureichenden Immunisierung ersts mmriger K lber in Zusammenhang bringen Die sehr gute Wirksamkeit verschiedener Pr parate in Verbindung mit deren strategischen Einsatz verhindert insbesondere in Gebieten mit geringem Infektionsdruck eine gewisse Weidekontamination wie sie zur Entwicklung einer protektiven Immunit t n tig w re CONNAN 1993 DAVID 1993 OAKLEY 1993 SCHNIEDER et al 1996c untersuchten in einer Zweijahresstudie vergleichend die Immuni t tsbildung von ersts mmrigen mit einem Ivermectin Bolus behandelten K lbern im Gegen satz zu einer unbehandelten Kontrollgruppe In der zweiten Weideperiode waren die unbe handelten Tiere besser gegen eine klinische Diktyokaulose gesch tzt was durch st rkere Ge wichtszunahmen und geringere Larvenausscheidung im Vergleich zu den im Vorjahr behan delten Tieren offensichtlich wurde 24 Schrifttum 2 1 6 3 Vakzinierung PFEIFFER u SUPPERER 1980 empfehlen vor allem in endemischen Gebieten die Impfung ersts mmriger K lber und auch lterer Tiere wenn diese l ngere Zeit keinen Lungenwurm kontakt hatten Das Impfvorhaben sollte dabei immer alle gemei
19. BIOZYM kamen Negativ sowie teilweise Positivkontrollen zum Einsatz 3 7 6 Darstellung von Nukleins uren durch Agarosegelelektrophorese Agarosegele wurden zur Kontrolle von Amplifikationsprodukten Restriktionsenzymspaltun gen sowie Aufreinigungen genutzt Zur Herstellung der Gele wurde die Agarose Agarose NEEO Ultra Qualit t Rotiagarose ROTH in einer Konzentration von 1 bis 2 in 1x TAE Puffer durch Aufkochen gel st Nach dem Abk hlen auf ca 52 C wurde der Farbstoff GelStar BIOZYM als 10 000fache Verd nnung der Stamml sung zu der fl ssigen Agaro se gegeben und nachfolgend das Gel gegossen Die zu analysierenden Proben wurden ent sprechend ihrem Volumen mit der ben tigten Menge an 6x Ladungspuffer zur Erh hung der Dichte versetzt und neben einem L ngenstandard in die Geltaschen eingebracht ber einen Stromgeber BIOMETRA RENNER IBI wurden je nach Gr e und Konzentration der Ge le 85 bis 110 Volt f r 45 bis 80 Minuten angelegt Der Farbstoff GelStar interkalierte w h Material und Methoden 71 rend der Elektrophorese in die DNA welche dann unter UV Licht 312 nm aufgrund der erzeugten Fluoreszenz sichtbar gemacht und mit einer Videodokumentationsanlage INTAS fotografisch festgehalten wurde 3 7 7 Isolierung von PCR Fragmenten aus Agarosegelen Zur Isolierung von Amplifikationsprodukten aus Agarosegelen wurde das Wizard PCR Preps DNA Purification System PROMEGA nach den Angaben des Herstell
20. Der Gesamtvergleich der L3i 88 Sequenzen ergab ebenfalls eine erh hte Signifikanz Hierbei waren von 16 direkt vor dem ersten Methionin liegenden Aminos uren welche bei allen Isoformen bereinstimmten s 9 4 2 neun bzw zehn Aminos uren identisch und vier respektive drei weitere iso funktionell Mittels dem BLAST search for short nearly exact matches erh hte sich diese Zahl auf 29 Aminos uren mit 19 bzw 20 identischen und f nf bzw vier iso funktionellen Aminos uren Wurde die Aminos uresequenz der L3i 99 in voller L nge verglichen erh hte sich der identische Teilbereich mit den oben genannten Proteinen welche durch alternatives Splei en entstehen auf 135 Aminos uren Die Sequenzidentit t betrug nunmehr 47 bei einer hnlichkeit von 61 Im Zuge des Sequenzidentit tsvergleichs mittels BLASTP konnten bei den im Folgenden aufgef hrten Aminos uresequenzen keine Identit ten festgestellt werden die den gestellten Anforderungen an eine Signifikanz gen gten Die L3i 10a sowie L3i 10b Aminos urese quenzen wiesen als Gesamtsequenz wie auch ab dem potentiellen Startcodon bereinstim mungen ber einen Teilbereich von 265 Aminos uren mit einem putativen Protein 329 aa von C elegans NP_506141 1 auf Es bestand jedoch nur eine Identit t von 33 die Se quenz hnlichkeit betrug 51 Die L3i 33c Sequenz zeigte eine 30 ige Identit t bei einer hnlichkeit von 46 ber 65 Aminos uren mit einem hypothetischen Pr
21. QPCR System STRATAGENE mit der dazugeh rigen Software Version 3 01 erfolgte die Auswertung der qPCR In den verschiedenen L ufen wurde ebenfalls ein so genanntes house keeping Gen welches in den einzelnen Proben in relativ konstanter Menge vorliegt amplifi ziert und quantifiziert Dieses housekeeping Gen als welches der Elongationsfaktor la ge w hlt wurde erm glicht eine Normalisierung und damit einen Vergleich der Transkriptions raten der zwei Larvenpopulationen 3 15 1 Charakterisierung zweier housekeeping Gene von D viviparus Da beim bovinen Lungenwurm kein zur Normalisierung der Transkriptionsraten der L3ni und L3i ben tigtes housekeeping Gen bekannt war musste zun chst ein solches charakterisiert werden Daher erfolgte mit Hilfe degenerierter Vorw rts und R ckw rtsprimer deren Design auf der Grundlage bereits ver ffentlichter Sequenzen der Organismen H contortus BM138861 BM138956 BF423011 O ostertagi BG924168 BG734046 Onchocerca volvolus M64333 A suum BI594745 und C elegans NM_076922 1 basierte die Cha rakterisierung eines Fragments des Elongationsfaktors 1a EF la Ein Sequenzabschnitt des B Tubulin Gens B Tubulin sollte mit den degenerierten Primern BTN1 und BTI2 PAPE 1999 amplifiziert werden Bezeichnung Sequenz Referenz EF 1a for 5 CAT ATH AAY ATY GTY GTB ATY GG 3 EF la rev 5 CAT RTT CTT RAT GAA RTC ACG 3 BTNI 5 GGI CAR TGY GGN AAY CAR AT 3 PAPE 1
22. SD SDS TAE Tab Taq TK TNE UPM UTR UV 265 Nanogramm Nanometer Stickstoffmonoxid engl nitric oxide optische Dichte Phenol Chloroform Isoamylalkohol Polymerase Kettenreaktion engl polymerase chain reaction Picogramm negativer dekadischer Logarithmus der H Ionen Konzentration Phenylethanol N Methyltransferase Rapid Amplification of cDNA Ends Ribonukleins ure engl ribonucleic acid Ribonuklease Carboxy X Rhodamin Umdrehungen pro Minute engl rounds per minute ribosomale RNA reverse Transkriptase Svedberg Superoxiddismutase Standardabweichung Natriumdodecylsulfat Tris Acetat EDTA Puffer Tabelle Thermus aquaticus Testerkontrolle Tris Acetat NaCl Puffer Unit Enzymeinheiten Universelle Primermischung engl Universal Primer Mix untranslatierte Region ultraviolett 266 Anhang 9 7 Abbildungs und Tabellenverzeichnis Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb Abb 1 SO SEE ISN eee Da 25 26 27 Schema des Differential Display und der RNA Arbitrarily Primed PCR 46 Schema der Representational Difference Analysis sennsenenennessenne 49 Schema der Suppression Subtractive Hybridization cccccccsecssecesceeeeeeeeeeseeeseeeeeeseeeaaes 51 Erststrang cDNA Synthese und Long Distance LD PCR
23. VOWELS u THOMAS 1992 THOMAS et al 1993 SCHACKWITZ et al 1996 Da bei D viviparus jedoch niedrige Temperaturen die Induktion der Entwicklungshemmung bedingen w re diese Rolle den thermosensorischen Neuronen zuzusprechen Diese werden bei C ele gans H contortus und A caninum von den ADF Neuronen repr sentiert MORI u OHSHI MA 1995 LI et al 2000 BHOPALE et al 2001 LI et al 2001 Diese Neuronen sind nach Untersuchungen von LI et al 2001 bei H contortus sehr viel besser im dritten als im ersten Larvenstadium entwickelt Die Autoren f hren hierauf das Verhalten des Parasiten zur ck morgens und abends auf Grashalme zu kriechen um so von potentiellen Wirten w hrend des Grasens aufgenommen zu werden Da auch dritte Lungenwurmlarven eine solche Positionie rung zeigen ist wahrscheinlich dass bei diesem Parasiten die thermosensorischen Neuronen im dritten Larvenstadium ebenfalls gut ausgebildet sind Nach den Ergebnissen dieser Arbeit k nnte ihre Funktion jedoch weit ber diesen verhaltensbezogenen Aspekt hinausgehen 198 Diskussion Bez glich der aufregulierten Gene der Hypobiose induzierten Larven ist allerdings in Betracht zu ziehen dass die Aufregulation der entsprechenden Transkripte m glicherweise auch eine Antwort auf einen Energiemangel darstellen k nnte W hrend die mRNA Isolierung aus den L3ni sp testens eine Woche nach der H utung zur dritten Larve erfolgte verblieben die L3i zur Induktion der Hypobiose f r
24. Zwischen 8 62 mm und 10 85 mm variierte die L nge der 68 Tag p i isolierten Larven welche zudem eine Scheide aufwiesen und daher als 4M Stadien klassifiziert wurden Die Autoren folgern dass in den Lungen befindliche hypo biotische Larven entweder kontinuierlich oder am Ende der Inhibitionsperiode ein L ngen wachstum aufweisen und sich w hrenddessen vom Stadium der L4 zur 4M entwickeln 2 2 3 Regulation der Hypobiose bei parasitischen Nematoden Die genauen Mechanismen sowohl der Induktion als auch der Aufhebung der Entwicklungs hemmung sind bei parasitischen Nematoden bislang nicht bekannt Auf Grund verschiedener Untersuchungen konnten Faktoren ermittelt werden die an der Induktion beteiligt sind ber Faktoren die zur Beendigung der Hypobiose beitragen k nnen bei den parasitischen Nema toden der Wiederk uer lediglich Hypothesen aufgestellt werden GIBBS 1968 und CON NAN 1978 bringen die Weiterentwicklung hypobiotischer Trichostrongyliden der Schafe in Zusammenhang mit der ver nderten hormonellen Lage kurz vor der Geburt bis in die Laktati onsphase welche mit einer Immunsuppression einhergehen k nnte Vergleichende Untersu chungen an nicht lammenden und lammenden Mutterschafen konnten dies jedoch nicht best tigen SCHILLHORN van VEEN u OGUNSUSI 1978 Auch blieben Versuche inhibierte O ostertagi PRICHARD et al 1974 und H contortus Stadien GIBBS 1968 durch Verab reichung von Immunsuppressiva an die Wirtstiere z
25. die unter kontrollierten Licht und Temperaturbedingungen im Labor inkubiert wurden best tigt werden Unter solchen Bedin gungen die dem Fr hling in der dortigen Region entsprachen stieg der Prozentsatz hypobio tischer Larven von 3 6 auf 94 9 Eine Temperaturerh hung besa dabei einen gr eren Einfluss auf die Induktion der Entwicklungshemmung als verl ngerte Helligkeitsphasen FERNANDEZ et al 1999 Durch K hlung kann die Hypobiose bei zur Sommer Inhibition bef higten bovinen Nematoden hingegen nicht induziert werden SMEAL u DONALD 1982b 30 Schrifttum Ob die Tageslichtlange auch die Induktion der Winter Inhibition beeinflusst ist fraglich CONNAN 1975 GIBBS 1986 GIBBS 1973 zeigte dass bei H contortus Larven die ei ner Photoperiode von nur 10 Stunden im Gegensatz zu 16 Stunden ausgesetzt waren der An teil hypobiotischer Stadien signifikant h her war Jedoch konnten CONNAN 1975 und CA PITINI et al 1990 den photoperiodischen Effekt auf die Ausbildung hypobiotischer H con tortus Stadien nicht best tigen Auch die Bedeutung von Feuchtigkeit bez glich der Ausl sung der Entwicklungshemmung bedarf noch weiterer Untersuchungen EYSKER 1978 erkannte dass der Beginn der Hypo biose bei H contortus und T circumcincta in trockenen Sommern verz gert einsetzte Nach Kultivierung von H contortus Larven unter sehr feuchten modrigen Bedingungen stellte CONNAN 1978 einen signifikant h heren Prozentsatz inhib
26. fragment length polymorphism of second internal transcribed spacers of ribosomal DNA Parasitol Res 82 392 394 SCHNIEDER T C EPE G v SAMSON HIMMELSTJERNA u C KOHLMETZ 1996b The development of protective immunity against gastrointestinal nematode and lungworm infections after use of an ivermectin bolus in first year grazing calves Vet Parasitol 64 239 250 SCHNIEDER T C EPE G v SAMSON HIMMELSTJERNA u C KOHLMETZ 1996c Use of ivermectin bolus against gastrointestinal nematode and lungworm infections in first year grazing calves Appl Parasitol 37 1 7 SCHNIEDER T F J KAUP u W DROMMER 1991 Morphological investigations on the pathology of Dictyocaulus viviparus infections in cattle Parasitol Res 77 260 265 SCHUMMER M W I NG P S NELSON R E BUMGARNER u L HOOD 1997 Inexpensive handheld device for the construction of high density nucleic acid arrays Biotechniques 23 1087 1092 SELMAN I E 1984 Control measures for parasitic bronchitis in cattle Vet Annu 4 80 84 SHUMAN S 1991 Site specific DNA cleavage by vaccinia virus DNA topoisomerase I Role of nucleotide sequence and DNA secondary structure J Biol Chem 266 1796 1803 SHUMAN S 1994 Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase J Biol Chem 269 32678 32684 Literaturverzeichnis 239 SIDDIQUI A A C S STANLEY P J SKELLY u S L BERK 2000 A
27. geben eine Fehlerrate von 0 1 f r die gesamte Amplifikationsreaktion an Bei dem in dieser Arbeit eingesetzten Mix aus Taq und proofreading Polymerase ist die Fehlerwahr Diskussion 187 scheinlichkeit allerdings um ein Vielfaches geringer Ferner sind hinsichtlich des Fehlens oder des falschen Einbaus eines Nukleotids Fehler bei der reversen Transkription Plasmidreplika tion und Sequenzierung in Betracht zu ziehen 5 5 4 Transkriptvarianten Bei der Zusammensetzung der einzelnen cDNA Fragmente wurden neben differierenden Se quenzen der RACE auch die sich aus der Uberpriifung der genspezifischen Primerpaare erge benden Sequenzen ber cksichtigt Nach GALAS 2001 existieren von jedem Gen durch al ternatives Splei en und der damit einhergehenden Kombination unterschiedlicher Exons min destens zwei oder drei verschiedene Transkriptvarianten Dies konnte in der vorliegenden Arbeit f r die differentiell transkribierten Sequenzen L3i 10 L3i 33 L3i 75 L3i 82 101 L3i 88 L3i 18 86 99 und L3i 100 sowie L3ni 56 beobachtet werden ber das alternative Splei en erfolgt eine quantitative Regulation der Genexpression welche durch eine Variabili t t in den untranslatierten Regionen der mRNA und damit einhergehender ver nderter mRNA Stabilit t und Translationseffizienz bedingt ist Des Weiteren wird durch die Entste hung von Isoformen die Mannigfaltigkeit der Proteine erh ht und eine Modulation der Prote infunktion erm glicht SMITH et
28. le unterliegen so wohl f r den Eintritt in das inhibierte Stadium als auch ein effizientes recovery ben tigt BARGMANN u HORVITZ 1991 VOWELS u THOMAS 1992 THOMAS et al 1993 SCHACKWITZ et al 1996 COBURN et al 1998 Mutationen dieser Einheit resultieren in 36 Schrifttum abnormalem chemosensorischen Verhalten und gest rter larvaler Entwicklung So besitzen daf 6 Mutanten defekte Scheidenzellen daf 10 Mutanten defekte Zilien in Amphiden und Phasmiden ALBERT et al 1981 HERMAN 1987 Die betroffenen Individuen bilden auch bei hohem Pheromonspiegel keine inhibierten Stadien aus Das vollst ndige Fehlen von sen sorischen Zilien resultiert aus einem Funktionsverlust des Gens daf 19 welches daf 24 ent spricht Dieser Transkriptionsfaktor vom RFX Typ reguliert dabei die Expression der Zilien gene SWOBODA et al 2000 Im Gegensatz zu allen anderen Mutationen der Zilienstruktur gene geht dies mit einem daf c Ph notyp einher PERKINS et al 1986 2 3 3 Signalkaskaden zur Regulation der Larvenentwicklung In Abh ngigkeit von den drei Umweltfaktoren Pheromonspiegel Nahrungsangebot und Tem peratur kontrollieren drei sich funktionell berlappende Wege die Larvenentwicklung ber neuronale Impulse Diese Signalkaskaden stellen parallele Wege zweier Gruppen von daf c Genen dar und steuern aktiviert die normale Larvenentwicklung ber den nukle ren Rezeptor daf 12 Bleiben die Signale dieser Wege aus erfolgt die Morphogenese zur daue
29. team ee 131 Analyse der Subtraktionseffizienz der Durchf hrung 1 eesenenen 133 Insertkontrolle einiger Klone der L3i uu 0000enseenseeeneesnenenensnennennsennnennne nennen nn 134 Analyse der Markierungseffizienz der cCDNA Sonden sensensesnnnennn 136 Chemilumineszente Detektion nach Einsatz der subtrahierten L3i cDNA als Hy bridisierungssondeis aniono taenn a R aa Ran nn an HN 138 Chemilumineszente Detektion nach Einsatz der subtrahierten L3ni cDNA als Hybr disierungssonde u 2 ueiaiekiainsen aka PE E ERS 138 Chemilumineszente Detektion nach Einsatz der L3i Tester Kontrolle als Hybridisierungsonde ccccceccceesseesceesseesceessecaecesecesecesecneeseeeseeeeeseeeseecseecsaecsecaeceseenaeee 139 Chemilumineszente Detektion nach Einsatz der L3ni Tester Kontrolle als Hybridisierungsonde 2 2 2 2 A E E E E RL In in 139 Anhang Abb 28 Abb 29 Abb 30 Abb 31 Abb 32 Abb 33 Tab 1 Tab 2 Tab 3 Tab 4 Tab 5 Tab 6 Tab 7 Tab 8 Tab 9 Tab 10 267 Chemilumineszente Detektion nach Einsatz der L3i cDNA Sonde 142 Chemilumineszente Detektion nach Einsatz der L3ni cDNA Sonde 143 Alignment Ausschnitt der drei L3ni 56 GSP Banden ssensenesnesennn 152 Differentielle Transkription verschiedener CDNA Sequenzen uunesnenensennneenneeenne en 165 Differentielle Transkription der L3ni
30. tum ausgehustet W hrend der Magen Darm Passage schl pfen die ersten Larven und gelan gen mit dem Kot in die Au enwelt Herrschen hier Temperaturen unter 8 C setzt nach Auf nahme durch den Wirt eine Entwicklungshemmung im fr hen pr adulten Stadium ein BARTH u PRESTON 1987 Bez glich der Hypobiose sei an dieser Stelle auf die weiteren Ausf hrungen im Kapitel 2 2 verwiesen 2 1 4 Klinik und Pathogenese Der Krankheitsverlauf der Diktyokaulose kann nach URQUHART et al 1973 in vier Phasen mit eigenst ndiger Symptomatik untergliedert werden 18 Schrifttum Die Penetrationsphase welche in der ersten Woche p i vonstatten geht umfasst die orale Aufnahme der Larven bis zu deren Anwesenheit in der Lunge Infolge der durch die Penetra tion der Larven verursachten L sionen der Darmschleimhaut entsteht eine subklinische Ente ritis Klinisch kann lediglich ein leichter Hustenreiz beobachtet werden PFEIFFER 1971 In der vom 8 bis 21 Tag p i dauernden alveol r bronchialen Phase welche zusammen mit der Phase der Penetration die Pr patenzzeit darstellt verursachen die in den Bronchien und Bronchioli vorhandenen pr adulten Stadien eine Entz ndung dieser luftf hrenden Wege Der Schweregrad dieser Bronchitis h ngt von der Anzahl initial aufgenommener infekti ser Lar ven Alter sowie Ern hrungszustand des Wirtstieres und den vorherrschenden Witterungsbe dingungen ab URQUHART et al 1973 Zu Beginn der zweiten Woche
31. 13 22 BLOCH U E 1782 Abhandlung von der Erzeugung der Eingeweidew rmer und den Mitteln wider derselben Berlin BOKHOUT B A J H BOON u J HENDRICKS 1979 Operational diagnostics of lungworm infection in cattle Vet Quart 1 195 203 BOON J H A KLOOSTERMAN u M BREUKINK 1984 Parasitological serological and clinical effects of continuous graded levels of Dictyocaulus viviparus inoculations in calves Vet Parasitol 16 261 272 BOON J H A KLOOSTERMAN v R van DEN BRINK 1982 The incidence of Dictyocaulus viviparus infections in the Netherlands I The enzyme linked immunosorbent assay as a diagnostic tool Vet Quart 4 155 160 BOON J H H W PLOEGER u A J RAAYMAKERS 1986 Sero epidemiological survey of Dictyocaulus viviparus infections in first season grazing calves in The Netherlands Vet Rec 119 475 479 BORGSTEEDE F H u M EYSKER 1987 Strains of cattle parasites in the Netherlands with different propensities for inhibited development Vet Parasitol 24 93 101 BOS H J u J BEEKMAN 1985 Serodiagnosis of lungworm infection in calves using ELISA Develop Biol Standard 62 45 52 BOWMAN J W C A WINTERROWD A R FRIEDMAN D P THOMPSON R D KLEIN J P DAVIS A G MAULE K L BLAIR u T G GEARY 1995 Nitric oxide mediates the inhibitory effects of SDPNFLRFamide a nematode FMRFamide related neuropeptide in Ascaris suum Journal of Neurophysiology 74 188
32. 28 103 113 CHRISTENSEN C M P NANSEN S A HENRIKSEN J MONRAD u F SATRIJA 1992 Attempts to immunize cattle against Ostertagia ostertagi infections employing normal and chilled hypobiosis prone third stage larvae Vet Parasitol 44 247 261 COBURN C M I MORI Y OHSHIMA u C I BARGMANN 1998 A cyclic nucleotide gated channel inhibits sensory axon outgrowth in larval and adult Caenorhabditis elegans a distinct pathway for maintenance of sensory axon structure Development 125 249 258 COLLIE D D C N MACALDOWIE A D PEMBERTON C J WOODALL N McLEAN C HODGSON M W KENNEDY u H R MILLER 2001 Local lung responses following local lung challenge with recombinant lungworm antigen in systemically sensitized sheep Clin Exp Allergy 31 1636 1647 CONNAN R M 1969 Studies on the inhibited development of Ostertagia spp in lambs J Helminthol 42 9 28 CONNAN R M 1975 The seasonal incidence of inhibition of development in Haemonchus contortus Res Vet Sci 12 272 274 CONNAN R M 1978 Arrested development in Haemonchus contortus in F H M BORGSTEEDE J ARMOUR u J JANSEN Hrsg Facts and Reflections III Central Veterinary Institute Lelystad Niederlande S 53 62 CONNAN R M 1993 Calfhood vaccination for dictyocaulosis Vet Rec 133 554 555 CORNWELL R L 1960 The complement fixing antibody response of calves to Dictyocaulus viviparus J Comp Path 70 49
33. 364 368 GOTHE R u R KANDELS 1984 Lungenw rmer bei Schafen in Hessen Untersuchungen zur Befallsh ufigkeit von Dictyocaulus filaria und Protostrongyliden sowie verschiedene Haltungsformen Berl M nch tier rztl Wochenschr 97 35 366 GOTTLIEB S u G RUVKUN 1994 daf 2 daf 16 and daf 23 genetically interacting genes controlling dauer formation in Caenorhabditis elegans Genetics 137 107 120 Literaturverzeichnis 223 GOUDIE A C N A EVANS K A GRATION B F BISHOP S P GIBSON K S HOLDOM B KAYE S R WICKS D LEWIS A J WEATHERLEY et al 1993 Doramectin a potent novel endectocide Vet Parasitol 49 5 15 GR FNER G 1987 Zum epizootiologischen Verlauf von Ostertagiose Dictyokaulose Erkrankungen bei Jungrinderherden in den Jahren 1980 bis 1984 in den n rdlichen Weidegebieten der DDR Monatsh Veterin rmed 42 5 15 GRANT A G R M FLOMEN M L TIZARD u D A GRANT 1992 Differential screening of a human pancreatic adenocarcinoma X gtl1 expression library has identified increased transcription of elongation factor EF 1a in tumor cells Int J Cancer 50 740 745 GRAVELEY B R 2001 Alternative splicing increasing diversity in the proteomic world Trends Genet 17 100 107 GRENACHE D G I CALDICOTT P S ALBERT D L RIDDLE u S M POLITZ 1996 Environmental induction and genetic control of surface antigen switching in the nematode Caenorhabditis elegans Proc
34. 4 erl utert Bei der Hybridisierung sowie der Detektion wurde nach dem unter 3 10 3 102 Material und Methoden beschriebenen Protokoll vorgegangen Abweichend kamen jedoch 25 ng Sonde ml Hybridi sierungsl sung DIG Easy Hyb ROCHE zum Einsatz und die Dauer der Filmexposition Kodak BioMax Light AMERSHAM BIOSCIENCES betrug beim ersten Film 1 5 Stun den gefolgt von einer 3 5 stiindigen Exposition des zweiten Films 3 12 Selektion und weitere Bearbeitung differentiell transkribierter Genfragmente 3 12 1 Selektion differentiell transkribierter cDNA Sequenzen Die Auswahl der Klone mit differentiell transkribierten Insert Sequenzen der L3i bzw L3ni erfolgte auf der Grundlage unterschiedlicher Signalintensit ten der cDNA dots auf den entwi ckelten Filmen F r diesen Vergleich wurden die 40 Minuten belichteten Filme des Differen tial Screenings sowie die 1 5 Stunden belichteten Filme der Verifizierungs Hybridisierung herangezogen Als Hauptkriterium f r eine differentielle Transkription galt das Ausbleiben eines Signals bei der Hybridisierung mit subtrahierter cDNA der in der SSH als Driver einge setzten Larvenpopulation Des Weiteren wurden Klone ausgew hlt die einen deutlichen Sig nalunterschied bei der Verwendung der entsprechenden Tester cDNA und Tester Kontroll Sonde im Gegensatz zur jeweiligen Driver cDNA und zugeh riger nicht subtrahierter Kon troll Sonde erkennen lie en Hierbei wurde jedoch einschr nkend eine st rkere
35. 7 sowie beispielhaft in Abb 31 dargestellt Dabei wird die relative In tensit t im Vergleich zur jeweils komplement ren cDNA Population Driver angegeben cDNA Template cDNA Template 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 L3i 10 n n L3ni 16 nn a L3i 33 L3ni 22 L3i 53 nn nn O n n L3ni 51 H H L3i 75 H L3ni 56 L3i 82 101 L3ni 67 O O L3i 88 L3ni 69 92 4 H H L3i 99 L3i 100 Tab 7 Intensit tsunterschiede der Banden mit L3ni bzw L3i cDNA Templates L3ni bzw L3i Template 1 doppelstr ngige cDNA 2 3 RACE cDNA aus Isolierung 3 3 5 RACE cDNA aus Isolierung 3 4 5 RACE cDNA aus Isolierung 5 50 ul Reaktionsansatz mit 30 PCR Zyklen 5 5 RACE cDNA aus Isolierung 5 25 ul Reaktionsansatz mit 35 PCR Zyklen Zeichenerkl rung keine oder kaum sichtbare Banden in der Driver cDNA schw chere Banden in der Driver cDNA keine oder minimale Intensit tsunterschiede zwischen Tester und Driver cDNA st rkere Banden in der Driver cDNA n n kein Amplifikationsprodukt nachweisbar Ergebnisse 165 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp M11i221122112241122 L3i 10 L3i 33 L3i 88 L3i 99 3000 bp 3000 bp 500 bp 500 bp 300 bp 300 bp 200 bp 200 bp 100 bp 100 bp M 1 1 2 2 M 1 1 2 2 L3ni 69 92 L3i 82 101 Abb 31 Differenti
36. 800 PERKIN ELMER J gesheim AmpliTaq Gold Polymerase GeneAmp 10x PCR Buffer II PROMEGA Mannheim Wizard PCR Preps DNA Purification System RNasin Ribonuclease Inhibitor Desoxy NTP Set QIAGEN Hilden QIAGEN Plasmid Midi Kit QIAGEN OPERON K ln TaqMan Sonden und Primer RENNER Dannstadt Microcomputer Elektrophoresis Power Supply Parafilm 45 um Einweg Filterhalter RETSCH Haan Analysesieb 200 x 50 mm Maschenweite 50 um ROCHE DIAGNOSTICS Mannheim DIG High Prime Labeling and Detection Starter Kit II DIG Wash and Block Buffer Set DIG Easy Hyb DIG DNA Labeling Mix positiv geladene Nylonmembranen 20x30 cm Hybridi zation Bags mRNA Isolation Kit Glykogen Rsal Smal Eael ROTH Karlsruhe Agarose NEEO Ultra Qualit t Rotiagarose Material und Methoden 59 SARTORIUS Gottingen Elektronische Prazisionswaage L610D STRATAGENE Amsterdam Niederlande MX 4000 Multiplex Quantitative PCR System Brilliant Quantitative PCR Core Reagent Kit ZEISS Jena Stereomikroskop 47 30 11 9901 Mikrometerokular Objektmikrometer Alle weiteren nicht einzeln aufgef hrten Produkte wurden von den Firmen Hans Landgraf Langenhagen Merck Darmstadt SIGMA Aldrich Deisenhofen Sarstedt N mbrecht Stra tagene Amsterdam Niederlande und Carl Roth Karlsruhe erworben Als Pipetten dienten Eppendorf Research 10 100 1000 und 5000 der Firma EPPENDORF Hamburg sowie die Mehrkanalpipette Matrix Impact2
37. 932 38 514 158 126 L3i 88 2 900 38 349 103 71 L3i 18 1518 341 1027 228 199 L3i 86 1515 338 1024 228 199 L3i 99 1423 3 932 309 288 L3i 100a 862 34 699 221 210 L3i 100b 845 71 682 203 184 L3i 100c 739 34 576 180 169 Tab 4 Sequenzl ngen der erstellten Genfragmente TR translatierte Region aa Gesamtzahl der Aminos uren ab Met Anzahl ab dem ersten Methionin Ergebnisse 157 Durch das Anf gen der 5 RACE Sequenz besa en die Sequenzen L3ni 22 und L3i 10a sowie alle Isoformen der L3i 33 L3i 82 und L3i 88 ein oder mehr Stopcodons vor der translatierten Aminos uresequenz Gleiches konnte bei den Sequenzen L3i 53 L3i 75 L3i 100 und L3i 101 bereits nach der Sequenzierung der in den subtrahierten cDNA Banken enthaltenen Inserts beobachtet werden s 4 8 3 1 Jedoch ergab sich im Alignment der Insertsequenz des Klons L3i 75 mit den beiden Sequenzen der 5 RACE Banden dass dieses Stopcodon durch Fehler der Polymerase oder bei der Plasmidreplikation bzw der Sequenzierung entstanden sein musste Den zusammengesetzten Gensequenzen fehlte daher dieses Stopcodon Die Amino s uresequenzen der L3i 101 sowie L3i 82a waren ab der 37igsten respektive zw lften Amino s ure identisch Ebenso wiesen die Klone L3i 18 und L3i 86 mit Ausnahme einer Aminos ure eine Sequenz bereinstimmung auf welche sich auch auf die letzten 228 Aminos uren der L3i 99 erstreckte Die oben beschriebenen Alignments als auch die der verschiedenen Isof
38. Amplifk ation line are Amplifk ation EE m exponentielle Amplifk ation Abb 3 Schema der Suppression Subtractive Hybridization 52 Schrifttum 2 4 2 3 Vorz ge und Limitierungen der subtraktiven Hybridisierungsverfahren Moderne subtraktive Hybridisierungsverfahren sind einfach durchf hrbar und reichern durch selektive Amplifikation der Tester Sequenzen die differentiell transkribierten Targets an F r die RDA beschreibt MYERS 1993 eine 10 bis 10 fache Anreicherung dieser Transkripte Bei dieser Technik bestehen jedoch wie auch bei anderen Verfahren Konzentrationsunter schiede der individuellen mRNA Spezies als deren Folge sehr seltene Transkripte oftmals nicht detektiert werden Die SSH l st dieses Problem durch einen Hybridisierungsschritt welcher die Sequenzh ufigkeiten basierend auf der Hybridisierungskinetik normalisiert DI ATCHENKO et al 1996 Dieser Konzentrationsausgleich in Verbindung mit der Suppressi on PCR verhindert auch die vorrangige Amplifikation von Sequenzen welche gro e Unter schiede bez glich der Transkriptionsrate aufweisen wie sie IWAMA et al 1998 bei der RDA beobachteten Die Detektion differentiell transkribierter Gene im Hinblick auf Aktivie rung und Repression wird durch eine reverse Subtraktion bei welcher der Tester zum Driver wird und umgekehrt m glich DIATCHENKO et al 1999 Zu bedenken ist jedoch dass sich damit die ben tigte Menge an Ausgangsmaterial erh ht Diese betr
39. Anthelmintische Metaphylaxe in Pferdegruppen mit larvaler Cyathostominose Ausl ser klinischer Erkrankungen in Tagung der DVG Fachgruppe Parasitologie und Parasit re Krankheiten Epidemiologie und Bek mpfung von Parasitosen Leipzig Abstract S 50 BAUER D H MULLER J REICH H RIEDEL V AHRENKIEL P WARTHOE u M STRAUSS 1993 Identification of differentially expressed mRNA species by an improved display technique DDRT PCR Nucleic Acids Res 21 4272 4280 BECK M T L HOLLE u W Y CHEN 2001 Combination of PCR subtraction and cDNA microarray for differential gene expression profiling Biotechniques 31 782 4 786 Literaturverzeichnis 213 BELLMER A 1990 Seroepidemiologische Untersuchungen tiber das Vorkommen von Dictyocaulus Infektionen bei Rindern in Niedersachsen mit Hilfe des ELISA Hannover Tierarztl Hochsch Diss BERG J M J L TYMOCZKO u L STRYER 2003 Biochemie 5 Aufl Spektrum Akademischer Verlag GmbH Heidelberg u Berlin S 368 369 447 448 642 644 664 688 755 756 793 794 BERTIOLL D J U H A SCHLICHTER M J ADAMS P R BURROWS H H STEINBI u J F ANTONIW 1995 An analysis of differential display shows a strong bias towards high copy number mRNAs Nucleic Acids Res 23 4520 4523 BHOPALE V M E K KUPPRION F T ASHTON R BOSTON u G A SCHAD 2001 Ancylostoma caninum the finger cell neurons mediate thermotactic behavior by infective larvae of t
40. Gel isoliert kloniert und anschlie end sequenziert s 3 7 7 bis 3 7 10 3 13 3 Rapid Amplification of cDNA Ends RACE Repr sentieren cDNAs lediglich ein Fragment der entsprechenden mRNA Sequenzen erm g licht die Rapid Amplification of cDNA Ends RACE den Erhalt der vollst ndigen Nuklein s uresequenz durch eine Amplifikation zwischen der bekannten Region und dem 3 oder 5 Ende der mRNA FROHMAN et al 1988 In dieser PCR die je nach zu amplifizierendem Ende als 3 oder 5 RACE bezeichnet wird kommen ein aus der bekannten Sequenzregion hergeleiteter genspezifischer Primer sowie ein universeller Primer zum Einsatz Dieser hybri 106 Material und Methoden disiert mit dem zu amplifizierenden Ende so dass die unbekannte Sequenz am 3 bzw 5 Ende der cDNA durch eine Sequenzierung erkannt werden kann Uberlappungsbereich 5 AAAAA 3 Oe TTTTT 5 Abb 9 Schematische Darstellung der RACE Bei dem in dieser Arbeit verwendeten SMART RACE cDNA Amplification Kit BD CLONTECH werden die Bindungsstellen f r zwei universelle Primer Universelles Primer A Mix UPM durch den Einsatz verschiedener Oligonukleotide s Abb 10 generiert Dies geschieht im Zuge einer reversen Transkription und sich anschlie ender PCR In der 5 RACE erfolgt die reverse Transkription mittels eines Oligo dT Primers dem so genannten 5 RACE cDNA Synthesis CDS Primer Dieser bindet an die am 3 Ende fast aller euka
41. Kontroll Sonde eine geringere Sensitivit t als die brigen Sonden aufwies wurde von dieser die 2 5fache Menge in der Hybridisierung eingesetzt Die Membranen wurden vor Beginn der folgenden Arbeits schritte in eine Hybridisierungstasche ROCHE eingeschwei t um eine NH Freisetzung und damit einhergehende pH Wert Ver nderung der Pr hybridisierungs bzw Hybridisie rungsl sung zu verhindern Zun chst wurden 50 ul Blockierungsl sung CLONTECH PCR Select Differential Scree ning Kit BD CLONTECH f r 10 Minuten bei 99 C denaturiert und anschlie end f nf Mi nuten im Eiswasserbad abgek hlt Die Blockierungsl sung enth lt gescherte Heringsperma 96 Material und Methoden DNA 10 mg ml um unspezifische Bindungsstellen auf der Tragermembran zu besetzen Weiterhin sind Oligonukleotide 0 3 mg ml enthalten die den Nested Primern bzw deren komplement ren Sequenzen entsprechen und daher mit den korrespondierenden Sequenzen der mittels Nested PCR synthetisierten cDNAs der dot blots hybridisieren Somit werden falsch positive Signale durch eventuell noch an der cDNA Sonde vorhandene Primersequen zen weitestgehend ausgeschlossen 45 ml einer auf 42 C vorgew rmten Pr hybridisierungs l sung DIG Easy Hyb ROCHE wurden mit der denaturierten Blockierungsl sung versetzt auf die in der Hybridisierungstasche befindliche Membran gegeben und diese anschlie end luftblasenfrei mit einem Schraubdeckel verschlossen Die Pr hybridisier
42. Konzentrationsmes sung der zu sequenzierenden Proben die DNA Konzentrationen auf jeweils ca 250 ng ul ein gestellt die Gef e zum Schutz vor Verdunstung mit Parafilm RENNER umwickelt und mit der Post verschickt Die bermittlung der Sequenzen und zugeh rigen Elektrophe rogramme erfolgte auf elektronischem Wege per E Mail 3 7 10 2 Sequenzbearbeitung und Sequenzidentit tsvergleich Die Bearbeitung der Sequenzdaten n mlich das Auffinden der verwendeten Primersequenzen und Entfernen der anh ngenden Vektorsequenz erfolgte mit dem Datenverarbeitungspro gramm Align Plus Sequence Alignment Program Version 4 0 S amp E SOFTWARE und dazugeh riger Zusatzprogramme SEQUAID Kansas State University Molecular Genetics Laboratory Weiterhin wurde der Identit tsvergleich der Vorw rts und R ckw rtssequenz 76 Material und Methoden eines Klons sowie die bersetzung in die entsprechenden Aminos uresequenzen mit diesen Programmen bewerkstelligt Zur Feststellung von Identit ten mit bereits in GenBank NCBI USA publizierten Sequenzen anderer Organismen erfolgte mit Hilfe des basic local alignment search tool BLAST NCBI USA ALTSCHUL et al 1990 Hierbei wurden auf Nukleins ureebene der BLASTN auf Aminos ureebene der BLAST search for short nearly exact matches sowie BLASTP und TBLASTX herangezogen Die Suche nach konservierten Dom nen in den A minos uresequenzen erfolgte in der conserved domain data
43. L3ni und L3i isoliert Das Gewicht des in die mRNA Isolierung Ergebnisse 125 eingesetzten Larvenmaterials betrug dabei 60 mg bis 100 mg Die Ergebnisse der spektralpho tometrischen Messung sind in folgender Tabelle aufgef hrt Isolierung MELA Gesamtmenge der Nr Anzahl L3 Reinheit mRNA in ng N 470 000 L3ni 1 794 1075 485 000 L3i 1 707 1344 5 500 000 L3ni 1 170 2820 500 000 L3i 1 197 3580 A 520 000 L3ni 1 566 666 500 000 L3i 1 567 1500 j 500 000 L3ni 1 262 4250 500 000 L3i 1 254 1780 r 250 000 L3ni 1 169 3040 250 000 L3i 1 197 3520 2 345 000 L3ni 1 110 2905 376 000 L3i 1 243 1757 Tab 1 mRNA Isolierung aus dritten D viviparus Larven 4 3 Suppression Subtractive Hybridization 4 3 1 Bestimmung der optimalen Anzahl an PCR Zyklen und LD PCR Um die zur Durchf hrung der SSH ben tigten Tester und Driver cDNAs herzustellen wurde mRNA der L3ni L3i sowie der HSM Kontrolle einer reversen Transkription unterzogen Bei der anschlie enden Bestimmung der optimalen LD PCR Zyklenzahl stellten sich 21 Zyklen als optimal f r eine Amplifikation von cDNA mit guter Qualit t heraus Die jeweils im Doppelansatz synthetisierte cDNA der L3ni L3i und HSM Kontrolle wies einen L ngenbereich von 250 bp bis 5000 bp auf Die unten stehenden Abbildungen zeigen beispielhaft die Ergebnisse dieser Arbeitsschritte 126 Ergebnisse 1000 bp 1000 bp 500 bp Abb 16 Bestimmung der optimalen Zyklenzahl mit L3i cDNA u
44. Menge abgesch tzt Ergibt dabei die Detektion ein sichtbares Signal bei einer aufgetragenen Menge von 0 1 pg cDNA Sonde liegt die erwartete Menge an markierter cDNA in der So denl sung vor Nach der im Benutzerhandbuch ROCHE 2000 angegebenen 20 min tigen 136 Ergebnisse Filmexposition war sowohl bei der Kontroll DNA als auch den generierten cDNA Sonden kein Signal zu detektieren Nach einer Belichtungszeit von zwei Stunden wiesen alle Proben schwache Signale bei 0 1 pg aufgetragener DNA auf Damit konnte die Konzentration an DIG markierter cDNA in der Sondenl sung mit der in der photometrischen Messung ermittel ten CDNA Menge s 4 5 1 korreliert werden Die unten stehende Abbildung zeigt das Ergebnis der chemilumineszenten Detektion nach knapp 19 Stunden Filmexposition wobei alle Proben als Duplikate auf die Membran aufge tragen wurden Die Sonden der subtrahierten L3ni und L3i cDNA sowie die L3i Tester Kontrolle wiesen ein Signal bis 0 01 pg cDNA mit etwa gleicher Intensit t auf Dahingegen zeigte die Sonde der L3ni Tester Kontrolle nur bis zu einer Menge von 0 03 pg cDNA Signa le In den Hybridisierungsans tzen f r das Differential Screening sollten die Sonden jedoch gleiche Sensitivit t besitzen Daher wurde entschieden von der L3ni Testerkontroll Sonde die 2 5fache cDNA Menge in der Hybridisierung einzusetzen Kontroll DNA subtrahierte L3i Sonde subtrahierte L3ni Sonde L3i Tester Kontroll Sonde L3ni Tester Kon
45. RUVKUN 1997 daf 2 an insulin receptor like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans Science 277 942 946 KISIEL M J K H DEUBERT u B M ZUCHERMAN 1976 Biogenic amines in the free living nematode Caenorhabditis briggsae Exp Aging Res 2 37 44 KLASS M u D HIRSH 1976 Non ageing developmental variant of Caenorhabditis elegans Nature 260 523 525 228 Literaturverzeichnis KLESIUS P H 1988 Immunity to Ostertagia ostertagi Vet Parasitol 27 159 167 KLOOSTERMAN A H W PLOEGER u K FRANKENA 1991 Age resistance in calves to Ostertagia ostertagi and Cooperia oncophora Vet Parasitol 39 101 113 KNOX D P u D G JONES 1992 A comparison of superoxide dismutase SOD EC 1 15 1 1 distribution in gastro intestinal nematodes Int J Parasitol 22 209 214 KOHLER BELLMER S 1991 Weitere Untersuchungen zum Einsatz des ELISA in Epizootiologie und Diagnostik bei Dictyocaulus viviparus im Landkreis Diepholz Hannover Tier rztl Hochsch Diss KOOYMAN F N J u M EYSKER 1995 Analysis of proteins related to conditioning for arrested development and differentiation in Haemonchus contortus by two dimensional gel electrophoresis Int J Parasitol 25 561 568 KOZAK M 1986a Influences of mRNA secondary structure on initiation by eukaryotic ribosomes Proc Natl Acad Sci USA 83 2850 2854 KOZAK M 1986b Point mutations define a sequence flanking the A
46. Signalintensi t t bei der Hybridisierung mit subtrahierter als mit nicht subtrahierter Tester cDNA gefordert Bez glich der Verifizierungs Hybridisierung wurde festgelegt dass die Signalst rke bei der Hybridisierung mit der urspr nglich als Driver eingesetzten cDNA die der Tester cDNA nicht bersteigen durfte ein bestehendes Signal wurde jedoch nicht verlangt 3 12 2 Plasmidpr paration Sequenzierung und Sequenzidentit tsvergleich Die Klone der subtrahierten cDNA Banken deren Inserts im Differential Screening als diffe rentiell transkribiert identifiziert und anschlie end durch erneute Hybridisierung als verifiziert galten wurden sequenziert Zur Gewinnung gr erer Mengen an Plasmid DNA f r die sp te re Sequenzierung erfolgte eine Midiprep der zuvor in 50 ml Kanamycin haltigem 50 ug ml Medium LB Medium angez chteten Klone welche mittels Restriktionsenzymverdau ber Material und Methoden 103 pr ft wurde s Kapitel 3 7 9 2 und 3 7 9 3 Zur Kontrolle der richtigen Insertlange wurde jeweils das entsprechende auf die Nylonmembranen aufgetragene cDNA Fragment s 3 9 2 in der gelelektrophoretischen Analyse des EcoRI Verdaus mitgef hrt Die von den SEQUENCE LABORATORIES bermittelten Sequenzen wurden mit dem Pro gramm Align Plus bearbeitet und in die m glichen Aminos uresequenzen bersetzt Mittels BLASTN sowie dem BLAST search for short nearly exact matches erfolgte ein Vergleich mit in GenBank NCBI
47. Stelle nicht weiter aufgef hrt Ergebnisse 167 Das EF 1a Fragment zeigte ber einen Teilbereich von 200 bp Identit ten von 86 mit dem EF la Gen von Thaumalea gillespieae AF003552 mit Gymnopais fimbriatus AF003559 herrschte eine 86 ige Homologie ber 194 Nukleotide hinweg Weitere signifikante Homo logien mit EF 1a Sequenzen anderer Organismen werden hier nicht n her beschrieben 4 11 2 Differentielle Transkription unter Bedingungen der qPCR In diesem Vorversuch wurde die differentielle Transkription der L3ni 69 92 und L3i 82 101 in einer konventionellen PCR berpr ft Hierbei wurden die Reagenzien und das Temperatur profil der qPCR mit TaqMan Sonden verwendet Nach der anschlie enden Elektrophorese der jeweiligen Doppelans tze konnten im 2 igen Agarosegel Banden der erwarteten Frag mentl ngen von ca 170 bp L3ni 69 92 sowie 185 bp L3i 82 101 sichtbar gemacht werden Diese Banden zeigten sich sowohl beim entsprechenden Tester als auch Driver cDNA Template jedoch waren mit der jeweiligen Tester cDNA die Banden deutlich intensiver en 3000 bp 500 bp 500 bp 200 bp 200 bp 100 bp 100 bp M 1 1 2 2 M 1 1 2 2 L3ni 69 92 L3i 82 101 Abb 32 Differentielle Transkription der L3ni 69 92 und L3i 82 101 2 iges Agarosegel M GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus 1 L3ni cDNA 2 L3i cDNA 168 Ergebnisse 4 11 3 qPCR mit TaqMan Sonden Durch die qPCR mit TaqMan Sonden konnten keine Ergebnisse hinsichtlich ein
48. Verifizierung der potentiell differentiell transkribierten CDNA Fragmente herangezogen werden konnten Abb 28 und Abb 29 zeigen 142 Ergebnisse die Hybridisierungsergebnisse nach 1 5 st ndiger Filmbelichtung Die Positionen der Nega tivkontrollen sind in blau umrandet Nach einer Neubewertung der nach dem Differential Screening als differentiell transkribiert angesehenen Klone unter Einbeziehung dieser Hybri disierungsergebnisse 1 5 stiindige Filmexposition verblieben von den 44 Klonen der subtra hierten L3ni cDNA Bank 22 Klone 50 0 und von den 58 Klonen der subtrahierten L31 cDNA Bank 26 Klone 44 8 als differentiell transkribiert Insgesamt ergaben sich somit 24 8 der 105 Klone der subtrahierten L3i cDNA Bank und 21 2 der 104 Klone der sub trahierten L3ni cDNA Bank als verifiziert differentielle Gentranskripte Klone der L3i cDNA Bank Klone der L3ni cDNA Bank Abb 28 S A PAM Nn bp T AA AAA gt 2 s gt 5 oe ee C ze u f 1 wma At pe ee ee Chemilumineszente Detektion nach Einsatz der L3i cDNA Sonde Ergebnisse Klone der L3i cDNA Bank Klone der L3ni cDNA Bank Abb 29 s 57 3 c yo ir t 143 4 8 Differentiell transkribierte Gene bei Dictyocaulus viviparus Chemilumineszente Detektion nach Einsatz der L3ni cDNA Sonde Folgende Klone der subtrahierten cDNA Banken konnten nach dem Differential Screening
49. Verlauf der Arbeit verwendeten Primer aufgef hrt Smal 1 Rsal Adapter 1 5 CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT 3 3 GGCCCGTCCA 5 Nested PCR Primer 1 5 TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT 3 PCR Primer 1 5 CTAATACGACTCACTATAGGGC 3 Nested PCR Primer 2R 5 AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT 3 Eael Rsal Adapter 2R 5 CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT 3 3 GCCGGCTCCA 5 Abb 7 Adaptersequenzen und in den PCRs verwendete Primer BD CLONTECH 84 Material und Methoden 3 8 9 3 Analyse der Ligationseffizienz Mindestens 25 der cDNAs m ssen Adapter an beiden Enden besitzen damit eine erfolgrei che subtraktive Hybridisierung gew hrleistet ist Um dies zu berpr fen wurde im Anschluss an die Ligation eine PCR durchgef hrt in welcher der PCR Primer 1 dessen Sequenz dem 5 Ende der Adapter entspricht s Abb 7 mit einem genspezifischen R ckw rtsprimer f r die L3 bzw HSM kombiniert und somit die Adapter cDNA Verbindung berspannt wird Als Referenz f r die Ligationseffizienz diente ein Reaktionansatz mit einem genspezifischen Pri merpaar Dieses wurde bei den Ans tzen der L3ni und L3i von dem mit dem Softwarepro gramm Lasergene DNASTAR Version 5 06 ausgew hlten Primer daf 1 II for und dem Pri mer daf 1 rev nach RICKLING 1999 repr sentiert wobei darauf geachtet wurde dass das Amplifikationsprodukt keine Rsal I Schnittstelle beinhaltete Bei den HSM Ans tzen wurden die
50. al 1989 Dabei k nnen die translatierten Proteine bei spielsweise durch den Ausschluss bestimmter funktioneller Gruppen sehr stark in ihrer Funk tion ver ndert oder gar inaktiv sein SMITH et al 1989 GRAVELEY 2001 MODREK u LEE 2002 Dies scheint bezogen auf die bereinstimmungen im Sequenzidentit tsvergleich und die Aminos urel nge der entsprechenden homologen Proteine und Isoformen insbeson dere auf die Sequenzen L3i 18 86 L3i 33c und L3i 88 2 zuzutreffen So besitzt die L31 88 2 die h chste bereinstimmung mit einer anderen Guanylyl Cyclase als die brigen L3i 88 Isoformen was auf eine differente Funktion dieser Isoform hindeutet Die L3i 18 86 Sequenzen wiesen im BLASTP Teilidentit ten zu anderen Proteinen als die L3i 99 auf wel che zudem nur in geringem Ma e signifikant waren M glicherweise handelt es sich hierbei um einen Verlust der Proteinfunktion Letzteres kann auch f r die Isoform L3i 33c angenom men werden welche keine signifikanten Homologien zeigte 188 Diskussion FROHMAN 1993 gibt jedoch zu bedenken dass durch variierende RACE Sequenzen unter Umst nden cDNA Fragmente generiert werden k nnen die in vivo nicht existieren Daher sollte mit Primern aus den u ersten Endbereichen der cDNAs die Existenz der zusammenge setzten Sequenzen berpr ft werden was in der vorliegenden Arbeit noch nicht erfolgt ist 5 5 5 Translation der differentiell transkribierten Sequenzen Bei der bersetzung de
51. auf Hierbei zeigten sich von 56 bzw 75 Nukleotiden 91 respektive 85 identisch wobei sich diese Ubereinstimmungen im Falle des Cosmids auf den Folgestrang bezogen Die in 251 Aminos uren bersetzte Insertsequenz stimmte mit dem oben genannten putativen Protein NP_507931 1 ber eine Teilsequenz von 148 Aminos uren zu 48 berein 56 Des Weiteren bestand noch ber 7 Aminos uren hinweg eine 85 ige Identit t 100 Der Klon L3i 82 beinhaltete ein 910 bp langes Insert welches 133 Aminos uren ergab Da von zeigten 95 Aminos uren eine 73 ige Teilidentit t 81 zu einer Phenylethanolamin N Methyltransferase PNMT von C elegans NP_505563 1 Mit einem weiteren Homolog sowie einem Mitglied der Familie der PNMTs von C elegans S27784 sowie NP_498914 1 waren von 86 Aminos uren 51 identisch 68 Das 496 Nukleotide umfassende Insert von Klon L3i 88 konnte in 106 Aminos uren bersetzt werden ber einen 74 Aminos uren umfassenden Teilbereich bestand eine Identit t von 55 66 mit einer Guanylyl Cyclase gcy 34 von C elegans NP_506319 1 Mit der gcy 32 und einer l slichen Guanylat Cyclase desselben Organismus NP_506452 1 und CAC35530 1 herrschten ber denselben Teilbereich Identit ten von 52 64 Weitere bereinstimmungen mit Guanylyl bzw Guanylat Cyclasen auch anderer Organismen wer den an dieser Stelle nicht weiter aufgef hrt Der Klon L3i 99 besa ein aus 548 bp bestehendes Insert welche
52. dem genspezifischen L3 Primer paar dessen Bandenintensit t als Referenz f r eine mindestens 25 ige Ligationseffizienz dienen sollte im Gegensatz zur Kombination von genspezifischem Vorw rtsprimer und adap terspezifischem Primer ligationsspezifisches Primerpaar zun chst kein PCR Produkt darge stellt werden Bei dem genspezifischen Primerpaar handelt es sich um eine Primerkombina tion aus der daf spezifischen PCR und somit um von C elegans abgeleitete Sequenzen Dabei ist nicht bekannt ob in der D viviparus cDNA Sequenzabschnitte vorliegen die mit diesen Primersequenzen zu 100 bereinstimmen Die geringere Amplifikationsrate des genspezifi schen Primerpaares beruht daher wahrscheinlich auf einer weniger effizienten Bindung der genspezifischen Primer an die cDNA Matrize im Gegensatz zu dem sequenzidentischen Adapterprimer Gest tzt wird die Annahme einer weniger spezifischen Bindung durch den im Agarosegel festgestellten Schmier Die Tatsache dass beim Einsatz des ligationsspezi fischen Primerpaares Banden nach weniger PCR Zyklen als mit dem genspezifischen Primer paar darstellt werden konnten wurde als zufrieden stellende Effizienz der Ligationsreaktion gewertet Die bei der gelelektrophoretischen Untersuchung der Suppression PCR festgestellte unter schiedliche Gr enverteilung und Intensit t der Amplifikationsprodukte der subtrahierten und nicht subtrahierten Proben sowie das Auftreten schwacher Banden bei den subtrah
53. der berlebensrate nach dieser Behandlung wurde die Anzahl lebender Larven in der Larvensus pension vor und nach der K hlung bestimmt Um vor der K hlung eine Aufreinigung der L3 zu erreichen wurden diese in frisches Leitungswasser berf hrt Zu diesem Zweck wurden die Larven in einen 250 ml Standzylinder gegeben dieser mit Leitungswasser aufgef llt und die Larven ber Nacht sedimentiert Am darauf folgenden Tag wurde der berstand bis auf ca 10 ml abgenommen die verbleibende Larvensuspension in einen 200 ml Erlenmeyerkol ben berf hrt und auf ca 50 ml mit Leitungswasser aufgef llt Zur Vermeidung von Konta minationen der Larvensuspension wurde die Gef ffnung mit Parafilm RENNER wel cher mit kleinen L chern zur Sauerstoffzufuhr versehen wurde verschlossen 62 Material und Methoden 3 6 4 berpr fung der Hypobiosef higkeit des Laborstammes 3 6 4 1 Experimentelle Infektion Bei insgesamt drei m nnlichen K lbern im Alter von drei Monaten erfolgte zur gleichen Zeit eine orale Infektion mit den zwei zu untersuchenden Larvenpopulationen L3i L3ni Kalb 1 wurde dabei an drei aufeinander folgenden Tagen mit jeweils 1000 nicht vorbehandelten in fekti sen dritten Larven L3ni oral infiziert Bei Kalb 2 und 3 erfolgte die Infektion an zwei aufeinander folgenden Tagen mit je 10 000 infekti sen larvalen Stadien die zuvor einer sechsw chigen K hlung bei 4 C L3i unterzogen wurden 3 6 4 2 Isolierung von D v
54. der Firma APOGENT DISCOVERIES Wehrheim Als Reaktionsgef e wurden 0 5 ml Safe Lock Reaktionsgef e der Firma EPPENDORF Ham burg 1 5 ml und 2 ml GefaBe sowie 0 5 ml 1 5 ml und 2 ml DEPC GefaBe der Firma BIO ZYM Hessisch Oldendorf 11 ml Gef e der Firma NUNC Wiesbaden und 50 ml Gef e der Firma RENNER Dannstadt verwendet In der quantitativen real time PCR wurden als Reak tionsgefaBe 8x strip tubes im 0 2 ml Format sowie optische Deckel 8x strip optical cap der Firma STRATAGENE Amsterdam Niederlande genutzt Fir die PCR wurden Sterilfiltertips der Firma BIOZYM Hessisch Oldendorf sowie oberfl chenoptimierte Sterilfiltertips der Fir ma NERBE PLUS Winsen genutzt Alle Amplifikationsreaktionen liefen soweit nicht anders vermerkt im MJ Research Multicycler PTC 200 BIOZYM ab 3 4 Bakterien und Vektoren Escherichia coli One Shot TOP10 F mcrA A mrr hsdRMS mcrBC d80lacZAM15 AlacX74 deoR recAl araD139 A ara leu 7697 galU galK rpsL Str endAl nupG pCR 4 TOPO 60 Material und Methoden 3 5 Versuchsplan Zun chst sollte versucht werden mit Hilfe sequenzspezifischer Primerpaare f r Gene die bei dem ebenfalls zur Entwicklungshemmung befahigten Erdnematoden Caenorhabditis elegans in diesen Prozess involviert sind eventuelle Sequenzhomologe bei Dictyocaulus viviparus zu identifizieren Dies erfolgte mittels Amplifikation genomischer DNA adulter Lungenw rmer mit anschlie ender Klonierung Sequenzierung und Sequenz
55. der Insertkontrolle eine Bande im Gel auf wiesen wurden je 600 ul abgenommen diese mit 600 ul Glyzerol gr ndlich durchmischt und bei 20 C gelagert Diese Glyzerolstocks repr sentierten neben der nachfolgend gewonnenen Plasmid DNA die subtrahierten L3ni bzw L3i cDNA Banken Nach dem Anlegen der Glyzerolstocks wurde mit dem Rest der jeweiligen Fl ssigkultur eine Plasmidpr paration in Form einer Miniprep s 3 7 9 1 durchgef hrt Diese diente falls ein Anz chten der Bakterienzellen aus den Glyzerolstocks nicht mehr m glich oder das Insert nicht mehr vorhanden sein sollte als Reserve f r eine erneute Transformation 3 10 Differential Screening 3 10 1 cDNA dot blotting F r das Differential Screening der subtrahierten L3ni und L3i Banken wurden die 104 re spektive 105 Amplifikationsprodukte der in Kapitel 3 9 2 beschriebenen Insertkontrolle auf eine positiv geladene Nylonmembran ROCHE aufgebracht Da im Differential Screening als Sonden neben den subtrahierten cDNAs auch die Tester Kontrollen der L3ni und L3i einge setzt werden sollten wurden vier identische Membranen mit den zu berpr fenden L3 cDNAs sowie den Negativkontrollen C1 und C2R angefertigt Um eine Hybridisierung der aufgetragenen cDNAs mit der Sonde zu erm glichen mussten die Proben zun chst denaturiert werden Hierzu wurden je 6 ul frisch angesetzter NaOH L sung 0 6 M mit 6 ul PCR Produkt der L3ni L3i Cl und C2R vermengt Dies geschah wie au
56. der PCR eingesetzte DIG DNA Labeling Mix ROCHE enthielt ne ben 0 65 mM dTTP und 0 35 mM DIG dUTP die brigen dNTPs in einer Konzentration von je 1 mM Die L sung wurde daher zu gleichen Teilen mit einem dNTP Mix von je 1 mM dATP dCTP dGTP und dTTP vermischt um das angestrebte 1 6 Verh ltnis zu erreichen Als Ausgangsmaterial f r die Herstellung der subtrahierten und nicht subtrahierten Sonden diente das jeweilige dreifach verd nnte Suppression PCR Produkt der L3ni und L3i Folgende 25 ul Dreifachreaktionsans tze gingen f r jede Probe in die PCR ein Material und Methoden 93 2 5 ul 10x Advantage 2 PCR Puffer 1 ul Nested Primer 1 10 uM 1 ul Nested Primer 2R 10 uM 5 ul dNTP Mix ImM dATP 1 mM dCTP 1 mM dGTP 0 825 mM dTTP 0 175 mM DIG dUTP 0 5 ul Advantage 2 Polymerase Mix 1 ul Template Die einzelnen Temperaturschritte entsprachen den unter 3 9 1 beschriebenen Reaktionsbedin gungen allerdings wurde die Denaturierungszeit auf 30 Sekunden verl ngert Nach Ablauf der Reaktion wurden die drei Ans tze je Probe zusammengef hrt und einer Gelelektrophorese unterzogen 3 10 2 2 Aufreinigung der DIG markierten Sonden Um optimale Bedingungen f r den im n chsten Schritt durchzuf hrenden Multi Enzymverdau zu schaffen mussten die PCR Pufferbestandteile entfernt werden Zu diesem Zweck kamen CHROMA SPIN 100 Columns BD CLONTECH zum Einsatz Somit wur den gleichzeitig nicht inkorporierte Primer dNTPs und die P
57. der je zwei L3ni L3i und HSM Proben mit n Butanol auf das geforderte Volumen wie unter 3 8 2 beschrieben Weiterhin wurde jede Probe mit 0 5 ul Glykogen 20 ug ul ROCHE versetzt um die Ausbeute an cDNA im Eluat zu erh hen Der Pufferaustausch der Gelmatrices mit 1x TNE Puffer und die nachfolgende Aufreini gung wurden nach dem beiliegenden Herstellerprotokoll durchgef hrt Abschlie end wurden die zwei Eluate der L3ni L3i und HSM Probe in jeweils ein Gef zusammengef hrt 3 8 7 eDNA Pr zipitation Um eine cCDNA L sung mit einer Konzentration von mindestens 300 ng ul f r die sp tere Adapterligation zu erhalten erfolgte eine F llung der cDNA Als monovalentes Salz wurde Ammoniumacetat verwendet da dieses in einer Konzentration von 2 bis 2 5 M in der DNA L sung die Kopr zipitation von Oligonukleotiden bis 30 bp unterbindet Zu den je 130 ul aufgereinigter L3ni L3i und HSM Probe wurden folgende Komponenten gegeben 2 ul Glykogen 20 ug ul ROCHE 58 4 ul Ammoniumacetat 7 5 M 476 ul 95 iges Ethanol Die Pr zipitation fand bei 20 C ber Nacht statt Es schloss sich eine Zentrifugation bei 13 000 g fiir 30 Minuten bei 4 C an Der Uberstand wurde abgenommen und die Pellets zweimal mit 70 igem Ethanol gewaschen Nach dem Trocknen der Pellets bei RT f r ca 10 Minuten wurden diese in 8 ul Ampuwa gel st 82 Material und Methoden 3 8 8 Konzentrationsbestimmung der cDNA Lo sung Zur Bestimmung der c
