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Sofia Alexandra Fagundes Lopes - Repositório da Universidade dos

1. 15 Figura 3 Ciclo Espermatog nico cccecceeccesseceeseeececeeeceseceeeeesacecnaeceeeeeeeenaeees 18 Figura 4 Esquema do Comportamento Sexual nas Fases de C rte e C pula 20 Figura 5 Avalia o das Caracter sticas Seminais por Observa o Directa 39 Figura 6 Grelha de Contagem do Hemocit metro ssesssssessesssessseessseeessresseess 44 XVII Lista de abreviaturas siglas e simbolos ARN Acido Ribonucleico ALH Amplitude do deslocamento lateral da cabe a do espermatoz ide BCF Frequ ncia de batimento flagelar cruzado BSA Albumina S rica Bovina CASA Computer Assited Semen Analysis cm Centimetro CP Crioprotectores DMSO Dimetilssulf xido FITC Isotiocionato de Fluoresce na FITC PSA Isotiocionato de Fluoresce na associado aglutinina de Pisum sativum FSH Hormona fol culo estimulante GH Hormona de Crecimento GnRH Hormona libertadora de Gonodotrofinas PI Iodeto Prop dico LH Hormona Luteinizante LN Linearidade mg Miligramas ml Mililitro XVIII mM Milimole mm Milimetro mm2 Milimetro ao quadrado mm3 Milimetro ao cubo MT Motilidade total MP Motilidade progressiva nm Nan metro PBS Solu o tamp o fosfato salino pH Potencial hidrogeni nico PRL Prolactina SDAT Servi o de Desenvolvimento Agr rio da Terceira SNC Sistema Nervoso Central Spz Espermatoz ides Spz ml Esperma
2. o das doses de s men recolhidas estas variaram entre branco branco acinzentado a amarelado A consist ncia variou entre densa e cremosa 5 valores cremosa 4 valores e pouco cremosa 3 valores segundo o Quadro 1 75 Relativamente ao volume do s men Quadro 4 os bodes 1 e 2 apresentaram valores muito semelhantes tendo o bode 3 apresentado um valor m dio 20 superior sem contudo atingir o nivel de signific ncia estat stica 4 2 Avalia o Microsc pica do S men 4 2 1 Avalia o da Motilidade Massal Na motilidade observaram se classifica es de 4 e 5 valores uma vez que os movimentos de onda obtidos variaram entre 60 e mais de 80 spz vivos Ainda com o s men fresco procedeu se a uma avalia o mais detalhada por citometria de fluxo de modo a determinar a percentagem de espermatoz ides vivos e mortos em cada uma das amostras de s men Embora n o se tenha procedido congela o do s men do bode 0 no ejaculado que se obteve 60 de motilidade massal avaliou se a viabilidade esperm tica de modo a comprovar que a elimina o deste bode para dador de s men tinha sido uma boa op o Deste modo p de se constatar que a viabilidade do mesmo era muito reduzida sendo a percentagem de espermatoz ides vivos de apenas 28 63 Nos restantes animais observaram se taxas de sobreviv ncia mais elevadas sendo o reprodutor 3 o que obteve melhores resultados com 42 39 8 54 de spz vivos Quadro 4 Tamb m de sa
3. Designam se por espermatoz ides os g metas masculinos produzidos nos tubos semin feros dos test culos S o c lulas complexas e altamente especializadas que devem manter a integridade de todas ou parte das suas fun es para serem fecundantes No bode o espermatoz ide tem aproximadamente 60 um de comprimento sendo formado por tr s zonas distintas cabe a pe a intermedi ria e cauda Fig 1 na cabe a que se encontra a informa o gen tica transmitida descend ncia uma vez que nesta zona do espermatoz ide que est contido o ADN uma pequena quantidade de citoplasma e o acrossoma Este ltimo forma uma esp cie de ves cula que cont m enzimas hidrol ticas fundamentais para a penetra o do espermatoz ide na zona pel cida Vidigal 2008 O tamanho da cabe a do espermatoz ide pode variar entre 8 a 10 um de comprimento 4 um de largura e 1 um de espessura Guerreiro 2002 be 2 Fiamento axe NA M Na S J ia a Skee Figura 1 Partes Constituintes do Espermatoz ide Adaptado Baril et al 1993 11 A pe a intermedi ria ou colo a zona interm dia do espermatoz ide que estabelece a liga o entre a cabe a e a cauda A cauda ou tamb m designado por flagelo a pe a do espermatoz ide que lhe confere a locomo o este factor que nos permitir visualizar a motilidade esperm tica na presen a de fluidos Vidigal 2008 A cauda pode ser subdividida em tr s zonas as quais s
4. UNIVERSIDADE DOS ACORES Departamento de Ci ncias Agrarias Influ ncia de diferentes curvas de congela o sobre a integridade do acrossoma de c lulas esperm ticas de s men caprino TESE DE MESTRADO EM ENGENHARIA ZOOT CNICA Sofia Alexandra Fagundes Lopes Angra do Hero smo 2013 UNIVERSIDADE DOS ACORES Departamento de Ci ncias Agrarias Influ ncia de diferentes curvas de congela o sobre a integridade do acrossoma de c lulas espermaticas de s men caprino Sofia Alexandra Fagundes Lopes Orientadores Prof Doutor Henrique Jos Duarte da Rosa Prof Doutor Joaquim Fernando Moreira da Silva TESE DE MESTRADO EM ENGENHARIA ZOOTECNICA Angra do Heroismo 2013 II Dedico esta tese 4 pessoa que mais me marcou durante o percurso acad mico ao meu bisav pelos ensinamentos e sabedoria de viver HI Aprendi que n o posso exigir o amor de ningu m Posso apenas dar boas raz es para que gostem de mim E ter paci ncia para que a vida fa a o resto William Shakespeare IV Agradecimentos N o queria deixar de agradecer a todos aqueles que de alguma forma contribu ram para a realiza o deste trabalho e que me acompanharam ao longo do percurso acad mico Ao meu orientador Doutor Henrique Jos Duarte da Rosa pelo seu apoio ensinamento amizade e sobretudo paci ncia e disponibilidade prestada ao longo da realiza o deste trabalho Ao meu orientador Doutor Joaquim Fernand
5. rg o o impulso conduzido aos nervos vomeronasais seguindo para o c rebro onde activado o centro neuronal a partir deste sinal que se desencadeiam sentimentos de prazer como o relacionamento sexual sendo a hip fise estimulada e consequentemente as gonadas atrav s de sinais end crinos Vitaliano 2011 O rg o vomeronasal apenas tem como fun o receber as feromonas e converter nas respectivas emo es e comportamentos provocando respostas espec ficas de conduta e desenvolvimento ou reprodu o no receptor Vitaliano 2011 Nos caprinos tal como na maioria das esp cies o comportamento sexual depende essencialmente de dois factores de factores internos referidos anteriormente como o 21 caso da taxa de hormonas esteroides e factores externos como a sazonalidade Vitaliano 2011 O comportamento sexual do macho baseia se essencialmente em dois factores a libido e a capacidade de servi o A libido definida como o desejo que o macho tem de montar e realizar a c pula Designa se por capacidade de servi o a capacidade que o macho apresenta ao montar e realizar a c pula na f mea Em primeiro lugar o comportamento sexual de um macho adulto depende de secre es hormonais e seguidamente de eventos sociais O desencadear do acto sexual resulta da interac o destes dois factores sendo o segundo factor o respons vel pelo desencadear do primeiro Factores externos como nutri o ou clima podem ainda intera
6. 3 105 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz mortos com acrossoma danificado spz MAD Quadro 8 13 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz mortos com acrossoma danificado spz MAD das diferentes curvas de congela o Estimates Measure MEASURE 1 Std Error 95 Confidence Interval 72 641 74 402 74 827 Quadro 8 14 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz mortos com acrossoma danificado spz MAD dos bodes Estimates Measure MEASURE 1 Bode Mean Std Error 95 Confidence Interval Quadro 8 15 M dia e Erro Padrao das percentagens dos spz mortos com acrossoma danificado spz MAD no dia da colheita Estimates Measure MEASURE 1 DiaColheita Mean Std Error 95 Confidence Interval Upper Bound 106 An lise de vari ncia e testes de compara es m ltiplas relativa percentagem de spz vivos e com acrossoma intacto Quadro 8 16 ANOVA de factores independentes Tests of Between Subjects Effects Measure MEASURE 1 Transformed Variable Average Source Type III Sum of Mean Square Ra ia Squares 15788 089 15788 089 6083 499 2 675 1 337 15 581 024 290 512 111 941 10 381 2 595 Quadro 8 17 Teste de compara es m ltiplas para os bodes Pairwise Comparisons Measure MEASURE 1 I Bode J Bode Mean Std Error Sig 95 Confidence Interval for Difference l J a Difference 848 759 000 Based on estimated marginal means The mean differe
7. A cor do s men pode variar de animal para animal e em fun o dos elementos anormais que possa conter A consist ncia indica nos de um modo geral se a concentra o esperm tica baixa ou alta ou seja um ejeculado com uma apar ncia mais aquosa ser indicativo de uma baixa concentra o de espermatoz ides 3 2 2 Volume O volume foi avaliado por micropipetagem imediatamente a seguir s recolha de modo a garantir maior exactid o 3 2 3 Mobilidade Massal Esta avalia o foi efectuada o mais r pido poss vel uma vez que o decr scimo dos movimentos acentuado com o passar do tempo Deste modo colocou se uma gota de 5 ul de s men puro numa l mina previamente aquecida a 37 C na estufa tendo sido 70 observada no microsc pio ptico com uma amplia o de 100x Avaliou se o vigor dos movimentos de onda em v rios campos de acordo com o descrito no Quadro 2 3 2 4 Concentra o Esperm tica A concentra o foi determinada por contagem atrav s da c mara de Neubauer preparando uma solu o para a mesma A solu o resultou da dilui o de 10 ul de s men puro com 990 ul de gua destilada dilui o1 100 Nos casos onde n o era poss vel efectuar a contagem devido concentra o esperm tica a dilui o era de 1 1000 Ap s a homogeneiza o da solu o preparou se a c mara de Neubauer colocando se 5 ul de gua destilada em cada um dos lados da l mina para fixar a lamela e posteriormen
8. Difference Upper Bound Based on estimated marginal means The mean difference is significant at the 05 level b Adjustment for multiple comparisons Least Significant Difference equivalent to no adjustments 110 An lise de vari ncia e testes de compara es m ltiplas relativa percentagem de spz mortos e com acrossoma intacto Quadro 8 24 ANOVA de factores independentes Tests of Between Subjects Effects Measure MEASURE 1 Transformed Variable Average Source Type III Sum of Mean Square ES Ea Squares Intercept 9647 316 9647 316 4578 484 Curva 4 528 2 264 1 074 Bode 411 621 205 811 97 675 Error 8 428 2 107 Quadro 8 25 Teste de compara es m ltiplas para os bodes Pairwise Comparisons Measure MEASURE 1 I Bode J Bode Mean Std Error Sig 95 Confidence Interval for Difference l J au al Difference 171 684 000 10 071 6 271 10 290 6 490 6 271 10 071 2 119 1 681 6 490 10 290 1 681 2 119 Based on estimated marginal means The mean difference is significant at the 05 level b Adjustment for multiple comparisons Least Significant Difference equivalent to no adjustments 111 Quadro 8 26 ANOVA para dia de colheita Tests of Within Subjects Effects Measure MEASURE 1 Squares Sphericity Assumed 41 649 20 825 Greenhouse Geisser 41 649 21 428 DiaColheita Huynh Feldt 41 649 n 20 825 Lower bound 41 649 j 41 649 Sphericity Assumed 3 594 898 G
9. N Std Deviation Std Error of Mean Mean N Std Deviation Std Error of Mean Mean N Std Deviation Std Error of Mean Mean N Std Deviation Std Error of Mean Spz mortos e Acrossoma Intacto 15 0358 9 7 10195 2 36732 13 8576 10 5 06297 1 60105 13 1485 8 8 43113 2 98086 14 0402 27 6 64312 1 27847 Spz mortos e Acrossoma Intacto Spz mortos e Acrossoma Spz mortos e Acrossoma Danificado 84 9642 9 7 10195 2 36732 86 1424 10 5 06297 1 60105 86 8515 8 8 43113 2 98086 85 9598 27 6 64312 1 27847 102 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz vivos com acrossoma intacto spz MAT Quadro 8 4 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz vivos com acrossoma intacto spz MAI das diferentes curvas de congela o Estimates Measure MEASURE 1 Curva Mean Std Error ERES Confidence Interval Lower Bound Quadro 8 5 M dia e Erro Padrao das percentagens dos spz vivos com acrossoma intacto spz MAI dos bodes Estimates Measure MEASURE 1 Bode Mean Std Error 95 Confidence Interval 10 971 23 104 20 960 Quadro 8 6 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz vivos com acrossoma intacto spz MAI no dia da colheita Estimates Measure MEASURE 1 2 3 103 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz vivos com acrossoma danificado spz MAI Quadro 8 7 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz vivos com acrossoma danifica
10. Saanen and 1 Alpine breed aged more than 2 years Collections 3 per animal were carried out during February 2012 in three sessions with 5 day intervals following a factorial experimental design with repeated measures The collections were always made in the mornings starting at around 08 00 hours and during each collection period the bucks alternated randomly The semen was collected with an artificial vagina after the bucks had been trained with a female induced in heat The artificial induction of heat was achieved with an intramuscular injection of 250 ug of oestradiol benzoate dissolved in 2 ml of mineral oil applied 24 to 48 hours prior to be necessary followed by a further injection applied 24 hours after at a dose of 100 ug in order to ensure the continuation of the heat for the next 24 hours In the laboratory took place the evaluation of seminal characteristics like volume sperm concentration and massal mobility After the counting of live and dead sperm by flow cytometry the procedures followed with the freezing of semen according to the three curves which differed in ramp cooling The temperatures of the different curves were similar varying only in the temperature of the second cooling ramp Curve A 25 C min Curve B 35 C min and Curve C 45 C min To test the influence of the curves on the acrosome integrity the cytometer was used again to determine the percentage of live and dead spermatozoa and the acrosom
11. a espermatog nese e a produ o de hormonas A espermatog nese o processo no qual ocorre a produ o de espermatoz ides imaturos com uma dura o aproximada de 61 dias nos ruminantes A produ o de hormonas ocorre no processo designado por esteroidogenese originando se essencialmente testosterona progesterona e estrog nios Os test culos durante o seu desenvolvimento fetal descem o canal inguinal at ao exterior da cavidade abdominal onde s o revestidos pela bolsa escrotal No escroto os dois test culos assumem uma posi o vertical e uma forma ov ide pesando cada um em m dia 50 a 300g segundo a idade a esp cie a ra a a poca reprodutiva e o estado nutricional do animal Baril et al 1993 Granados et al 2006 Os test culos devem apresentar se sim tricos em forma e tamanho el sticos e com uma consist ncia firme e m vel a bolsa escrotal a qual nos adultos atinge um per metro de 25cm Leite Browning 2009 Cada test culo possui o sistema sangu neo e nervoso independente A temperatura do test culo sempre inferior s restantes c lulas do corpo do bode e para que o processo de espermatog nese ocorra em boas condi es necess rio que a temperatura dos test culos se encontre ligeiramente abaixo da temperatura corporal entre 4 a 7 graus cent grados a menos Para este facto contribuem essencialmente os test culos e o escroto Esta termorregula o efectuada atrav s da suda o testicular
12. cnicas associadas indu o e sincroniza o hormonal de estro e de ovula o permite a produ o de crias e leite fora da poca reprodutiva Apesar do recurso insemina o artificial com s men congelado n o ser recente ainda se verificam taxas de sucesso baixas Isto deve se ao facto do s men caprino apresentar diferentes caracter sticas em rela o a outros ruminantes como por exemplo os bovinos Nos pequenos ruminantes e em particular na cabra a insemina o artificial desenvolveu se sobretudo a partir dos anos 70 Ponsart et al 2004 A criopreserva o de s men de mam fero um complexo processo que envolve o equil brio entre v rios factores afim de se obter resultados satisfat rios Apesar de todas as c lulas suportarem stresses f sicos semelhantes associados a estes processos o s men de diferentes esp cies varia na composi o forma tamanho e l pidos os quais afectam a criopreserva o A diferen a mais not ria e que alguns autores afirmam diminuir a taxa de sobreviv ncia dos espermatoz ides aquando da congela o a presen a de conte do enzim tico proveniente das gl ndulas bulbo uretrais que se encontra no plasma seminal A enzima a fosfolipase que hidrolisa a lecitina do diluidor base de gema de ovo em cidos gordos e lisolecitinas que afectam a viabilidade esperm tica Gibbons 2002 Para al m deste facto durante o processo de criopreserva o o espermatoz ide passa por mud
13. com defici ncias na cauda enrolada partida entre outras e com a presen a de gotas citoplasm ticas Baril et al 1993 2 8 2 4 T cnicas de Avalia o de S men in Vitro Tradicionalmente a avalia o de s men baseia se em par metros como o volume aspecto e determina o da concentra o que consiste na observa o da motilidade e morfologia esperm tica num microsc pio de luz convencional Contudo estes m todos n o deixam de ser subjectivos Nos ltimos anos tem se reunido esfor os no sentido de melhorar a avalia o seminal o que levou ao aparecimento de t cnicas de avalia o in vitro Estas t cnicas permitem um conhecimento mais detalhado de v rias caracter sticas esperm ticas 49 A avalia o do s men in vitro permite determinar a capacidade reprodutiva de um macho como reprodutor al m de complementar informa es obtidas durante a realiza o do exame cl nico Esta contribui o passa pela avalia o da fun o testicular epididim ria e de todo o sistema reprodutor do macho Para al m destes par metros importante para determinar o grau de normalidade das c lulas esperm ticas antes de serem processadas para o uso na insemina o artificial Uma das t cnicas in vitro que tem tido maior desenvolvimento a colora o fluorescente que permite ter uma an lise mais ampla da qualidade do s men a v rios n veis tais como ultra estrutural funcional e bioqu mico Vidigal 2008 Batis
14. de uso rectal com um electrodo bipolar Os estimuladores el ctricos apresentam uma bateria com 10 a 15 volts Segundo Evans e Maxwell 1987 quando o animal apresenta o recto seco recomendado utilizar uma descarga de 15 volts Recomenda se que os est mulos sejam aplicados a cada sete segundos com um aumento de 1 volt A ejacula o ocorre ap s 4 a 7 est mulos Muniz 2003 Este m todo apenas deve ser utilizado em machos reprodutores que n o possam ser treinados ou que se recusem saltar perante vagina artificial No entanto a aplica o deste m todo faz com que aumente a quantidade de plasma seminal na recolha do s men Durante a recolha o bode pode estar de p ou deitado de lado sobre uma mesa Antes da recolha deve se proceder limpeza da glande do p nis e segurar na mesma com uma gaze est ril para que o ap ndice filiforme e a uretra fiquem dirigidos para o interior do tubo de recolha e assim diminuir as percas de s men O volume do ejaculado pelo m todo de electroejacula o ligeiramente superior ao recolhido pelo m todo de vagina artificial e com uma concentra o esperm tica mais baixa Muniz 2003 A sonda rectal deve ser humedecida ou lubrificada com vaselina ou gel de palpa o rectal e introduzida no recto a uma profundidade de 15 a 20 cm com cuidado de modo a evitar les es nomeadamente na mucosa intestinal Guerreiro 2002 O p nis deve ser distendido de modo a endireitar a curva sigmoide e assim facilit
15. dilata o veia esperm tica devem ser exclu dos do programa de insemina o Por vezes na selec o do macho negligenciada a sua capacidade de salto e vigor sexual Estes aspectos podem ser observados aquando da exposi o do macho perante a f mea em cio A dificuldade em efectuar o salto pode dever se a traumas f sicos como artrite pieira ou les es no p nis Tamb m influenciada pelo temperamento e conduta sexual do macho Em ltima an lise fundamental que o macho seleccionado produza s men de boa qualidade e quantidade 2 7 4 Prepara o dos Machos Dadores de S men Os machos podem manifestar esterilidade transit ria devido a v rias condi es de stress como por exemplo a temperatura ou humidade elevadas a mudan a de ambiente de dieta entre outros factores Deste modo tratamentos para combater o stress devem ser efectuados com anteced ncia de pelo menos 6 a 8 semanas antes do programa de recolha Maia 2010 Deve observar se se alguns procedimentos de rotina s o factores de stress para o animal como por exemplo o c rte de cascos Tamb m o transporte dos animais um factor causador de stress pelo que deve ser efectuado com alguma anteced ncia para que seja poss vel a adapta o a um novo ambiente e dieta 33 Tem sido demonstrado que a administra o de concentrados com valores de prote na altos pode aumentar a produ o de espermatoz ides Evans e Maxwell 1987 Desta forma a nutri o
16. estar a 42 45 C e pode ser confirmada pela introdu o de um term metro est ril Se a 30 vagina estiver muito fria deve ser adicionada gua mais quente do que a inicialmente utilizada Para evitar o choque t rmico dos espermatoz ides os tubos de recolha devem estar aquecidos a 30 37 C Nos climas mais frios onde dif cil manter a temperatura da vagina artificial nos 42 45 C pode se mant la por um curto espa o de tempo dentro de uma incubadora a 37 C antes de ench la de gua Evans e Maxwell 1987 2 7 2 2 T cnica de recolha com Vagina Artificial A f mea na altura da recolha de s men n o deve apresentar p lo comprido nem sujidade na parte traseira A recolha de s men feita com o t cnico agachado no lado direito da f mea com a vagina artificial na sua m o direita junto ao flanco da f mea A vagina artificial na m o do t cnico deve tomar uma posi o de 45 dirigida para o p nis do macho e ligeiramente inclinada para baixo Evans e Maxwell 1987 Sousa 2000 O tubo de recolha deve ser mantido parcialmente quente pela m o que o segura Evans e Maxwell 1987 O t cnico deve estar atento pois geralmente ap s a entrada do macho na sala de recolha inicia se um comportamento de c rte seguido quase de imediato por um salto repentino Evans e Maxwell 1987 Aquando do salto o t cnico deve desviar o p nis com a m o esquerda para o interior da vagina artificial Imediatamente ap s a recolha o tubo deve
17. gicas O m todo mais utilizado para determinar a percentagem de espermatoz ides vivos e as suas anomalias morfol gicas por colora o diferencial Estes m todos dividem se em vitais se tiverem por finalidade determinar a percentagem de espermatoz ides vivos e totais se para al m de determinarem a percentagem dos espermatoz ides vivos avaliam as anomalias morfol gicas sousa 2000 Os espermatoz ides anormais s o detectados em esfrega os e corados numa l mina sendo poss vel examinar cada ejaculado no campo durante um programa de insemina o artificial Contudo fundamental observar o s men previamente s recolhas se os animais foram recentemente introduzidos no local ou caso manifestem outros sintomas de stress que possam afectar a qualidade do s men Tamb m aconselh vel durante o decorrer do programa de insemina o a verifica o peri dica da qualidade do s men dos bodes dadores Evans e Maxwell 1987 O m todo mais utilizado para determinar a percentagem de espermatoz ides vivos e normais por colora o com eosina nigrosina Esta teste baseado na permeabilidade do acrossoma eosina ou seja os espermatoz ides mortos na altura da colora o apresentam o acrossoma total ou parcialmente rosado ou vermelho Baril et al 1993 Aparecem tamb m espermatoz ides parcialmente corados apenas com metade da cabe a corada estes devem ser inclu dos no n mero de mortos Segundo Maia 2010 alguns a
18. o da luz tem por base o princ pio f sico que explica que quando um raio de luz choca contra uma part cula altera a direc o da luz no seu comprimento de onda As caracter sticas celulares que contribuem para a dispers o da luz s o o tamanho celular o n cleo a membrana celular e o material granular do interior da c lula complexidade celular Al m disso tamb m tem influ ncia na luz dispersada a forma da c lula e a sua superf cie lisa ou rugosa No entanto a luz n o se dispersa de igual forma em todas as direc es Ou seja a maioria dispersa directamente para a frente Sendo assim a luz que se dispersa frontalmente relaciona se com o tamanho celular do ingl s Forward Scatter FSC enquanto que a luz que se dispersa em ngulo recto do ingl s Side Scatter SSC est relacionada com a densidade celular e com a granularidade da c lula n o tendo correla o com o tamanho Corantes fluorescentes espec ficos fluorocromos s o utilizados para observar os componentes celulares que se deseja Assim as c lulas previamente coradas com fluorocromos uma vez excitadas pelo laser emitem luz de acordo com as suas caracter sticas fluorescentes e s o utilizadas para examinar aspectos bioqu micos biof sicos e moleculares das c lulas Por fim o sistema electr nico respons vel por converter o sinal ptico num sinal electr nico que posteriormente ser analisado por um computador 53 2 8 2 4 1 2 Proce
19. 2 Propor o Espermatoz ides M veis Este m todo utilizado para amostras de s men que foram dilu das e que podem ter diminu do a motilidade ap s o armazenamento Nestes casos deve recorrer se a uma amplia o maior 400x para observar os espermatoz ides individualmente A fase de aquecimento do microsc pico deve estar ligada para garantir a temperatura ptima de sobreviv ncia dos espermatoz ides O t cnico deve observar os v rios campos da l mina e avaliar de forma percentual os espermatoz ides que s o progressivamente m veis e que apresentam movimentos rectil neos Se a concentra o esperm tica for elevada que n o possibilite uma observa o individual dos espermatoz ides deve proceder se a uma dilui o gradual at conseguir se um bom plano de visualiza o dos mesmos No entanto de real ar que quanto menor for o factor de dilui o menor a margem de erro em qualquer avalia o esperm tica que se efectue Existem aparelhos mais sofisticados para determinar a motilidade do que os anteriormente referidos Estes podem por exemplo projectar a imagem do microsc pio numa tela e posteriormente utiliz la como fotografia Quando estas imagens s o processadas por computador estima se de forma precisa o n mero de espermatoz ides m veis e os seus movimentos de onda No entanto este tipo de equipamento caro e n o m vel Na pr tica os m todos de avalia o acima descritos s o suficientemente adeq
20. 2 parando rasa ee elas aaa sg artes tae os ede aise cee da E a Ep 83 VI Conclus es e Perspectivas PUTAS scan sis ei aaa UDIT 88 NAT ABIDNOSTAN A CA a O a A Aa 89 VIT ANEXOS apra AIR E OO MUDO AS a O gas a 100 XV Indice Quadros Quadro 1 Concentra o S men Avaliado pela Consist ncia Quadro 2 Determina o da Motilidade Massal Quadro 3 Curvas de Congela o com respectivas Rampas e Temperaturas de ATTETECIMENTO ssa sai dao ua dE vs Pont Tala cuba Vas cai Sadus a ada OU dt AE ad aa a dali E a oa Quadro 4 M dias e Erro Padr o dos par metros avaliados no s men fresco dos diferentes bodes As diferen as observadas n o foram estatisticamente Sea pi DE 60 Br RAD RCE TR SRP RE TR SR RO OD TR Quadro 5 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz vivos com acrossoma intacto spz VAD vivos com acrossoma danificado spz VAD mortos com acrossoma intacto spz MAT e mortos com acrossoma danificado spz MAD ssa iaama sabia baga taia sos poesia dia SA fa Quadro 6 Percentagem de espermatoz ides vivos spz Vivos vs mortos spz Mortos no s men fresco e descongelado em fun o do bode e do dia de colheitas sat td it Niet aa dO Do det do ate iat A da A Da CSS ake 13 11 80 XVI Indice de Figuras Figura 1 Partes Constituintes do Espermatoz ide 11 Figura 2 Esquema ilustrativo das etapas da Espermatog nese
21. 54 2 8 2 4 1 4 Aplica es da Citometria de Fluxo nn 55 2 8 2 4 2 An lises Espermaticas Computadorizadas 56 2 9 Processamento e Conserva o do S men ii erereerreraea 58 291 DUC AGG Semen enan pende SED Ga a ADS pa da Senter Sascha 58 29 11 Dil rdore o APR rii RR ER RE edt aes aaa is 58 20 1 2 Metodo de Di CAG susoni ets PRA ASA 60 2 9 1 3 Volume de S men e N mero de Espermatoz ides utilizados para Insemina o Artificial sensisse sinia se uia ado sda cia atad aaa ds aa tasas canas 60 2 9 1 4 Conserva o do S men c aiisssacsssdsecssesssuacceealesensnadveracevsnsseconsvevanvelebaaeceasines 61 2 9 VAL Semen REM Gerad ssa dupiseaa sis iei citas aaa 61 29 1 42 semen Congelados cs elated lee ds als ea set tele 63 2 9 1 4 2 1 Congela o Covencional ssa ect indo ees aa a 64 2 9 1 4 2 2 Congela o Automatizada sua te adie lean tirade ag 65 Ze Dol ACT Ole CUES e a a a lt nch ed idan eeu me aesatee 66 2 9 1 5 1 Crioprotectores Intracelulares assis So Edo oeasatons 66 2 9 1 5 2 Crioprotectores Extrac IUlares serasa msg ss esa stasasrasoes soro stas abs Lgensl re dias a stosgaca 67 M M terale Metodo Ss dra paca uia a UR OA Spa ft ied ota Doel Meee cated itt a 69 Salt Recolha de S men orio ttig SG Da DL pa Gut O Rca ge erotics 69 3 2 Avaliacao do SOME Mics cecseras Ser CSS E CO DR ES E ame aatadin 70 5 231 OF Consistencies nnsa ahd ae GUS anna dn a E S
22. Cromomicina A3 Os dois primeiros s o excitados a comprimentos de onda de 488 nm e unem se de forma estequiom trica ao ADN de cadeia dupla onde se intercalam entre a dupla h lice O Laranja de Acridina apresenta o inconveniente de unir se ao material pl stico criando interfer ncias em medi es posteriores O Hoechst e a Cromomicina A3 unem se de forma espec fica aos pares de adenina timina e citosina guanina respectivamente 2 8 2 4 1 4 Aplica es da Citometria de Fluxo A aplica o da citometria de fluxo ampla devido possibilidade do estudo das popula es e subpopula es celulares e de componentes intracitoplasm ticos e nucleares Com a citometria de fluxo poss vel analisar o conte do de ADN e ARN definir em que posi o do ciclo celular a c lula se encontra analisar cromossomas 55 determinar c lulas cancer genas que apresentem altera es na sua taxa normal de ADN e c lulas que se encontrem em processo de morte celular programada apoptose ou em processo de morte celular acidental necrose 2 8 2 4 2 An lises Espermaticas Computadorizadas As an lises esperm ticas segundo o m todo convencional de microscopia de luz podem ser influenciados pelo observador bem como necessitarem de mais tempo para prepara o das amostras e respectiva an lise resultando num n mero espermatoz ides mais baixo para avalia o Deste modo segundo Batista e Guerra 2010 nos ltimos anos foram desenvolvidas
23. Os espermat citos prim rios ap s a meiose dividem se e originam os espermat citos secund rios Estes s o caracterizados por c lulas diploides aos pares as quais sofrem uma segunda meiose ficando os cromossomas em n mero haploide Na anafase os centr meros dividem se e os cromat deos de cada par depois de serem convertidos em cromossomas separam se passando para as diversas c lulas filhas designadas por esperm tides Baril et al 1993 2 4 2 Espermiog nese Define se por espermiog nese o conjunto de altera es nucleares e citoplasm ticas que ocorrem nas c lulas esperm tides e que por sua vez levam forma o dos espermatoz ides Esta etapa fundamental uma vez que desta que depende a qualidade dos espermatoz ides O processo de espermiog nese caracterizado por tr s etapas principais Na primeira fase inicia se a forma o da cabe a do espermatoz ide a qual tem origem a partir do n cleo da esperm tide O acrossoma existente na cabe a cont m grande variedade de enzimas lisossomais as quais s o importantes na penetra o da zona pel cida do vulo uma vez que este se forma a partir do aparelho de Golgi De seguida ocorrem altera es no n cleo do acrossoma tais como o deslocamento do centro para a periferia condensa o da cromatina e redu o do volume nuclear Estas altera es coincidem com mudan as na cabe a do espermatoz ide Gonz lez 2002 Por fim um dos centr olos migra
24. bem como atrav s do m sculo cremaster Estes m sculos s o uma esp cie de bainhas musculares que permitem a aproxima o dos test culos entrada inguinal Quittet 1980 S 1990 Do mesmo modo quando a temperatura sobe quer por factores ambientais ou patol gicos o escroto distende se ao m ximo ficando os test culos com maior distanciamento da cavidade abdominal Quittet 1980 S 1990 Este fen meno permite a termorregula o pois quando a temperatura exterior elevada os test culos s o colocados fora do corpo aumentando a superf cie de troca de calor e de irradia o permitindo com que haja um abaixamento da temperatural corporal interna Quittet 1980 S 1990 No entanto se a temperatura testicular atingir a do restante corpo por apenas algumas horas o animal torna se est ril cerca de 14 dias depois Baril et al 1993 Na pele escrotal existem ainda glandulas sudoriparas e receptores de temperatura que permitem o arrefecimento dos test culos por evapora o A termorregula o tamb m efectuada em fun o da temperatura ambiente por aproxima o ou afastamento dos test culos da cavidade abdominal devido contra o ou relaxamento dos m sculos dartos respectivamente A proximidade dos test culos proporcionada em simult neo pelo m sculo crem ster externo A exist ncia de um sistema de vasos ao longo dos test culos plexo pampiniforme permite tamb m arrefecer o sangue arterial que ch
25. caracter sticas sejam concretizadas indispens vel a capacidade sensorial nomeadamente do macho permitindo lhe assim uma avalia o do estado fisiol gico da f mea Para que haja intera o com o ambiente e entre os animais estes socorrem se dos seus cinco sentidos Sousa 2000 Vitaliano 2011 19 Ja ee j Pipe co Pa x RN NY Are RD a rd Se d i j oe he de Ato de fungar Rea o de flehmen A 2 ECX wh i i i _ wn tr ES j ES 4 Nt 7 Ks W bi ON U Nhe o 4 NT q wid As A ANTA Vime coli o CA ie Heel Acotovelamento e Monta C pula escoiceamento Figura 4 Esquema do Comportamento Sexual nas Fases de Corte e C pula Adaptado Oliveira 2009 Na procur e identifica o da parceira por parte do macho fundamental o olfacto sendo este o respons vel pelo desencadear do comportamento reprodutivo Ap s a identifica o da f mea em cio que se caracteriza pelo in cio do cortejo o macho continua a testar a receptividade da f mea atrav s de v rias tentativas de monta Vitaliano 2011 As atitudes e actividades desenvolvidas pelo casal aquando do comportamento reprodutivo resultam da resposta de certas subst ncias qu micas Entre estas subst ncias encontram se as feromonas fundamentais na comunica o entre organismos da mesma esp cie A comunica o qu mica estabelecida entre animais da mesma esp cie semelhante ao sistema end crin
26. da periferia para o centro do espermatoz ide e o outro origina a cauda A cauda tem origem a partir de um vasto conjunto de altera es que compreendem a forma o do filamento axial da pe a interm dia da pe a principal e da 16 bainha mitocondrial Sousa 2000 Gonz lez 2002 O filamento axial uma estrutura similar aos c lios e flagelos com um axonema de 9 t bulos pares perif ricos e um par de t bulos centrais todos formados por prote nas contrateis chamadas tubulina e dine na que s o similares a actina e miosina unidas por pontes de nexina Gonz lez 2002 A espermiog nese finalizada com a liberta o dos espermatoz ides imaturos esperm tides nos t bulos como resultado da contra o das c lulas mioepetiliais dos t bulos semin feros Esta etapa designada por espermia o Durante este processo formam se corpos residuais no citoplasma das c lulas de Sertoli como resultado da actividade do complexo de Golgi e do ret culo endoplasm tico sendo depois fagocitados pelas pr prias c lulas de Sertoli Gonz lez 2002 2 4 3 Ciclo Espermatog nico O ciclo espermatog nico Fig 3 tamb m designado por ciclo do epit lio semin fero o resultado de associa es celulares da espermatog nese que aparecem ao longo dos tubos semin feros Quando as associa es celulares se repetem estabelecido um ciclo semin fero Podem existir v rias associa es celulares distintas dependendo da es
27. das contrac es musculares e da frequ ncia de ejacula o Setchell 1993 Garner e Hafez 1993 durante o transporte que os espermatoz ides sofrem a matura o e ganham capacidade de mobilidade progressiva e de fertiliza o do o cito Gamer e Hafez 1993 O armazenamento efectuado na cauda do epid dimo onde se encontra cerca de 75 dos espermatoz ides epididimais Evans e Maxwell 1987 Ashdow e Hafez 1993 Segundo Amann 1987 os espermatoz ides da cauda s o mais f rteis do que os do corpo do epid dimo o que leva a pensar que na cauda adquirem uma maior capacidade fertilizante Os vasos deferentes s o um par de canais desde a extremidade distal da cauda do epid dimo Depois de sair da cauda do epid dimo segue at zona proximal do test culo onde se insere o cord o esperm tico No in cio o vaso deferente suportado por dobras do peritoneu que passa ao longo do cord o esperm tico atrav s do canal inguinal para a regi o p lvica onde se funde com a uretra O Donnell et al 2001 A extremidade do ducto deferente apresenta uma zona mais ampla que se designa por ampola a qual no bode tem cerca de 6 a 7 cm de comprimento e 4 a 5 mm de di metro O Donnell et al 2001 A ampola tem uma camada espessa de m sculos nas suas paredes que segregam os constituintes do plasma seminal servindo de dep sito para armazenamento dos espermatoz ides antes e nos intervalos das ejacula es Sousa 2000 A
28. de onda ou da sua actividade em geral Esta t cnica suficiente para determinar quais os ejaculados com maior n mero de espermatoz ides mortos e baixa mobilidade mas no entanto n o 40 permite determinar a percentagem de espermatoz ides m veis e motilidade individuais Guerreiro 2002 A avalia o geralmente efectuada por um sistema de pontua o numa escala de 0 5 Quadro 2 Embora este m todo de avalia o seja subjectivo com a pr tica torna se mais precisa a pontua o atribu da motilidade esperm tica Apenas devem ser utilizadas para insemina o artificial as amostras que obtiverem uma pontua o de 4 ou 5 de modo a n o comprometer o sucesso da insemina o Sousa 2000 Quadro 2 Determina o da Motilidade Massal Escala Pontua o Descri o dos Movimentos de Onda Ondas muito r pidas e densas que se juntam formando 5 um redemoinho dif cil determinar ondas isoladas 90 ou mais de espermatoz ides vivos 4 Ondas r pidas e vigorosas n o forma redemoinho 70 a 85 de espermatoz ides ativos 3 Ondas de baixa amplitude e movimento lento 45 65 de espermatoz ides ativos 2 Observam se os movimentos esperm ticos mas n o forma ondas 20 40 de espermatoz ides ativos 1 Apenas movimento individual de poucos espermatoz ides 10 de espermatoz ides vivos 0 Totalmente sem movimento Fonte Chemineau et al 1991 41 2 8 2 1
29. dos bodes deve ser melhorada 6 8 semanas antes da recolha de s men Neste contexto poder ser necess ria a separa o dos animais para a alimenta o o que lhe permitir tomar conhecimento com um novo espa o Um dos suplementos alimentares utilizados nestas situa es o gr o de tremo o numa quantidade de 500 a 750 g animal dia Se o animal tiver a necessidade de se manter por um per odo mais longo com uma alimenta o diferenciada aconselh vel seguir recomenda es diet ticas Um dos factores mais importantes no controlo da qualidade e quantidade de s men a poca em que se efectua a recolha O s men de melhor qualidade quando recolhido na poca reprodutiva Este factor particularmente importante nas ra as sazonais Deste modo as recolhas de s men devem ser planeadas de forma a coincidirem com a poca reprodutiva No caso de o s men ser necess rio fora da poca reprodutiva deve ser armazenado congelado at sua utiliza o 2 7 5 Treino dos Machos Dadores de S men O m todo de recolha de s men mais adequado a vagina artificial Este m todo de recolha exige que os animais dadores sejam treinados com 2 a 3 semanas antes de iniciarem os programas de recolhas de s men Durante o per odo de treino o t cnico consegue determinar a qualidade do s men o que lhe permite recorrer a bodes com maior valoriza o seminal antes de dar in cio ao programa de recolha propriamente dito Os machos depois de
30. e Hafez E S E 1993 Spermatozoa and seminal plasma Reproduction in Farm Animals 6 Edition Philadelphia PA Lea amp Febiger 165 187 92 Gibbons A 2002 Inseminacion artificial con semen congelado en cabras de raza angora Taurus 4 16 24 32 Gon alves P B D Figueiredo J R Freitas V J F 2001 Biot cnica aplicada reprodu o animal S o Paulo 2 4 e 7 15 23 57 65 111 23 Gonz lez F H D 2002 Introdu o Endocronologia Reprodutiva Veterin ria Universidade Federal do Rio Grande do Sul Faculdade de Veterin ria Porto Alegre Gonzalez R A F 2004 Efeito da criopreserva o usando diferentes t cnicas de congela o e crioprotectores sobre par metros esperm ticos e a integridade de membranas do espermatoz ide bovino Disserta o de Tese de P s Gradua o em Reprodu o Animal Universidade de S o Paulo Faculdade de Medicina Veterin ria e Zootecnia S o Paulo Granados L B C Dias A J B Sales M P 2006 Aspectos Gerais da Reprodu o de Caprinos e Ovinos Projeto PROEX UENF Campo dos Goytacazes 54 Guerreiro R I N 2002 Caracteriza o reprodutiva e avalia o da conserva o de s men por um per odo de 48 horas em diferentes tipos de diluidores em bodes da ra a Algarvia Relat rio de est gio Licenciatura em Engenharia Zoot cnica Universidade dos A ores Angra do Hero smo 93 Harisson R A P e Vickers S E 1990 Use of fluorescent probes to asses
31. luz e de 70 detectados por meio de microscopia electr nica As diferen as dever o dever se o efeito conjugado do bode e dia de colheita Tamb m Santos 2001 logo ap s a descongela o de s men encontrou taxas elevadas 43 a 46 de danos no acrossoma 86 O factor bode teve influ ncia na percentagem de espermatoz ides mortos P lt 0 001 Em rela o ao factor dia de colheita observou se que apenas houve diferen as significativas P lt 0 05 entre os dias 2 9 12 0 43 e 3 13 23 0 82 na percentagem de spz mortos Segundo Oettl 1986 a maioria das les es esperm ticas no acrossoma ocorrem durante o processo de dilui o arrefecimento ou como resultado do per odo de equil brio a que submetido o s men Deste modo importante que se optimize o processamento inicial do s men fazendo com que a grande maioria de espermatoz ides chegue ao processo de congela o descongela o sem altera es no acrossoma e assim com maiores possibilidades de sobreviverem ilesos ao processo de congela o Neste contexto Rovay 2006 realizou um ensaio para verificar o efeito de diferentes protocolos de arrefecimento sobre criopreserva o do s men caprino e avalia o das caracter sticas morfol gicas do s men n o tendo encontrado diferen as significativas ap s o processo de criopreserva o 87 VI Conclus es e Perspectivas Futuras Este estudo teve como principal objectivo avaliar o efeito de 3 difere
32. mais aprofundada em 1979 por Landa e Almquist Gonzalez 2004 Estes autores conclu ram que a congela o de grande n mero de palhinhas n o afecta a integridade do acrossoma e a motilidade p s descongela o comparativamente s congela es de s men feita nos vapores de azoto l quido Na congela o programada as palhinhas ficam distribu das em diferentes n veis o que contribui para varia es na taxa de congela o individual de cada palhinha dentro de cada ciclo de congela o Gonzalez 2004 65 2 9 1 5 Crioprotectores O processo de congela o requer a utiliza o de agentes crioprotectores em quase todos os sistemas biol gicos A primeira refer ncia de crioprotectores data de 1908 utilizada por Maxinov em c lulas de plantas Este utilizou uma solu o contendo glicerol e observou que as c lulas das plantas sobreviviam a uma congela o a 22 C Bittencourt 2006 Estes agentes devem ser adicionados aos diluidores de modo a garantir a sobreviv ncia dos espermatoz ides durante o processo de congela o e descongela o Os crioprotectores podem ser divididos em dois tipos intracelulares e extracelulares Os crioprotectoes s o classificados como intracelulares ou penetrantes quando exercem ac o protectora no interior da c lula E extracelulares ou n o penetrantes quando actuam no exterior da c lula 2 9 1 5 1 Crioprotectores Intracelulares Os crioprotectores penetrantes CP s o subst nci
33. no interior deste seja dobr vel para o exterior do mesmo tubo permitindo assim formar um dep sito estanque para a gua depois de devidamente apertado por el sticos em ambas as extremidades do cilindro O t cnico antes de efectuar a recolha de s men deve desinfectar a vagina artificial enxaguando todo o revestimento da mesma com lcool a 70 em gua destilada e deixar secar A vagina entre cada recolha deve estar limpa seca e esterilizada De seguida o revestimento cheio at meio com gua a 48 50 C por uma torneira montada na parte lateral com o auxilio de um funil ou de uma seringa a gua quente ajudar o excesso de lcool a evaporar No entanto deve se ter cuidado para que a gua n o entre na manga de borracha o que poderia causar a morte dos espermatoz ides O ar insuflado para o interior da vagina deve ser numa quantidade que permita a f cil penetra o do p nis Depois de verificada a temperatura e a press o encaixa se no lado maior da vagina o tubo de borracha acoplado ao tubo graduado e coloca se dentro de uma capa isoladora de modo a evitar oscila es de temperatura e consequentes choque t rmicos Guerreiro 2002 A press o ideal requerida por cada macho apenas se pode saber por experi ncia Evans e Maxwell 1987 Por fim lubrifica se a outra extremidade da vagina com gel est ril ou vaselina de modo a facilitar a penetra o A temperatura da vagina artificial um pouco antes da recolha de s men deve
34. o designadas por pe a proximal principal e terminal A pe a proximal a parte mais grossa do flagelo que se encontra junto ao colo Esta pe a encontra se rodeada por mitoc ndrias que conferem energia necess ria locomo o do espermatoz ide A pe a principal a estrutura mais comprida e que cont m a maior parte dos elementos propulsores da cauda sendo revestida por uma bainha fibrosa Por ltimo a pe a terminal que mais curta do que as restantes mas n o menos importante uma vez que tem a fun o locomotora Guerreiro 2002 Maia 2010 Todas as caracter sticas estruturais do espermatoz ide est o focalizadas numa nica actividade funcional ou seja em assegurar a liberta o do material gen tico contido no n cleo para o ov cito onde ocorre a fertiliza o produzindo se o zigoto 2 3 Regula o Hormonal da Produ o de S men A puberdade nos bodes atingida aos 6 7 meses de idade contudo pode variar em fun o de diversos factores tais como os n veis hormonais de testosterona e de gonodotrofinas segregadas durante o per odo pr puberdade ra a n vel nutricional e sobretudo pelas condi es do meio ambiente No entanto alguns estudos demonstram que o processo end crino se inicia enquanto feto Contudo os n veis de testosterona diminuem ap s o nascimento o que leva a crer que a testosterona fetal tem a ver com a diferencia o sexual e com o crescimento dos rg os sexuais no feto 12 A
35. o s men temperatura ambiente e centrifugado a 600 x G durante 10 minutos numa propor o de 1 9 em citrato de s dio a 3 a 37 C Muniz 2003 Caso n o se remova o plasma seminal por lavagem do s men a percentagem de gema de ovo no diluidor n o deve exceder os 2 No entanto segundo Ferrari et al 1998 um diluidor base de tris com apenas 1 5 tem efeito t xico sobre os espermatoz ides Como crioprotector utiliza se normalmente o glicerol Cada ejaculado permite criopreservar em m dia 10 a 40 doses de s men dependendo da quantidade do mesmo e dos espermatoz ides por dose Segundo Mascarenhas e Sim es 2005 no s men congelado os ndices de fertilidade obtidos s o ligeiramente mais baixos que os obtidos com s men refrigerado devendo o n mero de espermatoz ides por dose ser de 125 milh es A congela o de s men pode ser efectuada de duas formas distintas por congela o convencional ou automatizada 2 9 1 4 2 1 Congela o Covencional A congela o segundo o m todo convencional feita de duas formas sendo estas a congela o horizontal ou vertical A congela o horizontal feita numa caixa de esferovite que serve de c mara de congela o Esta deve ter no seu interior um suporte para colocar as palhinhas na posi o horizontal O suporte deve estar colocado a 20 cm de altura do fundo da caixa e o azoto l quido a 15 cm altura de 5 cm do azoto l quido as palhinhas atingem temperaturas de 7
36. para cada dose de s men Um destes tubos servia para colocar a amostra de s men outro para proceder dilui o e o ltimo para levar ao cit metro para a avalia o A dilui o foi feita num tubo eppendorf com 10 pl de s men em 990 ul de PBS Depois retirou se 295 ul desta solu o e adicionou se 6 ul de PI 0 5 mg ml e 20 ul de FITC PSA incubando se de seguida na estufa a 37 C durante 10 minutos Por fim colocou se 600 ul de PBS e avaliou se no cit metro 3 3 Dilui o do S men As amostras de s men foram dilu das de forma a obter se uma concentra o final de 400 x 10 spz ml O diluidor utilizado foi base de tris gema ovo e preparado apenas numa frac ao Para isso adicionou se os seguintes compostos 375 mM de Tris 124 mM de acido c trico 41 6 mM de glucose 9 V V de gema ovo e 5 V V de glicerol devendo se obter um pH de 6 8 12 3 4 Congelacao do S men Ap s a dilui o e enchimento das palhinhas procedeu se ao seu arrefecimento Estas foram cuidadosamente colocadas numa caixa de isopor no frigorifico 4 C durante 2 horas e 30 minutos A congela o de s men foi efectuada com um aparelho autom tico designado como IceCub As palhinhas foram colocadas no interior deste aparelho num suporte horizontal onde se procedeu congela o segundo 3 curvas cada uma com tr s rampas de arrefecimento As temperaturas das diferentes curvas foram iguais variando apenas a temperatura de arrefecime
37. permanecem latentes e servem para substituir outras ou seja em situa es em que ocorra danifica o testicular por irradia o t xicos inflama es ou infe es Contrariamente as espermatog nias Al multiplicam se por mitoses originando espermatog nias do tipo A2 A3 A4 In e B As diferentes popula es de espermatog nias permanecem ligadas por pontes intracelulares de 2 a 3 um de largura 14 separadas das c lulas de Sertoli por espa os intracelulares de 0 2 um Gonz lez 2002 Filho 2006 Espermatog nia A Mitose Ord 16 dias e C4 in C009 s VAa NONS s Y Espermatog nia B Espermat cito II Jf Meiose II e s e Esperm tides 4 4 Esperma 4 gt O ia Figura 2 Esquema ilustrativo das etapas da Espermatog nese Adaptado http embriologiaufpe blogspot pt 2010 09 espermatogenese testiculo html As c lulas do tipo B 2n sofrem seis divis es mit ticas sucessivas originando os espermat citos prim rios Os espermat citos prim rios tamb m designados por aux citos s o caracterizados por grandes c lulas ovais de n cleo vis vel Gonz lez 2002 Os espermat citos prim rios originam c lulas tetraploides Durante a profase da primeira meiose da espermatog nese as c lulas sofrem altera es nucleares tais como 15 a troca de material gen tico entre cromatideos crossing over e a disjun o dos heterocromossomas X e Y Sousa 2000
38. por citometria de fluxo e procedeu se congela o do s men segundo as 3 curvas que diferiam nas rampas de arrefecimento As temperaturas das diferentes curvas foram iguais variando apenas a temperatura de arrefecimento na segunda rampa Curva A 25 C min Curva B 35 C min e Curva C 45 C min Para testar a influ ncia das referidas curvas sobre a integridade do acrossoma recorreu se novamente ao cit metro e determinou se a percentagem de espermatoz ides vivos e mortos e com o acrossoma intacto ou danificado VII As diferentes curvas nao influenciaram significativamente a taxa de mortalidade dos espermatoz ides com acrossoma intacto 11 6 0 63 spz Curva A 11 36 0 63 spz Curva B e 10 37 0 63 spz Curva C ou danificado 68 78 1 39 spz Curva A 70 54 1 39 spz Curva B e 70 96 1 39 spz Curva C No entanto observou se um efeito significativo dos bodes e dias de colheita nos quatro par metros estudados percentagem de espermatoz ides vivos com o acrossoma intacto VAI ou danificado VAD e percentagem de espermatoz ides mortos com o acrossoma intacto MAI ou danificado MAD Relativamente percentagem de espermatoz ides VAI o bode 1 apresentou valores 50 inferiores aos bodes 2 e 3 P lt 0 001 e o dia de colheita afectou substancialmente este par metro 25 33 0 66 spz dia colheita 1 18 40 0 66 spz dia colheita 2 e 11 31 0 91 spz dia colheita 3 P lt 0 01 A percentagem de espermatoz i
39. produ o de testosterona controlada pelo c rebro atrav s do Complexo Hipot lamo Hip fise Desta forma o Hipot lamo liberta GnRH a qual actua sobre o l bolo anterior da hip fise que por sua vez liberta duas hormonas para o sangue que levam a informa o aos test culos S o essas hormonas a Fol culo Estimulina FSH e a Luteinizante LH Com o in cio da puberdade ocorre um pronunciado aumento dos n veis de testosterona que est relacionado com o padr o de segrega o da LH que estimula a segrega o directa de testosterona nas c lulas de Leyding O inicio da puberdade estabelecido por eventos que ocorrem ao n vel do sistema nervoso central SNC e que contribuem para alterar o padr o de segrega o hipotal mica de GnRH Assim o crescimento e a matura o testicular s o influenciados por factores hormonais e possivelmente pelo sistema nervoso Gonz lez 2002 A FSH estimula a produ o de receptores para gonodotrofinas no test culo e a sua segrega o aumentada pelo crescimento testicular Hormonas como a FSH a hormona de crescimento GH e prolactina PRL contribuem para induzir a resposta testicular ac o da LH Estas hormonas aumentam no sangue durante o desenvolvimento sexual medida que a puberdade vai sendo atingida os n veis de testosterona aumentam de forma progressiva at idade adulta De um modo geral a puberdade atingida por ac o de um mecanismo central que activa a liberta
40. se observar a amostra a 400x deve se garantir que a mesma se encontra seca Depois identifica se a l mina com o n mero do animal O esfrega o pode ser conservado num ambiente seco ou dentro de um saco fechado e etiquetado Assim a amostra conserva se durante v rios meses sem altera es 2 8 2 3 1 2 Anomalias Morfol gicas Como j foi referido anteriormente a maioria dos ejaculados apresenta espermatoz ides anormais Estas anomalias podem ser divididas em v rias classes 48 consoante o seu grau de defici ncia Na primeira classe est o inclu dos os espermatoz ides que adquiram anomalias aquando da espermatog nese Na segunda os espermatoz ides que ganharam anomalias na passagem do epid dimo e na terceira aqueles que as suas anomalias ocorreram durante ou depois da ejacula o Nas anomalias prim rias incluem se todos os espermatoz ides que apresentam cabe a acrossoma cauda e pe a intermedi ria com malforma o Na segunda e terceira categoria est o inclu das os espermatoz ides que apresentam cabe as soltas gota citoplasm tica caudas enroladas e separa o do acrossoma Baril et al 1993 Sousa 2000 Os diferentes tipos de anomalia variam um pouco em fun o da esp cie animal que se observa Nos caprinos tal como nos outros pequenos ruminantes as anomalias mais comuns s o espermatoz ides sem cauda com anomalias nas cabe as com acrossoma anormal cabe as pequenas estreitas grandes ou largas
41. seminais em bodes da ra a Serrana Relat rio de est gio Licenciatura em Engenharia Zoot cnica Universidade dos A ores Vale de Santar m Souza A F Leit o M C G Batista A M Porto A L F Filho J L L Guerra M M P 2008 Prote nas do plasma seminal de caprinos relacionadas com o indice pluviom trico e a qualidade do s men Ci ncia Rural 97 Stellflug J N e Lewis G S 2007 Effect of early and late exposure to estrual ewes on ram sexual performance classifications Animal Reproduction Science 97 295 302 Tasseron F Amir D Schindler H 1977 Acrosome damage of ram spermatozoa during dilution cooling and freezing Journal Reproduction Fertility 51 461 462 Traldi A S 1994 T picos em reprodu o e I A em caprinos Manual t cnico Viana A K S Chalhoub M Filho A L R Almeida A K Portela A P M Bittencourt R F Alves S G G Bittencourt T C C Quintela A T 2006 Avalia o in vitro do s men caprino resfriado com ou sem centrifuga o do plasma seminal e dilu do em leite desnatado glicose e tris gema de ovo Ci ncia Animal Brasileira Goi nia 7 1 67 76 Vidigal K F 2008 Integridade e funcionalidade da membrana plasm tica acrossoma e mitoc ndrias esperm ticas em caprinos segundo a conforma o escrotal Disserta o da Tese de Mestrado de Ci ncia Animal Universidade Federal do Piau Teresina Vitaliano A B 2011 Avalia o do Comportame
42. ser identificado e colocado em banho maria a 30 33 C evitando se assim os choques t rmicos e as contamina es Deve ser dada especial aten o aos h bitos individuais de cada macho de modo a corrigi los e prepar lo para recolhas com vagina artificial Assim consegue se diminuir o n mero de saltos em falso e reduzir a frustra o dos animais e do t cnico O t cnico tamb m deve ter reflexos r pidos para n o perder a ejacula o aquando da montagem r pida dos bodes 31 Ocasionalmente pode observar se nalguns bodes a ejacula o retardada Neste caso o s men n o expelido a partir do tracto genital durante o primeiro impulso mas apenas depois de o animal desmontar Evans e Maxwell 1987 Esta perturba o a n vel do mecanismo ejaculat rio pode ser causada pela flex o do p nis durante a recolha ou prepara o incorrecta da vagina artificial Machos muito excit veis ou que foram retirados e estimulados por muito tempo antes de montar podem levar a uma ejacula o precoce A frequ ncia com que o s men pode ser colectado depende da idade condi o e temperamento do animal Os bodes podem ejacular 10 a 15 vezes ou mais num dia Quanto maior o n mero de ejaculados menor o volume e a concentra o do s men e consequentemente o n mero de espermatoz ides por ejaculado No entanto um programa de recolhas com 3 a 5 colheitas di rias durante 4 a 5 dias separadas por 2 a 3 dias de repouso n o devem causar uma re
43. 0 a 80 C devendo permanecer assim por 15 minutos De seguida devem ser submersas no azoto l quido 196 C por 5 minutos Betini et al 1998 64 A congela o vertical efectuada segundo o m todo desenvolvido por Souza e Mies Filho em 1986 Este m todo baseia se na utiliza o de uma caixa de madeira perfurada no centro de forma cil ndrica com 9 5cm de di metro e com um suporte para colocar as palhinhas na posi o vertical O suporte formado por um cilindro de tela met lica de 8 5cm de di metro e 11 5cm de altura uma parte superior e outra inferior constitu das por placas perfuradas de a o inoxid vel para permitirem a passagem das palhinhas Sob a placa inferior colocada uma tela fina de apoio para as palhinhas e uma estrutura de arame em forma de al a na parte superior de modo a facilitar o manuseamento Posteriormente coloca se o s men no cilindro e por sua vez na caixa de congela o altura de 5 cm da superf cie do azoto l quido durante 15 minutos a 70 a 80 C De seguida mergulha se o s men no azoto l quido 196 C durante 5 minutos Betini et al 1998 Muniz 2003 2 9 1 4 2 2 Congela o Automatizada A congela o pode ser feita usando uma m quina de congela o autom tica onde a redu o da temperatura ocorre automaticamente e de forma controlada A congela o autom tica foi descrita pela primeira vez em 1973 por Almquist e Wiggins sendo posteriormente estudada de forma
44. Volume do Ejaculado A medi o do volume de s men pode ser efectuada por leitura directa nos tubos de recolha graduados Fig 5 ou de forma mais precisa com uma pipeta calibrada Evans e Maxwell 1987 Baril et al 1993 A leitura feita excluindo a parte espumosa que se forma na parte superior do tubo ap s a colheita Baril et al 1993 Quando a recolha de s men efectuada por vagina artificial o volume m dio dos ejaculados varia entre 1 a 1 5 ml dependendo da ra a idade condi o do animal frequ ncia com que s o efectuadas as recolhas e da habilidade do t cnico Evans e Maxwell 1987 Baril et al 1993 No entanto segundo Traldi 1994 o normal de um ejaculado de bode varia entre 0 5 a 2 ml de s men sendo caracterizado por uma concentra o esperm tica de 1 a 5 bili es de espermatoz ides com aspecto cremoso e 38 uma colora o branco marm rea Animais mais jovens ou em mau estado nomeadamente sanit rio produzem volumes de ejaculado mais pequenos Guerreiro 2002 O volume do ejaculado diminui gradualmente com o n mero de recolhas sucessivas No caso de a recolha de s men ser efectuada por electroejacula o o volume de s men depende da habilidade do t cnico bem como da capacidade de resposta do macho Figura 5 Avalia o das Caracter sticas Seminais por Observa o Directa Adaptado Foto do autor 39 2 8 2 Avalia o Microsc pica 2 8 2 1 Mobilidade A avalia o do moviment
45. a de efeito deste 78 factor O animal que apresentou maior percentagem de espermatoz ides vivos com o acrossoma intacto spz VAI foi o bode 2 com 23 10 0 86 P lt 0 03 sendo a curva A 19 14 0 86 spz VAI a que apresentou melhores resultados e as colheitas do primeiro dia 25 33 0 66 spz VAI com valores significativos para este par metro P lt 0 002 Quanto percentagem de espermatoz ides vivos mas com o acrossoma danificado spz VAD o bode 1 teve 0 55 0 044 spz P 0 016 com valores mais altos para a curva C 0 49 0 044 spz VAD e para o dia de colheita 3 0 59 0 08 spz VAD P 0 032 No total a percentagem de espermatoz ides mortos 81 22 1 95 n 27 ap s a descongela o foi superior percentagem de espermatoz ides vivos 18 78 1 95 n 27 dos quais 14 04 1 28 n 27 apresentavam o acrossoma intacto e 85 96 1 28 n 27 o acrossoma danificado Relativamente percentagem de espermatoz ides mortos mas com o acrossoma intacto spz MAD o bode 3 foi o que apresentou valores mais altos com 14 16 0 63 P lt 0 01 e com um n vel de signific ncia de P 0 042 para o dia de colheita 3 No que concerne percentagem de espermatoz ides mortos mas com o acrossoma danificado spz MAD o bode 1 foi o que obteve maior contagem 82 84 1 39 spz MAD P lt 0 01 sendo a curva C a mais afectada Tamb m no terceiro dia de recolha de s men a percentagem de espermatoz ides mortos com o acro
46. an as estruturais nas membranas que resulta na diminui o da fertilidade Neste contexto o principal objectivo do presente trabalho a criopreserva o de s men de caprino sem a remo o do plasma seminal e congel lo segundo tr s curvas diferentes de modo a testar a influ ncia das mesmas sobre a integridade do acrossoma da c lula esperm tica II Revis o Bibliogr fica 2 1 Anatomia e Fisiologia do Aparelho Reprodutor do Bode O sistema reprodutor masculino uma s rie de rg os directamente associados ao processo reprodutivo A sua principal fun o proporcionar que o g meta ou espermatoz ide masculino fecunde o vulo sendo os principais rg os agrupados em tr s categorias A primeira categoria a produ o de espermatoz ides e armazenamento A produ o ocorre nos test culos que est o alojados no escroto com temperatura regulada de onde os espermatoz ides imaturos se deslocam para o epid dimo a fim de desenvolvimento e armazenagem A segunda categoria s o as gl ndulas que produzem o l quido ejaculat rio que incluem as ves culas seminais a pr stata e a gl ndula bulbouretral A terceira categoria aquela utilizada para a c pula e a deposi o de espermatoz ides esperma que estava no macho nesta categoria est o o p nis uretra e canal deferente 2 1 1 Test culos Os test culos s o os principais rg os do aparelho genital masculino apresentam duas fun es essenciais
47. aplica o do s men deve escolher se o diluidor e efectuar se a respectiva dilui o antes da sua utiliza o 2 9 1 Dilui o do S men O principal objectivo da dilui o de s men conseguir maior n mero de doses para insemina o artificial Caso contr rio apenas se conseguira cobrir uma f mea por monta natural a partir da mesma dosagem de s men uma vez que quando um bode cobre uma f mea apesar de depositado um grande n mero de espermatoz ides apenas s o aproveitados 100 a 140 milh es ou seja aqueles que conseguem atravessar o c rvix Deste modo o limite m nimo para se obter uma taxa de concep o aceit vel de 100 milh es de espermatoz ides por cada dose inseminante Guerreiro 2002 Maia 2010 A dilui o al m de permitir obter a partir de um mesmo ejaculado v rias doses inseminantes confere aos espermatoz ides condi es de ordem biol gica proporcionando aos espermatoz ides nutrientes e pH adequado e favorecendo um ambiente isot nico 2 9 1 1 Diluidores Existem v rios tipos de diluidores para caprinos compostos com diferentes ingredientes No entanto um bom diluidor deve conter as seguintes propriedades fornecer nutrientes aos espermatoz ides ter capacidade tamp o para prevenir as mudan as de pH proporcionar um ambiente isot nico ou seja promover a 58 osmolaridade igual do plasma seminal proteger o espermatoz ide do choque t rmico durante a refrigera o bem como pro
48. ar a sua remo o do prep cio A glande do p nis deve ser levemente segurada para tr s com uma gaze est ril de modo a que o ap ndice filiforme e a uretra sejam dirigidos para dentro do tubo de colheita antes da ejacula o para diminuir a perda do s men Evans e Maxwell 1987 Muniz 2003 A forma mais adequada segurar no tubo com uma m o e no p nis com a outra para que seja poss vel massajar o p nis para a frente entre os 27 est mulos el ctricos Evans e Maxwell 1987 Ap s a introdu o do electroejeculador no recto do animal pressiona se contra a p lvis aplicando se est mulos el ctricos curtos com uma dura o de 3 8 segundos e com intervalos entre descargas de 15 a 20 segundos Evans e Maxwell 1987 Guerreiro 2002 Ap s v rios est mulos as secre es das gl ndulas anexas fluem seguindo se o s men Quando se obt m inicialmente uma grande quantidade de plasma seminal este deve ser eliminado de modo a garantir uma menor dilui o do s men H uma varia o consider vel entre os machos na quantidade de estimulo necess ria para produzir uma ejacula o satisfat ria Evans e Maxwell 1987 No entanto apesar das contrac es e desconforto muscular provocado pelas descargas durante as recolhas de salientar que n o permanecem les es no animal 2 7 2 Recolha por Vagina Artificial O m todo de recolha de s men por vagina artificial o mais utilizado em caprinos apesar de implicar o trei
49. ara que a viabilidade dos espermatoz ides n o seja afectada Existem v rios factores que afectam a viabilidade dos espermatoz ides ap s a recolha do s men Deve garantir se que o s men n o exposto a condi es desfavor veis durante ou ap s a recolha Evans e Maxwell 1987 E que ap s a ltima recolha todo material foi devidamente limpo esterilizado seco e quente a 30 C especialmente nos dias frios Uma zona limpa pode ser transformada numa laborat rio de campo para que se proceda manipula o e exame r pido do s men Esta rea deve conter uma mesa ou bancada e espa o suficiente para o equipamento tal como microsc pico banho maria entre outras coisas Ap s a recolha o s men deve ser colocado em banho maria a 37 C Do mesmo modo o material utilizado no processo de avalia o deve estar aquecido a 37 C Para isso deve ser colocado sobre uma placa aquecedora ou numa estufa diminuindo assim as varia es t rmicas dos espermatoz ides Muniz 2003 36 Os ejaculados dos bodes variam em quantidade e qualidade A quantidade de espermatoz ides por ejaculado depende da concentra o e volume de s men Os par metros para avaliar a qualidade do s men s o a motilidade e a morfologia dos espermatoz ides Estas caracter sticas bem como a cor e o cheiro do s men devem ser analisados logo ap s a recolha 2 8 1 Avalia o Macrosc pica 2 8 1 1 Cor Cheiro e Aspecto do S men A cor do s men o pr
50. as em sua casa Um obrigado a todos porque este trabalho n o foi meu foi nosso VI Resumo O presente trabalho teve como objectivo testar o efeito de 3 curvas de congela ao diferentes sobre a integridade do acrossoma da c lula esperm tica de caprinos A colheita de s men foi realizada nos Servi os de Desenvolvimento Agr rio da Ilha Terceira SDAT tendo sido utilizados 3 bodes 2 de ra a Saanen e 1 de ra a Alpina com mais de 2 anos de idade As recolhas 3 por cada animal foram efectuadas durante o m s de Fevereiro de 2012 em 3 sess es espa adas de aproximadamente 5 dias seguindo um desenho factorial de medi es repetidas As recolhas foram sempre efectuadas pela manh com inicio por volta das 08 00 horas e em cada per odo de colheita os bodes alternavam aleatoriamente A colheita do s men foi obtida com vagina artificial ap s treino dos bodes utilizando uma f mea com cio induzido A indu o artificial do cio foi conseguida com uma injec o intramuscular de 250 ug de benzoato de estradiol dilu do em 2 ml de leo mineral aplicada 24 a 48 horas antes do momento necess rio seguida de uma nova injec o passadas 24 horas na dose de 100 ug de modo a garantir o prolongamento do cio pelas pr ximas 24 horas No laborat rio procedeu se avalia o de caracter sticas seminais como o volume a concentra o esperm tica e a mobilidade massal De seguida efectuou se a contagem dos espermatoz ides vivos e mortos
51. as ou f rmacos que diminuem as les es de origem qu mica ou mec nica causadas pela a congela o Um crioprotector ideal deve possuir as seguintes caracter sticas f sico qu micas baixo peso molecular alta solubilidade em meio aquoso e principalmente uma baixa toxicidade celular Estes crioprotectores possuem estruturas que lhes permitem fazer liga es de hidrog nio com as mol culas de gua diminuindo a forma o de cristais de gelo e o seu tamanho bem como a concentra o de solutos nos meios extra e intracelulares Estas liga es tamb m auxiliam na estabiliza o da estrutura quatern ria das prote nas da membrana evitando a desidrata o A caracter stica mais importante que todos os crioprotetores devem apresentar a capacidade de se ligarem mol cula de gua Gonzalez 2004 66 Em 1987 Ashwood Smith sugeriu diferentes componentes como agentes crioprotetores para congelamento de s men Estes foram lcoois como etanol etilenoglicol glicerol metanol e polietilenoglicol e tamb m as amidas como a acetamida formamida lactamida e o dimetilsulfoxido DMSO Gonzalez 2004 O uso de crioprotetores para os quais as c lulas t m alta permeabilidade resulta numa boa sobreviv ncia celular De entre os crioprotectores referidos anteriormente o glicerol o CP utilizado com maior frequ ncia na congela o de s men caprino tendo ac o a n vel intra e extracelular na protec o das estruturas celulares A capa
52. bons resultados na fertilidade mas requer a presen a dos machos junto das f meas a serem inseminadas Num centro de insemina o a dilui o de s men necess ria sendo esta dependente do tipo de insemina o e do n mero de doses inseminantes necess rias Assim para caprinos os volumes de s men recomendados para insemina o vaginal cervical e intra uterina para cada corno s o respectivamente 0 30 0 50 ml 0 05 0 20 ml e 0 05 0 10 ml Evans e Maxwell 1987 Guerreiro 2002 60 Para a insemina o artificial em caprinos necess ria uma dose de s men com maior quantidade de espermatoz ides do que em bovinos devido anatomia do sistema reprodutor da f mea Cada dose de s men deve conter pelo entre 100 a 200 milh es de espermatoz ides por ml Muniz 2003 Mascarenhas e Sim es 2005 Segundo Corteel e Leboeuf 1990 n o h qualquer vantagem sobre a fertilidade quando o n mero de espermatoz ides superior a 200 milh es por dose Estes autores aconselham o uso de 60 milh es de espermatoz ides nas cabras de ra a Saanen e 100 milh es nas de ra a Alpina 2 9 1 4 Conserva o do S men A conserva o do s men permite prolongar a capacidade de fertiliza o dos espermatoz ides bem como reduzir ou impedir reac es metab licas O s men pode ser conservado l quido ou congelado O processo de conserva o do s men l quido feito por arrefecimento at 4 5 C e relativamente simples de se efe
53. cidade protectora do glicerol deve se sua propriedade coligativa ou de liga o com a gua ao aumento de volume de canais de solventes descongelados dilui o de altas concentra es de sais e diminui o da press o osm tica do meio Bittencourt 2006 Outros crioprotectores de r pida penetra o como o etilenoglicol propanodiol e o DMSO t m menores pesos moleculares que o glicerol e agem protegendo o espermatoz ide provavelmente atrav s do mesmo mecanismo que o glicerol Bittencourt 2006 2 9 1 5 2 Crioprotectores Extracelulares Os crioprotectores extracelulares aumentam a osmolaridade do meio extracelular permitindo a passagem da gua do interior da c lula esperm tica para o meio extracelular impedindo a forma o de cristais de gelo no seu interior durante o processo de congela o Os crioprotectores n o penetrantes s o compostos com alto peso molecular como a cares lipoprote nas da gema do ovo prote nas do leite albumina s rica bovina BSA e em alguns casos amino cidos S o exemplo dos a cares a frutose trealose lactose manose rafinose e pol meros sint ticos como a 67 polivinilpirrolidona metilcelulose e amido Gonzalez 2004 Bittencourt 2006 Outros dois compostos que tamb m evidenciam caracter sticas crioprotectoras s o a glicina beta na e a prolina por estabilizarem a membrana plasm tica e provavelmente manterem a hidrata o das suas prote nas A gema do ovo um d
54. ctuar podendo o mesmo ser utilizado na pr pria explora o O processo de congela o mais complexo e dispendioso 2 9 1 4 1 S men Refrigerado O s men pode ser conservado recorrendo ao seu arrefecimento desde a sua temperatura ambiente temperatura da dilui o at 4 5 C ou 15 C sendo a sua viabilidade m xima de 48 horas Guerreiro 2002 Muniz 2003 Alguns autores referem per odos de conserva o de 24 horas mas segundo Mascarenhas e Sim es 2005 os ndices de fertilidade das cabras inseminadas decrescem rapidamente a partir 61 das 6 horas a 4 C Segundo estes autores a refrigera o permite manter a capacidade fecundante do s men apenas durante um periodo de 4 a 6 horas O diluidor pode ser de gema de ovo tris fructose gema de ovo glucose citrato ou leite de vaca leite inteiro aquecido leite em p reconstru do ou leite UHT Estes diluidores conferem protec o aos espermatoz ides contra os choques t rmicos durante o arrefecimento Para evitar o crescimento microbiano deve adicionar se 1000 UI de penicilina s dica e 1 mg de sulfato de estreptomicina por cada mililitro de diluidor Guerreiro 2002 O arrefecimento do s men pode fazer se no frigor fico 4 5 C ou em qualquer recipiente isolado hermeticamente que contenha gelo Em qualquer uma das situa es o ritmo de arrefecimento deve ser regulado pelo tamanho do recipiente e pela quantidade de gua que envolve os tubos de s men Este processo
55. da f mea e da efic cia e motiva o do macho Alguns machos conseguem introduzir o p nis no primeiro salto enquanto outros necessitam de encontrar a posi o ideal sendo para isso necess rio efectuarem v rios 23 saltos A ejacula o caracterizada por uma contrac o muscular intensa e pelo levantar da cabe a tendo uma dura o de um segundo Sousa 2000 Ap s a ejacula o o macho desmonta de imediato seguindo se um per odo refract rio ou de recupera o p s c pula no qual n o manifesta motiva o sexual Sousa 2000 A dura o do per odo refract rio aumenta gradativamente ap s sucessivas coberturas com a mesma f mea Vitaliano 2011 2 5 1 Factores que afectam o Comportamento Sexual dos Machos Zz O comportamento sexual do macho influenciado pela experi ncia que cada indiv duo possui variando na mesma propor o a frequ ncia e dura o dos comportamentos e a ejacula o Estes crit rios s o utilizados para classifica o e sele o de reprodutores O comportamento sexual tamb m influenciado por factores gen ticos fisiol gicos e hormonais Existem diferen as de libido entre ra as linhagens e idades dos indiv duos Os bodes das ra as utilizadas para produ o de leite s o mais activos sexualmente do que os machos das ra as de carne No entanto existe outro factor que determina a libido do animal sendo este o n vel de nutri o a que submetido e as suas caracter sticas q
56. de espermatoz ides vivos de modo a comprovar que a mesma poderia avan ar Foram congelados os ejaculados que apresentaram mais de 30 dos espermatoz ides vivos As taxas de mortalidade esperm tica foram superiores a 50 tendo variado entre 69 03 16 08 para o bode 1 e 57 61 8 53 para o bode 3 Quadro 4 4 4 2 Determina o da Integridade do Acrossoma O s men foi avaliado ap s a sua descongela o de modo a verificar qual a influencia das curvas de congela o utilizadas na sobreviv ncia dos espermatoz ides e consequentemente na sua capacidade fecundante O Quadro 5 apresenta os valores percentuais da conjuga o do estado de vida vivos ou mortos e da integridade do acrossoma intacto ou danificado dos espermatoz ides ap s descongela o em fun o do tipo de curva de congela o utilizada bem como dos efeitos dos bodes e das datas de recolha do s men Ap s a descongela o apenas se obtiveram em m dia 18 78 1 95 n 27 de espermatoz ides vivos dos quais 94 36 1 67 n 27 tinham o acrossoma intacto e apenas 5 64 1 67 n 27 apresentavam o acrossoma danificado A an lise estat stica dos dados relativos s percentagens de spz vivos e com acrossoma intacto ap s descongela o revelou um efeito significativo do bode e do dia de colheita Relativamente ao tipo de curva de congela o as pequenas diferen as observadas n o se revelaram estatisticamente significativas P 0 63 sugerindo aus nci
57. de Mestre Universidade Federal de Vi osa Minas Gerais S F V 1990 A cabra da produ o de leite protec o da natureza 2 Edi o Editora Cl ssica Editora Lisboa Portugal Santos A D F 2001 Caracter sticas reprodutivas e congelamento do s men de reprodutores das ra as Alpina e Saanen submetidos ao manejo de fotoper odo Tese de Mestrado em Zootecnia Universidade Federal de Vi osa Santos D O Simpl cio A A 2000 Par metros escrototesticulares e de s men em caprinos adultos submetidos insula o escrotal Pesquisa Agropecu ria Brasileira 35 9 1835 1841 96 Setchell B P 1993 Male reproduction Reproduction in Domesticted animals G J King Elsevier 83 127 Silva E C B e Guerra M M P 2012 Sondas fluorescentes um avan o na avalia o da integridade estrutural e funcional de espermatoz ides Revista de Ci ncias Agroveterin rias 11 2 162 169 Silva S V Batista A M Coleto Z F Guerra M M P 2009 Diferentes M todos e T cnicas na Avalia o Esperm tica Uma Breve Revis o Ci ncia veterin ria tropical 12 1 2 3 1 15 Snoeck P P N 2003 Aspectos da criopreserva o de s men eqiiino composi o do meio diluidor curvas de congela o e fertilidade Tese de Doutoramento em Medicina Veterin ria Faculdade de Medicina Veterin ria da Universidade Federal de Minas Gerais Belo Horizonte Sousa J P F 2000 Varia o anual das caracter sticas
58. des VAD diferiu significativamente entre o animal 1 e 2 P 0 016 e entre os dias de colheita 1 e 3 P 0 032 No que se refere percentagem de espermatoz ides mortos os factores animal e dia de colheita tamb m afectaram significativamente os resultados O bode 1 diferiu significativamentedos dos restantes na percentagem de espermatoz ides MAI Tamb m para este par metro os dias de colheita 2 e 3 revelaram se significativamente diferentes P 0 042 Na percentagem de espermatoz ides MAD o bode 1 diferiu dos bodes 2 e 3 P lt 0 001 Neste par metro verificaram se diferen as significativas entre o dia 1 e os dias 2 P 0 003 e 3 P lt 0 001 Os resultados deste ensaio permitiram concluir que as 3 curvas de congela o estudadas n o influenciaram significativamente as taxas de mortalidade dos espermatoz ides do s men de caprino sugerindo que qualquer delas se revelou eficaz na congela o de s men desta esp cie Verificou se no entanto uma varia o significativa quer entre animais quer entre dias de colheita reafirmando estes factores VII como bastante influenciadores da variabilidade frequentemente observada das capacidades fertilizantes do s men congelado de caprino Abstret This study was aimed to test the effect of 3 different freezing curves on the acrosome integrity of male goat sperm cell The semen collection was performed at the Departments of Agrarian Development of Terceira Island SDAT using 3 bucks 2
59. devo pacesie orem pamela 37 281 2 Volume AS BjACUIadO last sta sina ano T E aaa 38 256 2 A VANA O MIBFOSCODICA ain vessi ccs paid ns on NANDA a a Ea Aa 40 2 8 2 1 Mobilidade ut DS E AR SL DT Ia 40 2 8 2 1 1 Caracter sticas dos Movimentos das Ondas 40 2 8 2 1 2 Propor o Espermatoz ides M veis cccessceesseceeesececeeeeeeeteeeesteeeesaes 42 2 8 2 2 CONCEMUACAD susceecssavevatevtnteaesadeayeasasepeaceaaunsndeasgauaaed leoaadessdyedeasonondeeleenceeaones 42 2 8 2 2 1 Visualiza o Directa da Consist ncia do Ejaculado 43 2 8 2 2 2 Contagem exacta com um Hemocit metro 43 2 8 2 2 3 Densidade Optima atrav s de um Espectrofot metro e 45 2 8 2 3 Morfologia dos Espermatoz ides erra 46 2 8 2 3 1 Percentagem de Espermatoz ides Vivos e Anomalias Morfol gicas 47 2 0 2 0 1 1 Prepara o do ESITe eae Jus quis altos a anais putas age Sees tele 48 2 8 2 3 1 2 Anomalias Morfol gicas cs A caido ga ve Paso eees Seaver OR 48 2 8 2 4 T cnicas de Avalia o de S men in Vitro 49 Za A TC Ome era de FIXO 2 4 inata feitas toast Sora OG es pe sa gg a 51 2 8 2 4 1 1 Estrutura B sica e Funcionamento de um Cit metro de Fluxo 52 2 8 2 4 1 2 Processamento das amostras esseeeseseeseeseesseseresressrseresressrserssressesses 54 2 8 2 4 1 3 Compostos Fluorescentes mais utilizados para a Citometria de Fluxo
60. di o em fluxo permite an lises a alta velocidade ex 10 10 part culas por segundo e al m disso garante que as part culas analisadas sejam seleccionadas de toda a popula o sem qualquer subjectividade associada A an lise por citometria de fluxo objectiva tem um alto n vel de repetibilidade experimental e possui a vantagem de estar apta a trabalhar com amostras de volume 51 reduzido Al m disso o cit metro de fluxo tem a capacidade de detectar marcadores por m ltiplos fluorocromos associados a um nico espermatoz ide o que significa que mais de um atributo esperm tico pode ser avaliado simultaneamente A citometria de fluxo permite a observa o de caracter sticas como tamanho da c lula forma e complexidade interna assim como qualquer componente ou fun o do espermatoz ide que pode ser detectado por um fluorocromo ou composto marcado com fluoresc ncia 2 8 2 4 1 1 Estrutura B sica e Funcionamento de um Cit metro de Fluxo O cit metro de fluxo resultou da aplica o do conhecimento e t cnicas as quais foram independentemente desenvolvidas como a ci ncia da computa o tecnologia laser engenharia el ctrica matem tica medicina biologia biotecnologia biologia molecular produ o de anticorpos monoclonais qu mica org nica e f sica A citometria de fluxo baseia se no emprego de radia o laser fluxo hidrodin mico ptica subst ncias fluorescentes fluorocromos e recursos de inf
61. do spz MAI das diferentes curvas de congela o Estimates Measure MEASURE 1 Std Error 95 Confidence Interval A 442 044 321 963 B 383 044 263 904 C 490 044 369 611 Quadro 8 8 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz vivos com acrossoma danificado spz MAI dos bodes Estimates Measure MEASURE 1 Bode Mean Std Error 95 Confidence Interval 1 001 044 430 672 2 8313 044 193 434 3 451 044 330 072 Quadro 8 9 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz vivos com acrossoma danificado spz MAI no dia da colheita Estimates Measure MEASURE 1 DiaColheita Mean Std Error 95 Confidence Interval 1 332 026 260 404 2 396 027 319 472 3 088 076 1376 800 104 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz mortos com acrossoma intacto spz MAT Quadro 8 10 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz mortos com acrossoma intacto spz MAI das diferentes curvas de congela o Estimates Measure MEASURE 1 Curva Mean Std Error ES Confidence Interval Lower Bound 11 641 13 381 11 363 13 103 10 369 12 109 Quadro 8 11 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz mortos com acrossoma intacto spz MAI dos bodes Estimates Measure MEASURE 1 Bode Mean Std Error 95 Confidence Interval Upper Bound Quadro 8 12 M dia e Erro Padrao das percentagens dos spz mortos com acrossoma intacto spz MAI no dia da colheita Estimates Measure MEASURE 1 2
62. du o acentuada na qualidade ou quantidade de s men Evans e Maxwell 1987 Nos bodes normal efectuar se 2 a 3 recolhas di rias em dias alternados No entanto indispens vel que o intervalo entre recolhas seja de meia a uma hora para obten o de um bom ejaculado tanto em volume como em concentra o Evans e Maxwell 1987 2 7 3 Selec o dos Machos Dadores de S men Na escolha dos machos dadores devem ser examinados os rg os reprodutores nomeadamente o tamanho e a forma dos test culos A palpa o pode ser feita no escroto Os test culos devem ser firmes e el sticos sem les es ou deforma es e mover se livremente no saco escrotal As caudas do epid dimo devem ser facilmente palp veis e com igual forma e tamanho Se o epididimo inchar ou endurecer nalguma zona devido a les o ou doen a pode suspeitar se de epididimite Maia 2010 Tamb m 32 se deve ter em aten o a integridade do ducto deferente que deve ser duro e facilmente palp vel Por fim deve ser analisado o prep cio o p nis e particularmente o processo uretral devem ser analisados no aparecimento de anomalias Evans e Maxwell 1987 O processo uretral pode ser danificado aquando da tosquia Evans e Maxwell 1987 Animais que t m defeitos como criptorquidia test culos que n o desceram da cavidade abdominal para o escroto hipoplasia testicular test culos subdesenvolvidos spermiostasis bloqueio dos canais do epid dimo ou varicocelo
63. e c lcio o que aumenta a permeabilidade da membrana e consequentemente cria desordem nas reac es across micas Embora causem infertilidade os danos across micos n o interferem na motilidade e s o distribu dos igualmente entre a popula o de espermatoz ides m veis e im veis Santos 2001 No entanto segundo Bittencourt 2006 taxas de arrefecimento r pidas de 30 C at temperaturas inferiores a 10 C promovem uma queda progressiva da motilidade esperm tica e de acrossomas intactos antes da congela o e uma redu o na percentagem de c lulas com motilidade p s descongela o No presente trabalho a temperatura de arrefecimento foi igual nas tr s curvas alterando se apenas a temperatura de congela o a partir dos 5 C Contudo como j foi referido os resultados das diferentes curvas n o se diferenciaram significativamente apesar de segundo Snoeck 2003 ser ideal uma curva de congela o lenta de modo a permitir que os espermatoz ides se desidratem e r pida o suficiente para evitar que os espermatoz ides fiquem expostos por muito tempo a altas concentra es de soluto 85 No que concerne avalia o dos espermatoz ides vivos com o acrossoma intacto verificaram se diferen as significativas entre os bodes P lt 0 001 O teste de compara es m ltiplas e permitiu verificar que as diferen as apenas n o foram significativas entre os bodes 2 e 3 O mesmo se p de observar nos dias de recolha de s m
64. e integrety The different curves did not influence the mortality rate of sperm with intact acrosome 11 6 0 63 spz Curve A 11 36 0 63 spz Curve B e 10 37 0 63 spz Curve C or damagedo 68 78 1 39 spz Curve A 70 54 1 39 spz Curva B e 70 96 1 39 spz Curva C However there was a significant effect of bucks and collection days in the four parameters studied percentage of live sperm with intact VAD or damaged VAD acrosome and percentage of dead sperm with intact MAD or damaged MAD acrosome Concerning the percentage of VAI sperm male goat 1 showed values 50 lower than goats 2 and 3 P lt 0 001 and collection day substantially affected this parameter 25 33 0 66 SPZ collection day 1 18 40 0 66 SPZ collection day 2 and 11 31 0 91 SPZ collection day 3 P lt 0 01 The percentage of sperm VAD differed significantly between animals and 2 P 0 016 and between collection days 1 and 3 P 0 032 Regarding the percentage of dead spermatozoa animal and collection day factors also significantly affected the results Buck Isignificantelly differed in the percentage of MAI spermatozoa Also for this parameter the collection days 2 and 3 were significantly different P 0 042 In percentage of the MAD spermatozoa buck 1 differed from bucks 2 and 3 P lt 0 001 In this parameter there were significant differences between day 1 and day 2 P 0 003 and 3 P lt 0 001 The results of this experiment showed t
65. ega a estes por um mecanismo de contracorrente Para al m dos m todos de arrefecimento importante o isolamento dos mesmos que tamb m pode ser feito pelos p los que envolvem os test culos Cada um dos test culos revestido por tecido conjuntivo que forma uma esp cie de c psula composta por fibras colag neas e el sticas de cor esbranqui ada rodeada por art rias e veias testiculares t nica albug nea Depois desta t nica encontra se o par nquima testicular que apresenta uma cor amarelada e est dividido em v rios l bulos Sousa 2000 A visualiza o destes l bulos poss vel atrav s da sec o de cada um dos test culos Cada l bulo composto por v rios t bulos semin feros onde ocorre a espermatog nese e por tecido intersticial constitu do por vasos sangu neos nervos e c lulas de Leyding que segregam a testosterona sob o controlo da LH hipofis ria Baril et al 1993 Os t bulos semin feros ocupam aproximadamente 80 a 90 do par nquima testicular nos ruminantes t m entre 1500 a 7000 m de comprimento total e cerca de 0 2 mm de di metro de l men que acumula e transporta o esperma at rede testicular rete testis Baril et al 1993 Sousa 2000 Como foi referido anteriormente os tubos semin feros s o compostos por c lulas espermatog nicas ou seja por c lulas germinativas que originam o esperma e por c lulas de Sertoli que garantem o suporte e a alimenta o das primeiras tal co
66. en com um n vel de signific ncia de P lt 0 002 Tamb m se obtiveram resultados significativos P 0 016 entre os bodes 1 0 55 0 04 spz VAD e 2 0 31 0 04 spz VAD Os resultados obtidos no bode 2 v o de encontro ao estudo de Daskin e Tekin 1996 que verificaram uma maior taxa de motilidade e uma menor percentagem de danos no acrossoma p s descongela o para o s men congelado sem centrifuga o em meio com gema de ovo que para as amostras congeladas em meio sem gema de ovo 19 e 33 para motilidade e danos no acrossoma respectivamente No bode 2 obteve se uma motilidade de 86 25 2 25 e nos espermatoz ides vivos e mortos com o acrossoma danificado um total de 0 31 0 04 e 63 01 1 39 respectivamente como se pode observar no Quadro 5 No primeiro e terceiro dia de recolhas de s men obteve se valores de 0 33 0 03 e 0 59 0 08 P lt 0 032 respectivamente nos spz vivos com o acrossoma danificado Gonzalez 2004 fez um ensaio com s men de bovino utilizando diferentes t cnicas de congela o e consequentemente diferentes taxas de congela o n o obtendo nos seus resultados diferen as significativas nos par metros estudados entre os quais a integridade do acrossoma Neste trabalho a percentagem de espermatoz ides vivos com o acrossoma intacto Quadro 5 foram inferiores s obtidas por Tasseron et al 1977 que utilizando s men de carneiro observaram taxas da ordem dos 40 detec o feita por meio de microscopia de
67. entra o esperm tica a utiliza o do espectofot metro Esta t cnica baseia se na medi o da densidade ptica a um comprimento de onda de 550 nam metros de uma solu o salina contendo espermatoz ides com uma amostra branca sem espermatoz ides Se esta t cnica for utilizada de forma rotineira necess rio obter uma curva de calibra o utilizando 20 a 50 amostras de concentra es diferentes de espermatoz ides a partir da contagem do hemocit metro Baril et al 1993 A correla o e o declive da linha de regress o s o calculados entre a densidade ptica da amostra x e a sua concentra o esperm tica y Ou seja quanto maior a densidade esperm tica menor o feixe de luz transmitido pela amostra Baril et al 1993 Sousa 2000 O coeficiente de correla o deve ser superior a 0 9 e o declive pr ximo de 1 Deste modo um diagrama ou a mesma f rmula podem ser utilizadas como m todo de rotina 45 Nos carneiros o s men dilu do a uma taxa normal apresenta uma rela o inversa entre a quantidade de luz transmitida e o n mero de espermatoz ides da amostra No entanto para os bodes a mesma situa o n o ocorre devido colora o mais amarelada do s men devido ao plasma seminal que interfere na transmiss o da luz Evans e Maxwell 1987 O color metro deve ser calibrado com 10 a 15 contagens efectuadas pelo hemocit metro de modo a obter uma curva de calibra o Para a calibra o dever o se
68. espec ficas que desenvolvidas por dois elementos do sexo oposto induzem naturalmente c pula Cada uma das etapas que origina este comportamento sexual implica um estado motivacional comunica o entre parceiros e rea es fisiol gicas coordenadas estando sujeito a factores gen ticos ambientais nutricionais e hormonais Vitaliano 2011 No comportamento sexual podem distinguir se dois aspectos essenciais o interesse na aproxima o a indiv duos do sexo oposto libido e a realiza o do acto sexual O comportamento sexual no macho compreende um conjunto complexo de actividades que podem envolver uma reac o individual ou mudan as fisiol gicas tais como a interac o entre dois ou mais indiv duos cada um respondendo actividade do outro De um modo generalizado e simplificado para que ocorra o comportamento necess rio a exist ncia de um est mulo interno ou externo que interaja com o sistema nervoso Vitaliano 2011 Nos caprinos tal como nas outras esp cies o comportamento sexual proporcionado por factores intr nsecos e extr nsecos aos animais Os factores intr nsecos de maior nfase s o os n veis de hormonas esteroides Tamb m de salientar os factores gen ticos uma vez que existem diferen as de libido entre ra as e linhagens A primeira etapa caracter stica do comportamento reprodutivo a procura e identifica o do parceiro seguidas da c rte monta e por fim c pula Fig 4 Para que estas
69. esperm tica ou inibidores da capacita o actuando na superf cie do espermatoz ide protegendo ou estabilizando a membrana plasm tica evitando assim a rea o across mica precoce As diferentes curvas de congela o utilizadas A B e C n o apresentaram diferen as significativas na integridade across mica nos quatro par metros estudados VAI VAD MAI e MAD Bag et al 2001 efectuaram um estudo semelhante com carneiros como dadores de s men tendo utilizando uma taxa de congela o de 25 C min mas com temperaturas iniciais diferentes Pelo teste de termoresist ncia a 84 temperatura inicial de congela o de 125 C conferiu maior capacidade de criopreserva o aos espermatoz ides do que as temperaturas iniciais a 25 C ou 75 C P lt 0 05 Contudo Maia 2010 afirma que as palhinhas expostas a temperaturas entre 75 e 125 C n o afeta a sobreviv ncia do espermatoz ide ovino apesar do de caprino ser menos tolerante Nos caprinos geralmente recomendada a exposi o das palhinhas a uma temperatura de 75 C Barbas et al 2006 tamb m utilizaram duas curvas de congela o com diferentes temperaturas na segunda rampa em s men de carneiro colhido ao longo do ano obtendo um valor significativamente superior P lt 0 001 na curva com maior n mero de espermatoz ides normais nas pocas de Ver o e Outono Com o processo de arrefecimento a fun o das prote nas afectada como por exemplo os canais d
70. gir com os factores end crinos e sociais Vitaliano 2011 Na poca reprodutiva a procura de parceira por parte do macho deve se essencialmente exist ncia de feromonas libertadas pelas f meas na altura de cio e pela motiva o sexual e transmiss o de sinais ac sticos e visuais Os comportamentos padr o que induzem c pula s o a incita o sexual fase de cortejo erec o monta introdu o do p nis ejacula o desmonta e fase refract ria Segundo Patifio 2002 o comportamento sexual do macho distingue se em duas fases principais fase apetitiva c rte e fase de consuma o c pula Na c rte o macho aproxima se da f mea lateralmente adoptando uma postura com a cabe a baixa e prolongada em continuidade com as costas e mantendo as orelhas deitadas De seguida procede se identifica o olfativa onde o macho cheira e lambe a regi o anogenital da f mea Na maioria dos casos o primeiro contacto directo entre os indiv duos o farejo ano genital Estes farejos s o de curta dura o e por vezes repetidos entre comportamentos Sousa 2000 22 O acto de fungar permite ao macho inalar as feromonas libertadas pela f mea atrav s da urina manifestando um reflexo olfactivo denominado por Reflexo de Flehmen Durante este reflexo Fig 4 o macho faz fortes inala es no ar com o pesco o estendido retrai o l bio inferior e levanta o superior Sousa 2000 Vitaliano 2011 Segundo O Brien 1982
71. hat the 3 freezing curves studied did not significantly influence the mortality rates of male goat spermatozoa suggesting that any of them proved effective in freezing semen of this species There was however a significant variation between animals and between collection days confirming these as very influencing factors of the variability commonly observed in the fertilization ability of male goat semen XI Indice PLSTACSCIMEMLOS essas nian sais EA Esq ada Na SAE dds da Ta oar TAN nad RAT pda aA V RESUMO se St eee EE ia e E AETS S a A A E ORE VII JENSI KO EEE E T X Indicen a a a a eh save cht a al XII indice Ouddios naure E E EER TEE SI O N XVI Indic de ursos ean E aaa EA R XVII Lista de abreviaturas siglas e s mbolos ssesssseessseesssessesserrsseessseessresseessesesseesssees XVII E Biro QU O onre as e adel aaa ee A A A cal A 1 LE Revis o Bibliogr ficas orinn er it e OEE ERA Pnad a SS agrado 3 2 1 Anatomia e Fisiologia do Aparelho Reprodutor do Bode 3 PN AVE CSCW OS RE et a a a e dS can tlds RR eiai 3 UMD Epid DING ot je nea SR RN E RU E R 6 2 1 2 Gl nd l s ANERAS igoe sigri sa ias dE Sua ad 8 PR LAE ET A A eect Mace iad Soar NERD ER UR 9 2 2 S men e Caracter sticas Seminais ssa eo 10 22 Plasma Seminal aces isa ensina diga a A ae 10 Za 2s FISPETIMALOZONIES Eus rrenan nao pai GU UH a SR A a ARE 11 2 3 Regula o Hormonal da Produ o de S men re 12 2A Espe
72. idade reprodutiva Segundo Delgadillo e Chemineau 1992 o decr scimo de horas de luz estimula a secre o de LH pela hip fise via GnRH do hipot lamo o que leva ao crescimento testicular e liberta o de testosterona Deste modo os caprinos s o animais de dias curtos ou seja o seu per odo de actividade sexual ocorre durante os dias de menor intensidade luminosa 8 horas de luz Contrariamente os dias mais longos t m efeito inibit rio sobre a actividade reprodutiva dos caprinos 16 horas luz Dantas 2009 Nas regi es temperadas o fotoper odo um factor decisivo tendo grande influencia sobre as concentra es hormonais de LH FSH testosterona e prolactina A diminui o do fotoper odo estimula a secre o de LH e FSH pela hip fise verificando se consequentemente um aumento da actividade testicular e da produ o testosterona Quando os dias s o longos ocorre uma diminui o da secre o de gonodotrofinas e testoterona Vitaliano 2011 25 A percep o da luz pela retina do olho desencadeia uma s rie de est mulos que activam a adeno hipofise e consequentemente a produ o e liberta o de gonodotrofinas A luz recebida por fotoreceptores que enviam uma s rie de mensagens em cadeia a n vel neural at activar a gl ndula pineal que converte o estimulo neural em sinal hormonal este sinal hormonal que permite activar ou n o a secre o de melatonina Dantas 2009 A gl ndula pineal na aus ncia de lu
73. iferentes formas tais como ligando se especificamente a esses componentes celulares s o exemplos os fluorocromos que marcam os cidos nucleicos de cadeia dupla prote nas ou l pidos Tamb m podem distribuir se num compartimento celular espec fico exemplo no n cleo mitoc ndrias ou vac olos num 54 compartimento especifico sub celular em fun o do seu estado funcional o compartimento mitocondrial um exemplo t pico e ser utilizados ligados a anticorpos ou lectinas conjugados com outros fluorocromos a fluoresce na e a ficoeritrina s o exemplos de dois fluorocromos muito usados para este efeito Tamb m s o utilizados como uma n o marca o ou seja como marca o negativa Por exemplo a exclus o do iodeto de prop dio PI permite avaliar a integridade da membrana O primeiro fluorocromo a ser utilizado como marcador foi o FITC Este uma mol cula pequena com uma importante afinidade para as prote nas Por outro lado o FITC excitado com o azul 488 nm No entanto apresenta alguns inconvenientes relacionados com a quantifica o H que ter em conta que uma mol cula de FITC n o somente excit vel pela luz do laser sendo tamb m pela luz que provem de uma mol cula de fluorocromo que se encontre muito pr xima Para estudos de cidos nucleicos os fluorocromos mais empregues s o o Iodeto de Prop dio o Br mio de Etidio o Laranja de Acridina o Hoechst 33342 o Laranja de Tiazol a Mitramicina e a
74. imeiro par metro a ser avaliado A avalia o deve ser feita por observa o directa no tubo de recolha imediatamente a seguir recolha de s men Fig 5 A cor normal do s men de bode branco acinzentado a amarelado variando entre ejaculados do mesmo macho entre prata e branco Maia 2010 Se o s men apresentar uma tonalidade rosada poder indicar presen a de sangue que pode ser devido a les es do p nis durante a recolha Muniz 2003 As tonalidades cinza e castanho s o indicativas de contamina o ou alguma infec o no tracto reprodutivo Maia 2010 Tamb m podem ocorrer casos em que se observe a presen a de urina atrav s do odor Esta possibilidade evidente ap s recolhas de s men por electroejacula o Evans e Maxwell 1987 Se existir urina no s men este apresenta se mais dilu do e consequentemente com uma colora o menos intensa Guerreiro 2002 No que concerne ao aspecto deve variar de leitoso a cremoso Quadro 1 eliminando se sempre o s men aquoso ou turvo dado que indicativo de uma pequena concentra o esperm tica Muniz 2003 37 Quadro 1 Concentra o S men Avaliado pela Consist ncia N spz x10 ml Escala Pontua o Consist ncia M dia Desvio da M dia 5 Densa e Cremosa 5 0 4 5 6 0 4 Cremosa 4 0 3 5 4 5 3 Pouco Cremosa 3 0 2 5 3 5 2 Leitoso 2 0 1 0 2 5 1 Turvo 0 7 0 3 1 0 0 a Aquoso Insignificante Fonte Baril et al 1993 2 8 1 2
75. ise r pida objectiva e quantitativa de c lulas em suspens o Esta t cnica envolve a an lise das propriedades pticas dispers o da luz e fluoresc ncia de part culas que fluem em uma suspens o l quida sendo esta particularidade uma das principais diferen as existentes entre a citometria de fluxo e outras t cnicas de an lise quantitativa como por exemplo a microespectrofotometria que necessitam da fixa o de part culas a uma superf cie ex l mina Segundo Evenson et al 1980 a adapta o do cit metro de fluxo para avalia o esperm tica teve in cio no estudo da mensura o do conte do de DNA mas sua aplica o para an lise esperm tica tem aumentado consideravelmente nos ltimos 15 anos A citometria de fluxo uma ferramenta muito importante para a an lise celular uma vez que permite determinar em poucos minutos dados sobre todas as subpopula es celulares de uma amostra Este factor torna o m todo de citometria de fluxo ideal para a avalia o de popula es heterog neas como de espermatoz ides Batista e Guerra 2010 Por microscopia ptica apenas se conseguem examinar normalmente 200 c lulas esperm ticas enquanto que por citometria de fluxo consegue se examinar cerca de 30 000 espermatoz ides em menos de um minuto Este sistema automatizado permite ter maior exactid o nos resultados e diminui o no tempo de prepara o requerido em outras t cnicas fluorescentes Arruda et al 2011 A me
76. lativa percentagem de spz vivos e com acrossoma danificado Quadro 8 20 ANOVA de factores independentes Tests of Between Subjects Effects Measure MEASURE 1 Transformed Variable Average Source Type III Sum of Mean Square ai Squares Intercept 368 890 1321 802 Curva 618 2 215 Bode 2 377 8 515 Error 279 Quadro 8 21 Teste de compara es m ltiplas para os bodes Pairwise Comparisons Measure MEASURE 1 I Bode J Bode Mean Std Error 95 Confidence Interval for Difference l J Difference Upper Bound Based on estimated marginal means The mean difference is significant at the 05 level b Adjustment for multiple comparisons Least Significant Difference equivalent to no adjustments 109 Quadro 8 22 ANOVA para dia de colheita Tests of Within Subjecis Effects Measure MEASURE 1 Source Type III Sum of Mean Square ERRA Squares Sphericity Assumed Greenhouse Geisser DiaColheita Huynh Feldt Lower bound Sphericity Assumed Greenhouse Geisser Huynh Feldt Lower bound DiaColheita Curva Sphericity Assumed Greenhouse Geisser Huynh Feldt Lower bound DiaColheita Bode Sphericity Assumed Greenhouse Geisser Error DiaColheita Huynh Feldt Lower bound Quadro 8 23 Teste de compara es m ltiplas para o dia de colheita Pairwise Comparisons Measure MEASURE 1 I DiaColheita J DiaColheita Mean Difference Std Error 95 Confidence Interval for l J
77. let J C 1993 Manuel de formation pour I ins mination artificielle chez les ovins et les caprins tude FAO production et sant animales France Batista A M e Guerra M M P 2010 Novas t cnicas para avalia o da qualidade do s men caprino Departamento de Medicina Veterin ria Universidade Federal Rural de Pernambuco Revista Brasileira de Reprodu o Animal Belo Horizonte 34 3 125 132 Betini C Moraes G V Rigolon L P 1998 Efeito da congela o vertical e horizontal na qualidade do s men caprino Acta Scientiarum 20 3 361 365 Bittencourt R F 2006 Criopreserva o de s men caprino influ ncia dos diluidores de congela o tempos de equil brio e curvas de resfriamento Disserta o da Tese de Mestrado de Medicina Veterin ria Tropical Universidade Federal da Bahia 90 Chauhan M S e Anand S R 1990 Effect of egg yolk lipids on the freezing of goat semen Theriogenology 34 5 1003 1013 Chemineau P Cagnie Y Guerin Y Orgeur P Vallet J C 1991 Training manual on artificial insemination in sheep and goats FAO Reproduction and Health Paper Food and Agriculture Organization of the United Nations 222 Correa J R Rodriguez M C Patterson D J Zavos P M 1996 Thawing and processing of cryopreserved bovine spermatozoa at various temperatures and their effects on sperm viability osmotic shock and sperm membrane functional integrity Theriogenology 46 413 420 Co
78. lientar que este foi o animal que obteve melhor volume de ejaculado V 0 89 0 07 ml P gt 0 05 Quadro 4 Contrariamente o bode que apresentou menor percentagem de espermatoz ides vivos foi o que produziu menor volume esperm tico e maior concentra o de spz 5 08 x 10 spz ml P gt 0 05 Quadro 4 76 4 2 2 Concentra o do S men O bode 2 foi o que apresentou menor concentra o esperm tica sendo ultrapassado em cerca de 50 pelo bode 3 e em 150 pelo bode 1 2 05x10 2 98x10 e 5 08x10 spz ml respectivamente O s men do animal 1 contudo apresentou a menor motilidade e a menor percentagem de espermatoz ides vivos como se pode observar no Quadro 4 As diferen as n o atingiram por m o n vel de signific ncia estat stica provavelmente devida ao reduzido n mero de r plicas n 3 Quadro 4 M dias e Erro Padr o dos par metros avaliados no s men fresco dos diferentes bodes As diferen as observadas n o foram estatisticamente significativas Concentra o Bode Volume ml Motilidade SPZ vivos SPZ mortos x 10 spz ml 1 0 72 0 28 5 08 1 38 73 3 6 67 30 97 16 08 69 03 16 08 2 0 75 0 08 2 05 0 34 86 25 2 25 42 32 5 66 57 68 5 66 3 0 89 0 07 2 98 0 90 77 52 50 42 39 8 54 57 61 8 53 77 4 4 Avaliacao por Citometria de Fluxo 4 4 1 Determina o da Rela o entre Espermatoz ides Vivos e Mortos Antes de se proceder congela o determinou se a percentagem
79. m a f mea recebe um novo est mulo Por fim os machos que t m por h bito saltar e cobrir a f mea devem ser acostumados de imediato a ejacular no interior da vagina artificial O tempo necess rio para treinar um bode dador de s men depende do t cnico bem como da experiencia sexual e temperamento dos animais O manuseamento e familiaridade a que os animais est o acostumados com os humanos um factor importante Explora es que t m os animais alojados em infraestruturas s o mais f ceis de treinar uma vez que est o familiarizados com o ambiente local Normalmente os animais mais jovens s o mais t midos do que os mais velhos e os bodes tendem a ser mais sens veis a saltar na presen a de humanos 35 O t cnico deve ser uma pessoa paciente e gentil porque os animais em forma o s o particularmente sens veis distrac o ou a sustos provocados por t cnicos impacientes e a presen a de outros animais como c es e estranhos Um susto durante o per odo de treino pode ter efeito inibit rio prolongado no desempenho do animal Os t cnicos devem observar as caracter sticas comportamentais de cada macho de modo a garantir que os animais mant m uma produ o de s men de qualidade e quantidade adequadas ap s a recolha com vagina artificial 2 8 Avalia o do S men Ap s a recolha de s men a quantidade e qualidade de cada ejaculado deve ser cuidadosamente avaliada O manuseio do s men deve ser feito cuidadosamente p
80. m cio induzido A indu o artificial foi conseguida com uma injec o intramuscular de 250 ug de benzoato de estradiol dilu do em 2 5 ml de leo mineral aplicada 48 horas antes da hora prevista para a recolha Ap s esta injec o era feito o despisto do cio que ocorria normalmente entre as 16 e 36 horas Vinte e quatro horas ap s o aparecimento do cio era injectado novamente benzoato de estradiol numa dose de 100 ug em 1 ml de leo mineral As recolhas foram sempre efectuadas pela manh com inicio por volta das 08 00 horas e em cada per odo de recolhas os bode alternavam aleatoriamente A vagina artificial utilizada continha no seu interior gua aquecida a 48 50 C e era colocada uma pequena quantidade de gel entrada da mesma de modo a facilitar a penetra o Para evitar o choque t rmico dos espermatoz ides os tubos de recolha eram aquecidos a 33 37 C O transporte do s men para o laborat rio era feito numa caixa t rmica com gua a 30 33 C de modo a garantir a sua integridade 69 3 2 Avalia o do S men O s men era rapidamente transportado at ao laborat rio e imediatamente ap s a sua chegada colocado em banho maria a 36 C procedendo se depois sua avalia o As caracter sticas seminais avaliadas foram o volume a concentra o e a mobilidade massal 3 2 1 Cor e Consist ncia Estas caracter sticas foram avaliadas subjectivamente por observa o directa logo ap s a colheita de s men
81. m tr s partes iguais para congela o perfazendo um total de 27 amostras A recolha de s men foi efectuada segundo o m todo de vagina artificial A dilui o de s men para congela o foi efectuada de acordo com o protocolo utilizado por Atessahin et al 2008 com Tris e gema de ovo Neste estudo n o se procedeu lavagem do s men e aplicou se uma percentagem de gema de ovo de 9 Este facto contraria alguma da literatura existente acerca da intera o entre as enzimas do plasma seminal e lipases da gema de ovo Segundo Evans amp Maxwell 1987 quando se utilizam meios sint ticos para diluir s men de bode a reac o de coagula o n o ocorre se a percentagem de gema de ovo ap s a dilui o n o for superior a 2 Estudos mais recentes demonstraram que a presen a de plasma seminal e de gema de ovo s o importantes na sobreviv ncia dos espermatoz ides tendo Chauhan e Anand 1990 observado que a congela o de s men com um diluidor base de tris gema de ovo sem remo o do plasma seminal produz elevadas taxas de fertilidade Azer do et al 2001 conclu ram que a remo o do plasma seminal pode ser prejudicial congela o de s men caprino uma vez que a percentagem de espermatoz ides com membranas plasm ticas ntegras e de motilidade esperm tica diminuam ap s a centrifuga o do plasma seminal Viana et al 2006 observaram que ap s a centrifuga o do s men houve uma brusca redu o da motilidade e do vigo
82. mo a liberta o dos espermatoz ides maduros no l men do tubo semin fero desempenhado ainda fun o end crina atrav s da produ o de FSH Inibina e a prote na de liga o aos androg nios Baril et al 1993 Sousa 2000 2 1 1 1 Epid dimo O epid dimo um rg o formado por um s tubo alongado e completamente ligado ao test culo no epid dimo que a rete testis desemboca e ocorre o transporte e armazenamento dos espermatoz ides at ejacula o isto porque este rg o se subdivide em tr s zonas sucessivas e distintas cabe a corpo e cauda Baril et al 1993 A cabe a do epid dimo encontra se na zona proximal do test culo onde desembocam os ductos eferentes o corpo do epid dimo compreende a zona entre a cabe a e a zona distal do test culo onde se insere a cauda que liberta o seu fluido para ducto deferente O contorno da cauda pode ser identificado atrav s da palpa o da pele do escroto Evans e Maxmell 1987 Meijer e Vlissingen 1993 Os canais anteriormente referidos s o de extrema import ncia para desempenho reprodutivo do animal pois nestes que ocorre a matura o transporte e armazenamento dos espermatoz ides O transporte efectuado atrav s dos canais eferentes medida que os espermatoz ides se v o produzindo nos test culos Evans e Maxwell 1987 O transporte ao longo do epididimo pode demorar entre 10 a 14 dias consoante a actividade do epit lio ciliado dos ductos eferentes
83. na c mara de Neubauer De seguida deixa se repousar a placa para que haja sedimenta o dos espermatoz ides no fundo da l mina Baril et al 1993 Por fim coloca se o hemocit metro cuidadosamente no microsc pio Este deve conter um mecanismo de precis o que permita a visualiza o em duas direc es e contraste de fase No microsc pio de contraste de fase deve iniciar se a observa o a uma pot ncia baixa 40x ou 100x de modo a detectar a grade de contagem passando se posteriormente para uma amplia o mais elevada 400x Baril et al 1993 Maia 44 2010 A contagem deve ser efectuada sobre o 5 quadrados maiores numa linha diagonal Apenas se devem contar os espermatoz ides que t m as cabe as dentro dos quadrados grandes sendo assim eliminados os que apresentarem as cabe as sobre a linha do quadrado no sentido interior exterior Sousa 2000 A concentra o esperm tica calcula se pela soma da contagem diagonal dos Squadrados maiores multiplicando por 50 x 10 spz ml Esta t cnica muito precisa para determina o da concentra o esperm tica No entanto requer bastante tempo e paci ncia e n o deve ser efectuada como m todo de rotina por um centro de insemina o artificial Baril et al 1993 2 8 2 2 3 Densidade ptima atrav s de um Espectrofot metro Existem v rios modelos de color metros dispon veis Evans e Maxwell 1987 no entanto o m todo mais r pido e eficaz para determinar a conc
84. nce is significant at the 05 level b Adjustment for multiple comparisons Least Significant Difference equivalent to no adjustments 107 Quadro 8 18 Quadro 1 3 ANOVA para dia de colheita Tests of Within Subjects Effects Measure MEASURE 1 Squares Sphericity Assumed 710 222 355 111 154 466 Greenhouse Geisser 710 222 462 288 154 466 Huynh Feldt 710 222 355 111 154 466 Lower bound 710 222 710 222 154 466 Sphericity Assumed 64 435 16 109 7 007 Greenhouse Geisser 64 435 20 971 7 007 Huynh Feldt 64 435 16 109 7 007 Lower bound 64 435 32 218 7 007 Sphericity Assumed 594 242 148 560 64 621 Greenhouse Geisser 594 242 193 398 64 621 Huynh Feldt 594 242 148 560 64 621 Lower bound 594 242 i 297 121 64 621 Sphericity Assumed 18 392 2 299 Greenhouse Geisser 18 392 2 993 Huynh Feldt 18 392 2 299 DiaColheita DiaColheita Curva DiaColheita Bode Error DiaColheita Lower bound 18 392 4 598 Quadro 8 19 Teste de compara es m ltiplas para o dia de colheita Pairwise Comparisons Measure MEASURE 1 I DiaColheita J DiaColheita Mean Difference Std Error Sig 95 Confidence Interval for l J ee Difference 326 759 002 Based on estimated marginal means The mean difference is significant at the 05 level b Adjustment for multiple comparisons Least Significant Difference equivalent to no adjustments 108 An lise de vari ncia e testes de compara es m ltiplas re
85. no dos bodes para saltarem na cabra ou no manequim e ejacularem dentro da vagina artificial A recolha por vagina artificial requer por parte do t cnico v rias horas de trabalho e deste modo alguma paci ncia prefer vel come ar na poca reprodutiva Ver o e Outono em ra as sazonais e em animais jovens assim que atingem a puberdade importante que seja sempre a mesma pessoa a realizar o trabalho desde do treino dos animais at a futuras recolhas de s men Do mesmo modo os animais devem iniciar o treino no local onde futuramente ser o efectuadas as recolhas Nos caprinos recorre se por vezes a caixas individuais que permitem a imobiliza o da f mea e consequentemente facilitam o m todo de recolha de s men aquando do salto do macho Baril et al 1993 28 Os manequins mec nicos podem tornar se mais vantajosos do que os vivos na medida em que proporcionam maior estabilidade aquando da recolha e previnem o controlo de doen as entre os animais Evans e Maxwell 1987 Com manequins vivos necess rio garantir que n o ocorram movimentos laterais e para a frente evitando perdas de s men fundamental que no momento da recolha a f mea evidencie algum tipo de comportamento caracter stico de manifesta o de cio As f meas podem ser usadas inteiras recorrendo ao cio natural ou induzido pela aplica o de tratamento hormonal F meas castradas podem ser igualmente utilizadas recorrendo aplica o de tratamento ho
86. ntes curvas de congela o na taxa de mortalidade com ou sem danifica o do acrossoma dos espermatoz ides de s men caprino Os resultados foram muito semelhantes para as 3 curvas tendo as diferen as da ordem dos 2 a 3 n o se revelado estatisticamente significativas Embora o n mero de r plicas 9 parecesse razo vel no in cio do ensaio veio a verificar se uma variabilidade relativamente elevada coeficiente de varia o da ordem dos 14 motivada fundamentalmente pelo efeito significativo do bode e do dia de colheita Por outro lado a detec o de uma acentuada influ ncia quer do animal quer do dia de colheita do s men poder ser um alerta para a necessidade de ser redobrada a aten o a dar a estes dois factores Conjuntamente os resultados do presente trabalho parecem sugerir a aus ncia de qualquer efeito das curvas de congela o testadas sobre a taxa de mortalidade p s descongela o do s men de caprino Considerando que a distin o das curvas de congela o testadas apenas incidiu na segunda rampa de arrefecimento e de uma forma pouco acentuada diferen a de 10 C da temperatura sugere se testar futuramente curvas com diferen as de arrefecimento mais amplas e ou aplicadas a diferentes rampas 88 VII Bibliografia Amann R P 1987 Function of the epididymis in bulls and rams J Reprod Fertil Supll 34 115 Arruda R P Celeghini E C C Alonso M A Carvalho H F Oliveira L Z Nascimen
87. nto Reprodutivo Caprino e Ovino com o uso do efeito Macho Interesp cie P s Gradua o em Zootecnia Universidade Federal do Cear Fortaleza 98 Watson P F 1995 Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post thawing function Reproduction Fertility Development 7 4 871 91 99 VIII ANEXOS Quadro 8 1 An lise de vari ncia relativa aos par metros do s men fresco volume concentra ao e motilidade ANOVA P sum of Squares Between Groups 062 2 Within Groups 627 Total 689 Between Groups 16 131 Concentra o Within Groups 15 214 Total 31 345 Between Groups 312 311 Motilidade Within Groups 402 417 Total 714 727 Quadro 8 2 M dia e Erro Padrao dos espermatozoides vivos com acrossoma intacto e danificado Spz vivos e Acrossoma Intacto Spz vivos e Acrossoma Danificado Bode Spz vivos e Spz vivos e Acrossoma Acrossoma Intacto Danificado 95 0758 4 9241 N 9 9 Std Deviation 7 80262 7 80265 Std Error of Mean 2 60087 2 60088 Mean 97 2211 2 7788 N 10 10 Std Deviation 2 38595 2 38580 Std Error of Mean 75450 75446 Mean 89 9946 10 0055 N 8 8 Std Deviation 12 99390 12 99375 Std Error of Mean 4 59404 4 59398 Mean 94 3648 5 6351 27 27 Std Deviation 8 68042 8 68039 Std Error of Mean 1 67055 1 67054 101 Quadro 8 3 M dia e Erro Padr o dos espermatozoides vivos com acrossoma intacto e danificado Danificado Bode
88. nto na segunda rampa Quadro 3 Quadro 3 Curvas de Congela o com respectivas Rampas e Temperaturas de Arrefecimento Curva Rampa C arrefecimento 1 4 a 5 C 4 C min A 2 5 a 110 C 25 C min 3 110 a 140 C 35 C min 1 4 a 5 C 4 C min B 2 5 a 110 C 35 C min 3 110 a 140 C 45 C min 1 4 a 5 C 4 C min C 2 5 a 110 C 45 C min 3 110 a 140 C 35 C min 73 3 5 An lise Estat stica O ensaio foi delineado segundo um desenho factorial de medi es repetidas 3 curvas de congela o x 3 bodes x 3 dias de colheita de s men Os dados foram assim tratados de acordo com este modelo recorrendo se ANOVA factorial de medi es repetidas considerando se a curva de congela o e o bode como between subjects factors e o dia de colheita como within subjects variable Relativamente compara o das m dias dos par metros do s men avaliados macroscopicamente recorreu se ANOVA simples Sempre que a ANOVA detectava diferen as significativas dentro das vari veis estudadas seguia se um teste de compara es m ltiplas LSD para identificar essas diferen as Todos os valores percentuais foram previamente transformados segundo a f rmula P arcosen VP em que P representa o valor original Contudo nos quadros apresentados ao longo do texto os valores referidos s o sempre os originais 74 IV Resultados 4 1 Avalia o Macrosc
89. o poss vel conservar o s men por um per odo de tempo mais largo sem alterar a capacidade fecundante uma vez que o metabolismo do espermatoz ide p ra a esta temperatura Contudo a falta do azoto l quido mesmo que por poucas horas pode resultar na destrui o completa de um banco de s men Os diluidores para congela o de s men devem ter as mesmas caracter sticas dos utilizados para s men fresco e refrigerado ou seja devem proteger os espermatoz ides das mudan as de pH e toxicidade Al m de conter uma fonte de energia um agente para proteger a c lula do choque t rmico durante o arrefecimento e um agente crioprotector para proteger os espermatoz ides dos danos causados na membrana plasm tica durante a congela o Os diluidores mais utilizados para a criopreserva o de s men t m normalmente como constituintes os seguintes compostos leite desnatado glicose gua bi destilada penicilina G s dica e sulfato de estreptomicina Alguns autores recomendam a gema de ovo por ser rica em fosfol pidos o que protege os espermatoz ides do choque t rmico a temperaturas abaixo dos 0 C No entanto como j foi referido anteriormente os fosfol pidos em contacto com as enzimas do plasma seminal desencadeiam reac es bioqu micas que libertam compostos t xicos para os espermatoz ides Para contrariar este facto alguns autores sugerem a lavagem do s men 63 para remover o plasma seminal Esta lavagem deve ser feita com
90. o Moreira da Silva por todos os ensinamentos amizade conselhos e apoio durante todo o percurso acad mico Aos Servi os de Desenvolvimento Agr rio da Ilha Terceira em especial Eng Mar lia Coelho pelo empenho e dedica o na realiza o deste trabalho bem como ao senhor Manuel Sampaio pelo aux lio prestado com o maneio dos animais Ao Doutor Ant nio Eduardo Nobre Chaveiro pelos ensinamentos e posterior aux lio nas avalia es de s men Ao prof Doutor Eduardo Ferrandini Banchero pelos seus ensinamentos quer a n vel pessoal como profissional amizade e carinho no final deste percurso acad mico Ao Ens Ant nio Pedro Sim es por me permitir realizar a parte experimental g p p p p deste trabalho no hor rio laboral Ao meu colega e amigo Isac Rego pelo carinho amizade e sobretudo paci ncia para aturar os meus picos de stress A todos os outros colegas que me acompanharam desde o in cio do percurso acad mico com a sua amizade e companheirismo nos bons e maus momentos Porque amizade isso mesmo vencer em conjunto os obst culos Bem como na elabora o deste trabalho Aos pais pelos ensinamentos e valores transmitidos bem como o apoio e incentivo ao longo de todo o percurso acad mico A minha irm por nunca duvidar das minhas capacidades e acreditar mais em mim do que eu pr pria pela amizade e ajuda incondicional durante a realiza o deste trabalho E ao meu cunhado por aturar as noitad
91. o de GnRH Os centros hipotal micos produtores de GnRH proporcionam um est mulo prim rio para o in cio da matura o sexual 13 2 4 Espermatog nese O in cio da produ o de espermatoz ides representa apenas o final de um processo complexo e com v rias altera es Estas t m in cio no per odo pr natal quando as c lulas germinativas primordiais migram da crista germinal e permanecem nas gonadas algum tempo antes da diferencia o sexual Os machos enquanto feto e animais jovens t m os gon citos contidos dentro de t bulos semin feros Estes multiplicam se depois do nascimento do animal e originam as espermatog nias A efic cia quantitativa da espermatog nese Fig 2 depende sobretudo da forma como as divis es ocorrem As c lulas origin rias da ltima divis o das espermatog nias s o os espermat citos prim rios os quais por divis o mei tica originam c lulas filhas os espermat citos secund rios 2 4 1 Espermatocitog nese 2 Como referido anteriormente a partir das espermatog nias Fig 2 que se formam os espermatoz ides Estas s o c lulas diploides com 60 cromossomas no bode As espermatog nias consoante a sua morfologia e o seu estado de diferencia o podem dividir se em tr s tipos A interm dio In e B Sousa 2000 As espermatog nias do tipo A por multiplica o mit tica originam duas c lulas filhas sendo uma activa A1 e outra de reserva A0 As espermatog nias de reserva
92. o de ondas o teste mais simples que se efectua para observar a motilidade do s men fresco A avalia o da motilidade pode ser efectuada de duas formas distintas pelas caracter sticas de movimento de onda do s men ou pela percentagem de espermatoz ides progressivamente m veis na amostra A avalia o da percentagem de espermatoz ides progressivamente m veis deve ser feita quando o s men dilu do ou ap s congelamento e descongelamento Maia 2010 2 8 2 1 1 Caracter sticas dos Movimentos das Ondas Quando observado ao microsc pico o s men do bode exibe movimentos ondulat rios que permitem determinar a mobilidade massal Evans e Maxwell 1987 Sousa 2000 A observa o dos movimentos de onda deve ser imediata uma vez que decrescem rapidamente com o passar do tempo Em alguns casos decresce entre 15 a 20 segundos Guerreiro 2002 T cnicos experientes e com boa capacidade de visualiza o conseguem observar no tubo de recolha a olho nu os movimentos de onda no entanto indispens vel a sua observa o precisa ao microsc pio Para observa o microsc pica coloca se uma gota de s men puro numa l mina limpa e aquecida a 37 C sem lamela a uma amplia o baixa 40x ou 100x Para garantir a temperatura da l mina aquando da observa o recomenda se utilizar a platina aquecedora Se o movimento de ondas n o for observada efectuada uma estimativa da motilidade dos espermatoz ides sobre a energia dos movimentos
93. o de um indiv duo Os mensageiros qu micos libertados pelos indiv duos actuam ao n vel de receptores espec ficos desencadeando respostas comportamentais e ou fisiol gicas A diferen a existente entre 20 feromonas e hormonas deve se ao facto de estas ltimas serem libertadas no interior do indiv duo influenciando deste modo o metabolismo do mesmo enquanto que as feromonas s o libertadas para o exterior influenciando outros indiv duos da mesma esp cie Vitaliano 2011 Desta forma as feromonas permitem a comunica o pela aus ncia de sons e sinais visuais mas sim pela exist ncia de odores qu micos que s o libertos no meio exterior pela urina fezes ou por via cut nea As reac es que derivam das feromonas s o divididas em 30 grupos diferentes As mais conhecidas s o o reconhecimento do parceiro sexual e parental tal como a marca o territorial e de caminhos existindo tamb m rea es de agrega o dispers o e organiza o hier rquica dentro da comunidade e de alarme que s o libertas em situa o de perigo Vitaliano 2011 Segundo Kelliher 2007 nos mam feros os qu micos odor feros que chegam cavidade nasal s o detectados por receptores sensoriais localizados no epit lio olfactivo no sistema vomeronasal ou em ambos Este rg o encontra se no interior da cavidade nasal numa c psula cartilaginosa ligada por termina es nervosas ao hipot lamo Vitaliano 2011 Depois de recebido o est mulo pelo
94. oani 70 3 2 2 NOTTE hn a CDE DUR ate RE DEPT eae tian edie e ete Beenie 70 5 2 3 Mobilidade Massal a ASA DA dna 70 3 2 4 Concentra o ES Pella UC As utstara nuas US a DRUG LR aiii 71 3 2 5 Percentagem de Espermatoz ides Vivos no S men Fresco 71 3 2 6 Percentagem de Espermatoz ides Vivos e Integridade do Acrossoma no S men apos DESCONSelAGdO sais inadasb idade anda da E a a da 12 X Dil icaod Semen sed a a E E T A 12 SA C ngelicao da SEMEN sanar dah batia sca a EE ngehednaaasacan a L tone 13 JS An lise Estat istiea gs o a i nde a a i 74 Resultados sal cele ules lok ete nel age eee aE Me Soe a oa aah 75 4 1 Avalia o Macrosc pica do S men eesseeesseessesssesseesssessseessressesseessseessseesseest 75 4 2 Avalia o Microsc pica do S men asas desista renal inn goa aid da ata 76 4 2 1 Avalia o da Motilidade Massal eccesscccesececssececseccecseceecseeceesseeecsseeeesaeees 76 4 2 2 Concentra o do SEMEN quis amassada das tis a R SU GUS 11 4 4 Avalia o por Citometria de Fluxo sessssesesseessesssessseresseeesseessressresseessseesssressrese 78 4 4 1 Determina o da Rela o entre Espermatoz ides Vivos e Mortos 78 4 4 2 Determina o da Integridade do AcroSsOMa c cceeesceceseeeeeeeeeeeeeeecsteeeeeaeees 78 4 5 Semen Fresco vs S men Descongelado caes ccasdesvcadsel sa sdavaaseaeaaaidpecoetansesbaatesstatans 81 V DISCUSS O
95. odo apenas algumas cl nicas especializadas ou institui es de pesquisa adquirem este equipamento Silva et al 2009 Segundo Matos et al 2008 as diferen as estruturais da c lula esperm tica entre as esp cies estudadas s o outros factores que determina limita es na expans o do sistema CASA uma vez que se faz necess rio fornecer ao programa informa es espec ficas de cada c lula esperm tica como tamanho celular por exemplo para a efic cia dos resultados No entanto segundo Silva et al 2009 o interesse por este sistema tem vindo a aumentar devido crescente quantidade de estudos que se t m efectuado desde o ano 1987 na fisiologia esperm tica O registo dos dados quantitativos obtidos pelo sistema CASA permite a detec o de s bitas mudan as na cin tica esperm tica Deste modo poss vel melhorar o uso de novas amostras de criopreserva o refrigera o bem como de s men fresco em rela o aos tratamentos laboratoriais como diluidores crioprotectores entre outros Baseado nisto tem sido sugerido que os procedimentos de congela o e descongela o reduzem a cin tica dos espermatoz ides caprinos mensurados objectivamente por m todos computadorizados Batista e Guerra 2010 57 2 9 Processamento e Conserva o do S men Ap s a recolha e avalia o do s men este pode ser utilizado de tr s formas distintas fresco quer seja puro ou dilu do refrigerado ou congelado Consoante a forma de
96. onstitu do pelo plasma seminal e pelos espermatoz ides variando a sua composi o consoante as esp cies 2 2 1 Plasma Seminal O plasma seminal constitui a parte l quida do s men produzido nos test culos o qual segregado pelas gl ndulas vesiculares epid dimo ductos deferentes pr stata e gl ndulas bulbo uretrais Este fluido isot nico e neutro rico em numerosas subst ncias org nicas e inorg nicas como a fructose cido asc rbico inositol s dio pot ssio c lcio fosfol pidos prostaglandinas e prote nas que servem para proteger e nutrir os espermatoz ides Maia 2010 Para al m destes compostos o plasma seminal constitu do por 75 de gua A fructose o a car mais facilmente metaboliz vel e proporciona a maior fonte de energia que os espermatoz ides recebem Outros compostos facilitam a penetra o dos espermatoz ides nas vias genitais tais como sorbitol inositol cido c trico gliceril fosforilcolina fosfol pidos prostaglandinas em elevada concentra o gt 40u ml Guerreiro 2002 O plasma seminal tem essencialmente tr s fun es tais como transportar os espermatoz ides atrav s do aparelho reprodutor durante a ejacula o Tamb m funciona como activador dos espermatoz ides previamente im veis e proporciona um meio tamponizado e rico em nutrientes garantido a sobreviv ncia dos mesmos depois de depositados no aparelho reprodutor da f mea 10 2 2 2 Espermatoz ides
97. orm tica utilizada para determinar algumas caracter sticas estruturais e funcionais de part culas biol gicas tais como v rios tipos de c lulas protozo rios bact rias etc Esta tecnologia usada para determinar componentes e propriedades de c lulas e organelos celulares que fluem numa suspens o celular O funcionamento do cit metro consiste basicamente em uma fonte de luz um sistema de fluxo celular em componentes pticos para diferenciar e seleccionar as modifica es de luz em elementos electr nicos para amplificar e processar o sinal resultante e em um computador Resumindo constituido por tr s sistemas principais designados por sistema flu dico sistema ptico e sistema electr nico O sistema flu dico consiste na aspira o das c lulas ou part culas de uma suspens o previamente preparada for ando as a passar uma de cada vez 32 sequencialmente por uma c mara especial do ingl s flow cell Assim as part culas ficam envolvidas e centralizadas num fluxo cont nuo de l quido do ingl s sheath fluid sendo interceptadas por um feixe de laser Uma vez interceptadas pela fonte de ilumina o dois tipos de fen menos f sicos ocorrem dispers o da luz e fluoresc ncia fornecendo informa o acerca da c lula O sistema ptico inicia se com uma parte da luz que dispersada do ingl s Scatter de acordo com as caracter sticas morfol gicas e estruturais da c lula A dispers
98. os crioprotectores mais utilizados para proteger a membrana esperm tica nomeadamente nos caprinos As lipoprote nas de baixa densidade da gema do ovo especificamente os fosfol pidos t m sido determinadas como componentes indispens veis preserva o e protec o do espermatoz ide Segundo Watson 1995 a gema do ovo o composto que melhor protege o espermatoz ide do choque t rmico e consequentemente previne que a cauda se dobre e n o afecte a motilidade esperm tica Para al m dos agentes crioprotectores podem ser adicionadas outras subst ncias ao meio de congela o sendo estas i nicas ou n o Estas subst ncias contribuem para manter a osmolaridade e o pH tamp o podendo ainda ser adicionados antibi ticos e enzimas 68 II Material e M todos 3 1 Recolha de S men A recolha de s men foi realizada nos Servi os de Desenvolvimento Agr rio da Ilha Terceira SDAT sendo utilizados 3 bodes 2 de ra a Saanen e 1 de ra a Alpina com mais de 2 anos de idade As recolhas 3 por cada animal foram efectuadas durante o m s de Fevereiro de 2012 em 3 sess es espa adas de aproximadamente 5 dias seguindo o desenho factorial de medi es repetidas O espa amento entre sess es de recolha teve como objectivo garantir o normal restabelecimento da produ o esperm tica A colheita do s men foi obtida com vagina artificial ap s os bodes terem sido treinados durante cerca de 3 semanas utilizando uma f mea co
99. p cie Cada associa o tem tipos distintos de c lulas germinativas em v rios estados determinados basicamente por diferen as morfol gicas 17 Testiculo em corte Canal deferente C lulas imersticias Test culo Bolsa escrotal Espermatog nia Esperm tide Espermat cito Espermat cito lt Espermatoz ide T bulo seminifero Corte esquem tico de t bulo seminifero Figura 3 Ciclo Espermatog nico Adaptado http embriologiaufpe blogspot pt 2010 09 espermatogenese testiculo html A dura o de um ciclo semin fero o tempo que decorre entre o aparecimento sucessivo da mesma associa o celular H uma rela o entre a dura o do ciclo espermatog nico e a espermatog nese isto a espermatog nese tem aproximadamente quatro vezes a dura o do ciclo espermatog nico o que provoca associa es caracter sticas de c lulas dentro de uma rea de clonagem dos tubos semin feros Cada espermatog nia substitui a c lula m e e divide se em intervalos de tempo caracter sticos de cada esp cie Pressup e se que esse intervalo no bode seja de 10 dias Gonz lez 2002 O ciclo completo da espermatog nese come ando na primeira divis o espermatogonial e terminando na liberta o dos espermatoz ides no l men do tubo semin fero tem a dura o de 49 dias Baril et al 1993 18 2 5 Comportamento Sexual do Macho O comportamento sexual o conjunto de atitudes e iniciativas
100. pica do S men A primeira avalia o foi efectuada visualmente imediatamente ap s as recolhas de s men no tubo de recolha tendo sido avaliados a cor a consist ncia e o volume Posteriormente procedeu se observa o microsc pica no laborat rio onde se avaliou a motibilidade massal sendo classificada de acordo com Quadro 2 Pela observa o directa foi poss vel perceber que o s men do bode O ra a Saanen deveria ser eliminado do ensaio dada a sua cor e consist ncia mas de modo a comprovar a qualidade do mesmo procedeu se observa o microsc pica da motilidade massal O s men apresentava uma cor amarelada intensa e uma consist ncia bastante aquosa o que segundo o Quadro 1 foi classificado com O valores numa escala de O a 5 Quanto motilidade tamb m foi atribu da a mesma classifica o dada a percentagem muito reduzida de espermatoz ides vivos em 50 das recolhas de s men 5 spz vivos Contudo de salientar que a motilidade foi aumentando gradualmente com as colheitas tendo sido atribu da uma classifica o de 2 valores a uma amostra que tinha 20 spz vivos apesar de n o apresentarem movimentos de onda e outra com 3 valores uma vez que a amostra apresentava movimentos de onda de baixa amplitude e movimento lento Os restantes tr s animais dadores foram selecionados para proceder congela o de s men dado que as suas caracter sticas seminais obtiveram uma classifica o normal Quanto colora
101. r esperm tico com um aumento de patologias no acrossoma dos espermatoz ides em diferentes diluidores o que n o se 83 verificou com as amostras que n o foram centrifugadas Souza et al 2008 tamb m verificaram que a percentagem de patologias no acrossoma aumentou logo ap s a centrifuga o No s men fresco procedeu se avalia o de par metros como a motilidade de modo a selecionar os machos dadores O animal com melhores resultados para a motilidade e menor volume de plasma seminal foi o bode 2 o que se traduziu numa maior percentagem de espermatoz ides vivos com acrossoma intacto ap s a descongela o Este facto est de acordo com os resultados obtidos por Betini et al 1998 o qual descreve que possivelmente os espermatoz ides se sedimentam na extremidade inferior das palhinhas durante o processo de congela o na vertical Este processo promove a separa o do s men do meio diluidor reduzindo os efeitos t xicos das fosfolipases sobre as c lulas esperm ticas al m de uma menor altera o osm tica causando menores les es sobre a membrana esperm tica Correa et al 1996 A redu o do volume seminal indica nos uma menor secre o das gl ndulas acess rias que se traduz na aus ncia ou diminui o de alguns constituintes como prote nas do plasma seminal Santos e Simpl cio 2000 Souza et al 2008 descreveram que estas revestem o espermatoz ide sendo consideradas como factores de capacita o
102. r utilizadas v rias amostras de s men de diferentes concentra es A precis o do color metro deve ser verificada ao longo do tempo atrav s de compara es com as contagens do hemocit metro O s men dilu do 100x com uma solu o salina de 0 9 possibilita uma leitura na gama mais sens vel do color metro 2 8 2 3 Morfologia dos Espermatoz ides O exame morfol gico dos espermatoz ides um teste detalhado que nos permite avaliar a qualidade do s men Os ejaculados apresentam alguns espermatoz ides anormais normalmente 5 a 10 Evans e Maxwell 1987 Maia 2010 As amostras com elevada percentagem de espermatoz ides anormais ou seja com valores superiores a 20 25 traduzem uma taxa de fertilidade baixa Evans e Maxwell 1987 Maia 2010 A percentagem de espermatoz ides anormais varia em fun o da poca do ano da temperatura ambiental idade nutri o doen a e qualquer factor causador de stress Durante a rotina de processamento de s men n o realizada a avalia o morfol gica de cada ejaculado devido ao tempo necess rio para execut la Maia 2010 Normalmente esta avalia o feita durante o exame androl gico para selec o de dadores e repetida mensalmente O m todo mais utilizado para avalia o da morfologia esperm tica microscopia de contraste fase e microscopia de campo claro em amostras submetidas colora o 46 2 8 2 3 1 Percentagem de Espermatoz ides Vivos e Anomalias Morfol
103. reenhouse Geisser 3 594 925 Huynh Feldt 3 594 898 Lower bound 3 594 1 797 Sphericity Assumed 201 106 50 277 Greenhouse Geisser 201 106 51 734 Huynh Feldt 201 106 50 277 Lower bound 201 106 100 553 Sphericity Assumed 36 202 4 525 Greenhouse Geisser 36 202 4 656 Huynh Feldt 36 202 3 4 525 Lower bound 36 202 9 051 DiaColheita Curva DiaColheita Bode Error DiaColheita Quadro 8 27 Teste de compara es m ltiplas para o dia de colheita Pairwise Comparisons Measure MEASURE 1 I DiaColheita J DiaColheita Mean Difference Std Error Sig 95 Confidence Interval for l J Difference Upper Bound Based on estimated marginal means The mean difference is significant at the 05 level b Adjustment for multiple comparisons Least Significant Difference equivalent to no adjustments 112 An lise de vari ncia e testes de compara es m ltiplas relativa percentagem de spz mortos e com acrossoma danificado Quadro 8 28 ANOVA de factores independentes Tests of Between Subjecis Effects Measure MEASURE 1 Transformed Variable Average Squares 89428 672 89428 672 15237 973 9 126 4 563 777 1109 990 554 995 94 567 23 475 5 869 Quadro 8 29 Teste de compara es m ltiplas para os bodes Pairwise Comparisons Measure MEASURE 1 I Bode J Bode Mean Std Error 95 Confidence Interval for Difference l J Difference Upper Bound Based on estimated marginal mean
104. refere que este reflexo tamb m pode ser desencadeado quando o macho cheira a pr pria urina ou a urina de outros machos Segundo Sousa 2000 funcionalmente o Flehmen parece estar relacionado com o transporte de subst ncias vol teis quimio sensoriais da cavidade oral para o rg o vomeronasal As aproxima es ritualizadas do macho s o caracterizadas por v rios movimentos volta da f mea acompanhados de pequenos toques com as patas dianteiras e com a cabe a principalmente nos quartos traseiros das f meas e pela vocaliza o exteriorizando e retraindo a l ngua v rias vezes seguidas Sousa 2000 Vitaliano 2011 Se o macho reconhece a falta de ind cios de feromonas troca de f mea O bode tamb m bate e raspa os cascos no ch o evidenciando a sua masculinidade Todo este conjunto de movimentos permite ao macho identificar se a f mea est em cio desencadeando a reac o de encabritamento Ap s o cortejamento o macho alinha se com a f mea seguindo se o salto O tempo de reac o desde o primeiro contacto com a f mea ate c pula muito curto menos do que cinco minutos podendo ocorrer durante esse tempo falsos saltos por parte dos machos Caso o macho detecte que uma f mea se encontra na fase de proestro faz v rias tentativas de monta ficando o p nis parcialmente erecto No entanto estas montas geralmente n o se realizam Mas se a f mea se encontrar em cio a c pula ocorre em segundos dependendo da receptividade
105. resentam entre 2 5 a 4 cm de comprimento 2 a 2 5 cm de largura e 1 a 1 5 cm de espessura Leite Browning 2009 A pr stata uma gl ndula nica localizada em torno e ao longo da uretra e que elimina as suas secre es atrav s de v rios ductos existentes na uretra contribuindo para o volume de s men em todas as esp cies Sousa 2000 Leite Browning 2009 Apesar de pouco abundante a secre o da pr stata rica em amino cidos e enzimas que contribuem para aumentar a mobilidade dos espermatoz ides Sousa 2000 As secre es da pr stata tamb m s o ricas em i es inorg nicos com s dio cloro c lcio e magn sio Leite Browning 2009 Esta gl ndula composta por duas partes a pars disseminata composta por elementos glandulares ao longo da uretra e o corpo situado atr s da entrada do ducto deferente Os pequenos ruminantes apenas apresentam a pars disseminata sendo a gl ndula bilobulada e situada na zona dorsal da uretra Nestes animais a pr stata mede entre 3 5 a 4 cm de comprimento e 1 a 1 5 cm de largura As gl ndulas bulbouretrais ou de Cowper s o em n mero de duas e encontram se na uretra junto sa da da p lvis Leite Browning 2009 Estas gl ndulas s o pequenas esf ricas compactas e envolvidas pelo m sculo uretral Sousa 2000 Na zona proximal o m sculo esponjoso pelo que n o pode ser visualizado por via rectal Cada gl ndula tem um ducto que desemboca na parede dorsal da uretra Nos pequeno
106. rma to SENESE accscesccssaceswecacetsagensvadpuoadeesadeacdansaveasisygeadeadnadcoeasesuaacaayenadeusagendenteass 14 2 4 1 ESPETMALGCIIO SNES Ss utentes sascadanasuhcedsadguea eani e AEE EE EE aa 14 2 4 2 Espermio g nese ix is ssecbaisscceasladeassvavnsalensigveisadevsacese ANES EE ETA EER dente 16 24 3 Ciclo Espermatos nicO sissisota 17 2 5 Comportamento Sexual do Macho si san eae a aie eh 19 2 5 1 Factores que afectam o Comportamento Sexual dos Machos 24 DOA OMA GAC preen da as cons afiado E Dad Digo Lada ca nas Sae ada CA geleia ga o 25 2 1 Recolha de S men em Capriho Sse sys rei a a e sneer 26 2 1 1 Recolha por Blectr e acwlaCaayass cscs a iaga sides dar asas Degas aed ae dada oar 27 2 7 2 Recolha por Vagina Artificial qua ache ype sian dama ee eae 28 2 7 2 1 Prepara o da Vagina Artificial sinned pled eds Gece fe 29 2 7 2 2 T cnica de recolha com Vagina Artificial eeeeccecsseeeceseceeeteceesteeeeeees 31 2 7 3 Selec o dos Machos Dadores de Semen assassins pias ipa aiii ana de nnaTa nas a 32 2 7 4 Prepara o dos Machos Dadores de S men s 33 2 7 5 Treino dos Machos Dadores de S men rea 34 2 8 Avalia o do SCE square penis gp asa reta e a EEEE E a E es asas pas 36 2 8 1 Avalia o Macrosc pica cus tects aguiar io aan ieRa das aaa RGE Saens anna 37 2 8 1 1 Cor Cheiro e Aspecto do SEM cts em lenssesayhcssivesicesadevctes
107. rmonal para induzir o comportamento de cio O comportamento de estro consegue se com 3 2 ou apenas 1 injec o por semana de 100ug de benzoato de estradiol Baril et al 1993 A vagina artificial uma imita o da vagina da f mea apresentando as condi es necess rias manuten o da erec o e consequente ejacula o ou seja simula o das condi es t rmicas e estimula o mec nica press o da vagina natural Muniz 2003 Maia 2010 As vaginas artificiais s o semelhantes variando apenas no comprimento e di metro em fun o da esp cie alvo A vagina de caprinos deve compreender as seguintes medidas 15cm x 5 5cm Devem ser feitas de borracha forte pl stico ou outro material sint tico com boas propriedades de isolamento e revestimento interior Evans e Maxwell 1987 2 7 2 1 Prepara o da Vagina Artificial Antes de se iniciar o processo de recolha o t cnico deve verificar se o material foi devidamente limpo na ltima utiliza o A vagina deve ser totalmente desmontada para que se possa desinfectar cada uma das pe as da mesma separadamente Este 29 processo deve ser efectuado depois de cada utiliza o lavando e enxaguando com gua destilada fundamental que a vagina artificial se encontre devidamente montada para garantir a press o e temperatura adequadas Na montagem da vagina artificial a manga de borracha deve ser sempre maior que o tubo cil ndrico rijo de modo a garantir que quando colocada
108. rteel J M e Leboeuf B 1990 Evolution technico conomique de ins mination artificielle caprine Elevage amp Ins mination 237 3 17 Dantas V M 2009 Efeito da Sazonalidade nas Caracter sticas Reprodutivas de Bodes e Carneiros Semin rio de P s Gradua o em Ci ncia Animal Universidade Federal de Mato Grosso do Sul Faculdade de Medicina Veterin ria e Zootecnia Campo Grande Daskin A e Tekin N 1996 The effect of egg yolk on the quality of frozen Angora buck semen Turk Veterinerlik ve Hayvancilik Dergisi 20 5 395 398 91 Delgadillo J A Chemineau P 1992 Abolition of the seasonal release of luteinizing hormone and testosterone in Alpine male goats Capra hircus by short photoperiodic cycles Journal of Reproduction and Fertility 94 45 55 Evans G e Maxwell W M C 1987 Salamon s Artificial Insemination of Sheep and Goats 1 Edition Butterworths Pty Limited Austr lia Evenson D P Darzynkiewicz Z Melamed M R 1980 Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility Science 210 1131 1133 Ferrari S Leinz F Barnab V H 1998 Insemina o artificial em cabras com s men congelado nota pr via Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science 35 5 223 4 Filho W C M 2006 Espermatog nese em bovinos Semin rio Reprodu o Animal Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina Veterin ria e Zootecnia Garner D L
109. s The mean difference is significant at the 05 level b Adjustment for multiple comparisons Least Significant Difference equivalent to no adjustments 113 Quadro 8 30 ANOVA para dia de colheita Tests of Within Subjects Effects Measure MEASURE 1 Squares Sphericity Assumed 339 086 169 543 Greenhouse Geisser 339 086 243 958 Huynh Feldt 339 086 i 169 543 Lower bound 339 086 339 086 Sphericity Assumed 55 046 13 761 Greenhouse Geisser 55 046 19 802 Huynh Feldt 55 046 j 13 761 Lower bound 55 046 27 523 Sphericity Assumed 420 020 105 005 Greenhouse Geisser 420 020 5 151 093 Huynh Feldt 420 020 105 005 Lower bound 420 020 i 210 010 Sphericity Assumed 24 080 3 010 Greenhouse Geisser 24 080 4 331 Huynh Feldt 24 080 3 010 Lower bound 24 080 6 020 DiaColheita DiaColheita Curva DiaColheita Bode Error DiaColheita Quadro 8 31 Teste de compara es m ltiplas para o dia de colheita Pairwise Comparisons Measure MEASURE 1 I DiaColheita J DiaColheita Mean Difference Std Error Sig 95 Confidence Interval for l J In Difference 816 902 003 Based on estimated marginal means The mean difference is significant at the 05 level b Adjustment for multiple comparisons Least Significant Difference equivalent to no adjustments 114 115
110. s membrane integrity in mammalian spermatozoa Journal of Reproduction and Fertility 88 343 352 Karsch F J 1984 Endocrine and environmental control of oestrous cyclicity in sheep Reproduction in sheep Lindsay amp Pearce Australian Academy of Science 10 5 Kelliher K 2007 The Combined Role of the Main Olbhgbhgbhgfactory and Vomeronasal Systems in Social Communication in Mammals Hormones Behavior 52 561 570 Leite Browning M L 2009 Extension Animal Scientist Alabama A amp M University Artigo disponivel em www aces edu urban Pesquisado em 30 de Abril de 2012 Maia M S 2010 Tecnologia do S men e Insemina o Artificial em Caprinos e Ovinos Governo do Estado do Rio Grande do Norte 13 Mascarenhas R e Sim es J 2005 Insemina o artificial em caprinos de ra as aut ctones Ancabra 7 11 14 Matos D I Ara jo A A Roberto L G Toniolli R 2008 An lise computadorizada de espermatoz ides revis o de literatura Revista Brasileira de Reprodu o Animal 32 225 232 94 Meijer J C e Vlissigen J M F 1993 Gross structure and development of reproductive organs Reproduction in Domesticated Animals Elsevier 9 54 Muniz A P 2003 Insemina o Artificial em Caprinos Monografia para obten o do titulo de Bacharel em Veterin ria Universidade Paulista Faculdade de Medicina Veterin ria S o Paulo O Brien P H 1982 Flrhmen Its occurrence and possible func
111. s ruminantes as gl ndulas de Cowper medem 1cm de di metro sendo no bode apenas tubular 2 1 3 P nis O p nis o rg o copulador do macho ou seja permite com que os espermatoz ides sejam depositados no interior do aparelho genital feminino constitu do pela uretra pelo corpo espongiforme que envolve a uretra e pelo corpo cavernoso Ashdow e Hafez 1993 Nos caprinos como nos bovinos o tecido cavernoso apesar de existente muito pouco desenvolvido sendo o aumento de volume do p nis proporcionado pela distens o do S peniano O p nis do bode revestido por tecido fibroso com veias pouco desenvolvidas que lhe conferem rigidez inclusive na fase quiescente Sousa 2000 Apresenta um prolongamento vermiforme que lhe permite distribuir de forma mais homog nea e eficaz o s men no tracto genital feminino Tamb m enervado por fibras sensoriais particularmente na glande onde se encontra o ap ndice vermiforme com 3 a 4 cm de comprimento Ribeiro 1997 Este ap ndice tamb m designado por filiforme e a continua o da uretra A extremidade do p nis encontra se alojada numa invagina o de pele designada por prep cio O prep cio tem como fun o recobrir e proteger a glande do p nis Tamb m tem gl ndulas tubulares que segregam uma subst ncia gorda que facilita a penetra o do p nis no tracto reprodutor feminino aquando da c pula Sousa 2000 2 2 S men e Caracteristicas Seminais O s men c
112. so para determinar a concentra o se efectuado com rigor O principio desta medi o a contagem do n mero exacto de c lulas esperm ticas presentes num determinado volume de uma solu o de dilui o conhecida A maioria dos hemocit metros composta por duas grelhas Cada uma dividida em 16 quadrados maiores que se subdividem em outros 16 quadrados mais pequenos Fig 6 com uma rea de 1 400 mm A altura dist ncia entre a l mina e a lamela tem um valor constante de 1 10 mm e o volume de 1 4000 mm em cada quadrado pequeno Baril et al 1993 43 Figura 6 Grelha de Contagem do Hemocit metro Adaptado http www protocolosbiomed com br page 19 html Para se proceder avalia o do s men este deve ser dilu do numa solu o espermicida por exemplo uma solu o salina a 3 ou em soro fisiol gico formilado Sousa 2000 A dilui o para ser precisa deve conter 0 01 ml de s men puro misturado em 4 ml de solu o formilada salina 0 9 de cloreto de s dio e 0 1 de formalde do em gua destilada para homogeneizar a solu o A prepara o da c mara de Neubauer deve ser efectuada com o aux lio de uma pipeta Para fixar melhor a lamela l mina deve colocar se uma gota de gua em cada uma das laterais da lamela A pipeta tamb m serve para colocar uma gota do s men dilu do sem bolhas de ar no bordo do hemocit metro entre a l mina e a lamela Assim a gota espalhar se por capilaridade
113. ssamento das amostras Para se proceder leitura da amostra no cit metro fundamental que esta seja uma suspens o Algumas amostras necessitam de uma desagrega o mais ou menos intensa por meio de tratamentos mec nicos e enzim ticos Tamb m se deve ter em conta que a temperatura e o armazenamento podem ter efeito sobre a viabilidade celular alterando desta forma as popula es celulares 2 8 2 4 1 3 Compostos Fluorescentes mais utilizados para a Citometria de Fluxo A utiliza o de sondas fluorescentes tamb m designadas de fluorocromos na citometria de fluxo fundamental para o desenvolvimento desta t cnica As sondas fluorescentes s o um m todo muito sens vel para obter informa o acerca da estrutura fun o e viabilidade das part culas que se deseja analisar por citometria de fluxo importante n o esquecer que quando se utiliza mais do que uma sonda fluorescente estas devem ter espectros de emiss o diferentes para que se possam quantificar de forma separada No entanto h situa es em que os fluorocromos t m espectros de emiss es que se sobrep em obtendo se por isso resultados amb guos Por esta raz o os cit metros possuem um sistema inform tico de compensa o ou subtrac o de sinal No entanto dif cil predizer teoricamente o grau de compensa o devendo este ser ajustado individualmente Os compostos fluorescentes podem marcar os componentes estruturais e funcionais de interesse de d
114. ssoma danificado foi mais elevada P 0 003 como se pode comprovar no Quadro 5 79 Quadro 5 M dia e Erro Padr o das percentagens dos spz vivos com acrossoma intacto spz VAI vivos com acrossoma danificado spz VAD mortos com acrossoma intacto spz MAI e mortos com acrossoma danificado spz MAD Curva spz VAI spz VAD spz MAI spz MAD A 19 14 0 86 0 44 0 04 11 644 0 63 68 78 1 39 B 17 72 0 86 0 38 0 04 11 36 0 63 70 54 1 39 C 18 18 0 86 0 49 0 04 10 3740 63 70 96 1 39 Bode I 10 91 0 86 0 55 0 04 5 64 40 63 82 84 1 39 2 23 10 0 86 0 31 0 04 13 57 0 63 63 01 1 39 3 20 96 40 86 045 004 14 16 0 63 64 43 1 39 Dia Colheita 1 25 33 40 66 0 33 0 03 1102 0 87 63 31 1 13 2 18 40 0 66 0 40 0 03 9 12 0 43 72 09 0 64 3 11 31 0 91 0 59 0 08 13 23 0 82 74 87 1 39 80 4 5 S men Fresco vs S men Descongelado Ap s a obten o dos dados para a viabilidade do s men em fresco e descongelado procedeu se compara o do mesmo tendo em considera o as percentagens de espermatoz ides vivos e mortos como se pode observar no Quadro 6 O animal que apresentou maior percentagem de espermatoz ides vivos no s men fresco foi o bode 3 42 39 8 54 spz vivos No entanto ap s descongela o o s men que obteve melhores resultados foi o bode 2 23 42 2 14 spz vivos Deste modo o s men que teve maior percentagem de espermato
115. t cnicas para avaliar os mesmos atributos esperm ticos por sistemas automatizados de alta tecnologia O sistema CASA Computer Assisted Semen Analysis foi desenvolvido a meados dos anos 80 e proposto como uma ferramenta que poderia substituir a avalia o subjetiva e aperfei oar a rotina laboratorial Isto por ser um m todo mais preciso e r pido relativamente concentra o morfologia e qualidade do movimento das c lulas esperm ticas Silva et al 2009 Este tipo de sistema tem a capacidade de produzir informa o acerca da cin tica esperm tica com a utiliza o de campos de v deo contendo imagens de espermatoz ides electronicamente digitalizados bem como a determina o da posi o central de cada cabe a esperm tica Os par metros fornecidos por este equipamento s o motilidade total MT motilidade progressiva MP linearidade LIN retilinearidade STR e ndice de oscila o ou wobble WOB expressos em percentual velocidade curvilinear VCL velocidade em linha recta VSL e velocidade m dia do percurso VAP expressos em um s frequ ncia de batimento flagelar cruzado BCF expresso em Hertz amplitude do deslocamento 56 lateral da cabe a do espermatoz ide ALH expresso em micr metros Silva et al 2009 Batista e Guerra 2010 Apesar da quantidade de informa o que este m todo nos transmite n o facil maximizar a sua utiliza o dado o elevado custo de aquis o do equipamentos Deste m
116. ta 2010 Deste modo muitas sondas fluorescentes t m sido utilizadas isoladamente ou em combina o para analisar a integridade e a viabilidade esperm tica com o aux lio da microscopia fluorescente Batista 2010 No entanto a an lise microsc pica apenas quantifica um pequeno n mero de espermatoz ides dentro de uma determinada popula o de c lulas Esta t cnica associada citometria de fluxo permite que as sondas fluorescentes efectuem uma medi o mais r pida aos atributos espermaticos em larga escala Batista 2010 A avalia o de s men por microscopia de luz convencional tem sido cada vez mais substitu da pelos sistemas de an lises computadorizadas Estes sistemas permitem obter informa o mais detalhada sobre v rias caracter sticas da motilidade e da morfometria Recentemente t m sido introduzidos testes para avaliar o grau pelo qual os espermatoz ides sofrem stress oxidativo Batista 2010 Segundo Harrison e Vickers 1990 adapta es s t cnicas de colora o com sondas fluorescentes facilitam a visualiza o dos espermatoz ides em microsc pio de epifluoresc ncia e o aumento da aplicabilidade da t cnica a partir da adi o de concentra es baixas de formalde do para imobiliza o dos espermatoz ides durante a avalia o 50 2 8 2 4 1 Citometria de Fluxo A citometria de fluxo permite a observa o de determinadas caracter sticas das c lulas por um sistema de fluxo permitindo a an l
117. te 10 ul da solu o anterior no centro e bordo da lamela de modo a permitir a descida por capilaridade Depois deixou se repousar a placa para que ocorresse a sedimenta o dos espermatoz ides no fundo da l mina Por fim colocou se o hemocit metro cuidadosamente no microsc pio e visualizou se numa amplia o de 400x A contagem foi efectuada diagonalmente nos 5 quadrados maiores 3 2 5 Percentagem de Espermatoz ides Vivos no S men Fresco Antes da congela o do s men e ap s o processo de dilui o para enchimento das palhinhas procedeu se contagem dos espermatoz ides vivos por citometria de fluxo Para isso preparou se uma solu o com 20 ul de s men e 160 ul de PBS da qual se retirou 5 ul 50x 10 spz ml e se adicionou 495 ul de solu o para o cit metro Esta ltima solu o foi preparada com 4 ml de PBS e dois marcadores fluorescentes sendo estes o PI e o SYBR 14 com 10 e 4 ul respectivamente De seguida colocou se a solu o 15 minutos no escuro e posteriormente no cit metro para avalia o 71 3 2 6 Percentagem de Espermatoz ides Vivos e Integridade do Acrossoma no S men ap s Descongela o Para determinar a percentagem de espermatoz ides vivos e com o acrossoma intacto foi utilizado novamente o cit metro Primeiramente descongelou se as palhinhas uma por cada amostra em banho maria a 37 C durante 30 segundos De seguida colocaram se na estufa a 37 C tr s tubos devidamente identificados
118. tege lo das les es causadas na membrana plasm tica durante a congela o e descongela o e controlar a prolifera o microbiana Ou seja criar um ambiente que garanta que o espermatoz ide n o sofre altera es e deste modo promova uma boa taxa de fertilidade ap s a insemina o Maia 2010 Os meios mais utilizados para efectuar a dilui o do s men caprino s o de dois tipos sint ticos ou naturais Os diluentes sint ticos mais utilizados para dilui o de s men de bode para insemina o vaginal ou cervical cont m como tamp o o tris ou o citrato a glucose ou a fructose como fonte de energia e a gema do ovo para proteger a membrana dos espermatoz ides contra o frio No entanto para os caprinos os diluidores devem apresentar uma percentagem de gema de ovo mais baixa de modo a garantir que n o ocorra nenhuma reac o enzim tica Isto porque o plasma seminal do bode cont m uma enzima que coagula com a gema do ovo Nesta esp cie existem enzimas no plasma seminal que actuam sobre os fosfol pidos do diluidor formando reac es bioqu micas que libertam compostos t xicos para os espermatoz ides Baril et al 1993 A concentra o desta enzima varia consoante o macho sendo mais elevado no s men que se obt m por electroejacula o O diluidor natural de mais f cil utiliza o sobretudo em condi es de campo s men fresco o leite de vaca que pode ser utilizado inteiro desnatado ou em p devendo a quan
119. tem uma dura o m dia de 1 1 5 horas per odo durante o qual a descida da temperatura deve ocorrer de forma gradual fundamental que a descida de temperatura entre os 18 e os 5 C ocorra lenta e progressivamente porque caso contr rio ocorrem choques t rmicos aos quais os espermatoz ides s o altamente sens veis Depois de atingidos os 5 C fundamental que se mantenha esta temperatura durante o armazenamento e transporte dos espermatoz ides Segundo Traldi 1994 o s men deve ser transportado numa garrafa t rmica cheia de gelo com as palhinhas envolvidas em algod o para evitar o contacto directo com o gelo A insemina o com s men refrigerado deve ter uma dilui o de nove partes de diluidor para uma de s men isto para 13 5 ml de diluidor deve adicionar se 1 5 ml de s men Esta seria a quantidade adequada para inseminar 30 f meas com uma dose de 0 5 ml de s men 62 A escolha do diluidor fundamental para a preserva o dos espermatoz ides n o podendo ser t xico de baixo custo prepara o f cil e com pH e press o osm tica compat vel com a sua sobreviv ncia Segundo Traldi 1994 o s men fresco e refrigerado apresenta maior fertilidade quando a insemina o transperitoneal Por fim a dose de s men deve ser aquecida a 37 C durante 10 segundos antes da sua aplica o 2 9 1 4 2 S men Congelado 2 A conserva o do s men congelado efectuada a 196 C em azoto l quido Deste mod
120. tidade de gema de ovo ser limitada Baril et al 1993 Guerreiro 2002 O diluidor deve ser reconstitu do sempre que se efectue insemina o artificial O leite UHT tamb m pode ser utilizado e apresenta propriedades que permitem uma melhor conserva o do s men 59 2 9 1 2 M todo de Dilui o A dilui o do s men deve ser feita o mais r pido poss vel O diluidor e o s men devem ser colocados no banho maria a 30 33 C devendo permanecer a esta temperatura na altura da dilui o Maia 2010 O diluidor deve ser colocado antes do s men porque a adi o do diluidor mais frio que o s men pode provocar choques t rmicos que se traduzem numa redu o da fertilidade A adi o do diluidor deve tamb m ser sempre efectuada lentamente sobre o s men de modo a garantir que os espermatoz ides n o sofrem altera es e consequentemente diminuem a sua motilidade Depois de adicionado o diluidor ao s men procede se sua agita o de modo a homogeneizar a solu o e observa se ao microsc pio para comprovar o grau de motilidade dos espermatoz ides Evans e Maxwell 1987 2 9 1 3 Volume de S men e N mero de Espermatoz ides utilizados para Insemina o Artificial Um grande n mero de insemina es artificiais praticadas no mundo em particular na esp cie ovina na europa central e de leste s o realizadas com s men n o dilu do nos minutos que se seguem recolha do mesmo Baril et al 1993 Este m todo tem
121. tions in feral goats Animal Behaviour 30 1015 1019 O Donnel L Robertson K M Jones M E Simpson E R 2001 Estrogen and spermatogenesis Endocrine Reviews 22 3 289 318 Oettl E E 1986 Changes in acrossome morphology during cooling and freezing of dog semen Animal Reproduction Science 12 145 150 Oliveira M E F 2009 Ovinos Comportamento Sexual de Machos e F meas Revista InteRural 24 3 62 Pati o S R G 2002 Comportament Sexual Mascul In ndice Etologia Catal Documento dispon vel em http canal h net webs sgonzalez002 Etologia indice htm Pesquisado em 5 de Maio de 2012 Ponsart C Gerard O Caplin S 2004 Insemination history and state of the art in animals Gynecol Obstet Fertil 32 880 886 95 Quitret E 1980 La ch vre Guide de l eleveur Editora La Maison Rustique Paris Ribeiro S D A 1997 Caprinicultura Cria o Racional de Caprinos Editora Nobel Sao Paulo Livro dispon vel em http books google pt books id gssTh9pKbMEC amp printsec frontcover amp dq inauthor 22Silvio Doria de Almeida Ribeiro 22 amp hl pt PT amp sa X amp ei FVBKUc 4CKWP7Aan3ICgDw amp ved 0CDAQuwUwAA v onepage amp q amp f false Pesquisado em 19 de Junho de 2012 Rovay H 2006 Efeito de diferentes curvas de resfriamento tempos de equilibrio e crioprotectores perme veis no congelamento de espermatoz ides de caprinos Disserta o de p s gradua o
122. to J Silva D F Affonso F J Lemes K M Jaimes J D 2011 M todos de avalia o da morfologia e fun o esperm tica momento atual e desafios futuros Revista Brasileira de Reprodu o Animal 35 2 145 151 Ashdow R R e Hafez E S E 1993 Anatomy of male reproduction Reproduction in farm animals ed E S E Hafez 6th Edn Philadelphia PA Lea amp Febiger 3 19 Atessahin A Bucak M N Tuncer P B e Kizil M 2008 Effects of anti oxidant additives on microscopic and oxidative parameters of Angora goat semen following the freeze thawing process Small Ruminant Research 77 38 44 Azer do G A Esper C R Resende K T 2001 Evaluation of plasma membrane integrity of frozentawed goat spermatozoa with or without seminal plasma Small Ruminant Research 41 257 263 89 Bag S Joshi A Naqvi S M K Rawat P S Mittal J P 2002 Effect of freezing temperature at which straws were plunged into liquid nitrogen on the post thaw motility and acrosomal status of ram spermatozoa Animal Reproduction Science 72 175 183 Barbas J P Baptista C C Horta A E M 2006 Compara o entre dois m todos de congela o de s men de carneiros Merino Regional e Serra da Estrela ao longo do ano Departamento de Reprodu o Animal Esta o Zoot cnica Nacional Revista Portuguesa de Ci ncias Veterin rias 100 61 70 Baril G Chemineau P Cognie Y Gu rin Y Leboeuf B Orgeur P Val
123. toz ides por mililitro STR Retilinearidade SYBR 14 Corante supravital UHT Ultrapasteuriza o UI Unidades Internacionais VAP Velocidade m dia do percurso XIX VCL Velocidade curvilinear VSL Velocidade em linha recta V V Volume por volume WOB ndice de oscila o C Graus Celsius C min Graus Celsius por minuto spz MAD Percentagem espermatoz ides mortos com o acrossoma danificado spz MAI Percentagem espermatoz ides mortos com o acrossoma intacto spz VAD Percentagem espermatoz ides vivos com o acrossoma danificado spz VAI Percentagem espermatoz ides vivos com o acrossoma intacto ug Micrograma um Micr metro um s Micr metro por segundo XX I Introdu o Nos ltimos anos tem se verificado um aumento significativo do efectivo de caprinos a n vel mundial devido ao seu acrescido valor econ mico e dos subprodutos que dai adv m Contudo apenas agora come a a ser not rio o seu crescimento nos A ores o qual tem interesse econ mico para a regi o Neste contexto surge a necessidade de recorrer a t cnicas de melhoramento gen tico nomeadamente a insemina o artificial de acordo com os objectivos de cada produtor A aplica o das biotecnologias reprodutivas repercute se directamente no n mero de animais de elevada qualidade na explora o principalmente pela utiliza o de insemina o artificial e de transfer ncia de embri es A aplica o destas t
124. treinados para as recolhas de s men podem ser utilizados em recolhas mais espa adas no tempo uma vez que reaprendem facilmente a ejacular na vagina artificial Evans e Maxwell 1987 34 O treino consiste em desenvolver um efeito de reflexo condicionado no macho para que salte aquando da presenga da f mea e do t cnico num ambiente confinado Ao mesmo tempo o t cnico toma conhecimento individual do temperamento e comportamento de cada um dos machos Para que ocorra estimula o sexual por parte do macho fundamental estabelecer se um contacto visual e o olfactivo com a f mea tal como a observa o de outros machos a saltarem O treino dos bodes dadores de s men deve seguir 4 passos b sicos O primeiro passo para dar in cio ao treino do animal para recolhas de s men por vagina artificial deve consistir na mobiliza o do macho para o local onde habitualmente ser o feitas as recolhas por um per odo de 5 a 10 dias de modo a que o animal tome conhecimento do ambiente O passo seguinte a introdu o de f meas em cio para estimular o salto do macho Depois o macho deve ser acostumado a saltar com a f mea presa a uma manga de recolha ou a um local destinado mesma finalidade Este passo deve sempre ser feito na presen a do t cnico Se o macho deixado sozinho com a f mea e n o demonstra nenhum interesse deve ser retirado e reintroduzido novamente por curtos per odos de tempo Cada vez que o macho colocado em contacto co
125. uados para programas de insemina o artificial em caprinos e ovinos 2 8 2 2 Concentra o O objectivo da medi o da concentra o do ejaculado determinar o n mero de espermatoz ides por ml de s men puro de modo a gastar o m nimo de s men poss vel Ap s a determina o do volume e da concentra o poss vel calcular o factor de dilui o do s men Barril et al 1993 Sousa 2000 A concentra o esperm tica varia 42 geralmente entre 2 e 10 x 10 espermatoz ides por ml de s men ejaculado Segundo Gon alves et al 2001 o valor normal encontra se em torno dos 3 bili es ml de s men Mas segundo Evans e Maxwell 1987 o s men de bode de boa qualidade cont m 2 5 a 5 x 10 espermatoz ides ml Existem v rias formas de medir a concentra o visualiza o directa da consist ncia do ejaculado contagem exacta com um hemocit metro e medida da densidade ptima atrav s de um espectrofot metro podendo ainda ser utilizado um contador ou electr nico de part culas Coulter 2 8 2 2 1 Visualiza o Directa da Consist ncia do Ejaculado A aprecia o visual directa da concentra o esperm tica Fig 5 uma das t cnicas utilizadas por v rios centros de insemina o Esta pr tica nem sempre recomendada uma vez que a aprecia o subjectiva 2 8 2 2 2 Contagem exacta com um Hemocit metro A contagem exacta do n mero de espermatoz ides atrav s de hemocit metro o m todo mais preci
126. ualitativas O contacto pr vio dos machos com as f meas fornece lhes pr tica na execu o da c pula e ajuda na desinibi o de machos inexperientes Segundo Stellflug e Lewis 2007 a frequ ncia e dura o de cada comportamento depende de cada reprodutor e da sua experiencia sexual pr via servindo como crit rio de avalia o classifica o e sele o de reprodutores A express o sexual do macho pode ainda ser influenciada por factores fisiol gicos como a exist ncia de problemas f sicos ou ps quicos tais como peeira eczemas problemas nas articula es e medo Sousa 2000 Os factores sociais que mais desencadeiam apetite sexual no macho s o a incorpora o de novas f meas no 24 efectivo e a presen a de outros machos na altura da c pula A utiliza o de est mulos n o espec ficos como choques el ctricos altera o do local de recolha e troca de f mea aumentam a frequ ncia de ejacula o e diminuem o per odo refrat rio A hierarquia estabelecida no grupo pode influenciar a actividade sexual do macho quando v rios competem pela mesma f mea Deste modo o macho dominante efectua a maior parte das c pulas influenciando negativamente a actividade sexual dos restantes machos do grupo a obten o de um territ rio posi o social dominante forma o de um parceiro por exemplo 2 6 Sazonalidade A maioria dos caprinos tem origem em pa ses temperados o que se traduz numa acentuada varia o na sazonal
127. uretra um canal que se prolonga a partir da jun o das ampolas at a extremidade do p nis servindo de ducto excretor para a urina e s men Este canal possui duas por es intra abdominal e extra abdominal A por o intra abdominal caracterizada por uma acentuada curva sigm ide designada por S peniano uma vez que accionada pelo m sculo peniano a distens o desta curva que no momento da c pula permite o aumento de tamanho do p nis pelo consequente aumento da zona extra abdominal e a respectiva introdu o no aparelho genital feminino 2 1 2 Glandulas Anexas As gl ndulas anexas encontram se ao longo da por o p lvica da uretra com ductos que permitem expulsar as suas excre es para o exterior atrav s da uretra Elas compreendem as gl ndulas vesiculares da pr stata e bulbouretrais Estas gl ndulas s o respons veis pela produ o de fluido seminal que alimenta serve de tamp o e fornece outras subst ncias necess rias motilidade e fertilidade dos espermatoz ides Leite Browning 2009 As gl ndulas vesiculares tamb m designadas por vesiculas seminais s o um par de gl ndulas lobulares que facilmente se identificam devido sua apar ncia nodular O Donnell et al 2001 A apar ncia de cacho de uva destas gl ndulas permite acumular o esperma sendo este o resultado da mistura dos espermatoz ides com o liquido excretado pela pr stata S 1990 As gl ndulas vesiculares do bode ap
128. utores consideram estas c lulas como moribundas ou que morreram recentemente Segundo Evans e Maxwell 1990 os reprodutores que apresentarem mais de 20 30 dos espermatoz ides mortos e mais de 15 20 anormais n o devem ser utilizados nos programas de insemina o artificial 47 Para al m do m todo anteriormente referido existem outras t cnicas para determinar a percentagem de espermatoz ides vivos e normais tais como o teste de azul de bromofenol nigrosina azul de metileno rosa Bengala entre outros Para contabilizar a percentagem de espermatoz ides vivos necess rio observar diferentes campos na mesma l mina e contar no m nimo 150 espermatoz ides Baril et al 1993 Ap s estas contagens poss vel determinar as respectivas percentagens de espermatoz ides vivos e mortos 2 8 2 3 1 1 Prepara o do Esfrega o Para uma observa o adequada das prepara es coloridas fundamental que esta seja bem executada Na prepara o do esfrega o deve utilizar se uma l mina previamente aquecida a 37 C Coloca se numas das extremidades da l mina 1 a 2 gotas de corante e uma gota de s men dilu do separadamente As gotas devem atingir a mesma temperatura da l mina antes de se misturarem Evans e Maxwell 1987 As gotas misturam se com o aux lio de uma lamela ou l mina durante aproximadamente 10 segundos De seguida estende se a mistura ao longo da l mina de modo a obter uma pel cula fina sobre a mesma Antes de
129. z ides mortos quer em fresco quer ap s descongela o foi o bode 1 com 69 03 16 08 e 88 49 5 86 respectivamente Se tivermos em considera o o dia em que foi efectuada a recolha de s men o primeiro dia foi o que se obteve maior percentagem de espermatoz ides vivos antes 54 74 6 39 spz vivos e depois 25 66 2 02 spz vivos da congela o 81 Quadro 6 Percentagem de espermatoz ides vivos spz Vivos vs mortos spz Mortos no s men fresco e descongelado em fun o do bode e do dia de colheita spz Vivos spz Mortos S men Fresco S men Descongelado S men Fresco S men Descongelado Bode 1 30 97 16 08 11 52 5 87 69 03 16 08 88 49 5 86 2 42 32 5 66 23 42 2 14 57 68 5 66 76 57 2 14 3 42 39 8 54 21 41 7 52 57 61 8 53 78 59 7 52 Dia Colheita 1 54 74 6 39 25 66 2 02 45 26 6 39 74 34 2 02 2 25 49 6 07 18 79 5 61 74 51 6 06 81 21 5 62 3 35 45 10 40 11 90 7 3 64 55 10 40 88 10 47 29 82 V Discussao Este trabalho teve por objectivo testar a influ ncia de tr s curvas Curva A 25 C min Curva B 35 C min e Curva C 45 C min de congela o de s men de bode na percentagem de espermatoz ides vivos mortos bem como na integridade do acrossoma ap s a descongela o Para isso um total de tr s bodes reprodutores foram sujeitos a recolha de s men s tr s vezes tendo o s men sido dividido em cada uma das recolhas e
130. z no meio ambiente produz a melatonina que por sua vez estimula o hipot lamo a hip fise e os test culos ou os ov rios ao retorno da actividade reprodutiva Muniz 2003 Existe uma rela o directamente proporcional entre a secre o de melatonina e a dura o do per odo nocturno que podem ser indutivos ou supressivos Sinais indutivos de melatonina estimulam o ciclo hormonal reprodutivo enquanto sinais supressivos inibem Karsch 1984 Dantas 2009 A melatonina uma hormona presente no organismo de todos os mam feros sendo produzida e secretada durante a noite pela gl ndula pineal Muniz 2003 Dantas 2009 A s ntese da melatonina inicia se a partir do triptofano com a serotonina acetilada a Nacetilserotonina a qual metilada resultando na melatonina 2 7 Recolha de S men em Caprinos 2 A qualidade com que efectuada uma recolha de s men de extrema import ncia para o sucesso de um programa de insemina o artificial Uma boa recolha de s men engloba o processo de escolha e prepara o dos animais com intervalos adequados e dom nio da t cnica por parte do t cnico Em caprinos os m todos de recolha de s men podem ser variados tais como excita o mec nica do p nis colector vaginal sendo contudo o m todo da electoejacula o e da vagina artificial o mais utilizado 26 2 7 1 Recolha por Electroejacula o Existem diferentes tipos de estimuladores el ctricos O de uso mais comum

Sofia Alexandra Fagundes Lopes - Repositório da Universidade dos

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