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CEQ Sequencing Troubleshooting

1. ws au ti ad 0 0 0 H 0 72 B 9 100 10 420 Time Minutes Faible quantit de matrice employ e dans la r action de s quen age Actions correctrices 1 Ajouter la quantit correcte de matrice ADN dans la r action de s quen age Cela n cessite une quantification de la matrice par spectrophotom trie dans le cas d emploi de kits commerciaux ou par estimation sur gel d agarose et comparaison un ADN de quantit connue 2 L utilisateur peut essayer des dilutions en s rie de la m me matrice afin de d finir la quantit ad quate d ADN employer 3 Proc der un pr chauffage des matrices plasmidiques super enroul es En effet les matrices lin aires se pr tent un meilleur s quen age que les structures compactes 4 Si malgr une quantit ad quate de matrice employ e et une tape de pr chauffage l intensit de signal des donn es brutes ne s am liore pas augmenter le nombre de cycles dans le programme de thermocyclage de 30 40 ou 50 5 Si malgr une quantit ad quate de matrice employ e une tape de pr chauffage et ou une augmentation du nombre de cycles aucune am lioration n est not e quant l intensit des donn es brutes de fluorescence il est probable qu un inhibiteur de l ADN polym rase soit pr sent ne jamais re suspendre l ADN dans de l eau trait e au DEPC Une purification plus pouss e de la matrice ADN sera alors n cessaire Dans cer
2. gt Maintien 4 C 45 3 Pr sence de polyA et de poly T Le principal probl me est le d rapage de la polym rase sur de telles structures La fonction de r duction des pr pics peut tre utile I 1 11 120 190 141 TAG T GE CAT6GCTCG TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCETACCTTATATGS ATTATTTTA G Dans certains cas sp cifiques la s quence tudi e on peut essayer de red finir la position d hybridation de l amorce employ e essayer la chimie du kit DTCS r f 608000 et celle du kit Quick Start r f 608120 En conclusion La conduite g n rale tenir en cas de dysfonctionnement est de regarder les probl mes communs rattach s une amorce donn e une matrice donn e un type d chantillon donn une m thode de purification donn e un utilisateur en particulier etc Ne pas h siter nous contacter pour obtenir de l aide 46
3. V rifier l int grit de l amorce en HPLC ou en lectrophor se capillaire gt Purification insuffisante Utiliser au minimum des amorces dessal es Les conditions de thermocyclage gt Le nombre de cycle gt La temp rature d hybridation d Pr sence d inhibiteurs de polym rase Ils sont de diff rente nature DEPC Ph nol EDTA prot ines se liant l ADN etc e gt Penser purifier la matrice emploi de colonnes de filtration Stocker convenablement les amorces de s quen age eau ou Tris 38 e D gradation des fluorochromes De mani re typique les fluorochromes rouge et noir se d gradent les premiers WH W y N V la V H T y i 1 s V 15 YV A La VU W 14 Lau LU S 3 q k AN LN 13 C SAPA RAS J AA 2 De S AR CY 160 Time Minutes Les marqueurs sont stables dans le tampon de la r action de s quen age ainsi que dans le SLS recouvert d une goutte d huile Les diff rentes causes d une d gradation des fluorophores sont e gt Emploi d une mauvaise formamide ou d un SLS incorrectement conserv Utiliser le SLS fourni dans le kit ou disponible sous la r f rence 608082 Ne pas d g
4. A COULTER Guide de d pannage en s quen age pour syst me d analyses o n tiques Troubleshooting quide SOMMAIRE Section Diagnostic g n ral Donn es brutes Bon signal de donn es brutes Profil de courant Profil de courant normal Section D tecter un probl me sur le CEQTM A Est ce un probl me li l instrument ou la chimie 1 Diagnostic l aide de l ADN test pour s quen age r f 608070 2 Validation des composants du kits DTCS de s quen age 3 Les r actifs de l utilisateurs sont suspects 4 Le probl me vient il de la matrice ou de l amorce B Probl mes de courant 1 Injection lectrocin tique th orie 2 Diagnostiquer les probl me de courant quoi doit ressembler le profil de courant Un courant qui d cro t graduellement b Un courant irr gulier ou un courant qui s effondre c Les 8 capillaires pr sentent un m me courant irr gulier C Probl mes de donn es brutes 1 Types de probl mes de signaux de donn es brutes 2 Diagnostiquer les probl mes d intensit de courant 3 Les causes d un faible signal de donn es brutes a Faibles donn es brutes dues un manque de matrice b Faibles donn es brutes dues des probl mes d amorces 1 Quantit et qualit de l amorce 11 Conception de l amorce design c Faibles donn es brutes dues une formamide de mauvaise qualit Faibles donn es brutes dues l utilis
5. ajustement de la temp rature 3 utilisation d une mauvaise temp rature d hybridation non adapt e l amorce employ e au cours du s quen age 4 emploi de tubes ou de plaques qui ne s adaptent pas dans le thermocycleur 5 utilisation d un thermocycleur d pourvu de couvercle chauffant 6 perte des capuchons des barrettes ou tubes emploi de couvercle en silicone ou de film de scellage inadapt s L un de ces l ments conduira l obtention de faibles donn es brutes de fluorescence comme figur dans la figure c1 apr s 172 09 13240 18 Raw Data Activity lents 100 Time Actions correctrices 1 V rifier les performances du thermocycleur employ 2 V rifier que la mont e de temp rature est param tr e son maximum 3 V rifier le Tm de l amorce de s quen age employ e et ajuster en cons quence la temp rature d hybridation 4 S assurer de l utilisation de tubes ou de plaques pour La plaque pour chantillons employ e par le peut tre utilis e sur les thermocycleurs MJ PTC 200 et PE 9600 5 V rifier le bon positionnement des capuchons barrettes de capuchons film ou couvercle en silicone de scellage Si le scellage n est pas herm tique un ph nom ne d vaporation peut se produire amenant des modifications de la concentration du tampon du milieu r actionnel 18 4 Donn es brutes de fluorescence trop lev es
6. Contr ler la dur e de vie du gel v Remplacer le jeu de capillaires v Retirer le jeu de capillaires et nettoyer la fen tre de d tection Employer pour cela de l eau st rile ou de l thanol absolu Ne pas utiliser de m thanol Nettoyer la fen tre de d tection dans une seule direction v Nettoyer la zone du collecteur Section IV En r sum 1 Les m thodes de s paration disponibles sur le syst me S quen age gt LFR I 700 nt gt LFR a gt 800 nt gt LFR b 600 nt gt LFR c 500 nt gt Seq Test n utiliser que lors de la s paration de l chantillon test pUC18 r f 608070 Analyse de fragments gt Fragl gt Frag2 gt Frag3 migration de fragments jusqu 400 nt gt 4 migration de fragments jusqu 600 nt gt SNP I analyse de SNP gt Frag Test n utiliser que lors de s paration de l chantillon test fragments r f 608105 2 Les outils pour diagnostiquer les probl mes L chantillon test r f 608070 permet de v rifier l instrument le gel employ le jeu de capillaires utilis contr le pUC18 et son amorce de s quen age 47M13 inclus dans chaque kit de s quen age r f 608000 et 608120 permettent de v rifier les r actifs employ s au laboratoire la technique e Les chantillons propres l utilisateur permettent d estimer l implication de
7. Dans les cas les plus graves o le profil de courent est instable le flux de fragment d ADN marqu s ne passe pas au niveau de la fen tre de d tection un taux constant aboutissant des erreurs de s quen age Le logiciel de s quen age est con u pour compiler des donn es de fluorescence associ es des fragments d ADN qui migrent une vitesse relativement constante Cela permet au logiciel d estimer l espacement des fragments donn e prise en compte lors de l appel des bases Si l espacement entre les pics est augment trop peu de base par minute ce qui arrive dans les r gions o le courant a chut rapidement le logiciel peut ins rer des bases additionnelles dans la s quence Les figures ci apr s montrent respectivement des exemples de courant irr gulier et de courant qui s effondre ra S Current L e a Paie a e z tee Current LE 75 100 TES TTE Tms Mini tes Courant irr gulier S1 le courant est instable ou irr gulier le temps de migration des bases sera affect ce qui peut entra ner des impr cisions dans l appel des bases Dans l exemple pr c demment montr la vitesse de migration des bases pendant la p riode o le courant ne s est pas maintenu une valeur stable aura t ralentie et la fiabilit d appel s en trouvera diminu e En plus d une impr cision d attribution