58. des Laborstammes 102 102 103 104 104 105 109 110 111 113 114 115 116 116 117 120 120 121 122 122 122 123 124 124 124 124 4 2 Quantitative Bestimmung und Reinheit der isolierten mRNA 4 3 Suppression Subtractive Hybridization 4 3 1 Bestimmung der optimalen Anzahl an PCR Zyklen und LD PCR 4 3 2 Gelanalyse der mittels S ulenchromatographie aufgereinigten cDNA Proben 4 3 3 Restriktionsenzymspaltung mit Rsal 4 3 4 Gelanalyse der extrahierten und aufgereinigten Proben 4 3 5 Konzentrationsbestimmung der cCDNA L sung 4 3 6 Analyse der Adapterligationseffizienz 4 3 7 Suppression PCR 4 3 8 Nested PCR 4 3 9 Analyse der Subtraktionseffizienz 4 4 Subtrahierte cDNA Banken 4 4 1 Nested PCR 4 4 2 Subtrahierte cDNA Banken der L3ni und L3i 4 5 DIG markierte cDNA Sonden 4 5 1 Herstellung DIG markierter CDNA Sonden f r das Differential Screening 4 5 2 berpr fung der DIG cDNA Sonden 4 6 Differential Screening 4 7 Verifizierung differentiell transkribierter Sequenzen 4 7 1 Synthese DIG markierter cDNA Sonden der L3ni und L3i 4 7 2 Restriktionsenzymspaltung der DIG cDNA Sonden 4 7 3 Konzentrationsbestimmung der L3ni und L3i Sonden 4 7 4 berpr fung der DIG markierten L3ni und L3i Sonde 4 7 5 Chemilumineszente Detektion 4 8 Differentiell transkribierte Gene bei Dictyocaulus viviparus 4 8 1 Darstellung der Inserts 4 8 2 Sequenzierung der Inserts und Sequenzbearbeitung 4 8 3 Sequenzidentit tsvergleiche 4 8 3 1 Mittel
59. die L ufe der qPCR im selben Ger t Diese Variabilit t die mit mangelnder Reproduzierbarkeit der Daten einhergeht ist dabei von vielf ltiger Genese und hat somit eine Aufsummierung der Variabilit ten zur Folge So sind die mRNA Isolierung die reverse Transkription und auch die Amplifikationsreaktionen nicht immer von gleicher Effizienz Auch spielt neben der durch Pipettierungenauigkeiten differie renden Quantit t des Templates des Plasmids f r die Standardreihen der Primer sowie der Sonde auch die Qualit t der genannten Reaktionskomponenten eine wesentliche Rolle Dabei waren Qualit tsm ngel der Primer und im Speziellen der TaqMan und TaqMan MGB Sonden ein wiederholtes Problem insbesondere nach zwei bis dreimaliger Verwendung ei nes Aliquots Nach Meinung von BUSTIN 2002 ist weiterhin dem Quencher Bedeutung beizumessen So sei beim Einsatz von Sonden mit nicht fluoreszierenden Quenchern welche auch die TaqMan MGB Sonden dieser Arbeit gebunden waren im Gegensatz zu fluores zierenden Quenchern eine weniger gute Spezifit t und Reproduzierbarkeit gegeben Diese vermindert sich weiterhin auf Grund stochastischer Effekte mit sinkender initialer Kopienzahl PECCOUD u JACOB 1996 wodurch auch die Ermittlung differentieller Transkriptionsra ten erschwert wird FREEMAN et al 1999 Um das Problem der sehr stark variierenden Kopienzahlen zu umgehen sollte neben der abso luten auch eine auf den jeweiligen Ct Werten basierende
60. die nicht in der dauer larva transkribiert werden Dahingegen ordneten die Autoren 358 Transkripte als dauer larva spezifisch ein F r Letztgenannte stell ten WANG u KIM 2003 unter Verwendung von DNA Microarrays sogar 540 spezifische Gene fest Hinsichtlich der differentiellen Gentranskription ist jedoch anzumerken dass das Transkripti onsprofil nicht in allen Fallen auch mit dem Proteinprofil korreliert ist GRIFFIN et al 2002 So k nnen f r viele Gene signifikante Unterschiede bez glich der vorliegenden Menge an Transkript und korrespondierendem Protein festgestellt werden Ein Grund hierf r ist die vari ierende sequenz und strukturspezifische Halbwertszeit der verschiedenen Transkripte im Hinblick auf die Degradierung durch RNasen NEVINS 1983 WANG et al 2002 Auf der Stufe der Proteinsynthese regulieren verschiedene Faktoren vorrangig die Initiation der Trans lation in geringerem Umfang auch die Elongation und Termination PROUD 1986 Ferner wird die Funktion der translatierten Proteine durch deren Modifikation sowie intermolekulare Interaktionen reguliert GRIFFIN et al 2002 5 6 1 L3ni assoziierte Gene Die aufregulierten Gentranskripte der nicht Hypobiose induzierten Larven wiesen signifikante Homologien zu extrazellul ren Kupfer Zink Superoxiddismutasen L3ni 69 92 Paramyosi nen L3ni 16 nukle ren anchorage Proteinen L3ni 67 dem Vorl ufer eines exkretier ten sezernierten Proteins L3ni 51 einem putative
61. dieser Benzimidazole gegen adulte Stadien Schrifttum 23 von O ostertagi knapp 79 bzw 64 betrug konnten die Autoren bei inhibierten vierten Stadien nur eine 32 ige respektive 40 ige Wirksamkeit feststellen Bei der Applikation von Albendazol und Ivermectin Pour on hingegen ergaben sich keine Differenzen bez glich der Wirksamkeit Ebenso konnten BARTH u PRESTON 1987 in den Lungen Ivermectin behandelter Tiere keine inhibierten Lungenwurmstadien auffinden In der nicht behandelten Tiergruppe bestand die Parasitenpopulation hingegen zu ber 99 aus gehemmten f nften Stadien Nach Verabreichung von Levamisol ergab sich f r inhibierte und adulte Stadien von H contortus und O ostertagi eine ann hernd gleiche Reduktion von mindestens 96 9 ANDREWS 2000 Eine interessante Entdeckung bez glich der Wirksamkeit von Benzimi dazolen machten MILLER u OLSON 1990 in Louisiana Sie beobachteten eine bessere Effektivit t gegen hypobiotische O ostertagi Larven im Fr hjahr und Herbst im Gegensatz zum Sommer der Mitte der Inhibitionsperiode EYSKER 1997 vermutet diesbez glich ei nen tieferen Schlaf der gehemmten Stadien in der Mitte als zu Beginn oder Ende der Inhibi tionsperiode Eine Reaktivierung inhibierter Larven nach dem Einsatz von Anthelminthika wie sie beispielsweise als Pathomechanismus bei der larvalen Cyathosthominose des Pferdes diskutiert wird konnte zumindest f r Fenbendazol und Moxidectin nicht best tigt werden
62. her Ausbeute bei gleichzeitig verminderter Fehlerrate Die zur Ankersequenz des CDS Pri mers und SMART II Oligonukleotids komplement ren Basen dienen als Zielsequenz f r den PCR Primer s Abb 5 Somit erfolgt eine exponentielle Amplifikation nur bei cDNAs voller L nge da bei unvollst ndiger reverser Transkription nur eine Bindungsstelle f r den PCR Primer vorhanden ist 3 7 3 3 Bestimmung der optimalen Anzahl an LD PCR Zyklen Wird die Ausbeute an PCR Produkt nicht mit weiteren Zyklen erh ht hat die PCR ein Pla teau erreicht Erfolgen mehr Zyklen als es zum Erreichen des Plateaus erforderlich w re ver mindert sich die Qualit t der synthetisierten cDNA Mittels Gelelektrophorese wurde die An zahl der Zyklen mit der cDNA in ausreichender Menge und guten Template Eigenschaften f r sp ter durchzuf hrende Schritte gewonnen werden kann bestimmt Dabei wurde der Zyk lus vor dem die Plateauphase erreicht wurde als die optimale PCR Zyklenzahl definiert Zur Ermittlung der optimalen Zyklenzahl wurde neben den f r das eigentliche Experiment ben tigten Reaktionsans tzen ein weiterer als Testansatz in der LD PCR amplifiziert Nach 15 erfolgten PCR Zyklen mit dem unten dargestellten Temperaturprofil wurden die f r den weiteren Verlauf erforderlichen Proben bei 4 C aufbewahrt Von den verbleibenden Testan s tzen der L3ni und L3i wurden 15 ul zur Bestimmung der optimalen Zyklenzahl f r die sp tere Gelelektrophorese abgenom
63. nnte ber einen Rezeptor des Parasiten dessen Weiterentwicklung f rdern ARASU 2001 Untersuchungen ergaben ferner dass cGMP die Aktivierung dritter infekti ser Hakenwurmlarven vermittelt HAWDON u DATU 2003 Nach Meinung der Autoren ist diese Aktivierung zum Parasitismus analog der Aufhebung der Entwicklungsin hibition von C elegans so dass die Signalwege f r dessen recovery als Modell f r die Wirts infektion mit A caninum und anderen Parasiten dienen k nnte 2 4 Ermittlung differentiell transkribierter Gene Eine differentielle Gentranskription verschiedener Populationen oder Gewebe resultiert in mRNA Populationen die Konzentrationsunterschiede bez glich der mRNAs aufweisen wel che von induzierten bzw reprimierten Genen transkribiert werden Um diese Gene aus der gro en berzahl nicht differentiell transkribierter Gene zu ermitteln wurden eine Vielzahl von Verfahren wie das Differential Screening TEDDER et al 1988 RNA Fingerprinting LIANG u PARDEE 1992 WELSH et al 1992 subtraktive Hybridisierungsverfahren Schrifttum 43 SARGENT u DAWID 1983 HUBANK u SCHATZ 1994 DIATCHENKO et al 1996 cDNA Array Hybridisierung SCHUMMER et al 1997 sowie die serielle Analyse der Ge nexpression VELCULESCU et al 1995 entwickelt Im Folgenden sollen einige der am h u figsten genutzten Methoden eingehender Erw hnung finden 2 4 1 Fingerprinting Verfahren 2 4 1 1 Differential Display DD Das von LIANG und
64. of these genes were designed By cloning and sequencing of 83 amplification products there was no indication of such genes in D viviparus By the results of this project there is a first insight to the genetic regulation of inhibited and not inhibited larval development of the bovine lungworm 210 Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis ABU SOUD H M L L YOHO u D J STUEHR 1994 Calmodulin controls neuronal nitric oxide synthase by a dual mechanism J Biol Chem 269 32047 32050 AFONINA L I KUTYAVIN E LUKHTANOV R B MEYER u H GAMPER 1996 Sequence specific arrest of primer extension on single stranded DNA by an oligonucleotide minor groove binder conjugate Proc Natl Acad Sci USA 93 3199 3204 AIELLO L P G S ROBERTSON Y LIN Y NISHIO u G L KING 1994 Identification of multiple genes in bovine retinal pericytes altered by exposure to elevated levels of glucose by using mRNA differential display Proc Natl Acad Sci USA 91 6231 6235 ALBERT P S S J BROWN u D L RIDDLE 1981 Sensory control of dauer larva formation in Caenorhabditis elegans J Comp Neurol 198 435 451 ALBERT P S u D L RIDDLE 1983 Developmental alterations in sensory neuroanatomy of the Caenorhabditis elegans dauer larva J Comp Neurol 219 461 481 ALBERT P S u D L RIDDLE 1988 Mutants of Caenorhabditis elegans that form dauer like larvae Dev Biol 126 270 293 ALTSCHUL S F W GIS
65. relative Quantifizierung vorgenom men werden Diese Methode der Quantifizierung erschien insofern als besser geeignet als dass die Ct Werte der einzelnen Duplikate nur geringe Standardabweichungen aufwiesen und oftmals auch innerhalb der verschiedenen L ufe eines Templates geringere Variationen auf wiesen als die ermittelten Kopienzahlen Diese Art der Berechnung konnte jedoch auf Grund ungleicher PCR Effizienzen des Elongationsfaktors la und der jeweiligen Zielsequenz nicht vorgenommen werden In Anbetracht der m glichen differentiellen Transkription der Referenzsequenz EF 1o in Ver bindung mit der mangelnden Reproduzierbarkeit erscheinen die Ergebnisse der quantitativen real time PCR bez glich einer um den Faktor 21 respektive 2 erh hten Kopienzahl der L3i 82 101 bzw L3ni 69 92 Sequenz in den Hypobiose induzierten Dictyocaulus Larven 202 Diskussion zweifelhaft Allerdings k nnten die erhaltenen Daten dahingehend interpretiert werden dass gr ere Unterschiede in der Transkriptionsrate der L3i 82 101 als der L3ni 69 92 zwischen den beiden Larvenpopulationen bestehen 5 9 daf und age 1 spezifische PCR Bei dem zur Hypobiose bef higten Erdnematoden C elegans ist bereits eine Vielzahl von Genen bekannt die den Prozess der Entwicklungshemmung regulieren Davon ausgehend dass beim Lungenwurm des Rindes die genetische Regulation der Hypobiose ber homologe Proteine erfolgen k nnte wurde genomische D viviparus DNA auf eventue
66. s 3 15 5 der Sequenzen L3ni 69 92 und L3i 82 101 In dieser konventionellen PCR wurde der in der qPCR genutzte Brilliant Quantitative PCR Core Reagent Kit STRATAGENE verwendet Material und Methoden 115 Folgende Komponenten waren in den 25 ul Reaktionsans tzen enthalten 2 5 ul 10x Core PCR Puffer 1 ul dNTP Mix je 5 mM 1 ul MgCl 50 mM 1 ul SOD for bzw NMT for 50 uM 1 ul SOD rev bzw NMT rev 50 uM 0 5 ul SureStart Tag DNA Polymerase 5 U ul 2 ul 5 RACE cDNA der L3ni bzw L3i Die Amplifikationsreaktion lief bei folgendem Temperaturprofil ab Aktivierung der Polymerase 95 C 10 Minuten 40 Denaturierung 94 C 15 Sekunden x Primerannealing und extension 56 4 C L3ni 69 56 8 C L3i 82 30 Sekunden Nach Ablauf der PCR wurden die Amplifikationsprodukte gelelektrophoretisch auf Intensi t tsunterschiede der Banden bez glich der zwei cDNA Populationen hin untersucht 3 15 3 Synthese der Erststrang cDNA Von den beiden Larvenpopulationen wurden je zwei Erststrang cDNAs f r den Einsatz als Matrize in der quantitativen real time PCR synthetisiert wobei jeweils etwa gleiche Mengen an mRNA in die Umschreibung eingingen Aus insgesamt 751 ug bzw 378 ug isolierter L3ni mRNA und 377 ug bzw 753 ug isolierter L3i mRNA Isolierung 6 s 4 2 wurde wie in Ka pitel 3 13 3 beschrieben cDNA mittels des 3 CDS Primer und des SMART II A Oligonukle otid SMART RACE cDNA Amplification Kit
67. und 9 sind die Ergebnisse der qPCR unter Verwendung der unverdiinnten Templates dargestellt Dabei sind die Ct Werte und Kopienzahlen der Duplikate jeweils als Mittelwerte mit den entsprechenden Standardabweichungen und Variationskoeffizenten angegeben Zur 170 Ergebnisse Normalisierung der Transkriptionsrate zwischen den beiden Larvenpopulationen wurde zu dem berechnet wie viele L3ni 69 92 respektive L3i 82 101 Kopien auf eine EF 1a Kopie entfallen In der qPCR verwendete Templates cDNA 1 Erststrang cDNA 1 aus Isolierung 6 cDNA 2 Erststrang cDNA 2 aus Isolierung 6 cDNA 3 5 RACE cDNA aus Isolierung 5 cDNA 4 3 RACE cDNA aus Isolierung 3 cDNA 5 5 RACE cDNA aus Isolierung 3 171 Ergebnisse uarz ygaoysuogerer AD Sunyataaqepsepuels IS adoy q Jq oad uardoy Z6 69TET 19 s rzE 6E 7616 rO EzogT TL SSHT ZI TIGE FI ERLEE 89 6Z9L rO E 602 ER SZST OrDESI Br IPE TE CP LL 917899 OlOs 6tt EO eZIST Oo Z60EE PES 896 LEISSTZ PS L60LT 9 LPT 13 PS IE L 39902 PIEI SZERT ITOrZZ Lg Sgzz Or Les 0 SE0T E PaPZLel 08196 009862 02 058 0823 szog O626 s080 02 885 SETE STIE OS8PreT O08 Tz O069FT Oerrrt OSeest 00085 OrSss O9ZET F 01 76 69 MET zuanbag sap Fag IWY aayeywuen y OF 6 ZT 6r OF ST 11 809 STALE EPP 19S 3 PLPZ 6LTLET PZ TIS r6 019 zL 087 Ig Ze 16 97 zo CELE 11 101 62 229 66 ES 01 99t 9LOZLT 66 06ST LS P
68. und der Trichostrongylidosen des Rindes Schweiz Arch Tierheilkd 114 652 667 EDELMAN A M D K BLUMENTHAL u E G KREBS 1987 Protein serine threonine kinases Annu Rev Biochem 56 567 613 ENIGK K u D D WEL 1962 Beitrag zur Epizootiologie der Dictyocaulose des Rindes Dtsch tier rztl Wschr 69 72 78 ENIGK K u J HILDEBRANDT 1969 Zur Empf nglichkeit der Wiederk uer f r Dictyocaulus viviparus und Dictyocaulus filaria Strongyloidea Nematoda Zentralbl Veterin rmed B 16 77 ENTROCASSO C M 1988 Epidemiology and control of bovine ostertagiasis in South America Vet Parasitol 27 59 65 EPE C S BIENIOSCHEK S REHBEIN u T SCHNIEDER 1995 Comparative RAPD PCR analysis of lungworms Dictyocaulidae from fallow deer cattle sheep and horses Zentralbl Veterin rmed B 42 187 191 EPE C G v SAMSON HIMMELSTJERNA u T SCHNIEDER 1997 Differences in a ribosomal DNA sequence of lungworm species Nematoda Dictyocaulidae from fallow deer cattle sheep and donkeys Res Vet Sci 62 17 21 Literaturverzeichnis 219 EPE C WOIDTKE S M PAPE M HEISE F KRAEMER C KOHLMETZ u T SCHNIEDER 1999 Strategic control of gastrointestinal nematode and lungworm infections with eprinomectin at tournout and eight weeks later Vet Rec 144 380 382 ERMOLAEVA O D u E D SVERDLOV 1996 Subtractive hybridization a technique for extraction of DNA sequences distinguishing
69. weitere sechs bis acht Wochen ohne Energiezufuhr Auch CHERKASOVA et al 2000 messen der mit einem Energiemangel verbundenen Hungerpha se der C elegans dauer larva eine gewisse Bedeutung im Hinblick auf deren verst rkte Gentranskription bei Allerdings stellten die Autoren f r alle der von ihnen untersuchten dau er spezifischen C elegans Gene ein charakteristisches Transkriptionsmuster w hrend der Zeit der Entwicklungshemmung fest W hrend die Transkriptionsraten initial am h chsten waren fielen diese am dritten Tag moderat ab um daraufhin konstant zu verbleiben Daher schluss folgern CHERKASOVA ct al 2000 dass die Induktion dieser Gene einen Teil des dauer spezifischen Genprogramms bilden Sei die Aufregulation nur eine sekund re Antwort auf die fehlende Energiezufuhr w rde die Transkription dieser Gene nach Meinung der Autoren nicht abfallen und hernach konstant bleiben sondern mit zunehmender Dauer des Hungerns sogar ansteigen Um eine Aufregulierung bestimmter Gene als Antwort auf einen Energie mangel sicher auszuschlie en h tten in der vorliegenden Arbeit gek hlte und ungek hlte D viviparus Larven gleichen Alters verwendet werden m ssen Dies war jedoch nicht zu be werkstelligen da die Lebensdauer von bei Raumtemperatur inkubierten dritten Lungenwurm larven stark begrenzt ist Letztlich k nnten vergleichende Untersuchungen der Gentranskrip tion hypobiotischer und nicht hypobiotischer Stadien im Wirt L4 L5 die Frage k
70. welche neben der Anreicherung der Targets auch zu einer weitestgehenden Elimination der Driver Sequenzen f hrt Zudem erfolgt eine zus tzliche Degradierung der Sequenzen die Tester und Driver ge meinsam besitzen Zur Durchf hrung der RDA welche in Abb 2 schematisch dargestellt ist werden die zu ver gleichenden Populationen zun chst mittels eines Restriktionsenzyms fragmentiert Dieser Schritt ist auf genomischer Ebene zur Reduktion der Komplexit t sowie der Herstellung effi 48 Schrifttum zient amplifizierbarer Templates im L ngenbereich von 150 bp bis 1000 bp unbedingt erfor derlich Durch die Spaltung der DNA mit einem six cutter Restriktionsenzym entstehen die so genannten representations welche ungef hr 2 15 des Genoms ausmachen LISIT SYN etal 1993 LISITSYN 1995 Im Gegensatz dazu leitet sich eine mRNA Population von ungef hr 15 000 Genen ab und repr sentiert somit nur 1 2 des Genoms ALBERT et al 1994 eine Reduktion der Komplexit t ist daher bei cDNA Templates unn tig Bei dieser Applikation dient der Verdau mit einem four cutter der Bereitstellung mindestens eines amplifizierbaren Fragments jeder cDNA Spezies und einer insgesamten Maximierung der representations HUBANK u SCHATZ 1994 DIATCHENKO et al 1996 HUBANK u SCHATZ 1999 An die fragmentierten cDNA Populationen wird ein Adapter ligiert welcher aus einem 24 bp langen Oligonukleotid besteht Dem Reaktionsansatz wird ein weiteres
71. wie derholten Reaktionsans tzen bei allen Sequenzen Amplifikationsprodukte der 3 und 5 RACE zu erzielen Eine Ausnahme bildete jedoch die Sequenz L3ni 54 bei welcher mit bei den Primerkombinationen wie auch schon in der vorangegangenen Primer berpr fung in der RACE kein Amplifikationsprodukt nachgewiesen werden konnte Nach der Elektrophorese im 2 igen Agarosegel zeigten die RACE Produkte einiger diffe rentiell transkribierter Genfragmente eine klare Bande Bei anderen hingegen traten unab h ngig von der gew hlten Primerkombination mehrere Banden auf Hierbei wurden diejeni gen Banden kloniert welche die berechnete Mindestl nge der Amplifikationsprodukte ber schritten Bei der Insertkontrolle von jeweils drei Klonen pro Bande zeigten die einzelnen Inserts teilweise L ngendifferenzen von bis zu 50 bp In diesen F llen erfolgte eine Sequen zierung der jeweils differierenden Inserts Auf Grund verk rzter oder nicht zur Insertsequenz der Klone komplement rer RACE Produkte war in einigen F llen die Klonierung mehrerer Banden erforderlich Die Anzahl der klonierten Banden sowie die durchgef hrten Sequenzie rungen jeweils als Vorw rts und R ckw rtssequenz sind in Tab 3 aufgef hrt Dabei sind wiederholte Klonierungen ein und derselben Bande sowie erneute Sequenzierungen infolge einer nicht zufriedenstellenden ersten Sequenzierung mit ber cksichtigt Der Klon L3i 99 steht stellvertretend f r die teilidentischen Klon
72. zur Schnittstelle komplement res 12 bp langes Oligonukleotid hinzugef gt welches die Ligation seffizienz steigern soll Da die beiden Oligonukleotide nicht phosphoryliert sind wird nur das 24 bp lange Oligonukleotid an das 5 Ende der cDNA Fragmente ligiert welches auch in der folgenden PCR als Primer dient Die im Zuge der PCR generierten repr sentativen Amplikons werden zur Entfernung der Adapter einem nochmaligen Restriktionsenzymverdau unterzogen Um eine selektive Amplifikation der differentiellen Transkripte in einer weiteren PCR zu er m glichen erfolgt die Ligation eines neuen Adapters nur bei der Tester Population In der sich anschlie enden Hybridisierung in der das Driver Tester Verh ltnis 100 1 betr gt k nnen drei verschiedene Hybridmolek le gebildet werden Am h ufigsten sind Driver Driver Hybridmolek le welche keine Adapter besitzen Daher k nnen bei diesen Mo lek le w hrend des Auff llens der Enden keine Primerbindungsstellen generiert werden eine Amplifikation dieser Driver Sequenzen in der nachfolgenden PCR ist somit ausgeschlossen Das n chsth ufige Produkt stellen Driver Tester Hybride dar Durch das Verh ltnis der einge setzten CDNA Mengen hybridisieren nicht differentielle Tester Sequenzen hundertmal wahr scheinlicher mit dem Driver als mit sich selbst Diese gemeinsamen Sequenzen werden daher in erster Linie linear amplifiziert Nur die Tester Sequenzen welche Tester Tester Hybride bilden besitzen P
73. 0 YOKOTA et al 2001 Die von verschiedenen Autoren angege benen Prozents tze verifiziert differentiell transkribierter Klone variieren in diesem Zusam menhang von 94 STEIN 1997 bis unter 10 BREITENBACH et al 2001 CHAN et al 2002 STUBBS et al 1999 und REBRIKOV et al 2000 f hren eine hohe Zahl falsch po sitiver Klone auf geringe Differenzen zwischen den zu vergleichenden Populationen zuriick Im Rahmen eigener Untersuchungen konnten mit Hilfe des Differential Screenings 42 3 44 Klone der 104 Klone der subtrahierten L3ni cDNA Bank als differentiell transkribiert angesehen werden bei der L3i cDNA Bank galt dies f r 55 2 58 Klone der 105 Klone Nach dem Southern dot blotting verblieben gemessen an der Gesamtheit der Klone der jewei ligen subtrahierten cDNA Bank 21 2 22 Klone L3ni Klone und 24 8 26 Klone der L3i Klone als verifiziert differentiell transkribierte Genfragmente Auf Grund der beim Diffe rential Screening offensichtlichen Unterschiede beim Vergleich der Signalintensit ten der L3ni bzw L3i Klone nach der Hybridisierung mit subtrahierter L3ni respektive L3i cDNA war diese vergleichsweise geringe Zahl an positiven Klonen unerwartet YE und CONNOR 2000 stellten fest dass sich im Northern Blot regelm ig die Klone als falsch positiv her ausstellten welche beim vorangegangenen Screening sehr starke oder schwache Signale auf wiesen Nach Meinung der Autoren kann eine vom Normalbereich abweichende Sign
74. 0 1888 BREITENBACH U J P TUCKERMANN C GEBHARDT K H RICHTER G FURSTENBERGER G CHRISTOFORI u P ANGEL 2001 Keratinocyte specific onset of serine protease BSSP expression in experimental carcinogenesis The Journal of Investigate Dermatology 117 634 640 BRENNER S 1974 The genetics of Caenorhabditis elegans Genetics 77 71 94 Literaturverzeichnis 215 BROPHY P M L H PATTERSON u D L PRITCHARD 1995 Secretory nematode SOD offensive or defensive Int J Parasitol 25 865 866 BROWNLEE D L HOLDEN DYE u R WALKER 2000 The range and biological activity of FMRFamide related peptides and classical neurotransmitters in nematodes Adv Parasitol 45 109 180 B RGER H J 1983 Pathogenese Epizootiologie und Bek mpfungsm glichkeiten von Rundwurmerkrankungen beim Rind Prakt Tierarzt 64 3 10 B RGER H J 1987 Prophylaxe und Therapie parasit rer Krankheiten bei Wiederk uern in 17 Kongress DVG Bad Nauheim S 106 125 BURGLIN T R E LOBOS u M L BLAXTER 1998 Caenorhabditis elegans as a model for parasitic nematodes Int J Parasitol 28 395 411 BUSTIN S A 2000 Absolute quantification of mRNA using real time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 25 169 193 BUSTIN S A 2002 Quantification of mRNA using real time reverse transcription PCR RT PCR trends and problems J Mol Endocrinol 29 23 39 CAHILL C M G TZIVIO
75. 1 2 2 Bestimmung der optimalen Anzahl an LD PCR Zyklen 3 11 2 3 cDNA Sondenherstellung mittels LD PCR 3 11 2 4 Restriktionsenzymspaltung 3 11 2 5 Hybridisierung und Detektion 3 12 Selektion und weitere Bearbeitung differentiell transkribierter Genfragmente 3 12 1 Selektion differentiell transkribierter CDNA Sequenzen 3 12 2 Plasmidpr paration Sequenzierung und Sequenzidentit tsvergleich 3 13 Charakterisierung der differentiell transkribierten Genfragmente 3 13 1 Design der RACE und SL1 Primer 3 13 2 berpr fung der RACE Primer 3 13 3 Rapid Amplification of cDNA Ends RACE 3 13 4 Spliced leader 1 SL1 PCR 3 14 Uberpriifung differentiell transkribierter Sequenzen mittels konventioneller PCR 3 15 Quantitative real time PCR qPCR 3 15 1 Charakterisierung zweier housekeeping Gene von D viviparus 3 15 2 Uberpriifung der L3ni 69 92 und L3i 82 101 mittels konventioneller PCR 3 15 3 Synthese der Erststrang cDNA 3 15 4 Erstellung von Standardreihen 3 15 5 qPCR mit TaqMan Sonden 3 15 6 qPCR mit TaqMan MGB Sonden 3 16 daf und age 1 spezifische PCR 3 16 1 daf age 1 spezifische Primer 3 16 2 Amplifikation genomischer DNA 3 16 3 berpr fung der Sequenzen daf 12 0 und daf 16A u 3 16 3 1 Isolierung genomischer DNA 3 16 3 2 Primerdesign 3 16 3 3 Sequenzspezifische PCR 4 Ergebnisse 4 1 Parasitologisches Probenmaterial 4 1 1 Uberlebensrate der Larven nach Induktion der Entwicklungshemmung 4 1 2 berpr fung der Hypobiosefahigkeit
76. 134 Ergebnisse lelektrophorese einen Schmier im Bereich von ca 200 bp bis gut 2000 bp Die Kontroll cDNAs C1 und C2R die als sp tere Negativkontrollen im Differential Screening dienten wiesen die erwartete Fragmentl nge von ca 340 bp C1 bzw 200 bp C2R auf 4 4 2 Subtrahierte cDNA Banken der L3ni und L3i Mit Hilfe einer PCR erfolgte eine Insertkontrolle der Klone die zur Erstellung der subtrahier ten cDNA Banken ausgew hlt worden waren Dabei wurden 173 Klone der L3ni und 148 Klone der L3i berpr ft und solche ohne Insert oder mit mehr als einer Bande rote Pfeile in Abb 22 verworfen Somit wurden die subtrahierten CDNA Banken der L3ni und L3i von den jeweiligen Glyzerolstocks und der mittels Miniprep gewonnen Plasmid DNA der verbleiben den 104 Klone der L3ni sowie 105 Klone der L3i repr sentiert Die Insertl ngen der jeweili gen Klone variierten zwischen 250 bp und 2200 bp wobei die Mehrzahl der Klone ein 600 bp bis 1200 bp langes Insert besa Die Bezeichnung der Klone geschah durch Nennung der je weiligen Larvenpopulation L3ni oder L3i in Kombination mit der Nummer des Klons 1 bis 104 respektive 105 2000 bp 1200 bp 800 bp 400 bp Abb 22 Insertkontrolle einiger Klone der L3i 2 Yiges Agarosegel M Low DNA MASS Ladder K Negativkontrolle Ergebnisse 135 4 5 DIG markierte cDNA Sonden 4 5 1 Herstellung DIG markierter cDNA Sonden f r das Differential Screening Die mittels Nested PCR mit DIG
77. 1a Sequenz nicht gegeben war 174 Ergebnisse 4 12 daf und age 1 spezifische PCR Bei dem frei lebenden Nematoden C elegans wirken unter anderem die daf Gene sowie das age 1 Gen hemmend bzw f rdernd auf den Prozess der Entwicklungshemmung Mit insge samt 35 Primerpaaren welche anhand von 11 publizierten daf Gensequenzen sowie der age 1 Gensequenz aus verschiedenen Exonbereichen ausgew hlt bzw von RICKLING 1999 bernommen wurden sollte das Vorkommen dieser Gene bei D viviparus untersucht werden Dies geschah durch Amplifikation genomischer DNA adulter Lungenw rmer mit den genspe zifischen Primerpaaren wobei jede Reaktion im Doppelansatz erfolgte Nach Durchf hrung der PCR wurden die Proben auf 2 igen Agarosegelen analysiert Dabei zeigte sich lediglich bei der Primerkombination daf 1 eine einzelne Bande unter UV Beleuchtung welche auch der erwarteten Fragmentl nge von ca 380 bp entsprach Alle anderen Primerkombinationen lie en multiple Banden entstehen Es wurde jeweils die Bande der erwarteten Fragmentl nge sowie weitere besonders prominente Banden kloniert so dass letztlich 83 verschiedene Amplifikationsprodukte der daf und age 1 spezifischen PCR einer Sequenzierung unterlagen 4 12 1 Sequenzidentit tsvergleich auf Nukleins ureebene Die Genfragmente welche unter Verwendung der daf und age 1 spezifischen Primerkombi nationen amplifiziert worden waren wurden auf Nukleins ureebene BLASTN auf Identit ten mit b
78. 2 4 1 2 RNA Arbitrarily Primed PCR RAP PCR Die in Abb 1 dargestellte Methode der RNA Arbitrarily Primed PCR RAP PCR basiert auf einem dem DD sehr hnlichen Prinzip Der wesentliche Unterschied besteht im Einsatz eines 44 Schrifttum WELSH u McCLELLAND 1990 WILLIAMS et al 1990 oder zweier WELSH u Mc CLELLAND 1991 Zufallsprimer in der Erststrang cDNA Synthese in der RAP PCR statt der beim DD verwendeten Oligo dT Primer Daher kann die Arbitrarily Primed PCR neben dem RNA Fingerprinting WELSH et al 1992 MATHIEU DAUDE et al 1999 auch f r ein ge nomisches Fingerprinting WELSH u McCLELLAND 1990 WILLIAMS et al 1990 WELSH u McCLELLAND 1991 eingesetzt werden Bei ersterem werden durch die Zufalls primer auch solche mRNAs erfasst welche keine Poly A Ende besitzen zudem ist die Ana lyse einer differentiellen Transkription verschiedener Exons m glich WELSH et al 1992 MATHIEU DAUDE et al 1999 Erst und Zweitstrang cDNA Synthese erfolgen bei der RAP PCR unter wenig stringenten Bedingungen woran sich eine stringente PCR anschlie t Daher wird die Methode insensitiv gegen ber moderaten Verunreinigungen mit genomischer DNA Eine DNase Behandlung der RNA ist somit im Gegensatz zum DD nicht erforderlich MATHIEU DAUDE et al 1999 2 4 1 3 Vorz ge und Limitierungen der Fingerprinting Verfahren Mittels der Fingerprinting Verfahren besteht die M glichkeit mehr als zwei Populationen simultan vergleichen zu k nnen Ebens
79. 3ni 67 L3i 88 und L3i 99 Sequenzen beim Sequenzidenti t tsvergleich auf Aminos ureebene l ngere Teilidentit ten wenn statt der Sequenz ab dem ersten Methionin die gesamte translatierte Aminos uresequenz in den BLASTP einging Auf Grund dieser erh hten Identit ten in Verbindung mit jeweiligen Sequenzl nge der entspre chenden homologen Proteine ist davon auszugehen dass es nicht gelang das gesamte 5 Ende dieser Sequenzen zu ermitteln F r eine unvollst ndige Nuklein und damit Aminos urese quenz der L3ni 67 L3i 88 und L3i 99 spricht weiterhin die bestehende Sequenz bereinstim mung mit den jeweiligen C terminalen Bereichen der homologen Proteine Da die mRNA des L3ni 67 Homologs 22 980 Nukleotide umfasst ist eine Komplettierung dieser Sequenz mit tels der RACE respektive SL1 spezifischen PCR unwahrscheinlich Bez glich der L3i 88 Sequenzen ist anzumerken dass sich in dem gew hlten Leserahmen ein Stopcodon vor der translatierten Aminos uresequenz befindet Diese Tatsache spricht gegen ein unvollst ndiges 5 Ende Gemessen an der L nge der homologen Guanylyl Cyclasen von mindestens 646 Aminos uren im Gegensatz zu maximal 209 Aminos uren der verschiedenen L3i 88 Sequenzen scheint es sich bei dem Stopcodon vermutlich um einen Fehler in der Nukleins u resequenz zu handeln SAIKI et al 1988 sch tzen die Fehlerwahrscheinlichkeit der Taq Polymerase pro Nukleotid und Zyklus bei 20 PCR Zyklen auf 2x 10 FROHMAN et al 1988
80. 424 58 73 LI W S G KENNEDY u G RUVKUN 2003 daf 28 encodes a C elegans insulin superfamily member that is regulated by environmental cues and acts in the DAF 2 signaling pathway Genes Dev 17 844 858 LIANG P L AVERBOUKH u A B PARDEE 1993 Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by means of differential display refinements and optimization Nucleic Acids Res 21 3269 3275 LIANG P D BAUER L AVERBOUKH P WARTHOE M ROHRWILD H MULLER M STRAUSS u A B PARDEE 1995 Analysis of altered gene expression by differential display Methods Enzymol 254 304 321 LIANG P u A B PARDEE 1992 Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction Science 257 967 971 LIANG P u A B PARDEE 1997 Differential display A general protocol Methods Mol Biol 85 3 11 LIN K J B DORMAN A RODAN u C KENYON 1997 daf 16 An HNF 3 forkhead family member that can function to double the life span of Caenorhabditis elegans Science 278 1319 1322 LIN K H HSIN N LIBINA u C KENYON 2001 Regulation of the Caenorhabditis elegans longevity protein DAF 16 by insulin IGF 1 and germline signaling Nat Genet 28 139 145 LINTS R u S W EMMONS 2002 Regulation of sex specific differentiation and mating behavior in C elegans by anew member of the DM domain transcription factor family Genes Dev 16 2390 2402 LISITSYN N N LISITSYN u M WI
81. 5 738 72 4 60 5 Adenylyl Guanylyl Cyclase katalytische L3i 88a L3i88b L3i88c L3i88d L3i 88 2 Dom ne 194 aa smart00044 51 5 51 5 51 5 51 5 ns Proteine der EF Hand Superfamilie L3i 100a L3i100b L3i 100c 63 aa cd00051 100 100 90 5 67 aa cd00052 100 100 kein Alignment 151 aa KOG0027 98 77 987 815 152 aa KOG0030 954 94 80 3 160 aa COG5126 92 91 2 912 171 aa KOG0031 85 4 85 4 85 4 172 aa KOG0028 82 6 82 6 68 0 Weitere signifikante Homologien mit konservierten Dom nen von Proteinen der EF Hand Superfamilie werden hier nicht weiter beschrieben Tab 6 Sequenzidentitaten der differentiell transkribierten cDNA Sequenzen mit konservierten Dom nen n s nicht signifikant F r alle der oben aufgef hrten Sequenzen ergaben sich mit Ausnahme der L3ni 56 und L3i 53 weitere Identit ten mit konservierten Dom nen die jedoch nicht den gestellten An forderungen an eine Signifikanz gen gten 164 Ergebnisse 4 10 Uberpriifung differentiell transkribierter Sequenzen mittels konventioneller PCR Eine weitere berpr fung der differentiellen Transkription der cDNA Sequenzen welche beim Sequenzidentit tsvergleich signifikante Homologien zeigten erfolgte mittels konventio neller PCR In dieser fand neben Zweitstrang auch Erststrang cDNA der L3ni und L3i als Template Verwendung Die im 2 igen Agarosegel ermittelten Unterschiede der Bandenin tensit ten sind in Tab
82. 5a Immunological studies on Dictyocaulus viviparus infection Passive immunisation Vet Rec 67 291 297 JARRETT W F H W F M McINTYRE F W JENNINGS u W MULLIGAN 1957 The natural history of parasitic bronchitis with notes on prophylaxis and treatment Vet Rec 69 1329 1340 JARRETT W F H F W JENNINGS B MARTIN W I M McINTYRE W MULLIGAN N C C SHARP u G M URQUART 1958 A field trial of a parasitic bronchitis vaccine Vet Rec 70 451 453 JARRETT W F H F W JENNINGS W I M McINTYRE W MULLIGAN B A C THOMAS u G M URQUHART 1959 Immonological studies on Dictyocaulus viviparus infection The immunity resulting from experimen tal infection Immunol 2 252 267 JARRETT W F H W I M McINTYRE u G M URQUARD 1954 Husk in cattle A review of a year s work Vet Rec 66 676 JARRETT W F H W I M McINTYRE u G M URQUHART 1955b Some factors in the epidemiology of parasitic bronchitis in cattle Vet Rec 820 824 JIA K P S ALBERT u D L RIDDLE 2002 DAF 9 a cytochrome P450 regulating C elegans larval development and adult longevity Development 129 221 231 JOHNSON T E 2001 SAGE thoughts on aging Genome Res 11 1323 1324 Literaturverzeichnis 227 JONES R M N B LOGAN A J WEATHERLEY A S LITTLE u C D SMOTHERS 1993 Activity of doramectin against nematode endoparasites of cattle Vet Parasitol 49 27 37 JONES S J M D L R
83. 6 Transkriptionsfaktoren durch die daf 2 akt 1 und akt 2 Kinase verhindert deren Akkumulation im Zellkern und damit die Entwicklungshemmung HENDERSON u JOHNSON 2001 LIN et al 2001 Einen negativen Regulator der insulinartigen Signalkaskade stellt daf 18 ein PTEN Tumor suppressor Homolog dar Diese PIP3 Phosphatase antagonisiert die Funktion der age 1 PI3 Kinase und f rdert so die Entwicklungshemmung GIL et al 1999 MIHAYLOVA et al 1999 ROUAULT et al 1999 In der relativen Konzentration und Aktivit t von daf 18 re spektive age 1 vermuten GIL et al 1999 einen kritischen Punkt f r die weitere Larvenent wicklung von C elegans Die negative Regulation von daf 18 erfolgt dabei ber die daf 2 Genaktivitat MIHAYLOVA et al 1999 LEE et al 2001 sehen in daf 18 ein potentielles Verbindungsglied zwischen dem insulinartigen und TGF B Signalweg Kapitel 2 3 3 3 wel cher ebenfalls die zellul re Lokalisation von daf 16 reguliert Wie in kultivierten S ugetier zellen beobachtet k nnte TGF B die PTEN Transkriptionsrate senken dadurch die Aktivit t der akt 1 und akt 2 Serin Threonin Kinasen steigern und somit die nukle re Akkumulation von daf 16 welche die Bildung der dauer larva zur Folge hat verhindern LEE et al 2001 2 3 3 3 Transforming Growth Factor B TGF Signalweg Bei dem Erdnematoden C elegans sind nach PATTERSON u PADGETT 2000 drei Ligan den der TGF B Superfamilie bekannt Einer dieser Liganden n mli
84. 68 Eine rationelle Bek mpfung des Lungenwurmbefalls Veterin rmed Nachr 1 3 19 PRESIDENTE P J A u S E KNAPP 1973 Susceptibility of cattle to an isolate of Dictyocaulus viviparus from black tailed deer J Wildl Dis 9 41 43 PRESIDENTE P J A D E WORLEY u CATIN J E 1972 Cross transmission experiments with Dictyocaulus viviparus isolated from Rocky Mountain elk and cattle J Wildl Dis 9 41 43 PRICHARD R K A D DONALD u D R HENNESSY 1974 The effect of corticosteroid treatment on the development of inhibited Ostertagia ostertagi larvae Res Vet Sci 16 267 269 PROUD C G 1986 Guanine nucleotides protein phosphorylation and the control of translation TIBS 11 73 77 RAYMOND C S C E SHAMU M M SHEN K J SEIFERT B HIRSCH J HODGKIN u D ZARKOWER 1998 Evidence for evolutionary conservation of sex determining genes Nature 391 691 695 REBRIKOV D V O BRITANOVA N GURSKAYA K A LUKYANOV V S TARABYKIN u S A LUKY ANOV 2000 Mirror orientation selection MOS a method for eliminating false positive clones from libraries generated by suppression subtractive hybridization Nucleic Acids Res 28 e90 REHBEIN S M VISSER u R WINTER 2003 Helminth infection in cattle from Schleswig Holstein Germany after one grazing season Berl M nch tier rztl Wochenschr 116 41 44 236 Literaturverzeichnis REINKE V H E SMITH J NANCE J WANG J van DOREN
85. 69 92 und L31 82 101 nenennene 167 Amplification Plot eines L3ni und L3i Templates eesnensenseensennn 169 mRNA Isolierung aus dritten D viviparus Larven cennsnenensennsennnenn nn 125 Klone mit differentiell transkribierten Inserts ueeensennsenenenneennen 143 Anzahl klonierter Banden und Sequenzierungen der differentiell transkribierten Genfrasmenfei ahnisisnsekekliedunknikedeneundgenbannndenulsendssrdeit 154 Sequenzl ngen der erstellten Genfragmente ucnsensennseeseenseeneennneennne nennen 156 Sequenzidentit ten und Sequenz hnlichkeiten auf Aminos ureebene 159 160 Sequenzidentit ten der differentiell transkribierten cDNA Sequenzen mit konservierten Dom nen ne aer E E E E EEE E E EES 1632 163 Intensit tsunterschiede der Banden mit L3ni bzw L3i cDNA Templates 164 Qantitative real time PCR der Sequenz L3ni 69 92 uuuneeseensensennneennennnennnnnnenn nn 171 Qantitative real time PCR der Sequenz L3ni 82 101 uuneesesseeessenseenseenseennennenneenne nennen 172 Statistische Analyse der Transkriptionsraten in Bezug auf EF 1o eeeene 173 268 269 Danksagung Herrn Prof Dr Thomas Schnieder danke ich fiir die Uberlassung des Themas die stets freundliche Beratung und die jederzeit bestehende M glichkeit eines Gespr chs sowie das entgegengebrachte Vertrauen Herrn PD Dr Georg vo
86. 9 513 Literaturverzeichnis 217 CRAMER L G S R PITT S REHBEIN R P GOGOLEWSKI B N KUNKLE W K LANGHOFF K G BOND u A E MACIEL 2000 Persistent efficacy of topical eprinomectin against nematode parasites in cattle Parasitol Res 86 944 946 CROLL N A 1975 Indolealkylamines in the coordination of nematode behavioural activities Can J Zool 53 15 19 DALLEY B K u M GOLOMB 1992 Gene expression in the Caenorhabditis elegans dauer larva developmental regulation of Hsp90 and other genes Dev Biol 151 80 90 DAME J B M S BLOUIN v C H COURTNEY 1993 Genetic structure of populations of Ostertagia ostertagi Vet Parasitol 46 55 62 DAS M I HARVEY L L CHU M SINHA u J PELLETIER 2001 Full lenght cDNAs more than just reaching the ends Physiol Genomics 6 57 80 DAUGSCHIES A u A JOACHIM 2000 Eicosanoids in parasites and parasitic infections Adv Parasitol 46 181 240 DAVID G P 1993 Increased prevalence of husk Vet Rec 113 627 628 DE LEEUW W A u J B CORNELISSEN 1991 Identification and isolation of a specific antigen with diagnostic potential from Dictyocaulus viviparus Vet Parasitol 39 137 147 DEINDL E K BOENGLER N van ROYEN u W SCHAPER 2002 Differential expression of GAPDH and beta3 actin in growing collateral arteries Mol Cell Biochem 236 139 146 DENNIS E A 1994 Diversity of group types regulation and function of phosph
87. 999 BTI2 5 GAY TGY YTI CAR GGN TTY CA 3 Abb 12 Primerkombinationen zur Amplifikation der EF 1o und B Tubulin Fragmente 114 Material und Methoden F r die Amplifikation eines Sequenzabschnitts des B Tubulin Gens bzw EF la wurden fol gende 50 ul Reaktion angesetzt 5 ul GeneAmp 10x PCR Puffer II PERKIN ELMER 3 ul MgCl 25 mM 1 ul dNTP Mix je 2 mM 0 5 ul Vorwartsprimer 500 uM 0 5 ul R ckw rtsprimer 500 uM 0 25 ul AmpliTaq Gold Polymerase 5 U ul PERKIN ELMER 1 ul doppelstrangige cDNA der L3ni bzw L3i Die PCRs erfolgten bei unten stehendem Temperaturprofil Aktivierung der Polymerase 95 C 10 Minuten Denaturierung 94 C 1 Minute 36x Primerannealing 46 C Tubulin bzw 42 C EF la 1 Minute Primerextension 72 C 1 Minute finale Elongation 72 C 10 Minuten nur B Tubulin Im Anschluss an die PCR wurden die Proben auf ein Agarosegel geladen und die entstande nen Banden der erwarteten Fragmentl ngen der L3ni und L3i cDNA kloniert Jeweils ein Klon der L3ni und zwei Klone der L3i wurden sequenziert und mittels BLAST NCBI mit publizierten Gensequenzen anderer Organismen verglichen s Kapitel 3 7 7 bis 3 7 10 3 15 2 berpr fung der L3ni 69 92 und L3i 82 101 mittels konventioneller PCR In diesem Vorversuch zur qPCR erfolgte eine Amplifikation der 5 RACE cDNAs syntheti siert aus mRNA Isolierung 5 der zwei Larvenpopulationen mit den jeweiligen Primern f r die qPCR
88. A ERLICH 1988 Primer directed enzymatic amplification of DNA with thermostable polymerase Science 239 487 491 SAMBROOK J E F FRITSCH u T MANIATIS 1989 Molecular cloning A laboratory manual 2 Aufl Cold Spring Harbour Laboratory Press New York USA SAMSON HIMMELSTJERNA G v u T SCHNIEDER 1999 Morphology of inhibited larvae of the bovine lungworm Dictyocaulus viviparus J Helminthol 73 79 83 Literaturverzeichnis 237 SAMSON HIMMELSTJERNA G v A HARDER T SCHNIEDER J KALBE u N MENCKE 2000 In vivo activities of the new anthelmintic depsipeptide PF 1022A Parasitol Res 86 194 199 SANGER F S NICKLEN u A R COULSON 1977 DNA sequencing with chain termination inhibitors Proc Natl Acad Sci USA 74 5463 5467 SARGENT T D u I B DAWID 1983 Differential gene expression in the gastrula of Xenopus laevis Science 222 135 139 SCHACKWITZ W S T INOUE u J H THOMAS 1996 Chemosensory neurons function in parallel to mediate a pheromone response in C elegans Neuron 17 719 728 SCHAFER M 1992 Das poly A Ende der mRNA Seine Rolle in der Genexpression Biol Unserer Zeit 1 39 44 SCHILLHORN van VEEN T W u R A A OGUNSUSI 1978 Periparturient and seasonal rise in the trichostrongylid egg output of infected ewes during the dry season in Northern Nigeria Vet Parasitol 4 377 383 SCHNEIDER K R KLAAS B KASPERS u P STAEHELI 2001 Chicken interleukin 6 Eu
89. AKAMI et al 2001 Ferner aktiviert daf 11 in den ASI sowie ASJ Neuronen die Transkription von daf 28 und ist somit auch an der Regulation des insulinartigen Signalwegs beteiligt LI et al 2003 2 3 3 2 Insulinartige Signalkaskade Die Transkription von daf 28 einem Insulin vom B Typ findet in den ASI und ASJ Neuro nen statt und wird bei nicht Hypobiose induzierenden Bedingungen durch daf 11 Kapitel 2 3 3 1 gesteigert unter Pheromoneinwirkung und Nahrungsmangel hingegen stark repri miert Vermutlich beeinflusst auch daf 7 Kapitel 2 3 3 3 die Transkriptionsrate von daf 28 und anderen Insulinliganden positiv und ist somit neben daf 11 an der Regulation des insulin artigen Signalwegs welcher neben dem TGF Signalweg die Gruppe 2 der daf c Gene dar stellt beteiligt LI et al 2003 Auch gehen die Autoren davon aus dass daf 28 einen Ligan den f r daf 2 repr sentiert Dieses Gen codiert f r eine Insulin IGF 1 Rezeptor Tyrosin kinase KIMURA etal 1997 und reguliert Lebensspanne Metabolismus sowie Reproduktion des Nematoden ber parallele Signalkaskaden Die Bindung des Liganden an daf 2 induziert einerseits die Autophosphorylierung von age 1 fr her als daf 23 bezeichnet einer Phospha tidylinositol 3 PI3 Kinase MORRIS et al 1996 KIMURA et al 1997 welche die second messenger Phosphatidylinositol 3 4 biphosphat PIP2 und Phosphatidylinositol 3 4 5 tri phosphat PIP3 generiert PIP2 phosphoryliert das Genprodukt von
90. Aminos ureabfolge der zusammengesetzten Sequenzen wurde auf dieser Ebene mit in GenBank NCBI publizierten Proteinen anderer Organismen verglichen Dieser Sequenzidentit tsvergleich geschah mittels BLASTP mit der gesamten translatierten Aminos uresequenz sowie ab dem ersten Methionin dem potentiellen Startcodon Als signifikante Sequenzhomologie galt dabei ein E Value von kleiner als 0 001 in Verbindung mit einer mindestens 40 igen bereinstimmung ber mehr als 45 Aminos u ren In Tab 5 sind die signifikanten Ergebnisse des Sequenzidentit tsvergleichs ab dem po Ergebnisse 159 tentiellen Startcodon in numerischer Reihenfolge der Klone getrennt nach L3ni bzw L3i aufgelistet Ergaben sich bei der Erstellung der Sequenzen Isoformen ist hier nur die Sequenz mit dem l ngsten bereinstimmenden Teilbereich angef hrt die Identit ten der brigen Iso formen sind unter 9 3 aufgef hrt In Klammern befindlich sind die jeweiligen Sequenzl ngen sowie Accession bzw Versionen Nummern der homologen Sequenzen Teilidentische Sequenz Ber iden on bereich tit t lichkeit L3ni 16 hypothetisches Protein 872 aa von C briggsae CAE66607 1 873 aa 87 89 Paramyosin UNCoordinated locomotion UNC 15 872 aa sowie 0 0 Paramyosin 866 aa von C elegans NP_492085 1 und S04027 BR 7 Weitere signifikante Homologien mit Paramyosinen anderer Organismen z B O volvolus B malayi und D immitis werden an dieser Stelle nicht wei
91. Aus dem Institut f r Parasitologie der Tier rztlichen Hochschule Hannover Differentielle Gentranskription bei Hypobiose induzierten und nicht induzierten dritten Larven von Dictyocaulus viviparus THESE zur Erlangung des Grades eines DOCTOR OF PHILOSOPHY Ph D im Fachgebiet Parasitologie durch die Tierarztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Christina Strube aus Kassel Hannover 2004 Supervisor Prof Dr T Schnieder Betreuungsgruppe Prof Dr T Schnieder Prof Dr P Valentin Weigand Prof Dr K Pfister 1 Gutachten Prof Dr T Schnieder Institut f r Parasitologie Tier rztliche Hochschule Hannover Prof Dr P Valentin Weigand Institut f r Mikrobiologie Tier rztliche Hochschule Hannover Prof Dr K Pfister Institut f r vergleichende Tropenmedizin und Parasitologie Tier rztliche Fakult t Ludwig Maximilians Universit t M nchen 2 Gutachten Prof Dr H Zahner Institut f r Parasitologie Fachbereich Veterin rmedizin Justus Liebig Universit t Giessen Tag der m ndlichen Pr fung 03 Juni 2004 Diese Arbeit wurde gef rdert durch die Karl Enigk Stiftung Im Gedenken an F Teile dieser Arbeit wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt Christina Strube Georg von Samson Himmelstjerna Thomas Schnieder 2002 Molecular studies of the genetic regulation of hypobiosis in Dictyocaulus viviparus Joint Annual Meeting of the German and Dutch Societies for Parasitolog
92. BD CLONTECH hergestellt Diese wer den im Kapitel 4 11 4 als Erststrang cDNA 1 respektive 2 bezeichnet Au erdem wurden noch drei weitere Erststrang cDNAs welche bereits in der RACE Verwendung fanden als Template eingesetzt 116 Material und Methoden 3 15 4 Erstellung von Standardreihen Um Aussagen tiber die Kopienzahl der Transkripte in den beiden Larvenpopulationen und die Sensitivit t der qPCR treffen zu k nnen wurden Standardreihen f r die zu untersuchenden Gensequenzen L3ni 69 92 L3i 82 101 und EF 1a erstellt Dies erfolgte in Form einer Ver diinnungsreihe der in den pCR 4 TOPO Vektor INVITROGEN klonierten DNA mit 107 bis 10 Kopien pro Reaktionsansatz 3 15 5 qPCR mit TaqMan Sonden Die TaqMan Sonden sowie dazugeh rige Primer f r die Gensequenzen der L3ni 69 92 SOD L3i 82 101 PNMT und EF 1a wurden mit dem Softwareprogramm Beacon Designer PREMIER BIOSOFT ausgewahlt Die Synthese dieser Oligonukleotide wurde sowohl bei der Firma APPLIED BIOSYSTEMS als auch QIAGEN OPERON in Auftrag gegeben Als Quencherfarbstoff am 3 Ende der Sonden diente stets TAMRA als Reporterfarbstoff am 5 Ende wurde f r die EF la Sonde zun chst HEX gew hlt um eine Multiplex PCR mit der FAM markierten Sonde f r die L3ni 69 92 bzw L3i 82 101 zu erm glichen Die Verwendung dieses Fluoreszenzfarbstoffs erwies sich jedoch als ungeeignet f r eine zuverl ssige Detekti on so dass im weiteren Verlauf der Arbeit eine ebe
93. C A 60 C Primer EF 1a MGB rev CAA GAG ATG GGT AAG GGT TCT TTC 58 C Sonde EF la MGB 6 FAM TGA AAA ATT TGA GAA GGA AGC MGBNFQ 69 C Abb 14 In der qPCR verwendete Primer und TaqMan MGB Sonden Tm errech net von der Primerdesign Software Die zu untersuchenden L3ni und L3i cDNAs Plasmid Verd nnungsreihen sowie Negativ kontrollen wurden jeweils als Duplikate eingesetzt In den einzelnen Laufen wurden die Transkriptionsraten des EF la in Verbindung mit der L3ni 69 92 oder L3i 82 101 bzw bei den Sequenzen in den jeweiligen L3ni und L3i cDNAs analysiert Diese Transkriptionsraten wurden in je f nf verschiedenen Erststrang cDNAs der L3ni und L3i berpr ft Dabei wurden die Erststrang cDNAs in den einzelnen Laufen sowohl unverdiinnt 10fach und 100fach ver d nnt als Matrize eingesetzt In den qPCRs wurden Primer und Sonde in einer Endkonzentra tion von je 300 nM der Referenzfarbstoff ROX in einer Endkonzentration von 25 nM einge setzt Die Stockl sung des Referenzfarbstoffs 1 mM wurde durch die Zugabe von 179 ul Ampuwa und 20 ul 10x Core PCR Puffer zu 1 ul ROX zun chst auf eine Konzentration von 5 uM verd nnt Die 25 ul Reaktionsans tze enthielten folgende Komponenten 2 5 ul 10x Core PCR Puffer 1 ul dNTP Mix je 5 mM 2 78 wl MgCl 50 mM 0 75 ul Vorw rtsprimer 10 uM 0 75 wl Riickwartsprimer 10 uM 0 15 ul Sonde 50 uM 0 38 ul Referenzfarbstoff ROX 5 uM 0 13 wl SureStart Taq DNA Polymerase 5 U
94. CT GAG GCC ATT TCA TAG TAA AAT CCA TCA GAA TTT GCG TCG TAA TA 3 L3i 33 GTG TAC TGG ATG ATA GCA GTG CAT CGT CAT CAA TTA GTG AAG ATA A SL1 L3i 33 AGG CGC GTG GAG TGG ATG AGG TAT GAC A L31 53 for TAA CGA GAC CAT TAA AAG TGT GAC TAG CGT TAC GTG TAA GAG TCT L31 53 rev CGC TAG AAC TAC TAT GAC TGG ATG TAG TGA GAA TCT TGG TAA AAC A L31 53 ACT TTC AAT CGC AAA ATA TG A AAT CAA ATC GAT TGG AAT AGC SLI L3i 53 CTG GAT TCG GAA AAA GTT GTT GCA CTT CAA TGA A L31 75 for AAC CCA ACC GCT ATT GGG ATA CAT GAA GCA AAG TTG T L31 75 rev TGC ACC GCTTCT GTG TTA GTA GCA CTA TCG ATT ATT CGA TTA T SL1 L3i 75 AAC TCC GCT GAC ACC ACT TAA TCG ATT TTG L31 82 for CAC AAA ATC GCC AAG AGC TAA TGC GGT GGT ATG A L31 82 rev ATT TCG CGT ATC ACT GTG CTG CCT CAA CAC CAC L31 82 CTT GGA GCT GTT CGG AAA CAT CAA CAG ATG GAG ATG AGA L31 88 for AAA TAC GCT ATG CAA ACT GGT CGT TTT GAT TTC AAG TGT C L31 88 rev AGT ACA AGA TTT GGA ATT ATC TGA GCC AGC AGG ATG TAT G AC L31 88A for GGC AAA ATA CAA TGC AGT GAA AAG AGC TAC AAA TAC GCT ATG C L31 88A rev TAT GAA ACA GTA CAA GAT TTG GAA TTA TCT GAG CCA GCA GGA TGT A L31 88 AGG AGG TGC TCA ACC TCA GAC AAC TAA CAT TTC GAG A SL1 L31 88 TGA TTC GCA ATA GTA GGC GGT AGG ATA CTC ATG AGA A L3i 99 for ACC GGC CTT GAG GGA CGA AGT ATG TCA TTG G L3i 99 rev AAC TGG CGC CGT TGG CTT TGT TAC TAC TGA CTT CTC T L3i 99A for GTC GGC GAG GAT GCT CCA TCT ATC GTT CCA AATG L3i 99A rev GAC GCG GCA GTG ACG GTG GTA GTG ACG ACA AT SL1 L3i 99 TGC TGG TG
95. D CLONTECH wurden die zur Durch f hrung der SSH ben tigten cDNAs synthetisiert s 3 7 3 Es handelte sich dabei um die cDNA der beiden Larvenpopulationen sowie einer im CLONTECH PCR Select cDNA Subtraction Kit BD CLONTECH enthaltenen Kontroll mRNA aus humaner Skelettmusku latur HSM die im weiteren Verlauf der Arbeit als Positivkontrolle diente 3 8 1 1 Erststrang cDNA Synthese Neben den zu untersuchenden Larvenpopulationen L3ni und L3i ging die Kontroll mRNA HSM in die reverse Transkription ein Dabei wurden 0 927 ug L3ni mRNA 1 12 ug L3i mRNA und 1 ug HSM mRNA revers transkribiert F r die Kontroll mRNA wurde ein 10 ul Reaktionsansatz mit den im Herstellerprotokoll angegebenen Mengen der Reaktionskompo nenten f r die geringer konzentrierte mRNA der L3ni bzw L3i aus Isolierung 1 s Kapitel 4 2 ein 20 ul Reaktionsansatz gew hlt und entsprechend die doppelte Menge der Reaktions komponenten verwendet Das weitere Vorgehen entsprach dem Herstellerprotokoll 3 8 1 2 Zweitstrang cDNA Synthese F r die sp teren subtraktiven Hybridisierungen werden ca 2 ug Driver cDNA ben tigt Zur Ermittlung der optimalen Anzahl an PCR Zyklen war ebenfalls ein Testansatz erforderlich Daher erfolgte f r die LD PCR je ein Dreifachansatz f r die Proben L3ni L3i und HSM Die Reaktionsbedingungen zur Bestimmung der optimalen Zyklenzahl entsprachen den unter Ka pitel 3 7 3 3 beschriebenen Nachdem 20 als optimale PCR Zyklenzahl bestimmt w
96. DNA Konzentration in der L sung wurde die cDNA sechsfach mit Ampuwa verdiinnt und die OD bei einer Wellenlange von 260 und 280 nm im Spektralpho tometer gemessen Zur Schaffung ann hernd gleicher Konzentrationen an Tester und Driver cDNA der zwei Larvenpopulationen wurde die L3i cDNA mit Ampuwa auf eine Konzent ration von 510 5 ng ul verd nnt und somit der L3ni cDNA Konzentration von 499 5 ng ul angeglichen Die in dieser Konzentrationsmessung eingesetzte cDNA L sung welche 2 ul gel ste cDNA enthielt wurde auf ein Agarosegel aufgetragen um zu ermitteln ob die im unter 3 8 5 be schriebenen Restriktionsenzymverdau abgespaltenen Oligonukleotide durch die Aufreinigung mittels Phenol Chloroform Extraktion und S ulenchromatographie aus der cCDNA L sung entfernt wurden 3 8 9 Adapterligation Durch die Ligation von zwei verschiedenen Adaptern an die jeweilige Tester cDNA wurden jeweils zwei Testerpopulationen der L3ni L3i und HSM generiert Alle Arbeitsschritte er folgten soweit nicht anders vermerkt nach den Angaben des Herstellerprotokolls Dieser sowie die noch folgenden Arbeitsschritte der SSH wurden f r jede Probe L3ni L3i und HSM wiederholt durchgef hrt Durchf hrung 1 sowie Durchf hrung 2 3 8 9 1 Vorbereitung der Tester cDNA L3ni L3i Tester Nachdem die cDNAs der beiden Larvenpopulationen in ann hernd gleichen Konzentrationen vorlagen wurde jeweils 1 ul cCDNA L sungen der L3ni bzw L3i mit 5 ul Amp
97. Die iPLA gt besitzt aber auch die F higkeit Arachidons ure f r die Eikosanoidsynthese freizusetzen DENNIS 1994 Prostaglandine Leukotriene und andere Eikosanoide agieren bei Vertebraten als lokale Hormone die sowohl die Aktivit t der Zellen in welchen sie synthetisiert werden als auch die der Nachbarzellen ver ndern indem sie an 7TM Rezeptoren binden BERG et al 2003 S 688 und somit beispielsweise die Adenylat Cyclase aktivieren Obwohl in einer Vielzahl parasitischer Nematoden verschiedene Eikosa noide nachgewiesen werden konnten sind diese zwar in Bezug auf Parasit Wirt Interaktionen eingehender untersucht ihre Funktion im parasitischen Organismus selbst ist jedoch weitge hend unbekannt DAUGSCHIES u JOACHIM 2000 Somit ist ungewiss ob und in welcher Weise das iPLA gt Hombolog der L3i in die Signal bermittlung eingebunden sein k nnte Wird die Transkription der PNMT in den adrenergen Kopfneuronen WILLETT 1980 GOH u DAVEY 1985 LEE u KO 1991 der NO Synthase von A suum im zentralen Nervensys tem BASCAL et al 1995 WALKER et al 1995 und der C elegans GC Rezeptoren in un terschiedlichen sensorischen Neuronen YU et al 1997 auf D viviparus extrapoliert liegen Anhaltspunkte f r eine von den Neuronen des Kopfes ausgehende Signaltransduktion zur In duktion der Hypobiose vor Dies w re analog zu C elegans bei dem Signale chemosensori scher Kopfneuronen die Larvenentwicklung regulieren BARGMANN u HORVITZ 1991
98. Differenz von 155 bp durch eine L cke in den sonst identischen Sequenzen repr sentiert wurde Die k rzere der beiden Sequenzen stimmte mit dem entsprechenden Teilbereich des Klons L3i 33 berein hnliche Verh ltnisse konnten mit dem Primerpaar f r den Klon L3i 75 festgestellt werden 152 Ergebnisse Die erhaltenen 187 bzw 255 Nukleotide umfassenden Amplifikationsprodukte waren mit Ausnahme eines 67 bp langen Gaps identisch wobei auch hier die kiirzere Sequenz mit dem Insert des Klons korrespondierte Ebenso verhielt es sich mit den beiden Sequenzen welche mit der genspezifischen Primerkombination fiir den Klon L3i 100 generiert wurden Wieder um stimmte das k rzere 203 bp lange PCR Produkt mit dem Insert des Klons berein Bei der l ngeren aus 325 Basenpaaren bestehenden Sequenz wurde eine 123 Nukleotide umfas sende Sequenzl cke der sonst homologen Sequenzen beobachtet Die PCR Produkte der Pri merkombination f r den Klon L3i 88 besa en eine L nge von 182 bp welche mit dem Klon L3i 88 identisch waren sowie 255 bp und 311 bp die wiederum eine 55 Nukleotide bzw 114 Nukleotide umfassende Sequenzl cke bedingten Zwei solcher L cken ber eine L nge von 69 bp respektive 49 bp wurden bei der Verwendung der GSPs f r den Klon L3ni 56 beobach tet wobei die sequenzierten Banden eine L nge von 262 bp 311 bp sowie 383 bp besa en Ein Alignment Ausschnitt dieser drei Sequenzen von welchen die k rzeste zu dem entspre chenden In
