Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical - Support
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1. Definizione Piastra di ibridazione Controllo con templato negativo POS Posizione Controllo positivo Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione Q IZeuJO U sJd IUO INE UILUI Flusso di lavoro del saggio Il diagramma seguente illustra il flusso di lavoro del saggio MiSegDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina Fra i vari passaggi sono contrassegnati i punti di arresto sicuri Figura 1 Flusso di lavoro del saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina Ibridazione del pool Pulizia PCR os Tempo di intervento 20 min Emp APIa Elaborazione 30 min Pool di oligonucieotidi del saggio p g CF Clinical Sequencing pipari org nl Tampone di ibridazione Output Piastra LNP Piastre HYB Rimozione degli Normalizzazione della libreria oligonucleotidi non legati vu di iii 20 hi Tempo di intervento 20 min Elaborazione 50 min Reagenti Reagenti Tampone di lavaggio stringente Diluente normalizzazione libreria Tampone di lavaggio universale Microsfere libreria Output Lavaggio di normalizzazione della Itvreria Piastra FPU Raponi coreane IS NaOH Output Piastra SGP L oligonucleotidi legati Battiti Creazione di pool di librerie Reagenti Tempo di intervento 10 min Miscela di estensione ligazione Output Tampone di diluizione libreria Piastra FPU Provette PAL e DAL l Amplificazione mediante PCR Tempo di intervento 30 min Durata del cicio2. Sigillare la piastra LNP con un sigillo adesivo per piastre Agitare la piastra LNP su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 5 minuti Durante l eluizione di 5 minuti etichettare una nuova piastra per PCR con 96 pozzetti SGP_Plate_ID Piastra StoraGe 46 N codice 15038346 Rev A 16 17 18 19 20 Dispensare 30 ul di tampone di conservazione della libreria a ciascun pozzetto da usare nella piastra SGP Dopo l eluizione di 5 minuti assicurarsi che tutti i campioni nella piastra LNP siano completamente risospesi Se i campioni non sono completamente risospesi pipettare delicatamente i campioni su e gi oppure battere delicatamente la piastra sul banco per risospendere le microsfere quindi agitare per altri 5 minuti Posizionare la piastra LNP sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti Utilizzando una pipetta multicanale impostata su 30 pl trasferire il surnatante dalla piastra LNP alla piastra SGP Pipettare delicatamente su e gi 5 volte per miscelare NOTA Qualora nelle punte vengano inavvertitamente aspirate delle microsfere ridispensare queste ultime sulla piastra e lasciare riposare la piastra sul magnete per 2 minuti o controllare che il surnatante sia scomparso Sigillare la piastra SGP con un sigillo adesivo per piastre e quindi centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto PUNTO DI ARRESTO SICURO Qualora non si proceda immediatamente alla creazione di un pool di librerie e f al success
3. 24 ml 4 8 ml Conservazione tra2 Ce8 C Ingredienti attivi Soluzione acquosa tamponata contenente sali 2 mercaptoetanolo e formammide Soluzione acquosa tamponata contenente sali tra2 Ce8 C Tabella 5 Scatola 3B Reagenti post amplificazione Componente Quantit Microsfere per la 1 provetta pulizia della PCR Lavaggio di 2 provette normalizzazione della libreria Microsfere 1 provetta libreria Cella a flusso 6 contenitori MiSegDx saggio CF Clinical Sequencing Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione Volume di riempimento 5 ml 4 8 ml 12 ml 1 cella a flusso Conservazione tra2 Ce8 C Ingredienti attivi Soluzione acquosa tamponata contenente microsfere paramagnetiche in fase solida e polietilene glicole Soluzione acquosa tamponata contenente sali 2 mercaptoetanolo e formammide Soluzione acquosa tamponata contenente microsfere paramagnetiche in fase solida Substrato di vetro con oligonucleotidi legati covalentemente tra 2 C e 8 C tra 2 Ce8 C tra 2 Ce8 C IZELUIOJU qd IUO INEUILUI Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Scatola 4 Tabella 6 Scatola 4 Reagenti post amplificazione Componente Quantit Sire Ingredienti attivi Conservazione Soluzione SBS 6 flaconi 353 1 ml Soluzione acquosa tra2 Ce8 C MiSegDx PR2 tamponata saggio CF Clinical Sequencing Saggio MiSeqDx Cys
4. Conservazione Fornito da Miscela di estensione 1 provetta tra 25 Ce 15 C Illumina ligazione Tampone di lavaggio 1 flacone ima 2 IC e BNC Illumina stringente Tampone di lavaggio 1 provetta tra 2 Ce8 C Illumina universale Piastra filtro 1 piastra trallb Ge RORE Illumina Colletto adattatore 1 piastra tra 15 C e 30 C Illumina Piastra MIDI 1 piastra malo Ge BORE Utente Vaschette Come necessario tra 15 C e 30 C Utente 28 N codice 15038346 Rev A Preparazione 1 Prelevare la miscela di estensione ligazione dalla temperatura di conservazione compresa tra 25 C e 15 C e scongelare a temperatura ambiente La miscela di estensione ligazione viene utilizzato nella fase di estensione ligazione e impiega circa 20 minuti per scongelarsi 2 Estrarre il tampone di lavaggio stringente e il tampone di lavaggio universale dalla temperatura di conservazione compresa tra 2 C e 8 C e tenerli da parte a temperatura ambiente 3 Assemblare l unit piastra filtro FPU nell ordine seguente dall alto verso il basso Figura 5 Unit piastra filtro nebe uouipnosponuofio 6p SUOIZOLUIY A Coperchio B Piastra filtro C Colletto adattatore Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione D Q D Piastra MIDI 4 Etichettare la piastra filtro FPU_Plate_ID L ID piastra deve corrispondere all ID utilizzato per la piastra HYB 5 Pre lavare la membrana della piastra filtro come segue a Con una
5. Opzionale Per registrare informazioni pi dettagliate sui campioni inserire il nome e la descrizione di un campione D N codice 15038346 Rev A 3 Opzionale Per identificare i controlli sulla piastra selezionare Negative Negativo o Positive Positivo dal menu a discesa Control Controllo 4 Andare alla scheda Plate Graphic Schema piastra e utilizzare l opzione Copy to Clipboard Copia in appunti o Print Stampa per acquisire un immagine della piastra campioni Figura 4 Illumina Worklist Manager scheda Plate Graphic Schema piastra Illumina Worklist Manager Please Enter Sample Information CF Cinico Sequencing Assay Pite e E e pera CFTR Screening 1 B ci D E F G H Copy to Clipboard 5 Selezionare Finish Fine Rendimento dei campioni e rappresentazione dell indice Per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina il rendimento dei campioni per corsa di MiSeqDx di 8 campioni I primer di indicizzazione usati durante l amplificazione mediante PCR devono essere scelti in base al rendimento dei campioni finale desiderato per garantire diversit nella sequenza d indice MiSeqDx utilizza un LED verde per il sequenziamento delle basi G T e un LED rosso per il sequenziamento delle basi A C Per garantire la corretta registrazione a ogni corsa deve essere letto almeno uno dei due nucleotidi per ogni canale
6. Sigilli adesivi in alluminio Sigilli adesivi per piastre Punte di pipette dotate di barriera aerosol Impedire la contaminazione da PCR La PCR comunemente utilizzata in laboratorio per amplificare sequenze specifiche di DNA Se non si adottano misure igieniche adeguate nel laboratorio i prodotti della PCR possono contaminare i reagenti gli strumenti e i campioni di DNA genomico portando a risultati inesatti e inaffidabili La contaminazione da PCR pu interrompere i processi del laboratorio e ritardare sensibilmente il normale svolgimento del lavoro Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione 3 IZEULUIOJU qd IUO IE UILUI Accertarsi che il laboratorio abbia attuato le misure necessarie per ridurre il rischio di contaminazione da PCR Separare fisicamente le aree di pre amplificazione e post amplificazione Separare fisicamente gli spazi del laboratorio dove si eseguono i processi di pre amplificazione estrazione quantificazione e normalizzazione del DNA dagli spazi in cui si eseguono i processi di post amplificazione Non utilizzare mai lo stesso lavandino per lavare le vaschette utilizzate per la pre amplificazione e la post amplificazione Non utilizzare mai lo stesso sistema di purificazione dell acqua per i processi di pre amplificazione e post amplificazione Conservare tutti i materiali usati per i protocolli nell area di pre amplificazione e portarli nell area di post amplific
7. Con una pipetta multicanale dispensare 200 pl di etanolo all 80 appena preparato in ciascun pozzetto contenente il campione Non necessario sostituire le punte se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata In questa fase non occorre risospendere le microsfere b Incubare la piastra sul supporto magnetico per un minimo di 30 secondi o finch il surnatante limpido c Rimuovere attentamente e smaltire il surnatante Con la piastra CLP sul supporto magnetico eseguire un secondo lavaggio come segue a Con una pipetta multicanale dispensare 200 pl di etanolo all 80 appena preparato in ciascun pozzetto contenente il campione b Incubare la piastra sul supporto magnetico per un minimo di 30 secondi o finch il surnatante limpido c Rimuovere attentamente e smaltire il surnatante Utilizzare una pipetta multicanale P20 impostata su 20 ul per rimuovere l eccesso di etanolo Rimuovere la piastra CLP dal supporto magnetico e asciugare all aria le microsfere per 10 minuti Con una pipetta multicanale dispensare 30 ul di tampone di eluizione in ciascun campione e agitare brevemente Non necessario sostituire le punte se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata Sigillare la piastra con un sigillo adesivo per piastre Agitare la piastra CLP su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 2 minuti NOTA Assicurarsi che tutti i campioni siano completamente risospesi Se vi sono campioni in cui
8. da 280 a 2 400 x g accettabile q D N codice 15038346 Rev A 4 Blocco termico necessario un blocco termico per le provette Il blocco termico deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Intervallo di temperatura ambiente da 5 C a 99 C Regolazione della temperatura 0 1 C a 37 C 0 4 C a 60 C 5 Supporto magnetico necessario un supporto magnetico per una piastra a 96 pozzetti Le prestazioni migliori si osservano quando i magneti si trovano sul lato del supporto e non nella parte inferiore 6 Pipette di precisione necessaria una serie di pipette di precisione Come specificato sopra nell area di pre amplificazione necessario un altro set L utilizzo di pipette di precisione necessario per assicurare un erogazione accurata di reagente e campione possibile utilizzare sia pipette monocanale che multicanale se calibrate regolarmente e precise entro un margine del 5 del volume stabilito 7 Materiali di consumo sono necessari i seguenti materiali di consumo Piastre skirted per PCR a 96 pozzetti 0 2 ml polipropilene o equivalente Piastre di conservazione a 96 pozzetti 0 8 ml piastre MIDI NOTA assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti sia compatibile con il supporto magnetico Provette coniche 15 ml Provette per microcentrifuga Eppendorf sono consigliate quelle con tappo a vite Striscia a otto provette per PCR Bacinelle per soluzione in PVC priva di DNAasi e RNAasi vaschetta
9. la piastra sul supporto magnetico durante l aspirazione lenta della soluzione trasparente facendo attenzione a non toccare le microsfere separate Evitare la contaminazione incrociata Sostituire le punte fra l erogazione dei reagenti e dei campioni utilizzare sempre punte di pipette nuove fra l erogazione dei reagenti e quella dei campioni Miscelare le piastre seguendo le indicazioni miscelare i campioni con una pipetta multicanale e centrifugare la piastra quando indicato Non agitare le piastre Utilizzare punte dotate di barriera aerosol l utilizzo di punte di pipette dotate di barriera aerosol riduce il rischio di contaminazione incrociata da carry over di ampliconi o da campione a campione Lavaggio con etanolo all 80 durante la fase di pulizia della PCR Preparare sempre al momento etanolo all 80 preparare sempre al momento etanolo all 80 per le fasi di lavaggio L etanolo pu assorbire l acqua dall aria e influire sui risultati Rimuovere tutto l etanolo dai pozzetti assicurarsi che tutto l etanolo venga rimosso dal fondo dei pozzetti in quanto pu contenere residui di contaminanti Utilizzare una pipetta multicanale P20 per rimuovere l etanolo residuo e accelerare l asciugatura Consentire l evaporazione completa consentire un tempo di asciugatura di almeno cinque minuti fuori dal supporto magnetico a temperatura ambiente per Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione q T IZEULUJOJ
10. le microsfere non sono completamente risospese pipettare delicatamente su e gi per risospenderle e ripetere i due passaggi precedenti Incubare a temperatura ambiente da 15 C a 30 C per 2 minuti Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione 41 dOd FIISP ezinda 20 21 22 23 24 Posizionare la piastra CLP sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o finch il surnatante limpido Etichettare la nuova piastra MIDI LNP_Plate_ID Piastra di normalizzazione della libreria Utilizzando una pipetta multicanale P20 e punte fini trasferire delicatamente 20 ul di surnatante dalla piastra CLP alla piastra LNP Cambiare le punte tra i campioni onde evitare una contaminazione incrociata amp NOTA Qualora nelle punte vengano inavvertitamente aspirate delle microsfere ridispensare queste ultime sulla piastra e lasciare riposare la piastra sul magnete per 2 minuti o controllare che il surnatante sia scomparso Opzionale Trasferire i restanti 10 ul di surnatante dalla piastra CLP a una nuova piastra ed etichettare la piastra con il nome della corsa e la data Conservare questa piastra a una temperatura compresa tra 25 C e 15 C fino al completamento della corsa di sequenziamento e analisi dei dati I prodotti per PCR puliti possono essere usati per scopi di ricerca ed eliminazione guasti in caso di problemi a carico dei campioni Se ci si ferma a questo punto sigillare la p
11. per questo processo non si consigliano termociclatori per PCR con raffreddamento attivo ad es Peltier raffreddato termoelettricamente PUNTO DI ARRESTO SICURO Quando il blocco termico raggiunge i 40 C la piastra HYB stabile a una l temperatura di 40 C per 2 ore Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione z T jp1o sjonuogijo Ip jood jop SUOIZEpIIAI Rimozione degli oligonucleotidi non legati Questo processo consiste nella rimozione di oligonucleotidi non legati dal DNA genomico mediante un filtro in grado di selezionare le dimensioni Due fasi di lavaggio con il tampone di lavaggio stringente garantiscono la rimozione completa degli oligonucleotidi non legati Una terza fase di lavaggio con il tampone di lavaggio universale rimuove il tampone di lavaggio stringente residuo e prepara i campioni per la fase di estensione ligazione x AVVERTENZA y Questo set di reagenti contiene formammide una ammide alifatica che una Pi probabile tossina riproduttiva L inalazione l ingestione il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali Smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati in conformit alle norme locali di sicurezza vigenti Per ulteriori informazioni vedere le SDS per questo kit all indirizzo support illumina com sds ilmn Tempo stimato Durata totale 20 minuti Tempo di intervento dell operatore 20 minuti Materiali di consumo Elemento Quantit
12. schede di sicurezza sui materiali MSDS sono disponibili sul sito Web Illumina all indirizzo support illumina com sds ilmn Documentazione dei prodotti La documentazione dei prodotti in formato PDF pu essere scaricata dal sito Web Illumina Andare al sito support illumina com e selezionare un prodotto quindi fare clic su Documentation amp Literature Documentazione e letteratura Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione EIUS EZUE SISSY Illumina Emergo Europe San Diego Califomia 92122 U S A Molenstraat 15 1 800 809 ILMN 4566 2513 BH L Aia 1 858 202 4566 fuori dal Nord America Paesi Bassi techsupport illumina com www ilumina com
13. una provetta nuova da 15 ml 2 Utilizzare una pipetta P1000 impostata su 1 000 ul per risospendere completamente le microsfere libreria pipettando su e gi 10 volte 4 NOTA j E fondamentale risospendere completamente il pellet di microsfere della libreria in fondo alla provetta L uso di una provetta P1000 garantisce che le microsfere vengano risospese in modo omogeneo e che non ci sia massa di microsfere sul fondo della provetta Questo fondamentale per ottenere una densit dei cluster omogenea sulla cella a flusso 3 Pipettare 72 ul di microsfere libreria nella provetta contenente il diluente normalizzazione libreria Miscelare bene capovolgendo la provetta 15 20 volte 44 N codice 15038346 Rev A NOTA Per risospendere le microsfere completamente nella fase 2 necessaria una provetta P1000 impostata su 1 000 ul Miscelare solo le quantit richieste di diluente normalizzazione libreria e microsfere libreria per il saggio corrente necessario conservare il diluente normalizzazione libreria e le microsfere libreria residui separatamente alle temperature rispettivamente raccomandate Per conservare la stabilit le microsfere libreria non devono mai essere congelate o miscelate con il diluente normalizzazione libreria qualora non vengano utilizzate immediatamente Utilizzando una pipetta multicanale dispensare 45 ul della soluzione di lavoro di diluente normalizzazione libreria microsfere libreria combinata in ogni pozzetto
14. 0 x g a 20 C per 5 minuti 6 Ripetere il lavaggio nel modo seguente 30 N codice 15038346 Rev A a Con una pipetta multicanale dispensare 45 ul di tampone di lavaggio stringente in ciascun pozzetto contenente il campione Non necessario cambiare le punte quando si cambia colonna se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata b Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 5 minuti c Seil tampone di lavaggio non fa defluire tutto il liquido centrifugare nuovamente la piastra filtro a 2 400 x g a 20 C per 5 minuti 7 Smaltire tutto il materiale defluito contenente formammide raccolto fino a quel momento in un apposito contenitore per rifiuti pericolosi quindi riassemblare l FPU La stessa piastra MIDI pu essere riutilizzata per il resto del processo di pre amplificazione 8 Con una pipetta multicanale dispensare 45 ul di tampone di lavaggio universale in ciascun pozzetto contenente il campione Non necessario cambiare le punte quando si cambia colonna se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata 9 Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 10 minuti l NOTA Accertarsi che tutto il liquido sia defluito dopo la centrifugazione Ripetere la centrifugazione se necessario I residui di tampone di lavaggio potrebbero inibire le successive reazioni enzimatiche Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Gu
15. 38346 Rev A 4 Durante l incubazione della piastra FPU preparare l AMP piastra di amplificazione come descritto nella sezione successiva Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione 33 nebe ipnosjpnuobio Bsp suoize6i suUosua sz Amplificazione mediante PCR Questo passaggio consiste nell amplificazione dei prodotti del processo di estensione ligazione mediante primer che aggiungono sequenze di indici per il multiplex campioni oltre a comuni adattatori necessari per la generazione dei cluster Tempo stimato Durata totale circa 90 minuti Tempo di intervento dell operatore 30 minuti Materiali di consumo Elemento Master Mix per PCR Primer indice C A503 D A504 e E A505 Primer indice 1 A701 2 A702 e 10 A710 PCR polimerasi Sigillo per piastre PCR appropriato 0 05 N NaOH preparato al momento Piastra skirted per PCR a 96 pozzetti Vaschette Preparazione Quantit 1 provetta 1 provetta per primer 1 provetta per primer 1 provetta 1 Come necessario 1 piastra Come necessario Conservazione tra 25 C e 15 C tra 25 Cie 15 C tra 25 Ce 15 C tra 25 C e 15 C tra 15 C e 30 C mals Ge RORE tra 15 C e 30 C tal TC ewe Fornito da Ilumina Illumina Ilumina Illumina Utente Utente Utente Utente 1 Preparare 0 05 N di NaOH fresco aggiungendo 25 ul di 10 N di NaOH a 4 975 pl di acq
16. 90 min Master Mix per PCR PCR Primer indico NaOH Output Piastra AMP ji 2 O N codice 15038346 Rev A Preparazione del foglio campioni per MiSegDx 1 Nella schermata Welcome Benvenuto di Worklist Manager Illumina selezionare Create Worklist Crea lista di lavoro Viene visualizzata la schermata Enter Run Parameters Immetti parametri della corsa Figura 2 Illumina Worklist Manager schermata Enter Run Parameters Immetti parametri della corsa Illumina Worklist Manager Please Enter Run Parameters 2 Nel campo Test Type Tipo di test selezionare CF Clinical Sequencing Assay Saggio CF Clinical Sequencing 3 Nel campo Worklist Name Nome lista di lavoro immettere il nome per il foglio campioni Questo un campo obbligatorio Se per il nome del foglio campioni viene utilizzato l ID alfanumerico del codice a barre della cartuccia di reagenti il software operativo MiSeq MOS trover automaticamente il foglio campioni L ID del codice a barre si trova sull etichetta della cartuccia di reagenti proprio sotto il codice a barre Se per il foglio campioni viene utilizzato un qualsiasi altro nome il pulsante Browse Sfoglia nel software operativo MiSeq MOS pu essere utilizzato per trovare il foglio campioni corretto 4 Opzionale Immettere una descrizione per identificare la corsa 5 Assicurarsi che la data corrisponda alla data di inizio della corsa La data attuale appare per impostazione predefinita Sa
17. Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO DI PROPRIET DI ILLUMINA N codice 15038346 Rev A Aprile 2014 Introduzione Informazioni preliminari Flusso di lavoro del saggio Preparazione del foglio campioni per MiSeqDx Ibridazione del pool di oligonucleotidi Rimozione degli oligonucleotidi non legati Estensione ligazione degli oligonucleotidi legati Amplificazione mediante PCR Pulizia della PCR Normalizzazione della libreria Creazione di pool di librerie Le novit Assistenza tecnica 20 21 25 28 32 34 39 43 48 54 illumina Questo documento e il suo contenuto sono di propriet di Illumina Inc e delle aziende a essa affiliate Illumina e sono destinati esclusivamente a uso contrattuale da parte dei clienti di Illumina per quanto concerne l utilizzo dei prodotti qui descritti con esclusione di qualsiasi altro scopo Questo documento e il suo contenuto non possono essere usati o distribuiti per altri scopi e o in altro modo diffusi resi pubblici o riprodotti in alcun modo senza preventiva approvazione scritta da parte di Illumina Mediante questo documento Illumina non trasferisce alcuna licenza sui propri diritti su brevetti marchi di fabbrica copyright o diritti secondo il diritto consuetudinario n alcun diritto similare di alcun terzo AI fine di assicurare un uso sicuro e corretto dei prodotti qui descritti le istruzioni riportate in quest
18. U qd IUO IE UILUI l evaporazione completa L etanolo residuo pu influire sulle prestazioni delle reazioni successive Requisiti di input di DNA Per il protocollo del saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina sono necessari 250 ng di DNA genomico Illumina consiglia vivamente di quantificare il materiale genomico iniziale Quantificazione del DNA di input quantificare il materiale genomico iniziale mediante metodi spettrofotometrici UV basati su letture OD A260 A280 Valutazione della qualit del DNA per quantificare il DNA si utilizzano comunemente le misurazioni dell assorbanza a 260 nm Il rapporto fra l assorbanza a 260 nm e a 280 nm viene utilizzato come indicazione di purezza del campione Il protocollo ottimizzato per DNA con valori del rapporto di assorbanza maggiori di 1 5 Controlli qualit Le buone pratiche di laboratorio dispongono che in ogni corsa siano inclusi un campione di DNA di controllo positivo e un campione di controllo negativo non templato Il campione di DNA di controllo positivo deve essere un campione ben caratterizzato con una mutazione nota del CFTR Illumina raccomanda inoltre di includere in ciascuna corsa un controllo wild type Acronimi Tabella 9 Acronimi per il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina Acronimo Definizione AMP Piastra di amplificazione CPR Piastra di pulizia DAL Libreria di ampliconi diluita q 8 N codice 15038346 Rev A
19. a Procedura 1 Una volta completata la reazione di estensione ligazione di 45 minuti rimuovere la piastra FPU dall incubatore Rimuovere il sigillo in alluminio e sostituirlo con il coperchio della piastra filtro Si raccomanda di rimuovere il sigillo in allumino prima della centrifugazione per garantire che il surnatante di reazione possa defluire efficacemente nella piastra degli scarti Centrifugare la piastra FPU a 2 400 x g a 20 C per 2 minuti Utilizzando una pipetta multicanale aggiungere 25 ul di 0 05 N di NaOH a ogni pozzetto di campione sulla piastra filtro Prestando attenzione che le punte della pipetta entrino in contatto con la membrana pipettare NaOH su e gi 5 6 volte Le punte devono essere sostituite dopo ogni colonna Coprire e incubare la piastra filtro a temperatura ambiente per 5 minuti Durante l incubazione della piastra filtro utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 22 ul della soluzione di lavoro per PCR in ogni pozzetto della piastra AMP contenente i primer indice Sostituire le punte quando si passa da un campione all altro Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione 3 Pd YO Q1UCIP ALU SUOIZEIyI UN 6 Trasferire i campioni eluiti dal filtro alla piastra AMP come segue a b Impostare una pipetta multicanale P20 su 20 pl Pipettare i campioni nella prima colonna della piastra filtro su e gi 5 6 volte Trasferire 20 ul dalla piastra filtro alla c
20. a i campioni ove possibile utilizzare una pipetta multicanale Calibrare le pipette regolarmente Coerenza per preparazioni di campioni pi piccoli ciascuna provetta di reagente fornita con il kit contiene un volume sufficiente a produrre risultati usando pipette manuali e vaschette di reagenti seguendo le tecniche standard di laboratorio Per garantire la precisione nell erogazione dei volumi dei reagenti pipettare singolarmente i reagenti in ciascun pozzetto o pipettare con una pipetta multicanale in una striscia a 8 provette per PCR Manipolazione delle microsfere magnetiche Utilizzo a temperatura ambiente prima dell uso lasciare che le microsfere raggiungano la temperatura ambiente q 6 N codice 15038346 Rev A Agitare fino a sospensione completa immediatamente prima dell uso agitare le microsfere finch raggiungono la completa sospensione e il colore appare omogeneo Miscelare a fondo i campioni dopo aver aggiunto le microsfere ai campioni miscelare a fondo pipettando su e gi dieci volte Illumina consiglia anche di utilizzare un agitatore per miscelare a fondo i campioni Consentire un legame massimo per ottenere i risultati migliori incubare le miscele di microsfere campioni a temperatura ambiente per tutta la durata indicata sul protocollo Aspirare lentamente la soluzione trasparente dopo aver posizionato la piastra sul supporto magnetico attendere finch la soluzione diventa trasparente prima di procedere Tenere
21. azione secondo necessit Utilizzare apparecchiature e materiali dedicati Dedicare set completi separati di apparecchiature e materiali pipette centrifughe forno blocco termico ecc ai processi di pre amplificazione e post amplificazione e impedirne la condivisione tra le due aree Dedicare aree di conservazione separate congelatori e frigoriferi ai materiali di consumo pre amplificazione e post amplificazione Dato che i reagenti per la pre amplificazione e la post amplificazione vengono consegnati insieme importante disimballarli nell area di pre amplificazione e quindi spostare i reagenti per la post amplificazione nell apposita area di conservazione Procedure di pre amplificazione e post amplificazione Per impedire la contaminazione da PCR importante adottare procedure di laboratorio e attenersi alle pratiche migliori Illumina consiglia di pulire ogni giorno e ogni settimana le aree del laboratorio con sodio ipoclorito allo 0 5 candeggina al 10 a y ATTENZIONE Onde evitare la degradazione del campione o del reagente accertarsi che tutti i vapori della soluzione detergente si siano dissipati completamente prima di iniziare qualsiasi processo Pulizia quotidiana dell area di pre amplificazione Una pulizia quotidiana dell area di pre amplificazione con sodio ipoclorito allo 0 5 candeggina al 10 contribuisce a eliminare i prodotti della PCR entrati nell area di q 4 N codice 15038346 Rev A pre amplificazi
22. biente per circa un ora o fino a completo scongelamento 4 Rimuovere la cartuccia dal bagnomaria e batterla delicatamente sul banco per far fuoriuscire l acqua in eccesso dalla base Asciugare la base della cartuccia Verificare che sulla parte superiore della cartuccia di reagenti non sia caduta dell acqua HD O N codice 15038346 Rev A Ispezione della cartuccia di reagenti 1 Capovolgere la cartuccia dieci volte per miscelare i reagenti scongelati e poi ispezionare visivamente tutti i serbatoi per accertarsi che siano scongelati 4 NOTA E fondamentale che i reagenti nella cartuccia siano scongelati completamente e miscelati per assicurare il sequenziamento corretto Ispezionare visivamente il reagente nella posizione 1 per accertarsi che sia ben miscelato e privo di precipitati Battere delicatamente la cartuccia sul banco per ridurre le bolle d aria nei reagenti di NOTA I tubi dei pescanti del MiSeqDx vanno fino al fondo di ciascun serbatoio per aspirare i reagenti per questa ragione importante che i serbatoi non contengano bolle Riporre la cartuccia in ghiaccio o conservarla a una temperatura compresa tra 2 Ce8 C fino a 6 ore finch non si pronti a impostare la corsa Per risultati ottimali procedere direttamente caricando il campione e impostando la corsa Preparazione dei campioni per il sequenziamento 1 Portare il tampone di diluizione libreria a temperatura ambiente Agitare il tampone di diluizione
23. cromatico importante conservare l equilibrio cromatico per ciascuna base di lettura indici sequenziata altrimenti potrebbe verificarsi un problema di registrazione durante il sequenziamento della Lettura indici Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione D 3 xqbesij 2q iuoiIdweo 01601 9p suoizesedald Utilizzare il seguente set minimo di indici con bilanciamento dei colori per corse di sequenziamento di otto campioni Tabella 10 Combinazioni primer indice per corse di sequenziamento a 8 campioni Primer indice 1 Primer indice 2 Primer indice 10 A701 A702 A710 Primer indice C Campione 1 Campione 2 Campione 3 A503 Primer indice D Campione 4 Campione 5 Campione 6 A504 Primer indice E Campione 7 Campione 8 A505 Se non sono disponibili sei campioni univoci esclusi i controlli positivi e negativi accettabile completare la corsa con replicati di qualsiasi campione di DNA genomico umano 2 4 N codice 15038346 Rev A Ibridazione del pool di oligonucleotidi Questo passaggio consiste nell ibridazione del pool di oligonucleotidi per la fibrosi cistica contenente oligonucleotidi a monte e a valle specifici del gene regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica CFTR con campioni di DNA genomico i y AVVERTENZA Questo set di reagenti contiene formammide una ammide alifatica che una probabile tossina riproduttiva L inalazione l ingestione il contatto con la
24. cun pozzetto contenente il campione Non necessario cambiare le punte quando si cambia colonna se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata b Sigillare la piastra LNP con un sigillo adesivo per piastre c Agitare la piastra LNP su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 5 minuti d Posizionare la piastra sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o finch il surnatante limpido e Rimuovere attentamente e smaltire il surnatante in un apposito contenitore per rifiuti pericolosi Rimuovere la piastra LNP dal supporto magnetico e ripetere il lavaggio con lavaggio di normalizzazione della libreria come segue a Con una pipetta multicanale dispensare 45 pl di lavaggio di normalizzazione della libreria in ciascun pozzetto Non necessario cambiare le punte quando si cambia colonna se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata b Sigillare la piastra LNP con un sigillo adesivo per piastre c Agitare la piastra LNP su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 5 minuti d Posizionare la piastra sul supporto magnetico per un minimo di 2 minuti e Rimuovere attentamente e smaltire il surnatante in un apposito contenitore per rifiuti pericolosi Utilizzare una pipetta multicanale P20 impostata su 20 ul per rimuovere l eccesso di lavaggio di normalizzazione della libreria Rimuovere la piastra LNP dal supporto magnetico e dispensare 30 pl di 0 1 N di NaOH in ogni pozzetto per eluire il campione
25. della piastra LNP contenente le librerie Non necessario cambiare le punte quando si cambia colonna se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata Sigillare la piastra LNP con un sigillo adesivo per piastre Agitare la piastra LNP su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 30 minuti NOTA Questa incubazione di 30 minuti fondamentale per una corretta normalizzazione della libreria Le incubazioni con una durata superiore o inferiore ai 30 minuti possono influenzare la rappresentazione della libreria e la densit dei cluster Posizionare la piastra su un supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o fino alla scomparsa del surnatante Con la piastra LNP sul supporto magnetico utilizzando una pipetta multicanale impostata su 80 ul rimuovere attentamente e smaltire il surnatante in un apposito contenitore per rifiuti pericolosi 4 NOTA Qualora nelle punte vengano inavvertitamente aspirate delle microsfere ridispensare queste ultime sulla piastra e lasciare riposare la piastra per 2 minuti o fino alla scomparsa del surnatante Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione 4 D IEUJON IZEZZ dll elp SUO EuSkI 10 11 12 13 14 15 Rimuovere la piastra LNP dal supporto magnetico e lavare le microsfere con il lavaggio di normalizzazione della libreria come segue a Con una pipetta multicanale dispensare 45 ul di lavaggio di normalizzazione della libreria in cias
26. ggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione D q xqbesij ad iuoiIdweo 01601 9p suoizeredald 6 Selezionare Next Avanti Viene visualizzata la schermata Enter Sample Parameters Immetti informazioni campioni Figura 3 Illumina Worklist Manager schermata Enter Sample Information Immetti informazioni sui campioni Fr la Illumina Worklist Manager Please Enter Sample Information CF Clinical Sequencina Assay Plate Tr TT indicatesinvatc spie Same Son Name idear ienr cono Deren ti ATI Am A7 A505 A72 A72 A72 a7 ATO Co ATO Inserimento di informazioni sui campioni 1 Nella scheda Table Tabella o nella scheda Plate Piastra inserire le seguenti informazioni per ciascun pozzetto contenente campione a Sample ID ID campione inserire un ID campione univoco L ID campione viene usato per monitorare il campione dalla preparazione attraverso il sequenziamento fino all analisi Normalmente l ID un codice a barre tuttavia sono accettabili tutti i valori b Index 1 e Index 2 Indice 1 e Indice 2 specificare l adattatore dell indice che verr utilizzato per ogni Lettura indici Illumina consiglia di utilizzare le combinazioni che producono almeno una base A o C rosso e almeno una base G o T verde per ogni ciclo J NOTA Per informazioni su come scegliere gli indici appropriati vedere Rendimento dei campioni e rappresentazione dell indice a pagina 23 2
27. i oligonucleotidi a tutti i pozzetti contenenti il DNA genomico Cambiare le punte dopo ciascuna colonna onde evitare una contaminazione incrociata Utilizzando una pipetta multicanale aggiungere 40 ul di tampone di ibridazione a ogni campione nella piastra HYB Pipettare delicatamente su e gi 3 5 volte per miscelare Cambiare le punte dopo ciascuna colonna onde evitare una contaminazione incrociata di NOTA Controllare che eventuali cristalli o precipitato in tampone di ibridazione si siano sciolti NOTA f Non mescolare il saggio CF Clinical Sequencing pool di oligonudeotidi e il tampone di ibridazione per la conservazione Usato in combinazione il saggio CF Clinical Sequencing pool di oligonucleotidi diventa instabile anche se conservato congelato Sigillare la piastra HYB con un foglio di alluminio adesivo e assicurare la chiusura con un rullo di gomma o un cuneo sigillante Centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto Inserire la piastra HYB nel blocco preriscaldato a 95 C e incubare per 1 minuto Ridurre la temperatura del blocco termico preriscaldato a 40 C e proseguire l incubazione fino a quando il blocco di calore raggiunge i 40 C Il tempo di rampa di circa 80 minuti NOTA Durante l incubazione la temperatura del blocco termico si riduce gradualmente da 95 C a 40 C Tipicamente questo processo richiede 80 minuti Questo raffreddamento graduale essenziale per un ibridazione corretta pertanto
28. iastra LNP con un sigillo adesivo quindi centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto per garantire che tutto il surnatante si trovi in fondo al pozzetto PUNTO DI ARRESTO SICURO Dopo la pulizia della PCR la piastra stabile per circa 3 ore a una f temperatura compresa tra 2 C e 8 C 42 N codice 15038346 Rev A Normalizzazione della libreria Questo processo consiste nel normalizzare la quantit di ciascuna libreria per garantire una rappresentazione pi equilibrata nel pool di campioni Tempo stimato Durata totale 1 ora e 20 minuti Tempo di intervento dell operatore 30 minuti Materiali di consumo Elemento Quantit Conservazione Fornito da Diluente normalizzazione 1 provetta tra 25 C e 15 C Illumina libreria Microsfere libreria 1 provetta ima 2 Ceg C Illumina Lavaggio di normalizzazione 2 provette tra2 Ce8 C Illumina della libreria Tampone di conservazione 1 provetta mals Ge RORE Illumina della libreria 0 1 N NaOH preparato al 2 ml per 48 tra 15 C e 30 C Utente momento campioni Piastra skirted per PCR a 96 1 piastra malo T awT Utente pozzetti Provetta conica da 15 ml 1 provetta tra 15 C e 30 C Utente Sigillo adesivo per piastre Come necessario mAT ame Utente AVVERTENZA Y Questo set di reagenti contiene formammide una ammide alifatica che una probabile tossina riproduttiva L inalazione l ingestione il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni persona
29. ida di consultazione 31 ebs uou iposjpnuolIo 6p SUOIZOLUIY Estensione ligazione degli oligonucleotidi legati Questo processo collega gli oligonucleotidi ibridati a monte e a valle Una DNA polimerasi si estende dall oligonucleotide a monte fino alla regione target e successivamente si lega all estremit 5 dell oligonucleotide a valle mediante una DNA ligasi Il risultato consiste nella formazione di prodotti contenenti le regioni di interesse target affiancate da sequenze necessarie per l amplificazione Tempo stimato Durata totale 50 minuti Tempo di intervento dell operatore 5 minuti Materiali di consumo Elemento Quantit Conservazione Fornito da Miscela di estensione 1 provetta tra 25 Ce 15 C Illumina ligazione Sigillo adesivo in alluminio 1 sigillo tal Tewm T Utente Vaschette Come necessario tra 15 C e 30 C Utente Procedura 1 Utilizzando una pipetta multicanale aggiungere 45 ul di miscela di estensione ligazione a ogni pozzetto di campione della piastra filtro La reazione di estensione ligazione si verifica sulla membrana della piastra filtro Non necessario cambiare le punte quando si cambia colonna se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata 2 Sigillare la piastra filtro con un foglio di alluminio adesivo quindi coprire con il coperchio per fissare il foglio durante l incubazione 3 Incubare l intero gruppo FPU nell incubatore preriscaldato a 37 C per 45 minuti 3 D N codice 150
30. ine del 5 del volume stabilito 5 Materiali di consumo sono necessari i seguenti materiali di consumo Piastre skirted per PCR a 96 pozzetti 0 2 ml polipropilene o equivalente NOTA assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti sia compatibile con il supporto magnetico Piastre di conservazione a 96 pozzetti 0 8 ml piastre MIDI Bacinella per soluzione in PVC priva di DNAasi e RNAasi vaschetta Sigillo adesivo in alluminio Sigillo per piastre PCR appropriato Punte di pipette dotate di barriera aerosol Apparecchiatura e materiali per post amplificazione 1 Termociclatore necessario un termociclatore Il termociclatore deve essere dotato di un coperchio riscaldato e soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Intervallo di controllo della temperatura da 4 C a 99 C Accuratezza del controllo 0 25 C da 35 C a 99 C 2 Agitatore per micropiastre nell area adibita al laboratorio post amplificazione necessario un agitatore di micropiastre L agitatore di piastre deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Velocit massima di miscelazione 3 000 rpm giri min Intervallo di velocit di miscelazione 200 3 000 rpm giri min 3 Centrifuga da tavolo necessaria una centrifuga da tavolo in grado ci mantenere la temperatura di 20 C Come specificato sopra nell area di pre amplificazione necessaria un altra centrifuga Qualsiasi centrifuga per piastre che raggiunga le velocit previste dal protocollo
31. ione libreria nel bagno di acqua e ghiaccio 3 Cominciare a scongelare la cartuccia di reagente MiSeqDx Preparazione di una soluzione di diluizione fresca di NaOH x ATTENZIONE L utilizzo di una soluzione di diluizione fresca di NaOH essenziale per denaturare completamente i campioni in vista della generazione dei cluster sul dispositivo MiSeqDx Per denaturare i campioni preparare 1 ml di 0 1 N NaOH Preparando un volume di 1 ml si evita che errori di pipettaggio su volumi piccoli influenzino la concentrazione finale di NaOH 1 Combinare i seguenti volumi in una provetta per microcentrifuga Acqua priva di DNAsi e di RNAsi 900 ul 1 0 N di NaOH 100 pl 2 Capovolgere la provetta diverse volte per miscelare Denaturazione e diluizione del controllo interno PhiX 1 Combinare i seguenti volumi per diluire la libreria del controllo interno PhiX a 2nM Libreria del controllo interno PhiX da 10 nM 2 pl 1X tampone TE 8 pl 2 Combinarei seguenti volumi di libreria del controllo interno PhiX da 2 nM e 0 1 N di NaOH in una provetta per microcentrifuga in modo da ottenere una libreria del controllo interno PhiX da 1 nM Libreria del controllo interno PhiX da 2 nM 10 pl 0 1 N NaOH 10 pl 3 Inserire brevemente in un agitatore per miscelare la soluzione della libreria del controllo interno PhiX da 1 nM 4 Centrifugare la soluzione di templato a 280 x g a 20 C per 1 minuto 5 Incubare per 4 5 minuti a temperatura ambiente per de
32. ivo sequenziamento su MiSeqDx conservare la piastra SGP sigillata tra 25 C e 15 C per un massimo di 3 giorni Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione 47 IEUJON IZEZZ dll elp SUO EuSkI Creazione di pool di librerie Nella preparazione per la generazione e il sequenziamento dei cluster vengono combinati volumi uguali di librerie normalizzate diluite in un tampone di ibridazione e denaturate mediante calore prima di essere sottoposte a sequenziamento su MiSeqDx Il campione di controllo PhiX usato a fini di verifica interna per il sequenziamento Tempo stimato Durata totale 10 minuti Tempo di intervento dell operatore 10 minuti Materiali di consumo Elemento Quantit Conservazione Fornito da Tampone di diluizione 1 provetta tra 25 Ce 15 C Illumina libreria 10 nM controllo interno PhiX 2 pl tra 25 C e 15 C Illumina 0 1 N NaOH preparato al 1ml tra 15 C e 30 C Utente momento 1X tampone TE 8 ul malo Teme Utente Provette Eppendorf sono 2 provette tra 15 C e 30 C Utente consigliate quelle con tappo a vite Striscia a otto provette per 1 mals TC awm Utente PCR Portaghiaccio da 2 5 1 1 tra 15 C e 30 C Utente Preparazione del pool di librerie 1 Predisporre un blocco termico adatto a centrifugare provette da 1 5 ml a 96 C 48 N codice 15038346 Rev A 2 Inun portaghiaccio preparare un bagno di acqua e ghiaccio Raffreddare il tampone di diluiz
33. lato da campioni di sangue intero periferico umano raccolto in K EDTA Il test rileva le varianti di singolo nucleotide e Indel piccoli nella regione sequenziata e inoltre referta su due mutazioni introniche profonde e due delezioni ampie Il test deve essere usato sullo strumento MiSegDx Illumina SUOIZhnN Questo test previsto per contribuire alla diagnosi in individui con sospetta fibrosi cistica CF Questo saggio pi appropriato quando il paziente presenta una fibrosi cistica atipica o non classica o quando altri pannelli di mutazioni non sono riusciti a identificare entrambe le mutazioni causanti la malattia I risultati del test devono essere interpretati da un gruppo di genetisti molecolari certificati o da un esperto equivalente e devono essere usati assieme ad altre informazioni inclusi sintomi clinici altri test diagnostici e anamnesi familiare Questo test non indicato per indipendente diagnosi neonatale diagnosi prenatale analisi pre impianto screening del portatore screening dei neonati o screening della popolazione Informazioni sulla guida Nella presente guida di riferimento sono riportate istruzioni pi dettagliate suggerimenti sulle tecniche e cenni utili ai nuovi utenti formati per guidarli nell esecuzione corretta del protocollo del saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing La guida ha valore di integrazione e non intesa a sostituire il foglietto illustrativo contenuto nella confezione Come f
34. li Smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati in conformit alle norme locali di sicurezza vigenti Per ulteriori informazioni vedere le SDS per questo kit all indirizzo support illumina com sds ilmn Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione 43 IEUJON IZEZZ dll elp SUO BUSI Preparazione 1 Preparare 0 1N di NaOH fresco aggiungendo 30 ul di 10 N di NaOH a 2 970 pl di acqua sterile 2 Prelevare il diluente normalizzazione libreria dalla temperatura di conservazione tra 25 C e 15 C e portare a temperatura ambiente Utilizzare un bagnomaria tra 20 C e 25 C in base al bisogno E NOTA Il diluente normalizzazione libreria potrebbe formare precipitati o cristalli visibili Prima dell uso agitare energicamente quindi porre la provetta davanti a una luce ed eseguire un controllo visivo per assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente sciolti 3 Prelevare le microsfere libreria e il lavaggio di normalizzazione della libreria dalla temperatura conservazione compresa tra 2 C e 8 C e portare a temperatura ambiente Utilizzare un bagnomaria tra 20 C e 25 C in base al bisogno 4 Agitare le microsfere libreria energicamente per 1 minuto con inversione intermittente fino a risospensione delle microsfere e assenza di pellet sul fondo della provetta quando quest ultima viene capovolta Procedura 1 Dispensare 394 pl di diluente normalizzazione libreria in
35. libreria energicamente e assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente sciolti Se la piastra SGP stata conservata congelata scongelarla la piastra SGP fino a raggiungere la temperatura ambiente Centrifugare la piastra SGP a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto per raccogliere il condensato Etichettare una provetta Eppendorf nuova con PAL_Plate_ID Pooled Amplicon Library libreria di ampliconi raggruppati in pool Se la piastra SGP stata conservata congelata utilizzare una pipetta multicanale P200 impostata su 40 ul per mescolare ciascuna libreria da sequenziare Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione D q LA P POd Ip SUOIZESII 10 11 12 13 14 15 16 pipettando su e gi per 3 5 volte Sostituire le punte quando si passa da un campione all altro Trasferire 5 ul di ciascuna libreria da sequenziare dalla piastra SGP a una striscia a otto provette per PCR Sigillare l SGP con un sigillo adesivo per piastre e metterla da parte E NOTA Dopo l uso conservare la piastra SGP fra 25 C e 15 C La piastra SGP sigillata rimane stabile per un massimo di 3 giorni Combinare e trasferire il contenuto della striscia a otto provette per PCR nella provetta PAL Miscelare energicamente la provetta PAL in un agitatore Etichettare una provetta Eppendorf nuova con DAL_Plate_ID Diluted Amplicon Library libreria di ampliconi diluita Dispensare 585 ul di tamp
36. n base al foglio campioni come segue a 36 Utilizzando una pipetta multicanale dispensare 4 ul dei primer indice C A503 D A504 e E A505 soluzione trasparente nei pozzetti appropriati in una colonna della piastra AMP La sostituzione delle punte tra le colonne non necessaria Per evitare la contaminazione incrociata smaltire i tappi bianchi originali e applicare tappi bianchi nuovi Utilizzando una pipetta multicanale dispensare 4 ul dei primer indice 1 A701 2 A702 e 10 A710 soluzione gialla nei pozzetti appropriati in una N codice 15038346 Rev A riga della piastra AMP Le punte devono essere sostituite dopo ogni riga per evitare la contaminazione incrociata d Per evitare la contaminazione incrociata smaltire i tappi arancioni originali e applicare tappi arancioni nuovi Rimuovere tutte le provette di primer indice dall area di lavoro Preparare la soluzione di lavoro per la PCR con Master Mix per PCR PCR polimerasi nel modo seguente a Dispensare 5 6 ul di PCR polimerasi su 280 ul di Master Mix per PCR b Capovolgere 20 volte la soluzione di lavoro per la PCR preparata per miscelarla Nella prossima sezione questa soluzione di lavoro verr dispensata sulla piastra AMP La soluzione di lavoro per la PCR si mantiene stabile a temperatura ambiente per 10 minuti NOTA Aggiungere sempre PCR polimerasi a Master Mix per PCR subito prima dell uso Non conservare mai la soluzione di lavoro per PCR combinat
37. naturare la libreria del controllo interno PhiX in filamenti singoli Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione 4 Q SIC IP 00d IP SUOIZESII 6 Aggiungere il seguente volume di tampone di diluizione libreria pre raffreddato nella provetta contenente la libreria del controllo interno PhiX denaturata per ottenere una libreria del controllo interno PhiX da 20 pM Libreria del controllo interno PhiX denaturata 20 pl Tampone di diluizione libreria pre raffreddato 980 ul LO NOTA La libreria del controllo interno PhiX da 20 pM denaturata pu essere conservata fino a tre settimane tra 25 C e 15 C in aliquote singole Dopo tre settimane il numero dei cluster tende a diminuire Preparazione della cartuccia di reagenti Le istruzioni che seguono descrivono come scongelare la cartuccia di reagenti utilizzando un bagnomaria a temperatura ambiente Il metodo richiede circa un ora 1 Rimuovere la cartuccia di reagenti dal luogo di conservazione con temperatura tra 25 C e 15 C 2 Collocarela cartuccia di reagenti in un bagnomaria contenente abbastanza acqua deionizzata a temperatura ambiente da immergere la base della cartuccia di reagenti fino alla linea di livello acqua stampata sulla cartuccia stessa Evitare che l acqua superi la linea di massimo livello acqua Figura 7 Linea di massimo livello acqua 3 Lasciare la cartuccia di reagenti a scongelare a bagnomaria a temperatura am
38. ne e la post amplificazione Dato che i reagenti per la pre amplificazione e la post amplificazione vengono consegnati insieme importante disimballare i reagenti nella zona di pre amplificazione e quindi spostare i reagenti per la post amplificazione nell apposita area di conservazione Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Scatola 1 Tabella 1 Scatola 1A Reagenti pre amplificazione Componente Quantit Vomm ea Ingredienti attivi Conservazione riempimento Saggio CF 1 provetta 600 ul Soluzione acquosa tra 25 C e 15 C Clinical tamponata contenente Sequencing oligonucleotidi mirati al pool di gene CFTR oligonucleotidi Tampone di 1 provetta 4 32 ml Soluzione acquosa tra 25 C e 15 C ibridazione tamponata contenente sali e formammide Miscela di 1 provetta 4 8 ml Soluzione acquosa tra 25 C e 15 C estensione tamponata contenente ligazione una miscela proprietaria di DNA polimerasi DNA ligasi e ANTP Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione T NE UILUIDIO IUOIZELUIOJU Volume di Componente Quantit riempimento Ingredienti attivi Primer indice C 1 provetta 192 ul Primer per PCR con A503 D A504 per sequenze indice e e E A505 primer adattatori di sequenziamento Primer indice 1 1 provetta 128 ul Primer per PCR con A701 2 A702 per sequenze indice e e 10 A710 primer adattatori di sequenziamento PCR polimerasi 1 provetta 56 ul DNA polimera
39. nenti della reazione mediante le microsfere per la pulizia della PCR Tempo stimato Durata totale 50 minuti Tempo di intervento dell operatore 20 minuti Materiali di consumo Elemento Quantit Conservazione Fornito da Tampone di eluizione 1 provetta tra 15 C e 30 C Illumina Microsfere per la pulizia della 400 ul per 8 ima 2 XC e BNC Illumina PCR campioni Etanolo all 80 preparato al 5 ml per 8 tra 15 C e 30 C Utente momento campioni Piastre MIDI a 96 pozzetti 2 malo TC awT Utente Sigillo adesivo per piastre Come necessario tra 15 C e 30 C Utente Vaschette Come necessario malb Tew T Utente Preparazione NOTA Rileggere la sezione Precauzioni all inizio del presente protocollo sulla gestione delle microsfere magnetiche e sul lavaggio con etanolo all 80 durante la pulizia della PCR 1 Portare le microsfere per la pulizia della PCR a temperatura ambiente 2 Preparare al momento etanolo all 80 a partire dall etanolo assoluto NOTA Preparare sempre al momento l etanolo all 80 per le fasi di lavaggio L etanolo pu assorbire l acqua dall aria e influire sui risultati Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione 3 Q HOd Elep ezinda Procedura 1 10 11 Centrifugare la piastra AMP a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto per raccogliere il condensato Etichettare la nuova piastra MIDI CLP_Plate_ID Piastra di pulizia Capovolgere 10 volte le microsfere per la p
40. o documento devono essere scrupolosamente ed esplicitamente seguite da personale qualificato e adeguatamente addestrato Leggere e comprendere a fondo tutto il contenuto di questo documento prima di usare tali prodotti LA LETTURA INCOMPLETA DEL CONTENUTO DEL PRESENTE DOCUMENTO E IL MANCATO RISPETTO DI TUTTE LE ISTRUZIONI IVI CONTENUTE PU CAUSARE DANNI AL PRODOTTO LESIONI PERSONALI A UTENTI E TERZI E DANNI MATERIALI ILLUMINA NON SI ASSUME ALCUNA RESPONSABILIT DERIVANTE DALL USO IMPROPRIO DEI PRODOTTI QUI DESCRITTI COMPONENTI E SOFTWARE INCLUSI O DA QUALSIASI USO DI TALI PRODOTTI NON ESPLICITAMENTE CONTEMPLATO NELLE LICENZE SCRITTE O NELLE AUTORIZZAZIONI CONCESSE DA ILLUMINA IN OCCASIONE DELL ACQUISIZIONE DEI PRODOTTI STESSI DA PARTE DEL CLIENTE PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 2012 2014 Illumina Inc Tutti i diritti riservati Illumina e MiSeqDx sono marchi o marchi registrati di Illumina Inc Tutti gli altri marchi e denominazioni qui citati sono di propriet dei rispettivi titolari AMPure Beckman e Beckman Coulter sono marchi di fabbrica o marchi registrati di Beckman Coulter Inc Introduzione POM Uso previsto Il saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina un sistema diagnostico in vitro per il sequenziamento mirato che risequenzia le regioni di codifica delle proteine e i limiti introne esone del gene regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica CFTR in DNA genomico iso
41. olonna corrispondente della piastra AMP Pipettare delicatamente su e gi 5 6 volte per miscelare accuratamente il DNA con la soluzione di lavoro per PCR NOTA Inclinare leggermente la piastra FPU per garantire la completa aspirazione ed evitare la formazione di bolle d aria Trasferire le colonne restanti dalla piastra filtro alla piastra AMP in modo simile Le punte devono essere sostituite dopo ogni colonna per evitare la contaminazione incrociata Dopo che tutti i campioni sono stati trasferiti la piastra MIDI di raccolta degli scarti della piastra FPU pu essere smaltita Il colletto adattatore in metallo deve essere pulito e conservato per l uso futuro 7 Coprire la piastra AMP con l apposito sigillo e assicurarlo con un rullo di gomma 8 Centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto 9 Trasferire la piastra AMP nell area di post amplificazione 10 Eseguire la PCR utilizzando il seguente programma su un termociclatore 38 95 C per 3 minuti 25 cicli di 95 C per 30 secondi 62 C per 30 secondi 72 C per 60 secondi 72 C per 5 minuti Mantenere a 10 C PUNTO DI ARRESTO SICURO Se non si procede immediatamente alla pulizia della PCR la piastra AMP pu restare sul termociclatore per la notte oppure pu essere conservata a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C per massimo 48 ore N codice 15038346 Rev A Pulizia della PCR Questo processo consiste nel purificare i prodotti della PCR dagli altri compo
42. one Identificare le aree di pre amplificazione a maggior rischio di contaminazione e pulirle con una soluzione di sodio ipoclorito allo 0 5 candeggina al 10 prima di iniziare qualsiasi processo di pre amplificazione Aree ad alto rischio comprendono in via esemplificativa i seguenti elementi ripiani dei banchi maniglie delle porte maniglie di frigoriferi congelatori mouse di computer tastiere Pulizia quotidiana dell area di post amplificazione Ridurre la quantit di prodotti della PCR nell area di post amplificazione contribuisce a ridurre il rischio di contaminazione nell area di pre amplificazione La pulizia quotidiana dell area di post amplificazione mediante sodio ipoclorito allo 0 5 candeggina al 10 contribuisce a tale risultato Identificare le aree di post amplificazione a maggior rischio di contaminazione e pulirle ogni giorno con una soluzione di sodio ipoclorito allo 0 5 candeggina al 10 Aree ad alto rischio comprendono in via esemplificativa i seguenti elementi termociclatori area del banco utilizzata per elaborare il DNA amplificato maniglie delle porte maniglie di frigoriferi congelatori mouse di computer tastiere Pulizia settimanale di tutte le aree del laboratorio Una volta alla settimana eseguire una pulizia profonda delle aree di pre amplificazione e post amplificazione con sodio ipoclorito allo 0 5 candeggina al 10 Pulire i ripiani dei banchi e le superfici del laboratorio Pulire tu
43. one di diluizione libreria nella provetta DAL Dispensare 6 ul di controllo interno PhiX 20 pM nella provetta DAL Con la stessa punta pipettare su e gi per 3 5 volte per sciacquare la punta e assicurare che il trasferimento sia completo Trasferire 9 ul di PAL nella provetta DAL contenente il tampone di diluizione libreria Con la stessa punta pipettare su e gi per 3 5 volte per sciacquare la punta e assicurare che il trasferimento sia completo Mescolare la DAL agitando la provetta molto velocemente NOTA f Se si desidera conservare la restante PAL per utilizzarla in futuro porre la provetta PAL a una temperatura fra 25 C e 15 C La PAL si conserva bene per 3 giorni La libreria diluita DAL deve essere preparata al momento e utilizzata immediatamente per caricare il MiSeqDx Se conservata la DAL pu comportare una riduzione significativa della densit dei cluster Centrifugare la provetta DAL a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto per raccogliere il contenuto Incubare la provetta DAL in un blocco termico a 96 C per 2 minuti Dopo l incubazione capovolgere la provetta DAL 1 2 volte per mescolarla quindi porla immediatamente in un bagno di acqua e ghiaccio Tenere la provetta DAL nel bagno di acqua e ghiaccio per 5 minuti D N codice 15038346 Rev A J NOTA necessario eseguire la fase di denaturazione mediante calore immediatamente prima di caricare la DAL nella cartuccia di reagente del MiSeqDx per assicura
44. orio per registrare dati come il nome dell operatore le informazioni sui campioni e gli indici gli orari di inizio e fine i numeri di lotto dei reagenti e i codici a barre Worklist Manager Illumina utilizzato per creare il foglio campioni mediante un applicazione basata su una procedura guidata Worklist Manager Illumina presenta una funzionalit atta a registrare i parametri per la piastra campioni come l ID campione gli indici doppi e altre caratteristiche applicabili alla corsa NOTA E possibile scaricare i documenti sul saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina descritti sopra dal sito Web Illumina all indirizzo http support illumina com Andare alla pagina di supporto del saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina e fare clic sulla scheda Documentation amp Literature Documentazione e letteratura N codice 15038346 Rev A Informazioni preliminari In questa sezione sono descritti il contenuto del kit del saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina i materiali di consumo e le apparecchiature utilizzate le raccomandazioni per l input di DNA e le migliori pratiche da adottare durante il protocollo Contenuto del kit del saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Il kit del saggio MiSegDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina contiene i seguenti componenti Conservare i componenti del kit alla temperatura indicata e in zone designate per la pre amplificazio
45. pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali Smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati in conformit alle norme locali di sicurezza vigenti Per ulteriori informazioni vedere le SDS per questo kit all indirizzo support illumina com sds ilmn Tempo stimato Durata totale 1 ora e 35 minuti Tempo di intervento dell operatore 15 minuti Materiali di consumo Elemento Quantit Conservazione Fornito da Saggio CF Clinical 1 provetta tra 25 C e 15 C Illumina Sequencing pool di oligonucleotidi Tampone di ibridazione 1 provetta tra 25 Cecl5 E Illumina DNA genomico quantit 5 ul tra 25 C e 15 C Utente consigliata 50 ng ul Piastra skirted per PCR a 96 1 piastra ina la SC e SOC Utente pozzetti Sigillo adesivo in alluminio 2 sigilli tra 15 C e 30 C Utente Vaschette sterili Come necessario mali Ge BORE Utente Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione D D jp1o sjonuogijo Ip jood jop SUOcIZEpIIAI Preparazione 1 Rimuovere il saggio CF Clinical Sequencing pool di oligonucleotidi il tampone di ibridazione i campioni di DNA genomico e il campione di controllo positivo dal luogo di conservazione tra 25 C e 15 C e lasciarlo scongelare a temperatura ambiente 2 Inserire in unagitatore il saggio CF Clinical Sequencing pool di oligonucleotidi e il tampone di ibridazione e agitare vigorosamente per assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamen
46. pipetta multicanale dispensare 45 ul di tampone di lavaggio stringente in ciascun pozzetto b Coprire la piastra FPU con il coperchio della piastra filtro e tenerla coperta durante ogni fase di centrifugazione c Centrifugare la piastra FPU a 2 400 x g a 20 C per 5 minuti Procedura 1 Una volta completata l ibridazione confermare che il blocco termico si sia raffreddato a 40 C Mentre la piastra HYB si trova ancora nel blocco termico rinforzare i sigilli con un rullo di gomma o un cuneo sigillante Se non si raggiungono i 40 C in 80 minuti continuare a incubare fino al raffreddamento del blocco termico a 40 C 2 Estrarre la piastra HYB dal blocco termico e centrifugare a 1 000 x g a 20 C per 1 minuto per raccogliere il condensato 3 Con una pipetta multicanale impostata su 60 pl trasferire l intero volume di ciascun campione nel centro dei corrispondenti pozzetti precedentemente lavati della piastra filtro Cambiare le punte dopo ciascuna colonna onde evitare una contaminazione incrociata 4 Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 400 x g a 20 C per 5 minuti 5 Lavare la piastra filtro come segue a Con una pipetta multicanale dispensare 45 ul di tampone di lavaggio stringente in ciascun pozzetto contenente il campione Non necessario cambiare le punte quando si cambia colonna se si fa attenzione a evitare la contaminazione incrociata b Coprire la piastra filtro con il coperchio e centrifugare a 2 40
47. pparecchiatura e materiali richiesti non forniti Apparecchiatura e materiali per pre amplificazione 1 Blocco termico necessario un blocco termico per una piastra a 96 pozzetti Il blocco termico deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Sono accettabili i blocchi termici con coperchi riscaldati Intervallo di temperatura ambiente da 5 C a 99 C Regolazione della temperatura 0 1 C a 37 C 0 4 C a 60 C 2 Incubatore di campioni necessario un incubatore forno per ibridazione L incubatore deve soddisfare le seguenti specifiche di prestazione Intervallo di temperatura da 10 C a 100 C Regolazione della temperatura 0 2 C 3 Centrifuga da tavolo necessaria una centrifuga da tavolo in grado ci mantenere la temperatura di 20 C Come specificato sopra nell area di post Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione I q amplificazione necessaria un altra centrifuga Qualsiasi centrifuga per piastre che raggiunga le velocit previste dal protocollo da 280 a 2 400 x g accettabile 4 Pipette di precisione necessaria una serie di pipette di precisione Come specificato sopra nell area di post amplificazione necessario un altro set L utilizzo di pipette di precisione necessario per assicurare un erogazione accurata di reagente e campione possibile utilizzare sia pipette monocanale che multicanale se calibrate regolarmente e precise entro un marg
48. re che il templato sia caricato in modo efficace sulla cella a flusso del MiSeqDx ql IP OOd IP SUOIZESIO ODI Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione D 9 Le novit Una volta raggruppate in pool le librerie di ampliconi con il PhiX diluito e denaturato le librerie sono pronte per essere caricate sulla cartuccia MiSeqDx saggio CF Clinical Sequencing nell apposito serbatoio etichettato con Load Samples Carica campioni La corsa di sequenziamento viene quindi impostata mediante l interfaccia software operativo MiSeq MOS Vedere la Guida di consultazione per lo strumento MiSeqDx n codice 15038353_ITA per istruzioni al riguardo S 4 N codice 15038346 Rev A Assistenza tecnica Per assistenza tecnica contattare l Assistenza tecnica Illumina Tabella 11 Dati di contatto generali Illumina Sito Web Illumina www illumina com E mail techsupport illumina com Tabella 12 Numeri di telefono Assistenza clienti Illumina Area geografica Numero di contatto Area geografica Nord America 1 800 809 4566 Italia Austria 0800 296575 Norvegia Belgio 0800 81102 Paesi Bassi Danimarca 80882346 Regno Unito Finlandia 0800 918363 Spagna Francia 0800 911850 Svezia Germania 0800 180 8994 Svizzera Irlanda 1 800 812949 Altri paesi Schede di sicurezza sui materiali MSDS Numero di contatto 800 874909 800 16836 0800 0223859 0800 917 0041 900 812168 020790181 0800 563118 44 1799 534000 Le
49. si proprietaria Master Mix per 1 provetta 2 8 ml Soluzione acquosa PER tamponata contenente sali e ANTP Tabella 2 Scatola 1B Reagenti post amplificazione Componente Quantit cea Ha Ingredienti attivi riempimento Diluente 1 provetta 4 6 ml Soluzione acquosa normalizzazione tamponata contenente libreria sali 2 mercaptoetanolo e formammide Tampone di 1 provetta 4 5 ml Soluzione acquosa diluizione tamponata libreria Controllo 1 provetta 10 ul Soluzione acquosa interno PhiX tamponata contenente DNA genomico PhiX Conservazione tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C Conservazione tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C tra 25 C e 15 C Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Scatola 2 Tabella 3 Scatola 2 Reagenti post amplificazione Componente Cartuccia MiSeqDx saggio CF Clinical Sequencing Quantit 6 cartucce Indice Cartuccia monouso che contiene i reagenti per la generazione dei cluster e il sequenziamento da utilizzarsi con MiSegDx compresi formammide 2 mercaptoetanolo e DMSO lt 2 Conservazione tra 25 C e 15 C N codice 15038346 Rev A Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Scatola 3 Tabella 4 Scatola 3A Reagenti pre amplificazione Componente Quantit Tampone di 1 flacone lavaggio stringente Tampone di lavaggio universale 1 provetta Volume di riempimento
50. te disciolti quindi centrifugare brevemente le provette per raccogliere il liquido 4 NOTA Prima di utilizzare il tampone di ibridazione porre la provetta davanti a una luce ed eseguire un controllo visivo per assicurarsi che tutti i precipitati si siano completamente sciolti 3 Impostare un blocco termico per piastra a 96 pozzetti su 95 C 4 Preriscaldare un incubatore a 37 C per prepararsi alla fase di estensione ligazione 5 Creare la piastra campioni in base all immagine stampata da IWM Controllare la corrispondenza della posizione dei controlli positivi e negativi Illumina consiglia di analizzare i campioni in lotti non inferiori a otto NOTA L uso dei controlli consente all Assistenza tecnica Illumina di garantire un assistenza efficace nella risoluzione dei problemi L Assistenza tecnica Ilumina non fornisce assistenza salvo queste reazioni di controllo fossero incluse nella corsa Procedura 1 Etichettare una nuova piastra PCR a 96 pozzetti HYB_Plate_ID 2 Aggiungere 5 ul di campione o controllo a 50 ng ul 250 ng totali ai pozzetti appropriati nella piastra HYB Seguire il layout della piastra generato per la corretta selezione dei pozzetti NOTA Verificare che il layout dei campioni di DNA e le posizioni dei controlli positivi e negativi corrispondano nello schema della piastra 2 6 N codice 15038346 Rev A Utilizzando una pipetta multicanale aggiungere 5 ul del saggio CF Clinical Sequencing pool d
51. tic Fibrosis Clinical Sequencing Scatola 5 Tabella 7 Scatola 5 Reagenti pre amplificazione RRR Volume di AA Componente Quantit riempimento Ingredienti attivi Conservazione Piastra di tra 15 C e 30 C microtitolazione in polipropilene con una membrana di polietersulfone modificata Piastra filtro 6 piastre Tabella 8 Scatola 5 Reagenti post amplificazione aa Vol i Componente Quantit hoaa di riempimento Tampone di 1 provetta Soluzione acquosa eluizione tamponata Tampone di 1 provetta 3 5 ml Soluzione acquosa tra 15 C e 30 C conservazione tamponata della libreria Reagenti richiesti non forniti Ingredienti attivi Conservazione tra 15 C e 30 C Reagenti pre amplificazione gt 10 N NaOH preparare da compresse o con una soluzione standard gt Tampone TE gt Acqua priva di DNasi e di RNasi O N codice 15038346 Rev A Reagenti post amplificazione 10 N NaOH preparare da compresse o con una soluzione standard Etanolo 200 proof vol 100 per biologia molecolare Tampone TE Acqua priva di DNasi e di RNasi Apparecchiatura e materiali Apparecchiatura e materiali di consumo forniti venduti separatamente 1 Strumento MiSeqDx n catalogo DX 410 1001 2 Kit TruSeq Index Plate Fixture n di catalogo FC 130 1005 3 Kit TruSeq Index Plate Fixture amp Collar n di catalogo FC 130 1007 4 NE UILUIDIO IUOIZELUIOJU Tappi sostitutivi per adattatore indice n di catalogo DX 502 1003 A
52. tti gli strumenti che non vengono puliti ogni giorno Lavare a fondo i pavimenti del laboratorio Assicurarsi che il personale responsabile della pulizia settimanale sia adeguatamente preparato sulla prevenzione della contaminazione da PCR Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione lo NE UILUIDIO IUOIZELUIOJU Oggetti caduti sul pavimento Il pavimento contaminato dai prodotti della PCR trasferiti sulle scarpe delle persone provenienti dall area di post amplificazione pertanto qualsiasi oggetto che cada sul pavimento deve essere trattato come contaminato Gli oggetti monouso caduti sul pavimento come provette vuote punte di pipette guanti appendiabiti devono essere smaltiti Gli oggetti non monouso caduti sul pavimento come una pipetta o un contenitore di campioni importante devono essere puliti immediatamente e a fondo con soluzione di sodio ipoclorito allo 0 5 candeggina al 10 per rimuovere la contaminazione da PCR Pulire qualsiasi superficie del laboratorio entrata in contatto con l oggetto contaminato Le persone che manipolano qualsiasi oggetto caduto sul pavimento monouso o non devono smaltire i propri guanti da laboratorio e indossarne un paio nuovo Precauzioni Durante la preparazione delle librerie per il sequenziamento mediante il presente protocollo attenersi alle raccomandazioni seguenti Garantire la coerenza Utilizzare pipette multicanale per garantire la coerenza fr
53. ua sterile 34 N codice 15038346 Rev A 2 Determinare i primer indice da utilizzare in base alla stampa dello schema della piastra di Worklist Manager Illumina 3 Rimuovere Master Mix per PCR e i primer indice appropriati dal luogo di conservazione tra 25 C e 15 C quindi scongelarli sul banco a temperatura ambiente Per lo scongelamento dei reagenti attendere circa 20 minuti 4 Dopo chei primer indice sono completamente scongelati agitare ogni provetta per miscelare e centrifugare brevemente le provette in una microcentrifuga Utilizzare provette Eppendorf da 1 7 ml come adattatori per la microcentrifuga 5 Disporre i primer in un rack utilizzando le seguenti disposizioni a Disporre le provette con i primer Primer indice C A503 D A504 e E A505 tappo bianco soluzione trasparente verticalmente allineate alle righe da A a H b Disporre le provette con i primer Primer indice 1 A701 2 A702 e 10 A710 tappo arancione soluzione gialla orizzontalmente allineate alle colonne da 1a12 Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione 3 H HOd Q1UeIP aL suozeoyduy Figura 6 Fissaggio della piastra indice A Primer indice C A503 D A504 e E A505 tappi bianchi B Primer indice 1 A701 2 A702 e 10 A710 tappi arancioni C Piastra AMP 6 Etichettare una nuova piastra per PCR a 96 pozzetti AMP piastra di amplificazione 7 Dispensare i primer indice sulla piastra AMP i
54. ulizia della PCR Agitare energicamente e quindi capovolgere ancora 10 volte Controllare visivamente la soluzione per assicurarsi che le microsfere siano ben risospese Utilizzando una pipetta multicanale aggiungere 45 ul di microsfere per la pulizia della PCR a ogni pozzetto di campione della piastra CLP Utilizzando una pipetta multicanale impostata su 60 pl trasferire il prodotto per PCR dalla piastra AMP alla piastra CLP Sostituire le punte quando si passa da un campione all altro Sigillare la piastra CLP con un sigillo adesivo per piastre Agitare la piastra CLP su un agitatore per micropiastre a 1 800 rpm per 2 minuti Incubare a temperatura ambiente da 15 C a 30 C senza agitare per 10 minuti Posizionare la piastra su un supporto magnetico per un minimo di 2 minuti o fino alla scomparsa del surnatante Con la piastra CLP sul supporto magnetico e una pipetta multicanale impostata su 100 pl rimuovere attentamente e smaltire il surnatante Sostituire le punte quando si passa da un campione all altro L NOTA Qualora nelle punte vengano inavvertitamente aspirate delle microsfere dispensare nuovamente queste ultime sulla piastra e lasciare riposare la piastra sul magnete per 2 minuti o controllare che il surnatante sia scomparso 40 N codice 15038346 Rev A 12 13 14 15 16 17 18 19 Con la piastra CLP sul supporto magnetico lavare le microsfere con etanolo all 80 appena preparato come segue a
55. unziona il saggio Per ciascun amplicone del gene CFTR prevista una coppia di oligonucleotidi CF specifica L ibridazione di questi oligonucleotidi su DNA genomico avviene in una piastra a 96 pozzetti successivamente il processo di estensione e ligazione forma templati di DNA costituiti dalle regioni di interesse affiancate da sequenze di primer Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione 3 universali Mediante i primer indice forniti con il kit i templati di DNA vengono amplificati mediante PCR raggruppati in pool in una singola provetta e sequenziati sullo strumento MiSeqDx Sonda Regione di Sonda personalizzata 1 interesse personalizzata 2 0 TOT lele Pa Perrino ver SO Sonda Sonda personalizzata 1 personalizzata 2 n P7 Indice 1 Indice 2 PS P7 Indice1 Indice 2 P5 Ibridazione di sonde oligonucleotidiche personalizzate Estensione e ligazione Aggiunta di indici e adattatori di sequenziamento mediante PCR Amplicone finale pronto per il sequenziamento con MiSeq DO 9 4 N codice 15038346 Rev A Panoramica del processo Il processo del saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Illumina pu essere riassunto nei seguenti passaggi Creazione di un foglio campioni SUOIZNPOJMU Innanzitutto preparare un foglio campioni da utilizzare su MiSeqDx per identificare ciascun campione e l indice corrispondente Per preparare il foglio campioni utili
56. zzare Worklist Manager Illumina un applicazione basata su una procedura guidata che consente di registrare l ID dei campioni gli indici e altri parametri applicabili alla piastra a 96 pozzetti Il foglio campioni utilizzato anche come guida per impostare la piastra durante il flusso di lavoro del saggio Preparazione delle librerie Preparare le librerie utilizzando il protocollo dettagliato nella presente guida per l utente Sequenziamento dei campioni su MiSeqDx Il saggio MiSegDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing deve essere sequenziato su uno strumento MiSeqDx mediante una corsa paired end da 150 cicli Per istruzioni su come eseguire una corsa di sequenziamento su MiSeqDx vedere la Guida di consultazione per lo strumento MiSegDx n codice 15038353_ITA Sequenziamento automatico e analisi dei dati MiSeq Reporter elabora le identificazioni delle basi generate dallo strumento MiSeqDx Si tratta di un software integrato sullo strumento e nei suoi processi MiSeq Reporter produce informazioni relative all allineamento e alle varianti strutturali Per ulteriori informazioni sul software vedere la Guida per l utente di MiSeg Reporter n codice 15038356_ITA Strumenti per il monitoraggio Illumina fornisce i seguenti strumenti per il monitoraggio e indicazioni sui campioni nel laboratorio Saggio MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Guida di consultazione D possibile utilizzare il Modulo di monitoraggio del laborat
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