Strumento MiSeqDx™ (15050260) - Support
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1. presentata nella tabella 8 L amplicone 9 presenta una corsa per omopolimeri di 14 A in base alla sequenza di riferimento del genoma umano versione 19 Tuttavia le informazioni per il riferimento composito ben caratterizzato per 7 dei 13 campioni presentano 13 A in questa corsa per omopolimeri In questi 7 campioni questa delezione di una coppia di basi rappresenta un falso negativo nello studio di accuratezza del sequenziamento MiSegDx 9 L amplicone 46 presenta un inserzione di una base che viene riportata nei 9 campioni nel database dei riferimenti ben caratterizzati e viene rilevata correttamente in tutti i campioni analizzati 22 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxIM 10 L amplicone 95 presenta una corsa per omopolimeri di 14 A in base alla sequenza di riferimento del genoma umano versione 19 Tuttavia le sequenze per il riferimento composito ben caratterizzato per 13 dei 13 campioni presentano 15 A in questa corsa per omopolimeri In questi 13 campioni questa inserzione di una coppia di basi rappresenta un falso negativo nello studio di accuratezza del sequenziamento MiSeqDx 23 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxIM La tabella seguente contiene i dati dallo Studio 1 presentati con una percentuale di concordanza positiva e negativa dove i risultati delle varianti sono confrontati sulle informazioni dei riferimenti compositi ben caratterizzati per i calcoli PPA Poich le2. Estensione ligazione degli oligonucleotidi legati Amplificazione mediante PCR Pulizia della PCR Normalizzazione della libreria Creazione di pool di librerie Preparazione della cartuccia di reagenti 1 Scongelare la cartuccia di reagenti MiSeqDx in un bagnomaria contenente abbastanza acqua deionizzata a temperatura ambiente cos da immergere la base della cartuccia di reagenti fino alla linea di livello acqua stampata sulla cartuccia stessa Evitare che l acqua superi la linea di massimo livello acqua Lasciare la cartuccia di reagenti a scongelare a bagnomaria a temperatura ambiente per circa un ora o fino a completo scongelamento Rimuovere la cartuccia dal bagno d acqua e batterla delicatamente sul banco per far fuoriuscire l acqua in eccesso dalla base Asciugare la base della cartuccia Verificare che sulla parte superiore della cartuccia di reagenti non sia caduta dell acqua Ispezione della cartuccia di reagenti 1 2 3 Capovolgere la cartuccia dieci volte per miscelare i reagenti scongelati e poi ispezionare visivamente tutti i serbatoi per accertarsi che siano scongelati NOTA E fondamentale che i reagenti nella cartuccia siano scongelati completamente e miscelati per assicurare il sequenziamento corretto Ispezionare visivamente il reagente nella posizione 1 per accertarsi che sia ben miscelato e privo di precipitati Battere delicatamente la cartuccia sul banco per ridurre le bolle d aria nei reagenti Febbraio
3. de cazioni identifi r a ne La genomico RA IR campione che stato cazioni CSE identificazioni cone soma frammento pioni pioni AS corrette per cazioni dell amplicone a o possibile effettuare non l corrette analizzato unici analizzati campione errate riuscite e mo I e ee oo e e e o e e ee E e e e o e CI ee E e e e o a O 12 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM N di Dimensione N di N totale se CINESE NONE 3 se N di identifi N di dirai x Contenuto N di identificazioni per identifi VA i su di Ampli Cromo del cam di cam de cazioni identifi r a ne La genomico RA IR campione che stato cazioni USE identificazioni cone soma frammento pioni pioni AS corrette per cazioni dell amplicone a o possibile effettuare non l corrette analizzato unici analizzati ala campione errate riuscite VC E IC E E O OOO E E E e e de o o e E E E E O OE O CO E E EL o a oo 13 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM Ampli cone 75 N di Dimensione N di N totale si SIENTE se N di identifi N di dia Contenuto N di identificazioni per identifi AG X oa di Cromo del cam di cam RIT cazioni identifi X ae ana le genomico Dea 3 campione che stato cazioni n identificazioni soma frammento i 5 pioni pioni Ay corrette per cazioni dell amplicone RPD possibile effettuare non corrette analizzato unici analizz
4. 139 100 SNV 115 10 124 Poly T 5 13 15 124 124 Regioni omologhe su un cromosoma diverso 16 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 m 00 Strumento MiSegDxTM Ampli cone 117 123 125 127 129 131 N di Dimensione N di N totale se CINESE NONE 3 z N di identifi N di dirai Contenuto N di identificazioni per identifi VA ma di Cromo del cam di cam Di cazioni identifi X dia le genomico RA IR campione che stato cazioni CSE identificazioni soma frammento 5 pioni pioni 2155 corrette per cazioni dell amplicone a E possibile effettuare non corrette analizzato unici analizzati zo campione errate riuscite 10 135 Poly A 6 13 15 135 0 135 0 100 Regioni omologhe su un cromosoma diverso e fe I e O e e o O LA CI 7 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM N di Dimensione N di N totale se CINESE NONE 3 se N di identifi N di dirai x Contenuto N di identificazioni per identifi VA i su di Ampli Cromo del cam di cam de cazioni identifi r ie eta genomico Fa SAY campione che stato cazioni CSE identificazioni cone soma frammento pioni pioni A corrette per cazioni dell amplicone a o possibile effettuare non corrette analizzato unici analizzati campione errate riuscite E CL CR 11 134 Poly A 5 13 15 134 134 Poly T 5 137 11 133 26 GC 13 15 133 133 100 SNV e e
5. 2014 Strumento MiSegDxTM MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Ma P N di N N N N N N li ra i ontenuto cam totale totale di totale totale di totale totale di PE e EAE Bee pioni di di identi di di identi di di identi cone mento dell am 3 i BERG i d i i 3 j SES i analiz identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio analiz plicone fo ficazi ficazi ficazi ficazi p ficazi ficazi i zati icazio icazio ni icazio icazio ni icazio icazio ni al ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite erratet riuscite errate pece E o _ LL euro e Pel e o Lrr_rr 3 131 Poly T 5 135 100 100 100 SNV 21 3 117 Poly A 6 135 100 100 Poly T 5 Regioni omologhe su un cromosoma diverso 29 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 1 O m 00 Strumento MiSegDxTM MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Ma P N di N N N N N N li ra i ontenuto cam totale totale di totale totale di totale totale di PE e EAE Bee pioni di di identi di di identi di di identi cone mento dell am 5 i BERG i d i i 3 SES i analiz identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio analiz plicone fo ficazi ficazi ficazi ficazi ficazi ficazi o zati icazio icazi
6. 2014 N codice 15050260 Rev A ITA 5 Strumento MiSegDxM 4 NOTA I tubi dei pescanti del MiSeqDx vanno fino al fondo di ciascun serbatoio per aspirare i reagenti per questa ragione importante che i serbatoi non contengano bolle Riporre la cartuccia in ghiaccio o conservarla a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C fino a 6 ore finch non si pronti a impostare la corsa Per risultati ottimali procedere direttamente caricando il campione e impostando la corsa Preparazione dei campioni per il sequenziamento 1 Ja A UO N g 10 11 12 13 14 15 16 17 Portare il tampone di diluizione libreria a temperatura ambiente Agitare il tampone di diluizione libreria energicamente e assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente sciolti Se la piastra SGP stata conservata congelata scongelarla fino a raggiungere la temperatura ambiente Centrifugare la piastra SGP a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto Predisporre una provetta Eppendorf nuova d ora in avanti indicata come provetta PAL Determinare i campioni da raggruppare in pool per il sequenziamento Per il sequenziamento possibile utilizzare al massimo 48 campioni contemporaneamente Se la piastra SGP stata conservata congelata mescolare ciascuna libreria da sequenziare pipettando su e gi per 3 5 volte Trasferire 5 ul di ciascuna libreria da sequenziare dalla piastra SGP colonna per colonna a una striscia a otto provette per PCR Sigillare l SGP
7. Genotipo del campione S549N HET 1812 1 G gt A HET Q493X F508del HET F508del 2184delA HET Y122X R1158X HET F508del 2183AA gt G HET R75X HET 1507del F508del HET 46 N codice 15050260 Rev A ITA Varianti Identifica zioni totali per centro 810 810 810 810 810 810 810 810 Identificazioni con concordanza positiva varianti Cen tro 1 6 6 12 12 12 2 12 Cen tro 12 12 10 12 12 Cen tro 12 12 12 12 12 Identificazioni con concordanza negativa wild type Cen Cen tro tro 1 2 804 804 804 804 798 798 To 78 798 665 798 798 804 804 798 798 804 804 798 798 798 798 804 798 N di identifica zioni errate N di identifica zioni non riuscite Concor danza positiva 100 100 100 100 94 44 100 100 100 Concor danza negativa 100 100 100 100 94 44 100 100 100 Concor danza complessiva oJ o 100 100 100 100 94 44 100 100 100 Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM Identificazioni con Identificazioni con Identifica concordanza positiva concordanzanegativa N di N di Concor Concor Concor Pan Naa zioni variant wildtype identifica identifica danza danza danza nello vi Genotpo delrampione Variant totali per zioni zioni non positiva negativa complessiva pioni centro an 3 ei n dA
8. Poly C 6 135 100 100 60 GC SNV m 00 40 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Mag IE N di N N N N N N li ra unto cam totale totale di totale totale di totale totale di dee e Ria BC pioni di di identi di di identi di di identi cone mento dell am 3 i BERG i d i i 3 j SES i i analiz identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio analiz plicone fo ficazi ficazi ficazi ficazi p ficazi ficazi zati icazio icazio ni icazio icazio ni icazio icazio ni Ali ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite errate riuscite errate VC E wsp po ow poo oo wo I oo se se fo fo e fo e e fe fe 41 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Mag IE N di N N N N N N li ra unto cam totale totale di totale totale di totale totale di SARI a BC pioni di di identi di di identi di di identi cone mento dell am 3 i BERG i d i i 3 j SES i i analiz identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio analiz plicone fo ficazi ficazi ficazi ficazi p ficazi fi
9. analizzati in due replicati indipendenti 3 N identificazioni campione che stato possibile effettuate rappresenta il numero di basi che presentavano una qualit adeguata per essere identificate dal sistema 4 N di identificazioni non riuscite rappresenta il numero di basi in un amplicone che non sono state identificate nella corsa 5 N di identificazioni corrette per campione rappresenta il numero di basi nell amplicone che sono state individuate e che hanno fornito risultati che corrispondevano alla sequenza di riferimento del genoma umano versione 19 e al riferimento composito ben caratterizzato 6 N di identificazioni errate rappresenta il numero totale di identificazioni non corrette per SNV o Indel in quell amplicone le note a pi di pagina sottostanti forniscono ulteriori dettagli sulle identificazioni non corrette 7 La di identificazioni corrette pari alla percentuale di identificazione corretta per tutte le basi nell amplicone dove l identificazione corretta per SNV o Indel si basa sulle informazioni dei riferimenti compositi ben caratterizzati e l identificazione corretta per le basi nella restante sequenza dell amplicone si basa sul confronto con la sequenza di riferimento del genoma umano versione 19 Questa colonna potrebbe presentare pi di un risultato previsto per un dato amplicone se alcuni campioni contengono un Indel o no ad esempio amplicone 9 La di identificazioni corrette per i campioni con un risultato non corretto
10. first estrazione campioni analizzati identificazione pass Precipitazione 168 100 100 100 alcolica Isolamento su 168 100 100 100 colonna di gel di silice Estrazione con 168 100 100 100 microsfere magnetiche Accuratezza La percentuale di concordanza con un metodo di analisi di riferimento sequenziamento bidirezionale Sanger calcolata per quelle posizioni delle basi che hanno ottenuto un identificazione delle basi Percentuale di campioni first pass Il numero di campioni che corrispondono alla percentuale di identificazione specificata la prima volta che sono elaborati senza la necessit di ripetere la corsa o elaborazione ulteriore sottoforma di una percentuale del numero totale dei campioni analizzati durante un singolo esperimento di sequenziamento MiSegDx Input di DNA La gamma di input di DNA per la piattaforma MiSeqDx stata valutata eseguendo uno studio di diluizione in serie usando 14 campioni di DNA rappresentativi che contenevano 16 singole varianti del gene uniche Ciascun campione stato analizzato in duplicati a 9 livelli di input di DNA che andavano da 1250 ng a 1 ng 1250 ng 500 ng 250 ng 100 ng 50 ng 25 ng 10 ng 5 ng e 1 ng Per la determinazione dell accuratezza i genotipi dei campioni sono stati confrontati coni dati ottenuti dal sequenziamento bidirezionale Sanger 1250 ng e 25 ng sono stati identificati come il legame superiore e inferiore per l input di DNA rispettivamente in quanto h
11. numero di basi negli ampliconi sequenziate con affidabilit Varianti previste per campione include sia le SNV che gli Indel 3 Per le varianti non identificate vedere la prima tabella per lo Studio 1 e le note a pi di pagina 8 10 4 Percentuale di concordanza positiva PPA 100xTP TP FN dove i veri positivi TP rappresentano il numero di identificazioni delle varianti positive a coordinate genomiche in cui le varianti sono presenti in base alla sequenza di riferimento e l allele mutante identificato concorda con la sequenza di riferimento colonna denominata Varianti identificate correttamente e i falsi negativi FN rappresentano il numero di identificazioni delle varianti negative a coordinate genomiche in cui le varianti sono presenti in base alla sequenza di riferimento colonna denominata Varianti identificate 5 Percentuale di concordanza negativa NPA 100xTN FP TN dove i falsi positivi FP rappresentano il numero di identificazioni delle varianti positive a coordinate genomiche in cui le varianti sono assenti in base alla sequenza di riferimento o se l allele mutante identificato discordante con la sequenza di riferimento non nella tabella in questo studio non sono state eseguite PPA 89 47 89 47 95 00 90 00 90 91 9870 95 83 95 24 89 47 90 91 94 74 95 83 90 00 NPA5 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 identificazioni delle varianti falso positive e veri nega
12. sequenziamento sullo strumento MiSeqDx Illumina usando la chimica SBS sequenziamento mediante sintesi La chimica SBS utilizza un metodo che fa uso di terminatori reversibili per rilevare le singole basi nucleotidiche man mano che vengono incorporate in filamenti di DNA crescenti Il software di analisi in tempo reale RTA esegue l analisi delle immagini e l identificazione delle basi e assegna anche un punteggio qualitativo a ciascuna base per ciascun ciclo di sequenziamento Al termine dell analisi primaria il software MiSeq Reporter sullo strumento MiSegDx elabora le identificazioni delle basi mediante l analisi secondaria che include de multiplexing generazione di file FASTO allineamento identificazione delle varianti e generazioni di file VCF che contengono le informazioni relative alle varianti individuate in posizioni specifiche in un genoma di riferimento Limiti della procedura 1 Per uso diagnostico in vitro 2 Questo prodotto limitato a fornire Output di sequenziamento di gt 1 Gb gt 3 milioni di letture Lunghezza di lettura in corse paired end 2 x 150 bp gt 75 delle basi con punteggio qualitativo superiore a Q30 pi del 75 delle basi presentano un punteggio qualitativo su scala Phred superiore a 30 il che indica un accuratezza di identificazione delle basi superiore al 99 9 3 Le varianti in corse per omopolimeri che superano otto basi saranno filtrate nel file VCF filtro R8 4 Questo sistema stato convalidato per i
13. 00 m 00 100 100 100 100 100 Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM Identificazioni con Identificazioni con Identifica concordanza positiva concordanzanegativa N di N di Concor Concor Concor Pan Naa zioni varianti wildtype identifica identifica danza danza danza nello SE SRO FARE bibita totali per zioni zioni non positiva negativa complessiva pioni centro se A n S n errate riuscite tro tro tro tro tro tro 1 2 3 1 2 3 s em se o o o wj s no m_ wo waero w e e e mlm ojo o w NE 67 S549R c 1647T gt G 810 804 804 804 100 100 HET o waen w e e e moo o wo n w m 00 w saem w e e e m as o o o m o 51 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM Identificazioni con Identificazioni con l Identifica concordanza positiva concordanza negativa N di N di tori Conta Cona Pan Nat zioni Sara widiype identifica identifica danza danza danza nello ur SR RE bla totali per zioni zioni non positiva negativa complessiva pio centro DN n sui n ga ne errate riuscite tro tro tro tro tro tro 1 2 3 1 2 3 621 1G gt T A455E 810 12 12 12 798 798 798 100 HET w P C e Sc RE CI I CSC CCR CI ACI CA DR ECC sw reno Deo E Ea ne ne o lt DIRETTI CIA ICE CCA RI e omni _ B R117H F508del HET 100 E 1 9 TG 12 1 5 B si Sordi RESA 10 B EA 2789 5G gt A HOM 100 HET F508del 1898 1G gt A 12 12 798 798 798
14. 00 HET e TE w w p 52 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM N di Pan cam nello Paci pioni B 89 B 90 B 91 B 92 totali Genotipo del campione F508del 2143delT HET 3905insT HET 394delTT HET F508del HET Varianti Identifica zioni totali per centro 810 810 810 810 74556 Identificazioni con concordanza positiva varianti Cen Cen Cen tro tro tro 1 2 3 12 12 12 6 6 6 6 6 6 6 6 6 2209 Identificazioni con concordanza negativa wild type Cen Cen Cen tro tro tro 1 di 3 798 798 798 804 804 804 804 804 804 804 804 804 221182 N di identifica zioni errate N di identifica zioni non riuscite 0 273 Concor danza positiva 100 100 100 100 99 77 1 La posizione del wild type corrispondente alla variante N1303K per un replicato ha prodotto un identificazione non riuscita a causa della coperture insufficiente 2 Un replicato dei campioni 5 e 75 ha registrato una percentuale di identificazione dello 0 Ulteriore investigazione indica che i campioni potrebbero non essere stati aggiunti alla piastra campioni prima della preparazione della libreria perch i volumi dei campioni rimanenti nelle provette erano coerenti con nessun volume rimosso 3 Evidenze empiriche indicano che probabilmente i campioni 9 e 10 sono stati scambiati dall operatore prima della preparazione della lib
15. 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Ma P N di N N N N N N li At i SIRIO cam totale totale di totale totale di totale totale di cad A SRO pioni di di identi di di identi di di identi cone mento dell am x x Be x F si 3 x A SER a i analiz identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio analiz plicone SX i FACES De er p RE Ne i zati ficazio ficazio ni ficazio ficazio ni ficazio ficazio ni E ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite errate riuscite errate 103 133 Poly A 5 135 100 100 100 57 GC 105 136 Poly C 5 135 100 100 100 67 GC 109 10 139 58 GC 135 100 100 100 SNV 36 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM Ampli cone Crom i 118 10 119 Poly C 5 SNV 119 120 N di Contenuto p cam genomico ioni dell am P licone Salza P zati Poly T 5 Regioni omologhe su un cromosoma diverso Poly A 6 Regioni omologhe su un cromosoma diverso MiSeqDx 1 N totale di identi ficazio ni non riuscite N totale di identi ficazio ni errate di identi ficazio ni corrette MiSeqDx 2 N totale di identi ficazio ni non riuscite N totale
16. 2 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxIM Materiale di consumo Scopo Carta pulente per lenti 10x15 cm ca Pulizia della cella a flusso Tween 20 Lavaggio dello strumento Pinzette di plastica con punta quadrata opzionale Estrazione della cella a flusso dal relativo contenitore Acqua priva di DNasi priva di RNasi Lavaggio dello strumento Linee guida per l acqua priva di DNasi e RNasi Per eseguire le procedure dello strumento usare sempre acqua priva di DNasi e RNasi Non usare mai acqua di rubinetto o acqua deionizzata A titolo di esempio accettabile quanto segue e Acqua pari a 18 MQ Megaohm e Acqua Milli Q e Acqua Super Q e Acqua sterile per biologia molecolare Avvertenze e precauzioni a y ATTENZIONE La legge federale limita la vendita di questo dispositivo da parte o dietro prescrizione di un medico o di un medico autorizzato dalla legge dello stato in cui esercita ad usare o ad ordinare l uso del dispositivo 1 Alcuni componenti di reagenti forniti da Illumina da usare con lo strumento MiSeqDx contengono formammide una ammide alifatica che una probabile tossina riproduttiva Per maggiori informazioni vedere gli inserti della confezione dei rispettivi prodotti L inalazione l ingestione il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali Smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati conformemente alle norme di sicurezza in vigore localmente Per informazio
17. 3 ampliconi Le delezioni di 2 basi sono state identificate correttamente in un campione Le delezioni di 3 basi sono state identificate correttamente in 21 campioni Riproducibilit La riproducibilit della piattaforma MiSeqDx stata determinata usando due saggi rappresentativi Febbraio 2014 N codice 15050260 Rev A ITA 26 Strumento MiSegDxTM Studio 1 x stato progettato un saggio rappresentativo per interrogare una variet di geni che coprono 24 434 basi su 19 diversi cromosomi e che contengono potenzialmente gli esoni rilevanti dal punto di vista clinico Lo studio ha esaminato 13 campioni su nove corse usando tre diversi strumenti MiSeqDx e tre diversi operatori Tabella 5 Sono stati usati un singolo lotto di reagenti per la preparazione della libreria e due lotti di materiali di consumo per il sequenziamento I 13 campioni erano stati prelevati da due genitori e 11 bambini Questi campioni sono spesso stati sottoposti a sequenziamento da laboratori multipli e metodi di sequenziamento multipli Due campioni sono stati analizzati in duplicati in questo modo ciascuna corsa ha generato risultati per 15 campioni Per la valutazione della riproducibilit da lotto a lotto sono stati analizzati 94 campioni e due controlli non templati su tre lotti Ciascun lotto stato diviso in corse da 48 campioni per testare tutti i reagenti e le possibili combinazioni di primer indice Tutte le corse di sequenziamento sono state completa
18. Caricamento campioni Pipettare 600 ul delle librerie di campioni nel serbatoio contrassegnato con la dicitura Load Samples Caricamento campioni Fare attenzione a evitare di toccare la capsula sigillante durante l erogazione del campione Una volta caricato il campione verificare la presenza di bolle d aria nel serbatoio In caso di presenza di bolle d aria picchiettare delicatamente la cartuccia sul banco in modo da farle fuoriuscire Passare direttamente alla procedura di impostazione della corsa usando l interfaccia del software operativo MiSeq MOS 6 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxIM Impostazione della corsa 1 Eseguire l accesso al software operativo MiSeq MOS 2 Selezionare Sequence Sequenziamento Si aprono una serie di schermate di configurazione nell ordine seguente Select Run Type Load Flow Cell Load Reagents Review e Pre Run Check Selezione tipo di corsa Caricamento cella a flusso Caricamento reagenti Revisione e Verifica pre corsa 3 Selezionare Diagnostic Run Corsa diagnostica 4 Quando viene visualizzata la schermata Load Flow Cell Carica cella a flusso pulire e quindi caricare la cella a flusso 5 Chiudere il coperchio a scatto e lo sportello dello scomparto della cella a flusso Il coperchio a scatto e lo sportello dello scomparto della cella a flusso devono essere chiusi per poter avviare la corsa Una volta eseguito il caricamento della cella a flusso il software
19. Concor Concor Pan Nadi zioni varianti wildtype identifica identifica danza danza danza nello x Genotipo delcampione Varian totali per zioni zioni non positiva negativa complessiva piopi centro se A n S n errate riuscite tro tro tro tro tro tro 1 2 3 1 2 3 aos wm se o o o wj s no m_ uo a y waan OO so 6 6 6 sw ss siwfo 0 mo lm A 39 F508del 3849 10kbC gt T 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET F508del 3659delC 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET m 00 a s owen OO o e 6 6 sa ss a o o mo 49 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM Identificazioni con Identificazioni con Identifica concordanza positiva concordanza negativa N di N di Crei Conto Pan Noei zioni varianti pe identifica identifica danza danza nello S Genotipo delcampione Variant totali per zioni zioni non positiva negativa pioni centro a 3 n n dan Ka errate riuscite tro tro tro tro tro tro 1 2 3 1 2 3 F508del 1898 1G gt A 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET vo ft e e E e HET p s sero sio e e e e sw smo n io o o ss maen sio 6 e e e sw emo n uo mo s 9 w_ se o o e so so so o no _ s 8 ww se lo o e wwo no mo _ e a wr de Jo o e mo mo ae o fo no jw 50 N codice 15050260 Rev A ITA Concor danza complessiva 100 m
20. a cella a flusso Il riscaldatore in questo scomparto funziona a una temperatura compresa tra 22 C e 95 C e potrebbe provocare bruciature Lo strumento pesa circa 58 kg ed eventuali cadute o errata manipolazione possono causare lesioni gravi Note sulle procedure Il rendimento per una corsa MiSeqDx pu essere tra 8 e 48 campioni I primer di indicizzazione usati durante l amplificazione mediante PCR devono essere scelti in base al rendimento dei campioni finale desiderato per garantire diversit nella sequenza d indice NOTA Per la massima efficienza di rendimento eseguire la preparazione della libreria per un massimo di 96 campioni e quindi dividere i campioni in due corse di sequenziamento con un massimo di 48 campioni ciascuno MiSeqDx utilizza un LED verde per il sequenziamento delle basi G T e un LED rosso per il sequenziamento delle basi A C Per garantire la corretta registrazione a ogni corsa deve essere letto almeno uno dei due nucleotidi per ogni canale cromatico importante conservare l equilibrio cromatico per ogni base dell indice letta sottoposta a sequenziamento altrimenti potrebbe verificarsi un problema di registrazione durante il sequenziamento della Lettura indici Se si sequenziano meno di 48 campioni in una corsa di sequenziamento selezionare gli indici appropriati in base alle relative sequenze per conservare il bilanciamento cromatico nei canali verde e rosso Come requisito minimo le corse da 8 a 48 campion
21. aio 2014 Strumento MiSegDxIM Studio 2 Uno studio di riproducibilit da centro a centro eseguito con un saggio rappresentativo il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Illumina includeva un sottogruppo di variazioni genetiche di CFTR significative dal punto di vista clinico analizzate con il software MiSeq Reporter usando il flusso di lavoro per il sequenziamento del DNA target sulla piattaforma MiSeqDx Lo studio in cieco usava 3 centri di sperimentazione e 2 operatori in ciascun laboratorio Due pannelli ben caratterizzati di 46 campioni ciascuno sono stati testati da ciascun operatore in ciascun centro per un totale di 810 identificazioni per centro I panelli erano costituiti da una miscela di DNA genomico proveniente da linee cellulari con varianti note del gene CFTR oltre che da sangue deleucocitato con aggiunta di linee cellulari con varianti note del gene CFTR I campioni di sangue servivano per consentire l incorporazione delle fasi di estrazione necessarie per preparare il gDNA utilizzato come input primario per il flusso di lavoro del saggio La percentuale dei campioni pass vale a dire il numero di campioni che hanno superato la metrica QC al primo tentativo stato del 99 88 Tutti i risultati del test sono basati su test iniziali Tabella 7 Riepilogo dei risultati dello studio di riproducibilit eseguito con un saggio rappresentativo MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Pan nello gt gt gt N di pioni
22. anno ottenuto una percentuale di campioni first pass del gt 95 senza identificazioni non corrette 100 di accuratezza e percentuale di identificazione Gli input di DNA di 1250 ng 250 ng e 100 ng sono stati ulteriormente analizzati con 4 campioni di DNA rappresentativi e 20 replicati per ciascun livello di input di DNA per ciascun campione n 4 20 80 campioni mentre il legame inferiore di 25 ng stato analizzato con 14 campioni 20 replicati per ciascun campione n 14 20 280 campioni L accuratezza e la percentuale di campioni first pass sono risultati pari al 100 a tutti i livelli di input di DNA e percentuale di identificazione dei campioni di gt 99 Sostanze interferenti Per valutare l impatto delle sostanze interferenti sulla piattaforma MiSegDx un saggio rappresentativo progettato per interrogare un gene singolo che copre 11 529 basi stato valutato in presenza o in assenza di potenziali sostanze interferenti Nello studio sono stati usati otto campioni di sangue intero che rappresentavano otto genotipi unici Quattro sostanze interferenti endogene bilirubina colesterolo emoglobina e trigliceride sono state testate aggiungendole ai campioni di sangue prima dell estrazione del DNA Per valutare l interferenza risultante dalla Febbraio 2014 N codice 15050260 Rev A ITA 54 Strumento MiSegDxIM raccolta del sangue prelievo breve EDTA stato aggiunto ai campioni di sangue in due concentrazioni I limiti di concentrazi
23. ati ENI campione errate riuscite 7 127 59 GC 13 15 127 0 127 0 100 SNV e dele _e__ VE E E CO e eoo E e E e e O O e CO 83 85 87 89 14 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM Dimensione Ampli Cromo del cone soma frammento analizzato 91 9 119 N di Contenuto cam genomico ioni dell amplicone P ri unici Regioni 13 omologhe su un cromosoma diverso Regioni omologhe su un cromosoma diverso N totale di cam pioni analizzati 15 N di identificazioni per campione che stato possibile effettuare 119 N di identifi cazioni non riuscite 0 N di identifi cazioni corrette per campione 119 N di identifi cazioni errate di identificazioni corrette 100 15 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM N di Dimensione N di N totale si SIENTE 3 se N di identifi N di dirai x Contenuto N di identificazioni per identifi T R dui di Ampli Cromo del cam di cam de cazioni identifi r a eta genomico Dea 3 campione che stato cazioni USE identificazioni cone soma frammento pioni pioni AS corrette per cazioni dell amplicone RPD possibile effettuare non corrette analizzato unici analizzati O campione errate riuscite 103 9 133 Poly A 5 13 15 133 0 133 0 100 57 GC 105 136 Poly C 5 13 15 136 136 100 67 GC 109 10 139 58 GC 13 15 139
24. bassa a basi con identificazione non riuscita in quelle corse dove la profondit di sequenziamento media era di 33 2 con un minimo di 21 e un massimo di 52 7 Quando le identificazioni non riuscite non vengono incluse nel calcolo la percentuale di identificazioni corrette del 100 43 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxIM 8 L amplicone 9 presenta una corsa per omopolimeri di 14 A in base alla sequenza di riferimento del genoma umano versione 19 Tuttavia le informazioni del riferimento ben caratterizzato per 7 dei 13 campioni presentano 13 A in questa corsa per omopolimeri In questi 7 campioni questa delezione di una coppia di basi chiamata un falso negativo e viene chiamata come falso negativo riproducibile in tutte e nove le corse L amplicone 95 presenta una corsa per omopolimeri di 14 A in base alla sequenza di riferimento del genoma umano versione 19 Tuttavia le sequenze del riferimento composito ben caratterizzato per 13 dei 13 campioni presentano 15 A in questa corsa per omopolimeri In questi 13 campioni questa inserzione di una coppia di basi non identificata ed riproducibile al 100 ad es un falso negativo 44 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxM I risultati dello Studio 1 sulla riproducibilit per ciascun campione sono mostrati combinati in una colonna da tutte le nove corse I risultati visualizzati sono solo per le varianti di singolo nucleotide e p
25. cazi zati icazio icazio ni icazio icazio ni icazio icazio ni fol ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite errate riuscite errate 19 122 Poly G 6 135 100 100 66 GC 187 19 121 Poly C 5 135 100 100 72 GC Regioni omologhe su un cromosoma diverso 42 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 00 Strumento MiSeqDx MiSeqDx 1 MiSegDx 2 MiSeqDx 3 Dime N di N N N N N N E ione del Contenuto cam totale totale di totale totale di totale totale di APURI igan 135 Srnanbeo pioni di di identi di di identi di di identi cone mento dell am analiz identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio analiz plicone a FRESE DIRE ee a SOA zati ficazio ficazio ni ficazio ficazio ni ficazio ficazio ni zato i E A z ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite errate riuscite errate 189 19 123 64 GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 190 19 138 15 0 0 100 0 0 100 0 0 100 191 20 117 Poly T 5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 192 22 136 Poly A 7 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 193 22 122 Poly A 5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly C 5 194 22 1122 62 GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 SNV 195 22 119 66 GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 1 Frammenti analizzati indica la dimensione della regione genomica sequenziata
26. con un sigillo adesivo per piastre e metterla da parte NOTA Dopo l uso conservare la piastra SGP fra 25 C e 15 C La piastra SGP sigillata rimane stabile per un massimo di 3 giorni Combinare e trasferire il contenuto della striscia a otto provette per PCR nella provetta PAL Miscelare energicamente la provetta PAL Predisporre una provetta Eppendorf nuova d ora in avanti indicata come provetta DAL Dispensare 585 ul di tampone di diluizione libreria nella provetta DAL Dispensare 6 ul di controllo interno PhiX 20 pM nella provetta DAL Pipettare su e gi per 3 5 volte per sciacquare la punta e assicurare che il trasferimento sia completo Trasferire 9 ul di PAL nella provetta DAL contenente il tampone di diluizione libreria Pipettare su e gi per 3 5 volte per sciacquare la punta e assicurare che il trasferimento sia completo Mescolare la DAL agitando la provetta molto velocemente Centrifugare la provetta DAL a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto Incubare la provetta DAL in un blocco termico a 96 C per 2 minuti Dopo l incubazione capovolgere la provetta DAL 1 2 volte per mescolarla quindi porla immediatamente in un bagno di acqua e ghiaccio Tenere la provetta DAL nel bagno di acqua e ghiaccio per 5 minuti Caricamento delle librerie di campioni nella cartuccia 1 Utilizzare la punta di una pipetta pulita e vuota da 1 ml per forare la capsula di alluminio che sigilla il serbatoio contrassegnato con la dicitura Load Samples
27. dell amplicone se analizzato unici E E E E IC A 19 3 131 Poly T 5 13 15 131 131 SNV 21 3 117 Poly A 6 13 15 117 117 Poly T 5 Regioni omologhe su un cromosoma diverso N totale na iii di N di identificazioni per i cam ST campione che stato ioni E alizzati possibile effettuare analizzati N di identifi cazioni non riuscite N di identifi cazioni corrette per campione N di identifi cazioni errate di identificazioni corrette 100 100 n 00 25 4 133 Poly C 7 13 15 133 133 100 66 GC 10 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM N di Dimensione N di N totale si SIENTE se N di identifi N di dia X Contenuto N di identificazioni per identifi re i no di Ampli Cromo del cam di cam NIE cazioni identifi ina ta genomico Dea 3 campione che stato cazioni XI identificazioni cone soma frammento 4 pioni pioni A corrette per cazioni dell amplicone a gta possibile effettuare non i corrette analizzato unici analizzati EAN campione errate riuscite 27 4 123 SNV 13 15 123 0 123 0 100 39 4 129 Poly A 5 13 15 129 129 100 Poly T 5 SNV 11 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM N di Dimensione N di N totale se CINESE NONE 3 se N di identifi N di dirai x Contenuto N di identificazioni per identifi T a So di Ampli Cromo del cam di cam
28. di identi ficazio ni errate di identi ficazio ni corrette MiSeqDx 3 N totale di identi ficazio ni non riuscite N totale di identi ficazio ni errate di identi ficazio ni corrette 100 100 00 100 100 E C a o a a cele ii E 122 CARA Z e ee Pi ee ed E a e 37 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Mag IE N di N N N N N N li ra unto cam totale totale di totale totale di totale totale di Ple ig E BRE pioni di di identi di di identi di di identi cone mento dell am i A Be x F si 3 x A SER i analiz identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio analiz plicone dti FASE De er p RE Ne i zati ficazio ficazio ni ficazio ficazio ni ficazio ficazio ni hi ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite errate riuscite errate se E e eo eo e e e e e e 135 11 134 Poly A 5 135 100 100 100 Poly T 5 137 11 133 SNV 135 100 100 26 GC m 00 38 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Mag IE N di N N N N N N li ra u
29. enze di riferimento del database erano derivate dalla combinazione di metodologie di sequenziamento multiple dati disponibili pubblicamente e informazioni ereditarie Per valutare l accuratezza del sistema la tabella seguente stata compilata in base ai dati ottenuti dalla prima corsa nello studio Per questo studio non sono stati ripetuti test I risultati ottenuti da questo studio sono presentati qui di seguito 8 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM Tabella 1 Studio 1 Accuratezza dei dati a livello di ampliconi per la piattaforma MiSeqDx Dimensione N di N totale La gati Contenuto N di identificazioni per Ampli Cromo del cam di cam genomico Sa Pn campione che stato cone soma frammento g pioni pioni mi E i dell amplicone TA si possibile effettuare analizzato unici analizzati 1 1 132 Poly C 5 13 15 132 63 GC E UO OO IE O E s e z o emo s es ee dA Aa Poly C 5 SECCA e s a Ceo e fa E e s ea o po a oo a e wo e s o es E O CO ode boo bbe b b bP 9 N codice 15050260 Rev A ITA N di identifi cazioni non riuscitet 0 N di identifi cazioni corrette per campione 132 N di identifi cazioni errate di identificazioni corrette 100 100 100 100 99 54 Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM Dimensione N di i Contenuto Ampli Cromo del i cam genomico pt cone soma frammento 4 pioni p i
30. equenziati contenenti PolyA 7 Lunghezze PolyT lt 8 ripetizione PolyT di 8 nucleotidi era stata identificata correttamente in 270 dei 270 ampliconi sequenziati contenenti PolyT 8 Lunghezze PolyG lt 6 ripetizione PolyG di 6 nucleotidi era stata identificata correttamente in 405 dei 405 ampliconi sequenziati contenenti PolyG 6 Lunghezze PolyC lt 7 ripetizione PolyC di 7 nucleotidi era stata identificata correttamente in 135 dei 135 ampliconi sequenziati contenenti PolyC 7 Lunghezze di dinucleotidi ripetuti lt 5x tutte le basi in 135 dei 135 ampliconi sequenziati con 5x di ripetizione di dinucleotidi sono state identificate correttamente Lunghezze di trinucleotidi ripetuti lt 4x tutte le basi in 810 dei 810 ampliconi sequenziati con 4x di ripetizione di trinucleotidi sono state identificate correttamente Inserzioni di 1 base e delezioni di 3 o meno basi 2 delle 3 inserzioni di 1 base testati sono state identificate correttamente Le identificazioni corrette sono state fatte per due inserzioni di 1 base in regioni non omopolimeriche in 82 ampliconi Un inserzione di 1 base non era stata identificata in una corsa per omopolimeri di 14 A su cromosoma 2 in 135 ampliconi 3 delle 4 delezioni di 1 base sono state identificate correttamente Tutte le identificazioni corrette sono state eseguite in regioni non omopolimeriche in 4 ampliconi Una delezione di 1 base non era stata identificata in una corsa per omopolimeri di 14 A su cromosoma 9 in 6
31. er i risultati di inserzioni delezioni rispetto alla sequenza del database di riferimento per tre corse su tre strumenti Questa analisi dimostra che i risultati per le varianti erano riproducibili per questi campioni su nove corse Tabella 6 Riepilogo dei risultati di riproducibilit della piattaforma MiSeqDx per 13 campioni ben caratterizzati Varianti di singolo nucleotide SNV Inserzioni delezioni Indel N ci N di corse N iso TTT i N di N di DNA ETNA per campione Sy identificazioni N di falso N di falso Indel dentificazioni N di falso N di falso ara positivi negativi si positivi negativi 1 NA128773 18 16 16 0 0 3 1 0 2 2 NA128783 18 17 17 0 0 p 0 0 2 3 NA12879 9 18 18 0 0 2 J 0 1 4 NA12880 9 17 17 0 0 3 Il 0 2 DI NA12881 9 19 19 0 0 3 1 0 2 6 NA12882 9 15 5 0 0 1 0 0 1 7 NA12883 9 22 22 0 0 2 1 0 1 8 NA12884 9 19 19 0 0 2 1 0 Il 9 NA12885 9 17 17 0 0 2 0 0 2 10 NA12886 9 19 19 0 0 3 1 0 2 11 NA12887 9 18 18 0 0 1 0 0 1 12 NA12888 9 22 22 0 0 2 Il 0 Il 13 NA12893 9 17 17 0 0 3 1 0 2 1 Falso positivo Variante identificata dalla corsa di sequenziamento MiSeqDx ma non presente nel database di riferimento 2 Falso negativo Variante presente nel database di riferimento ma non identificata nella corsa di sequenziamento MiSeqDx 3 I campioni NA12877 e NA12878 sono stati analizzati in duplicati I campioni replicati hanno generato risultati identici 45 N codice 15050260 Rev A ITA Febbr
32. ettere una descrizione per identificare la corsa Assicurarsi che la data corrisponda alla data di inizio della corsa Selezionare Next Avanti 4 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxIM Inserimento di informazioni sui campioni 1 5 Nella scheda Table Tabella o nella scheda Plate Piastra inserire le seguenti informazioni per ogni pozzetto contenente campione a Sample ID ID campione inserire un ID campione univoco b Index 1 e Index 2 Indice 1 e Indice 2 specificare l adattatore dell indice che verr utilizzato per ogni Lettura indici c Manifest Manifest specificare in nome del file manifest che contiene le informazioni relative ai campioni in quel determinato pozzetto Opzionale Per registrare informazioni pi dettagliate sui campioni inserire il nome e la descrizione di un campione Opzionale Per identificare i controlli sulla piastra selezionare Negative Negativo o Positive Positivo dal menu a discesa Control Controllo Andare alla scheda Plate Graphic Schema piastra e utilizzare l opzione Copy to Clipboard Copia in appunti o Print Stampa per acquisire un immagine della piastra campioni Selezionare Fine Preparazione dei campioni La procedura seguente deve essere eseguita in base alle Istruzioni per l uso contenute nell inserto della confezione del kit MiSeqDx Universal 1 0 Ibridazione del pool di oligonucleotidi Rimozione degli oligonucleotidi non legati
33. fe errate riuscite tro tro tro tro tro tro 1 2 3 1 2 3 A 93 F508del W1282X 810 12 11 12 798 797 798 23 97 22 99 96 99 92 HET A F508del 3849 10kbC gt T 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET sangro sio e 6 6 e asso lo w cm m 00 F508del 3659delC 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET 47 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM Identificazioni con Identificazioni con Identifica concordanza positiva concordanza negativa N di N di tori Conta Cona Pan Sa zioni varianti wildtype identifica identifica danza danza danza cam Genotipo del campione Varianti Sg A ni lisi nello pioni totali per Ced Cor Coi C re Ceh Cek zioni ve non ona ve na essiva centro tto a da tro a tro errate riuscite 1 2 3 1 2 3 A 19 621 1G gt T 711 1G gt T 810 12 12 12 798 798 798 100 HET A F508del R560T HET LE 100 A F508del Y1092X C gt A KA CA ax ka esi 100 HET DIC CIR N COS CIC CECI CIC CNC CAT aoa som sio 6 6 e es sullo o 0 lio lia aoa ereo O eo Te Te e si sale o i i Li n e le sio e o o so so solo o so i li no 30 men OO sio 6 6 e es sullo 0 io lio lia a a j mica feo le e e si sso o i 0 li a Ja aim Ts e e e slilslo o e jan le 48 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM Identificazioni con Identificazioni con Identifica concordanza positiva concordanzanegativa N di N di Concor
34. i PE e EA PN pioni di di identi di di identi di di identi cone mento dell am 5 i BERG i d i i 3 SES i analiz identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio analiz plicone fo ficazi ficazi ficazi ficazi ficazi ficazi na zati icazio icazio ni icazio icazio ni icazio icazio ni ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite errate riuscite errate 91 119 Regioni 135 100 100 100 omologhe su un cromosoma diverso N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Mag IE N di N N N N N N li ra unto cam totale totale di totale totale di totale totale di dei VR BRE pioni di di identi di di identi di di identi cone mento dell am g i Fasti A 4 f ni i k ati i i analiz identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio analiz plicone dti FASE De er p RE Ne zati ficazio ficazio ni ficazio ficazio ni ficazio ficazio ni zato z z 5 ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite erratet riuscite errate 93 Regioni omologhe su un cromosoma diverso se de ee e Le eli re ei Pi e e dee e e i lede ei 35 N codice
35. i devono includere una combinazione di primer di indicizzazione identificata nell inserto della confezione del kit MiSegDx Universal 1 0 Per elaborare in maniera accurata corse pi piccole devono essere presenti almeno otto campioni Se non sono disponibili sei campioni univoci esclusi i controlli positivi e negativi accettabile completare la corsa con replicati o qualsiasi campione di DNA genomico umano Per il set minimo di indici bilanciati per colore da usare nelle corse di sequenziamento a otto campioni vedere l inserto della confezione del kit MiSeqDx Universal 1 0 Istruzioni per l uso Le istruzioni seguenti per l uso dello strumento MiSegDx richiedono i reagenti forniti nel kit MiSeqDx Universal 1 0 Preparazione del foglio campioni per MiSeqDx 1 611 Nella schermata Welcome Benvenuto di Worklist Manager Illumina selezionare Create Worklist Crea lista di lavoro Nel campo Test Type Tipo di test selezionare MiSeqDx Universal Nel campo Worklist Name Nome lista di lavoro immettere il nome per il foglio campioni Se per il nome del foglio campioni viene utilizzato l ID alfanumerico del codice a barre della cartuccia di reagenti il software operativo MiSeq MOS trover automaticamente il foglio campioni Se per il foglio campioni viene utilizzato un qualsiasi altro nome il pulsante Browse Sfoglia nel software operativo MiSeq MOS pu essere utilizzato per trovare il foglio campioni corretto Opzionale Imm
36. i di identi mento Li analiz identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio analiz plicone fo ficazi ficazi ficazi ficazi ficazi ficazi Sat zati 1caz10 1caz10 nl 1Caz10 1Caz10 nl 1Caz10 1Caz10 nl ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite errate riuscite errate sof se fo fo ie fo fa fe fe s mw E wsp po w p po woo IC 32 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Ma P N di N N N N N N li At i SIRIO cam totale totale di totale totale di totale totale di cad A SRO pioni di di identi di di identi di di identi cone mento dell am 5 i BERG i d i i 3 SES i analiz identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio analiz plicone fo ficazi ficazi ficazi ficazi ficazi ficazi na zati icazio icazio ni icazio icazio ni icazio icazio ni ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite erratet riuscite errate VE oo O IC O E eo o VE E CO eo O CO e RC ie _ leo ie e eni 7 127 59 GC 135 100 100 SNV RAR ER ME i E VA DCO O O 33 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM 34 MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Ma P N di N N N N N N li At i ontenuto cam totale totale di totale totale di totale totale d
37. iconi sequenziate con affidabilit 3 Percentuale di concordanza positiva PPA 100xTP TP EN 4 Percentuale di concordanza negativa NPA 100xTN FP TN 5 La variante non identificata rappresenta la delezione di una coppia di basi nell amplicone 9 nella corsa di omopolimeri di 14 A non identificata da MiSeqDx che presente nella sequenza NIST Prestare attenzione che la sequenza NIST non include l inserzione di una coppia di basi nell altro omopolimero di A che era presente nell altro database di riferimento usato sopra nello Studio 1 Studio 3 stato eseguito un ulteriore studio di accuratezza per valutare le prestazioni di inserzioni e delezioni piccole in un saggio rappresentativo il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis 139 Variant Illumina che include un sottogruppo di variazioni genetiche del gene CFTR significative dal punto di vista clinico e analizzato con il software MiSeq Reporter usando il flusso di lavoro di sequenziamento del DNA target sulla piattaforma MiSeqDx Le inserzioni e le delezioni interrogate sono state rilevate dove previsto con elevata affidabilit Questi campioni sono stati caratterizzati mediante il sequenziamento bidirezionale Sanger un metodo di riferimento usato per stabilire le sequenze previste Tabella 4 Riepilogo delle delezioni Indel con la piattaforma MiSeqDx N di identi Contenuto ficazioni BRIO N di N n N di di i Dimen N di basi identifi aea Ba Ampli genomico campione che a
38. identificazioni per identifi ar g pe di cam di cam Di cazioni identifi X diana le genomico ioni ioni campione che stato cazioni SANE DENSA identificazioni dell amplicone P a P gta possibile effettuare non i P corrette unici analizzati 00 campione errate riuscite 13 15 133 0 133 0 100 S Poly G 6 13 15 122 122 100 66 GC m 00 Poly C 5 13 15 121 121 72 GC Regioni omologhe su un cromosoma diverso 21 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxIM N di i i di N di identifi N di X PINEN SIONE Contenuto Negli N totale N di identificazioni per identifi i 7 n O f 3 di Ampli Cromo del cam di cam NIE cazioni identifi RIE nato genomico SBA SR campione che stato cazioni 66 identificazioni cone soma frammento 5 pioni pioni a corrette per cazioni dell amplicone possibile effettuare non f corrette analizzato unici analizzati LAIN campione errate riuscite 191 20 117 Poly T 5 13 15 117 0 117 0 100 192 DD 136 Poly A 7 13 15 136 0 136 0 100 193 22 122 Poly A 5 13 15 122 0 122 0 100 Poly C 5 194 DI 122 62 GC 18 o 122 0 122 0 100 SNV 195 22 119 66 GC 13 15 119 0 119 0 100 1 Frammenti analizzati indica la dimensione della regione genomica sequenziata in basi non sono inclusi i primer specifici per il target 2 N totale dei campioni elencati 15 perch due dei 13 campioni unici analizzati sono stati
39. illumina Strumento MiSegDx M PERUSO DIAGNOSTICO IN VITRO N di catalogo DX 410 1001 Uso previsto Lo strumento di sequenziamento MiSeqDx Illumina misura i segnali fluorescenti di nucleotidi marcati mediante l uso di reagenti e celle a flusso specifici kit MiSeqDx Universal 1 0 per lo strumento hardware di imaging e software per l analisi dei dati La piattaforma MiSeqDx prevista per il sequenziamento mirato del DNA genomico umano ottenuto da campioni di sangue periferico intero La piattaforma MiSeqDx non prevista per il sequenziamento dell intero genoma o il sequenziamento de novo MiSeqDx previsto per l uso con i kit di saggi e reagenti per IVD forniti da Illumina Principi della procedura La piattaforma MiSegDx Illumina prevista per il sequenziamento mirato del DNA genomico umano ottenuto da campioni di sangue periferico intero usando i materiali di consumo forniti da Illumina Il DNA genomico viene elaborato durante la procedura di preparazione della libreria che specificatamente amplifica le regioni genomiche previste di ciascun campione usando gli oligonucleotidi personalizzati e progettati dall utente aggiungendo inoltre gli indici e le sequenze di cattura della cella a flusso ai prodotti amplificati La preparazione della libreria consiste di quattro fasi principali ibridazione estensione ligazione amplificazione mediante PCR e normalizzazione della libreria Le librerie dei campioni cos ottenute sono pronte per il
40. in basi non sono inclusi i primer specifici per il target 2 Numero di campioni calcolato da 9 corse di 15 campioni una volta la corsa da 11 campioni e due volte la corsa da 2 campioni 3 Numero totale di identificazioni non riuscite rappresenta il numero combinato di mancate identificazioni ottenute per tutte le 45 corse che analizzavano l amplicone specifico usando uno strumento MiSeqDx specifico 4 Numero totale di identificazioni errate rappresenta il numero combinato di identificazioni errate ottenute per tutte le 45 corse che analizzavano l amplicone specifico usando uno strumento MiSegDx specifico 5 La di identificazioni corrette pari alla percentuale di identificazioni corrette per tutte le basi nell amplicone dove l identificazione corretta per SNV o Indel si basa sul database dei riferimenti compositi ben caratterizzati e l identificazione corretta per le basi nella restante sequenza dell amplicone si basa sul confronto con la sequenza di riferimento del genoma umano versione 19 Questa colonna potrebbe presentare pi di un risultato previsto per un dato amplicone se per alcuni campioni prevista la presenza di uno o pi Indel ad esempio amplicone 9 6 L amplicone 1 presentava diverse basi il cui genotipo non stato possibile identificare 12 basi nelle corse 1 9 in NA12881 1 base nelle corse 2 9 e 3 basi nelle corse 1 9 in NA12886 20 basi nelle corse 1 9 e 26 basi nelle corse 1 9 in NA12888 Questo dovuto alla copertura
41. informazioni dei riferimenti compositi forniscono solo risultati per le varianti di singolo nucleotide e inserzioni delezioni i risultati delle basi non varianti sono confrontati alla sequenza di riferimento del genoma umano versione 19 per i calcoli NPA Tutte le basi non varianti presentano una concordanza del 100 con la sequenza di riferimento Tutte le SNV presentano una concordanza del 100 con la sequenza di riferimento Le varianti che non sono state identificate erano inserzioni di 1 base o delezioni di 1 base nelle regioni omopolimeriche Tabella 2 Concordanza dei risultati di identificazione delle basi sulla piattaforma MiSeqDx con i dati di riferimento per 13 campioni ben caratterizzati Camp ione NA12877 NA128378 NA12879 NA12880 NA12881 NA12882 NA12883 NA12884 NA12885 NA12886 NA12887 NA12888 NA12893 N di ampli coni 195 195 195 195 195 195 195 195 195 195 195 195 195 di copertura degli ampliconi 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Varianti previste per campione 19 19 20 20 22 16 24 21 19 p2 19 24 20 Varianti identificate corretta mente 17 17 19 18 20 15 23 20 17 20 18 29 18 Varianti non identi ficate Basi non varianti identificate corretta mente 24418 24417 24416 24417 24415 24419 24412 24415 24417 24415 24416 24412 24417 1 di copertura degli ampliconi rappresenta il
42. l rilevamento di SNV e fino a delezioni di 3 basi La valutazione delle inserzioni di 1 base stata limitata a 3 diverse inserzioni su 3 cromosomi separati 5 Il sistema ha problemi nel rilevare le inserzioni o le delezioni di 1 base in tratti omopolimerici ad es PolyA 6 Il sistema MiSeqDx progettato per fornire risultati qualitativi vale a dire genotipo Febbraio 2014 N codice 15050260 Rev A ITA 1 Strumento MiSegDxM 7 Come per qualsiasi flusso di lavoro basato sull ibridazione polimorfismi o mutazioni latenti nelle regioni che legano gli oligonucleotidi possono interessare gli alleli sottoposti a sonda e di conseguenza le identificazioni effettuate 8 La copertura minima raccomandata per l amplicone necessaria per l identificazione accurata delle varianti Q max_gt poly_site gt 100 di 75x Componenti del prodotto MiSeqDx Illumina composto da e Strumento MiSeqDx N di catalogo DX 410 1001 I seguenti componenti software sono richiesti per il funzionamento e l analisi dei dati MiSeqDx Applicazione Funzione software MOS Controlla il software funzionamento operativo dello MiSeqDx strumento RTA Esegue l analisi software di primaria analisi in tempo reale MiSeq Esegue l analisi Reporter secondaria Descrizione L applicazione software MOS gestisce il funzionamento dello strumento durante il sequenziamento e genera immagini da usare con il software di analisi in tempo reale RTA L applica
43. legge l etichetta RFID e ne registra il contenuto Se l etichetta RFID viene letta correttamente nell angolo inferiore destro della schermata appare un messaggio di conferma 6 Quando viene visualizzata la schermata Load Reagents Caricamento reagenti svuotare il flacone degli scarti caricare un flacone di soluzione SBS MiSeqDx PR2 e quindi caricare la cartuccia di reagenti Quando il flacone di Soluzione SBS MiSeqDx PR2 e la cartuccia di reagenti sono caricate il software legge e registra le etichette RFID Se l etichetta RFID viene letta correttamente nell angolo inferiore destro della schermata appare un messaggio di conferma 7 Selezionare il foglio campioni appropriato Per impostazione predefinita il software cercher il file del foglio campioni con un nome che corrisponde al numero del codice a barre della cartuccia di reagenti caricata sullo strumento 8 Confermare le impostazioni della corsa e i risultati della verifica pre corsa 9 Avviare la corsa La schermata Sequencing Sequenziamento si apre all inizio della corsa La schermata fornisce una rappresentazione visiva dell avanzamento della corsa che comprende le intensit e i punteggi qualitativi Q scores Risultati Il software integrato di analisi primaria in tempo reale RTA esegue l analisi delle immagini e l identificazione delle basi e assegna anche un punteggio qualitativo a ciascuna base per ciascun ciclo di sequenziamento Al termine dell analisi primaria il s
44. li prodotti LA LETTURA INCOMPLETA DEL CONTENUTO DEL PRESENTE DOCUMENTO E IL MANCATO RISPETTO DI TUTTE LE ISTRUZIONI IVI CONTENUTE PU CAUSARE DANNI AL PRODOTTO LESIONI PERSONALI A UTENTI E TERZI E DANNI MATERIALI ILLUMINA NON SI ASSUME ALCUNA RESPONSABILIT DERIVANTE DALL USO IMPROPRIO DEI PRODOTTI QUI DESCRITTI COMPONENTI E SOFTWARE INCLUSI O DA QUALSIASI USO DI TALI PRODOTTI NON ESPLICITAMENTE CONTEMPLATO NELLE LICENZE SCRITTE O NELLE AUTORIZZAZIONI CONCESSE DA ILLUMINA IN OCCASIONE DELL ACQUISIZIONE DEI PRODOTTI STESSI DA PARTE DEL CLIENTE 55 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxIM PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 2014 Illumina Inc Tutti i diritti riservati Illumina e MiSeqDx sono marchi o marchi registrati di Illumina Inc Tutti gli altri marchi e denominazioni qui citati sono di propriet dei rispettivi titolari AMPure Beckman e Beckman Coulter sono marchi di fabbrica o marchi registrati di Beckman Coulter Inc Febbraio 2014 N codice 15050260 Rev A ITA 56 Strumento MiSegDxIM Informazioni di contatto dl Ilumina Emergo Europe San Diego California 92122 U S A Molenstraat 15 1 800 809 ILMN 4566 2513 BH L Aia 1 858 202 4566 fuori dal Nord America Paesi Bassi techsupport illumina com www illumina com Etichettatura del prodotto Fare riferimento alla chiave dei simboli spediti con ciascun kit per un riferimento completo ai simboli che possono apparire sulla confezi
45. mancate N identifi identifi sione identificate Lr cazioni DE Nec cone j dell ampli stato identifi cazioni cazioni inserto ig campione sot campione cone possibile cazioni errate corrette corrette effettuare 1 129 Inserzione di 130 130 0 130 0 100 1 base 2 154 Delezione di 151 Mal 0 151 0 100 3 basi 3 167 Delezione di 165 165 0 165 0 100 2 basi 25 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxIM N di identi N di i Contenuto ficazioni Daon N di PENENT N di di Dimen N di basi identifi na n Ampli genomico campione che a mancate er identifi identifi sione A x identificate na cazioni 0 Sa cone i dell ampli stato gt identifi A cazioni cazioni inserto ti campione LR campione cone possibile cazioni errate corrette corrette effettuare 4 134 Delezione di 133 199 0 133 0 100 1 base 5 132 Delezione di 131 131 0 131 0 100 1 base 6 129 Delezione di 128 128 0 128 0 100 1 base I dati forniti da questi studi di accuratezza supportano l asserzione che la piattaforma MiSeqDx pu sequenziare accuratamente Contenuto GC gt 19 tutte le basi in 135 dei 135 ampliconi sequenziati con 19 di contenuto GC identificato correttamente Contenuto GC lt 72 tutte le basi in 135 dei 135 ampliconi sequenziati con 72 di contenuto GC identificato correttamente Lunghezze PolyA lt 7 ripetizione PolyA di 7 nucleotidi era stata identificata correttamente in 270 dei 270 ampliconi s
46. n 12 diverse combinazioni di primer di indicizzazione Quarantotto 48 combinazione di indici sono state analizzate in una corsa di sequenziamento I risultati dei campioni sono stati confrontati con i dati ottenuti dal sequenziamento bidirezionale Sanger per tutte le posizioni varianti Riproducibilit e accuratezza sono risultate del 100 per tutte le combinazioni di primer indice campione Brevetti e marchi registrati Questo documento e il suo contenuto sono di propriet di Illumina Inc e delle aziende a essa affiliate Illumina e sono destinati esclusivamente a uso contrattuale da parte dei clienti di Illumina per quanto concerne l utilizzo dei prodotti qui descritti con esclusione di qualsiasi altro scopo Questo documento e il suo contenuto non possono essere usati o distribuiti per altri scopi e o in altro modo diffusi resi pubblici o riprodotti in alcun modo senza preventiva approvazione scritta da parte di Illumina Mediante questo documento Illumina non trasferisce alcuna licenza sui propri diritti su brevetti marchi di fabbrica copyright o diritti secondo il diritto consuetudinario n alcun diritto similare di alcun terzo AI fine di assicurare un uso sicuro e corretto dei prodotti qui descritti le istruzioni riportate in questo documento devono essere scrupolosamente ed esplicitamente seguite da personale qualificato e adeguatamente addestrato Leggere e comprendere a fondo tutto il contenuto di questo documento prima di usare ta
47. ni contattare l Assistenza tecnica Ilumina 2 Alcuni componenti dei reagenti forniti da Illumina contengono 2 mercaptoetanolo un agente riducente Per maggiori informazioni vedere gli inserti della confezione dei rispettivi prodotti L inalazione l ingestione il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali Utilizzarlo in un area ben ventilata e smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati conformemente alle norme di sicurezza in vigore localmente Per informazioni contattare l Assistenza tecnica Illumina 3 Maneggiare tutti campioni come se fossero agenti potenzialmente infettivi 4 Il mancato rispetto delle procedure descritte pu produrre risultati errati o una riduzione significativa della qualit del campione 5 Adottare le normali precauzioni di laboratorio Non pipettare con la bocca Non mangiare bere o fumare nelle zone designate per il lavoro Manipolare i campioni e i reagenti del kit indossando guanti e indumenti da laboratorio monouso Dopo aver maneggiato i campioni e i reagenti del kit lavarsi bene le mani 6 necessario adottare idonee pratiche di laboratorio e una valida igiene per impedire la contaminazione di reagenti strumenti e campioni di DNA genomico con i prodotti della PCR La contaminazione da PCR pu produrre risultati inesatti e inaffidabili 7 AI fine di prevenire la contaminazione accertarsi che le aree di pre amplificazione e post amplificazione siano dotate delle apposite at
48. nto cam totale totale di totale totale di totale totale di Ple ig E BRE pioni di di identi di di identi di di identi cone mento dell am i A Be x F si 3 x A SER i analiz identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio analiz plicone dti FASE De er p RE Ne i zati ficazio ficazio ni ficazio ficazio ni ficazio ficazio ni E ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite erratet riuscite errate RE wao e o o m CO o w o o e e ooo e e o a e o w e eo 13 123 Poly T 5 135 100 100 26 GC 15 n _ 00 39 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Ma P N di N N N N N N li ra i ontenuto cam totale totale di totale totale di totale totale di PE e EAE Bee pioni di di identi di di identi di di identi cone mento dell am 3 Be x F si 3 j SER i analiz identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio analiz plicone ficazi FASE De er p RE Ne zati icazio ficazio ni ficazio ficazio ni ficazio ficazio ni al ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite errate riuscite errate Pene il we een _ a _ el eli de e ll e e _ I 165 17 116
49. o ni icazio icazio ni icazio icazio ni ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite errate riuscite errate 4 133 Poly C 7 135 100 100 100 66 GC eje w e e be e p beo e be eo ece o o e e eo e po bo e eo o e e oo e CE CO e e e eo 2 0 1 30 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Ma P N di N N N N N N li ra i ontenuto cam totale totale di totale totale di totale totale di PE e EAE Bee pioni di di identi di di identi di di identi cone mento dell am 5 i BERG i d i i 3 SES i analiz identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio analiz plicone fo ficazi ficazi ficazi ficazi ficazi ficazi o zati icazio icazio ni icazio icazio ni icazio icazio ni ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite errate riuscite errate 37 Poly T 6 0 0 100 0 0 100 0 0 100 4 129 Poly A 5 135 100 100 Poly T 5 SNV eps is is fo fo e fo o le 0 ife Ls e fe Le fe e e eo 31 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM Ampli cone 51 53 55 57 MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Ma AE N di N N N N N N At i ontenuto cam totale totale di totale totale di totale totale di Crom SM SI pioni di di identi di di identi d
50. oftware MiSeq Reporter sullo strumento MiSeqDx inizia l analisi secondaria come descritto di seguito De multiplexing Il de multiplexing costituisce la prima fase dell analisi se nel foglio campioni sono elencati pi campioni e la corsa presenta letture indici Mediante il de multiplexing possibile separare i dati da campioni raggruppati in pool in base a sequenze indice brevi che etichettano i campioni di diverse librerie Ciascuna sequenza di lettura indici e viene messa a confronto con le sequenze indice specificate nel foglio campioni In questa fase non vengono considerati i valori qualitativi Generazione di file FASTQ Dopo il de multiplexing MiSeq Reporter genera file intermedi in formato FASTO un formato di testo utilizzato per rappresentare le sequenze I file FASTQ contengono le letture di ciascun campione e i punteggi qualitativi con l esclusione delle letture dei cluster che non hanno attraversato il filtro Il punteggio qualitativo Q calcolato come 10 log P dove P la probabilit di identificazione delle basi errata Febbraio 2014 N codice 15050260 Rev A ITA 7 Strumento MiSegDxIM Allineamento Mediante l allineamento possibile confrontare le sequenze rispetto a un riferimento al fine di identificare una relazione fra le sequenze e assegnare un punteggio in base a regioni di similarit Le letture allineate vengono scritte su file in formato BAM Per il kit MiSeqDx Universal 1 0 MiSeq Reporter utilizza un alg
51. one di ciascuna sostanza sono riportati nella tabella seguente Inoltre per valutare l interferenza risultante dalla preparazione dei campioni stato aggiunto 15 di tampone di lavaggio a 8 DNA genomici purificati stata raggiunta una percentuale di identificazione del 100 per tutti i campioni analizzati oltre a una riproducibilit del 100 nell identificazione dei genotipi tra i campioni in presenza o in assenza delle sostanze interferenti Concentrazione Concentrazione Numero totale di analizzata nel analizzata nel Percentuale di Sostanza del test a IA replicati sangue sangue identificazione limite superiore limite inferiore Bilirubina 16 684 umol 1 137 umol l 100 Colesterolo 16 13 mmol l 2 6 mmol l 100 Emoglobina 16 2 g l 0 4 g l 100 Trigliceride 16 37 mmol l 7 4 mmol l 100 EDTA 16 7 mg ml 2 8 mg ml 100 Indicizzazione del campione I primer indice dei campioni sono utilizzati nel kit per assegnare un codice a barre univoco a ciascun campione di DNA consentendo di raggruppare in un pool pi campioni in una singola corsa di sequenziamento Sono stati analizzati complessivamente 96 indici di campioni mediante un saggio rappresentativo progettato per interrogare un gene singolo che copre 11 529 basi con 8 campioni di DNA unico al fine di verificare la capacit del saggio di identificare i genotipi in modo coerente per un dato campione fra diverse combinazioni di primer di indicizzazione Ciascun campione stato analizzato co
52. one e sull etichettatura del prodotto Febbraio 2014 N codice 15050260 Rev A ITA 57
53. ooo e e e o e eoo 18 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM N di Dimensione N di N totale si SIENTE 3 se N di identifi N di dirai X Contenuto N di identificazioni per identifi T a So di Ampli Cromo del cam di cam de cazioni identifi r a eta genomico Dea 3 campione che stato cazioni USE identificazioni cone soma frammento 4 pioni pioni A corrette per cazioni dell amplicone a dt possibile effettuare non corrette analizzato unici analizzati N campione errate riuscite 147 13 116 Poly C 5 13 15 116 0 116 0 100 26 GC 19 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM N di Dimensione N di N totale se CINESE NONE 3 se N di identifi N di dirai x Contenuto N di identificazioni per identifi VA i su di Ampli Cromo del cam di cam de cazioni identifi t a pale genomico Vo pi campione che stato cazioni USE identificazioni cone soma frammento pioni pioni da corrette per cazioni dell amplicone a o possibile effettuare non i corrette analizzato unici analizzati OE campione errate riuscite 165 17 116 Poly C 6 13 15 116 116 100 60 GC SNV DE E e e O E eo z E O E A CR z fe ee e O ICE CI 20 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM Dimensione Ampli Cromo del cone soma frammento analizzato 179 18 133 N di N di N totale N di identifi N di n Contenuto N di
54. oritmo di Smith Waterman con matrice a banda che esegue allineamenti locali di sequenze per determinare il grado di similarit fra due sequenze Identificazione delle varianti Per il kit MiSeqDx Universal 1 0 MiSeq Reporter utilizza il Variant Caller Starling che identifica SNP e Indel piccoli e riassume la profondit e le probabilit per ciascun sito nel genoma Starling produce report di SNP e Indel in formato html e file di testo delimitato da tabulazione contenenti le varianti in formato VCF Variant Call Format Per informazioni su come possono essere calcolati i risultati dai file VCF vedere la Guida per l utente di MiSeg Reporter n codice 15039188 Caratteristiche prestazionali Accuratezza Sono stati condotti tre studi separati per valutare l accuratezza della piattaforma MiSegDx Studio 1 Questo studio usa un saggio rappresentativo progettato per interrogare una variet di geni che coprono 24 434 basi su 19 diversi cromosomi e che contengono potenzialmente gli esoni rilevanti dal punto di vista clinico I 13 campioni unici usati in questo studio appartengono a due genitori e 11 bambini Questi campioni sono spesso stati sottoposti a sequenziamento da laboratori multipli e metodi di sequenziamento multipli Sei campioni sono femminili e sette sono maschili L accuratezza stata determinata per le varianti di singolo nucleotide SNV confrontando i dati dello studio su un database dei riferimenti ben caratterizzati Le sequ
55. reria Concor danza negativa 100 100 100 100 99 88 Concor danza complessiva 100 100 100 100 99 88 4La posizione del wild type corrispondente alla variante M1V per un replicato di ciascuno dei due campioni ha prodotto un identificazione non riuscita a causa della copertura insufficiente 53 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxIM Estrazione del DNA Tre diversi metodi di estrazione estrazione con microsfere magnetiche precipitazione alcolica e isolamento mediante colonna di gel di silice sono stati valutati utilizzando sangue intero anticoagulato in K EDTA In questo studio sono stati usati quattordici campioni di sangue unici che rappresentano una gamma di genotipi da un gene rappresentativo I tre metodi di estrazione del DNA sono stati analizzati indipendentemente da 2 diversi operatori e ciascuno di loro ha eseguito 3 corse per ciascun metodo di estrazione Ciascuna estrazione stata eseguita da ciascun operatore in giorni diversi La concentrazione di DNA e il rapporto A260 A280 dei campioni di gDNA estratto sono stati determinati usando spettrofotometria La dimensione complessiva del campione per ciascun metodo di estrazione esaminato nello studio stato pari a 168 14 campioni x 2 operatori metodo di estrazione x 3 corse operatore x 2 replicati campioni di gDNA estratto Percentuale di Metodo di Numero di Percentuale di a a IA E Accuratezza campioni
56. te da un singolo operatore e su un singolo strumento MiSegDx per rimuovere qualsiasi potenziale variazione da parte dell operatore o dello strumento Tabella 6 Le identificazioni corrette sono state determinate per le varianti di singolo nucleotide SNV confrontando i dati dello studio su informazioni dei riferimenti ben caratterizzati Per lo studio di riproducibilit non si sono verificate corse non riuscite o corse ripetute Le tabelle seguenti mostrano i risultati degli studi per valutare la riproducibilit del sistema 27 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio 2014 Strumento MiSegDxTM Tabella 5 Studio 1 Risultati sulla riproducibilit da strumento a strumento per la piattaforma MiSeqDx a livello di ampliconi MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Dimen di N N N N N N sions del Contenuto totale totale di totale totale di totale totale di Amphi ion am genomico ioni di di identi di di identi di di identi cong mento aeu aon identi identi ficazio identi identi ficazio identi identi ficazio E I PHORE ficazio ficazio ni ficazio ficazio ni ficazio ficazio ni zato ni non ni corrette ni non ni corrette ni non ni corrette riuscite errate riuscite erratet riuscite errate 1 Poly C 5 135 0 0 100 236 0 99 617 396 0 99 347 63 GC CINICI CRI I II O CO O LI E 7 Poly T 5 100 100 100 Poly C 5 I ao e e eo I CEE o E 28 N codice 15050260 Rev A ITA Febbraio
57. tivi TN rappresentano il numero di identificazioni delle varianti negative a coordinate genomiche in cui le varianti sono assenti in base allo standard di riferimento colonna denominata Basi non varianti identificate correttamente Febbraio 2014 N codice 15050260 Rev A ITA 24 Strumento MiSegDxTM Studio 2 I risultati del sequenziamento per il pannello degli ampliconi sopra indicato sono stati confrontati con un genotipo altamente affidabile per NA12878 dal National Institutes of Standards and Technology NIST v 2 15 Dei 195 ampliconi 184 ampliconi rientravano nelle identificazioni di riferimento altamente affidabili nella sequenza NIST ed erano stati confrontati Le identificazioni di basi non varianti sono state confrontate con la sequenza di riferimento del genoma umano versione 19 Tabella 3 Confronto dei risultati del sequenziamento sulla piattaforma MiSeqDx per il campione NA12878 con il database NIST Basi non di Varianti Varianti DI N di SI Li varianti Camp copertura Varianti identificate non sf PPA NPA ampli I identificate ione i degli previste corretta identi coni i 2 corretta ampliconi mente ficate mente NA12878 184 100 17 16 15 23066 94 12 100 1 Zook JM et al Integrating sequencing datasets to form highly confident SNP and indel genotype calls for a whole human genome arXiv 1307 4661 q bio GN 2 di copertura degli ampliconi rappresenta il numero di basi negli ampl
58. trezzature ad es pipette punte di pipette agitatori e centrifughe 8 Le combinazioni indice campione devono corrispondere esattamente a quelle del foglio campioni La non corrispondenza fra il foglio campioni e il layout della piastra risulter in una perdita di identificazione dei campioni positivi e nella refertazione di risultati errati 9 Durante la fase di normalizzazione della libreria in base all inserto della confezione dei rispettivi reagenti estremamente importante risospendere completamente il pellet di microsfere della libreria Questo fondamentale per ottenere una densit dei cluster omogenea sulla cella a flusso MiSegDx Febbraio 2014 N codice 15050260 Rev A ITA 3 Strumento MiSegDxTM 10 11 12 13 14 Attenersi ai tempi di incubazione indicati nella procedura di normalizzazione della libreria come descritto nell inserto della confezione dei rispettivi reagenti Un incubazione inadeguata pu influire sulla rappresentazione della libreria e sulla densit dei cluster Si consiglia vivamente l installazione di un software antivirus fornito dall utente per proteggere il computer dai virus Consultare il Manuale d uso per le istruzioni relative all installazione Non far funzionare MiSegDx se un qualsiasi pannello rimosso Il funzionamento dello strumento con un qualsiasi pannello rimosso crea esposizione potenziale a tensioni di linea e tensioni c c Non toccare il piano portacelle nello scomparto dell
59. zione software RTA converte le immagini generate da MOS per ciascuna tile per cclo della corsa di sequenziamento in file di identificazioni delle basi che rappresentano gli input per il software MiSeq Reporter L applicazione software RTA non contiene un interfaccia utente Il software MiSeq Reporter elabora le identificazioni delle basi mediante l analisi secondaria che include de multiplexing generazione di file FASTQ allineamento identificazione delle varianti e generazioni di file VCF che contengono le informazioni relative alle varianti individuate in posizioni specifiche in un genoma di riferimento Conservazione e manipolazione Elemento Specifica Temperatura Trasporto e conservazione da 10 C a 40 C Condizioni di funzionamento da 19 C a 25 C Umidit Trasporto e conservazione umidit senza condensa Condizioni di funzionamento umidit relativa 30 75 senza condensa Apparecchiatura e materiali richiesti non forniti Materiali di consumo per il sequenziamento Kit MiSeqDx Universal 1 0 n di catalogo DX 103 1001 Materiali di consumo forniti dall utente Prima di avviare una corsa di sequenziamento accertarsi di avere a disposizione i seguenti materiali di consumo forniti dall utente Materiale di consumo Scopo Salviettine imbevute di alcol isopropilico al 70 Pulizia del vano portacella oppure di etanolo al 70 Panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle Pulizia del piano portacelle
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