99. G TGA AGC GCT AAT TAA TGA ATC GTC TT L31 100 for AAT ATC GCC AAG TTT TCA ATA TGT TTG ACA TAG ATC GTA GTG GAG L3i 100 rev GTT GTC CGT GAT ATC GCC CAA CTC TCG GAG AAT ATA 248 9 2 Accession Nummern differentiell transkribierten Sequenzen Anhang L3i 10a L3i 10b L3i 33a L31 33b L3i 33c L31 53 L3i 75a L3i 75b L3i 82a L3i 82b L3i 82c L3i 82d L3i 82e L3i 101 L3i 88a L3i 88b L3i 88c L3i 88d L3i 18 L31 86 L31 99 L3i 88 2 L3i 100a L3i 100b L3i 100c AY536871 AY536872 AY 542514 AY 542513 AY570698 AY570697 AY534336 AY534337 AY 542519 AY 542520 AY 542521 AY 542522 AY 542523 AY 542518 AY536870 AY536869 AY536867 AY536868 AY536866 AY534889 AY534890 AY534891 AY 542515 AY 542516 AY 542517 L3ni 16 Leni 22 L3ni 51 L3ni 56a L3ni 56b L3ni 56c L3ni 56d L3ni 56e L3ni 67 L3ni 69 92 L3ni 17 L3ni 54 EF la Nr 1 EF 1la Nr 2 EF la Nr 3 B Tubulin AY552027 AY533126 AY533127 AY533128 AY533129 AY533130 AY533131 AY533132 AY533133 AY533134 Sonstige Accession Nummern AY534331 AY534330 AY534333 AY534334 AY534335 AY 534332 Anhang 9 3 249 Identit ten und hnlichkeiten der Aminos ure Isoformen L3ni 56b L3ni56c L3ni56c L3ni 56e putatives Protein bilateralen Ursprungs Teilbereich 182 aa 157 aa 127 aa 126 aa 232 aa von C elegans NP_491869 1 Identit t 48 52 55 54 hnlichkeit 65
100. GLER 1993 Cloning the differences between two complex genomes Science 259 946 951 LISITSYN N A 1995 Representational difference analysis finding the differences between genomes Trends Genet 11 303 307 Literaturverzeichnis 231 LUCE M J u P D BURROWS 1998 Minimizing false positives in differential display Biotechniques 24 766 8 770 LUKYANOV K A G A LAUNER V S TARABYKIN A G ZARAISKY u S A LUKYANOV 1995 Inverted terminal repeats permit the average length of amplified DNA fragments to be regulated during preparation of cDNA libraries by polymerase chain reaction Anal Biochem 229 198 202 LUUKKONEN B G M W TAN u S SCHWARTZ 1995 Efficiency of reinitiation of translation on HIV type 1 mRNAs is determined by the length of the upstream ORF and by intercistronic distance J Virol 69 4086 4094 MAGAT W J W J HUBBARD u E L JESKA 1972 Ascaris suum quantitative chemical analysis of eggs and larvae Exp Parasitol 32 102 108 MARIUS V S BERNARD J P RAYNAUD P PERY u G LUFFAU 1979 Dictyocaulus viviparus in calves quantification of antibody activities in sera and respiratory secretions by immuno enzymatic analysis Ann Rech Vet 10 56 63 MASSEY H C JR C C BALL u J B LOK 2001 PCR amplification of putative gpa 2 and gpa 3 orthologs from the A T rich genome of Strongyloides stercoralis Int J Parasitol 31 377 383 MATHIEU DAUDE F T TREN
101. GMP Signalweg besitzen letztlich als Zielgen das ehemals auch als daf 20 bezeichnete Gen daf 12 RIDDLE et al 1981 VOWELS u THOMAS 1992 THOMAS et al 1993 GOTTLIEB u RUVKUN 1994 LARSEN et al 1995 GRENACHE et al 1996 Dieses Gen welches sowohl fiir die Entwicklungshemmung als auch das recovery verantwortlich ist codiert f r drei Isoformen eines nukle ren Rezeptors ANTEBI et al 1998 Die zwei daf 12a Isoformen besitzen je eine Liganden als auch DNA Bindungsdom ne und bedingen die normale Larvenentwicklung Die Isoform daf 12al weist dabei Homologien zu einem Steroid Thyroid Hormonrezeptor von Strongyloides stercoralis sowie Vitamin D Rezeptoren verschiedener Vertebraten auf Dahingegen enthalt das daf 12b Genprodukt welches die Ausbildung der dauer larva f rdert nur die Bindungsdom ne f r einen Liganden ANTEBI et al 1998 ANTEBI et al 2000 SNOW u LARSEN 2000 Oft mals aktivieren nukle re Rezeptoren die Gentranskription in Anwesenheit von Hormonen und unterdr cken sie bei deren Fehlen Mehrere Autoren vermuten daher einen hormonellen Me chanismus bei der Regulation der normalen oder inhibierten Entwicklung sowie der Lebens spanne der Adulten ANTEBI et al 1998 ANTEBI et al 2000 SNOW u LARSEN 2000 GERISCH et al 2001 Allerdings ist bisher nicht bekannt welcher Ligand an den nukle ren Rezeptor daf 12 bindet Diesbez glich k nnte das f r ein Cytochrom P450 codierende Gen daf 9 welches in sensorischen Neuronen expri
102. Gel Electrophoresis Apparatus Standard Power Pack P25 BIOZYM Hessisch Oldendorf MJ Research Multicycler PTC 200 Gel Star BD CLONTECH Heidelberg SMART PCR cDNA Synthesis Kit SMART RACE cDNA Amplification Kit CLON TECH PCR Select cDNA Subtraction Kit CLONTECH PCR Select Differential Screen ing Kit CHROMA SPIN 100 DEPC H20 Columns CHROMA SPIN 1000 DEPC H O Columns Advantage 2 Polymerase Mix Advantage 2 PCR Kit EPPENDORF Hamburg Thermomixer 5436 Thermomixer comfort Material und Methoden 57 FRESENIUS Bad Homburg Ampuwa GFL Burgwedel Warmeschrank 3033 Wasserbad 1083 HERAEUS Osterode Warmeschrank BT 5042 E Warmeschrank TU 60 60 Biofuge Pico Biofuge 13 Omnifuge 2 ORS HYBAID Heidelberg Hybaid Midi Gel Horizontal Electrophoresis System IBI New York USA MBP 300 300 V Power Supply INTAS G ttingen UV Tisch TF M 20 x 40 cm 312 nm Video Geldokumentations Anlage INTEGRA Fernwald KODAK GBX Developer KODAK GBX Replenisher INVITROGEN Karlsruhe TOPO TA Cloning Kit for Sequencing 250 bp DNA Ladder Low DNA MASS Ladder Primer JOUAN Unterhaching Zentrifuge BR4i GIBCO BRL LIFE TECHNOLOGIES Eggenstein EcoRI Taq DNA Polymerase MACHEREY amp NAGEL Diiren NucleoSpin Plasmid NucleoSpin Tissue Nucleobond AX 100 58 Material und Methoden MBI FERMENTAS St Leon Rot GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus MEMMERT Schwabach W rmeschrank ULE
103. H H HOLMAN 1965 Duration of the aquired resistance of calves to infection with Dictyocaulus viviparus Res Vet Sci 6 344 395 MICHEL J F u A SHAND 1955 A field study of the epidemiology and manifestations of parasitic bronchitis in adult cattle Vet Rec 67 249 266 MIHAYLOVA V T C Z BORLAND L MANJARREZ M J STERN u H SUN 1999 The PTEN tumor suppressor homolog in Caenorhabditis elegans regulates longevity and dauer formation in an insulin receptor like signaling pathway Proc Natl Acad Sci USA 96 7427 7432 MILLER J E u F OLSON 1990 Critical evaluation of oxfendazole against inhibited Ostertagia ostertagi Proc Meeting Amer Assoc Vet Parasitol San Antonio USA Abstract S 14 MITCHELL G F 1982 Host protective immune response to parasites and evasion by parasites generalisation and approaches to analysis in SYMONS L E A A D DONALD u J K DINEEN Hrsg Biology and Control of Endoparasites Academic Press Sydney Australien S 331 341 MODREK B u C LEE 2002 A genomic view of alternative splicing Nat Genet 30 13 19 MOE T K J ZILIANG A BARATHI v R W BEUERMAN 2001 Differential expression of glyceraldehyd 3 phosphate dehydrogenase GAPDH beta actin and hypoxanthine phosphoribosyltransferase HPRT in postnatal rabbit sclera Curr Eye Res 23 44 50 MOORE J L TETLEY u E DEVANEY 2000 Identification of abundant mRNAs from the third stage larv
104. H W MILLER E W MYERS u D J LIPMAN 1990 Basic local alignment search tool J Mol Biol 215 403 410 ANDERSON N 1977 The efficiency of levamisole thiabendazole and fenbenadazole against naturally acquired infections of Ostertagia ostertagi in cattle Res Vet Sci 23 298 302 ANDERSON N 1988 Control of Ostertagia ostertagi infections in Australia Vet Parasitol 27 49 57 ANDERSON N J ARMOUR W F H JARRETT J JENNINGS J D RITCHIE u G M URQUARD 1965a A field study of parasitic gastritis in cattle Vet Rec 77 1196 1204 ANDERSON N J ARMOUR J JENNINGS J D RITCHIE u G M URQUARD 1965b Inhibited development of Ostertagia ostertagi Vet Rec 77 146 147 Literaturverzeichnis 211 ANDREWS S J 2000 The efficacy of levamisole and a mixture of oxfendazole and levamisole against the arrested stages of benzimidazole resistant Haemonchus contortus and Ostertagia circumcincta in sheep Vet Parasitol 88 139 146 ANTEBL A J G CULOTTI u E M HEDGECOCK 1998 daf 12 regulates developmental age and the dauer alternative in Caenorhabditis elegans Development 125 1191 1205 ANTEBI A W H YEH D TAIT E M HEDGECOCK u D L RIDDLE 2000 daf 12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C elegans Genes Dev 14 1512 1527 APFELD J u C KENYON 1998 Cell nonautonomy of C elegans daf 2 function in the regulation of diapause
105. IDDLE A T POUZYREV V E VELCULESCU L HILLIER S R EDDY S L STRICKLIN D L BAILLIE R WATERSTON u M A MARRA 2001 Changes in gene expression associated with developmental arrest and longevity in Caenorhabditis elegans Genome Res 11 1346 1352 J RGENSEN R J 1973 In vitro effect of bile on the motility of Dictyocaulus viviparus third stage larvae Acta vet scand 14 341 343 J RGENSEN R J 1980 Dictyocaulus viviparus migration in agar of larvae subjected to a variety of physicochemical exposures Exp Parasitol 49 106 115 J RGENSEN R J u C P OGBOURNE 1985 Bovine dictyocaulosis a review and annotated bibliography Verlag Commonwealth Agriculture Bureaux Slough UK S 2 J RGENSEN R J H RONNE C HELSTED u A R ISKANDER 1982 Spread of infective Dictyocaulus viviparus larvae in pasture and to grazing cattle experimental evidence of the role of Pilobolus fungi Vet Parasitol 10 331 339 KAGAWA H H IMADZU K KURODA S MATSUMOTO M OGASAWARA u Y SAKUBE 1995 Muscle gene structures and expressions in pharyngeal and body wall muscles of Caenorhabditis elegans International C elegans Meeting 1995 Abstract 300 KAPILOFF M S J M MATHIS C A NELSON C R LIN u M G ROSENFELD 1991 Calcium calmodulin dependent protein kinase mediates a pathway for transcriptional regulation Proc Natl Acad Sci USA 88 3710 3714 KIMURA K D H A TISSENBAUM Y LIU u G
106. KI u S V TINGEY 1990 DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers Nucleic Acids Res 18 6531 6535 WIRTHERLE N C 2003 Untersuchungen zur Verbreitung von Anthelminthikaresistenzen bei Pferden in Niedersachsen Hannover Tierarztl Hochsch Diss WOLKOW C A K D KIMURA M S LEE u G RUVKUN 2000 Regulation of C elegans life span by insulinlike signaling in the nervous system Science 290 147 150 WONG K K u M McCLELLAND 1993 Stress inducible gene of Salmonella typhimurium identified by arbitrarily primed PCR of RNA Proc Natl Acad Sci USA 91 639 643 WRIGHT S J ARMOUR u R G BRUCE 1973 Inhibited development of Ostertagia ostertagi British Society for Parasitology Proceedings 67 16 17 Literaturverzeichnis 245 YANG G P D T ROSS W W KUANG P O BROWN u R J WEIGEL 1999 Combining SSH and cDNA microarrays for rapid identification of differentially expressed genes Nucleic Acids Res 27 1517 1523 YAZWINSKI T A C TUCKER u C FEATHERSTONE 1994 Residual anthelmintic activity of abamectin in artificially infected calves Vet Rec 134 195 YE Z u J R CONNOR 2000 Identification of iron responsive genes by screening cDNA libraries from suppression subtractive hybridization with antisense probes from three iron conditions Nucleic Acids Res 28 1802 1807 YI W J M ROSS u D ZARKOWER 2000 mab 3 is a direct tra 1 target gene regul
107. KLE J WELSH B JUNG T VOGT u M McCLELLAND 1999 Identification of differentially expressed genes using RNA fingerprinting by arbitrarily primed polymerase chain reaction Methods Enzymol 303 309 324 MATZ M D SHAGIN E BOGDANOVA O BRITANOVA S LUKYANOV L DIATCHENKO u A CHENCHIK 1999 Amplification of cDNA ends based on template switching effect and step out PCR Nucleic Acids Res 27 1558 1560 McCLELLAND M F MATHIEU DAUDE u J WELSH 1995 RNA fingerprinting and differential display using arbitrarily primed PCR TIG 11 242 246 MICHEL J F 1955 Studies on host resistance to dictyocaulus infections I The phenomen of inhibited development J Comp Path 65 149 158 MICHEL J F 1967 Methods for testing anthelmintics Vet Rec 80 366 232 Literaturverzeichnis MICHEL J F 1976 The epidemiology and control of some nematode infections in grazing cattle Adv Parasitol 14 355 397 MICHEL J F 1978 Topical themes in the study of arrested development in F H M BORGSTEEDE J ARMOUR u J JANSEN Hrsg Facts and Reflections III Central Veterinary Institute Lelystad Niederlande S 7 17 MICHEL J F M B LANCASTER u C HONG 1979 The effect of age acquired resistance pregnancy and lactation on some reactions of cattle to infection with Ostertagia ostertagi Parasitology 79 157 168 MICHEL J F A MACKENZIE C D BRACEWELL R L CORNWELL J ELLIOT N HEBERT u
108. MT die Umsetzung von Phenylethanolamin und Noradrenalin in den Neurotransmit ter Adrenalin KISIEL et al 1976 FRANDSEN u BONE 1988 SMART 1988 In Nemato den kommt die PNMT spezifisch in den adrenergen Neuronen des Kopfes vor WILLETT 1980 GOH u DAVEY 1985 LEE u KO 1991 Als Funktion der Catecholamine Noradre nalin und Adrenalin sowie Serotonin wird eine Kontrolle der Bewegung Entwicklung und Reproduktion sowie der Nahrungsaufnahme und des Kohlenhydratmetabolismus angenom men die Signalwege sind bislang jedoch nicht gekl rt SMART 1989 Dem Neurotransmitter Noradrenalin wird eine Rolle bei der H utung der Parasitenstadien zugesprochen ROGERS u HEAD 1972 GOH u DAVEY 1985 FLEMING 1993 BROWNLEE ct al 2000 Ferner ist dieses Catecholamin in die physiologischen Ver nderungen involviert die sich bei der Entwicklung der infekti sen Larve hin zum fr hen parasitischen Stadium vollziehen RO GERS u HEAD 1972 Diese entwicklungsf rdernden Funktionen des Noradrenalins k nnten in den Hypobiose induzierten Larven durch dessen gesteigerte Umwandlung in Adrenalin infolge einer erh hten PNMT Konzentration reduziert oder unterbunden werden Dass es sich bei diesem Neurotransmitter um ein spezifisches Produkt der entwicklungsgehemmten Larven handeln k nnte welches in anderen parasitischen Stadien nur eine untergeordnete Rolle spielt wird durch Untersuchungen von BARGIEL et al 1970 unterst tzt Diese stellten im K rper von A suum kna
109. Molek le in den Poren zur ckgehalten werden Im Eluat erscheinen daher die retenierten Molek le nach sinkender Molek lgr e Vor dem Aufbringen der Proben auf die S ulen erfolgte ein Pufferaustausch der Gelmatrices welche zuvor durch mehrmaliges Schwenken vollst ndig resuspendiert wurden Der Puffer der nach Entfernung der Verschlusskappen sofort aus den S ulen lief wurde verworfen Zum Pufferaustausch wurden 1 5 ml 1x TNE Puffer auf die Gelmatrix gegeben Auch dieser Durchfluss wurde verworfen Es erfolgte nun ein langsames Auftragen von je 2 Proben der L3ni L3i und HSM cDNA in die Mitte des Gelbetts jeweils einer S ule Im Anschluss dar an wurden 25 ul 1x TNE Puffer auf die Gelmatrix appliziert Nachdem der Puffer vollst ndig aus der S ule getropft war wurde dieser Schritt mit 150 ul 1x TNE Puffer wiederholt Zur Gewinnung der aufgereinigten cDNA aus den S ulen wurden diese in neue 1 5 ml Gef ver bracht und mit je 320 ul 1x TNE Puffer eluiert Eine zweite Elution mit je 75 ul 1x TNE Puf fer in ein neues 1 5 ml Gef schloss sich an 3 8 4 Gelanalyse der aufgereinigten Proben Von jedem Eluat der oben beschriebenen S ulenchromatographie wurden nach der Durchf h rung 10 ul f r die Bestimmung der Wiederfindungsrate abgenommen Neben diesen Aliquots wurden auf das Agarosegel auch je 3 ul der in die Aufreinigung eingegangenen LD PCR Produkte aufgetragen Da in der zweiten Eluatfraktion jeweils eine h here Ausbeute an a
110. N 1999 Negative regulation of the forkhead transcription factor FKHR by Akt J Biol Chem 274 16741 16746 TAWE W N M L ESCHBACH R D WALTER u K HENKLE DUHRSEN 1998 Identification of stress responsive genes in Caenorhabditis elegans using RT PCR differential display Nucleic Acids Res 26 1621 1627 TAYLOR E I 1951 Parasitic bronchitis in cattle Vet Rec 63 859 867 TEDDER T F M STREULI S F SCHLOSSMANN u H SAITO 1988 Isolation and structure of a cDNA encoding the B1 CD20 cell surface antigen of human B lymphocytes Proc Natl Acad Sci USA 85 208 212 TERAMI H B D WILLIAMS S KITAMURA Y SAKUBE S MATSUMOTO S DOI T OBINATA u H KAGAWA 1999 Genomic organization expression and analysis of the troponin C gene pat 10 of Caenorhabditis elegans J Cell Biol 146 193 202 THALHOFER H P u H W HOFER 1989 Purification and properties of cyclic 3 5 GMP dependent protein kinase from the nematode Ascaris suum Archives of Biochemical Biophysics 273 535 542 THATCHER J D C HAUN u P G OKKEMA 1999 The DAF 3 Smad binds DNA and represses gene expression in the Caenorhabditis elegans pharynx Development 126 97 107 THOMAS J H D A BIRNBY u J J VOWELS 1993 Evidence for parallel processing of sensory information controlling dauer formation in Caenorhabditis elegans Genetics 134 1105 1117 THOMAS R J WALLER P J u B R COTTRILL 1975 The eff
111. N N NASRIN S OGG J DORE G RUVKUN u M ALEXANDER BRIDGES 2001 Phosphatidylinositol 3 kinase signaling inhibits DAF 16 DNA binding and function via 14 3 3 dependent and 14 3 3 independent pathways J Biol Chem 276 13402 13410 CALLAHAN H L R K CROUCH u E R JAMES 1990 Hydrogen peroxide is the most toxic oxygen species for Onchocerca cervicali microfilariae Parasitology 100 407 415 CAPITINI L A K E McCLURE u R P HERD 1990 Effect of environmental stimuli on pre infective and infective stages of Haemonchus contortus in the northern United States for the induction of hypobiosis Vet Parasitol 35 281 293 CASSADA R C u R L RUSSELL 1975 The dauerlarva a post embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans Dev Biol 46 326 342 216 Literaturverzeichnis CHAN E C S FRASER S YIN G YEO K KWEK R J FAIRCLOUGH u R SMITH 2002 Human myometrial genes are differentially expressed in labor a suppression subtractive hybridization study J Clin Endocrinol Metab 87 2435 2441 CHERKASOVA V S AYYADEVARA N EGILMEZ u R R SHMOOKLER 2000 Diverse Caenorhabditis elegans genes that are upregulated in dauer larvae also show elevated transcript levels in long lived aged or starved adults J Mol Biol 300 433 448 CHIEJINA S N B B FAKAE u B O EZE 1988 Arrested development of gastrointestinal trichostrongylids in goats in Nigeria Vet Parasitol
112. Natl Acad Sci USA 93 12388 12393 GRIFFIN T J S P GYGI T IDEKER B RIST J ENG L HOOD u R AEBERSOLD 2002 Complementary profiling of gene expression at the transcriptome and proteome levels in Saccharomyces cerevisiae Mol Cell Proteomics 1 323 333 GUIMARAES M J F LEE A ZLOTNIK u T McCLANAHAN 1995 Differential display by PCR novel findings and applications Nucleic Acids Res 23 1832 1833 GUNTHER C V L L GEORGI u D L RIDDLE 2000 A Caenorhabditis elegans type I TGF beta receptor can function in the absence of type II kinase to promote larval development Development 127 3337 3347 GUPTA R P u H C GIBBS 1970 Epidemiological investigations on Dictyocaulus viviparus Bloch 1782 infection in cattle Can vet J 11 149 156 GUPTA R P u H C GIBBS 1976 A note on the morphogenesis of inhibited stages of Dictyocaulus viviparus Bloch 1782 Haryana Agricultural University Journal of Research 6 205 207 224 Literaturverzeichnis GURSKAYA N G L DIATCHENKO A CHENCHIK P D SIEBERT G KHASPEKOV K A LUKYANOV L L VAGNER O D ERMOLAEVA K LUKYANOV u E D SVERDLOV 1996 Equalizing cDNA subtraction based on selective suppression polymerase chain reaction Cloning of Jurkat cell transkripts induced by phytohemaglutinin and phorbol 12 myristate 13 acetat Anal Biochem 240 90 97 HADAS E u M STANKIEWICZ 1998 Superoxide dismutase and total antioxidant status
113. OP 898 LESRE 0009 ZUSSTIE O 6021 76 69 TET Ergebnisse 172 JUATIA OHSU OIEI A AD ardoy n Jq ord uatdosy 01 78 IT 66 IPOTE BE FIERLEE 09 ZErI 99 65 TT Br 9bE te TESz 6EDZIE EE EISS OT Os6TT PE SP 396 SO OF 6ZI TESSE PS S0L8Z OC LP ST EL 8990 lS ze 69 96E F rzLEI OSETEZ 0855551 0HE6E OL sT 06621 F636 Ossret OzrrrT OSP OEE OSeesl OOE 8T 083731 STEGE F68 01 ZI TEOT BEES LOZ LEO LVT60 0L 9793 rE 06 Er 06 Sr SE8I 209601 9LOTOET SOLTE SORES OOrSsT SETT O0ZF ST TOL 78 TET A Sunynssageprepueig IS TOL TR ICT zuanbag zap YId IWY aanemuen a Ergebnisse 173 Wie aus den Tab 8 und 9 ersichtlich ist konnte auch mit den TaqMan MGB Sonden keine zufriedenstellende Reproduzierbarkeit erreicht werden Vielmehr variierten die Variations koeffizienten der drei untersuchten Sequenzen in Abh ngigkeit von der Sondencharge sowie der wiederholten Verwendung und dem damit verbundenen Auftauen der Sondenaliquots bzw der Templates Aber auch innerhalb der einzelnen Duplikate ergaben sich teilweise sehr hohe Standardabweichungen respektive Variationskoeffizienten wodurch die Beurteilung der Ergebnisse zus tzlich erschwert wurde Insgesamt zeigte sich jedoch eine deutliche differen tielle Transkription der Sequenz L3i 82 101 da auf eine EF 1a Kopie bei den Hypobiose in duzierten Larven sehr viel mehr L3i 82 101 Kopien entfallen als b
114. PARDEE 1992 entwickelte Differential Display DD stellt eins der ersten auf einer PCR basierenden Verfahren zur Identifikation differentiell transkribierter Ge ne dar Bei dieser Methode welche in Abb 1 schematisch dargestellt ist wird zun chst cDNA der zu vergleichenden Populationen synthetisiert Dabei kann sowohl mRNA als auch Gesamt RNA revers transkribiert werden LIANG u PARDEE 1992 LIANG et al 1993 LIANG et al 1995 VELCULESCU et al 1995b LIANG u PARDEE 1997 Da in der sp te ren PCR Zufallsprimer Verwendung finden ist eine vollstandige Entfernung chromosomaler DNA aus der isolierten RNA durch eine DNase unerl sslich LIANG et al 1993 LIANG et al 1993 LIANG et al 1995 LIANG u PARDEE 1997 Als Primer f r die Reverse Tran skriptase dienen Oligo dT Primer mit ein LIANG et al 1993 oder zwei zus tzlichen Nukleotiden LIANG u PARDEE 1992 am 3 Ende wobei f r jeden Primer eine separate Reaktion angesetzt wird Die Zweitstrang cDNA Synthese und die anschlie ende Amplifika tion erfolgen mit Hilfe von Zufallsprimern sowie dem entsprechenden Oligo dT Primer des reversen Transkriptionsansatzes Die Amplifikationsprodukte werden anschlie end auf einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt Die vergleichende Betrachtung der jeweils entstandenen Bandenmuster erm glicht die Erkennung differentieller Transkripte Die ent sprechenden Banden werden isoliert reamplifiziert und f r die Sequenzanalyse kloniert
115. Proteine wodurch eine initiale Reinigung stattfand Gleichzeitig wurde dabei die GTC Konzentration so eingestellt dass die Bindung der Poly A Sequenz an die Thymidin Kette m glich aber die Inhibition von RNasen noch gegeben war Nach erfolgter komplement rer Bindung der mRNA an die Oligo dT Zellulose bewirkten mehrere Waschschritte mit einem Hoch und Niedrig Salz Puffer das Auswaschen von DNA restlichen Proteinen und sonstigen Zellbestandteilen Abschlie end wurde die mRNA mittels eines auf 65 C erw rmten Eluti onspuffers aus der S ule zur ck gewonnen S mtliche Reaktionsschritte wurden gem dem Herstellerprotokoll vorgenommen Die Pr zipitation der mRNA erfolgte durch Zugabe von 10 ul Glykogen 40 ul Kaliumacetat und 1 ml 95 igem Ethanol ber Nacht bei 70 C Am folgenden Tag wurde die gef llte mRNA durch eine 30 Minuten andauernde Zentrifugation bei 13 000 g und 4 C gesammelt und der ber dem Pellet befindliche berstand abgenommen Es schloss sich eine Waschung des Pellets zur Beseitigung von Salz und Alkoholresten mit 1 ml 70 igem Ethanol an Hierbei erfolgte eine Zentrifugation f r 10 Minuten bei 4 C und 13 000 g Der berstand wurde verworfen Anschlie end wurde das Pellet zur Entfernung restlichen Ethanols ca 10 Minuten bei RT getrocknet und danach abh ngig von der sich anschlie enden Untersu chung in 5 bis 8 ul DEPC Bidest gel st 3 7 2 Quantitative Bestimmung und Reinheit der isolierten mRNA D
116. R BEGLEY S J M JONES E B DAVIS S SCHERER S WARD u ET AL 2000 A global profile of germline gene expression in C elegans Mol Cell 6 605 616 REN P C S LIM R JOHNSEN P S ALBERT D PILGRIM u D L RIDDLE 1996 Control of C elegans larval development by neuronal expression of a TGF beta homolog Science 274 1389 1391 RICKLING S 1999 Vergleichende Untersuchungen zur Genexpression persistierender und nicht persistierender Stadien von Dictyocaulus viviparus Hannover Tier rztl Hochsch Diss RIDDLE D L M M SWANSON u P S ALBERT 1981 Interacting genes in nematode dauer larva formation Nature 290 668 671 ROBERTS L S u D FAIRBAIRN 1965 Metabolic studies on adult Nippostrongylus brasiliensis Nematoda Trichostrongyloidea J Parasitol 51 129 138 ROGERS W P u R HEAD 1972 The effect of the stimulus for infection on hormones in Haemonchus contortus Comp Gen Pharmacol 3 6 10 ROMMEL M u T SCHNIEDER 1989 Neue Anthelminthika und neue Behandlungssysteme zur Bek mpfung der Weideparasitosen der Rinder Angew Parasitol 30 101 109 ROUAULT J P P E KUWABARA O M SINILNIKOVA L DURET D THIERRY MIEG u M BILLAUD 1999 Regulation of dauer larva development in Caenorhabditis elegans by daf 18 a homologue of the tumour suppressor PTEN Curr Biol 9 329 332 SAIKI R K D H GELFAND S STOFFEL S J SCHARF R HIGUCHI G T HORN K B MULLIS u H
117. ROCHE eingeschwei t welche an einer E cke einen Schraubverschluss besa en durch welchen der Pufferwechsel erfolgen konnte 3 10 3 Hybridisierung und Detektion 3 10 3 1 Hybridisierung Die mit DIG 11 dUTP markierten cCDNA Sonden bilden bei entsprechender hoher Sequenz bereinstimmung in Abh ngigkeit von der Hybridisierungstemperatur mit den auf einer Tr germembran fixierten einzelstr ngigen cDNAs Hybridmolek le aus Mit den subtrahierten sowie Tester Kontroll Sonden der L3ni und L3i wurde je ein cDNA dot blot s 3 10 1 hybridisiert Dabei wurde das nachfolgende Protokoll wie auch das der sich anschlie enden Detektion strikt eingehalten um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen und somit differentiell transkribierte cCDNA Sequenzen ausfindig zu machen Nach dem DIG Ap plication Manual for Filter Hybridization 2000 ROCHE betr gt die optimale Hybridisie rungstemperatur f r eine DNA DNA Hybridisierung von S ugetieren 42 C wenn folgende Bedingungen gegeben sind eine Sequenzhomologie von 80 100 die Verwendung von DIG Easy Hyb ROCHE oder einem Standardpuffer mit 50 Formamid und einem GC Gehalt der DNA von 40 In Ermangelung entsprechender Angaben f r Nematoden wurde diese Hybridisierungstemperatur auch in dieser Arbeit gew hlt In Vorversuchen wurde als optima le Sondenkonzentration 16 5 ng markierte cDNA Sonde ml Hybridisierungsl sung ermittelt Da jedoch bei der berpr fung der Sonden s 4 5 2 die L3ni Tester
118. Reaktionen in der L3ni cDNA nachweisbar war Jedoch repr sentierte diese Isoform auch immer unter Verwendung der L3i cDNA die prominenteste Bande Somit ist wahrscheinlich dass mit dem L3ni Template nachweisbare Bande der L3i 88a nicht auf ein differentielles alternatives Splei en sondern lediglich auf das in beiden Larvenpopulationen seltenere Vorkommen der brigen Isoformen zur ckzuf hren ist 5 8 Quantitative real time PCR qPCR Die mit TagqMan MGB Sonden durchgef hrte qPCR erbrachte f r die Sequenz L3i 82 101 PNMT eine signifikante um mehr als den Faktor 21 erh hte Kopienzahl dieses Transkriptes in den L3i im Gegensatz L3ni und best tigte damit die bisherigen Ergebnisse der vorliegen den Arbeit bez glich der differentiellen Transkription dieses Gens Entgegen der Erwartung ergab die Auswertung der Kopienzahlen der L3ni 69 92 SOD wenn auch statistisch nicht signifikant ebenfalls ein vermehrtes Vorliegen knapp zweifach erh ht dieser cDNA in den L3i statt in den L3ni Dieses Ergebnis ist in sofern widerspr chlich als dass diese Sequenz wie auch die L3i 82 101 von zwei Klonen der subtrahierten cDNA Bank repr sentiert wurde was als Hinweis auf eine deutliche differentielle Transkription gewertet werden kann Ebenso zeigte sich dieses Transkript auch bei den brigen Untersuchungen dieser Arbeit immer als unzweifelhaft differentiell transkribiert Eine m gliche Erkl rung f r diesen Umstand ist eine differentielle Gentr
119. S 973 974 Uber die Aktivierung der Adenylat Cyclase und dem damit einhergehenden erh hten cAMP Spiegel k nnte Adrenalin auch in den Energiestoffwechsel der Zellen eingreifen So nehmen inhibierte D viviparus Stadien lange Zeit keine Nahrung auf sondern zehren von ihren Re servegranula Nach eigenen Beobachtungen erscheinen die sechs bis acht Wochen gek hlten dritten Larven nahezu durchsichtig Im Gegensatz dazu sind bei frischen dritten Larven sehr viele dunkel gef rbte Granula erkennbar Bei parasitischen Nematoden repr sentiert Glyko gen das prim re Energiespeichermolek l wohingegen die Energiegewinnung aus Fetten von untergeordneter Bedeutung zu sein scheint ROBERTS u FAIRBAIRN 1965 ROGERS u HEAD 1972 MAGAT et al 1972 In Vertebraten aktiviert Adrenalin ber so genannte 7TM Rezeptoren die Adenylat Cyclase welche ihrerseits ber die cAMP Signalkaskade die Akti vierung der entsprechenden Enzyme f r die Utilisation der Fette und des Glykogens bedingt BERG et al 2003 S 642 644 u 664 Auf Grund der Existenz einer Catecholamin sensitiven Adenylat Cyclase in P redivivus WILLETT et al 1979 vermutet WILLETT 1980 auch f r parasitische Nematoden diesen catecholaminergen Signalweg des Glykoge nabbaus Somit k nnte die Adrenalin vermittelte Signalwirkung das L3i assoziierte Glycerin Kinase Homolog aktivieren und auf diesem Weg die notwendige Energie f r das berleben der inhibierten Stadien bereitstellen Die zu dem D
120. Sekunden Denaturierung 94 C 10 Sekunden 27x Primerannealing 66 C 30 Sekunden Primerextension 72 C 1 5 Minuten 3 8 13 Nested PCR Diese PCR in der dreifach verdiinntes Suppression PCR Produkt als Template diente er reicht durch die Verwendung von Nested Primern s Abb 7 eine weitere Anreicherung dif ferentiell transkribierter Sequenzen da analog zur vorangegangenen Suppression PCR nur mit unterschiedlichen Adaptern ligierte cDNAs exponentiell amplifiziert werden Die Suppression PCR Doppelans tze der subtrahierten cDNA der L3ni und L3i s 3 8 12 wurden auch in die ser Nested PCR als separate Ans tze gehandhabt In der Amplifikationsreaktion deren Pro dukte nachfolgend einer Gelelektrophorese unterzogen wurden fand das Temperaturprofil der Suppression PCR Anwendung s 3 8 12 Abweichend liefen bei einer Annelingtemperatur von 68 C nur 12 Zyklen ab und auf die initiale Denaturierung wurde verzichtet 3 8 14 PCR Analyse der Subtraktionseffizienz Die Analyse der Subtraktionseffizienz dient der berpr fung einer erfolgreichen Durchf h rung der SSH Dies geschah durch einen Vergleich der vorhandenen Menge bekannter cDNA Sequenzen vor und nach der subtraktiven Hybridisierung in Form einer PCR Nicht differen tiell transkribierte und daher im Zuge der SSH weitestgehend eliminierte Sequenzen lassen bei der Verwendung subtrahierter cDNA als Matrize im Gegensatz zu nicht subtrahierter cDNA mindestens f nf PCR Zyk
121. Strube 2004 Differentielle Gentranskription bei Hypobiose induzierten und nicht induzierten dritten Larven von Dictyocaulus viviparus Die Diktyokaulose ist eine der bedeutsamsten parasit ren Erkrankungen der Weiderinder Dabei sind unerkannt mit hypobiotischen Lungenwurmstadien infizierte Tiere bez glich der Verbreitung der Parasitenpopulation von Jahr zu Jahr von besonderer epidemiologischer Be deutung Davon ausgehend dass die Entwicklungshemmung nach der Induktion durch Au Benfaktoren einer genetischen Regulation unterliegt wurde die Gentranskription von Hypo biose induzierten und nicht induzierten dritten D viviparus Larven vergleichend untersucht Zur Untersuchung der differentiellen Gentranskription bei Hypobiose induzierten und nicht induzierten Drittlarven erfolgte unter Anwendung der Suppression Subtractive Hybridization eine Anreicherung der differentiellen Transkripte zur Erstellung subtrahierter cDNA Banken Diese enthielten 105 Klone der Hypobiose induzierten und 104 Klone der nicht induzierten Lungenwurmlarven Nach der berpr fung der cDNA Banken mit der Technik des Differen tial Screenings verblieben 58 Klone der Hypobiose induzierten und 44 Klone der nicht indu zierten Stadien von denen 26 respektive 22 Klone mittels Southern dot blotting verifiziert werden konnten Von den insgesamt 48 Genfragmenten zeigten 20 Transkripte signifikante Homologien mit 16 verschiedenen Nuklein bzw Proteinsequenzen Unter Anwendung der R
122. T TCT GAG CTT TCT CAA GGT CAA CAA TAA G L3ni 22 for AAG AAT TTT CCG ACC AAC TCC TGA ATG TGA TAT TGG ATG T L3ni 22 rev TCA CGC GAT TTA TAA TCT CCA TAA AGA ATT CCC GAA CTT G L3ni 51 for AAC GGC GGA TGC AAG TGC GAC ATC AGA AG L3ni 51 rev GCA TTC GGC AGC GTT GTT GTA AGA GGT AAC TAC TTC GTT L3ni 54 for GGA GGT GTA GCC GCT TCG CTT AAA CTT CAT AAG CCT CTA CT L3ni 54 rev ATG ATG CCC CTT GAA TGC TAT CGC CAA AAT GAG AAT AAA T L3ni 54A for CTG GGC CGA ATT TTG AAC CGA CTT GGA AAA GAT L3ni 54A rev G ATG CCC CTT GAA TGC TAT CGC CAA AAT GAG AAT AA L3ni 56 for TGT CCG GTG ATA GTT CGC AAA GTG ATA GAT TCT ATT GCC TAT L3ni 56 rev GTT TGG CTG CGG AAG TAT ATT CGG CAG ATT CTGG L3ni 67 for ACT TGC GCA GCA TGG ATT CGA GGG TAT AAC ATC C L3ni 67 rev GGC CCG TTC ACA AAC CTG AAT AGA TGG ATC AAA GCT TC L3ni 67 GAG AAC GAT GAC GTC GGA ACT GCG TGA CTG GTA A SL1 L3ni 67 GCA CGT TGA GTT AAT AAA TCT AAG CCT CTT GAC G L3ni 69 for GGC AAA CGG TTG TCT AGC AGC TGG AGG TCA TTA TA L3ni 69 rev ATA CGT ATC GCG CCC AAT TCC AAG CGT TTA GTT TA L3i 10 for TAA TCC GAT TTC GGC GAA AAA GGC CTC ATC TAA TTG T L3i 10 rev GAC GCA GCG CTT GCA AAG CCT GAG TCT CTT T L3i 10 GAA CGT AAC CGC TTA CGA CGC AAA ACG CTG TCA GC L3i 33 for TCC ACG CGC CTG TGT CCC GTT CTA AAA CA L3i 33 rev GTT CAA CGG CGG AAG TTT CCC ACC ATT AGC AG Anhang 247 Bezeichnung Sequenz 5 3 L31 33A for GGT GGC GAT GAC TAC TGG TAT TAT GAC GTC GCA TCA GAT L3i 33A rev A
123. UG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes Cell 44 283 292 KOZAK M 1987a An analysis of 5 noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs Nucleic Acids Res 15 8125 8148 KOZAK M 1987b At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells J Mol Biol 196 947 950 KOZAK M 1987c Effects of intercistronic length on the efficiency of reinitiation by eukaryotic ribosomes Mol Cell Biol 7 3438 3445 KOZAK M 1999 Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes Gene 234 187 208 KOZAK M 2002 Pushing the limits of the scanning mechanism for initiation of translation Gene 299 1 34 Literaturverzeichnis 229 KUANG W W D A THOMPSON R V HOCH u R J WEIGEL 1998 Differential screening and suppression subtractive hybridization identified genes differentially expressed in an estrogen receptor positive breast carcinoma cell line Nucleic Acids Res 26 1116 1123 KUTYAVIN I V I A AFONINA A MILLS V V GORN E A LUKHTANOV E S BELOUSOV M J SINGER D K WALBURGER S G LOKHOV A A GALL et al 2000 3 minor groove binder DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures Nucleic Acids Res 28 655 661 KUTYAVIN I V E A LUKHTANOV H B GAMPER u R B MEYER 1997 Oligonucleotides with conjugated dihydropyrroloindole tripeptides base composition and backbone effects on
124. UPM 5 CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3 0 4 uM 5 CTAATACGACTCACTATAGGGC 3 2 uM Abb 10 In der RACE verwendete Oligonukleotide BD CLONTECH 108 Material und Methoden F r die Durchf hrung der RACE die soweit nicht anders vermerkt nach Anleitung des Her stellerprotokolls erfolgte wurde zun chst wie unter 3 7 1 beschrieben mRNA aus den Hypo biose induzierten und nicht induzierten D viviparus Larven isoliert Isolierung 3 s 4 2 In die Erststrang cDNA Synthese f r die 3 bzw 5 RACE gingen je 285 ng mRNA der L3ni und 643 ng mRNA der L3i ein Die Touchdown PCR in der die entsprechende L3ni bzw L3i Erststrang cDNA als Template diente lief bei dem unter 3 13 2 aufgef hrten Tempera turprofil mit 35 Zyklen im dritten Reaktionsschritt ab Anschlie end wurden die Amplifikati onsprodukte im Agarosegel visualisiert Da sich insbesondere das 5 Ende bei einigen cDNA Fragmenten zun chst nicht darstellen lie wurde f r die 5 RACE eine erneute Erststrang cDNA Synthese unter Verwendung des entsprechenden reversen Primers kombiniert mit dem jeweiligen 5 Primer s 9 1 anstelle des 5 RACE CDS Primers durchgef hrt um somit gezielt nur genspezifische oder verwandte mRNA Molek le revers zu transkribieren Dabei wurde f r jeden dieser Klone eine separate Reaktion angesetzt in welcher je 1696 ng L3ni mRNA bzw 463 ng L3i mRNA aus Isolie rung 4 s 4 2 eingesetzt wurden das weitere Vorgeh
125. ae of the parasitic nematode Ostertagia ostertagi Biochem J 347 Pt 3 763 770 Literaturverzeichnis 233 MORI I u Y OHSHIMA 1995 Neural regulation of thermotaxis in Caenorhabditis elegans Nature 376 344 348 MORRIS J Z H A TISSENBAUM u G RUVKUN 1996 A phosphatidylinositol 3 OH kinase family member regulating longevity and diapause in Caenorhabditis elegans Nature 382 536 539 MURAKAMI M M KOGA u Y OHSHIMA 2001 DAF 7 TGF beta expression required for the normal larval development in C elegans is controlled by a presumed guanylyl cyclase DAF 11 Mech Dev 109 27 35 MYERS R M 1993 The pluses of subtraction Science 259 942 943 NDAO M V S PANDEY J ZINSSTAG u K PFISTER 1995 Helminth parasites and hypobiosis of nematodes in N Dama cattle during the dry season in The Gambia Vet Parasitol 60 161 166 NELSON F K P S ALBERT u D L RIDDLE 1983 Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory excretory system J Ultrastruct Res 82 156 171 NEVINS J R 1983 The pathway of eukaryotic mRNA formation Ann Rech Biochem 52 441 466 O NEILL M J u A H SINCLAIR 1997 Isolation of rare transcripts by representational difference analysis Nucleic Acids Res 25 2681 2682 OAKLEY G A 1983 The epidemiology control and treatment of parasitic bronchitis in cattle Proc Brit Cattle Vet Ass 82 83 97 114 OAKLEY G A 1993 Calfhood vaccination
126. al 1973 ARMOUR u BRUCE 1974 ARMOUR 1978 EYSKER 1981a So wiesen K lber die mit acht Wochen bei 4 C gek hlten O ostertagi Larven infiziert worden waren durchschnittlich 66 ent wicklungsgehemmte Stadien auf ARMOUR u BRUCE 1974 Auch f r H contortus best tigen Untersuchungen den Einfluss der K hlung auf die Induktion der Hypobiose BLITZ u GIBBS 1972a EYSKER 1981a berichtet in diesem Zusammenhang dass die st rkste Inhi bition von H contortus Larven durch Inkubation bei 15 16 C ausgel st w rde niedrigere Temperaturen seien weniger effektiv Auch bei D viviparus ist die Induktion der Entwick lungshemmung durch mehrw chige K hlung bei 4 7 C m glich GUPTA u GIBBS 1970 PFEIFFER 1976 INDERBITZIN 1976 PFEIFFER u SUPPERER 1980 EYSKER et al 1992 SAMSON HIMMELSTJERNA u SCHNIEDER 1999 RICKLING 1999 Nach sechsw chiger Inkubation infekti ser D viviparus Larven bei 4 C konnten INDERBITZIN 1976 und PFEIFFER 1976 bereits 76 bis 94 entwicklungsgehemmte Stadien nach Schrifttum 29 achtw chiger K hlung sogar 97 bis 98 solcher Stadien ausmachen Es entwickelten sich jedoch ebenso 22 bis 49 der nicht gek hlten Larven nur bis zum pr adulten Stadium Auch in Feldversuchen konnte der Einfluss niedriger Temperaturen auf die Induktion der Hypobio se beobachtet werden So fanden ANDERSON et al 1965b bei K lbern die sich im sp ten Herbst nur zwei Wochen auf einer O ostertagi kontaminierten Weide befa
127. alinten sit t daher als Indikator f r einen falsch positiven Klon angesehen werden Dieser Zusam menhang wurde auch im Rahmen dieser Arbeit bei der Verifizierung mittels Southern dot blotting des fteren beobachtet 184 Diskussion 5 5 Charakterisierung ausgew hlter differentiell transkribierter Genfragmente 5 5 1 berpr fung der genspezifischen Primer Die insgesamt 19 verifiziert differentiell transkribierten Genfragmente der subtrahierten cDNA Banken welche beim Sequenzidentit tsvergleich mittels BLAST signifikante ber einstimmungen aufwiesen sollten mit Hilfe der Rapid Amplification of cDNA Ends RACE vervollst ndigt werden Zuvor erfolgte eine berpr fung der ausgew hlten genspezifischen Primerpaare Hierbei konnte mit den zwei Primerpaaren f r den Klon L3ni 54 trotz wiederholter Versuche kein PCR Produkt dargestellt werden Dies k nnte durch die Auswahl suboptimaler Primer respek tive einer ungeeigneten Primerkombinationen bedingt sein Weiterhin ist in Betracht zu zie hen dass es sich bei dem L3ni 54 Fragment um eine Kontamination der in der SSH verwen deten L3ni cDNA handelt oder die reverse Transkription der L3ni 54 auf Grund eines sehr raren Sequenzaufkommens unzureichend war F r einen der letztgenannten Punkte als m gli che Ursache spricht die schwache Signalintensit t dieses Klons beim Differential Screening und das Ausbleiben von Signalen im Zuge des Southern dot blotting bei welchem cDNA Sonden aus fr
128. an markierter Sonde gleichzusetzen 4 7 5 Chemilumineszente Detektion Die Hybridisierung der 104 bzw 105 Klone der subtrahierten L3ni und L3i cDNA Banken mit den cDNA Sonden der beiden Larvenpopulationen erbrachte keinen deutlichen Hinweis auf eine differentielle Transkription Die Inserts der Klone zeigten wenn ein Signal erkennbar war in den meisten F llen sowohl mit der entsprechenden Tester als auch der Driver cDNA Sonde ein positives Hybridisierungsergebnis lediglich die Signalintensit t variierte Auff llig war dass unabh ngig von der eingesetzten Sonde nach 1 5 st ndiger Filmexposition nur bei wenigen Klonen der subtrahierten L3i cDNA Bank gut sichtbare Signale detektiert werden konnten Im Zuge einer Belichtung der Chemilumineszenzfilme f r eine Dauer von 3 5 Stun den erh hte sich in beiden subtrahierten cDNA Banken die Anzahl an Klonen mit positivem Hybridisierungsergebnis Zudem verst rkte sich die Signalintensit t der Klone die nach einer Expositionszeit von 1 5 Stunden nur schwach erkennbare Signale entstehen lie en Dies galt sowohl bei der Verwendung der L3ni cDNA Sonde als auch beim Einsatz der L3i cDNA Sonde Allerdings zeigten bei der verl ngerten Belichtungsdauer auch die auf den jeweiligen Membranen befindlichen Negativkontrollen f r die in der LD PCR inkorporierten Oligo nukleotide im Gegensatz zur 1 5 st ndigen Filmbelichtung nun ein schwach positives Signal so dass diese Hybridisierungsergebnisse nicht zur
129. and life span Cell 95 199 210 ARASU P 2001 In vitro reactivation of Ancylostoma caninum tissue arrested third stage larvae by transforming growth factor beta J Parasitol 87 733 738 ARMOUR J 1978 Arrested development in cattle nematodes with special reference to Ostertagia ostertagi in F H M BORGSTEEDE J ARMOUR u J JANSEN Hrsg Facts and Reflections III Central Veterinary Institute Lelystad Niederlande S 77 88 ARMOUR J u R G BRUCE 1974 Inhibited development in Ostertagia ostertagi infections a diapause phenomenon in a nematode Parasitology 69 161 174 ARMOUR J u M DUNCAN 1987 Arrested larval development in cattle nematodes Parasitology Today 3 171 176 ARMOUR J F W JENNINGS u G M URQUART 1967 The possible existence of two strains of Ostertagia ostertagi Vet Rec 80 208 209 ARMOUR J F W JENNINGS u G M URQUHART 1969 Inhibition of Ostertagia ostertagi at the early fourth larval stage I The seasonal incidence Res Vet Sci 10 232 237 BACINSKY A 1973 The morphological evaluation of Dictyocaulus viviparus found in red deer and cattle Morfologicke zhodnotenie povodcov diktyokaulozy ziskanych z jelenov a z hov dzieho dobytka Folia Veterinaria 17 209 219 BAERMANN G 1917 Eine einfache Methode zur Auffindung von Ankylostomum Nematoden Larven in Erdproben Tijdschr Diergeneeskd 57 131 137 212 Literaturverzeichnis BAIN R K u W SYMINGTON 1986
130. anskription des Elongationsfaktorsla auf welchen die Zielsequenzen normalisiert wurden Dieses wie auch andere housekeeping Gene beispielsweise B Aktin oder 200 Diskussion die Glycerinaldehydphosphat Dehydrogenase GAPDH unterliegen oftmals in verschiedenen Geweben oder Stoffwechselzust nden ebenfalls einer gesteigerten oder verminderten Tran skription BUSTIN 2000 CHERKASOVA et al 2000 MOE et al 2001 CHAN et al 2002 DEINDL et al 2002 BUSTIN 2002 In der C elegans dauer larva findet sich beispielsweise eine Aufregulation von B Aktin und EF la wohingegen die Transkriptionsrate dieser zwei housekeeping Gene mit zunehmendem Alter des Nematoden abnimmt CHERKASOVA et al 2000 M glicherweise ist diese Abregulation durch eine verminderte Zellteilungsrate sowie einen herabgesetzten Zellstoffwechsel und damit einer allgemeinen Senkung der Gentran skription bedingt So wird der Elongationsfaktor EF la verst rkt in Tumorzellen exprimiert ferner wird ihm auch eine Funktion bei der Organisation des Zytoskeletts zugesprochen GRANT et al 1992 KUANG et al 1998 CHAN et al 2002 Daher w re eine Aufregulati on der EF la Gensequenz in den stoffwechsel und zellteilungsaktiveren nicht Hypobiose induzierten Larven denkbar Lage nur eine zweifach erh hte Kopienzahl in diesen Larven vor w re das vermehrte Vorliegen der L3ni 69 92 Sequenz in den L3i bereits relativiert Da die Transkriptionsrate der 18S rRNA im Gegensatz zu den genannten
131. apid Amplification of cDNA Ends und einer spliced leader 1 SL1 spezifischen PCR wur den 16 der differentiellen Gensequenzen sowohl in 3 als auch in 5 Richtung komplettiert Im Zuge dieser Vervollst ndigung ergaben sich f r neun verschiedene Gensequenzen Transkriptvarianten Ein erneuter Sequenzidentit tsvergleich erbrachte bez glich der nicht induzierten Larven aussagekr ftige bereinstimmungen mit extrazellul ren Kupfer Zink Su peroxiddismutasen SOD Paramyosinen nukle ren anchorage Proteinen dem Vorl ufer eines exkretierten sezernierten Proteins einem putativen Protein bilateralen Ursprungs und einem weiteren putativen Protein Diese Identit ten bezogen sich auf Sequenzen von C ele gans mitunter auch auf parasitische Nematoden und andere Invertebraten als auch auf Verte braten Bei den Hypobiose induzierten Dictyocaulus Larven konnten signifikante Homolo Zusammenfassung 207 gien mit Phenylethanolamin N Methyltransferasen PNMT Guanylyl Cyclasen Calmoduli nen Glycerin Kinasen DM DNA Bindungsdom nen enthaltenden Proteinen und einer Kal zium unabhangigen Phospholipase Az der oben angef hrten Organismen festgestellt werden Diese Proteine welche funktional an der Signalregistrierung und transduktion der Zelltei lung und differenzierung der Regulation der Transkription dem Metabolismus und der Lo komotion beteiligt oder in Parasit Wirt Interaktionen involviert sind k nnen in fast allen F l len mit der inh
132. as Larvenmaterial wiederholt mit einer sterilen Skalpellklinge zusam mengekratzt um eine effektive Zerkleinerung zu gew hrleisten welche mikroskopisch kon trolliert wurde ZEISS Um die Zerkleinerung zu erleichtern wurden w hrend der Durchf h rung alle verwendeten Materialien wie auch das Larvenmaterial selbst mehrfach mit fl ssi gem Stickstoff bergossen Nach der berf hrung der zerm rserten Larven in ein 2 ml DEPC Gef wurde sofort mit der mRNA Isolierung begonnen 3 7 Allgemeine molekularbiologische Methoden 3 7 1 mRNA Isolierung Die mRNA welche f r verschiedene Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit erforderlich war wurde aus den zerkleinerten Larven mit dem Quick Prep Micro mRNA Purification Kit AMERSHAM BIOSCIENCES isoliert Die bei fast allen eukaryontischen mRNAs am 3 Ende vorliegende homopolymere Poly A Sequenz hybridisiert dabei an eine ebenfalls ho mopolymere Thymidin Kette welche kovalent an Zellulosepartikel gebunden ist Diese Oli go dT Zellulose wird im Verlauf der mRNA Isolierung in eine Schleuders ule verbracht Zun chst erfolgte im Rahmen der mRNA Isolierung ein weiterer Aufschluss des zerkleinerten Larvenmaterials s 3 6 6 durch Hinzuf gen von Guanidinium Thiocyanat GTC haltigen Extraktionspuffer und gr ndlicher Durchmischung Die anschlie ende Zugabe von Eluti Material und Methoden 65 onspuffer zu dem Zellhomogenat bedingte nach sorgfaltiger Vermischung das Ausfallen vie ler
133. asitol Res 78 594 597 GIBBONS L M u J H GLUND 2002 Dictyocaulus capreolus n sp Nematoda Trichostrongyloidea from roe deer Capreolus capreolus and moose Alces alces in Sweden J Helminthol 76 1 7 GIBBONS L M u L F KHALIL 1988 A revision of the species Dictyocaulus Railliet amp Henry 1907 Nematoda Trichostrongyloidea with the description of D africanus n sp from African artiodactylids Journal of African Zoology 102 151 175 GIBBS H C 1968 Some factors involved in the spring rise phenomen in sheep in E J L SOULSBY Hrsg The reaction of the host to parasitism N G ELWERT Universit ts und Verlagsbuchhandlung Marburg S 160 173 GIBBS H C 1973 Transmission of parasites with reference to the strongyles of domestic sheep and cattle Can J Zool 51 281 289 GIBBS H C 1982 Mechanisms of survival of nematode parasites with emphasis on hypobiosis Vet Parasitol 11 25 48 GIBBS H C 1986 Hypobiosis in parasitic nematodes an update Adv Parasitol 25 129 174 GIBSON T E u G EVERETT 1978 Further investigations on the effect of different levels of larval intake on the output of eggs of Ostertagia circumcincta in lambs Res Vet Sci 24 169 173 222 Literaturverzeichnis GIL E B L E MALONE L X LIU C D JOHNSON u J A LEES 1999 Regulation of the insulin like developmental pathway of Caenorhabditis elegans by a homolog of the PTEN tum
134. atierten Aminos uren beziehen Die L nge der Aminos uresequenz welche sich ab dem ersten AUG Triplett der translatierten Region ergab ist jeweils in der Spalte ab Met angegeben Zeigten sich Sequenzunterschiede der 3 respektive 5 RACE wie beispielsweise in Form von Sequenzl cken wurden verschiedene Sequenzen generiert Zudem wurden bei der Zusammensetzung der cDNA Sequenzen die bei der berpr fung der genspezifischen Primer erhaltenen verschieden langen Sequenzen der L3ni 56 L3i 33 L3i 75 L3i 82 L3i 88 und L3i 100 ber cksichtigt s 4 9 2 woraus sich letztlich die Bezeichnungen a bis e ergeben Sequenz bp TR aa abMet Sequenz bp TR aa abMet L3i1l0a 1771 149 1126 325 320 L3ni 16 3215 33 2717 894 876 L3i 10b 1782 3 1136 378 377 L3ni 22 950 68 766 232 206 L3i33a 1718 42 1607 521 521 L3ni 51 1055 1 897 298 292 L3133b 1614 42 1454 470 470 L3ni 56a 848 2 751 249 217 L3i33c 1874 42 368 108 108 L3ni 56b 907 2 685 227 195 L3i 53 1923 144 1712 522 517 L3ni 56c 858 2 613 203 171 L3i75a 1743 1 1683 560 552 L3ni 56d 976 2 511 169 137 L3i75b 1810 1 1404 467 459 L3ni 56e 655 2 508 168 136 L3i82a 1177 14 916 300 266 L3ni 67 712 2 625 207 123 L3i82b 1278 14 736 240 206 L3ni 69 L3i82c 1382 14 709 231 197 beng ee ee ee ee L3i82d 1288 14 718 234 200 L3i 82e 1454 14 652 212 178 L3i 101 1325 90 1064 324 266 L3i 88a 873 38 667 209 177 L3i 88b 929 38 766 242 210 L3i 88c 800 38 637 199 167 L3i 88d
135. ating diverse aspects of C elegans male sexual development and behavior Development 127 4469 4480 YI W u D ZARKOWER 1999 Similarity of DNA binding and transcriptional regulation by Caenorhabditis elegans MAB 3 and Drosophila melanogaster DSX suggests conservation of sex determining mechanism Development 126 873 881 YOKOTA N M UCHIJIMA S NISHIZAWA H NAMBA u Y KOIDE 2001 Identification of differentially expressed genes in rat hippocampus after transient global cerebral ischemia using subtractive cDNA cloning based on polymerase chain reaction Stroke 32 168 174 YU S L AVERY E BAUDE u D L GARBERS 1997 Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons a new family of chemosensory receptors Proc Natl Acad Sci USA 94 3384 3387 ZHUMABAYEVA B L DIATCHENKO A CHENCHIK u P D SIEBERT 2001 Use of SMART generated cDNA for gene expression studies in multiple human tumors Biotechniques 30 158 163 ZUBAY G 2000 Stoffwechselintegration bei Wirbeltieren in BRANDT U u H SCHAGGER Hrsg Biochemie 4 Aufl McGraw Hill International Ltd Maidenhead UK S 685 246 Anhang 9 Anhang 9 1 Genspezifische Primer der RACE und SL1 PCR Bezeichnung Sequenz 5 3 L3ni 16 for CTT GCC GAT GCG AAT CGA AAA CTG CAT GAG TT L3ni 16 rev AGC GGT CGA TTT CAA ATT GCA TAT TCT TGC GAA GAG L3ni 16A for AAG CTA GTT TGG AAG ATA CCC AAC GTC AGC TCC AAC AAG L3ni 16A rev GAA TAG CGA TGG TG
136. ational difference analysis a sensitive and flexible method for identification of differentially expressed genes Methods Enzymol 303 325 349 HUBERT J D KERBOEUF B CARDINAUD F BLOND RIOU u R FOURNIER 1997 Persistent efficacy of topical moxidectin against Dictyocaulus viviparus and Ostertagia ostertagi Vet Parasitol 68 187 190 HUBERT J D KERBOEUF B CARDINAUD u F BLOND 1995 Persistant efficacy of moxidectin against Dictyocaulus viviparus and Ostertagia ostertagi in cattle Vet Rec 136 223 224 INDERBITZIN F 1976 Experimentell erzeugte Entwicklungshemmung von Dictyocaulus viviparus des Rindes Z rich Univ Veterin rmed Fak Diss INGEBRITSEN T S u P COHEN 1983 Protein phosphatases properties and role in cellular regulation Science 221 331 338 226 Literaturverzeichnis INOUE T u J H THOMAS 2000a Suppressors of transforming growth factor beta pathway mutants in the Caenorhabditis elegans dauer formation pathway Genetics 156 1035 1046 INOUE T u J H THOMAS 2000b Targets of TGF beta signaling in Caenorhabditis elegans dauer formation Dev Biol 217 192 204 IWAMA A P ZHANG G J DARLINGTON S R McKERCHER R MAKI u D G TENEN 1998 Use of RDA analysis of knockout mice to identify myeloid genes regulated in vivo by PU 1 and C EBPalpha Nucleic Acids Res 26 3034 3043 JARRETT W F H F W JENNINGS W I M McINTYRE W MULLIGAN u G M URQUHART 195
137. base mittels des RPSBLAST 3 8 Suppression Subtractive Hybridization Die Suppression Subtractive Hybridization SSH basiert auf der Technik der subtraktiven Hybridisierung und erm glicht den Vergleich zweier mRNA Populationen im Hinblick auf differentiell transkribierte Gene In der vorliegenden Arbeit werden diese Populationen von den Hypobiose induzierten L3i und nicht induzierten L3ni dritten Dictyocaulus Larven repr sentiert Zun chst wurde die mRNA in cDNA umgeschrieben Die CDNA Population in welcher die spezifischen differentiell transkribierten Gene enthalten sind wird als Tester L3i cDNA bezeichnet und mit der Referenz cDNA dem so genannten Driver L3ni cDNA in zwei Schritten hybridisiert Die Kinetik dieser Hybridisierungsreaktionen bedingt einen Mengenausgleich sowie eine Anreicherung differentiell transkribierter Sequenzen wo bei diese beiden Parameter in zwei folgenden Amplifikationsreaktionen n mlich der Sup pression und Nested PCR weiter forciert werden Neben dieser so genannten Vorw rts Subtraktion fand gleichzeitig eine reverse Subtraktion statt in welcher die beiden Popula tionen vertauscht werden also der Driver nun als Tester L3ni cDNA dient und mit der L3i cDNA subtrahiert wird Alle Arbeitsschritte erfolgten soweit nicht anders vermerkt nach den Angaben der Herstellerprotokolle Material und Methoden 77 3 8 1 Reverse Transkription und LD PCR Mit Hilfe des SMART PCR cDNA Synthesis Kit B
138. bierter D viviparus Larven Inhibierte Parasitenpopulationen k nnen durch ihr uniformes Aussehen identifiziert werden Da sich in nat rlichen Populationen normalerweise auch ein Teil der Larven ungehemmt ent wickelt ergibt sich eine bimodale Gr enverteilung EYSKER 1993 INDERBITZIN 1976 und PFEIFFER 1976 fanden nach experimenteller Infektion mit gek hlten D viviparus Larven in den Lungen der Tiere inhibierte pr adulte f nfte Stadien Beide Autoren werteten dabei Stadien mit einer L nge von weniger als 5 mm bei Vorhandensein einer Genitalanlage als entwicklungsgehemmt GUPTA u GIBBS 1976 beschreiben hypobiotische Lungen Schrifttum 27 wurmlarven mit einer L nge von 0 9 bis 2 7 mm und einem Genitalsystem welches bei allen Larven in hnlichem Ausma entwickelt war Neuere Untersuchungen zur Morphologie f hr ten SAMSON HIMMELSTJERNA u SCHNIEDER 1999 an inhibierten Larven aus Lun gensp lproben zweier experimentell infizierter K lbern durch Es zeigte sich dass wie auch f r O ostertagi ARMOUR et al 1969 und H contortus BLITZ u GIBBS 1972a beschrie ben die Entwicklungshemmung bereits in den vierten Lungenwurmstadien einzusetzen scheint Bei allen aus den Sp lproben am 15 bzw 68 Tag p i isolierten entwicklungsge hemmten D viviparus Larven konnten SAMSON HIMMELSTJERNA u SCHNIEDER 1999 Genitalanlagen feststellen Die am 15 Tag p i gewonnen vierten Larven L4 waren dabei zwischen 0 8 mm und 1 08 mm lang
