Home

TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit

1. P gina 26 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit 10 Limita es do teste Para detectar a muta o de 1 num fundo de ADN de tipo selvagem necess rio ter um Ct do ensaio de controlo da amostra lt 29 no ABI7500 e de lt 28 9 no LightCycler 480 Instrument Os ensaios n o conseguir o detectar muta o a 1 em amostras com valores Ct de controlo superiores e a sensibilidade da detec o de muta o diminuir medida que o Ct de controlo aumentar acima destes valores O valor do Ct de controlo do ADN da amostra baseia se na concentra o conforme determinado por PCR Os valores baseados em leituras de Densidade ptica n o correspondem aos valores Ct de ensaio de controlo em amostras de ADN fragmentado O kit inclui quantidades adicionais da mistura da reac o de controlo para permitir a avalia o dos Cts das amostras antes de se utilizar o kit Se uma amostra apresentar um resultado positivo quanto a muta o em que o Ct de muta o gt 38 o ensaio deve ser classificado como negativo ou abaixo dos limites do kit Isto efectuado automaticamente pelo LightCycler Adapt Software Poder ocorrer alguma reactividade cruzada entre as reac es de muta o Por exemplo se ocorrer um n vel elevado de muta o 12ALA algumas das outras reac es de muta o tamb m apresentar o resultados positivos Isto deve se ao facto dos iniciadores ARMS detectarem outras m
2. 5 apresentado um Run Summary Result quando a execu o deter minada como V lida ou Inv lida Isto dependente dos controlos da execu o nas colunas 1 e 2 P gina 17 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit 6 Controlos da execu o 6 1 O LightCycler Adapt Software calcula automaticamente o valor ACt do padr o misturado utilizando a f rmula Ct de muta o Ct de controlo ACt 6 2 O LightCycler Adapt Software compara os valores com os valores previstos indicados no Quadro 7 Quadro 7 Valores ACt previstos do LightCycler Adapt Software Ensaio ACt do padr o misturado 6 3 Os valores Cte ACt s o indicados 6 4 Os seguintes Alarmes Avisos s o assinalados para os controlos de execu o nas colunas 1 e 2 Quadro 8 Alarmes Avisos do LightCycler Adapt Software para os controlos de execu o Alarme Aviso Significado CT OUT OF RANGE O Ct do FAM para o ensaio de controlo est 7 an fora do intervalo EXO FAIL Para o padr o misturado o Ct do controlo ex geno EE lt 30 ou negativo quando o resultado FAM negativo DELTA CT OUT OF RANGE Os valores ACt de muta o est o fora do o om intervalo definido EXO CONTROL INVALID A reac o do controlo ex geno falhou num NTC TARGET CHANNEL INVALID A reac o do FAM tem um valor Ct positivo num NTC 6 4 1 Os significados dos Alarmes Avisos s o d
3. nico LightCycler 480 Instrument Il Esta valida o do LightCycler Adapt Software actualmente apenas para a unidade de controlo que um computador aut nomo ou seja n o faz parte de uma rede proibida a utiliza o de qualquer outro computador uma vez que o software poderia n o funcionar conforme previsto 3 Abra o LightCycler Adapt Software clicando no cone do LightCycler Adapt Software no ambiente de trabalho da esta o de trabalho e preencha o campo do nome de utilizador Este nome ser introduzido como o autor do relat rio 4 Na janela principal utilize o bot o do browser para seleccionar um nico ficheiro de execu o do LightCycler 480 Para remover a selec o o software tem de ser fechado e aberto novamente P gina 16 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit 5 Seleccione um tipo de relat rio pdf ou csv Se escolher csv ent o ser automaticamente criada uma vers o pdf adicionalmente 6 Seleccione Analyse para criar o relat rio de resultados O relat rio guardado automaticamente na pasta que cont m o ficheiro de execu o e lhe dado o mesmo nome que o ficheiro de execu o 7 O relat rio ser apresentado automaticamente 8 O resultado report vel apresentado na coluna Mutation Status do quadro Sample Result Table Interpreta o do relat rio do LightCycler Adapt Software 1 O relat rio do LightCyc
4. o das sete muta es do gene K RAS poss vel num fundo de ADN gen mico de tipo selvagem num ensaio por PCR em tempo real baseado na tecnologia DxS Scorpions Este m todo altamente selec tivo Desde que existam suficientes c pias de ADN poss vel a detec o de cerca de 1 de mutante num fundo de ADN gen mico de tipo selvagem O Kit K RAS detecta sete muta es do K RAS nos c d os 12 e 13 do oncogene K RAS conforme indicado no Quadro 1 P gina 3 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Quadro 1 Muta es do K RAS detectadas pelo Kit DxS As identidades c smicas s o obtidas do Cat logo de Muta es som ticas no cancro http Awww sanger ac uk genetics CGP cosmic Muta o Mudan a de base Identidade c smica Gly12Ala GGT gt GCT 522 Gly12Asp GGT gt GAT 521 Gly12Arg GGT gt CGT 518 Gly12Cys GGT gt IGT 516 Gly12Ser GGT gt AGT 517 Gly12Val GGT gt GTT 520 Gly13Asp GC gt GAC 532 G 3 Princ pios tecnol gicos O Kit K RAS combina duas tecnologias a ARMSO e a Scorpions 11 12 13 para detectar muta es em ensaios por PCR em tempo real ARMS A amplifica o espec fica do alelo ou muta o obtida por ARMS A polimerase Tag do ADN extremamente efectiva na sua distin o entre uma correspond ncia e uma n o correspond ncia na extremidade de 3 de um iniciador da PCR Sequ ncias mut
5. o do controlo ex geno ser avaliada apenas nos po os de reac o de muta o n o no po o do ensaio de controlo com a excep o das colunas de padr o misturado e de NTC ver ponto 6 ou se um Ct de controlo ex geno for lt 30 P gina 21 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit b Se existir uma determina o de muta o positiva mas o ensaio de controlo ex geno tiver falhado no po o positivo quanto a muta o o Alarme Aviso EXO FAIL n o ser apresentado uma vez que poder existir inibi o competitiva da reac o de FAM O estado da muta o v lido Se existir uma determina o de muta o positiva para uma amostra num po o de muta o e um ensaio de controlo ex geno tiver falhado num po o de muta o diferente para a mesma amostra a muta o no pri meiro po o ser determinada e o resultado v lido No entanto ser apresentado um Alarme Aviso EXO FAIL Este indica que existe um problema com o ensaio no po o em que oensaio de controlo ex geno falhou e uma muta o poder ter passado despercebida neste po o poss vel que a muta o determinada seja uma reactividade cruzada entre os ensaios em vez da verdadeira muta o que passou despercebida No entanto o estado da muta o no ensaio que indica a determina o da muta o positiva permanece v lido uma vez que est presente uma muta o clara e a decis o cl nica permanece a
6. o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit 2 N O misture com agita o forte a Tag ou quaisquer misturas de reac o que contenham Taq pois poderia causar a desactiva o da enzima Certifique se de que a Tag est temperatura ambiente antes de ser utilizada Vire o frasco para se assegurar que toda a Taq fica no fundo do frasco e em seguida pipete colocando a ponta da pipeta logo abaixo da superf cie da Tag afim de minimizar o risco de revestir a ponta com um excesso de Taq Misture as misturas principais pipetando cuidadosamente para cima e para baixo Acrescente imediatamente aos po os de reac o 20ul das misturas principais Acrescente imediatamente aos po os de reac o 5 ul de amostra padr o misturado ou gua para os controlos sem modelo NTC Cada amostra de ADN deve ser testada com todos os ensaios de muta o e o de controlo O Quadro 6 apresenta a configura o da placa Quadro 6 Configura o da placa do Kit K RAS Disposi o de 96 po os Ensaio 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Controlo misturado Padr o Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 Amostra 8 Amostra 9 Amostra 10 B 12ALA Padr o misturado Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 Amostra 8 Amostra 9 Amostra 10 C 12ASP Padr o misturado Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 Amostra 8 A
7. o entre todo o conjunto de dados e que os ensaios eram suficientemente robustos para suportar a varia o entre lotes ABI7500 Foram efectuadas experi ncias para estabelecer o desempenho de precis o de cada ensaio atrav s da repeti o de uma placa de PCR com uma gama de amostras com concentra es de ADN altas e baixas e n vel de muta o alto e baixo para 3 lotes de reagentes num dia entre dias entre operadores e entre equipamentos P gina 31 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Foi utilizado um ANOVA de uma via para avaliar a varia o entre r plicas lotes de reagente execu es dias de testes equipamentos e operadores A hip tese nula era de que os valores m dios eram iguais em todas as categorias As m dias totais DP e CV foram tamb m calculados para os valores Ct Nenhum dos ensaios apresentou um desvio significativo ao n vel de p 0 05 da hip tese nula das m dias sendo iguais em todas as categorias Isto indica que os ensaios eram suficientemente robustos para suportar as varia es de equipamento para equipamento operador para operador lote para lote dia para dia e execu o para execu o Valida o da precis o LightCycler 480 Instrument A precis o foi avaliada utilizando 92 amostras de FFPE e 28 dilui es de linha celular positiva muta o Estas foram testadas com o Kit K RAS e tamb m foram sequenciadas utilizando o sequenciament
8. dos limites do kit quando forem iguais ou superiores a 38 necess rio ter um Ct de controlo de 28 9 ou inferior para fornecer ADN suficiente para que uma muta o de 1 seja detectada determinados os valores de cut off de 1 e o valor de cut off Ct de 38 Se o Ct de controlo for superior a28 9 efor detectada uma muta o apresentada uma muta o positiva e este Alarme Aviso n o apresentado uma vez que esta amostra cont m uma muta o clara No entanto se o Ct de controlo for superior a 28 9 e a amostra parecer ser de negativa quanto a muta o este Alarme Aviso apresentado para avisar que muta es de n vel baixo poder o ter passado despercebidas medida que o Ct de controlo aumenta acima de 28 9 a sensibilidade da detec o da muta o diminui LIMITED Ct de controlo gt 35 Indica que est dispon vel muito pouco ADN amplific vel pelo que s podem ser detectadas muta es presentes numa alta percentagem Nas amostras LIMITED se uma muta o positiva apresentar um Ct lt 38 ser lhe atribu do ainda um estado v lido e ser reportada A presen a de muta es de baixo n vel numa amostra com um resultado negativo eum Alarme Aviso LIMITED n o pode ser descontada EXO FAIL O software verifica se h amplifica o do ensaio de controlo ex geno para estabelecer se poderia estar presente um inibidor que poderia originar um resultado negativo falso utilizada a seguinte l gica a A reac
