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Enzygnost® Anti-HAV

1. Enzygnost Anti HAV Realiza o Programac o do BEP II BEP III BEP 2000 Menu para o Preparag o dos reagentes BEP Il T BEE 2009 MENU NO 4 x 100 ul de soro de controlo negativo OPERATE 1 YES 2 x 25 ul de soro standard 80 25 ul de amostra DOSAGEM DO ANTIGENO ASPIRATE NO SOAKTIME 0 BEP Il BEP Ill DISP VOL 50 CHANNEL NO 3 PHOT NO OPERATE 2 YES 50 ul de ant geno Placas incompletas DOSAGEM DO CONJUGADO completar at meia placa WASHINGS 0 com fileiras de po os ASPIRATE NO cheias de gua SOAKTIME 0 50 ul de solu o de uso DISP VOL 50 do conjugado CHANNEL NO 2 4 PHOT NO 120 mn 5 min OPERATE 3 YES 37 1 C LAVAGEM E DOSAGEM DO CROMOGENEO y WASHINGS 4 BEP Il lavar 4 vezes Ec 3 ASPIRATE NO EE SOAKTIME 0 J DISP VOL 100 CHANNEL NO 4 100 ul de solug o crom PHOT NO gena pronta para uso OPERATE 4 YES y DOSAGEM DA SOLUGAO DE i BLOQUEIO 30 2 Ense WASHINGS 0 protegido da luz ASPIRATE NO SOAKTIME 0 y DISP VOL 100 100 pi de solu o CHANNEL NO 5 para bloqueio PHOT YES y MEAS WL 450 en REF WL 650 BLK COR NO EVAL MODE 4 4 GEN CUT NO Avaliag o 450 nm NEG CONT 4 comprimento de onda de MAX NEG refer ncia 650 nm MIN NEG 0 700 y FACT NEG 0 5 MAX POS 0 300 Resultado do teste THRESH CUT OFF OQEC G11 C0540 513 H 49 MAA COS WE Bibliography Literatur Litt ratu
2. Colectivo de amostras N de amostras Inicialmente reactiva Repeti o reactiva M Anti HAV pos 30 30 30 Anti HAV pos plasmas 30 30 30 Anti HAV IgG pos 157 157 157 Anti HAV IgM pos 84 84 84 Seroconvers es 12 A sensibilidade corresponde sensibilidade de um teste similar K Anti HAV pos 204 204 204 Anti HAV pos 205 202 203 Anti HAV pos 168 166 167 Tab 3 Especificidade Para as an lises de especificidade foram determinados os seguintes dados em dois centros independentes K M Colectivo de amostras N de amostras Inicialmente reactiva Repeti o reactiva M soros normais negativos 50 0 0 amostras de plasma normal negativas 50 0 0 K soros normais negativos 176 6 3 soros normais negativos 310 9 5 Tab 4 Reprodutibilidade Para as an lises de reprodutibilidade as amostras foram testadas sempre com determina es de 8 vezes durante 5 dias O c lculo dos coeficientes de varia o CV foi efectuado de acordo com o modelo de componentes de vari ncia Amostra Valor m dio de extin o E CV Intra ensaio Inter ensaio F1 1 203 3 6 7 8 F2 0 607 5 0 9 2 F3 0 331 9 4 7 8 F4 0 115 8 3 16 6 OQEC G11 C0540 513 H 48 IT TT 0M NEN 9 Tab 5 Realiza o e programa o do ensaio
3. Conjugate Buffer Anti HAV to be used as a diluent for Anti HAV POD Conjugate contains glycerin 100 g L Tween 20 20 g L sodium chloride 8 8 g L EDTA 1 9 g L bovine albumin 1 g L polygeline and phosphate 50 mmol L Preservative Phenol max 1 g L HAV Antigen Hepatitis A virus antigen from human fibroblasts inactivated Preservative Phenol max 1 g L Anti HAV Standard Serum 80 Human serum containing antibodies to HAV nominal value 80 20 IU L based on the WHO Reference Preparation Nominal absorbance value lt 0 3 A Preservative Phenol max 1 g L Anti HAV Control Serum negative Human serum without antibodies to HAV Nominal absorbance value gt 0 7 Preservative Phenol max 1 g L Washing Solution POD concentrate Phosphate buffer solution 90 mmol L containing Tween 18 g L Preservative Phenol max 1 g L Buffer Substrate TMB Hydrogen peroxide approximately 0 1 g L in acetate buffer solution 25 mmol L Preservative n butanol max 1 Chromogen TMB Tetramethyl benzidine dihydrochloride 5 g L Stopping Solution POD 0 5 N sulfuric acid The pack contains a matched set of reagents Reagents must not be interchanged with other kits unless the reagents are from an identical lot i e they must display the required 6 digit lot numbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table Washing Solution POD Stopping Solu tion POD and Working Chromogen Solution are
4. Independientemente de esto todos los materiales obtenidos a partir de sangre humana deben ser manipulados con las precauciones necesarias siguiendo las medidas de seguridad recomendadas en caso de riesgo biol gico puesto que nunca se puede excluir completamente la existencia de agentes pat genos 5 3 El ant geno HAV aislado de fibroblastos humanos se somete a un reconocido proceso de inactivaci n del virus transformaci n con propiolactona Por razones de seguridad se debe tratar de todas maneras el antigeno HAV con las correspondiente medidas de seguridad 5 4 Se aconseja utilizar guantes de seguridad durante el desarrollo del test 5 Para la eliminaci n del material infeccioso s lido se recomienda colocarlo en el autoclave por lo menos 1 hora a 121 C Las soluciones aspiradas se deben recoger en dos recipientes conectados uno con el otro Los recipientes deben contener un medio de desinfecci n apropiado para inactivar virus pat genos humanos Deben observarse la concentraci n y el tiempo de acci n dados por el fabricante OQEC G11 C0540 513 H 35 IT A E E Preparaci n de reactivos Antes de empezar el test llevar todos los reactivos y las muestras a investigar a una temperatura entre 18 y 25 C No retirar la placa de pruebas del envase que la contiene Por cada placa de prueba diluir 20 ml de la soluci n de lavado POD concentrado a 400 ml con agua destilada o desionizada Soluci n de u
5. emm OQEC G11 C0540 513 H 22 IT MENTA Caract ristiques du test Sensibilit et sp cificit Les r sultats de l tude de sensibilit et de sp cificit sont r sum s dans les tableaux 2 et 3 en annexe Pour d terminer la sensibilit un total de 878 chantillons anti HAV positifs a t test donnant une sensibilit entre 98 5 et 100 test initial et entre 99 0 et 100 retest La r activit du test d tecter les chantillons de s roconversion a t test e sur un panel de 12 s roconversions Les r sultats ont montr que la sensibilit du test Enzygnost Anti HAV pour la d tection des s roconversions correspondait celle d un test comparable La sensibilit analytique a t d termin e lt 20 UI par rapport au standard international de l OMS N anmoins on ne peut exclure que dans le cadre d une large utilisation du test certains chantillons ne soient pas d tect s Pour d terminer la sp cificit un total de 586 chantillons sanguins anti HAV n gatifs a t test donnant une sp cificit comprise entre 96 6 et 100 test initial et entre 98 3 et 100 retest Selon le collectif tudi ou la r alisation du test par ex des valeurs diff rentes peuvent tre obtenues Selon l tat actuel des connaissances un r sultat positif avec le test anti HAV ne permet pas avec certitude de conclure une infection par le virus de l h patite A ni une immunisation de m me qu
6. La distribution des s rums standard de contr le et des chantillons ainsi que la r alisation du test sont effectu es enti rement automatiquement par l appareil cf manuel d utilisation du BEP9 2000 Validation du test Les diff rentes valeurs de densit optique obtenues pour les s rums de contr le sont utilis es pour le calcul de la valeur moyenne si DO 20 700 0 010 lt D O sr gp lt 0 300 Si une seule des densit s optiques du S rum de contr le Anti HAV n gatif ne r pond pas au critere ci dessus elle peut tre n glig e Les deux densit s optiques obtenues pour le S rum standard 80 doivent r pondre au crit re indiqu A d faut refaire le test OQEC G11 C0540 513 H 21 e IT A E E Exploitation du test L exploitation est effectu e automatiquement par le BEP 2000 ou le BEP Ill Se reporter aux manuels d utilisation des appareils Les chapitres suivants sont pr vus pour une exploitation des r sultats sans l aide d un logiciel Test qualitatif Calculer la valeur moyenne des densit s optiques obtenues pour le S rum de contr le Anti HAV n gatif puis la valeur seuil en multipliant cette valeur moyenne par le facteur 0 5 D O n g Le domaine de confiance est d fini comme suit Valeur seuil 10 Selon les crit res du test les chantillons test s sont class s de la facon suivante x 0 5 valeur seuil cut off R sultat du test d D O gt cut off 10 n gatif 2 D
7. Toutes les tapes de dilutions doivent imp rativement tre effectu es avec le S rum de contr le Anti HAV n gatif Solution d emploi du Conjugu pr lever la quantit de Conjugu Anti HAV POD n cessaire et la diluer au 1 41 avec le Tampon Conjugu Anti HAV Pour une plaque ajouter 150 ul de Conjugu Anti HAV POD dans un flacon 6 ml de Tampon Conjugu Anti HAV Stabilit s et conditions de conservation Avant leur ouverture tous les l ments du coffret Enzygnost Anti HAV se conservent 2 8 C jusqu la date indiqu e sur l tiquette Pour les stabilit s et conditions de conservation apr s ouverture des flacons et apr s pr paration des r actifs leur dilution d emploi se reporter au tableau 1 en annexe Mat riel n cessaire BEP II pour la r alisation automatique de la distribution des r actifs et des tapes de lavage BEP Ill pour la r alisation automatique du test apres la distribution des chantillons et pour l exploitation automatique du test BEP 2000 pour la r alisation entierement automatique du test et de son exploitation Pipettes pipettes a embouts interchangeables de 25 50 100 et 1000 ul Incubateur bain marie couvert 37 1 C R alisation du test Realisation du test l aide du BEP Il 1 Sch ma de distribution D terminer le nombre de cupules n cessaires nombre d chantillons a tester 6 cupules pour les contr les Sortir du cadre les ba
8. gua destilada Por raz es t cnicas que se prendem com o sobreenchimento dos frascos n o permitido verter conjuntamente os conte dos dos frascos de cromog nio TMB e de tamp o substrato TMB Para a execuc o quantitativa do teste necess rio preparar a partir do soro standard Anti HAV 80 as seguintes dilui es negativas com o soro de controlo Anti HAV 40 IU I Dilui o de 1 2 p ex 100 ul de soro standard Anti HAV 80 100 ul de soro de controlo Anti HAV negativo 20 IU I Dilui o de 1 4 p ex 100 ul do standard 40 IU 100 ul de soro de controlo Anti HAV negativo 10 IUM Diluig o de 1 8 p ex 100 ul do standard 20 IU I 100 ul de soro de controlo Anti HAV negativo Para as concentra es expect veis de Anti HAV gt 60 IU I os soros ou plasmas t m de ser dilu dos da seguinte maneira At 600 IU I dilui o de 1 11 p ex 10 ul de amostra 100 ul de soro de controlo Anti HAV negativo At 6 000 IU dilui o de 1 101 p ex 10 ul de amostra 1 000 ul de soro de controlo Anti HAV negativo At 60 000 IU I dilui o de 1 1 111 p ex 10 ul de amostra 1 000 ul de soro de controlo Anti HAV negativo e a partir da 10 ul 100 ul de soro de controlo Anti HAV negativo Todas as etapas de dilui o necess rias s dever o ser executadas de forma negativa com o correspondente soro de controlo Anti HAV Solu o de uso do conjugado Retirar a quantidade necess ria de conjug
9. IT MEN TEA DADE BEHRING Enzygnost Anti HAV Enzyme immunoassay for the detection of antibodies to hepatitis A virus antigen in serum and plasma Enzymimmunoassay zum Nachweis von Antik rpern gegen Hepatitis A Virus Antigen in Serum und Plasma Test immunoenzymatique pour la mise en evidence des anticorps anti antigene du virus de l h patite A dans le serum et le plasma Metodo immunoenzimatico per l identificazione degli anticorpi contro l antigene del virus dell epatite A nel siero e nel plasma Ensayo inmunoenzim tico para el reconocimiento de los anticuerpos contra el antigeno virus de la hepatitis A en sueros y plasmas humanos Teste imunoenzim tico para detecc o de anticorpos contra o ant geno do virus da hepatite A no soro e no plasma English Page 2 to 9 Deutsch Seite 10 bis 17 Francais Pages 18 a 25 Italiano Pagina 26 fino 33 Espa ol P gina 34 hasta 41 Portugu s P gina 42 a 49 Summary of Test Procedure Page 9 Kurzanleitung Testdurchf hrung Seite 17 La technique en bref Page 25 Istruzioni in breve esecuzione del Test Pagina 33 Resumen de la t cnica P gina 41 Resumo da t cnica P gina 49 Bibliography Literatur Litt rature Bibliografia Bibliograf a Bibliografia Page Seite Pagina P gina 50 OQEC G11 C0540 513 H 1 Edition March 2003 IT E ILS Enzygnost Anti HAV Intended Use Enzyme immunoassay for the detection of antibodies to hepatitis A virus antigen in se
10. MEAS WL 450 y REF WL 650 C nach maximalih BLK COR NO EVAL MODE 4 y GEN CUT NO Auswertung 450 nm NEG CONI 4 Referenzwellenl nge 650 nm MIN NEG 0 700 FACT NEG 0 5 MAX POS 0 300 Testergebnis THRESH CUT OFF OQEC G11 C0540 513 H 17 IT E ILS Enzygnost Anti HAV Domaine d utilisation Test immunoenzymatique pour la mise en vidence des anticorps anti antigene du virus de l h patite A dans le s rum et le plasma La r alisation du test immunoenzymatique est effectu e l aide des ELISA Processeurs BEP Il BEP Ill et BEP 2000 Le test a t mis au point pour l analyse d chantillons individuels et non d chantillons pool s ni dilu s Il ne doit tre utilis qu des fins de diagnostic in vitro Int r t diagnostique Au d but d une h patite A 1 2 3 4 on met toujours en vidence des anti HAV et le plus souvent une activit d ja lev e Un r sultat n gatif en anti HAV exclut donc une tiologie a h patite A de la maladie Dans la mesure ou apr s une infection la pr sence d anti HAV persiste pendant toute la vie leur mise en vidence garantit l existence d une immunit ce qui constitue un crit re de d cision important lorsqu on se pose la question de proc der une immunisation active par vaccination ou l administration d immunoglobulines pour une prophylaxie apr s un risque de contage Enzygnost Anti HAV permet en exploitant quantitativement le S rum standa
11. Medio de conservaci n Fenol m x 1 g l Suero control Anti HAV negativo Suero humano sin anticuerpos contra HAV Valor normativo de extinci n gt 0 7 Medio de conservaci n Fenol m x 1 g l Soluci n de lavado POD concentrado Soluci n tamp n de fosfato 90 mmol l conteniendo Tween 18 g l Medio de conservaci n Fenol m x 1 g l Tamp n Sustrato TMB Per xido de hidr geno aprox 0 1 g l en soluci n tamp n de acetato 25 mmol l Medio de conservaci n n Butanol m x 1 Crom geno TMB Clorhidrato de tetrametilbencidina 5 g l Soluci n de detenimiento POD cido sulf rico 0 5 N Los reactivos con excepci n de la soluci n de lavado POD la soluci n de detenimiento POD y la soluci n de uso del crom geno preparada a partir de los reactivos dependientes del lote crom geno TMB y Tamp n sustrato TMB s lo se pueden utilizar juntos si provienen del mismo lote esto es s lo en la combinaci n con el mismo n mero de 6 cifras Nr de Lote que est impreso en el envase o que se puede tomar de la Tabla Barcode incluida en ste Advertencias y medidas de seguridad 1 S lo para ser utilizado en diagn sticos in vitro 2 Cada donaci n individual de sangre destinada a la preparaci n de los sueros est ndar y de control ha sido sometida a pruebas para detectar el HBsAg anti HCV anti HIV 1 y anti HIV 2 Para la elaboraci n se van a utilizar nicamente donaciones con resultados negativos
12. Probe Extinktionsmittelwert E 96 VK Intra Assay Inter Assay F1 1 203 3 6 7 8 F2 0 607 5 0 9 2 F3 0 331 9 4 7 8 F4 0 115 8 3 16 6 OQEC G11 C0540 513 H 16 ME II E EC N Tab 5 Testdurchf hrung und programmierung Enzygnost Anti HAV Testdurchf hrung Men programmierung BEP II BEP III BEP 2000 f r den Vorbereitung der Reagenzien BEP Il BEP 2000 MENU NO 4x 25 ul Kontroll Serum negativ ORERATE 1 YES 2 x 25 ul Standard Serum 80 DOSIERUNG ANTIGEN je 25 ul Probe WASHINGS 0 ASPIRATE NO SOAKTIME 0 DISP VOL 50 BEP II BEP Ill CHANNEL NO 3 PHOT NO OPERATE 2 YES 50 ul Antigen teilbest ckte Platten mit DOSIERUNG KONJUGAT Wasserriegeln auf halbe WASHINGS 0 Platten erg nzen ASPIRATE NO SOAKTIME 0 DISP VOL 50 E ga CHANNEL NO 2 Gebrauchsl sung PHOT NO y OPERATE 3 YES 120 min gt min WASCHEN UND DOSIERUNG e 37 1 C CHROMOGEN y WASHINGS 4 4 x Waschen BEP II a ASTRALE NO a DISP VOL 100 CHANNEL NO 4 100 ul Chromogen PHOT NO Gebrauchsl sung OPERATE 4 YES y DOSIERUNG STOPPLOSUNG 30 min 2 min WASHINGS 18 bis 25 C ASPIRATE NO lichtgesch tzt SOAKTIME 0 DISP VOL 100 y CHANNEL NO 5 100 ul Stoppl sung PHOT YES
13. es s o efectuadas automaticamente com o BEP 2000 ou o BEP Ill Para o efeito favor consultar os manuais de instrug es Em caso de avaliac o efectuada sem a assist ncia de software necess rio prestar atenc o aos seguintes cap tulos Teste qualitativo O valor m dio negativo dos valores de extinc o do soro de controlo Anti HAV calculado a partir dos valores de extin o do soro de controlo Anti HAV Para o c lculo do valor limite multiplica se o valor medio de extinc o do soro de controlo Anti HAV negativo pelo factor 0 5 E neg x 0 5 valor limite cut off Como intervalo de incerteza define se Valor limite 10 De acordo com os crit rios do teste as amostras da an lise s o classificadas do seguinte modo Testergebnis 1 E amostra gt Cut off 10 negativo 2 E amostra lt Cut Off 10 positivo 3 cut off 10 E amostra X Cut off 10 duvidoso Amostras que no teste inicial reajam com valores de extinc o num intervalo de 10 do valor limite intervalo de incerteza t m de ser consideradas provisoriamente duvidosas Para clarifica o do resultado a amostra ter de ser submetida a um novo teste mas desta vez numa dupla determinac o Se na repetic o do teste o valor m dio da dupla determinac o for inferior ao valor limite de 10 ou superior ao valor limite de 10 o resultado duvidoso inicial pode ser desprezado e a amostra pode ser considerada positiva ou negativa Se mesmo assim
14. 30 ml Cromog nio TMB 1x3ml Soluc o de bloqueio POD 1x 100 ml Frasco vazio para soluc o de uso cromog nio 1 unidade Pel culas aderentes 6 unidades Bolsa de polietileno para conservar as fileiras de pocos n o utilizadas 1 unidade Tabela de valores do c digo de barras 1 unidade Folheto da embalagem 1 unidade OQEC G11 C0540 513 H 42 Edic o Marco 2003 e IT MEN TIA Composi o Enzygnost Anti HAV placa de ensaio Placa de microtitula o revestida de anticorpos humanos contra o antigene do v rus da hepatite A Conjugado Anti HAV POD Anti HAV monoclonal rato conjugado com peroxidase POD em solu o tamp o Tris 0 05 mol l Dilui o de uso 1 40 em tamp o para conjugado Anti HAV Conservante Fenol m x 19 1 Tamp o para conjugado Anti HAV como meio de diluig o para o conjugado Anti HAV POD Cont m glicerina 100g l Tween 20 20 g l cloreto de s dio 8 8 g l EDTA 1 9 g l albumina bovina 1 g l poligelina e fosfato 50 mmol l Conservante Fenol m x 1 g l Antigene HAV Antigene do v rus da hepatite A obtido de fibroblastos humanos inactivado Conservante Fenol m x 1 g l Soro standard Anti HAV 80 Soro humano com anticorpos contra o HAV nominalmente 80 20 IU I baseado no preparado de refer ncia da OMS Valor indicativo de extin o lt 0 3 E Conservante Fenol m x 1 g l Soro de controlo Anti HAV negativo Soro humano sem anticorpos contra o HAV V
15. 5 Inkubation 2 Stunden 5 Minuten bei 37 1 C inkubieren Waschvorgang unmittelbar anschlie en 6 Waschen Folie abziehen alle Vertiefungen aussaugen und mit je ca 0 3 ml Waschl sung 4mal waschen Nach Abschlu der Waschschritte die n chste Reagenzdosierung sofort anschlie en um ein Ein trocknen zu vermeiden 7 Substrat Dosierung In jede Vertiefung 100 ul Chromogen Gebrauchsl sung einf llen Platte mit neuer Folie abkleben 8 Substrat Inkubation 30 2 Minuten bei 18 bis 25 C lichtgesch tzt inkubieren 9 Stoppreaktion Folie entfernen und je Vertiefung 100 ul Stoppl sung POD zugeben dabei gleichen Zeittakt wie bei Punkt 7 einhalten 10 Messung Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren Als Wellenl nge der Referenzmessung wird 650 nm ggf zwischen 615 und 690 nm empfohlen Testdurchf hrung mit BEP Ill Bei der Abarbeitung mit BEP Ill m ssen die Testplatten bis zur Probendosierung Punkt 1 bis 2 der Testdurchf hrung BEP II vorbereitet werden Alle folgenden Abarbeitungsschritte erfolgen vollauto matisch im Ger t siehe BEP Ill Bedienungsanleitung Platten nicht mit Folie abkleben Nach Been den der Proben Dosierung die Platte unmittelbar in den BEP III eingeben Die in der BEP Ill Software eingestellten Inkubationszeiten k nnen auf Grund der technischen Rah menbedingungen Ger tetaktung von denen der BEP Il Prozessierung abweichen sind jedoch in der Kombination BEP III Enzygnost v
16. Testdurchf hrung m ssen von dem Anti HAV Standard Serum 80 folgende Ver d nnungen mit dem Anti HAV Kontroll Serum negativ hergestellt werden 40 IUA Verd nnung 1 2 z B 100 ul Anti HAV Standard Serum 80 100 ul Anti HAV Kontroll Serum negativ 20 IU I Verd nnung 1 4 z B 100 ul des 40 IU Standards 100 ul Anti HAV Kontroll Serum negativ 10 IU I Verd nnung 1 8 z B 100 ul des 20 IU I Standards 100 ul Anti HAV Kontroll Serum negativ Bei zu erwartenden Anti HAV Konzentrationen von gt 60 IU I m ssen die Seren oder Plasmen wie folgt verd nnt werden Bis 600 IU I Verd nnung 1 11 z B 10 ul Probe 100 ul Anti HAV Kontroll Serum negativ Bis 6 000 IU I Verd nnung 1 101 z B 10 ul Probe 1 000 ul Anti HAV Kontroll Serum negativ Bis 60 000 IU I Verd nnung 1 1111 z B 10 ul Probe 1 000 ul Anti HAV Kontroll Serum negativ daraus 10 ul 100 ul Anti HAV Kontroll Serum negativ Alle notwendigen Verd nnungsschritte sind nur mit dem zugeh rigen Anti HAV Kontroll Serum nega tiv durchzuf hren Konjugat Gebrauchsl sung Dem Anti HAV POD Konjugat ist die ben tigte Menge zu entnehmen und mit dem Konjugat Puffer Anti HAV 1 40 zu verd nnen Je Testplatte 150 ul Anti HAV POD Konjugat zu einer Originalabf llung 6 ml Konjugat Puffer Anti HAV zugeben Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Unge ffnet sind alle Bestandteile der Kombinationspackung Enzygnost Anti HAV bei einer Lager temperatur von
17. before testing Do not remove the test plates from the container while doing this For each test plate dilute 20 mL of Washing Solution POD concentrate with 400 mL distilled or deionized water Working Chromogen Solution For each test plate dilute 1 mL of Chromogen TMB with 10 mL of Buffer Substrate TMB in the empty bottle supplied with the kit and store closed and protected from light Rinse the bottle thoroughly with distilled water after use For technical reasons overfill it is not permissible to pour together the full contents of the Chromogen TMB vial and the full contents of the Buffer Substrate TMB vial OQEC G11 C0540 513 H 3 e IT EN TEA For the quantitative test the following dilutions of the Anti HAV Standard Serum 80 must be prepared using the Anti HAV Control Serum negative 40 IU L dilute 1 2 e g 100 uL Anti HAV Standard Serum 80 100 uL Anti HAV ControlSerum negative 20 IU L dilute 1 4 e g 100 uL of the 40 IU L standard 100 uL Anti HAV Control Serum negative 10 IU L dilute 1 8 e g 100 uL of the 20 IU L standard 100 uL Anti HAV Control Serum negative In the case of sera or plasma samples with expected Anti HAV concentrations of gt 60 IU L the samples must be diluted as follows Up to 600 IU L dilute 1 11 e g 10 uL sample 100 uL Anti HAV Control Serum negative Up to 6000 IU L dilute 1 101 e g 10 uL sample 1000 uL Anti HAV Control Serum negative Up to 60 00
18. cut off 10 Epope lt cut off 10 grenzwertig Proben die in der initialen Testung mit Extinktionswerten in einem Bereich von 10 des Grenzwer tes grenzwertiger Bereich reagieren m ssen als vorl ufig grenzwertig betrachtet werden Zur Abkl rung des Ergebnisses muss die Probe erneut diesmal jedoch in Doppelbestimmung getestet werden Ist in der Wiederholungstestung der Mittelwert der Doppelbestimmung kleiner als der Grenzwert 10 96 bzw gr er als der Grenzwert 10 so kann das initial grenzwertige Ergebnis vernachl ssigt werden und die Probe als positiv bzw negativ betrachtet werden Ist auch danach keine Zuordnung der Proben als positiv oder negativ m glich lautet das Testergebnis grenzwertig Quantitativer Test Zur quantitativen Auswertung werden die Extinktionsmittelwerte aus den Doppelbestimmungen der Standardreihe 10 20 40 und 80 IU I gebildet Anhand dieser Standardkurve wird die Anti HAV Konzentration der Probe abgelesen Wurde die Probe verd nnt so muss die anhand der Standardkurve abgelesene Konzentration mit dem Verd nnungsfaktor multipliziert werden Einschr nkungen der Testdurchf hrung 1 Natriumazid haltiges Patientenmaterial darf nicht verwendet werden 2 Mikrobiell kontaminierte Proben sollten nicht verwendet werden 3 Antikoagulanzien wie Heparin EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht 4 Lip mische h molytische Rheumafaktor haltige und ANA haltige Proben sow
19. ecc Enzygnost e BEP sono marchi registrati della Dade Behring Marburg GmbH negli Stati Uniti Germania e altri paesi Dade Behring Marburg GmbH Emil von Behring Str 76 D 35041 Marburg www dadebehring com Tab 1 Enzygnost Anti HAV Conservazione e validit Campioni Reagenti Condizioni Conservazione Stabilit Enzygnost Anti HAV dopo apertura 2 48 C 6 settimane piastra test pozzetti rimanenti nel sacchetto con l essiccante Coniugato anti HAV POD dopo apertura 2 8 C 4 settimane Tampone coniugato dopo apertura 2 8 C 4 settimane Coniugato diluito 1 40 2 48 C 4 settimane pronto per l uso 18 25 C 1 settimana Antigene HAV dopo apertura 2 8 C 4 settimane Siero standard anti HAV 80 dopo apertura 2 8 C 4 settimane Siero di controllo anti HAV negativo lt 20 C 3 mesi Diluizione dello standard anti HAV dopo l aggiunta 40 20 10 UI L del siero st 2 48 C 4 settimane d anti HAV 80 appena aperto Cromogeno TMB dopo apertura 2 48 C data di scadenza Tampone Substrato TMB dopo apertura 2 8 C data di scadenza Soluzione d uso di cromogeno 1 10 2 8 C 5 giorni 18 25 C 8 ore ben chiuso protetto dalla luce Soluzione di lavaggio POD dopo apertura 2 48 C data di scadenza concentrata 1 20 2 8 C 1 settimana 1 20 18 25 C 1 giorno Soluzione bloccante POD dopo apertura 2 8 C data di scadenza OQEC G1
20. enzimatica del substrato e del cromogeno reazione di colore blu viene interrotta mediante l aggiunta di soluzione bloccante POD reazione di colore giallo L intensit del colore sviluppato inversamente proporzionale alla concentrazione degli anticorpi presenti nel campione in esame Reagenti Materiali forniti Enzygnost Anti HAV 1 x 96 Enzygnost Anti HAV piastra test 1 pz Coniugato Anti HAV POD 1x0 4 mL Tampone coniugato Anti HAV 2x6mL Antigene HAV 2x6mL Siero standard Anti HAV 80 1x0 5mL Siero di controllo Anti HAV negativo 1x6mL Soluzione di lavaggio POD concentrato 1x 100 mL Tampone substrato TMB 1x30mL Cromogeno TMB 1x3mL Soluzione bloccante POD 1x100 mL Flacone vuoto per soluzione d uso del cromogeno 1 pz Fogli adesivi 6 pz Sacchetti in PE per la conservazione delle file di pozzetti no utilizzate 1 pz Tabella con i codici a barre 1 pz Istruzioni per l uso 1 pz OQEC G11 C0540 513 H 26 Edizione Marzo 2003 IT MEN TIA Composizione Enzygnost Anti HAV piastra test Piastra per microtitolazione sensibilizzata con anticorpi umani contro l antigene del virus dell epatite A Coniugato anti HAV POD Anticorpo anti HAV monoclonale topo coniugato con perossidasi POD in soluzione tampone Tris 0 05 mol L Diluizione d uso 1 40 in tampone coniugato anti HAV Conservante fenolo mass 1 g L Tampone coniugato anti HAV per diluire il coniugato anti HAV POD contiene glicerina 100 g L Tw
21. im Anhang zusammengefa t Bei der Ermittlung der Sensitivit t wurden insgesamt 878 Anti HAV positive Proben untersucht und eine Sensitivit t von 98 5 bis 100 initiale Testung bzw 99 0 100 Retestung ermittelt Die Reaktivit t des Tests bei Serokonversionsproben wurde anhand von 12 Serokonversionspanels unter sucht Dabei zeigte sich dass Enzygnost Anti HAV eine Sensitivit t bez glich der Erkennung von Serokonversionen aufweist die der Empfindlichkeit eines vergleichbaren Tests entspricht OQEC G11 C0540 513 H 14 e IT MEN TEA Die analytische Sensitivit t wurde am internationalen Standard der WHO mit lt 20 IU I ermittelt Unabh ngig davon kann nicht ausgeschlossen werden dass sich bei breiter Anwendung des Tests einzelne Proben dem Nachweis entziehen k nnen Bei der Ermittlung der Spezifit t wurden insgesamt 586 Anti HAV negative Blutproben untersucht und eine Spezifit t von 96 6 bis 100 initiale Testung bzw 98 3 bis 100 Retestung ermittelt Bedingt durch das Untersuchungskollektiv die Testdurchf hrung u a sind abweichende Werte m glich Nach derzeitigem Kenntnisstand kann aus einem positiven Ergebnis der Anti HAV Testung nicht mit Sicherheit abgeleitet werden dass eine Hepatitis A Infektion bzw eine bestehende Immunit t vorliegt wie auch ein negatives Testergebnis das Vorliegen einer Hepatitis A Infektion oder einer bestehenden Immunit t nicht sicher ausschlie t Reproduzierbarkeit
22. n o for poss vel classificar as amostras como positivas ou negativas o resultado do teste ser duvidoso Teste quantitativo Para a determinac o quantitativa determinam se os valores m dios de extinc o das duplas determina es da s rie standard de 10 20 40 e 80 UI A concentrac o de Anti HAV na amostra lida com base nesta curva standard Se a amostra tiver sido dilu da a concentrac o lida com base na curva standard tem de ser multiplicada pelo factor de dilui o Limitac es de execuc o do teste 1 N o pode ser utilizado material de pacientes contendo azida de s dio 2 As amostras contaminadas por micr bios n o devem ser utilizadas 3 Os anticoagulantes como heparina EDTA e citrato n o influenciam o resultado do teste 4 As amostras lip micas hemoliticas ou que contenham factor reumat ide e ANA ou tenham sido inactivadas pelo calor 1h 56 C n o prejudicam o teste 5 O tamp o substrato TMB a solu o de uso cromog nio e a solu o de bloqueio POD n o devem entrar em contacto com i es de metais pesados nem subst ncias oxidantes n o usar pipetas com partes met licas condutoras de l quido N o efectuar as reacc es do substrato na proximidade de desinfectantes que contenham hipoclorito 6 Uma colorac o azul espont nea da soluc o de uso cromog nio antes de esta ser colocada na placa de ensaio amp indicio de contaminac o dever ent o preparar se uma soluc o fresca num re
23. ne TMB avec 10 ml de Tampon Substrat dans le flacon plastique vide joint au coffret et conserver la solution l abri de la lumi re Apr s emploi bien rincer le flacon avec de l eau distill e Pour des raisons techniques de capacit des flacons il n est pas possible de verser le contenu d un flacon de Chromog ne TMB dans un flacon de Tampon Substrat TMB ni inversement Pour une exploitation quantitative du test pr parer les dilutions suivantes du S rum standard Anti HAV 80 avec le S rum de contr le Anti HAV n gatif 40 IU I dilution au 1 2 par ex 100 ul de S rum standard Anti HAV 80 100 ul de S rum de contr le Anti HAV n gatif 20 IU dilution au 1 4 par ex 100 ul de S rum standard 40 UI 100 ul de Serum de contr le Anti HAV n gatif 10 IU dilution au 1 8 par ex 100 ul de Serum standard 20 UI I 100 ul de Serum de contr le Anti HAV n gatif Si on s attend des concentrations d anti HAV gt 60 UI I diluer les serums ou les plasmas aux dilutions suivantes eod 600 UI I dilution au 1 11 par ex 10 ul d chantillon 100 ul de Serum de contr le Anti HAV n gatif Jusqu 6000 UI I dilution au 1 101 par ex 10 ul d chantillon 1000 ul de S rum de contr le Anti HAV n gatif Jusqu 60 000 UI I dilution au 1 1111 par ex 10 ul d chantillon 1000 ul de Serum de contr le Anti HAV n gatif puis 10 ul de ce m lange 100 ul de Serum de contr le anti HAV n gatif
24. negativo correspondiente Soluci n de uso del conjugado Tomar la cantidad necesaria del conjugado Anti HAV POD y diluirlo 1 40 con el tamp n para conjugado Anti HAV por cada placa de prueba agregar 150 ul de conjugado Anti HAV POD a un frasco original 6 ml de tamp n para conjugado Anti HAV Estabilidad y almacenaje Todos los componentes del embace combinado Enzygnost Anti HAV a n cerrados conservados a una temperatura entre 2 y 8 C son utilizables hasta las fechas de vencimiento dadas en las etiquetas La estabilidad y las condiciones de almacenamiento de los envases ya abiertos o de los reactivos ya diluidos listos para el uso se pueden tomar de la Tabla 1 del anexo Equipo necesario BEP Il Para la realizaci n autom tica de la distribuci n de los reactivos y de las etapas de lavado BEP Ill Para la realizaci n autom tica del test despu s de distribuir las muestras as como para la valoraci n BEP 2000 Para la realizaci n y valoraci n completamente autom tica del test Pipetas Pipetas de mbolo 20 50 100 y 1000 ul Incubador Ba o de agua cubierto 37 1 C Procedimiento Procedimiento en el BEP Il 1 Esquema de distribuci n Determinar el n mero necesario de pocillos de la placa n mero de muestras a investigar 6 pocillos para los controles Los elementos de la placa de prueba no utilizados se deben retirar del marco que los contiene y almacenarse para ser usados posteriorment
25. parations obtenues partir de sang humain doivent tre manipul es avec les pr cautions n cessaires en cas de risque biologique dans la mesure o l on ne peut exclure totalement un risque d infection 5 3 Lantig ne HAV isol partir de fibroblastes humains a t pr par selon une proc dure d inactivation virale reconnue traitement par la B propiolactone Par s curit il est toutefois recommand de manipuler l antig ne HAV avec toutes les pr cautions n cessaires 5 4 Il est recommand de porter des gants de protection pendant toute la r alisation du test 5 Pour d contaminer le mat riel de laboratoire infect l autoclaver pendant au moins 1 heure 121 C Toutes les solutions aspir es doivent tre r colt es dans deux r cipients reli s l un l autre et contenant chacun un d sinfectant sp cialement pr vu pour inactiver les virus pathog nes pour l Homme Respecter les concentrations et temps d incubation indiqu s par le fabricant du d sinfectant utilis OQEC G11 C0540 513 H 19 E e IT E U ILS Pr paration des r actifs Porter tous les r actifs et chantillons une temp rature comprise entre 18 et 25 C avant le d but du test sans sortir la plaque test de son emballage Pour une plaque diluer 20 ml de Solution de lavage concentr e avec le l eau distill e ou d sionis e en completant a 400 ml Solution d emploi du Chromog ne pour une plaque diluer 1 ml de Chromog
26. serums n gatifs normaux 50 0 0 chantillons plasmatiques 50 0 0 n gatifs normaux K s rums n gatifs normaux 176 6 3 s rums n gatifs normaux 310 9 5 Tab 4 Reproductibilit Dans l tude de reproductibilit es chantillons ont t test s 8 fois sur 5 jours Le calcul des coefficients de variation CV a t effectu selon le mod le de variance plusieurs facteurs chantillon Valeur moyenne CV de densit optique D O R p tabilit Reproductibilit F1 1 203 3 6 7 8 F2 0 607 5 0 9 2 F3 0 331 9 4 7 8 F4 0 115 8 3 16 6 OQEC G11 C0540 513 H 24 ME II CEE Tabl 5 R alisation du test et programmation Enzygnost Anti HAV R alisation du test BEP Il BEP Ill BEP 2000 Programmation du menu pour le pr paration des r actifs BEP 2000 4 x 25 ul de Serum de contr le n gatif 2 x 25 ul de S rum de standard 80 25 ul de chaque chantillon BEP Il BEP Ill compl ter ventuellement la plaque a mi plaque y BEP Il MENU NO OPERATE 1 YES DISTRIBUTION DU ANTIGENE WASHINGS 0 ASPIRATE NO SOAKTIME 0 DISP VOL 50 CHANNEL NO 3 PHOT NO OPERATE 2 YES DISTRIBUTION DU CONJUGUE WASHINGS 0 ASPIRATE NO SOAKTIME 0 DISP VOL 50 CHANNEL NO 2 PHOT NO OPERAT
27. terminar la dosificaci n de las muestras continuar inmediatamente con adici n del ant geno 3 Dosificaci n del ant geno A adir a las muestra ya agregadas en cada pocillo 50 ul de la soluci n de ant geno y seguir de inmediato con la dosificaci n del conjugado 4 Dosificaci n del conjugado Igualmente a adir 50 ul de soluci n de uso del conjugado a cada muestra y ant geno ver advertencia cubrir la placa de prueba con la l mina adhesiva y colocar directamente en el incubador Advertencia Para evitar resultados falsos en el procedimiento manual la dosificaci n del conjugado debe hacerse de tal manera que la punta de la pipeta no toque el borde de la cavidad y no entre en contacto con el l quido de la muestra 5 Incubaci n Incubar 2 horas 5 min a 37 1 C Lavar inmediatamente despu s 6 LavadoRetirar la l mina adhesiva aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar 4 veces con aprox 0 3 ml de la soluci n de lavado cada vez Despu s de la ltima etapa continuar inmediatamente con la dosificaci n de los reactivos para evitar sequedad 7 Distribuci n del sustrato Agregar en cada pocillo 100 ul de soluci n de crom geno lista para el uso Cubrir la placa con una nueva l mina adhesiva 8 Incubaci n del sustrato Incubar 30 2 min entre 18 y 25 C protegiendo de la luz 9 Reacci n de detenimiento Retirar la l mina adhesiva y agregar en cada pocillo 100 ul de soluci n de detenimiento POD mantener
28. 0 IU L dilute 1 1 111 e g 10 uL sample 1 000 uL Anti HAV Control Serum negative then 10 uL thereof 100 uL Anti HAV Control Serum negative All the necessary dilutions must be prepared using only the relevant Anti HAV control serum negative Working Conjugate Solution Withdraw the necessary volume of Anti HAV POD Conjugate and dilute 1 40 with Conjugate Buffer Anti HAV For each test plate add 150 uL Anti HAV POD Conjugate to an original vial 6 mL of Conjugate Buffer Anti HAV Storage and Stability Stored unopened at 2 to 8 C all components of the Enzygnost Anti HAV test kit may be used up to the date of expiry given on the labels For complete stability and storage data for reagents that have been opened or diluted for use see Table 1 in the Appendix Equipment Required BEP II For automatic dispensing of reagent and washing BEP Il For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as for evaluation BEP 2000 For fully automatic processing and evaluation of the test Pipettes Piston type pipettes 25 50 100 and 1000 uL Incubator Covered water bath 37 1 C Procedure Procedure for the BEP Il 1 Pipetting scheme Ascertain the number of wells required number of samples to be investigated plus 6 wells for controls Remove from the holder any strips which are not required for the test and store for later use See Table 1 for stability data For the quantitative t
29. 1 C0540 513 H 31 in nessun caso oltre la data di scadenza e MES II E E Tab 2 Sensibilita Nella valutazione della sensibilit sono stati ottenuti in due centri indipendenti K M i seguenti dati Insieme di campioni Numero di Reattivita iniziale Reattivita dopo campioni ripetizione M Anti HAV pos 30 30 30 Anti HAV pos Plasmi 30 30 30 Anti HAV IgG pos 157 157 157 Anti HAV IgM pos 84 84 84 Sieroconversione 12 la sensibilit corrisponde a quella di test analoghi K Anti HAV pos 204 204 204 Anti HAV pos 205 202 203 Anti HAV pos 168 166 167 Tab 3 Specificita Nella valutazione della specificit sono stati ottenuti in due centri indipendenti K M i seguenti risultati Insieme di campioni Numero di Reattivita iniziale Reattivita dopo campioni ripetizione M Sieri normali negativi 50 0 0 Plasmi normali negativi 50 0 0 K Sieri normali negativi 176 6 3 Sieri normali negativi 310 9 5 Tab 4 Riproducibilita Nella valutazione per la riproducibilita i campioni sono stati analizzati ripetendo le determinazioni 8 volte per 5 giorni E stato trovato un coefficiente di variazione CV secondo il modello del componente della varianza Campioni Valore medio E CV Intra assay Inter assay F1 1 203 3 6 7 8 F2 0 607 5 0 9 2 F3 0 331 9 4 7 8 F4 0 115 8 3 16 6 OGEC G11 C0540 513 H 32 Psst EEE E EC TT I9 Tabella 5 Esecuzione
30. 1 C0540 513 H 40 MES II E EC Tabla 5 Realizaci n de la prueba y programaci n Enzygnost Anti HAV Procedimiento BEP Il BEP Ill BEP 2000 Programaci n para el Preparaci n de los reactivos BEP Il BEP 2000 MENU NO 4 x 25 ul de suero control negativo OPERATE 1 YES 2 x 25 pl de suero est ndar 80 DOSIFICACI N DEL ANT GENO 25 ul de muestra WASHINGS 0 ASPIRATE NO SOAKTIME 0 DISP VOL 50 BEP Il BEP Ill CHANNEL NO 3 PHOT NO OPERATE 2 YES fraccionadas a medias DOSIFICACI N DEL CONJUGADO 50 ul de ant geno placas con elementos WASHINGS con agua ASPIRATE NS SOAKTIME 0 DISP VOL 50 50 ul de conjugado diluido CHANNEL NO 2 listo para el uso PHOT NO V OPERATE 3 YES pet on LAVADO E Y DOSIFICACI N CEE DEL CHROM GENO y WASHINGS 4 ASPIRATE NO 4 lavar BEP II m SOAKTIME 0 m DISP VOL 100 CHANNEL NO 4 100 ul de sol de uso PHOT NO del crom geno OPERATE 4 YES y DOSIFICACI N SOLUCI N DE DETENIMIENTO 30 min 2 min WASHINGS 0 entre 18 y 25 C ASPIRATE NO protegido de la luz SOAKTIME 0 4 DISP VOL 100 CHANNEL NO 5 100 ul de sol de detenimiento PHOT YES 4 MEAS WL 450 m ximo 1 h despu s REE We se y EVAL MODE 4 GEN C
31. 1 Schema di distribuzione definire il numero dei pozzetti necessari numero dei campioni da esaminare pi 6 pozzetti per i controlli Togliere le file di pozzetti non utilizzate e conservarle per un successivo impiego v Tab ella 1 Per il test quantitativo allestire una curva di calibrazione v Lavoro di preparazione le cui concentrazioni vanno rispettivamente esaminate in doppio in tal caso il numero dei campioni necessari dato dal numero dei campioni da esaminare pi 12 pozzetti per i controlli e gli standard OQEC G11 C0540 513 H 28 IT ED U TIA 2 Distribuzione dei campioni Test qualitativo distribuire 25 uL pozzetto di siero di controllo anti HAV negativo in ciascuno dei primi 4 pozzetti da A1 a D1 25 uL di siero standard anti HAV 80 nei due pozzetti successivi da E1 a F1 e distribuire in ognuno dei successivi pozzetti 25 uL di campione In alternativa allo schema di distribuzione sopra riportato possibile distribuire il siero standard anti HAV 80 all inizio ed alla fine della serie Schema di distribuzione distribuire 25 mL pozzetto di siero di controllo anti HAV negativo in 4 pozzetti 25 uL di siero standard anti HAV 80 nel pozzetto successivo quindi distribuire 25 uL pozzetto del campione nei pozzetti successivi Alla fine della serie piastra distribuire ancora 25 pautL di siero standard anti HAV 80 Test quantitativo distribuire 25 uL pozzetto di siero di controllo anti HAV negativo in cia
32. 10 uL campione 1000 uL siero di controllo anti HAV negativo fino a 60000 UI L diluizione 1 1111 es 10 uL campione 1000 uL siero di controllo anti HAV negativo 10 uL di questa diluizione 100 uL di siero di controllo anti HAV negativo Tutte le fasi di diluizione necessarie vanno preparate usando solo il relativo siero di controllo anti HAV negativo Soluzione d uso del coniugato prelevare il quantitativo necessario di coniugato anti HAV POD e diluirlo 1 40 con il tampone coniugato anti HAV Aggiungere per ogni piastra test 150 uL di coniugato anti HAV POD in una confezione originale 6 mL di tampone coniugato anti HAV Conservazione e validit Prima dell apertura tutte le componenti della confezione Enzygnost Anti HAV possono essere utilizzate fino alla data di scadenza indicata in etichetta purch conservate a 2 8 C I dati completi relativi alla conservazione e alla stabilit dei reagenti diluiti sono riportati nella Tabella 1 in appendice Apparecchiature richieste BEP Il Per la distribuzione automatica del reagente e per il lavaggio BEP Ill Per l esecuzione automatica del test dopo distribuzione del campione e per la valutazione dei risultati BEP 2000 Per l esecuzione completamente automatica del test e la valutazione dei risultati Pipette Pipette a stantuffo da 25 50 100 e 1000 uL Incubatore bagnomaria coperto 37 1 C Esecuzione del test Esecuzione del test con BEP Il
33. 2 bis 8 C bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten verwendbar Die Haltbarkeit und Lagerbedingungen der ge ffneten bzw gebrauchsverd nnten Reagenzien sind der Tabelle 1 im Anhang zu entnehmen Erforderliche Ger te BEP II Zur automatischen Durchf hrung der Reagenzien Dosierung und der Waschschritte BEP Ill Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendispensierung sowie Auswertung BEP 2000 Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung Pipetten Kolbenhubpipetten 25 50 100 und 1000 ul Inkubator Bedecktes Wasserbad 37 1 C Testdurchf hrung Testdurchf hrung mit BEP Il 1 Ansatzschema Ben tigte Anzahl der Auftragsstellen feststellen Anzahl der zu untersuchenden Proben plus 6 Ver tiefungen f r Kontrollen F r die Testdurchf hrung nicht ben tigte Riegel dem Halterahmen ent nehmen und f r die sp tere Verwendung lagern siehe Tabelle 1 Bei quantitativer Testauswertung wird eine Standardkurve erstellt siehe vorbereitende Arbeiten deren einzelne Konzentrationen jeweils als Doppelbestimmung eingesetzt werden in diesem Fall Anzahl der zu untersuchenden Proben plus 12 Vertiefungen f r Kontrollen und Standardreihe 2 Probendosierung Qualitativer Test In 4 Vertiefungen A1 bis D1 je 25 ul Anti HAV Kontroll Serum negativ in 2 Vertiefungen E1 und F1 je 25 ul Anti HAV Standard Serum 80 und in die folgenden Vertiefungen je 25 ul Probe pipettieren Alternativ zu oben aufgef hrtem Pipetti
34. Behring Str 76 D 35041 Marburg www dadebehring com Tabla 1 Estabilidad y almacenaje Enzygnost Anti HAV Anti HAV 40 20 10 UI con suero est ndar 80 Anti HAV recien abierto Material Reactivos Estado Almacenamiento Estabilidad Enzygnost Anti HAV Abierto entre 2 y 8 C en el 6 semanas placa de prueba envase con c psulas elementos restantes deshidratantes Conjugado Anti HAV POD Abierto entre 2 y 8 C 4 semanas Tampon para Conjugado Abierto entre 2 y 8 C 4 semanas Conjugado diluido listo 1 40 entre 2 y 8 C 4 semanas para usar entre 18 y 25 C 1 semana Ant geno HAV Abierto entre 2 y 8 C 4 semanas Suero est ndar 80 Anti HAV Abierto entre 2 y 8 C 4 semanas Suero control Anti HAV negativo lt 20 C 3 meses Diluciones de est ndar Anti HAV Despu s de preparar entre 2 y 8 C 4 semanas Chrom geno TMB Abierto entre 2 y 8 C hasta la fecha de vencimiento Tamp n sustrato TMB Abierto entre 2 y 8 C hasta la fecha de vencimiento Soluci n de uso del Crom geno 1 10 entre 2 y 8 C 5 d as entre 18 y 25 C 8 horas en recipiente cerrado protegido de la luz Soluci n de lavado POD Abierto entre 2 y 8 C hasta la fecha de concentrado vencimiento 1 20 entre 2 y 8 C 1 semana 1 20 entre 18 y 25 C 1 dia Soluci n de detenimiento POD Abierto entre 2 y 8 C hasta la fecha de vencimiento OQEC G11 C0540 513 H 39 e
35. Die Ergebnisse zur Intra Inter assay Reproduzierbarkeit sind in der Tabelle 4 im Anhang zusammengefasst Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten Abh ngig von der Test durchf hrung u a sind durchaus abweichende Werte m glich Enzygnost und BEP sind eingetragene Marken der Dade Behring Marburg GmbH in den USA Deutschland und anderen L ndern Dade Behring Marburg GmbH Emil von Behring Str 76 D 35041 Marburg www dadebehring com Tab 1 Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Enzygnost Anti HAV Ce Material Reagenz Zustand Lagerung Stabilit t Enzygnost Anti HAV nach Offnen 2 bis 8 C 6 Wochen Testplatte restliche Riegel im Beutel mit Trockenkapseln Anti HAV POD Konjugat nach ffnen 2 bis 8 C 4 Wochen Konjugat Puffer nach ffnen 2 bis 8 C 4 Wochen gebrauchsfertig verd nntes 1 40 2 bis 8 C 4 Wochen Konjugat 18 bis 25 C 1 Woche HAV Antigen nach ffnen 2 bis 8 C 4 Wochen Anti HAV Standard Serum 80 nach ffnen 2 bis 8 C 4 Wochen Anti HAV Kontroll Serum negativ lt 20 C 3 Monate Anti HAV Standard nach Ansatz mit 2 bis 8 C 4 Wochen Verd nnung frisch ge ffnetem 40 20 10 IU I Anti HAV Stan dard Serum 80 Chromogen TMB nach ffnen 2 bis 8 C bis Verfalldatum Puffer Substrat TMB nach ffnen 2 bis 8 C bis Verfalldatum Chromogen Gebrauchsl sung 1 10 2 bis 8 C 5 Tage 18 bis 25 C 8 Stunden geschlossen
36. E 3 YES LAVAGE ET DISTRIBUTION DU CHROMOGENE WASHINGS 4 ASPIRATE NO SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL NO 4 PHOT NO OPERATE 4 YES 50 ul de l antig ne avec des barrettes y remplies d eau 50 ul Conjugu la dilution d emploi 120 mina 5 min 37 1 C 4 lavages BEP Il r alisation automatique du test 100 ul de solution d emploi du chromogene DISTRIBUTION DE LA SOLUTION D ARRET i i WASHINGS 0 2 nee x ASPIRATE NO l abri de la lumi re SOAKTIME 0 DISP VOL 100 V CHANNEL NO 5 100 ul de solution d arr t PHOT YES 4 MEAS WL 450 REF WL 650 BLK COR NO EVAL MODE 4 y GEN CUT NO exploitation a 450 nm N CONT 4 longueur donde de reference 650 nm MIN NEG 0 700 J FACT NEG 0 5 MAX POS 0 300 r sultat du test THRESH CUT OFF OQEC G11 C0540 513 H 25 IT E ILS Enzygnost Anti HAV Uso previsto Metodo immunoenzimatico per l identificazione degli anticorpi contro l antigene del virus dell epatite A nel siero e nel plasma Il test immunoenzimatico viene eseguito sugli analizzatori BEP II BEP Ill e BEP 2000 ELISA Il test stato sviluppato per analizzare campioni singoli e non pool di campioni Il prodotto soltanto per uso diagnostico in vitro Significato diagnostico All insorgere di un infezione da epatite A l attivit degli anticorpi anti HAV sempre elevata 234 Un risultato negativo in un paziente
37. H 29 IT A E TIA Validita del test I singoli valori di estinzione dei sieri di controllo negativi vengono utilizzati per calcolare il valore medio quando Eneg 2 0 700 0 010 lt Esrgo lt 0 300 Se uno dei valori di estinzione del siero di controllo anti HAV negativo non rientra nell ambito indicato pu essere trascurato valori di estinzione del siero standard 80 devono rientrare entrambi nell ambito indicato Se queste condizioni non vengono rispettate il test deve essere ripetuto Valutazione del test Sul BEP 2000 e BEP Ill il calcolo dei risultati viene eseguito automaticamente Consultare i rispettivi manuali d uso Per la valutazione dei risultati senza l utilizzo del software consultare i seguenti paragrafi Test qualitativo Calcolare il valore di estinzione medio del siero di controllo anti HAV negativo quindi calcolare il cut off moltiplicando per un fattore di 0 5 Ene X 0 5 cut off neg Viene definito ambito dubbio cut off 10 Secondo i criteri del test i campioni in esame vengono cosi classificati Risultato del test 1 E gt cut off 10 negativo 2 E lt cut off 10 positivo 3 cut off 10 Ecampione lt Cut off 10 dubbio campioni che nel test iniziale reagiscono con valori di estinzione in un ambito di 10 del cut off ambito dubbio devono essere considerati temporaneamente dubbi Per definire il risultato il test deve essere ripetuto ma questa volta in d
38. HOT NO _ _ OPERATE 4 YES E mins e min DISPENSE STOPPING SOLUTION u WASHINGS 0 protected from light ASPIRATE NO SOAKTIME 0 1 100 ul Stopping Solution NET NO 20 PHOT YES aftermax 1h 5 MEAS WL BLK COR NO Evaluate at 450 nm EVALM IODE NO Referenewavelength 650 nm NEG CONT 4 MAX NEG MIN NEG 0 700 FACT NEG 0 5 MAX POS 0 300 Testresult THRESH CUT OFF OQEC G11 C0540 513 H 9 IT E ILS Enzygnost Anti HAV Anwendungsbereich Enzymimmunoassay zum Nachweis von Antik rpern gegen Hepatitis A Virus Antigen in Serum und Plasma Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP Il BEP Ill und BEP 2000 Der Test wurde entwickelt f r die Untersuchung von Einzelproben nicht von gepoolten oder verd nnten Proben Das Produkt darf nur f r in vitro diagnostische Zwecke angewen det werden Diagnostische Bedeutung Bei Erkrankungsbeginn einer Hepatitis A 1 2 3 4 ist Anti HAV immer und meist bereits in hoher Aktivit t nachweisbar Ein negatives Ergebnis bei einem Patienten schlie t deshalb die Hepatitis A tiologie der Erkrankung aus Da Anti HAV nach einer Infektion zeitlebens nachweisbar bleibt kann mit dessen Nachweis eine bestehende Immunit t gesichert werden ein wesentliches Entscheidungs kriterium bei der Frage nach aktiver Immunisierung durch Impfung oder Einsatz von Immunglobulinen zur Postexpositionsprophylaxe bei Risikokontakten Enzygnost Anti HAV erm glic
39. MODE 4 4 GEN CUT NO NEG CONT 4 Lettura a 450 nm lunghezza MAX NEG d onda di riferimento 650 nm MIN NEG 0 700 FACT NEG 0 5 MAX POS 0 300 7 THRESH Risultati CUT OFF OQEC G11 C0540 513 H 33 IT E ILS Enzygnost Anti HAV Campos de aplicaci n y objetivos Ensayo inmunoenzim tico para el reconocimiento de los anticuerpos contra el ant geno virus de la hepatitis A en sueros y plasmas humanos La realizaci n del ensayo inmunol gico se lleva a cabo en los ELISA Prozessoren BEP II BEP III y BEP 2000 El test se desarroll para la investigaci n de muestras individuales no de muestras en pool El producto debe ser usado nicamente en diagn sticos in vitro Significado diagn stico Al comienzo de una hepatitis A 1 2 3 4 se puede reconocer siempre el anti HAV y en la mayor a de los casos con actividad muy elevada Un resultado negativo para un paciente excluye por lo tanto a la hepatitis A como la causa de la dolencia Dado que el anti HAV despu s de una enfermedad permanece reconocible toda una vida con este reconocimiento se puede garantizar la existencia de una inmunidad un criterio de decisi n muy importante para la pregunta de inmunizaci n activa mediante vacunaci n o por el uso de inmunoglobulinas para profilaxis post exposici n en contactos con riesgo El Enzygnost Anti HAV permite con la valoraci n cuantitativa en base a un suero est ndar Anti HAV curva de calibraci n
40. O lt cut off 10 positif 3 cut off 10 lt D O gchantilton cut Off 10 douteux Les Echantillons initialement trouv s dans un domaine de 10 par rapport la valeur seuil zone grise doivent tre consid r s comme provisoirement douteux Pour clarifier le r sultat retester l echantillon mais cette fois en double Si la valeur moyenne du retest est trouv e soit inf rieure a la valeur seuil 10 soit sup rieure la valeur seuil 10 le r sultat initial douteux peut amp tre n glig et l chantillon est rendu soit positif soit n gatif Si le retest ne permet toujours pas de classer l chantillon en positif ni en n gatif rendre le r sultat douteux chantillon chantillon Test quantitatif Pour une exploitation quantitative du test calculer les valeurs moyennes des dosages en double de la s rie des concentrations du standard 10 20 40 et 80 UII Lire les concentrations en anti HAV des chantillons sur la courbe d talonnage ainsi tablie Si les chantillons ont t dilu s la concentration lue sur la courbe d talonnage doit tre multipli e par le facteur de dilution Limites de r alisation du test Ne pas utiliser d chantillons de patients contenant de l azide de sodium Ne pas utiliser d chantillons contamin s Les anticoagulants comme l h parine l EDTA et le citrate n ont aucune influence sur les r sultats du test 4 L utilisation d chantillons lip mi
41. The resulting immune complex binds to the HAV specific antibodies bound to the surface of the microtitration plate After the unbound components are removed by washing the bound enzyme activity of the conjugate is measured The enzymatic reaction of the substrate and chromogen blue color reaction is stopped by the addition of Stopping Solution POD yellow color reaction The color intensity is inversely proportio nal to the concentration of antibodies in the sample Reagents Materials provided Enzygnost Anti HAV 1x 96 Enzygnost Anti HAV Test Plate 1 pcs Anti HAV POD Conjugate 1x 0 4 mL Conjugate Buffer Anti HAV 2x6mL HAV Antigen 2x6mL Anti HAV Standard Serum 80 1x 0 5 mL Anti HAV Control Serum negative 1x6mL Washing Solution POD concentrate 1x 100 mL Buffer Substrate TMB 1x 30 mL Chromogen TMB 1x3 mL Stopping Solution POD 1x 100 mL Empty bottle for Working Chromogen Solution 1 pcs Adhesive foils 6 pcs Polyethylene bag for storing unused test strips 1 pcs Barcode table of assigned values 1 pes Instructions for use 1 pcs Composition Enzygnost Anti HAV Test Plate Microtitration plate coated with human antibodies to hepatitis A virus antigen Anti HAV POD Conjugate Anti HAV monoclonal mouse peroxidase POD conjugate in Tris buffer solution 0 05 mol L Working dilution 1 40 in conjugate buffer Anti HAV Preservative Phenol max 1 g L OQEC G11 C0540 513 H 2 Edition March 2003 e IT E TEA
42. UT NO Valoraci n a 450 nm longitud NEG CONT 4 de onda de referencia 650 nm MAX NEG MIN NEG 0 700 FACT NEG 0 5 Resultado de la prueba MAX POS u 300 CUT OFF OQEC G11 C0540 513 H 41 IT E ILS Enzygnost Anti HAV Campo de aplicac o Teste imunoenzim tico para detecc o de anticorpos contra o antig nio do v rus da hepatite A no soro e no plasma O processamento do teste imunoenzim tico efectua se nos processadores ELISA BEP Il BEP Ill e BEP 2000 O teste foi desenvolvido para a an lise de amostras individuais n o de amostras pool ou dilu das O produto s pode ser utilizado para fins de diagn stico in vitro Significado diagn stico O Anti HAV sempre detect vel no in cio de uma doen a com hepatite A 1 2 3 4 e na maior parte dos casos j em elevada actividade Por isso um resultado negativo no paciente exclui da doenca a etiologia da hepatite A Uma vez que ap s uma infec o o Anti HAV permanece detect vel durante toda a vida a sua detecc o garante a exist ncia de uma imunidade o que constitui um crit rio essencial quando se coloca a quest o de uma imuniza o activa por vacina o ou administra o de imunoglobulinas como profilaxia da p s exposi o em caso de risco de contacto Mediante uma valora o quantitativa na base de soro standard Anti HAV curva de calibra o o Enzygnost Anti HAV permite obter a determina o quantitativa do teor de anticorpos anti HA
43. V expresso em Ul l segundo o standard internacional da OMS Princ pio metodol gico O Enzygnost Anti HAV um teste imunoenzim tico baseado no princ pio competitivo Os anticorpos espec ficos da amostra sob teste e os anticorpos monoclonais anti HAV conjugados com POD entram em competi o pela fixa o sobre o antig nio HAV que adicionado tamb m como componente da reac o a este teste de uma s etapa Consoante a concentra o do anticorpo espec fico da amostra a quantidade de conjugado que se aglutina com o antig nio ser maior ou menor O imunocomplexo assim formado aglutina se aos anticorpos espec ficos HAV fixados superf cie da placa de microtitula o Ap s elimina o por lavagem dos componentes n o aglutinados determinada a actividade enzim tica aglutinada do conjugado A transforma o enzim tica do substrato e cromog nio reac o crom tica azul interrompida por adi o da solu o de bloqueio POD reac o crom tica amarela A intensidade crom tica inversamente proporcional concentra o de anticorpos existente na amostra Reagentes Conte do da embalagem comercial Enzygnost Anti HAV 1x96 Enzygnost Anti HAV placa de ensaio 1 unidade Anti HAV Conjugado POD 1x0 4ml Tamp o para conjugado Anti HAV 2x6ml Antigene HAV 2x6ml Soro standard 80 Anti HAV 1x0 5 ml Soro de controlo negativo Anti HAV 1x6ml Solug o de lavagem POD concentrado 1x 100 ml Tamp o Substrato TMB 1 x
44. ada concentra o individual testada em duplicado neste caso o n mero das amostras sob teste mais 12 po os para os controlos e a gama de standards 2 Dosagem das amostras Teste qualitativo Pipetar em cada um dos 4 po os A1 a D1 25 ul de soro de controlo Anti HAV negativo em cada um dos 2 po os E1 e F1 25 ul de soro standard Anti HAV 80 e em cada um dos po os seguintes 25 ul de amostra Alternativamente ao esquema de pipeta o acima indicado permitido tamb m aplicar o soro standard Anti HAV 80 uma vez no in cio e outra vez no fim da s rie de teste OQEC G11 C0540 513 H 44 e CHE TEA Esquema de pipeta o Dosear em cada um dos 4 po os 25 ul de soro de controlo Anti HAV negativo num po o 25 ul de soro standard Anti HAV 80 em cada um dos po os seguintes 25 ul de amostra e no fim da s rie de teste ou da placa de ensaio novamente 25 ul de soro standard Anti HAV 80 Teste quantitativo Pipetar em cada um dos 4 po os A1 A2 B1 e B2 25 ul de soro de controlo Anti HAV negativo e pipetar seguidamente em cada um dos 2 pocos 25 ul de cada uma das concentra es do soro standard Anti HAV 80 C1 e C2 40 D1 e D2 20 E1 e E2 e 10 F1 e F2 UI Dosear em cada um dos po os seguintes 25 ul de amostra consoante a necessidade eventualmente pr diluida Imediatamente ap s a conclus o da dosagem das amostras proceder adic o do antigene 3 Dosagem de antigene Juntar a cada poco exposto 50 ul de
45. ado Anti HAV POD e diluir a 1 40 com o tamp o para conjugado Anti HAV Adicionar por placa de ensaio 150 ul de conjugado Anti HAV POD a um frasco original 6 ml de tamp o para conjugado Anti HAV Estabilidade e condi es de conserva o N o abertos e se conservados entre 2 e 8 C todos os componentes da embalagem combinada Enzygnost Anti HAV podem ser utilizados at ao termo dos prazos de validade indicados nos r tulos A estabilidade e condi es de conserva o dos reagentes abertos ou dilu dos para uso podem ser consultados na tabela 1 em anexo Instrumentos necess rios BEP II Para a execu o autom tica da dosagem de reagentes e passos de lavagem BEP Il Para processamento autom tico e interpreta o do teste ap s a dosagem das amostras BEP 2000 Para o processamento e interpreta o do teste de forma integralmente autom tica Pipetas Pipetas de mbolo de 25 50 100 e 1000 ul Incubadora Banho maria coberto 37 1 C Execu o do teste Execu o do teste com BEP II 1 Esquema de prepara o Determinar o n mero necess rio de pontos de aplica o n mero das amostras a analisar mais 6 po os para controlos Para a execu o do teste retirar do caixilho de suporte as fileiras de po os desnecess rias e conserv las para utiliza o posterior veja a tabela 1 Para a interpreta o quantitativa do teste estabelecer uma curva standard veja trabalhos preparat rios em que c
46. alidiert worden Testdurchf hrung mit BEP 2000 Die Probendosierung und die anschlieBende Testabarbeitung erfolgen vollautomatisch im Ger t sie he BEP 2000 Bedienungsanleitung 99 Testvalidierung Die Einzelwerte der Extinktionen f r die Kontroll Sera werden zur Berechnung der Mittelwerte einge setzt wenn Eneg 20 700 0 010 lt Esrgo x 0 300 Von den Extinktionswerten des Anti HAV Kontroll Serums negativ kann ein au erhalb der Spezifikati on liegender Wert vernachl ssigt werden Die Extinktionswerte des Standard Serums 80 m ssen beide die Spezifikationen erf llen Werden diese Bedingungen nicht erf llt ist der Test zu wiederholen Testauswertung Die Auswertungen erfolgen mit dem BEP 2000 oder BEP Ill automatisch Bitte dazu die Bedienungs anleitungen heranziehen Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterst tzung zu beachten OQEC G11 C0540 513 H 13 e IT ED N A Qualitativer Test Aus den Extinktionswerten des Anti HAV Kontroll Serums negativ wird der Mittelwert gebildet Zur Grenzwertberechnung wird der Extinktionsmittelwert des Anti HAV Kontroll Serums negativ mit dem Faktor 0 5 multipliziert E og X 0 5 Grenzwert cut off Als grenzwertiger Bereich wird definiert Grenzwert 10 Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert Testergebnis 1 Eprobe gt Cut off 10 negativ 2 Eprobe lt cut off 10 positiv 3
47. alor indicativo de extinc o gt 0 7 Conservante Fenol m x 1 g l Soluc o de lavagem POD concentrado Solu o tamp o de fosfato 90 mmol l contendo Tween 18 g l Conservante Fenol m x 1 g l Tamp o Substrato TMB Per xido de hidrog nio aprox 0 1 g l em soluc o tamp o de acetato 25 mmol l Conservante n butanol m x 1 96 Cromog nio TMB Diidrocloreto de tetrametilbenzidina 5 g l Soluc o de bloqueio POD cido sulf rico 0 5 N Os reagentes com excepc o da soluc o de lavagem POD da soluc o de bloqueio POD e da soluc o de uso cromog nio preparada a partir dos reagentes espec ficos de cada lote com Cromog nio TMB e Tamp o substrato TMB s podem ser utilizados como constituintes de um mesmo lote ou seja somente na combina o de 6 cifras n de lote que vem impressa na embalagem e indicada na tabela de c digo de barras adjunta Advert ncias e medidas de precauc o 1 S para uso diagn stico in vitro 2 Cada d diva individual de sangue destinada preparac o de soros standard e de controlo foi previamente examinada com vista detecc o de HBsAg Anti HCV Anti HIV1 e Anti HIV2 Na elaborac o s foram utilizadas doac es com resultado negativo Independentemente disso todos os materiais obtidos a partir de sangue humano devem ser manuseados com as precaug es necess rias seguindo as medidas de seguran a recomendadas em caso de risco biol gico uma vez que nunca se pode exclui
48. arar la muestra como positiva o negativa Si despu s de la repetici n tampoco es posible clasificar la muestra como positiva o negativa el resultado del test es valor lim trofe gt cut off 10 negativa lt cut off 10 positiva cut off 10 valor lim trofe muestra muestra lt muestra Ensayo cuantitativo Para la valoraci n cuantitativa se van a determinar los coeficientes de extinci n promedio de las dos determinaciones de las serie est ndar 10 20 40 y 80 UI I Basados en esta curva est ndar se va a determinar la concentraci n de anti HAV en la muestra Si la muestra ha sido diluida la concentraci n le da en la curva debe ser multiplicada por el factor de diluci n Limitaciones del procedimiento No utilizar material del paciente que contenga azida s dica No utilizar muestras contaminadas microbiol gicamente Los anticoagulantes como heparina EDTA y citrato no influyen sobre los resultados del test Muestras lip micas hemol ticas muestras que contengan factor reumatoideo muestras con ANA as como muestras inactivadas por calor 1h 56 C no presentan ninguna influencia sobre el test 5 El Tamp n sustrato PMB la soluci n de uso del crom geno y la soluci n de detenimiento POD no deben entrar en contacto con iones de metales pesados o sustancias oxidantes no utilizar pipetas con componentes met licos No efectuar la reacci n del sustrato en la cercan a de medios de desinf
49. atre concentrations du S rum standard Anti HAV 80 C1 et C2 40 D1 et D2 20 E1 et E2 et 10 F1 et F2 Dans les cupules suivantes distribuer 25 ul de chacun des chantillons tester ventuellement pr dilu s si n cessaire Ala fin de cette premiere tape de distribution enchainer imm diatement la distribution de l Antig ne HAV 3 Distribution de l Antig ne Ajouter dans chaque cupule contenant le standard le contr le ou un chantillon 50 ul de Solution Antig ne et encha ner imm diatement la distribution du Conjugu 4 Distribution du Conjugu Ajouter dans chaque cupule 50 ul de solution d emploi du Conjugu cf Remarque couvrir la plaque test d une feuille adh sive et la placer imm diatement dans l incubateur Remarque Pour viter l obtention de r sultats erron s en r alisation manuelle du test veiller lors de la distribution du Conjugu ce que l extr mit de la pipette ne touche pas le bord de la cupule ni le m lange d j pr sent dans la cupule 5 Incubation Laisser incuber 2 heures 5 minutes 37 1 C et enchainer imm diatement le processus de lavage 6 Lavage Retirer la feuille adh sive aspirer le contenu de toutes les cupules et laver 4 fois avec env 0 3 ml de Solution de lavage A la fin du lavage enchainer imm diatement la distribution du r actif suivant pour viter le dess chement des solutions 7 Distribution du Substrat Ajouter dans chaque cupule 100 ul d
50. cificaciones ste puede excluirse Los dos valores de extinci n del suero est ndar 80 deben cumplir con las especificaciones Si estas condiciones no se cumplen se debe repetir el test OQEC G11 C0540 513 H 37 e IT E U ILS Evaluaci n del test La evaluaci n con el BEP 2000 o con el BEP III se realiza autom ticamente Para esto consultar los manuales de operaciones Los siguientes cap tulos son para tener en cuenta en el caso de evaluaciones sin la ayuda del software Ensayo cualitativo Obtener el valor promedio de los valores de extinci n del suero control Anti HAV negativo Para calcular el valor l mite se multiplica el valor de extinci n promedio del suero control Anti HAV negativo por el factor 0 5 E neg X 0 5 Valor l mite cut off El rango lim trofe se define Valor l mite 10 Seg n los criterios del ensayo las muestras se definen de la siguiente manera Resultados del test 1 E 2 E 3 cut off 10 lt E Las muestras que en un ensayo inicial reaccionan con valores de extinci n en un rango de 10 del valor l mite rango lim trofe deben ser tomadas provisionalmente como de valor lim trofe Para aclarar estos resultados debe medirse la muestra nuevamente pero esta vez en una doble determinaci n Si al repetir el valor promedio de la doble determinaci n es menor que el valor l mite 10 o mayor que el valor l mite 10 se puede eliminar el valor l mite inicial y decl
51. cipiente limpo O contacto cut neo com as soluc es acima mencionadas dever ser evitado 7 Durante a incubac o a placa de ensaio dever ser mantida em repouso p ex sobre um dispositivo de flutuac o fixo ou em banho maria sem circulac o neste caso as cavidades est o em contacto com a gua temperada Se forem utilizados conservantes para evitar a contaminac o microbial da gua tomar todo o cuidado para que nem a superf cie da placa de ensaio nem as cuvetes entrem em contacto com estas soluc es uma vez que as contaminac es podem originar reacc es n o espec ficas 8 Os soros de controlo s o produzidos utilizando soros humanos naturais Por isso podem ocorrer turvac es que n o afectam o resultado do teste OQEC G11 C0540 513 H 46 MENTA Caracter sticas de performance do teste Sensibilidade e especificidade Os resultados da an lise de sensibilidade e especificidade est o resumidos nas tabelas 2 3 no anexo Para a determina o da sensibilidade foi analisado um total de 878 amostras Anti HAV positivas tendo sido determinada uma sensibilidade de 98 5 a 100 teste inicial e 99 0 100 repeti o do teste Foi analisada a reactividade do teste nas amostras de seroconvers o com base em 12 pain is de seroconvers o Neste caso em rela o detec o de seroconvers es foi observado que o Enzygnost Anti HAV apresenta uma sensibilidade correspondente sensibilidade de um teste simila
52. control Anti HAV negativo 1x6ml Soluci n de lavado POD concentrado 1x 100 ml Tamp n sustrato TMB 1x30 ml Crom geno TMB 1x3ml Soluci n de detenimiento POD 1x 100 ml Frasco vac o para la soluci n de uso del crom geno 1 unidad L minas adhesivas 6 unidades Bolsa de PE para guardar los elementos no necesarios 1 unidad Tabla de valores Barcode 1 unidad Bolet n informativo 1 unidad OQEC G11 C0540 513 H 34 Edici n Marzo 2003 IT EG U TIA Composici n Enzygnost Anti HAV placa de prueba Placa de microtitulaci n recubierta con anticuerpo humano contra el ant geno virus de la hepatitis A Conjugado Anti HAV POD Anti HAV monoclonal rat n conjugado con peroxidasa POD en soluci n tamp n de Tris 0 05 mol l Diluci n para usar 1 40 en tamp n para conjugado Anti HAV Medio de conservaci n Fenol m x 1 g l Tamp n para conjugado Anti HAV como medio de diluci n para el conjugado Anti HAV POD Contiene glicerina 100 g l Tween 20 20 g l cloruro de sodio 8 8 g l EDTA 1 9 g l alb mina bovina 1 g l poligelina y fosfatos 50 mmol l Medio de conservaci n Fenol m x 1 g l Antigeno HAV Antigeno virus de la hepatitis A obtenido de fibroblastos humanos inactivado Medio de conservaci n Fenol m x 1 g l Suero est ndar 80 Anti HAV Suero humano con anticuerpos contra HAV nominalmente 80 20 UI I en relaci n con un preparado de referencia Valor normativo de extinci n lt 0 3 E
53. de armazenagem SE CE Mark CE Zeichen Marquage CE Marchio CE CE Marca Marca CE D VN MA Catalogue Number Katalog Nummer R f rence Codice Catalogo N mero EF de Cat logo Consult Instructions for Use Gebrauchsanweisung beachten Consulter la Ji Notice d Utilisation Istruzioni per I uso Consultar Instucciones para el Uso IN Consulte as Instru es de Utiliza o OQEC G11 C0540 513 H 50 i e
54. e ver Tabla 1 Para la valoraci n cuantitativa se prepara una curva est ndar de referencia ver trabajos preliminares para la cual cada concentraci n se toma en una doble determinaci n en este caso el n mero de muestras a investigar m s 12 pocillos para controles y serie de est ndares 2 Dosificaci n de las muestras Ensayo cualitativo Pipetear en 4 pocillos A1 hasta D1 25 ul por c u del suero de control Anti HAV negativo en 2 pocillos E1 y F1 25 ul por c u del suero est ndar 80 Anti HAV y en los siguientes pocillos 25 ul de c u de las muestras Como alternativa al esquema de pipeteo arriba mencionado est tambi n permitido colocar el suero est ndar 80 Anti HAV una vez al comienzo y una vez al final de la serie de medidas OQEC G11 C0540 513 H 36 e IT CO D Esquema de pipeteo Dosificar en cuatro pocillos 25 ul por c u de suero control Anti HAV negativo en un pocillo 25 ul de suero est ndar 80 Anti HAV en los siguientes pocillos 25 ul de c u de las muestras y al final de la serie o de la placa de prueba otra vez 25 de suero est ndar 80 Anti HAV Ensayo cuantitativo Pipetear en 4 pocillos A1 A2 B1 y B2 25 ul por c u de suero control Anti HAV negativo y a continuaci n en 2 pocillos 25 ul por c u del correspondiente suero est ndar Anti HAV 80 C1 y C2 40 D1 y D2 20 E1 y E2 10 F1 y F2 En los siguientes pocillos dosificar 25 ul de c u de las muestras en caso necesario diluir Al
55. e che sono a diretto contatto con i liquido Non eseguire le reazioni del substrato in prossimit di disinfettanti contenenti ipoclorito 6 Se la Soluzione d uso del cromogeno presenta spontaneamente una colorazione blu prima di essere trasferita nella piastra test ci indica che la soluzione contaminata in tal caso preparare una nuova soluzione in un contenitore pulito 7 Durante la fase di incubazione la piastra deve essere protetta da vibrazioni es su un supporto fisso oppure a bagnomaria senza circolazione d acqua i pozzetti devono essere a contatto con l acqua termostatata Se vengono utilizzati conservanti per evitare la contaminazione dell acqua occorre fare attenzione ache la superficie superiore della piastra ed i pozzetti non vengano a contatto con queste soluzioni in quanto simili contaminazioni possono produrre reazioni aspecifiche 8 sieri di controllo sono prodotti utilizzando siero umano nativo Pertanto possono diventare torbidi senza per interferire sul risultato del test a OQEC G11 C0540 513 H 30 e IT EN TIA Caratteristiche del test Sensibilita e specificita risultati dello studio sulla sensibilit e sulla specificit sono riassunti nelle tabelle 2 e 3 in appendice Per la valutazione della sensibilit sono stati esaminati 878 campioni anti HAV positivi e si riscontrata una sensibilit del 98 5 100 nell analisi iniziale e del 99 0 100 nella ripetizione La reatti
56. e programmazione del test Enzygnost Anti HAV Esecuzione del test Programmazione BEP II BEP Ill BEP 2000 del men per il Preparazione dei reagenti e BEP Il BEP 2000 MENU NO OPERATE 1 YES 4 x 25 ul Siero di controllo negativo DISPENSAZIONE ANTIGENE 2 x 25 ul Siero standard 80 WASHINGS 0 25 ul de per campioni ASPIRATE NO SOAKTIME 0 DISP VOL 50 CHANNEL NO 3 BEP II BEP III PHOT NO OPERATE 2 YES DISPENSAZIONE CONIUGATO Nel caso di piastre riempite WASHINGS 0 50 uL de l antigene parzialmente aggiungere file ASPIRATE NO di pozzetti con acqua fino a SOAKTIME 0 riempire mezza piastra test DISP VOL 50 CHANNEL NO 2 50 uL coniugato diluito PHOT NO pronto bbs OPERATE 3 YES LAVAGGIO E DISPENSAZIONE 120 min 5 min CHROMOGENO a 37 1 C WASHINGS 4 ASPIRATE NO SOAKTIME 0 4 lavaggi BEP II CES DISP VOL 100 automatica CES test CHANNEL NO 4 4 PHOT NO 100 uL Soluzione d uso OPERATE 4 YES Jeleomogeng DISPENSAZIONE SOLUZIONE 4 BLOCCANTE WASHINGS 0 30 min 2 min ASPIRATE NO a 18 bis 25 C SOAKTIME 0 al riparo della luce DISP VOL 100 V CHANNEL NO 5 100 uL Soluzione bloccante PHOT YES MEAS WL 450 4 REF WL 650 BLK COR NO Cal massimo entro 1 ora EVAL
57. e solution d emploi du Chromog ne et couvrir la plaque d une nouvelle feuille adh sive 8 Incubation du Substrat Laisser incuber 30 2 minutes 18 25 C l abri de la lumi re 9 Arr t de la r action Retirer la feuille adh sive et ajouter dans chaque cupule 100 ul de Solution d arr t POD en respectant le m me rythme que pour la distribution du Substrat 10 Mesure Proc der dans l heure qui suit une mesure photom trique 450 nm Il est recommand de choisir 650 nm comme longueur d onde de r f rence d faut celle ci peut tre comprise entre 615 et 690 nm R alisation du test l aide du BEP III Pour une r alisation du test sur le BEP III pr parer les plaques jusqu la distribution des s rums standard de contr le et des chantillons points 1 et 2 de R alisation du test l aide du BEP Il Toutes les tapes suivantes sont effectu es enti rement automatiquement par l appareil cf Manuel d utilisation du BEP III Ne pas couvrir les plaques d une feuille adh sive Apr s la distribution des s rums standard de contr le et des chantillons placer imm diatement la plaque dans le BEP Ill Les temps d incubation pr vus dans le logiciel du BEP III peuvent varier par rapport ceux du BEP Il pour des raisons techniques d environnement rythme des mesures de l appareil Ils ont cependant t valid s pour la combinaison BEP III Enzygnost R alisation du test l aide du BEP 2000
58. ecci n que contengan hipoclorito 6 Una coloraci n azul espont nea de la soluci n de uso del crom geno antes de colocarla en la placa de prueba indica una contaminaci n prepare una nueva soluci n en un recipiente limpio Evite el contacto de la piel con estas soluciones 7 La placa de prueba debe mantenerse en reposo durante la incubaci n por ej con flotadores fijos o en un ba o de agua no circulante las cavidades deben estar en contacto con el agua temperada Si se utilizan agentes de conservaci n para evitar la contaminaci n del agua se debe tener mucho cuidado de que ni la superficie de la placa de prueba ni los pocillos entren en contacto con esta soluci n ya que este tipo de contaminaciones puede producir reacciones no espec ficas 8 Los sueros de control son fabricados utilizando sueros humanos Por esta raz n puede aparecer turbidez la cual sin embargo no influye en el resultado del test a Pon OQEC G11 C0540 513 H 38 IT EN D Caracter sticas del test Sensibilidad y Especificidad Los resultados de las pruebas de sensibilidad y especificidad est n resumidas en las Tablas 2 3 ver anexo Para determinar la sensibilidad se estudiaron un total de 878 muestras con anti HAV positivo encontr ndose una sensibilidad del 98 5 al 100 ensayo inicial o de 99 0 a 100 repetici n del test La reactividad del test para muestras con seroconversi n fue estudiada en base a 12 paneles de seroconversi
59. een 20 20 g L cloruro di sodio 8 8 g L EDTA 1 9 g L albumina bovina 1 g L poligelina e fosfato 50 mmol L Conservante fenolo mass 1 g L Antigene HAV Antigene del virus dell epatite A da fibroblasti umani inattivato Conservante fenolo mass 1 g L Siero standard anti HAV 80 Siero umano contenente anticorpi anti HAV valore nominale 80 20 UI L riferito al preparato di riferimento dell OMS Valore nominale di estinzione lt 0 3 E Conservante fenolo mass 1 g L Siero di controllo anti HAV negativo Siero umano privo di anticorpi anti HAV Valore nominale di estinzione gt 0 7 Conservante fenolo mass 1 g L Soluzione di lavaggio POD concentrata Soluzione di tampone fosfato 90 mmol L contenente Tween 18 g L Conservante fenolo mass 1 g L Tampone substrato TMB e perossido di idrogeno ca 0 1 g L in soluzione tampone acetato 25 mmol L Conservante n butanolo mass 1 Cromogeno TMB tetrametilbenzidina cloridrato 5 g L Soluzione bloccante POD acido solforico 0 5 N La confezione contiene un set combinato di reagenti E necessario utilizzare solo reagenti appartenenti tutti ad uno stesso lotto ad esclusione della soluzione di lavaggio POD la soluzione bloccante POD e soluzione d uso del cromogeno preparata con i reagenti Cromogeno TMB e Tampone Substrato TMB appartenenti tutti allo stesso lotto La combinazione ammessa dei numeri di lotto a 6 cifre amp quella s
60. el mismo ritmo que en el punto 7 10 Medici n Realizar la medici n en el fot metro a 450 nm en el t rmino de una hora Como longitud de onda para la medida de referencia se recomienda 650 nm en caso dado entre 615 y 690 nm Procedimiento en el BEP Ill Para la realizaci n del test en el BEP Ill las placas de prueba se deben preparar hasta la distribuci n de las muestras punto 1 hasta punto 2 del Procedimiento en el BEP II Todas las etapas subsiguientes van a ser realizadas de forma completamente autom tica por el aparato ver manual de operaciones del BEP Ill No aplique l mina adhesiva a las placas Despu s de terminar la dosificaci n de las muestras colocar la placa inmediatamente en el BEP Ill Los tiempos de incubaci n dados en el software del BEP III pueden desviarse de los dados para el proceso en el BEP Il debido a razones t cnicas ritmo del aparato pero est n validados en la combinaci n BEP III Enzygnost Procedimiento en el BEP 2000 La distribuci n de las muestras y la realizaci n subsiguiente del test se efect a de forma completamente autom tica por el aparato ver manual de operaciones del BEP 2000 Validaci n del test Los valores aislados de extinci n para el suero control se usan para el c lculo del valor promedio si Eneg 20 700 0 010 lt Est o lt 0 300 Si entre los valores de extinci n del suero control Anti HAV negativo existe un valor por fuera de las espe
61. erschema ist es auch erlaubt Anti HAV Standard Serum 80 einmal zu Beginn und einmal am Ende der Testreihe aufzutragen Pipettierschema In 4 Vertiefungen je 25 ul Anti HAV Kontroll Serum negativ in eine Vertiefung 25 ul Anti HAV Standard Serum 80 in die folgenden Vertiefungen je 25 ul Probe und am Ende der Serie bzw Testplatte noch einmal 25 ul Anti HAV Standard Serum 80 dosieren OQEC G11 C0540 513 H 12 e IT E TEA Quantitativer Test In 4 Vertiefungen A1 A2 B1 und B2 je 25 ul Anti HAV Kontroll Serum nega tiv und anschlieBend in jeweils 2 Vertiefungen je 25 ul des Anti HAV Standard Serums entspre chend 80 C1 und C2 40 D1 und D2 20 E1 und E2 und 10 F1 und F2 IU I pipettieren In die folgenden Vertiefungen je 25 ul Probe evtl nach Bedarf vorverd nnt dosieren Nach Beenden der Proben Dosierung die Antigen Zugabe unmittelbar anschlie en Antigen Dosierung In jede Vertiefung zu der vorgelegten Probe je 50 ul Antigen L sung zudosieren und die Konjugat Dosierung unmittelbar anschlie en 4 Konjugat Dosierung Jeweils 50 ul Konjugat Gebrauchsl sung zu Probe und Antigen zudosieren siehe Hinweis die Testplatte mit Folie abkleben und sofort in den Inkubator stellen Hinweis Bei manueller Durchf hrung muss zur Vermeidung von verf lschten Ergebnissen die Konjugat Dosierung so vorgenommen werden dass die Pipettenspitze den Rand der Kavit t nicht ber hrt und nicht in die Probenfl ssigkeit eintaucht
62. erungsmittel Phenol max 1 g l Waschl sung POD Konzentrat Tween haltige 18 g l Phosphat Pufferl sung 90 mmol l Konservierungsmittel Phenol max 1 g l Puffer Substrat TMB Wasserstoffperoxid ca 0 1 g l in Acetat Pufferl sung 25 mmol l e Konservierungsmittel n Butanol max 1 96 Chromogen TMB Tetramethylbenzidin dihydrochlorid 5 g l Stoppl sung POD 0 5 N Schwefels ure Die Reagenzien ausgenommen Waschl sung POD Stoppl sung POD und die aus den chargen gebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer Substrat TMB hergestellte Chromogen Gebrauchsl sung sind nur chargengebunden zu verwenden d h nur in der Kombination der einzel nen 6 ziffrigen Chargen Bezeichnungen Ch B die auf der Packung aufgedruckt bzw der separat beigepackten Barcodewerte Tabelle zu entnehmen sind Warnungen und Vorsichtsma nahmen 1 Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung 2 Jede individuelle Blutspende die zur Herstellung von Standard und Kontroll Sera vorgesehen war wurde auf HBsAg auf Anti HCV auf Anti HIV1 und auf Anti HIV2 untersucht F r die Herstellung wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet Unabh ngig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie auszu schlie ender Gef hrdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogef hrdung empfohlenen Sicherheitsma nahmen gehandhabt werden 5 3 Das aus humanen Fibroblasten isolierte HAV A
63. es Gef lichtgesch tzt Waschl sung POD nach ffnen 2 bis 8 C bis Verfalldatum Konzentrat 1 20 2 bis 8 C 1 Woche 1 20 18 bis 25 C 1 Tag Stoppl sung POD nach ffnen 2 bis 8 C bis Verfalldatum In keinem Fall l nger als bis zum Verfalldatum OQEC G11 C0540 513 H 15 A A Tab 2 Sensitivit t Bei den Untersuchungen zur Sensitivit t wurden an zwei unabh ngigen Zentren K M folgende Daten E 5 TT I ermittelt Probenkollektiv Probenanzahl initial reaktiv retest reaktiv M Anti HAV pos 30 30 30 Anti HAV pos Plasmen 30 30 30 Anti HAV IgG pos 157 157 157 Anti HAV IgM pos 84 84 84 Serokonversionen 12 Sensitivit t entspricht der Empfind lichkeit eines vergleichbaren Testes K Anti HAV pos 204 204 204 Anti HAV pos 205 202 203 Anti HAV pos 168 166 167 Tab 3 Spezifit t Bei den Untersuchungen zur Spezifit t wurden an zwei unabh ngigen Zentren K M folgende Daten ermit telt Probenkollektiv Probenanzahl initial reaktiv retest reaktiv M normal negative Seren 50 0 0 normal negative Plasmaproben 50 0 0 K normal negative Seren 176 6 3 normal negative Seren 310 9 5 Tab 4 Reproduzierbarkeit Bei den Untersuchungen zur Reproduzierbarkeit wurden die Proben an 5 Tagen in jeweils 8fach Be stimmung getestet Die Berechnung der Variationskoeffizienten VK erfolge nach dem Varianzkomponentenmodell
64. es were tested on 5 days in 8 fold determinations on each day The calculation of the coefficients of variation CV was performed according to the variance component model Sample Mean A value A CV Intra assay Inter assay FA 1 203 3 6 7 8 F2 0 607 5 0 9 2 F3 0 331 9 4 7 8 F4 0 115 8 3 16 6 OQEC G11 C0540 513 H 8 Tab 5 Test procedure and programming Me II E EC Enzygnost Anti HAV Test procedure BEP II BEP Ill BEP 2000 Menu programming for the Prepare reagents 1 B E po Il BEP 2000 MENU NO 4 x 25 ul Control Serum negative OPERATE 1 YES 2x25 ul Standard Serum 80 DISPENSE ANTIGEN 25 ul sample each WASHINGS 0 ASPIRATE NO SOAKTIME 0 DISP VOL 50 BEP Il BEP Ill CHANNEL NO 3 PHOT NO OPERATE 2 YES 50 ul antigen in the case of partially DISPENSE CONJUGATE filled plates Add water WASHINGS 0 y filled strips to make up to ASPIRATE NO 50 ul Working half a plate SOAKTIME 0 Conjugate Solution DISP VOL 50 y CHANNEL NO 2 120 min 5 min PHOT NO 37 1 C OPERATE 3 YES 4 WASH AND DISPENSE Wash 4x BEP II az CHROMOGEN Ww UN WASHINGS 4 ASPIRATE NO SOAKTIME 0 100 ul Working DISP VOL 100 Chromogen Solution CHANNEL NO 4 P
65. esclude quindi l eziologia dell infezione da epatite A Poich dopo un infezione gli anticorpi anti HAV sono rilevabili per tutta la vita possibile garantire con la loro identificazione una costante immunit ci costituisce un decisivo criterio di valutazione riguardo all immunizzazione attiva mediante vaccinazione o impiego di immunoglobuline per la profilassi in seguito ad esposizione al virus in caso di contatti a rischio Nella valutazione quantitativa l Enzygnost Anti HAV consente in base al siero standard anti HAV curva di verifica di determinare quantitativamente il contenuto anticorpale HAV e di dichiararne il contenuto in UI L riferito allo standard internazionale dell OMS Principio del metodo L Enzygnost Anti HAV un test immunoenzimatico basato sul principio del metodo a competizione Gli anticorpi specifici presenti nel campione in esame e gli anticorpi monoclonali anti HAV coniugati POD competono per legarsi ai siti dell antigene HAV che a sua volta impegnato nella reazione ad una fase come reagente A seconda della concentrazione di anticorpi specifici nel campione si legher all antigene una quantit maggiore o minore di coniugato L immunocomplesso cosi formatosi si lega quindi agli anticorpi specifici anti HAV fissati alla superficie della piastra di microtitolazione Dopo l eliminazione tramite lavaggio delle componenti non legate si determina l attivit enzimatica del coniugato che si legato La reazione
66. est prepare a standard curve see preparatory work from concentrations determined in duplicate in this case the number of wells required is given by the number of samples to be investigated plus 12 wells for controls and the standard series 2 Dispense samples Qualitative Test Pipette 25 uL well of Anti HAV Control Serum negative into 4 wells A1 to D1 25 pL Anti HAV Standard Serum 80 into 2 wells E1 and F1 and 25 uL well into the subsequent wells As an alternative to the above pipetting scheme it is also possible to pipette the Anti HAV Standard Serum 80 once at the start and once at the end of the series Pipetting scheme Pipette 25 uL well of Anti HAV Control Serum negative into 4 wells 25 uL Anti HAV Standard Serum 80 into the next well and then fill the following wells with 25 uL well of sample At the end of the series plate pipette 25 uL of Anti HAV Standard Serum 80 once more Quantitative Test Pipette 25 uL well of Anti HAV Control Serum negative into 4 wells A1 A2 B1 and B2 and then 25 uL well Anti HAV Standard Serum into 2 wells each per dilution i e 80 IU L into wells C1 and C2 40 IU L into wells D1 and D2 20 IU L into wells E1 and E2 and 10 IU L into wells F1 and F2 Then dispense 25 uL well of sample into the subsequent wells predilute if necessary After completing the sample dispensing step proceed immediately to the antigen dispensing step 3 Dispense Antigen Add 50 uL antigen solution to each well
67. exceptions to this requirement Note that the Working Chromogen Solution must first be prepared from matched components do not use Chromogen TMB and Buffer Substrate TMB from kits with a different number Warnings and Precautions 1 For in vitro diagnostic use only 2 Each individual blood donation intended for use in the manufacture of standard and control sera is tested for HBsAg Anti HCV Anti HIV1 and Anti HIV2 Only donations with negative findings were used for manufacture Nevertheless since absence of infectious agents cannot be proven all materials obtained from human blood should always be handled with due care observing the precautions recommended for biohazardous material 5 3 The HAV antigen isolated ffom human fibroblasts is subjected to an accepted virus inactivation procedure reaction with B propiolactone Nevertheless to ensure safety the HAV antigen should be handled with care 5 4 Itis advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure 5 Itis recommended that solid materials be disinfected by autoclaving for at least one hour at 121 C All aspirated liquids should be collected in two receptacles connected in series The receptacles should contain a disinfectant suitable for inactivating pathogenic human viruses The concentrations and reaction times specified by the manufacturer must be observed Preparations of the Reagents Pre warm all reagents and test samples to 18 to 25 C
68. gativ 1x6ml Waschl sung POD Konzentrat 1x 100 ml Puffer Substrat TMB 1 x 30 ml Chromogen TMB 1x3ml Stoppl sung POD 1x 100 ml Leerflasche f r Chromogen Gebrauchsl sung 1 St ck Abklebefolien 6 St ck PE Beutel zur Aufbewahrung nicht ben tigter Restriegel 1 St ck Barcode Wertetabelle 1 St ck Packungsbeilage 1 St ck OQEC G11 C0540 513 H 10 Ausgabe M rz 2003 IT ED U D Zusammensetzung Enzygnost Anti HAV Testplatte Mit humanen Antik rpern gegen Hepatitis A Virus Antigen beschichtete Mikrotitrationsplatte Anti HAV POD Konjugat Anti HAV monoclonal Maus Peroxidase POD konjugiert in Tris Pufferl sung 0 05 mol l Gebrauchsverd nnung 1 40 in Konjugat Puffer Anti HAV Konservierungsmittel Phenol max 1 g l Konjugat Puffer Anti HAV als Verd nnungsmedium f r Anti HAV POD Konjugat enth lt Glycerin 100 g l Tween 20 20 g l Natriumchlorid 8 8 g l EDTA 1 9 g l Albumin vom Rind 1 g l Polygeline und Phosphat 50 mmol l Konservierungsmittel Phenol max 1 g l HAV Antigen Hepatitis A Virus Antigen aus humanen Fibroblasten inaktiviert Konservierungsmittel Phenol max 1 g l Anti HAV Standard Serum 80 Humanserum mit Antik rpern gegen HAV nominell 80 20 IU I bezogen auf das WHO Referenz Pr parat Extinktionsrichtwert lt 0 3 E Konservierungsmittel Phenol max 1 g l Anti HAV Kontroll Serum negativ Humanserum ohne Antik rper gegen HAV Extinktionsrichtwert gt 0 7 Konservi
69. ht bei quantitativer Auswertung anhand des Anti HAV Standardserums Eichkurve eine quantitative Bestimmung des HAV Antik rpergehalts und Deklaration in IU I bezogen auf den internationalen Standard der WHO Prinzip der Methode Enzygnost Anti HAV ist ein Enzymimmunoassay nach dem kompetitiven Testprinzip Die in der Untersuchungsprobe enthaltenen spezifischen Antik rper und die POD konjugierten monoklonalen Antik rper gegen HAV konkurrieren um die Bindungsstellen des HAV Antigens das ebenfalls als Reagenz Komponente dem Einschritt Assay zugesetzt wird In Abh ngigkeit von der Konzentration des spezifischen Antik rpers in der Probe kann mehr oder weniger Konjugat an das Antigen gebunden werden Der entstandene Immunkomplex bindet sich an die an der Oberfl che der Mikrotitrationsplatte fixierten HAV spezifischen Antik rper Nach Entfernung der ungebundenen Bestandteile durch Waschen wird die gebundene Enzymaktivit t des Konjugates bestimmt Die enzymatische Umsetzung von Substrat und Chromogen blaue Farbreaktion wird durch Zusatz von Stoppl sung POD unterbrochen gelbe Farbreaktion Die Farbintensit t ist der in der Probe vorhandenen Antik rperkonzentration umgekehrt proportional Reagenzien Inhalt der Handelspackung Enzygnost Anti HAV 1x96 Enzygnost Anti HAV Testplatte 1 St ck Anti HAV POD Konjugat 1x0 4 ml Konjugat Puffer Anti HAV 2x6ml HAV Antigen 2x6ml Anti HAV Standard Serum 80 1x0 5 ml Anti HAV Kontroll Serum ne
70. ie hitzeinaktivierte Proben 1 h 56 C f hren zu keiner Testbeeintr chtigung Puffer Substrat TMB Chromogen Gebrauchsl sung und Stoppl sung POD d rfen nicht in Kontakt mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen keine Pipetten mit fl ssigkeits f hrenden Metallteilen verwenden Die Substratreaktion nicht in der N he von Hypochlorit haltigen Desinfektionsmitteln durchf hren E 6 Eine spontane Blauf rbung der Chromogen Gebrauchsl sung vor der Ubertragung in die Test platte deutet auf Kontamination hin eine frische L sung ist in einem sauberen Gef anzusetzen Hautkontakt mit den vorgenannten L sungen ist zu vermeiden 7 Die Testplatte soll w hrend der Inkubation ruhig liegen z B auf fixierter Schwimmhilfe oder im nicht zirkulierenden Wasserbad die Kavit ten sind dabei in Kontakt mit dem temperierten Wasser Wer den Konservierungsmittel zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet so ist sorgf l tig darauf zu achten dass weder die Testplattenoberfl che noch die N pfchen mit diesen L sungen in Kontakt kommen da derartige Kontaminationen unspezifische Reaktionen hervorrufen k nnen 8 Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt Daher k nnen Tr bungen auftreten die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen a Leistungsmerkmale des Tests Sensitivit t und Spezifit t Die Ergebnisse zur Pr fung der Sensitivit t und Spezifit t sind in den Tabellen 2 3
71. ient samples containing sodium azide 2 Samples with microbial contamination should not be used 3 Anticoagulants such as heparin EDTA and citrate do not affect the test results 4 Lipemic and hemolytic samples samples containing rheumatoid factors or ANAs and heat treated samples 1 hour 56 C do not affect the test Buffer Substrate TMB Working Chromogen Solution and Stopping Solution POD must not be allowed to come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances do not use pipettes with metal parts which are in direct contact with the liquid The substrate reaction step must not be performed in the vicinity of disinfectants containing hypochlorite 6 Ifthe Working Chromogen Solution has spontaneously developed a blue color before transferal into the test plate this indicates that the solution is contaminated a fresh solution must be prepared in a clean vessel Skin contact with the aforementioned solutions is to be avoided 7 The test plate should be protected from vibration during the incubation phase e g placed on a secured flotation device or in a non circulating water bath the wells of the plate must be in contact with the thermostated water If preservatives are used to prevent microbial contamination of the water care must be taken that neither the surface of the test plate nor the wells come into contact with these solutions since such contamination can lead to unspecific reactions 8 The control sera we
72. izio del test portare tutti i reagenti ed i campioni in esame a 18 25 C Durante questa operazione non togliere la piastra test dal contenitore Per ogni piastra test diluire 20 mL di soluzione di lavaggio POD concentrata con 400 mL di acqua distillata o deionizzata Soluzione d uso di cromogeno per ogni piastra test diluire 1 mL di cromogeno TMB con 10 mL di tampone substrato TMB nel flacone vuoto appositamente fornito e conservare chiuso al riparo dalla luce Dopo l uso lavare accuratamente il flacone con acqua distillata Per motivi di capacit del flacone non possibile versare il contenuto di un flacone di cromogeno TMB direttamente nel flacone con il tampone substrato TMB Per l esecuzione quantitativa del test il siero standard anti HAV 80 deve essere diluito con il siero di controllo anti HAV negativo come segue 40 UI L diluizione 1 2 es 100 uL siero standard anti HAV 80 100 uL siero di controllo anti HAV negativo 20 UI L diluizione 1 4 es 100 uL della diluizione contenente 40 UI L standard 100 uL siero di controllo anti HAV negativo 10 UI L diluizione 1 8 es 100 uL della diluizione contenente 20 UI L standard 100 uL siero di controllo anti HAV negativo Se le concentrazioni di anticorpi anti HAV previste sono gt 60 UI L diluire i sieri o i plasmi come segue fino a 600 UI L diluizione 1 11 es 10 uL campione 100 uL siero di controllo anti HAV negativo fino a 6000 UI L diluizione 1 101 es
73. l Serum negative and then calculate the cut off value by multiplying by a factor of 0 5 Aneg X 0 5 cut off The retest range is defined as Cut off 10 OQEC G11 C0540 513 H 5 IT MEN TH Based on the criteria of the test the samples are classed as follows Test result 1 Asample gt Cut off 10 negative E Asamp e lt Cut off 10 positive 3 cut off 10 Asampie lt cut off 10 equivocal Samples which in the initial test yield absorbance readings in a range of 10 of the cut off retest range must be considered provisionally equivocal To clarify the result the sample must be retested but this time in duplicate Ifthe retest mean value of the double determination is less than the cut off 10 or greater than the cut off 10 the initial equivocal result can be ignored and the sample considered negative or positive as appropriate If after the retest it is still not possible to class the sample as positive or negative then the test result is defined as equivocal Quantitative Test For the quantitative evaluation calculate the mean absorbance values from the double determinations of the standard series 10 20 40 and 80 IU L The Anti HAV concentrations for the sample are read from this standard curve If the sample was diluted then the concentration read from the standard curve must be multiplied by the dilution factor Limitations of the Procedure 1 Do not used pat
74. n En este caso se encontr que el Enzygnost Anti HAV muestra en relaci n con el reconocimiento de una seroconversi n una sensibilidad que corresponde a la de un test comparable La sensibilidad anal tica se determin con relaci n a un est ndar internacional de la OMS con x 20 UII Independientemente de esto no se puede excluir que para un amplio uso del test algunas muestras no se puedan reconocer Para determinar la especificidad se investigaron en total 586 muestras de sangre con anti HAV negativo y se obtuvo una especificidad del 96 6 al 100 ensayo inicial o del 98 3 al 100 repetici n del test Dependiendo entre otros del colectivo estudiado del desarrollo del test es posible encontrar valores divergentes De acuerdo al estado actual de los conocimientos de un resultado positivo al test Anti HAV no se puede deducir con seguridad que exista una infecci n por hepatitis o el que haya una inmunidad as como un resultado negativo del test tampoco excluye una infecci n por hepatitis o el que haya una inmunidad Reproducibilidad Los resultados de la reproducibilidad intra inter assay est n resumidos en la Tabla 4 en el anexo En este caso se trata de datos dados como ejemplo Dependiendo entre otros del desarrollo del test son posibles desviaciones de estos valores Enzygnost y BEP son marcas de f brica registradas de Dade Behring Marburg GmbH en USA Alemania y en otros pa ses Dade Behring Marburg GmbH Emil von
75. n ning n caso m s all de la fecha de vencimiento e A A Tab 2 Sensibilidad En la investigaci n de la sensibilidad siguientes datos E 2 El A en dos centros independientes K M se encontraron los Colectivo de muestras N mero Reactividad Reactividad de muestras inicial repetida M Anti HAV pos 30 30 30 Anti HAV pos plasmas 30 30 30 Anti HAV IgG pos 157 157 157 Anti HAV IgM pos 84 84 84 Seroconverciones 12 La sensibilidad corresponde a la sen sibilidad de un m todo comparable K Anti HAV pos 204 204 204 Anti HAV pos 205 202 203 Anti HAV pos 168 166 167 Tab 3 Especificidad En la investigaci n de la especificidad en dos centros independientes K M se encontraron los siguientes datos Colectivo de muestras N mero Reactividad Reactividad de muestras inicial repetida M Sueros normales negativos 50 0 0 Muestras de plasma normal negativas 50 0 0 K Sueros normales negativos 176 6 3 Sueros normales negativos 310 9 5 Tab 4 Reproducibilidad En las investigaciones de la reproducibilidad se estudiaron las muestras 5 d as cada una en determinaciones ctuplas EI c lculo del coeficiente de variaci n CV se efect o de acuerdo al modelo de componentes de varianza Muestra Valor promedio de extinci n E CV Intra assay Inter assay F1 1 203 3 6 7 8 F2 0 607 5 0 9 2 F3 0 331 9 4 7 8 F4 0 115 8 3 16 6 OGEC G1
76. ntigen wird einem anerkannten Virusinaktivierungsverfahren Umsetzung mit B Propiolacton ausgesetzt Zur Sicherheit sollte das HAV Antigen trotzdem mit entsprechender Vorsicht gehandhabt werden 5 4 Das Tragen von Untersuchungshandschuhen w hrend der gesamten Testdurchf hrung wird ange raten 5 Zur Desinfektion fester Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens 1 Stunde bei 121 C Alle abgesaugten L sungen sind in zwei hintereinandergeschalteten Vorlagen zu sam meln Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten das geeignet ist human pathogene Viren zu inaktivieren die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten m ssen beachtet werden OQEC G11 C0540 513 H 11 e I IT ED U D Vorbereitung der Reagenzien Alle Reagenzien und Untersuchungsproben vor Testbeginn auf 18 bis 25 C erw rmen Dabei die Testplatte nicht dem Beh ltnis entnehmen Je Testplatte 20 ml Waschl sung POD Konzentrat mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 ml verd nnen Chromogen Gebrauchsl sung Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer Substrat TMB in der mitgelieferten Leerflasche verd nnen und verschlossen unter Lichtschutz aufbewahren Flasche nach Gebrauch sorgf ltig mit destilliertem Wasser sp len Wegen technisch bedingter berf llung ist das Zusammengie en der Flascheninhalte von Chromogen TMB und Puffer Substrat TMB nicht zul ssig F r die quantitative
77. o do teste com BEP III Para o processamento com o BEP III as placas de ensaio t m de ser preparadas at dosagem de amostras ponto 1 e 2 de Execu o do teste com BEP Il Todas as etapas seguintes de processamento s o executadas automaticamente no aparelho veja Manual de instru es do BEP N o cobrir as placas com pel cula aderente Ap s a conclus o da dosagem de amostras colocar a placa imediatamente no BEP III Devido s condi es t cnicas de base cad ncia do aparelho os tempos de incuba o ajustados no software do BEP III podem divergir dos tempos de incuba o do processamento com o BEP Il mas foram validados para a combina o BEP III Enzygnost Execu o do teste com BEP 2000 A dosagem de amostras e o processamento subsequente do teste realizam se no aparelhe de forma integralmente autom tica veja Manual de instru es do BEP 2000 Valida o do teste Os valores individuais de extin o dos soros de controlo servem para c lculo dos valores m dios se E neg 2 0 700 0 010 lt E srgo 0 300 Dos valores de extinc o do soro de controlo Anti HAV negativo um valor que se situe fora da especificac o pode ser desprezado Os valores de extinc o do soro standard 80 t m de corresponder ambos s especificac es N o estando preenchidas estas condic es necess rio repetir o teste OQEC G11 C0540 513 H 45 e IT A E E Avaliac o do teste As avaliac
78. on or of current immunity just as a negative test result does not reliably exclude the presence of hepatitis A infection or current immunity Reproducibility The results for intra assay and inter assay reproducibility are summarized in Table 4 See Appendix This data is based on example calculations Deviations from these values may occur of course due to differences in test procedure etc Enzygnost and BEP are registered trademarks of Dade Behring Marburg GmbH in the USA Germany and other countries D 35041 Marburg www dadebehring com Dade Behring Marburg GmbH Emil von Behring Str 76 USA Distributor Dade Behring Inc Newark DE 19714 U S A Tab 1 Storage and Stability Enzygnost Anti HAV CE Material Reagent State Storage Stability Enzygnost Anti HAV once opened 2 to 8 C 6 weeks Test plate remaining strips in the bag with the desiccant Anti HAV POD Conjugate once opened 2 to 8 C 4 weeks Conjugate Buffer once opened 2 to 8 C 4 weeks Conjugate 1 40 2 to 8 C 4 weeks diluted ready to use 18 to 25 C 1 week HAV Antigen once opened 2 to 8 C 4 weeks Anti HAV Standard Serum 80 once opened 2 to 8 C 4 weeks Anti HAV Control Serum negative lt 20 C 3 months Anti HAV Standard Dilution after addition of 2 to 8 C 4 weeks 40 20 10 IU L recently opened Anti HAV Standard Serum 80 Chromogen TMB once opened 2 to 8 C expiry date B
79. oppio Se nella ripetizione del test il valore medio della determinazione in doppio risultasse inferiore al cut off 10 o maggiore 10 allora il risultato dubbio iniziale pud essere trascurato e il campione va considerato rispettivamente positivo o negativo Se anche successivamente non fosse possibile classificare il campione come positivo o negativo il risultato del test viene definito dubbio campione campione Test quantitativo Per la valutazione quantitativa calcolare i valori medi di estinzione della determinazione in doppio delle diluizioni standard 10 20 40 e 80 UI L Le concentrazioni di anti HAV nei campioni si leggono vengono lette da questa curva standard Se il campione stato diluito moltiplicare la concentrazione ottenuta dalla curva standard per il fattore di diluizione Limitazioni della procedura 1 Non utilizzare campioni di pazienti contenenti sodio azide 2 campioni contaminati da microbi non dovrebbero essere utilizzati 3 Gli anticoagulanti quali eparina EDTA e citrato non influenzano il risultato del test 4 campioni lipemici e emolitici e quelli contenenti fattori reumatoidi o ANAs e campioni inattivati con il calore 1 ora 56 C non interferiscono con il risultato del test I Tampone Substrato TMB la Soluzione d uso del cromogeno e la Soluzione bloccante POD non devono venire a contatto con ioni di metalli pesanti o con sostanze ossidanti non utilizzare pipette con parti metallich
80. prepared up to the sample dispensing step Items 1 to 2 in the section entitled Test Procedure for the BEP II All the subsequent processing steps are then performed fully automatically in the instrument see BEP III Instruction Manual Do not seal the plates with foil Once the samples are dispensed place the test plate immediately in the BEP Ill The settings for the incubation times in the BEP III software may differ from the times on the BEP II for technical reasons system speed but have been validated for Enzygnost on the BEP III Procedure for the BEP 2000 The sample dispensing steps and subsequent processing of the test are performed fully automatically by the analyzer see BEP 2000 Instruction Manual Validation The individual absorbance readings for the control sera are used to calculate the mean absorbance values if Aneg 0 700 0 010 Agra lt 0 300 If one of the absorbance values of the Anti HAV Control Serum negative is outside the limit this value can be neglected Both absorbance values of the Standard Serum 80 must comply If these conditions are not fulfilled the test must be repeated Evaluation The evaluations take place automatically if using the BEP9 2000 or the BEPS Ill Please consult the relevant instruction manuals The following sections apply if the measurements are carried out without using a software Qualitative Test Calculate the mean absorbance value of the Anti HAV Contro
81. ques h molytiques contenant des facteurs rhumatoides ou des ANA ainsi que d chantillons inactiv s la chaleur 1 h 56 C n a pas d influence sur les r sultats du test 5 Le Tampon Substrat TMB la solution d emploi du Chromog ne et la Solution d arr t POD ne doivent pas entrer en contact avec des ions de m taux lourds ni des substances oxydantes ne pas utiliser de pipettes parties m talliques au niveau du passage des solutions La r action du substrat ne doit pas tre effectu e proximit de d sinfectants contenant de l eau de Javel 6 Une coloration bleue spontan e de la solution d emploi du Chromog ne avant son transfert dans la plaque indique une contamination pr parer alors une nouvelle solution dans un r cipient propre Eviter tout contact de la peau avec les solutions sus mentionn es 7 Laplaque test doit rester immobile pendant toute la dur e de l incubation la placer par ex dans un bain marie non circulant ou la fixer sur un support veiller ce que le fond des cupules soit en contact avec l eau thermostat e Si un conservateur est utilis pour viter la contamination de l eau veiller ce que celle ci ne touche pas la surface de la plaque ni n entre dans les cupules au risque d entrainer des r actions non sp cifiques 8 Les s rums de contr le sont pr par s partir de s rums humains natifs Aussi peuvent ils devenir troubles sans que cela ait d influence sur les r sultats du test
82. r A sensibilidade anal tica foi determinada com base num standard internacional da OMS com lt 20 IU I Independentemente disso n o de excluir que algumas amostras individuais n o escapem detec o no caso de uma utiliza o mais ampla do teste Para a determina o da especificidade foi analisado um total de 586 amostras de sangue Anti HAV negativas tendo sido determinada uma especificidade de 96 6 a 100 teste inicial ou 98 3 a 100 repeti o do teste Em consequ ncia do colectivo testado da execu o do teste etc poss vel obter se valores diferentes No estado actual de conhecimentos a partir de um resultado positivo do teste Anti HAV n o pode inferir se com certeza a presen a de uma infec o por hepatite A ou a exist ncia de imunidade tampouco um resultado negativo do teste permite excluir com seguran a a presen a de uma infec o por hepatite A ou a exist ncia de imunidade Reprodutibilidade Os resultados referentes reprodutibilidade intra inter ensaio est o resumidos na tabela 4 no anexo Neste caso trata se de dados averiguados a t tulo de exemplo E poss vel obter valores completamente diferentes dependendo da execu o do teste Enzygnost e BEP s o marcas registadas da Dade Behring Marburg GmbH nos USA Alemanha e noutros pa ses Dade Behring Marburg GmbH Emil von Behring Str 76 D 35041 Marburg www dadebehring com Tab 1 Estabilidade e condi es de conserva o Enzygnos
83. r inteiramente o risco de contaminac o por agentes patog nicos 5 3 O antigene HAV isolado de fibroblastos humanos submetido a um reconhecido processo de inactivac o do virus transformac o com f propiolactona N o obstante por raz es de seguranga deve usar se de toda a cautela ao manipular o virus HAV 5 4 Recomenda se o uso de luvas de protecc o durante toda a execuc o do teste 5 Para a desinfecc o de materiais s lidos aconselh vel proceder a uma autoclavagem durante pelo menos 1 hora a uma temperatura de pelo menos 121 C Todas as soluc es aspiradas devem ser recolhidas em dois recipientes ligados em s rie Os recipientes devem conter um desinfectante apropriado para a inactivac o de virus patog nicos humanos necess rio seguir as concentra es e tempos de reac o indicados pelo fabricante OQEC G11 C0540 513 H 43 IT ED U ILS Preparac o dos reagentes Antes de iniciar o teste levar todos os reagentes e amostras a temperatura de 18 a 25 C mas nao tirar a placa de ensaio do seu recipiente Por cada placa de ensaio diluir 20 ml da soluc o de lavagem POD concentrado com agua destilada ou desionizada at obter 400 ml Solu o de uso do cromog nio Diluir por placa 1 ml de cromog nio TMB com 10 ml de tamp o substrato TMB no frasco de pl stico vazio fornecido em conjunto e conserv lo fechado e protegido contra a luz Depois do uso lavar o frasco meticulosamente com
84. rd Anti HAV courbe d talonnage de faire un dosage quantitatif des anticorps anti HAV et d exprimer les r sultats en UI I en r f rence au standard international de l OMS Principe de la m thode Enzygnost Anti HAV est un test immunoenzymatique bas sur le principe de comp tition Les anticorps sp cifiques pr sents dans l chantillon tester et les anticorps anti HAV monoclonaux conjugu s au POD entrent en comp tition vis vis des sites de fixation de l antigene HAV galement ajout comme r actif dans ce test en une tape Selon la concentration d anticorps sp cifiques dans l chantillon plus ou moins de conjugu se fixe sur l antigene Les immuncomplexes ainsi obtenus se lient alors aux anticorps anti HAV sp cifiques fix s la surface de la plaque de microtitration Apr s limination des l ments non li s par lavage l activit enzymatique li e du conjugu est mesur e La transformation enzymatique du substrat et du chromog ne r action color e bleue est stopp e par l addition de Solution d arr t POD r action color e jaune L intensit de la coloration est inversement proportionnelle la concentration d anticorps pr sente dans l chantillon R actifs Conditionnement Enzygnost Anti HAV 1x96 Enzygnost Anti HAV plaque test 1 piece Conjugu Anti HAV POD 1x0 4 ml Tampon Conjugu Anti HAV 2x6ml Antigene HAV 2x6ml S rum standard Anti HAV 80 1x0 5 ml Serum de contr le Anti HAV n ga
85. re Bibliagrafia Bibliografia Bibliografia 1 R H Purcell 1994 Hepatitis viruses Changing patterns of human disease Proc Natl Acad Sci USA 91 2401 2406 2 E E Mast M J Alter 1993 Epidemiology of viral hepatitis an overview Virology 4 273 283 3 S M Lemon B H Robertson 1993 Current perspectives in the virology and molecular biology of hepatitis A virus Virology 4 285 295 4 S M Lemon L N Binn 1983 Serum neutralizing antibody response to hepatitis A virus J Infect Dis 148 1033 1039 5 U S Department of Health and Human Services CDC Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories HHS Publication CDC 93 8395 1999 Section Il 8 16 Symbols Key Symbolschl ssel Explication des Symboles Interpretazione simboli Clave de los Simbolos Chave dos Simbolos Manufactured by Hergestellt von Fabriqu par Prodotto da Fabricado por In Vitro Diagnostic Medical Device In Vitro Diagnosticum Dispositif M dical Diagnostic n Vitro Dispositivo Medico per Diagnostica n Vitro Producto sanitario para Diagn stico n Vitro LOT Lot Number Chargenbezeichnung Num ro de Lot Numero di Lotto N mero de Lote EXP Expiration Date Verfalldatum Date de P remtion data di scadenza Fecha ccm de vencimiento termo da validade Storage Temperature Lagertemperatur Temp rature de Conservation Temperatura di conservazione Temperatura de almacenamiento Temperatura
86. re produced using native human sera Therefore turbidity may occur but does not impair the test result a Specific Performance Characteristics Sensitivity and Specificity The results of the study on sensitivity and specificity are summarized in Tables 2 3 see Appendix In establishing the sensitivity ofthe test a total of 878 anti HAV positive samples were investigated and the sensitivity was found to range from 98 5 to 100 initial testing and 99 0 to 100 retest result The reactivity of the test with seroconversion samples was investigated using 12 seroconversion panels The results showed that as regards detection of seroconversion Enzygnost Anti HAV has a sensitivity equivalent to that of a comparable test The analytical sensitivity of the test was found to be lt 20 IU L using the WHO International Standard Nevertheless the possibility cannot be ruled out that isolated samples may escape detection when the test is used on a large scale In establishing the specificity of the test a total of 586 anti HAV negative blood samples were investigated and the specificity was found to range from 96 6 to 100 initial testing and 98 3 to 100 retest result Deviations from these values may occur due to differences in sample population test procedure etc OQEC G11 00540 513 H 6 e IA 1 E 5 HEBT Current knowledge indicates that a positive anti HAV test result does not provide certainty of hepatitis A infecti
87. rrettes non utilis es dans le test et les conserver pour une utilisation future cf Tableau 1 Pour une exploitation quantitative du test tablir une courbe d talonnage cf Pr paration des r actifs et pr voir un dosage en double de chaque concentration du standard dans ce cas la le nombre de cupules n cessaires sera donc gal au nombre d chantillons plus 12 cupules pour les contr les et les dilutions du standard 2 Distribution des S rums standard de contr le et des chantillons Test qualitatif distribuer dans les 4 premi res cupules A1 a D1 25 ul de Serum de contr le Anti HAV n gatif dans les 2 cupules suivantes E1 et F1 25 ul du Serum standard Anti HAV 80 puis dans les cupules suivantes 25 ul de chacun des chantillons a tester Comme alternative on peut galement distribuer le S rum standard Anti HAV 80 une fois en d but de s rie et une fois en fin de s rie OQEC G11 C0540 513 H 20 e IT ED N Schema de pipetage distribuer dans 4 cupules 25 ul de Serum de contr le Anti HAV negatif dans une cupule 25 ul de Serum standard Anti HAV 80 puis dans les cupules suivantes 25 ul de chaque echantillon tester En fin de s rie ou de plaque distribuer de nouveau 25 ul de Serum standard Anti HAV 80 Test quantitatif distribuer dans 4 cupules A1 A2 B1 et B2 25 ul de Serum de contr le Anti HAV n gatif puis distribuer en double dans les 8 cupules suivantes 25 ul de chacune des qu
88. rum and plasma The processing of the enzyme immunoassay is done with the BEP II BEP Ill and BEP 2000 ELISA Processors The test was developed for testing individual samples not for pooled or diluted samples The product is for in vitro diagnostic use only Summary and Explanation The onset of hepatitis A 1 2 3 4 is always accompanied by detectable and usually high levels of anti HAV A negative result for a patient therefore excludes hepatitis A as a cause of illness After an infection anti HAV remains detectable for a lifetime so that detection of anti HAV is indicative of current immunity an essential criterion in deciding whether to supply active immunization by vaccination or to administer immunoglobulins for post exposure prophylaxis in at risk contacts Using the Anti HAV Standard Serum calibration curve for quantitative evaluation Enzygnost Anti HAV enables the HAV antibody levels to be quantified and expressed in IU L based on the WHO international standard Principle of the Method Enzygnost Anti HAV is an enzyme immunoassay based on the competitive test principle The specific antibodies contained in the test sample and the POD conjugated monoclonal antibodies to HAV compete for the binding sites on the HAV antigen which is likewise contained in a reagent added to the one step assay The quantity of conjugate which can be bound to the antigen depends on the concentration of the specific antibody in the sample
89. scuno dei primi 4 pozzetti A1 A2 B1 e B2 quindi distribuire 25 uL pozzetto di siero standard anti HAV nei successivi due pozzetti es 80 UI L nei pozzetti C1 e C2 40 UI L nei pozzetti D1 e D2 20 UI L nei pozzetti E1 e E2 e 10 UI L nei pozzetti F1 e F2 Distribuire quindi 25 uL pozzetto di campione nei successivi pozzetti se necessario prediluire Al termine dell operazione procedere immediatamente con la fase di distribuzione dell antigene 3 Distribuzione dell antigene aggiungere 50 uL di soluzione antigene in ogni pozzetto contenente i campioni e procedere immediatamente con la distribuzione del coniugato 4 Distribuzione del coniugato aggiungere 50 uL di soluzione d uso di coniugato in ogni pozzetto v nota ricoprire la piastra con pellicola e metterla immediatamente nell incubatore Nota in caso di esecuzione manuale per evitare risultati falsamente positivi la distribuzione del coniugato deve essere effettuata in modo che il puntale della pipetta non tocchi il bordo dei pozzetti e non venga a contatto con il campione 5 Incubazione incubare per 2 ore 5 min a 37 1 C e procedere subito con la fase di lavaggio 6 Lavaggio rimuovere la pellicola aspirare il liquido da ogni pozzetto e lavare 4x con ca 0 3 mL pozzetto di soluzione di lavaggio Conclusa la fase di lavaggio procedere subito con la dispensazione del reagente successivo per evitare l essiccamento dei pozzetti 7 Distribuzione del
90. so del crom geno Por cada placa de prueba diluir 1 ml de crom geno TMB con 10 ml de tamp n sustrato TMB en el frasco pl stico vac o adjunto y mantener cerrado protegido de la luz Despu s de su uso enjuagar cuidadosamente el frasco con agua destilada Por razones t cnicas sobrellenado no est permitido verter el contenido del crom geno TMB en el frasco de tamp n sustrato TMB Para el procedimiento cuantitativo se deben preparar las siguientes diluciones del suero est ndar 80 Anti HAV con el suero control Anti HAV negativo 40 UIA Diluci n 1 2 por ej 100 ul suero est ndar 80 Anti HAV 100 ul suero control Anti HAV negativo 20 UIA Diluci n 1 4 por ej 100 ul del suero est ndar 40 100 ul suero control Anti HAV negativo 10 UM Diluci n 1 8 por ej 100 ul del suero est ndar 20 100 ul suero control Anti HAV negativo Si se esperan concentraciones de anti HAV gt 60 UI I los sueros o plasmas se deben diluir de la siguiente manera Hasta 600 UI I diluci n 1 11 por ej 10 ul de muestra 100 ul de suero control Anti HAV negativo Hasta 6000 UI diluci n 1 101 por ej 10 ul de muestra 1000 ul de suero control Anti HAV negativo Hasta 60 000 UI diluci n 1 1111 por ej 10 ul de muestra 1000 ul de suero control Anti HAV negativo y de esto 10 ul 100 ul de suero control Anti HAV negativo Todas las etapas necesarias para la diluci n se deben realizar nicamente con el suero control Anti HAV
91. soluc o de antig nio e passar imediatamente a dosagem de conjugado 4 Dosagem de conjugado Acrescentar 50 ul de soluc o de uso do conjugado respectivamente a amostra e ao antig nio veja a Nota cobrir a placa de ensaio com pel cula aderente e colocar imediatamente na incubadora Nota Para n o adulterar os resultados em caso de execuc o manual a dosagem do conjugado deve ser efectuada de tal maneira que a ponta da pipeta n o toque no bordo da cavidade nem mergulhe no l quido da amostra 5 Incubac o Deixar incubar durante 2 horas 5 min aprox a 37 1 C imediatamente a seguir dar in cio amp lavagem 6 Lavagem Retirar a pel cula aderente aspirar o conte do de todos os po os e lavar cada um deles 4 vezes com aprox 0 3 ml de solu o de lavagem Depois das etapas de lavagem passar imediatamente dosagem de reagentes seguinte para evitar que sequem 7 Dosagem de substrato Dosear 100 ul de solu o de uso cromog nio em cada po o cobrir a placa com nova pel cula aderente 8 Incuba o do substrato Deixar incubar durante 30 2 min protegido contra a luz entre 18 e 25 C 9 Reac o de bloqueio Retirar a pel cula aderente e acrescentar a cada po o 100 ul de solu o de bloqueio POD mantendo o mesmo ritmo que em 7 10 Medi o Fazer uma medi o fotom trica a 450 nm no espa o de 1 hora Como comprimento de onda de refer ncia aconselha se 650 nm eventualmente entre 615 e 690 nm Execu
92. squ a la date de p remption Tampon Substrat TMB Apr s ouverture 2 8 C Jusqu a la date de p remption Solution d emploi du Chromog ne 1 11 2 8 C 5 jours 18 25 C 8 heures dans un r cipient ferm l abri de la lumi re Solution de lavage POD Apres ouverture 2 8 C Jusqu a la date concentr e de p remption 1 20 2 8 C 1 semaine 1 20 18 25 C 1 jour Solution d arr t POD Apr s ouverture 2 8 C Jusqu a la date de p remption OQEC G11 C0540 513 H 23 jamais au del de la date de p amp remption e Tab 2 Sensibilit _ TC II LE E 2 El A L tude de sensibilit men e sur deux sites ind pendants K et M a donn les r sultats suivants Collectif d chantillons Nombre Echantillons r actifs Echantillons r actifs d chantillons dans le test initial dans le retest M anti HAV positif 30 30 30 anti HAV positif plasmas 30 30 30 anti HAV IgG positif 157 157 157 anti HAV IgM positif 84 84 84 s roconversions 12 sensibilit identique celle d un test comparable K anti HAV positif 204 204 204 anti HAV positif 205 202 203 anti HAV positif 168 166 167 Tab 3 Specificite L tude de sp cificit men e sur deux sites ind pendants K et M a donn les r sultats suivants Collectif d chantillons Nombre Echantillons reactifs Echantillons r actits d echantillons dans le test initial dans le retest M
93. substrato distribuire in ogni pozzetto 100 uL di soluzione d uso di cromogeno e ricoprire la piastra con nuova pellicola 8 Incubazione incubare per 30 2 min a 18 25 1 C al riparo dalla luce 9 Arresto della reazione rimuovere la pellicola e aggiungere in ogni pozzetto 100 uL di soluzione bloccante POD rispettando lo stesso ritmo seguito per 7 Distribuzione del substrato 10 Lettura eseguire la lettura fotometrica a 450 nm entro 1 ora La lunghezza d onda di riferimento consigliata 650 nm o se necessario tra 615 e 690 nm Esecuzione del test con il BEP Ill Prima dell esecuzione sul BEP Ill preparare le piastre fino alla fase di dispensazione del campione punto 1 2 del paragrafo Esecuzione del test con BEP Il Tutte le fasi successive sono eseguite in maniera completamente automatica dall analizzatore v manuale d uso del BEP III Non coprire le piastre con la pellicola Terminata la dispensazione dei campioni mettere subito la piastra sul BEP III Le impostazioni dei tempi di incubazione nel software del BEP III possono differire da quelli del BEP Il per motivi tecnici velocit del sistema ma sono state validate per l Enzygnost sul BEP Ill Esecuzione del test con BEP 2000 Le fasi di dispensazione del campione e la successiva esecuzione del test sono eseguite in maniera completamente automatica dall analizzatore v manuale d uso del BEP 2000 OQEC G11 C0540 513
94. t Anti HAV Material Reagente Estado Conservac o Estabilidade Enzygnost Anti HAV Ap s abertura 2a 8 C 6 Semanas placa de ensaio em bolsa com restantes pocos c psulas secas Conjugado Anti HAV POD Ap s abertura 2 a 82 C 4 Semanas Tamp o conjugado Ap s abertura 2 a 8 C 4 Semanas Conjugado dilu do 1 40 2 a 8 C 4 Semanas pronto para uso 18 a 252 C 1 Semana Antigene HAV Ap s abertura 2 a 82 C 4 Semanas Soro standard Anti HAV 80 Ap s abertura 2 a 82 C 4 Semanas Soro de controlo Anti HAV negativo lt 20 C 3 Meses Diluig o standard Anti HAV Ap s prepara o 2 a 8 C 4 Semanas Verd nnung com soro standard 40 20 10 IU I Anti HAV 80 acabado de abrir Cromog nio TMB Ap s abertura 2 a 82 C At data de validade Tamp o substrato TMB Ap s abertura 2 a 82 C At data de validade Solu o de uso cromog nio 1 10 2 a 8 C 5 Dias 18 a 25 C 8 Horas recipiente fechado protegido contra a luz Soluc o de lavagem POD Ap s abertura 2 a 8 C At data de validade concentrado 1 20 2 a 8 C 1 Semana 1 20 18 a 25 C 1 Dia Solu o de bloqueio POD Ap s abertura 2 a 8 C At data de validade Jamais por um per odo de tempo para al m da data de validade OQEC G11 C0540 513 H 47 e ME II E E Tab 2 Sensibilidade Para as an lises de sensibilidade foram determinados os seguintes dados em dois centros independentes K M
95. t optique indicative lt 0 3 D O Agent de conservation ph nol max 1 g l S rum de contr le Anti HAV n gatif S rum humain exempt d anticorps anti HAV Valeur de densit optique indicative 2 0 7 D O Agent de conservation ph nol max 1 g l Solution de lavage POD concentr e Solution tampon phosphate 90 mmol l additionn e de Tween 18 g l Agent de conservation ph nol max 1 g l e Tampon Substrat TMB Peroxyde d hydrogene env 0 1 g l en solution tampon ac tate 25 mmol l Agent de conservation n butanol max 1 96 Chromogene TMB T tram thylbenzidine dihydrochlorure 5 g l Solution d arr t POD acide sulfurique 0 5 N Les r actifs l exception de la Solution de lavage POD de la Solution d arr t POD et de la solution d emploi du Chromog ne obtenue partir des lots de r actifs indiqu s pour le Chromogene TMB et le Tampon Substrat TMB ne peuvent tre utilis s que selon la combinaison des num ros de lots 6 chiffres indiqu s sur le coffret et dans le tableau des valeurs codes barres joint Mises en garde et pr cautions d emploi 1 R serv un usage de diagnostic in vitro 2 Tout don de sang individuel pr vu pour la pr paration des S rums standard et de contr le a t test vis vis de l AgHBs de l anticorps anti VHC de l anticorps anti VIH 1 et de l anticorps anti VIH 2 Seuls les dons trouv s n gatifs ont t utilis s N anmoins toutes les pr
96. tampata sulla confezione ed anche riportata nell allegata tabella con i codici a barre Avvertenze e precauzioni 1 Solo per uso diagnostico in vitro 2 Ogni singola donazione di sangue utilizzata per la produzione del siero standard e dei sieri di controllo stata esaminata per la ricerca dell HBsAg e degli anticorpi anti HCV anti HIV1 e anti HIV2 Solo i campioni risultati negativi sono stati impiegati per la produzione Tuttavia poich non possibile escludere con assoluta certezza il pericolo di agenti patogeni5 tutti i derivati da sangue umano devono essere trattati con le necessarie precauzioni rispettando le norme di sicurezza sul rischio biologico 3 L antigene HAV isolato da fibroblasti umani viene sottoposto ad un apposito processo di inattivazione reazione con propiolattone Tuttavia per sicurezza l antigene HAV dovrebbe essere trattato con le dovute cautele 4 Siconsiglia l uso di guanti di protezione durante l intera esecuzione del test 5 Perla distruzione del materiale solido infettivo si consiglia il trattamento in autoclave per almeno 1 ora a 121 C Tutti i liquidi aspirati devono essere raccolti in due raccoglitori collegati in serie raccoglitori dovrebbero contenere un disinfettante adatto all inattivazione dei virus patogeni umani Osservare le concentrazioni ed i tempi di incubazione indicati dal produttore OQEC G11 C0540 513 H 27 e I IT A E E Preparazione dei reagenti Prima dell in
97. tif 1x6ml Solution de lavage POD concentr e 1x 100 ml Tampon Substrat TMB 1x30 ml Chromog ne TMB 1x3ml Solution d arr t POD 1x 100 ml Flacon vide pour solution d emploi du Chromog ne 1 piece Feuilles adh sives 6 pi ces Sachets PE pour la conservation des barrettes non utilis es 1 piece Tableau de valeurs codes barres 1 piece Fiche technique 1 piece OQEC G11 C0540 513 H 18 Edition Mars 2003 ATT COS WE Composition Enzygnost Anti HAV plaque test Plaque de microtitration recouverte d anticorps humains anti antig ne du virus de l h patite A Conjugu Anti HAV POD Anti HAV monoclonal souris conjugu la peroxydase POD en solution tampon Tris 0 05 mol l Dilution d emploi 1 41 en Tampon Conjugu Anti HAV Agent de conservation ph nol max 1 g l Tampon Conjugu Anti HAV comme solution de dilution pour le Conjugu Anti HAV POD contient de la glyc rine 100 g l du Tween 20 20 g l du chlorure de sodium 8 8 g l de l EDTA 1 9 g l de l albumine bovine 1 g l de la polyg line et du phosphate 50 mmol l Agent de conservation ph nol max 1 g l Antigene HAV Antigene du virus de l h patite A obtenu partir de fibroblastes humains inactiv Agent de conservation ph nol max 1 g l S rum standard Anti HAV 80 Serum humain contenant des anticorps anti HAV valeur nominative de 80 20 IU I en r f rence la pr paration de r f rence de l OMS Valeur de densi
98. uffer Substrate TMB once opened 2 to 8 C expiry date Working Chromogen Solution 1 10 2 to 8 C 5 days 18 to 25 C 8 hours sealed container protected from light Washing Solution POD once opened 2 to 8 C expiry date concentrate 1 20 2 to 8 C 1 week 1 20 18 to 25 C 1 day Stopping Solution POD once opened 2 to 8 C expiry date in no case past the expiration date OQEC G11 C0540 513 H 7 A Tab 2 Sensitivity NIH The sensitivity studies performed at two independent centers K M yielded the following data Sample population Number of samples initial reactive retest reactive M Anti HAV positive Anti HAV positive Plasmas Anti HAV IgG positive Anti HAV IgM positive Seroconversions K Anti HAV positive Anti HAV positive Anti HAV positive 30 30 157 84 12 204 205 168 30 30 30 30 157 157 84 84 Sensitivity corresponds to the sensitivity of a comparable test 204 204 202 203 166 167 Tab 3 Specificity The specificity studies performed at two independent centers K M yielded the following data Sample population Number of samples initial reactive retest reactive M normal negative sera normal negative plasma samples K normal negative sera normal negative sera 50 50 176 310 0 0 0 0 6 3 9 5 Tab 4 Reproducibility In the studies on reproducibility the sampl
99. un r sultat n gatif ne permet pas avec certitude d exclure la pr sence d une infection par le virus de l h patite A ou d une immunisation Reproductibilit Les r sultats de l tude de r p tabilit et de reproductibilit sont r sum s dans le tableau 4 en annexe Les valeurs indiqu es sont donn es titre d exemple Selon la r alisation du test par ex on peut obtenir des valeurs tr s divergentes Enzygnost et BEP sont des marques d pos es de Dade Behring Marburg GmbH aux USA en Allemagne et dans d autres pays Dade Behring Marburg GmbH Emil von Behring Str 76 D 35041 Marburg Conservation Stabilit 6 semaines www dadebehring com Tab 1 Stabilit s et conditions de conservation Enzygnost Anti HAV R actif Pr paration tat Enzygnost Anti HAV Apr s ouverture 2 8 C plaque test barrettes dans sachet avec capsules dessicatives Conjugu Anti HAV POD Apr s ouverture 2 8 C 4 semaines Tampon Conjugu Apr s ouverture 2 8 C 4 semaines Solution d emploi du Conjugu 1 41 2 8 C 4 semaines 18 25 C 1 semaine Antigene HAV Apres ouverture 2 8 C 4 semaines Serum standard Anti HAV 80 Apr s ouverture 2 8 C 4 semaines Serum de contr le Anti HAV n gatif lt 20 C 3 mois Dilutions du Standard Apres preparation 2 8 C 4 semaines Anti HAV 40 20 10 Ul ml avec le S rum standard Anti HAV 80 juste ouvert Chromog ne TMB Apr s ouverture 2 8 C Ju
100. una determinaci n cuantitativa del contenido de anticuerpo HAV y su declaraci n en Ul l con relaci n a un est ndar internacional de la OMS Principio del m todo El Enzygnost Anti HAV es un ensayo inmunoenzim tico seg n el principio de ensayo competitivo Los anticuerpos espec ficos contenidos en la muestra a investigar y los anticuerpos contra HAV conjugados con POD compiten por el sitio de uni n del ant geno HAV que igualmente se a ade como reactivo componente del ensayo de una etapa Dependiendo de la concentraci n de anticuerpos espec ficos existentes en la muestra se puede unir mayor o menor cantidad de conjugado al ant geno El complejo inmunol gico formado se une al anticuerpo HAV espec fico fijado a la superficie de la placa de microtitulaci n Despu s de retirar por lavado los componentes que no se han unido se determina la actividad enzim tica ligada del conjugado La transformaci n enzim tica del sustrato y del crom geno reacci n de color azul se va a interrumpir a adiendo la soluci n de detenimiento POD reacci n de color amarillo La intensidad del color es indirectamente proporcional a la concentraci n de anticuerpos existente en la muestra Reactivos Contenido del envase comercial Enzygnost Anti HAV 1x96 Enzygnost Anti HAV placa de prueba 1 unidad Conjugado Anti HAV POD 1x0 4ml Tamp n para conjugado Anti HAV 2x6ml Antigeno HAV 2x6ml Suero est ndar 80 Anti HAV 1x0 5 ml Suero
101. vit del test per i campioni in sieroconversione stata verificata analizzando 12 pannelli di sieroconversione L Enzygnost Anti HAV ha dimostrato una sensibilit corrispondente a quella di test analoghi in merito alla precocit di rilevamento della sieroconversione La sensibilit analitica risultata essere x 20 UI L secondo lo standard internazionale dell OMS Non si pu tuttavia escludere la possibilit che con l impiego del test su vasta scala qualche campione possa risultare non identificato Per la valutazione della specificit sono stati esaminati complessivamente 586 campioni di sangue anti HAV negativo ed risultata una specificit del 96 6 100 nel test iniziale e del 98 3 100 nella ripetizione del test Possibili scostamenti da tali valori possono dipendere dal tipo di collettivit esaminata dalla modalit di esecuzione del test o da altre variabili Le attuali conoscenze indicano che un risultato di un test anti HAV positivo non indica la certezza di un infezione da epatite A oppure di un immunit recente cos come un risultato negativo non esclude in modo attendibile la presenza di un infezione da epatite A oppure una immunit recente Riproducibilit risultati per la riproducibilit intra inter serie sono riassunti nella Tabella 4 in appendice Questi dati si basano su calcoli esemplificati Deviazioni da questi valori sono senz altro possibili e sono dovute alle differenti procedure analitiche
102. with previously dispensed sample and proceed immediately to the conjugate dispensing step OQEC G11 C0540 513 H 4 e IT MENTA 4 Dispense Conjugate Add 50 uL of working conjugate solution to each well see Note seal the test plate with foil and place immediately in the incubator Note If the test is performed manually to avoid falsified results the conjugate must be dispensed in such a menner that the tip of the pipette does not touch the edges of the wells and does not contact the sample 5 Incubation Incubate for 2 hours 5 minutes at 37 1 C Proceed immediately to the wash step 6 Wash Remove the foil aspirate all the wells and wash 4x with approximately 0 3 mL well of washing solution After completing the wash cycles proceed immediately to the next reagent dispensing step otherwise the wells may dry out 7 Dispense Substrate Pipette 100 uL of the Working Chromogen Solution into each well and cover the plate with fresh foil 8 Incubate Incubate at 18 to 25 C for 30 2 minutes protected from light 9 Stop reaction Remove the foil and add 100 uL of Stopping Solution POD to each well keeping to the same timing as in 7 Dispense Substrate 10 Read Measure in the photometer at 450 nm within one hour The recommended reference wavelength is 650 nm or if necessary between 615 and 690 nm Procedure for the BEP Ill If the test is processed using the BEP III the test plates must be

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