139. bt und die Lebensspanne der sich aus ihnen entwi ckelnden Adulten die f r C elegans normalen zwei Wochen betr gt KLASS u HIRSH 1976 2 3 2 Chemosensorische Kontrolle der Larvenentwicklung Wie im Kapitel 2 3 beschrieben wird bei C elegans die Entwicklungshemmung haupts ch lich vom Pheromonspiegel in der Umgebung bestimmt dessen H he von der Populations dichte abh ngt Die Produktion dieses Pheromons wird wahrscheinlich durch das Gen daf 22 reguliert GOLDEN u RIDDLE 1985 stellten fest dass entsprechende Mutanten kein Phe romon produzieren aber auf exogen zugef hrtes Pheromon mit der Ausbildung der dauer larva reagieren Die Antwort auf das Pheromon h ngt von bilateral symmetrischen Amphiden ab VOWELS u THOMAS 1994 deren zw lf Neuronen in den Ganglien des Kopfes lokali siert sind Von dort aus ziehen afferente Neuronenbahnen lateral an die Mund ffnung zu einer Pore in der Kutikula welche von einer St tzzelle gebildet wird Eine Scheidenzelle umgibt einige der zilienbesetzten Nervenendigungen Die jeweils acht chemosensorischen Nervenen digungen der Amphide sind direkt der Umwelt exponiert WARE et al 1975 WARD et al 1975 Die chemosensorischen Neurone ADF ASI sowie ASG regulieren die Produktion e1 nes TGF Signals und hemmen so die Bildung der dauer larva GEORGI et al 1990 BARGMANN u HORVITZ 1991 ESTEVEZ et al 1993 REN et al 1996 Dahingegen werden die ASJ Neuronen deren Regulation cGMP gesteuerte Ionenkan
140. cDNA encoding a nuclear hormone receptor of the steroid thyroid hormone receptor superfamily from the human parasitic nematode Strongyloides stercoralis Parasitol Res 86 24 29 SIEBERT P D A CHENCHIK D E KELLOGG K A LUKYANOV u S A LUKYANOV 1995 An improved method for walking in uncloned genomic DNA Nucleic Acids Res 23 1087 1088 SKRJABIN K I 1931 Dictyocauliosis of cattle in the USSR Veterinarnyi Spetsialist na Sotsialitischeskoj Stroike 19 23 32 SMART D 1988 Catecholamine synthesis in Ascaridia galli Nematoda Int J Parasitol 18 485 492 SMART D 1989 What are the functions of the catecholamines and 5 hxdroxytryptamine in parasitic nematodes in BENNET E M BEHM C u C BRYANT Hrsg Comparative Biochemistry of Parasitic Helminths 1 Aufl Chapman and Hall London UK S 25 34 SMEAL M G 1982 Bases and Approaches for Control of Nematodes in cattle in SYMONS L E A A D DONALD J K DINEEN Hrsg Biology and Control of Endoparasites Academic Press Sydney Australien S 187 207 SMEAL M G u A D DONALD 1981 Effects on inhibition of development of the transfer of Ostertagia ostertagi between geographical regions of Australia Parasitology 82 389 399 SMEAL M G u A D DONALD 1982a Inhibited development of Ostertagia ostertagi in relation to production systems for cattle Parasitology 85 Pt 1 21 25 SMEAL M G u A D DONALD 1982b Inhibit
141. ch daf 7 ist in den Sig Schrifttum 39 nalweg zur Regulation der dauer larva involviert Die pheromongesteuerte durch daf 11 ak tivierte Transkription des daf 7 Gens welches f r ein TGF B Homolog codiert findet in den ASI Neuronen statt und f rdert die normale Larvenentwicklung REN et al 1996 SCHACKWITZ et al 1996 MURAKAMI et al 2001 LI et al 2003 Bindet das TGF B Homolog an daf 4 eine Typ II Rezeptor Serin Threoninkinase ESTEVEZ et al 1993 akti viert diese wiederum eine Kinase vom Typ I das Genprodukt von daf 1 GEORGI et al 1990 Nach GUNTHER et al 2000 kann der Signalweg auch nur ber die Typ I Se rin Threoninkinase erfolgen jedoch ist die Bindungsaffinit t von daf 7 f r den daf 4 daf 1 Komplex h her als f r daf 1 allein Der phosphorylierte Typ I Rezeptor aktiviert seinerseits die Smad Proteine daf 8 und daf 14 PATTERSON u PADGETT 2000 INOUE u THO MAS 2000b Diese regulatorischen Smads interagieren mit Co Smads woraufhin der Kom plex in den Zellkern gelangt und dort mit anderen Faktoren die Transkription der Zielgene aktiviert oder reprimiert Hierf r besitzen Smads zwei konservierte Dom nen MHI f r die Vermittlung der DNA Bindung und Interaktionen mit Proteinen sowie MH2 welche die Ak tivierung der Transkription bedingt und mit anderen Transkriptionsfaktoren interagiert INOUE u THOMAS 2000b stellten fest dass daf 14 keine DNA Bindungsdom ne besitzt und daher die Transkription nicht direkt be
142. ch das nachfolgende Auftragen von 2x je 1 ul Probe auf eine unbehandelte beschrifte te positiv geladene Nylonmembranen ROCHE mit Hilfe der Mehrkanalpipette Matrix Im pact2 APOGENT DISCOVERIES Die so pr parierten Membranen wurden durch viermi 92 Material und Methoden niitiges Schwenken in 0 5 M Tris HCl pH 7 5 neutralisiert Es folgten zwei Waschschritte mit autoklaviertem Aqua bidest Nach einer Lufttrocknung wurde die Membranen in Alumi niumfolie eingeschlagen und die cDNA durch drei igmin tiges Backen bei 120 C im War meschrank MEMMERT zusatzlich fixiert 3 10 2 Herstellung DIG markierter cDNA Sonden Zur Ermittlung nicht differentiell transkribierter Klone der subtrahierten cDNA Banken wur den Hybridisierungssonden von subtrahierter und nicht subtrahierter TK cDNA der L3ni und L3i hergestellt Die Sondenmarkierung erfolgte w hrend einer PCR mit Digoxigenin 11 dUTP DIG DNA Labeling Mix ROCHE bei dem das Digoxigenin DIG ber eine Alkali labile Esterbindung an den Nukleotidteil gebunden ist 3 10 2 1 DIG Markierung der Sonden mittels PCR Bei der DIG Markierung mittels PCR ist das Verh ltnis von DIG dUTP dTTP von der Se quenzl nge der zu markierenden Sonde abh ngig So wird in der PCR bei bis zu 1 kb langen Sonden ein Verh ltnis von 1 3 bei 1 3 kb langen Sonden hingegen von 1 6 verwendet Dieses Verh ltnis wurde auch f r die Markierung der bez glich der Sequenzl nge variierenden cDNAs gew hlt Das in
143. ch die differentiell transkribierten CDNA Sequenzen enthielten 4 8 2 Sequenzierung der Inserts und Sequenzbearbeitung Die Sequenzierung der insgesamt 48 differentiell transkribierten cDNA Fragmente 22 der L3ni und 26 der L3i erfolgte zur Absicherung der korrekten Basenabfolge in beide Richtun gen Wiesen die Vorw rts und R ckw rtssequenz nicht mindestens eine bereinstimmung von 98 auf was insbesondere bei sehr langen bzw Inserts mit Poly A Sequenzen der Fall war erfolgte eine erneute Sequenzierung Innerhalb einer Larvenpopulation erfolgte auch ein Vergleich der Sequenzen untereinander Dabei stellte sich heraus dass der Klon L3ni 69 und L3ni 92 ein zu 100 identisches Insert besa en Die Klone L3i 18 und L3i 86 deren Vorw rts und R ckw rtssequenz jeweils zu 99 respektive 100 identisch waren wiesen untereinander eine 98 ige bereinstim mung auf Bei Klon L3i 18 betrug die L nge des Inserts 686 bp von Klon L3i 86 hingegen 683 bp Mit dem 548 Nukleotide umfassenden Insert von Klon L3i 99 zeigten diese eine hn lichkeit von 66 bzw 67 Dabei waren mit Ausnahme zweier Basen die jeweils letzten 348 bp der drei verschiedenen Inserts identisch Das Insert von Klon L3i 82 welches aus 910 Nukleotiden bestand zeigte mit der 995 bp langen Insertsequenz des Klons L3i 101 eine I dentit t von 71 wobei der homologe Bereich bei Base 195 des Klons L3i 101 respektive Base 1 des Klons L3i 82 begann Der Sequenzidentit tsb
144. chen der Matrize und Sonde vor wird diese von der Tag Polymerase verdr ngt bevor sich deren 3 5 Exonukleaseakti vit t entfaltet Eine spezielle Form der TagMan Sonden stellen die TaqgMan Minor Groo ve Binder MGB Sonden dar MGB z B Dihydrocyclopyrroloindol sind halbmondf rmige Molek le welche sich in die kleine Kurve doppelstr ngiger DNA falten Daher bilden Oligo nukleotid MGB Konjugate hyper stabile Duplexes mit komplement rer DNA was eine Er h hung der Schmelztemperatur bedingt Dies erlaubt die Nutzung k rzerer Sonden mit folg lich effizienterer Fluoreszenzunterdr ckung und somit erh hter Sensitivit t Zudem hybridi sieren sowohl 5 als auch 3 MGB konjugierte Oligonukleotide mit h herer Spezifit t an die DNA als nicht modifizierte Oligonukleotide insbesondere dann wenn sich die Basen Fehlpaarung im Bindungsbereich des MGB befindet AFONINA et al 1996 KUTYAVIN et al 1997 KUTYAVIN et al 2000 Tag Polymerase Synthese Exonuklease Reporter Quencher gt Om Abb 11 Prinzip der qPCR mit TaqMan bzw TaqMan MGB Sonden Material und Methoden 113 In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl TaqMan Sonden als TaqMan MGB Sonden eingesetzt Die brigen f r die Reaktionsans tze ben tigten Reagenzien stammten aus dem Brilliant Quantitative PCR Core Reagent Kit STRATAGENE Die Reaktionen erfolgten in einem Fluoreszenzdetektor mit integriertem Thermocycler dem Mx4000 Multiplex
145. chorage pro teins a secreted excreted protein precursor a putative protein of bilateral origin and another putative protein These identities were found to sequences of C elegans now and then also of parasitic nematodes other invertebrates as well as of vertebrates In the hypobiosis induced larvae there were significant similarities to phenylethanolamine N methyltransferases PNMT guanylyl cyclases calmodulins glycerol kinases DM DNA binding containing pro teins and a calcium independent phospholipase A of the organisms listed above These pro teins are functionally involved in signal registration and transduction cell division and differ entiation the regulation of transcription metabolism and locomotion or take part in parasite Summary 209 host interactions In almost all cases these proteins could be connected with arrested and not arrested development respectively To investigate the transcription levels of the SOD homo logue and the PNMT homologue in the hypobiosis induced and not induced Dictyocaulus larvae quantitative real time PCR was performed For the PNMT homologue this method showed significant differences with reference to the copy numbers in the two larval popula tions confirming differential gene transcription To investigate if there are homologues of the so called dauer formation daf genes and the age 1 gene of the free living soil nematode C elegans existing in D viviparus in all 35 primer pairs of 12
146. cht dass bei gemeinsamer Weidenutzung von lteren immunen und empf nglichen Tieren letztere infolge der Aufnahme weniger Larven eine protektive Immunit t erlangen In gef hr deten Gebieten kann ein st ndiger Umtrieb im Abstand von drei bis acht Tagen einer massi ven Infektion vorbeugen da die D viviparus Larven mindestens vier Tage ben tigen um Infekti sit t zu erlangen HIEPE 1985 EYSKER et al 1992 Jungrinder sollten auf m g lichst trockenen Fl chen gehalten und ber k nstliche Tr nken versorgt werden da zur Ent wicklung Verbreitung und berleben infektionsf higer Larven Feuchtigkeit eine wichtige Rolle spielt TAYLOR 1951 ENIGK u D WEL 1962 PFEIFFER u SUPPERER 1980 Die Besatzdichte der Weidefl chen ist insofern von Bedeutung als dass bei intensiver Bewei dung die Tiere gen tigt sind auch in unmittelbarer Umgebung von Kothaufen zu grasen E 22 Schrifttum NIGK u DUWEL 1962 BOON et al 1986 Somit erklart sich der von BELLMER 1990 festgestellte geringere Lungenwurmbefall bei Tieren die auf der Weide zugefiittert wurden Des Weiteren mindern ein sp ter Austrieb sowie fr hes Aufstallen die Gefahr einer Lungen wurminfektion BOON et al 1986 BELLMER 1990 KOHLER BELLMER 1991 2 1 6 2 Anthelminthika Verschiedene Breitbandanthelminthika k nnen zur Behandlung und Bek mpfung der Diktyo kaulose eingesetzt werden wobei an dieser Stelle auf die Arbeit von KOHLER BELLMER 1991 verwiesen werden soll
147. copy DNA cDNA Synthese Primer zyklisches Adenosinmonophosphat zyklisches Guaosinmonophosphat Chloroform Isoamylalkohol Zentimeter Cycle threshold Variationskoeffizient engl coefficient of variance dauer formation Desoxyadenosintriphosphat Desoxycytidintriphosphat didesoxy Diethylpyrocarbonat Desoxyguaosintriphosphat Desoxyribonukleins ure engl deoxyribonucleic acid Desoxynucleosidtriphosphat Desoxythymidinintriphosphat 264 dUTP dRn EDTA et al FAM GC GMP GSP GTC HCl HSM iPLA gt kb ul L3 L3i L3ni LB LD uM ME MGB MgCl MMLV ml mM mRNA NaCl NH OAc NaOH Anhang Desoxyuridintriphosphat normalisierte Baseline korrigierte Fluoreszenz Ethylendiamintetraessigs ure lat et alii Carboxy Fluoreszin Guanin Gravitationskonstante Guanylyl Cyclase Guanosinmonophosphat genspezifischer Primer Guanidinium Thiocyanat Salzs ure humane Skelettmuskulatur Kalzium unabh ngige Phospholipase A Kilobasen Liter Mikroliter dritte Larven inhibierte dritte Larven nicht inhibierte dritte Larven Luria Bertani lange Distanz engl long distance molar Mol Liter mikromolar Mercaptoethanol minor groove binder Magnesiumchlorid murine moloney leukemia virus Milliliter millimolar Boten RNA engl messenger RNA Natriumchlorid Ammoniumacetat Natriumhydroxid Anhang ng nm NO OD P C I PCR pg pH PNMT RACE RNA RNase ROX rpm rRNA RT SOD
148. dUTP markierten Sonden der subtrahierten L3ni und L3i cDNA sowie der jeweiligen Tester Kontrolle stellten sich im 2 igen Agarosegel wie erwar tet als ein Schmier im Bereich von 200 bp bis 2000 bp dar Nach dem Multi Enzymverdau der cDNA Sonden mit den Restriktionsenzymen Rsal Eael und Smal wurden die Proben erneut gelelektrophoretisch analysiert Dabei wiesen die mit Plasmid DNA versetzten Kontrollen zur berpr fung der Enzymaktivit t jeweils die erwarte ten 4 Banden der vorher berechneten L ngen auf Bei zus tzlich aufgetragener ungeschnitte ner Plasmid DNA hingegen war auf gleicher H he keine Bande erkennbar es fand somit ein vollst ndiger Enzymverdau statt Im Vergleich zu den unverdauten Proben stellte sich der im 2 igem Agarosegel sichtbare Schmier der verdauten cDNA Sonden in einem geringeren Gr enbereich dar Eine genaue Absch tzung der jeweiligen Gr enbereiche war jedoch auf Grund der geringen aufgetragenen cCDNA Menge schwer m glich Die Konzentrationsbestimmung der Sonden welche im Anschluss an die s ulenchroma tographische Aufreinigung durchgef hrt wurde ergab folgende Werte cDNA Sonde Konzentration Reinheit subtrahierte L3ni cDNA 36 95 ng ul 1 661 subtrahierte L3i cDNA 37 00 ng ul 1 568 L3ni Tester Kontrolle 35 55 ng ul 1 634 L3i Tester Kontrolle 30 30 ng ul 1 674 4 5 2 berpr fung der DIG cDNA Sonden Durch Verd nnungsreihen der synthetisierten Sonden wurde die DIG markierte cDNA
149. dentischen Adaptern an den 5 Enden sollte das im Agarosegel sichtbare Bandenmuster der subtrahierten Kontroll DNA bei der subtrahierten HSM cDNA ebenfalls erkennbar sein Tats chlich konn ten in dem entstandenen Schmier die meisten dieser Banden wenn auch in schw cherer Auspr gung als bei der subtrahierten Kontroll DNA lokalisiert werden Das PCR Produkt der experimentellen subtrahierten cDNAs die in dieser Arbeit von der L3ni und L3i cDNA re pr sentiert wurden erscheint in der gelelektrophoretischen Analyse gew hnlich als Schmier im Gr enbereich von 200 bp bis 2000 bp in welchem auch distinkte Banden auftreten k n nen In dem sich ber den erwarteten Gr enbereich erstreckenden Schmier konnten schwache Banden sowohl in der subtrahierten cDNA der L3ni als auch der L3i festgestellt werden Auff llig war bei allen drei Populationen dass die PCR Produkte der subtrahierten cDNA und der zugeh rigen nicht subtrahierten Tester Kontrolle eine unterschiedliche Gr Benverteilung aufwiesen da der Schmier der Tester Kontrollen jeweils ber 2000 bp hinaus sichtbar war Des Weiteren unterschied sich insbesondere bei den beiden Larvenpopulationen die subtrahierte CDNA Probe von der zugeh rigen Tester Kontrolle im Bereich zwischen ca 600 bp und 1200 bp Hier zeigte die subtrahierte cDNA eine allgemein st rkere Intensit t der Amplifikationsprodukte Zudem war wie oben beschrieben auch das Auftreten schwacher Banden e
150. dere in den Keimbah nen exprimiert http www ncbi nlm nih gov entrez viewer fcgi val NM_059468 1 Die bei diesem Organismus insgesamt 1416 in den Keimbahnen aufregulierten Gene regulieren bei spielsweise die Embryogenese Meiose die Entwicklung der Vulva oder die Eiproduktion REINKE et al 2000 WALHOUT et al 2002 PIANO et al 2002 PIANO et al 2002 nehmen an dass diese Gene auch f r grundlegende zellul re und Wachstumsprozesse w h rend der Larvenentwicklung ben tigt werden Somit treibt das homologe D viviparus Gentranskript vermutlich in den nicht entwicklungsgehemmten Larven die geschlechtliche m glicherweise auch die allgemeine Entwicklung voran Die Funktion des exkretierten sezernierten sowie des putativen Proteins von C elegans ist bislang noch nicht bekannt Daher kann kein Zusammenhang zwischen der differentiellen Gentranskription und der nicht inhibierten Entwicklung der D viviparus Larven hergestellt werden 5 6 2 L3i assoziierte Gene Bei den Hypobiose induzierten Larven konnten aufregulierte Transkripte mit signifikanten Homologien zu Phenylethanolamin N Methyltransferasen L3i 82 101 Guanylyl Cyclasen L3i 88 Calmodulinen L3i 100 Glycerin Kinasen L3i 53 DM DNA Bindungsdom nen Diskussion 193 enthaltenden Proteinen L3i 99 und einer Kalzium unabh ngigen Phospholipase A L3i 75 ermittelt werden Wie auch in Vertebraten katalysieren in Nematoden Phenylethanolamin N Methyltransfera sen PN
151. des 10fach verd nnten Nested PCR Produkte NP der subtrahierten cDNAs sowie der nicht subtrahierten Tester Kontrollen TK der L3ni und L331 welche in der PCR zur Uberpriifung einer effektiven subtraktiven Hybridisierung als Templa te dienen sollten ergab folgende Werte Konzentration Reinheit Durchf hrung 1 ng ul L3ni subtrahiertes NP Ansatz 1 44 1 708 subtrahiertes NP Ansatz 2 48 1 759 Tester Kontrolle NP 38 1 714 L3i subtrahiertes NP Ansatz 1 33 1 239 subtrahiertes NP Ansatz 2 47 1 659 Tester Kontrolle NP 40 1 745 Durchf hrung 2 L3ni subtrahiertes NP Ansatz 1 29 7 1 737 subtrahiertes NP Ansatz 2 42 2 1 737 Tester Kontrolle NP 32 4 1 705 L3i subtrahiertes NP Ansatz 1 47 1 1 698 subtrahiertes NP Ansatz 2 47 5 1 715 Tester Kontrolle NP 34 9 1 396 Nach einer effektiven subtraktiven Hybridisierung sollte die subtrahierte cDNA im Vergleich zu der entsprechenden nicht subtrahierten TK erst nach 5 bis 15 weiteren PCR Zyklen Ban den im Agarosegel erscheinen lassen wenn eine nicht differentiell transkribierte Sequenz amplifiziert wird Unter Verwendung der Primerkombination daf 1 I for und daf 1 rev konnte mit der L3i TK der Durchf hrung 1 nach 33 PCR Zyklen ein Amplifikationsprodukt im Agarosegel festgestellt werden dahingegen war bei der subtrahierten L3i cDNA auch nach 38 Zyklen keine Bande erkennbar so dass die Differenz zwischen beiden Proben mindestens zehn Zyklen bet
152. differentiell transkribierte Sequenzen effizient anreichern Die SSH tr gt somit dem Umstand Rechnung dass ca 90 der mRNA Spezies in nur 15 bis 20 Kopien pro Zelle vorliegen und damit durchschnittlich lediglich 0 004 der gesamten mRNA Population einer Zelle repr sentieren BERTIOLI et al 1995 DIATCHENKO et al 1996 stellten bei cDNA Proben denen 0 1 sowie 0 01 und 0 001 virale DNA Fragmente zugesetzt wurden eine 100 1000 und 5000fache Anreicherung dieser Fragmente fest Wie auch bei der RDA werden die zu vergleichenden cDNA Populationen zun chst mit ei nem Restriktionsenzym gespalten woran sich eine Adapterligation anschlie t Diese erfolgt allerdings nur bei der Tester Population welche zu diesem Zweck in zwei Portionen unterteilt und mit zwei unterschiedlichen Adaptern ligiert wird so dass zwei Tester Subpopulationen resultieren Es folgen zwei Hybridisierungsschritte Bei der ersten Hybridisierung werden die zwei Tester Subpopulationen in getrennten Ans tzen mit einem berschuss an Driver versetzt und denaturiert gefolgt von der Reassoziation der Molek le Die einzelstr ngigen cDNAs Molek l a in Abb 3 der Tester Subpopulationen repr sentieren die normalisierte Target Fraktion Dieser Konzentrationsausgleich zwischen h ufigen und seltenen Targets erfolgt beruhend auf der Hybridisierungskinetik durch das schnellere Reannealing von h ufigen Transkripten welche Homohybride b bilden cDNAs welche Tester und Driv
153. e 77 Aminos uren lange Sequenz Diese war ber ein 25 Aminos uren langes Teilst ck zu 92 identisch 96 mit dem fizzy related Protein von C elegans NP_496075 1 Mit ENSANGP00000017686 von A gambiae XP_320924 1 bestand eine Teilidentit t von 57 65 ber 40 Aminos uren hinweg Der Klon daf 16 besa eine in 100 Aminos uren translatierbare Insertsequenz 61 dieser A minos uren waren zu 54 identisch 67 mit einem RNase H integrase like protein fami ly member von C elegans NP_490700 1 Mit einem hypothetischen Protein desselben Or ganismus T31583 bestand eine 41 ige Identit t 52 ber 89 Aminos uren hinweg Letztlich zeigte keine der 83 Sequenzen der daf und age 1 spezifischen PCR Homologien mit den daf Genen bzw dem age 1 Gen von C elegans Ergebnisse 177 4 12 3 berpr fung der Sequenzen 16Au und 120 Mit dieser PCR sollte berpr ft werden ob es sich bei den ermittelten Sequenzen daf 16A u und daf 12 o um Lungenwurm oder Wirts DNA handelt Genomische DNA dritter D vivi parus Larven diente als Template als Primer wurden neben den urspr nglich verwendeten Primerkombinationen daf 12 und daf 16A zus tzlich je ein Insertsequenz spezifisches Pri merpaar daf I2RNA und daf l6prp eingesetzt Nach der gelelektrophoretischen Auftren nung der Amplifikationsprodukte konnten beim Einsatz der Insert spezifischen Primerkombi nationen daf I2RNA und daf l16prp keine Banden der erwarteten Fragmen
154. e Kontroll DNAs C1 und C2R unter Verwendung der Nested Primer s Abb 7 amplifiziert Bei diesen Kontroll DNAs handelt es sich um Plasmide deren Inserts von zwei humanen Genfragmenten repr sentiert werden welche die Sequenzen des Nested Primers 1 C1 und Nested Primers 2R C2R beinhalten und somit als Negativkontrollen in der sp teren Hybridisierung dienen Zun chst erfolgte die Vorbereitung der Matrizen f r diese Nested PCR Dazu wurden je 5 ul der C1 bzw C2R DNA mit 3 ul Ampuwa versetzt und f r 5 Minuten bei 96 C denaturiert Bis zur weiteren Verwendung wurden die Proben auf Eis gehalten Die im Zuge der Suppres sion PCR entstandenen Amplifikationsprodukte der subtrahierten L3ni und L3i cDNA wur den dreifach mit Ampuwa verd nnt bevor sie als Template eingesetzt wurden Das Tempe raturprofil dieser PCR ist im Folgenden aufgef hrt Denaturierung 94 C 10 Sekunden 11x Primerannealing 60 C 30 Sekunden Primerextension 72 C 1 5 Minuten finale Elongation 72 C 5 Minuten 90 Material und Methoden Nach Ablauf der Reaktion erfolgte eine Amplifikationskontrolle mittels Gelelektrophorese Anschlie end wurden die Nested PCR Produkte der L3ni und L3i zur sp teren Erstellung der subtrahierten cDNA Banken wie unter 3 7 8 beschrieben kloniert Die Hybridisierungs Negativkontrollen C1 und C2R lagerten bis zur weiteren Verwendung bei 20 C 3 9 2 Insertkontrolle mittels PCR Von den LB Agarplatten
155. e L3i 18 und L3i 86 der Klon L3i 82 f r den teilidentischen Klon L3i 101 und der Klon L3ni 69 f r den identischen Klon L3ni 92 154 Ergebnisse 3 RACE 5 RACE Klon klonierte Sauce enn Den klonierte Banden q 8 Banden L3ni 16 1 4 1 2 L3ni 22 L3ni 51 L3ni 56 L3ni 67 L3ni 69 L3i 10 L3i 33 L3i 53 L3i 75 L3i 82 L3i 88 L3i 99 L3i 100 Sequenzierungen hn N NRF WW WR NY KF NK N YVnwWwn WwW BN NNN W W NN Nn BWR PBN RK WRK kK N YN ANN NNA WN PN WwW R Tab 3 Anzahl klonierter Banden und Sequenzierungen der differentiell transkri bierten Genfragmente 4 94 Erstellung vollst ndiger Sequenzen der differentiell transkribierten Fragmente Die cDNA Fragmente der subtrahierten cDNA Banken wurden mittels der im Alignment festgestellten berlappungsbereiche in 3 bzw 5 Richtung um die entsprechenden RACE bzw SL1 Sequenzen verl ngert Die mit dem GSP der L3ni 22 erhaltenen Sequenzen der 3 RACE bestanden stets aus 447 untereinander identischen Nukleotiden von welchen die ersten 193 bp mit dem Insert des Klons L3ni 22 bereinstimmten nachfolgend war jedoch keine Identit t mehr zu beobachten Wurde neben der 5 RACE Sequenz auch die der 3 RACE an das cDNA Fragment des Klons angeh ngt zeigte sich beim Sequenzidentit tsvergleich mittels BLASTP s 4 9 5 2 eine h here Signifikanz ber einen zudem l ngeren Teilbereich Des Weiteren glich sich die Anzahl der translatierten Aminos ur
156. e Transkription und LD PCR 3 8 1 1 Erststrang cDNA Synthese 3 8 1 2 Zweitstrang cDNA Synthese 3 8 2 Volumenkonzentration mit n Butanol 3 8 3 Aufreinigung mittels S ulenchromatographie 3 8 4 Gelanalyse der aufgereinigten Proben 3 8 5 Restriktionsenzymverdau 3 8 6 Probenaufreinigung nach Restriktionsenzymverdau 3 8 6 1 Phenol Chloroform Extraktion 3 8 6 2 Saulenchromatographie 3 8 7 cDNA Prazipitation 3 8 8 Konzentrationsbestimmung der cDNA L sung 3 8 9 Adapterligation 3 8 9 1 Vorbereitung der Tester cDNA 3 8 9 2 Ligation der Adapter 3 8 9 3 Analyse der Ligationseffizienz 3 8 10 Erste subtraktive Hybridisierung 3 8 11 Zweite subtraktive Hybridisierung 3 8 12 Suppression PCR 3 8 13 Nested PCR 3 8 14 PCR Analyse der Subtraktionseffizienz 3 9 Erstellung subtrahierter cDNA Banken 3 9 1 Nested PCR mit subtrahierter cDNA 3 9 2 Insertkontrolle mittels PCR 3 9 3 subtrahierte cDNA Banken 3 10 Differential Screening 3 10 1 cDNA dot blotting 3 10 2 Herstellung DIG markierter cCDNA Sonden 3 10 2 1 DIG Markierung der Sonden mittels PCR 3 10 2 2 Aufreinigung der DIG markierten Sonden 3 10 2 3 Multi Enzymverdau 3 10 2 4 berpr fung der DIG markierten cDNA Sonden 3 10 3 Hybridisierung und Detektion 3 10 3 1 Hybridisierung 3 10 3 2 Detektion 3 11 Verifizierung differentiell transkribierter Sequenzen mittels cDNA dot blot 3 11 1 Southern dot blotting 3 11 2 Herstellung DIG markierter cCDNA Sonden 3 11 2 1 Reverse Transkription 3 1
157. e als Primer verwendeten cDNA Synthesis CDS Primer handelt es sich um einen Oligo dT Primer der am 5 Ende eine Ankersequenz be sitzt die der des SMART II Oligonukleotid entspricht Die in der cDNA Synthese verwen deten Oligonukleotide sind in der folgenden Abbildung dargestellt CDS Primer 5 AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACT a9N N 3 Rsal N A C G oder T N A C oder G PCR Primer 5 AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT 3 SMART II Oligonukleotid 5 AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG 3 Rsal Abb 5 In der cDNA Synthese verwendete Oligonukleotide BD CLONTECH 68 Material und Methoden 3 7 3 2 Zweitstrang cDNA Synthese mittels Long Distance LD PCR Um ausreichende Mengen an cDNA f r die sp tere subtraktive Hybridisierung zu erhalten erfolgte im n chsten Schritt neben der Zweitstrang cDNA Synthese auch eine cDNA Amplifikation durch eine Long Distance LD PCR welche mit den Reagenzien des Advan tage 2 PCR Kit BD CLONTECH durchgef hrt wurde Der hierin enthaltene Advantage 2 Polymerase Mix welcher soweit nicht anders vermerkt bei allen im Zuge dieser Arbeit durchgef hrten Amplifikationen eingesetzt wurde enth lt neben einer nukleasedefizienten Taq DNA Polymerase Mutante der so genannten TITANIUM Taq DNA Polymerase und dem TagStart Antik rper f r eine automatische hot start PCR noch eine proofreading Po lymerase Diese Kombination erm glicht die Amplifikation langer cDNA Sequenzen mit ho
158. e als differentiell transkribiert best tigt werden konn ten wurden nach der Sequenzierung einem Identit tsvergleich mit bereits publizierten Se Diskussion 179 quenzen anderer Organismen unterzogen Die Komplettierung der differentiell transkribierten cDNA Fragmente erfolgte mit Hilfe der Rapid Amplification of cDNA Ends RACE sowie einer spliced leader 1 SL1 spezifischen PCR Die so vervollst ndigten Sequenzen gingen wiederum in einen Sequenzidentit tsvergleich ein Mittels der quantitativen real time PCR qPCR sollte eine Bestimmung der Transkriptionsra te zweier ausgew hlter cDNA Sequenzen in Hypobiose induzierten und nicht induzierten dritten D viviparus Larven erreicht werden Abschlie end wurde auf der Ebene von genomischer DNA berpr ft ob bei D viviparus Homologe solcher Gene vorhanden sind die bei dem frei lebenden Erdnematoden C elegans in die Regulation der Entwicklungshemmung involviert sind F r diese Untersuchung wurden spezifische Primerpaare verschiedener daf Gene und des age 1 Gens eingesetzt 5 1 berpr fung der Hypobiosef higkeit des Laborstammes Die Induktion der Hypobiose durch mehrw chige K hlung infekti ser Larven bei 4 C konnte f r verschiedene Spezies der Trichostrongyliden BLITZ u GIBBS 1972a ARMOUR u BRUCE 1974 ARMOUR 1978 EYSKER 1981a sowie f r D viviparus PFEIFFER 1976 INDERBITZIN 1976 nachgewiesen werden PFEIFFER 1976 und INDERBITZIN 1976 konnten nach experimen
159. e inhibierte und nicht inhibierte Entwicklung dritter parasitischer Nematodenlarven vorantreiben k nnte bleibt somit abzuwarten 5 10 Zusammenfassende Beurteilung und Ausblick Es konnte belegt werden dass bei dem verwendeten Stamm des bovinen Lungenwurms die Entwicklungsinhibition experimentell durch K hlung infekti ser dritten Larven induzierbar ist Daher konnten Untersuchungen zur differentiellen Gentranskription in Hypobiose indu zierten und nicht induzierten Stadien mit der Technik der Suppression Subtractive Hybridiza tion gefolgt von der Erstellung subtrahierter cDNA Banken vorgenommen werden Mittels Differential Screening und Southern dot blotting wurden insgesamt 48 Insert Sequenzen der cDNA Banken als differentiell transkribiert verifiziert Der Erstellung vollst ndiger cDNA Sequenzen und auch Transkriptvarianten gelang mit Hilfe der Rapid Amplification of cDNA Ends und spliced leader 1 SL1 spezifischen PCR bei 16 von 19 nach einem Sequenzidenti Diskussion 205 t tsvergleich ausgew hlten Gensequenzen Bei diesem wie auch dem zweiten Sequenzidenti t tsvergleich konnten signifikante Ubereinstimmungen mit Genen bzw Proteinen festgestellt werden welche der Signalregistrierung und transduktion sowie der Genregulation Zelltei lung oder Zelldifferenzierung dienen Auch ergaben sich bereinstimmungen mit Proteinen die metabolische sowie lokomotorische Funktionen erf llen oder in Parasit Wirt Interaktionen involviert si
160. ect of aging on the antigenicity of Haemonchus contortus larvae Res Vet Sci 19 113 114 TISSENBAUM H A J HAWDON M PERREGAUX P HOTEZ L GUARENTE u G RUVKUN 2000 A common muscarinic pathway for diapause recovery in the distantly related nematode species Caenorhabditis elegans and Ancylostoma caninum Proc Natl Acad Sci USA 97 460 465 242 Literaturverzeichnis UNGEMACH F R 1994 Anthelminthika Ivermectin in W LOSCHER F R UNGEMACH u R KROKER Hrsg Grundlagen der Pharmakotherapie bei Haus und Nutztieren Verlag Parey Berlin Hamburg S 258 260 URQUHART G M 1985 Field experience with the bovine lungworm vaccine Joint IABS WHO Symposium on Diagnostics and Vaccines for Parasitic Diseases Stockholm Schweden Develop Biol Stand 62 109 112 URQUHART G M W F H JARRETT u W I M McINTYRE 1973 Pathology clinical signs epidemiology treatment and control Helminth diseases of cattle sheep and horses in Europe Glasgow S 23 29 VANCE D E 2000 Lipide und Membranen in BRANDT U u H SCHAGGER Hrsg Biochemie 4 Aufl McGraw Hill International Ltd Maidenhead UK S 459 VELCULESCU V E L ZHANG B VOGELSTEIN u K W KINZLER 1995 Serial analysis of gene expression Science 270 484 487 VERCRUYSSE J 1985 The seasonal prevalence of inhibited development of Haemonchus contortus in sheep in Senegal Vet Parasitol 17 159 163 VOWELS J J u J H THOMAS
161. egt beim ersten AUG Triplett ein suboptimaler Kontext vor resultiert daraus das so ge nannte leaky scanning bei welchem die Translation meist erst am zweiten AUG Codon ge startet wird KOZAK 1986b KOZAK 1987b KOZAK 1987c ber die Konsensus Sequenz parasitischer Nematoden liegen bislang keine Kenntnisse vor Wird daher von der Vertebra ten Konsensus Sequenz auf parasitische Nematoden extrapoliert ergibt sich f r das erste Diskussion 189 AUG Triplett der Sequenzen L3ni 22 und L3i 53 ein suboptimaler Kontext Auf die M glich keit dass am ersten AUG Codon der Translationsstart durch ein A oder G an den Positionen 3 bzw 4 auch bei D viviparus erzwungen werden k nnte deutet die Analyse der ab die sem Triplett translatierten full length cDNA Sequenzen hin So besitzen die L3ni 51 L3ni 69 92 und L3i 82 101 Sequenzen an Position 3 ein A die L3i 82 101 tr gt zudem noch ein G an Position 4 Bei den L3ni 56 Sequenzen befindet sich an diesen Positionen jeweils ein G Dieses G existiert bei den Sequenzen L3ni 16 und L3i 10b hingegen nur an Position 3 an welcher es die Translationseffizienz weniger stark beeinflusst als ein A KO ZAK 2002 Bei den Sequenzen L3i 100a und 100c ist allein an Position 4 ein G befindlich Fir eine eventuelle Bedeutung dieser Nukleotide beziiglich der Translationseffizienz spricht weiterhin dass das ausgew hlte Startcodon der L3i 53 welches vom zweiten AUG Codon der Nukleins uresequenz rep
162. ei den nicht induzierten Larven Dahingegen ergibt sich bezogen auf EF la f r die L3ni 69 92 Sequenz in den Hy pobiose induzierten Larven eine leicht erh hte Transkriptionsrate im Vergleich zu den nicht induzierten Larven was den bisherigen Ergebnissen dieser Arbeit widerspricht Mit Hilfe des Computerprogramms SigmaStat Version 2 0 JANDEL SCIENTIFIC San Rafael USA wurde die Relation der Zielsequenz Kopien zu den jeweiligen EF 1a Kopien statistisch aus gewertet Dabei erfolgte die berpr fung auf signifikante Korrelationen f r die normalverteil ten Daten der L3ni 69 92 mittels des t Tests wohingegen die nicht normalverteilten Daten der L3i 82 101 mit dem Mann Whitney Rank Sum Test berechnet wurden Anhand der gemittel ten Daten aus den Tab 8 und 9 s Tab 10 ergibt sich f r die Sequenz L3i 82 101 eine statis tisch signifikante 21 33fach h here Kopienzahl in den L3i p lt 0 001 Die Unterschiede in den L3ni 69 92 Kopienzahlen 1 96fach in den L3i erh ht sind mit einem p Wert von 0 063 hingegen nicht signifikant L3i82 101 L3ni 69 92 Kopien Kopien cDNA EF la Kopie SD EF 1a Kopie SD L3i 0 87 0 48 p lt 0 001 0 31 0 27 p 0 063 L3ni 0 04 0 02 0 16 0 10 Tab 10 Statistische Analyse der Transkriptionsraten in Bezug auf EF la SD Standardabweichung Eine relative Quantifizierung konnte f r keine der beiden Sequenzen erfolgen da eine ann hernd gleiche PCR Effizienz der jeweiligen Ziel sowie EF
163. einflussen kann hnliches vermuten die Autoren f r daf 8 Die Aktivierung von Genen f r die reproduktive Entwicklung und assoziierten me tabolischen Genen erreichen daf 14 und daf 8 ber eine Komplexbildung mit dem Co Smad daf 3 welches bei alleiniger Aktivit t die Bildung der dauer larva mit entsprechenden Meta bolismus bewirkt PATTERSON et al 1997 THATCHER et al 1999 PATTERSON u PADGETT 2000 INOUE u THOMAS 2000a Das bisher nicht klonierte Gen daf 5 steht auf derselben Stufe des Signalwegs zur Entwicklungshemmung wie daf 3 Daher nehmen ver schiedene Autoren an dass auch daf 5 negativ ber die TGF Signalkaskade reguliert wird THATCHER et al 1999 PATTERSON u PADGETT 2000 Neben der Regulation von daf 18 durch daf 7 Kapitel 2 3 3 2 k nnten auch die Smad Prote ine die Verbindungsglieder zwischen dem TGF und insulinartigen Signalweg darstellen OGG et al 1997 sowie PATTERSON et al 1997 vermuten dass der Forkhead Transkrip tionsfaktor daf 16 mit daf 3 daf 8 oder daf 14 interagiert So k nnte daf 16 unter Hypobiose induzierenden Bedingungen mit daf 3 einen Komplex bilden und so die notwendigen Gene regulieren OGG et al 1997 wohingegen im Zuge der reproduktiven Entwicklung akt 1 und 40 Schrifttum akt 2 diese Komplexbildung durch Phosphorylierung des daf 16 Genprodukts inhibieren w r den PARADIS u RUVKUN 1998 2 3 4 Zielpunkt der Signalkaskaden Die TGF B Signalkaskade sowie der insulinartige und c
164. elle Transkription verschiedener cDNA Sequenzen 2 Yiges Agarosegel M GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus 1 L3ni cDNA 2 L3i cDNA Insgesamt ergab sich mittels dieser PCRs dass bei den cDNA Sequenzen L3ni 51 L3ni 69 92 L3i 33 L3i 75 L3i 82 101 L3i 88 sowie L3i 99 differentiell transkribierte Gene vorliegen Bez glich der L3ni 16 L3i 10 bzw L3i 100 erscheint eine differentielle Transkrip tion nicht hinreichend eindeutig Die L3i 53 konnte auf Grund zu geringer Vergleichsm g lichkeiten nicht ausgewertet werden Im Gegensatz dazu sprechen die Ergebnisse dieser U berpr fung der L3ni 22 L3ni 56 und L3ni 67 gegen eine differentielle Gentranskription Die Bandenmuster einiger genspezifischer Primerkombinationen welche zwei respektive drei 166 Ergebnisse Banden im Agarosegel entstehen lie en wiesen gewisse Besonderheiten auf So entstand die oberste der drei Banden der L3ni 56 welche der Isoform L3ni 56d entspricht immer bei dem L3i cDNA Template mit der L3ni cDNA war sie nur bei einer der f nf Amplifikationsreak tionen nachweisbar Regelm ig zeigte sich bei der L3i 75 die untere der zwei Banden Iso form L3i 75a bei der L3i cDNA deutlich st rker wohingegen die obere Bande nicht immer Intensit tsunterschiede zwischen den beiden Larvenpopulationen aufwies Die mittlere der drei L3i 88 Banden auf welcher die Isoform L3i 88a beruht war bei allen PCR Produkten der L3i Templates die prominenteste Bande Diese erschien auch al
165. els LD PCR Die Sondenmarkierung erfolgte mit Digoxigenin 11 dUTP DIG DNA Labeling Mix RO CHE s 3 10 2 im Zuge der LD PCR Auf Grund der variierenden Sequenzlangen der cDNA Molek le wurde ein DIG dUTP dTTP Verh ltnis von 1 6 gew hlt s 3 10 2 1 F r beide Larvenpopulationen erfolgten je drei 25 ul Reaktionsans tze welche die folgende Komponenten enthielten 2 5 ul 1 ul 7 5 ul 1 ul 1 ul 10x Advantage 2 PCR Puffer PCR Primer 10 uM dNTP Mix 1mM dATP 1 mM dCTP 1 mM dGTP 0 825 mM dTTP 0 175 mM DIG dUTP Advantage 2 Polymerase Mix verdiinnte Erststrang cDNA Die PCR liefen bei dem unter 3 11 2 2 aufgef hrten Temperaturprofil ber 24 Zyklen ab ab schlie end wurden die je drei Amplifikationsprodukte der L3ni und L3i zusammengef hrt und gelelektrophoretisch analysiert Material und Methoden 101 3 11 2 4 Restriktionsenzymspaltung Im Anschluss an die Herstellung der Sonden wurden diese einem Verdau mit dem Restrikti onsenzym Rsal unterzogen um die angeh ngten Oligonukleotide bzw inkorporierte Primer s Abb 5 und deren komplement re Sequenzen zu entfernen Dieser Verdau wurde ange setzt da auch die Erst und Zweitstrang cDNA Synthese der in den subtrahierten cDNA Banken enthaltenen Inserts mit dem SMART PCR cDNA Synthesis Kit BD CLONTECH erfolgte Diese cDNAs unterlagen bereits bei der Durchf hrung der SSH eine Restriktionsen zymspaltung mit Rsal s 3 8 5 Dennoch konnte nicht g nzlic
166. en Erdnematoden C elegans lassen erkennen dass dieses Ph nomen auf einer genetischen Grundlage basiert und durch Einwir kung u erer Faktoren induziert respektive moduliert wird Zur Steuerung der Lebensprozesse werden zu jedem bestimmten Zeitpunkt nur 10 bis 15 der insgesamt vorhandenen Gene eines Organismus exprimiert wobei f r jedes Entwick lungsstadium sowie nderungen des Zellstoffwechsels ein zustandsspezifisches charakteris tisches Genexpressionsmuster besteht Durch vergleichende Untersuchungen von mRNA Populationen Hypobiose induzierter und nicht induzierter dritter D viviparus Larven k nnten somit Erkenntnisse ber die genetische Regulation der Entwicklungshemmung gewonnen werden Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zun chst die Hypobiosef higkeit des etablierten D viviparus Laborstammes berpr ft Es folgte anschlie end die vergleichende Untersu chung der Gentranskription Hypobiose induzierter L3i und nicht induzierter L3ni dritter Lungenwurmlarven Zu diesem Zweck wurde isolierte mRNA beider Larvenpopulationen in cDNA umgeschrieben und die darin befindlichen differentiell transkribierten Sequenzen mit tels der Suppression Subtractive Hybridization SSH angereichert Es schloss sich die Erstel lung subtrahierter L3ni und L3i cDNA Banken an Zur Verifizierung der in diesen Banken enthaltenen Klone wurde neben dem Differential Screening auch ein Southern dot blotting durchgef hrt Die cDNA Inserts welch
167. en Primern mittels S ulenchromatographie wie unter 3 8 6 2 beschrieben 3 10 2 4 berpr fung der DIG markierten cDNA Sonden Die Effizienz der DIG Markierung durch die PCR beeinflusst die Sensitivit t der Sonden und damit deren Konzentration in der Hybridisierungsl sung Des Weiteren war die berpr fung der vier verschiedenen Sonden im Hinblick auf vergleichbare Ergebnisse des sp teren Diffe rential Screenings unerl sslich Mittels spektralphotometrischer Messung AMERSHAM BIOSCIENCES wurde die cDNA Konzentration der Sonden bestimmt F r jede Sonde sowie f r eine DIG markierte Kontroll DNA DIG High Prime Labeling and Detection Starter Kit II ROCHE wurde eine Verd n nungsreihe mit DNA Verd nnungspuffer DIG High Prime Labeling and Detection Starter Kit II ROCHE erstellt Die Konzentrationen betrugen dabei pro Mikroliter 10 pg 3 pg 1 pg 0 1 pg 0 03 pg und 0 01 pg Von jeder Verd nnungsreihe sowie dem Verd nnungspuffer als Negativkontrolle wurden 2x je 1 ul auf eine unbehandelte positiv geladene Nylonmembran aufgetragen und die DNA wie unter 3 10 1 beschrieben fixiert Der Gehalt an DIG markierter cDNA in den Sondenl sungen sowie deren Nachweisgrenzen wurden durch chemilumines zente Detektion s 3 10 3 2 nach dem Protokoll des DIG Application Manual for Filter Hybridization ROCHE 2000 bestimmt Zur Durchf hrung der erforderlichen Schritte wur Material und Methoden 95 den die Membranen in Hybridisierungstaschen
168. en der des homologen Proteins von C elegans an da die zusammengesetzte Sequenz nun ein Stopcodon enthielt Daher wird im Folgenden nur die in 5 und 3 Richtung verl ngerte Sequenz beschrieben das Aminos ure Alignment mit der L3ni 22 Sequenz ohne Poly A Ende ist unter 9 4 1 abgebildet Ergebnisse 155 Die Sequenzierung der 3 RACE Produkte des Klons L3ni 56 erbrachte zwei verschieden lange Sequenzen wobei diese L ngendifferenz durch ein Gap in den sonst bereinstimmen den Sequenzen repr sentiert wurde Im Zuge der 5 RACE des Klons L3i 10 ergaben sich eine 1009 bp sowie eine 987 bp lange Sequenz Diese zeigten sich ab der Base 171 bzw 151 identisch gingen aber mit einer L n genver nderung der translatierten Aminos uresequenz einher Die Sequenzierung der 3 RACE Produkte der L3i 82 respektive L3i 101 sowie L3i 88 ergab jeweils zwei in der L nge differierende Sequenzen wobei dieser Umstand eine Sequenzl cke in den sonst identischen Basenabfolgen bedingte Zwei solcher L cken waren des Weiteren beim Vergleich eines 5 RACE Produkts der L3i 88 mit den brigen durch diese RACE er haltenen Sequenzen zu beobachten Als Konsequenz daraus ergab sich eine Aminos urese quenz deren Stopcodon vor dem Identit tsbereich mit der L3i 88 Sequenz des Klons der sub trahierten cDNA Bank befindlich war Diese Sequenz wurde als L3i 88 2 bezeichnet und konnte infolge von berlappungsbereichen mit der 3 RACE Sequenz um das Pol
169. en erfolgte wie oben beschrieben Zu dem wurde ein drittes Mal Erststrang cDNA f r die 5 RACE nach Herstellerprotokoll syn thetisiert wobei 1408 ng L3ni mRNA und 1216 ng L3i mRNA Isolierung 5 s 4 2 in die Reaktion eingingen Je differentiell transkribiertem Genfragment wurden ein bis f nf Banden der 3 respektive 5 RACE kloniert jeweils drei Kolonien angez chtet und einer Plasmidpr paration unterzogen Es folgte die Sequenzierung eines oder mehrerer Klone pro Bande in beide Richtungen s 3 7 8 bis 3 7 10 In den bermittelten Sequenzen wurden die GSP und UPM Sequenzen auf gesucht und letztere von der Sequenz entfernt Anschlie end wurden die RACE Sequenzen mittels Alignment auf berlappungsbereiche mit der bereits bekannten cDNA Sequenzregion berpr ft Anhand dieser berlappenden Sequenzabschnitte konnte das cDNA Fragment in 3 bzw 5 Richtung verl ngert werden Der Identit tsvergleich mit publizierten Sequenzen sowie konservierten Dom nen erfolgte mittels BLASTN BLASTP und RPSBLAST NCBI wobei auf Aminos ureebene neben der Gesamtsequenz auch die Sequenz ab dem ersten Methionin dem potentiellen Startcodon in den BLAST einging Material und Methoden 109 3 13 4 Spliced leader 1 SL1 PCR Neben der RACE stellt die spliced leader 1 SL1 PCR eine weitere M glichkeit dar ein cDNA Fragment in 5 Richtung zu vervollst ndigen Die 22 bp lange SL1 Sequenz wird durch trans Splei en dem 5 Ende der
170. en wie daf 16A u So bestand auf einer L nge von 158 bp respektive 38 bp mit dem Klon RP42 550C12 von B taurus AC087860 2 eine Teilidentit t von 84 bzw 89 Die weiteren Identit ten glichen ebenfalls im Wesentlichen denen des Klons 16A u Das Insert daf 12 0 welches eine L nge von 228 bp aufwies war ber einen Bereich von 80 Nukleotiden zu 98 mit der Transfer RNA Met 3 sowie zwei Cosmiden von C elegans M25474 1 U46668 1 sowie U41549 1 identisch Eine 100 ige bereinstimmung die sich ber 73 bp erstreckte bestand mit weiteren Met tRNAs und Cosmiden von C elegans z B M25472 1 und M25473 1 Des Weiteren zeigten sich hnliche Identit ten mit Initiator oder Varianten Met tRNAs der verschiedensten Organismen wie z B X laevis Salmo salar H sapiens und D melanogaster Eine 92 ige 50 Nukleotide umfassende Teilidentit t bestand zwischen dem Insert des Klons daf 19 0 welches eine L nge von 110 bp aufwies und drei olfaktorischen Rezeptoren von M musculus AY318609 1 AY073213 1 und NM_146877 1 Eine 86 ige Sequenzidentit t welche einen Bereich von 53 bp berspannte wurde bei der 326 bp langen Insertsequenz daf 12B o mit zwei transkribierten Sequenzen f r fizzy related Proteine von X laevis BC045037 1 Y14163 1 festgestellt Der Klon daf 4A M dessen Insert aus 317 bp bestand zeigte auf einer L nge von 52 Nukleo tiden eine Teilidentit t von 84 mit einer kurzkettigen Dehydrogenase Reduktase
171. entiell transkribiert ermittelten Gene der Hypobiose induzierten und nicht induzierten dritten Lungenwurmlarven wurden in einer konventionellen PCR bez glich ihrer differentiellen Transkription berpr ft Dazu wurden Teilbereiche dieser Gene unter Einsatz der ausgew hlten sequenzspezifischen Vorw rts und R ckw rtsprimer GSP for und GSP rev s 9 1 jeweils mit L3ni und L3i cDNA amplifiziert und nachfolgend gelelektrophoretisch auf das Vorhandensein von Banden respektive verglei chend auf deren Intensit t hin analysiert In dieser PCR diente sowohl Erstrang als auch dop pelstr ngige cDNA der L3ni und L3i als Matrize Letztere wurde zuvor mit CHROMA SPIN 100 DEPC Columns BD CLONTECH s 3 8 3 aufgereinigt um die anschlie ende Konzentrationsmessung nicht durch noch vorhandene Primer oder dNTPs zu verfalschen Diese erfolgte da in der PCR ann hernd gleiche Mengen doppelstr ngiger L3i und L3ni cDNA als Template eingesetzt werden sollten Die Reaktionsans tze enthielten die unten auf gef hrten Komponenten 2 5 ul 10x Advantage 2 PCR Puffer 1 ul GSP for 50 uM 1 ul GSP rev 50 uM 1 ul dNTP Mix je 10 mM 0 2 ul Advantage IT Polymerase Mix 1 ul doppelstrangige cDNA der L3ni bzw L3i Die PCR lief bei folgendem Temperaturprofil ab Denaturierung 95 C 10 Sekunden 25x lt 4 Primerannealing 68 C 15 Sekunden Primerextension 72 C 3Minuten Material und Methoden 111 Des Weiteren erfolgte eine A
172. entit t mit einem Mitglied der Calmodulin Familie von C elegans NP_506147 1 festgestellt wer den Mit einem hypothetischen Protein von C elegans T20411 bestand eine Teilidentit t von 81 95 ber einen Bereich von 61 Aminos uren bzw eine 53 ige Teilidentitat 58 ber 112 Aminos uren Weitere Identit ten mit Calmodulinen verschiedenster Orga nismen z B C elegans Vitis vinifera Solanum commersonii wiesen zwar ein entsprechen des E Value aber einen zu geringen Prozentsatz identischer Aminos uren auf um als signifi kant zu gelten Das 995 bp umfassenden Insert des Klons L3i 101 welches sich mit dem des Klons L3i 82 zu 71 identisch zeigte konnte in 302 Aminos uren bersetzt werden Unabh ngig davon ob der Sequenzidentit tsvergleich ab der ersten Aminos ure oder dem ersten Methionin 244 Aminos uren durchgef hrt wurde ergaben sich Identit ten mit den bereits bei Klon L3i 82 beschriebenen Proteinen Die Identit t mit der PNMT erstreckte sich dabei ber 244 Amino s uren und betrug 61 72 vor Zu dem Homolog als auch dem Mitglied der PNMT Familie bestand eine bereinstimmung von 52 67 ber eine L nge von 92 Aminos u ren sowie eine 38 ige Identit t 55 bez glich 72 Aminos uren Ergebnisse 151 Die mit dem Klon L3i 99 teilweise und untereinander zu 98 identischen Klone L3i 18 und L3i 86 mit einer Insertl nge von 686 bp bzw 683 bp zeigten im Gegensatz zum Insert des Klons L3i 99
173. eosinophile Granulozyten wandern in die Alveolen und Bronchiolen ein SCHNIEDER et al 1991 um die Entz ndungsursache zu eliminieren Schrifttum 19 In der Phase der Postpatenz erholen sich die betroffenen Tiere Der gr te Teil der Lungen wurmpopulation ist eliminiert und die Krankheitssymptome klingen ab Infolge gesteigerter Futteraufnahme kehren die Tiere zu ihrem Ausgangsk rpergewicht zur ck JARRETT et al 1957 URQUHART et al 1973 OAKLEY 1983 SCHNIEDER et al 1996b In einigen F l len ist der Krankheitsverlauf jedoch so gravierend dass sich die klinischen Symptome ver schlechtern und die Tiere nach zwei bis vier Tagen sterben Werden K he auf stark kontaminierte Weiden getrieben und sind somit pl tzlich einem hohen Infektionsdruck ausgesetzt kann das so genannte Reinfektionssyndrom beobachtet werden Auf Grund unzureichender Immunit t gelangen etliche Larven in die Lunge so dass eine aku te und schwere Erkrankung resultiert 2 1 5 Diagnose Leichte respiratorische Symptome sechs bis acht Wochen nach Weideaustrieb der Tiere geben erste Hinweise auf einen Lungenwurmbefall Unter k rperlicher Belastung ist Husten indu zierbar PFEIFFER u SUPPERER 1980 GR FNER 1987 In der Initialphase der Erkran kung sind die klinischen Symptome jedoch nicht pathognomonisch TAYLOR 1951 JAR RETT et al 1957 SCHNIEDER et al 1989 daher sollten sich geeignete Nachweisverfahren anschlie en Das Trichter Auswanderverfah
174. er Lungenwurmlarven die Verifizierung dieser beim Einsatz genomischer DNA adulter Stadien erhaltenen Sequenzen Dies war sowohl mit den genspezi fischen daf Primern als auch mit spezifischen Primern f r die entsprechenden Insert Sequenzen der Fall Daher kann davon ausgegangen werden dass es sich bei den Sequenzen 16Au und 120 um Amplifikationsprodukte auf Basis von Wirts DNA handelt Basierend auf den Ergebnissen der daf und age 1 spezifischen PCR unterliegt die Regulation der Hypobiose bei D viviparus mit gro er Wahrscheinlichkeit anderen Steuerungsmechanis men respektive Signalkaskaden als f r C elegans bekannt Dieser Erdnematode erscheint somit als Modellorganismus f r parasitische Nematoden BURGLIN et al 1998 bez glich der genetischen Regulation der Entwicklungshemmung zumindest f r D viviparus ungeeig net Dies w re durch einen zu geringen Verwandtschaftsgrad parasitischer und frei lebender Nematoden oder parasitenspezifische Signalwege zur genetischen Regulation der Hypobiose erkl rbar Gest tzt wird diese Annahme durch die Tatsache dass f r eine bestimmte Spezies oder bergeordnete Einheiten jeweils spezifische Gene vorliegen was bei Datenbankverglei chen offensichtlich wurde So zeigen ungef hr 50 der identifizierten C elegans Gene keine hnlichkeit mit anderen Datenbanksequenzen bei Brugia trifft dies auf 55 der Klone des expressed sequence tag EST Projekts zu BLAXTER et al 1996 Auch MOORE et al 2000 k
175. er cDNA Banken auf die positiv geladenen Nylonmembranen ROCHE aufgebracht wurde 3 11 2 Herstellung DIG markierter cDNA Sonden 3 11 2 1 Reverse Transkription In die Erststrang cDNA Synthese mit dem SMART PCR cDNA Synthesis Kit BD CLONTECH s Kapitel 3 7 3 1 gingen 1 15 ug L3ni mRNA und 1 35 ug L3i mRNA aus der zweiten mRNA Isolierung s 4 2 ein Mit Ausnahme der Verd nnung der fertigen Erst strang cDNA in 90 ul Ampuwa statt in 450 ul TE Puffer wurde nach Anweisung des Her stellerprotokolls vorgegangen Die Sequenz des PCR Primers ist in Abb 5 dargestellt 3 11 2 2 Bestimmung der optimalen Anzahl an LD PCR Zyklen Vor der DIG Markierung der zwei cDNA Populationen wurde zun chst die optimale Zyklen zahl der LD PCR ermittelt Der 25 ul Testansatz der L3ni bzw L3i enthielt die folgenden Komponenten 2 5 ul 10x Advantage 2 PCR Buffer 1 ul dNTP Mix je 10 mM 1 ul PCR Primer 10 uM 1 ul Advantage 2 Polymerase Mix 1 ul verdiinnte Erststrang cDNA Die Amplifikation fand bei unten stehendem Temperaturprofil statt Abweichend von dem unter 3 7 3 3 beschriebenen Vorgehen wurden 5ul Aliquots nach 18 21 und 24 PCR Zyklen entnommen und anschlie end gelelektrophoretisch analysiert 100 Material und Methoden initiale Denaturierung 95 C 1 Minute Denaturierung 95 C 10 Sekunden 18x bzw 3x Primerannealing 65 C 30 Sekunden Primerextension 68 C 6 Minuten 3 11 2 3 cDNA Sondenherstellung mitt
176. er differen tiellen Transkription der L3ni 69 92 bzw L3i 82 101 erzielt werden Bereits beim Einsatz der Plasmid Verd nnungsreihen als Template scheiterte zun chst die selektive Amplifikation Es entstand im 2 igen Agarosegel sowohl bei den oben genannten Sequenzen als auch bei EF la ein multiples Bandenmuster Nachdem mit einer Primercharge nur Fragmente der erwarte ten L ngen amplifiziert werden konnten erwiesen sich Detektion und Quantifizierung als unzureichend Gelang mit einer Sondencharge die Signaldetektion wobei die Sonde EF la besondere Schwierigkeiten bereitete lag die Sensitivit t bei maximal 10 Kopien Des Weite ren ergaben sich innerhalb der Duplikate oftmals Differenzen um bis zu zwei Cycle threshold Ct Werte Wurde ein solcher Lauf unter Verwendung derselben Aliquots wiederholt waren die erhaltenen Werte nicht reproduzierbar in den meisten F llen konnte nunmehr keine ber den Threshold hinausgehende Fluoreszenzemission detektiert werden 4 11 4 qPCR mit TaqMan MGB Sonden Da es mittels der qPCR mit TaqMan Sonden nicht gelang verwertbare Ergebnisse zu erzie len wurden in einem erneuten Versuch TaqMan MGB Sonden eingesetzt Diese erwiesen sich als weitaus besser geeignet als die TaqMan Sonden jedoch missgl ckte auch hier in Abh ngigkeit von der Sondencharge und wiederholter Verwendung eines Sondenaliquots bei einigen L ufen die Signaldetektion Hinsichtlich der Sensitivit t welche anhand der Plasm
177. er gemeinsam besitzen bilden auf Grund des Driver berschusses Heterohydride c aus In der zweiten Hybridisierung werden die Ans tze der ersten Hybridisierung ohne Denaturierung vermischt Somit k nnen nur die normalisierten einzelstr ngigen Sequenzen untereinander sowie mit dem erneut zugesetzten denaturierten Driver hybridisieren Aus den normalisierten Targets entsteht hierbei eine neues Hybridmolek l e welches unterschiedliche Adapter an den 5 Enden besitzt In den folgenden PCRs findet auf Grund des Suppressionseffekts SIEBERT et al 1995 nur eine exponentielle Amplifikation der normalisierten Molek le vom Typ e statt Typ b Molek le besitzen an ihren Enden lange inverted repeats welche loop Strukturen ausbilden Dieses intramolekulare Annealing ist stabiler als die Bindung des k rze ren Primers was eine Amplifikation der entsprechenden Molek le weitgehend unterbindet Schrifttum 51 s Abb 8 Eine zweite als Nested PCR durchgef hrte Amplifikation tr gt zur weiteren se lektiven Anreicherung der normalisierten Transkripte bei Es folgt die Erstellung der subtrahierten cDNA Banken Tester mit Adapter 1 Driver im berschu Tester mit Adapter 2 7777777 DE _ A Denaturierung erste Hybridisierung D a m __ U A Vermis chen der Ans tze Zugabe won denaturierten Driver im berschuss zweite Hybridisierung Auff llen der Enden Suppression PCR a d keine Amplifk ation gt keine