9. lise Foram calculadas m dias erros padr o e desvios padr o eos dados foram agrupados por lote de kit equipamento ou operador para avaliar a varia o causada por estas vari veis A repetitividade geral dos ensaios tamb m foi avaliada Os dados indicam que a varia o geral entre os ensaios baixa e 2 desvios padr o volta da m dia cobrem um intervalo de 1 4 ciclos da m dia para o ensaio com o desvio padr o m ximo Para todos os testes o ACt m dio para cada operador encontra se dentro dos 0 15 ciclos da m dia geral para todo o conjunto de dados As diferen as entre operadores n o eram superiores a 0 2 Ct demonstrando que a varia o entre operadores n o era superior varia o entre todo o conjunto de dados e que os ensaios eram suficientemente robustos para suportar a varia o entre operadores Para cada um de todos os testes a diferen a entre as m dias dos equipamentos individuais ea m dia geral era de 0 097 e a diferen a entre as m dias dos equipamentos individuais n o era pior do que 0 186 demonstrando que avaria o entre equipamentos n o era superior varia o entre todo o conjunto de dados e que os ensaios eram suficien temente robustos para suportar a varia o entre equipamentos Para cada um de todos os testes a diferen a entre um s lote e a m dia geral era de 0 195 eapior diferen a entre lotes era de 0 38 demonstrando que a varia o entre lotes n o era superior varia
10. 8 0 2 277 2 2 8 N O misture com agita o forte a Taq ou quaisquer misturas de reac o que contenham Tag pois poderia causar a desactiva o da enzima Certifique se de que a Tag est temperatura ambiente antes de ser utilizada Vire o frasco para se assegurar que toda a Tag fica no fundo do frasco e em seguida pipete colocando a ponta da pipeta logo abaixo da superf cie da Tag afim de minimizar o risco de revestir a ponta com um excesso de Taq P gina 23 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit 4 Misture as misturas principais pipetando cuidadosamente para cima e para baixo 5 Acrescente imediatamente aos po os de reac o 20 ul das misturas principais 6 Acrescente imediatamente aos po os de reac o 5 ul de amostra padr o misturado ou gua para os controlos sem modelo NTC Cada amostra de ADN deve ser testada com os ensaios de controlo e de muta o O Quadro 12 apresenta a configura o da placa Quadro 12 Configura o da placa K RAS do ABI7500 Disposi o de 96 po os Ensaio 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Padr o Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Controlo misturado 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Padr o Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra 12ALA misturado 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C Padr o Amostra Amostra Amostr
11. ADN num fundo de ADN de tipo selvagem e em gua Cada ensaio de muta o dever apresentar uma efic cia de 90 a 110 100 10 Para cada ensaio foram definidas curvas padr o utilizando uma dilui o em s rie de 5 vezes e foi executada uma placa de PCR contendo tr s lotes de reagentes do kit Os padr es de muta o de 100 foram testados a 50 ng 10 ng 2 ng e 0 4 ng de ADN em cada um dos ensaios de muta o diluindo em gua Os ensaios de muta o tamb m foram testados utilizando uma dilui o em s rie de 5 vezes em 10 ng ul de ADN de linha celular para avaliar o efeito de sobressatura o Foram geradas curvas padr o para cada ensaio de muta o a partir dos dados experimentais As efic cias da PCR foram calculadas utilizando a equa o 4 00 1 q Declive 4 O n vel mais alto de sobressatura o nas dilui es de linha celular de 10 ng ul originou efic cias superiores a 100 Foram calculadas as efic cias gerais em todos os lotes de reagentes Todos os valores foram semelhantes e dentro de 10 da efic cia do ensaio de controlo Curvas padr o paralelas entre o ensaio de controlo eos ensaios de muta o significa que o m todo de ACt de an lise adequado para utiliza o P gina 33 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Manteve se a linearidade a n veis aceit veis ao longo do intervalo de 0 4 ng de ADN a 50 ng de ADN Valida o da reactividad
12. a sec o de avalia o de amostras do LightCycler 480 Instrument 3 Seleccione o separador Sample Editor e em Step 1 Select Workflow seleccione acaixa de verifica o Abs Quant Em Select Filter Combinations certifique se de que ambos os filtros est o seleccionados 465 510 nm e 533 580 nm Defina os nomes das amostras no Passo 2 e Passo 3 Na coluna 1 o nome da amostra deve ser Padr o misturado Na coluna 2 o nome da amostra deve ser NTC Nas colunas 3 a 12 devem ser introduzidos os nomes das amostras Os nomes devem ser id nticos para todos os po os na coluna 1 O Quantification Sample Type deve ser definido para unknown desconhecido A coluna de r plicas dever ser deixada em branco uma vez que as r plicas n o s o consideradas pelo LightCycler Adapt Software 4 Seleccione o bot o Experiment e clique no bot o Start Run para guardar o ensaio e iniciar a ciclagem An lise de amostras do LightCycler 480 Instrument 1 Ao concluir a execu o do LightCycler 480 Instrument utilizando a janela do navegador exporte o ensaio ficheiro ixo para uma localiza o adequada que possa ser acedida pelo LightCycler Adapt Software 2 IMPORTANTE O LightCycler Adapt Software est validado para utiliza o num s sistema de computador que definido como uma nica unidade de controlo esta o de trabalho fornecida pela Roche Diagnostics para utiliza o com um
13. de dados da determina o de cut off de 1 cobria 6 84 o valor ACt de 1 para o ensaio 12VAL foi alterado de 7 5 para 6 5 para evitar a possibilidade de um resultado falso positivo O quadro 18 a seguir apresenta os valores ACt de 1 actuais com base nos resultados de valida o de sobressatura o Quadro 18 Resultados da valida o de sobressatura o Ensaio Valores ACt de 1 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Pagina 30 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Valida o da precis o LightCycler 480 Instrument A precis o foi testada utilizando controlos sint ticos de 1 em 3 n veis diferentes de ADN da linha celular negativas muta o do Kit K RAS Cada controlo foi testado em triplicado para o ensaio relevante numa placa que tamb m continha padr o misturado em duplicado e reac es NTC simples para assegurar que as reac es estavam a funcionar dentro das especifica es A mesma placa foi repetida 54 vezes num espa o de tempo de 6 dias Incorporada nesta matriz de execu es estava a utiliza o de 3 equipamentos 3 lotes de reagentes e 3 operadores Os valores Ct foram obtidos a partir do LightCycler Adapt Software e todas as combina es de valores Ct foram utilizadas para calcular valores ACt Todos os valores ACt que excediam tr s vezes a dist ncia interquart lica foram considerados at picos e removidos da an
14. todos acima dos valores de cut off de 1 indicando que os valores de cut off de 1 eram robustos O Quadro 17 apresenta os piores n veis de sobressatura o das 5 execu es Quadro 17 Resultados de sobressatura o Piores valores ACt de sobressatura o 12ALA 12 35 12ASP 11 36 Ensaio 12ARG Sem sobressatura o 12CYS Sem sobressatura o 12SER 11 74 12VAL 12 29 13ASP 11 29 ABI 7500 A sobressatura o foi avaliada utilizando ADN de linha celular em pool de linhas celulares negativas muta o do Kit K RAS a3 diferentes n veis de ADN Foram testadas tr s placas de PCR id nticas Cada placa inclu a 3 lotes de reagentes O padr o misturado foi utilizado como o controlo positivo Adicionalmente foram testadas amostras de FFPE positivas em duplicado A maioria das amostras positivas muta o s o positivas para uma nica muta o Os outros ensaios de muta o podem ser utilizados para avaliar a sobressatura o embora esteja prevista alguma reactividade cruzada entre alguns ensaios e muta es positivas Contudo isto produz um padr o conhecido Foram obtidos valores Ct e valores ACt e comparados aos valores de cut off de 1 Os dados das amostras de ADN de linha celular e das amostras de FFPE apresentaram valores ACt que estavam todos acima dos valores de cut off de 1 excepto de uma amostra de FFPE que apresentou um ACt mesmo abaixo 6 84 do cut off de 7 5 Como ointervalo
15. 12 Assist ncia t cnica P gina 19 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit 7 Resultados de amostras 7 1 O quadro Sample Result Table apresenta nomes de amostras obtidos do LightCycler 480 Instrument Software e valores Ct de ensaio de controlo 7 2 O LightCycler 480 Adapt Software calcula os valores ACt e determina se uma amostra positiva ou negativa quanto a muta o com base nos valores de cut off de 1 indicados no Quadro 9 Quadro 9 Valores de cut off de 1 do LightCycler Adapt Software Valores ACt de 1 6 25 7 72 6 83 6 95 8 95 6 5 9 09 7 3 Se um valor ACt de muta o para uma amostra for inferior ao valor de cut off ACt de 1 a amostra determinada como positiva de muta o OLightCycler Adapt Software indicar que est presente muta o mas indicar apenas uma nica muta o Se existirem 2 valores ACt positivos ser indicado o valor mais pequeno assumido que o segundo valor tenha sido gerado atrav s de reactividade cruzada de uma inicia o e liga o de um iniciador de muta o de uma muta o diferente Nos raros casos em que est presente uma muta o dupla a decis o cl nica ser id ntica ao do caso em que est presente uma muta o simples 7 4 Se os valores ACt da amostra forem superiores aos valores ACt de 1 a amostra considerada negativa quanto a muta o poder conter uma muta
16. 500 eno LightCycler 480 Instrument utilizando o LightCycler Adapt Software para obter valores Ct Foram realizados varios testes em cada um dos equipamentos Os resultados desses testes s o resumidos a seguir Valida o do cut off de 1 LightCycler 480 Instrument A detec o da muta o de 1 num plano de fundo do ADN da linha celular negativa muta o do Kit K RAS foi determinada atrav s de uma s rie de tr s diferentes concentra es do ADN da linha celular para atribuir um valor ACt de cut off a cada ensaio de muta o Para cada ensaio foram testadas dilui es de 1 em triplicado em 3 exe cu es separadas tanto para o ensaio de controlo como para o ensaio de muta o Este procedimento foi repetido por 3 diferentes operadores Os valores Ct foram obtidos a partir do LightCycler Adapt Software Calcularam se os valores ACt de 1 a partir de todas as combina es de muta o e os valores Ct de controlo relativos s r plicas numa execu o Os valores ACt de cut off foram definidos como o valor m dio de todas as execu es e concentra es Os resultados destes testes encontram se resumidos na sec o de interpreta o de dados ABI7500 Para cada ensaio foram testadas dilui es de 1 em triplicado para 3 lotes do kit em 3 execu es separadas tanto para o ensaio de controlo como para o ensaio de muta o O padr o misturado foi utilizado em cada placa para assegurar que os ensaios esta