8. age r f BCI 608019 AF 3 Ne pas d congeler et recongeler successivement le SLS ou la formamide d ionis e Pour ce faire nous recommandons de r partir les solutions en aliquots de 250 ul 1 aliquot correspondant la quantit n cessaire pour la remise en suspension de 8 chantillons Conserver les aliquots 20 C dans un cong lateur d pourvu d un syst me automatique de d givrage N utiliser qu une seule fois les aliquots et les liminer apr s utilisation d Faibles donn es brutes dues l utilisation d eau en remplacement SLS Nous ne recommandons pas d employer de l eau pour remettre en suspension les culots d ADN purifi s avant le d p t des chantillons sur le Les fluorochromes Beckman Coulter Well RedTM n tant sont pas stables dans l eau pure les r sultats obtenus seraient similaires ceux g n r s par l emploi d une mauvaise formamide se r f rer au paragraphe pr c dent Actions correctrices se r f rer au paragraphe pr c dent 2155 e Faibles donn es brutes dues une injection insuffisante d chantillon Une injection insuffisante de fragments de s quen age dans les capillaires du syst me CEQTM aboutit des donn es brutes de faible intensit Employant la technique d injection lectrocin tique le syst me CEQTM est tr s sensible la pr sence de sels en exc s dans les chantillons inject s En effet les sels en exc s entrent en c
9. s des exemples de probl mes de courant li s la matrice ADN et dans une moindre mesure des prot ines et autre macromol cules charg es 2 Diagnostiquer les probl mes de courant quoi doit ressembler le profil de courant a Un courant qui d cro t graduellement Les matrices d ADN super enroul comme les mol cules d ADN plasmidique ont tendance entrer en grande quantit dans les capillaires et boucher leur extr mit H en r sulte une augmentation de la r sistance et une chute du courant au cours de la s paration Les capillaires bouch s pr sentent 2 sortes de probl mes de courant Dans les cas o le profil de courant pr sente une chute graduelle sans variation irr guli re 1l est couramment observ des longueurs de lecture courtes Cette diminution de la longueur de lecture est le r sultat d un ralentissement g n ral de la vitesse de s paration des fragments d ADN Ainsi il passe au niveau de la fen tre de d tection moins de fragments d ADN marqu et par cons quent moins de bases sont s quenc es En r gle g n rale les mol cules d ADN lin aire telles que les produits de ou les produits de digestion d endonucl ase de restriction ne posent pas de probl me de courant D autre part d autres macromol cules qui co purifient avec les matrices ADN peuvent galement g n rer des probl mes de courant Parmi ces macromol cules se trouvent les prot ines glycoprot ines ADN chromosomique
10. Ces r actifs sont essentiellement ceux employ s lors de la purification des r actions de s quence par pr cipitation thanol tels que ac tate de sodium EDTA et thanol Dans certains cas lors de l emploi de vieux kits de s quen age la formamide fournie par l utilisateur peut aussi tre source d ennuis En r gle g n rale le sympt me traditionnel li l emploi d ac tate de sodium d EDTA d thanol ou de formamide de mauvaise qualit est l obtention de donn es brutes de faible intensit occasionnellement associ es des profils irr guliers de courant L utilisation d ac tate de sodium et d EDTA fournis par Sigma ainsi que du SLS inclus dans chaque kit de s quen age permettra d liminer presque tous les probl mes li s l emploi de r actifs de qualit m diocre Si l un de ces r actifs est suspect remplacer chacun d eux de mani re syst matique un seul la fois afin d identifier l l ment d fectueux Si la matrice contr le atteint les sp cifications 98 700 nt mais que les chantillons de l utilisateurs ne donnent pas de bons r sultats passer la section suivante 4 Le probl me vient il de la matrice ou de l amorce Apr s avoir prouv la bonne fonctionnalit de la matrice contr le pUC18 et de son amorce de s quen age 47 les chantillons de l utilisateur peuvent tre s quenc s Dans mesure du possible les r actifs doivent tre test s individuellemen
11. bact rien ARN et d bris de la paroi cellulaire Actions correctives pour r soudre les probl mes mineurs de courant Une diminution graduelle du courant au cours de la s paration indique qu il peut y avoir un exc s de matrice ADN dans la r action de s quen age ou que la matrice est tr s fortement super enroul e existe plusieurs solutions pour rem dier ces probl mes list es de la plus simple la plus labor e 1 Si les donn es brutes sont en quantit suffisante il suffit souvent de diminuer le temps d injection des chantillons dans les capillaires pour am liorer la longueur de lecture ainsi que la pr cision d appel des bases Le simple fait de refaire migrer l chantillon en diminuant de moiti le temps d injection peut r soudre le probl me i e si l injection initiale tait 2 kV pendant 60 secondes appliquer 2 KV pendant 30 secondes 2 Une autre alternative si les donn es brutes sont en quantit suffisante est de r duire la quantit de matrice mise en pr sence dans la r action de s quen age Dans ce cas la diminution de moiti de la quantit de matrice peut liminer le probl me 1 e si la quantit initiale de matrice tait 100 fmoles employer 50 fmoles pour la nouvelle r action de s quence 6 3 Proc der au pr chauffage de la matrice ADN avant la r action de s quen age Le traitement par pr chauffage se r f rer au guide d taill d utilisation du kit de s qu
12. cycle au cours du thermocyclage pour g n rer moins de signaux de fluorescence lors de la r action de s quen age 19 5 Les ph nom nes d insertion a Les insertions dues aux amorces n 1 La pr sence d un pourcentage significatif d amorces 1 dans une pr paration d amorces peut entra ner l apparition de pr pics pr c dant un pic de s quence r el Dans certains cas ces petits pics peuvent tre appel s comme de vraies bases dans la s quence Cela se produit g n ralement plus souvent dans une s quence qui pr sente un G suivi d un Toutefois des multiplets 1 TT ou CC peuvent aussi tre associ s ces ph nom nes d insertion Dans l exemple ci apr s la pr sence d une grande quantit d amorce 1 20 associ e l amorce employ e pour le s quen age a pour cons quence l insertion d un pr pic plus petit devant chaque pic r el de s quence Comme le montre l illustration plusieurs reprises ces pr pics sont consid r s comme de vraies bases et appel s en cons quence 120 130 T GM A T G MA 110 G A T G G A A A G T T Pas d amorces n 1 20 Les caract ristiques d incorporation de l ADN polym rase thermostable employ e dans le kit de s quen age ainsi que les caract ristiques des fluorochromes Well Red TM peuvent tre utiles pour distinguer les pr pics des pics r els Par exemple lorsque d
13. d gradation des chantillons et par cons quent des signaux de faible intensit comme le montre l exemple ci dessous Les marqueurs rouge et noir sont particuli rement sensibles ce ph nom ne 144 N XE Raw AIA V i L J I x pl LE PA a A L PAA eue e ri P 2 ie 5 L l i 1 Actions correctrices l Proc der une nouvelle r action de s quen age et employer l huile min rale incluse dans les kits de s quen age Beckman Coulter 2 Proc der une nouvelle r action de s quen age et employer l huile min rale de qualit Biologie Mol culaire de chez Sigma r f Sigma 5904 g Faibles donn es brutes dues des probl mes de thermocyclage La chimie DTCS du syst me CEQTM n cessite l emploi d un thermocycleur pour produire une amplification lin aire appel e s quen age cyclique et g n rer suffisamment de siganux de fluorescence pour obtenir un appel de bases pr cis Le programme de thermocyclage ainsi que les performances du thermocycleur sont des points critiques pour l obtention de r sultats optimum Parmi les diff rents probl mes de thermocyclage qui peuvent tre rencontr s figurent les l ments suivants 1 emploi d un thermocycleur mal adapt ou ayant de faibles performances 2 emploi d un mauvais programme de thermocyclage notamment dans les tapes d
14. d terminer selon le site de coupure choisi l enzyme de restriction employer Le plasmide doit tre coup en une position avale la s quence tudi e Par exemple si l amorce de s quen age s hybride sur le plasmide au niveau de la position n 100 et que la s quence d sir e est comprise entre les positions n 100 et 600 le site de reconnaissance de l endonucl ase de restriction devra se trouver la position 601 ou sup rieure 4 L limination de la matrice lors de la purification des r actions de s quence est la seule m thode efficace pour liminer les probl mes d instabilit de courant s agit d un proc d tr s labor qui n cessite l emploi d amorces et de r actifs particuliers mais qui aboutit des r actions de s quence ne pr sentant aucun probl me de courant 9 c Les 8 capillaires pr sentent un m me courant irr gulier Si les 8 capillaires pr sentent des probl mes identiques de courant irr gulier le probl me consiste en un blocage du passage lectrique au niveau du collecteur lt manifold gt La cause la plus fr quente de ce genre de probl me est la pr sence d une bulle d air proximit de l lectrode qui g ne le passage du courant La cons quence est que les 8 capillaires vont pr senter des longueurs de lecture moindres vraisemblablement associ es des erreurs lors de l appel des bases Ce genre de profil met en cause un probl me au niveau
15. dans la matrice ou l amorce Ces sels entrent en comp tition lors de l injection lectrocin tique R action de s quence associ e des sels R action de s quence sans impuret REMEDES Diminuer la quantit de matrice Purifier la matrice Refaire synth tiser l amorce c Probl mes li s l amorce La conception de l amorce design e gt l amorce id ale pr sente les caract ristiques suivantes x longueur 22 25 pb contenu GC 50 Tm gt 55 C temp rature d hybridation 590 LR Raw Dala s m s S a T r C Amorce fwd Tm 43 59 Amorce 79 89 80000 P 70000 el _ 60000 75000 z 50000 40000 50000 20000 20000 M 10000 NR EEEE AU ali Mud Li dit di W U UW 0 K as een A Lot N RA PO AYA 5 ado a vu RAR 0 49 42 Time Minutes pme Minutes Influence du Tm 37 linm ln Era Influences des interactions d amorces structures pingle cheveux dim risation La qualit de l amorce gt D gradation des amorces viter de trop congeler et d geler l amorce Stocker dans de l eau milliQ ou dans du Tris 10 mM gt Synth se de mauvaise qualit
16. des bases la longueur totale de lecture sera galement diminu e cause d une vitesse de s paration amoindrie ME eurent 7 lt 8 4 n 3 1 2 L i s re E J 1 LI re 4 D d 25 4 125 180 175 Tumas Courant qui s effondre Dans d autres cas les probl mes de courant peuvent tre plus significatifs La figure ci dessus montre un profil de courant qui ne parvient pas atteindre la valeur normale et finale de migration 8 12 uA pour chuter rapidement une valeur inf rieure 2 uA Actions correctrices pour r soudre les probl mes de courant irr gulier ou qui s effondre La survenue de profil de courant irr gulier indique qu il y a un probl me accru de surcharge des capillaires par l chantillon Dans ces cas 1l faut prendre des mesures plus drastiques Dans le cas d un profil de courant irr gulier refaire migrer l chantillon en diminuant de moiti le temps d injection ne permettra pas de r soudre le probl me Les tapes n cessaires sont les suivantes 1 Si les donn es brutes de fluorescence sont en quantit suffisante il suffira dans une premi re intention de diminuer de moiti la quantit de matrice dans la r action de s quen age i e si la quantit initiale de matrice tait 100 fmole
17. du module d analyse Sequencing Lorsque l on consulte les donn es brutes la principale caract ristique regarder est l intensit du signal En r gle g n rale l intensit du signal d cline de mani re graduelle au cours de la migration comme d crit ci dessous 0 43 60900 26 Raw Data 125000 100000 z Toto x II 25000 T M k L 26 50 100 150 175 Tiens RAI NES h Dans l exemple ci dessus l intensit de signal en d but de s paration est proche de 125 000 unit relative de fluorescence puis d cro t jusqu la valeur 25 000 RFU fin de migration L intensit de signal est un param tre important car en absence de signal d intensit suffisante 1l est peu probable d obtenir un appel de bases pr cis L exemple repr sent ci dessus montre une intensit de fluorescence excellente N anmoins 1l n est pas n cessaire pour chacun des chantillons analys s d avoir une si importante intensit de signal pour aboutir un appel pr cis de bases La caract ristique importante se rappeler est le rapport signal bruit Avec un rapport signal bruit proche de 3 1 le logiciel pourra proc der un appel pr cis de bases Ainsi un profil de donn es brutes commen ant 25 000 RFU et se terminant 5 000 RFU associ une ligne de ba
18. du syst me de migration plut t qu au niveau des chantillons en cours d analyse La formation de bulles d air peut avoir plusieurs origines trop de mouvements de retrait et ou d installation de la cartouche de gel mauvaise mise en place de la fen tre de d tection du jeu de capillaire dans le collecteur d o une mauvaise adh sion au joint du collecteur d rangement accidentel du positionnement l lectrode L exemple ci dessous montre des profils de courant d un jeu de 8 capillaires lors de la pr sence d une bulle d air dans le collecteur du syst me CEQTM k UN OP ANNE m trom q O Cd AT De RE Actions correctrices pour r soudre les probl mes de courant li s la pr sence d air dans le collecteur 1 Proc der une ou deux purges du collecteur partir du menu de contr le direct dans le module de pilotage du syst me CEQTM 2 Contacter un ing nieur de maintenance Beckman Coulter si les probl mes persistent 10 C PROBLEMES DE DONNEES BRUTES 1 Les diff rents types de probl mes de signaux rencontr s en donn es brutes e en existe de plusieurs sortes Le probl me le plus commun est une intensit de signal trop faible Dans ce cas 1l n y a pas assez de signal de fluorescence repr sent sur les lectrophor gram
19. kit r f 608000 et 608120 Enfin les chantillons du laboratoire pourront alors tre s quenc s Ces 3 test permettent de juger l int grit des donn es brutes du profil de courant et des donn es analys es Ci dessous se trouvent list es en d tail les op rations mener pour l ensemble de ces 3 tests en vue de diagnostic 1 Diagnostic l aide de l ADN test pour s quen age r f 608070 L ADN test pour s quen age est employ pour confirmer le bon fonctionnement de l appareil et des diff rents consommables qu il emploie gel de s paration jeu de capillaires tampon s paration Ce contr le consiste en une r action de s quen age purifi e r alis e partir de la m me matrice ADN pUC18 fournie dans les kits DTCS de s quen age Ce contr le doit g n rer des donn es de fluorescence d intensit initiale comprise entre 50 000 et 120 000 RFU L intensit doit ensuite d cro tre de mani re graduelle jusqu la fin de la phase de s paration Le profil de courant doit entre autre pr senter un aspect normal se r f rer la section pr c dente Enfin 1l est n cessaire de v rifier la pr cision de lecture afin de contr ler si l instrument r pond ses sp cifications savoir une pr cision de 98 700 bases r aliser l alignement la matrice contr le pUC18dG Si l ADN test permet l obtention de bons r sultats bonnes donn es brutes profil de courant normal et sp ci
20. l ADN matrice et de l amorce dans la qualit des r sultats 28 3 Aspect des chromatogrammes aloi lt j sl eus FA Ese fit 7 ali xj di LE e lt P HO a 202 0403493381 jom Arabes ami lt j rc vel lee sellaisia im ele alaa RF s elz n ti alale Dels gt a alala feta gt J kel Ce ere h E pe et es gt USCA CTISCACICGCMIRMGCTTCGSSTOSMOCOCOSTEA ACTTCAMGITGAGC TOGA ATGICGCCTTCCTCGCAGGGCAGAGOATCACGCGGGTTGCO GGAGGTOTAGLCYA CT E k CTCTECACAGC TCOCTAMGCCACTGOCTGCTO CANGITOCTHHCI TC Y TALS AC 5 GANGA GA PAC HT CC A RP CG MANG AUG LPS AAA A MA NGANHMAN MGA ALLAN AM PCA Co TC PAC CCS A PC TR RC A TC GTGGTCTT TGAA 1 ACGGAGCITCACATCAATCAGATAAA Faw Data 126000 100000 T 6000 ut conte 26000 c Curentimiors ra Fa TT 10 20 B TO Time Mnut 29 A PROBLEMES D
21. li s l amorce Conception Qualit Pr sence d inhibiteurs de la polym rase D gradation des fluorochromes Probl me li aux mat riels employ s Thermocycleur Centrifugeuse 35 Probl me li chimie a La concentration d ADN est inadapt e S il y a trop peu de matrice la r action de s quen age g n re trop peu de produits REMEDE ajouter plus d ADN dans la r action La concentration correcte d ADN mettre en pr sence dans la r action de s quence est de gt 50 100 fmoles pour l ADN double brin gt 25 50 fmoles pour l ADN simple brin gt 10 50 fmoles pour les produits de PCR Table de quantification pour la matrice ADN Size kilobase pairs 7 U 77 8 l O RE C e o o o o s 8 16 o f o s H E For ssDNA the values ng should be divided by 2 Use no more than 1 5 ug of template DNA ng for 25 fmol ng for 50 fmol ng for 100 fmol DNA molecular weight marker XIII 50 base pair ladder Cat No 1 721 925 50 pg 1 Ag Unit Comment estimer la concentration de la matrice gt Migration sur gel d agarose avec marqueur de poids mol culaire z voir ci contre w gt Lecture en fluorescence e g kit picogreen o gt Lecture en spectrophotom trie http tsochernroche comipack insert 172 1 52 51 36 b Pr sence de sels
22. pas de lt sauver gt une pr paration contamin e b Les insertions dues un m lange de matrices un m lange d amorces ou un mauvais appariement d amorce Dans bien des cas de mauvais r sultats de s quen age sont dus plusieurs v nements de s quen age se produisant en une m me r action Les v nements multiples de s quen age sont g n ralement dus un m lange de matrices 2 ou plusieurs matrices ADN dans la r action un m lange d amorces en plus de l amorce de s quen age la r action est initi e par l une des amorces ayant servi g n rer le produit de PCR s quenc ou un mauvais appariement de l amorce de s quen age cette derni re s hybride en 2 ou plusieurs sites sur la matrice s quenc e Tous ces v nements de s quen age multiple conduisent aux m mes sympt mes bases ins r es plus de 8 10 bases par minute dans les donn es brutes et superposition de pics tant dans les donn es brutes que dans les donn es analys es co migration de plus d un fragment marqu de s quen age 1 Lorsque plusieurs populations diff rentes de mol cules d ADN pr sentant un site commun d hybridation pour l amorce de s quen age sont pr sentes dans le milieu r actionnel plusieurs r actions de s quen age peuvent se produire simultan ment Il est assez fr quent de r cup rer une population mixte partir d chantillon PCR apr s excision sur gel e g technique de different
23. 0 IL E 25 20 T 100 125 150 172 Time 2 1 19 Raw Data Activity fenis 25 50 T5 100 125 150 175 Time Minutes Actions correctrices 1 Ajouter la quantit ad quate d amorce la r action de s quen age Cela n cessite une quantification de l amorce par spectrophotom trie La quantit recommand e d amorce est un exc s molaire minimum de 40 fois la quantit de matrice Pour le s quen age de la plupart des matrices ADN 3 10 pmoles d amorce sont suffisantes pour une r action de s quen age r ussie 2 S assurer du degr de puret de l amorce utilis e Se fournir aupr s de soci t s connues et reconnues de synth se fa on d oligonucl otides est le meilleur moyen d obtenir des amorces de haute qualit Si possible employer des amorces purifi es par TSP ou HPLC 3 Toujours prendre soin de la conception de l amorce design avoir un Tm lev viter les possibilit s de formation de structures secondaires ou de dim risation d amorces existe diff rents logiciels permettant de v rifier ces aspects 4 S assurer que l amorce est remise en suspension dans une solution exempte d EDTA ou de DEPC L eau de qualit Biologie Mol culaire ou un tampon Tris 10 mM 8 0 constituent les meilleures solutions de remise en suspension 5 Augmenter le nombre de cycles dans le programme de thermocyclage de
24. 30 40 ou 50 14 c Faibles donn es brutes dues une formamide de mauvaise qualit La formamide sert la remise en suspension des fragments d ADN s quenc s avant le d p t des chantillons sur le Afin d obtenir des donn es de s quen age de haute qualit la solution de formamide doit tre pr par e et stock e correctement Si la formamide n est pas d ionis e ni correctement conserv e elle se d composera en ammoniac et acide formique Ce dernier d truit les fluorochromes ce qui aboutit l obtention de signaux bruts de fluorescence de faible intensit L exemple ci apr s montre un chantillon qui a t re suspendu avec une formamide non d ionis e Il est noter que la pr cision d appel de base pour cet chantillon est inf rieur 90 gt 40 bases 500 bases Raw Data 130000 120000 1160000 100000 20000 Activity lents 5 l Id a 4 Ja a K 10 20 40 s 20 100 110 120 s Time Minutes Actions correctrices 1 Employer la solution de d p t des chantillons SLS fournie par Beckman Coulter dans les kits de s quen age r f 608000 et 608120 2 Si le SLS n est pas disponible ou en quantit insuffisante pr parer de la formamide d ionis e en suivant les recommandations de l annexe D de la notice d utilisation incluse dans chaque kit de s quen
25. Dans certains cas l intensit du signal de fluorescence peut tre si lev e qu elle risque saturer le syst me de d tection Cela conduit un appel de base erron notamment lorsque le logiciel sera amen estimer de mani re artificielle la hauteur des pics ainsi que leur position Dans ce contexte des extra bases sont ins r es dans la s quence tudi e En param trant l axe des ordonn es des donn es brutes de fluorescence pleine chelle 137 000 cnts et en examinant la forme des pics l utilisateur peut d terminer si ces derniers sont saturants Le fait que le sommet des pics soit tronqu voir le trac bleu dans l exemple 1 dessous indique que le d tecteur est satur L intensit de fluorescence des pics est alors trop importante WIH 211 Analyzed Data 40 50 T G T TE T ERT EE GCA ACG EEE AC TG EE T EGA 4 TE E CCG G G W h d JUN y VA Tirra Insertion de bases due des pics satur s Actions correctrices 1 Si les pics sont d intensit trop lev e la solution la plus simple est de refaire migrer l chantillon en employant un temps d injection plus court par exemple 30 secondes au lieu de 1 minute 2 Employer moins de matrice ADN ou diminuer le nombre de
26. E COURANT Le syst me d pose les chantillons dans les capillaires par injection lectrocin tique ATTENTION toutes les mol cules charg es n gativement seront d pos es dans les capillaires Cela concerne re L ADN produits la r action de s quen age L ADN matrice L ARN Les prot ines re Les sels 1 Un courant qui d cro t graduellement associ des longueurs de lecture diminu es 83 60 44405 84 Paw Data CAUSES Pr sence d un exc s d ADN super enroul REMEDES Diminuer le temps d injection R duire la concentration de matrice Faire un pr traitement de la matrice par chauffage 96 C pendant 1 minute 30 2 Un courant qui chute Exemple de profils pouvant tre rencontr s Current 34 48 0 38 Lurrent 1 3 lt 4 7 i 1 3 3 2 2 3 4 u y a 1 4 iP LUE PTE Tiras i hira av Ces profils de courants sont associ s des lectures courtes ou une analyse qui choue un appel impr cis de bases i Era Coria Fize Orit AP Fr Fr LT E Er FE Fr wa LZ DEEE HL E H t la 50 fmol de matrice pr chauff e pendant 1 minute 96 C 50 fmol de matrice non pr chauff e REMEDES D
27. an Coulter afin de faire intervenir un ing nieur de maintenance 2 Validation des composants du kit DTCS s quen age Apr s avoir v rifi que l instrument ainsi que le gel de s paration et le jeu de capillaires ne sont pas incrimin s dans le probl me rencontr 1l faut pr parer des r actions de s quence avec le 8 et l amorce 47 fourni dans le kit Ce test permet de discriminer si le probl me provient des r actifs fournis par se Beckman Coulter ou bien des r actifs employ s au laboratoire Les r sultats sont conformes aux sp cifications du syst me pr cision de 98 700 nt confirment la qualit des r actifs Beckman Coulter ainsi que les r actifs et mat riels de l utilisateur l exception des matrices ADN qu il s quence et des amorces qu il emploie cet effet S1 le test ne donne pas une pr cision de 98 700 nt 1l est d usage de recommencer l aide d un autre kit de s quen age si possible n appartenant pas au m me num ro de lot Si l chec se renouvelle avec un second kit les r actifs du laboratoire ou la m thode de purification peuvent para tre suspects Dans le cas o sont les r actifs de l utilisateur qui sont incrimin s passer la section suivante 3 Les r actifs de l utilisateur sont suspects L utilisateur apporte plusieurs r actifs qui peuvent avoir un impact sur les donn es brutes de fluorescence mais aussi sur le profil de courant
28. ation au niveau de l chantillon ayant pour origine sels amorces impures v Trop de cycle pour la r action de s quen age v Conditions de thermocyclage tr s efficaces entra nant des signaux qui saturent le d tecteur v Mauvaise qualit de l amorce 1 v Amorce d grad e v La formamide se d grade en acide formique et en ammoniaque Ces produits ioniques de d gradation entrent en comp tition de mani re significative avec les chantillons d ADN au moment l injection lectrocin tique entra nant une baisse de l intensit de signal De plus ils peuvent causer la d gradation de l chantillon lui m me v Mauvais appariement v M lange de matrices vV Amorce de mauvaise qualit 26 SOLUTIONS EVENTUELLES v Eluer la matrice ADN dans de l eau st rile ou dans une solution Tris 10 mM pH 8 5 Ne pas utiliser un tampon force ionique lev e pour l lution de l ADN lors de la purification de la matrice Employer des amorces purifi es HPLC v Utiliser la bonne concentration d amorce v Eviter l ajout de sels de quelque nature que ce soit dans l chantillon R injecter l chantillon avec un temps moindre v Diminuer le nombre de cycle sur le thermocycleur v Am liorer la qualit de synth se des amorces employ es pour le s quen age v Utiliser le SLS pour la remise en suspension v Stocker et employer le SLS correctement v D ioniser corre
29. ation d eau en remplacement SLS e Faibles donn es brutes dues une injection insuffisante d chantillon f Faibles donn es brutes dues qualit de l huile min rale Faibles donn es brutes dues des probl mes de thermocyclage 4 Donn es brutes de fluorescence trop lev es 5 Les ph nom nes d insertion a Les insertions dues aux amorces 1 b Les insertions dues un m lange de matrices un m lange d amorces ou un mauvais appariement d amorce 6 Bruit de fond lev Section IIT Tableau d aide rapide au diagnostic Section IV En r sum N 1 O ON 11 11 11 11 13 13 13 15 15 16 17 17 19 20 20 21 23 24 28 Section Diagnostic g n ral Le syst me pr sente plusieurs outils permettant l utilisateur d identifier et de r soudre rapidement les probl mes A cet effet les 2 l ments les plus utiles sont les donn es brutes raw data et le profil de courant au cours la s paration lectrophor tique Dans certains cas les donn es analys es peuvent tre utilis es mais uniquement apr s s tre assur que les profils des donn es brutes et du courant sont corrects DONNEES BRUTES BON SIGNAL DE DONNEES BRUTES Les donn es brutes g n r es par le syst me sont accessibles temps r el pendant une s paration lectrophor tique mais sont aussi disponibles partir
30. ctement la formamide si elle est pr par e au laboratoire v S lectionner une temp rature d hybridation qui limite les hybridations non sp cifiques Employer des r gions de s quence sans ambigu t pour choisir le site d hybridation de l amorce de s quen age v Pr parer la matrice ADN en vitant soigneusement les contaminations par d autres matrices v Dans le cas des produits de PCR employer pr f rentiellement un site interne d hybridation pour l amorce de s quen age v Dans la plupart des cas l esp ce contaminante est pr sente en faible quantit et une simple dilution de la matrice permettra de diminuer sa concentration et de limiter ainsi ses effets Probl me rencontr gt Mobilit des sels gt Mauvaise r solution gt Capillaires Profil donn es brutes amp courant Compression des donn es dans la r gion situ e entre 20 et 70 bases de l extr mit de l amorce V rifier la pr cision d appel des bases avec la matrice contr le pUC18 gt La r solution n est pas bonne gt Moins de 6 pics par minute gt Pr sence de pics douteux gt D but retard des donn es malgr un profil normal de courant gt Un ou plus des 4 trac s sont sup rieurs 6 000 cnts au d but de la migration Origine probable du probl me v Due la migration des sels pr sents dans le tampon de s paration v Mauvais thermocyclage v Mauvaise formamide v Prob
31. ction lt r duction des gt dans le logiciel 41 100 110 120 T T 5 5 5 5 6 6 Sequence Analysis Parameters Editor DefaultSequence nalysisPar 3 OO Alignment Use Default Mobility Lali T lt 100 110 120 T T 8 C LES MATRICES DIFFICILES Elles peuvent tre class es en 3 cat gories Produits de PCR courts Difficult purifier Echantillons riches Formation de structures internes telles que des pingles cheveux Pr sence de polyA ou de polyT Probl me de d rapage de l enzyme 1 Les produits de PCR courts lt 200 pb 60 38 83169 09 Raw Data 125000 100000 75000 Acti ty ents Ch 25000 40 50 Time Minutes Lors de purification sur colonne il est possible de perdre du mat riel faible rendement de r cup ration Pr f rer alors la purification par traitement Exo SAP exonucl ase Shrimp Alkaline Phosphatase La proc dure est la suivante Ajouter 0 05 U SAP 0 1 U Exo par ul de r action de PCR Incuber 37 C pendant 60 minutes Inactiver les enzymes pendant 15 minutes une temp rature gt 75 C Maintenir ensuite 4 C 2 Les matrices riches La pr sence de zones riches en GC conduit fr quemment u
32. de V rifier la concentration de PEDTA e assurer de Plajout de lhuile min rale apr s la purification v Pr chauffer tous les chantillons plasmidiques pour la proc dure suivre se r f rer la page 17 du protocole d taill de s quen age ainsi qu la note d application A 1872A Ne pr chauffer que l ADN s quencer contenu dans de l eau v Ajouter une tape suppl mentaire dans le programme de cyclage n est pas pr conis v Diminuer les suivre les protocole v V rifier la m thode employ e de purification de la matrice v Employer le SLS fourni dans le kit de s quen age quantit s d Adn recommandations du Probl me rencontr gt Non reproductibilit gt Faible longueur de lecture gt Appel de base impr cis gt Donn es non analys es Profil donn es brutes amp courant Aucun signal mais un profil de courant normal aucun signal m me de terminateurs marqu s non incorpor s Seul le signal des terminateurs marqu s non incorpor s est visible associ un profil de courant normal Aucun signal et un mauvais profil de courant Aucun signal et un mauvais profil de courant irr gulier ou en chute identique gt dans les 8 capillaires gt dans 1 seul capillaire pour le m me chantillon Origine probable du probl me v Perte du culot d ADN v L extr mit des capillaires est cass e v Les ddNTPs n ont pas t ajou
33. donn es repr sent es graphiquement comme l Activit Cnts en fonction du Temps s paration Minutes doivent pr senter des valeurs de fluorescence comprises entre 5 000 et 125 000 cnts Le signal doit tre lev au d but puis d cliner graduellement au cours de la migration 3 Les causes d un faible signal de donn es brutes a Faibles donn es brutes dues un manque de matrice L une des causes les plus couramment rencontr es pour g n rer des donn es brutes de fluorescence faibles est l insuffisance de matrice ADN mise en pr sence dans la r action de s quen age L emploi de la quantit correcte de matrice est un l ment cl de la r ussite du s quen age en lectrophor se capillaire Nous recommandons l utilisation de 50 100 femtomoles fmoles d ADN plasmidique pour une r action de s quen age Cela constitue suffisamment de matrice pour g n rer des quantit s ad quates de fragments de s quen age marqu s mais pas trop pour entra ner des probl mes de courant voir le chapitre sur les probl mes de courant La moiti de cette quantit 25 50 fmoles sera employ e pour des matrices simple brin telles que l ADN du phage et des quantit s encore moindres seront requises pour les produits de PCR 10 50 fmoles pour les produits de PCR de taille inf rieure 3 kb Dans la plupart des cas la quantit de matrice employ e pour la r action de s quen age n est pas d termin e et
34. eler et recongeler successivement le SLS Nous recommandons d aliquoter le SLS d s sa premi re utilisation e gt Les culots ont t chauff s pour les s cher apr s la pr cipitation l thanol S cher les culots sous vide ou l air mais SANS CHAUFFER e gt Oubli de recouvrir d une goutte d huile les chantillons re suspendus en SLS L huile min rale a un double r le protecteur protection contre l oxydation des fluorochromes et protection contre l vaporation lors de la d naturation des chantillons par le CEQTM Probl me li aux instruments a Thermocycleur gt Utiliser un appareil couvercle chauffant gt Eviter l vaporation avec bouchons et tapis de scellage gt V rifier la fonctionnalit du thermocycleur b Centrifugeuse gt Employer une centrifugeuse r frig r e pour la purification l thanol des r actions de s quence gt Pour les plaques appliquer une force gt 1000 g et pour les tubes gt 10 000 g c CEQ gt Proc der aux v rifications avec l chantillon test r solution et pr cision de lecture capillaires et gel 39 3 Donn es brutes de fluorescence trop importantes Raw Data REMEDES R duire l injection des chantillons Diminuer la concentration de matrice ADN R duire le nombre de cycle V rifier la concentration de la matrice avant de lancer les r actions de s quen age 4 Trop de pic
35. en age DTCS provoque des coupures de ADN nicking qui all ge la structure super enroul e des ADN plasmidiques Rappelons que les matrices ADN super enroul es sont la cause principale des probl mes de courant 4 est possible de proc der la combinaison des degr s vari s des recommandations 1 2 et 3 pour liminer les probl mes de courant Par exemple r aliser une tape de pr chauffage sur 50 fmoles de matrice 5 Employer des techniques de purification des matrices ADN qui liminent les macromol cules telles que les prot ines glycoprot ines ADN chromosomique bact rien ARN et d bris de la paroi cellulaire La plupart des m thodes de pr paration des ADN commercialis es permettent d obtenir des ADN exempts de macromol cules contaminantes 6 Eliminer la matrice de la r action de s quen age s agit d un proc d tr s labor qui n cessite l emploi d amorces et de r actifs particuliers mais qui aboutit des r actions de s quence ne pr sentant aucun probl me de courant La technique la plus courante consiste employer des amorces de s quen age biotinyl es ainsi que le kit de purification de r action de s quence DynaPureIl M Inc Oslo Norv ge r f rence produit 603 05 qui permet l limination de contaminants tels que la matrice ADN les terminateurs marqu s incorpor s les dN T Ps et autres sels b Un courant irr gulier ou un courant qui s effondre
36. ert noir et rouge est inf rieure 6 000 cnts La figure ci apr s montre un exemple de capillaires sales Les r sultats de gauche sont associ s des donn es de qualit acceptable l exemple de droite montre un cas extr me de capillaires sales Data B 71 2205 09 Feu Data stat fonts ENTE Actions correctrices 1 Retirer le jeu de capillaires et proc der au nettoyage de la fen tre de d tection Pour ce faire employer de l eau st rile Ne pas utiliser de m thanol Nettoyer avec un coton tige dans une seule direction 2 Dans la fonction de contr le direct Direct Control du module de Run proc der une purge du collecteur Manifold Purge et remplir les capillaires avec du gel Fill Capillaries avant de proc der leur nettoyage voir recommandation 1 ci dessus 23 Section Tableau d aide rapide au diagnostic Profil donn es brutes Probl me rencontr amp courant gt Non reproductibilit gt Faible longueur de lecture gt Appel de base impr cis gt Donn es non analys es Signal brut faible et profil de courant normal Signal brut faible et profil de courant irr gulier ou en chute Origine probable du probl me v Pas assez d ADN v Mauvais thermocyclage Probl me avec le thermocycleur v Mauvaise formamide v Concentration d amorce incorrecte v Resuspension insuffisante du culot dans le SLS v Probl me au moment de la pu
37. eux T se succ dent le premier pic est g n ralement plus important Ainsi un petit pic de T suivi d un grand pic de T d signe le premier pic comme tant un ne devant pas tre int gr dans la s quence tudi e Actions correctrices La seule mani re de corriger ce probl me est de travailler avec des amorces de s quen age de haute qualit 1 Si vous vous fournissez aupr s de services externes service commun soci t de synth se fa on d oligonucl otides demandez au prestataire d employer les conditions de synth se ayant le plus important degr de qualit est important de noter que les m thodes de purification d oligonucl otides bas es sur la chromatographie ne permettent pas de s parer compl tement la fraction n 1 de la fraction oligonucl otide ayant la taille attendue et par cons quent ne permettent pas de sauver une pr paration contamin e 2 Si vous proc dez vous m me la synth se des amorces travaillez en configuration lt Haute qualit sur le synth tiseur employ Cela n cessite g n ralement d employer de plus grandes quantit s de r actifs de capping et des temps de greffage chimique plus longs Comme mentionn pr c demment les m thodes de purification d oligonucl otides bas es sur la chromatographie ne permettent pas de s parer compl tement la fraction n 1 de la fraction oligonucl otide ayant la taille attendue et par cons quent ne permettent
38. fications atteintes 700 bases cela signifie que l instrument et les consommables associ s ne sont pas en cause Le diagnostic approfondi des probl mes devra alors se focaliser sur la chimie La figure ci dessous montre un exemple d un ADN test d passant les sp cifications normalement requises 700 bases 100 110 120 130 140 150 1 Template GAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTAMCCGCTCACAATTCCAC GAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTAMCCGCTCACAATTCCAC Error H 4 El 3830 00 0 01 _ JL SO A NN AAA a Lie 4 Hi Results Tot 600 Tot 700 Tot i Hame Err 1 J ______ M ja 0 O jo o 3 b jo o o 5 4 Si test ne permet pas l obtention de bons r sultats donn es brutes anormales profil courant instable et sp cifications non atteintes 700 bases 1l faut tester les consommables associ s tels que le gel de s paration le jeu de capillaires et un autre lot d ADN test Les diff rents consommables doivent tre test s s par ment afin d identifier celui qui est d fectueux Si malgr la substitution de chacun des consommables aucun r sultat n est obtenu contactez le service apr s vente Beckm
39. iel display ou partir de PCR contenant plusieurs fragments amplifi s Cela peut aussi se rencontrer avec des chantillons de plasmides quand par exemple plus d une colonie recombinante est mise en culture Dans ce cas le d but des donn es de s quence est bon s quence commune du vecteur mais au niveau de la r gion ins r e les diff rences entre populations se traduiront par la pr sence de bases ins r es 21 2 Le m lange d amorces ou des amorces qui s apparient mal sont deux ph nom nes similaires dansle sens o ils vont conduire l insertion de bases partir d v nements multiples d extension d amorce se produisant dans le m me milieu r actionnel Dans le premier cas la totalit des amorces employ es pour g n rer le produit de PCR n a pas t compl tement limin e avant de proc der la r action de s quen age Ainsi les amorces r siduelles initient des r actions de s quence partir de r gions diff rentes sur la matrice 3 S il existe 2 voire plusieurs site d hybridation pour l amorce sur la matrice tudi e l amorce de s quen age ne va pas s apparier correctement La cons quence est l existence d un exc s de bases dans les donn es analys es qui g n re l insertion de bases dans la s quence finale Dans bien des cas les donn es pr sentent tellement d insertion que l analyse choue L exemple ci dessous montre un exemple d insertion de bases ayant pour o
40. iminuer la concentration de la matrice Faire un pr chauffage la matrice 1 minute 96 C Cliver la matrice emploi d une endonucl ase de restriction Eliminer la matrice apr s la r action de s quen age emploi de billes magn tiques i Comment optimiser le pr traitement de la matrice par chauffage Dans un premier temps essayer 1 2 puis 3 minutes 96 C Si aucune am lioration n est observ e appliquer 5 minutes 86 C l Hd LT FE LE Mn C gt 32 3 Un courant qui chute de mani re identique dans les 8 capillaires j Sequence Analysis 020821 1HIY H06_0208210929 File Edit View Tools Analysis Window Help sjel aala Helelole 1 ali em oA gt J z A MC MG N T NN H 171 020821 1HIV HO6 2020820 15 x i0 x 101 EE 10 9 020821 1HIV H06 0208210929 9 020821 1FIV F06 02082109239 9 020821 1DMK D06 020821094 9 020821 1 06 020821092 Farm tre For Help press F1 A E Z Eceos ceo o A ceo s 9 64 2 220 13 45 CAUSES Pr sence de bulles d air dans le collecteur REMEDES Proc der une purge du colleteur puis refaire migrer l chantillon ATTENTION A LA DEGRADATION DU GEL Pas plus de 72 heures sur le CEQTM Conservati
41. l me lors de la purification des r actions de s quence v Huile min rale incorrecte v Incrimination du jeu de capillaires Incrimination du gel de s paration v Le jeu de capillaires a plus de 150 migrations son actif Le rev tement interne du capillaire est endommag v L extr mit des capillaires s est dess ch e Le jeu de capillaires n a pas t stock correctement Certains compos s chimiques ont t employ s avec l chantillon et ont endommag les capillaires e g DMSO v La plaque de tampon mise en pr sence ne correspond pas au plan de la plaque d chantillons v Fen tre de d tection sale v Collecteur sale 27 SOLUTIONS EVENTUELLES v Uniquement observ en version logicielle v 1 1 v Ph nom ne non version 2 x et sup rieure rencontr en v V rifier si le contr le pUC18 atteint les sp cifications Si c est le cas les l ments suspects sont la matrice ADN s quenc e ou l amorce employ e v Si le contr le pUC18 n atteint pas les sp cifications gt Employer le SLS pour remettre en suspension les chantillons purifi s gt V rifier le thermocycleur gt Probl me lors de la pr cipitation thanol V rifier la pr sence de glycog ne Centrifuger 4 C Contr ler le pH du NaAc Contr ler la concentration de V rifier que l huile min rale t ajout e Contr ler la dur e de vie des capillaires
42. mes par l activit en ordonn e pour g n rer un appel de bases pr cis Un autre probl me rencontr est une intensit de fluorescence trop importante qui peut saturer le syst me de d tection par photomultiplicateur L origine de ce ph nom ne est due la pr sence d un trop grand nombre de fragments d ADN marqu s Une troisi me cat gorie de probl me est la pr sence de trop de pics de fluorescence Ceci peut tre du 2 v nements de s quen age ind pendants s tant produit pour un m me chantillon Ce ph nom ne trouve son origine lorsque la r action de s quence poss de 2 matrices ou plus contaminations ou bien lorsque la matrice s quenc e pr sente de multiples site d hybridation de l amorce Une variante de ce ph nom ne est connue sous le nom de probl me de pr pic Les pr pics sont dus une synth se de faible qualit des amorces employ es pour le s quen age Dans ce cas une forte proportion d amorces n 1 est pr sente les amorces n 1 sont des amorces plus courtes d une base que la longueur normalement attendue Tous les probl mes ci dessus mentionn s ainsi que plusieurs autres cas de figure sont pr sent s et discut s dans les paragraphes suivants 2 Diagnostiquer les probl mes d intensit de signal La premi re tape consiste observer le signal de fluorescence des donn es brutes lt Raw Data dans le module Sequencing du logiciel Les
43. ne chute rapide voire une interruption des donn es brutes de fluorescence 43 Data 66 53 2306 50 12122 AT ns T H SAR on A ET 05 68 85172 08 a dut I 2 4 34 Tu fe Eu linm 99 53 67 16 58 126000 100000 76000 ut ont 26000 44 REMEDES Modification de la chimie gt DMSO Ne pas employer dommageable pour les capillaires gt Single Strand Binding Protein Stratagene 0 5 ug pour 20 ul de r action de s quen age DTCS Fonctionne mieux avec le kit DTCS r f 608000 qu avec le kit Quick Start r f 608120 gt B taine Concentration finale 0 7 2 M par r action de s quen age Fonctionne tr s bien avec les 2 types de kits r f 608000 et 608120 gt D azaGTP Remplace le mix dNTPs du kit DTCS r f 608000 compos s s par s de chez Sigma USB Ajuster les dNTPs une concentration finale 0 6 mM utiliser le d aza GTP en lieu et place du dITP La temp rature d extension employ e sera de 72 C Pr traitement la chaleur gt De 1 5 minutes Ajustement des conditions de thermocyclage gt Hot start 2 minutes 96 gt 30 cycles de 30 secondes 96 74 76 69967 07 Raw Data 4 minutes 60
44. omp tition avec les fragments de s quen age au moment de l injection aboutissant un chargement moindre de mol cules d ADN marqu Les sels en exc s trouvent g n ralement leur origine dans des r actions de s quen age incorrectement purifi es et dans les produits de d gradation de la formamide Favs sr Faw D dan V aiik insta R action de s quen age avec exc s de sels R action de s quen age sans impuret Actions correctrices 1 Respecter la proc dure de purification des r actions de s quence par pr cipitation l thanol d crite dans les notices d utilisation incluses dans chaque kit r f BCI 608019 2 Si la proc dure de purification retenue est l emploi de colonnes de filtration s assurer que le mat riel contenu dans ces colonnes ne contient pas de sels v rifier aupr s du fournisseur la compatibilit de l emploi de ce genre de colonnes avec les s quenceurs capillaires 3 Employer la solution de d p t des chantillons SLS fournie par Beckman Coulter dans les kits de s quen age r f 608000 et 608120 pour la remise en suspension des chantillons 16 f Faibles donn es brutes dues la qualit de l huile min rale L huile min rale incluse dans les kits de s quen age r f 608000 et 608120 est une huile de haute qualit d pourvue d activit nucl asique L emploi d huile min rale de qualit inf rieure peut conduire une
45. on 4 C entre 8 et 12 mois 33 B PROBLEMES DE DONNEES BRUTES Les diff rents types de probl mes pouvant tre rencontr s sont les suivants Bruit de fond important Diminue la sensibilit surtout si les signaux sont faibles Signaux bruts trop faibles Lecture courte ou absence de lecture Le rapport minimum signal bruit doit tre 3 1 Signaux bruts trop importants Source d erreur lors de l appel des bases Trop de pics Refl te souvent la pr sence de plusieurs s quences dans un m me chantillon 1 Bruit fond important Faw Cata B 71 2705 03 I u stat fonts aema OIT E S1 la ligne de base est sup rieure 6 000 cnts ou RFU Relative Fluorescence Unit nettoyer la fen tre de d tection en employant l une des solutions suivantes eau milliQ thanol 70 soufflage d air 34 2 Donn es brutes de fluorescence trop faibles i Pas de signal et absence de pic de terminateurs marqu s 65 82 74343 26 Raw Cata Tira gan CAUSES Perte du culot dans le cas d une pr cipitation l thanol D gradation des fluorochromes ii Pas de signal mais pr sence du pic de terminateurs marqu s 126000 100000 ut anto 26000 40 Time Minut CAUSES re Probl me li la chimie Concentration d ADN inadapt e Pr sence de sels dans l chantillon Probl mes
46. ption de l amorce design Les amorces doivent tre correctement choisies pour avoir un Tm suffisamment lev sup rieur 55 ne pas former de structures secondaires internes telles que des structures en pingle cheveux et avoir une faible probabilit de former des dim res d amorces Le Tm des amorces doit tre au moins plus lev de 5 C que la temp rature d hybridation du programme de thermocyclage 50 afin de se fixer correctement la matrice ADN et permettre l extension la polym rase La formation de structures secondaires internes ainsi que de dim res d amorces est favoris e de mani re thermodynamique par rapport l hybridation de l amorce sa matrice Ainsi ces ph nom nes r duisent la concentration effective d amorce dans le milieu r actionnel de s quen age Dans l exemple suivant la matrice est la m me mais 2 amorces diff rentes ont t utilis es L amorce n 1 pr sente un Tm de 43 5 C un contenu en GC de 31 6 et une longueur de 19 bases L amorce n 2 pr sente quant elle un Tm de 79 8 C un contenu en GC de 62 5 associ s une longueur de 24 bases Les effets sur les donn es g n r es sur le CEQTM sont clairs Avec une r action peu efficace l intensit de signal demeure faible et la pr cision d appel des bases n est pas optimale 112 0 1240 25 Raw Data 110000 100000 Sa T0000 60000 Activity 40000 30009
47. rification des r actions de s quence v Huile min rale incorrecte v Oubli de l huile min rale v Le pr traitement des plasmides la chaleur n a pas t r alis chantillons de plasmides cosmides YAC BAC ou PAC v Le pr chauffage a t r alis en pr sence de tous les l ments de la r action de s quen age v L tape de pr chauffage t incluse au d but du programme de cyclage v Trop t d pos dans les capillaires v Les chantillons sont associ s des ions contaminants qui sont inject s dans les capillaires ions issus de sels contaminants ou de la d gradation de la formamide v emploi d une m thode incorrecte de purification de la matrice s quenc e e g CsCl ph nol chloroforme ou limination incompl te de P thanol lors de la pr paration des chantillons etc 24 SOLUTIONS EVENTUELLES v Augmenter la concentration d ADN toujours quantifier la matrice v V rifier la concentration d amorce v V rifier que le culot est bien remis en suspension dans le SLS ou si le contr le pUC18 n atteint pas les sp cifications v Employer le SLS fourni dans le kit pour la remise en suspension v Contr ler le thermocycleur v V rifier que les bonnes conditions de thermocyclage ont t employ es sur le thermocycleur v probl me de pr cipitation thanol S assurer que le glycog ne est bien ajout Centrifuger 4 C V rifier le pH
48. rigine une matrice contamin e Les donn es brutes de fluorescence Raw Data semblent correctes mais les donn es analys es contiennent de nombreuses bases ins r es 5 doit pas tre vu de pics superpos s le gel 5 tant r solutif 1 base 250 65 5 65 0 670 67 5 68 0 63 5 63 0 695 70 0 70 5 Time Minute 747 20 0 16 Analyzed Data Actions correctrices 1 Pr parer la matrice ADN de mani re viter la pr sence de plusieurs matrices 2 Dans bien des cas lorsque la matrice contaminante est pr sente en tr s faible quantit le simple fait de diluer l chantillon contribuera diminuer proportion de s quence contaminante permettant d obtenir une s quence correcte 3 Purifier les produits de PCR avant de proc der leur s quen age 4 employer de pr f rence des amorces qui s hybrident en un site interne au produit de PCR s quenc amorces nich es 5 S lectionner des temp ratures d hybridation qui limitent les mauvais appariements 6 Les r gions ne pr sentant aucune ambigu t de s quence seront privil gi es pour choisir les sites d hybridation de l amorce de s quen age 6 Bruit de fond lev Une ligne de base lev e peut conduire un appel de bases incorrect ainsi qu des longueurs de lecture faibles Les performances optimum du syst me de d tection du sont atteintes lorsque la ligne de bases pour les 4 canaux bleu v
49. s les ph nom nes de contamination a Contamination de la matrice 28 03 1405 24 Raw Data Plasmides Plusieurs colonies ont t piqu es et cultiv es REMEDES Pr lever une autre colonie Etaler nouveau sur boite 40 Produits de PCR Plusieurs produtts de PCR sont pr sents et ont t s quenc s REMEDES V rifier la puret du produit de PCR sur gel d agarose Purifier le produit de PCR Dans certains cas les produits de PCR pr sentent de faibles niveaux de contamination dont l apparence est la suivante Il Q l h 20 1 h 4 Val CEN d A D 4 4 A 65 70 75 30 40 60 EAL Time Minutes Time Minutes REMEDES R duire l injection des chantillons Diminuer la quantit de matrice employ e pour la r action de s quen age Augmenter la temp rature d hybridation lors de la r action de PCR Revoir le design des amorces de la PCR b Contamination au niveau des amorces Contamination par les amorces ayant servi g n rer le produit de PCR s quence REMEDES Purifier les produits de PCR en les passant sur colonnes de filtration ou en les traitant Exo SAP D gradation des amorces ph nom ne de pics 1 REMEDES Employer des amorces fra chement pr par es Re synth tiser de nouvelles amorces Employer fon
50. s employer 50 fmoles pour la nouvelle r action de s quence 2 Le traitement de pr chauffage de la matrice ADN avant la r action de s quen age est fortement recommand pour les chantillons de plasmides super enroul s afin d liminer les probl mes de courant irr gulier ou qui chute 1 e pr chauffage 96 C pendant 1 minute avant l ajout l amorce et du Les exemples ci apr s montrent les am liorations obtenues apr s un tel traitement des chantillons 8 a uen Era Caia x Fis Crit mamana mana a aaa m gt A AE m F E E w IF SE _ E a 2 gt H 4 R L 50 fmol de matrice pr chauff e pendant 1 minute 96 C 50 fmol de matrice non pr chauff e 3 Une m thode alternative au traitement par pr chauffage est de lin ariser le plasmide par une endonucl ase de restriction avant d ajouter la matrice dans la r action de s quen age En effet cette m thode permet de convertir un plasmide avec une structure super enroul e en une mol cule lin aire Cette derni re se comporte alors comme un produit de PCR pour lesquels en r gle g n rale il n est pas observ de probl me de courant Cette m thode tr s efficace n cessite de conna tre la carte de restriction du plasmide afin de
51. s 8 capillaires 51 n y pas suffisamment de tampon dans la plaque de tampon v Pr sence de bulles d air dans le puits de l chantillon 25 v Proc der 2 purges du collecteur puis 2 remplissages du capillaire avec du gel note employer une nouvelle plaque de tampon v Nettoyer la zone du collecteur au niveau de l appareil Remplir les puits la plaque de tampon au moins au 3 4 v V rifier l absence de bulles d air au niveau de la plaque d chantillons avant de la charger sur le CEQTM Probl me rencontr gt Non reproductibilit gt Faible longueur de lecture gt Appel de base impr cis gt Donn es non analys es gt Fort signal de donn es brutes mais appel incorrect des bases pr sence de bases ins r es gt Effets de la formamide gt Art facts li s Profil donn es brutes amp courant Saut de la ligne de base des donn es brutes Donn es brutes de fluorescence satur es associ es un profil de courant normal gt Perte des fluorophores gt Diminution g n rale de l intensit de signal gt Aucun signal gt et ou probl me de courant gt Les donn es analys es contiennent de nombreuses base ins r es gt Pr sence de pics superpos s en donn es brutes ainsi qu en donn es analys es gt Plus de 9 bases par minute en donn es brutes Origine probable du probl me v Pr sence d l ments de contamin
52. se de 1 500 RFU aboutira une s quence correctement appel e PROFIL DE COURANT PROFIL DE COURANT NORMAL Lorsqu une s paration lectrophor tique lieu le syst me CEQTM affiche de mani re continuelle et en temps r el le courant qut traverse chacun des 8 capillaires Ce profil de courant qui peut par la suite tre consult pour chacun des chantillons dans le module d analyse Sequencing peut tre tr s utile pour le diagnostic de certains probl mes Un profil normal de courant doit pr senter l aspect ci dessous Current Current micro Avec les m thodes LFR le profil de courant atteint directement sa valeur finale Cette derni re doit tre comprise entre 5 et 9 uA et doit rester stable tout au long de la s paration profil en plateau Cette valeur est d termin e par le voltage de s paration employ lui m me d fini dans la m thode de s paration appliqu e l chantillon Section D tecter un probl me sur le CEQ A EST CE UN PROBLEME LIE P INSTRUMENT OU A LA CHIMIE Afin de diagnostiquer de mani re efficace un probl me sur le syst me CEQTM 1 faut adopter une approche syst matique Le premier test r aliser est de proc der la s paration d un ADN test pour s quen age r f 608070 avec la m thode Seq Test Apr s avoir obtenue une analyse couronn e de succ s il sera proc d au s quen age de l ADN contr le pUC18 fourni dans chaque
53. t s dans le cas du kit r f 608000 v Les chantillons n ont pas t remis en suspension dans la formamide ou le SLS v Pas assez d chantillon dans le puits v La r action enzymatique ne s est pas faite v L amorce employ e n est pas adapt e v Mauvaise d hybridation v Un des r actifs manque dans le cas du kit r f 608000 v Thermocycleur employ hors service temp rature SOLUTIONS EVENTUELLES v Utiliser des embouts de pipettes d di s aux d p ts sur gel pour liminer plus efficacement l thanol lors de la purification de la r action de s quence v Changer le jeu de capillaires si les extr mit s sont cass es v V rifier que tous les r actifs ont bien t mis en pr sence v N utiliser que le SLS fourni dans le kit pour la remise en suspension v Employer au moins 30 ul de SLS pour re suspendre les chantillons v V rifier que tous les r actifs aient t mis en pr sence v V rifier le Tm de l amorce de s quen age et ajuster en fonction la temp rature d hybridation v V rifier le programme de cyclage employ ainsi que les phases d ajustement de temp rature v Contr ler le thermocycleur Voir plus haut les explications sur les profils de courant d fectueux v Pr sence de bulles d air qui se sont form es dans le collecteur v La zone du collecteur est sale ne permettant pas un contact herm tique avec le capillaire v Le courant peut tre perturb dans le
54. t en vue de cibler de mani re plus efficace l identification des composants d fectueux Par exemple si l utilisateur emploie une matrice ADN qui peut tre s quenc e avec l amorce 47 une comparaison simultan e des r actions de s quence faite avec cette amorce et une des amorces de l utilisateur pourra tre r alis e B PROBLEMES DE COURANT 1 Injection lectrocin tique th orie Les probl mes de courant sont g n ralement associ s l injection lectrocin tique de l chantillon et la s paration des fragments d ADN s quenc dans le gel de polyacrylamide lin aire LPA 1 Le syst me d injection lectrocin tique permet de charger les mol cules charg es n gativement dans la matrice l extr mit des capillaires Ces mol cules charg es n gativement comprennent les fragments de s quen age termin s par un fluorochrome qui sont les mol cules que l on souhaite s parer mais aussi d autres mol cules telles que la matrice ADN des prot ines des sels les dNTPs et les terminateurs marqu s non incorpor s Comme le syst me CEQTM emploie la technique d injection lectrocin tique pour d poser les chantillons dans les capillaires 1l est possible que des l ments non d sirables soient introduits dans les capillaires Parmi l ensemble des mol cules ind sirables la plus probl matique est la matrice ADN pr sente dans la r action DTCS Ci dessous se trouvent list
55. tains cas une simple pr cipitation des plasmides l thanol permettra d liminer l inhibiteur alors que d autres situations n cessiteront l emploi de m thodes de pr paration d ADN disponibles sur le march comme les kits Qiaquick de Qiagen 12 b Faibles donn es brutes dues des probl mes d amorces 1 Quantit et qualit de l amorce La quantit et la qualit des amorces employ es pour le s quen age peuvent avoir une influence sur l intensit des donn es brutes de fluorescence Ainsi l utilisation de quantit insuffisante d amorce ou l emploi d amorce de faible qualit e g une amorce incompl tement d prot g e apr s sa synth se aboutiront des donn es brutes de faible intensit La plupart des fournisseurs d oligonucl otides procurent des pr parations d amorces suffisamment pures La majorit d entre eux proposent des amorces dessal es qui fonctionnent correctement en s quen age d ADN N anmoins une purification accrue des amorces par TSP Titryl Specific Purification ou HPLC High Performance Liquid Chromatography est vivement recommand e surtout si l on a besoin de donn es de s quen age de tr s haute qualit Il a t mis en vidence que des amorces purifi es en lectrophor se sur gel d naturant pouvaient contenir des inhibiteurs de l ADN polym rase En cons quence il faut viter l emploi de telles amorces pour les r actions de s quen age Conce
56. tr s souvent trop peu de mat riel est mis en pr sence Dans d autres situations une approximation incorrecte de la concentration d ADN est faite L estimation de la concentration d ADN par mesure spectrophotom trique n est correcte que si l ADN est pur comme c est le cas lors de l emploi de kits commerciaux de purification d ADN Une pr paration brute de matrice ADN i e miniprep brute de lyse alcaline qui pr sentera des quantit s substantielles de prot ines et ou aboutira une surestimation de la concentration d ADN Par cons quent une quantit trop faible de matrice sera employ e pour le s quen age 11 L exemple figur ci dessous montre le s quen age d un ADN pour lequel la quantit de matrice employ e n tait pas suffisante Dans cet exemple 25 fmoles d ADN ont t ajout es la r action de s quen age On peut remarquer la faible intensit des donn es brutes tout au long de la migration en particulier pour les trac s rouge vert et noir Un indicateur facilement identifiable d une faible concentration de matrice et plus g n ralement d une r action de s quen age faible est la pr sence d une grande quantit de terminateurs marqu s non incorpor s mat rialis s ici par le grand pic aux alentours de 40 minutes 11 66 106135 30 Raw Data 125000 100000 75000 Activity cots 50000 N

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