178. erdr ckt BIRNBY et al 2000 JONES et al 2001 Dies muss jedoch nicht zwangsl ufig einen Widerspruch in der Regulation der Entwicklungshemmung von C elegans und D viviparus bedeuten da die Vielfalt der l slichen respektive membrangebundenen GCs auch differente Signaleffekte nach sich zieht Das von NO Synthasen gebildete Signalmolek l NO welches zur Aktivierung der l slichen GCs ben tigt wird BERG et al 2003 S 755 756 findet sich bei A suum im zentralen Ner vensystem dem die sensorischen Organe innervierenden peripheren Nervensystem und dem enterischen Nervensystem BASCAL et al 1995 WALKER et al 1995 Die neuronalen NO Synthasen von Vertebraten werden erst nach Bindung des Kalzium Ca Calmodulin Kom plexes katalytisch aktiv ABU SOUD et al 1994 LEE u STULL 1998 und auch die bislang untersuchten NO Synthasen von A suum sowie P redivivus sind zumindest partiell von Cal modulin respektive Ca abh ngig BOWMAN et al 1995 BASCAL et al 2001 Somit k nnte zwischen der L3i assoziierten Gentranskription des Calmodulin Homologs und des l slichen GC Homologs ein Zusammenhang bestehen F r das Calmodulin Homolog k nnte aber auch eine weiter reichende Rolle im hypobioti schen Prozess der D viviparus Larven angenommen werden So stimuliert dieses zur Familie der EF Hand Proteine geh rende Regulatorprotein welches durch Bindung des second mes 2 ni x 5 sengers Ca aktiviert wird eine Reihe von Enz
179. ereich der mit der jeweils letzten Ergebnisse 145 Base der beiden Klone endete wurde auf einer Lange von 111 Nukleotiden in Form einer Sequenzl cke unterbrochen da diese Nukleotide bei Klon L3i 101 nicht vorhanden waren 4 8 3 Sequenzidentitatsvergleiche Mit den erhaltenen Sequenzen der differentiell transkribierten Inserts der subtrahierten cDNA Banken wurde ein Vergleich auf Nukleins ureebene BLASTN mit in GenBank NCBI publizierten Sequenzen durchgeftihrt Des Weiteren wurden mittels Align Plus die drei m glichen Aminos uresequenzen bersetzt und auf dieser Ebene BLAST search for short nearly exact matches mit publizierten Sequenzen anderer Organismen verglichen Mit cDNA Fragmenten welche in den vorangegangenen Sequenzidentit tsvergleichen noch keine signifikanten Identit ten aufwiesen erfolgte ein erneuter Vergleich mittels TBLASTX Falls hierbei Signifikanzen festgestellt werden konnten wurden die Sequenzen nachfolgend bear beitet und die so erhaltenen Aminos uresequenzen nochmals mit dem BLAST search for short nearly exact matches auf Aminos ureebene verglichen Im folgenden sind die ermit telten signifikanten Homologien beschrieben an welche die Anforderung gestellt wurde ein E Value von kleiner als 0 001 in Verbindung mit einer mindestens 40 igen bereinstim mung aufzuweisen wobei die Prozentzahl in Klammern die Sequenz hnlichkeit angibt Diese ist bestimmt durch den Anteil identischer und iso fu
180. ereits GenBank NCBI ver ffentlichten Sequenzen anderer Organismen berpr ft Signifikante Identit ten sind im Folgenden beschrieben wobei eine bereinstimmung ber einen Teilabschnitt von mindestens 40 bp vorausgesetzt wurde Die Nummer des jeweiligen Klons gibt dabei die verwendete Primerkombination an die Accession bzw Versionen Nummern der homologen Sequenzen sind in Klammern aufgef hrt Das 176 bp lange Insert des Klons daf 16A u zeigte eine 86 ige bereinstimmung ber einen 137 bp langen Teilbereich sowie eine 90 ige bereinstimmung ber 63 Nukleotide mit dem Klon RP42 550C12 von Bos taurus AC087843 2 hnliche Sequenzidentit ten ber denselben Teilbereich wurden mit anderen bovinen Klonen AC087860 2 AC092496 3 AC090961 2 AC089992 2 sowie der X inactivation center region Jpx and Xist genes und dem pankreatischen anionischen Trypsinogen Gen von B taurus AJ421481 1 bzw Ergebnisse 175 AF453325 1 beobachtet Des Weiteren lag eine 81 ige bereinstimmung ber einen 106 bp langen Sequenzabschnitt mit dem prp Gen f r das Prionprotein des genannten Organismus AJ298878 1 vor Mit dem Prionprotein Gen von Ovis aries U67922 1 bestand eine Teil identit t von 83 ber 79 bp sowie von 100 ber 23 bp hinweg Weitere signifikante Iden tit ten werden an dieser Stelle nicht weiter aufgef hrt Das ebenfalls mit dem daf 16A Primerpaar generierte Insert des Klons daf 16A o zeigte sehr hnliche Identit t
181. erien welche C elegans als Nahrungsquelle die nen Diese drei Faktoren regulieren auch das recovery das hei t die Wiederaufnahme der Entwicklung zum adulten Nematoden GOLDEN u RIDDLE 1982 GOLDEN u RIDDLE 1984a GOLDEN u RIDDLE 1984b 2 3 1 Besonderheiten der dauer larva Die in ihrer Entwicklung inhibierte dauer larva l sst sich anhand bestimmter Kennzeichen von normal entwickelten Larven unterscheiden Morphologisch erscheint sie durch radi re Schrumpfung sehr d nn besitzt keine Pharynx oder Darm ffnung und die Darmzellen wir ken dunkel CASSADA u RUSSELL 1975 Auch exkretorische Dr sen NELSON et al 1983 und sensorische Organe ALBERT u RIDDLE 1983 weisen eine Hypobiose spezifi sche Morphologie auf Ferner ist die u ere Kutikula dicker und mit einer zus tzlichen Schrifttum 35 Schicht unterlegt POPHAM u WEBSTER 1978 was dem Nematoden eine besondere Re sistenz gegen schadhafte Umwelteinfl sse verleiht ALBERT u RIDDLE 1988 Die in der Entwicklung gehemmte Larve zeigt weiterhin eine reduzierte Aktivit t Meist liegt sie lang gestreckt und bewegungslos reagiert aber sofort auf mechanische Stimuli Das pharyngeale Pumpen ist v llig eingestellt Verbessern sich die Lebensbedingungen beginnt der Nematode innerhalb von vier Stunden mit der Nahrungsaufnahme und h utet sich zur vierten Larve CASSADA u RUSSELL 1975 Die dauer larva wird auch als nicht alterndes Stadium be zeichnet da sie mehrere Monate berle
182. ers verwendet Die relevante Bande wurde unter UV Kontrolle mit einer sterilen Skalpellklinge ausgeschnit ten die DNA mittels einer Schleuders ule von der Agarose getrennt und anschlie end in 50 ul autoklaviertem Aqua bidest eluiert 3 7 8 Klonierung von PCR Amplifikaten 3 7 8 1 Klonierungsvektor Die Taq DNA Polymerase besitzt eine nicht Template abh ngige Terminale Transferase Ak tivit t durch welche an beide 3 Enden des Amplifikationsprodukts ein Desoxyadenosin an gef gt wird An den 3 Enden des zur Klonierung verwendeten Plasmidvektors pCR 4 TOPO aus dem TOPO TA Cloning Kit for Sequencing INVITROGEN hingegen befin det sich ein Desoxythymidinrest wodurch eine effiziente Klonierung erreicht wird Ebenfalls an den 3 Enden des Vektors ist die Topoisomerase I des Vaccinia Virus lokalisiert Diese bindet doppelstr ngige DNA an spezifischen Stellen und spaltet in einem DNA Strang das Phosphodiester R ckgrat nach der Sequenz 5 CCCTT SHUMAN 1991 Die dabei frei werdende Energie wird in Form einer kovalenten Bindung zwischen dem 3 Ende des ge schnittenen Stranges und einem Tyrosyl Rest Tyr 274 der Topoisomerase I gespeichert Diese Phospho Tyrosyl Bindung kann wiederum von der 5 OH Gruppe des zertrennten Stranges angegriffen werden wodurch die Spaltungsreaktion r ckg ngig gemacht und die Topoisomerase I freigesetzt wird SHUMAN 1994 Bei der Klonierung von PCR Produkten in den pCR 4 TOPO Vektor w
183. erst im TBLASTX Identit ten Diese gen gten dabei nicht den an eine Signifi kanz gesetzten Anforderungen werden jedoch im Folgenden kurz beschrieben Es konnte jeweils eine 115 Aminos uren lange Sequenz erstellt werden die mit dem unter L3i 99 ge nannten Proteinen von C elegans eine bereinstimmung von 31 41 ber insgesamt 138 Aminos uren ergab 4 9 Charakterisierung der differentiell transkribierten Gene 4 9 1 Spezifit t der RACE Primer Die mit den genspezifischen Primerpaaren f r die Inserts der Klone L3ni 56 L3i 82 sowie L3i 88 generierten Touchdown PCR Produkte lie en im Agarosegel unabh ngig von der ge w hlten Primerkombination neben der Bande mit der erwarteten L nge noch zwei weitere Banden entstehen Eine weitere Bande trat mit den GSPs f r das Insert von Klon L3i 33 L3i 75 sowie L3i 100 auf Mit den beiden Primerpaaren f r den Klon L3ni 54 konnte auch nach wiederholten Versuchen kein Produkt amplifiziert werden Bei der Verwendung der GSP f r die brigen differentiell transkribierten cDNA Sequenzen war im Zuge der gelelektrophoretischen Kontrolle jeweils eine Bande der erwarteten Fragmentl nge festzustellen 4 9 2 Sequenzierung der GSP Amplifikationsprodukte Die GSP Amplifikationsprodukte welche mehr als eine Bande nach der Gelelektrophorese aufwiesen unterlagen einer Klonierung und Sequenzierung F r das Primerpaar L3i 33 erga ben sich dabei eine 599 bp sowie eine 444 bp lange Sequenz wobei die
184. es UPM und GSP rev eine exponentielle Amplifikation nur der cDNA Molekiile die am 5 Ende von der komplement ren SMART Sequenz und am 3 Ende von der Oligo dT Sequenz flankiert sind Die Poly A Sequenz der mRNA wird in der 3 RACE insofern genutzt als dass in der rever sen Transkription zur Erststrang cDNA Synthese ein modifizierter Oligo dT cDNA Synthe sis CDS Primer Verwendung findet an dessen 5 Ende eine Adaptersequenz angeh ngt ist die dem SMART II A Oligonukleotid entspricht Die Vervielf ltigung des 3 Endes ge schieht in der darauf folgenden PCR durch den Einsatz des UPM und GSP for Die Amplifikation des unbekannten 3 und 5 Endes erfolgte durch eine Touchdown PCR DON et al 1991 in welcher die Annealingtemperatur schrittweise gesenkt wird Diese ist in den ersten PCR Zyklen h her als die Schmelztemperatur der universellen Primer wodurch nur eine Elongation der GSPs erfolgt Nach dieser Anreicherung an genspezifischem Ampli fikationsprodukt wird die Annealingtemperatur soweit reduziert dass die universellen Primer ebenfalls hybridisieren k nnen und eine exponentielle Amplifikation des genspezifischen 3 oder 5 Endes m glich ist SMART II A Oligonukleotid 5 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG 3 3 RACE CDS Primer 5 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTgoN N 3 N A C G oder T N A C oder G 5 RACE CDS Primer 5 T2s N N 3 N A C G oder T N A C oder G
185. esistenzgene zu erzielen fand nach der Zugabe von 250 ul SOC Medium eine Inkubation f r eine Stunde bei 37 C und 225 rpm im Sch ttelinkubator GFL statt Nachdem die Trans formation vollst ndig vollzogen war wurde die gesamte Wirtszellsuspension auf zwei zuvor mit Kanamycin 50 ug ml Agar versetzte LB Agar N hrb den mit einem sterilen Dry galskispatel ausgestrichen und ber Nacht bei 37 C inkubiert Material und Methoden 73 3 7 9 _ Plasmidpraparation 3 7 9 1 Plasmidpr paration mittels Miniprep Von den LB Agarplatten wurden Klone nach dem Zufallsprinzip ausgew hlt und in 5 ml LB Medium welches 50 ug Kanamycin ml Medium enthielt berf hrt Das Wachstum der Zel len fand bei 37 C unter st ndigem Sch tteln GFL ber Nacht statt Nach dem Anlegen von Glyzerolstocks wobei 600 ul Bakterienkultur mit 600 ul Glyzerol gr ndlich durchmischt wurden erfolgte mit dem Rest der jeweiligen Fl ssigkultur eine Plasmidpr paration in Form einer Miniprep Diese diente falls ein Anz chten der Bakterienzellen aus den Glyzerolstocks nicht mehr m glich oder das Insert nicht mehr vorhanden sein sollte als Reserve f r eine er neute Transformation Bei einem Teil der Proben wurde die so gewonnene Plasmid DNA auch f r eine Sequenzierung genutzt Die Isolierung der Plasmid DNA erfolgte mit dem NucleoSpin Plasmid Kit MACHEREY amp NAGEL Im Zuge der Plasmidisolierung wurden die f r 15 Minuten bei 3000 g abzentri fugierten Zellen z
186. fael USA durchgef hrt Im An schluss an die berpr fung auf Normalverteilung mit Kolmogorov Smirnov erfolgte die Be rechnung eventueller signifikanter Korrelationen unter Verwendung des t Tests respektive des Mann Whitney Rank Sum Tests 3 16 daf und age 1 spezifische PCR Bei dem ebenfalls zur Entwicklungshemmung bef higten frei lebenden Erdnematoden C ele gans konnten bereits die so genannten daf Gene sowie das Gerontogen age 1 welche in den hypobiotischen Prozess involviert sind identifiziert werden s Kapitel 2 3 3 und 2 3 4 Es sollte berpr ft werden ob bei D viviparus Homologe dieser Gene existieren 3 16 1 daf age 1 spezifische Primer Basierend auf den elf publizierten daf Gensequenzen sowie der age 1 daf 23 Gensequenz wurden mit Hilfe des Softwareprogramms Lasergene DNASTAR 28 daf spezifische sowie drei age 1 spezifische Primerkombinationen s 9 5 ausgew hlt wobei die Primerpaare je weils in einem Exonbereich des entsprechenden Gens lokalisiert waren Des Weiteren wurden Material und Methoden 121 in der PCR auch bereits publizierte sequenzspezifische Primerpaare fiir die Gene daf 1 daf 3 daf 4 sowie age 1 nach RICKLING 1999 s 9 5 eingesetzt Die Oligonukleotidsynthese der insgesamt 35 Primerkombinationen erfolgte im Auftrag durch die Firma INVITROGEN 3 16 2 Amplifikation genomischer DNA Mittels der 35 sequenzspezifischen Primerpaare fiir die C elegans daf Gene und das Geron togen age 1 er
187. falls and potential Biotechniques 26 112 115 FROHMAN M A 1993 Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full length complementary DNAs thermal RACE Methods Enzymol 218 340 356 FROHMAN M A M K DUSH u G R MARTIN 1988 Rapid production of full length cDNA from rare transcripts Amplification using a single gene specific oligonucleotide primer Proc Natl Acad Sci USA 85 8998 9002 GALAS D J 2001 Sequence interpretation Making sense of the sequence Science 291 1257 1260 GATONGI P M R K PRICHARD S RANJAN J M GATHUMA W K MUNYUA H CHERUIYOT u M E SCOTT 1998 Hypobiosis of Haemonchus contortus in natural infections of sheep and goats in a semi arid area of Kenya Vet Parasitol 77 49 61 Literaturverzeichnis 221 GEMS D 1999 Nematode ageing Putting metabolic theories to the test Curr Biol 9 R614 R616 GEORGI L L P S ALBERT u D L RIDDLE 1990 daf 1 a C elegans gene controlling dauer larva development encodes a novel receptor protein kinase Cell 61 635 645 GERISCH B C WEITZEL C KOBER EISERMANN V ROTTIERS u A ANTEBI 2001 A hormonal signaling pathway influencing C elegans metabolism reproductive development and life span Dev Cell 1 841 851 GIANGASPERO M F A BAHHADY G ORITA u L GRUNER 1992 Summer arrested development of abomasal trichostrongylids in Awassi sheep in semi arid areas of north west Syria Par
188. folgte die Amplifikation genomischer DNA adulter Lungenwiirmer Die 50 ul Doppelans tze enthielten folgende Komponenten 5 ul 10x PCR Puffer 1 5 ul MgCl 50 mM 1 ul dNTP Mix je 10 mM 1 ul Vorwartsprimer 50 uM 1 ul R ckw rtsprimer 50 uM 0 25 ul Taq DNA Polymerase 5 U ul 2 ul genomische DNA Die PCRs fanden bei dem unten aufgefiihrte Temperaturprofil statt wobei die unter 9 5 ange gebenen Annealingtemperaturen meist den von der Primerdesign Software Lasergene DNASTAR errechneten Temperaturen entsprachen in einigen Reaktionen ergaben sich je doch diesbez glich Differenzen von 0 2 C initiale Denaturierung 94 C 3 Minuten Denaturierung 94 C 1 Minute 35x Primerannealing x C 1 Minute Primerextension 72 C 1 Minute finale Elongation 72 C 10 Minuten Nach der Amplifikationsreaktion unterlagen die PCR Produkte einer Gelelektrophorese Ban den welche in etwa die erwartete Fragmentl nge aufwiesen oder sich besonders prominent 122 Material und Methoden darstellten wurden kloniert und sequenziert Der Identit tsvergleich mit publizierten Sequen zen anderer Organismen erfolgte mittels BLASTN s Kapitel 3 7 7 bis 3 7 10 3 16 3 berpr fung der Sequenzen daf 12 0 und daf 16A u Da es sich bei dem Template der daf spezifischen PCR um genomische DNA adulter Parasi ten handelte welche aus Rinderlungen gewonnenen wurden bestand die Gefahr der Verun reinigung mit Wirtszell DNA Dahe
189. for dictyocaulosis Vet Rec 133 603 OGG S S PARADIS S GOTTLIEB G I PATTERSON L LEE H A TISSENBAUM u G RUVKUN 1997 The fork head transcription factor DAF 16 transduces insulin like metabolic and longevity signals in C elegans Nature 389 994 999 PAPE M 1999 Charakterisierung des B Tubulin Gens der kleinen Strongyliden des Pferdes Hannover Tier rztl Hochsch Diss 234 Literaturverzeichnis PARADIS S M AILION A TOKER J H THOMAS u G RUVKUN 1999 A PDK1 homolog is necessary and sufficient to transduce AGE 1 PI3 kinase signals that regulate diapause in Caenorhabditis elegans Genes Dev 13 1438 1452 PARADIS S u G RUVKUN 1998 Caenorhabditis elegans Akt PKB transduces insulin receptor like signals from AGE 1 PI3 kinase to the DAF 16 transcription factor Genes Dev 12 2488 2498 PARFITT J W u I J SINCLAIR 1967 Cross resistance to Dictyocaulus viviparus produced by Dictyocaulus filaria infections in calves Res Vet Sci 8 6 19 PATTERSON G I A KOWEEK A WONG Y LIU u G RUVKUN 1997 The DAF 3 Smad protein antagonizes TGF beta related receptor signaling in the Caenorhabditis elegans dauer pathway Genes Dev 11 2679 2690 PATTERSON G I u R W PADGETT 2000 TGF beta related pathways Roles in Caenorhabditis elegans development Trends Genet 16 27 33 PECCOUD J u C JACOB 1996 Theoretical uncertainty of measurements using quantitative polymerase chain
190. genommen und 10 000fach in 80 ml Blockierungsl sung verd nnt Diese Antik rperl sung wurde der Membran f r eine 30 min tige Inkubation zugegeben gefolgt von zwei Waschschritten mit einer Dauer von je 20 Minuten in 500 ml Waschpuffer Nachdem die Membran 3 Minuten in 80 ml Detektionspuffer inkubiert worden war wurde sie in eine Hybridisierungstasche ROCHE verbracht und mit CSPD ready to use DIG High Prime Labeling and Detection Starter Kit II ROCHE betr ufelt Nach 5 Minuten wurde mit einem Rollger t bersch ssiges CSPD entfernt und die Membran luftblasenfrei in der Hybridisierungstasche eingeschwei t woran sich eine Inkubation f r 15 Minuten bei 37 C zur Steigerung der Lumineszenz anschloss 98 Material und Methoden Die Sichtbarmachung der entstehenden Lichtsignale erfolgte mit Hilfe von KODAK Bio Max Light Filmen AMERSHAM BIOSCIENCES deren obere linke Ecke zur sp teren Orientierung abgeschnitten wurde Nach einer Reinigung der Hybridisierungstasche mit der darin befindlichen Membran mittels Ethanol fand eine Filmexposition f r 1 5 Stunden statt nachfolgend wurde ein weiterer Film f r 40 Minuten auf der Membran belassen Die Ent wicklung und Fixierung der Filme mit anschlie ender Trocknung bei Raumtemperatur ge schah durch Verwendung des KODAK GBX Developer und KODAK GBX Replenisher IN TEGRA nach Herstellerprotokoll 3 11 Verifizierung differentiell transkribierter Sequenzen mittels cDNA dot blot Nac
191. gt f r die SSH ein bis vier Mikrogramm mRNA DIATCHENKO et al 1996 DIATCHENKO et al 1999 Ist diese Menge nicht verf gbar k nnen Tester und Driver durch zus tzliche Adapterligation vor Be ginn des SSH Protokolls amplifiziert werden GURSKAYA et al 1996 Diese wie auch die Pr amplifikation von Gesamt RNA f hrt aber zu einem Hintergrund in den finalen PCR Produkten DIATCHENKO et al 1996 DIATCHENKO et al 1999 Weiterhin vermuten die Autoren dass durch diesen Schritt einige Sequenzen verloren gehen k nnten Die Amplifika tion von Gesamt RNA bietet andererseits den Vorteil auch nicht poly adenylierte Transkripte detektieren zu k nnen HUBANK u SCHATZ 1994 HUBANK u SCHATZ 1999 Im Vergleich mit den Fingerprinting Verfahren ist der Anteil falsch positiver Klone bei der RDA respektive SSH wesentlich geringer HARRIS et al 1998 ermittelten f r das Differen tial Display eine Rate an falsch positiven Klonen von 93 im Gegensatz zu 30 bei der RDA und 0 bei der SSH wobei mit letzterer nur eine differentiell transkribierte Sequenz detektiert werden konnte hnliche Ergebnisse stellten auch andere Autoren f r die genannten subtraktiven Hybridisierungsverfahren fest DIATCHENKO et al 1996 von STEIN et al 1997 WELFORD et al 1998 KUANG et al 1998 BREITENBACH et al 2001 und Schrifttum 53 CHAN et al 2002 hingegen konnten mit der SSH weniger als 10 der Klone als differen tiell transkribiert verifizieren Diese
192. gulati on der Hypobiose beim gro en Lungenwurm des Rindes ansatzweise aufgekl rt werden Schrifttum 15 2 Schrifttum 2 1 Die Diktyokaulose des Rindes 2 1 1 Der Erreger Bei Dictyocaulus viviparus BLOCH 1782 dem gro en Lungenwurm des Rindes handelt es sich um einen Nematoden welcher taxonomisch der Ordnung der Strongylida und der Fami lie der Dictyocaulidae angeh rt Er verursacht die parasit re Bronchitis Der adulte sich re produzierende Parasit siedelt sich in den Bronchioli Bronchien sowie der Trachea von Rin dern und verschiedenen Wildwiederk uerarten an ENIGK u HILDEBRANDT 1969 PRE SIDENTE et al 1972 PRESIDENTE u KNAPP 1973 Als weitere Arten der Gattung Dictyocaulus parasitieren bei Equiden D arnfieldi bei kleinen Wiederk uern D filaria und bei Reh und Rotwild D eckerti SKRJABIN 1931 GOTHE 1983 GOTHE u KANDELS 1984 Dass es sich bei letztgenanntem um eine eigene Spezies und nicht um ein D viviparus Isolat handelt haben molekulargenetische Untersuchungen ergeben EPE et al 1995 SCHNIEDER et al 1996a EPE et al 1997 Nach GIBBONS u KHALIL 1988 existieren als weitere Arten D cameli und D africanus bei afrikanischen Paarhufern K rzlich beschrieben GIBBONS u H GLUND 2002 mit D capreolus eine neue Spezies bei Rothirschen und Elchen in Schweden auf deren Eigenst ndigkeit bereits vorangegangene Untersuchungen hindeuteten HOGLUND et al 1999 Arten die bei mehre ren Wirtstierarten auftrete
193. h ausgeschlossen werden dass Inserts welche ein 5 oder 3 Ende dieser geschnittenen cDNAs repr sentieren infolge eines eventuell unvollst ndigen Enzymverdaus noch die oben erw hnten Oligonukleotidsequenzen beinhalteten und somit bei der Verwendung einer ungeschnittenen Sonde die Gefahr falsch positiver Ergebnisse in der sp teren Detektion der Sondensignale bestand Bevor die Proben in den Rsal Verdau eingingen wurden die CDNA Sonden der L3ni und L3i mittels CHROMA SPIN 100 DEPC H20 Columns BD CLONTECH s 3 8 3 nach dem Herstellerprotokoll aufgereinigt um optimale Reaktionsbedingungen f r das Restriktionsen zym zu schaffen Nach erfolgter Aufreinigung wurde den Proben die entsprechende Menge an 10x Reaktionspuffer L sowie jeweils 2 ul Rsal 10 U ul ROCHE hinzugef gt Zur Kontrolle der Enzymaktivit t wurden von den zwei Ans tzen je 3 ul abgenommen und mit 1 ul Plas mid DNA versetzt Nach Ablauf der Spaltungsreaktion welche f r vier Stunden bei 37 C erfolgte wurden die Proben auf einem Agarosegel analysiert Im Anschluss an den Enzymverdau fand abermals der oben aufgef hrte Reinigungsschritt statt um die Sondenl sung von den abgespaltenen Primern und zugesetzten Reaktionskom ponenten zu befreien 3 11 2 5 Hybridisierung und Detektion Die berpr fung der Nachweisgrenze der cDNA Sonden und somit Feststellung des Gehalts an DIG markierter cDNA in den Sondenl sungen der L3ni und L3i erfolgte wie unter 3 10 2
194. h der Identifikation differentiell transkribierter Gensequenzen mit Hilfe des Differential Screenings erfolgte eine weitere Hybridisierung der in den subtrahierten cCDNA Banken ent haltenen Sequenzen zum Ausschluss nur artifiziell angereicherter cDNA Sequenzen und da mit falsch positiver Klone Diese Verifizierung der als differentiell transkribiert angesehenen Sequenzen erfolgt blicherweise mittels einer mRNA Hybridisierung im Northern Blot Da f r eine Northern Blot Analyse 10 ug bis 20 ug Gesamt RNA bzw bei ow copy Transkripten 5 ug bis 10 ug mRNA erforderlich sind konnte diese Methode aus Mangel an Untersu chungsmaterial nicht durchgef hrt werden Alternativ wurde eine erneute Hybridisierung der Sequenzen der subtrahierten cDNA Banken in Form eines Southern dot blottings vorgenom men Dazu wurden aus frisch isolierter mRNA der L3ni und L3i cDNA Sonden synthetisiert deren Markierung mit Digoxigenin 11 dUTP ROCHE im Zuge einer LD PCR erfolgte 3 11 1 Southern dot blotting Zur Verifizierung der in den subtrahierten L3ni und L3i cDNA Banken enthaltenen 104 bzw 105 Sequenzen mittels einer L3ni und L3i cDNA Sonde wurden zwei identische Membranen wie unter 3 10 1 beschrieben angefertigt Als Negativkontrolle f r die sp tere Hybridisierung diente hierbei das SMART II Oligonukleotid 10 uM SMART PCR cDNA Synthesis Material und Methoden 99 Kit BD CLONTECH s Abb 5 welches neben den Insert Amplifikationsprodukten s 3 9 2 d
195. he Betriebe erhebliche Produktionseinbu en durch unerwartete und zun chst unerkannte Aus br che der Diktyokaulose J RGENSEN u OGBOURNE 1985 Im Jahr 1993 registrierten die Veterin runtersuchungs mter in England und Wales 135 F lle parasit rer Bronchitis mit einer Morbidit t von 10 bis 100 und einer Mortalit t von 3 Dabei waren K lber ent gegen der Erwartungen nur in 28 der F lle betroffen DAVID 1993 2 1 3 Biologie und Entwicklungszyklus Mit dem Kot des infizierten Wirtes werden unbescheidete erste Lungenwurmlarven ausge schieden TAYLOR 1951 SOLIMAN 1953 JORGENSEN 1980 Diese entwickeln sich unter g nstigen klimatischen Bedingungen innerhalb einer Woche ber ein zweites einfach bescheidetes Larvenstadium zu den 300 um bis 400 um langen dritten doppelt bescheideten infekti sen Larven BACINSKY 1973 W hrend dieser Entwicklungszeit nehmen die Larven keine Nahrung auf sondern zehren von ihren in Granula gespeicherten Reservestoffen PFEIFFER u SUPPERER 1980 OAKLEY 1983 Da Rinder das Grasen in unmittelbarer N he von Kothaufen vermeiden ist zur Aufrechterhaltung des Infektionsgeschehens eine Translokation der Larven notwendig Passiv geschieht die Verbreitung der Larven durch eine Verteilung der Kotfladen eine aktive Verbreitung erfolgt durch Vektoren wie K fer V gel oder koprophile Pilzen der Gattung Pilobolus JORGENSEN et al 1982 Erst nach Passage Schrifttum 17 des Herbivorendarms keimen diese P
196. he dog hookworm Exp Parasitol 97 70 76 BIENIOSCHEK S 1994 Experimentelle Wechselinfektionen zwischen Zerviden und Hauswiederk uern mit gro en Lungenwiirmern Dictyocaulus spp Leipzig Univ Veterinarmed Fak Diss BIRNBY D A E M LINK J J VOWELS H TIAN P L COLACURCIO u J H THOMAS 2000 A transmembrane guanylyl cyclase DAF 11 and Hsp90 DAF 21 regulate a common set of chemosensory behaviors in Caenorhabditis elegans Genetics 155 85 104 BISSET S A u E D MARSHALL 1987 Dynamics of Ostertagia spp and Cooperia oncophora in field grazed cattle from weaning to 2 years old in New Zealand with particular reference to arrested development Vet Parasitol 24 103 116 BLAXTER M u L LIU 1996 Nematode spliced leaders ubiquity evolution and utility Int J Parasitol 26 1025 1033 BLAXTER M L N RAGHAVAN I GOSH D GUILIANO W LU S A WILLIAMS B SLATKO u A L SCOTT 1996 Genes expressed in Brugia malayi infective third stage larvae Mol Biochem Parasitol 77 77 93 BLITZ N M u H C GIBBS 1972a Studies on the arrested development of Haemonchus contortus in sheep I The induction of arrested development Int J Parasitol 2 5 12 214 Literaturverzeichnis BLITZ N M u H C GIBBS 1972b Studies on the arrested development of Haemonchus contortus in sheep II Termination of arrested development and the spring rise phenomenon Int J Parasitol 2
197. housekeeping Genen so gut wie keinen Schwankungen unterliegt wird sie von verschiedenen Autoren als interner Standard empfohlen BUSTIN 2000 MOE et al 2001 DEINDL et al 2002 BUSTIN 2002 In diesem Fall m sste jedoch Gesamt RNA als Template in der qPCR eingesetzt werden da die 18S rRNA bei der mRNA Isolierung nicht erfasst wird Nach den Ergebnissen der Auswertung der verschiedenen L ufe erscheint eine reelle Quanti fizierung der Kopienzahlen durch die qPCR eher fraglich W hrend bei den einzelnen Dupli katen bez glich der Ct Werte maximal Variationskoeffizienten von 5 7 beobachtet werden konnten lagen diese bei den Kopienzahlen insgesamt wesentlich h her und reichten bis 87 5 Beim Vergleich der Kopienzahlen einer Sequenz ergaben sich zwischen den jeweils f nf verschiedenen L3ni und L3i Templates zum Teil auff llige Differenzen was auf eine unterschiedliche Template Qualit t oder Quantit t zur ckgef hrt werden k nnte Jedoch wa ren diese Differenzen auch bei verschiedenen L ufen innerhalb eines der Templates festzu stellen teilweise variierten die Kopienzahlen um den Faktor zehn und mehr Ebenso stellte WIRTHERLE 2003 eine hohe Variabilit t bez glich der DNA Quantifizierung fest Auch in Diskussion 201 dieser Untersuchung wurden TaqMan MGB Sonden der Firma APPLIED BIOSYSTEMS Warrington UK sowie das Brilliant Quantitative PCR Core Reagent Kit STRATAGENE Amsterdam Niederlande verwendet ferner erfolgten
198. htige Rolle f r das berleben des Parasiten im Wirt KNOX u JONES 1992 Die differentielle Transkription der extrazellul ren Kupfer Zink Superoxiddismutase bei den D viviparus Larven k nnte auf die unterschiedliche Immunreak tion des Wirtsorganismus zur ckgef hrt werden So persistieren hypobiotische Lungenwurm stadien ber Monate ohne erkennbare Zellinfiltration an ihrem Ansiedlungsort wohingegen ungehemmte Stadien in den Lungen betroffener Tiere eine starke zellul re Reaktion ausl sen SCHNIEDER et al 1991 F r das differentiell transkribierte Paramyosin Gen welches zu dem Paramyosin Gen unc 15 von C elegans Homologien aufweist kann urs chlich eine unterschiedliche Aktivit t der L3ni bzw L3i angenommen werden Nach BRENNER 1974 existieren bei C elegans zwei prim re Muskeltypen Dies sind die der Lokomotion dienenden K rperwandmuskeln und die zur Nahrungsaufnahme ben tigte Pharynxmuskulatur In beiden Geweben wird dabei unter der Kontrolle eines Promotors und Enhancers das Paramyosin Gen unc 15 exprimiert KA GAWA et al 1995 welches zusammen mit Myosin die dicken Filamente der Muskulatur bildet HOPPE u WATERSTON 2000 In Leitungswasser inkubierte Hypobiose induzierte dritte D viviparus Larven sind zumeist zusammengerollt und verharren damit bewegungslos Ebenso zeigen hypobiotische im Gegensatz zu ungehemmten Entwicklungsstadien in der Lunge des Wirtes keine Bewegungsaktivit t und nehmen ferner keine Nahrung auf D
199. hybridization Nucleic Acids Res 25 3718 3723 KUTZER E 1988 Bedeutung parasit rer Wechselinfektionen bei Haus und Wildwiederk uern Monatsh Veterin rmed 43 577 580 LARSEN M 1999 Biological control of helminths Int J Parasitol 29 139 146 LARSEN P L 1993 Aging and resistance to oxidative damage in Caenorhabditis elegans Proc Natl Acad Sci USA 90 8905 8909 LARSEN P L P S ALBERT u D L RIDDLE 1995 Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans Genetics 139 1567 1583 LEE D L u R C KO 1991 Catecholaminergic neurons in Trichinella spiralis Nematoda Parasitol Res 77 269 270 LEE R Y J HENCH u G RUVKUN 2001 Regulation of C elegans DAF 16 and its human ortholog FKHRL 1 by the daf 2 insulin like signaling pathway Curr Biol 11 1950 1957 LEE S J u J T STULL 1998 Calmodulin dependent regulation of inducible and neuronal nitric oxide synthase J Biol Chem 273 27430 27437 LI J X ZHU F T ASHTON H R GAMBLE u G A SCHAD 2001 Sensory neuroanatomy of a passively ingested nematode parasite Haemonchus contortus amphidial neurons of the third stage larva J Parasitol 87 65 72 230 Literaturverzeichnis LI J X ZHU R BOSTON F T ASHTON H R GAMBLE u G A SCHAD 2000 Thermotaxis and thermosensory neurons in infective larvae of Haemonchus contortus a passively ingested nematode parasite J Comp Neurol
200. i 37 C ruhren anschlieBend 15 min bei 100 C 20x SSC 3 M NaCl 0 3 M NaCitrat pH 7 SDS Puffer 10 SDS in Aqua bidest gel st sterilfiltriert durch 0 2 um Einweg Filterhalter 2x Waschl sung 2x SSC 0 1 SDS 0 5x Waschl sung 0 5x SSC 0 1 SDS 1x TAE 40 mM Tris Acetat pH 8 2 mM EDTA TE Puffer 10 mM Tris HCl pH 7 6 1 mM EDTA 1x TNE 10 mM Tris HCl pH 8 10 mM NaCl 0 1 mM EDTA F r alle L sungen und Puffer wurde Aqua bidest verwendet Alle L sungen und Puffer wur den soweit m glich autoklaviert oder aus autoklavierten Stamml sungen hergestellt 3 2 Medien und Platten LB Medium 1 Bacto Trypton 0 5 Hefeextrakt 1 NaCl pH 7 LB Agarplatten LB Medium mit 15 g Agar l 56 Material und Methoden S mtliche L sungen wurden autoklaviert Als Antibiotikum wurde Kanamycin in einer Kon zentration von 50 ug ml Medium bzw Agar verwendet 3 3 Reagenzien Enzyme Reaktionsgef e Reaktionskits und Ger te AMERSHAM BIOSCIENCES Freiburg Autoradiography Cassette RPN 1645 35 x 43 cm KODAK BioMax Light Film 24x30 cm Spektralphotometer Gene Quant pro Hoefer HE 33 Mini Submarine Unit Quick Prep Mi cro mRNA Purification Kit ANGEWANDTE GENTECHNOLOGISCHE SYSTEME Heidelberg Horizontal Mini Gel Electrophoresis System APPLIED BIOSYSTEMS Warrington UK TaqMan Sonden sowie TaqMan Minor Groove Binder Sonden und Primer BIOMETRA G ttingen Personal Cycler Agagel Midi Wide Horizontal
201. i 4 C wurde der Prozentsatz der berlebenden Lungenwurmlarven berechnet Die berlebensrate schwankte zwischen 33 und 75 8 bei einem Mittelwert von 55 5 berlebender Larven 4 1 2 berpr fung der Hypobiosef higkeit des Laborstammes Das mit insgesamt 3000 nicht Hypobiose induzierten Larven L3ni infizierte Kalb 1 wurde am 27 Tag p i get tet und seziert Aus der er ffneten Trachea und den Bronchien konnten 425 adulte Lungenw rmer mit einer L nge von ca 3 cm bis 7 cm entnommen werden Kalb 2 und 3 wurden mit insgesamt 20 000 Hypobiose induzierten Larven L3i infiziert T tung und Sektion von Kalb 2 erfolgten wie bei Kalb 1 am 27 Tag p i Die Lungenperfusion erbrachte 317 gehemmte Larven mit einer L nge von 0 45 mm bis 1 13 mm zwei Stadien erwiesen sich als ca 3 mm lang Bei Kalb 3 ergab die Lungenperfusion 42 Tage p i eine Ausbeute von 94 ca 1 mm bis 1 5 mm langen und f nf ca 3 mm langen gehemmten Lun genwurmstadien die Anlage einer Bursa copulatrix war bei elf Individuen erkennbar Zum Sektionszeitpunkt konnte bei Kalb 1 in 2x 5 g Kot eine Ausscheidung von 23 bzw 86 D viviparus Larven festgestellt werden Kalb 2 schied keine Larven aus Bei Kalb 3 fanden sich zum Zeitpunkt der Sektion in 2x 10 g Kot eine respektive drei Lungenwurmlarven 4 2 Quantitative Bestimmung und Reinheit der isolierten mRNA Im Verlauf der vorliegenden Arbeit wurde f r verschiedene Untersuchungen insgesamt sechsmal mRNA aus den
202. ibierten respektive nicht inhibierten Entwicklung in Zusammenhang gebracht werden Mit dem PNMT und dem SOD Homolog wurde zur Bestimmung der Trans kriptionsrate in den Hypobiose induzierten und nicht induzierten Larven eine quantitative real time PCR vorgenommen Bei dem PNMT Homolog ergaben sich signifikante Unter schiede der in den beiden Larvenpopulationen vorliegenden Kopienzahlen wodurch die diffe rentielle Transkription auch mit dieser Methode best tigt werden konnte Um der Frage nach zugehen ob bei D viviparus Genhomologe der so genannten dauer formation daf Gene und des age 1 Gens welche bei dem frei lebenden Erdnematoden C elegans die larvale Entwick lung regulieren vorhanden sind wurden von zw lf dieser Gene insgesamt 35 spezifische Primerpaare ausgew hlt Die Klonierung und Sequenzierung von 83 Amplifikationsprodukten ergab jedoch keinen Hinweis auf das Vorhandensein solcher Gene bei D viviparus f r des sen mRNA jedoch die Existenz der SL1 Sequenz nachgewiesen werden konnte Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit geben erste Einblicke in die genetischen Steuerungs mechanismen der inhibierten und nicht inhibierten Larvenentwicklung des bovinen Lungen wurms 208 Summary 7 Summary Christina Strube 2004 Differential gene transcription of hypobiosis induced and not induced third stage larvae of Dictyocaulus viviparus Dictyocaulosis is one of the most important parasitic diseases in first year grazing calve
203. id Verd nnungsreihen ermittelt wurde ergaben sich in den auswertbaren L ufen f r die Taq Man MGB Sonden folgende Kopienzahlen Sonde SOD MGB 10 Kopien in zwei L ufen nur 10 Kopien Sonde NMT MGB 10 Kopien in einem Lauf nur 10 Kopien Sonde EF la 10 Kopien in einem Lauf 10 Kopien Beim Einsatz der je f nf verschiedenen L3ni bzw L3i Erststrang cDNAs in Verd nnungs stufen als unverd nntes sowie 10fach und 100fach verd nntes Template konnte bei einigen Ergebnisse 169 L ufen nicht die erwartete Erh hung um drei Ct Werte pro Verd nnungsstufe festgestellt werden vielmehr ergaben sich Variationen zwischen zwei und vier Ct Werten Dementspre chend unterschieden sich auch bei Quantifizierung die Kopienzahlen der jeweiligen Sequen zen hierbei nicht um den Faktor zehn Abb 33 zeigt beispielhaft den Amplification Plot eines Laufs mit L3ni bzw L3i cDNA Hierbei sind die Ct Werte der EF la und L3ni 69 92 SOD Sequenz f r beide Templates nahezu gleich Bei der Sequenz L3i 82 101 PNMT hingegen wurde mit dem L3i Template drei Zyklen fr her ein ber die Hintergrundfluoreszenz hinausgehendes Signal detektiert Dies entspricht einer zehnfach erh hten Kopienzahl im Vergleich zu dem L3ni Template SOD L3ni SOD L3i PNMT L3i PNMT L3ni oe G Y a c o a a o ta 3 i EF la L3ni L3i Cycles Abb 33 Amplification Plot eines L3ni und L3i Templates In Tab 8
204. identit tsvergleich Des Weiteren wurde zur Identifikation differentiell transkribierter Gene bei Hypobiose induzierten L3i und nicht induzierten L3ni dritten Lungenwurmlarven die Suppression Subtractive Hybridi zation SSH mit nachfolgendem Differential Screening der erstellten subtraktiven cDNA Banken angewandt Anschlie end erfolgte die Best tigung einer differentiellen Transkription mittels cDNA dot blot Diese verifizierten Genfragmente wurden kloniert sequenziert und mit bereits ver ffentlichten Sequenzen anderer Organismen verglichen wobei cDNA Sequenzen die signifikante Identit ten aufwiesen einer weiteren Charakterisierung unterla gen Hierzu wurden die Fragmente mittels der 3 und 5 Rapid Amplification of cDNA Ends RACE komplettiert und nach erneuter Klonierung und Sequenzierung wiederum einem Se quenzidentit tsvergleich unterzogen Abschlie end wurde jeweils ein differentiell transkri biertes Gen der Hypobiose induzierten und nicht induzierten dritten Larven ausgew hlt um dessen Transkriptionsrate in den beiden Larvenpopulationen mit Hilfe der quantitativen real time PCR zu ermitteln 3 6 Parasitologisches Probenmaterial und dessen Aufbereitung 3 6 1 Etablierung eines Laborstammes Um ausreichende Mengen an parasitologischen Probenmaterial zu sichern wurde zu Beginn der Arbeit ein D viviparus Laborstamm etabliert Zu diesem Zweck wurde ein Kalb mit einer nat rlich erworbenen Lungenwurminfektion gekauft Die
205. ie Messung der optischen Dichte OD erfolgte mit einem Spektralphotometer AMERS HAM BIOSCIENCES bei einer Wellenl nge von 260 und 280 nm Eine OD260 von 1 ent spricht dabei einer Konzentration von 40 pg ml einzelstr ngiger RNA SAMBROOK et al 1989 Der Reinheitsgrad errechnet sich aus dem Verh ltnis der OD260 zur OD2 0 und betr gt bei einer reinen RNA L sung 2 Die mRNA wurde zur photometrischen Konzentrationsmes sung bei der Verwendung von Quarzk vetten 10fach bei Plastik Einwegk vetten 50fach mit DEPC Bidest verd nnt Nach der quantitativen Bestimmung wurde der mRNA 1 ul 40 U RNasin Ribonuclease Inhibitor PROMEGA zugef gt um eine Degradierung der mRNA zu vermeiden und sofort mit der Erststrang cDNA Synthese begonnen 66 Material und Methoden 3 7 3 cDNA Synthese 3 7 3 1 Erststrang cDNA Synthese Die Erststrang cDNA Synthese beruht auf der Fahigkeit der Reversen Transkriptase mRNA in einzelstrangige DNA umzuschreiben Als Primer dient bei dieser Reaktion ein Oligo dT Primer der selektiv an die Poly A Sequenz am 3 Ende der mRNAs hybridisiert Liegen sehr lange mRNA Sequenzen oder solche mit Sekund rstrukturen vor wird in der reversen Tran skription oftmals nicht die gesamte Sequenz umgeschrieben die Erststrang cDNA Synthese bricht vor dem 5 Ende auch nicht degradierter mRNAs ab Um m glichst viele cDNAs in voller L nge zu erhalten wurde f r die Durchf hrung der un ter Kapitel 3 8 beschriebenen Suppressi
206. ierten Pro 182 Diskussion ben lieferten erste Hinweise auf eine differentielle Gentranskription der L3ni und L3i Der Erwartung zufolge sollten sich die beobachteten Unterschiede im Zuge der Nested PCR ver st rken jedoch n herten sich die jeweiligen subtrahierten und nicht subtrahierten Proben in ihrem gelelektrophoretischen Bild einander an Dies k nnte durch eine Hintergrund Amplifikation wie sie oftmals bei der Verwendung mittels RT PCR synthetisierter cDNA auftritt bedingt sein DIATCHENKO et al 1999 Auch sind zu viele Suppression bzw Ne sted PCR Zyklen STEIN 2001 YOKOTA et al 2001 respektive ein unspezifisches Annealing mit nachfolgender Elongation der PCR Primer sowie nicht ligierter Adapter als m gliche Ursachen zu bedenken REBRIKOV et al 2000 Des Weiteren muss eine ungen gende Effizienz der Ligations oder subtraktiven Hybridisierungsreaktionen in Betracht gezo gen werden wobei erstere nach den Ergebnissen dieser Arbeit zumindest f r die Kontrolle humane Skelettmuskulatur sicher ausgeschlossen werden kann Gleiches gilt f r eine unge n gende Subtraktionseffizienz im Hinblick auf die beiden Larvenpopulationen der Durchf h rung 1 Bei dieser Durchf hrung ging jeweils die vierfache der im Protokoll angegebenen Drivermenge in die subtraktive Hybridisierungsreaktion ein Dahingegen war bei der Durch f hrung 2 die mit der empfohlenen Menge an Driver angesetzt wurde die Subtraktionseffi zienz nicht zufrieden ste
207. ierter Larven fest als bei relativ trocken kultivierten Larven Er bemerkte jedoch auch dass letztere Larven eine herabgesetzte Infekti sit t aufwiesen was die unterschiedlichen Ergebnisse der beiden Kultivierungsme thoden erkl ren k nnte 2 2 3 2 Immunit t des Wirtes Nach GIBBS 1986 basiert einer der zwei Hypobiosetypen auf immunologischen Vorg ngen EYSKER 1993 stellte fest dass bei permanent auf einer mit O ostertagi kontaminierten Weide grasenden K lbern bis zu 95 der gesamten O ostertagi Wurmb rde von inhibierten Stadien repr sentiert wurde Dahingegen waren bei K lbern die nur f r einen Zeitraum von 4 Tagen auf einer entsprechenden Weide grasten lediglich 2 bis 16 der Parasiten hypobio tisch Der Autor erkl rt den hohen Prozentsatz inhibierter Larven bei den permanent gewei deten K lbern mit der Entwicklung einer Wirtsimmunit t Auch bei t glicher Verabreichung einiger tausend 7 circumcincta Larven an L mmer entwickelten die Tiere eine Immunit t welche mit einem hohen Prozentsatz inhibierter Larven einherging GIBSON u EVERETT 1978 Nach MICHEL 1978 handelt es sich dabei jedoch um eine allm hliche Akkumula tion inhibierter Larven wohingegen adulte Stadien ber den Verlauf der Weidesaison verlo ren gehen Immunisierungsversuche mit D viviparus st tzten die Annahme der Immunit t als einen ausl senden Faktor der Hypobiose Bei immunen K lbern die nach Reinfektion keine Schrifttum 31 Larven a
208. iese Aktivit tsunterschiede k nnen als Erkl rung f r die differentielle Transkription des Paramyo sin Gens herangezogen werden Unterst tzend kommt hinzu dass beim Southern dot blotting der Klon L3ni 17 welcher Identit ten zu Troponin T Proteinen verschiedenster Organismen aufwies unter Verwendung der cDNA Sonde der L3ni ein deutlich st rkeres Signal als bei der L3i cDNA Sonde entstehen lie Troponin T bildet zusammen mit den Troponinen C und I einen Komplex welcher an die aus Aktin und Tropomyosin bestehenden d nnen Filamente 192 Diskussion der Muskeln bindet und deren Kontraktion ber die Freisetzung von Kalzium aus dem sar koplasmatischen Retikulum reguliert TERAMI et al 1999 Die nukle ren anchorage anc 1 Proteine von C elegans verankern Mitochondrien und den Zellkern in charakteristischer Position an den Aktinfilamenten des Zytoskeletts und verhin dern somit ein freies Umhertreiben im Zytoplasma HEDGECOCK u THOMSON 1982 STARR u HAN 2002 Die ungehemmten dritten D viviparus Larven welche eine L nge von 300 bis 400 um besitzen entwickeln sich im Wirt innerhalb von drei Wochen zu den 3 bis 8 cm langen Adulten BACINSKY 1973 Diese intensive Wachstumsphase der L3ni k nnte im Zusammenhang mit der Aufregulation der anc 1 Gentranskripte stehen da sie mit vielen Mitosen und somit neu zu verankernden Zellkernen und Mitochondrien einhergeht Bei C elegans wird das putative Protein bilateralen Ursprungs insbeson
209. ifizierung dieser Fragmente mittels spezifischer RT PCR misslang Bei dem frei lebenden Erdnematoden C elegans liegen bereits viele Erkenntnisse ber die genetische Regulation der Entwicklungshemmung vor GIBBS 1986 spekuliert dass der letztliche Stimulus f r die Ausl sung der Hypobiose in Analogie zu C elegans ein vom Para siten selbst produziertes Pheromon sein k nnte BURGLIN et al 1998 sieht in diesem Erd nematoden sogar einen Modellorganismus f r parasitische Nematoden und auch EYSKER 1997 h lt es f r lohnend bei parasitischen Nematoden nach der Existenz von Genen die bei C elegans in die Entwicklungshemmung involviert sind zu forschen und erhofft hieraus ei nen Erkenntnisgewinn ber die Entwicklung dritter parasitischer Stadien RICKLING 1999 untersuchte mit sequenzspezifischen Primerpaaren f r f nf Gene die bei C elegans in die Entwicklungshemmung involviert sind genomische DNA und cDNA Hypobiose induzierter und nicht induzierter dritter D viviparus Larven sowie eines nicht zur Hypobiose bef higten Vakzinestammes Bei einem Teil der Reaktionsans tze waren nach der anschlie enden Gele lektrophorese Amplifikationsprodukte feststellbar RICKLING 1999 h lt es daher f r m g lich dass die C elegans Gene f r welche ein Amplifikat erzeugt werden konnte auch im Genom der Lungenw rmer vorhanden sind Dies bedarf jedoch der weiteren berpr fung da die Amplifikate keiner weiteren Charakterisierung unterzoge
210. ignalintensit t es konnten keine zus tzlichen Klone mit positivem Hybridisierungsergebnis beobachtet werden Zur Ermittlung differentiell transkribierter Genfragmente folgte ein Einzelvergleich der Klone basierend auf der Signaldetektion nach 40 min tiger Filmexposition Hierbei wurden ausblei bende oder variierende Signalintensit ten eines Klons bez glich der vier verschiedenen Hy bridisierungssonden bewertet Dabei stellten sich 44 von insgesamt 104 Klonen 42 3 der subtrahierten L3ni cDNA Bank und 58 von den 105 Klonen 55 2 der subtrahierten L3i cDNA Bank als differentiell transkribiert dar Zwei solcher Klone sind in den Abb 23 bis 26 beispielhaft mit Kreisen gekennzeichnet Die ebenfalls auf den einzelnen Membranen befindlichen Negativkontrollen welche von den C1 und C2R DNAs repr sentiert wurden blieben auf allen Membranen negativ Die Positio nen der Negativkontrollen sind in den Abb 23 bis 26 welche die Hybridisierungsergebnisse nach 40 min tiger Filmexposition darstellen blau markiert 138 Klone der L3i cDNA Bank Klone der L3ni cDNA Bank Ergebnisse Abb 24 Chemilumineszente Detektion nach Einsatz der subtrahierten L3i cDNA als Hybridisierungssonde Klone der L3i cDNA Bank Klone der L3ni cDNA Bank Boe Br lt a a a lb nt e EA Abb 25 Chemilumineszente Detektion nach Einsatz der subtrahierten L3ni cDNA als Hybridisierungssonde Ergebnisse 139 Klone der L3i cDNA Ban
211. ilze aus in deren Sporangien sich die D viviparus Larven von basal einbohren um bei Licht und steigender Temperatur mit diesen Fruchtk r pern mehrere Dezimeter vom Kothaufen weggeschleudert zu werden DONCASTER 1981 Nach oraler Aufnahme werden die Lungenwurmlarven durch Kontakt mit der Gallenfl ssig keit des Wirtes aktiviert JORGENSEN 1973 Nach Verlust ihrer Scheiden durchdringen sie die D nndarmschleimhaut und gelangen ber das Lymphgef system zu den Mesenterial lymphknoten wo die H utung zur vierten Larve erfolgt JARRETT et al 1957 Diese er reicht ber den Ductus thoracicus sowie die Vena cava cranialis die rechte Herzkammer von wo aus der weitere Weg ber die Arteria pulmonalis zum Kapillargebiet der Lunge erfolgt Hier bohren sich die Larven in die Alveolen aus h uten sich zu geschlechtlich differenzierten pr adulten f nften Stadien und erreichen ungef hr eine Woche post infectionem p i die Bronchioli und Bronchien Es folgt eine intensive Wachstumsphase so dass drei bis vier Wo chen p i erste geschlechtsreife Lungenw rmer vorliegen wobei m nnliche Adulte 3 bis 4 cm weibliche 3 bis 8 cm lang sind BACINSKY 1973 Die Pr patenz betr gt somit drei bis vier Wochen die Patenz dauert etwa einen Monat J RGENSEN u OGBOURNE 1985 Die bereits embryoniert abgelegten Eier gelangen ber das Flimmerepithel der Trachea in den Pharynx und werden vom Wirtstier abgeschluckt ein geringer Teil wird auch mit dem Spu
212. im Kit enthaltenen G3PDH Primer BD CLONTECH mit folgender Sequenz verwendet daf 1 II for 5 TCG AAG AAA TGA TGA AGC 3 daf rev 5 GGA CGG AAG CTG CTA CAA 3 G3PDH 5 Primer 5 ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3 G3PDH 3 Primer 5 TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3 Abweichend vom Herstellerprotokoll wurde die Uberpriifung der Ligationseffizienz nicht nur mit den Tester cDNAs sondern auch der nicht subtrahierten TK bei folgendem Temperatur profil durchgef hrt und die Proben nach abgeschlossener Amplifikation gelelektrophoretisch analysiert initiale Denaturierung 94 C 30 Sekunden Denaturierung 94 C 10 Sekunden Primerannealing 65 C bei HSM Ansatz 1 bis 6 25x 57 8 C bei L3 Ansatz 1 bis 4 30 Sekunden 59 3 C bei L3 Ansatz 5 und 6 Primerextension 68 C 2 5 Minuten Material und Methoden 85 3 8 10 Erste subtraktive Hybridisierung Weisen die Tester eine zufrieden stellende Ligationseffizienz auf kann mit der subtraktiven Hybridisierung fortgefahren werden Hierbei wird jeder der zwei Testerpopulationen s Kapi tel 3 8 9 2 in einem separaten Ansatz nicht Adapter ligierte Driver cDNA im berschuss zugesetzt Obwohl gleiche Volumina an Tester und Driver vermischt werden ist ein Driver Uberschuss gegeben da vor der Adapterligation die unter 3 8 9 1 beschriebene sechsfache Verdiinnung der Tester cDNA mit Ampuwa erfolgte Bedingt durch die Kinetik der ersten subtraktiven Hybridisierungsreak
213. imer 1 sollte sichergestellt werden dass mindestens 25 der cDNAs der jeweiligen Ligationsansat ze an beiden 5 Enden Adapter tragen Sowohl bei Durchf hrung 1 als auch bei Durchf hrung 2 ergab sich folgendes Mit dem GSP rev und PCR Primer 1 erschienen bei der HSM cDNA drei statt der erwarteten einen Bande im Gel was auf einen unvollst ndigen Enzymverdau zur ckzuf hren war Diese Primerkombination ergab bei der Larven cDNA regelm ig einen Schmier mit darin erkennbaren Banden Die Amplifikation mit dem genspezifischen Pri merpaar lie erst nach Ablauf f nf weiterer PCR Zyklen ein im Gel sichtbares Produkt ent stehen nicht dargestellt Dabei erschien jedoch nicht nur eine Bande bei gut 200 bp wie sie in Vorversuchen erzielt wurde sondern ein multiples Bandenmuster Dieses entsprach dabei dem in Vorversuchen festgestellten Bandenmuster bei abgesenkter Annealingtemperatur Ins gesamt konnte bei allen analysierten Proben auf eine gute Ligationseffizienz geschlossen werden 2000 bp 800 bp 400 bp 200 bp M 1 2 3 45 61 23 4 5 612 3 45 6K L3i L3ni HSM Abb 19 Analyse der Ligationseffizienz 2 Yiges Agarosegel M Low DNA MASS Ladder 1 3 5 PCR Primer 1 und GSP rev 1 2 Adapter1 ligierte cDNA 2 4 6 GSP for und GSP rev 3 4 Adapter 2R ligierte cDNA K Negativkontrolle 5 6 Tester Kontrolle 130 Ergebnisse 4 3 7 Suppression PCR Bei erfolgreicher Unterdriickung der Amplifikation von Hybridmolekiilen mit i
214. inos uren eine 56 ige bereinstimmung 66 mit dem vermeintlichen Protein bilateralen Ursprungs von C elegans NP_491869 1 festgestellt werden Mit agCP10600 von Anopheles gambiae strain PEST EAA05528 1 bestand eine Teilidentit t von 44 65 ber 72 Aminos uren Weitere signifikante Identit ten wurden mit zwei G Protein gekoppelten Rezeptoren von Dro sophila melanogaster NP_569948 3 und NP_788854 1 ber eine Sequenzl nge von 63 A Ergebnisse 147 minos uren beobachtet von denen sich 41 69 identisch zeigten Mit zwei hypotheti schen Proteinen von Homo sapiens sowie einem unbenannten Protein von Mus musculus NP_ 060108 1 AAH02694 sowie BAB28536 1 konnte ber 64 Aminos uren hinweg eine Teilidentit t von 42 64 beobachtet werden Eine 80 ige bereinstimmung ber 122 der 414 Nukleotide des Inserts von Klon L3ni 67 herrschte mit dem essentiellen Gen anc 1 von C elegans NM _058952 1 welches f r insge samt drei verschiedene Protein Isoformen codiert Mit zwei dieser Isoformen n mlich einem Mitglied der nukle ren anchorage Proteinfamilie 1 sowie dem nukle ren anchorage Protein 1 NP_491353 1 sowie ANC1_CAEEL zeigte die in 93 Aminos uren bersetzte Insertsequenz eine 73 ige Teilidentit t 82 wobei sich diese ber 89 Aminos uren erstreckte Weiter hin bestand mit Nesprin 1 beta 2 von H sapiens AA027774 1 eine 64 ige bereinstim mung 79 in Bezug auf 39 Aminos uren Mit 29 weitere
215. ion of development of Ostertagia ostertagi effect of temperature on the infective larval stage Parasitology 85 27 32 SMITH C W J J G PATTON u B NADAL GINARD 1989 Alternative splicing in the control of gene expression Annu Rev Genet 23 527 577 SNOW M I u P L LARSEN 2000 Structure and expression of daf 12 a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans Biochim Biophys Acta 1494 104 116 240 Literaturverzeichnis SOLIMAN K N 1953 Migration route of Dictyocaulus viviparus and D filaria infective larvae to the lungs J Comp Path 63 77 86 SOMPAYRAG L S JANE T C BURN D G TENEN u K J DANNA 1995 Overcoming limitations of the mRNA display technique Nucleic Acids Res 23 4738 4739 STARR D u M HAN 2002 Role of ANC 1 in tethering nuclei to the actin Science 298 406 409 STEIN O D v 2001 Isolation of differentially expressed genes through subtractive suppression hybridization Methods Mol Biol 175 263 278 STEIN O D v W G THIES u M HOFMAN 1997 A high throughput screening for rarely transcribed differentially expressed genes Nucleic Acids Res 25 2598 2602 STROMBERG B E G A AVERBECK J F ANDERSON B W WOODWARD J CUNNINGHAM A BRAKE u T SKOGERBOE 1999 Comparison of the persistent efficacy of the injectable and pour on formulations of doramectin against artificially induced i
216. ird dieses Prinzip zur Ligation des Inserts genutzt 72 Material und Methoden Ein selektives Wachstum der Wirtszellen wird durch im Vektor enthaltene Gene fiir Ampicil lin und Kanamycinresistenz bedingt Die Selektion auf rekombinante Plasmide erfolgt durch das auf dem Vektor befindliche f r E coli letale control of cell death B ccdB Gen welches mit dem C Terminus des LacZa Fragments fusioniert ist Die Ligation eines Inserts unter bricht die Expression der LacZa ccdB Genfusion wodurch ein Wachstum der Wirtszellen mit rekombinanten Plasmiden erm glicht wird 3 7 8 2 Ligation Zu je 4 ul PCR Produkt wurden lul Salzl sung sowie 1 ul des Vektors pCR 4 TOPO hinzugef gt und dieser Ansatz f r 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert Nach Ablauf der Ligationsreaktion erfolgte eine K hlung auf Eis 3 7 8 3 Transformation Die im TOPO TA Cloning Kit for Sequencing INVITROGEN enthaltenen kompetenten E coli One Shot TOP10 Zellen dienten als Wirtszellen f r die rekombinanten Plasmide Um die Permeabilit t der Bakterienzellmembran zu erh hen und somit das Einschleusen des Vektors zu erleichtern wurden die Zellen starken Temperaturschwankungen ausgesetzt Nach Hinzuf gen der 6 ul Ligationsreaktion zu den Wirtszellen wurden diese f r 30 Minuten auf Eis inkubiert dann f r 30 Sekunden in ein 42 C warmes Wasserbad und anschlie end erneut auf Eis gehalten Um eine erste Zellvermehrung und die Expression der Antibiotika R
217. isch isolierter mRNA eingesetzt wurden Eine Degradation der mRNA welche der RACE zugrunde lag ist unwahrscheinlich da sich dieses Problem nur bei der L3ni 54 Sequenz ergab Einige der genspezifischen Primerpaare ergaben bei der gelelektrophoretischen Auftrennung zwei oder drei statt der erwarteten einen Bande Bei den hieraus erhaltenen Sequenzen waren im Alignment regelm ig eine oder mehr Sequenzl cken der sonst identischen Basenabfolgen zu beobachten Dieser Umstand der des fteren auch bei den RACE Sequenzen festgestellt werden konnte ist auf ein alternatives Splei en der mRNAs zur ckzuf hren welches in Ka pitel 5 5 4 diskutiert werden sollen 5 5 2 Rapid Amplification of cDNA Ends RACE Bei der Durchf hrung der RACE gestaltete sich insbesondere die 5 RACE als schwierig So waren wiederholte Versuche n tig um von allen differentiell transkribierten Genfragmenten Diskussion 185 ein Amplifikat zu erhalten welches die jeweils erwartete Mindestlange tiberschritt Als Ursa chen ftir diese Problematik sind neben degradierter mRNA vor allem sehr lange Transkripte und stabile Sekund rstrukturen infolge GC reicher Regionen am 5 Ende zu nennen wodurch sowohl die reverse Transkription als auch die nachfolgende Amplifikation beeintr chtigt wer den FROHMAN et al 1988 FROHMAN 1993 MATZ et al 1999 DAS et al 2001 Beim Identit tsvergleich mit den entsprechenden Insert Sequenzen der Klone waren insbe sondere
218. isierung bezeichnete Vorgang wird bei verschiedenen Verfahren zur Analyse differentieller Transkripte genutzt Die subtraktive Hybridisierung welcher eine Fragmentierung der Nukleins uren vorausgeht erm glicht die unmittelbare Konstruktion differentieller Banken aus genomischer DNA oder deren Transkripten ERMOLAEVA u SVERDLOV 1996 Die zu untersuchende DNA oder mRNA welche die differentiellen Targets beinhaltet wird dabei als Tracer oder Tester be zeichnet und mit dem so genannten Driver in welchem die entsprechenden Sequenzen nicht oder nur in geringerer Anzahl vorhanden sind hybridisiert Die Grundidee der subtraktiven Hybridisierung ist dass die Tester Sequenzen vorrangig mit dem im berschuss zugesetzten Driver reassoziieren Lediglich die Targets f r welche keine oder nur wenige komplement ren Sequenzen in der Driver Population vorhanden sind hybridisieren zwangsl ufig mit sich selbst oder verbleiben einzelstr ngig Zwei relativ neu entwickelte Techniken der subtraktiven Hybridisierung sollen in den folgenden Kapiteln n her beschrieben werden 2 4 2 1 Representational Difference Analysis RDA Die Representational Difference Analysis RDA wurde f r die Detektion von Unterschieden auf genomischer Ebene LISITSYN et al 1993 beschrieben und kurz darauf der Isolierung differentiell transkribierter Gene auf mRNA Ebene angepasst HUBANK u SCHATZ 1994 Die RDA basiert auf einer selektiven Amplifikation der Tester Sequenzen
219. iviparus Stadien aus der Lunge Kalb 1 und 2 wurden am 27 Tag post infectionem p i Kalb 3 am 42 Tag p i get tet und seziert um Luftr hre Lunge und Herz unverletzt zu entnehmen Bei Kalb 1 wurden Trachea und Bronchien mit einer Schere er ffnet die Parasitenstadien mit einer Pinzette entnommen und in ein Gef mit Leitungswasser berf hrt Im Gegensatz dazu wurde bei Kalb 2 und 3 nach Er ffnung der rechten Vorkammer ein an die Hauswasserleitung angeschlossener Schlauch 1 5 cm in die Arteria pulmonalis eingef hrt und u erlich fest fixiert Nach der Ligation der Vena pulmonalis wurde die Lunge mit ca 20 1 Leitungswasser perfundiert EYSKER et al 1990 die Sp lfl ssigkeit ber die Luftr hre durch ein Sieb mit 50 um Ma schenweite RETSCH geleitet und in einem entsprechend gro em Gef aufgefangen Die in dem Sieb zur ckgehaltenen Parasitenstadien wurden mit Leitungswasser aus dem Sieb ge sp lt und in ein Becherglas berf hrt Die Ausz hlung und Bestimmung erfolgte bei den durch Lungenperfusion erhaltenen Lun genwurmstadien mittels eines Stereomikroskops OLYMPUS bei zehnfacher Vergr erung die Vermessung erfolgte mit Hilfe eines Stereomikroskops mit Okularmikrometer ZEISS welches zuvor mit einem Objektmikrometer ZEISS geeicht wurde Zudem wurden die Para sitenstadien auf eventuelle Anlagen einer Bursa copulatrix untersucht die als Merkmal f r eine Differenzierung zum m nnlichen Geschlecht diente Mate
220. j hrlich stattfindenden saisonalen Entwicklungshemmung welche immer in derselben Jahreszeit auftritt Die Hypo biose stellt eine wichtige Uberlebensstrategie der Parasiten dar BLITZ u GIBBS 1972a da sie den Parasiten das Uberdauern f r sie ung nstiger Umweltbedingungen erm glicht um anschlie end die Entwicklung fortzusetzen sich zu reproduzieren und somit eine Verbreitung der Population von Jahr zu Jahr sicherzustellen GIBBS 1986 DAME et al 1993 EYSKER 1993 KOOYMAN u EYSKER 1995 GIBBS 1982 vermutet in der Hypobiose weiterhin die Strategie der Parasiten sich m glichst fr h und in gro er Zahl in neugeborenen Tieren anzusiedeln Geschieht dies fr h genug k nnte dies eine Immuntoleranz des Wirtes bedingen Dahingegen h tte die Aufnahme sehr vieler infekti ser Larven m glicherweise eine Immun paralyse des Neonaten zur Folge EYSKER et al 1994 stellten fest dass vor allem ltere Rinder inapperent mit inhibierten Lungenwurmstadien infiziert sind Reifen diese zu adulten sich reproduzierenden Parasiten erfolgt die Larvenausscheidung ohne klinische Symptome Diese unerkannten Ausscheider kontaminieren die Weidefl chen und stellen eine enorme Gef hrdung empf nglicher Jungtiere dar Die Entwicklungshemmung in deren Folge infizierte Tiere als Carrier fungieren spielt somit eine bedeutsame Rolle in der Epidemiologie parasitischer Nematoden EYSKER 1993 EYSKER et al 1994 KOOYMAN u EYSKER 1995 2 2 2 Morphologie inhi
221. k Klone der L3ni cDNA Bank g _ ese S F e Eo gt se fe ee eN Se G se ee 0 bee 0 s Abb 26 Chemilumineszente Detektion nach Einsatz der L3i Tester Kontrolle als Hybridisierungsonde Klone der L3i cDNA Bank Klone der L3ni cDNA Bank Abb 27 Chemilumineszente Detektion nach Einsatz der L3ni Tester Kontrolle als Hybridisierungsonde 140 Ergebnisse 4 7 Verifizierung differentiell transkribierter Sequenzen 4 7 1 Synthese DIG markierter cDNA Sonden der L3ni und L3i Die Synthese der Sonden aus frisch isolierter mRNA der L3ni und L3i geschah im Rahmen der LD PCR fiir welche 24 PCR Zyklen als optimal ermittelt wurden Nach der DIG Markierung wurden die beiden cDNA Sonden auf ein 1 2 iges Agarosegel aufgetragen wo bei sich unter UV Beleuchtung jeweils ein Schmier im Bereich von ca 200 bp bis 4000 bp darstellte 4 7 2 Restriktionsenzymspaltung der DIG cDNA Sonden Im Anschluss an die Restriktionsenzymspaltung mit Rsal zeigte sich nach der Gelelektropho rese im 1 5 igen Agarosegel bei den verdauten Proben im Gegensatz zu den unverdauten Proben eine Intensit tszunahme des Schmier s im Bereich von ca 150 bp bis 500 bp Des Weiteren konnten zwei Banden die in der unverdauten L3ni cDNA sichtbar waren nicht mehr lokalisiert werden Die zur berpr fung der Enzymaktivit t eingesetzten Kontrollans t ze mit zugef gter Plasmid DNA wiesen jeweils drei Banden der er
222. l ren ob die verst rkte Transkription bestimmter L3i assoziierter Gene ausschlie lich auf einem Energie mangel dieser Larvenpopulation beruht 5 7 berpr fung der differentiellen Transkription mittels konventioneller PCR Mit je f nf verschiedenen Templates der L3ni und L3i wurde unter Verwendung der jeweili gen genspezifischen Primerpaare die differentielle Transkription der vervollst ndigten Gense quenzen berpr ft Die deutlichsten Unterschiede in der Bandenintensit t oder gar fehlende Banden in der Driver cDNA wiesen dabei neben der Sequenz L3i 88 die Sequenzen L3ni 69 92 L3i 82 101 und L3i 99 auf Daher erscheint es folgerichtig dass diese Sequenzen Diskussion 199 in den subtrahierten cDNA Banken von jeweils zwei respektive drei L3i 99 18 86 vollstan dig oder teilweise identischen Inserts repr sentiert werden Diese Untersuchung deutet ferner auf ein differentielles Vorkommen verschiedener Isoformen in den beiden Larvenpopulationen hin So konnte die entsprechende Bande der L3ni 56d Isoform regelm ig unter Verwendung von L3i cDNA amplifiziert werden wohingegen dies mit L3ni cDNA nur in einem Fall gelang Bei der L3i 75 zeigte sich stets ein vermehrtes Vor liegen der Isoform L3i 75a in der cDNA inhibierter Larven wohingegen die Isoform L3i 75b nicht konstant Unterschiede in der Bandenintensit t bez glich des L3i bzw L3ni Templates erkennen lie Ferner war die Isoform L3i 88a die einzige welche bei einigen
223. lationen auf Da jedoch beim Differential Screening nur geringf gige Differenzen festgestellt werden konnten wurde dieser Klon nicht weiter verfolgt 4 8 3 1 Mittels TBLASTX festgestellte Homologien Bei den im Folgenden beschriebenen Inserts konnten erst mit Hilfe des TBLASTX signifikan ten Homologien festgestellt werden da sich vor Beginn der homologen Aminos uresequenz ein Stopcodon befand Daraufhin erfolgte eine weitere Sequenzbearbeitung mit dem Align Plus Programm Die hinter dem jeweiligen Stopcodon befindliche Aminos uresequenz wurde nachfolgend mittels dem BLAST search for short nearly exact matches sowohl in ihrer Gesamtheit als auch ab dem ersten Methionin dem potentiellen Startcodon mit den publizier ten GenBank Sequenzen verglichen Die hierbei beobachteten signifikanten bereinstim mungen sind nachfolgend in numerischer Reihenfolge der Klone beschrieben Der Klon L3i 53 besa ein 621 bp langes Insert welches in 111 Aminos uren translatiert werden konnte Dieses zeigte sich ber 62 Aminos uren zu 58 identisch 77 mit einer Glycerol Kinase von C elegans NP_494721 1 Mit einer solchen von D melanogaster NP_524655 1 bestand ber einen Bereich von 72 Aminos uren eine 40 ige bereinstim mung 50 Weitere signifikante Identit ten mit Glycerin Kinasen anderer Organismen wie H sapiens oder Streptomyces avermitilis werden an dieser Stelle nicht weiter beschrieben Erfolgte der Sequenzidentit tsverg
224. leich ab dem ersten Methionin mit nur 72 Aminos uren umfasste der Teilidentit tsbereich mit der oben genannten Glycerin Kinase von C elegans nur noch 40 Aminos uren von denen 55 80 identisch waren Die Identit ten mit den anderen oben genannten Proteinen gen gten nicht mehr den an eine Signifikanz gestellten Anforderungen 150 Ergebnisse Das 475 bp lange Insert des Klons L3i 75 wurde in 156 Aminos uren bersetzt Mit einer Kalzium unabh ngigen Phospholipase Az von C elegans NP_500969 1 herrschte eine Teil identit t von 67 77 ber 120 Aminos uren Uber 129 Aminos uren erstreckte sich die 48 ige bereinstimmung 61 mit ENSANGP00000022338 von A gambiae XP_319089 1 Mit einer Kalzium unabh ngigen Phospholipase A von H sapiens BAA94997 1 bestand eine Teilidentit t von 44 56 ber einen Bereich von 146 Ami nos uren Die beschriebenen Ergebnisse wurden dabei nicht beeinflusst wenn der Sequenz identit tsvergleich erst ab dem ersten Methionin 129 Aminos uren erfolgte Weitere signifi kante Homologien werden an dieser Stelle nicht weiter aufgef hrt Der Klon L3i 100 beinhaltete ein 698 Nukleotide umfassendes Insert translatiert ergaben sich 180 Aminos uren auf die ein Stopcodon folgte Somit lag bereits die gesamte Sequenz des Proteins vor Sowohl mit der gesamten Aminos uresequenz als auch ab dem ersten Methionin 169 Aminos uren konnte eine ber 181 Aminos uren bestehende 61 ige 69 Id
225. leitung 13 1 Einleitung Der gro e Lungenwurm Dictyocaulus viviparus ist neben Ostertagia ostertagi und Cooperia oncophora weltweit in den gem igten Klimazonen der wirtschaftlich bedeutsamste Parasit der Rinder Die durch diesen Nematoden verursachte Erkrankung die parasit re Bronchitis geht mit Entwicklungsst rungen und h ufig sogar dem Tod infizierter Tiere einher Insbeson dere in endemischen Gebieten erleiden landwirtschaftliche Betriebe erhebliche Produktions einbu en da trotz vielf ltiger Bek mpfungsm glichkeiten Verluste nicht immer vermieden werden k nnen Die F higkeit des Parasiten seine Entwicklung im Wirt zu unterbrechen wenn f r die frei lebenden wenig resistenten larvalen Stadien lebensfeindliche Umweltbedingungen herrschen ist von gro er epidemiologischer Bedeutsamkeit W hrend dieser Zeit n mlich den Winter monaten auf der n rdlichen Halbkugel persistieren die entwicklungsgehemmten pr adulten Stadien in der Lunge ohne dass die betroffenen Tiere klinische Symptome zeigen oder Lar ven ausscheiden Nach der Weiterentwicklung zu adulten sich reproduzierenden Parasiten scheiden die infizierten Tiere im Fr hjahr wiederum ohne sichtbare Krankheitsanzeichen Lar ven aus kontaminieren die Weidefl chen und stellen somit eine enorme Gefahr f r empf ng liche Jungtiere dar Diese unerkannten Ausscheider bei welchen es sich in erster Linie um ltere Rinder handelt gelten als Hauptverbreitungsquelle der L
226. len sp ter Banden im Gel erscheinen Im Idealfall erfolgt dieser Vergleich mit einem nicht differentiell transkribierten Gen beispielsweise einem Haushaltsgen sowie einem differentiell transkribierten Gen Da bei D viviparus weder Se 88 Material und Methoden quenzen von Haushaltsgenen noch differentiell transkribierten Genen publiziert waren erfolg te die Amplifikation unter Verwendung des mittels Lasergene DNASTAR ausgew hlten Primer daf 11 for sowie dem Primer daf 1 rev nach RICKLING 1999 daf I for 5 ACG CGT TTA GCA CTA CTG GTT GT 3 daf rev 5 GGA CGG AAG CTG CTA CAA 3 In der PCR Analyse der Subtraktionseffizienz dienten die Nested PCR Produkte der L3ni und L3i als Template da aus diesen im weiteren Verlauf der Arbeit die subtrahierten cDNA Banken entstehen und sie zudem als Sonde im Differential Screening Verwendung finden sollten Um sicherzustellen dass die Nested PCR Produkte der subtrahierten cDNAs und der nicht subtrahierten Tester Kontrollen der L3ni respektive L3i ann hernd gleiche cDNA Konzentrationen aufwiesen erfolgte vor dem Einsatz als Matrize eine quantitative Bestim mung mit jeweils 10fach verd nnten Nested PCR Produkt und anschlie endem Konzentrati onsausgleich Die PCR lief bei folgendem Temperaturprofil ab Denaturierung 94 C 30 Sekunden 18x Primerannealing 56 C 30 Sekunden Primerextension 68 C 2 Minuten Nach diesen 18 Zyklen wurde von jeder Probe ein 5 ul Aliq
227. lidentit t von 68 86 mit einem puta tiven Protein von C elegans NP_492899 1 Der Klon L3ni 51 besa ein 684 Nukleotide umfassendes Insert Dieses war auf einer L nge von 53 bp zu 88 identisch mit der mRNA f r einen Vorl ufer eines exkretier ten sezernierten Proteins sowie einem Cosmid von C elegans NM_070441 1 bzw CEY73F8A Mit denselben Sequenzen bestand des Weiteren eine 85 ige bereinstimmung ber 49 bp hinweg Die genannten Identit ten bezogen sich bei dem Cosmid auf den Folge strang Auf Aminos ureebene zeigte dieser Klon ber eine 212 Aminos uren umfassende Teilsequenz der insgesamt 227 Aminos uren eine 64 ige Identit t 75 mit dem Vorl ufer eines exkretierten sezernierten Proteins von C elegans NP_502842 1 Mit dem multidrug Resistenzprotein mrp 3 von C elegans NP_510616 1 wies die in 199 Aminos uren translatierte Insertsequenz des Klons L3ni 54 welche aus 599 bp bestand eine Teilidentit t von 59 78 ber 188 Aminos uren auf Mit der Sequenz mrp 4 desselben Organismus NP_509658 1 waren von 208 Aminos uren 46 identisch 63 Weitere signifikante bereinstimmungen mit multidrug Resistenzproteinen auch anderer Organismen sowie ABC Transportern oder ATP bindenden Kassetten werden an dieser Stelle nicht weiter aufgef hrt Der Klon L3ni 56 beinhaltete ein aus 602 Nukleotiden bestehendes Insert welches in 107 Aminos uren bersetzt wurde Dabei konnte ber einen Bereich von 87 Am
228. ll vorhandene Genhomologe berpr ft Hierzu kamen insgesamt 35 verschiedene genspezifische Primerpaa re f r zw lf daf Gene und das age 1 Gen welche bei C elegans in die genetische Steuerung der Hypobiose involviert sind zum Einsatz Vier dieser Primerkombinationen verwendete bereits RICKLING 1999 zur Kl rung dieser Fragestellung allerdings wurden die erhaltenen Amplifikate nicht eingehender untersucht Mittels der durchgef hrten PCRs konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit mit s mtlichen Primerpaaren Amplifikate erzeugt werden allerdings trat nur bei Verwendung der daf 1 Pri merkombination eine singul re Bande der erwarteten L nge im Agarosegel auf Ebenso stellte RICKLING 1999 bei Verwendung genomischer DNA adulter Lungenw rmer sowie cDNA von L3ni L3i und eines nicht zur Hypobiose f higen Vakzinestammes eine Bande im selben Gr enbereich fest Auch konnte RICKLING 1999 bei Verwendung der Primerkombination daf 4 und age 1 jeweils eine einzelne Bande der erwarteten Fragmentl nge beobachten wo hingegen die Amplifikation mit dem Primerpaar daf 3 misslang Im Gegensatz dazu entstand in der vorliegenden Arbeit mit diesen drei Primerkombinationen ein multiples Bandenmuster RICKLING 1999 spekuliert dass bei D viviparus bez glich daf 1 und daf 4 hnliche Ver h ltnissen wie bei C elegans bestehen k nnten und sieht des Weiteren Hinweise auf ein Vor liegen des age 1 Gens im Genom des Parasiten Jedoch konnten in der vo
229. llend Diese Durchf hrung wies bereits bei der Suppression und Nested PCR weniger deutliche Unterschiede zwischen den subtrahierten und nicht subtrahier ten Proben auf Im Zuge dieser Arbeit stellte sich somit das im Herstellerprotokoll vorgesehe ne Verh ltnis von Tester und Driver als nicht ausreichend f r eine effiziente Subtraktion her aus 5 3 Subtrahierte cDNA Banken Die mit der L3ni cDNA erstellte subtrahierte cDNA Bank wurde von 104 Klonen die der L3i von 105 Klonen repr sentiert wobei die Inserts der jeweiligen Banken eine L nge von 200 bp bis 2200 bp aufwiesen Diese durch die Restriktionsenzymspaltung mit Rsal bedingte Gr Benverteilung entspricht im Wesentlichen dem von YOKOTA et al 2001 angegebenen Be reich von 100 bp bis 2000 bp Dahingegen stellten YANG et al 1999 eine durchschnittli chen Insertl nge von lediglich 50 bp bis 1000 bp fest Die im Rahmen dieser Arbeit erstellten subtrahierten CDNA Banken beinhalteten nur sehr wenige Klone mit einer L nge von weniger Diskussion 183 als 500 bp was die Beobachtung von SCHNEIDER et al 2001 hinsichtlich einer Bevorzu gung langerer differentiell transkribierter Fragmente durch die SSH zu bestatigen scheint 5 4 Differential Screening und Southern dot blotting Da die mittels der SSH Technik erstellten subtrahierten cDNA Banken immer auch eine ge wisse Anzahl an falsch positiven Klone enthalten ist ein Screening dieser Banken unerlass lich YE u CONNOR 200
230. meisten mRNAs von verschiedensten Nematoden an geh ngt BLAXTER u LIU 1996 Das Vorkommen der SL1 Sequenz bei D viviparus ist bislang allerdings nicht belegt Die SL1 PCR wurde unter Verwendung der jeweiligen mit dem 5 RACE CDS Primer gene rierten L3i und L3ni Erststrang cDNAs Isolierung 3 durchgef hrt Als Primer dienten ne ben den entsprechenden genspezifischen R ckw rtsprimern SL1 GSP s 3 13 1 und 9 1 der untenstehende SL1 Primer dessen Sequenz der Literatur entnommen wurde TAKACS et al 1988 SLI Primer 5 GGT TTA ATT ATC CCA AGT TTG AG 3 Der 50 ul Reaktionsansatz enthielt folgende Komponenten 5 ul 10x Advantage 2 PCR Puffer 1 ul SL1 GSP 50 uM 1 ul SL1 Primer 50 uM 1 ul dNTP Mix je 10 mM l ul Advantage II Polymerase Mix 2 5 ul doppelstr ngige cDNA der L3ni bzw L3i Die PCR lief bei folgendem Temperaturprofil ab initiale Denaturierung 94 C 1 Minute Denaturierung 94 C 20 Sekunden 40x Primerannealing 62 C 20 Sekunden Primerextension 72 C 3 Minuten finale Extension 72 C 7 Minuten 110 Material und Methoden Nach der Amplifikationsreaktion erfolgte eine gelelektrophoretische Analyse wobei die ent standenen Banden ausgeschnitten und anschlieBend kloniert und sequenziert wurden s 3 7 7 bis 3 7 10 3 14 berpr fung differentiell transkribierter Sequenzen mittels konventioneller PCR Die mit Hilfe der bisher angef hrten Verfahren als differ
231. men und diese wieder in den Thermocycler verbracht Nach Material und Methoden 69 dem die Testans tze drei weitere der unten aufgef hrten PCR Zyklen durchlaufen hatten wurden wiederum 15 ul abgenommen und dieses Vorgehen noch zweimal wiederholt Von den 15 ul Aliquots der 15 18 21 und 24 durchlaufenen Zyklen wurden jeweils 5 ul auf ein Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt initiale Denaturierung 95 C 1 Minute Denaturierung 95 C 15 Sekunden 15 bzw 3x Primerannealing 65 C 30 Sekunden Primerextension 68 C 6 Minuten 3 7 4 Primerdesign Um die gew nschte Amplifikation zu erzielen sollten die Oligonukleotide welche der Poly merase als Primer dienen bestimmten Anforderungen gen gen Die Primerl nge betr gt im Regelfall 18 bis 24 Nukleotide bei einem Guanosin G Cytosin C Gehalt von 40 bis 60 Am 3 Ende der Primer sollten ein oder zwei G bzw C platziert sein um eine bessere Bindung zu gew hrleisten Befinden sich dort jedoch mehr als drei G oder C werden fehl hybridisierende Primer stabilisiert Um diese Fehlhybridisierungen zu vermeiden sollten Pri mer auch nicht mehr als vier gleiche Basen hintereinander enthalten Ferner ist darauf zu ach ten dass Vorw rts und R ckw rtsprimer keine komplement ren Sequenzen insbesondere am 3 Ende aufweisen da sonst Primerdimere entstehen Auch sollte ein Primer nicht selbst komplement r sein und somit interne Sekund rstruktu
232. miert wird eine Schl sselrolle einnehmen GERISCH et al 2001 JIA et al 2002 In Vertebraten konnte gezeigt werden dass die neu ronale Expression dieser Cytochrome der Synthese von Steroiden dient JIA et al 2002 und GERISCH et al 2001 schlie en aus ihren Untersuchungen dass Cholesterol den Vorl ufer f r das Substrat von daf 9 darstellt und dieses Gen daher in die Synthese des daf 12 Liganden involviert ist oder einen Liganden f r einen anderen nukle ren Rezeptor bereitstellt welcher als Transkriptionsrepressor und auch Partner der verschiedenen daf 12 Isoformen fungiert Schrifttum 41 Wie die drei Signalkaskaden letztlich die inhibierte oder normale Larvenentwicklung bedin gen ist noch nicht vollst ndig gekl rt Bei Wirbeltieren wird das Zusammenspiel der Signale von TGF und Vitamin D Rezeptoren ber Smad Proteine vermittelt welche als Liganden abh ngige Koaktivatoren der Vitamin D Rezeptoren fungieren Alternativ k nnten die drei Signalwege einzeln oder in Kombination die Biosynthese oder Verf gbarkeit lipophiler Hor mone kontrollieren die den daf 12 Rezeptor Transkriptionskomplex aktivieren ANTEBI et al 2000 Daf r spricht dass sowohl der daf 2 Insulin IGF 1 als auch der daf 4 Typ II TGF Rezeptor den Metabolismus und die inhibierte Entwicklung cell nonautonomously also ber ein sekund res Signal vermitteln APFELD u KENYON 1998 WOLKOW et al 2000 INOUE u THOMAS 2000b Dieses k nnte daf 9 ge
233. mit tels BLASTP die bereinstimmungen sp testens ab der 31 Aminos ure der jeweiligen homo logen Proteine Ferner entspricht deren L nge in etwa den translatierten Aminos uresequen zen der differentiellen Gentranskripte Auch bez glich der L3i 18 86 welche im BLAST kei ne signifikanten Homologien aufwies kann von einer vollst ndig vorliegenden cDNA Sequenz ausgegangen werden 186 Diskussion Im Fall der L3ni 22 bestand das 3 RACE Produkt stets aus 447 Nukleotiden welches nach 193 bp nicht mehr mit der Insert Sequenz des Klons L3ni 22 tibereinstimmte Wurde die 3 RACE Sequenz an das cDNA Fragment des Klons angef gt zeigte sich im BLASTP mit dem homologen Protein eine h here bereinstimmung ber einen zudem l ngeren Teilbe reich Da der translatierte Leserahmen der L3ni 22 Sequenz nun auch ein Stopcodon enthielt ergab sich ferner eine nahezu identische L nge der Aminos uresequenz 206 aa mit der des homologen Proteins 202 aa Daher konnte davon ausgegangen werden dass diese mit dem Poly A Ende erstellte Sequenz der L3ni 22 den wirklichen Verh ltnissen entsprach Das fal sche 3 Ende der Insert Sequenz beruht vermutlich auf einer Fehlhybridisierung mit nachfol gender Extension w hrend einer der vielen Amplifikationsreaktionen die zur Erstellung der subtrahierten cDNA Banken erforderlich waren Es gelang jedoch nicht alle Genfragmente mittels der RACE und SL1 spezifischen PCR zu komplettieren So zeigten die L
234. mplifikation der Erststrang cDNAs die auch in der RACE s 3 13 3 als Matrize eingesetzt wurden Bei der Verwendung der 5 RACE cDNA als Templa te welche aus der mRNA der f nften Isolierung synthetisiert wurde wurden die Reaktionen wie oben beschrieben angesetzt und durchliefen anschlie end das Temperaturprofil der in Kapitel 3 13 2 aufgef hrten Touchdown PCR Der dritte Zyklenabschnitt wurde jedoch 25 mal durchlaufen so dass insgesamt 35 Zyklen resultierten Eine weitere Reaktion wurde als 50 ul Ansatz mit entsprechend auf 5 ul erh htem Volumen an 10x Advantage 2 PCR Puffer und 30 Zyklen in der Touchdown PCR durchgef hrt In die genspezifische Amplifikation der 3 respektive 5 RACE cDNA generiert aus der mRNA der Isolierung 3 ging jeweils ein 50 ul Reaktionsansatz mit 1 5 ul L3ni respektive L3i Template ein Die Amplifikation erfolgte wiederum als Touchdown PCR mit insgesamt 30 Zyklen 3 15 Quantitative real time PCR qPCR Mit ausgew hlten differentiell transkribierten Sequenzen der Hypobiose induzierten und nicht induzierten dritten D viviparus Larven wurde eine quantitative real time PCR qPCR zur Ermittlung der Transkriptionsrate in den beiden Larvenpopulationen auf der Grundlage von Erststrang cDNA durchgef hrt In der qPCR erfolgt in einem geschlossenen Gef wodurch die Kontaminationsgefahr deut lich gesenkt wird neben der Amplifikation auch eine Detektion und Quantifizierung von Nukleins uren Detektion
235. n zeigen eine unterschiedliche Anpassung an ihre Wirte welche sich unter anderem durch die Ausbildung einer patenten Infektion u ert Diese erfolgt bez g lich D arnfieldi erheblich h ufiger im Esel als im Pferd HASSLINGER 1989 f r D vivipa rus ist das Rind empf nglicher als die Wildwiederk uer KUTZER 1988 BIENIOSCHEK 1994 2 1 2 Verbreitung und wirtschaftliche Bedeutung D viviparus ist weltweit in Gebieten gem igten Klimas verbreitet in denen zumindest zeit weise Temperaturen zwischen 15 C und 20 C herrschen SCHNIEDER 2000 Nach serolo 16 Schrifttum gischer Untersuchung von 258 nieders chsischen Herden ersts mmriger Rinder konnten SCHNIEDER et al 1993 eine Seropr valenz von knapp 40 feststellen In Schleswig Holstein wurden im Rahmen einer parasitologischen Sektion bei gut 73 der insgesamt 15 Jungbullen Lungenw rmer nachgewiesen REHBEIN et al 2003 Niederl ndische Untersu chungen ergaben dass mehr als 75 der 123 untersuchten Herden seropositiv reagierten BOON et al 1986 In England traf dies auf 66 von insgesamt 32 Rinderherden BAIN u SYMINGTON 1986 in Schweden auf 80 der 15 untersuchten Betriebe zu HOGLUND et al 2001 In endemischen Gebieten erlangt die Diktyokaulose gro e wirtschaftliche Bedeutung da sie hier zur wichtigsten Mortalit tsursache bei Weiderindern werden kann JARRETT et al 1954 Aber auch in Gebieten mit geringerer Inzidenz ergeben sich f r landwirtschaftlic
236. n Aminos uren konnte eine 44 ige Teilidentit t 62 beobachtet werden Gleiche Identit ts und hnlichkeitsverh lt nisse zeigten sich mit der Nesprin 1 Isoform beta von H sapiens z B NP_056108 1 Weite re signifikante Identit ten werden an dieser Stelle nicht weiter aufgef hrt Der Klon L3ni 69 welcher ein mit dem Klon L3ni 92 identisches Insert von 417 Basenpaaren enthielt zeigte auf einer Lange von 37 respektive 41 Nukleotiden eine 94 ige bzw 90 ige bereinstimmung mit der mRNA Sequenz f r die Superoxiddismutase von H contortus Z69630 1 Auf Aminos ureebene waren 104 der bersetzen 105 Aminos uren zu 75 85 identisch mit der extrazellul ren Superoxiddismutase von H contortus CAA93449 1 Die gesamte translatierte Aminos uresequenz stimmte zudem zu 65 83 mit einer Supe roxiddismutase von C elegans NP_4999091 1 berein Weitere Identit ten mit Su peroxiddismutasen von C elegans und anderen Organismen wie D melanogaster werden hier nicht weiter angef hrt Das Insert des Klons L3i 10 bestand aus 827 Nukleotiden welche in 273 Aminos uren ber setzt werden konnten Diese ergaben eine 40 ige bereinstimmung 51 auf einer L nge von 259 Aminos uren mit einem putativen Protein von C elegans NP_506141 1 Mit der mRNA Sequenz eines putativen Proteins sowie einem Cosmid von C elegans NP_075530 1 sowie CEF53H2 wies das 756 bp lange Insert des Klons L3i 33 Identit ten 148 Ergebnisse
237. n Protein bilateralen Ursprungs L3ni 56 und einem weiteren putativen Protein L3ni 22 auf Im Gegensatz zu den Ergebnissen dieser Arbeit wird bei C elegans die zu D viviparus homo loge extrazellul re Kupfer Zink sowie eine mitochondriale Mangan Superoxiddismutase SOD in verst rktem Ma e in der dauer larva transkribiert LARSEN 1993 TAWE et al 1998 JOHNSON 2001 JONES et al 2001 Diese Tatsache k nnte mit der Funktion der SOD n mlich der Umwandlung von Superoxid zu molekularem Sauerstoff und Hydrogenpe roxid und damit dem Schutz des Organismus vor Sch den durch freie Sauerstoffradikale er kl rt werden Als Hauptquellen f r die Entstehung dieser Oxidantien gelten die mitochondria le Respiration sowie aktivierte Phagozyten HADAS u STANKIEWICZ 1998 GEMS 1999 Diskussion 191 Bei der C elegans dauer larva wirkt die gesteigerte Aktivit t dieser Superoxiddismutasen einer oxidativen Sch digung entgegen und erm glicht so den nicht alternden Status LAR SEN 1993 TAWE et al 1998 Allerdings werden die intrazellul re Kupfer Zink und eine weitere Mangan SOD in der C elegans dauer larva nicht verst rkt transkribiert JOHNSON 2001 Bei parasitischen Nematoden hingegen dient die SOD der Abwehr der im Zuge des oxidative burst von den Phagozyten freigesetzten Sauerstoffradikalen Die sezernierte SOD wird daher auch als immune defense protein bezeichnet CALLAHAN et al 1990 BROPHY et al 1995 und spielt eine wic
238. n Samson Himmelstjerna sei herzlich f r alle fachlichen Anregungen und Hilfestellungen die fruchtbaren Diskussionen und f r sein Einf hlungsverm gen ge dankt Frau Sandra Buschbaum danke ich f r die geduldige Einarbeitung ihre unerm dliche Hilfsbe reitschaft und Motivation Auch sei Frau Ursula K ttler f r ihre helfenden H nde unter ande rem beim Sammeln der Luwus gedankt Beiden danke ich weiterhin ganz herzlich f r die vielen pers nlichen Gespr che und die freundschaftliche Atmosph re Frau Meike Stoverock danke ich f r die vielen fachlichen und pers nlichen Diskussionen und ihre Freundschaft beim Durchleben von H hen und Tiefen Den Doktoranden des Instituts f r Parasitologie Frau Dr Friederike Kr mer und Herrn Dr Christian Epe sei f r die vielen Gespr che und das fast immer erfolgreiche Bem hen mich auch an einem schwarzen Tag zum Lachen zu bringen gedankt Frau Katrin zum Felde danke ich ganz herzlich f r ihre Hilfe bei der Literaturbeschaffung und die Einweisung in den Reference Manager All meinen Freunden danke ich f r das Verst ndnis f r Zeitmangel in hei en Phasen das Beistehen in dunkelsten Momenten und f r die unbeschwerten Zeiten voller Spa Ganz besonders danke ich meinen Eltern und Geschwistern f r ihre Liebe ihren R ckhalt ihre Unterst tzung in allen Lebensbereichen und so viel mehr Ohne Euch w ren manche T ler tiefer gewesen
239. n wurden 34 Schrifttum 2 3 Entwicklungshemmung bei C elegans Bei dem frei lebenden Erdnematoden C elegans ist viel ber die genetische Regulation der Entwicklungshemmung bekannt Auf Grund der Vielzahl an Genen die bei C elegans in den hypobiotischen Prozess involviert sind soll im Folgenden nur auf die daf Gene n her einge gangen werden welche eine wichtige Rolle in der Regulation der Larvenentwicklung spielen und unter anderem in drei Signalkaskaden involviert sind Durch Studien an Mutanten konn ten die daf Gene in zwei generelle Klassen eingeteilt werden Die daf d dauer formation de fective Mutanten sind nicht zur Entwicklungshemmung bef higt GOLDEN u RIDDLE 1984a Im Gegensatz dazu entwickeln sich die daf c dauer formation constitutive Mutanten unabh ngig von ausl senden Faktoren zu inhibierten Stadien SWANSON u RIDDLE 1981 GOLDEN u RIDDLE 1984a Bei geringer Populationsdichte erreicht C elegans innerhalb von drei Tagen nach dem Schlupf ber vier larvale das adulte Stadium Jedoch kann sich mit der zweiten H utung ein fakultatives juveniles Stadium die so genannte dauer larva entwickeln Diese Formation ist eine Antwort auf berbev lkerung und wird durch ein vom Nematoden produziertes Phe romon induziert dessen Sekretion mit zunehmender Populationsdichte steigt Modulierend wirken Nahrungsangebot und Umgebungstemperatur F rdernd sind dabei Temperaturen ber 22 C und ein Mangel an ubiquit ren Bakt
240. nahmen Anthelminthika Vakzinierung Biologische Bek mpfung 2 2 Hypobiose 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 2 3 1 2 2 3 2 22 3 3 2 2 3 4 2 2 3 5 Funktion der Hypobiose Morphologie inhibierter D viviparus Larven Regulation der Hypobiose bei parasitischen Nematoden Klimatische Einfl sse Immunitat des Wirtes Altersresistenz des Wirtes Infektionsdosis Genetische Determination 2 3 Entwicklungshemmung bei C elegans 2 3 1 23 2 23 3 23 31 2 3 3 2 2 3 3 3 2 3 4 23 3 Besonderheiten der dauer larva Chemosensorische Kontrolle der Larvenentwicklung Signalkaskaden zur Regulation der Larvenentwicklung Signalweg ber zyklisches Guanosinmonophosphat cGMP Insulinartige Signalkaskade Transforming Growth Factor TGF B Signalweg Zielpunkt der Signalkaskaden Homologe von daf Genen bei parasitischen Nematoden 2 4 Ermittlung differentiell transkribierter Gene 2 4 1 2 4 1 1 2 4 1 2 2 4 1 3 2 4 2 2 4 2 1 2 4 2 2 2 4 2 3 Fingerprinting Verfahren Differential Display DD RNA Arbitrarily Primed PCR RAP PCR Vorz ge und Limitierungen der Fingerprinting Verfahren Subtraktive Hybridisierungsverfahren Representational Difference Analysis RDA Suppression Subtractive Hybridization SSH Vorz ge und Limitierungen der subtraktiven Hybridisierungsverfahren 3 Material und Methoden 31 Puffer und L sungen 3 2 Medien und Platten 3 3 Reagenzien Enzyme Reaktionsgef e Reaktionskits und Ger te 55 55 55 56 3 4 Bakte
241. nd Die quantitative real time PCR best tigte zus tzlich die diffe rentielle Transkription einer der zwei untersuchten Gensequenzen Die Existenz der SL1 Sequenz konnte auch f r D viviparus gezeigt werden Homologe ver schiedener daf Gene sowie des age 1 Gens des Erdnematoden C elegans konnten bei D viviparus nicht festgestellt werden Die ermittelten differentiell transkribierten Sequenzen sowie die erstellten hypothetischen Signalwege bed rfen noch weiterf hrender Untersuchungen zur Best tigung ihrer Rolle bei der genetischen Regulation der Larvenentwicklung Dies k nnte durch vergleichende Unter suchungen zur Gentranskription hypobiotischer und nicht hypobiotischer im Wirt befindli chen vierten und f nften Lungenwurmstadien erfolgen Die Ausschaltung der ermittelten dif ferentiell transkribierten Gene oder der entsprechenden Transkripte mit nachfolgenden Infek tionsversuchen k nnte letztlich die genetische Regulation der Hypobiose durch diese Gene best tigen Durch die Identifikation spezifischer Gene gehemmter Larven ist die Herstellung einer Vakzine m glich welche den Wirt in die Lage versetzt auch hypobiotische Stadien durch Immunmechanismen zu eliminieren Ebenso k nnten die erhaltenen differentiell transk ribierten Gene als Grundlage f r Untersuchungen hinsichtlich der genetischen Steuerungsme chanismen der Hypobiose in anderen parasitischen Nematoden dienen 206 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Christina
242. nd LD PCR 1 2 iges Agarosegel 1 2 iges Agarosegel M 250 bp DNA Ladder M 250 bp DNA Ladder l 15 PCR Zyklen 1 L3i cDNA 2 18 PCR Zyklen 2 L3ni cDNA 3 21 PCR Zyklen K Negativkontrolle 4 24 PCR Zyklen 4 3 2 Gelanalyse der mittels S ulenchromatographie aufgereinigten cDNA Proben In die S ulenchromatographie gingen jeweils zwei Ans tze der mit n Butanol auf ein Volu men von ca 60 ul eingeengten cDNAs der L3ni L3i und HSM ein Die sich anschlie ende Gelanalyse der je zwei Eluatfraktionen diente der Absch tzung der Wiederfindungsrate der cDNA wobei wie erwartet 50 in der ersten Eluatfraktion vorgefunden wurden In der zwei ten Eluatfraktion lag auf Grund der Gr enfraktionierung cDNA mit insgesamt geringerer L nge vor Da aber eine h here cDNA Ausbeute als im ersten Eluat festzustellen war wurden die beiden Eluate f r den nachfolgenden Restriktionsenzymverdau zusammengef hrt Ergebnisse 127 4 3 3 Restriktionsenzymspaltung mit RsaI Durch diesen Enzymverdau wurden die f r die Adapterligation ben tigten glatten Enden ge schaffen und die im Zuge der cDNA Synthese inkorporierten Oligonukleotidsequenzen ab gespalten Nach dem Rsal Verdau zeigen die cDNA Fragmente einen Wechsel in der Gr Benverteilung von ca 200 bp bis 5000 bp auf nunmehr 100 bp bis 2000 bp Des Weiteren konnten die im Restriktionsenzymverdau abgespaltenen Oligonukleotide jeweils in Form ei ner schwachen Bande dargestellt werden 5000 bp 2000 bp
243. nden besitzen nun kurze inverted repeats Der resultierende Suppressionseffekt wird aber nur bei sehr kurzen cDNAs offensichtlich da hier effizienter loop Strukturen gebildet werden was eine vermehrte Amplifikation l ngerer Fragmente bedingt Durch die Adapter modifikation ist zudem in der ersten PCR nur noch ein Primer n tig und damit auch das Prob lem der Primerdimere umgangen LUKYANOV etal 1995 Eine wesentliche Limitierung der subtraktiven Hybridisierungsverfahren ist die Beschr nkung auf den Vergleich zweier Populationen Durch die Verwendung eines Restriktionsenzyms welches sticky ends hinterl sst und darauf abgestimmte Adapter k nnen mit der RDA keine Fragmente von den Enden der Transkripte oder solche ohne entsprechende Schnittstelle de tektiert werden HUBANK u SCHATZ 1994 HUBANK u SCHATZ 1999 Ferner sind bei der RDA und SSH die Qualit t der RNA und synthetisierten cDNA die Einhaltung der richti gen Konzentrationsverh ltnisse und das Gelingen der einzelnen Reaktionsschritte von gro er 54 Schrifttum Bedeutung f r den Erfolg der Methoden HUBANK u SCHATZ 1994 IWAMA et al 1998 von STEIN 2001 Material und Methoden 55 3 Material und Methoden 3 1 Puffer und L sungen 6x Ladungspuffer 0 25 Bromphenolblau 40 Saccharose in Aqua bidest GTC ME Puffer 4 M Guanidinium Thiocyanat 0 1 M Tris HCl pH 7 5 1 B Mercapto Ethanol DEPC Bidest 0 1 Diethylpyrocarbonat in Aqua bidest 12 Stunden be
244. nden und solchen die dort ber die gesamte Weideperiode grasten ann hernd gleich hohe Prozents tze von 87 bis 95 an inhibierten Larven Dahingegen waren bei Tieren die im Fr hherbst f r vier Wochen auf diesen Fl chen grasten nur 8 bis 26 der Parasitenpopulation hypobiotisch Die Sommer oder Trockensaison Inhibition kann bei O ostertagi in den feuchten Regionen der S dh lfte Australiens ANDERSON 1988 in Teilen von Argentinien Uruguay und Bra silien ENTROCASSO 1988 dem S den der USA WILLIAMS et al 1983 WILLIAMS u KNOX 1988 sowie Neuseeland BISSET u MARSHALL 1987 beobachtet werden Dieses Ph nomen wurde des Weiteren bei 7 circumcincta H contortus Oesophagostomum radia tum und verschiedenen Cooperia Arten der kleinen Wiederk uer in verschiedenen afrikani schen und asiatischen L ndern wie Gambia N DAO et al 1995 Kenia GATONGI et al 1998 dem Senegal VERCRUYSSE 1985 Nigeria CHIEJINA et al 1988 sowie dem Nordwesten Syriens GIANGASPERO et al 1992 beschrieben ber die klimatischen Fakto ren die zur Ausl sung dieser Form der Entwicklungshemmung beitragen ist bislang wenig bekannt FERNANDEZ et al 1999 sehen in der Saison Fr hling an sich einen wichtigen induzierenden Faktor Sie stellten einen 3 15fach h heren Anteil hypobiotischer O ostertagi Larven in K lbern fest wenn diese im Fr hjahr auf den Versuchsweiden grasten Dieses Er gebnis konnte durch experimentelle Infektion mit Larven
245. nerieren und damit den TGF B und in sulinartigen Signalweg verbinden welche die dauer f rdernde Aktivit t von daf 3 daf 5 und daf 16 unterdr cken Dadurch w rde direkt oder indirekt daf 9 aktiviert Das daraufhin von daf 9 synthetisierte Hormon aktiviert wiederum den daf 12a Transkriptionskomplex mit der Folge einer normalen Larvenentwicklung Unter ung nstigen Umweltbedingungen hingegen w rde die daf 9 Aktivit t von daf 3 daf 5 und daf 16 inhibiert eventuell ber Substratentzug Somit k nnte das Hormon f r daf 12a nicht synthetisiert werden und der daf 12b Komplex w rde die Bildung der dauer larva initiieren GERISCH et al 2001 JIA et al 2002 Inwiefern die brigen bislang nicht klonierten daf Gene durchnumeriert bis daf 36 in die Kontrolle der Larvenentwicklung einbezogen sind ist noch weitgehend unklar So ist ber das Gen daf 15 bekannt dass es auf derselben Stufe wie daf 9 agiert und mutiert einen daf d Ph notyp verursacht ALBERT u RIDDLE 1988 Ob funktionelle Verbindungen oder Paral lelen zwischen daf 15 und daf 9 bestehen wird zurzeit erforscht 2 3 5 _ Homologe von daf Genen bei parasitischen Nematoden GOMEZ ESCOBAR et al 2000 identifizierten bei dem filaroiden Nematoden Brugia ma layi ein daf 7 Homolog Die Autoren vermuten jedoch eher eine immunmodulatorische als eine wachstums und differenzierungsf rdernde Funktion dieses Proteins wie es bei C ele gans der Fall ist Weiterhin wurde bei B pahanga
246. nfalls FAM markierte EF la Sonde ver wendet wurde Bezeichnung Sequenz 5 3 Tn Primer SOD for ATT ACA CTC AAT GGT TAT CAC AGT 55 C Primer SOD rev GCC CAA TTC CAA GCG TTT AG 55 8 C Sonde SOD 6 FAM TAG ACG ATA CCG ATG ACT CCA CAC GC TAMRA 65 2 C Primer PNMT for AAT GAT ATT AAC GCA GGA AGG AA 54 8 C Primer PNMT rev TGC AGC AAT ATT CTA CAC AAA AG 54 6 C Sonde PNMT 6 FAM TGT GACAAC GGT ATC AAA CAT CCC TTG G TAMRA 65 C Primer EF la for CGA CTG GTC ATC TCA TCT ACA 54 9 C Primer EF la rev TCT AAT ACC CAT GCG TAC TTG A 55 2 C Sonde EF 1a 6 FAM ACC CTT ACC CAT CTC TTG TGC TTC CTT TAMRA 65 1 C Abb 13 In der qPCR verwendete Primer und TaqMan Sonden Tm errechnet von der Primerdesign Software Material und Methoden 117 Bevor mit der quantitativen Untersuchung begonnen wurde erfolgte eine Optimierung der qPCR Hierzu wurde mittels konventioneller PCR durch Anlegen eines Gradienten von 56 C bis 61 C MJ Research Multicycler PTC 200 BIOZYM die optimale Annealingtemperatur der drei Primerkombinationen analysiert Des Weiteren wurden im MX 4000 Multiplex Quantitative PCR System STRATAGENE verschiedene Endkonzentration der Sonden 200 nM bis 500 nM und Primer 25 nM Vorw rts und 300 nM R ckw rtsprimer sowie beide Primer 300 nM sowie Annealingtemperaturen 52 C bis 56 C getestet In der qPCR wurden jeweils als Duplikate die Verd nnungsreihen der Plasmide 10 bis 10
247. nfection with Dictyocaulus viviparus in cattle Vet Parasitol 87 45 50 STUBBS A P P D ABEL M GOLDING G BHANGAL Q WANG J WAXMAN G W H STAMP u E LALANI 1999 Differentially expressed genes in hormone refractory prostate cancer American Journal of Pathology 154 1335 1343 SUN Y G HEGAMYER u N H COLBURN 1994 Molecular cloning of five messenger RNAs differentially expressed in preneoplastic or neoplastic JB6 mouse epidermal cells one is homologous to human tissue inhibitor of metalloproteinases 3 Cancer Res 54 1139 1144 SWANSON M M u D L RIDDLE 1981 Critical periods in the development of the Caenorhabditis elegans dauer larva Dev Biol 84 27 40 SWIETLIKOWSKI M 1969 Studies on immunity of calves to Dictyocaulus viviparus reinfection V Serological studies on experimental dictyocaulosis caused by normal and X ray inactivated larvae Acta Parasitologica Polonica 16 100 115 SWOBODA P H T ADLER u J H THOMAS 2000 The RFX type transcription factor DAF 19 regulates sensory neuron cilium formation in C elegans Mol Cell 5 411 421 Literaturverzeichnis 241 TAKACS A M J A DENKER K G PERRINE P A MARONEY u T W NILSEN 1988 A 22 nucleotide spliced leader sequence in the human parasitic nematode Brugia malayi is identical to the trans spliced leader exon in Caenorhabditis elegans Proc Natl Acad Sci USA 85 7932 7936 TANG E D G NUNEZ F G BARR u K L GUA
248. ni ein Homolog des daf 7 Gens festgestellt GOMEZ ESCOBAR et al 1997 Auch konnten bei Strongyloides stercoralis Orthologe des 42 Schrifttum daf 12 Gens welches bei C elegans in die Formation der dauer larva involviert ist SIDDI QUI et al 2000 sowie gpa 2 und gpa 3 Orthologe MASSEY JR et al 2001 gefunden werden Es ist jedoch zu bedenken dass dieser Parasit nicht zur Hypobiose befahigt ist Fer ner kann in den Entwicklungszyklus eine frei lebende Generation eingeschaltet werden Die Gattung Strongyloides repr sentiert somit einen Mediator zwischen den obligat parasitischen und frei lebenden Nematoden Bez glich der Reaktivierung hypobiotischer Larven bestehen bei C elegans und Ancylostoma caninum offensichtlich hnliche Verh ltnisse TISSENBAUM et al 2000 stellten fest dass muscarinerge Agonisten bei beiden Organismen die Weiterentwicklung f rdern wohingegen der muscarinerge Antagonist Atropin diese inhibiert Die Autoren schlie en daraus einen Sig nalweg ber Acetylcholin welcher das insulinartige Signal w hrend des recovery von C ele gans aktiviert und vermuten dass auch die Reaktivierung hypobiotischer Hakenwurmlarven ber ein insulinartiges Signal von Seiten des Wirtes oder des Parasiten vermittelt wird ARA SU 2001 beobachtete einen stimulatorischen Effekt der TGF Isoformen 1 und 2 auf die Reaktivierung inhibierter A caninum Larven Das w hrend der Gravidit t vom Wirt vermehrt synthetisierte TGF B2 k
249. nktioneller Aminos uren Die Auflistung erfolgt in numerischer Reihenfolge der Klone getrennt nach L3ni bzw L3i wobei bestehende Sequenzidentit ten auf Nukleins ureebene zuerst genannt werden Die jeweiligen Accession bzw Versionen Nummern der teilidentischen Sequenzen sind in Klammern angef hrt Der Klon L3ni 16 enthielt ein 723 bp umfassendes Insert welches mit zwei Gensequenzen f r Paramyosin unc 15 sowie einem Cosmid von C elegans NM_059648 1 CEUNCI5 sowie CEF07A5 eine 80 ige bereinstimmung ber 528 bp aufwies Die Identit t mit dem Cosmid bezog sich dabei auf den Folgestrang Mit der mRNA f r Paramyosin von B malayi BMILMS bestand auf einer Lange von 331 Nukleotiden eine Identit t von ebenfalls 80 Weitere Teilidentit ten mit Paramyosinsequenzen anderer Organismen wie Wucheria banc rofti oder Dirofilaria immitis werden an dieser Stelle nicht weiter aufgef hrt Auf Aminos u reebene zeigten sich die 240 translatierten Aminos uren ber die gesamte L nge zu 95 i 146 Ergebnisse dentisch 97 mit drei Paramyosinsequenzen von C elegans S04027 CAA30857 1 NP_492085 1 und einem hypothetischen Protein von C briggsae CAE66601 1 Weitere Paramyosin Identit ten beispielsweise mit O volvolus W bancrofti oder Anisakis simplex werden hier nicht weiter beschrieben Das 657 bp lange Insert des Klons L3ni 22 wurde in 138 Aminos uren bersetzt Es ergab sich auf einer L nge von 72 Aminos uren eine Tei
250. nsam weidenden Rinder ein beziehen D WEL 1971 OAKLEY 1983 Dabei werden den Tieren zweimal im Abstand von vier bis sechs Wochen 1000 mit 400 Gray bestrahlte infekti se Larven oral verabreicht Hierdurch ist ein Schutz vor Erkrankung auch bei starken Infektionen gegeben JARRETT et al 1957 Bei massiven Reinfektionen in Einzelf llen auch ohne Reinfektion kommt es je doch zur Heranreifung adulter Lungenw rmer sowie zur Larvenausscheidung MICHEL etal 1965 D WEL 1971 PFEIFFER u SUPPERER 1980 Die sich daraus ergebende Weide kontamination f hrt zur Superinfektion und dadurch zu einer fortw hrenden Auffrischung der Impfung ECKERT 1972 URQUHART 1985 Dies ist infolge der nur drei bis f nf Monate anhaltenden Impfimmunit t MICHEL et al 1965 auch notwendig Da das Alter der Impflin ge Einfluss auf die Belastbarkeit der Immunit t nimmt empfiehlt D WEL 1971 eine Vak zinierung erst ab einem Alter von zwei Monaten Anschlie end sollten die Tiere zudem noch zwei bis vier Monate aufgestallt bleiben 2 1 6 4 Biologische Bek mpfung Der nematophage Pilz Duddingtonia flagrans welcher aus dem Kot von Rindern isoliert wer den konnte bietet nach LARSEN 1999 neue M glichkeiten zur Prophylaxe Dieser Pilz immobilisiert und zerst rt frei lebende Larven in einem Hyphennetz HENRIKSEN et al 1997 stellten in Rinderkot nach Zusatz von 50 000 Chlamydosporen g Kot durchschnittlich eine 86 ige Reduktion der Anzahl an D viviparus Lar
251. nute bei 13 000 g zentrifugiert um die L sung in eine obere organische und untere w ssrige Phase zu trennen Die obere organische Phase wurde verworfen Zu der verbleibenden w ssrigen Phase welche die Nukleins uren enthielt und deren Volumen noch ca 100 ul betrug wurden nochmals 750 ul n Butanol gegeben Wieder erfolgte nach gr ndlicher Durchmischung eine Zentrifugation f r 1 Minute bei 13 000 g und Verwerfen der organischen Phase Nach diesem Schritt verblieben ca 60 ul der eingesetzten Proben so dass mit der S ulenchromatographie begonnen werden konnte 3 8 3 Aufreinigung mittels S ulenchromatographie F r die weitere Durchf hrung der SSH war ein Enzymverdau erforderlich Deshalb musste die amplifizierte cDNA von den brigen Reaktionskomponenten der LD PCR befreit werden Zudem sollte das PCR Produkt auch von kurzen aus degenerierter mRNA transkribierten cDNA Sequenzen bereinigt werden F r diesen Zweck wurden die auf dem Prinzip der Gel filtrations Chromatographie beruhenden CHROMA SPIN 1000 DEPC H 0O Columns BD CLONTECH verwendet welche DNA Molekiile von weniger als 300 bp zu 99 aus der Material und Methoden 79 aufgetragenen Probe entfernen Im Inneren dieser S ulen befindet sich ein Gelbett mit darin eingeschlossenen mikroskopisch kleinen aus einem hydrophilen por sen Material bestehen den K gelchen Molek le deren Gr e die der Poren bersteigt wandern sehr schnell durch das Gelbett wohingegen kleinere
252. o gelingt es sowohl induzierte als auch reprimierte Gene zu identifizieren AIELLO et al 1994 Weiterhin ist insbesondere bei beschr nktem Ausgangsmaterial die geringe Menge von 100 ng mRNA bzw 200 ng Gesamt RNA welche zur Durchf hrung ben tigt wird als ein Vorteil der Fingerprinting Verfahren zu nennen Bei den Fingerprinting Methoden ist jedoch zu bedenken dass am Ende der PCR die Sequen zen reichlich vorhandener RNAs dominieren BERTIOLI et al 1995 Dahingegen k nnen seltene RNAs zu denen viele differentiell transkribierte Sequenzen z hlen oftmals nicht de tektiert werden WELSH et al 1992 McCLELLAND et al 1995 da die Amplifikationsreak tion teilweise empfindlich auf geringe nderungen der Templatekonzentration reagiert WELSH u McCLELLAND 1990 WONG u McCLELLAND 1993 Dies stellt eine der wichtigsten Limitierungen der RNA Fingerprintings dar Als sehr nachteilig erwies sich auch die hohe Zahl falsch positiver Banden die beispielsweise bei unterschiedlicher Template Qualit t und Template Konzentration der Proben auftreten Diese betr gt beim Differential Schrifttum 45 Display zwischen 50 und 75 bis hin zu 93 SUN et al 1994 SOMPAYRAC et al 1995 HARRIS et al 1998 Um diesem Umstand Rechnung zu tragen wurde das Original protokoll LIANG u PARDEE 1992 von zahlreichen Autoren BAUER et al 1993 GUI MARAES et al 1995 LUCE u BURROWS 1998 PIENTA u SCHWAB 2000 modifiziert Weiterhin decken Finge
253. of larvae and adults of Trichostrongylus colubriformis Haemonchus contortus and Ostertagia circumcincta Parasitol Res 84 646 650 HANSEN HAGGE T E U TREFZER A S ZU REVENTLOW K KALTOFT u W STERRY 2001 Identification of sample specific sequences in mammalian cDNA and genomic DNA by the novel ligation mediated subtraction Limes Nucleic Acids Res 29 e20 HARRIS A J J G SHADDOCK M G MANJANATHA J A LISENBEY u D A CASCIANO 1998 Identification of differentially expressed genes in aflatoxin B1 treated cultured primary rat hepatocytes and Fischer 344 rats Carcinogenesis 19 1451 1458 HASSLINGER M A 1989 Dictyocaulus arnfieldi in equines present situation and future aspects J Egypt Vet Med Ass 49 445 455 HAWDON J M u B DATU 2003 The second messenger cyclic GMP mediates activation in Ancylostoma caninum infective larvae Int J Parasitol 33 787 793 HEDGECOCK E M u J N THOMSON 1982 A gene required for nuclear and mitochondrial attachment in the nematode C elegans Cell 30 321 330 HENDERSON S T u T E JOHNSON 2001 daf 16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans Curr Biol 11 1975 1980 HENRIKSEN S A M LARSEN J GRONVOLD P NANSEN u J WOLSTRUP 1997 Nematode trapping fungi in biological control of Dictyocaulus viviparus Acta vet scand 38 175 179 HERMAN R K 1987 Mosaic analysi
254. olipase A J Biol Chem 269 13057 13060 DIATCHENKO L Y F LAU A P CAMPBELL A CHENCHIK F MOQADAM B HUANG S LUKYANOV K LUKYANOV N G GURSKAYA E D SVERDLOV u P D SIEBERT 1996 Suppression subtractive hybridization a method for generating differentially regulated or tissue specific cDNA probes and libraries Proc Natl Acad Sci USA 93 6025 6030 DIATCHENKO L S LUKYANOV Y F LAU u P D SIEBERT 1999 Suppression subtractive hybridization a versatile method for identifying differentially expressed genes Methods Enzymol 303 349 380 218 Literaturverzeichnis DON R H P T COX B J WAINWRIGHT K BAKER u J S MATTICK 1991 Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification Nucleic Acids Res 19 4008 DONCASTER C C 1981 Observations on relationships between infective juveniles of bovine lungworm Dictyocaulus viviparus Nematoda Strongylida and the fungi Pilobolus kleinii and P crystallinus Zygomycotina Zygomycetes Parasitology 82 421 428 DOPCHIZ M C A E PARMA u C A FIEL 2000 Hypobiosis induction alters the protein profile of Ostertagia ostertagi Nematoda Trichostrongylidae Folia Parasitol Praha 47 135 140 DUNSMORE J D 1960 Retarted development of Ostertagia species in sheep Nature 186 986 987 D WEL D 1971 Die Dictyocaulose des Rindes Tier rztl Umschau 26 152 158 ECKERT J 1972 Bek mpfung der Dictyocaulose
255. olution r konserviert sind Nach den bisherigen Kenntnissen ben Proteine mit DM DNA Bindungsdom nen jedoch allein geschlechtsspezifische bzw determierende Funktionen aus Daher erscheint unklar welche Bedeutung der verst rkten Transkription in den inhibierten D viviparus und C elegans Larven bez glich der Entwicklungshemmung beizumessen ist Die Aufregulation des Homologs der Ca unabh ngigen Phospholipase A iPLA2 in den L3i steht m glicherweise in Zusammenhang mit den Inkubationsbedingungen bei der Induk tion der Hypobiose Diese Enzyme remodellieren die membranalen Phospholipide bei gleich zeitiger Inkorporation von Arachidons ure BALSINDE et al 1995 BALSINDE u DENNIS 1997 Bei Bakterien Pflanzen und auch h heren Tiere konnte gezeigt werden dass diese ber einen vermehrten Einbau unges ttigter und oder kurzkettiger Fetts uren die Schmelz temperatur ihrer Membranen niedrigen Umwelttemperaturen anpassen VANCE 2000 Dies gew hrleistet die Fluidit t der Membranlipide von welcher membranale Prozesse wie die Signaltransduktion und Transportvorg nge abh ngen BERG et al 2003 S 368 369 Die aufregulierte Transkription des iPLA gt Homologs w re somit durch die Inkubation der L3i bei Diskussion 197 4 C erkl rbar Ausgehend von einer verminderten Zellteilungsrate dieser Larven k nnte die verst rkte Remodellierung der membranalen Phospholipide an sich als eine weitere Zustands anpassung betrachtet werden
256. olymerasen aus den Sondenl sungen entfernt Die n tigen Arbeitsschritte erfolgten gem dem Herstellerprotokoll 3 10 2 3 Multi Enzymverdau Da sowohl in der PCR zur Markierung der Sonden als auch bei der Amplifikation der auf die Nylonmembranen aufgetropften cDNAs die Nested Primer 1 und 2R Verwendung fanden bestand die Gefahr falsch positiver Hybridisierungsergebnisse Durch den Verdau mit den Restriktionsenzymen Rsal Smal und Eael ROCHE wurden die Nested Primer von den Son den abgespalten Die Erkennungssequenzen dieser Enzyme welche bei RsaI durch die Adap 94 Material und Methoden terligation an die mit RsaI verdaute cDNA s 3 8 5 wieder hergestellt wurden sind in Abb 7 dargestellt Da die Sonden nach der Aufreinigung unterschiedliche Volumina aufwiesen wur de die zugesetzte Menge an 10x Reaktionspuffer A dem Probenvolumen angepasst Zun chst wurde zu jeder Probe lul Smal 10 U ul ROCHE gegeben und die Reaktionen f r 1 Stunde bei 25 C inkubiert anschlie end wurden den Ans tzen je 2 ul Rsal 10 U ul ROCHE und 1 ul Eael 10 U ul ROCHE hinzugef gt Zur Kontrolle der Enzymaktivit t wurden von je dem Reaktionsansatz je 3 ul abgenommen und diese mit einem Mikroliter einer Plasmid DNA vermischt Alle Ans tze wurden f r eine Dauer von vier Stunden bei 37 C verdaut und nachfolgend auf einem Agarosegel analysiert Im Anschluss an den Multi Enzymverdau erfolgte eine Reinigung der Sonden von den ab gespalten
257. on Subtractive Hybrization und die Herstellung der Sonden zur Verifizierung der differentiell transkribierten Gensequenzen s 3 11 2 der SMART PCR cDNA Synthesis Kit BD CLONTECH eingesetzt Die SMART Methode Switching Mechanism At 5 end of RNA Template beruht auf der Terminalen Transferase Aktivit t der verwendeten Moloney murine leukemia virus MMLV reversen Transkriptase RT die zus tzlich eine RNase H Punktmutation aufweist Erreicht das Enzym das 5 Ende der mRNA h ngt es an das 3 Ende der synthetisierten cDNA einige zus tzliche Nukleotide vorwiegend Desoxycytidin an Dieses Oligo dC Tailing erm glicht dem SMART II Oli gonukleotid welches am 3 Ende eine Oligo dG Sequenz besitzt die Hybridisierung Dar aufhin wechselt die Reverse Transkriptase das Template und verl ngert die synthetisierte cDNA um die zum SMART II Oligonukleotid komplement ren Basen s Abb 4 Bricht die cDNA Synthese vor Erreichen des 5 mRNA Endes ab ist die Terminale Transferase Aktivit t des Enzyms sehr viel geringer Somit erfolgt das Template Switching der Reversen Transkriptase meist nur dann wenn die cCDNA mRNA Hybriden in voller L nge vorliegen Material und Methoden 67 AAAAA TTTTT pees SMART II Oligo Erststrang cDNA Synthese re AAA AA GC I d C Tailing und Template Switching AAAAA TTTTT e Abb 4 Erststrang cDNA Synthese und Long Distance LD PCR Bei dem in der Erststrang cDNA Synthes