17. RY FRANGA Roche Diagnostics S A SU A Roche Diagnostics 2 Avenue du Vercors Schweiz AG BP 59 Meylan Cedex Industriestr 7 38240 Rotkreuz CH 6343 ESPANHA Roche Diagnostics S L IT LIA Roche Diagnostics Italy Av de la Generalitat s n V le G B Stucchi 110 Sant Cugat del Valles Monza Ml 20052 Barcelona E 08190 Se tiver adquirido este kit num pa s que n o est inclu do na lista de filiais da Roche Diagnostics acima contacte a Roche Diagnostics GmbH em Mannheim no endere o indicado a seguir CENTRO Roche Diagnostics GmbH PRINCIPAL DE Sandhofer Strasse 116 DISTRIBUIGAO D 68305 Mannheim 14 Data de emiss o da ltima revis o Data da ltima vers o Janeiro de 2009 Resumo das altera es Redigido novamente exaustivamente para incorporar informa es para utiliza o no Roche LightCycler 480 Real Time PCR System Instrument II P gina 37 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit 15 Refer ncias 1 2 3 10 11 12 R A Hilger M E Scheulen D Strumberg 2002 The Ras Raf MEK ERK Pathway in the Treatment of Cancer Onkologie 25 511 518 Pavan Bachireddy Pavan K Bendapudi Dean W Felsher 2005 Getting at MYC through RAS Clin Cancer Res 11 12 4278 4281 Sae Won Han Tae You Kim Yoon Kyung Jeon Pil Gyu Hwang Seock Ah Im Kyung Hun Lee Jee Hyun Kim Dong Wan Kim Dae Seog Heo Noe Kyeong Kim Doo H
18. TheraScreen molecular diagnostics for personalised medicine TheraScreen K RAS Mutation Kit Para a detec o de 7 muta es no gene K RAS Para utiliza o no Roche LightCycler 480 Real Time PCR System Instrument II N de Catalogo 05015278001 E no Applied BioSystems 7500 Real Time PCR System N mero de refer ncia 4351105 Inclui o manual do utilizador do LightCycler Adapt Software v1 1 da Roche Diagnostics N de Cat logo 05474914001 para o TheraScreen K RAS Mutation Kit CE IVD Instru es de utiliza o C digos dos produtos Tamanho do kit C digo do produto DxS N mero de encomenda da Roche Diagnostics 20 reac es KR 21 05366216190 80 reac es KR 22 05366224190 Vers o das instru es DU001g Data da revis o maio de 2009 Armazenar entre 18 C e 25 C Ce P gina 1 de 40 Diagnostic Innovations Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit ndice 1 Utiliza o prevista Instru es de utiliza o 3 2 Resumo e explica o do teste ss ieresssesescenaa 3 3 Principios TECHOLOGICOS cise occas he isaac acct d ss ss 4 A REAGENTES siort ainainen onrada il doctcdcacensdoecteveidectaseedeniadhetenaiacs 6 5 ADVERT NCIAS E PRECAU ES 0 sccssscsssssssssscesseseesnssseeseeeesesees 7 6 Armazenagem estabilidade e cond
19. a Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra 12ASP misturado 2 3 4 5 6 7 8 9 10 D Padr o Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra 1 2ARG misturado 2 3 4 5 6 7 8 9 10 E Padr o Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra 1 2CYS misturado 2 3 4 5 6 T 8 9 10 F Padr o Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra 12SER misturado 2 3 4 5 6 7 8 9 10 G Padr o Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra 12VAL misturado 2 3 4 5 6 7 8 9 10 H Padr o Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra 1 3AS P misturado 2 3 4 5 6 7 8 9 10 7 Vede e rode com brevidade a placa da PCR para assegurar a concen tra o dos reagentes no fundo dos po os 8 Coloque imediatamente a placa no equipamento ABI7500 Configura o do Equipamento ABI7500 1 Seleccione o cone do 7500 System Software no ambiente de trabalho da esta o de trabalho ligada ao equipamento Abra um novo ficheiro de execu o a partir do menu File utilizando o 7500 Sequence Detection Software vers o 1 4 2 Em Assay seleccione Standard Curve Absolute Quantification Em Run Mode seleccione Standard 7500 3 Desloque se para a janela de co
20. adas com o Kit K RAS Protocolo de avalia o de amostras Configura o da placa 1 Descongele temperatura ambiente a mistura da reac o de controlo e o padr o misturado do Kit K RAS Uma vez que descongeladas misture cada uma das solu es invertendo cada tubo 10 vezes para evitar concentra es de sais localizadas Prepare misturas suficientes para as amostras de ADN uma reac o de padr o misturado e uma reac o de controlo sem modelo NTC mais 2 reac es adicionais 2 Para preparar a mistura principal utilize as quantidades de reagentes por reac o conforme indicado no Quadro 3 Quadro 3 Volumes de mistura principal do ensaio de controlo Mistura principal Ensaio Mistura de reac o ul x1 19 8 0 2 Taq ul x1 Ensaio de controlo Pagina 10 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit 3 N O misture com agita o forte a Tag ou quaisquer misturas de reac o que contenham Taq pois poderia causar a desactiva o da enzima Certifique se de que a Tag est temperatura ambiente antes de ser utilizada Vire o frasco para se assegurar que toda a Taq fica no fundo do frasco e em seguida pipete colocando a ponta da pipeta logo abaixo da superf cie da Tag afim de minimizar o risco de revestir a ponta com um excesso de Taq Misture a mistura principal pipetando cuidadosamente para cima e para baixo Acrescente imediatame
21. adas espec ficas podem ser amplificadas de forma selectiva mesmo nas amostras em que a maioria das sequ ncias n o exiba a muta o pois e Quando se consegue uma correspond ncia total com o iniciador a amplifica o tem lugar com toda a efic cia e Quando a base de 3 n o encontra correspond ncia apenas ocorre amplifica o de fundo de baixo n vel Scorpions A detec o da amplifica o realizada com Scorpions As mol culas tipo Scorpions s o mol culas bifuncionais que cont m um iniciador da PCR ligado de forma covalente a uma sonda O fluor foro integrado nesta sonda interage com um supressor tamb m incorporado na sonda o que reduz a fluoresc ncia Durante uma reac o PCR quando a sonda se liga ao amplicon o fluor foro e o supressor separam se Isto origina um aumento da fluoresc ncia do tubo de reac o An lise dos dados M todo de ACt Os ensaios de Scorpions em tempo real utilizam o numero de ciclos de PCRs necess rios para detectar um sinal fluorescente acima de um sinal de fundo como uma determina o das mol culas alvo presentes no in cio da reac o O ponto no qual o sinal detectado acima da fluoresc ncia do fundo denominado o limiar do Ciclo Ct Cycle threshold P gina 4 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Os valores ACt da amostra s o calculados como sendo a diferen a entre o Ct do ensaio de muta o eo Ct do ensa
22. amostras s o obtidos do ecr de edi o de amostras do LightCycler 480 Instrument no ficheiro de execu o do ensaio Se houver um conflito de nomes na coluna o software indica SAMPLE MISMATCH na coluna Sample Name do quadro Sample Result Table Na disposi o da placa o software indica o nome da amostra seguido por MISMATCH Se se tratar de um erro ortogr fico o nome pode ser corrigido no ficheiro de execu o do LightCycler 480 Instrument eos dados novamente analisados com o LightCycler Adapt Software Configura o experimental do ABI7500 Para cada amostra de ADN os ensaios de muta o e de controlo t m de ser analisados na mesma execu o de PCR para evitar as varia es de execu o para execu o 1 Descongele temperatura ambiente as misturas de reac o e o padr o misturado do Kit K RAS Uma vez que descongeladas misture cada uma das solu es invertendo cada tubo 10 vezes para evitar concentra es localizadas de sais Prepare misturas suficientes para as amostras de ADN o padr o misturado e os controlos sem modelo NTC mais 2 reac es adicionais por cada mistura conforme indicado no Quadro 11 Quadro 11 Volumes de mistura principal do Kit K RAS Ensaio Misturas principais Mistura Tag ul Tag ul x1 de reac o ul por placa x14 por placa x14 Mistura de reac o ul x1 Ensaio de controlo 19 8 0 2 277 2 2 8 Ensaios de muta o 2 19
23. anchard F Charbonnier F Le Pessot A Lamy M P Galais L Bastit A Killian R Sesboue J J Tuech A M Queuniet B Paillot J C Sabourin F Michot P Michel T Frebourg 2007 British Journal of Cancer 96 1166 1169 Shirin Khambata Ford Christopher R Garrett Neal J Meropol Mark Basik Christopher T Harbison Shujian Wu Tai W Wong Xin Huang Chris H Takimoto Andrew K Godwin Benjamin R Tan Smitha S Krishnamurthi Howard A Burris III Elizabeth A Poplin Manuel Hidalgo Jose Baselga Edwin A Clark David J Mauro 2007 Journal of Clinical Oncology 25 22 3230 3237 Newton CR Graham A Heptinstall LE Powell SJ Summers C et al 1989 Analysis of any point mutation in DNA The amplification refractory mutation system ARMS Nucleic Acids Res 17 7 2503 16 Whitcombe D Theaker J Guy S P Brown T Little S 1999 Detection of PCR products using self probing amplicons and fluorescence Nature Biotech 17 804 807 Pagina 38 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Thelwell N Millington S Solinas A Booth J and Brown T 2000 Mode of Action and Application of Scorpion Primers to Mutation Detection Nucleic Acids Research 28 19 3752 3761 De Roock W Piessevaux H De Schutter J Janssens M De Hertogh G Personeni N Biesmans B Van Laethem JL Peeters M Humblet Y Van Cutsem E T
24. as separadas de uso exclusivo para preparar as misturas de reac o e adicionar o modelo de ADN A prepara o e distribui o das misturas de reac o devem ser efectuadas numa rea diferente daquela onde se adiciona o modelo Os tubos nunca devem ser abertos ap s uma reac o PCR Cada ensaio inclu do no Kit K RAS tem as suas pr prias caracter sticas Os c lculos do resultado devem ser efectuados em termos dos par metros correctos do ensaio consultar a sec o Interpreta o de dados relat rios Os valores Ct de muta o de 38 ou mais devem ser classificados como negativos ou abaixo dos limites do kit Os ensaios cont m uma reac o de controlo ex gena controlo interno para al m da reac o de interesse consultar a sec o Princ pios tecnol gicos Se ambos os ensaios tiverem falhado os dados devem ser eliminados pois poder o haver inibidores presentes que podem originar resultados falso negativos A dilui o da amostra pode reduzir o efeito dos inibidores mas tenha em aten o que a mesma tamb m diluiria o ADN Devem ser adoptadas precau es gerais de laborat rio tais como mas n o apenas as seguintes a N o pipete com a boca b N o fume n o coma e n o beba em reas onde amostras ou reagentes do kit estejam a ser manipulados c Lave as m os depois de efectuar o teste Utilize apenas a polimerase Tag Taq fornecida no kit n o substitua por Tag de outros kits do mesmo tipo ou de qualqu
25. as tr s placas de PCR id nticas cada uma contendo 3 lotes de reagente do kit variando a polimerase Tag em 10 e 10 da quantidade recomendada a quantidade recomendada tamb m foi testada O padr o misturado foi testado assim como os padr es de 1 em dois n veis de ADN e em 50 ng de ADN da linha celular negativo quanto a muta o Os dados dos ensaios foram analisados para determina o da sua m dia desvio padr o e coeficiente de varia o Os resultados mostraram poucas varia es DP equivalente entre os ensaios e CV lt 10 nos resultados dos ensaios quando se variou o n vel de Tag em 10 demonstrando que os ensaios podiam tolerar uma varia o de at 10 nos n veis de polimerase Tag 12 Assist ncia t cnica Para obter assist ncia t cnica e informa es adicionais contacte o seu distribuidor local da Roche A sec o 13 cont m uma lista de pormenores de contacto dos principais distribuidores da Roche P gina 36 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit 13 Informa es sobre o fabricante e os distribuidores DxS Limited IM 48 Grafton Street Manchester M13 9XX Reino Unido Roche Molecular Systems Inc Branchburg NJ 08876 USA Distributedby Um Membro do Grupo Roche REINO Roche Diagnostics ALEMANHA Roche Diagnostics GmbH UNIDO Charles Avenue Sandhoferstr 116 Burgess Hill Dept VM G West Sussex Mannheim D 68298 Reino Unido RH15 9
26. c lula indicam o n mero aproxi mado de ciclos ap s ser detectado o verdadeiro sinal positivo para poder ser visto um sinal de reactividade cruzada Os valores acima de 9 ciclos n o foram inclu dos pois classificam se como resultados negativos quanto a muta o Quadro 20 ABI7500 Resultados da valida o da reactividade cruzada Amostra positiva 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Pagina 34 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit LightCycler 480 Instrument Estes estudos determinaram a toler ncia dos ensaios de muta o a varia es de temperatura nos ciclos Como a temperatura de annealing a temperatura mais cr tica que afecta o desempenho do ensaio a temperatura de annealing o par metro que foi variado A toler ncia para os ciclos foi avaliada utilizando padr es sint ticos de 1 em 3 n veis diferentes de ADN Para cada muta o estas amostras foram executadas em triplicado juntamente com o padr o misturado em duplicado e reac es NTC simples para assegurar que os ensaios eram executados de acordo com as especifica es Cada placa foi testada s temperaturas de annealing de 59 C 60 C e 61 C 60 C a temperatura ideal para o ensaio ser executado mas a varia o atrav s ou entre os blocos da PCR significa que o ensaio tem de ser robusto atrav s de todo o intervalo especificado Ca
27. da placa foi executada em triplicado a cada uma das temperaturas Os valores Ct foram obtidos a partir do LightCycler Adapt Software etodas as combina es de valores Ct de controlo e de muta o foram utilizadas para calcular os valores ACt Todos os ensaios estavam em conformidade com os crit rios de aceita o de que os valores a 59 C ea 61 C n o devem diferir do valor m dio a 60 C o desvio padr o a60 C Isto indica que os ensaios s o suficientemente robustos para suportar um desvio de 1 C na temperatura de annealing ABI7500 Foram executadas tr s placas de PCR id nticas cada uma contendo 3 lotes de reagente do kit a cada uma das temperaturas de annealing O padr o misturado foi testado assim como 50 ng de ADN da linha celular em pool negativo quanto a muta o Uma vez que 60 C a temperatura de annealing recomendada as placas foram executadas a 58 C 60 C e 62 C Se os ensaios fossem suficientemente robustos para tolerar as temperaturas da experi ncia os valores de ACt do padr o misturado deveriam ficar dentro de 1 5 dos valores definidos para o padr o misturado e os valores ACt da linha celular em pool deveriam ficar acima dos pontos de cut off de 1 O 12ASP mostrou a maior susceptibilidade varia o de temperatura no entanto todos os ensaios apresentaram resultados aceit veis s 3 tem peraturas demonstrando que os ensaios s o robustos quando executados a temperaturas 2 C acima ou abai
28. de cut off de 1 O software indica um resultado de muta o positivo ou negativo e remove qualquer subjectividade da an lise e interpreta o dos dados do Kit K RAS Formato do Kit K RAS O Kit K RAS fornecido com oito ensaios e Um ensaio de controlo e Sete ensaios de muta o Todas as misturas de reac o cont m um ensaio de controlo ex geno controlo interno etiquetado com HEX para ser detectado pelo detector JOE no ABI7500 Este controla a presen a de inibidores que podem dar origem a resultados falso negativos Ensaio de controlo O ensaio de controlo etiquetado com FAM utilizado para avaliar o ADN total de uma amostra Este ensaio de controlo amplifica uma regi o do ex o 4 do gene K RAS Os iniciadores e a sonda foram concebidos para evitar quaisquer polimor fismos conhecidos do K RAS P gina 5 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico Ensaios de muta o TheraScreen K RAS Mutation Kit Cada ensaio de muta o etiquetado com FAM cont m um Scorpion e um iniciador ARMS para discrimina o entre o ADN de tipo selvagem e o ADN mutante detectado por um ensaio de PCR em tempo real 4 Reagentes Este Kit K RAS cont m reagentes suficientes para efectuar a avalia o de qualidade das amostras e executar os ensaios K RAS para at 20 ou 80 reac es consoante o tamanho do kit Tamanho do kit C digo do produto DxS N mero de encomenda da Roche Diagnostics 20 r
29. de laborat rio com amostras de ADN extra das de tecido colorrectal envolvido em parafina e fixado em formalina Indica es de utiliza o Os resultados do teste do Kit K RAS servem para ajudar o m dico a identificar doentes com cancro colorrectal que n o possam beneficiar de terapia de receptor de factor de crescimento anti epid rmico EGFR epidermal growth factor como o panitumumab ou o cetuximab O Kit K RAS n o se destina a diagnosticar cancros colorrectais utilizado como auxiliar de outros factores de progn stico relevantes utilizados para seleccionar doentes adequados para o tratamento com terapias anti EGFR com base no estado de muta o do doente em causa O estado de muta o do doente ser tomado em considera o por um m dico juntamente com outros factores de doen a para formular uma decis o terap utica Nenhuma decis o sobre o tratamento de doentes com cancro se deve basear apenas no estado de muta o K RAS 2 Resumo e explica o do teste O Kit K RAS um dispositivo de diagn stico com marca CE em confor midade com a Directiva da Uni o Europeia 98 79 CE para Dispositivos M dicos de Diagn stico in vitro Os cancros humanos apresentam frequentemente muta es do oncogene K RAS 1 4 A presen a destas muta es correlaciona se com uma falta de reac o a certas terapias carcin genas do inibidor do factor EGFR em doentes com cancros colorrectais metastaticos 5 10 14 21 A detec
30. dhesive Film numero de refer ncia 4311971 Tubos esterilizados para a prepara o de misturas principais P gina 6 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit e Pipetas de uso exclusivo para a prepara o de misturas de PCR e Pipetas de uso exclusivo para distribuir o modelo de ADN e H20 esterilizada isenta de nuclease 5 ADVERT NCIAS E PRECAU ES Apenas para utiliza o de diagn stico in vitro O Kit K RAS n o se destina a diagnosticar ou analisar a presen a de qualquer tipo de cancro incluindo o cancro colorrectal utilizado como auxiliar de outros factores de progn stico actualmente utilizados para seleccionar doentes eleg veis que n o beneficiariam de trata mentos anti EGFR do cancro O tratamento de doentes com cancro n o se deve basear apenas no estado de muta o do gene K RAS O m dico deve tomar em considera o o estado de muta o do doente juntamente com outros factores da doen a O conte do do Kit K RAS pode ser congelado descongelado at 8 vezes sem se verificar um efeito adverso no desempenho do ensaio N O congelar descongelar mais de 8 vezes os reagentes do Kit K RAS Tenha em aten o que as amostras de tumores s o n o homog neas e os dados de uma amostra de um tumor podem n o condizer com os dados de outras sec es do mesmo tumor As amostras de tumor podem ainda conter tecido n o tumoral N o se prev que o ADN de tecido n
31. e cruzada LightCycler 480 Instrument A valida o da reactividade cruzada nao foi realizada uma vez que o LightCycler Adapt Software apenas assinala uma nica muta o com o ACt mais pequeno ABI7500 Uma vez que toda as muta es detectadas pelo Kit K RAS ocorrem com uma regi o de 5 pares da base de esperar a ocorr ncia de alguma reactividade cruzada entre os iniciadores Este estudo determinou o padr o de reactividade cruzada do Kit K RAS Efectuaram se testes utilizando controlos de muta o sint ticos para estabelecer quantos ciclos depois de um positivo verdadeiro poss vel detectar um sinal de reactividade cruzada Cada mistura de reac o de muta o foi executada com seis r plicas dos sete controlos individuais de muta o de 100 Al m disso cada controlo foi testado com a mistura de reac o correspondente e com todas as outras misturas de reac o na mesma execu o O padr o de reactividade cruzada foi determinado calculando a diferen a entre o valor Ct da amplifica o real da cassete correspondente e o sinal de reactividade cruzada de cada um dos outros iniciadores O padr o de reactividade cruzada previsto apresentado no Quadro 20 a seguir O padr o de reactividade cruzada demonstrou ser consistente e permitir que o utilizador leia um padr o de amplifica o em que mais do que um ensaio origina um resultado positivo de forma a obter o resultado de ensaio correcto Os n meros em cada
32. eac es KR 21 05366216190 80 reac es KR 22 05366224190 O n mero de amostras que podem ser testadas depende do tamanho do lote da amostra Quadro 2 Conte do do Kit K RAS Reagentes fornecidos 20 reac es 80 reac es Volume Volume Mistura da reac o de controlo 1300 ul 5200 ul Mistura de reac o 12ALA 650 ul 2600 ul Mistura de reac o 12ASP 650 ul 2600 ul Mistura de reac o 12ARG 650 ul 2600 ul Mistura de reac o 12CYS 650 ul 2600 ul Mistura de reac o 12SER 650 ul 2600 ul Mistura de reac o 12VAL 650 ul 2600 ul Mistura de reac o 13ASP 650 ul 2600 ul Padr o misturado 300 ul 1000 ul Polimerase Tag do DNA 60 ul 240 ul Equipamentos e reagentes n o fornecidos com o Kit K RAS O utilizador necessitar dos seguintes equipamentos e consum veis O LightCycler 480 Instrument ou a ABI7500 Real time PCR Machine com capacidade de ciclagem conforme definido na Sec o 9 Protocolo K RAS para a detec o de muta es O LightCycler Adapt Software v1 1 da Roche Diagnostics N de Cat logo 05474914001 Placas de PCR de 0 2 ml isentas de DNAse LightCycler 480 Instrument Multiwell Plate 96 numero de cat logo 04729692 001 ou ABI MicroAmp Optical 96 well reaction Plate numero de refer ncia 4306737 com MicroAmp Optical A
33. ejpar S KRAS wild type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab Ann Oncol 2007 Nov 12 Li vre A Bachet JB Le Corre D Boige V Landi B Emile JF C t JF Tomasic G Penna C Ducreux M Rougier P Penault Llorca F Laurent Puig P KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer Cancer Res 2006 66 3992 5 Li vre A Bachet JB Boige V Cayre A Le Corre D Buc E Ychou M Bouch O Landi B Louvet C Andr T Bibeau F Diebold MD Rougier P Ducreux M Tomasic G Emile JF Penault Llorca F Laurent Puig P KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab J Clin Oncol 2008 26 374 9 C Bokemeyer et al K RAS status and efficacy of first line treatment of patients with metastatic colorectal cancer mCRC with FOLFOX with or without cetuximab The OPUS experience J Clin Oncol 26 2008 May 20 suppl abstr 4000 E Van Cutsem et al K RAS status and efficacy in the first line treatment of patients with metastatic colorectal cancer mCRC treated with FOLFIRI with or without cetuximab The CRYSTAL experience J Clin Oncol 26 2008 May 20 suppl abstr 2 S Tejpar et al Relationship of efficacy with K RAS status wild type versus mutant in patients with irinotecan refractory metastatic colorectal cancer mCRC treated with irinotecan q2
34. er outro ou por Tag de outro fornecedor Descongele apenas os reagentes necess rios para cada execu o n o descongele o kit todo de cada vez a fim de minimizar o n mero dos ciclos de congelamento descongelamento Informa es de seguran a Aten o Todos os produtos qu micos e materiais biol gicos devem ser considerados potencialmente perigosos As amostras s o potencialmente infecciosas e devem ser tratadas como tal O Kit K RAS s deve ser utilizado por pessoas que tenham recebido forma o sobre as t cnicas de laborat rio apropriadas P gina 8 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Quando trabalhar com os componentes deste Kit K RAS deve utilizar sempre uma bata de laborat rio luvas descart veis e culos de seguran a apropriados Depois de utilizados os componentes do Kit K RAS devem ser eliminados como desperd cios cl nicos 6 Armazenagem estabilidade e condi es de transporte Armazenagem Todos os componentes deste Kit K RAS devem ser armazenados logo ap s terem sido recebidos a uma temperatura de 18 C a 25 C no escuro num congelador de temperatura constante Evite descongelar desnecessariamente os componentes congelados do Kit K RAS Estabilidade N o utilize o Kit K RAS ap s o prazo de validade indicado O conte do do Kit K RAS permanecer est vel at a data do prazo de validade quando armazenado nas condi es de armazena
35. escritos mais detalhadamente a seguir 6 4 1 1 CT OUT OF RANGE Oensaio de controlo para o padr o misturado deve ter um valor Ct de 26 60 2 Se o ensaio estiver fora deste intervalo apresentado este Alarme Aviso para todos os po os de padr o misturado dado que os valores ACt n o s o calculados e o padr o misturado inv lido Isto indica que o ensaio de controlo n o est a funcionar correctamente P gina 18 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit 6 5 6 6 6 4 1 2 EXO FAIL Este Alarme Aviso apresentado se o ensaio do controlo ex geno em qualquer um dos po os de padr o misturado tiver um valor inferior a 30 pois isto poderia indicar que nesta mistura est presente contamina o da PCR Se oensaio do controlo ex geno falhar quando uma reac o FAM falhar em qualquer um dos po os de padr o misturado tamb m aparece o Alarme Aviso EXO FAIL Isto indica que existe um problema com este ensaio que poder originar resultados falso negativos O padr o misturado j se encontra invalidado devido falha do FAM 6 4 1 3 DELTA CT OUT OF RANGE Se os valores ACt do padr o misturado se encontrarem dentro de 2 00 dos valores indicados no Quadro 7 o software indicar um estado v lido Se o ACt estiver para al m do intervalo esperado o estado ser inv lido e ser apresentado este Alarme Aviso Isto indica que existe um problema com um ensaio que poder ori
36. esta o de trabalho ligada ao equipamento Abra um novo ficheiro de execu o a partir do menu File no 7500 Sequence Detection Software vers o 1 4 Em Assay seleccione Standard Curve Absolute Quantification Em Run Mode seleccione Standard 7500 Desloque se para a janela de configura o do detector seleccionando o bot o Next Adicione lista de detectores um detector JOE e um FAM com os supressores definidos para none Se estes detectores ainda n o existirem seleccione o bot o New Detectors e defina um detector FAM e um JOE com o supressor definido para none Defina Passive Reference para None e seleccione o bot o Next Seleccione a placa inteira e marque as caixas de verifica o para os detectores FAM e JOE para garantir que ambos os corantes s o monitorizados em cada po o Seleccione o bot o Finish No separador Instrument defina a ciclagem conforme indicado no Quadro 4 P gina 12 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Quadro 4 Condi es de ciclagem do ABI7500 Temperatura Ciclos Recolha de dados Fase 1 95 C 1 Fase 2 95 C 60 C 8 Seleccione o bot o Start para guardar o ensaio e iniciar a ciclagem 9 Ao concluir a execu o certifique se de que a refer ncia passiva est definida para none no ecr de inspector de po os No separado
37. evem ser utilizadas as seguintes emendas ao protocolo Qiagen e Sec es de FFPE devem ser colhidas para l minas de vidro e O excesso de parafina deve ser raspado de ao redor das sec es de tecido utilizando um bisturi esterilizado fresco e Raspe o material de sec o de tecido para micro tubos de centrifuga o utilizando um bisturi diferente para cada amostra a extrair e A digest o de Proteinase K deve continuar at conclus o Isto poder demorar at 48 horas e As amostras devem ser elu das em 200 ul de tamp o ATE do kit de extrac o de Qiagen Quaisquer m todos alternativos de prepara o de amostras t m de ser validados pelo utilizador final 3 Armazenamento do ADN extra do Armazenar a 20 C antes da an lise Protocolo de avalia o de amostras A mistura de ensaio de controlo suplementar fornecida com o Kit K RAS deve ser utilizada para avaliar o ADN total de uma amostra O ensaio de controlo amplifica uma regi o do ex o 4 do gene K RAS Devem ser preparadas amostras com apenas o ensaio de controlo utilizando o padr o misturado como um controlo positivo ea gua como o controlo sem modelo NTC Tenha em aten o que para obter uma utiliza o ideal dos reagentes do Kit K RAS as amostras dever o estar em lotes Todas as execu es experimentais devem conter controlos Se as amostras forem testadas individualmente ser o utilizados mais reagentes e diminuir o n mero de amostras que podem ser test
38. gem recomendadas e na sua embalagem original O conte do do Kit K RAS pode ser congelado descongelado at 8 vezes sem se verificar um efeito adverso no desempenho do ensaio N O congelar descongelar mais de 8 vezes os reagentes do Kit K RAS Condi es de transporte O conte do do Kit K RAS foi expedido em gelo seco e deve chegar ao seu destino em estado ainda congelado Se o Kit K RAS n o chegar ao destino em estado congelado se a embalagem exterior tiver sido aberta durante o transporte se aremessa n o contiver uma nota de embalagem instru es de utiliza o ou os reagentes contacte o seu distribuidor local da Roche Diagnostics para os dados de contacto consulte a sec o 12 Assist ncia t cnica 7 Equipamento Para as instru es completas sobre a prepara o e utiliza o do equipamento de PCR em tempo real consulte o manual do utilizador do equipamento 8 Amostras O material das amostras deve ser ADN gen mico humano extra do de amostras de tumores colorrectais envolvidas em parafina e fixadas em formalina Colheita e prepara o de amostras 1 Transporte das amostras Metodologia de patologia normal para assegurar a qualidade das amostras 2 Processo recomendado de extrac o das amostras Extrac o de ADN utilizando o kit de tecido Qiagen QlAamp DNA FFPE n mero de cat logo 56404 P gina 9 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit D
39. ginar resultados falsos 6 4 1 4 EXO CONTROL INVALID Nos po os de controlo sem modelo NTC o ensaio de controlo ex geno tem de apresentar um resultado positivo em todos os 8 po os Ct lt 41 Se for obtido um resultado negativo este Alarme Aviso apresentado e indicado um estado de inv lido Isto indica um problema com o ensaio que poder originar resultados falsos 6 4 1 5 TARGET CHANNEL INVALID Nos 8 po os de controlo sem modelo NTC o resultado do FAM tem de ser negativo Ct gt 38 Qualquer amplifica o indica contamina o Um resultado positivo far com que este Alarme Aviso seja apresentado e invalidar o controlo sem modelo NTC No caso de um estado de inv lido para qualquer um dos po os de padr o misturado ou po os de controlo sem modelo NTC o Run Summary Result ser Run Invalid No quadro Sample Result Table estar o indicados os nomes das amostras e os valores Ct de controlo mas o estado de muta o estar indicado como invalid O padr o misturado indica que todos os ensaios est o a funcionar correctamente Se n o for este o caso poder originar um falso positivo ou uma determina o de muta o negativa falsa O controlo sem modelo NTC indica que n o existe contamina o nas misturas principais e que o controlo ex geno est a funcionar conforme previsto No caso improv vel do LightCycler Adapt Software gerar uma mensagem de erro consulte a sec o
40. i es de transporte 9 7 So JU lfoio ga cio a RANENDE NERD RED e AUD E SAN N Snan N PKS ANTENEN 9 8 AMOSTRAS sa eccnhancot anstwcnt ansscesenesehacetwaatases tay asecadededcnectesndeanisustaanssucsieantensnses 9 9 Protocolo K RAS para a detec o de muta es 14 10 Limita es do teste aos nisso na sa sess ened isa emcee an ideia ic as anaana 27 11 Caracter sticas de desempenho dos ensaios 28 12 Assist ncia TECNICA casei annciasiisinienaiiisionaiiinii diria rd 36 13 Informa es sobre o fabricante e os distribuidores 37 14 Data de emiss o da ltima revis o ass ossos 37 15 RETEPBING AS ia ia a E 38 Notas para o Comprados assista sipiiioiripisra dire di ii pain da nanana 40 P gina 2 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit A IMPORTANTE Leia atentamente estas instru es e familiarize se com todos os componentes do Kit K RAS antes de utiliz lo 1 Utiliza o prevista Instru es de utiliza o Utiliza o prevista O DxS TheraScreen O K RAS Mutation Kit K RAS Kit um teste de diagn stico in vitro que serve para detectar sete muta es som ticas do oncogene K RAS e proporciona uma avalia o qualitativa do estado da muta o O Kit K RAS deve ser utilizado por profissionais de laborat rio com a devida forma o num ambiente
41. io de controlo da mesma amostra As amostras s o classificadas como tendo muta o positiva se tiverem valores de ACt inferiores ao valor ACt de 1 desse ensaio Acima deste valor a amostra poder conter menos do que 1 de muta o para al m do limite dos ensaios ou a amostra poder ser negativa muta o Quando se utilizam iniciadores ARMS pode ocorrer alguma inicia o ineficaz originando um Ct de fundo muito retardado de ADN que n o cont m uma muta o Todos os valores ACt calculados a partir da amplifi ca o de fundo ser o superiores aos valores ACt de 1 e a amostra ser classificada como negativa muta o O Kit K RAS tem marca CE para utiliza o de diagn stico in vitro no Roche Diagnostics LightCycler 480 Real Time PCR System Instrument II LightCycler 480 Instrument de formato de 96 po os n mero de refer ncia Roche 05015278001 ou no Applied BioSystems 7500 Real Time PCR System n mero de refer ncia 4351105 ABI7500 Para o LightCycler 480 Instrument o Kit K RAS deve ser utilizado em combina o com oLightCycler Adapt Software v1 1 para o TheraScreen K RAS Mutation Kit CE IVD LightCycler Adapt Software Este software foi concebido para automatizar a determina o de um tra ado de amplifica o positivo ou negativo e calcular a um limiar adequado a partir do qual se obt m valores Ct Estes s o utilizados para calcular valores ACt da amostra que s o comparados com os valores
42. ler Adapt Software cont m informa es gerais sobre a an lise 1 1 O autor do relat rio a pessoa que executou o software e criou o relat rio 1 2 indicada a data e hora da an lise 2 O relat rio oferece uma perspectiva geral da an lise com pormenores sobre o nome do ficheiro de execu o utilizado mais o ficheiro de defini o do algoritmo e a sequ ncia do algoritmo Os pormenores do algoritmo s o fixos e n o podem ser alterados 3 A sec o de resultados indica o nome completo e o caminho do ficheiro da execu o do LightCycler 480 Instrument assim como os seguintes pormenores 3 1 N mero de s rie do LightCycler 480 Instrument 3 2 Instrument Name o identificador atribu do ao LightCycler 480 Instrument no LightCycler 480 Instrument Software 3 3 Run Date a data e hora da execu o do LightCycler 480 Instrument 3 4 Run Operator o nome da pessoa que se encontrava em sess o no LightCycler 480 Instrument Software quando o ensaio foi executado 3 5 Experiment Name o nome do ficheiro de execu o 3 6 Software Version a vers o do software utilizado no LightCycler 480 Instrument 3 7 Lot Number n mero de lote obtido do campo Lot No do ecr de configura o do ensaio no LightCycler 480 Instrument Software 4 A configura o da placa apresentada com os nomes de amostras obtidos do ecr de edi o de amostras do LightCycler 480 Instrument Software
43. mesma independen temente da muta o que estiver presente Se a amostra for determinada como negativa mas uma reac o do controlo ex geno tiver falhado em qualquer um dos ensaios de muta o ser apresen tado o Alarme Aviso EXO FAIL e o estado inv lido poss vel que uma muta o possa ter passado despercebida Se o Ct do ensaio do controlo ex geno for lt 30 em qualquer um dos 8 po os ser apresentado um Alarme Aviso EXO FAIL eoestado ser inv lido poss vel que exista contamina o de produto da PCR neste ensaio O ficheiro de execu o do LightCycler 480 Instrument pode ser verificado para estabelecer a causa poss vel do ensaio de controlo ex geno falhar Se todas as reac es do controlo ex geno tiverem falhado numa coluna poder estar presente um inibidor Se tiver falhado em apenas 1 po o poder existir um problema de configura o da placa 7 5 2 5 FAIL apresentado um Alarme Aviso FAIL quando o software n o consegue determinar uma curva de amplifica o como positiva ou negativa por exemplo se o formato da curva for anormal P gina 22 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit 7 5 3 OLightCycler Adapt Software verifica se onome de amostra numa coluna inteira o mesmo de maneira a assegurar de que a muta o e os valores Ct do ensaio de controlo utilizados para calcular os valores ACt s o da mesma amostra Os nomes de
44. mostra 9 Amostra 10 D 12ARG Padr o inistrado Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 Amostra 8 Amostra 9 Amostra 10 E 12CYS Padr o misturado Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 Amostra 8 Amostra 9 Amostra 10 F 12SER Padr o misturado Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 Amostra 8 Amostra 9 Amostra 10 G 12VAL Padr o misturado Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 Amostra 8 Amostra 9 Amostra 10 H 13ASP Padr o misturado Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 Amostra 8 Amostra 9 Amostra 10 7 Vede e rode com brevidade a placa da PCR para assegurar a concen tra o dos reagentes no fundo dos po os 8 Coloque imediatamente a placa no equipamento LightCycler 480 P gina 15 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Configura o do LightCycler 480 Instrument 1 Seleccione o cone do LightCycler 480 Instrument Software no ambiente de trabalho da esta o de trabalho ligada ao equipamento Inicie sess o no software e a partir da p gina de perspectiva geral seleccione New Experiment from Template 2 Escolha o K RAS LC480II Run Template a partir da lista de modelos de execu o para mais detalhes consulte
45. nfiguragao do detector seleccionando o bot o Next Adicione lista de detectores um detector JOE e um FAM com os supressores definidos para none Pagina 24 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Se estes detectores ainda n o existirem seleccione o bot o New Detectors e defina um detector FAM eum JOE com o supressor definido para none Defina Passive Reference para None e seleccione o bot o Next Seleccione a placa inteira e marque as caixas de verifica o para os detectores FAM e JOE para garantir que ambos os corantes s o monitorizados em cada um dos po os Seleccione o bot o Finish No separador Instrument defina a ciclagem conforme indicado no Quadro 13 Quadro 13 Condi es de ciclagem do ABI7500 Temperatura Ciclos Recolha de dados Fase 1 95 C 1 Fase 2 95 C 60 C 7 Seleccione o bot o Start para guardar o ensaio e iniciar a ciclagem An lise de amostras do ABI7500 1 Certifique se de que a refer ncia passiva est definida para none no ecr de inspector de po os Verifique se cada um dos po os emite um sinal JOE do ensaio de controlo ex geno a Se o ensaio de controlo ex geno produzir um resultado positivo continue com a an lise b Se o ensaio de controlo ex geno tiver falhado mas a reac o do FAM tiver amplificado fortemente contin
46. nte 20 ul da mistura principal de controlo a cada um dos po os de reac o Acrescente imediatamente aos po os de reac o 5 ul de amostra padr o misturado ou gua para os controlos sem modelo NTC A placa deve ser configurada com o padr o misturado adicionado ao po o A1 e o controlo sem modelo gua adicionado ao A2 Todos os outros po os em utiliza o devem conter as amostras Vede e rode com brevidade a placa da PCR para assegurar a concen tra o dos reagentes no fundo dos po os 10 Siga a configura o do equipamento para a plataforma adequada Protocolo de avalia o de amostras Configura o do LightCycler 480 Instrument 1 2 Coloque imediatamente a placa no LightCycler 480 Instrument Seleccione o cone do LightCycler 480 Software no ambiente de trabalho da esta o de trabalho ligada ao equipamento Inicie sess o no software e a partir do ecr Overview seleccione New Experiment from Template A partir dos modelos de execu o apresentados escolha K RAS LC480II Run Template Este modelo ter os seguintes par metros 1 O formato de detec o DxS IVD Assays O volume de reac o 25 Um passo de espera inicial a 95 C durante 4 minutos A 9 N Uma amplifica o de 2 passos para 45 ciclos com uma desnatura o a 95 C durante 30 segundos e uma annealing a60 C durante 1 minuto A aquisi o de fluoresc ncia uma aquisi o nica no
47. o Sanger As determina es de muta o do Kit K RAS foram comparadas entre os 2 m todos e obtiveram se 18 resul tados discrepantes 5 FFPEs e 13 linhas celulares em que o sequen ciamento indicava um resultado negativo mas a amostra era positiva utilizando o ensaio DxS Para confirmar a presen a de uma muta o nestas 18 amostras cada uma teve a regi o volta das muta es clonada Para resolver a discrep ncia foi utilizada a presen a de um clone positivo quanto a muta o ABI 7500 A precis o foi avaliada utilizando controlos sint ticos dilu dos em 2 n veis de ADN da linha celular negativos muta o do Kit K RAS para obter 3 diferentes percentagens de muta o cobrindo ambos os n veis de muta o positivo enegativo Para cada muta o foram executadas 3 placas id nticas utilizando cada uma 3 lotes de reagente Foram testados n veis de muta o de 25 5 e 0 5 As amostras de 25 e 5 dever o originar resultados positivos quanto a muta o ACt abaixo dos valores de cut off de 1 a amostra de 0 5 dever originar um resultado negativo quanto a muta o ACt acima dos valores de cut off de 1 Os resultados encontram se resumidos no Quadro 19 a seguir Quadro 19 ABI7500 Resultados da valida o da precis o Ensaio Ensaio 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Pagina 32 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mu
48. o mas a um n vel que est abaixo dos limites deste kit 7 5 Alarmes Avisos 7 51 O LightCycler Adapt Software gerar um numero de Alarmes Avisos para as amostras no quadro Sample Result Table conforme descrito no Quadro 10 Quadro 10 Alarmes Avisos de amostras do LightCycler Adapt Software REP DILUTION O Ct de controlo inferior a 24 CONF LEVEL O Ct de controlo superior a 28 9 e nenhuma muta o indicada LIMITED O Ct de controlo superior a 35 EXO FAIL O ensaio de controlo ex geno falhou quando a reac o do FAM tamb m falhou numa reac o de muta o ou o Ct do controlo ex geno inferior a 30 FAIL O software n o consegue determinar se a curva positiva ou negativa P gina 20 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit 7 5 2 Os significados dos Alarmes Avisos s o descritos mais detalhadamente a seguir 7 5 2 1 7 5 2 2 7 5 2 3 7 5 2 4 REP_DILUTION Ct de controlo lt 24 Oensaio foi validado para um nivel de ADN que apresenta um Ct de controlo de 24 ou superior Se uma amostra apresentar um Ct de ensaio de controlo inferior devera ser diluida para assegurar que fica dentro do intervalo de trabalho valido CONF LEVEL Ct de controlo gt 28 9 Uma amostra negativa com um Ct de controlo gt 28 9 sera assinalada com um Alarme Aviso CONF_LEVEL Os valores Ct de muta o s o classificados como negativos ou para al m
49. o tumoral contenha as muta es de K RAS detectadas pelo Kit K RAS Todos os ensaios do Kit K RAS geram produtos de PCR curtos Contudo o Kit K RAS nao funciona em ADN altamente fragmentado A avalia o do ADN dever basear se na PCR e poder diferir da quantifica o baseada em leituras de Densidade ptica O kit inclui quantidades adicionais da mistura da reac o de controlo para permitir a avalia o da qualidade e quantidade do ADN nas amostras antes de executar o Kit K RAS Os reagentes do Kit K RAS foram dilu dos a uma concentra o ideal N o se recomenda a dilui o adicional do reagente a qual poderia resultar numa redu o do seu desempenho N o recomend vel a utiliza o de volumes inferiores a 25 ul que aumentariam o risco de falsos negativos Todos os reagentes do Kit K RAS foram formulados especificamente para serem utilizados com os testes indicados Para se manter um n vel de desempenho ptimo n o se devem substituir os reagentes do Kit K RAS P gina 7 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Para assegurar um n vel ideal de actividade e desempenho os iniciadores Scorpions tal como todas as mol culas etiquetadas com fluoresc ncia devem ser sempre protegidos da luz para evitar a sua foto descolora o Tenha muito cuidado para evitar a contamina o das reac es PCR com o material de controlo sint tico Recomenda se a utiliza o de pipet
50. passo dos 60 C P gina 11 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit 3 Seleccione oseparador Sample Editor e em Step 1 Select Workflow seleccione a caixa de verifica o Abs Quant Em Select Filter Combinations certifique se de que ambos os filtros est o seleccionados 465 510 nm e 533 580 nm Defina os nomes das amostras no Passo 2 e Passo 3 O Quantification Sample Type dever ser definido para unknown desconhecido A coluna de r plicas dever ser deixada em branco Seleccione o bot o Experiment e clique no bot o Start Run para guardar o ensaio e iniciar a ciclagem Ao concluir a execu o seleccione o separador Analysis e escolha Abs Quant 2nd Derivative Max a partir da janela Create New Analysis Aceite os valores predefinidos do ecr Create New Analysis Certifique se de que o bot o Filter Comb 465 510 e seleccione o bot o Calculate Os valores Ct s o apresentados no quadro Samples Seleccione o bot o Filter Comb e altere os filtros para 533 580 nm Seleccione o bot o Calculate e obtenha os valores Ct de controlo ex geno a partir do quadro Samples Protocolo de avalia o de amostras Configura o do ABI7500 Instrument is 2 Coloque imediatamente a placa no equipamento ABI7500 Seleccione o cone do 7500 System Software no ambiente de trabalho da
51. previstos para o padr o misturado est o apresentados na sec o de interpreta o de dados Valida o da sobressatura o Define se a sobressatura o como sendo a amplifica o n o espec fica nos ensaios de muta o de um alvo de ADN de tipo selvagem presente numa amostra espec fica Esta causa um n vel mensur vel de ru do de fundo A sobressatura o do ADN de tipo selvagem foi avaliada em cada ensaio de muta o O estudo de sobressatura o assegurou que os valores de cut off de 1 estabelecidos anteriormente estavam abaixo do n vel de sobressatura o e impediriam o registo de um resultado falso positivo LightCycler 480 Instrument Dez amostras de ADN da linha celular negativas muta o do Kit K RAS a diferentes concentra es 5 amostras de FFPE negativas muta o do Kit K RAS e 5 amostras de FFPE positivas muta o do Kit K RAS foram testadas em duplicado em 5 placas As amostras positivas muta o foram positivas para uma nica muta o e as outras muta es foram utilizadas para testar a sobres satura o Os valores Ct foram obtidos a partir do LightCycler Adapt Software etodas as combina es de valores Ct foram utilizadas para calcular valores ACt P gina 29 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Os resultados dos ensaios negativos muta o das amostras de ADN de linha celular e das amostras de FFPE apresentaram valores ACt que estavam
52. r do Amplification Plot seleccione todos os po os em utiliza o e seleccione o corante JOE a partir do menu de lista pendente de detectores 10 Verifique o sinal JOE de cada amostra e compare ao sinal JOE do po o de NTC controlo sem modelo Repare em todas as amostras que t m uma curva de amplifica o atrasada ou que falharam a ampli fica o para o controlo ex geno conforme comparado com o NTC 11 No separador Amplification Plot seleccione todos os po os em utiliza o e seleccione o corante FAM a partir do menu de lista pendente de detectores Utilize a defini o da linha de base autom tica e o Ct manual e em seguida defina manualmente o limiar no meio da fase exponencial utilizando a escala logar tmica para oeixo Y conforme descrito no guia do utilizador do ABI7500 12 Seleccione o bot o Analyse para obter os valores Ct Interpreta o da avalia o de amostras Avalie os valores Ct de NTC para se certificar de que n o existe contamina o que cause uma amplifica o positiva no canal FAM Ct inferior a 40 ou uma reac o de controlo ex geno falhada no canal HEX sem Ct indicando um problema de configura o O padr o misturado dever dar um Ct de ensaio de controlo canal FAM de 26 29 no ABI7500 e lt 29 no LightCycler 480 Instrument Os dados n o dever o ser utilizados se falhar qualquer um destes 2 controlos de execu o Ct de ensaio de controlo 29 35 Interprete com cuidado uma vez q
53. seguir detectar muta es de n veis mais elevados Ct de controlo 2 35 Apenas algumas c pias amplific veis de ADN est o presentes na amostra es ser prov vel visualizar muta es se a maioria das c pias tiver sofrido muta o Ct de controlo 2 38 o ADN reduzido e os dados n o dever o ser utilizados 2 Valores ACt do padr o misturado 2 1 Os valores ACt do padr o misturado devem ser os valores indicados no Quadro 14 embora possam ocorrer varia es de 2 devido a diferentes defini es de limiar em diferentes equipamentos Quadro 14 Valores ACt do padr o misturado e pontos de cut off de 1 do ABI7500 Ensaios padr o do padr o ACt do Intervalo aceit vel ACt 1 da z amostra misturado misturado 12ALA 0 70 2 70 a 1 30 6 5 12ASP 1 04 3 04 a 0 96 12ARG 0 02 2 02 a 1 98 12CYS 0 98 2 98 a 1 02 12SER 0 02 1 98 a 2 02 12VAL 0 19 2 19 a 1 81 13ASP 1 12 3 12 a 0 88 3 Valores ACt da amostra 3 1 3 2 3 3 Se o valor ACt da amostra for superior ao valor de 1 conforme indicado no Quadro 14 a amostra de ADN classificada como negativa quanto a muta o ou estando abaixo dos limites do Kit K RAS Se o ACt da amostra for inferior ao valor de 1 a amostra de ADN classificada como positiva quanto a muta o Os valores Ct de muta o de 38 ou superior devem ser classifica dos como negativos ou abaixo dos limites do kit
54. t Software utilizando a base de que diluindo gt aumentar o Ct em 1 9 Protocolo K RAS para a detec o de muta es Leia atentamente estas instru es e familiarize se com todos os componentes do Kit K RAS antes de utiliz lo Para utilizar o Kit K RAS eficazmente as amostras devem estar num lote de 10 para encher uma placa de 96 po os A utiliza o de lotes mais pequenos faz com que possam ser testadas menos amostras com o Kit K RAS Configura o experimental do LightCycler 480 Instrument Para cada amostra de ADN os ensaios de muta o e de controlo t m de ser analisados na mesma execu o de PCR para evitar as varia es de execu o para execu o 1 Descongele temperatura ambiente as misturas de reac o e o padr o misturado do Kit K RAS Uma vez que descongeladas misture cada uma das solu es invertendo cada tubo 10 vezes para evitar concentra es de sais localizadas Prepare misturas suficientes para as amostras de ADN o padr o misturado e os controlos sem modelo NTC mais 2 reac es adicionais por cada mistura conforme indicado no Quadro 5 Quadro 5 Volumes de mistura principal do Kit K RAS Misturas principais Mistura Tag ul Tag ul x1 de reac o ul por placa x14 por placa x14 Ensaio Mistura de reac o ul x1 Ensaio 19 8 0 2 277 2 2 8 de controlo oleae 19 8 0 2 277 2 2 8 de muta o P gina 14 de 40 Apenas para utiliza
55. tation Kit A redu o em precis o do ensaio 12ALA deve se varia o entre r plicas a um n vel de ADN Valida o da linearidade LightCycler 480 Instrument A linearidade foi avaliada utilizando padr es sint ticos a n veis de muta o de 100 1 e 0 para cada ensaio A cada uma das percentagens de muta o foi realizada uma dilui o em s rie para manter on vel de muta o mas reduzir a quantidade total de ADN Produziram se curvas padr o executando cada dilui o em triplicado em 3 placas de r plicas para o ensaio de controlo e o ensaio de muta o relevante Os valores Ct foram produzidos utilizando o LightCycler Adapt Software Foi produzido um gr fico para cada muta o dados n o indicados em que o Ct do ensaio de controlo e o Ct do ensaio de muta o foram representados graficamente um em rela o ao outro efoi efectuada uma regress o para cada n vel de muta o Os intervalos de confian a de 95 tamb m foram representados graficamente para cada n vel de muta o N o se obtiveram valores Ct de muta o dos testes de 0 Os gr ficos de 100 e 1 mostraram que havia uma discrimina o clara entre os conjuntos de dados eos declives das curvas eram substancialmente equivalentes indicando uma efic cia de amplifica o semelhante em toda uma gama de concentra es de muta o ABI7500 Este estudo avaliou a efic cia de cada um dos ensaios de muta o em toda uma gama de concentra es de
56. ue muta es de n vel muito baixo poder o n o ser detectadas Ct de ensaio de controlo 35 38 Apenas algumas c pias amplific veis de ADN est o presentes em tais amostras e as muta es provavelmente s poder o ser visualizadas se a maioria das c pias tiver sofrido muta o Ct de ensaio de controlo gt 38 Rejeite a amostra uma vez que est presente ADN m nimo e o Kit K RAS n o poder detectar muta es P gina 13 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Tenha em aten o que se uma amostra originar um Ct de ensaio de controlo atrasado o Ct do controlo ex geno da amostra dever ser comparado com o controlo ex geno do NTC Se o controlo ex geno da amostra for atrasado ou negativo quando comparado com o NTC poder estar presente um inibidor poss vel reduzir o efeito de um inibidor diluindo a amostra embora isto tamb m dilua o ADN Dilui o de amostra Um Ct de controlo lt 24 ir sobrecarregar os ensaios de muta o As amostras com um Ct de controlo lt 24 devem ser dilu das De notar que para o LightCycler 480 Instrument os valores Ct obtidos atrav s do 2 m todo derivativo poder o ser ligeiramente diferentes dos obtidos com oLightCycler Adapt Software Recomenda se que as amostras concentradas sejam dilu das para ficarem dentro do intervalo gt 24 mas lt 29 valores Ct baseados no 7500 Sequence Detection Software ou no LightCycler 480 Instrumen
57. ue com a an lise pois a re ac o do FAM predominou sobre a reac o de controlo ex geno c Se ambas as reac es do FAM e da reac o de controlo ex geno tiverem falhado os dados devem ser eliminados pois poder o estar presentes inibidores Esses inibidores poderiam originar resultados falso negativos No separador Amplification Plot seleccione todos os po os em utiliza o e seleccione ocorante FAM apartir do menu de lista pendente de detectores Utilize a defini o da linha de base autom tica e o Ct manual e em seguida defina manualmente o limiar no meio da fase exponencial utilizando a escala logar tmica para o eixo Y conforme descrito no guia do utilizador do ABI7500 Analise os dados e calcule o valor ACt da seguinte maneira Ct do ensaio de muta o da amostra Ct do ensaio de controlo da amostra ACt P gina 25 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Para facilidade de an lise os dados podem ser exportados para o Microsoft Excel Interpreta o dos dados do ABI7500 1 Valores Ct de controlo 1 14 1 2 1 3 1 4 1 5 O valor do Ct de controlo deve ser 2 24 para evitar sobrecarregar o ensaio Ct de controlo lt 29 o Kit K RAS consegue detectar nestas amostras muta es muito pequenas como as de apenas 1 Em amostras com um Ct de controlo de 2 29 o kit n o detecta muta es muito pequenas como as de 1 mas continua a con
58. uta es no mbito de algumas bases umas das outras No material de controlo sint tico a reactividade cruzada forma um padr o leg vel no ABI7500 que permite que o verdadeiro positivo seja determinado a partir de v rios sinais ver Quadro 15 Quadro 15 Padr o de reactividade cruzada do material de controlo sint tico no ABI7500 Sim indica o sinal verdadeiro Os n meros indicam o n mero aproximado de ciclos a seguir ao sinal verdadeiro durante os quais se pode verificar um sinal de reactividade cruzada N o se introduziram valores para al m de 9 ciclos dado que os mesmos ficariam na zona negativa Amostra positiva 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Nota O padr o de reactividade cruzada poder ser diferente em amostras de ADN por ex amostras de ADN envolvidas em parafina P gina 27 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit O Kit K RAS foi concebido para detectar uma muta o numa amostra de ADN Caso um segundo ensaio de muta o produzir um resultado positivo prov vel que se trate de reactividade cruzada No entanto j se observaram mutantes duplos embora raramente Se o padr o n o se enquadrar no padr o de reactividade cruzada poder ser necess rio fazer mais investiga es 11 Caracter sticas de desempenho dos ensaios O desempenho de ensaio foi caracterizado para o Kit K RAS Kit no ABI7
59. va da Uni o Europeia 98 79 CE para Dispositivos M dicos de Diagn stico in vitro A compra deste produto acompanhada por uma licen a limitada n o transfer vel para utiliza o das tecnologias ARMS e Scorpions apenas para utiliza o em diagn stico in vitro ARMS est coberto pelas patentes dos EUA 5 595 890 e EP 332435 Scorpions pelas patentes dos EUA 6 326 145 e EP1088102 As informa es contidas neste documento est o sujeitas a altera es A DxS Limited n o se responsabiliza por quaisquer erros que possam aparecer neste documento Em caso algum a DxS Limited assumir qualquer tipo de responsabilidade quer por contrato acto il cito incluindo neglig ncia ou de outra forma por quaisquer reivindica es apresentadas em rela o a ou derivadas da utiliza o deste produto Nenhum conte do deste documento exclui ou limita qualquer responsabilidade que seja ilegal que a DxS Limited exclua ou limite Copyright 2009 DxS Limited Reservados todos os direitos DxS Limited 48 Grafton Street Manchester M13 9XX Reino Unido www dxsdiagnostics com Pagina 40 de 40
60. vam a funcionar dentro dos crit rios especificados Calcularam se os valores ACt de 1 a partir de valores Ct m dios relativos as r plicas numa execu o e um lote Os valores ACt de cut off foram definidos como o valor m dio arredondado para o 0 5 mais pr ximo de todos os lotes execu es e concentra es para concentra es em que todas as r plicas deram um valor Ct Os resultados destes testes encontram se resumidos no Quadro 16 a seguir P gina 28 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Quadro 16 Resultados da valida o dos valores de cut off de 1 do ABI7500 Ensaio Valores ACt de1 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP O cut off de 1 do 12VAL foi alterado para 6 5 com base no estudo de Sobressatura o Consulte a argumenta o descrita a seguir Determina o do ACt do padr o misturado LightCycler 480 Instrument Os valores ACt do padr o misturado sao valores m dios obtidos de 50 execu es nas quais o padr o misturado foi testado Os valores Ct foram obtidos a partir do LightCycler 480 Adapt Software Os valores ACt previstos para o padr o misturado est o apresentados na sec o de interpreta o de dados ABI7500 Os valores do padr o misturado foram definidos utilizando a m dia de 422 valores ACt Estes foram calculados atrav s de muitos diferentes lotes de kit e execu es Os valores ACt
61. w and escalating doses of cetuximab q1w The EVEREST experience preliminary data J Clin Oncol 26 2008 May 20 suppl abstr 4001 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer Abstract 0 037 Presented June 27 2008 KRAS mutation status is a predictive biomarker for cetuximab benefit in the treatment of advanced colorectal cancer Results from NCIC CTG CO 17 A phase III trial of cetuximab versus best supportive care Christos Karapetis et al Rafael G Amado Michael Wolf Marc Peeters Eric Van Cutsem Salvatore Siena Daniel J Freeman Todd Juan Robert Sikorski Sid Suggs Robert Radinsky Scott D Patterson and David D Chang Wild Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients with Metastatic Colorectal Cancer J Clin Oncol 2008 26 1626 1634 Pagina 39 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Notas para o comprador Nem este produto o TheraScreen K RAS Mutation nem quaisquer dos seus componentes podem ser revendidos ou de outra forma transferidos ou modificados para revenda sem a aprova o por escrito da DxS Limited TheraScreen e Scorpions sao marcas comerciais registadas da DxS Limited ARMS uma marca comercial registada da AstraZeneca UK Limited LIGHTCYCLER e ROCHE s o marcas comerciais da Roche ABI7500 uma marca comercial da Applied BioSystems Este produto um dispositivo de diagn stico com marca CE em conformidade com aDirecti
62. xo da temperatura ideal Valida o da toler ncia Taq LightCycler 480 Instrument Estes estudos determinaram a toler ncia dos ensaios de muta o a varia es do n vel de polimerase Tag uma fonte potencial de varia o introduzida pelo utilizador visto que este elemento adicionado pelo utilizador Foi avaliada a toler ncia dos ensaios a diferentes n veis de Tag utilizando padr es sint ticos de 1 em 3 n veis diferentes de ADN P gina 35 de 40 Apenas para utiliza o em diagn stico TheraScreen K RAS Mutation Kit Cada amostra foi testada em triplicado para um n vel de Tag alto normal e baixo o n vel alto tem 20 mais Tag que o normal e o n vel baixo tem 20 menos Tag que o normal Tamb m foram executados padr o misturado em duplicado e reac es NTC simples para assegurar que os ensaios estavam a funcionar dentro das especifica es Foram realizadas execu es em triplicado para cada placa eforam testados 3 lotes diferentes de Taq Os valores Ct foram obtidos a partir do LightCycler Adapt Software e todas as combina es de valores Ct das r plicas numa placa foram utilizadas para calcular valores ACt Todos os ensaios estavam em conformidade com os crit rios de aceita o de que as m dias das amostras de Tag alto e de Taq baixo n o diferem do valor m dio do n vel normal de Tag por mais de 1 desvio padr o dos dados de Tag normal ABI7500 Para cada ensaio de muta o foram executad
63. yun Chung Yung Jue Bang 2006 Optimization of Patient Selection for Gefitinib in Non Small Cell Lung Cancer by combined analysis of Epidermal Growth Factor Receptor Mutation K ras Mutation and AKT Phosphorylation Clin Cancer Res 12 8 2538 2544 William Pao Theresa Y Wang Gregory J Riely Vincent A Miller Qiulu Pan Marc Ladanyi Maureen SF Zakowski Robert T Heelan Mark G Kris Harold E Varmus 2005 KRAS Mutations and Primary Resistance of Lung Adenocarcinomas to Gefitinib or Erlotinib PloS Medicine 2 1 57 61 Astrid Lievre Jean Baptiste Bachet Delphine Le Corre Valerie Boige Bruno Landi Jean Francois Cote Gorana Tomasic Christophe Penna Michel Ducreux Philippe Rougier Frederique Penault Llorca Pierre Laurent Puig 2006 KRAS Mutation Status is Predictive of Response to Cetuximab Therapy in Colorectal Cancer Cancer Res 66 8 3992 3995 Silvia Benvenuti Andrea Sartore Bianchi Federica Di Nicolantonio Carlo Zanon Mauro Moroni Silvio Veronese Salvatore Siena Alberto Bardelli 2007 Cancer Res 67 6 2643 2648 W De Roock J De Schutter G De Hertogh M Jannsens B Biesmans N Personeni K Geboes C Verslyp E Van Cutsem S Tejpar 2007 Journal of Clinical Oncology 25 18S 4132 G Finocchiaro F Cappuzzo P A Janne K Bencardino C Carnaghi W A Franklin M Roncalli L Crino A Santoro M Varella Garcia 2007 Journal of Clinical Oncology 25 18S 4021 F Di Fiore F Bl

TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

TheraScreen&reg;: K-RAS Mutation Kit

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit