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- Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

1. 123 Procedimento b sicos de an lise de resultados 130 Contatos com a BioM rieux Brasil 140 FOC AA O O UN AS DI SURTO 141 Teste Amplicor 1 142 T cnica apresenta o procedimento de ensaio 152 Procedimento de opera o do sistema 159 Manuten o e 1 193 Procedimento b sicos de an lise de resultados 201 Contatos com a 229 Introdu o Este manual visa orientar os usu rios da Rede Nacional de Laborat rios de Carga Viral no sentido da realiza o correta dos testes dentro dos padr es de qualidade preconizados pelo Minist rio da Sa de Programa Nacional de DST e Aids As t cnicas modernas de biologia molecular permitiram que fossem desenvolvidos procedimentos para a quantifica o dos n veis de RNA viral no plasma de indiv duos infectados pelo HIV A quantifica o do RNA do HIV 1 Carga Viral considerada o marcador laboratorial mais adequado para o estabelecimento do progn stico de indiv duos infectados para o monitoramento da resposta terap utica aos anti retrovirais e na avalia o da progress o da doen a Com base nessas quantifica es sabe se que n veis altos de RNA plasm ticos est
2. 24 Nenhum l quido foi encontrado no cassete de reagente da posicao HH HH Fazer o load de um novo cassete de reagente 377 No level found Erro de sensibilidade reagent pos reagente Realizar Extended Presen a de ar na agulha Prime Contactar a CARD A operagao solicitada ao sistema n o pode ser 380 System in process Tentar mais tarde Bip Tela realizada porque o mesmo est ocupado A opera o solicitada ao 381 Printer spooler sistema n o pode ser Bip Tela overload try again realizada porque o mesmo est ocupado 383 New file Um novo arquivo foi Nenhuma a ao Bip Tela criado pelo operador necessaria O arquivo requisitado 384 File in use est sendo usado pelo Tentar mais tarde Bip Tela sistema nao teve sucesso procura O nome do arquivo que I e Usar outro nome de Duplicate file esta sendo criado ja Bip Tela arquivo existe 382 Data base Data base full Data base full 2 5 Apagar os resultados Bip Tela esta cheia File in use O arquivo requisitado modification not est sendo usado pelo Tentar mais tarde Bip Tela saved sistema File in use not O arquivo requisitado est sendo usado pelo Tentar mais tarde Bip Tela deleted sistema Asrina into O A ring j foi ciclado Mover o A ring para o oner location N o coloc lo no TCA ou DP1 ou DP2 Bip Impress didi TCB Pressio
3. BIO E F2 1 E LJ gt Manual de Carga Viral HIV 1 ndice I gos d o O Cn go 001 Conceitos B sicos Biologia Molecular 002 Conceitos B sicos do HIV 1 012 o IH er A e ol PO O O FUSE 018 Preparo de 022 Coleta manuseio e 023 Divis o de rea 025 Metodologia de quantificacao do RNA viral do HIV 027 DO asi ada dO ERICH REIN MUNITUM EC O 030 Teste Versant HIV 3 0 031 T cnica apresenta o procedimento de ensaio 036 Procedimento de opera o do sistema 041 Manuten o e 4 060 Procedimento b sicos de an lise de resultados 070 Contactos COM A EPUM DM 078 BioM rieux nn 079 Teste Nuclisens HIV 1 080 T cnica apresenta o procedimento de ensaio 085 Procedimento de opera o do sistema 105 Manuten o e
4. Pr refrigere centr fuga e o rotor no Programa 1 1000 RPM 49C e tempo Hold Remova da Caixa 2 freezer os padr es e controles Descongele os padr es controles rapidamente em gua fria e corrente homogeneize por invers o e no agitador V rtex Manter em banho de gelo durante o uso Proceda da mesma maneira com as amostras caso estas estejam congeladas NOTA Os padr es e controles devem ser preparados no dia em que for realizado o procedimento do ensaio N o utilize precipitados preparados e armazenados anteriormente tubos est reis e marque os com identifica es de Amostras Padr es e Controles os padr es A E e F s o utilizados em duplicata Remova da Caixa 1 geladeira o reagente Bead Suspension e homogeneize por inversao Adicione 50 uL em cada tubo Adicione 1 0 mL de Amostras Padr es e Controles nos respectivos tubos abrindo os um a um com aux lio de gaze ou papel absorvente Tampe firmemente agite no V rtex e coloque os no rotor da centr fuga 4 4 HealthCare Cuidadosamente retire os tubos da centrifuga Imediatamente abra o tubo com aux lio de uma gaze ou papel absorvente e aspire o sobrenadante usando uma pipeta de transfer ncia est ril para cada tubo ou utilize uma bomba de v cuo Aspire com cuidado para evitar aspirar todo o sobrenadante Evite aspirar no lado em que se encontra o precipitado Deixe aproximadamente 20 uL do sobrenada
5. 185 FLUXO DO LOAD CHECK Load Chech PASSED A rotina ser processada Se o Cobas Amplicor est no modo b sico a amplifica o e a detec o ser o realizados Se usar o paralelo estiver somente a amplifica o ser realizada Pressionar Load Check FAILED Inicia a amplifica o Pressionar STOP STOP TRANSFER aparecer na tela Pressionar SHIFT e ENTER simultaneamente Fazer as corre es necess rias Pressionar START Esperar pela mensagem Load Check failed e a rotina ser realizada Se o Cobas Amplicor est programado para o Modo B sico ser realizada a amplifica o e a detec o No Modo Paralelo somente a amplifica o e desnatura o ser o realizados 186 Nome do teste Teste File R tulo do Cassete Nota Alguns testes Cobas Amplicor e Cobas Amplicor Monitor podem n o ter sido aprovados para uso em todos pa ses Consulte um representante da Roche para os testes que est o dispon veis no seu pa s 187 R tulo do cassete Nome do teste Teste R tulo do cassete Probe Suspension 2 File Probe Suspension 2 Padr o de Quantificacao QS Tabela 1 Consumo de D cups 188 1 A tubes no ensaio 2 D cups para detec o do alvo H Testes Qualitativos 1 A idea do aluga nes Testes Quantitativos 4 3 D cups para detec ao do IC e QS IC Qualitativos 1 A x detec o do QS ou C QS Quantitativos 2 4 4D cups necess
6. AREA Numero minimo de pontos de for a necess rios em cada sala Codedra apropriada bancada Lixo malenal contaminado Ar condicionado independente em pad uma das salas Tr nsi o permitido os t cnicos envolvidos nz t cnica pe de tr nsito proibido Aventais especificos par cada area 5 Material especifico de cada sala Sala 1 rea limpa extrac o isolamento pr amplificac o Sala 1A Intermedi ria preparo de Master Mix Sala 2 rea de Biologia Molecular p s amplificac o detecc o 26 Quantifica o do RNA viral do HIV 1 Metodologias disponiveis na rede A quantifica o da carga viral do HIV 1 pode atualmente ser realizada por tr s metodologias distintas segundo os produtos de 3 empresas gt QUANTIPLEX HIV 1 RNA 3 0 Assay BAYER DIAGNOSTICS NASBA gt NUCLISENS HIV 1 QT BioM riex RT PCR gt AMPLICOR HIV 1 MONITOR ROCHE Das tr s metodologias dispon veis duas fazem a amplifica o de forma direta amplificando alvo e uma de forma indireta amplificando sinal Compara es estat sticas revelaram estreita correla o superior a 90 entre os tr s ensaios A an lise da varia o intrateste n o revelou diferen as sistem ticas entre as duplicatas com nenhuma das tr s metodologias citadas sugerindo boa reprodutibilidade das mesmas Entretanto como elas s o baseadas em pr ncipios diferentes sugere se que os resu
7. 2 Ly T HealthCare 7 Procedimentos B sicos de An lise e Interpreta o de Resultados O teste considerado v lido se todas as condi es abaixo forem cumpridas As unidades relativas de luz RLUs para os padr es s o m dia geom trica RLU Padr o A gt RLU Padr o B gt RLU Padr o C gt RLU Padr o D gt m dia geom trica RLU Padr o E gt m dia geom trica RLU Padr o F O Controle Negativo HIV 1 tem valor de lt 50 c pias mL Os valores dos controles positivos HIV 1 est o dentro do intervalo especificado Revise essas instru es para certificar se de que o teste foi realizado de acordo com os procedimentos recomendados pela Bayer Certifique se de que os padr es e controles est o na posi o correta indicada no diagrama da placa Certifique se de que os reagentes est o dentro do prazo de validade Certifique se de que foi executada a manuten o obrigat ria do System 340 Utilize o seguinte crit rio para avaliar os resultados O limite de detec o do teste de 50 c pias mL As amostras com valores menores que 50 c pias mL est o abaixo do limite inferior da quantifica o do teste As amostras com valores iguais ou maiores que 50 c pias mL cont m HIV 1 RNA nas quantidades registradas Amostras com valores acima de 500 000 c pias mL est o acima do limite superior da quantifica o e podem ser dilu das 1 10 para obter um valor quantitativo NOTA Dilua amostras em s
8. Al anida 1 gt Selecione Automated Test Name 1 7 Jun 97 15 37 Left Right r Strips Strips Select rest strips and press Start 7 Selecione o teste Test name HIV 3 0 a primeira op o Caso n o esteja selecionado HIV 3 0 utilize a tecla OPTIONS para selecionar Informe o n mero de tiras a serem utilizadas no ensaio na placa da esquerda e placa da direita utilizando a tecla OPTIONS OBS Se n o estiver utilizando a placa da direita coloque O Em seguida pressione a tecla START O equipamento efetuar o Selftest Coloque as duas placas no equipamento 53 e Bayer HealthCare Coloque as placas selantes pads previamente preparada 4 sobre cada placa 1 Barreira de silicone 2 Filme selante 3 Arma o Feche a porta de acesso e pressione START INICIALIZA O DO SOFTWARE Ao ligar o computador pressione as teclas CTRL ALT DELETE a Utilize usu rio qdms senha Bayer Ao abrir tela clique duas vezes com o mouse DMS 340 NEW ID LIST Permite ao usu rio a cria o de uma lista de trabalho Selecione NEW ID LIST Selecione o teste HIV 3 0 e clique ok Abrir uma tela para cadastro dos pacientes a partir da posi o B1 Pode se cadastrar at 84 pacientes por placa Salve esta lista em arquivo de mem ria com formato dmL Ex 25042002 dmL Para imprimir esta lista de trabalho abra arquivo File e selecione Print 54 2
9. Separar 4 microtubos de 1 7 mL novos um para cada sonda e identific los como Wt Qa Qb e Qc respectivamente Pipetar 130uL da oligop rola tampa rosa em cada um deles pode se utilizar a mesma ponteira Utilizando uma pipeta P200 e uma ponteira de 200uL com filtro pipetar 130uL da sonda WT tampa branca no microtubo identificado como WT Descartar a ponteira Utilizando uma pipeta P200 e uma ponteira de 200uL com filtro pipetar 130uL da sonda Qa tampa vermelha no microtubo identificado como Qa Descartar a ponteira Utilizando uma pipeta P200 e uma ponteira de 200uL com filtro pipetar 130uL da sonda Qb tampa amarela no microtubo identificado como Qb Descartar a ponteira Utilizando uma pipeta P200 e uma ponteira de 200uL com filtro pipetar 130uL da sonda Qc tampa azul no microtubo identificado como Qc Descartar a ponteira Homogeneizar bem cada um e reservar 3 Prepara o das amostras Preparar numerar um microtubo novo para cada amostra para dilui o das amostras amplificadas Pipetar o diluente de detec o com um volume x encontrado no r tulo da caixa de detec o ex 200uL em todos os microtubos Utilizando uma pipeta P20 e uma ponteira de 20uL com filtro pipetar 5uL da amostra amplificada no microtubo correspondente contendo diluente 101 IR IE U X de amostra Fechar o microtubo imediatamente e trocar a ponteira a cada pipetagem Abrir ao mesmo temp
10. do Carrossel RS 19 Proceder com a leitura verificar procedimentos b sicos de opera o 20 Ap s terminar leitura fazer o Shutdown verificar procedimentos de manuten o do leitor NASBA A n o realiza o deste procedimento pode acarretar problemas para o equipamento 21 Para desligar o equipamento proceda na seguinte ordem Leitor Impressora Monitor CPU estabilizador AVISO Para a realiza o do procedimento BACKUP das corridas realizadas no NucliSens Reader passo 1 Sair do sistema NucliSens atrav s do comando Routine Exit to DOS passo 2 Escrever a palavra compacta passo 3 Inserir o Disquete e apertar a tecla enter a todas as mensagens enviadas pelo software Desta forma todos os seus arquivos ser o enviados para o disquete e sua tela do computador ficar vazia Somente realizar o back up ap s a importa o de todas as rotinas para o SISCEL 104 BIOCM IRIE U X 5 Procedimentos para Opera o dos Equipamentos N L WW W NW NUCLISENS NASBA DIAGNOSTICS RI E LU EXTRACTOR Nucleic acid diagnostics 5 1 Descri o de Opera o do Equipamento NucliSens Extractor Desde sua introdu o os ensaios de amplifica o de DNA RNA t m provado ser uma ferramenta poderosa no uso diagn stico e cl nico Para esta finalidade um dos mais poderosos m todos de extra o de cidos nucl icos a meto
11. parafusos e levantando a placa do sistema Figura 1 e Limpar a placa com um pano mido e secar com um pano seco 193 girar e soltar desatarraxar incubador desatarraxar E RE 1 2 2 soltar Torre de inicializa o desatarraxar Plataforma Plataforma Plataforma racks racks racks desatarraxar went met reagentes reagentes Figura 1 e Soltar o bloco incubador pressionando para baixo os dois bot es de reten o Figura 1 e Levantar o bloco da sua base Limpar o bloco com um pano mido e secar com pano seco Cuidado para n o molhar a resist ncia Limpar os orif cios do bloco incubador com cotonete mido e Remover a bandeja de reagentes gen ricos D cups desatarraxando os dois parafusos levantando a bandeja livre do sistema e Limpar a bandeja com um pano mido e em seguida com um pano seco e Posicionar as plataformas e bloco incubador limpos e secos e Limpar a torre de inicializa o com um pano umido e depois secar cuidadosamente com outro seco 194 Remo ao e limpeza da roda de lavagem Desligar o Cobas Amplicor Acessar a roda de lavagem levantando a tampa principal e o teclado do Cobas Amplicor A roda de lavagem ficar visivel Girar as torres de lavagem brancas no sentido hor rio de modo que as mesmas se afastem do centro da roda de lavagem Remover a roda de lavagem desatarraxando o parafuso do centro da roda separan
12. F2 Fazer uma ordem de trabalho para o A Ring Lista de trabalho sem perfil para teste qualitativo Pressionar at aparecer na tela O Entry Pressionar EDIT Colocar o n mero do A Ring com o leitor de c digo de barras ou teclado Pressionar ENTER A mensagem NEW ORDER aparecer na tela Pressionar ENTER N o colocar o n mero do perfil Pressionar ENTER Identificar a amostra no primeiro A tube opcional Pressionar ENTER Pressionar STEP para selecionar o tipo de amostra C Controle S Amostra Pressionar ENTER Se C for selecionado escolha uma das seguintes op es gt Para controle pressionar STEP para aparecer Pressionar ENTER Pressionar STEP para selecionar o teste Pressionar ENTER gt Para controle pressionar para aparecer Pressionar ENTER Pressionar STEP para selecionar o teste Pressionar ENTER Se S for selecionado Reflex testing opcional gt Para usar a op o relex testing Pressionar STEP para selecionar pressionar ENTER depois STEP para selecionar o teste prim rio Pressionar ENTER Pressionar STEP para selecionar ou Pressionar ENTER e depois STEP para selecionar o Reflex test 182 Determina que o teste selecionado o teste prim rio Determina que se teste prim rio for positivo o REFLEX test selecionado ser realizado automaticamente Determina que se teste prim rio for negativo o REFLEX test seleciona
13. Gloss rio Antiparalelo termo que descreve o alinhamento de dois filamentos de DNA em uma h lice com suas liga es 3 5 fosfodi ster em dire es opostas Acido nucl ico macromol cula composta por unidades repetidas de uma mol cula de a car uma base nitrogenada e cido fosf rico uma pentose um fosfato e quatro bases Desnatura o separa o dos filamentos complementares de uma mol cula de DNA atrav s de meios fisicos ou qu micos pela ruptura das pontes de hidrog nio presentes entre os pares de bases DNA mol cula helicoidal de duplo filamento no qual a informa o gen tica codificada na sequ ncia de bases de purina e pirimidina os pares s o ligados por pontes de hidrog nio e longitudinalmente h um esqueleto de a car fosfato Dupla h lice configura o t pica adotada pelas cadeias de polinucleot deos do DNA Iniciador Primer pequeno segmento sint tico de DNA com comprimento e sequ ncia definidos usados para localizar e iniciar a s ntese e amplifica o de um segmento de DNA alvo Nucleos deo nucleot deo sem o cido fosf rico E a combina o de uma mol cula de pentose e uma base nitrogenada Nucleot deo a combina o de uma mol cula de pentose uma base nitrogenada e um cido fosf rico Pentose mol cula de a car com cinco tomos de carbono ribose no RNA e desoxirribose no DNA Pirimidina tipo de base nitrogenada encontrada em cidos nucl icos
14. O n mero de part culas virais presente em uma determinada amostra de um individuo infectado conhecido como carga viral A carga viral plasm tica detectada na forma de RNA do HIV reflete a din mica desse virus nos individuos infectados quantificando as part culas que est o sendo produzidas e lancadas na circulac o sanguinea O n vel de RNA do HIV no plasma um marcador cl nico importante O n mero de part culas virais mais elevado durante a infecc o prim ria e mais baixo na fase assintom tica Existe uma relac o direta entre a quantidade de HIV detectada e a rapidez com que a infeccao progride N veis elevados de replica o do virus e o aumento da carga viral est o associados a deteriorac o acelerada do sistema imune O colapso do sistema imune que antecede o aparecimento da aids resultado da destruic o das c lulas CD4 e das alterac es imunit rias provocadas pelo v rus Na figura abaixo observe as varia es nas contagens de linf citos TCD4 e na carga viral ao longo da infeccao pelo HIV 16 A carga viral til para avaliar progress o da doen a indicar o in cio da terapia e determinar a efic cia dos anti retrovirais Months Years Symptoms E P P o After Nature Medicine 1996 2 625 17 Biosseguran a Materiais biol gicos tais como sangue soro e c lulas s o potencialmente infectantes e muitas vezes est o contaminados com agentes
15. Trocar agulha Transfer Tip Check Agulha est torta Trocar agulha Bip Impress Transfer tip wet or bent 227 Failure Level detection statistic warning System master init System init O sistema est iniciando Close DP cover and TC covers Wash reservoir low vol Waste container high volume pata base O sistema est ocupado Tente mais tarde try again Data base mismatch Ocorreu um erro de Repetir o procedimento try again entrada de dados Startup after diagnostic run Ar em excesso nas Realizar Extended tubula es Prime O tubo da torre de lavagem est vazio A sensibilidade do n vel de l quido n o est adequada Uma novo software nova vers o foi instalado no sistema O sistema foi resetado pressionando o bot o reset da CPU 3 vezes As tampas dos DPs ou TCs est o abertas Ap s Extended Prime e troca de seringa o sistema retorna sua opera o normal O sensor do reservat rio do tamp o de lavagem n o est detectando l quido O sensor do reservat rio do esgoto waste est detectando l quido Fechar as tampas Confirmar se o n vel do tamp o de lavagem est lt 5 mm abaixo do topo do tubo da torre Verificar se h Vazamento na torre ou tubo da torre de lavagem Verificar 1 agulha 2 sensores de n vel dos gal es Realizar Extended Bip Impress Prime Contactar a CARD A mem ria do sistema foi
16. car nas fitas opostas somente certos pares de bases podem se encaixar na estrutura Como vemos na figura os nicos pares poss veis s o o AT e o CG E importante salientar que o par AT unido por duas pontes de hidrog nio e o par CG por tr s pontes de hidrog nio isso faz com que o par CG seja mais est vel que o AT Tr s Pontes de Hidrog nio Duas Pontes de Hidrog nio atraindo G e C atraindo A e T ND 7 o Desoxirribose H O Desoxirribose ADENINA TIMINA GUANINA CITOSINA A seq ncia axial de bases ao longo de uma cadeia de polinucleot deo pode variar consideravelmente por m na outra cadeia a seq ncia deve ser complementar Assim as duas cadeias que constituem um segmento de DNA s o complementa res entre si Durante a duplica o do DNA as duas cadeias dissociam se e cada uma age como um molde para a s ntese da nova cadeia complementar FT y AATGGAGTTS J que a estrutura de dupla h lice do DNA preservada por liga es fracas poss vel separar as duas cadeias atrav s de aquecimento ou pH alcalino A temperatura necess ria para romper os pares GC maior do que a necess ria para romper o par AT A temperatura na qual ocorre a separa o das cadeias de DNA ponto de desnaturacao depende da raz o AT GC Se o DNA ap s a desnatura o for vagarosamente resfriado as cadeias complementares pareiam se de forma ordenada restabelecendo assim a conforma o original
17. execution err controle da temperatura 216 TcControl fatal cmd Problema no hardware de Contactar a CARD Bip Impress 219 controle da temperatura 202 21723 d d reset Problema no hardware de Contactar a CARD Bip Impress occurred controle da temperatura 2182232 TcControl fatal event Problema no hardware de Contactar a CARD Bip Impress err controle da temperatura inpaya pan Erro no hardware do 220 ae y sistema de transfer ncia Contactar a CARD Bip Impress de fluido id parapas Erro no hardware do 22213 3 13 4 P sistema de transfer ncia Contactar a CARD Bip Impress open err de fluido RIEN Erro no hardware do 2231 1 HH P sistema de transfer ncia Contactar a CARD Bip Impress send err de fluido rp Erro no hardware do 2243 31314 P sistema de transfer ncia Contactar a CARD Bip Impress Gud de fluido Transfluid fatal cmd TONO Maro e 2264 1 1E dE MM sistema de transfer ncia Contactar a CARD Bip Impress de fluido E Erro no hardware do 22713 HH 4 sistema de transfer ncia Contactar a CARD Bip Impress occurred de fluido Transfluid fatal Erro no hardware do 228 sistema transfer ncia Contactar a CARD Bip Impress event err de fluido 230 iic Contactara CARD 00 a CARD Bip Impress WashFiuid Tubos de aspira o ou Verificar as agulhas de 235 HHHH ressuspensao aspiragao e Bip Impress exe err desalinhados ressuspe
18. o A sintese prot ica n o resultante da leitura direta da sequ ncia nucleot dica do DNA Como o DNA est localizado no cromossomo no n cleo da c lula e a s ntese prot ica ocorre quase que na sua integra nos ribossomos localizados no citoplasma as informa es gen ticas contidas na sequ ncia nucleot dica do DNA tem que ser transferida para uma mol cula intermedi ria que pode mover se para o citoplasma o RNA mensageiro Apenas uma das fitas do DNA transcrita dando origem a uma unica sequ ncia de RNAm para cada gene A indica o de qual fita deve ser transcrita orientada por uma sequ ncia especifica chamada promotor localizada antes da sequ ncia a ser transcrita que reconhecida pela RNA polimerase enzima sintetizadora de RNAm Como a RNA polimerase adiciona sequencialmente monofosfatos de ribonucleos deo extremidade 3 da cadeia de RNA em crescimento a polimeriza o ocorre na dire o 5 gt 3 Isso significa que cada mol cula de RNAm ser id ntica sequ ncia nucleot dica da fita de DNA que n o transcrita O RNAm transcrito transportado para os ribossomos RNAr no citoplasma onde ocorre a s ntese prot ica No caso dos retrov rus a informa o gen tica segue o sentido inverso de RNA para DNA Esse processo conhecido por transcri o reversa e ocorre devido presen a de uma enzima a transcriptase reversa Enzima que participa na sintese do mRNA O
19. o de solu es nas placas da direita e esquerda Complete as duas placas de ensaio com po os pretos Coloque na bandeja de aquecimento do equipamento N o coloque os PADS s Selecione START Ap s esta a o verifique visualmente se todos os po os est o preenchidos com gua de maneira uniforme gt Selecione ASPIRATE O equipamento efetuar teste de aspira o de solu es nas placas da direita e esquerda s Complete as duas placas de ensaio com po os pretos preenchidos com agua Coloque na bandeja de aquecimento do equipamento N o coloque os PADS s Selecione START Ap s esta a o verifique visualmente se todos os po os foram aspirados de maneira uniforme o volume restante deve ser inferior a 15 ul Selecione PANEL O equipamento efetuar teste no visor indicador de erros bips alto e baixo Caso qualquer a o descrita n o tenha tido uma boa performance NAO INICIE O ENSAIO entre em contato imediatamente com a BAYER 64 2 Lp T HealthCare 6 2 MANUTEN O MENSAL 1 PERFORMANCE CHECKS BACKGROUND O equipamento efetuar teste de leitura nas placas da direita e esquerda Programe o software na fun o READ para receber os dados das leituras Selecione READ Preencha os dados da placa da esquerda Selecione o teste background m Selecione a lista de trabalho none n Coloque as informa es solicitadas nome do operador lote do kit validade do kit e clique OK Desconsid
20. o do HIV 1 CP35 acrescentada a cada uma de quatro dilui es de amplicon do HIV 1 e a cada uma de duas dilui es do amplicon do Padrao de Quantifica o do HIV 1 respectivamente Os amplicons biotinilados s o hibridizados com as sondas oligonucleotidicas especificas do alvo que se encontram ligadas as part culas magn ticas Cada determina o quantitativa requer quatro medi es separadas de reagente de absorb ncia utilizando a solu o de suspens o da sonda do HIV 1 e duas medi es de absorb ncia utilizando a solu o de suspens o da sonda do Padr o de Quantifica o do HIV 1 Rea o de Detec o Ap s a rea o de hibridiza o o Analisador COBAS AMPLICOR lava as part culas magn ticas no tubo D para remover qualquer material n o ligado ap s isso se adiciona Conjugado Avidina Peroxidase de r bano picante O Conjugado Avidina Peroxidase de r bano picante liga se amplicon biotinilado hibridizado com as sondas oligonucleotidicas especificas para o alvo que se encontram ligadas as part culas magn ticas O Analisador COBAS AMPLICOR remove o conjugado n o ligado atrav s da lavagem das part culas magn ticas e ent o uma solu o de substrato contendo per xido de hidrog nio e 3 3 5 5 tetrametilbenzidina TMB acrescentada a cada tubo D Na 147 presen a de per xido de hidrog nio a peroxidase de r bano picante com part culas ligadas catalisa a oxida o de TMB para formar um complexo
21. o do reagente Remover a tampa do cassete limpar e posicion los novamente no sistema Bip Tela Pressionar START A a o pretendida n o qu na I Obter assist ncia de um User privilege permitida devido ao 422 I acc usuario com um nivel Bip Tela violation privil gio de acesso do n maior de acesso usuario s Usar uma nova I Profile already exists Este n de perfil ja existe identifica o de perfil Bip Tela TS confina push Recurso para confirmar Pressionar lt SHIFT gt e os valores mostrados na ENTER Tela SHIFT ENTER tela do sistema simultaneamente 228 Durante o oadcheck foi detectado que a tampa do cassete da posi o est molhada Cassette cover wet reagent pos 9 Contatos com a Roche Roche Diagn stica Brasil Ltda Endereco Av Engenheiro Billings 1729 Bairro Jaguar Sao Paulo SP CEP 05321 010 Suporte ao Cliente CARD Central de Atendimento Roche Diagn stica Telefone 0800 7720295 E mail brasil cardOroche com ESSE E l T _ PE H m Central de Atendimenio Roche Diagnostics A CARD foi criada em 2001 com o objetivo de fornecer suporte t cnico e cient fico Ao entrar em contato com a CARD o cliente atendido por uma de nossas receptadoras que a partir da solicita o feita registra o chamado no sistema Clarify e o direciona para o especialista apropriado assistente t cnico ou
22. prster Matta TAMPAO DE LAVAGEM Recomenda se a retirada da frasco da geladeira 24 horas antes de come ar a ser utilizado sendo mantido a temperatura ambiente e protegido da luz Esse procedimento facilita a dissolu o dos cristais de Tiocianato de Guanidina Antes do uso deixar o frasco a 379 C por 30 minutos para solubilizar totalmente os cristais Agitar de vez em quando CALIBRADORES Sachet prateado incluso no kit de Amplifica o Dentro deste sachet existe um tubo com tampa amarela com uma esfera liofilizada Nessa esfera estao reunidos os calibradores Qa Qb e Qc 02 BIOCOM IRIE U Caso a esfera esteja quebrada reconstitua como prescrito Caso a esfera sofra altera es de cor ou tamanho contacte a empresa para troca da mesma Pipeta e ponteiras Pipeta P1000 e uma ponteira de 1000uL ou pipeta P200 com uma ponteira de 200uL com filtro neste caso pipetar 2 vezes 110uL trocando a ponteira para n o contaminar o tampao de eluicao Prepara o Essa esfera liofilizada deve ser reconstitu da em 220uL do tamp o de elui o e ser levada imediatamente ao vortex S LICA A s lica vem pronta para uso mas deve ser levada ao vortex para homogeneizar TAMP O DE ELUI O O tamp o de elui o n o precisa ser preparado ele vem pronto para uso Usado na prepara o dos calibradores e elui o das amostras ETANOL 70 Especifica es Deve ser preparado a partir de Etanol absoluto grau P A
23. 4091 Arquivo de calibra o Chame a assist ncia t cnica inacess vel Erro da mam ria do PC 4092 Desligue e ligue novamente o PC 4093 a 4094 Erro de Software Chame a assist ncia t cnica 4121 Download n o completado waitfor download correto inv lido correto 4207 a 4209 Drive n o est pronto tente novamente 4241 Path vazio Escolha o nome de path correto 4242 a 4246 Erro de software Chame a assist ncia t cnica 4248 Incapaz de achar ou abrir Foi escolhido um nome de arquivo arquivo inv lido Escolha um correto 4301 a 4334 4701 Tempo esgotado da Impressora sem uso por um impressora longo tempo Tente novamente conectando e ligando a impressora 4702 Impressora desligada Ligue a impressora antes do PC Impressora selecionada Chame a assist ncia t cnica n o encontrada 4703 4704 Impressora sem papel Coloque papel na impressora 4705 Erro da impressora Ligue a impressora antes do desligou PC 4706 Ligue a impressora antes do PC 4802 a 4812 falhou a opera o de Tente novamente a mesma leitura do disco opera o 4814 Erro da forma de Chame a assist ncia t cnica calibra o 134 BICM IRIE U X C DIGO DE ERROS CAUSAS PROCEDIMENTOS 4815 Arquivo path est vazio Chame a assist ncia t cnica 4816 a 4818 Erro de software Chame a assist ncia t cnica 4902 Desligue e ligue novamente o executar o programa 5000 Chame a assist ncia t cnica 5001 Repita o p
24. 7019 Ensaio indefinido no Defina um ensaio a ser 7016 7017 arquivo Import de importado importa o 7020 Lista de trabalho est cheia Capacidade m xima 12 amostras 135 B ID I E U C DIGO DE ERROS CAUSAS PROCEDIMENTOS 7021 Capacidade m xima 12 amostras 7022 Lista de trabalho est N o existe lista de trabalho Defina uma lista de trabalho definida com as amostras a serem 7023 lidas Dara amostra lista 7025 Defina ensaio HIV definidos quantitativo 7026 Erro nos resultados Dados incompletos Faltou Resultados n o calculados tubo na leitora Corra uma para esta amostra lista de trabalho antes N o existe mais dados para serem calculados Nenhuma amostra foi Caso tenha certeza que quer selecionada para a dele o deletar amostra selecione a com a barra de espa o Apenasamostras n o processadas podem ser selecionadas amostra no carrossel os tubos em uma nova lista 7040 a 7048 7049 a 7050 7037 a 7038 7055 a 7057 Erro de configuracao Chame a assist ncia t cnica 7059 Lista detrabalho j foi Voc est tentando abortar abortada uma lista que n o est mais correndo O instrumento est dispon vel 7060 a 7062 Erro de path Chame a assist ncia t cnica 7063 Dados da amostra n o s o Chame a assist ncia t cnica v lidos F f 7064 Graficos nao disponiveis Tubo ainda n o foi lido para amostra N o po
25. Assim sendo o esqueleto de um cido nucl ico composto por fosfatos e pentoses que se alternam As bases nitrogenadas est o ligadas aos a cares desse esqueleto O cido fosf rico utiliza dois de seus tr s grupos cidos nas liga es di ster 3 e 5 O grupo remanescente confere ao nucleot deo suas propriedades de cido O DNA o principal armazenador da informa o gen tica Esta informa o copiada ou transcrita para mol culas de RNA cujas sequ ncias de nucleot deos contem o c digo para a ordena o espec fica amino cidos As proteinas s o ent o sintetizadas em um processo que envolve a tradu o do RNA RNA DNA 3 End z 1 fa 5 E los 0 0 0 an e am e Phosphodiester linkage As pentoses sao de dois tipos ribose no RNA e desoxirribose no DNA A nica diferen a entre esses dois a cares que a desoxirribose possui um atomo de oxig nio a menos Ribe Desoxirnbose 5 HzOH j 2 Q cT C C H H4 XH HA aC mg E OH OH oH H As bases encontradas nos cidos nucl icos s o tamb m de dois tipos pirimidinas e purinas As pirimidinas possuem um nico anel heterociclico enquanto as purinas t m dois an is unidos No DNA as pirimidinas sao timina T e citosina C as purinas sao adenina A e guanina G O RNA contem uracila U no lugar da timina T T 7 xcd f i b b En 2
26. Est vel por 2 semanas a temperatura ambiente Armazenar de 2 25 C C LOAD Cassetes de Reagentes na Rack 1 2 B Pressionar at aparecer L Rcass Pressionar EDIT Digitar o n mero da rack ou use o leitor de c digo de barras Pressionar ENTER Se for uma nova rack a mensagem New File aparecer Pressionar ENTER Pressionar STEP para selecionar o tipo de rack Pressionar ENTER Colocar a posi o do cassete na rack com o leitor de c digo de barras ou teclado Se usar o teclado pressionar ENTER Colocar o n mero de identifica o do cassete com o leitor de c digo de barras ou teclado Se usar o teclado pressionar ENTER Repetir as etapas 7 para cada cassete adicionado na rack 178 9 Pressionar PRINT para obter uma c pia 10 Pressionar para salvar D LOAD racks de reagentes na plataforma 1 Pressionar LOAD at aparecer na tela L Rrack 2 Pressionar EDIT 3 ENTER para mover o cursor para a posi o apropriada da rack loci loc2 ou gen rico 4 Colocar o n mero da rack para cada posi o usando o leitor de c digo de barras ou o teclado Pressionar ENTER 5 Pressionar ESCAPE para salvar Para apagar 1 Um campo pressionar SHIFT e Zero simultaneamente 2 Uma rack inteira de reagentes pressionar SHIFT e Space simultaneamente E LOAD A rings 1 Colocar o A Ring na posi o desejada TCA TCB DP1 DP2 2 Pressionar at aparecer na tela L Aring 3 Pressionar
27. Pressionar SHIFT e simultaneamente para confirmar a sele o Para ver resultados 7 Pressionar at aparecer na tela R Treat 8 Pressionar 1 para selecionar Result Inspection e Pressionar EDIT 10 Digitar o n mero do A ring pressionar 11 para ver o resultado de cada A tube 12 Pressionar quando terminar 184 START Pressionar O analisador realizar um Load Check verificando os seguintes itens Volumes e cassetes de reagentes gt Volume do tamp o de lavagem no reservat rio gt Volume do gal o de esgoto gt N mero do A ring e a correspond ncia com o n mero das ordens gt N mero do D cups gt Blank do substrato STOP Pressionar ISTOP depois usar STEP para selecionar as seguintes op es Pressionar SHIFT e ENTER simultaneamente quando aparecer a escolha desejada na tela Stop Transfer Durante o Load Check o mecanismo de transfer ncia termina a tarefa e depois para Testes n o s o perdidos e a opera o do Termociclador n o ser afetada Durante a corrida Novas amostras n o ser o realizadas a atividade do mecanismo de transfer ncia continua at terminar os testes que foram iniciados A opera o do termociclador n o ser afetada Abort Transfer Imediatamente para o mecanismo de transfer ncia Todos os testes em processo s o perdidos A opera o do termociclador n o ser afetada Abort TCA A opera o do TCA ser abortada Abort TCB A opera o do TCB ser abortada
28. colocando o nome do teste data lote validade do kit n mero do A ring nome do operador e Seguir passo a passo o procedimento do teste que est sendo realizado e Quando terminar de colocar a amostras nos A tubes com Master Mix tirar o jaleco e trocar as luvas levar o A ring dentro do saco pl stico o mesmo que vem o A ring na caixa para a rea 2 Amplifica o e detec o onde est o Cobas Amplicor N O 159 A VOLTAR PARA A REA 1 Pr PCR Vestir o jaleco exclusivo da rea 2 Preparar o Cobas Amplicor seguindo o checklist O fluxo de trabalho no laborat rio deve ser realizado de uma forma unidirecional come ando na rea de Pr amplifica o e passando para a rea P s Amplificac o Amplifica o Detec o Os procedimentos na rea de Pr Amplifica o t m que ser iniciado com a prepara o do Master Mix e continuar com a prepara o das amostras Os materiais e equipamentos devem ser exclusivos de cada rea e n o devem ser utilizados para outros procedimentos nem transportados entre as reas Luvas devem ser utilizadas em cada rea e substitu las quando mudar da rea 1 para a rea 2 Os materiais da rea 2 sempre dever o permanecer na rea 2 P s amplificacao Prepara o do Master Mix pr amplifica o rea 1 rea 1A Caixa para preparar o Master Mix e Retirar o A ring do saco pl stico n o desprezar o saco pl stico e Posicionar o A ring no suporte do A ring
29. composta por um anel heteroc clico C T U Ponte de hidrog nio intera o fraca n o covalente que resulta do partilhamento de um pr ton entre tomos eletronegativos adjacentes liga os filamentos antiparalelos de DNA unindo os pares de bases AT e GC tamb m encontrada em proteinas Purina tipo de base nitrogenada encontrada em cidos nucl icos composta de dois an is ligados A ou G Reestrutura o processo pelo qual filamentos separados de uma mol cula de DNA podem reestruturar se como consequ ncia das propriedades de pareamento de bases do nucleot deo 10 RNA mol cula de um nico filamento que possui uma estrutura de subunidades semelhante do DNA relacionada com a tradu o do DNA em prote na Seq ncia axial seq ncia linear de bases ao longo de um filamento da mol cula de DNA Seq ncia complementar seq ncia correspondente do filamento axial rigidamente determinada pelas regras do pareamento de bases AT GC Sonda pequena seq ncia de DNA usada para isolar ou detectar uma seq ncia alvo complementar na rea o Tradu o processo atrav s do qual uma proteina sintetizada a partir de amino cidos de acordo com as especifica es codificadas no RNA Transcri o processo atrav s do qual uma mol cula de RNA polimerizada em um modelo de DNA com o auxilio de diversas enzimas Transcri o Reversa processo de s ntese do cDNA DNA complementar usando um molde
30. lises de dados gr ficos curva padr o e controles Os resultados s o gerados em c pias mL de acordo com a necessidade do usu rio e Conectividade os dados sao gerados e podem ser exportados no formato TXT ASCII integrando se com o sistema do laborat rio Especifica es T cnicas Comprimento 100 3cm 39 5in Largura 68 6cm 27in Altura 45 4cm 17 9in Peso 68 0kg 15016 Temperatura ambiente de opera o 18 309 Humidade relativa do ambiente 24 80 Categoria de instalacao II Grau de poluicao 2 Voltagem 100 120 ou 200 240 V n o bi volt Freq ncia 50 60 Hz Pot ncia 400 VA m ximo SY B 5 Bayer HealthCare Embalagens do Reagente HIV 1 RNA 3 0 bDNA O Kit composto de 2 caixas de reagentes Caixa 1 com reagentes gerais probes e tamp es armazenado em geladeira 2 a 89 38 n Bayer HealthCare B P _ YE E F BA Caixa 2 contendo os padroes controles e label probe armazenado em freezer entre 60 a 809C O laborat rio dever receber um conjunto de caixa 1 e caixa 2 5 i 3 39 2 Lp T HealthCare Material Necess rio para Tecnologia Abaixo uma rela o de instrumentos necess rios para a realiza o da t cnica com os desc
31. m part culas magn ticas e sondas espec ficas marcadas com rut nio No interior do NucliSens Reader o material hibridizado imobilizado na superf cie de um eletrodo e uma voltagem aplicada desencadeando uma rea o de xido redu o padr o denominada eletroquimioluminesc ncia ECL O sinal de ECL quantificado e convertido em c pias por mililitro pelo software do equipamento SISTEMA NUCLISENS O sistema NucliSens HIV 1 QT foi desenvolvido baseado na tecnologia NASBA imitando n vitro o ciclo replicativo do HIV 1 in vivo E um sistema completo de alta confiabilidade e sensibilidade capaz de detectar em uma nica rea o um valor de carga viral vari vel em uma faixa de 40 a 10 000 000 de c pias na amostra testada A quantifica o pelo Sistema Nuclisens se desenvolve em tr s etapas e integra o sinergismo de tr s tecnologias chave 1 Liberagao e Isolamento do RNA viral Tecnologia BOOM 2 Amplificacao Tecnologia NASBA 3 Detec o do Material Amplificado Eletroquimioluminesc ncia ECL 1 1 Libera o e Isolamento do RNA Viral Tecnologia BOOM Amostra Cl nica Lise Celular A rea o come a com a adi o da amostra cl nica a um tamp o de lise contendo Tiocianato de Guanidina e detergente Triton X 100 Este tamp o solubiliza as proteinas e os lip dios levando inativa o dos agentes infecciosos presentes na amostra Desse modo c lulas e part culas virais s o desintegradas enzimas RNases e
32. o associados queda r pida na popula o de linf citos TCD4 e progress o mais r pida para AIDS RELA O ENTRE PROGRESS O CL NICA E MARCADORES LABORATORIAIS Contagem de C lulas T CD4 dr DU D i nmn Carga Viral J Coffin Xl International Conf on AIDS vancouver 1996 Nessa perspectiva o Minist rio da Saude por meio do Programa Nacional de DST e AIDS implantou as Redes laboratoriais para a Carga Viral e para contagem de linf citos TCD4 Neste manual voc vai encontrar informa es a respeito das tr s metodologias implantadas pelo Programa Nacional de DST e AIDS Conceitos b sicos de Biologia Molecular cidos Nucl icos cidos nucl icos s o pol meros que resultam da repeti o de quatro diferentes unidades denominados nucleot deos A sequ ncia linear dos quatro nucleot deos na mol cula de DNA a fonte b sica da informa o gen tica Os cidos nucl icos s o macromol culas Todos os organismos vivos contem cidos nucl icos na forma de DNA cido desoxirribonucl ico e RNA cido ribonucl ico Os cidos nucl icos s o compostos por uma mol cula de a car pentose bases nitrogenadas purinas e pirimidinas e cido fosf rico A mol cula de cido nucl ico um pol mero linear no qual os mon meros nucleot deos s o interligados por pontes ou liga es do tipo fosfodi ster Essas liga es unem o carbono 3 da pentose do nucleot deo adjacente
33. o permita que o tempo de pipetagem exceda 04 minutos Feche a porta e Pressione START O equipamento incubar as placas por 30 minutos Ap s a incuba o o equipamento automaticamente resfriara as placas a 349 C e far as sequ ncias de lavagem Reagente de Trabalho Amplificador No in cio do ciclo de resfriamento lavagem do Pr Amplicador remova a Sonda amplificadora da Caixa 1 e coloque a na bancada temperatura ambiente Prepare o Reagente de Trabalho Amplificador em um tubo de polipropileno de 15 mL de acordo com a tabela 8 84 13 0 mL 100 uL Tampe e inverta o tubo no m nimo 10 vezes e passe no Vortex por 20 segundos Repita se necess rio ate obter totalmente a homogeneiza o Coloque no banho a 379C para dissipar a espuma Descarte se for utilizar dentro de 30 minutos Quando as placas forem ejetadas imediatamente abra a porta Adicione 100 uL do Reagente de Trabalho Amplificador utilizando uma pipeta multicanal de 12 Carregue a placa da esquerda primeiro da fileira A para H N o permita que o tempo de pipetagem exceda 04 minutos Feche a porta e pressione START O equipamento incubar as placas por 30 minutos Ap s a incuba o o equipamento automaticamente resfriara as placas a 349 Ce far as sequ ncias de lavagem 48 e HealthCare Reagente de Trabalho Marcador Label Remova o Label Diluent da Caixa 1 do kit e coloque no banho a 379C por no m nimo 10
34. resetada Instalar test files PCR files e os par metros de configura o Bip Impress es 7 7 Nenhuma a o e necess ria Bip Impress Bip Tela Nenhuma a o E Tela necess ria Completar o reservat rio do tamp o de lavagem Verificar se o sensor est posicionado na altura correta do reservat rio Bip Impress Esvaziar o reservat rio do esgoto waste Verificar se o sensor est posicionado na altura correta do reservat rio Bip Impress Bip Impress Bip Impress WES P CEU MU e 23 Apagar ordens de modo que sejam necess rios menos de 210 D cups Recomecar a corrida 364 No test reagent N o foi feito o load do Fazer o oad do Bip Impress found reagente em questao reagente Uma das tampas dos termocicladores est aberta Foram criadas ordens que requerem mais de 210 D cups More than 210 363 detections loaded Bip Impress Load inconsistency cover open Fechar bem as tampas 365 dos termocicladores Bip Tela Load inconsistency TCA TCB DP1 or DP2 order not found All tests finished ring est completa trabalho para o A ring Criar uma rack de reagente gen ricos Fazer o oad da rack de reagentes gen ricos Criar uma rack de reagentes espec ficos Fazer o oad da rack de reagentes espec ficos N o foi feito o load de Criar uma rack de reagentes espec ficos reagentes espec ficos necess rio para a Fazer o
35. 13 1 07 63 Sep Timed 130601 07 53 step Incubate 13Der 09 73 Cooldown activates 13Dsc01 08 32 Cadldown cycle complete l3Dec 1 0837 cep ait 1 1 08 36 Wait 13Deco1 06 36 1 08 37 Step Prima 1301011 06 17 Times i3Deco1 Slep Wash 1 1 08 30 step Prima 13Dec 06 34 Step 13 01 8 38 Step Timeaut liDsc l 08 38 Step Lond 1 08 40 Sie p Timro 1aDeco1 06 40 Step 132001 08 41 Step Timeoul 13Dec o 06 41 step Inculate 13Deri 1 0 11 Cooldown cycle actives 13Dsc017 02 30 Cooldown cycle complete l3Decod 08 20 Step Wait 1 5 24 Si ep Wait 130 01 08 24 Each 0574 step Prima 1aDeccd 00 74 13lleco1 0524 Wash 1 575 Primas 13Dec01 09 25 Step Dec 08 26 Step Timeaout 1iDesc l 08 26 Lond Hii 08 28 Sep Timmai ta us po 5 d orn npa tn n bn pg 6n EO PH DT DO PB T O tn fn cen pg n tn pH DT DO Hr FT EO pn br a c pd in En pH DT EX HS CT GR Left Tray Bayer HealthCare Solares Version 40 74 Bayer HealthCare QUANTIPLEX E sen Lun Sallwara Version 4 0 Data Filo hrebdna DHE Collected 17 1301 11 44 Lott Trag ID List Fido hivi21220 E ont Loc 06 25 Step Timeout Dedo 09 21 Timeari 13Dac
36. 137 0 005 O 986 0 B Diagnostics 004 367 007 275 006 285 004 529 005 254 205 B OUTROS COMENT RIOS RELACIONADOS AOS RESULTADOS DE TESTES QUANTITATIVOS Coment rio INTERPRETA O Os valores do QS e da amostra est o dentro do intervalo do ensaio mas o RESUELTO valor calculado est abaixo do limite inferior do intervalo linear do teste Os valores do QS e da amostra estao dentro do intervalo do ensaio mas o RESULTE valor calculado est acima do limite superior do intervalo linear do teste Todos os valores de absorb ncia da amostra est o abaixo do TARGETOD LO intervalo de OD do ensaio Todos os valores de absorb ncia da amostra est o acima do TARGE TOO TIA intervalo de OD do ensaio Todos os valores de absorb ncia da amostra est o fora do intervalo TARG_RANGE de OD do ensaio BLANKHIGH A absorbancia do blank do substrato esta muito alta TCRANGE O perfil do termociclador esta fora de especifica o QCERROR As absorb ncias dos controles est o fora de especifica o RGTEXPIRED Um ou mais reagentes usados para o teste esta vencido A temperatura da plataforma de reagentes est fora de REAGTEMP especifica o INCUBTEMP A temperatura da incubadora esta fora de especifica o CALCERROR Erro de calculo da absorbancia Erro de intervalo do fot metro ABORTED O teste foi abortado CONJEMPTY O cassete de conjugado esta vazio TREAGEMPTY O cassete
37. 5 para 3 a s ntese de uma das cadeias complementares realizada de forma continua enquanto que a outra sintetizada descontinuamente Os fragmentos da cadeia descontinua s o ligados pela enzima DNA ligase Muitas outras proteinas est o envolvidas na estabiliza o e manuten o da integridade das cadeias simples que s o precursoras para a sintese da fita dupla assim como no reconhecimento dos s tios de inicia o As Dna polimerases possuem al m da fun o de sintetizar polinucleot deos atividade exonucle sica chamada de corre o de leitura na qual os nucleot deos incorporados incorretamente s o removidos Essa propriedade fundamental para a manuten o da integridade da sequ ncia original Muito da complexidade inerente replica o de dNA adv m do fato de que as duas cadeias da dupla h lice se orientam em dire es opostas 5 gt 3 e 3 gt 59 e suas c pias devem igualmente apresentar dire es opostas Ainda o alongamento de todas as cadeias c pias individuais ocorre na dire o 5 3 Esse aparente paradoxo foi esclarecido com a descoberta de que uma fita c pia cresce continuamente em uma dire o enquanto a outra fita c pia constru da de forma descontinua a partir de por es menores que se alongam individualmente em dire o oposta Essa constru o necessita de duas enzimas a DNA polimerase I para preencher as lacunas e a DNA ligase para juntar os fragmentos Transcri
38. C Kemper M e cols Multicenter evaluation of the performance characteristics of the Nuclisens HIV 1 QT Assay Used for Quantitation of Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA J Clin Micr 2003 41 164 173 140 A ROCHE NO MUNDO A F Hoffmann La Roche AG conhecida simplesmente por Roche uma empresa internacional que se dedica saude do homem Foi fundada em 1896 em Basil ia na Su ca por Fritz Hoffmann 1868 1920 juntamente com sua esposa Adele La Roche que notaram entre a classe m dica e a popula o uma necessidade crescente de medicamentos de alta qualidade com n veis constantes de efic cia terap utica e excelente confiabilidade A ROCHE NO BRASIL No Brasil a Roche iniciou suas operac es em 14 de marco de 1931 Inicialmente contava com 17 funcion rios instalados em um pr dio de 250 m2 no centro do Rio de Janeiro Desde ent o a empresa cresceu imensamente em n mero de funcion rios instala es neg cios e investimentos no pa s aumentando sensivelmente sua participa o no cotidiano brasileiro Como em outros pa ses do mundo a Roche no Brasil est dividida em 3 unidades de neg cio Farmac utica Roche Consumer Health e Diagn stica A DIVIS O DIAGN STICA Em seus centros de pesquisa e de produ o na Su a Alemanha ustria e nos Estados Unidos a Roche desenvolve e produz sistemas de diagn stico laboratorial que s o comercializados por suas afiliadas em cerca de 40 pa ses Estes sis
39. Cancele a operacao deletar 8013 Velocidade do vortex O Chame a assist ncia t cnica 8014 Par metro digitado tem Foi escolhido um nome de sintaxe incorreta arquivo inv lido Escolha um correto 8015 a 8018 Erro de software Chame a assist ncia t cnica est na revis o errada est gio anterior existe est gio anterior 8023 Vari veis do conjunto de Chame a assist ncia t cnica par metros n o v lidos 8024 Par metros n o v lidos Chame a assist ncia t cnica 137 C DIGO DE ERROS BIOM RIEUX 8026 8027 8028 8029 a 8038 8039 8040 8041 a 8045 8046 8047 8048 8049 8050 8051 8052 a 8054 9001 9057 11011 CAUSAS PROCEDIMENTOS par metros do ensaio atual existem p de correr o teste iniciar corrida Tubo inicial deve ser maior que O R plica maior que Confira todas as duplicatas n mero total ou tubos processados Erro de Software Chame a assist ncia t cnica N mero total de tubos Coloque os tubos no processados menor que carrossel dois Vendo o primeiro conjunto Aguarde voc fez uma op o de dados dispon veis N o inv lida existem mais dados anteriores Vendo o ltimo conjunto de Aguarde voc fez uma op o dados dispon veis N o inv lida existem mais dados Relat rio n o p de ser Verifique os cabos de liga o impresso Verifique a ou se os equipamentos est o impressora ligados N o pode ver dad
40. Deve ser feito de 2 a 30 Conserva o Em Geladeira 4 a 89C 2 2 Kit de Isolamento Embalagem e Conte do 05 unidades de microtubos contendo s lica tampa transparente Kit Manual e Automatizado 05 unidades de microtubos contendo tamp o de elui o tampa branca Kit Manual 05 unidades de frascos transparentes contendo tamp o de lavagem no Kit Manual 01 garrafa de 450 mL contendo tamp o de lavagem Kit Automatizado 05 unidades de frascos de 60 mL contendo tamp o de elui o Kit Automatizado Transporte Deve ser feito de 29C a 30 Conserva o o Kit manual deve ser conservado em 20 C visto que em um tempo prolongado de armazenagem a 8 C poderia ocorrer 85 B ID I E U X contamina o ao tamp o de elui o que n o cont m nenhum conservante Por outro lado o Kit Automatizado pode ser armazenado de 29C a 309C pois este possui conservante para o tamp o de lavagem impedindo sua contamina o 2 3 Kit de Amplifica o HIV 1 QT IS NS lool Sans 0164 To be used in conjunction with NucliSens 1 QT Isolation and Detection reagents dade ren in 50 tests for the quantitative determination wa ES of HIV 1 RNA in human plasma and serum 6105 md divent For in vitro diagnostic use ite Store at lt 20 C Read accompanying instructions for uso Moy forc tyre by Ora lensa Embalagem
41. Manual n o necessitando de nenhum cuidado espec fico Quanto ao Tamp o de Elui o a nica diferen a est na sua apresenta o Ele se apresenta em um frasco de maior volume 60 mL no entanto tamb m n o ser necess rio nenhum cuidado espec fico Vale a pena lembrar que se o kit de Isolamento Automatizado for armazenado em temperatura de 2 a 8 C na geladeira ser necess rio colocar o tamp o de lavagem em Banho Maria a 37 por 30 minutos para retirar os poss veis cristais formados devido a sua composi o Tiocianato de Guanidina S 96 BICM IRIE U Equipamentos Termobloco aferido a 65 C 1 C termobloco aferido 41 0 5 C vortex pipeta P200 pipeta P20 banho Maria aferido a 419C 0 5 C sala 2 detec o estantes para microtubos Verificar a temperatura antes de usar Pelo menos uma vez por semana checar com mais de um term metro Se houver d vidas consultar a assessoria da bioM rieux Brasil S A e checar com um term metro digital REAGENTES Primers Enzimas e Diluentes A esfera liofilizada deve ser reconstitu da com 120uL do diluente do primer Levar imediatamente ao vortex e aguardar at a total dissolu o dos gr nulos Caso a esfera esteja quebrada reconstitua como prescrito Caso a esfera sofra altera es de cor ou tamanho contacte a empresa para troca da mesma ENZIMAS A esfera liofilizada deve ser reconstitu da com 55uL do di
42. NucliSens seja carregado no seu computador Todos os usu rios Seu computador pode estar configurado para entrada direta no sistema NASBA ou no sistema NUCLISENS Visualmente os dois sistemas s o muito parecidos assim confira sempre no canto superior esquerdo da tela se o seu computador se encontra no sistema desejado Para mudar de um sistema para outro quando a seguinte mensagem aparecer na tela 113 BIOM IR EUX Prime the instrument Escolha Em seguida aparecer a tela de LOGIN User Mame Para logar clique no campo User Password name nome do usu rio e escolha um nome da lista de usu rios e pressione Enter Digite Password senha associado ao m usu rio Agora clique no bot o LOGIN Em seguida no menu ROTINE clique na op o EXIT TO DOS Na tela que aparece digite o nome do programa que voc deseja trabalhar por exemplo nuclisens OS PROCEDIMENTOS RESUMIDOS ABAIXO EST O DESCRITOS DE FORMA COMPLETA NO MANUAL DO USU RIO SE O DE PROCEDIMENTOS B SICOS DE OPERA O Quando o computador for ligado a seguinte mensagem aparecer Prime the instrument Escolha 114 B ID I R I E U X Em seguida aparecer a tela de LOGIN User ane ci Para logar clique no campo User Password name nome do usu rio e escolha pressione Enter Digite um nome da lista de usu r
43. Preparar uma solu o de hipoclorito de s dio com concentra o final de 0 2 semanalmente Verifique o teor de cloro ativo do hipoclorito de s dio Ex diluir 100 mL de hipoclorito comercial 2 em 900 mL de gua destilada dissolvendo os cristais totalmente antes do USO ATEN O Utilizar reagente de limpeza apropriado para laborat rio de biologia molecular para limpeza de vidraria 2 Verificar o rings nas placas de ensaio Verifique os o rings das placas de ensaio Os o rings prendem as tiras de po os de captura na placa AA A LL AA Tee o GS x r gt den 5 gt J e td ei ma E i 2 E A A 61 e Bayer HealthCare 3 CLEAN SYSTEM Partindo do MAIN MENU Malin Menu 1421 Event 100 Sy Lom amiga E sqruica File Management Sistem Pause gt Selecione System Management Management Hetricve Data bate and Time Perfarmance Checks Maintenance system information Beeper option Selecione Maintenance Malnienanre Clean 5ysten Eject Plates pash Aca WReaid wanh Chango Syringe Hatitonanea Log Selecione Clean System Complete os frascos A B H2O e hipoclorito do m dulo de fluidos com a solu o de limpeza 0 2 9o rec m preparada Selecione START O equipamento efetuar a desinfec o de toda a tubula o Ap s esta a o Enx g e os frascos A 20 com gua d
44. QS fora da sequ ncia Nenhum valor ser calculado repetir todo procedimento extra o de amostras e controles amplifica o e detec o Se uma corrida for inv lida repetir todo procedimento extra o amplifica o e detec o O Cobas Amplicor resultados de Asso junto com o valor do n mero de c pias para amostras e controles O valor de Asso para as dilui es seriadas do alvo e do QS devem seguir um valor de decr scimo com aumento do fator de dilui o exceto para valores Asso de dilui es que ultrapassam o intervalo linear do teste amostras com altos t tulos ou para dilui es ou valores pr ximos da leitura de fundo amostras com baixos t tulos Dilui es do Amplicon HIV 1 Dilui es do Amplicon HIV 1 1 2 1 9 3 1 81 4 1 729 Os valores da dilui o da absorb ncia devem diminuir com a dilui o seriada com valor mais alto na primeira dilui o pura e mais baixo na ltima 1 729 Se os valores A660 do HIV 1 n o est o em sequ ncia uma mensagem de erro OD SEQUENCE aparecer para amostras ou controles 201 Coment rio INTERPRETA O QS INVALID Os valores de absorb ncia do QS est o fora do intervalo O valor de para o controle negativo est fora do NC INVALID intervalo aceit vel O valor para o controle positivo baixo est fora do L LPC INVALID intervalo aceit vel O valor para o controle positivo alto est fora do HPC INVALID intervalo aceit vel Indica um valo
45. UL p amis C cmmantz ep Selo Versi n d HealthCare 72 Bayer HealthCare QUANTIPLEX TV HIT RASO Assay ib DNA Sofumara Version 4 01 Data Filo hitna OHS Colciod 121401 11 04 Loft Tras ID List Flo his 121220 Fatlent Spacimons Comenta Log Lar aa AL S l _ GLIANTIPL EX Log Data Filo hrebeina Colloctod 1224564 11 04 IB List File hnd21220 Event Loc dzBec 15 03 Test RHA 3 0 12 01 15 03 Calibrator Resulba PL comt 1050787 L Allenualed IRL count Q EMA Nereallenua ed dark count 145 r dark cera lt 135 k Alenuation lacior adustment factor 095 12Decb1 1514 Step Lond 12Dec 01 15 04 Siep Timeo 120 ec0 15 05 Timeout T2Derir 1605 Step Incubate 12001 18 24 Datomatic fluid system rinse 12011 22 25 fluid system rinse 13501 02 25 Automatic fluid system se 130001 06 38 Automatic Bui system rinse 13Dart1 07 31 Cooldown cycle activales 13Dsc 1 07 44 Cacldewn cycle complete l3Decod 07 44 Step Wait 1 1 07 48 Step Wait 130 01 07 48 Siep jTabDecbe1 07 48 step Primas i3Decn 07 49 Sep Timecud 150ec01 07 48 Wash 1iDec 1 07 49 step Prima 13Dec01 07 69 Step 13 1 07 50 Step Timeout Cect 07 50 Step Lond T3Dec M 07 63 13 01 07 53 Slep Timen
46. apresenta um atividade simultaneamente de transcri o reversa e de polimerase do DNA Isto permite que a transcri o reversa e a amplifica o por PCR ocorram na mesma mistura de rea o 145 As amostras processadas s o adicionadas mistura de amplifica o em tubos de amplifica o tubos A nos quais ocorrem a transcri o reversa e a amplifica o por PCR O iniciador jusante ou antisense SKCC1B e o iniciador a montante ou sense SK145 s o biotinilados nas extremidades 5 A rea o aquecida para permitir que o iniciador jusante se ligue especificamente ao RNA alvo do HIV 1 e ao RNA do Padr o de Quantifica o do HIV 1 Na presen a de e de trifosfatos de desoxinucle sidos em excesso dNTPs incluindo trifosfatos de desoxiadenosina desoxiguanosina desoxicitidina e desoxiuridina e desoxitimidina a rTth pol alonga o iniciador ligado formando uma cadeia de DNA cDNA complementar ao RNA alvo Amplifica o do Alvo Ap s a transcri o reversa do RNA do HIV 1 alvo e do Padr o de Quantifica o do RNA do HIV 1 a mistura de rea o aquecida para desnaturar o h brido RNA cDNA e exp r as sequ ncias alvo do iniciador medida que a mistura aquece o iniciador a montante SK145 liga se especificamente cadeia de cDNA a rTth pol alonga o iniciador e ocorre a sintese de uma segunda cadeia de DNA Isto completa o primeiro ciclo de PCR dando origem a uma c pia de DNA de dupla cadeia da regi
47. assessor cient fico A partir de ent o o especialista presta ao cliente todo o suporte necess rio que o mesmo necessita 10 Refer ncias bibliogr ficas Bula do kit Cobas Amplicor HIV 1 Monitor v1 5 Saiki R K Gelfand D H Stoffel S et al 1988 Primer directed enzymatic amplification of DNA polymerase Science 239 487 491 Mullis K B Faloona F A 1987 Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction Methods in Enzymology 155 335 350 Myers T W and Gelfand D H 1991 Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus Dna polymerase Biochemistry 30 7661 7666 Longo M C Berninger M S Hartley J L 1990 Use of uracil DNA glycosylase to control carry over contamination in polymerase chain reactions Gene 93 125 128 229
48. cio a operac o Quando o computador acabar de circular gua por sua tubula o emitir um som e pedir que os tubos sejam colocados no ar Para dar in cio operac o com os tubos j no ar aperte qualquer tecla Quando o computador acabar de circular ar nos tubos aparecer a seguinte mensagem na tela APERTE A TECLA ESC SAIA DO SISTEMA NUCLISENS CONFIRME SUA SAIDA DESLIGUE O LEITOR E DEPOIS O COMPUTADOR 126 BIOM I R I E U X Para sair do sistema NucliSens selecione o menu ROUTINE clique em Quit e clique na opcao EXIT TO DOS FA A SEMPRE O SHUTDOWN ANTES DE DESLIGAR O EQUIPAMENTO Procedimentos Necess rios para Manuten o do READER NucliSens O seu aparelho foi devidamente calibrado por um de nossos t cnicos mesmo assim ele precisa de cuidados especiais para manter esta calibra o PROCEDIMENTOS DE MANUTEN O DO READER NUCLISENS 1 O equipamento deve ser desligado sempre ap s a sua utiliza o nunca esquecendo de se realizar o Shut down 2 Ao se ligar o equipamento para uma nova detec o deve se realizar o procedimento de prime e check flow rate 3 Uma vez por semana o laborat rio deve proceder com o teste de Backflush Shut down di rio sempre ap s ler a rotina 1 Retirar as tubula es do Assay Buffer e do Cleaning Solution e colac las em gua destilada e iniciar o Shut down dentro do menu instrument 2 Ap s o leitor circular gua pel
49. colorido cuja absorb ncia medida pelo Analisador COBAS AMPLICOR a um comprimento de onda de 660 nm Ilustra o da Metodologia do Teste Cobas Amplicor HIV 1 Monitor v1 5 Sequ ncia alvo 3 Primer Biotina Figura 3 Etapa 1 Transcri o Reversa Primer biotinilado liga se sequ ncia RNA alvo Sequ ncia RNA alvo 3 5 Biotina rTth DNA Polymerase mer Figura 4 Etapa 2 Transcrigao Reversa rTth DNA polimerase catalisa extensao do primer pela incorpora o dos nucleotideos complementares Sequ ncia RNA alvo 148 Diagnostics Z gt Figura 5 Etapa 3 Final da transcri o reversa resulta na s ntese do D complementar cDNA da seq ncia do RNA alvo Sequ ncia RNA alvo d k E aa 1 i FT 1 5 1 m d i 1 WM FA F1 F1 P1 RE ww e k E k P 3 F k ww A WX ET E Th m Biotin cDNA Figura 6 PCR Etapa 1 Desnatura o por aquecimento Biotina Primer Biotina Figura 7 PCR Etapa 2 O primer liga se ao cDNA Biotina Primer rTth DNA Polimerase j Biotina 149 Diagnostics Figura 8 PCR Etapa 3 ArTth DNA Polimerase catalisa a extensao do primer Amplicon Biotina Biotina cDNA Figura 9 Fina
50. da amostra parte frontal acima da primeira posi o do carrossel Consulte o Manual No menu Instrument escolha a op o Advanced e depois Backflush O equipamento ir a aspirar reversamente a gua come ando pelo esgoto e descartando na agulha frontal Repetir o processo tr s vezes e encerrar o teste Quando terminar esse teste proceda novamente o check flow rate e corrija caso necess rio 128 BICM IRIE U X PLANILHA PARA MANUTEN O DIARIA DO NUCLISENS READER DATA FLOW BACK SHUT OPERADOR OBSERVA ES RATE FLUSH DOWN 129 D R IE U X 7 Procedimentos B sicos de An lise e Interpretacao de Resultados Interpretacao dos Resultados do NucliSens HIV I QT Como todos n s sabemos 3 calibradores em concentra es conhecidas s o adicionados cada tubo de rea o Na folha de resultados os sinais de eletroquimioluminesc ncia referentes amostra WT e aos calibradores Qa Qb e Qc s o representados na coluna SIGNAL Para sabermos se a rea o atingiu uma efici ncia m nima satisfat ria devemos somar todos os valores da coluna SIGNAL de uma determinada amostra O valor da soma corresponde ao valor de ECL TOTAL para aquela amostra e pode ser comparado com uma pizza inteira Esta pizza pode ser divida em 4 fatias de tamanhos diferentes onde cada fatia corresponde ao sinal de ECL da amostra WT e de cada um dos calibradores Qa Qb e Qc respectivam
51. de Atendimento Diagn stico CAD Telefones 0800 129633 0800 7704004 11 5694 5621 11 5694 5963 www bayer com br ds Endereco Rua Domingos Jorge 1100 Sao Paulo SP Brasil CEP 04779 900 10 Refer ncias Bibliogr ficas 1 Collins ML Irvine B Tyner D et al A branched DNA signal amplification assay for quantification of nucleic acid targets below 100 molecule mL Nucleic Acids Res 1997 25 2979 84 2 Kern D Collins M Fultz T et al An enhanced sensitivity branched DNA assay for quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma J Clin Micro 1996 34 3196 3202 3 Cao Y Ho DD Todd J et al Clinical evaluation of branched DNA signal amplification for quantifying HIV type 1 in human plasma AIDS Res Hum Retroviruses 1995 11 353 61 4 Iuliano R Forastieri G Brizzi M et al HIV plasma viral load detection by branched DNA signal amplification New Microbiol 1995 18 299 301 5 Operator s Manual Bayer System 340 bDNA Analyzer and Data Management Software Rev A 2003 09 78 BICM IRIE U A bioM rieux completou em 2003 40 anos de atividades especializadas na rea do diagn stico in vitro desenvolvendo produzindo e comercializando produtos aplic veis nos segmentos cl nico e industrial Com mais de 5 300 colaboradores presentes em mais de 130 pa ses incluindo o Brasil onde iniciou suas atividades em 1966 Segmento Cl nico Diagn stico de doen as infecciosas como HIV Hepat
52. de Biosseguran a FIOCRUZ 2000 Manual de Biosseguran a do Minist rio da Sa de Coordena o Nacional de DST e Aids Manual de Carga Viral do Minist rio da Sa de Secretaria de Pol tica de Sa de Coordena o Nacional de DST e Aids 1999 The cell ver autor Bio tica Biorrisco Silvio Valle 29 HealthCare Grupo Bayer Fundada em 1863 na Alemanha e presente no Brasil desde 1896 a Bayer consolidou se como uma das mais importantes e respeitadas ind strias internacionais oferecendo ao mercado uma ampla gama de produtos e servi os que abrangem os campos da sa de alimenta o agricultura e materiais inovadores pol meros Possui atividades nos cinco continentes com mais de 350 empresas e representa es e cerca de 115 400 colaboradores 2 700 s no Brasil A Bayer Health Care Produtos Diagn sticos atua com destaque neste segmento ofertando testes confi veis e precisos nas reas de Quimica Clinica Hematologia Hemostasia Uroan lise Imunologia Sorologia e principalmente Biologia Molecular com as t cnicas de LIPA line in probe Assays usado na genotipagem do v rus da Hepatite C TMA amplificacao mediada por transcri o usado na detec o da presen a do RNA do virus da Hepatite C e a metodologia bDNA branched DNA teste de Carga Viral empregado na quantifica o dos v rus HIV HCV e HBV Recentemente a Bayer adquiriu tamb m a empresa Visible Genetics e passou a ofere
53. de RNA 11 Conceitos B sicos O HIV O HIV pertence fam lia Retroviridae g nero dos Lentivirus Estrutura viral e gen mica O HIV possui forma esf rica tem aproximadamente 110nm de di metro e a estrutura da part cula viral infectante tamb m chamada de v rion est esquematizada na figura abaixo nela voc observa o cido ribonucl ico RNA o envelope e as prote nas estruturais de uma part cula viral E M LC PE Up env surface Glycoprotein SU gp 120 env Transmembrane Glycoprotein IM 2 gp41 gag 2 Membrane Associated Matrix Protein MA p17 J ga Capsid CA Core Shell p24 RNA 2 molecules pol Protease PR p mersase RT amp RNAse H RNH p s Integrase IN p32 Na figura podem ser observadas as prote nas estruturais que s o codificadas pelos genes gag env e pol O gene gag codifica as prote nas do caps deo viral p24 e p17 o gene env as glicoprote nas contidas no envelope do virus 41 e gp120 e gene pol codifica as enzimas transcriptase reversa integrase e protease Os n meros das prote nas e glicoprote nas indicam seus pesos moleculares O HIV apresenta genoma dipl ide duas mol culas de RNA de fita simples de polaridade positiva de 9 8Kb covalentemente ligadas dentro de um nucleocaps deo prot ico em formato de cone circundado por um envelope lipoprot ico onde se encontram ancoradas as glicoprote nas O genoma j foi tod
54. de dupla h lice reestrutura o A reestrutura o do DNA usada para estimar o tamanho n de nucleot deos do genoma de um organismo Um genoma grande leva mais tempo para se reestruturar do que um pequeno Um DNA de cadeia nica pode tamb m se reestruturar com um RNA complementar resultando em uma mol cula h brida onde h uma cadeia de DNA e outra de RNA A hibridiza o molecular um m todo para caracterizar RNAs pois uma mol cula de RNA se combina somente com a do DNA da qual foi transcrita RNA A estrutura do RNA semelhante do DNA exceto pela substitui o da ribose e da uracila Os nucleot deos do RNA tamb m s o formados por a car uma base nitrogenada e cido fosf rico O a car do RNA a ribose e as bases sao citosina uracila adenina e guanina As tr s classes principais de RNA s o RNA mensageiro RNA de transfer ncia e RNA riboss mico Cada um consiste de uma fita nica de ribonucleot deos e possuem um peso molecular uma sequ ncia nucleot dica e uma fun o biol gica caracter stica RNA mensageiro RNAm funciona como molde usado pelos ribossomos para a tradu o da informa o gen tica na sequ ncia de amino cidos das prote nas A sequ ncia de nucleot deos do RNAm complementar mensagem gen tica contida em um segmento especifico da fita molde de DNA RNA de transfer ncia RNAt identificam e transportam os amino cidos at os ribossomos Est o implicados na
55. de reagente especifico esta vazio 06 8 Problemas Causas e Solu es na Realiza o dos Testes c digos de erro do equipamento Lista de Problemas e Soluc es do Cobas Amplicor Objetivos Identificar problemas erros ou mensagens no Analisador Cobas Amplicor determinar as prov veis causas dos problemas erros ou mensagens realizar a es corretivas adequadas OBS As mensagens marcadas com fundo amarelo referem se aos problemas mais frequentes atendidos na CARD 207 MENSAGENS DO ANALISADOR POR COMPONENTE OU FUN O A cmliBcscs do Atma Em Verificar a identifica o do A A ring already cycled un 9 ring e se as amostras foram quest o ja foi realizada Verificar usando o menu TC QC e se necess rio contactar a CARD O A ring que est sendo Verificar a identificacao do A A ring not cycled colocado no sistema p ring ou realizar a amplificacao detec o n o foi amplificado do mesmo A ring amplification O perfil do TC est fora da error especifica o A ring on DP pos has not been cycled to continue push lt START gt twice Verificar a identifica o do A ring Se a amplifica o n o for necess ria Pressionar lt START gt duas vezes O A ring que est sendo colocado no DP do sistema n o foi amplificado A identifica o do n mero do I Verificar a identifica o do A Duplicate number A ring foi previamente usada o no sistema 9 Load A rings int
56. deixar o sistema prosseguir com a incuba o overnight NOTA A incuba o leva de 16 a 18 horas n o devendo exceder 18 horas para continuar o procedimento 45 2 T HealthCare SALA 2 SEGUNDO DIA N O PRESSIONE O BOT O START AT QUE AS SEGUINTES ATIVIDADES TIVEREM SIDO COMPLETADAS Usando luvas limpe todas as pipetas e a rea de trabalho com lcool et lico 70 gt Transfira o conte do de cada tamp o de lavagem A amp B para os respectivos recipientes no m dulo de fluidos do System 340 de acordo com a tabela Po os de Amostras Tamp o captura Lavagem A Lavagem B Remova da Caixa 1 do Kit na geladeira Diluente Pr amplificador Amplificador nico Sulfato Dextran Aqueca o Diluente Pr Amplificador Amplificador Sulfato Dextran em banho maria a 379C por no m nimo 10 minutos Sonda pr amplificadora manter temperatura ambiente Prepare o Diluente de Trabalho Pr Amplificador Amplificador em um tubo de polipropileno de 50 mL de acordo com a tabela Pocos de Captura Amostras Diluente Sulfato de Pre Amplif Dextran 46 2 d HealthCare Nota Devido a alta viscosidade do Sulfato de Dextran a pipetagem deve ser feita devagar e cuidadosamente podendo ser utilizado repipetador com combtips livre de Dnase e Rnase descart veis Tampe o tubo e inverta 10 vezes e passe para o Vortex por no m nimo 20 segundos Coloque no banho 379C e deixe a
57. e Conte do 05 unidades de microtubos contendo Diluente do Primer tampa azul 05 unidades de microtubos contendo Diluente das Enzimas tampa vermelha 05 unidades de microtubos contendo Primer Sachet prateado contendo um microtubo de tampa azul Possui uma esfera liofolizada 05 unidades de microtubos contendo Enzimas Sachet prateado contendo um microtubo de tampa vermelha Possui uma esfera liofolizada 05 unidades de microtubos contendo Calibradores Sachet prateado contendo um microtubo de tampa amarela Possui uma esfera liofolizada Usado na etapa de Isolamento Transporte 2 C a 30 C Conserva o 2 C a 8 C 86 BIOCM IRIE U X 2 4 Kit de Detec o HIV 1 QT NUCL SE NS Detection reagents ASA DIA DP CG STIK FE T Wa 1 48 Banc rugs Taaa sbam bein a e ag ind om Embalagem e Conte do 01 unidade de microtubo contendo Sonda WT tampa branca 01 unidade de microtubo contendo Sonda Qa tampa vermelha 01 unidade de microtubo contendo Sonda Qb tampa amarela 01 unidade de microtubo contendo Sonda Qc tampa azul 02 unidades de microtubos contendo Oligop rolas tampa rosa 01 unidade de microtubo contendo Solu o de Refer ncia RS tampa branca 02 frascos contendo Diluente de Detec o Transporte 2 C a 30 C Conservagao 2 C a 8 C 2 5 Equipamento Extractor O Extractor realiza a extra o semi automatizada dos cidos nucl icos Possui um comple
58. load da rack de detec o reagentes espec ficos Fazer o load de N o foi feito o oad do cassetes de Substrato Substrato suficientes para a corrida Fazer o load de cassetes de Conjugado suficientes para a corrida Fazer o oad de cassetes de Solu o de Desnatura o suficientes para a corrida Host interface I T X 366 initialized VE HH O sistema esta iniciando Bip Impress necessaria O sistema est se preparando para realizar Iniciar o loadcheck o loadcheck Thermal cycler O sistema abortou a 368 aborted opera o de um Contactar a CARD Bip Impress termociclador 369 Close DP and TC Ocorre durante in cio de Fechar as tampas Bip Tela covers and start opera o normal Pressionar START P Foi feito o load do A ring Criar a lista de trabalho mas a ordem nao foi do A ring criada Fazer o load do A ring Bip Tela Load inconsistency N o foi feito o load do n no generic reagent da rack de reagentes rack in loadlist gen ricos Bip Tela N o foi feito o load do n da rack de reagentes espec ficos Load inconsistency reagent not loaded Bip Tela Load inconsistency Sub reagent not loaded Bip Tela Load inconsistency N o foi feito o oad do Con reagent not Conjugado loaded Bip Tela Load inconsistency DN reagent not loaded N o foi feito o load da Solu o de Desnatura o Bip Tela Check instrument 367 Bip Tela and start
59. minutos Centrifugar rapidamente ap s a incuba o dar um spin e em at no m ximo 5 min levar os microtubos para o banho Maria a 41 C na sala de deteccao Incubar no banho Maria 90min No caso de se fazer a detec o logo em seguida amplifica o aproveitar para ligar o equipamento na seguinte ordem estabilizador leitor impressora monitor Cpu OBS EQUIPAMENTO DEVE SER LIGADO 2HS ANTES DE SER USADO 10 Proceder para a detec o imediatamente ou armazenar o produto amplificado a 20 NO CASO DE ARMAZENAMENTO DOS MICROTUBOS A 20 C OU A 70 C COM MATERIAL AMPLIFICADO PROCEDER COM A DETEC O SOMENTE ATE 1 MES Nessa fase a t cnica pode ser interrompida Chegamos ao final da amplifica o dos cidos nucl icos 99 BICM IRIE U X SALA 2 rea de Amplificac o e Leitura dos Resultados Cs pr EQUIPAMENTOS Pipeta P1000 pipeta P200 pipeta P20 banho Maria aferido a 419C 0 5 C estantes para microtubos Verificar a temperatura antes de usar Pelo menos uma vez por semana checar com mais de um term metro Se houver d vidas consultar a assessoria da bioM rieux Brasil S A e checar com um term metro digital REAGENTES Sondas Oligop rolas Diluente de Detec o e Solu o de Refer ncia RS gua para o equipamento SONDAS E SOLUCAO DE REFER NCIA RS N o necessita ser preparado pois j v m pronto no kit N
60. minutos Misture por invers o o recipiente varias vezes antes do uso Remova a Sonda Marcada da Caixa 2 e descongele rapidamente em agua corrente e homogeneize bem Imediatamente retorne a Sonda Marcada nao utilizada ao freezer 709C No in cio do ciclo de resfriamento lavagem Amplificador Prepare o Reagente de Trabalho Marcador em um tubo de polipropileno de 15 mL conforme a tabela Amostras Label diluent Label probe Diluente Marcador Sonda Marcada e inverta o tubo por 10 vezes para homogeneizar Mantenha em temperatura ambiente para a espuma dissipar Descarte se nao for utilizar dentro de 30 minutos Quando as placas forem ejetadas imediatamente abra a porta Adicione 100 uL do Reagente de Trabalho Marcador utilizando uma pipeta multicanal de 12 Carregue a placa da esquerda primeiro da fileira A para H N o permita que o tempo de pipetagem exceda 04 minutos Feche a porta e pressione START O equipamento incubar as placas por 45 minutos Ap s a incuba o o equipamento automaticamente resfriara as placas a 349 Ce far as sequ ncias de lavagem Reagente de Trabalho Substrato No come o da Incuba o de Marca o remova da Caixa 1 o Substrato e o Substrate Enhancer do kit e coloque os na bancada para atingirem a temperatura ambiente 49 2 d HealthCare Nota O substrato susceptivel contamina o pela Fosfatase Alcalina Use luvas novas no manuseio deste
61. ncia amplifica o e adicionar 100 Manually denature alerta para que os A rings no uL do reagente de TCA e TCB sejam desnatura o em cada A desnaturados manualmente tube Realizar um prime no sistema limpar e secar o poste de inicia o Verificar 1 a presen a de bolhas no reservat rio 2 impedimento no mecanismo de transfer ncia 3 o n vel da solu o de lavagem O mecanismo de transfer ncia n o pode iniciar Transfer Transfer not initialized Mechanism Limpar o pegador de D cup Verificar 1 se h ac mulo de detritos ou umidade no pegador de D cup 2 se as conex es do pegador de D cup n o est o soltas ou quebradas Reiniciar o sistema para a retirada de D cups e adicionar novas racks de D TransFluid cmd exec error 225 Problemas no pegador de D cup A rack de reagente ou de D Verificar a posi o correta na cup est posicionada plataforma incorretamente na Recadastrar ou reposicionar plataforma de forma correta e reiniciar Verificar a integridade do D Defeito no D cup cup Verificar se falta D cup ou se Nenhum D cup presente h D cup preso no sistema Agulha est torta Inspecionar visualmente a agulha e trocar se necess rio 216 Verificar o n vel do tamp o de lavagem Limpar e secar o poste de inicia o Secar o excesso de tamp o de lavagem na agulha Verific
62. o alvo de RNA do HIV 1 e de RNA do Padr o de Quantifica o do HIV 1 A mistura de rea o novamente aquecida para separar a dupla cadeia de DNA resultante e exp r as sequ ncias alvo do iniciador A medida que a mistura aquece os iniciadores SK145 e SKCCIB ligam se ao DNA alvo A rTth pol na presen a de Mn e de dNTPs em excesso alonga os iniciadores ligados ao longo dos modelos alvo para produzir uma mol cula de DNA de dupla cadeia com 155 pares de bases denominada amplicon O analisador COBAS AMPLICOR repete automaticamente este processo durante um determinado n mero de ciclos cada um duplicando eficazmente a quantidade de DNA amplicon A amplifica o ocorre apenas na regido do genoma do HIV 1 que se encontra entre os iniciadores n o amplificado a totalidade do genoma do HIV 1 146 Rea o de Hibridizacao Ap s amplifica o por PCR o Analisador COBAS AMPLICOR acrescenta automaticamente a Solu o de Desnatura o aos tubos A e o amplicon do HIV 1 e o amplicon do Padr o de Quantifica o do HIV 1 s o desnaturados quimicamente para formar um DNA de cadeia simples Para se obterem resultados quantitativos ao longo de um grande limite din mico o Analisador COBAS AMPLICOR dilui em s rie o amplicon desnaturado em tubos de detec o tubos D Uma suspens o de part culas magn ticas revestidas por uma sonda oligonucleotidica espec fica para o amplicon do HIV 1 SKIO2 e para o amplicon do Padrao de Quantifica
63. o de lise contendo amostra Trocar a ponteira a cada pipetagem 2 Utilizando a pipeta P200 e uma ponteira de 200uL com filtro pipetar 5OuL de s lica em cada tubo de tamp o de lise contendo amostra e calibradores Agitar o tubo de s lica no vortex a cada tr s pipetagens Trocar a ponteira a cada pipetagem 3 Tampar bem os tubos contendo amostra calibradores e s lica e incubar por 10 minutos a temperatura ambiente agitando a cada 2 minutos por inversao Centrifugar os tubos por 5 min a aproximadamente 2500 rpm Abrir os tubos amostra por amostra retirar a espuma com uma pipeta de transfer ncia ou bomba de v cuo descartar a pipeta de transfer ncia ou ponteira da bomba Envolver a borda do tubo com uma gaze ou papel absorvente e descartar por inversao o sobrenadante em um recipiente apropriado Utilizar a gaze papel para limpar a borda do tubo Fechar o tubo Trocar a pipeta de transfer ncia ou ponteira da bomba a cada amostra Repetir o procedimento para cada amostra Esse procedimento evita que res duos na borda do tubo entrem em contato com as luvas contaminando as TUR 94 BICOCM IRIE U X 6 Abrir um tubo de amostra silica de cada vez e utilizando a pipeta P1000 e uma ponteira de 1000uL com filtro adicionar do tamp o de lavagem Fechar o tubo 7 Repetir o procedimento para o restante das amostras Trocar a ponteira a cada pipetagem 8 Ressuspender totalmente a s lica no tamp o de lavagem
64. o deve de modo algum ser usado gelado S deve ser pipetado na hora da leitura N o pode ser colocado no banho maria Vortexar vigorosamente DILUENTE DE DETEC O Em microtubos numerados para a detec o pipetar a quantidade de diluente de acordo com a dilui o especificada na caixa do Kit O volume do diluente a ser usado na dilui o vari vel de lote para lote e deve ser feita conforme a indica o na caixa do kit Caso ocorra problemas relacionados com a dilui o das amostras ou seja mensagem de erro ou aviso detectar novamente com outro fator de dilui o isto significa que o fator de dilui o deve ser ajustado para otimizar a t cnica Utilize a f rmula que segue Novo fator de dilui o fator de dilui o atual x sinal de Qb 150000 100 BICM IRIE U INSUMOS Y Microtubos Y Tubos de polipropileno de 5mL 12x75mm Y Ponteiras de 1000uL com filtro Y Ponteiras de 200uL com filtro Y Ponteiras de 20uL com filtro Y Tubos de polipropileno tipo Falcon de 50mL Y Gaze ou papel absorvente cortado Y Descarte apropriado para as ponteiras Y Fita Crepe v Luvas Procedimento 1 Se voc estiver come ando a rea o a partir deste passo retirar o material amplificado do freezer a 20 C e deixar a temperatura ambiente 2 Prepara o das Solu es de Hibridiza o bem um dos tubos contendo oligop rolas tubo rosa nos dedos ou no vortex antes de usar
65. o reservat rio do tamp o de lavagem Esvaziar o esgoto Prime o instrumento Pressionar at aparecer na tela SY Dyag Pressionar lt 2 gt Device Check Pressionar lt 1 gt Prime Pressionar START para iniciar prime Quando completar Prime pressionar WU Q N vy Vv Vv Vv N 176 6 Extended Prime Desligar o equipamento Abrir o TCB Ligar o equipamento Pressionar at aparecer na tela SY Diag Pressionar 2 para selecionar Device Check Pressionar 1 para selecionar Prime Pressionar Extended prime Pressionar ESCAPE Fechar TCB para iniciar o prime O prime parar automaticamente Y V V YV V V V Y V V 7 Durante prime verifique seringas tubula o bloco de v lvula presen a de vazamento 8 Verificar Transfer tip agulha quanto a presen a de gota 9 Verificar se impressora est ligada B Preparo de Reagentes Pressionar LOAD at aparecer na tela L Rcass Pressionar NEXT at aparecer a rack desejada Pressionan PRINT para obter uma c pia da quantidade de reagentes de cada rack Preparar a quantidade necess ria para os testes a serem realizados Q N COBAS AMPLICOR Reagentes Especificos gt Probe Suspension 1 cassete 100 testes e Agitar bem PS1 no vortex e Transferir 2 5 mL da PS1 para o cassete de reagente contendo PS N O INVERTER N O AGITAR Verificar na bula a validade depois de preparado o reagente AD3 Diluente do Amplicon 1 cassete 75 testes Pronto p
66. por no m ximo 4 ciclos 12 horas por ciclo no instrumento e deve ser armazenado de 2 89C entre os ciclos Substrate SB3 Substrate SB 5 frascos 1 cassete 75 testes Pipetar 5 mL do SB no cassete contendo SB3 Para homogeneiza o utilize a pipeta aspirando e soltando a mistura 5 vezes O substrato de trabalho deve ser preparado todo dia O substrato pronto est vel por 16 horas N o expor SB3 e SB ou substrato preparado para uso a metais agentes oxidantes ou luz direta 167 D LOAD Cassetes de Reagentes na Rack e Pressionar LOAD at aparecer L Rcass Pressionar EDIT e Digitar o n mero da rack ou usar o leitor de c digo se barras e Pressionar ENTER e Colocar a posi o do cassete na rack com o leitor de c digo de barras ou teclado Se usar o teclado pressionar ENTER e Colocar o n mero de identifica o do cassete como o leitor de c digo de e barras ou teclado Se usar o teclado pressionar ENTER e Repetir as duas ltimas etapas para cada cassete adicionado na rack e Pressionar ESCAPE para salvar e bem os cassetes na rack E LOAD Racks de Reagentes na Plataforma e Pressionar LOAD at aparecer L Rack e Pressionar EDIT e Colocar o n mero de identifica o da rack com o leitor de c digo de barras ou teclado Se usar o teclado pressionar ENTER e Como leitor de c digo de barras escolher a posi o que a rack ser colocada Loc 1 Loc 2 ou generic e Pressio
67. recuperar a condensa o Agite no V rtex por 10 segundos Deixe resfriar por 10 minutos em temperatura ambiente Usando Luvas limpas transfira os Pocos de Captura para as placas met licas do System 340 Pressione firmemente com cuidado cada tira de pocos de captura e quebre a aba lateral Observe que a Placa Met lica est entalhada para ser fixada para esquerda Coloque as placas na bandeja de orienta o e mantenha coberta para evitar poss vel contamina o NOTA Use sempre tiras de po os pretos para ocupar as fileiras onde n o est o sendo realizados ensaios caso n o for executar nenhum teste na placa da direita preencha a mesma com po os pretos N o utilize tiras de po os quebrados 44 e HealthCare Usando luvas limpas coloque o filme selante em cada armacao pads Observe se o filme selante e o de silicone est o firmemente presos arma o Transfira 100 uL das amostras padr es e controles na placa conforme a lista de trabalho Complete a placa da fileira A a H Programe o System 340 para receber as placas Coloque as duas placas nas bandejas de incuba o Coloque a arma o pads sobre cada placa Feche a porta de acesso e pressione START gt O analisador automaticamente selar as placas e come ar a aquecer para a temperatura de incuba o overnight 529C Observe se o analisador mostra a mensagem System is Maintaining Temperature antes de
68. rios para todas detec es 5 D cups necess rios para Blank de Cassetes x 2 E Substrato 6 Total de D cups necess rios para uma corrida Legenda n mero 189 Tabela 2 Consumo de Reagente N mero adicionais de testes necess rios X Y Z 14 Denaturation Solution Z 100 Conjugate Z 100 Total do N mero de n mero de testes que testes por restam no corrida X Sistema Y N mero de cassetes necess rios para adicionar N mero de testes por Nome do Reagente cassete Substrate Target Probe Suspension IC Probe Suspension QS Probe Suspension Amplicon Dilution Reagent Opcional para testes Qualitativos Usado nos testes Quantitativos 45 o n mero desta coluna for menor que 1 um cassete de reagente deve ser adicionado ao sistema 190 Nome do Reagente Probe Suspension alvo espec fico Probe Suspension IC espec fico QS espec fico Substrate SB Conjugate CN Denaturation DN Amplicon Dilution Reagent Wash Buffer N mero de Testes 100 testes qualitativos 24 determina es quantitativas 100 testes qualitativos 48 determina es QS 24 determina es incluindo Alvo e QS 10 L da solu o de lavagem dilu da 1 10 250 testes Instru es de Preparo Agitar no Vortex Probe Suspension 1 Transferir 2 5 mL da Probe Suspension 1 no cassete Probe suspension 2 N o agitar Pipetar 5 mL do S
69. seg 10000 rpm na microcentrifuga 15 Repetir o item 11 16 Repetir os passos 12 13 e 14 substituindo o tamp o de lavagem pelo Etanol 70 17 Repetir a lavagem com etanol mais uma vez itens 15 e 16 18 Repetir os passos 11 12 13 e 14 substituindo o Etanol 70 por ACETONA 19 Amostra por amostra abrir o microtubo com o aux lio de uma gaze ou papel absorvente retirar todo o sobrenadante com uma Ppipeta de transfer ncia ou bomba de v cuo tomando cuidado para n o perder s lica se ficar mais do que 30uL de tamp o a elui o e ou a amplifica o podem ser inibidas Trocar a gaze papel absorvente e a pipeta de transfer ncia ou ponteira da bomba a cada amostra 20 Ap s retirar sobrenadante do ltimo microtubo colocar todos os microtubos abertos no termobloco por 10 min a 56 C O tempo ideal de 10 minutos Se ap s os 10 minutos a s lica n o estiver totalmente seca deixar a 56 C por mais 5 minutos Normalmente 10 minutos s o suficientes Cobrir os microtubos abertos com uma gaze ou papel absorvente 95 BIOCOM IRIE U X 21 Fechar os microtubos e verificar se a s lica secou completamente Dar umas batidinhas no fundo do microtubo o p de s lica deve se soltar da parede do microtubo 22 N 19637 as 1125 4 Io 601 J ls J 23 Amostra por amostra abrir o microtubo o auxilio de uma gaze ou papel absorvente Utilizando a pipeta P200 e uma ponteira de 200uL com filtro pipetar 5Ou
70. semanas a temperatura ambiente e Armazenar de 2 259C e 500 testes por kit 1 Encher o RESERVAT RIO gal o branco do tamp o de lavagem diluindo o Wash Buffer seguindo tabela abaixo Wash 10X I Agua Destilada Volume Total concentrado 164 2 Esvaziar o ESGOTO gal o amarelo 3 Limpar a TORRE de inicializa o com uma gaze umedecida com agua 4 Limpar o PEGADOR de D cup com uma gaze umedecida com agua tomando o cuidado de n o enroscar a gaze na molinha 5 Realizar um EXTENDED Prime e Aparelho desligado e Abrir o TCB e Ligar o aparelho e Pressionar SYSTEM at aparecer DEVICE CHECK e Pressionar 2 e Pressionar 1 PRIME e Pressionar STEP EXTENDED PRIME e Pressionar ESCAPE e Fechar TCB 6 Durante prime verifique SERINGAS TUBULACAO BLOCO CE V LVULAS 7 Verificar TRANSFER TIP agulha 8 Verificar se a IMPRESSORA est ligada c Preparo dos reagentes Verificar a quantidade necess ria para os testes a serem realizados procedendo da seguinte maneira e Pressionar LOAD at aparecer na tela L Rcass e Pressionar NEXT at aparecer a rack desejada e Pressionar PRINT para obter uma c pia da quantidade da reagentes de cada rack 165 c1 Preparar Reagentes Espec ficos gt IM Probe Suspension 1 cassete 100 testes e Agitar bem IM PS1 no vortex e Misturar bem no vortex IM PS1 transferir 2 5 mL da IM PS1 para um cassete de reagente contendo IM4 v1 5 N O INVERTER N O AGITAR U
71. tradu o das palavras do c digo gen tico do RNAm na seq ncia trinucleot dica espec fica chamada de antic don que complementar a um c don seq ncia trinucleot dica do RNAm que codifica um amino cido espec fico RNA riboss mico RNAr s o os principais componentes dos ribossomos servem de suporte molecular para as rea es qu micas da montagem de polipept deos Apesar da mol cula de RNA possuir uma nica cadeia de polinucleot deo o RNA n o uma estrutura linear simples e lisa As mol culas de RNA possuem extensas regi es de complementa o nas quais as pontes de hidrog nio entre os pares de bases AU e GC s o formadas unindo diferentes por es da mesma mol cula Como resultado disso a mol cula dobra se sobre si mesma formando estruturas denominadas alcas Replicacao do DNA Toda c lula ao se dividir tem seu conte do de DNA duplicado na integra transmitindo assim todas as caracter sticas gen ticas A esse processo chamamos replica o Ela ocorre de maneira semiconservativa porque quando as duas fitas originais sao separadas cada uma vai servir de molde para a constru o de uma fita nova A fita c pia sintetizada pela a o catalisadora da DNA polimerase III enzima que utiliza como molde cadeia precursora e incorpora os nucleot deos de forma seq encial na nova cadeia produzindo a de acordo com a lei de pareamento das bases Como essa polimerase sintetiza DNA na dire o de
72. 2 Ap s os 30 min retirar a estante do banho maria remover a fita adesiva Cuidado A cola da fita crepe pode ficar na borda dos tubos de hibridiza o 13 Prepara o da SOLU O DE REFER NCIA RS 14 Agitar vigorosamente o tubo contendo a Solu o de Refer ncia Utilizando a pipeta P1000 e uma ponteira de 1000ul com filtro pipetar 250uL Solu o de Refer ncia do kit em um tubo novo de 12x75mm de polipropileno identificado como RS O RS n o pode ser incubado 15 Aliquotar em um tubo de polipropileno tipo Falcon de 50mL aproximadamente 13mL de Assay Buffer O Assay Buffer Tampao do Teste deve ser retirado do mesmo frasco que est sendo utilizado no aparelho 16 Utilizando uma pipeta P1000 e uma ponteira de 1000uL com filtro pipetar 300uL do Tampao de Teste Assay Buffer em todos os tubos de amostra Se n o encostar nas paredes dos tubos pode se usar a mesma ponteira S utilizar a mesma ponteira se tiver total seguranga Caso o laborat rio possua um repipetador este poder ser utilizado desde que as ponteiras utilizadas sejam livres de RNAses e DNAses 17 0 tubo AN tamb m deve receber 300ul de tamp o N o pipetar tamp o no tubo RS 18 Colocar todos os tubos no carrossel do aparelho sendo que no n 1 ficar o tubo RS e no n mero 2 ficar o tubo AN Do n mero 3 em diante ficaram os quatro tubos de cada amostra em sequ ncia totalizando 42 tubos no carrossel Por exemplo 103 BIOM IRIE U X
73. 5 4 H RNA Z IR CA H HEN H Adenina A Cuanina DNA O DNA contem as informag es necess rias para manter a hereditariedade das c lulas vivas Em 1953 baseados nos dados de difra o de raios X de Wilkins e Franklin Watson e Crick propuseram um modelo de estrutura do DNA que explicava a regularidade da sua composi o de bases e suas propriedades biol gicas particularmente sua duplica o na c lula Quanto a sua estrutura a mol cula de DNA constitu da por duas cadeias helicoidais de polinucleot deos com giro para a direita formando uma h lice dupla em torno de um mesmo eixo central Cada cadeia constitu da por res duos do a car desoxirribose unidos por liga es di sterfosfato atrav s de seus carbonos 3 e 5 Uma base nitrogenada encontra se unida ao carbono 1 de cada res duo do a car As duas fitas s o antiparalelas mostrando que suas liga es fosfodi ster 3 5 correm em dire es opostas As bases est o empilhadas dentro da h lice em um plano perpendicular ao seu eixo A car e Fosfato DNA lt E ai zt m Bases Nitrogenadas As bases nitrogenadas que comp em o DNA s o guanina timidina citosina e adenina As duas cadeias polinucleot dicas mantem se unidas atrav s de pontes de hidrog nio que se estabelecem entre pares de bases especificas adenina com timidina e citosina com guanina Desde que exista uma dist ncia fixa entre as duas mol culas de a
74. 993 Dentre as mais importantes aplica es da PCR est o a arqueologia medicina forense testes de paternidade gen tica pesquisa biol gica e diagn stico cl nico Nos diagn sticos cl nicos os cientistas podem extrair o material gen tico de uma amostra pesando apenas um trilhon simo de um grama copiar sua sequ ncia gen tica muitas e muitas vezes e obter material suficiente para detectar a presen a de um v rus espec fico bact ria ou material gen tico que sofreu muta o Esse processo de amplifica o permite ao laboratorista detectar a presen a de virus e bact rias no plasma ou em outros fluidos do paciente e em alguns casos medir a carga viral quantificar do agente patog nico Os testes baseados na t cnica da PCR consistem basicamente de 3 etapas 1 Extra o na etapa da extra o ocorre a quebra da capa proteica viral e exposi o do material gen tico 142 2 Amplifica o durante a etapa de amplifica o o material gen tico extra do amplificado dando origem a bilh es de c pias id nticas ao original 3 Detec o a etapa de detec o consiste em um processo de ELISA sendo que a carga viral detectada diretamente proporcional a colora o obtida karia Pu Targa Segosnca DNA Sirana s PA Supertobed DNA Sirana F Figura 1 A PCR amplifica uma seq ncia alvo Princ pios e Procedimentos O Teste COBAS AMPLICOR HIV I MONITOR baseia se em cinco
75. ACCGTACTTG ATAGAAT lt DNA l gt lll TGGC AYA_ 14 O Y lt lt C mRNA 6 U G G SN A NANA Ne Tradu o A rela o entre a sequ ncia de nucleot deos do DNA e a sequ ncia de amino cidos da proteina correspondente denominado c digo gen tico O c digo gen tico lido em grupo de tr s nucleot deos sendo que cada grupo de 3 codifica um amino cido Cada sequ ncia de trinucleot deos chamada de c don O processo de decodifica o pelo qual a informa o gen tica presente na mol cula de RNAm dirige a s ntese prot ica chamada tradu o Esse processo envolve os tr s RNAs mensageiro riboss mico e de transfer ncia Na tradu o o ribossomo liga se primeiro a um sitio especifico na mol cula de RNAm c don de inicia o ATG que ajusta a fase de leitura O ribossomo ent o se movimenta ao longo da mol cula de RNAm traduzindo um c don de cada vez usando os RNAt para adicionar amino cidos ao final da cadeia polipept dica em alongamento A tradu o finalizada quando o ribossomo reconhece na fita de rNAm a presen a do c don de termina o A dire o da leitura de 5 3 sendo que a sequ ncia de nucleot deos da fita de DNA corresponde sequ ncia de amino cidos da proteina traduzida na dire o do N terminal para C terminal Duplica o reversa DNA dt RNA 4 PROTENA transcri o tradu o replica o
76. ACS concentra o m nima de 96 Marcas Aprovadas MERCK e VETEC Prepara o da solu o 70 O Etanol absoluto deve ser dilu do em gua 1 MilliQ de prefer ncia ou gua de inje o A dilui o e as al quotas devem ser feitas em tubo pl stico polipropileno novo tipo Falcon graduado at 50mL Ex Misturar 15mL de gua com 35mL de etanol absoluto ACETONA Especifica es ACETONA P A ACS Prepara o Al quotar em tubo de pl stico polipropileno novo e est ril tipo Falcon _ 7 A iQ SS Usar preferencialmente os tubos de polipropileno tipo Falcon Estes tubos devem ser trocados no m nimo uma vez por semana para evitar contamina o Recipientes de vidro cont m s lica que pode reter cidos nucl icos que podem contaminar a rea o Utilizar detergente apropriado para limpeza de vidraria de laborat rio de Biologia Molecular tipo Extran 222272 222 2222 2 2 2 CR GG 2 2 2 272 EG SESSIONS ASS 5 x 7 7 x 7 7 x x x x x x 7 1 7 7 7 1 7 x 7 7 1 5 W v INSUMOS Microtubos pipetas de transfer ncia e ou ponteiras amarelas sem filtro ponteiras de 1000uL com filtro ponteiras de 200uL com filtro ponteiras de 20uL com filtro tubo de polipropileno tipo Falcon de 50mL gaze ou papel absorvente cortado p
77. ANGE ATEN O Se voc tiver que alterar algum dado como por exemplo a identifica o da amostra ou o volume utilizado preencha novamente o campo CHECKSUM e escolha a op o CHANGE SET DEFAULT 117 BIOM IRIE U X NOTA Se o CHECKSUM n o for preenchido corretamente o computador n o prossegue No caso de o CHECKSUM estar correto e o computador n o aceitar os dados verifique todos os dados inseridos novamente Pode ter ocorrido algum erro de digita o Para as amostras seguintes n o necess rio preencher os dados de AMP BATCH ID DET BATCH ID V PARAMETER QA IN QB IN QC IN e CHECKSUM novamente Para estas amostras basta inserir os dados de SAMPLE ID e VOL No espa o do SAMPLE ID digite a identifica o da amostra No espa o VOL digite o volume exato de amostra utilizado para o teste daquele paciente Quando tudo estiver preenchido corretamente clique o ADD TO LIST Repita o procedimento para cada uma das amostras e ao terminar clique o CLOSE maiores informa es encontram se no manual do usu rio A tela com as INFORMA ES SOBRE AS AMOSTRAS Sample Details deve surgir no seu computador Nesta tela existe uma tabela com os dados de todas as amostras que comp em aquela rotina Caso exista a necessidade de editar algum dado em alguma das amostras proceda da seguinte maneira e Clique sobre a amostra a ser editada e Fa a as modifica es necess rias preencha novamente
78. Abrir o tubo e com o aux lio de uma pipeta de transfer ncia transferir todo o conte do para o microtubo numerado correspondente quela amostra Fechar o microtubo Descartar o tubo de tamp o de lise Trocar a pipeta de transfer ncia Repetir o procedimento para cada amostra Para os laborat rios que optaram por utilizar bomba de v cuo proceder da seguinte maneira utilizar sempre uma ponteira nova para cada paciente Ap s aspira o de cada paciente descartar a ponteira e proceder a limpeza da mangueira realizando aspira o com etanol 70 por 3 vezes ATEN O Verificar se todos os microtubos est o fechados corretamente Trocar as uvas 10 Centrifugar os microtubos na microcentrifuga por 30 seg a 10000 rpm 11 Amostra por amostra abrir o microtubo com o aux lio de uma gaze ou papel absorvente retirar todo o sobrenadante com uma Ppipeta de transfer ncia ou bomba de v cuo tomando cuidado para n o perder s lica se ficar mais do que 30uL de tamp o a elui o e ou a amplifica o podem ser inibidas Trocar a gaze papel absorvente e a pipeta de transfer ncia ou ponteira da bomba a cada amostra 12 Utilizando a pipeta P1000 e uma ponteira de 1000uL com filtro pipetar 1000uL de tamp o de lavagem Fechar o microtubo Trocar a ponteira de 1000uL com filtro a cada amostra Repetir o procedimento para cada amostra 13 Levar os tubos ao vortex e agitar at que toda a s lica entre em suspens o 14 Centrifugar por 30
79. CR5 apresenta uma dele o mutante o receptor celular codificado por esse gene fica estruturalmente alterado A condi o de homozigose est associada a um efeito protetor infec o pelo HIV 1 A condi o de heterozigose apesar de n o proteger o indiv duo da infec o est associada n o progress o ou per odos de lat ncia cl nica mais prolongados Embora as c lulas TCD4 pare am ser o principal alvo para o HIV outras c lulas do sistema imune com mol culas CD4 em suas superf cies tamb m sao infectadas Entre elas est o os mon citos e macr fagos que podem 14 hospedar grandes quantidades de v rus sem serem mortos desse modo atuam como reservat rios Ap s a intera o da membrana do envelope viral com a membrana celular ocorre uma altera o conformacional que exp e um pept deo de fus o a gp41 O caps deo viral ent o liberado no citoplasma da c lula hospedeira Observe na figura que por a o da transcriptase reversa do v rus no citoplasma da c lula a fita de RNA serve de molde para a transcri o reversa de duas fitas complementares de DNA viral CDNA Transcri o reversa sintese do DNA a partir do RNA realizada pela enzima transcriptase reversa O cDNA viral de fita dupla transportado para o n cleo e incorporado ao genoma da c lula hospedeira pela a o da integrase e passa a ser denominado provirus Prov rus o DNA do HIV incorporado aos genes da c lula
80. DNases s o inativadas e o cido nucl ico liberado Ap s a lise os cidos nucl icos permanecem est veis no tamp o por per odos extensos a 70 C por 14 dias em temperatura de 2 a 8 C e por 48 horas em temperatura ambiente No caso de necessidade de transporte o tampao de lise permite a remessa segura das amostras sob estas condicoes As amostras em tampao de lise nunca devem ser armazenadas a 20 C Amostra Cl nica Isolamento Ao tamp o de lise contendo o cido nucl ico liberado s o adicionados os tr s calibradores internos Qa Qb e Qc e part culas de s lica A partir desta etapa inicia se o processo de purifica o do cido nucl ico Qualquer cido nucl ico presente na amostra ser ent o associado s lica e imobilizado em fase s lida permitindo a realiza o de sucessivas etapas de lavagens que eliminam por completo os materiais solubilizados presentes no sistema 81 BICM IRIE U X restos de prote nas lip dios e etc O resultado desta extra o um cido nucl ico altamente purificado e livre de fatores inibit rios Amostra Calibradores S lica 2 Lavagens Lipidios E Elui o Y Centrifuga o lt gt cido Nucl ico Purificado Figura 2 Representa o esquem tica da fase de libera o e isolamento do cido nucl ico Tecnologia BOOM 1 2 Fase de Amplifica o NASBA O processo iniciado pelo anelamento de u
81. EDIT 4 Pressionar para selecionar a posicao apropriada 5 Colocar o n mero de identifica o com o leitor de c digo de barras ou teclado se usar o teclado pressionar ENTER 6 Pressionar PRINT para obter uma c pia 7 Pressionar ESCAPE para salvar 179 F Fazer uma ordem de trabalho para o A Ring com perfil 1 2 Pressionar at aparecer na tela O Entry Pressionar EDIT Colocar o n mero do A Ring com o leitor de c digo de barras ou teclado Pressionar ENTER A mensagem NEW ORDER aparecer na tela Pressionar ENTER Colocar o n mero do perfil Pressionar ENTER Colocar o n mero da amostra para o primeiro A Tube opcional Pressionar ENTER Pressionar IP para passar para a pr xima amostra Repetir as etapas 6 7 para cada A Tube Se o teste quantitativo aceitar ou entrar o n mero de c pias por rea o de PCR 0534 Intervalo do controle positivo baixo LPCLo LPC HI e o intervalo do controle positivo alto HPCLo HPCHi Esses dados s o encontrados no cart o que acompanha o kit 10 Pressionar PRINT para obter uma c pia 11 Pressionar ESCAPE para salvar F1 Fazer uma ordem de trabalho para o A Ring Lista de trabalho sem perfil para teste quantitativo Pressionar at aparecer na tela O Entry Pressionar EDIT Colocar o n mero do A Ring com o leitor de c digo de barras ou teclado Pressionar ENTER A mensagem NEW ORDER aparecer na tela Pressionar ENTER N o colocar
82. EM TODAS AS DEZ ESTA ES e Em cada esta o coloque uma extremidade do tubo de limpeza na rosca superior e gire a gentilmente Conecte a outra metade na conex o da esta o com o esgoto 123 BIOCM IRIE U SHUT DOWN DI RIO 1 1 Instale os tubos de limpeza 2 No lugar do Wash Buffer instale a garrafa Cleaner contendo gua de laborat rio tipo 1 que deve ser exclusiva do procedimento de Shut Down 3 Na posi o CLEANER da unidade principal do Extractor instale uma outra garrafa de Cleaner contendo etanol 70 4 No menu TOP selecione a op o Shutdown 1 5 Pressione a op o OK se necess rio 6 Pressione a op o START para come ar o ciclo de limpeza lt Depois de completar o ciclo de limpeza desligue o equipamento pressionando o interruptor externo NOTA Este procedimento deixa flu dos de limpeza no instrumento e nos tubos de limpeza que conservar a tubulu o livre de cristaliza o SHUT DOWN PARA O FIM DE SEMANA 2 1 lt Fa a a limpeza externa di ria 2 Instale os tubos de limpeza 3 No lugar do Wash Buffer instale a garrafa Cleaner contendo etanol 70 8 No menu TOP selecione a op o Shutdown 2 9 Pressione a op o OK se necess rio 10 Pressione a op o START para come ar o ciclo de limpeza 11 Depois de completar o ciclo de limpeza desligue o equipamento pressionando o interruptor
83. ENTER e Pressionar ESCAPE para salvar I LOAD D Cups posicionar bem as racks J Verificar se o WASTE foi esvaziado K Verificar se o RESERVOIR foi abastecido com solu o de lavagem L Verificar se a IMPRESSORA foi ligada M Pressionar START N Verificar LOAD Check que a impressora imprimiu O Verificar RESULTS 170 Para deletar resultados OBS Recomenda se deletar os resultados regularmente ou quando atingir 500 testes 1 Pressionar at aparecer na tela R Treat 2 Pressionar 2 Result Management 3 Usar STEP para selecionar Delete ID um A ring especifico ou Delete All A rings para apagar todos resultados 4 SHIFT e ENTER simultaneamente para confirmar a sele o Para ver resultados 1 Pressionar RESULT at aparecer na tela R Treat 2 Pressionar 1 para selecionar Result Inspection 3 Pressionar EDIT 4 Digitar o n mero do A ring pressionar ENTER 5 para ver o resultado de cada A tube Pressionar quando terminar 171 5 Procedimentos para opera o dos equipamentos Cobas Amplicor Guia R pido de Refer ncia TECLA FUNCAO DA TECLA TECLA FUNCAO DA TECLA Move para o campo ou STATUS Pert linha sei i corrida Inserir letras ou Carregar amostras h nipa ECAD reagentes e racks Identificar A ring amostras Selecionar Selecionar a escolha ORDER controle ou amostra dentro de um campo Determinar os testes ou particular perfil a ser rea
84. Homogeneizar o HIV 1 Mn v1 5 vortex e Adicionar 100 HL P200 de HIV 1 Mn v1 5 no frasco de HIV 1 HIM MMX v1 5 tampar o frasco e agitar 10 a 15 vezes por inversao estabilidade 4 horas 2 8 C N o agitar o Master Mix no vortex Descartar o frasco HIV 1 Mn restante e Distribuir 50 HL P200 de Master Mix pronto para o uso em cada tubo A tube n o fechar os A tubes neste momento Descartar o tubo Master Mix pronto para uso que sobrou e Retornar A ring com Master Mix ao saco pl stico do A ring e deixar 2 8 C e at o momento de usar O Master Mix pronto para uso est vel nos A tubes 160 B Prepara o das amostras e controles Descongelar as amostras temperatura ambiente agit las vortex 3 a 5 seg Realizar um spin r pido das amostras para retirar o plasma da tampa e evitar contamina o de amostra para amostra Abrir cada tubo usando uma gaze ou papel absorvente trocar gaze ou papel para cada amostra Ter o cuidado de n o sujar as luvas quando manipular as amostras evitando contaminar de uma amostra para outra Deixar todos reagentes temperatura ambiente Identificar os tubos de 2 0 mL com tampa de rosca com fundo em V para cada amostra e os 3 controles negativo positivo baixo positivo alto Marcar a face externa dos tubos em rela o parte externa da centr fuga para identificar a localiza o do pellet O frasco de reagente HIV 1 LYS deve ser colocado contra um fundo branco para verif
85. L de tamp o de elui o Fechar o microtubo Trocar a ponteira de 200uL com filtro a cada amostra Repetir o procedimento para cada amostra 24 Depois de fechar o ltimo microtubo levar todos os tubos ao vortex 25 Elui o Incubar os microtubos no termobloco a 56 C por 10 min Ap s 5 min retirar os microtubos um a um do termobloco e levar ao vortex para manter a s lica em suspens o depois voltar para o termobloco 26 Centrifugar na microcentrifuga 5 min 10 000rpm para a s lica depositar e o material ficar no sobrenadante P e j 9 Ji Sugerimos armazenar o sobrenadante com o pellet de s lica no caso de isolamento manual ou o eluido livre de silica no caso de isolamento automatizado como reserva a 209C ou preferencialmente a 70 C at a finaliza o do ensaio Nessa fase a t cnica pode ser interrompida Chegamos ao final do isolamento dos cidos nucl icos Os reagentes de Isolamento Automatizado NucliSens usados na extragao de cidos nucl icos atrav s do equipamento Extractor podem ser aplicados perfeitamente na extra o de cidos nucl icos pelo m todo manual Para isto deve se tomar o cuidado de fracionar o Tamp o de Lavagem em al quotas de 50mL Essas al quotas devem ser em frascos est reis por exemplo em tubos Falcon de polipropileno Esse cuidado essencial para evitar posteriores contamina es do de Lavagem A S lica se apresenta da mesma forma do Kit de Isolamento
86. Lp T HealthCare Caso seja necess rio a corre o de alguma informa o na lista de trabalho abra o arquivo File selecione a lista de trabalho e altere os dados salvando novamente este arquivo sobre o j existente READ Permite ao usu rio preparar o software para o recebimento da leitura dos dados enviados pelo SYSTEM 340 Selecione Read Preencha os dados da placa da esquerda Selecione o nome do teste Selecione a lista de trabalho a ser utilizada j previamente preparada no NEW ID LIST Coloque as informa es nome do operador lote do kit validade do kit e clique OK Introduza os valores das concentra es de padr es e controles que est o no suplemento de bula na caixa 2 no freezer Verifique se os valores est o corretos e clique YES Crie um nome para o arquivo de resultados utilizando o formato dms Ex 26052002 dms Abrir op o para o preenchimento de dados da placa da direita Caso n o esteja sendo utilizada clique em NOT USED O software emitir uma mensagem na tela WAITING FOR DATA Ap s esta mensagem o software est habilitado para receber os dados enviados pelo equipamento FILE Permite ao usu rio o gerenciamento dos arquivos gravados na mem ria do software e solicitar impress o 55 e Bayer HealthCare 5 2 EQUIPAMENTOS AUXILIARES CENTR FUGA REFRIGERADA Ligar a centrifuga na rede el trica verificar a voltagem correta do instrumento Ligar o b
87. a dever existir um ambiente designado Somente para os procedimentos de preparo de reagentes e posterior preparo de amostras libera o e isolamento dos cidos nucl icos e pr amplifica o do RNA viral das amostras cl nicas Este ambiente dever conter todos os materiais e equipamentos necess rios para tal e eles n o devem ser retirados deste ambiente e nem utilizados para outra finalidade que n o esta Se o laborat rio n o possuir uma rea distinta para a separa o do plasma a mesma rea pr poder ser utilizada desde que contenha um fluxo laminar destinado para este procedimento A rea p s ou de Biologia Molecular dever estar destinada amplifica o e detec o do RNA viral ATEN O Os materiais e equipamentos devem ser exclusivos de cada rea Equipamentos e materiais usados para o preparo dos reagentes n o devem ser usados para preparo de amostras ou para pipetagem processamento de cido nucl ico amplificado ou de outras fontes de cido nucl ico alvo muito importante que jamais sejam trocados materiais e equipamentos entre um ambiente e outro e que aventais luvas canetas e etc utilizados em um ambiente n o sejam em hip tese alguma levados para outra rea 25 Disposi o das reas 1 Divisoria ate o toto separando totalmente as duas reas com ou sem vidro a e ERIS q IE RO o im ER 32
88. a 13 Foto da caixa fechada de Figura 14 Foto da caixa fechada de reagentes gen ricos de reagentes espec ficos Figura 15 Foto da caixa aberta de Figura 16 Foto da caixa aberta reagentes gen ricos de reagentes espec ficos 153 O kit Cobas Amplicor Wash Buffer composto por duas garrafas contendo cada uma tamp o de lavagem 10 vezes concentrado para ser usado no analisador Cobas Amplicor para realiza o do teste Cobas amplicor HIV 1 Monitor v1 5 AMPLICOR COBAS AMPLICOR Wash Buffer Figura 17 Foto do kit Cobas Amplicor Wash Buffer Armazenamento e Conserva o dos Kits N o congelar os reagentes Armazenar HIV 1 LYS HIV 1 QS v1 5 HIV 1 DIL HIV 1 MMX v1 5 HIV 1 Mn NHP HIV 1 C HIV 1 L C e HIV 1 H C de 2 8 C Estes reagentes s o est veis at a data de validade indicada Uma vez abertos qualquer por o n o utilizada deve ser descartada Armazenar AD3 e DN4 de 2 25 C Uma vez cadastrados no analisador Cobas Amplicor AD3 e DN4 s o est veis por 30 dias de 2 8 C ou at a data de validade o que vier primeiro Estes reagentes podem ser usados por no m ximo 4 ciclos no analisador 24 horas por ciclo e devem ser armazenados de 2 8 C entre os ciclos Armazenar CN4 de 2 89 Uma vez cadastrado no analisador Cobas Amplicor CN4 est vel por 30 dias de 2 8 C ou at a data de validade o que vier primeiro Este reagente pode ser usado por no m ximo 4 ciclos no analis
89. a de 20 ml de hipoclorito a 50 1980 ml de gua 2 Exemplo de aplica o da f rmula para preparo de hipoclorito a 2 a partir de hipoclorito com 50 de cloro ativo Dados VHS 2000 ml 9o de cloro ativo do Hd 50 9o de cloro ativo desejado 2 Calculando o volume necess rio de hipoclorito dispon vel 2000 ml x 2 volume necess rio do Hd 80 ml Calculando o volume de gua a ser adicionado Volume de gua a ser adicionado 2000 ml 80 ml 1920 ml Portanto para preparar 2000 ml de hipoclorito a 2 a partir de hipoclorito a 50 voc precisa de 80 ml de hipoclorito a 50 1920 ml de gua OBSERVACAO O hipoclorito de s dio deve ser guardado em frascos escuros bem vedados e em temperatura ambiente O hipoclorito deve ser preparado diariamente no volume necess rio ao trabalho Ao final do dia descarte as sobras dilu das em bastante gua na rede de esgoto do laborat rio 22 Coleta manuseio e transporte das amostras 1 Coleta N o necess ria a prepara o especial do paciente antes de iniciar a coleta das amostras mas recomenda se um jejum de 8h O manuseio correto das amostras imprescind vel para proteger o RNA viral do HIV 1 de degradacao Coletar o sangue observando as precau es universais para pun o venosa Coletar o sangue em tubos est reis contendo EDTA ks 0 15 sol V V final OBS N o usar tubos de EDTA com gel Nunca u
90. a no agitador V rtex Prepare o Reagente de Trabalho de Lise em um tubo c nico de Polipropileno de 50 mL conforme a tabela abaixo Pocos de Diluente Reagente Sondas Sondas Alvo Captura Amostras Lise lise Captura target Homogeneize por invers o 10 vezes e utilize o V rtex de 05 a 10 segundos depois inverta novamente 10 vezes Conserve em temperatura ambiente e deixe diminuir a espuma formada Descarte se n o for utilizar dentro de 02 horas e meia NOTA Para uma corrida com a placa inteira 84 testes organize os precipitados das amostras padr es e controles congelados em 02 sets de 48 testes cada 43 e HealthCare Remova o primeiro set de precipitados do freezer e deixe o em temperatura ambiente por 05 minutos Abra o tubo com auxilio de uma gaze ou papel absorvente Adicione 120 uL do Reagente de Trabalho de Lise usando uma ponteira nova para cada tubo tampe firmemente Agitar V rtex por 10 segundos Transfira os tubos para sala 2 SALA 2 Transferir os tubos para o termobloco e incubar 63 por 02 horas Repita o processo com os sets seguintes Remova da Caixa 1 do Kit na geladeira Wash A Solu o de lavagem A Wash A Solu o de lavagem B Wash B que ser o utilizados no segundo dia Po os de Captura Capture Well e mantenha em Temperatura ambiente Uma vez completada 02 horas remova os tubos do termobloco e homogeneize por invers o cada tubo para
91. a proteina codificada por ele continuamente Para controlar a exist ncia do RNA as c lulas possuem uma enzima com fun o espec fica de degradar o RNA a Rnase Nas c lulas vivas esta enzima fica armazenada de forma inativa at que seja necess ria sua utiliza o Quando uma c lula morre e se rompe essa enzima se espalha na amostra No cotidiano isso n o interfere em nada mas em um teste que visa detectar e quantificar o RNA viral esse fato assume uma grande import ncia Assim todo o material utilizado tem que ser est ril e novo N o correto encostar as m os sem luvas limpas em qualquer material sempre que achar necess rio passe uma solu o de agua sanit ria dilu da a 10 e ou lcool et lico dilu do a 70 nas luvas Uma vez de luvas deve se evitar qualquer contato com a pele e cabelos para evitar contamina o das luvas e dos materiais a serem utilizados por Rnases provenientes de c lulas rompidas presentes 4 Contamina o da amostra por material j amplificado amplicons depois de amplificado passa a existir uma quantidade muito grande de DNA RNA na amostra Assim o material amplificado deve ser tratado como altamente contaminante do ensaio e sendo assim deve ser manipulado em ambiente destinado especificamente a ele 28 Refer ncia Bibliogr fica Lehninger Albert Lester Principles of Biochemistry Bulas e Manuais informativos ABBOTT Roche Organon Teknica Bio M rieux e Bayer Manual
92. a seta A para aumentar os valores de temperatura ou pressione a seta Y para diminuir a temperatura at o ajuste da temperatura desejada C Para visualizar uma temperatura selecionada Pressione o bot o Set 121 BICM IRIE U X Considera es Por se tratar de banho seco recomendamos n o adicionar gua nos blocos A Limpeza do equipamento pode ser realizada com uma gaze umedecida com agua de laborat rio pura e imediatamente seca para evitar cristaliza es sobre o equipamento Voltagem 110V 220V MANUAL DE OPER ES B SICAS DO BANHO MARIA GFL a Para Ligar o Equipamento Colocar o interruptor localizado na parte frontal do equipamento na posicao Liga I Ao ligar o equipamento o aquecimento da gua ir iniciar at a temperatura selecionada A posi o O configura aparelho desligado b Para Selecionar a Temperatura Desejada Pressione o botao mesmo tempo pressione para aumentar os valores de temperatura ou pressione para diminuir a temperatura at o ajuste da temperatura desejada c Para visualizar uma temperatura selecionada Pressione o bot o C Considera es Recomendamos adicionar gua purificada Destilada ou Bidestilada Para limpeza ideal do equipamento deve se efetuar a troca de gua semanalmente Voltagem 110V 220V MANUAL DE OPER ES B SICAS DA MICROCENTR FUGA EPPENDORF a Para ligar o equipamento coloque o interruptor na posi o Liga 1 b Ajust
93. a tubula o o sistema circula ar para secar a tubula o Para isto deve se retirar as tubula es da gua e deixar no ar Nunca esque a de circular ar na tubula o Quando acabar o shutdow recoloque a tubula o nos tubos correspondentes Check flow rate di rio sempre antes de ler a rotina 1 Retire a mangueira do reservat rio de esgoto e coloque na proveta fornecida junto com o equipamento 2 No menu Instrument escolha a op o Advanced e de dentro desse menu escolha check flow rate e clique Pump 8 5 mL O equipamento desprezar um volume na proveta 3 Descarte o volume e volte a mangueira na proveta Pressione novamente Pump 8 5 mL 4 Me a o volume e caso esse n o seja de 8 5 0 1 mL coloque o volume medido no quadro Flow Volume mL pressione Calculate new index e repita o passo 3 Se o valor obtido for menor do que 6 feche a tela e chame a assist ncia t cnica 5 Caso o volume agora esteja em 8 5 mL termine o procedimento e realize o procedimento seguinte backflush 127 BICM IRIE U X Backflush semanal sempre ap s a leitura do ltimo teste n o esquecendo de realizar o check flow rate antes 1 2 Proceda com esse teste apenas se o teste anterior passar caso contr rio chame a assist ncia t cnica Retire a mangueira do reservat rio do esgoto limpe a e coloque em um Becker com gua bidestilada Retire o carrossel Coloque um frasco receptor abaixo da agulha de succao
94. a uma ordem para o s A ring s em quest o Excedeu a capacidade de detec o de testes na corrida Criar uma rack de reagentes gen ricos Posicionar a rack com reagentes gen ricos na plataforma Criar uma rack de reagente espec fico Colocar na rack o reagente espec fico e posicion la na plataforma Adicionar cassetes de substrato suficientes Criar uma lista de trabalho para o A Ring Fazer o load do A Ring Modificar a ordem de trabalho para n o exceder 210 testes incluindo blanks MEN As amostras n o foram No A ring in load list i I Inserir as amostras inseridas no sistema No specific reagent in A rack de reagente especifico P B 2 I Inserir reagente especifico load list nao foi inserida No test reagent found O reagente espec fico necess rio para o teste n o Inserir reagente espec fico foi adicionado Not enough D cups Adicionar racks de D cups CUps para a corrida Not enough generic test reagent N o h reagente espec fico suficiente para a corrida Realizar um STOP TRANSFER e adicionar cassetes de reagentes Reagent missing load and start Load inconsistency TCA TCB DP1 or DP2 order not found N o foi adicionado um reagente necess rio para realizar o teste solicitado Pressionar START Realizar um STOP TRANSFER e adicionar cassetes de reagentes Pressionar START Specific rea
95. ador 24 horas por ciclo e deve ser armazenado de 2 8 C entre os ciclos 154 Armazenar SB3 e SB de 2 8 C Estes reagentes s o est veis at a data de validade indicada Uma vez adicionado o SB no SB3 o cassete de reagente est vel por 16 horas no analisador N o expor SB3 SB ou o cassete preparado a metais agentes oxidantes ou a luz direta Armazenar IM PS1 v1 5 e IM4 v1 5 de 2 8 C Estes reagentes s o est veis at a data de validade indicada Uma vez adicionado o IM PS1 v1 5 no IM4 v1 5 o cassete de reagente est vel por 14 dias de 2 8 C O cassete preparado pode ser usado por no m ximo 2 ciclos no analisador 24 horas por ciclo e deve ser armazenado de 2 8 C entre os ciclos Armazenar IQ PS1 v1 5 e IQ4 v1 5 de 2 8 C Estes reagentes s o est veis at a data de validade indicada Uma vez adicionado o IQ PS1 v1 5 104 v1 5 o cassete de reagente est vel por 30 dias de 2 8 C O cassete preparado pode ser usado por no m ximo 4 ciclos no analisador 24 horas por ciclo e deve ser armazenado de 2 8 entre os ciclos Armazenar WB de 2 8 C WB est vel at a data de validade indicada O tamp o preparado diluindo WB 1 10 com gua destilada ou deionizada deve ser armazenado de 2 25 C no reservat rio de tamp o do Cobas Amplicor e est vel por 2 semanas a partir da data de preparo Apresenta o do Equipamento O analisador Cobas Amplicor um analisador cl nico automatizado para ser usad
96. amento Erro RS0031 IRL factor out of range Valor de leitura de referencia fora dos limites Este erro pode acontecer ao ligar o equipamento durante os testes iniciais ou durante um ensaio no momento da leitura Este erro indica uma falha na leitura O valor ideal para o IRL factor 1 0 Porem esse fator fica normalmente calibrado entre 0 80 e 1 25 Valores acima de 1 40 e abaixo de 0 70 s o cr ticos Se esse erro acontecer ao ligar o equipamento pode se verificar visualmente o estado da cabe a de leitura e caso necess rio efetuar uma limpeza Logo ap s efetuar o teste de leitura Detector Se acontecer durante uma rotina fatalmente o ensaio ser perdido Caso o erro permane a entrar em contato com a Assist ncia T cnica Bayer Erro GAO221 Slip detected Erro de posi o Este erro normalmente cancela o ensaio No arquivo de eventos ele aparece com um W o que indica apenas um aviso Quando esse erro acontece o equipamento tenta novamente fazer o movimento se tiver sucesso ele continua o processo Caso n o ele passa para o passo seguinte Esse erro indica que o mecanismo de movimenta o da cabe a de leitura lavagem j esta com desgaste Sendo necess ria interven o t cnica Entrar em contato com a Assist ncia T cnica Bayer Erro AS0304 No vacuum detected during prime Falta de aspira o durante a lavagem Verificar se n o esta faltando s solu es necess rias para a lavagem Verific
97. aparecer na impress o do resultado O resultado para amostras ou controles inv lida Repetir todo procedimento processamento de amostras amplifica o e detec o para essa amostra ou controle INTERPRETA O DE RESULTADOS COM VALORES Asso FORA DA SEQU NCIA Valores de absorb ncia para dilui es do amplicon do HIV 1 devem seguir um padr o de decr scimo dos valores de Ass com o aumento do fator de dilui o exceto para dilui es que est o saturadas e dilui es com valor de leitura de fundo Em rea es contendo altas c pias HIV 1 mL dilui es tubo 1 2 e 3 podem ser saturadas resultando em valores de mais baixos Esses valores s o v lidos mesmo n o apresentando valores de Asso para dilui es do tubo 1 ao tubo 4 Em rea es contendo alta quantidade de c pias HIV 1 mL dilui es tubo 1 2 e 3 podem ser saturadas resultando em valores de mais baixos Esses valores s o v lidos mesmo n o apresentando valores de Asso para dilui es do tubo 1 ao tubo 4 Em rea es contendo baixa quantidade de c pias HIV 1 mL dilui es tubo 2 e 3 e 4 podem conter valores de Asso de leitura de fundo Esses valores s o v lidos mesmo n o apresentando valores de para dilui es do tubo 1 ao tubo 4 Todas as dilui es com valores de Ass entre 0 15 e 2 0 devem seguir um padr o de decr scimo de valores de para as dilui es do tubo 1 ao tubo 4 Caso as dilui es n o sigam esse padr o ocorreu u
98. ar 1 se o volume do tamp o de lavagem suficiente 2 a presen a de bolhas de ar nas linhas hidr ulicas 3 todas as conex es de fluido atr s do sistema Realizar Extended Prime Transfer Tip Wet or Bent 263 fechadas Trocar a agulha Transfer Tip Check 5 Failure 264 A agulha esta torta Trocar a agulha Realizar um Extended Excessivo ar nas tubulacoes Prime Confirmar se o n vel do tamp o de lavagem est abaixo de 5 mm do topo do Verificar se h vazamento na torre de lavagem ou no tubo da torre Transfer Tip is dripping Transfer Tip Ar no sistema de flu do Verificar 1 se a agulha est corretamente posicionada e presa 2 se todos os reagentes racks e D cups est o corretamente posicionados na plataforma 3 se todas as tampas do cassetes est o totalmente A agulha est torta Ar no sistema de fluido Limpar o poste de inicia o Verificar 217 do sistema de fluido ou seringas A agulha pode estar posicionada incorretamente Vazamento nos componentes 1 se h tamp o de lavagem no reservat rio 2 seringas tubos de conex o e a regi o da esta o de lavagem quanto presen a de tamp o de lavagem Realizar um Extended Prime Verificar as seringas quanto a vazamento e ajust las se necess rio Examinar os componentes do sistema de fluido quanto a vazamento Ve
99. ar a ponteira Fechar o tubo com a amostra e proceder do mesmo modo para todas as outras amostras SEMPRE ABRIR UM TUBO DE AMOSTRA E O RESPECTIVO TUBO DE TAMP O DE LISE POR VEZ 91 BICM IRIE U X 5 Levar o tubo contendo o tampao de lise e as amostras ao vortex lise viral 6 Centrifugar por 2 min a aproximadamente 2500 rpm p Equipamentos PoNormal Banho Maria a 37 C 19C centr fuga sorol gica centr fuga para microtubos termobloco aferido a 56 19C vortex pipeta P1000 pipeta P200 pipeta P20 estantes para tubo de 15 mL estantes para microtubos Verificar a temperatura antes de usar Pelo menos uma vez por semana checar com mais de um term metro Se houver d vidas consultar a assessoria da bioM rieux Brasil S A e checar com um term metro digital PoBomba a V cuo Banho Maria a 37 C Centr fuga Sorol gica centr fuga para microtubos termobloco aferido a 56 C vortex pipeta P1000 pipeta P200 pipeta P20 e bomba a v cuo estantes para tubo de 15 mL estantes para microtubos Verificar a temperatura antes de usar Pelo menos uma vez por semana checar com mais de um term metro Se houver d vidas consultar a assessoria da bioM rieux Brasil S A e checar com um term metro digital Reagentes Tamp o de Lavagem Calibradores S lica Tamp o de Elui o Etanol 70 verificar modo de preparo e Acetona incluso no sachet prateado no kit de Amplificacao
100. ar a velocidade desejada em rota es por minuto rpm girando o bot o rpm c Ajustar o tempo em minutos girando o bot o min OBSERVA O n o esque a de fechar o rotor encaixando e girando a tampa N o esque a de realizar sempre a checagem do balanceamento dos microtubos no rotor d Ao terminar o tempo estipulado a centrifuga o cessa automaticamente 122 BICM IRIE U 6 D AU eee Desligamento do Sistema NASBA VAAAAAAAAAAAAANAN NNNNNNN WW WN NUCL SENS ASBA DIAGNOSTICS M R I E U EXTRACTOR Nucleic acid diagnostics PROCEDIMENTOS DE MANUTEN O DI RIA AP S O T RMINO DA ROTINA LIMPEZA EXTERNA DI RIA 1 lt Remover todos os cartuchos 2 lt Limpe a parte externa do instrumento com um pano e etanol 70 3 lt Limpe as roscas superiores e a conex o com o esgoto cada esta o da unidade principal usando um cotonete ou uma gaze 4 lt Inspecione visualmente as seringas quanto a vazamentos Qualquer vazamento entrar em contato com a Assist ncia T cnica 5 Verifique o n vel do esgoto Mais de 34 cheio deve ser esvaziado e a frasco lavado com gua 6 Inspecione toda a tubula o quanto a sinal de vazamentos nos PLUGS 7 Inspecione o PLUG do Wash Buffer quanto a cristaliza o presen a de cristais lave vigorosamente a tampa e o PLUG com etanol 70 ANTES DE RODAR OS PROCEDIMENTOS DE SHUT DOWN INSTALE OS TUBOS DE LIMPEZA
101. ar e se for necess rio executar a manuten o na cabe a de lavagem Caso o erro permane a entrar em contato com a Assist ncia T cnica Bayer 16 2 T HealthCare Erro CLO304 Frame Pad pickup failure Falta das placas selantes Pads Acontece quando n o s o colocados os pads para inicializa o de um ensaio e os sensores de detec o acusam a falta Verificar se est o colocados corretamente e reiniciar o teste Caso o erro permane a entrar em contato com a Assist ncia T cnica Erro de Transbordamento nas Placas N o h mensagem de erro Durante uma das fases de pipetagem constatado visualmente que h transbordamento em uma ou nas duas placas durante um ensaio Esse erro acontece quando pelo menos uma das agulhas de lavagem esta obstru da Devido ao transbordamento o ensaio perdido Deve se verificar a cabe a de lavagem executar a manuten o necess ria e executar novamente os testes de dispensa o e aspira o Dispense e Aspirate por tr s vezes Se for mais observado o transbordamento pode se preparar um novo ensaio porem por seguran a recomendado o uso de uma quantidade menor de amostra Caso o erro permane a entrar em contato com a Assist ncia T cnica Bayer Qualquer outra mensagem de erro por favor entrar em contato com a Bayer 77 5 UY I HealthCare 9 Contatos com a Bayer Para entrar em contato com a Assist ncia T cnica ou Assessoria Cientifica utilize a Central
102. ara uso Uma vez colocado no Cobas Amplicor este reagente est vel por 30 dias de 2 89C ou at a data de validade Este reagente pode ser usado por no m ximo 4 ciclos 24 horas por ciclo no instrumento e deve ser armazenado de 2 89C entre os ciclos 177 COBAS AMPLICOR Reagentes Gen ricos COBAS AMPLICOR Generic Detection kit 100 testes gt Solu o de Desnatura o 1 cassete 100 testes Pronto para uso Uma vez colocado no CA esse reagente est vel por 30 dias ou at a data de validade do kit Este reagente pode ser usado no m ximo 6 ciclos 12 horas cada no instrumento e deve ser armazenado 2 8 C entre as corridas gt Avidin HRP Conjugate 1 cassete 100 testes qualitativos ou 16 determina es quantitativas Pronto para uso Uma vez colocado no CA este reagente est vel por 30 dias ou at a data de validade do kit Este reagente pode ser usado no m ximo 6 ciclos 12 horas cada no instrumento e deve ser armazenado 2 8 C entre as corridas gt Substrate A 5 cassetes Substrate B 5 frascos 75 testes qualitativos ou 12 determina es no quantitativo Pipetar 5 mL do Substrate B SB no cassete contendo Substrate SB3 e aspirar pipetar 5 vezes com a pipeta para homogeneiza o O substrato de trabalho dever ser preparado todo dia O substrato pronto est vel por 16 horas gt Wash Buffer kit Wash Buffer concentrado 10 vezes 2 garrafas 500 testes Diluir o Wash Buffer com gua destilada
103. art veis necess rios Materiais de consumo equipamentos e acess rios fornecido pelo fabricante Pipeta ajust vel 20 mL at 200 mL Pipeta ajust vel 200 mL at 1000 mL Pipeta sorol gica de 2 mL Pipeta sorol gica de 10 mL Pipeta multicanal 12 canais ajust vel Termobloco 63 0 59 com capacidade para 96 tubos de 1 5 mL Centr fuga refrigerada com rotor para 23500 g Agitador V rtex Banho Maria Freezer de 60 a 80 C Microtubo de 1 5 mL resistente a ultracentrifuga o Containers para l quidos para multicanal capacidade 120mL Tubos c nicos de polipropileno 15 mL Tubos c nicos de polipropileno 50 mL Ponteiras com filtro de 200 mL Ponteiras com filtro de 1000 mL Ponteiras de 200 mL Ponteiras de transfer ncia est ril Materiais de consumo equipamentos e acess rios n o fornecidos pelo fabricante Repipetador ou p ra para pipetas sorol gicas Estantes para tubos microtubos Banho Maria para sala 2 Agitador V rtex para sala 2 Geladeira para armazenamento de reagentes e HealthCare 4 Procedimentos para Realiza o do Teste O procedimento de realiza o do teste consiste de tr s atividades principais Prepara o do precipitado viral Hibrida o das sondas Detec o da luminesc ncia produzida SALA 1 PREPARA O DOS PRECIPITADOS VIRAIS Usando luvas limpe todas as pipetas a rea de trabalho com lcool etilico 70
104. car a temperatura antes de usar Pelo menos uma vez por semana checar com mais de um term metro Se houver d vidas consultar a assessoria da bioM rieux Brasil S A e checar com um term metro digital Reagentes Tamp o de Lise NucliSens Recomenda se retirar da geladeira os tubos contendo o tamp o de lise 24 horas antes de comegar a ser utilizado e mant lo a temperatura ambiente e protegido da luz Esse procedimento facilita a dissolu o dos cristais de Tiocianato de Guanidina Numerar os tubos com tamp o de lise na tampa e no r tulo Deixar o frasco a 37 C por 30 minutos para solubilizar totalmente os cristais de Tiocianato de Guanidina Agitar de vez em quando Centrifugar na centr fuga sorol gica por 2 minutos a aproximadamente 2 000 rpm lt SEMPRE CENTRIFUGAR OS TUBOS DE TAMP O DE LISE ANTES DE ABRI LOS 90 BICM IRIE U X Procedimento 1 Colher as amostras em tubos com EDTA conforme procedimento b sico 2 Centrifugar a amostra para fazer a separa o do plasma em at quatro horas ap s a coleta O plasma deve ser fracionado em al quotas utilizando se uma pipeta P1000 e uma ponteira de 1000uL com filtro A amostra deve ser congelada imediatamente ap s a centrifuga o Se o plasma j estiver congelado deixar descongelar em temperatura ambiente Homogeneizar por invers o e centrifugar para retirar o material da tampa Uma vez congeladas as amostras s devem
105. cartucho 2 O eppendorff para elui o tem que estar em posi o 3 A porta da esta o tem de estar fechada e lt Pressione a op o START para come ar a extra o 12 DESCARREGANDO O EQUIPAMENTO Quando acabar a corrida o alerta UNLOAD I Selecione a op o UNLD a tela de UNLOAD vai aparecer mostrando o estatus das 10 esta es de trabalho e Levante as portas de seguran a e Abra a porta das esta es e desconecte a Rosca superior do cartucho e Com o aux lio das alavancas de eje o mova as para a esquerda desengate o cartucho da conexao de esgoto e Cuidadosamente remova os cartuchos do equipamento e lt Remova o tubo contendo o elu do do cartucho e lt Descarte os cartuchos em um container de biosseguran a dentro de 15 minutos e lt Ap s remover todos os cartuchos pressione a tecla OK 112 VNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNA A Le Mi A A ue WN NN AN i WM NUCLISENS NASBA DIAGNOSTICS M IR I E LU NUCLISENS READER Nucleic acid diagnostics 5 2 Descric o de Operac o do Equipamento NucliSens Reader O leitor NUCLISENS READER deve ser ligado no m nimo duas horas antes da leitura das amostras Laborat rios integrantes da Rede Nacional de Carga Viral do Minist rio da Sa de Como seu computador possui o sistema SISCEL ao ligar o computador uma tela com uma lista de op es aparecer Escolha a op o 8 oito para que o sistema
106. cer tamb m os ensaios Trugene de Resist ncia do virus HIV atrav s de sequenciamento gen mico A Bayer Health Care participa do Programa Nacional da Rede de Laborat rios de Carga Viral desde 2002 estando presente em 23 laborat rios disponibilizando o teste Versant HIV 1 3 0 para medi o da Carga Viral com muito orgulho que a Bayer participa deste Programa reconhecido mundialmente e que t m propiciado a milhares de portadores do virus HIV uma qualidade de vida melhor al m de manter sob controle esta importante epidemia Bayer S A 30 2 T HealthCare 1 bDNA branched DNA HIV 1 RNA 3 0 ASSAY A tecnologia do branched DNA um ensaio de hibrida o em fase s lida tipo sanduiche de cidos nucl icos usando mol culas de DNA ramificadas bDNA A amostra tratada com reagente de lise e o material nucl ico do virus liberado ent o hibridado em solu o usando dois conjuntos de sondas oligonucleot deas Uma das sondas serve como sonda de captura localizada na superficie dos po os da placa que h brida especificamente com RNA do HIV e faz com que o RNA do HIV fique ligado placa A segunda sonda serve para fixar o RNA do HIV placa e tamb m para hibridar com um outro conjunto de sondas pr amplificadora e amplificadora DDNA a essa ltima se atribui a fun o de aumentar o nivel de sinal da hibrida o As mol culas de bDNA atuam como amplificadoras por se ligar a uma sonda marcada com f
107. co de alum nio utilize outro swab limpo e seco para terminar a limpeza gt Nunca utilize hipoclorito para limpeza do bloco de alum nio pois poder provocar corros o do mesmo 58 Bayer HealthCare BANHO MARIA lt a Ligar o banho maria rede el trica verificar a voltagem Completar o volume com gua destilada e ajustar o termostato para temperatura 37 Sempre verificar antes do ensaio a temperatura Manuten o Manter o banho sempre limpo Completar o volume de gua destilada sempre que necess rio evitando assim o aquecimento excessivo da resist ncia e consequente danifica o 59 4 UY I HealthCare 6 Manuten o Limpeza e Desligamento do Sistema MANUTEN O SYSTEM 340 gt ANTES DE INICIAR UM ENSAIO ou SEMANALMENTE caso o equipamento n o esteja sendo utilizado m Clean System n Realizar teste de Performance Checks Detector Dispense Aspirate Panel n Verificar o rings nas placas de ensaio Preparar lt de limpeza Hipoclorito 0 2 9 o m Limpeza dos frascos de lavagem e enx g e Limpeza do frasco de res duo Limpar a superficie externa do equipamento com lcool et lico 70 gt MENSAL Realizar teste de Performance Checks Background Quando necess rio I Limpeza das agulhas do pente de lavagem 60 e Bayer HealthCare 6 1 MANUTEN O ANTES DE INICIAR O ENSAIO ou SEMANALMENTE 1 Preparac o da SOLU O DE LIMPEZA
108. cs battery not present mem ria do CPU est baixa Ana BEER NOTT NO IORRAM H um problema de mem ria Contactar a CARD Press ESC and then start to clean up available H um problema de mem ria Contactar a CARD 209 O operador deve se logar Digitar a identificacao do Invalid user ID ao sistema operador e sua senha O n de identifica o do A ring j foi usado anteriormente Verificar a identifica o do A ring em quest o Verificar identificacao do A O n de identificagao ja foi Not unique ring ou use um numero usado anteriormente diferente Blank da leitura aceit vel para o Blank error blank L quido ou bolhas foram Limpar a tampa do cassete Cover wet detectadas na tampa do com papel absorvente cassete N o agitar os reagentes Realizar um STOP Mensagem liberada no TRANSFER e colocar no Empty loadcheck para indicar que o sistema um novo cassete de cassete de reagente esta reagente Pressionar vazio lt START gt para recome ar a corrida Realizar um STOP Expired TRANSFER e adicionar um Insufficient reagent novo cassete de reagente Pressionar lt START gt para found tests para os testes solicitados na OUNO cassete de reagente available ordem de trabalho recomecar a corrida Load inconsistency A lista de trabalho do A ring Criar uma nova lista de All tests finished foi realizada trabalho para o A Ring Load inconsistency Con rea
109. de selecionar tubo de solu o de refer ncia RS N o pode selecionar tubo de ensaio negativo AN este ensaio selecionado selecionar selecionado selecionar 7072 7073 N o p de deletar o n vel Delete todos os usu rios deste n vel primeiro 7074 Janela de fundo n o abre 7065 Cancele a opera o 7066 Cancele a opera ao 136 BIOM RIEUX C DIGO DE ERROS CAUSAS PROCEDIMENTOS usu rio foi expirado Erro de identifica o Identifique corretamente as amostras Assegure se de n o repetir ID 7081 a 7086 Erro de prefer ncias Chame a assist ncia t cnica 7087 Incapaz de abrir um Chame a assist ncia t cnica arquivo de tela 7088 Erro de Software Chame a assist ncia t cnica arquivo 7090 A tela PrintScreen est desabilitada neste 7091 a 7095 Erro de comunica o Verifique os cabos de liga o ou se os equipamentos est o ligados 7096 Primeira amostra Cancele a operacao Nenhuma amostra anterior amostra posterior ensaio anterior ensaio posterior 8001 a 8006 Erro de configurac o Chame a assist ncia t cnica 8007 a 8009 Sintaxe incorreta do Foi escolhido um nome de arquivo no diret rio atual arquivo inv lido Escolha um correto 8009 Nenhum par metro Selecione um par metro selecionado N o pode antes de iniciar a corrida iniciar corrida 8010 Nenhum dado anterior para Cancele a operacao ver 8011 Par metro IRS n o Cancele a opera o edit vel 8012 Nenhum par metro para
110. dem ser validadas As amostras que estiverem abaixo do limite de detec o s podem ser validadas quando o limite de detec o estiver em 80 Por m quando o valor de ECL TOTAL for menor do que 250 000 o resultado do teste n o pode ser considerado Lembre se sempre que ao reportar um resultado necess rio respeitar o limite de detec o inferior mesmo que o computador tenha liberado um valor de carga viral menor que o limite de detec o inferior descrito na bula do teste 131 BICM IRIE U VALIDAR RESULTADO UM Total de ECL Total de ECL gt 1000 000 lt 1000 000 250 000 lt Total de ECL lt Total de 1000 000 ECL lt 250 000 A raz o Qb Qa 5 e A raz o Qb Qa 5 e Qc Qb 5 verdadeira Qc Qb 5 FALSA A Carga Viral da A Carga Viral da amostra est amostra est ACIMA do limite ABAIXO do limite de detec o de detec o O limite est O limite est em 80 c pias acima de 80 por mL c pias por mi 132 BIOM RIEUX 8 Problemas Causas e Solu es na Realiza o dos Testes C digos de Erros do Equipamento NucliSens Reader C DIGO DE ERROS CAUSAS PROCEDIMENTOS 4002 a 4007 usu rio inicie novamente a corrida 4010 e 4011 4012 a 4026 Erro de comunica o Verifique os cabos de liga o ou se os equipamentos est o ligados 4027 a 4036 Erro de software Chame a assist ncia t cnica 4038 Erro de comunica o Falha Verifique os cabos de li
111. derais para o transporte de amostras cl nicas e de agentes etiol gicos Importante Cabe ao ponto executor a responsabilidade de dar treinamento e supervis o aos postos de coleta sobre o procedimento da coleta separa o do plasma acondicionamento e transporte das amostras al m de prover os mesmos de todos os insumos necess rios separa o das amostras tais como ponteiras microtubos etc Observa o Nunca enviar amostras s sextas feiras s bados e domingos ou v speras de feriados sem autoriza o do laborat rio executor 24 Divis o da rea fisica vide nova portaria da SAS MS a ser publicada divis o da rea f sica dever ser respeitada pelas tr s tecnologias A alta sensibilidade das t cnicas de biologia molecular pode representar um grave problema caso algumas medidas de seguran a e procedimentos especiais n o sejam tomadas Quanto organiza o f sica o laborat rio deve obedecer a determinadas regras b sicas para evitar contamina es Deve se tomar o cuidado de designar ambientes f sicos separados para as diferentes etapas envolvidas no preparo da rea o O fluxo de trabalho deve ser unidirecional iniciando se na rea de extra o isolamento e pr amplifica o sala 1 ou rea limpa e passando para a rea de p s amplifica o amplifica o detec o sala 2 rea de Biologia Molecular para evitar a contamina o do ambiente pelos amplicons Dessa form
112. dio a 2 9o por um tempo minimo de 24 horas antes de ser autoclavado Ap s esse tempo drene o hipoclorito e descarte o na rede de esgoto Esse procedimento n o oferece riscos para o meio ambiente uma vez que depois de 24 horas o cloro j evaporou Tubos contendo co gulos sangue total ou soro puro devem ser autoclavados diretamente sem descontamina o pr via com hipoclorito pois em presen a de grande quantidade de mat ria org nica ele ineficiente Os res duos especialmente os perfuro cortantes devem ser descartados em recipientes de paredes r gidas com tampa contendo hipoclorito de s dio a 2 O material dispensado n o deve ultrapassar 2 3 do volume do recipiente para que o hipoclorito n o perca sua capacidade de desinfec o Colocar os res duos s lidos em sacos pr prios para autoclava o e ap s o procedimento minimo de 45 minutos em temperatura de 121 C acondicionar em sacos pl sticos de cor branca identificados com o simbolo de risco biol gico e a informa o de para incinerar ou para aterro sanit rio de acordo com o procedimento utilizado na sua regi o Desinfec o do Laborat rio A ORGANIZA O MUNDIAL DE SAUDE recomenda que os laborat rios sigam algumas normas como O lixo do laborat rio deve ser retirado 2 vezes ao dia Semanalmente esvaziar o conte do do banho maria lavar seu interior e colocar gua destilada Checar a temperatura ap s esse procedimento 19 O piso deve ser l
113. do a roda do sistema Figura 2 Cuidar para n o entortar as ponteiras de aspira o ou de ressuspensao Limpar a roda de lavagem com um pano mido e secar com outro seco Recolocar a roda de lavagem fazendo o processo inverso descrito acima Voltar as torres brancas girando no sentido anti hor rio percebendo quando h o encaixe perfeito Caso n o fique bem posicionada quando uma rotina for colocada os D cups poder o ficar presos na torre e perder a rea o que foi iniciada Bra o de lavagem Torre de lavagem desatarraxar lavagem 4 gt 195 Figura 2 Troca das ponteiras agulhas da esta o lavagem e Desligar o Cobas Amplicor e Acessar a roda de lavagem abrindo a tampa principal do Cobas Amplicor e levantar o teclado As ponteiras agulhas de aspira o e de ressuspens o ficar o vis veis figura 3 e As agulhas de Ressuspens o e a tubula o de conex o s o recolocadas individualmente e Remover as agulhas de Ressuspens o soltando as pressionando o grampo no topo da bra o de lavagem e depois retirando as agulhas de sua posi o Desatarraxar o encaixe do outro extremo da tubula o para desconect la totalmente e Substituir as ponteiras de Ressuspens o por pe as novas procedendo de maneira inversa da desmontagem e Ao substituir a tubula o certificar se de que cada terminal da tubula o esteja bem conectado na posi o determinada aos n meros corresponden
114. do ser realizado automaticamente gt Se a op o Reflex testing n o desejada deixar o campo de op o do teste em branco e pressionar ENTER Pressionar STEP para selecionar o teste Pressionar ENTER duas vezes 10 Pressionar J para ir para o pr ximo A tube 11 Repetir a partir da etapa 6 para cada A tube 12 Pressionar PRINT para obter uma c pia 13 Pressionar ESCAPE para salvar a lista de trabalho para o A ring G Selecionar o Modo de corrida 1 Pressionar at aparecer na tela SY Conf 2 Pressionar 1 para selecionar SYSTEM SET UP 3 Pressionar EDIT 4 Usar para selecionar o m dulo de corrida BASIC ou PARALLEL 5 Basic rea o do come o ao fim sem interven o do operador 6 Parallel o aparelho p ra ap s a Desnatura o o operador troca os A Rings para a posi o de detec o e acrescenta outro A Ring para amplificar 7 Pressionar ENTER 8 Pressionar para salvar 183 H Iniciar uma corrida 1 Verificar a quantidade de D cup 2 Verificar se o reservat rio de solu o de lavagem suficiente para realizar a corrida 3 Esvaziar o waste container gal o esgoto 4 Pressionar START 5 Verificar a impressao do LOAD CHECK I Gerenciar Resultados Para deletar resultados OBS Recomenda se deletar os resultados semanalmente 5 Pressionar at aparecer na tela R Treat 6 Pressionar 2 Result Management 7 Usar para selecionar delete ID um A ring especifico ou Delete All A rings 8
115. dologia BOOM O NucliSens Extractor um equipamento desenhado para realizar o isolamento automatizado de cidos n cleicos a partir de v rias amostras biol gicas utilizando a metodologia BOOM O instrumento reduz significativamente o tempo necess rio para a extra o de cidos nucl icos e reduz o risco de contamina o entre as amostras devido a seu sistema de extra o totalmente fechado O sistema apropriado para o trabalho com um grande n mero de amostras na tecnologia NASBA 105 9 CONFIGURA O DO SISTEMA E o C a 3 Impressora Filtro de vapores Container do Esgoto 106 B ID R IE U X CONFIGURA O DA UNIDADE PRINCIPAL LED da LED da esta o 1 esta o 2 Montagem da rosca superior em eleva o Montagem da rosca superior abaixada Encaixe do cartucho Rosca do encaixe do cartucho gira para Porta da esta o x aberta tj prender o cartucho Porta da esta o fechada Cartucho encaixado Encaixe cartucho esgoto Alavanca de ejecao da conex o de esgoto 4 Detector do ixe d Aquecedor tubo de do cartucho ido manivela do cartucho 107 BIOM RIEUAX FLUXO DE TRABALHO DO EXTRACTOR LIGAR O EXTRACTOR V LVULA GIRA ER O ESGOTO DESCARTE Um BUFFER FECHAMENTO E SUB CAMARA LAVAGENS md WASH BUFFER LAVAGENS TM ETANOL 709 o LAVAGENS cow ACETONA SECAGEM
116. e Primer 2 Reverse Transcriptase se Transcriptase 4 4 1 1 1 3 Detec o Eletroquimioluminesc ncia ECL Na fase da detec o al quotas da amostra amplificada s o adicionadas a quatro tubos contendo uma quantidade padr o de sondas espec ficas e gen ricas Em cada tubo ocorrer uma rea o de hibridiza o entre as sondas e o cido nucl ico de acordo com a figura abaixo Oligobiotina Ru bpy oligo ON OSI 9 Estreptavidina cido Nucleico Figura 4 Representa o esquem tica do processo de hibridiza o entre as sondas e o cido nucl ico A sonda gen rica ligada a esferas magn ticas atrav s do complexo biotina estreptoavidina Estas part culas s o imobilizadas na superf cie de um eletrodo que cont m um ima durante o processo de quantifica o do cido nucl ico as part culas n o hibridizadas e rea o s o eliminadas ap s a passagem de um fluxo de tamp o 83 IR I E U X As sondas especificas s o sintetizadas de acordo com cada sequ ncia dos 20 nucleot deos internos dos RNAs WT Qa Qb e s o marcadas com um tomo de rut nio Ru O Rut nio na presen a de um composto chamado Tripropilamina TPA sofre uma rea o de eletroquimioluminesc ncia ECL desencadeada ap s uma tens o el trica gerada pelo eletrodo Como consequ ncia desta rea o ocorre a emiss o de um ph
117. e vpu p16 influencia a libera o das part culas virais e aumenta a reciclagem do antigeno CD4 O gene env codifica a glicoprote na precursora gp 60 que posteriormente clivada para formar a 9 41 transmembranar e a gp120 glicoprote na de face externa respons vel pela liga o do virus ao receptor celular Por fim o gene nef p27 potencializa a infectividade viral mantendo altos os n veis de infec o Genoma informa o gen tica total contida em uma c lula ou organismo Gene regi o do DNA que controla uma caracter stica gen tica Usualmente um gene codifica uma proteina 13 A Replica o do HIV A figura abaixo mostra como ocorre a replica o do HIV no organismo humano Hau viral parsias Filngrasa 4 gt J al HIV RNA e PE DNA intagratas b n o host gaama lt F A d d O principal receptor para a entrada do HIV 1 na c lula do hospedeiro o linf cito TCD4 A infec o tem in cio quando uma part cula viral que cont m duas c pias de RNA HIV encontra uma c lula com uma mol cula de superf cie chamada CD4 A intera o do virus com a membrana celular feita pela liga o da gp 120 ao receptor CD4 da c lula hospedeira por m co receptores ou receptores secund rios s o tamb m necess rios para a entrada do virus na c lula Participam desse processo co receptores de quimiocinas CCR5 e CXCR4 fusinas Quando o gene que codifica o C
118. e Trocar a agulha fazendo o processo inverso e Fazer um Prime Estendido 199 Levante Figura 6 Zerar a Contagem da Seringa e Pressionar SYSTEM at aparecer na tela SY Diag Pressionar e Pressionar Instrument Run Info e Pressionar SYR 1 xxxxxxxx SYR 2 XXXXXXXX e XXXXXXX representa a contagem de cada seringa Pressionar EDIT e Pressionar SHIFT e SPACE simultaneamente para zerar a contagem e Confirmar pressionando SHIFT e ENTER simultaneamente e Verificar se a contagem foi apagada e Repetir todo o processo para a segunda seringa Pressionar ESCAPE 200 7 Procedimentos B sicos de An lise e Interpreta o de Resultados Validacao da corrida Verificar se na impress o de resultados h alguma mensagem ou coment rio em rela o aos controles N o v lida uma corrida se houver os seguintes coment rios para os controles HIV 1 Monitor Coment rio INTERPRETA O QS INVALID Os valores de absorb ncia do QS est o fora do intervalo O valor de para o controle negativo est fora do NC INVALID intervalo aceit vel O valor para o controle positivo baixo est fora do L LPC INVALID intervalo aceit vel O valor para o controle positivo alto est fora do intervalo aceit vel Indica um valor de Asso do alvo fora da seq ncia Nenhum valor ser calculado repetir todo procedimento extra o de amostras e controles amplifica o e detec o Indica um valor de Asso do
119. ente Como o tamanho da fatia WT vai variar conforme a carga viral do paciente as fatias referentes aos calibradores tamb m v o variar Quanto mais alta for a carga viral do paciente menor vai ser o sinal de ECL dos calibradores Para validar o resultado de amostras com carga viral alta basta calcular o ECL TOTAL daquela amostra e de uma outra amostra qualquer da mesma rotina que tenha o seu resultado v lido e ver se os valores s o similares FATIA Valor de Sinal 46275 EXEMPLO FATIA Valor de Gk Qa 9916 Qb 185047 Qc 46275 Wt baixo Wt alto valor de ECL TOTAL deve ser maior ou igual 1 000 000 e deve ser bem pr ximo entre as amostras de uma mesma corrida Quando o valor de ECL TOTAL est maior ou igual a 1 000 000 e o limite inferior de detec o est em 80 o resultado est v lido No caso do valor de ECL TOTAL estar entre 250 000 e 1 000 000 devemos verificar se a propor o entre os calibradores est sendo respeitada Para sabermos se o valor de sinal dos calibradores est dentro da propor ao correta entre eles basta dividir o valor de sinal do QA por 5 O valor obtido deve estar bem pr ximo ao valor de sinal de Qb O mesmo deve ser feito com o valor de Qb para saber se 130 BICM IRIE U X verificar o valor do Qc Caso a propor o tenha sido respeitada as amostras que estiverem acima do limite de detec o po
120. er limpa e seca AGITADOR Bivolt Ajustar a chave na parte posterior do equipamento Ligar o agitador rede el trica verificar a voltagem Ajustar o bot o de velocidade no n mero 9 Ajustar o bot o de agita o em continua ou peri dica Limpar agitador com lcool et lico 70 em cada etapa da rea o 57 2 Lp T HealthCare TERMOBLOCO Bivolt autom tico Ligar no minimo 15 minutos antes do uso O equipamento est ajustado temperatura fixa de 63 Possui 3 timers T1 T2 T3 que est o ajustados com tempo fixo de 120 minutos Selecione um dos timers Pressione a tecla T1 para disparar a cronometragem o led acima da tecla acende indicando no display o tempo programado 1 2 pressione novamente para disparar a cronometragem o led ficar piscando Repita a operacao acima para os outros timers T2 e T3 Ap s o t rmino do tempo soar um alarme sonoro indicando no display qual dos timers T1 T2 T3 decorreu o tempo Pressione a tecla correspondente para parar de soar o alarme Em caso de queda de energia uma bateria interna recarreg vel mant m os timers e o indicador de temperatura em funcionamento por um per odo de 4 horas Manuten o A limpeza do bloco do incubador dever ser feita sempre que ocorrer o derramamento de l quidos Desligue o aparelho da tomada el trica Com um swab limpo umedecido em lcool et lico 70 fazer a limpeza das cavidades do blo
121. ere os dados e clique ENTER a Os valores est o corretos Clique YES Crie um nome para o arquivo de resultados EX backe250402 dms n Abrir uma op o para preenchimento e informa o da placa da direita da mesma forma que a placa da esquerda Click OK n Crie um nome para o arquivo de resultados EX backd250402 dms O software emitir uma mensagem na tela WAITING FOR DATA m Ap s esta mensagem o software est habilitado para receber os dados enviados pelo equipamento 65 e Bayer HealthCare Partindo do MAIN MENU Menu 1421 ev i 10d System Managment zgruicae Flle Management System Pause Selecione System Management vy amp tam Managenent Hetrieve Data Gate and Time Perftu rmanre checks Maintenance System information Beeper option Selecione Performance Checks Perfurmarnus Checks Detector o1spense Background Aspirate gt Selecione Background Complete as duas placas de ensaio com po os brancos Coloque na bandeja de aquecimento do equipamento N o coloque os PADS Selecione START O equipamento realizar a leitura de todos os po os e enviar automaticamente os dados para o computador A leitura de cada po o dever ser inferior a 0 050 RLUSs Retorne ao Main Menu utilizando a tecla Previous 66 er HealthCare 6 3 MANUTEN O QUANDO NECESS RIA Este procedimento pode ser realizado caso o equipamento apresente err
122. espec fico a foi cadastrada Cadastrar o tipo de rack de posi o errada no menu oa reagente correta All tests finished Os testes solicitados j Verificar a identifica o das terminaram amostras Foi adicionado um reagente gen rico na rack de reagente espec fico ou vice versa Rack type mismatch Apagar os resultados de algumas ordens anteriores ap s ter imprimido os resultados a serem arquivados O sistema n o tem mem ria para armazenar os dados dos testes solicitados Database full Os resultados n o podem ser Delete not allowed purgados se eles n o foram result s exist impressos ou enviados para o LIS Os resultados n o podem ser Modification not purgados uma vez que os Aguardar o t rmino do allowed TC in process testes est o sendo processo processados Imprimir os resultados ou envi los para o LIS antes de purg los Os testes para a lista de No results to selected trabalho selecionada n o order terminaram e os resultados n o est o dispon veis Esperar o t rmino dos testes Os testes para a lista de trabalho selecionados n o terminaram e os resultados n o est o dispon veis cycler with errors especifica o QC menu Ligar para a CARD aborted abortou a amplifica o CARD 215 Results not yet Esperar o t rmino dos testes available Um erro de hardware no Esperar o t rmino da mecanismo de transfer
123. esposta dos mesmos terapia Atualmente a Roche Molecular vem implantando seus novos sistemas baseados na PCR em Tempo Real atendendo s necessidades dos laborat rios cl nicos pesquisas e an lise de alimentos Neste manual voc ter informa es sobre a t cnica de biologia molecular mais utilizada nos laborat rios do mundo obtendo informa es detalhadas do procedimento para a realiza o do teste de carga viral do HIV 141 1 PCR Rea o em Cadeia da Polimerase O que PCR A PCR Rea o em Cadeia da Polimerase uma t cnica in vitro que reproduz a capacidade natural de replica o do DNA uma tecnologia patenteada que gera m ltiplas c pias de uma seq ncia espec fica de nucleotideos de um determinado organismo A PCR constitui um mecanismo para detectar com alta especificidade concentra es extremamente baixas de determinados organismos A tecnologia elaborada por K Mullis e desenvolvida pela equipe de cientistas da Cetus Corporation foi publicada pela primeira vez em1987 na revista Science por R Saiki S Scharf F Faloona K Mullins C Horn H Erlich N Arnheim Amplifica o enzim tica das sequ ncias gen micas da B globina e an lises do s tio de restri o das c lulas da anemia falciforme Science 230 1350 1354 1985 e foi aclamada como uma das mais poderosas ferramentas da biologia molecular Por esta revolucion ria descoberta o Rd Mullis ganhou o Pr mio Nobel de Qu mica em 1
124. espuma dissipar aproximadamente 15 minutos Descarte se n o for usar dentro de 02 horas Reagente de Trabalho Pr Amplificador Prepare o Reagente de Trabalho Pr Amplificador em um tubo de polipropileno de 15 mL de acordo com a tabela Pocos de Amostras Diluente Trabalho Sonda Pr Captura Pre Amplificador Amplificador Amplificadora Tampe o tubo e inverta por 10 vezes e passe no V rtex por 20 segundos Repita se necess rio ate obter totalmente a homogeineizacao Coloque no banho a 37 C at dissipar a espuma Descarte se nao for utilizar dentro de 30 minutos Mantenha o Diluente de Trabalho Pr Amplificador Amplificador no banho a 379C para uso posterior Apos a incuba o overnight e quando os reagentes estiverem preparados pressione o bot o START do Analisador para que se inicie o resfriamento e lavagem das placas NOTA O ciclo de lavagem resfriamento do segundo dia leva aproximadamente 15 a 20 minutos dependendo da temperatura ambiente e do n mero de tiras a ser lavado O equipamento automaticamente ir lavar e aspirar cada po o em seguida a placa ser ejetada Mantenha a placa na bandeja aquecida durante a adi o do pr ximo reagente 47 G 5 HealthCare Quando as placas forem ejetadas imediatamente abra a porta Adicione 100 uL do Reagente de Trabalho Pr Amplificador utilizando uma pipeta multicanal de 12 Carregue a placa da esquerda primeiro da fileira A para H N
125. estilada preferencialmente Tipo I Complete volume com gua destilada preferencialmente Tipo I Selecione START Ap s esta a o Enx g e novamente os frascos A B H 20 com gua destilada preferencialmente Tipo I e complete novamente o volume com gua destilada preferencialmente Tipo I e Bayer HealthCare Selecione START a Terminado o Clean System retorne a tela de System Management utilizando a tecla Previous 4 PERFORMANCE CHECKS Partindo do MAIN MENU Menu Text Event Ld 5ystam Management File Management System Pause Selecione System Management System managenant Retrieve Data Cate and Time Perfornanto Checks Maintenance votes Information Beeper option Selecione Performance Checks Checks Detector Panel o1spense Background Aspirate gt Selecione DETECTOR O equipamento efetuar teste de detec o verificando o dark count que um sinal eletr nico de fundo do tubo fotomultiplicador e o desempenho da l mpada interna de refer ncia Verifique os valores de leitura Dark Count with attenuation and Dark Count with no attenuation menor que 300 Temperatura ambiente entre 18 e 30 C IRL Count with no attenuation esteja entre 700 000 a 1 300 000 Attenuation Factor esteja entre 100 e 196 Selecione START 63 2 T HealthCare Selecione DISPENSE O equipamento efetuar teste de dispensa
126. etiol gicos diferentes do que se est pesquisando ou ainda desconhecidos Por isso fundamental que medidas de biosseguran a adequadas sejam adotadas nos laborat rios onde h manipula o desses materiais Equipamentos de Prote o Individual EPI devem ficar em lugar de f cil acesso aos funcion rios do laborat rio e culos de seguran a protetor facial e m scaras descart veis usadas sempre que houver possibilidade de aeross is e Jaleco longo de mangas compridas e punho retr til preferencialmente descart vel deve ser usados somente dentro da rea do laborat rio e Luvas descart veis devem ser resistentes de material sint tico vinil ou l tex para manipula o de materiais potencialmente infectantes As luvas descart veis usadas para os procedimentos da t cnica PCR Polimerase Chain Reaction devem ser isentas de talco e Pipetas autom ticas devem estar calibradas e validadas e Prop s descart veis e Cal ados fechados e de material resistente Usar EPI um direito seu e a institui o em que voc trabalha obrigada a fornec los Equipamentos de Prote o Coletiva EPC s o utilizados para minimizar a exposi o dos funcion rios ao risco e em caso de acidentes reduzir suas consequ ncias e Chuveiro de emerg ncia e lava olhos devem estar instalados pr ximos ao ambiente laboratorial e Extintores de inc ndio e Centr fugas com rotor provido de tampa Cabi
127. evine contamina o ambiental pela enzima AmpErase e Utiliza tubos de amplifica o e de reagentes fechados evitando a evapora o dos mesmos e Utiliza controle interno para amostras negativas 156 WOMEENMEEXEXxXEMEAMLGAGLLEXEEXEXQI Figura 18 Foto do equipamento Cobas Amplicor Dimens es e Peso do Equipamento e Peso 75 Kg Largura 86 cm e Profundidade 57 cm e Altura tampa fechada 41 cm e Altura tampa aberta 90 cm Especifica es Para um desempenho timo do analisador Cobas Amplicor os requisitos ambientais dever o estar em conformidade com as seguintes especifica es e Temperatura ambiente entre 15 e 32 C e Umidade relativa inferior a 80 a 32 C e Altitude inferior 3000 metros 157 3 Material Necess rio Para a Tecnologia da PCR Materiais de consumo equipamentos e acess rios fornecidos pelo fabricante rea 1 Pr Amplifica o Centr fuga refrigerada para rota o de 23 600 x g Agitador de tubos vortex Pipetas autom ticas de 20 uL 200 uL e 1000 uL Ponteiras com filtros est reis e Rnase free de 20 uL 200 uL e 1000 uL Pipetas sorol gicas de poliestireno est reis de 10 mL Tubos de 2 0 mL tipo Eppendorf est reis e com tampa de rosca Tubos c nicos de 50 mL com tampa Tranfer tips pipeta tipo Pasteur est reis de ponta fina e Rnase free A Rings rea 2 P s Amplifica o Cobas Amplicor Nobreak Impressora D Cups Pipetas sorol gicas de
128. externo NOTA Este procedimento deixa fluido de limpeza no instrumento e nos tubos de limpeza que conservar a tubulu o livre de cristaliza o 124 I R I E UI X PROCEDIMENTO CLEAN O Procedimento CLEAN deve ser feito como rotina para prevenir entupimentos e tamb m verificar se h vazamentos em alguma esta o o aparecimento de muitas bolhas de ar sugere vazamento na esta o neste caso contacte a assist ncia t cnica da empresa Para realizar o procedimento CLEAN o usu rio deve seguir os seguintes passos 1 lt Instale os tubos de limpeza 2 lt No lugar do Wash Buffer instale a garrafa Cleaner contendo etanol 70 3 No menu TOP selecione a op o CLEAN 12 Pressione a op o OK se necess rio Observa o verifique o n vel de etanol 70 na garrafa a garrafa deve estar no m nimo pela metade do seu volume total 125 AAA WN WA GEN NUCLISENS NASBA DIAGNOSTICS BIOM IRIEU NUCLISENS READER Nucleic acid diagnostics DESLIGANDO O EQUIPAMENTO O aparelho deve ser desligado ap s a ltima leitura do dia e ligado novamente 2 horas antes da pr xima leitura No menu INSTRUMENT escolha op o SHUTDOWN O computador solicitar que as tubula es da solu o CLEANER SOLUTION e da solu o ASSAY BUFFER sejam colocadas em gua destilada e ou deionizada Quando estiverem prontas pressione qualquer tecla para dar in
129. forma O dado de identifica o u Format error 2 identifica o do Bip Tela do cassete est incorreto cassete Esta sendo feito o oad Fazer apenas uma Cassette not unique do mesmo cassete em us we unica vez o oad de Bip Tela HHHH duas posi es diferentes cada cassete na rack da mesma rack Cycling finished with Ciclagem do A ring 452 HHH eo indicado foi feita mas Contactar a CARD Bip Tela TC error um erro foi detectado 221 A opera o solicitada ao Printer busy try sistema n o pode ser Tentar mais tarde later realizada porque o mesmo est ocupado Nenhuma a o e Ip Print message necessaria Bip Tela 421 Wrong password O password digitado n o Entrar com o password Bip Tela esta correto correto A opera o solicitada ao sistema n o pode ser Locked system busy Tentar mais tarde Bip Tela realizada porque o mesmo est ocupado O operador abortou o Duplicate number 0 n fornecido ao sistema Duplicate number number A Usar novo n mero Bip Tela ja existe funcionamento da agulha Resolver o problema Tranfer aborted TCs will continue mas a desnatura o e corrida precisasse ser abortada Pressionar START para recome ar a desnatura o e detec o que fez com que a a ciclagem continuar Bip Impress detec o est o paradas Tela N o inverter os cassetes durante a prepara
130. ga o de instrumento ou se os equipamentos est o ligados 4039 Volume de fluxo 0 n o Chame a assist ncia t cnica p de processar ajuste do FRI 4040 Volume de fluxo n o p de Chame a assist ncia t cnica processado 4042 a 4051 de comando ao iniciar novamente 4053 Arquivo de configura o PASM foi alterado Arquivo de dados foi Chame a assist ncia t cnica modificado Nome do arquivo inv lido Escolha o nome do arquivo 4054 4058 correto Erro de comunica o Verifique os cabos de liga o ou se os equipamentos est o ligados 4068 a 4070 corrompido 4072 Sequ ncia do programa est em execu o 4073 Nenhuma sequ ncia do Instrumento n o dispon vel execu o 4074 N o p de ler o arquivo sequ ncia 4063 Erro de software Chame a assist ncia t cnica 4076 Sem mem ria suficiente Desligue e ligue o PC Dara executar o novamente O adaptador do mouse n o Desligue e ligue o PC foi encontrado novamente 4078 a 4080 Erro de software Chame a assist ncia t cnica 133 BIOM RIEUX C DIGO DE ERROS CAUSAS PROCEDIMENTOS 4081 Revis o da calibra o Chame a assist ncia t cnica incompat vel te 50 tubos m ximo 12 amostras 4085 Aguarde terminar a rotina executar pedido 4089 Marca incompat vel de Mantenha os instrumentos instrumentos PC impressora e lei tor instalados pelo fornecedor 4090 Arquivo de calibra o Chame a assist ncia t cnica inv lida incapaz de l lo
131. gent not na rack de reagentes loaded ENNI ud EIE cover open termocicladores est aberta tampas dos termocicladores END US WF UN DN reagent not loaded n o foi colocado na rack desnaturacao ENN 8 ME Dilution reagent not amplicon n o foi colocado na de dilui o do amplicon 210 Duplicate number Colocar um cassete novo de substrato preparado recentemente Verificar a presen a de bolhas no D cup Mensagem liberada no loadcheck junto com blank error para indicar que o cassete atual apresenta uma alta leitura do blank Load Check Mensagem liberada no loadcheck para indicar que o cassete de substrato est fora Colocar um cassete novo de substrato preparado recentemente Indica que o reagente est vencido N o h reagente suficiente Adicionar suficiente cassete O conjugado n o foi colocado de conjugado suficientes para o teste Load inconsistency no generic reagent rack in loadlist Load inconsistency reagent not loaded Load inconsistency Sub reagent not loaded More than 210 detections loaded O n mero da rack de reagentes gen ricos n o foi informado ao sistema O n da rack de reagente espec fico n o foi informada ao sistema N o foi adicionado reagente espec fico suficiente para a detec o O substrato n o foi adicionado na rack de reagentes N o foi criad
132. gent rack Um reagente espec fico n o Posicionar o reagente na 211 1 pos empty Specific reagent rack 2 pos empty Specific reagent rack 3 pos empty File in use modification not saved Operation Run clean up in process Accept or enter the QS copy amp first Database full No reflex tests possible Only control tests allowed Order entry error test xx Test file does not exist Order does not exist Order just modified by foi adicionado na rack da posi o amp 1 da plataforma ica ausente Um reagente espec fico n o foi adicionado na rack rack da posi o amp 2 da plataforma do X ausente Um reagente espec fico n o foi adicionado na rack 3 da rack da posi o plataforma ica ausente Os arquivos est o protegidos e o processo desejado nao pode ser realizado O sistema est retirando os tubos de uma corrida abortada Se foi realizada com sucesso o sistema retorna para STANDBY Um novo n mero de c pias Inserir o n mero de c pias nao foi adicionado na ordem do QS correto Os resultados de algumas ordens de trabalho dever o A mem ria do sistema n o tem espa o para adicionar mais informa es N o pode configurar controles para o reflex tests A designa o do controle n o foi selecionada A ordem para este teste n o foi criada A ordem de trabalho indicada n o foi criada A ordem de trabalho foi modificada pelo hos
133. h Step Incobale 13Dec 1 10 12 Cooldawn rycle actvaled 120 01 122 Loddovn cuc le complele i13Deco 10 22 Step Wal T3Decb1 10 26 Step Wail T3Dgco 1027 Step Timeout 13Dec 1827 Step Prima 1IDecO1 10 27 Slep Timeoul T3Deco 10 27 1 1035 Step Primas 1IDec 1 10 23 Siep Timeou 10 26 Slaj Frima l3Deco 10 79 Timeout 13Dec l 10 28 Step Tali 130 01 10 30 Step Prima 10 30 Siep Aspire T3Deco 10 30 Step Timeout T3Decb1 10 30 Shap Load 10 32 Timea i Deco 10 32 Step Tmeaul T3DeeD 10 32 Step Timeout 121025601 10 33 1300 11 03 Step Wail 1IDec 1 11 03 Siep Timecul AEs 11 03 Timea 13E c01 11 03 Step Rand 1310071 11 04 Calibration Results Non altenaated IRL count 1045931 on pr en ng ca 00 Ch 1500 pg On 06 Dr CO 0600 2000 CO 15 00 AMenualed count EREDT i Meon alenuaeddeakcount 132 dok couri 138 Ahenualicn tacior 160 0 IPLE aduelment factor 095 E 1ib 01 11 05 Calibrabon Men aibeniited count 1045058 fAHnenualed FAL count E7 TA i Non allenuated desk coui 130 dark conri 145 Henualicn aclor 158 1 IRL adreiment factor as 2 Lp T HealthCare 8 Problemas Causas e Solu es na Realiza o dos Testes C digos de Erros do Equip
134. hospedeira OBS Em um mesmo organismo o provirus pode em algumas c lulas permanecer em lat ncia e n o dar sinal de sua presen a Em outras c lulas o processo replicativo pode ser lento com multiplica o controlada ou acelerado levando a lise celular Para que o DNA proviral produza novos virus c pias de RNA devem ser feitas O prov rus para se replicar subverte a maquinaria celular e passa a comandar os mecanismos enzim ticos da c lula hospedeira Isso significa dizer que as enzimas celulares passam a trabalhar na sintese de RNAs gen micos mensageiros mRNA e na s ntese de prote nas virais As citocinas prote nas envolvidas na regula o normal da resposta imune podem tamb m regular a transcri o Mol culas como fatores de necrose tumoral TNF alfa e interleucina IL 6 secretados em n veis elevados pelas c lulas de pacientes HIV positivos podem auxiliar na ativa o do DNA proviral Outras infec es por organismos tais como Mycobacterium tuberculosis podem tamb m melhorar a transcri o O RNAm viral transportado do n cleo celular para o citoplasma e come a a tradu o das prote nas virais utilizando a maquinaria celular de s ntese prot ica O pr ximo passo a montagem da part cula viral proteinas e RNAs virais e o ancoramento da part cula membrana plasm tica da c lula hospedeira Uma part cula viral imatura formada e ao aderir membrana celular adquire um envelope Ocor
135. icar a hora e data do estao incorretos sistema O cassete foi inserido Colocar a identifica o correta Format error i incorretamente via teclado do cassete Verificar o D cup usado para o blank substrato em rela o High Substrate Blank Agulha obstru da a bolha ou espuma e volume do substrato no D cup 3004L a REED ESET ou vencido e reiniciar a corrida Level detection Pode haver ar no sistema de Realizar o Extended Prime statistic warning Limpar e secar a agulha Verificar a localiza o do sensor de n vel e conect lo se necess rio A detec o de n vel pode estar desconectada A concentra o do tamp o de Preparar um tamp o de lavagem pode estar incorreta lavagem novo reagent pos___ detectar o reagente quando terminar a corrida O conjugado dispon vel insuficiente para a ordem solicitada Not enough A solu o de desnatura o Denaturant Solution dispon vel insuficiente para a ordem solicitada O reagente em quest o n o Not enough o e Adicionar outro cassete do suficiente para realizar a generic test reagent I reagente Not enough Substrate N o h insuficiente substrato Adicionar outro cassete de reagent found para a ordem solicitada substrato SB3 Adicionar outro cassete de conjugado Not enough Conjugate reagent CN found Adicionar outro cassete de solu o de desnatura o N o h suficiente reagente para realizar a ordem so
136. icar se h uma tonalidade amarela ou vazamento no frasco caso isso ocorra contatar a Roche para reposi o do kit inteiro n o utilizar o kit Dissolver completamente os cristais do HIV 1 LYS 37 n o usar BM por no m ximo 30 minutos 1 frasco suficiente para 12 amostras Homogeneizar o HIV 1 QS v1 5 tubo com tampa roxa no vortex por 10 seg Adicionar 100 uL P200 do HIV 1 QS v1 5 em um frasco de HIV 1 LYS v1 5 observando a colora o rosa Agitar bem no vortex est vel por 4 horas temperatura ambiente Nesta etapa todos os tubos dever o estar fechados somente o tubo que est sendo manipulado dever estar aberto e poder ser usada uma nica ponteira Pipetar 600 P1000 do Working Lysis Reagent preparado na etapa anterior em cada tubo de 2 0 mL devidamente identificados para paciente e controles Adicionar 200 uL P200 plasma de cada paciente vortex 3 a 5 seg logo em seguida da adicao Nos tubos dos controles negativo e positivos baixo e alto adicionar 200 pL P200 de NHP vortex 3 a 5 seg logo ap s a adi o 161 e Agitar os tubos controles que vem no kit fazer um spin para retirar o liquido da tampa e a seguir adicionar 50 dos controles que est o no kit de extra o com tampas azul e vermelhas Ver esquema a seguir SEQU NCIA DE PREPARO DOS CONTROLES Pipetar 50 uL de controle HIV Adicionar 200 uL de NHP Tubo 2 mL com tamp o Vortex Tubo de controle que Lysis mai
137. icionada incorretamente Roda de lavagem molhada ou com espuma WashFluid fatal event err 2383 4344 Bip Impress Manualmente remover o D cup apertando a 260 D cup could not be O pegador de D cup n o mola do pegador de D released soltou o D cup cup Limpar o pegador de D cup 21 Verificar 1 posicionamento da rack de D cup 2 se h algum D cup preso no pegador de D cup 3 esta o de lavagem incubadora fot metro e plataforma para ver o posicionamento da rack de D cup 4 D cup quanto a algum defeito Reiniciar o sistema para limpeza Contactar a CARD Verificar agulha usando procedimentos para agulha molhada ou Bip Impress torta ou falha na verifica o da agulha O sensor de D cup n o 261 D cup missing detectou o D cup Bip Impress A agulha falhou durante a detec o do poste de inicia o durante a inicia o 262 Init detection error Limpar torre de inicia o Enxugar a agulha Verificar 1 volume do tamp o de lavagem H ar no sistema se h bolhas no sistema se as conex es das tubula es est o bem presas Realizar Extended Prime Transfer tip wet or bent 263 Bip Impress Verificar 1 encaixe da agulha 2 se a capa protetora da agulha est posicionado em seu devido lugar A agulha est torta se os reagentes e racks de D cup est o bem posicionados se os reagentes est o bem fechados
138. ificar se a roda de A torre de lavagem nao foi A e lavagem esta posicionada posicionada corretamente corretamente s Vide Liquid is present or Ha liquido ou espuma na roda flooding occurs at the wash de lavagem E wheel O sensor nao esta o Tu I e Verificar a posi o do sensor devidamente posicionado w A a o n o permitida E Miscella User Privilege E Solicitar o acesso a um I I devido ao nivel de acesso ao 2 neous Violation usuario de maior privil gio MENSAGENS DO ANALISADOR POR C DIGO DO ERRO 005 RAM Error Contactar a CARD Controller error Contactar a CARD Bip Impress 203 Contactar a CARD 205 Contactar a CARD a CARD Bip Impress Reagent emperature too Temperatura do Reduzir a temperatura Bip impress on ambiente acima de 38 Contactar a CARD Incubator Temperatura da too incubadora acima de Contactar a CARD Bip Impress prep 39 C TcControl system err DO re 5 Contactar a CARD Bip Impress controle da temperatura 21044 d TcControl percom Problema no hardware de Contactar a CARD Bip Impress open err controle da temperatura 213444 TcControl percom Problema no hardware de Contactar a CARD Bip Impress send err controle da temperatura 2142 43 d TcControl percom Problema no hardware de Contactar a CARD Bip Impress rece err controle da temperatura 215244 d TcControl cmd Problema no hardware de Contactar a CARD Bip Impress
139. imerase Mn rTth DNA Polimerase Nucleot deos Citosina dCTP Guanina dGTP Uracila dUTP Adenina dATP AmpErase Primer Biotinilado Figura 2 Master Mix Reagente Pr Transcricao Reversa Amplificacao por PCR Selec o do Alvo A sele o da sequ ncia de RNA alvo do HIV 1 depende da identifica o de regi es dentro do genoma do HIV 1 que apresentem uma conserva o m xima da sequ ncia Por conseguinte a sele o adequada dos iniciadores e da sonda essencial para que o teste tenha capacidade para detectar o gen tipo do HIV 1 O Teste COBAS AMPLICOR HIV 1 MONITOR usa os iniciadores SK145 e SKCC1B para definir uma sequ ncia de 155 nucleot deos dentro da regi o altamente conservada do gene gag do HIV 1 A regi o gag codifica os ant genos espec ficos de grupo ou prote nas estruturais do n cleo do virus Em regra os genes gag do HIV i apresentam uma extens o de aproximadamente 1500 nucleot deos estando localizados sensivelmente nas posi es 789 a 2290 do genoma do HIV A sequ ncia de nucleot deos dos iniciadores foi aperfei oada para permitir uma amplifica o equivalente dos subtipos do HIV 1 do Grupo M Transcri o Reversa As rea es de transcri o reversa e de amplifica o por PCR s o efetuadas no termociclador utilizando a enzima termoest vel recombinante Thermus thermophilus DNA Polimerase rTth pol Na presen a de mangan s e sob condi es de tamponamento adequadas a rTth pol
140. impo antes e no final da rotina de trabalho com uma solu o de hipoclorito de s dio a 0 5 Usar panos de ch o distintos para a limpeza das salas As bancadas devem ser descontaminadas com hipoclorito de s dio a 0 5 desde que n o sejam de material met lico nesse caso proceder a limpeza com lcool 70 p p antes e depois da rotina de trabalho Limpar todos os equipamentos pipetas centr fugas agitadores termoblocos etc antes e depois de cada rotina com lcool a 70 p p Ao usar cabines de seguran a que possuam l mpada ultravioleta acende la por 20 minutos ap s a passagem do lcool a 70 p p Todos os procedimentos de limpeza devem ser feitos por pessoal qualificado E importante verificar se essas pessoas est o usando os equipamentos de prote o individual EPI apropriados Procure manter como parte da sua rotina as seguintes pr ticas Lave as m os antes e depois de qualquer procedimento laboratorial Nunca pipete com a boca N o fume n o coma n o beba dentro da rea do laborat rio Quando estiver usando luvas nao manuseie objetos de uso comum como telefone ma anetas e etc e n o saia da rea do laborat rio com elas N o guarde alimentos e bebidas em geladeiras destinadas ao armazenamento de material biol gico Nunca entre na sala 1 pr se j entrou na sala 2 p s Se precisar faze lo pe a que algu m o fa a para voc 20 Preparo de solu es desinfetantes Hipoc
141. ios e O Password senha associado ao usu rio Agora clique no bot o CB LIN A tela principal do sistema ser carregada e mostrar a ltima rotina carregada no sistema Antes de comecar a leitura voc deve verificar se o equipamento esta pipetando corretamente Para isso no menu principal abaixo representado escolha a op o INSTRUMENT e no menu que se abre escolha a op ao ADVANCED No menu ADVANCED selecione a op o CHECK FLOW RATE e realize o procedimento descrito Faca o check flow rate sempre que ligar o equipamento antes de uma nova rotina Agora j podemos entrar com os nomes da nova rotina Para isto clique na opcao ROUTINE do menu 115 BB ID M IR I E U e no menu de op es que surgir clique na op o NEW RUN A seguinte tela aparecer Flush current wWurklist Selecione a mo ys op o A tela que d o nome aos ensaios aparecer O nome do ensaio dado de acordo com a data e o n mero de ensaios rodados previamente naquele dia 98010701 run ou seja ano m s dia n mero do ensaio naquela data run Clique em OK A tela com a lista de trabalho Worklist aparecer O comeco da rotina j aparecer na tela com o tubo referente solu o de refer ncia RS como tubo 1 Abaixo da tabela principal aparecer a seguinte tabela Selected Assay HIV 1 QT sample ID Vol Add to List Delete from List Print Worklist Cancel Clique sobre o select as
142. ites Tuberculose e infec es respirat rias bem como patologias cardiosvasculares e c ncer atrav s de an lise de amostras biol gicas sangue saliva urina Segmento Industrial An lise de amostras industriais alimento produtos farmac uticos e cosm ticos ou amostras do meio ambiente gua ar superficie para determinar sua qualidade microbiol gica L der mundial no segmento de microbiologia a bioM rieux apresenta tamb m forte presen a nos segmentos de imunoensaios hemostasia e biologia molecular Pioneira no fornecimento de testes de Carga Viral HIV para o Minist rio da Sa de desde 2001 a bioM rieux respons vel pelo fornecimento de testes e suporte t cnico para 33 laborat rios da Rede Nacional de Carga Viral para HIV A Partir de 2005 estaremos lan ando novos produtos voltados para o segmento da Biologia Molecular NucliSens miniMAG e NucliSens Magnetic Extraction Reagents Dois inovadores e importantes produtos para extra o de cidos nucl icos capazes de efetivamente extrair tanto DNA quanto RNA Oferecendo um alto n vel de flexibilidade possibilitando testar diferentes tipos de amostras biol gica soro plasma sangue l quor fezes escarro etc e em diferentes volumes NucliSens EasyQ o primeiro sistema autom tico que combina a metodologia NASBA de amplifica o e a tecnologia Real Time de detec o molecular bioM rieux fazendo do diagn stico in vitro a semente pa
143. l do primeiro ciclo da PCR Produ o da dupla fita de DNA Amplicon Amplicon Biotina cDNA Figura 10 Final do segundo ciclo da PCR A rTth DNA polimerase catalisa a extensao do primer 150 Fita Simples de RNA 1 ciclo 1 h brido RNA CDNA Mur 2 ciclo 2 3 ciclo 4 Figura 11 PCR Amplificacao Exponencial A cada novo ciclo dobra a quantidade do alvo resultando em um aumento exponencial de Amplicon 151 2 Apresenta o dos Kits e Equipamentos Apresenta o dos Kits O teste Cobas Amplicor HIV Monitor um teste de amplifica o de cidos nucleicos in vitro destinado quantifica o do RNA do v rus da Imunodefici ncia Humana Tipo 1 HIV 1 no plasma humano Atrav s deste teste poss vel determinar o RNA do HIV 1 numa concentra o de 50 a 750 000 c pias mL O kit Cobas Amplicor HIV Monitor v1 5 fornece reagentes para um total de 48 testes e apresentado como uma nica caixa a qual cont m 2 outras caixas uma contendo os reagentes de amplifica o reagentes de prepara o das amostras e controles e reagentes espec ficos de detec o e a outra caixa que cont m os reagentes gen ricos de detec o AMPLICOR Figura 12 Foto do kit Cobas Amplicor HIV 1 Monitor v1 5 152 AMPLICOR COBAS AMPLICOR HIV 1 MONITORTM Test version 1 5 Reagenti S Re y nts Spezifische Reagenzien R actifs Sp cifiques 5 pec licos Figur
144. la parede oposta da marca o do tubo e pelo menisco do l quido tomando cuidado para n o raspar ou perder o pellet N o usar bomba de v cuo retirar o m ximo poss vel a presen a do lcool pode inibir a rea o da PCR parcial ou totalmente e Adicionar 400 uL P1000 HIV 1 DIL vortex 10 seg e A amplifica o das amostras e controles dever ser realizada dentro de 2 horas caso n o seja possivel congelar imediatamente a 209C por no m ximo uma semana as amostras extra das somente poder o ser descongeladas uma vez mais de um descongelamento poder abaixar a carga viral e Caso as amostras tenham sido congeladas deix las temperatura ambiente para descongelar Agitar no vortex por 5 seg e Usando uma ponteira com filtro para cada amostra Pipetar 50 HL P200 das amostras preparadas nos A tubes evitar pegar qualquer precipitado e N O passar com a ponteira contendo amostra por cima de outros tubos que est o abertos tampar imediatamente ap s a adi o da amostra Uma vez colocada a amostra preparada no A tube com Master Mix a amplifica o dever ser iniciada dentro de 45 minutos e Levar o s A ring s ao termociclador do Cobas Amplicor 163 C Preparac o do COBAS AMPLICOR rea 2 Amplificac o e Detecc o a Ligar a IMPRESSORA b Realizar a Manuten o Di ria gt Wash Buffer Kit Preparar Wash Buffer concentrado 10 vezes 2 garrafas Diluir o Wash Buffer com gua destilada Est vel por 2
145. licitada Not enough test reagent found Adicionar outro cassete para O reagente em quest o Verificar a identifica o ou O n mero j foi utilizado usar um n mero diferente Not unique I anteriormente Excessive noise or A rack de reagente esta I Reposicionar a rack de Reagent Rack rattling occurs at the colocada incorretamente na reagentes na plataforma reaqent rack plataforma A plataforma da rack de reagente na plataforma n o Apertar os parafusos que est posicionada prendem a plataforma uramente Generic reagent rack Os reagentes que est o na Cadastrar os reagentes not defined rack de reagentes gen ricos gen ricos 214 foram cadastrados E O reagente gen rico que foi adicionado na rack n o est Generic reagent rack Posicionar o reagente na pos empty presente rack O n mero de identificac o da Not unique rack foi utilizado anteriormente Verificar a identifica o ou usar um n mero diferente Verificar se todas as racks de reagentes necess rias est o posicionadas A rack n o est localizada na Rack not present A sua posi ao programada A rack de reagente est M I Verificar a posi ao correta da posicionada incorretamente rack na plataforma na plataforma O sensor da rack est w e Verificar o sensor danificado Inserir o reagente gen rico na rack de reagente gen rico e o reagente espec fico na rack de reagente
146. lizado Ver e imprimir l Selecionar o proximo E resultados e apagar arquivo arquivos Selecionar o modo b sico ou paralelo Inserir os par metros Mover para o pr ximo SYSTEM no sistema Mudar data campo ou linha e hora Prime o sistema Inserir informa o Pressionar para iniciar num rica ou START uma corrida c digo num rico para letras Deletar s um Interromper ou abortar E uma corrida id Sair de qualquer tela Permitir ao operador salvando os dados fazer mudan as inseridos Para voltar Audor selecionar para a primeira tela en op es e dados principal Imprimir a lista Mostrar informa o corrente HELP sobre o campo ou o arquivo que se selecionado apresenta na tela Usada em conjunto com Salvar os dados HELP outras teclas para Tra inseridos e o mover em mover para o proximo dire o contr ria arquivo 172 Teclas que sao utilizadas simultaneamente Para deletar o campo onde est o cursor Para deletar um arquivo inteiro Ex Rack de Reagentes Ordem Perfil Test File PCR File Para confirmar uma acao Ex apagar resultados alterar data e hora Mover o cursor um espa o para tr s Para mover o cursor para arquivos anteriores Para mover o cursor para op es anteriores Teclas utilizadas na tela alfa num rica para mover o cursor para telas anteriores 173 36 Tabela Alfa num rica 66 67 O 66 usado como espa o 174 RUN S R
147. lorito de s dio a 0 5 e a 2 Para preparar uma solu o percentual de hipoclorito deve se levar em conta a concentra o de cloro ativo indicada no r tulo do hipoclorito que se tem dispon vel Para o preparo da solu o desinfetante utilizar as seguintes f rmulas 1 F rmula para c lculo do volume necess rio do hipoclorito dispon vel VSH x de cloro ativo desejado volume necess rio do Hd 9o de cloro ativo do Hd Hd gt hipoclorito dispon vel VSH gt volume final da solu o de hipoclorito no percentual de cloro ativo desejado 2 F rmula para c lculo do volume de gua a ser adicionado ao Hd para obter o hipoclorito no percentual de cloro ativo desejado Volume de gua a ser adicionado VSH volume necess rio do Hd Hipoclorito no percentual desejado volume necess rio de Hd volume de gua Exemplos 1 Exemplo de aplica o da f rmula para preparo de hipoclorito a 0 5 a partir de hipoclorito com 50 de cloro ativo Dados VHS 2000 ml 9o de cloro ativo do Hd 50 9o de cloro ativo desejado 0 5 Calculando o volume necess rio de hipoclorito disponivel 2000 ml x 0 5 volume necess rio do Hd 20 ml Calculando o volume de gua a ser adicionado Volume de gua a ser adicionado 2000 ml 20 ml 1980 ml 21 Portanto para preparar 2000 ml de hipoclorito a 0 5 a partir de hipoclorito a 50 voc precis
148. ltados sejam comparados dentro do mesmo m todo Os princ pios metodol gicos dos tr s produtos dispon veis comercialmente encontram se descritos na tabela abaixo REGI O FAIXA DE VOLUME DE PRODUTO METODOLOGIA GEN MICA DETEC O AMOSTRA UTILIZADA Cp mL UTILIZADO uL AMPLICOR RT PCR GAG 400 a 750 000 HIV 1 HIV 1 QT 10 000 000 VERSANT HIV RNA 3 0 POL 50 a 500 000 1000 ASSAY Contamina es Para uma t cnica de amplifica o de cidos nucl icos o termo contamina o pode assumir alguns sentidos diferentes 1 Contamina o do t cnico pela amostra toda e qualquer amostra de fluidos biol gicos deve ser tratada como de potencial risco infeccioso 2 Contamina o de uma amostra para outra no caso de uma t cnica de amplifica o cuidados para n o respingar amostras nas luvas nas bancadas e em qualquer material sao essenciais Todo material utilizado tem que ser novo e est ril uma vez que a menor contaminacao por outra amostra pode ser amplificada e gerar um resultado falso 3 Contamina o por enzimas degradantes do material a ser analisado nas c lulas vivas uma das fun es do DNA codificar a sequ ncia das prote nas A liga o entre o c digo gen tico e a prote na funcionante o RNA Assim a exist ncia e degrada o da mol cula de RNA t m que ser controlada de alguma forma pois enquanto o RNA estiver presente no citoplasma celular aquela c lula produzir
149. luente da enzima Rolar o tubo entre os dedos delicadamente Aguardar 15 min e centrifugar por 15 segundos pulsar Caso a esfera esteja quebrada reconstitua como prescrito Caso a esfera sofra altera es de cor ou tamanho contacte a empresa para troca da mesma OH NUNCA VORTEXAR O Enzima Liofilizada Coloca se diluente INSUMOS Microtubos ponteiras de 1000uL com filtro ponteiras de 200uL com filtro ponteiras de 20uL com filtro gaze ou papel absorvente cortado previamente descarte para ponteiras e luvas 977 BICOM IRIE U X v Microtubos Se voc iniciar a rea o a partir desta etapa ent o numere os microtubos novos para realizar a amplifica o se n o utilize os microtubos numerados no in cio da rea o Y 1 caixa de ponteiras de 1000uL com filtro Y 1 caixa de ponteiras de 200uL com filtro Y 1 caixa de ponteira de 20uL com filtro Y Gaze ou papel absorvente cortado Y Descarte apropriado para as ponteiras v Luvas S egii ncia antes de iniciar a rea o Procedimento Antes de iniciar o procedimento verificar as temperaturas dos termoblocos 1 A Utilizando a pipeta P20 e uma ponteira de 20uL com filtro pipetar em todos os microtubos 10uL de primer Fechar todos os microtubos Procedendo assim se usa apenas uma ponteira pois os microtubos estao limpos Com o auxilio de uma gaze ou papel absorvente abrir o tubo de isolamento e o tubo de amplificaca
150. m erro O resultado desse controle ou amostra inv lido repetir o processamento da amostra amplifica o e detec o para essa amostra 203 Exemplos de resultados de Asso fora da sequ ncia do Alvo do QS Fator de Dilui o Fator de Interpreta o dos resultados Dilui o _ V lido Amostra com alto 2 578 0 700 0 397 t tulo de absorb ncia acima do intervalo linear V lido amostra com baixo t tulo de absorb ncia ou Exemplo 2 0 216 0 004 0 016 0 007 3 436 0 743 M proximo do limite de detec o Inv lido aparecer uma mensagem OD SEQUENCE Inv lido aparecer uma Exemplo 4 2 887 1 357 mensagem OD SEQUENCE Inv lido aparecer uma 0 004 mensagem OD SEQUENCE 204 Resultados liberado pelo Cobas Amplicor Result RingID T T Test Titer 276 186 HIM E 2 5 HIM E 218 815 HIM 4 07E2 218 4 5 HIM 1 15E2 AIO 5S HIM E Inspection opecimenID FLG Comment 30093870 TARGETOD LO 30093873 TARGETOD LO 30093889 30094015 RESULT LO 30094017 TARGETOD LO QS Target Absorbances QS Absorbances Time completed 62 0 003 0 006 1 JUN 04 20 59 62 0 004 0 005 1 JUN 04 21 06 62 0 504 0 060 1 JUN 04 21 13 62 0 299 0 033 1 JUN 04 21 21 62 0 006 0 004 1 JUN 04 21 28 004 0 491 0 004 O 443 0 008 0 150 0 007 0
151. m filtro pipetar 5uL da amostra dilu da em cada um dos tubos com numera o correspondente a aquela amostra No total s o quatro tubos de leitura para cada amostra cada um j contendo uma das 4 sondas de detec o WT Qa Qb Qc Como as sondas s o diferentes necess rio trocar de ponteira a cada tubo pipetado mesmo sendo a mesma amostra 102 BICM IRIE U 7 Prepara o AN Tubo branco Assay Negative Utilizando a pipeta P20 e uma ponteira de 20 uL com filtro Pipetar 20uL da sonda WT preparada oligop rola e sonda WT em um tubo novo de 12x75mm de polipropileno Utilizando a pipeta P20 e uma ponteira de 20uL com filtro pipetar 5uL de diluente de deteccao 8 Cobrir todos os tubos com uma fita crepe 9 Agitar toda a estante para homogeneizar bem sem tir la da bancada para evitar que o material se espalhe na parede do tubo Quando n o der mais para ver a poeirinha marrom no fundo dos tubos a agitacao foi suficiente 10 Incubar todos os tubos na pr pria estante em banho maria a 41 por 30 min sendo que a cada 10 min deve se retirar a estante do banho maria e coloc la na bancada para agitar bem voltando a estante para o banho Essa incuba o ir promover a hibridiza o 11 Durante a hibridiza o aproveite para checar o equipamento READER realizar o check flow rate o back flush quando necess rio e cadastrar a rotina verificar procedimentos b sicos de opera o 1
152. m primer oligonucleot dico designado P1 sequ ncia alvo O primer P1 projetado para que a por o 3 da sequ ncia seja complementar ao RNA alvo e a por o 5 codifique o promotor para a T7 RNA polimerase Depois da liga o o primer estendido pela a o da Transcriptase Reversa do virus da Mieloblastose Avi ria AMV RT resultando numa c pia de cDNA da sequ ncia alvo de RNA Na etapa seguinte a por o de RNA deste h brido DNA RNA digerida pela RNase H Dessa forma a fita de cDNA torna se acess vel para o anelamento do segundo primer designado P2 A enzima Transcriptase Reversa novamente ativada e a segunda fita da cadeia de cDNA sintetizada gerando um cDNA de fita dupla com o s tio promotor da T7 RNA Polimerase ntegro em uma extremidade O s tio promotor integro reconhecido pela T7 RNA Polimerase que ativada resultando na sintese de grandes quantidades de fitas negativas de RNA A partir deste ponto inicia se a fase c clica da rea o de amplifica o NASBA ou seja as fitas negativas de RNA funcionar o como molde a mesma via de rea o descrita entretanto os primers se ligar o em ordem reversa primeiro ocorrer o anelamento de P2 e em seguida o anelamento de P1 82 BIOCOM IRIE U X Legenda Primer 1 RNA senso EN RNA antisenso A A Reverse Transcriptase DNA senso DNA antisenso RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase T7 RNA polymeras
153. ma 2 se est sendo usada a fonte de corrente el trica correta 3 se a tomada est funcionando fus vel Profile already exists To confirm press lt SHIFT gt lt ENTER gt Este n mero de perfil que est sendo criado j existe The Analyzer does not operate after the power is switched ON O sistema n o est recebendo corrente el trica The system starts but A tampa principal do sistema E Feche a tampa principal does not initialize esta aberta Close TC Cover A tampa do termociclador ou Fechar a tampa dos a da posic o de detecc o est termocicladores e das message is displayed 2225 aberta posi es de detec o x A agulha est gotejando Vide Transfer Tip A agulha est torta ou Vide Transfer Tip molhada A identifica o do cassete foi Apagar o cassete se Cassette not unique I E Reagent BS inserida duas vezes para a necessario e cadastrar pos mesma rack de reagentes novamente O cassete existe em duas Apagar o reagente de uma racks de reagentes e ambas 2 das racks estao no sistema L quido ou bolhas foram Secar com um papel Cover wet detectados na tampa do absorvente e n o agitar o cassete reagente ao inseri lo na rack 213 Adicionar novo cassete ao Empty O cassete esta vazio I sistema I Vencido o prazo de validade Expired P Colocar novo reagente do reagente A data e ou hora do sistema Verif
154. ma vez preparado o reagente est vel por 14 dias a 2 8 C O reagente pode ser usado por no m ximo 2 ciclos 24 horas por ciclo no instrumento e deve ser armazenado de 2 8 C entre os ciclos gt IQ Probe Suspension 1 cassete 100 testes e Agitar bem IQ PS1 no vortex e Transferir 2 5 mL da IQ PS1 v 1 5 para o cassete de reagente contendo IQ4 v1 5 N O INVERTER N O AGITAR Uma vez preparado o reagente est vel por 30 dias a 2 89C O reagente IQ4 pode ser usado por no m ximo 4 ciclos 24 horas por ciclo no instrumento e deve ser armazenado de 2 89C entre ciclos AD3 Diluente do Amplicon 1 cassete 75 testes Pronto para uso Uma vez colocado no Cobas Amplicor este reagente est vel por 30 dias de 2 89C ou at a data de validade Este reagente pode ser usado por no m ximo 4 ciclos 24 horas por ciclo no instrumento e deve ser armazenado de 2 89C entre os ciclos 166 c2 Preparar Reagentes Gen ricos gt Solu o de Desnatura o 1 cassete 100 testes Pronta para uso Uma vez colocado no Cobas Amplicor este reagente est vel por 30 dias de 2 89C ou at a data de validade Este reagente pode ser usado por no m ximo 4 ciclos 24 horas por ciclo no instrumento e deve ser armazenado de 2 89C entre os ciclos Avidin HRP Conjugate 1 cassete Pronto para uso Uma vez colocado no Cobas Amplicor este reagente est vel por 30 dias de 2 89C ou at a data de validade Este reagente pode ser usado
155. me limpe com lcool et lico 70 Esvazie e enx g e os recipientes de lavagens A e B complete com agua destilada preferencialmente gua tipo I Descarte o Lixo de acordo com as normas de Biosseguranca do seu Laborat rio Guarde as placas met licas po os pretos armagao selante e barreira de silicone para o pr ximo ensaio Pressione START Aguarde Ap s o t rmino da lavagem retorne ao menu principal NOTA Caso mais de uma rotina seja processada durante a semana pode se manter o equipamento ligado Complete os recipientes de gua e de solu o de limpeza pois a cada 4 horas ser efetuado um prime no equipamento 51 ten Bayer HealthCare 5 Procedimento para Opera o dos Equipamentos 5 1 SYSTEM 340 amp Data Management Software System 340 Data Management Software INICIALIZACAO DO SYSTEM 340 Ligar o equipamento Bot o na parte posterior no canto inferior esquerdo Aguardar Pressionar a tecla START para execu o do SELF TEST Para verifica o da parte mec nica e calibra o PMT Ap s o t rmino do SELF TEST aparecer a tela de Menu principal MAIN MENU Menu Test Event L OH Sy Lom sarvica File Management System Pause PROCEDIMENTO PARA PROGRAMA O DO ENSAIO Partindo do MAIN MENU Man Menu Test Event L0d System Merge E Fervica File Management System Pause 52 e Bayer HealthCare Selecione Test Testa AT
156. n o pode Nao tentar apagar a Bip Tela TC in process ordem ser apagada ina has np DEEN O A ring n o foi ciclado Mover o A ring para 412 i e N o coloc lo no DP1 ou TCA ou TCB Bip Tela y DP2 Pressionar START Bip Tela Refazer a ordem Bip Tela Deixar o A ring no DP1 ou DP2 Pressionar START O A ring foi ciclado em outro sistema A operagao solicitada ao 413 een pusy Try NAO POSSE Tentar mais tarde Bip Tela again realizada porque o mesmo est ocupado O sistema est tentando E Press ESC and then realizar uma limpeza Rae remover 414 Pressionar ESCAPE Bip Tela START to clean up ap s um erro no hardware O sistema est checando me Nenhuma a o e Interface check a comunica o da M Bip Tela necessaria interface O sistema est Menus RAM check verificando o RAM do 279 Bip Tela necessaria hardware Photometer check q e esta MEDIUS 995 Bip Tela verificando o fot metro necessaria Pressionar START 415 416 17 4 26 perfil requisitado foi Nenhuma acao Profile created P q Ro 5 Tela criado necessaria O ensaio foi finalizado e a M Run clean up in 55 estarem necess ria Tela processo O operador est tentando ram especifica no oci ou fazer da rack loc2 441 Rack type mismatch gen rica na posicao de rod derak Bip Tela rack especifica ou vice a t gen rica na posi o gen versa da plata
157. nar ENTER e Escape para salvar 168 F LOAD A rings e Colocar o A ring na posicao desejada TCA TCB DP1 DP2 e Pressionar LOAD at aparecer L Aring e Pressionar EDIT e Pressionar ENTER para selecionar a posicao LOAD apropriada e Colocar o numero de identifica o com o leitor de c digo de barras ou teclado Se usar o teclado pressionar ENTER e Pressionar ESCAPE para salvar G Fazer uma ordem lista de trabalho para o A rings Worklist com perfil e Pressionar ORDER at aparecer O Entry e Pressionar EDIT e Colocar o n mero do A ring com o leitor de c digo de barras ou teclado e Pressionar ENTER e A mensagem NEW ORDER aparecer na tela e Pressionar ENTER e Colocar o n mero do perfil e Pressionar ENTER e Opcional Colocar o n mero da amostra para o primeiro A tube e Pressionar ENTER e Pressionar n para passar para a pr xima amostra e Repetir o processo para cada A tube e Pressionar PRINT para obter uma c pia e Pressionar ESCAPE para salvar 169 F Selecionar o Modo de corrida e Pressionar SYSTEM at aparecer SY Conf e Pressionar 1 para selecionar SYSTEM SET UP e Pressionar EDIT e Usar STEP para selecionar o modo de corrida BASIC ou PARALLEL e Basic rea o do come o ao fim sem interven o do operador e Parallel o aparelho p ra ap s a desnatura o O operador troca os A rings para a posi o de detec o e acrescenta outro A ring para amplificar e Pressionar
158. nar START Drocess iniciada pelo sistema necess ria Order locked try N o tentar modificar ou Bip Tela later processo apagar a ordem Cup order locked Uma ordem est em N o tentar modificar ou I 401 Bip Tela try later Drocesso apagar a ordem Test order locked Uma ordem est em N o tentar modificar ou Bip Tela 402 try later processo apagar a ordem Bip Tela 225 sendo criada pelo necess ria operador Uma ordem foi modificada pelo host do computador Order entorno Um erro de entrada na 405 y i ordem ocorreu para o Repetir o procedimento Bip Tela test teste designado Delete not allowed N o foi aceita a tentativa i OS 406 I resultados antes de Bip Tela result s exist de apagar os resultados apag los Order just modified by host Nenhuma a o Bip Tela necessaria Foi feita uma tentativa de modifica o de ordem Modify not allowed 407 result s exist Nenhuma a o ara a qual alguns H q g necessaria resultados j haviam sido obtidos No results to Foi feita uma tentativa Nenhuma acao 408 para obter resultados oia Bip Tela selected order necessaria que nao existem 409 Order does not exist PRO 0 Fazer a ordem Bip Tela Dara o A ring designado O teste desejado n o foi No tests to selected especificado na ordem do A tube defined 410 A ordem est 411 Delete not allowed andamento e
159. nes de seguran a biol gica classe II devem ser posicionadas longe de portas janelas e de equipamentos que de alguma forma promovam a movimenta o do ar empurrando ar n o filtrado diretamente para a superficie de trabalho podendo assim contaminar o material que est sendo manipulado Os laborat rios s o obrigados a manter os EPC em boas condi es de funcionamento Todos os funcion rios devem receber treinamento para utiliza los Esses equipamentos devem estar sinalizados e instalados ou colocados em locais conhecidos de todos e de f cil acesso 18 Evitar a forma o de aeross is seguindo algumas normas como Abrir os tubos contendo sangue com a parte a ser aberta envolvida em um pedaco de gaze ou papel absorvente Usar uma gaze diferente para cada tubo evitando assim a contamina o cruzada A gaze depois de usada deve ser descartada em hipoclorito de s dio a 2 Esse procedimento deve ser feito preferencialmente dentro de uma cabine de seguran a biol gica Quando utilizar centrifugas e agitadores magn ticos espere at a parada completa do equipamento para manipular o material Verifique sempre que utilizar a centr fuga se ocorreu algum vazamento em seu interior durante o procedimento de centrifuga o Neste caso limpe a com hipoclorito de s dio a 2 Descarte do Material Biol gico Deixar o material descartado tais como ponteiras e gazes utilizadas imerso em uma solu o de hipoclorito de s
160. nsao Verificar manualmente Bra o ou roda de o bra o e a roda de lavagem travados lavagem quanto ao 20 movimento com o sistema desligado Verificar se a torre de lavagem est posicionada corretamente Verificar 1 o posicionamento das as agulhas de aspira o e ressuspens o e torres de lavagem se as conex es est o bem presas se a tubula o do esgoto waste est obstru da 2 2 WashFluid fatal cmd is u m ao I 236 en sistema de transfer ncia Contactar a CARD Bip Impress de fluido WashFluid reset edis io aaa ES I 2371 1E TE d sistema de transfer ncia Contactar a CARD Bip Impress occurred de fluido Erro no hardware do sistema de transfer ncia Contactar a CARD de fluido 2402 4 d CommCrt system Erro de comunica o do Contactar a CARD Bip Impress err hardware 2423 d Hd CommCrt percom Erro de comunica o do Contactar a CARD Bip Impress open err hardware 2434 4 4d CommCrtl percom Erro de comunica o do Contactar a CARD Bip Impress send err hardware 2443 4 3 4 CommCrtl percom Erro de comunica o do Contactar a CARD Bip Impress rece err hardware asma Omme ema Erro de comunica o do contactar a CARD Bip Impress execution err hardware 2463 4 4d CommCrtl fatal cmd Erro de comunica o do Contactar a CARD Bip Impress err hardware 2473 d d CommcCrtl reset Erro de comunica o do Contactar a CARD Bip Impress occurred hardware Bip Impress Torre de lavagem pos
161. nte para cada tubo Ressuspender o precipitado no agitador de V rtex NOTA Em caso de utilizar bomba de v cuo proceder da seguinte maneira Utilizar sempre uma ponteira nova para aspirar cada tubo Ap s a aspiracao de cada paciente descartar a ponteira e realizar a limpeza da mangueira aspirando lcool et lico 70 por 3 vezes Imediatamente congele os precipitados virais a 709C por pelo menos 30 minutos antes de continuar com o procedimento de ensaio Os precipitados virais das amostras podem ser armazenados por at 4 semanas antes da execu o do teste SALA 1 LISE DOS PRECIPITADOS PRIMEIRO DIA Antes de iniciar a lise dos precipitados assegure se que todo o procedimento de manuten o do equipamento foi executado com sucesso NOTA Ligar o termobloco SALA 2 um dia antes de iniciar a lise dos precipitados a fim de evitar o fluxo entre as salas 1 e 2 42 G d HealthCare Usando luvas limpe todas as pipetas e a rea de trabalho com lcool et lico 70 Remova da Caixa 1 do Kit na geladeira Diluente de lise Lysis Diluent Aque a o diluente de lise em banho de 379C por 10 a 20 minutos Lise Reagente Lysis Reagent sonda de captura Capture Probes sonda alvo Target Probes Mantenha na bancada at atingir temperatura ambiente Prepara o Reagente de trabalho de Lise Homogeneize o Diluente de Lise e o Reagente de Lise por invers o e passe as Sondas Alvo e de Captur
162. o CHECKSUM e escolha a op o CHANGE SET DEFAULT Para sair da tela INFORMA ES SOBRE AS AMOSTRAS selecione a op o OK A tela com a lista de trabalho aparecer Carregue o carrossel Para soltar o carrossel retire a tampa pressione a alavanca de eje o no lado esquerdo inferior do painel frontal da leitora mantenha a alavanca pressionada e puxe o carrossel Coloque as amostras no carrousel da maneira indicada na tela do computador e recoloque o carrousel no aparelho O carrossel encaixa debaixo do experimentador de amostra Coloque o carrossel embaixo do experimentador e empurre para tr s at travar na 118 BICM IRIE U X posi o correta Um click ouvido quando o carrousel encaixa na posi o correta Recoloque a tampa e no menu selecione a op o Routine Clique na op o RUN WORKLIST e o aparelho come ar a realizar a leitura das amostras Para ver o resultado de cada amostra clique a op o ROUTINE novamente mas desta vez escolha a op o SAMPLE RESULT Para selecionar uma amostra clique no espa o ao lado do campo SELECTED SAMPLE e clique sobre a amostra desejada Para imprimir o resultado de uma amostra selecione a amostra desejada e clique na op o PRINT Para ver o gr fico da amostra selecionada clique sobre a op o VIEW GRAPH no canto superior direito da tela A seguinte tela aparecer ECL Signal 3 4 5 6 10 10 10 10 Number of copies per input Idle Bisconnec
163. o O A ring n o foi colocado na Colocar o A ring na posi ao proper position posi o correta correta A identifica o do n mero do Verificar a identifica o do A Not unique A ring foi utilizada ring ou use uma identifica o anteriormente diferente Observar a orienta o das conex es 3 com 3 4 com 4 etc Verificar se as conex es do bra o de lavagem est o At end of run D cup As conex es dos tubos de has excessive volume aspira o ou ressuspens o gt 300uL est o incorretas As seringas de 500 uL e 1000 Posicionar as seringas uL est o invertidas corretamente Verificar se os tubos de aspira o e ressuspens o As agulhas de aspira o ou pira P bs estao dobrados ou ressuspens o podem estar obstru das obstru dos Verificar 1 o sistema de fluido quanto a bolhas de ar no sistema o n vel do reservat rio do H bolhas de ar no sistema tamp o de lavagem de fluido a posi o da tubula o do reservat rio se est na altura ideal e a condi o do filtro Porex Realizar Extended Prime Bubbles or foam present in D cups 208 Realizar Extended Prime e verificar se h vazamento de tamp o A agulha est entupida Ap s o Extended Prime se a agulha continuar entupida troque a por uma nova EEE EM ET cover and TC cover termocicladores est aberta dos termocicladores Verificar se os D cups D cup apresenta defeito apresentam algum defeito e sub
164. o as teclas set e speed no painel de controle e Digitar o tempo de corrida 15 minutos pressionando as teclas set e time no e painel de controle e Digitar a temperatura 20 pressionando as teclas set e temperatura no painel de controle 5 Depois de programar todos os valores aguardar um pouco at todos os valores pr selecionados aparecerem simultaneamente 6 Pressionar novamente a tecla memory lock Program number 1 est programado 7 Repetir as etapas acima para os outros programas selecionando os par metros desejados 192 6 Manuten o Limpeza e Desligamento do Sistema COBAS AMPLICOR Remo o e limpeza da plataforma dos reagentes espec ficos plataforma de D cups e bloco incubador e Certificar se que o interruptor de for a esteja desligado e o cabo de for a desconectado da tomada e Certificar se de que a ponteira de transfer ncia agulha esteja totalmente levantada antes de movimentar o mecanismo de transfer ncia e Antes de remover as bandejas posicionar o mecanismo de transfer ncia manualmente de modo que fique totalmente do lado esquerdo de seu curso Segurar na parte superior do mecanismo de transfer ncia e com cuidado empurr lo para a esquerda e Remover quaisquer racks de reagentes e de D cups do sistema e limp las mergulhando as em gua com sab o Enx gua las e deixar secar ao ar livre e Retirar a plataforma vibrat ria da rack de reagente espec fico soltando os dois
165. o correspondente Sempre trabalhar com uma amostra por vez Neste passo n o abrir todos os tubos de uma nica vez para evitar contamina o entre amostras Se a amplifica o for feita a partir de material isolado e congelado deixar o material isolado descongelar a temperatura ambiente Centrifugar os tubos a 10 000rpm por 5 minutos antes de utilizar Utilizando a pipeta P20 e uma ponteira de 20uL com filtro pipetar 5 uL da amostra isolada no tubo contendo o primer Fechar o tubo contendo a s lica e o tubo de amplifica o correspondente e descartar a ponteira Repetir o procedimento para cada uma das amostras Incubar os tubos no termobloco a 65 C por 5 min transferir os tubos imediatamente para 41 C por 5 min Tirando os tubos de amplifica o um de cada vez do termobloco a 419C pipetar a enzima nos tubos de amplificacao Abrir um tubo de amplifica o por vez e utilizando a pipeta P20 e uma ponteira de 20uL meros de lote s o iquais e os d gitos finais est o em 96 7 8 BIOCOM IRIE U X com filtro pipetar 5uL de enzima Fechar o tubo homogeneiz lo com a ponta dos dedos e retornar o microtubo imediatamente para o termobloco descartar a ponteira Repetir o procedimento para cada uma das amostras Tomar o cuidado de ficar com os tubos fora do termobloco o menor tempo poss vel N O RETIRAR TODOS OS TUBOS DO TERMOBLOCO DE UMA VEZ Ap s pipetar a enzima no ltimo microtubo incubar por 5
166. o em procedimentos de teste de diagn stico in vitro qualitativos e quantitativos usando os reagentes Cobas Amplicor e ou Cobas AmpliScreen O analisador Cobas Amplicor combina cinco instrumentos pipetador termociclador incubadora esta o de lavagem e fot metro num nico sistema e automatiza os processos de amplifica o e detec o 155 Caracter sticas do Cobas Amplicor e Sistema analisador automatizado de bancada e Automatiza tr s processos amplifica o do cido nucl ico hibridiza o do produto amplificado com sonda espec fica detec o do produto amplificado ligado sonda pela forma o de cor e Reduz necessidade de interven o do operador durante o teste e Processa diferentes testes simultaneamente e Multiplex testing detec o m ltipla a partir de uma nica amostra amplificada e Reflex testing testes adicionais pr selecionados e Executa a entrada dos dados por c digo de barras e Controles negativo e positivo e Protocolos padronizados garantia de sensibilidade e especificidade da PCR e Pipetagem e adi o de reagentes autom ticas e Realiza amplifica o e detec o em paralelo e Amplifica e detecta at 48 amostras simultaneamente e Cada termociclador capacidade 12 amostras pode amplificar testes diferentes simultaneamente e Monitora os reagentes em uso e descart veis e Verifica a validade dos reagentes em uso por c digo de barras e Opera overnight e Pr
167. o n mero do perfil Pressionar ENTER 180 6 Identificar a amostra no primeiro A tube opcional Pressionar ENTER 7 Pressionar para selecionar o tipo de amostra C Controle S Amostra Pressionar ENTER 8 Se C for selecionado escolha uma das seguintes op es Para controle pressionar para aparecer Pressionar ENTER Pressionar para selecionar o teste Pressionar ENTER gt Para controle baixo pressionar para aparecer Pressionar ENTER Pressionar para selecionar o teste Pressionar ENTER gt Para controle alto pressionar para aparecer Pressionar ENTER Pressionar para selecionar o teste Pressionar ENTER 9 Se S for selecionado deixar o campo de op o do teste vazio pressionar ENTER Pressionar STEP para selecionar o teste Pressionar ENTER Se um segundo teste for desejado pressionar para selecionar o teste Pressionar ENTER 10 Pressionar para ir para a pr xima amostra 11 Repetir o processo para cada A tube 12 Pressionar at aparecer QS copy QS 13 Aceitar ou entrar o n mero de c pias por rea o de PCR QS Intervalo do controle positivo baixo LPCLo LPC HI e o intervalo do controle positivo alto HPCLo Esses dados s o encontrados no cart o que acompanha o kit Usar o leitor de c digo de barras ou o teclado 14 Pressionar PRINT para obter uma c pia 15 Pressionar ESCAPE para salvar a lista de trabalho do A ring 181
168. o no TESTE DE DISPENSA O ASPIRA O 1 Limpeza das agulhas do pente de lavagem Partindo do MAIN MENU selecione gt System Management gt Maintenance gt Service Read Wash Abra a porta de acesso Solte os tubos do pente de lavagem 3 e 4 x Desaperte manualmente o parafuso de fixa o do pente 2 Deslize o pente para frente Insira uma linha de nylon em cada agulha Com auxilio uma seringa injete agua destilada e observe se h obstrucao repita esta etapa 2 vezes x Instale o pente de lavagem Aperte parafuso com m o Conectar os tubos certifique se que est o bem encaixados Feche a porta de acesso Pressione START G er HealthCare 6 4 Desligamento do Sistema Antes de desligar o SYSTEM 340 certifique se que foi efetuado o procedimento de Clean System Desligue o equipamento no bot o na parte posterior do equipamento no canto inferior esquerdo Caso seja efetuada mais de uma rotina durante a semana pode se manter o equipamento ligado Complete os recipientes de gua de solu o de limpeza pois a cada 4 horas ser efetuado um prime no equipamento 68 LLL LLLLLLLLLL 14 o bo bo dE Eo bo b b b b b Rsud A SSI Lo LLLLLLLCLLLECLELECLECEELLEECLLLEL n ITL TITI CA LL ll S LLL LL LEE ELE LC LLL OPE WarsAs oySN31nNvW 21 69
169. o seq enciado e analisado sendo que seus genes receberam a seguinte nomenclatura gag pol vif vpr tat rev vpu env e nef 12 gag d PA MN uw TT vpr VPU env Precursor Precursor pol Precursor env A s M lt Prot RT RNAse Int As proteinas sintetizadas a partir do gene gag comp em o n cleo core que envolve o genoma viral O gene gag traduzido na forma de uma prote na precursora Pr55 9 9 que posteriormente clivada para compor as prote nas p17 prote na de matriz p24 prote na estrutural do caps deo p9 prote na do nucleocaps deo que se liga fortemente ao RNA viral e p7 O gene pol tamb m traduzido na forma de um precursor 160 SP codifica para as enzimas virais Protease p10 Transcriptase Reversa Rnase H p51 66 e Integrase p32 O gene vif p23 parece atuar aumentando a infectividade mas sua fun o ainda n o foi totalmente elucidada A fun o do gene vpr p15 codifica os ativadores da transcri o A proteina p14 codificada pelo gene tat atua como transativador transcricional interagindo com fatores de transcri o celulares e a sequ ncia TAR viral promovendo a inicia o e elonga o dos transcritos virais O gene ver p19 indispens vel replica o viral age como transativador p s transcricional ligando se sequ ncia RRE viral e fatores celulares promovendo splicing e ou transporte do RNAm viral O gen
170. o somente o tubo contendo a amostra amplificada e o tubo de dilui o correspondente Agitar o tubo de dilui o rec m preparado Montagem dos tubos de leitura Separar 42 tubos de12x75mm exatos de polipropileno sendo 40 tubos para as amostras 1 tubo para o AN e 1 tubo para o RS Identificar os tubos da seguinte maneira 1W 2W e assim por diante at 10W 1A 2A 3A e assim por diante at 10A 1B 2B 3B e assim por diante at 10B 1C 2C 3C e assim por diante at 10C Distribuir os tubos na estante conforme o esquema abaixo 0000000000 C 5 5 5 VU 0000000000 DODODOVOOVOU Utilizando uma pipeta P20 e uma ponteira de 20ul com filtro distribuir as sondas Pipetar 20uL da solu o de hibridiza o contendo a sonda WT em cada um dos 10 tubos identificados como w n mero da amostra na primeira fileira e no tubo de detec o identificado como AN Trocar ponteira Pipetar 20uL da solu o de hibridiza o contendo a sonda Qa em cada um dos10 tubos identificados como A na segunda fileira Trocar ponteira Pipetar 20uL da solu o de hibridiza o contendo a sonda Qb em cada um 00510 tubos identificados como B na terceira fileira Trocar ponteira Pipetar 20uL da solu o de hibridiza o contendo a sonda Qc em cada um dos 10 tubos identificados como C na quarta fileira Trocar ponteira Utilizando uma pipeta P20 e uma ponteira de 20uL co
171. oro controle negativo Bayer HIV 1 RNA 3 0 bDNA Teste novamente amostras dilu das e multiplique o resultado obtido pelo fator de dilui o X 10 para determinar o valor em c pias mL de HIV 1 RNA no esp cime original 70 e Bayer HealthCare Os resultados abaixo representam um laudo de ensaio HIV RNA 3 0 bDNA EAN HP RHA 30 sassy 0 Oparatbor carla Lol Humber 2037 Data Fila DHS Luminesec enca z d 1 ond Controls Lar A1 A hd AG Jun AD g HL SA 41513741 Sd E 31615 FE 55 56 11 H 3 5072 IB List Fils hi121229 Ex ration Daba DD R Colecod 1211014 11 04 E AT A311 412 En C E T dl au A sa gt CE Std C 5161 dl D 310 Srl E Es zu F 252 n Cu Lo PCHu 435 Hi Pra aa 2 241 15 ES 3058 Standard Curve 1000 10000 copies Let Trag Pos C ntrol Results Hi Pcu 161977 Toaca 169100610 Vverucn d ri 71 GUANTIPLEX HI 3 Assay 0 Data Filo liisbdua D 1211454 11 04 Latt Trag ID List Filo hic d21220 Patient Spacimorns Hanull Log Lac va AL E umso um lt a ia E m 4 WN 262 qms EE E EE EE EEE Test meo pues pad a umm fm
172. os da Aguarde corrida atual teste n o completado Chame a assist ncia t cnica Erro de protocolo de Verifique os cabos de liga o comunica o ou se os equipamentos est o ligados Sem cleaning solution Coloque cleaning solution no instrumento 11012 11015 11021 11022 11023 11024 11041 a 11053 11055 Sem ECL Buffer solution Coloque Assay Buffer no instrumento Alta c lula Chame a assist ncia t cnica incorretos instrumento Sem cleaning solution Coloque cleaning solution no instrumento Alta c lula Chame a assist ncia t cnica Falha na medida do fluxo Execute o check flow rate 11054 Standby detectou frasco de Coloque cleaning solution no cleaning solution vazio instrumento Standby detectou frasco de Coloque Assay Buffer no Assay Buffer vazio instrumento 138 BIOM RIEUX C DIGO DE ERROS CAUSAS PROCEDIMENTOS corrida 12001 Usu rio abortou a corrida Inicie novamente o teste 12011 a 12022 Incompatibilidade de N o troque os instrumentos instrumentos PC leitora e impressora 12100 Erro de Software Chame a assist ncia t cnica 12101 Menos que duas amostras Coloque os tubos no na lista de trabalho carrossel 12102 Falta de um tubo no Coloque o tubo no carrossel carrossel 12103 Posi o incorreta do Ajuste o carrossel na posi o carrossel correta de refer ncia ensaio inicializado inicializado atrav s do quick prime instrumentos PC leitora e impressora ir
173. os na Tecnologia NASBA MANUAL DE OPERA ES B SICAS DO TERMOBLOCO SKS DUPLO DIGITAL BIOMEDICAL a Para Ligar o Equipamento Colocar o interruptor localizado na parte traseira do equipamento na posi o Liga I A posi o O configura aparelho desligado b Para Selecionar a Temperatura Desejada Mantenha o HEATER em posi o OFF luz verde acesa e pressione a seta A para aumentar os valores da temperatura ou pressione a seta WV diminuir a temperatura at o ajuste da temperatura desejada c Para Aquecer o Equipamento Pressionar o bot o HEATER de forma que a luz verde acenda em ON A luz verde acesa em OFF configura aquecimento desligado d Para visualizar uma temperatura selecionada Pressione o bot o Sel Considera es Por se tratar de banho seco recomendamos n o adicionar gua nos blocos A Limpeza do equipamento pode ser realizada com uma gaze umedecida com agua de laborat rio pura e imediatamente seca para evitar cristaliza es sobre o equipamento Voltagem 110V 220V MANUAL DE OPERA ES DO TERMOBLOCO TECHNE DRI BLOCK DB 2D a Para Ligar o Equipamento Colocar o interruptor localizado na parte traseira do equipamento na posi o Liga I Ao ligar o equipamento a temperatura subir instantaneamente at atingir a temperatura selecionada A posi o O configura aparelho desligado b Para Selecionar a Temperatura Desejada Pressionar o bot o SET e ao mesmo tempo pressionar pressione
174. osfatase alcalina Desta maneira o sinal gerado pelo complexo HIV RNA sondas amplificado para detec o e quantifica o do RNA viral Finalmente a adi o de um substrato quimioluminescente reage com a ltima sonda e o sinal lido em um lumin metro A unidade relativa de luz RLU gerada proporcional quantidade de RNA do HIV na amostra As c pias de RNA do HIV s o calculadas usando uma curva padr o gerada por um conjunto de seis calibradores e tr s controles HIV externos A faixa de detec o de 50 a 500 000 c pias mL apresenta linearidade em todo o intervalo O bDNA um ensaio overnight Veja a seguir a rea o ilustrada em seis diferentes etapas 31 e Bayer HealthCare 1 Rompe o virus degrada RNases e libera o RNA 7 RNA Alvo Adiciona w S SIS Tamp o de Lise 2 sondas Alvo de Hibrida o e Captura vA a Hibrida CEs e LEs ao Alvo e y fica o mesmo a microplaca ANT Microplaca LE 32 azar Bayer HealthCare 3 Etapa de Pr Amplificacao Fi Hibrida as sondas pr amplificadoras as LEs Microplaca 4 Etapa de Amplifica o EE Hibrida as sondas amplificadoras s L pr amplificadoras Microplaca 33 E Bayer HealthCare 5 Etapa da Sonda Marcada e e Sp ee A Hibrida as sondas marcadas s sondas AM amplificadoras eei Lg Wa 6 Forma o do Sinal Adiciona o substrato Dioxetano e mede a q
175. ot o preto na frente do lado esquerdo do equipamento Aparecer na tela o ltimo programa realizado Antes de iniciar um ensaio limpe a centrifuga e o rotor com lcool et lico 70 Pr refrigera o Pr refrigere a centrifuga e o rotor utilizando o programa 1 m nimo 15 minutos antes de preparar as amostras ou utilize o programa Pre Cool Selecione o n mero 1 no display aparecer na tela 1000 RPM 49C Hold Selecione START com a seta na parte inferior do display Automaticamente inicia se o processo de centrifuga o e aparecer uma nova tela indicando running speed time temp Quando a temperatura estiver estabilizada selecione STOP com a seta na parte inferior do display 56 G er HealthCare Prepara o das amostras Para preparar as amostras utilize o programa 2 Selecione o n mero 2 no display aparecer na tela 17000 RPM 49C 01 00 hr Selecione START com a seta na parte inferior do display Automaticamente inicia se o processo de centrifuga o e aparecer uma nova tela indicando running speed time temp A contagem de tempo realizada de maneira regressiva ap s o t rmino de 1 hora soar um alarme e a centrifuga PARA automaticamente Ap s o t rmino da centrifuga o desligue o bot o preto na frente do lado esquerdo do equipamento Limpe a centrifuga e o rotor com lcool etilico 70 Feche a tampa somente quando a parte interna da centrifuga estiv
176. oton de maneira que a quantidade de luz emitida por esta rea o proporcional quantidade de amostra amplificada No interior do NucliSens Reader essa luz capturada pelo tubo fotomultiplicador PMT e convertida em um sinal digital que interpretado pelo software do equipamento Photon 620 nm NANNY Figura 5 Representa o esquem tica rea o de Eletroquimioluminesc ncia que ocorre no interior do tubo fotomultiplicador PMT Ap s a emiss o do sinal digital o computador tra a uma curva padr o utilizando os tr s calibradores Qa Qb e Qc A partir dessa curva calculada a concentra o do RNA viral alvo WT e o resultado fornecido em n mero de c pias por mililitro c pias mL como no exemplo a seguir Sinal NucliSens 10 10 10 10 10 107 N mero de c pias por mL Figura 6 Representa o esquem tica do gr fico liberado pelo software do NucliSens Reader 84 BICM IRIE U X 2 Apresenta o dos Kits e Equipamentos 2 1 Kit de Tamp o de Lise 1 lysis buffer NUCLI SENS a ds kand occompasplig for d m For in vitro wma Low between 2 and B C massa A m I p sam hama LI pp TEP WEISE ua oq bisik dl NE ter a WIL pend a Embalagem e Conte do 50 unidades de tubos transparentes contendo 9 0 mL de tamp o de lise cada para uso individual Transporte
177. poliestireno est reis de 10 mL Materiais de consumo equipamentos e acess rios n o fornecidos pelo fabricante Fluxo laminar opcional Geladeira rea Pr Amplifica o Geladeira rea P s Amplificacao Luvas sem talco Jaleco Sapatilha pr p Proveta para preparo do Wash Buffer gua destilada ou deionizada Isopropanol e etanol absolutos Estante para tubos de 2 0 mL 158 4 Procedimento Para a Realiza o do Teste Antes de iniciar o procedimento seguir rigorosamente as observa es abaixo e t cnica da PCR sempre usar luvas sem talco para evitar inibi o da enzima e Todo procedimento de extra o dever ser realizada com ponteiras com barreira e Antes de iniciar a extra o e ap s o t rmino da extra o limpar as pipetas e fluxo laminar ou a superf cie da bancada usando hipoclorito 0 5 e em seguida etanol 70 O respons vel pela realiza o da t cnica dever sempre vestir um jaleco exclusivo para a rea 1 e usar luvas sem talco e Preparar a rea para a extra o e Caso o Laborat rio n o tenha fluxo laminar dever usar culos protetores e m scara como em qualquer rotina laboratorial e Deixar os reagentes e amostras a temperatura ambiente e Limpar a superf cie da bancada ou fluxo laminar e pipetas P20 P200 e P1000 com hipoclorito 0 5 e depois com etanol 70 e Deixar dispon vel na bancada as ponteiras com filtro 20 uL 200 uL e 1000 uL e Fazer a lista de trabalho
178. processos principais prepara o da amostra transcri o reversa do RNA alvo para produzir DNA complementar CDNA amplifica o por PCR do cDNA alvo usando iniciadores espec ficos cornplementares para o HIV 1 hibridiza o dos produtos amplificados com sondas oligonucleot dicas espec ficas do s alvo s e detec o dos produtos amplificados e ligados a sonda por determina o colorim trica O Teste COBAS AMPLICOR HIV 1 MONITOR permite uma transcri o reversa e amplifica o por PCR simult nea do HIV 1 e do RNA do Padr o de Quantifica o do HIV 1 O reagente de Mistura Principal cont m um par de iniciadores espec ficos para o RNA do HIV 1 e para o RNA do Padr o de Quantifica o do HIV 1 tendo sido desenvolvido 143 para facultar uma quantifica o equivalente dos subtipos do HIV 1 do grupo M N o se determinaram as caracter sticas de desempenho do Teste com amostras do Grupo O A quantifica o do RNA viral do HIV 1 efetuada utilizando o Padr o de Quantifica o do HIV 1 O Padr o de Quantifica o do HIV 1 uma c pia transcrita de RNA n o infecciosa que cont m locais de liga o ao iniciador id nticos aos do RNA do HIV 1 alvo e uma regi o nica de liga o que permite que o amplicon do Padr o de Quantifica o se distinga do amplicon do HIV 1 O Padr o de Quantifica o do HIV 1 encontra se incorporado em cada amostra individual num n mero de c pias conhecido e transportado atrav dos pas
179. r de do alvo fora da sequ ncia Nenhum valor ser calculado repetir todo procedimento extra o de amostras e controles amplifica o e detec o Indica um valor de Asso do QS fora da sequ ncia Nenhum valor ser calculado repetir todo procedimento extra o de amostras e controles amplifica o e detec o Se uma corrida for inv lida repetir todo procedimento extra o amplifica o e detec o O Cobas Amplicor resultados de Asso junto com o valor do n mero de c pias para amostras e controles O valor de Asso para as dilui es seriadas do alvo e do QS devem seguir um valor de decr scimo com aumento do fator de dilui o exceto para valores Asso de dilui es que ultrapassam o intervalo linear do teste amostras com altos t tulos ou para dilui es ou valores pr ximos da leitura de fundo amostras com baixos t tulos Dilui es do Amplicon HIV 1 Dilui es do Amplicon HIV 1 1 pura 2 1 9 3 1 81 4 1 729 Os valores da dilui o da absorb ncia devem diminuir com a dilui o seriada com valor mais alto na primeira dilui o pura e mais baixo na ltima 1 729 Se os valores A660 do HIV 1 n o est o em sequ ncia uma mensagem de erro OD SEQUENCE aparecer para amostras ou controles 202 Dilui es do Amplicon QS Dilui es do Amplicon HIV 1 1 pura 2 1 9 Se o valor da Aeeo para dilui o 2 1 9 for maior que o valor da primeira dilui o pura um erro ocorreu e QS SEQUENCE
180. r se de que a seringa de 500 esteja colocada na posi o da seringa de 500 uL e que a seringa de 1000 esteja colocada na posi o da de 1000 uL e Fazer um Prime Estendido e verificar se h vazamentos 197 Rosca Anel de Inox Parafuso Preto Figura 4 Troca do filtro do tamp o de lavagem e Certificar se de que o Cobas Amplicor esteja desligado e o cabo de for a esteja desconectado e Remover a tampa e as tubula es do reservat rio de lavagem e coloque o no suporte de acr lico da tubula o e Desatarraxar o filtro branco Porex conectado na extremidade da mangueira no sentido hor rio e limpar ou instalar um filtro novo girando o cuidadosamente em sentido hor rio at sentir uma resist ncia aprox 10 mm e Recolocar as tubula es do reservat rio de lavagem no gal o e Conectar o cabo de for a e ligar o sistema e Fazer um Prime Estendido 198 Figura 5 Pegador de D cup Troca da ponteira Agulha de transfer ncia e Desligar o Cobas Amplicor e Vide Figura 5 para os detalhes referentes montagem da ponteira de transfer ncia e levantar e remover a tampa preta do topo do mecanismo de transfer ncia e Soltar a capa de metal do conjunto desatarraxando a etapa 1 da figura 6 e Girar e levantar a capa de metal etapa 1 e 2 da figura 6 e Girar a agulha 90 no sentido anti hor rio etapa 3 da figura 6 e Levantar a agulha cuidadosamente etapa 4 da figura 6
181. r uma sa de melhor 19 BICM IRIE U X 1 NASBA Amplificac o Baseada na Seq ncia de cidos Nucl icos O NASBA um teste de amplificac o de cido Nucl ico utilizado para a quantificacao de RNA de HIV 1 em plasma ou soro humano Consiste em uma rea o de amplifica o isot rmica que ocorre a 41 C e pode gerar um fator de 10 c pias de RNA em 90 minutos A metodologia baseia se na atividade simult nea de tr s enzimas a Transcriptase Reversa AMV RNase H E Coli e T7 RNA Polimerase e leva a amplifica o da regi o correspondente ao gene gag do genoma do HIV 1 no RNA Viral alvo e nos calibradores Qa Qb e Qc Figura 1 Calibradores internos e suas concentrac es previamente conhecidas Os calibradores s o tr s RNAs sint ticos adicionados rea o na fase inicial e servem de controladores internos Distinguem se do RNA de HIV 1 tipo selvagem ou WT em uma pequena seq ncia de 20 nucleot deos localizada no centro da regi o a ser amplificada Durante todo processo a amplifica o do RNA alvo amostra feita simultaneamente amplifica o dos tr s calibradores Co amplifica o Detec o Figura 2 Esquema da co amplifica o do RNA alvo e dos calibradores e a detec o mostrando a hibridiza o com a sonda espec fica marcada com rut nio 80 BICM IRIE U X A revela o do resultado ocorre atrav s da hibridiza o do cido nucl ico com sondas gen ricas que cont
182. re o brotamento do v rus imaturo de forma intensa provocando a destrui o da c lula hospedeira Durante este ponto do ciclo de vida viral o core do virus imaturo e ainda n o infeccioso O amadurecimento feito pela a o da protease viral que cliva as longas cadeias de proteinas e enzimas que constituem o core em peda os menores Essa clivagem resulta em part culas virais infecciosas ES Din mica do HIV no organismo infectado O linf cito TCD4 a principal c lula alvo do HIV Estudos indicam que cerca de 10 bilh es de v rus s o produzidos por dia e que essas part culas virais tem uma meia vida de aproximadamente 4 horas De forma semelhante um grande n mero de linf citos TCD4 produzido e destru do sendo que a meia vida de um linf cito infectado de 2 4 dias N o h portanto per odo de lat ncia virol gica e mesmo durante a infec o cr nica assintom tica observa se uma grande batalha entre o sistema imune do indiv duo infectado e o virus Com o passar do tempo o virus desestrutura a arquitetura dos rg os linf ticos comprometendo a reposi o dos linf citos TCD4 um 8 8 84 A produc o e eliminac o di ria das part culas virais podem ser comparadas a um movimento de gua que sai de uma torneira em direc o ao ralo de uma pia A quantidade de virus que resta na pia a carga viral resultado da guerra que travada entre o CD4 e os virus Carga Viral
183. reagente Quando come ar o ciclo de resfriamento lavagem da Marca o Prepare o Reagente de Trabalho Substrato em um tubo de 15 mL de polipropileno conforme tabela Tiras de Captura Substrato Substrate Enhancer 11 0 mL 1000 uL Tampe o tubo e inverta o por no m nimo 10 vezes para homogeneiza o Mantenha em temperatura ambiente Descarte se n o for usar dentro de 30 minutos gt O reagente de Trabalho Substrato dever apresentar aspecto leitoso Mude o volume da pipeta multicanal para 80 Quando as placas forem ejetadas imediatamente abra a porta Adicione 80 uL do Reagente de Trabalho Substrato utilizando uma pipeta multicanal de 12 Carregue a placa da esquerda primeiro da fileira A para H N o permita que o tempo de pipetagem exceda 04 minutos Feche a porta e pressione START O equipamento incubar as placas por 30 minutos Programe o DMS na fun o READ Ap s os 30 minutos de incuba o o Analisador automaticamente ler as contagens de luminesc ncia RLU das placas e transferir os dados para o arquivo DMS no computador Ser montada uma curva onde se poder fazer an lise cr tica do comportamento dos Padr es Controles e testes 50 2 T T HealthCare MANUTEN O DO ANALISADOR AP S CADA ENSAIO Remova as placas do equipamento descartando as tiras de ensaio utilizadas limpe as placas com lcool et lico 70 Desmonte a arma o selante descartando o fil
184. reconhec vel Chamada de redu o de Aguarde a leitura dos tubos dados quando os tubos n o terminar foram lidos corra novamente 12307 a 12308 Erro de AN Fa a um novo tubo NA e corra novamente 12309 Sinal da amostra muito Aumente o fator de dilui o e alto repitaa detec o est o bons refeito a hibridiza o muito baixo 12402 ndice da taxa de fluxo Verifique e corrija o check muito baixo flow rate 12501 Encontrado dados Aguarde o t rmino do teste insuficientes 30301 a 30318 Erro de software e ou Chame a assist ncia t cnica instrumento 139 R IE U X 9 Contatos com a bioM rieux Assist ncia T cnica 0800264848 Assessoria Cient fica Linda Khalili Boukai 21 7813 1930 Ana Maria dos S Ferreira 85 9101 6785 Ger ncia de Produto Rog ria Campos 21 2444 1326 bioM rieux Brasil S A 21 2444 1400 Estrada do Mapu 491 Jacarepagu CEP 22710 261 Rio de Janeiro 10 Refer ncias Bibliogr ficas 1 NASBA HIV 1 RNA QT Manual de Instru es para utiliza o do produto 2 Boom R Sol CJA Salimans MMM e cols Rapid and simple method for purification of nucleic acids J Clin Micr 1990 28 495 503 3 van Buul C Cuypers H e cols O NucliSens Extractor para Isolamento Infusion Therapy 1998 25 147 151 4 Manual de Carga Viral Minist rio da Saude Secretaria de Pol ticas da Sa de Coordena o Nacional de DST e AIDS 1999 5 Ginocchio C
185. reviamente descarte para ponteiras descarte para liquidos sem hipoclorito e luvas 25 BICM IRIE U Microtubos Utilizando luvas limpas separar 10 microtubos de 1 5mL fech los e numer los na tampa e na parede do tubo igualmente a numeracao do tampao de lise No caso de amplificacao ser realizada logo em seguida preparar mais 10 microtubos da mesma maneira Separar v 70 pipetas de transfer ncia para quem usa bomba v cuo nesta etapa separar 10 pipetas de transfer ncia e 60 ponteiras novas e est reis sem filtro 1 caixa de ponteiras de 1000uL com filtro 1 caixa de ponteiras de 200uL com filtro 1 caixa de ponteiras de 20uL com filtro Tubos de polipropileno tipo Falcon de 50mL Gaze ou papel absorvente cortado Descarte apropriado para as ponteiras Descarte apropriado para os tamp es Luvas Procedimento Antes de iniciar o procedimento recomenda se abrir os tubos com aux lio de uma gaze ou papel absorvente e limpar os cristais na tampa ou na borda do tubo cuidando para que os cristais nao caiam na solu o de lise pois isto poderia levar a problemas de amplifica o ou invalida o de amostras Recomenda se utilizar gaze ou papel absorvente para abrir os tubos com tampao de lise em todas as etapas a seguir SS s 1 Utilizando a pipeta P20 e uma ponteira de 20uL com filtro pipetar 20uL da solu o contendo os calibradores reconstitu dos tubo de tampa amarela em cada tubo de tamp
186. rificar as conex es da agulha se a agulha est torta se h dep sito de sal na rea da agulha Limpar a agulha e troc la se necess rio Wash reservoir low O sensor de n vel pode estar Reposicionar o sensor ao Wash Buffer I volume posicionado muito alto nivel apropriado Wash Tower Wash Wheel Liquid is present or flooding occurs at the wash wheel O n vel do tamp o de lavagem est baixo As agulhas de aspira o e ressuspens o n o est o devidamente posicionadas As tubula es podem estar obstru das Encher o reservat rio com tampao Se a amplifica o estiver em andamento realizar um STOP TRANSFER e adicionar o tamp o de lavagem Realizar um Extended Prime Verificar 1 se as agulhas est o devidamente posicionadas no bra o de lavagem se as torres de lavagem foram reposicionadas devidamente se que as conex es est o bem ajustadas Verificar se as tubula es do waste est o dobradas ou obstru das Remover e secar a roda de lavagem Secar a rea abaixo da roda 218 de lavagem Os tubos de aspira o ou Washfluid cmd exec ressuspens o est o error 235 incorretamente posicionados ou desalinhados Verificar a correta posi o e prender as agulhas no bra o de lavagem Manualmente verificar o O bra o de lavagem esta brago e o movimento da roda travado ou a roda de lavagem I de lavagem com o sistema em movimento I desligado S Ver
187. rocedimento 5003 a 5007 Falhou a opera o de Tente novamente a mesma leitura de arquivos operacdo 5018 a 5129 Erro de instrumento Chame a assist ncia t cnica 5130 a 5132 Verifique se o carrossel est bem encaixado 5133 Coloque os tubos no carrossel 5135 a 5182 Chame a assist ncia t cnica 5183 Encaixe bem o carrossel 5184 a5599 Chame a assist ncia t cnica 7000 Chame a assist ncia t cnica 7001 Nenhum usu rio dispon vel Arquivo de usu rio n o existe no banco de dados ou foi apagado Chame a assist ncia t cnica 7002 Tente outro ID 7003 Digite um nome para o usu rio em branco usu rio 7004 Chame a assist ncia t cnica definidos 7005 Nome de n vel j existente Chame a assist ncia t cnica 7006 Voc deve selecionar um Escolha um n vel dispon vel nome de n vel 7008 Digite a senha corretamente 7009 Senha deve ser digitada Redigite sua senha duas vezes 7010 Senha nova igual a Escolha uma senha diferente antiga da anterior 7011 A senha pode conter Obede a a especifica o de apenas letras e n meros caracteres 7012 A senha tem menos de 3 Obede a a especifica o de caracteres caracteres 7014 Nenhuma mudan a foi feita Z Voc n o entrou no Selecione o ID de usu rio sistema de usu rio para para logar se logar se Nenhum usu rio dipon vel O Arquivo de usu rio n o no banco de dados existe ou foi apagado Chame a assist ncia t cnica selecionado HIV quantitativo
188. s QS RNA para logo ap s a pertence ao kit de extra o adi o do prepara o da Plasma tem Lysis possui plasma para amostra com RNase Dithiothreitol que tampas vermelhas neutralizar a n neutraliza RNase RNase positivos Tubo de NHP com Tampa branca e azul negativo e Incubar todos os tubos 10 minutos temperatura ambiente e Adicionar 800 uL P1000 de isopropanol em cada tubo somente o tubo que estiver sendo manipulado dever estar aberto os outros dever o permanecer fechados neste momento retampar e agitar vigorosamente no vortex 3 a 5 seg e Verificar se foi feita a marca na face externa dos tubos em rela o parte externa da centrifuga para identificar a localiza o do pellet e Centrifugar a 16 000 g por 15 min temperatura ambiente e Usando uma transfer tip para cada amostra aspirar lentamente o sobrenadante pela parede oposta da marca o do tubo e pelo menisco do l quido tomando cuidado para n o raspar ou perder o pellet N o usar bomba de v cuo Poder restar at 20uL 162 e Adicionar 1 0 mL P1000 de etanol 70 o preparado no momento do uso vortex 3 a 5 seg temperatura ambiente em frasco e pipetas est reis Neste momento o pellet visivel Etanol Agua Etanol 95 Agua Absoluto Destilada Merck I Destilada Merck e Centrifugar 16 000 g por 5 min temperatura ambiente e Usando uma transfer tip para cada amostra aspirar lentamente o sobrenadante pe
189. s de lise Siga corretamente o esquema de prepara o das amostras O tamp o de lise com a amostra devem estar a temperatura ambiente 109 BIOCM IRIE U Para fechar o cartucho seguir o esquema abaixo e tampa esta fechada adequadamente quando a seta na tampa do cartucho esta entre as 2 marcas da camara de amostra N o tente abrir a tampa no caso de a amostra passar da segunda marca Isso pode ocasionar vazamentos Prossiga com o teste assim mesmo da camara de amostra PROCEDIMENTOS INICIAIS DI RIOS 1 lt LIGAR O EQUIPAMENTO Ouve se um sonoro mais de um significa erro 2 lt Checar o n vel do esgoto O esgoto deve ser esvaziado quando o gal o de esgoto estiver aproximadamente com 34 do volume total Lavar o galdo com gua 3 Verificar se as mangueiras est o conectadas corretamente ao esgoto e ao filtro de vapor e se a porta de exaust o do filtro de vapor est aberta TUBULA O DO FILTRO DE G S Tampa de conex o r pida do filtro Tubula o 4 sgoto Unidade principal Tampa de conex o r pida da tubula o do esgoto OBS Trocar o filtro de vapor a cada 6 meses Filtro de vapor Container do Esgoto Porta de exaust o do Filtro de Vapor Nota Deve estar sempre aberta Remova a tampa antes de utilizar 110 BIOM IRIE U 4 lt Verificar o cartucho de secagem de ar Este cartucho preenchido com s lica de colora o az
190. say e selecione a op o HIV 1 QT No espa o do SAMPLE ID digite a identifica o da amostra No espa o VOL digite o volume exato de amostra utilizado para o teste daquele paciente volume de plasma em ul pipetado Tampao de Lise Quando tudo estiver preenchido corretamente clique o ADD TO LIST adicionar lista A tela de Informa o da Amostra Sample Data aparecer 116 BICM IRIE U X Details for sample Yolune amp Batch 936000900 det Batch 96088808 V parameter Change set defaults Accept no change No espa o Details for Sample vai estar o n mero de identifica o da amostra No VOLUME vai estar a quantidade de volume de amostra testada Ao lado do campo AMP BATCH ID coloque o n mero de lote de amplifica o utilizado para aquela corrida Ao lado do campo DET BATCH ID coloque o n mero de lote do kit de detec o utilizado Os dados a serem inseridos nos campos de V PARAMETER QA IN QB IN QC IN e CHECKSUM se encontram na etiqueta afixada na caixa do kit de deteccao Entre com os dados corretamente Os dados variam lote a lote Para aceitar os dados introduzidos selecione a op o CHANGE SET DEFAULT Na hora de cadastrar a segunda rotina de um mesmo kit n o h a necessidade de entrar com os valores de AMP BATCH ID DET BATCH ID V PARAMETER QA IN QB IN QC IN apenas o CHECKSUM deve ser colocado novamente Neste caso escolha a op o ACCEPT NO CH
191. ser descongeladas na hora de serem testadas e n o devem ser congeladas para nova utiliza o O ideal colocar a quantidade de plasma a ser utilizada no teste dentro do tampao de lise para poder congelar O tamp o de lise mant m a integridade das amostras As amostras em tamp o de lise podem ser mantidas por 48 horas a temperatura ambiente por 2 semanas na geladeira 2 a 8 C ou por longos per odos a 70 C As amostras em tampao de lise n o podem ser mantidas a 20 C Os plasmas hemolisados n o devem ser utilizados pois liberam RNAse celular Os plasmas lip micos podem ser utilizados sem problema desde que sejam bem centrifugados 3 Levar os tubos com tampao de lise e os tubos com as amostras centrifugadas para a rea destinada ao isolamento 4 Pipetar 1mL de cada amostra nos tubos com tampao de lise da sequinte maneira Abrir os tubos de tampao de lise e manter as tampas encostadas em cima de cada um Abrir o tubo da amostra com auxilio de uma gaze ou papel absorvente em volta da tampa pois o v cuo de dentro do tubo pode gerar aerossol levando contamina o entre as amostras Apoie a tampa sobre o papel com a superf cie contaminada da tampa voltada para cima Utilizando a pipeta P1000 e uma ponteira de 1000uL com filtro uma para cada amostra pipetar 1 mL da amostra retirar a tampa do tubo com tamp o de lise e pipetar a amostra Fechar bem o tubo com o tamp o e a amostra e descart
192. sos de prepara o transcri o reversa amplifica o por PCR hibridiza o e detec o da amostra em conjunto com o HIV 1 alvo e amplificado em conjunto com o HIV 1 alvo O analisador COBAS AMPLICOR calcula os n veis de RNA do HIV 1 presentes nas amostras de teste comparando o sinal do HIV 1 com o sinal do Padr o de Quantificacao em cada amostra O Padr o de Quantifica o compensa os efeitos de inibi o e controla o processo de amplifica o visando permitir uma quantifica o rigorosa do RNA do HIV 1 presente em cada amostra Prepara o da Amostra Extra o do Material Gen tico Pelo m todo Standard o RNA do HIV 1 isolado diretamente do plasma por lise de part culas virais com um agente caotr pico seguido por precipita o do RNA com lcool Com o m todo Ultra sens vel de prepara o da amostra as part culas virais do HIV 1 no plasma s o primeiramente concentradas por centrifuga o a alta velocidade seguidas por lise de part culas virais com um agente caotr pico seguido por precipita o do RNA do HIV 1 com lcool Introduz se um n mero conhecido de mol culas de Padr o de Quantifica o do RNA em cada amostra em conjunto com o reagente de lise O Padr o de Quantifica o do HIV 1 processado atrav s dos passos de prepara o transcri o reversa amplifica o e detec o da amostra e usado para quantifica o do RNA do HIV 1 presente na amostra de teste 144 Mg Taq DNA Pol
193. stitu los se necess rio Posicionar a rack de D cups Rack de D cups est mal corretamente na plataforma posicionada D cups are not handled properly Limpar o pegador de D cup Verificar se h algum impedimento do movimento Contactar a CARD se o problema persistir Verificar se falta D cup ou se D cup missing 261 Falta D cup h algum preso no pegador de D cup Verificar se o D cup est D cup apresenta defeito ntegro ou se apresenta algum defeito Verificar se a rack de D cups est bem posicionada na plataforma A rack de D cup n o est Reiniciar o sistema para bem posicionada limpeza Colocar uma nova rack de D cup e Pressionar START novamente Durante a detec o o D cup could not be sistema n o pode soltar o D released cup e a corrida foi ent o abortada O n mero de D cups colocado Not enough D cups no sistema n o suficiente Adicionar racks de D cups no found para realizar os testes sistema solicitados Ocorreu um erro que Pressionar ESCAPE e depois necessita da retirada dos D START para iniciar a retirada cups que estavam em dos tubos do sistema N o processo antes da corrida ser retirar nenhum D cup abortada manualmente Keypad display screen O cartucho do software n o Verifique se o cartucho est Display lights up but text is est posicionado bem posicionado no seu not present adequadamente encaixe Change CPU board A bateria que supre a Electroni
194. t do computador somente quando conectado ao LIS A ordem selecionada est Esperar o t rmino da corrida Order locked try later sendo realizada pelo sistema e tentar novamente 2127 rack Posicionar o reagente na rack Posicionar o reagente na rack Esperar o t rmino da corrida at aparecer na tela Standby ou use STOP TRANSFER Aguardar o t rmino do processo N o retirar manualmente os D Cups ser apagadas Para fazer o reflex test para controles mudar o tipo de amostra de C para S na lista de trabalho No tests ordered for N o h ordem para este A Verificar a identifica o do A A ring ring espec fico ring e o arquivo de ordens Refazer a ordem com o sinal apropriado para designar os controles Verificar a identifica o do teste selecionado Rever o test file para assegurar que o teste existe Inserir o arquivo do teste Verificar a identifica o da ordem de trabalho e fazer uma ordem se necess rio Esta ordem n o tem Verificar a ordem em Order has no results resultado ainda questao Nenhuma a o necess ria neste momento Colocar o n mero do perfil e Pressionar lt SHIFT gt ENTER para reescrever um perfil existente ou escolher um n mero novo n u uw Verificar os fus veis e ligar Power init error O sistema n o pode iniciar para a CARD Verificar 1 seo fio do sistema est conectado na tomada e no siste
195. ted Para sair do gr fico clique em CLOSE localizado no canto direito inferior do gr fico Para ver todos os resultados juntos mas sem o gr fico escolha a 119 BIOM IRIEUI op o ASSAY RESULT CANUCLISENWNRUNS 99032402 RUN Created 24 Mar 1999 10 55 Assay Hiv 1 Qt Sample ID_ Qualif Result 721 Valid lt LDL 10001 722 Valid 4000 cp ml 1000ul 723 Valid 2000 cp ml 3 l 1000 1 13 14 724 Valid 8400 cp ml 15 16 10001 17 18 725 Valid 43000 cp ml 19 20 100011 21 22 726 Valid 43 cp ml 23 24 10001 25 26 727 Valid lt EBE 22 28 100011 29 30 728 Valid 280 cp ml 31 32 1000ul 33 34 729 Valid LDL 35 36 10001 37 Qb 38 Qc 5 935036 225477 43735 39021 910824 210269 37841 17502 847700 156576 37647 OOO E TY 32212 3 645815 147432 37544 OOO E ODO y 730 Valid 2000 cp ml 39 19660 40 98299 1000ul 227818 32017 O resultado de uma amostra s sai quando todos os quatro tubos da amostra j tiverem sido lidos O aparelho s imprime os resultados quando acabar de ler toda a rotina Para imprimir resultados individuais com gr fico escolha a op o PRINT da tela SAMPLE RESULT Para imprimir todos os resultados numa folha s sem gr fico escolha a op o PRINT da tela ASSAY RESULT 120 BICM IRIE U 5 3 Outros Equipamentos Utilizad
196. temas s o compostos por uma ampla variedade de kits que utilizados dentro de aparelhos automatizados produzidos com tecnologia de ponta na rea mecano eletr nica auxiliam o laborat rio na obten o de resultados mais r pidos mais precisos e mais reprodut veis Al m de suas conhecidas linhas de Bioqu mica Imunologia Hematologia e Uroan lise a Roche Diagn stica foi pioneira no desenvolvimento padroniza o e comercializa o de uma metodologia que hoje se tornou sin nimo de diagn stico por biologia molecular a PCR Polymerase Chain Reaction DUAS D CADAS DE PCR A Roche tornou a PCR Rea o em Cadeia da Polimerase um padr o de refer ncia entre as tecnologias baseadas na detec o de DNA para o diagn stico de doen as incluindo o monitoramento da carga viral de pacientes com AIDS A tecnologia elaborada por K Mullis e desenvolvida pela equipe de cientistas da Cetus Corporation foi publicada pela primeira vez em 1985 na revista Science e foi aclamada como uma das mais poderosas ferramentas da biologia molecular Por esta revolucion ria descoberta o Dr Mullis ganhou o Pr mio Nobel de Qu mica em 1993 O portfolio de produtos da Roche oferece uma gama de op es incluindo kits para diagn stico in vitro e instrumentos Como parte de uma solu o integrada para cuidado da sa de nossos produtos baseados na tecnologia da PCR permitem aos m dicos monitorar o desenvolvimento das doencas de seus pacientes e a r
197. tes do bra o 3 e 4 Agulhas de Ressuspens o mon trs x 1 amp 11 196 Figura 3 Posicionar os mbolos das seringas procedendo da seguinte maneira e Ligar o Cobas Amplicor e Pressionar SYSTEM at aparecer na tela SY Diag e Pressionar 2 Device Check e Pressionar 3 Syringe Exchange e Pressionar START para posicionar os mbolos e Desligar o Cobas Amplicor e Ou deixar o Cobas Amplicor desligado e elevar com cuidado o mbolo manualmente e Remover e trocar uma seringa por vez e Acessar as seringas abrindo a tampa principal do Cobas Amplicor e depois levantando o teclado A seringa de 500 uL e a seringa de 1000 estar o vis veis Vide a figura 4 para os detalhes de montagem da seringa e Desatarraxar a parafuso preto no sentido hor rio e Desatarraxar a rosca do anel de inox no topo da seringa no sentido hor rio e remova a seringa de sua posi o figura 4 e Remover o mbolo de inox da seringa e remova o Teflon e o O ring do mbolo utilizando o suporte de acr lico que acess rio do equipamento e Recolocar o O ring e o Teflon com partes novas n o apertar demais os parafusos e Limpar a seringa se necess rio com agua destilada e Testar se o mbolo flui livremente na seringa caso haja resist ncia verificar se o Teflon est torto e se necess rio trocar novamente e Ao recolocar as seringas certifica
198. tilizar tubos de coleta reciclados Ap s a coleta conservar as amostras por um per odo m ximo de 4 horas a temperatura ambiente 18 C at 25 C N o refrigere at a separa o do plasma Separar o plasma das c lulas at 4h ap s a coleta por centrifuga o a 1000Xg durante 15 min N o submeta o plasma a processos de filtra o ou centrifuga o adicionais com o intuito de diminuir a turbidez O plasma pode ser armazenado a 209 por no m ximo 72h Caso as amostras n o sejam processadas nesse per odo as mesmas devem ser armazenadas em freezer com temperatura de 60 C 80 Armazenar o plasma em tubos est reis livres de RNAses e DNAses com tampas rosque veis ou em microtubos de polipropileno No caso da metodologia Nuclisens HIV 1 Qt processar conforme procedimentos padronizados utilizado para esta metodologia Recomenda se que as amostras sejam estocadas em al quotas com quantidade suficiente para a realiza o dos testes evitando assim processo de congelamento descongelamento das amostras Manuseie todas as amostras como potencialmente infectantes 25 2 Transporte Se for necess rio o transporte das amostras plasma ao ponto executor as mesmas dever o ser acondicionadas em caixas de isopor contendo gelo seco ou gelo recicl vel em quantidade suficiente para manterem os plasmas congelados Assegure se de que o empacotamento e a estocagem estejam de acordo com as regulamenta es fe
199. tubos com capacidade at 12 000RPM Ponteiras novas e est reis com filtro O 20uL 20 200uL 200 1000uL lcool 70 preparado a partir de etanol absoluto Merck gt 99 8 art 100983 Acetona P A Dois 02 termoblocos ajust veis Microtubos novos e est reis tipo eppendorf de 1 5 mL Tubo de polipropileno de 12 x 75mm com volume de 5 mL novos Pipetas de transfer ncia est reis para o isolamento manual Banho maria 41 C Vortex NucliSens Reader 3 2 Materiais de Consumo Equipamentos e Acess rios n o Fornecidos pelo Fabricante Centr fuga para tubos de 10mL com capacidade at 2 000 RPM Micropipetas ajust veis de O 20uL 20 200uL 200 1000uL Capela de fluxo laminar vertical opcional Tubos c nicos tipo Falcon de 50mL novos e est reis Luvas descart veis Papel higi nico extra macio Timer Estantes para microtubos de 1 5mL Estantes para tubos de 15 mL Dois 02 term metros de mercurio Recipientes para coleta de material descartado Fita Crepe Equipamentos de prote o individual EPIs touca m scara prop culos avental 89 B ID I R IE U X 4 Procedimentos para a Realiza ao do Teste 4 1 Procedimentos de uso do Kit NucliSens HIV 1 QT SALA 1 rea de Liberac o Isolamento e Pr amplificacao do Acido Nucl ico g Equipamentos Banho Maria 379 Centr fuga Sorol gica pipeta P1000 estantes para tubo de 15 mL estantes para microtubos Verifi
200. ubstrate B SB no cassete contendo Substrate SB3 Homogeneizar com a pipeta aspirando e soltando v rias vezes Pronto para uso Pronto para uso Pronto para uso Diluir 1 parte do Wash Buffer 10 X concentrado para 9 partes de gua destilada Armazenagem e Estabilidade Verificar na bula O substrato preparado est vel por 16 horas Preparar diariamente Reagente em uso est vel por 30 dias quando armazenado 2 89 Reagente em uso est vel por 30 dias quando armazenado 2 89 Reagente em uso est vel por 30 dias quando armazenado 2 89 O wash Buffer dilu do est vel por 2 semanas a temperatura ambiente 191 Wash 10X concentrado gua Destilada Volume Total 200 MI 1 8L 2L 500 mL 4 5L Su 600 mL 5 4 L 6 L 800 mL 7 2 L 8 L 1000 mL 9 0 L Programa ao da Centr fuga Heraeus Precooling to 4 C Usar a fun o PRETEMP para pr esfriar ou pr aquecer o rotor vazio 1 2 4 1 Ligar a centrifuga e fechar a tampa Selecionar P na tela Program Selecionar a temperatura 4 C usando a tecla set no painel de temperatura Pressionar a tecla start O rotor atingir a temperatura dentro de 20 minutos programar Pressionar a tecla program Selecionar Program 1 9 programas podem ser armazenados na mem ria 2 CE Abrir a mem ria pressionando a tecla lock Selecionar os par metros desejados e Digitar 16000 RPM pressionand
201. uimioluminesc ncia 34 As so ndas do sistema bDNA s o dirigidas contra o 35 Bayer HealthCare 2 Apresenta o dos Kits e Equipamento Bayer System 340 bDNA Analyzer amp Data Management Software Uma plataforma automatizada para os ensaios da linha branched DNA bDNA o System 340 simplifica os teste de diagn stico molecular A tecnologia bDNA capacita a detec o direta do cido nucl ico em plasma e o System 340 realiza os ensaios de forma automatizada Desenhado para laborat rios de m dio e grande porte o System 340 realiza o processo da amplifica o at a detec o do sinal O software de gerenciamento de dados baseado em Windows fornece o mapeamento das placas dados sobre o processo em geral e gera relat rios com os resultados finais 36 2 Lp T HealthCare Caracter sticas Automa o Reduz dramaticamente a manipula o melhorando a efici ncia operacional Flexibilidade Processa de 12 168 amostras simult neamente Checagem de erros o sistema detecta automaticamente os erros ocorridos durante as opera es e permite a interven o do usu rio uma vez os erros estejam resolvidos Monitoramento autom tico da performance de qualidade relat rio com tais dados e Esgoto reduzido O system 340 gera poucos descart veis e pouca quantidade de l quidos reduzindo o custo com material contaminante O System 340 gera todas as an
202. ul Quando este cartucho estiver 34 rosa ele deve ser substitu do Nota Colocar sempre o cartucho com a parte rosa voltada para baixo 5 Carregar os reagentes Quando frascos novos de reagentes com volume total forem colocados em uso pressionar a op o LOAD para atualizar o volume Nota Se N O forem colocados novos frascos de reagentes N O pressionar LOAD S instale frascos cheios no Extractor O Extractor n o tem sensor de n vel Ele capaz de calcular volumes j utilizados e volumes restantes 6 Recolocar a garrafa de Wash Buffer no equipamento 7 lt Fazer o PRIME duas vezes com o Wash Buffer e todos os outros reagentes Aguarde o ciclo total de cade PRIME Na tela TOP pressione a op o REAGENTS Pressione ent o a op o PRIME do reagente desejado Fazer o PRIME de todos os reagentes quando inicializar o equipamento UM DE CADA VEZ Para retornar tela TOP inicial apertar a op o TOP REAGENTE Wash Buffer Tamp o de Lavagem 1 frasco 450mL para 5 corridas de 10 amostras cada amostras amostras amostras Cleaner gua pr pria para 500mL por dia de opera o laborat rio grau 1 ou melhor 8 lt Selecione a fun o PRESS TEST do menu de MAINTENANCE manuten o para tirar qualquer l quido dos tubos de limpeza das 10 esta es do equipamento Ap s realizar o PRESS TEST pressionar a op o BAK 9 Remover os tubos de limpeza das esta es que ser o
203. un LOAD S Load LOADCHECK S LoaCh OPERATOR S Oper TIME DATE S Time A RINGS L ARing REAGENT RACKS L RRack REAGENT CASSETTES LRCass ORDER ENTRY A ring Worklist O Entry Create PROFILES O Profi TREATMENT 1 Result Inspection Management 3 Result Calibration Programming SYProg 1 Test File 2 PCR File Configuration SY Conf 1 System Setup 2 Result Setup 3 Printout Setup 4 Operators Access 5 Interface Configuration 6 Version Information DIAGNOSTIC SY Diag 1 Key amp Barcode Check 2 Device Check 1 Prime 2 Wash Arm Adjust 3 Syringe Exchange 4 Host Interface Check 5 Print Interf Check 6 Photometer Check 7 RAM Check 8 Run In 3 Instrument Run Info 4 Files Summary 5 Message Log ADVANCED DIAGNOSTIC SY Adia 1 Remote Diagnostic 175 PREPARAR UMA CORRIDA NO SISTEMA COBAS AMPLICOR 1 Pr PCR Prepara o do Reagente 2 Pr PCR Prepara o das Amostras e Controles 3 P s PCR Amplifica o e Detec o a Realizar a manutencao diaria b Preparar reagentes c Carregar os cassetes de reagentes na rack d Carregar as racks de reagentes na plataforma e Carregar A rings f Fazer a lista de trabalho para os A rings g Selecionar o modo de corrida h Carregar D cups Pressionar j Verificar a impressao do Load Check k Verificar os resultados A Manuten ao Di ria Limpar o poste de inicializa o Limpar o pegador de D cup Encher
204. utilizadas e lt Levante as portas de seguran a e Abra a porta das esta es segure o tubo de limpeza e desconecte a Rosca superior do tubo de limpeza e Com o aux lio das alavancas de eje o mova as para a esquerda desengate o tubo de limpeza da conex o de esgoto 111 BICM IRIE U X 10 Colocar os cartuchos contendo as amostras s lica e calibradores devidamente fechado no extractor e Sempre colocar um cartucho na posicao 1 e Quando menos de 10 amostras forem ser extra das num ensaio distribuir os cartuchos de maneira aproximadamente balanceada nas esta es de trabalho do extractor Esta es utilizadas a 2 3 4 5 6 7 8 9 110 e lt Insira a manivela da valvula do cartucho na fenda propria e deslize o cartucho at que a conex o com o equipamento fique segura Deslize o cartucho fazendo press o tanto na parte inferior como na superior do cartucho e lt Feche a porta da esta o e lt Encaixe gentilmente a rosca superior da esta o ao cartucho N O FORCE A ROSCA e lt Ap s carregar todos os cartuchos feche as portas de seguran a do equipamento 11 Iniciar o Extractor e Pressione a op o RUN no menu inicial e No menu que aparece selecione a opcao aproximada do volume de extra o no caso maior que 11mL e Se cartucho estiver colocado de maneira apropriada o LED da esta o ficar verde Para isso 1 A rosca da esta o tem de estar conectada ao
205. v V LVULA SE VOLTA PARA O TUBO DO ELU DO ELUI O DO CIDO NUCL ICO COM O TAMP O DE ELUI O v RETER O ELU DO PARA AN LISE POSTERIOR 108 M I R IE U X PREPARACAO DE AMOSTRA TRABALHAR DE LUVA DURANTE TODAS AS ETAPAS DO PROCEDIMENTO 1 Preparacao dos cartuchos A Acoplar o tubo com tampa de silicone onde ficar o material elu do segurando o cartucho com cuidado Um som deve ser produzido quando a tampa do tubo for perfurada Inserir o suplemento local apropriado Agulha de do cartucho Forca excessiva pode danificar o plastico cartucho Tampa Tubo do perfur vel elu do s 2 Libera o do cido Nucl ico e lt Centrifugar Tamp o de lise a velocidade e tempo necess rios para baixar todos os flu dos no tubo Por exemplo 2 minutos a 1500g e Centrifugar o tubo de amostra a velocidade e tempo necess rios para baixar todos os flu dos no tubo e lt Abrir o tubo da amostra com o auxilio de um papel absorvente ou gaze e transferir para o tampao de lise a quantidade de amostra a ser testada e lt Adicionar os calibradores e Adicionar 50uL de s lica em cada tamp o de lise Nota Centrifugar a s lica e depois vortexar vigorosamente a cada tr s pipetagens 3 Transferir o material para o cartucho lt Vortexar o tamp o de lise contendo amostra s lica e calibrador lt Tenha certeza que n o existam cristais nos tampoe
206. xo sistema hidr ulico que realiza a purifica o das amostras atrav s de sucessivos processos de lavagens em tamp o etanol e acetona O Extractor realiza a elui o dos cidos nucl icos em tamp o apropriado livre de s lica Componentes B sicos do Sistema Unidade Principal Sistema Controle Impressora Bobina de Papel T rmico Cartuchos Suplementos Reagentes Etanol amp Acetona Esgoto Filtro de Vapor NUCL SENS u amp 97 BIOCM IRIE U X 2 6 Equipamento NucliSens Reader O Nuclisens Reader respons vel pela emiss o dos resultados do sistema Nuclisens HIV 1QT Neste equipamento a luz proveniente das rea es de Eletroquimioluminesc ncia ECL convertida em um sinal digitalizado que lido e interpretado pelo software O resultado liberado impresso em n mero de c pias por mL juntamente com os valores dos sinais de ECL de todas as amostras O NucliSens Reader tamb m libera um gr fico padr o para cada amostra v lida lida no equipamento Componentes B sicos do Sistema Computador Impressora Carrossel PMT Tubofotomultiplicador Magneto Eletrodo Agulha Compartimento para Tamp o de ensaio Compartimento para Solu o de Limpeza Esgoto 88 B I DM R I E U X 3 Materiais B sicos para a Tecnologia NASBA 3 1 Materiais de Consumo Equipamentos e Acess rios Fornecidos pelo Fabricante Centr fuga para micro

- Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

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