258. onnten bei der Mehrzahl der von ihnen ermittelten 19 O ostertagi cDNA Sequenzen 204 Diskussion keine Identit ten innerhalb der Datenbanken und dabei insbesondere nicht mit C elegans feststellen Die Autoren werteten die isolierten Gene daher als spezifisch f r parasitische Ne matoden hnliche Verh ltnisse liegen bei den eigenen Untersuchungen vor Von den insge samt 209 sequenzierten Inserts der subtrahierten cDNA Banken zeigten lediglich 20 Klone auf Aminos ureebene als signifikant gewertete bereinstimmungen mit den Datenbankse quenzen wobei sich die Identit ten auf 16 verschiedene Proteinen bezogen Auf Nukleins u reebene konnten nur f r sechs Klone signifikante Identit ten ermittelt werden Bez glich der genetischen Regulation der Larvenentwicklung scheinen jedoch auch berein stimmende Mechanismen bei dem frei lebenden Erdnematoden C elegans und parasitischen Nematoden vorzuliegen So zeigen vergleichende Untersuchungen von A caninum und C elegans dass die Aufhebung der Entwicklungshemmung wahrscheinlich ber die gleichen Signale vermittelt respektive inhibiert wird TISSENBAUM et al 2000 ARASU 2001 HAWDON u DATU 2003 sehen auf Grund ihrer Untersuchungen in der genetischen Regu lation des dauer recovery von C elegans ein Modell f r die Parasiteninfektion des Wirtes Inwieweit molekularbiologische Untersuchungen parasitarer DNA auf C elegans Genhomologe den von EYSKER 1997 erhofften Erkenntnisgewinn ber di
259. or suppressor gene Proc Natl Acad Sci USA 96 2925 2930 GOH S L u K G DAVEY 1985 Occurence of noradrenaline in the central nervous system of Phocanema decipiens and its possible role in ecdysis Can J Zool 221 161 163 GOLDEN J W u D L RIDDLE 1982 A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans Science 218 578 580 GOLDEN J W u D L RIDDLE 1984a A pheromone induced developmental switch in Caenorhabditis elegans temperature sensitive mutants reveal a wild type temperature dependent process Proc Natl Acad Sci USA 81 819 823 GOLDEN J W u D L RIDDLE 1984b The Caenorhabditis elegans dauer larva developmental effects of pheromone food and temperature Dev Biol 102 368 378 GOLDEN J W u D L RIDDLE 1985 A gene affecting production of the Caenorhabditis elegans dauer inducing pheromone Mol Gen Genet 198 534 536 GOMEZ ESCOBAR N W F GREGORY u R M MAIZELS 2000 Identification of tgh 2 a filarial nematode homolog of Caenorhabditis elegans daf 7 and human transforming growth factor beta expressed in microfilarial and adult stages of Brugia malayi Infect Immun 68 6402 6410 GOMEZ ESCOBAR N B A van DEN u R MAIZELS 1997 A member of the TGF beta receptor gene family in the parasitic nematode Brugia pahangi Gene 199 101 109 GOTHE R 1983 Zur Dictyocaulus arnfieldi Infektion der Equiden Berl M nch tier rztl Wschr 96
260. orden war erfolgte die weitere Amplifikation der verbleibenden bei 4 C gelagerten Reaktionsans tze mit den noch erforderlichen PCR Zyklen Da sich im Verlauf der Arbeit herausstellte dass je zwei LD PCR Ans tze der L3ni L3i und HSM eine zu geringe cDNA Ausbeute f r die weiteren Schritte lieferten wurden gewisse Abweichungen von der oben beschriebenen Vorgehensweise der LD PCR vorgenommen So 78 Material und Methoden wurde von der L3ni und der L3i Erststrang cDNA je 2 ul als Template eingesetzt des Weite ren f r alle drei Proben L3ni L3i und HSM die Zahl der Reaktionsans tze auf sechs erh ht Abweichend vom unter 3 7 3 3 angefiihrten Temperaturprofil wurde in den nun 21 PCR Zyklen die Denaturierungszeit auf 10 Sekunden verkirzt 3 8 2 Volumenkonzentration mit n Butanol Um eine ausreichende Menge an cDNA f r sp tere Reaktionen zu erhalten wurden 2x je drei 100 ul umfassende LD PCR Produkte der L3ni L3i und HSM zusammengef hrt Da das Pro benvolumen fiir die im n chsten Schritt durchzuf hrende S ulenchromatographie 70 ul nicht bersteigen durfte erfolgte eine Einengung der Proben mit n Butanol Da dieses kaum mit Wasser mischbar ist bilden sich zwei Phasen Die Butanolphase kann bis zu 19 Gewichtspro zent Wasser aufnehmen wodurch das Volumen der w ssrigen Phase verringert wird Zur Volumeneinengung der Proben wurden je 800 ul n Butanol zu den Ans tzen gegeben und nach gr ndlicher Durchmischung f r 1 Mi
261. ormen sind ebenso wie die jeweiligen Accession Nummern der Nukleins uresequenzen unter 9 4 2 respektive 9 2 aufgef hrt 4 9 5 Sequenzidentit tsvergleiche 4 9 5 1 Sequenzidentit tsvergleich auf Nukleins ureebene Mit den differentiell transkribierten Sequenzen welche durch die RACE Produkte in 3 und 5 Richtung verl ngert werden konnten erfolgte mittels BLASTN ein Identit tsvergleich mit in GenBank NCBI publizierten Nukleins uresequenzen Als signifikant wurde dabei ein E Value von kleiner als 0 001 gewertet Sequenzidentit ten welche von den in Kapitel 4 8 3 beschriebenen abweichen sind im Folgenden aufgelistet wobei die Accession bzw Versio nen Nummern der teilidentischen Sequenzen in Klammern angef hrt werden Die L3ni 16 Sequenz zeigte sich ber einen Bereich von 455 Nukleotiden zu 81 identisch mit dem essentiellen Paramyosin Gen UNC 15 von C elegans NM _059684 1 Mit dieser mRNA bestand des Weiteren eine Teilidentit t von 80 ber 528 bp 79 ber 494 bp 82 ber 158 bp und 86 ber 65 bp hinweg Die zwei erstgenannten bereinstimmungen konnten auch mit einem weiteren unc 15 Gen f r Paramyosin und einem Cosmid von C ele gans CEUNC15 und CEF07A5 festgestellt werden Mit diesen beiden Sequenzen bestand 158 Ergebnisse ferner eine 81 ige Identit t welche 251 Nukleotide umfasste Mit dem unc 15 Gen zeigten sich weiterhin noch Ubereinstimmungen von 83 ber 113 bp 89 ber 46 bp und 87
262. otein 1476 aa von R norwegicus XP_218479 2 Wurde die Aminos uresequenz ab dem potentiellen Startcodon verglichen ergaben sich f r die L3i 18 und L3i 86 Identit ten mit vier Proteinen zwei Zink Finger und zwei hypothetische Proteine ber einen Bereich von lediglich 44 Aminos uren Die Teilidentit t lag bei 47 die Sequenz hnlichkeit betrug 50 Die bereinstimmungen mit den DM DNA Bindungsdom nen enthaltenden Proteinen wie sie noch beim Identit ts vergleich mittels des BLAST search for short nearly exact matches und auch weiterhin mit der L3i 99 Sequenz festzustellen waren traten nicht mehr auf Beim Vergleich der Aminos u ren ab dem ersten Methionin konnte das BLAST Programm keine signifikanten Identit ten ermitteln 162 Ergebnisse 4 9 5 3 berpr fung auf konservierte Dom nen Die Aminos uresequenzen wurden mittels des RPSBLAST auf das Vorliegen konservierter Dom nen CD der conserved domain database NCBI berpr ft Die folgende Tabelle gibt Alignments von mehr als 51 in Verbindung mit einem E Value von kleiner als 0 001 wie der Prozentzahlen bez glich der Identit t werden vom RPSBLAST Programm nicht angege ben Neben der Aminos urel nge der konservierten Region sind die zugeh rigen CD Nummern angegeben Bei keiner der Sequenzen zeigten sich Identit tsunterscheide wenn der RPSBLAST mit der Gesamtsequenz bzw mit der Aminos uresequenz ab dem potentiellen Startcodon durchgef hrt wurde
263. p i steigt nach JARRETT et al 1957 die Atemfrequenz der Tiere teilweise kann auch Husten festgestellt werden In Abh ngigkeit von pr disponierenden Faktoren klingen diese Symptome ab oder verst rken sich Im letzteren Fall steigt die Atemfrequenz auf 70 Atemz ge pro Minute h u figes Husten und Dyspnoe sind zu beobachten Je nach Schwere der Erkrankung kommt es zu einer Verminderung oder gar Zerst rung des Zilienbesatzes der Bronchialepithelien was eine Verminderung der mukozili ren Clearance bedingt Ansammlungen von vermehrt gebildetem Schleim Zelltriimmern und Entz ndungszellen obstruieren die Bronchiolen nachfolgende Alveolen werden atelektatisch Das Bronchialepithel wird durch hyperplastische Basalzellen das flache Alveolarepithel durch Typ I Pneumozyten ersetzt SCHNIEDER et al 1991 Pa thohistologisch ist weiterhin eine lokale Infiltration mit eosinophilen Granulozyten und Mast zellen feststellbar SCHNIEDER et al 1991 COLLIE et al 2001 Im Laufe der Patenzphase schreiten die Krankheitserscheinungen weiter voran Betroffene Tiere zeigen Inappetenz Fieber und muk sen Nasenausfluss Die erschwerte Atmung bedingt eine s gebockartige Stellung der Tiere Auf Grund der schlechten Abwehrlage der erkrankten Rinder kommt es h ufig zu bakteriellen Superinfektionen mit der Folge einer katarrhalisch purulenten Bronchopneumonie MICHEL u SHAND 1955 JARRETT et al 1957 PFEIF FER u SUPPERER 1980 Makrophagen neutrophile und
264. pdk 1 eine Akt PKB Kinase welche wiederum die Serin Threonin Kinasen akt 1 und akt 2 aktiviert wobei deren Aktivierung auch direkt ber PIP3 erfolgt PARADIS u RUVKUN 1998 PARADIS et al 1999 Auf der anderen Seite kontrolliert daf 2 in multiplen Gruppen von Signalzellen die Produk tion oder Aktivit t eines zweiten noch unbekannten Signals welches die Entwicklung und Lebensspanne verschiedener Gewebe reguliert APFELD u KENYON 1998 Beide Wege antagonisieren letztlich daf 16 ehemals auch als daf 17 bezeichnet bez glich seiner f rdern 38 Schrifttum den Aktivit t auf die Ausbildung der dauer larva PARADIS u RUVKUN 1998 TANG et al 1999 CAHILL et al 2001 HENDERSON u JOHNSON 2001 LEE et al 2001 LIN et al 2001 Das Gen daf 16 codiert fiir drei Isoformen eines Forkhead Transkriptionsfaktors wel che durch alternatives Splicing entstehen Diese Isoformen besitzen unterschiedliche DNA Bindungsdom nen und interagieren vermutlich mit verschiedenen Partnern oder binden an unterschiedliche Promotoren LIN et al 1997 OGG et al 1997 Bei g nstigen Umweltbe dingungen befinden sich die daf 16 Genprodukte im Zytoplasma und regulieren ein schnelles Wachstum sowie die Reproduktion von C elegans Verschlechtern sich die Lebensbedingun gen gelangen die Transkriptionsfaktoren in den Zellkern und verz gern Wachstum und Re produktion dahingegen werden Stressresistenz und Lebensdauer gesteigert Die Phosphory lierung der daf 1
265. pp 22 ng Noradrenalin und nur 1 7 ng Adrenalin pro Gramm frischen Gewebes fest Noch offensichtlicher war dieser Konzentrationsunterschied im Kopfbereich des Nematoden welcher einen h heren Anteil nervalen Gewebes enth lt Hier fanden die Autoren pro Gramm Gewebe sogar 44 ng Noradrenalin bei unver ndertem Adrenalingehalt Letztgenanntes Catecholamin vermindert bei Nematoden ferner die somatische Aktivit t CROLL 1975 was eine weitere Erkl rung f r die verst rkte Transkription des PNMT Homologs in den L3i w re M glicherweise nimmt das durch die katalytische Aktivit t der PNMT synthetisierte Adrena lin sogar eine zentrale Rolle bei der Induktion der Entwicklungshemmung und der damit ver nderten Stoffwechsellage der D viviparus Larven ein So entdeckten WILLETT etal 1979 194 Diskussion in dem frei lebenden Erdnematoden Panagrellus redivivus eine Catecholamin sensitive Ade nylat Cyclase welche den second messenger cAMP generiert und dabei st rker von Adrena lin als von Noradrenalin und nur in geringem Ma e von Dopamin aktiviert wird WILLETT u RAHIM 1978 WILLETT et al 1979 WILLETT 1980 Die weitere Signaltransduktion wird in Vertebraten ber cCAMP abh ngige Proteinkinasen vermittelt INGEBRITSEN u COHEN 1983 welche eine wichtige Rolle bei der Regulation des Zellstoffwechsels und der Zelldifferenzierung spielen EDELMAN et al 1987 und ferner an der Regulation der Gentranskription beteiligt sind BERG et al 2003
266. publizierten Sequenzen auf Nukleins ure und Aminos ureebene s 3 7 10 Auf Grund eines m glichen Stopcodons in der untranslatierten Region UTR am 5 Ende der mRNA und damit in der cDNA oder der Entstehung eines solchen durch Fehler der Polymerase der Plasmidreplikation oder der Sequenzierreaktion gingen die Fragmente wel che noch keine signifikanten Homologien aufwiesen nochmals mit Hilfe des TBLASTX in den Sequenzidentit tsvergleich ein Der TBLASTX bersetzt dabei eine gegebene Nuklein s uresequenz in die m glichen Aminos ureabfolgen ohne die Translation an einem Stopco don zu beenden Der Identit tsvergleich erfolgt dann mit den in der GenBank enthaltenen Proteinsequenzen Ergaben sich hierbei signifikante Homologien wurde mittels Align Plus der betreffende Leserahmen hinter dem Stopcodon in die Aminos uresequenz translatiert und diese wiederum mit dem BLAST search for short nearly exact matches in ihrer Gesamtheit als auch ab dem ersten Methionin auf Identit ten berpr ft 3 13 Charakterisierung der differentiell transkribierten Genfragmente Die differentiell transkribierten Genfragmente der L3ni und L3i die im Sequenzidentit tsver gleich signifikante Homologien aufwiesen sollten mit der Rapid Amplification of cDNA Ends RACE FROHMAN et al 1988 vervollst ndigt werden und dienten daher als Se quenzgrundlage f r die Herstellung genspezifischer Vorw rts GSP for und R ckw rtspri mer GSP rev Konn
267. r daf 16prp rev 5 AAA AAC CTA GCA GCG AGT G 3 5 GGC CCA TAA CCC AGA GG 3 5 TTC TCC ATT GCT GCT TTG TA 3 5 CTA GTG AGA TGG ATG AAT 3 Abb 15 Primer zur berpr fung der Sequenzen daf 12 0 und daf 16A u 3 16 3 3 Sequenzspezifische PCR Die Amplifikation genomischer DNA der L3ni und L3i erfolgte jeweils mit den Primerpaaren daf 12 daf 12RNA daf 16A und daf 16prp In den 25 ul Reaktionsans tzen waren folgende Komponenten enthalten 2 5 ul 10x Advantage 2 PCR Puffer 1 ul dNTP Mix je 10 mM 1 ul Vorwartsprimer 50 uM 1 ul R ckw rtsprimer 50 uM 0 25 ul Advantage 2 Polymerase Mix 2 ul genomische DNA In dieser PCR fand folgendes Temperaturprofil Anwendung initiale Denaturierung Denaturierung Primerannealin 35x 5 Primerextension 94 C 3 Minuten 94 C 45 Sekunden 47 8 C bei den daf 12 Kombinationen 42 5 C bei den daf 16 Kombinationen 68 C 1 Minute 1 Minute Im Anschluss an die PCR wurden die Proben im Agarosegel analysiert Bei zwei Banden die mit Hilfe des Primerpaares daf 16prp amplifiziert wurden erfolgte eine weitere Charakterisie rung wie unter 3 7 7 bis 3 7 10 beschrieben 124 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4 1 Parasitologisches Probenmaterial 4 1 1 Uberlebensrate der Larven nach Induktion der Entwicklungshemmung Durch Ausz hlung der lebenden dritten D viviparus Larven vor und nach der sechs bis achtw chigen K hlung be
268. r ber einen Zeitraum von f nf Jahren in einem Labor passagiert worden war Des Weiteren verdeutlichten reziproke Transferexperimente geographisch isolierter O ostertagi Populationen die genetische Grundlage der saisonbedingten Induktion der Hypobio se SMEAL u DONALD 1981 FRANK etal 1986 FRANK etal 1988 Schrifttum 33 Durch molekularbiologische Untersuchungen konnten bei H contortus zwei nicht n her cha rakterisierte Proteine identifiziert werden die wahrend der Induktion der Larven zur Entwick lungshemmung stark anstiegen Bei nicht Hypobiose induzierten Larven sowie einem nicht zur Hypobiose f higen Laborstamm waren diese Proteine nicht in diesem Ausma vorhanden KOOYMAN u EYSKER 1995 DOPCHIZ et al 2000 stellten bei Hypobiose induzierten O ostertagi Larven ein ver ndertes Proteinprofil im Bereich von 66 bis 77 kDa fest dessen Proteingehalt im Vergleich mit nicht induzierten Larven um den Faktor 5 25 erh ht war In nerhalb dieser Region fanden sich zwei Proteine mit einem Molekulargewicht von 75 4 bzw 70 kDa mit einer um den Faktor 4 45 respektive 44 16 gesteigerten Proteinmenge bei den Hy pobiose induzierten Larven RICKLING 1999 untersuchte auf mRNA Ebene Unterschiede der Gentranskription mit Hilfe des Differential Displays bei Hypobiose induzierten und nicht induzierten dritten D viviparus Larven Die 37 als differentiell transkribiert ermittelten Genfragmente konnten jedoch nicht komplettiert werden Auch eine Ver
269. r sentiert wird an Position 3 ein A und an 4 ein G besitzt Auch beeinflussen die das AUG Triplett umgebenden Sekund rstrukturen die Translationsef fizienz da diese eine Verlangsamung des Ribosoms bedingen und so zur besseren Erkennung des Initiationscodons beitragen KOZAK 1986a Bez glich der L3i 10a und L3i 18 86 kann eine Bindung des Ribosoms an eine interne Ribosomen Eintrittsstelle PELLETIER u SO NENBERG 1988 vermutet werden da sich stromaufw rts des als Startpunkt ausgew hlten Tripletts mehrere AUG Codons befinden 5 6 Differentiell transkribierte Gene bei D viviparus Die abgeleiteten Aminos uresequenzen der differentiell transkribierten Gene der Hypobiose induzierten und nicht induzierten dritten D viviparus Larven wiesen beim Sequenzidentit ts vergleich signifikante Homologien mit Proteinen anderer Organismen und mitunter auch kon servierten Dom nen auf In diesem Kapitel soll die m gliche Bedeutung der Aufregulation dieser Gentranskripte welche im folgenden auch als L3ni respektive L3i assoziiert bezeich net werden im Hinblick auf die m gliche Bedeutung bei der Regulation der inhibierten und nicht inhibierten Entwicklung und damit verbundenen Vorg ngen des Zellstoffwechsels dis kutiert werden Diesbez glich werden ferner Analogien und Unterschiede zu C elegans erl u tert Bei diesem frei lebenden Erdnematoden konnten JONES et al 2001 mit Hilfe der SA 190 Diskussion GE 533 Transkripte ermitteln
270. r J Biochem 268 4200 4206 SCHNIEDER T 1992 Dictyocaulus viviparus Isolation and characterization of a recombinant antigen with potential for immunodiagnosis Int J Parasitol 22 933 938 SCHNIEDER T 1993a A dipstick immunoassay using a recombinant antigen for the rapid diagnosis of bovine dictyocaulosis Res Vet Sci 54 278 282 SCHNIEDER T 1993b The diagnostic antigen encoded by gene fragment Dv3 14 a major sperm protein of Dictyocaulus viviparus Int J Parasitol 23 383 389 SCHNIEDER T 2000 Helminthosen der Wiederk uer Befall mit Nematoden In M ROMMEL J ECKERT J E KUTZER W KORTING und T SCHNIEDER Hrsg Veterin rmedizinische Parasitologie 5 Aufl Verlag Paul Parey Berlin S 267 238 Literaturverzeichnis SCHNIEDER T u A BELLMER 1993 Seroepidemiologische Untersuchungen zur Ermittlung von Risikofaktoren bei der Dictyocaulose des Rindes Tier rztl Umschau 48 11 15 SCHNIEDER T A BELLMER u F J KAUP 1989 Neueste Erkenntnisse zur tiologie Pathogenese und Bek mpfung der Dictyocaulose Wien tier rztl Mschr 76 372 376 SCHNIEDER T A BELLMER u A M TENTER 1993 Seroepidemiological study on Dictyocaulus viviparus infections in first year grazing cattle in northern Germany Vet Parasitol 47 289 300 SCHNIEDER T C EPE u G v SAMSON HIMMELSTJERNA 1996a Species differentiation of lungworms Dictyocaulidae by polymerase chain reaction restriction
271. r Parasiten darstellt Hinweisend f r eine geneti sche Regulation ist dabei die M glichkeit der Selektion auf oder gegen die F higkeit zur Hy pobiose So konnten WATKINS u FERNANDO 1984 bei Obeliscoides cuniculi einem Nematoden des Kaninchens durch Selektion auf Entwicklungshemmung in nur f nf Genera tionen den Anteil inhibierter Stadien nach k hler Lagerung von 15 auf 90 steigern Auch das Produktionssystem kann eine solche Selektion bedingen Auf einer Farm in New South Wales fanden SMEAL u DONALD 1982a bei den dort gehaltenen Fleischrindern einen h heren Anteil hypobiotischer O ostertagi Larven als bei Milchrindern Die Autoren sahen die Erkl rung f r diese Tatsache in der unterschiedlichen Verf gbarkeit neuer Wirte W h rend im Zuge des intensiven Milchvieh Managements st ndig neue K lber geboren werden kalben Fleischrinder nur einmal j hrlich im Fr hling Somit sind die Parasiten zur Erhaltung ihrer Population auf die F higkeit zur Entwicklungshemmung angewiesen Eine Selektion gegen die Hypobiosef higkeit tritt des fteren unter Laborbedingungen auf da das Larven material f r k nftige Passagen meist zu Beginn der Patenz gesammelt wird Nach mehreren Passagen eines O ostertagi Stammes sprach dieser nicht mehr auf externe Hypobiose indu zierende Stimuli an ARMOUR et al 1967 Auch BORGSTEEDE u EYSKER 1987 beo bachteten unter Feldbedingungen eine verminderte Ansprechbarkeit eines O ostertagi Stammes der zuvo
272. r Parasiten inhibiert in K lbern konnte keine Entwicklungshemmung erkannt werden Der Effekt des Alters wird dabei durch vorangegangene Immunisierung potenziert So erh hte sich der Prozentsatz inhi bierter Stadien bei 21 Monate alten immunen Tieren auf 86 Bei immunen K lbern waren nur 23 der Parasiten in ihrer Entwicklung inhibiert Ob die Kompensationsf higkeit lterer Tiere bez glich der vom Parasiten ausgel sten Suppression der spezifischen und unspezifi schen Immunantwort KLESIUS 1988 diese Altersresistenz bedingt ist bislang nicht gekl rt 2 2 3 4 Infektionsdosis Mit steigender Infektionsdosis konnte bei verschiedenen Trichostrongyliden des Schafes eine erh hte Anzahl inhibierter Stadien im Wirtsorganismus beobachtet werden DUNSMORE 32 Schrifttum 1960 Auch EYSKER 1993 erkannte vermehrt hypobiotische O ostertagi Larven bei K l bern die ber eine Weideperiode hinweg auf einer sehr stark kontaminierten Fl che weideten Er brachte dies jedoch in Zusammenhang mit einer erworbenen Immunit t der Tiere Nach MICHEL 1978 kann dies auch eine Ansammlung inhibierter Larven darstellen da infolge der hohen Infektionsdosen insgesamt eine h here Parasitenb rde resultiert 2 2 3 5 Genetische Determination Verschiedene Autoren BLITZ u GIBBS 1972a ARMOUR u BRUCE 1974 CAPITINI et al 1990 FERNANDEZ et al 1999 gehen davon aus dass die Hypobiose eine genetisch ma nifestierte obligate berlebensstrategie de
273. r erhaltenen full length cDNAs in die jeweilige Aminos uresequenz wurde bei den Sequenzen L3ni 22 L3i 10a L3i 18 86 L3i 53 und L3i 100b auf Grund der im BLASTP festgestellten Homologien nicht das erste AUG Triplett der Nukleins uresequenz als Translationsstartpunkt gew hlt Dabei k nnen Abweichungen von der ersten AUG Re gel verschiedene Ursachen zugrunde liegen Folgt auf das erste AUG Triplett nach bis zu 30 Codons ein Terminationscodon kann die 40 S Untereinheit des Ribosoms an der mRNA ver bleiben und die Translation an einem sp teren AUG Codon erneut starten KOZAK 1987c LUUKKONEN et al 1995 KOZAK 1999 An diesem ist die Reinitiation am effizientesten wenn eine gewisse Entfernung zu dem Terminationscodon des vorherigen Leserahmens besteht KOZAK 1987c Dies konnte bei Sequenzen L3ni 22 und L3i 100b festgestellt werden Ferner beobachtete KOZAK 1987a dass die das AUG Triplett flankierenden Sequenzen dessen Erkennung als Initiationscodon beeinflussen Den optimalen Kontext f r den Start der Translation repr sentiert bei Vertebraten die Konsensus Sequenz GCCRCCaugG Befindet sich dabei an Position 3 ein A respektive G oder an den Positionen 3 und 4 ein G er folgt die Initiation der Translation unabh ngig von den restlichen in der Konsensus Sequenz vorliegenden Nukleotiden nahezu immer an diesem AUG Codon da es sich hier um die wichtigsten Positionen der Konsensus Sequenz handelt KOZAK 1986b KOZAK 1987b Li
274. r hohe Prozentsatz falsch positiver Klone beruht nach YOKOTA et al 2001 auf den vielen zu durchlaufenden PCR Zyklen Um die Zahl falsch positiver Klone zu minimieren wurde f r die SSH die Technik der mirror orientation selec tion entwickelt REBRIKOV et al 2000 F r eine hohe Anzahl falsch positiver Klone bei der RDA machen HUBANK u SCHATZ 1999 eine ungen gende Stringenz verantwortlich Mit erh hter Stringenz gehen jedoch im Zuge der wiederholten subtraktiven Hybridisierung einige differentielle Transkripte verloren IWAMA et al 1998 Ferner bedingen auch illegi time Sequenzfusionen sowie die Ligation partiell degradierter Oligonukleotide die oft recht hohe Zahl falsch positiver RDA Klone O NEILL u SINCLAIR 1997 HANSEN HAGGE et al 2001 IWAMA et al 1998 vermuten als weitere Ursache Qualit tsunterschiede der cDNA respektive der Amplikons Diese Autoren beobachteten auch eine Tendenz der RDA vorrangig kleine Fragmente der cDNAs zu isolieren Ebenso besa en zun chst die Inserts der mit den SSH Produkten erstellten subtrahierten cDNA Banken nur eine durchschnittlichen L nge von 200 bp da k rzere Fragmente effizienter hybridisieren sowie amplifiziert und in Vektoren ligiert werden DIATCHENKO et al 1999 Die Autoren entwickelten daher Adap ter die im Gegensatz zu denen des Originalprotokolls DIATCHENKO et al 1996 an den 5 Enden 22 identische Nukleotide aufwiesen Auch Molek le mit unterschiedlichen Adaptern an den E
275. r larva 2 3 3 1 Signalweg ber zyklisches Guanosinmonophosphat cGMP Die Gene daf 11 und daf 21 welche die Gruppe 1 der daf c Gene repr sentieren vermitteln auf derselben Stufe die chemosensorische Signaltransduktion in verschiedenen der Umwelt exponierten Amphidneuronen VOWELS u THOMAS 1992 VOWELS u THOMAS 1994 BIRNBY et al 2000 Bei dem daf 21 Genprodukt handelt es sich um das Hitzeschockpro tein 90 welches in den inhibierten Larven 15fach angereichert ist DALLEY u GOLOMB 1992 BIRNBY et al 2000 BIRNBY et al 2000 vermuten dass dieses Chaperon mit dem daf 11 Genprodukt assoziiert ist und dessen inaktive Form oder ein noch unbekanntes Protein welches f r die chemosensorische Transduktion von daf 11 ben tigt wird stabilisiert daf 11 welches in den ASI ASJ und anderen chemosensorischen Neuronen exprimiert wird co diert f r eine transmembranale Guanylyl Cyclase TM GC und katalysiert die Bildung von cGMP aus GTP BIRNBY et al 2000 cGMP fungiert als second messenger der Kinasen andere Nukleotid Cyclasen Phosphodiesterasen und cGMP gesteuerte Ionenkan le reguliert Schrifttum 37 Bei nicht Hypobiose induzierenden Bedingungen unterdr ckt daf 11 noch unbekannte Fakto ren in den ASI und ASJ Neuronen Damit wird die dauer f rdernde Aktivit t der ASJ Neuronen inhibiert und gleichzeitig in den ASI Neuronen die Transkription von daf 7 wel ches den TGF Signalweg einleitet gesteigert BIRNBY et al 2000 MUR
276. r lebenden Larven wurde mikroskopisch ZEISS kontrolliert Anschlie end erfolgten zur Auswaschung des NaOCl drei Waschschritte bei denen die Gef e mit DEPC Bidest auf 10 ml aufgef llt und jeweils 10 Minuten bei 600 g zentrifugiert wurden Nach jedem Zentri fugationsschritt wurde der berstand so weit wie m glich abgenommen das Larvenpellet durch Vortexen resuspendiert und wieder auf 10 ml aufgef llt Nach der letzten Zentrifugati on wurde das Larvenpellet in 500 ul GTC ME Puffer resuspendiert in ein 1 5 ml DEPC Gef berf hrt und bei 70 C gelagert 64 Material und Methoden 3 6 6 Degradation der Parasitenmembran Der Aufschluss der u eren und inneren Parasitenmembranen ist Voraussetzung fiir eine effi ziente RNA Isolierung Die u ere Membran wurde dabei von der Kutikula repr sentiert da ausschlie lich entscheidete Larven verwendet wurden Die Degradation der Parasitenmemb ranen geschah durch Zerm rsern der Larven unter fl ssigem Stickstoff Die f r die mRNA Isolierung eingesetzten 250 000 bis 520 000 L3 wurden dabei zun chst in ein 1 5 ml DEPC Gef zusammengef hrt und 5 Minuten bei 1500 g zentrifugiert Danach wurde der berste hende GTC ME Puffer abgenommen um das Gewicht der eingesetzten Larvenmenge zu be stimmen SATORIUS F r die sich anschlie ende Zerm rserung wurde das Larvenpellet in 70 ul DEPC Bidest resuspendiert in einen M rser berf hrt und mit einem Pistill zerkleinert Hierbei wurde d
277. r sollten zwei Gensequenzen die mit den Primerpaaren daf 12 bzw daf 16A synthetisiert wurden und im BLASTN signifikante Identit ten zeigten unter Verwendung genomischer DNA dritter D viviparus Larven amplifiziert werden um die mit genomischer DNA adulter Lungenw rmer erhaltenen Sequenzen zu verifizieren 3 16 3 1 Isolierung genomischer DNA In die Pr paration genomischer DNA mit Hilfe des NucleoSpin Tissue Kit MACHEREY amp NAGEL gingen je 20 000 L3ni bzw L3i ein Soweit nicht anders angegeben wurden alle Schritte nach dem Standardprotokoll des Herstellers durchgef hrt Die Lyse des eingesetzten Gewebes erfolgte mittels einer Proteinase K SDS L sung Daran anschlie end wurden durch die Zugabe chaotroper Salze sowie Ethanol zur F llung der DNA geeignete Voraussetzungen f r die Bindung der genomischen DNA an eine Silica Membran geschaffen Zur Beseitigung von Proteinen und sonstigen Kontaminanten schlossen sich zwei Waschschritte mit verschiedenen Puffern an bevor die genomische DNA zweimal mit je 50 ul auf 70 C vorgew rmtem autoklavierten Aqua bidest eluiert wurde 3 16 3 2 Primerdesign Basierend auf den ermittelten Gensequenzen daf 12 0o und daf 16A u wurden mit dem Soft wareprogramm Lasergene DNASTAR Primer mit unten aufgef hrter Sequenz ausgew hlt die neben den Primerpaaren daf 12 und daf 16A der Verifizierung dienen sollten Material und Methoden 123 daf 2RNA for daf I2RNA rev daf 16prp fo
278. rangegangenen Hybridisierungsschritt gebildeten Hybridmolek le erfolgte mittels chemilumineszenter Detektion Hierzu wurde ein mit alkalischer Phospha tase AP konjugierter gegen Digoxigenin gerichteter Antik rper auf die Membranen ver bracht Dessen Position wird durch die Zugabe eines von der Phosphatase umsetzbaren Sub strates sichtbar gemacht Damit kann indirekt auch die Position der hybridisierten Sonde be stimmt werden Als Substrat diente CSPD DIG High Prime Labeling and Detection Starter Kit I ROCHE dessen enzymatische Dephosphorylierung zur Bildung eines meta stabilen Dioxetan Phenolat Anions f hrt welches zerf llt und dabei in gepufferter L sung Licht von 477 nm emittiert Diese Lichtsignale wurden auf einem Chemilumineszenzfilm sichtbar ge macht Die Stamml sungen der in der Detektion verwendeten Puffer aus dem DIG Wash and Block Buffer Set ROCHE wurden entsprechend den Herstellerangaben zu gebrauchsfertigen L sungen verd nnt Alle Inkubationen erfolgten soweit nicht anders vermerkt unter leichtem Sch tteln bei Raumtemperatur Nachdem die hybridisierte Membran f r zwei Minuten in 500 ml Waschpuffer gewaschen worden war folgte eine Inkubation in 500 ml Blockierungsl sung f r 45 Minuten Von der Oberfl che des im DIG High Prime Labeling and Detection Starter Kit II ROCHE enthalte nen Anti Digoxigenin AP Konjugats 750 U ml welches zuvor 5 Minuten bei 10 000 g zentrifugiert worden war wurden 8 ul ab
279. ranskription der mRNA eine Amplifikation der Erststrang cDNA in Form einer Long Di stance LD PCR Die Verwendung amplifizierter cDNA bedingt jedoch eine erh hte Hinter grundreaktion in den sp teren PCRs der Suppression Subtractive Hybridization SSH Ferner besteht die Gefahr dass einige der Sequenzen verloren gehen weshalb eine Pr amplifikation der mRNA nach M glichkeit unterbleiben sollte DIATCHENKO et al 1996 DIATCHEN KO et al 1999 Um das Problem einer unerw nschten selektiven Amplifikation bestimmter Sequenzen zu umgehen und eine hoch repr sentative cDNA bei gleichzeitig guter Qualit t zu erhalten wurde die Amplifikationsreaktion vor Erreichen der Plateauphase beendet Als ein Kriterium zur Beurteilung der cCDNA Qualit t dient die L nge der resultierenden cDNA Fragmente Die mittels der SMART Technik synthetisierte cDNA wies in der Gele lektrophorese einen Gr enbereich von bis zu 5000 bp auf Daran gemessen dass die durch schnittliche Gr enverteilung der cDNA f r andere als S ugetierspezies oftmals nur 500 bis 3000 bp betr gt konnte von einer guten Qualit t der hergestellten cDNAs ausgegangen wer den Unklar blieb inwieweit die cDNA die einzelnen mRNA Spezies repr sentierte Nach ZHUMABAYEVA etal 2001 ist die SMARTTM Methode bei gleichzeitiger Restriktion auf die exponentielle Amplifikationsphase jedoch gut geeignet zur Synthese hoch repr sentativer cDNA Bei der weiteren Durchf hrung der SSH erwiesen
280. reaction Biophys J 71 101 108 PELLETIER J u N SONENBERG 1988 Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA Nature 334 320 325 PERKINS L A E M HEDGECOCK J N THOMSON u J G CULOTTI 1986 Mutant sensory cilia in the nematode Caenorhabditis elegans Dev Biol 117 456 487 PFEIFFER H 1971 Zur Kenntnis der Dictyocaulose des Rindes Wien tier rztl Monatsschr 58 54 63 PFEIFFER H 1976 Zur verz gerten Entwicklung des Rinderlungenwurmes Dictyocaulus viviparus Wien tier rztl Mschr 63 54 55 PFEIFFER H u R SUPPERER 1980 Die Dictyocaulose des Rindes Wien tier rztl Mschr 58 14 28 u 54 63 PIANO F A J SCHETTER D G MORTON K C GUNSALUS V REINKE S K KIM u K J KEMPHUES 2002 Gene clustering based on RNAi phenotypes of ovary enriched genes in C elegans Curr Biol 12 1959 1964 Literaturverzeichnis 235 PIENTA K J u E D SCHWAB 2000 Modified differential display technique that eliminates radioactivity and decreases screening time Biotechniques 28 272 277 PLOEGER H W 2002 Dictyocaulus viviparus re emerging or never been away Trends Parasitol 18 329 332 POPHAM J D u J M WEBSTER 1978 An alternative interpretation of the fine structure of the basal zone of the cuticule of the dauer larva of the nematode Caenorhabditis elegans Nematoda Can J Zool 56 1556 1563 POUPLARD L 19
281. ren ausbilden Im Idealfall weisen Vor w rts und R ckw rtsprimer den gleichen Schmelzpunkt auf welcher nach folgender Formel errechnet werden kann Tm N x GC x 4 N x AT x 2 Abb 6 Formel zur Errechnung der Schmelztemperatur Tm von Oligonukleoti den N Anzahl der Basenpaare THEIN u WALLACE 1986 70 Material und Methoden In dieser Arbeit erfolgte das Design der genspezifischen Primer fiir die konventionelle PCR mit Hilfe des Softwareprogramms Lasergene DNASTAR Version 5 06 die ausgew hlten und auf die oben beschriebenen Anforderungen berpr ften Primer wurden von der Firma INVITROGEN synthetisiert 3 7 5 Polymerase Kettenreaktion PCR Mit Hilfe der PCR SAIKI et al 1988 k nnen in vitro spezifische Nukleins uresequenzen vervielf ltigt werden Im ersten Reaktionsschritt unterliegt die doppelstr ngige DNA durch hohe Temperaturen einer Denaturierung so dass im nachfolgenden Schritt zwei die zu ampli fizierende DNA Sequenz flankierende Primer an den f r sie komplement ren Bereichen an die Einzelstr nge binden k nnen Annealing Eine thermostabile Polymerase synthetisiert im dritten Reaktionsschritt die zum jeweiligen Einzelstrang komplement re DNA Kopie Exten sion Diese drei Reaktionsschritte laufen in einer Anzahl von Zyklen hintereinander ab und bedingen so die Amplifikation der zwischen den Primern liegenden DNA Sequenz Zur Kon trolle des korrekten Ablaufs der PCR in den Thermocyclern BIOMETRA
282. ren nach BAERMANN 1917 dient dem direkten und spezifi schen Erregernachweis Laut SCHNIEDER u BELLMER 1993 wurde diese Technik in 258 nieders chsischen Betrieben jedoch nur in 2 7 der F lle zur Best tigung der Verdachtsdi agnose angewandt Mit Hilfe dieser Methode ist wie auch beim Nachweis von Eiern und Larven im Sputum infizierter Tiere BOON et al 1984 der direkte Erregernachweis fr hes tens drei Wochen p i m glich JARRETT et al 1958 D WEL 1971 BOS u BEEKMAN 1985 F r eine sichere Herdendiagnose sind bei negativem Untersuchungsbefund Proben nahmen von mehreren Tieren an aufeinander folgenden Tagen notwendig PFEIFFER u SUPPERER 1980 da die Parasitenausscheidung der Wirtstiere intervallweise und quantitativ unterschiedlich erfolgt TAYLOR 1951 JARRETT et al 1958 DUWEL 1971 20 Schrifttum Serologische Nachweisverfahren stellen eine weitere M glichkeit zur Diagnose einer Lun genwurminfektion dar Der Infektionsnachweis durch stark ansteigende Titer komplement bindender Antik rper wurde erstmals von JARRETT et al 1955a beschrieben Dieser Anti k rperanstieg kann erstmalig vier bis sechs Wochen p i unter Verwendung von aus adulten Parasiten gewonnenem Antigen verzeichnet werden JARRETT et al 1959 CORNWELL 1960 Auch der Agargelpr zipitationstest erlaubt nur den Nachweis einer patenten Infektion PARFITT u SINCLAIR 1967 SWIETLIKOWSKI 1969 Der indirekte H magglutinati onstest eignet sich zum Antik rpe
283. rf hrt und wiederum mit P C I ver setzt erneut zentrifugiert und die obere Phase in ein neues Gef gegeben Nach nochmaliger Durchf hrung dieses Schrittes waren in der Interphase keine Pr zipitate mehr sichtbar Die Proben wurden daraufhin mit je 450 ul Chloroform Isoamylalkohol 24 1 versetzt und gr nd lich gemischt Im Anschluss an die einmin tige Zentrifugation bei 13 000 g wurde die obere Phase in ein neues 1 5 ml Gef gegeben Mit der jeweils verbliebenen Interphase sowie unte ren Phase wurde eine R ckextraktion vorgenommen um den Verlust an cDNA m glichst gering zu halten Hierzu wurden die jeweils verbliebenen Phasen der obigen Extraktion in ein 2 ml Gef gegeben und je 200 ul 1x TNE Puffer hinzugef gt durchmischt und wie oben beschrieben zentrifugiert Die obere w ssrige Phase des L3ni L3i und HSM Ansatzes wur de abgenommen und auf die entsprechenden Proben der P C I C I Extraktion verteilt die un tere Phase und die Interphase wurden verworfen Material und Methoden 81 3 8 6 2 S ulenchromatographie Zur Entfernung der 23 bp langen abgespaltenen Primersequenzen aus den mittels Phenol Chloroform Extraktion vorgereinigten Proben wurden CHROMA SPIN 100 DEPC H20 Columns BD CLONTECH verwendet deren Porengr e eine ber 99 ige Entfernung von bis zu 30 bp langen Oligonukleotiden bedingt Da mit den CHROMA SPIN 100 Columns nur ein Volumen von 40 bis 75 ul aufgereinigt werden kann erfolgte eine Einengung
284. rial und Methoden 63 3 6 4 3 Ermittlung der Larvenausscheidung Am 21 Tag post infectionem p i wurde den drei Versuchskalbern rektal Kot entnommen Von jedem Tier wurden zweimal je 10 g Kot abgewogen um die Zahl der ausgeschiedenen Larven mittels des Trichter Auswanderverfahrens BAERMANN 1917 zu ermitteln Auch am Tag der T tung erfolgte eine rektale Kotentnahme Von Kalb 1 und 2 wurden zweimal je 5 g Kot von Kalb 3 zweimal je 10 g Kot abgewogen und dem Trichter Auswanderverfahren unterzogen 3 6 5 Entscheidung infekti ser D viviparus Larven Das mit Natriumhypochlorid NaOCl zu entscheidende Larvenmaterial stellten die dritten doppelt bescheideten unbehandelten sowie Hypobiose induzierten Larven dar Um einen ge wissen Reinigungseffekt zu erzielen wurden die Larven am Tag vor der Entscheidung in ei nen 250 ml Standzylinder gegeben und dieser mit Leitungswasser aufgef llt Die Sedimenta tion der Larven fand ber Nacht bei Raumtemperatur RT bzw 4 C statt Am darauf folgen den Tag wurde der berstand abgenommen Nachdem die Larven mit DEPC Bidest auf ca 15 ml aufgef llt wurden erfolgte eine Ausz hlung der lebenden Larven Diese wurden dann in Portionen zu jeweils 50 000 bis 100 000 L3 in 11 ml Gef e berf hrt und mit DEPC Bidest auf 5 ml aufgef llt Nach der Zugabe von 250 ul NaOCl 12 Cl fand eine 15 min tige Inkubation bei 37 C unter Sch tteln bei 150 rpm GFL statt Die vollst ndige Entschei dung de
285. rien und Vektoren 3 5 Versuchsplan 3 6 Parasitologisches Probenmaterial und dessen Aufbereitung 3 6 1 Etablierung eines Laborstammes 3 6 2 Isolierung von Lungenwurmlarven aus dem Kot 3 6 3 Induktion der Entwicklungshemmung 3 6 4 Uberpriifung der Hypobiosefahigkeit des Laborstammes 3 6 4 1 Experimentelle Infektion 3 6 4 2 Isolierung von D viviparus Stadien aus der Lunge 3 6 4 3 Ermittlung der Larvenausscheidung 3 6 5 Entscheidung infekti ser D viviparus Larven 3 6 6 Degradation der Parasitenmembran 3 7 Allgemeine molekularbiologische Methoden 3 7 1 mRNA Isolierung 3 7 2 Quantitative Bestimmung und Reinheit der isolierten mRNA 3 7 3 cDNA Synthese 3 7 3 1 Erststrang cDNA Synthese 3 7 3 2 Zweitstrang cDNA Synthese mittels Long Distance LD PCR 3 7 3 3 Bestimmung der optimalen Anzahl an LD PCR Zyklen 3 7 4 Primerdesign 3 7 5 Polymerase Kettenreaktion PCR 3 7 6 Darstellung von Nukleins uren durch A garosegelelektrophorese 3 7 7 Isolierung von PCR Fragmenten aus Agarosegelen 3 7 8 Klonierung von PCR Amplifikaten 3 7 8 1 Klonierungsvektor 3 7 8 2 Ligation 3 7 8 3 Transformation 3 7 9 Plasmidpr paration 3 7 9 1 Plasmidpr paration mittels Miniprep 3 7 9 2 Plasmidpr paration mittels Midiprep 3 7 9 3 Darstellung der Inserts 3 7 10 Sequenzierung der Inserts und Sequenzbearbeitung 3 7 10 1 Automatische Sequenzierung 3 7 10 2 Sequenzbearbeitung und Sequenzidentit tsvergleich 3 8 Suppression Subtractive Hybridization 3 8 1 Revers
286. rimerbindungsstellen an beiden Enden und unterliegen einer exponentiellen Amplifikation Das entstandene PCR Produkt wird mit Mungobohnennuklease verdaut um vorhandene einzelstr ngige cDNAs wie sie z B bei der linearen Amplifikation entstehen zu entfernen Damit erfolgt eine weitere Anreicherung der Target Sequenzen im Reaktionsan Schrifttum 49 satz In diesem werden wiederum die Adapter abgespalten und neue ligiert gefolgt von sub traktiver Hybridisierung mit erh hter Stringenz und selektiver Amplifikation Nach nochma liger Wiederholung dieser Prozedur liegt schlieBlich ein drittes Differenzprodukt fiir die Er stellung der subtrahierten CDNA Bank vor Tester mit Adapter 1 Driver mit Adapter 1 ng eng Schmelzen des 12 bp Oligonukleotids Auff llen der Enden FCR Restritions enzyme p altung Tester mit Adapter 2 Schmelzen _ Hybridisierung mit Driver im berschu z2s e exponentielle Amplifkation lineare Amplifk ation keine Amplifk ation Werdau mit Mlun gob ohnennuklease erstes Differenzprodu kt Restrktiors enzyrmwer dau Ad apter ligation wiederholte Subtraktionen und Amplifk ationen Abb 2 Schema der Representational Difference Analysis 50 Schrifttum 2 4 2 2 Suppression Subtractive Hybridization SSH Die Suppression Subtractive Hybridization SSH DIATCHENKO et al 1996 erreicht einen Konzentrationsausgleich der verschiedenen cDNAs und kann durch diese Normalisierung auch seltene
287. rkennbar Somit konnte von einer erfolgreichen subtraktiven Hybridisierung und Suppression PCR ausgegangen werden Die beschriebenen Beobachtungen waren bei der Durchf hrung 2 im Gegensatz zur im Folgenden abgebildeten Durchf hrung 1 insgesamt we niger deutlich erkennbar Ergebnisse 131 2000 bp 800 bp 400 bp 200 bp 100 bp Abb 20 Suppression PCR 2 Yiges Agarosegel M Low DNA MASS Ladder 1 subtrahierte cDNA Doppelans tze bei L3i und L3n1 2 nicht subtrahierte Tester Kontrolle P subtrahierte Kontroll DNA K Negativkontrolle 4 3 8 Nested PCR Nach erfolgter Nested PCR sollte sich das Bandenmuster der subtrahierten HSM cDNA wei ter dem der subtrahierten Kontroll DNA angleichen Dies wurde in der vorliegenden Arbeit jedoch nicht erreicht vielmehr waren einige der mittels Suppression PCR entstandenen Ban den der subtrahierten HSM cDNA nun nicht mehr im Agarosegel auffindbar Auch gelang es nicht mehr die schwachen Banden der jeweiligen Doppelans tze der subtrahierten L3ni und L3i cDNA darzustellen Entgegen der Erwartung in der gelelektrophoretischen berpr fung der Amplifikationsreaktion einen noch deutlicheren Unterschied zwischen den subtrahierten Proben und den zugeh rigen nicht subtrahierten Tester Kontrollen als nach der Suppression PCR zu erkennen glich sich das Bild der jeweiligen Proben weitestgehend an 132 4 3 9 Analyse der Subtraktionseffizienz Ergebnisse Die spektrophotometrische Messung
288. rliegenden Arbeit mit den insgesamt 83 ermittelten Sequenzen der daf und age 1 spezifischen PCR beim Se quenzidentit tsvergleich sowohl auf Nuklein als auch Aminos ureebene keinerlei hnlich keit mit der age 1 respektive den daf Gensequenzen von C elegans festgestellt werden Da Diskussion 203 her ist zweifelhaft ob Homologe dieser Gene im Lungenwurmgenom vorliegen Einschran kend muss jedoch bemerkt werden dass der Einsatz genspezifischer Primer eine weitestge hende bereinstimmung von eventuell gemeinsam vorliegenden Gensequenzen voraussetzt Die Verwendung degenerierter Primer hingegen w rde auch eine Amplifikation von Se quenzabschnitten mit geringerer Identit t erlauben Da allerdings schon mit den genspezifi schen Primerkombinationen fast ausschlie lich ein multiples Bandenmuster erzeugt wurde erscheint diese Vorgehensweise wenig geeignet Dieses Problem k nnte durch die Verwen dung von cDNA statt genomischer DNA als Matrize vermindert werden da erstere aufgrund fehlender Intronsequenzen eine geringere Komplexit t aufweist Nicht empfehlenswert f r eine Untersuchung auf Genhomologe ist nach den Ergebnissen dieser Arbeit der Einsatz ge nomischer DNA adulter D viviparus Exemplare Bei der Entnahme aus der Lunge verursa chen am Nematoden anhaftende Wirtszellen eine Kontamination der zu isolierenden genomi schen DNA der Parasiten So misslang bei der berpr fung der Sequenzen 16A u und 12 0 mittels genomischer DNA dritt
289. rnachweis sowohl nach einer Infektion als auch einer Vak zination BOKHOUT et al 1979 Zwar beobachteten DE LEEUW u CORNELISSEN 1991 Kreuzreaktionen mit Seren von Tieren die mit Fasciola hepatica und Ascaris suum monoinfiziert waren die Titer waren jedoch sehr gering MARIUS et al 1979 stellten den ersten Enzyme linked Immunosorbent Assay ELISA f r D viviparus vor Bei Verwendung von aus adulten Lungenw rmern gewonnenem Rohantigen erwies sich dieser Test als sehr sensitiv wobei der initiale Titeranstieg fr hestens drei BOON et al 1982 bis vier MARIUS et al 1979 Wochen p i registrierbar ist Zwei Wochen p i also noch w hrend der Pr patenz konnten BOS u BEEKMAN 1985 unter Verwendung somatischen Antigens aus dritten sowie in vitro kultivierten vierten Larven einen signifikan ten Titeranstieg feststellen SCHNIEDER 1992 1993b beschrieb den Einsatz eines rekombinanten Antigens zur Diag nose der Diktyokaulose des Rindes Als Gluthation S Transferase Fusionsprotein ergab das DvGST3 14 Antigen im indirekten ELISA bei Untersuchung von Seren experimentell infi zierter K lber eine 93 ige Sensitivit t bei 99 iger Spezifit t Da es sich bei dem Antigen um ein spezifisches Protein adulter Lungenw rmer handelt reagieren Seren vakzinierter Tiere nicht positiv SCHNIEDER 1993b Dieses rekombinante Antigen diente der Entwicklung eines diagnostischen Dipstick Immunoassays welcher eine hohe Spezifit t und Sensitivit t be
290. rprinting Methoden durch den Einsatz von Zufallsprimern haufig nur einen Teil der mRNAs ab Sie k nnen daher fiir Untersuchungen bei welchen nur wenige differentielle Transkripte erwartet werden ungeeignet sein SOMPAYRAC et al 1995 Um alle der sch tzungsweise 15 000 verschiedenen mRNAs zu visualisieren werden nach LI ANG u PARDEE 1992 bzw BAUER et al 1993 f r das Differential Display 240 respek tive 312 Primerkombinationen ben tigt Spezifisch f r das Differential Display ist dass die ses sich auf Differenzen des 3 Endes der transkribierten Sequenzen beschrankt Solche in der 5 Region wie Varianten alternativ gesplei ter mRNAs werden meist nicht detektiert Be z glich des 3 Endes ist die Methode infolge des Einsatzes eines Oligo dT Primers aller dings auf poly adenylierte mRNAs limitiert 46 Schrifttum Differential Dis play RNA Arbitrany Primed PCR Ada Ag AA MUTTITITT Erststrang cDNA Synthese Zweitstrang tDMA Synthese m NVITITITT vergleichende Gelelektrophorese EF E3 Abb 1 Schema des Differential Display und der RNA Arbitrarily Primed PCR V A C oder G N A C G oder T Schrifttum 47 2 4 2 Subtraktive Hybridisierungsverfahren Durch Einwirkung von Hitze oder Schaffung alkalischer Verh ltnisse einzelstr ngig vorlie gende DNAs bzw RNAs besitzen die F higkeit ber Basenpaarungen mit komplement ren DNA oder RNA Str ngen stabile Duplexe zu bilden Dieser als Hybrid
291. rug Die Uberpriifung der L3ni cDNA ergab bei der TK nach 28 Zyklen eine Ergebnisse 133 Bande welche in geringerer Intensit t erst nach 10 weiteren PCR Zyklen bei der subtrahier ten cCDNA erschien Obwohl nach der Nested PCR im Agarosegel keine deutlichen Unter schiede zwischen subtrahierter cDNA und der jeweiligen TK sichtbar waren konnte somit eine gute Subtraktionseffizienz f r beide Larvenpopulationen der Durchf hrung 1 festgestellt werden Bei den Proben der Durchf hrung 2 hingegen die in der zweiten subtraktiven Hybridisierung gem dem Herstellerprotokoll behandelt wurden war die Subtraktionseffi zienz unzureichend Es erschienen sowohl bei der subtrahierten cDNA als auch der TK der L3ni und L3i erst nach Ablauf von 38 PCR Zyklen schwach erkennbare Amplifikationspro dukte nach 43 Zyklen war jeweils eine deutliche Bande vorhanden YB a 2000 bp 800 bp p 800 bp 200 bp 200 bp M12345 678 910K M123 45 67 8 910K L3i L3ni Abb 21 Analyse der Subtraktionseffizienz der Durchf hrung 1 2 Yiges Agarosegel M Low DNA MASS Ladder 1 5 subtrahierte cDNA 1 6 18 PCR Zyklen 6 10 nicht subtrahierte TK 2 7 23 PCR Zyklen K Negativkontrolle 3 8 28 PCR Zyklen 4 9 33 PCR Zyklen 5 10 38 PCR Zyklen 4 4 Subtrahierte cDNA Banken 4 4 1 Nested PCR Die Nested PCR zur Erstellung der subtrahierten cDNA Banken in welcher die subtrahierte L3ni und L3i cDNA der Durchf hrung 1 als Template eingesetzt wurde ergab nach der Ge
292. ryontischen mRNAs vorliegende homopolymere Poly A Sequenz Die Synthese des 5 Endes der Erststrang cDNA beruht auf dem unter 3 7 3 1 beschriebenen Template Swit ching der MMLV RT wobei die komplement re Sequenz des SMART II A Oligonukleo tid welche als Primerbindungsstelle fungiert der entstandenen Erststrang cDNA angef gt wird Erfolgt jedoch ein unerw nschtes Priming durch das SMART II A Oligonukleotid besitzen die entstehenden cDNA Molekiile diese Sequenz an beiden Enden was eine Hinter grund Amplifikation in der 5 RACE zur Folge h tte Aus diesem Grund wird die 5 RACE als Suppression PCR durchgef hrt s Abb 8 Die erforderlichen inverted repeats an den Enden der cDNA werden durch eine Step out PCR generiert in welcher ein Mix aus zwei Primern die Inkorporation dieser zus tzlichen Sequenzen bedingt Ein Primer beinhaltet diese Sequenz als einen nicht hybridisierenden berhang welcher den Enden des Templates in den Material und Methoden 107 ersten Zyklen der PCR hinzugef gt wird MATZ et al 1999 In den folgenden PCR Zyklen dient ein zweiter zu der Uberhangssequenz komplementirer kiirzerer Primer als Startsequenz f r die Polymerase Dieser zweite Primer liegt in einer viel h heren Konzentration im Pri mermix vor Daher tritt im Zuge dieser Step out PCR bedingt durch die Lange der inverted repeats bei SMART II A Oligonukleotid geprimten Sequenzen ein Suppressionseffekt ein So erfolgt bei der Verwendung d
293. s Cattle infected with hypobiotic larvae play an important epidemiological part as silent car riers ensuring parasite survival from year to year Assuming that inhibition of development of D viviparus induced by external factors is genetically regulated the gene transcription of hypobiosis induced and not induced third stage larvae was compared To investigate differen tial gene transcription of hypobiosis induced and not induced larvae Suppression Subtractive Hybridization was used to enrich differentially transcribed gene fragments for creating sub tracted libraries containing 105 clones of the inhibited and 104 clones of the not inhibited larvae After Differential Screening 54 clones of the hypobiosis induced and 44 clones of the not induced stages were remaining as differential sequences From these 26 and 22 clones could be verified by Southern dot blotting respectively Of the in all 48 gene transcripts 20 transcripts showed significant homologies with 16 different nucleotide and protein sequences respectively By performing Rapid Amplification of cDNA Ends and a spliced leader 1 SL1 specific PCR the full length of 16 sequences for the 3 as well as the 5 end was obtained thereby observing transcript variants of nine gene sequences Renewed search for sequence identities to the transcripts of the not induced larvae resulted in significant homologies to ex tracellular cooper zinc superoxide dismutases SOD paramyosins nuclear an
294. s 65aa 50 70 Protein 685 aa von C elegans NP_510557 2 und T19968 gcy 32 646 aa l sliche Guanylyl Cyclase 684 aa und ein 66aa 43 65 hypothetisches Protein 699 aa von C elegans sowie die l sliche Guanylyl Cyclase 2 beta 406 aa von Limax marginatus NP_506452 3 CAC35530 1 T18984 BAC80153 1 Weitere signifikante Homologien mit Guanylyl Cyclasen von C elegans und anderen Orga nismen z B R norwegicus D melanogaster werden hier nicht weiter beschrieben L3i 99 zwei DM DNA Bindungsdom nen enthaltende Proteine 510 aa 110aa 49 63 bzw 470 aa von C elegans NP_502770 1 bzw NP_502771 1 L3i 100a Mitglied der Calmodulin Familie 202 aa von C elegans 18laa 82 90 NP_506147 1 hypothetisches Protein 201 aa von C briggsae CAE75516 1 18laa 82 90 Weitere signifikante Homologien mit Calmodulin Sequenzen und hypothetischen Proteinen der oben genannten Organismen werden an dieser Stelle nicht weiter aufgef hrt Tab 5 Sequenzidentit ten und Sequenz hnlichkeiten auf Aminos ureebene Ergebnisse 161 Ging die gesamte Aminos uresequenz in den Identit tsvergleich ein zeigten sich bei folgen den Sequenzen Ver nderungen bez glich der oben beschriebenen ab dem ersten Methionin festgestellten bereinstimmungen Die L3ni 67 Sequenz wies mit den oben genannten Prote in Isoformen von C elegans nun Identit ten ber 213 Aminos uren bei einer Sequenzidentit t von 40 und einer Sequenz hnlichkeit von 50 auf
295. s TBLASTX festgestellte Homologien 4 9 Charakterisierung der differentiell transkribierten Gene 4 9 1 Spezifitat der RACE Primer 4 9 2 Sequenzierung der GSP Amplifikationsprodukte 4 9 3 Rapid Amplification of cDNA Ends RACE und spliced leader 1 SL1 PCR 4 9 4 Erstellung vollst ndiger Sequenzen der differentiell transkribierten Fragmente 4 9 5 Sequenzidentit tsvergleiche 4 9 5 1 Sequenzidentit tsvergleich auf Nukleins ureebene 4 9 5 2 Sequenzidentit tsvergleich auf Aminos ureebene 4 9 5 3 berpr fung auf konservierte Dom nen 4 10 berpr fung differentiell transkribierter Sequenzen mittels konventioneller PCR 4 11 Quantitative real time PCR qPCR der L3ni 69 92 und L3i 82 100 4 11 1 Charakterisierung eines EF 1a und B Tubulin Genfragments 4 11 2 Differentielle Transkription unter Bedingungen der qPCR 4 11 3 qPCR mit TaqMan Sonden 4 11 4 qPCR mit TaqMan MGB Sonden 4 12 daf und age 1 spezifische PCR 4 12 1 Sequenzidentit tsvergleich auf Nukleins ureebene 4 12 2 Sequenzidentit tsvergleich auf Aminos ureebene 4 12 3 berpr fung der Sequenzen 16Au und 120 124 125 125 126 127 127 128 128 130 131 132 133 133 134 135 135 135 137 140 140 140 140 141 141 143 144 144 145 149 151 151 151 153 154 157 157 158 162 164 166 166 167 168 168 174 174 176 177 5 Diskussion 5 1 5 2 5 3 5 4 5 5 5 5 1 3 9 2 5 5 3 5 5 4 5 5 5 5 6 5 6 1 5 6 2 5 7 5 8
296. s einzige bei Verwendung von L3ni cDNA als Template wenn im Agarosegel ein Amplifikationsprodukt sichtbar war 4 11 Quantitative real time PCR qPCR der L3ni 69 92 und L3i 82 100 4 11 1 Charakterisierung eines EF 1a und Tubulin Genfragments Die Amplifikationsprodukte der mit degenerierten Primern f r die housekeeping Gene EF la und Tubulin amplifizierten L3ni respektive L3i cDNA wiesen im 2 igen Agarosegel Banden der erwarteten Fragmentl nge von ca 290 bp EF 1a bzw 370 bp Tubulin auf Davon wurden jeweils zwei L3i Klone und ein L3ni Klon sequenziert Im Align Plus wie sen die 334 bp langen Tubulin Fragmente untereinander eine 100 ige bereinstimmung auf Die 244 bp umfassenden EF 1o Sequenzen zeigten sich bez glich der entsprechenden Vorw rts und R ckw rtssequenzen zu 100 identisch der Vergleich der Sequenzen unter einander ergab eine bereinstimmung von 98 Der Sequenzidentit tsvergleich mit publizierten Sequenzen anderer Organismen erfolgte mit tels BLASTN NCBI Hierbei wies das Tubulin Fragment ber 333 Nukleotide hinweg eine 83 ige Homologie zu einer B Tubulin Sequenz von Cyathostomum pateratum AF487833 1 auf eine Identit t von 82 bestand ber einen Bereich von 274 bp mit Cyli cocyclus nassatus AF181092 1 Zudem bestehende Identit ten mit B Tubulin Sequenzen weiterer kleiner Strongyliden des Pferdes Magen Darm Strongyliden des Schafes sowie an deren Organismen werden an dieser
297. s in 182 Aminos uren trans latiert wurde Diese zeigten auf einer L nge von 217 Aminos uren Identit ten von 41 49 mit zwei durch alternatives Splei en entstehenden DM DNA Bindungsdom nen enthal tenden Proteinen von C elegans NP_502770 1 NP_502771 1 Die 398 bp lange und in 105 Aminos uren translatierte Insertsequenz des Klons L3ni 17 zeig te ber 44 Nukleotide hinweg eine 93 ige Teilidentit t mit zwei essentiellen Troponin T Sequenzen tnt 4 sowie einem Cosmid von C elegans NM_071143 2 NM_ 182357 1 sowie AF039039 2 Des Weiteren bestand auf Aminos ureebene ber 102 Aminos uren hinweg eine 75 ige bereinstimmung 89 mit Troponin T tnt 3 und einem hypothetischen Pro tein von C elegans NP_509338 1 sowie T15496 Eine 88 ige bzw 81 ige bereinstim mung ber einen 44 bp respektive 81 bp umfassenden Bereich ergab sich mit drei weiteren tnt 3 Sequenzen von C elegans NM_171736 1 NM_076937 1 NM_07636 1 bereits auf Ergebnisse 149 Nukleins ureebene das E Value betrug jedoch nur 0 012 Mit Troponin von O ostertagi CAD11862 1 waren auf einer L nge von 100 Aminos uren 72 identisch 86 Weitere signifikante Homologien mit verschiedenen Troponin Sequenzen anderer Organismen wie Troponin T von Libellula pulcella und Periplaneta americana werden an dieser Stelle nicht weiter aufgef hrt Dieser Klon wies beim Southern dot blotting Unterschiede in der Signalin tensit t bez glich der beiden Larvenpopu
298. s of two genes that affect nervous system structure in Caenorhabditis elegans Genetics 116 377 388 HIEPE T 1985 Lehrbuch der Parasitologie Veterin rmedizinische Helminthologie Verlag Fischer Jena Bd 3 S 419 Literaturverzeichnis 225 H GLUND J C SVENSSON u A HESSLE 2001 A field survey on the status of internal parasites in calves on organic dairy farms in southwestern Sweden Vet Parasitol 99 113 128 H GLUND J E WILHELMSSON D CHRISTENSSON T MORNER P WALLER u J G MATTSSON 1999 ITS2 sequences of Dictyocaulus species from cattle roe deer and moose in Sweden molecular evidence for a new species Int J Parasitol 29 607 611 HOLLAND P M R D ABRAMSON R WATSON u D H GELFAND 1991 Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5 3 exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase Proc Natl Acad Sci USA 88 7276 7280 HOPPE P E u R H WATERSTON 2000 A region of the myosin rod important for interaction with paramyosin in Caenorhabditis elegans striated muscle Genetics 156 631 643 HORAK I G 1981 The similarity between arrested development in parasitic nematodes and diapause in insects J Afr Vet Med Assoc 52 299 303 HUBANK M u D G SCHATZ 1994 Identifying differences in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA Nucleic Acids Res 22 5640 5648 HUBANK M u D G SCHATZ 1999 cDNA represent
299. s weiterhin ein genspezifischer R ckw rtsprimer f r die SLI PCR ausgew hlt Da in dieser PCR die Annealingtemperatur 62 C betragen sollte wurde bei der Auswahl der Primer die unter 9 1 mit SL1 bezeichnet sind eine Schmelztemperatur von 64 C bis 71 C gefordert 3 13 2 berpr fung der RACE Primer Dieser Vorversuch diente der berpr fung der Funktionalit t und Spezifit t der f r die ein zelnen Genfragmente ausgew hlten GSP for und GSP rev In der Touchdown PCR diente je nachdem welcher Larvenpopulation die GSPs zugeh rig waren cDNA der L3ni bzw L3i als Matrize Die 20 ul Ans tze enthielten folgende Reagenzien Material und Methoden 105 2 ul 10x Advantage 2 PCR Puffer 1 ul GSP for 50 uM 1 ul GSP rev 50 uM 0 4 ul dNTP Mix je 10 mM 0 2 ul Polymerase Mix 1 ul cDNA Folgendes Temperaturprofil fand in der Touchdown PCR Anwendung Denaturierung 94 C 10 Sekunden 5 S Primerannealing und extension 72 C 3 Minuten Denaturierung 94 C 10 Sekunden 5x Primerannealing 70 C 15 Sekunden Primerextension 72 C 3 Minuten Denaturierung 94 C 10 Sekunden 20x Primerannealing 68 C 15 Sekunden Primerextension 72 C 3 Minuten Nach Ablauf der PCR wurden die Amplifikationsprodukte gelelektrophoretisch analysiert Da die Amplifikationsprodukte der GSP einiger Klone zwei oder drei Banden im Agarosegel entstehen lie en wurden zur Kl rung dieses Umstandes die entstandenen Banden aus dem
300. sertbereich des Klons L3ni 56 homolog war ist in Abb 30 dargestellt Die Ampli fikationsprodukte der GSPs f r den Klon L3i 82 erwiesen sich als 363 bp 468 bp und 538 bp umfassende Sequenzen deren L ngendifferenzen ebenfalls zwei Sequenzl cken mit einer L nge von 72 bp respektive 104 bp bedingten Keine dieser drei Sequenzen stimmte dabei mit dem zugeh rigen Teilbereich der Klone L3i 82 bzw L3i 101 zu 100 berein es traten wie derum Sequenzl cken auf gatgatggattttgttassaacattaggtttgtttattgasatcacctaatt Abb 30 Alignment Ausschnitt der drei L3ni 56 GSP Banden Ergebnisse 153 4 9 3 Rapid Amplification of cDNA Ends RACE und spliced leader 1 SL1 PCR Die differentiell transkribierten Genfragmente der L3ni und L3i sollten durch den Einsatz genspezifischer Vorw rts bzw R ckw rtsprimer vervollst ndigt werden Bei der Durchf hrung der RACE gestaltete sich insbesondere die 5 RACE als schwierig da mit der zun chst generierten Erststrang cDNA bei den Sequenzen L3ni 67 L3i 10 L3i 82 sowie L3i 88 kein Amplifikationsprodukt generiert werden konnte Auch ein erneuter Ver such mit Erststrang cDNA f r deren Synthese mRNA unter Verwendung der entsprechenden genspezifischen R ckw rtsprimer anstelle des 5 RACE CDS Primers umgeschrieben wurde blieb erfolglos Daher wurde eine dritte reverse Transkription mit dem 5 RACE CDS Primer durchgef hrt Letztlich gelang es mittels der verschiedenen Matrizen und Primer nach
301. ses Feldisolat diente als Ausgangs material f r die folgenden im Institut f r Parasitologie der Tier rztlichen Hochschule Hanno ver stattfindenden Passagen im Wirt Material und Methoden 61 3 6 2 Isolierung von Lungenwurmlarven aus dem Kot Mit Hilfe des Trichter Auswanderverfahrens BAERMANN 1917 wurden erste unbescheide te Larven aus rektal entnommenem Kot experimentell infizierter K lber gewonnen Um die Verunreinigungen in der abgelassenen Larvensuspension zu reduzieren erfolgte eine Sedi mentation der Larven ber Nacht in 500 ml Standzylindern Am folgenden Tag wurde der berstand abgenommen und ein zweites Trichter Auswanderverfahren ber Siebe mit einer Maschenweite von 50 um welche zus tzlich mit 3 Lagen Zellstoff ausgeschlagen wurden angeschlossen Die so gewonnenen Larven wurden in Leitungswasser in 200 ml Erlenmeyer kolben bei Raumtemperatur inkubiert Zur Vermeidung von Kontaminationen erfolgte mittels Parafilm RENNER ein weitestgehender Verschluss der Gef ffnung Nach 5 bis 10 Ta gen wurden die nun als doppelt bescheidete infekti se dritte Entwicklungsstadien L3 vor liegenden Larven weiterverarbeitet 3 6 3 Induktion der Entwicklungshemmung Zur Untersuchung der Gentranskription bei entwicklungsgehemmten dritten Lungenwurmlar ven L3i wurde bei einem Teil der aus dem Kot isolierten Larven die Hypobiose durch sechs bis achtw chige K hlung experimentell induziert INDERBITZIN 1976 Zur Ermittlung
302. sich die nach dem Herstellerprotokoll des SMART PCR cDNA Synthesis Kit BD CLONTECH einzusetzenden cDNA Mengen als ungen gend So wurde die n tige cDNA Konzentration von mindestens 300 ng ul f r die Adapterligation erst erreicht als nach der LD PCR mit der dreifachen der angegebenen cDNA Menge fortgefahren wurde Erkl rbar ist dies durch die mehrfachen Aufreinigungs Diskussion 181 und Konzentrationsschritte welche jeweils mit einem Verlust an cDNA einhergehen Auch BECK et al 2001 stellten fest dass die in verschiedenen Protokollen angef hrte Ausgangs menge von bis 4 ug mRNA DIATCHENKO et al 1996 DIATCHENKO et al 1999 STEIN 2001 f r die cDNA Synthese ohne zus tzlichen Amplifikationsschritt unzureichend ist Die Autoren geben eine ben tigte Ausgangsmenge von mindestens 10 ug mRNA an STEIN 2001 sieht in einer unvollst ndigen Restriktionsenzymspaltung mit Rsal einen weite ren kritischen Punkt f r das Gelingen der SSH und empfiehlt statt eines Verdaus von ein bis zwei Stunden Dauer eine Inkubation ber Nacht Bei eigenen Untersuchungen war nach einer vierst ndigen Restriktionsenzymspaltung bei allen Proben ein deutlicher Wechsel in der Gr Benverteilung der cDNA Fragmente ersichtlich des Weiteren konnte im Agarosegel eine Oli gonukleotid Bande visualisiert werden Somit erscheint eine vier Stunden andauernde Inkuba tion des Reaktionsansatzes als ausreichend Bei der Analyse der Adapterligationseffizienz konnte mit
303. sitzt und ohne aufwendigen personellen und apparativen Aufwand angewendet werden kann SCHNIEDER 1993a Schrifttum 21 2 1 6 Bek mpfung Die Bek mpfung der Diktyokaulose erfolgt durch weidetechnische Ma nahmen strategischen Einsatz von Anthelminthika und Vakzinierung ROMMEL u SCHNIEDER 1989 Das Ziel besteht in der Vermeidung wirtschaftlicher Verluste durch eine Unterbindung der Infektion oder falls dies nicht m glich sein sollte der Begrenzung auf ein subklinisches Niveau B RGER 1983 B RGER 1987 In enzootischen Gebieten wird die Induktion einer protek tive Immunit t ersts mmriger Rinder ohne Erkrankung derselben angestrebt MICHEL u SHAND 1955 2 1 6 1 Weidetechnische Ma nahmen In Gebieten mit geringer Inzidenz kann zur Vermeidung der Infektion der Versuch unter nommen werden empf ngliche Rinder auf lungenwurmfreie Weiden auszutreiben POU PLARD 1968 GUPTA u GIBBS 1970 MICHEL 1976 PFEIFFER u SUPPERER 1980 Eine gemeinsame Beweidung ersts mmriger und zweits mmriger Tiere sollte vermieden werden da letztere als unerkannte Ausscheider fungieren k nnen JARRETT et al 1955b PFEIFFER u SUPPERER 1980 OAKLEY 1983 Auch sollten ersts mmrige Rinder auf eine zuvor von lteren Tieren genutzte Fl che erst nach Ablauf von f nf Wochen bis vier Mo naten MICHEL u SHAND 1955 POUPLARD 1968 oder gar erst nach einem Jahr PFEIF FER u SUPPERER 1980 ausgetrieben werden SELMAN 1984 hingegen vertritt die An si
304. suspension 20 Minuten bei 3000 g zentrifugiert und das ber dem Pellet befindliche Medium abgenommen Die Isolierung der Plasmid DNA erfolgte mit dem QIAGEN Plasmid Midi Kit QIAGEN sowie dem Nucleobond AX 100 Kit MACHEREY amp NAGEL nach Anleitung des Her stellerprotokolls Wie bei der Miniprep s 3 7 9 1 fand eine alkalische Lyse der Zellen ge folgt von einer Kaliumdodecylsulfat Pr zipitation statt Die weitere Reinigung der Plasmid DNA geschah mittels Anionenaustauscherchromatographie Dabei wurde die niedrige Salz konzentration der Plasmid DNA L sung welche auf eine zuvor equilibrierte S ule aufgetra genen wurde schrittweise durch zwei Waschschritte erh ht Da die zur Elution der Plasmid DNA erforderliche Salzkonzentration pH Wert abh ngig ist wurde diesem Umstand mit ei nem entsprechenden Elutionspuffer Rechnung getragen Die nach der Elution pr zipitierte Plasmid DNA wurde in 50 ul autoklaviertem Aqua bidest gel st 3 7 9 3 Darstellung der Inserts In rekombinanten Klonen kann durch Restriktionsenzymspaltung das Insert dargestellt und somit der Erfolg einer Klonierung berpr ft werden Als Restriktionsenzym wurde EcoRI LIFE TECHNOLOGIES gew hlt da im verwendeten pCR 4 TOPO Vektor das Insert von zwei EcoRI Schnittstellen flankiert wird Dazu wurden in einem 20 ul Reaktionsansatz 10 ul Plasmid DNA einer Miniprep bzw 1 ul Plasmid DNA einer Midiprep mit 2 ul 10x Re aktionspuffer und 1 ul EcoRI 1 U ul
305. te mittels der RACE das 5 Ende der Genfragmente nicht vollst ndig ermittelt werden sollte eine spliced leader 1 SL1 PCR als weitere M glichkeit zur Identifi zierung des unbekannten 5 Endes dienen 104 Material und Methoden 3 13 1 Design der RACE und SL1 Primer Die genspezifischen Primer GSP f r die RACE wurden unter dem Aspekt ausgew hlt eine Schmelztemperatur von mindestens 68 C im Idealfall jedoch 70 C bis 72 C zur Durchfiih rung einer Touchdown PCR s 3 13 2 und 3 13 3 aufzuweisen Dies ging neben einer Pri merl nge von bis zu 45 Nukleotiden auch mit weniger stringenten Anforderungen an die b rigen unter 3 7 4 beschriebenen Parameter einher Die in der 3 und 5 RACE verwendeten GSP for und GSP rev sind im Kapitel 9 1 dargestellt wobei die mit 5 respektive 3 be zeichneten Primer in der 5 bzw 3 RACE eingesetzt wurden Die Sequenzen des Primerpaares L3i 99A sowie L3i 99 rev fanden sich jeweils in den cDNA Sequenzen der teilidentischen Klone L3i 18 L3i 86 und L3i 99 der Primer L3i 99for war spezifisch f r die Sequenz dieses Klons Bez glich der teilidentischen Klone L3i 82 und L3i 101 wurde der Primer L3i 82 rev spezifisch f r den Klon L3i 82 gew hlt wohingegen die Sequenz der Primer L3i 82for und 5 L3i 82 in der Insertsequenz beider Klone zu finden war F r die Insertsequenzen L3ni 67 sowie L3i 33 L3i 53 L3i 75 L3i 88 und L3i 99 wurde zur Erstellung des 5 Ende
306. teller Infektion gek hlter D viviparus Larven bis zu 98 entwick lungsgehemmte Stadien isolieren welche eine L nge von weniger als 5 mm aufwiesen Infek tionsversuche von RICKLING 1999 mit Hypobiose induzierten Lungenwurmlarven ergaben bei T tung der Wirtstiere am 16 bzw 42 Tag p i 0 4 bis 0 6 mm bzw 3 bis 5 mm lange ge hemmte Stadien Gleiche Verh ltnisse lagen bei eigenen Untersuchungen vor Nach Infektion zweier K lber mit 20 000 Hypobiose induzierten D viviparus Larven und T tung der Tiere am 27 bzw 42 Tag p i wurden 0 45 bis 3 mm bzw 1 bis 3 mm lange hypobiotische Ent wicklungsstadien isoliert Dahingegen konnten bei dem am 27 Tag p i get teten Kalb wel ches mit 3000 ungek hlten und somit nicht Hypobiose induzierten Larven infiziert worden war nur adulte Parasiten mit einer L nge von 3 bis 7 cm aus der Lunge entnommen werden Auch RICKLING 1999 fand nach Infektion mit ungek hlten Larven nur solche Stadien deren Entwicklung ber das pr adulte Stadium hinausging 180 Diskussion Diese Vorversuche belegen neben der Hypobiosef higkeit des etablierten D viviparus Laborstammes auch die M glichkeit der experimentellen Induktion der Hypobiose und stellen die Basis der nachfolgenden molekulargenetischen Untersuchungen bez glich der genetischen Regulation der Entwicklungshemmung dar 5 2 Suppression Subtractive Hybridization Auf Grund der beschr nkten Menge an Ausgangsmaterial erfolgte nach der reversen T
307. ter beschrieben L3ni 22 putatives Protein 222 aa von C elegans NP_492899 1 202 aa 61 76 L3ni 51 Vorl ufer eines exkretierten sezernierten Proteins 294 aa von 286aa 63 74 C elegans NP_502842 1 L3ni 56a putatives Protein bilateralen Ursprungs 232 aa von C elegans 215aa 57 72 NP_491869 1 L3ni 67 nukle res anchorage Protein 1 8545 aa und nukle res 123aa 51 60 anchorage Proteinfamilie 1 Mitglied 7659 aa von C elegans ANC1_CAEEL und NP_491353 1 L3ni 69 extrazellul re Kupfer Zink Superoxiddismutase Cu Zn SOD 17laa 63 74 L3ni 92 183 aa von H contortus CAA93449 1 extrazellul re Cu Zn SOD 221 aa von C elegans JE0098 156 aa 57 74 SOD 4 Cu Zn 176 aa von C elegans NP_4999091 1 156 aa 57 74 Cu Zn SOD 184 aa von C elegans S40984 154 aa 57 74 F r weitere signifikante Homologien mit SODs anderer Organismen z B Zaprionus tubercu latus und D melanogaster erfolgt keine Beschreibung L3i 33a b hypothetisches Protein 318 aa von C briggsae CAE70988 1 76aa 50 61 L3i 53 Glycerol Kinase 502 aa von C elegans NP_494721 1 Sl5aa 67 80 hypothetisches Protein CBG18455 502 aa von C briggsae 514aa 67 80 CAE71520 1 Gk2 prov Protein 563 aa von X laevis AAH56091 1 523aa 48 66 Weitere signifikante Homologien mit Glycerol Kinasen anderer Organismen z B H sapiens und M musculus werden an dieser Stelle nicht weiter beschrieben
308. tion ein weiterer Mengenausgleich diffe rentiell transkribierter Sequenzen da nur cDNAs mit unterschiedlichen Adaptern an den Mo lek lenden einer exponentiellen Amplifikation unterliegen Dahingegen kommt es bei Mole k len die gleiche Adapter an den Enden tragen zu einem Suppressionseffekt der PCR s Abb 8 welcher durch die Lange der Adapter bedingt ist Die Hybridisierung dieser lan gen komplement ren Sequenzen einhergehend mit der Ausbildung so genannter loops ist stabiler als die Hybridisierung des k rzeren PCR Primers Denaturierung Adapter m u Annealing Primer i ss _ _ _D i DNA Synthese loop verhindert Primerannealing I E mM Suppression PCR Zu Abb 8 Schema der Suppression PCR In dieser PCR in welcher der in Abb 7 dargestellte PCR Primer 1 als Universalprimer einge setzt wurde dienten neben den subtrahierten Proben auch die verd nnten nicht subtrahierten Tester Kontrollen der L3ni L3i und HSM s 3 8 9 2 als Matrize da sie als Kontrollen so wohl einer erfolgreichen Suppression PCR als auch subtraktiven Hybridisierung in den sp te ren Gelelektrophoresen fungieren sollten Die subtrahierten Proben der L3ni und L3i gingen dabei jeweils als Doppelansatz in die Reaktion ein Des Weiteren wurde eine im Kit enthalte Material und Methoden 87 ne subtrahierte Kontroll DNA in der PCR die bei unten stehendem Temperaturprofil ablief mitgef hrt initiale Denaturierung 94 C 25
309. tion verbleiben differentiell transkribierte CDNA Sequenzen in einem angeglichenem Mengenverh ltnis als einzelstr ngige Molek le f r die zweite sub traktive Hybridisierung wohingegen die sowohl in der Tester als auch in Driver cDNA vor handenen Sequenzen Hybridmolek le bilden s Abb 3 Bei den zwei L3i bzw L3ni Testern wurde jeweils die cDNA der anderen Larvenpopulation als Driver verwendet den HSM Testern wurde HSM Driver cDNA zugesetzt 3 8 11 Zweite subtraktive Hybridisierung Nach der ersten subtraktiven Hybridisierung werden die je zwei Ans tze der L3ni L3i und HSM s 3 8 10 ohne vorherige Denaturierung vermischt Gleichzeitig erfolgt wiederum im Uberschuss die Zugabe frisch denaturierter Driver cDNA was eine weitere Anreicherung und Normalisierung differentiell transkribierter Sequenzen bedingt Diese Zielsequenzen bil den in der zweiten subtraktiven Hybridisierung Hybridmolek le mit unterschiedlichen Adap tern an ihren Enden aus s Abb 3 wodurch eine exponentielle Amplifikation in der nachfol genden Suppression PCR erm glicht wird Abweichend vom Herstellerprotokoll wurde in dieser zweiten subtraktiven Hybridisierung den jeweiligen Proben der Durchfiihrung 1 die vierfache der angegebenen Menge an Driver cDNA zugesetzt wohingegen bei der Durchfiihrung 2 nach den Angaben des Herstellers verfahren wurde 86 Material und Methoden 3 8 12 Suppression PCR In dieser PCR erfolgt durch die selektive Amplifika
310. tl nge von 51 bp bzw 143 bp dargestellt werden Weiterhin gelang es nicht unter Verwendung des Primerpaa res daf 12 die ca 100 bp umfassende Bande der PCR mit genomischer DNA adulter Lungen w rmer zu reproduzieren Mit der Primerkombination daf 16A war es bei der Verwendung genomischer Larven DNA m glich zwei Produkte zu amplifizieren die sich in etwa auf der H he der urspr nglich klonierten Banden daf 16A u und daf 16A o befanden Diese mit ge nomischer DNA der dritten Dictyocaulus Larven entstandenen Banden wurden kloniert und sequenziert Im BLASTN lie en sich jedoch die in Kapitel 4 12 1 aufgef hrten Sequenzho mologien dieser Inserts nicht verifizieren 178 Diskussion 5 Diskussion Der Nematode D viviparus der gro e Lungenwurm des Rindes besitzt die F higkeit bei Einwirkung bestimmter Umweltbedingungen seine Entwicklung im Wirtsorganismus f r ei nen gewissen Zeitraum zu unterbrechen Diese Entwicklungshemmung wird auch als Hypo biose oder Diapause bezeichnet W hrend dieser Zeit verbleiben die Parasitenstadien an ihrem Ansiedlungsort in der Lunge ohne durch Immunmechanismen des Wirtes eliminiert zu wer den Die betroffenen Tiere zeigen dabei als auch nach der Weiterentwicklung der inhibierten Stadien zu sich reproduzierenden Adulten keine klinischen Symptome und tragen daher zur unerkannten Verbreitung der Lungenw rmer bei Untersuchungen an anderen ebenfalls zur Hypobiose bef higten Organismen wie dem frei lebend
311. troll Sonde Abb 23 Analyse der Markierungseffizienz der cDNA Sonden Jeweils im Doppelansatz aufgetragene CDNA Menge 1 10 pg 3 0 1 pg 2 3 pg 6 0 03 pg 3 1 pg 7 0 01 pg 4 0 3 pg 8 Negativkontrolle Ergebnisse 137 4 6 Differential Screening Nach der Entwicklung der Chemilumineszenzfilme zeigten sich sowohl nach 1 5 stiindiger als auch nach 40 min tiger Exposition deutliche Signalunterschiede beim Vergleich der subtra hierten L3ni und L3i cDNA Banken in Abh ngigkeit von der jeweils eingesetzten subtra hierten cDNA Sonde Besonders augenf llig war dabei der Unterschied in der Signalintensitat beim Einsatz der subtrahierten L3i cDNA Sonde W hrend fast alle Klone der L3i cDNA Bank sehr deutliche Signale entstehen lie en war dies nur bei einigen Klonen der L3ni cDNA Bank der Fall Insgesamt etwas weniger deutlich stellte sich dieser Intensit tsunter schied bei den cDNA Banken unter der Verwendung der subtrahierten L3ni cDNA Sonde dar Die Hybridisierung mit den Tester Kontroll Sonden der L3i und L3ni hingegen ergab beim Vergleich der beiden subtrahierten cDNA Banken lediglich mit der L3i Tester Kontroll Sonde einen Hinweis auf differentielle Transkription Bei der Verwendung der Tester Kontroll Sonde der L3ni zeigten die CDNA Banken der L3ni und L3i im Gesamtbild keinen Unterschied in der Signalst rke Beim Vergleich der Detektion nach 40 min tiger bzw 1 5 st ndiger Belichtung ergaben sich lediglich Unterschiede in der S
312. trophiler Granulozyten sowie die Bildung von Fremdk rperriesenzellen ausl sen SCHNIEDER et al 1991 Nach MITCHELL 1982 existieren bei Parasiten drei Immunevasionsstrategien eine reduzierte oder ver nderte Antigenit t respektive Immunogenit t Modifikationen in der Induktion und St rke der Immunantwort sowie intrazellul re Ver nderungen der Makrophagen So ergab sich eine herabgesetzte antigene Potenz bei f r zwei Monate bei 4 C gek hlten H contortus Larven deren Antigen in Komplementbindungsreaktionen eingesetzt wurde THOMAS et al 1975 Bei vergleichenden Labmagenuntersuchungen von Rindern welche mit einem zur Hy pobiose bef higten respektive nicht bef higten O ostertagi Stamm infiziert waren konnten jedoch bei ersteren st rkere zellul re Reaktionen der Mukosa festgestellt werden Auch war die Anzahl IgG und IgM jedoch nicht IgA produzierender Zellen erh ht SMEAL 1982 2 2 1 Funktion der Hypobiose Grunds tzlich kann nach GIBBS 1986 bei parasitischen Nematoden auf Grund verschiede ner ausl sender Mechanismen zwischen zwei Typen der Hypobiose unterschieden werden n mlich der durch Immunmechanismen ausgel sten und wirtsunabh ngigen Entwicklungs 26 Schrifttum hemmung wobei letztere vorrangig eine saisonale Anpassung darstellt Ahnlich unterteilt HORAK 1981 in eine unspezifische Entwicklungshemmung die zu jeder Zeit durch wirts oder parasitenspezifische Faktoren ausgel st werden kann sowie einer
313. two closely related genomes critical analysis Genet Anal 13 49 58 ESTEVEZ M L ATTISANO J L WRANA P S ALBERT J MASSAGUE u D L RIDDLE 1993 The daf 4 gene encodes a bone morphogenetic protein receptor controlling C elegans dauer larva development Nature 365 644 649 EYSKER M 1978 The significance of inhibited development on the epidemiology of trichostrongylid infections in sheep in The Netherlands in F H M BORGSTEEDE J ARMOUR u J JANSEN Hrsg Facts and Reflections III Central Veterinary Institute Lelystad Niederlande S 25 42 EYSKER M 1981a Experiments on inhibited development of Haemonchus contortus and Ostertagia circumcincta in sheep in The Netherlands Res Vet Sci 30 62 65 EYSKER M 1981b Resistance to reinfection with Haemonchus contortus in lactating and barren ewes following a single infection with larvae conditioned for inhibited development Z Parasitenkd 65 343 351 EYSKER M 1993 The role of inhibited development in the epidemiology of Ostertagia infections Vet Parasitol 46 259 269 EYSKER M 1997 Some aspects of inhibited development of trichostrongylids in ruminants Vet Parasitol 72 265 272 EYSKER M J H BOERSEMA J B CORNELISSEN F N KOOYMAN u W A DE LEEUW 1992 Dictyocaulus viviparus in calves effect of rotational grazing on the development of infections Vet Parasitol 41 127 135 EYSKER M J H BOERSEMA u W M HENDRIKX
314. u reaktivieren erfolglos Dahingegen er gaben Untersuchungen an O ostertagi BLITZ u GIBBS 1972b sowie H contortus AR MOUR u BRUCE 1974 dass die Dauer der Inhibition unabh ngig vom Immunstatus des 28 Schrifttum Wirtes als auch saisonalen Einfl ssen ist was auf eine pr determinierte Lange der Hypobiose schlie en l sst 2 2 3 1 Klimatische Einfl sse Die Entwicklungshemmung in parasitischen Nematoden setzt generell zu einer Zeit ein in der die klimatischen Bedingungen f r die Entwicklung oder das berleben frei lebender Stadien ung nstig sind Dies ist bei sehr kalter respektive sehr hei er oder trockener Witterung gege ben EYSKER 1993 1997 differenziert daher zwischen der Winter Inhibition welche im sp ten Herbst beginnt und der im Fr hjahr oder vor der Trockensaison einsetzenden Sommer oder Trockensaison Inhibition und betrachtet die Witterungsbedingungen als den wohl wich tigsten Faktor bei der Induktion der Hypobiose Die Winter Inhibition wird vor allem in Nord sowie Zentraleuropa und Nordamerika beo bachtet GIBBS 1986 ARMOUR u DUNCAN 1987 Der induzierende Faktor ist dabei in erster Linie die Temperatur wobei andere im folgenden noch zu diskutierende Faktoren die Entwicklungshemmung positiv zu beeinflussen scheinen Eine larvale Entwicklungshemmung kann bei O ostertagi und Teladorsagia circumcincta experimentell durch mehrw chige K h lung bei 4 bis 6 C induziert werden CONNAN 1969 WRIGHT et
315. uch erfolgte f r die einzelnen Proben eine Auswertung der Cycle threshold Ct Werte welche der relativen Quantifizierung dienen sollten Bei dieser Quanti fizierungsmethode werden die jeweilige Templatemengen in Relation zu einem Kalibrator cb gesetzt Dieser wird beispielsweise im Fall der L3ni 69 92 vom Ct Mittelwert der einzel nen L ufe unter Verwendung eines der L3ni Templates repr sentiert Die jeweiligen sich mit den brigen L3ni sowie L3i Templates ergebenden Ct Mittelwerte werden auf diesen Ka librator bezogen wodurch eine relative Erh hung bzw Senkung der Transkriptionsrate ermit telt werden kann Diese Berechnungen erfolgen nach der Normalisierung auf eine endogene Referenzsequenz EF 1a nach folgender Formel 120 Material und Methoden AACt 2 Dabei gilt ACt Ct L3ni 69 92 bzw L3i 82 101 Ct EF 10 AACt ACt 3ni 69 92 bzw L3i 82 101 ACt cb Voraussetzung f r die relative Quantifizierung ist jedoch eine ann hernd gleiche PCR Effizienz der Ziel und Referenzsequenz Hierzu erfolgte f r die jeweiligen Standardreihen eine Berechnung der ACt Werte der einzelnen Verd nnungsstufen Bei der graphischen Dar stellung der ACt Werte einer Verd nnungsstufe berschreitet die Steigung der angelegten Geraden im Falle einer qualen PCR Effizienz nicht den Wert von 0 1 Die statistische Auswertung der qPCR Ergebnisse wurde mit dem Computerprogramm SigmaStat Version 2 0 JANDEL SCIENTIFIC San Ra
316. ufge reinigter CDNA gewonnen werden konnte als nach dem ersten Elutionsschritt wurden die beiden Eluatfraktionen der L3ni L3i und HSM Probe in je ein Gef zusammengef hrt 3 85 Restriktionsenzymverdau Die Spaltung der aufgereinigten cDNA erfolgte mit Restriktionsenzym Rsal um k rzere cDNA Fragmente mit glatten Enden f r die sp tere Ligation der Adapter zu erhalten Gleich 80 Material und Methoden zeitig wurden im Zuge dieses Verdaus auch die bei der CDNA Synthese angeh ngten bzw inkorporierten Primersequenzen von den cCDNA Molek len entfernt Zu den je zwei L3ni L3i und HSM Proben mit einem Volumen von jeweils 400 ul wurden folgende Komponenten PROMEGA hinzugef gt 45 2 ul 10x Reaktionspuffer C 4 52 ul acetyliertes bovines Serumalbumin BSA 10 ug ul 2 ul Rsal 10 U ul Der Restriktionsenzymverdau erfolgte bei 37 C f r eine Dauer von vier Stunden und wurde anschlie end gelelektrophoretisch kontrolliert 3 8 6 Probenaufreinigung nach Restriktionsenzymverdau 3 8 6 1 Phenol Chloroform Extraktion Den je zwei Restriktionsenzymverdau Ans tzen der L3ni L3i und HSM cDNA wurde zur Entfernung der enthaltenen Proteine jeweils 450 ul Phenol Chloroform Isoamylalkohol P C D in einem Mischungsverh ltnis von 25 24 1 zugesetzt und nach gr ndlicher Durchmi schung eine Minute bei 13 000 g zentrifugiert Die obere w ssrige Phase mit den darin enthal tenen Nukleins uren wurde in ein neues 1 5 ml Gef be
317. ul 1 ul Erststrang cDNA Material und Methoden 119 Um Pippetierungenauigkeiten bei den Duplikaten weitestgehend zu vermeiden wurden zu n chst mittels einer automatischen Mehrkanalpipette Matrix Impact2 APOGENT DIS COVERIES 52 8 ul Mastermix mit 2 2 ul Template vermischt und davon je 25 ul in ein se parates Reaktionsgef gegeben Bevor die Ans tze in das Ger t verbracht wurden erfolgte eine kurze Zentrifugation um die durch den Deckel der Reaktionsgef e verlaufende Fluo reszenzmessung die jeweils in der Annealingphase der Reaktion stattfand nicht durch anhaf tende Mikrotr pfchen zu beeintr chtigen Das von dem Softwareprogramm Primer Express APPLIED BIOSYSTEMS angegebene Temperaturprofil fand Anwendung allerdings wurde die Annealingzeit von 20 Sekunden auf 24 Sekunden verl ngert Aktivierung der Polymerase 95 C 10 Minuten Denaturierung 94 C 20 Sekunden 40x Primerannealing 55 C 24 Sekunden Primerextension 72 C 30 Sekunden Die Analyse der qPCR erfolgte mittels der normalisierten Baseline korrigierten Fluoreszenz dRn wobei die Optionen adaptive baseline und treat individually angewendet wurden Dabei fand eine absolute Quantifizierung der L3ni 69 92 L3i 82 101 und EF la Kopienzahlen anhand der eingesetzten Standardreihen statt Mit den jeweils ermittelten Ko pienzahlen konnte berechnet werden wie viele L3ni 69 92 bzw L3i 82 101 Kopien auf eine EF 1a Kopie entfallen A
318. un chst in einem RNase haltigem Puffer resuspendiert Die Degradation der RNA ist n tig um deren Bindung an die in einer Schleuders ule untergebrachte Silica Membran zu verhindern Die anschlie ende Lyse der Zellen und Denaturierung der DNA und Proteine erfolgte durch eine NaOH SDS Behandlung Mittels Kaliumacetat welches mit SDS einen unl slichen Komplex bildet wurden die denaturierten Proteine sowie Zelldebris mit der Zellwand assoziierten chromosomalen DNA gef llt Ein nachfolgender Zentrifugationsschritt bei 4 C unterst tzte diese Pr zipitation Zudem wurde infolge der Zugabe des Kaliumacetat haltigen Puffers eine Neutralisation des alkalischen Lysats erreicht und somit wird die Bin dung der renaturierten Plasmid DNA an die Silica Membran erm glicht Eine weitere Reini gung der in die S ule eingebrachten Plasmid DNA erfolgte in einem Waschschritt in wel chem ein ethanolhaltiger Puffer Verwendung fand Abschlie end wurde die Plasmid DNA in 50 ul autoklavierten Aqua bidest eluiert Alle der Elution vorangegangenen Schritte wurden nach Anleitung des Herstellerprotokolls durchgef hrt 74 Material und Methoden 3 7 9 2 Plasmidpr paration mittels Midiprep Von den zur Pr paration vorgesehenen Klonen wurden 50 ul bis 100 ul des jeweiligen Glyze rolstocks s 3 7 9 1 in 50 ml Kanamycin haltigem 50 ug ml Medium LB Medium unter st ndigem Sch tteln bei 37 C ber Nacht angez chtet Am darauf folgenden Tag wurde die Bakterien
319. und Quantifizierung geschehen dabei durch Messung von Fluoreszenzemission Hierf r nutzt die qPCR unter anderem fluoreszenzmarkierte Sonden sowie die 3 5 Exonukleaseaktivitat der Thermus aquaticus Taq DNA Polymerase Diese spaltet w hrend der Extensionsphase vom 5 terminalen Ende doppelstr ngiger DNA Nukleotide ab und setzt dabei Mono und Oligonukleotide frei HOLLAND et al 1991 Bei den TagMan Sonden handelt es sich um an beiden Enden mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte DNA Sonden die zu einem internen Bereich des PCR Amplifikats komplement r sind Am 3 Ende der Sonde welches infolge bestimmter Modifikationen keiner Extension durch die Tag Polymerase unterliegt befindet sich ein so genannter Quencherfarbstoff Dieser unterdr ckt bei intakter Sonde im Zuge des Fluoreszenzenergietransfers die emittierte Fluoreszenzenergie des Reporterfarbstoffs welcher kovalent an das 5 Ende der Sonde 112 Material und Methoden des Reporterfarbstoffs welcher kovalent an das 5 Ende der Sonde gebunden ist Wird diese durch die 3 5 Exonukleaseaktivitat der Taq Polymerase hydrolysiert kann der Quencher farbstoff auf Grund der r umlichen Trennung zum Reporterfarbstoff dessen emittierte Fluo reszenzenergie nicht mehr unterdr cken wodurch ein messbares Signal entsteht s Abb 11 Die Taq Polymerase hydrolysiert dabei nur korrekt angelagerte Sonden was die besondere Spezifit t der qPCR bedingt Liegen Basen Fehlpaarungen zwis
320. ung erfolgte f r 1 5 Stunden bei 42 C und 82 rpm im Wasserbad GFL F r die nachfolgende Hybridisierung wurden je 495 ng markierte cDNA Sonde und 50 ul Blockierungsl sung BD CLONTECH wie oben beschrieben denaturiert abgek hlt und mit 30 ml einer auf 42 C vorgew rmten Hybridisierungsl sung DIG Easy Hyb ROCHE vermischt Somit lag eine Sondenkonzent ration von 16 5 ng ml Hybridisierungsl sung statt der im Benutzerhandbuch ROCHE emp fohlenen Konzentration von 25 ng ml Hybridisierungsl sung vor Diese wurde nach dem Ab gie en der Pr hybridisierungsl sung durch einen 45 um Zelluloseacetat Einweg Filterhalter RENNER auf die Membran verbracht und die Hybridisierungstasche wieder luftblasenfrei verschlossen Die Hybridisierungsreaktion lief dann bei 42 C und 82 rpm f r 22 Stunden im Wasserbad GFL ab Im Anschluss an die Hybridisierung schlossen sich vier Waschschritte zur Denaturierung von Hybridmolek len aus nicht homologen cDNAs an Dazu wurden die Membranen in eine Plas tikschale berf hrt und zweimal mit je einem Liter Niedrig Stringenzpuffer 2x SSC 0 1 SDS f r 10 Minuten unter leichtem Sch tteln bei Raumtemperatur inkubiert Es folg ten zwei Waschschritte bei 68 C mit jeweils einem Liter auf 68 C vorgew rmten Hoch Stringenzpuffer 0 5x SSC 0 1 SDS f r eine Dauer von 20 Minuten unter leichtem Schiit teln im Wasserbad GFL Material und Methoden 97 3 10 3 2 Detektion Die Visualisierung der im vo
321. ungenwurminfektion Die einzelnen Stadien der Entwicklung eines Organismus sowie der damit verbundene Zell stoffwechsel werden durch Aktivierung bzw Reprimierung bestimmter Gene gesteuert wobei exo oder endogene Faktoren modulierend wirken k nnen Daher ist davon auszugehen dass auch die Hypobiose nach Induktion durch Umweltfaktoren einer genetischen Regulation un terliegt Bislang sind jedoch bei D viviparus und anderen parasitischen Nematoden keine in die Entwicklungshemmung involvierten Gene bekannt Molekulargenetisch erfolgt die Identi fizierung aktivierter Gene oftmals auf der Ebene der messenger RNA welche Transkripte von Genen darstellt und in die entsprechenden Proteine translatiert wird Der Vergleich von RNA Populationen welche unterschiedliche Zust nde eines Organismus repr sentieren erm glicht die Erfassung solcher Transkripte die f r einen bestimmten Zustand spezifisch sind 14 Einleitung Ziel dieser Arbeit ist es durch den Vergleich der Gentranskription Hypobiose induzierter und nicht induzierter dritter Lungenwurmlarven solche Gene zu identifizieren die im Zuge der Entwicklungsinhibition aktiviert oder reprimiert werden Au erdem soll eine n here Charak terisierung dieser Gene erfolgen Zus tzlich soll untersucht werden ob Homologe von Genen die den Prozess der Entwicklungshemmung des frei lebenden Erdnematoden Caenorhabditis elegans steuern auch bei D viviparus vorhanden sind Dadurch soll die genetische Re
322. uot entnommen Daraufhin durch liefen die Proben f nf weitere PCR Zyklen bei obigem Temperaturprofil wonach wiederum die Entnahme eines 5 ul Aliquot erfolgte Dieser Schritt wurde noch dreimal wiederholt so dass die Reaktionsans tze der Durchf hrung 1 letztlich insgesamt 38 Zyklen durchliefen Bei der Durchf hrung 2 wurde das erste 5 ul Aliquot nach 23 PCR Zyklen das letzte eben falls im Rhythmus von jeweils f nf Zyklen nach 43 Zyklen entnommen Mittels dieser Ali quots wurde die Subtraktionseffizienz gelelektrophoretisch analysiert Material und Methoden 89 3 9 Erstellung subtrahierter cDNA Banken Mittels subtrahierter cDNA der L3ni und L3i der Durchf hrung 1 erfolgte die Erstellung subtrahierter L3ni und L3i cDNA Banken Die berpr fung dieser Banken auf falsch positi ve Klone gelang im weiteren Verlauf der Arbeit mit Hilfe des Differential Screenings 3 9 1 Nested PCR mit subtrahierter cDNA Durch eine Amplifikation des subtrahierten Suppression PCR Produkts werden in dieser PCR differentiell transkribierte cDNA Sequenzen weiter angereichert und equalisiert s 3 8 13 Das synthetisierte Nested PCR Produkt unterlag anschlieBend einer Klonierung zur Erstellung der subtrahierten cDNA Banken der L3ni und L3i Neben den unter 3 8 12 synthetisierten subtrahierten Suppression PCR Produkten der zwei Larvenpopulationen wurden in dieser PCR auch zwei im CLONTECH PCR Select Diffe rential Screening Kit BD CLONTECH enthalten
323. us in calves New Zeal Vet J 43 21 22 244 Literaturverzeichnis WILLETT J D 1980 Control mechanisms in nematodes in B M ZUCKERMAN Hrsg Nematodes as Biological Models Vol 1 Behaviorial and developmental models 1 Aufl Academic Press New York USA S 225 WILLETT J D u I RAHIM 1978 Determination of adenosine 3 5 cyclic monophosphate levels in tissues of the free living nematode Panagrellus redivivus Comp Biochem Physiol B 60 403 405 WILLETT J D R A TURNER M McRAE u J A BOLLINGER 1979 Catecholamine sensitive adenylate cyclase activity during development and senescence in the nematode Panagrellus redivivus Age 2 126 WILLIAMS J C A DEROSA Y NAKAMURA u A F LOYACANO 1997 Comparative efficacy of ivermectin pour on albendazole oxfendazole and fenbendazole against Ostertagia ostertagi inhibited larvae other gastrointestinal nematodes and lungworm of cattle Vet Parasitol 73 73 82 WILLIAMS J C u J W KNOX 1988 Epidemiology of Ostertagia ostertagi in warm temperate regions of the United States Vet Parasitol 27 23 38 WILLIAMS J C J W KNOX B A BAUMANN T G SNIDER M D KIMBALL u T J HOERNER 1983 Seasonal changes of gastrointestinal nematode populations in yearling beef cattle in Louisiana with emphasis on prevalence of inhibition in Ostertagia ostertagi Int J Parasitol 13 133 143 WILLIAMS J G A R KUBELIK K J LIVAK J A RAFALS
324. usschieden wurden im Zuge der Sektion sehr kleine wahrscheinlich inhibierte Lar ven aufgefunden MICHEL 1955 Ebenfalls vermehrt hypobiotische Larvenstadien traten nach der Reinfektion von K lbern auf die mit einem r ntgenattenuierten Vakzinestamm ge impft worden waren MICHEL et al 1965 Ahnliches beobachtete EYSKER 1981b fiir H contortus bei zuvor immunisierten L mmern Die Immunisierung wurde dabei mit gek hl ten Larven durchgef hrt Der Autor schlussfolgert dass inhibierte Larven ihrerseits immuno gen sind Immunisierungsversuche mit Hypobiose induzierten und nicht induzierten O oster tagi Larven best tigen dieses CHRISTENSEN et al 1992 2 2 3 3 Altersresistenz des Wirtes Das vermehrte Auftreten entwicklungsgehemmter Stadien bei lteren Tieren wurde bereits bei D viviparus MICHEL et al 1965 O ostertagi MICHEL et al 1979 KLESIUS 1988 C oncophora KLOOSTERMAN et al 1991 und H contortus EYSKER 1993 beobachtet KLOOSTERMAN et al 1991 sowie MICHEL et al 1979 schreiben dabei dem Alter der Tiere eine Rolle bei der Induktion der Entwicklungshemmung zu KLOOSTERMAN et al 1991 stellten einen offensichtlichen Effekt der Altersresistenz auf C oncophora fest auf O ostertagi hingegen besa das Alter der Tiere keinen Einfluss Im Gegensatz dazu beschreiben MICHEL et al 1979 eine Altersresistenz bei O ostertagi Bei empf nglichen Rindern im Alter von 21 Monaten waren nach experimenteller Infektion 27 de
325. uwa ver d nnt Material und Methoden 83 HSM Tester Die HSM Probe dient als Positivkontrolle bei Durchf hrung der SSH Um eine Tester cDNA mit Genfragmenten zu erhalten die nicht in der Driver cDNA vorliegen wurde der HSM Tester cDNA eine mit Haelll verdaute X174 DNA zugef gt Bei erfolgreicher subtraktiver Hybridisierung stellt diese Kontroll DNA nach erfolgter Suppression PCR die prominentesten Gelbanden Zun chst wurden 2 ul der im Kit enthaltenen Kontroll DNA mit 38 ul Ampuwa versetzt um eine DNA Konzentration von 150 ng ul zu erreichen Zur Fertigstellung des HSM Testers wurden 5 ul dieser Verd nnung mit 1 ul der unter 3 8 7 generierten HSM cDNA vermischt 3 8 9 2 Ligation der Adapter Dieser Schritt dient der Herstellung der je zwei Testerpopulationen und der nicht subtrahier ten Tester Kontrolle der L3ni L3i und HSM durch Adapterligation an das 5 Ende der cDNA Molek le Jeder Tester wird dabei mit zwei unterschiedlichen Adaptern Adapter 1 respektive 2R in separaten Ans tzen ligiert so dass je zwei Testerpopulationen der L3ni L3i und HSM cDNA resultieren Zur Herstellung der nicht subtrahierten Tester Kontrolle TK der L3ni L3i und HSM wurden je 2 ul der entsprechenden Ligationsans tze von Tester 1 und 2 vermischt so dass nach erfolgter Adapterligation bei einem Drittel der cDNA Molek le unterschiedliche Adapter am 5 Ende vorliegen Im Folgenden sind neben den A daptersequenzen auch die im weiteren
326. ven fest W rde dieser Pilz als Futter supplement oder in Form von Lecksteinen eingesetzt k nnte die Anzahl infekti ser Larven auf der Weide reduziert und somit klinische oder subklinische Erkrankungen vermieden wer den LARSEN 1999 Inwieweit die biologische Bek mpfung der Diktyokaulose mit D flagrans Praxisreife erlangt bleibt abzuwarten Schrifttum 25 2 2 Hypobiose Das Ph nomen der Entwicklungshemmung oder inhibierten Entwicklung welches auch als Hypobiose oder Diapause bezeichnet wird ist bei verschiedensten Organismen beschrieben An dieser Stelle soll im Wesentlichen nur auf die zur Hypobiose befahigten parasitischen Nematoden der Wiederk uer eingegangen werden Da in einer Parasitenpopulation meist nur eine gewisse Anzahl der Nematoden und zudem nur bei bestimmten ausl senden Faktoren hypobiotisch wird stellt die Entwicklungshemmung ein fakultatives Ph nomen dar EYSKER 1993 Das Larvenstadium in welchem die Entwick lungshemmung einsetzt und damit auch der Ansiedlungsort der hypobiotischen Stadien im Wirtsorganismus variiert familien und gattungsabh ngig W hrend der Inhibition persistieren die Entwicklungsstadien im Wirtsorganismus ohne durch Immunmechanismen eliminiert zu werden So verbleiben gehemmte Lungenwurmstadien ber Monate ohne erkennbare Zellin filtration in den Bronchien wohingegen ungehemmte Stadien in der Lunge betroffener Tiere eine starke zellul re Reaktion mit Infiltration eosinophiler und neu
327. verschiedene 3 RACE Sequenzen der L3i 33 und L3i 53 k rzer als die Insert Sequenz Nach FROHMAN 1993 sind verk rzte 3 Enden auf ein Annealing des Oligo dT Primers an interne A reiche Regionen statt an das Poly A Ende zur ck zu f hren Als Ursa che fiir diese Fehlhybridisierung nennt der Autor die relativ niedrige Temperatur und den Primeriiberschuss w hrend der reversen Transkription Diese unvollst ndigen 3 Enden k n nen in manchen F llen durch das Unterschreiten der erwarteten Fragment Mindestl nge oder das Fehlen eines Stopcodons in der translatierten Aminos ureabfolge ermittelt werden Einen weiteren Hinweis liefert das Fehlen des Polyadenylierungssignals DAS et al 2001 Bei die sem Signal handelt es sich um eine hoch konservierte mRNA Sequenz mit der Basenabfolge 5 AAUAAA 3 welches bei ber 88 der mRNAs die Voraussetzung f r das Anh ngen der Adenosin Nukleotide bildet WELSH et al 1990 SCH FER 1992 Diese hoch konservierte Sequenz konnte in der vorliegenden Arbeit bei 50 der Sequenzen L3ni 16 L3ni 22 L3ni 56 L3ni 69 92 sowie L3i 53 L3i 82 101 und L3i 100 festgestellt werden 5 5 3 Komplettierung der differentiell transkribierten cDNA Sequenzen Mit Hilfe der RACE und SL1 spezifischen PCR konnten die Transkripte L3ni 16 L3ni 22 L3ni 51 L3ni 56 L3ni 69 92 sowie L3i 10 L3i 53 L3i 75 L3i 82 101 und L3i 100 als full length cDNA Sequenzen erstellt werden So beginnen beim Sequenzidentit tsvergleich
328. versetzt eine Stunde bei 37 C inkubiert und anschlie Bend gelelektrophoretisch berpr ft Material und Methoden 75 3 7 10 Sequenzierung der Inserts und Sequenzbearbeitung 3 7 10 1 Automatische Sequenzierung Das zur automatischen Sequenzierung angewandte Verfahren entspricht in seinem Prinzip der Kettenabbruchreaktion nach SANGER et al 1977 Durch den Einbau fluoreszenzmarkierter Didesoxy Nukleotide erfolgt ein basenspezifischer Abbruch w hrend der Elongationsphase der Reaktion in welcher nur ein Vorw rts respektive R ckw rtsprimer eingesetzt wird und somit nur eine lineare Amplifikation stattfindet Infolge des zuf lligen Einbaus von einem der vier Didesoxynukleositriphosphate ddNTPs deren Fehlen der 3 OH Gruppe eine Verkn p fung mit der 5 Phosphatgruppe eines neu anzuf genden Nukleotids unm glich macht variie ren die synthetisierten DNA Str nge in ihrer Lange und der Art des 3 Endes Nach Beendi gung der Reaktion werden die DNA Fragmente in einem Polyacrylamidgel entsprechend ihrer L nge elektrophoretisch aufgetrennt wobei ein am unteren Rand des Gels befindlicher Laser scanner die mit unterschiedlichen Floureszenzfarbstoffen markierten ddNTPs detektiert Die registrierten Signale werden dann durch entsprechende Software in die Nukleins uresequenz umgesetzt Die Sequenzierung der zu untersuchenden Proben wurde bei der Firma SEQUENCE LABO RATORIES G ttingen in Auftrag gegeben Hierf r wurden nach einer
329. viviparus Transkript homologe Glycerin Kinase von C elegans wird auch in dessen inhibierter dauer larva verst rkt transkribiert WANG u KIM 2003 Neben der durch die Adenylat Cyclase vermittelten Signaltransduktion repr sentiert der Gua nylyl Cyclase Reaktionsweg ein weiteres wichtiges Signalsystem Bei C elegans sind bisher 29 verschiedene Guanylyl Cyclasen GC bekannt deren Rezeptoren in unterschiedlichen Diskussion 195 sensorischen Neuronen exprimiert werden YU et al 1997 Die zu dem L3i assoziierten Gentranskript homologen l slichen GCs werden durch das Signalmolek l Stickstoffmonoxid NO aktiviert BERG et al 2003 S 756 und bilden daraufhin den second messenger cGMP Dieser wiederum aktiviert andere Nukleotid Cyclasen cGMP abh ngige Proteinkinasen so wie Phosphodiesterasen oder bindet an cGMP gesteuerte Ionenkan le und vermittelt so die intrazellul re Signal bertragung BIRNBY et al 2000 ZUBAY 2000 Die Pr senz einer cGMP abh ngigen Proteinkinase in A suum THALHOFER u HOFER 1989 l sst die Exis tenz eines GC cGMP Signalwegs auch in anderen parasitischen Nematoden vermuten Somit k nnte bei D viviparus ein solcher Signalweg ma geblich in die Induktion der Hypobiose involviert sein Auch bei C elegans ist eine von daf 11 codierte transmembranale GC BIRNBY et al 2000 in die Regulation der Larvenentwicklung involviert Allerdings wird bei diesem Nematoden die Ausbildung der dauer larva durch diese GC unt
330. von C elegans NM _058779 1 Eine 84 ige 52 Nukleotide umfassende bereinstimmung zeigte das 317 bp lange Insert daf 4A u mit dem Cosmid Y47G6A von C elegans AC024791 1 176 Ergebnisse 4 12 2 Sequenzidentitatsvergleich auf Aminos ureebene Die 83 Sequenzen der daf und age 1 spezifischen PCR wurden mittels TBLASTX NCBI und mit den in GenBank NCBI enthaltenen Proteinen verglichen Dabei zeigten drei Ampli fikationsprodukte signifikante Homologien wobei neben der Identit t die Sequenz hnlichkeit in Klammern angegeben ist Mit dem Programm Align Plus wurde die Nukleins urese quenz dann in die entsprechenden Aminos uren bersetzt und nochmals unter Verwendung des BLAST for short nearly exact matches auf Homologien mit Aminos uresequenzen anderer Organismen deren Accession bzw Versionen Nummern in Klammern aufgef hrt sind verglichen Das 34 Aminos uren umfassende Insert des Klons daf 4A M zeigte sich auf einer L nge von 26 Aminos uren zu 96 identisch 100 mit zwei kurzkettigen Dehydrogena sen Reduktasen sowie dem hypothetischen Protein von C elegans NP _491180 1 NP 491181 2 sowie AAK29888 2 Mit CG31549 PA von D melanogaster NP_730972 2 bestand eine 81 ige Teilidentit t 92 ber 27 Aminos uren Auch mit anderen G Protein gekoppelten Rezeptoren dieses Organismus z B NP_649563 1 und NP_569875 2 bestanden signifikante Sequenzidentit ten Das Insert des Klons daf 12B o beinhaltete ein
331. warteten L ngen auf Al lerdings konnte in der Kontrolle des L3ni Sondenansatzes noch eine schwache Bande des ungeschnittenen Plasmids in H he von ca 4000 bp festgestellt werden die Restriktionsen zymspaltung lief somit in diesem Ansatz unvollst ndig ab 4 7 3 Konzentrationsbestimmung der L3ni und L3i Sonden Nachdem die verdauten Sonden durch eine S ulenchromatographie aufgereinigt worden wa ren fand eine photometrische Bestimmung der cDNA Konzentration statt welche folgende Werte ergab Sonde Konzentration Reinheit cDNA Sonde der L3ni 27 10 ng ul 1 694 cDNA Sonde der L3i 21 55 ng ul 1 710 Ergebnisse 141 4 7 4 Uberpriifung der DIG markierten L3ni und L3i Sonde Auf dem fixierten Film waren nach einer Expositionszeit von einer Stunde bei der aufgetra genen Sondenmenge von 0 3 pg sowohl bei der cDNA Sonde der L3ni als auch der L3i deut liche Signale gleicher Intensit t sichtbar somit lag eine ad quate Menge an DIG markierter cDNA in der Sondenl sung vor Die Kontroll DNA zeigte Signale bis zu einer Verd nnung von 0 1 pg DNA welche in schwacher Auspr gung auch bei der L3ni und L3i Sonde zu be obachten waren Nach einer auf vier Stunden verl ngerten Filmbelichtung wiesen die synthe tisierten Sonden ebenfalls eine deutliche Signalintensit t bei 0 1 pg und damit die erwartete Menge an markierter cDNA auf Die ermittelten cDNA Konzentrationen von 27 10 ng ul der L3ni respektive 21 55 ng ul der L3i war daher der Menge
332. wurden Klone nach dem Zufallsprinzip ausgew hlt und in 5 ml LB Medium welches 50 ug Kanamycin ml Medium enthielt berf hrt Das Wachstum der Zel len fand bei 37 C unter st ndigem Sch tteln GFL ber Nacht statt Mit Hilfe der PCR wur den die angez chteten Klone ermittelt in denen rekombinante Plasmide mit nur einem ligier ten Insert vorlagen Diese Klone dienten im weiteren Verlauf der Arbeit zur Erstellung der subtraktiven CDNA Banken Die 20 ul Reaktionsans tze enthielten folgende Komponenten 2 ul 10x Advantage 2 PCR Puffer 0 6 ul Nested Primer 1 10 uM 0 6 ul Nested Primer 2 10 uM 0 4 ul dNTP Mix je 10 mM 0 2 ul Advantage II Polymerase Mix 1 ul Flissigkultur Die Amplifikationsreaktion lief bei folgendem Temperaturprofil ab initiale Denaturierung 94 C 30 Sekunden j Denaturierung 95 C 10 Sekunden x Primerextension und Elongation 68 C 3 Minuten Von den PCR Produkten wurden jeweils 5 ul zur Kontrolle des amplifizierten Inserts auf ein Agarosegel aufgetragen Klone ohne Insert und solche bei denen zwei oder mehr Banden sichtbar waren wurden wie auch die zugeh rigen Amplifikationsprodukte verworfen Die Material und Methoden 91 PCR Produkte welche nur eine Bande im Agarosegel entstehen lie en wurden bei 20 C gelagert und im weiteren Verlauf der Arbeit dem Differential Screening unterzogen 3 9 3 subtrahierte cDNA Banken Von den Fl ssigkulturen der Klone die im Zuge
333. y DGP and NVP Liibeck Travemtinde 20 23 03 2002 Christina Strube Georg von Samson Himmelstjerna Thomas Schnieder 2002 Gene expression in hypobiosis induced and not induced Dictyocaulus viviparus larvae XXII World Buiatric Congress Hannover 18 23 08 2002 Christina Strube Georg von Samson Himmelstjerna Thomas Schnieder 2003 Untersuchungen zur Genregulation der Entwicklungshemmung bei Larven des Rinderlungenwurms Dictyocaulus viviparus Tagung der DVG Fachgruppe Parasitologie und Parasit re Krankheiten Leipzig 20 21 03 2003 Christina Strube Georg von Samson Himmelstjerna Thomas Schnieder 2003 Genes involved in hypobiosis in bovine lungworm World Association for the Advancement of Veterinary Parasitologie WAAVP New Orleans 10 14 08 2003 Christina Strube Georg von Samson Himmelstjerna Thomas Schnieder 2004 Investigation of differentially transcribed genes in hypobiosis induced and not induced third stage Dictyocaulus viviparus larvae by quantitative real time PCR 21 Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft f r Parasitologie DGP W rzburg 17 20 03 2004 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 2 Schrifttum 2 1 Die Diktyokaulose des Rindes 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 1 4 2 1 5 2 1 6 2 1 6 1 2 1 6 2 2 1 6 3 2 1 6 4 Der Erreger Verbreitung und wirtschaftliche Bedeutung Biologie und Entwicklungszyklus Klinik und Pathogenese Diagnose Bek mpfung Weidetechnische Ma
334. y A Ende verl ngert werden Die erhaltenen 5 RACE Sequenzen der L3i 82 bzw L3i 101 konnten nur zur Verl ngerung der L3i 82 herangezogen werden da mit der L3i 101 Sequenz nach einem anf nglich berlappenden Sequenzbereich Unstimmigkeiten in 5 Richtung auftraten Die zwei RACE Sequenzen welche die Inserts der Klone L3i 18 L3i 86 und L3i 99 in 5 Richtung erg nzen sollten stimmten mit den Sequenzen von L3i 18 bzw L3i 86 nur soweit berein wie diese auch mit dem cDNA Fragment des Klons L3i 99 identisch waren s 4 8 2 Daher konnten die Insert Sequenzen dieser beiden Klone nur in 3 Richtung erg nzt werden Die Sequenzierung der 5 RACE Produkte der L3i 100 ergab eine 565 bp und eine 599 bp umfassende Sequenz Nach anf nglichen Unstimmigkeiten ber 147 bzw 302 bp waren die beiden Sequenzen mit Ausnahme eines schon bei der berpr fung der GSP festgestellten Gaps s 4 9 2 untereinander identisch Mit Hilfe der SL1 PCR gelang es f r die Sequenzen L3i 75 und L3i 33 ein 5 Ende zu ermit teln Gleichzeitig wurde damit auch die Existenz der SL1 Sequenz bei D viviparus nachge wiesen 156 Ergebnisse Tab 4 gibt die L ngen der erstellten Nukleins ure und Aminos uresequenzen wieder Als translatierte Region TR sind diejenigen Basen angegeben welche in Homologien aufwei sende Aminos uresequenzen mit nachfolgendem Stopcodon bersetzt werden konnten wobei sich diese Angaben auf die Gesamtzahl der transl
335. ymen Pumpen und Transportproteinen wie 196 Diskussion die Ca ATPase Pumpe und Calmodulin abh ngige Proteinkinasen INGEBRITSEN u CO HEN 1983 BERG et al 2003 S 447 448 ber letztere moduliert der Ca Calmodulin Komplex auch die Gentranskription KAPILOFF et al 1991 so dass Calmodulin m gli cherweise direkt an der Induktion der Hypobiose beteiligt ist Bez glich der Aufregulation dieses Transkripts in den L3i bestehen Analogien zu C elegans Bei diesem Nematoden wird das zum L3i Transkript homologe sowie ein weiteres Calmodulin ebenfalls in den inhibierten Larven verst rkt transkribiert http elegans begsc bce ca SAGE Dauer_specific_P0 05 txt Im Hinblick auf die Regulation der Gentranskription k nnte das L3i Homolog der DM DNA Bindungsdom nen enthaltenden Proteine ein Zielpunkt der oben beschriebenen Signalkaska den sein Diese C elegans Homologe sind auch bei diesem Organismus in der inhibierten Larve aufreguliert http elegans begsc be ca SAGE Dauer_specific_P0 05 txt Proteine mit DM Dom nen repr sentieren Transkriptionsfaktoren welche die geschlechtsspezifische Ent wicklung einschlie lich der Dotterproteinsynthese und der Differenzierung des peripheren Nervensystems regulieren RAYMOND et al 1998 YI u ZARKOWER 1999 YI et al 2000 LINTS u EMMONS 2002 Eine solche Funktion ist auch f r D viviparus anzunehmen da diese Gene nach Angabe der Autoren bei Invertebraten und m glicherweise auch Vertebraten ev
336. zeichnung Sequenz 5 3 Annealingtemperatur daf 7 for daf 7 rev daf 11 for daf 11 rev daf 11A for daf 11A rev daf 12 for daf 12 rev daf 12A for daf 12A rev daf 12B for daf 12B rev daf 14 for daf 14 rev daf 14A for daf 14A rev daf 14B for daf 14B rev daf 16 for daf 16 rev daf 16A for daf 16A rev daf 16B for daf 16B rev daf 18 for daf 18 rev GAA AAG ATC GGA TGG GAC TGG A GTT GAC ATT GGC GAT TGA GAC G AAT TGC TTT GGC TCC GTT CGT TCT TTT TCC AAT TCT GCC GTT CTA TTT TAA CGT ATT GGC TGG AAG GAG TAA TGT CTG CTG TCG TTG GAG TCG ACA ACT GCG GCG GAG GAA AAA TGG ATG ATG CGG TGA TAA ATG TGG CTC GCG CCA CAA CTC CAC ATC TCT TCG GCA GCA TCA CCA CCT C TGT TAC CAT GAG GCG TTT CGT C TTT GCC CCT TAA TTG TTG GTG TCT TAC CGG CAA GCA TCA ATA ATC CA AAG GTC CGA GAG CCA ATG TTT TC TTA CCG GCA AGC ATC AA GAC ATT CGG CAC TCA TCA CT TTT GGCTAA CTG TAC TGA CTG ACC CCT ATT TCC GGC CGT TCG TTA TTA GTG CGC GTC GGG CTC CTC AAT TGA TCG GTT GGC TTC TTA CG GAT CGT CGT CTC GTG TTT CTC C TAC GCA TTT GAT CAG TTC TAT ACT ACC GGG TGC CTA TGG AGA GCC GAT GAA GAA GCG ACA GTA ATT TAA GCC GGA TCC TCT CATA GCA TCG GCG TTT CAT TTC TTC 56 6 C 51 4 C 52 C 54 9 C 55 8 C 55 6 C 54 9 C 51 8 C 52 6 C 56 3 C 48 6 C 51 6 C 54 C 262 Anhang Bezeichnung Sequenz 5 gt 3

Differentielle Gentranskription bei Hypobiose induzierten und nicht

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents