Chlamydia IgA SeroFIA
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1. 1 botella 80 ml de sangre humana no transmite infecci n todos los 510 09M CONTROL NEGATIVO Suero humano negativo componentes de sangre humana que se proporcionan en para anticuerpos IgG IgA e IgM frente a C el kit deben manipularse como muestras de suero o pneumoniae C trachomatis y C psittaci sangre potencialmente infecciosas de forma id ntica o Contiene azida sodica lt 0 1 Listo para usar similar a aquellas recomendaciones publicadas en el _1 vial 0 5 ml manual CDC NIH Biosafety in Microbiological and 913 10M CONTROL POSITIVO C trachomatis Suero Biomedical Laboratories 1988 normativa espa ola humano positivo para anticuerpos IgA frente a C R D 664 1997 sobre Protecci n de los Trabajadores trachomatis Contiene azida s dica lt 0 1 Listo contra Riesgos relacionados con la Exposici n a Agentes para usar oi Biol gicos en el Trabajo ze 2 El material antig nico procedente de Chlamydia que 913 11M CONTROL POSITIVO C pneumoniae Suero recubre los portas ha sido inactivado y no contiene humano positivo para anticuerpos IgA frente a C organismos vivos detectables Sin embargo ya que no se pneumoniae Contiene azida s dica lt 0 1 Listo conoce ning n m todo capaz de garantizar para daai DD completamente que los productos derivados de Ai organismos patol gicos no transmiten infecci n los portas 913 12M CONTROL POSITIVO C psittaci Suero humano ci a y desecharse como si tuviesen positivo para anticue2. 88 Concordancia entre Ambos m todos 25 30 X 100 83 Nota No pudo calcularse la sensibilidad debido al bajo n mero de muestras positivas REFERENCIAS 1 Piura B Sarov l Sarov B Kleinman D Chaim W and Insler V 1985 Serum IgG and IgA antibodies specific for Chlamydia trachomatis in salpingitis patients as determined by the immunoperoxidase assay Eur J Epidemiol 1 110 116 Tsunekawa T and Kumamoto Y 1989 A study of IgA and IgG titers of C trachomatis in serum and prostatic secretion in chronic prostatitis J J A Inf Dis 63 2 130 137 Kaneti J et al 1988 IgG and IgA antibodies specific for Chlamydia trachomatis in acute epididymits Europ Urol 14 323 327 Kletter Y Caspi D Yarom M Sarov B Sarov l and Tanay A 1988 Serum IgA and IgG Antibodies Specific to Chlamydia in Patients with Rieter s Syndrome RS In Proceedings of The European Society for Chlamydia Research Societa Editrice Esculapio Bologna p 170 Stutman H R Rettig P J and Reyes S 1984 Chlamydia trachomatis as a cause of Pneumonitis and pleural effusion J Pediat 104 588 591 Paran H Heimer D and Sarov I 1986 Serological clinical and radiological findings in adults with broncho pulmonary infections caused by Chlamydia trachomatis Isr J Med Sci 22 823 827 Grayston J T Campbell L A Kuo C C Mordhorst C H Saikku P Thom D H and Wang S P 1990 A new respira
3. C 1 C o camara de incubaci n 510 02M PORTAS SUBSTRATO DE LA REACCION humeda a 37 C 3x7 pocillos unidad 7 Bandejas de pl stico para la incubaci n de los portas Los portas est n recubiertos con ant genos de 8 Agua destilada o doblemente desionizada para la diluci n de la soluci n de lavado concentrada Frasco lavador de pl stico C pneumoniae C trachomatis y C psittaci cada uno de ellos en una fila de pocillos 9 diferente Fig 1 Cada porta se empaqueta en una bolsa de aluminio que contiene un paquete con gel de s lice 15 unidades 10 Soporte de portas y jarra de tinci n 11 Cron metro 12 Microscopio de fluorescencia con filtros apropiados para lectura de fluorescencia con FITC y con aumentos de 40x y 100x PRECAUCIONES Para Utilizaci n en el Diagn stico In Vitro B100 SOLUCION DE LAVADO CONCENTRADA 20x Medidas de Seguridad 05M Soluci n de PBS Tween pH 7 4 7 6 que contiene 4 Este kit contiene suero humano que ha sido analizado por CINa Na2 HPO4 KH2POA4 y e ula nani t cnicas aprobadas por la FDA CE y se ha encontrado 3 j ue es negativo para el ant geno de superficie de la B100 DILUYENTE DEL SUERO Tamp n PBS que hepatitis Bey pale arc uence frente a VHC y VIH Sin 03M contiene gelatina alb mina s rica bovina Cl Mg y embargo ya que no se conoce ning n m todo capaz de azida s dica por debajo del 0 1 ofrecer una garant a absoluta de que el producto derivado
4. CL ous Chlamydia IgA SeroFIA Ensayo de inmunofluorescencia para la deteccion de anticuerpos IgA especificos frente a C pneumoniae C trachomatis y C psittaci en suero humano Manual de Instrucciones Kit para 3 X 105 determinaciones Ref N 513 018 Para uso en el Diagn stico In Vitro Exclusivamente para uso professional Almacenar de 2 8C No congelar Savyon Diagnostics Ltd 3 Habosem St Ashdod 77610 ISRAEL Tel 972 8 8562920 Fax 972 8 8523176 E mail support savyondiagnostics com Aplicaciones Chlamydia IgA SeroFlIA es un ensayo semicuantitativo de inmunofluorescencia para la determinaci n diferencial de anticuerpos IgA espec ficos frente a C pneumoniae C trachomatis y C psittaci en muestras de suero humano Para uso en el diagnostico n Vitro Introduccion Chlamydia bacteria gram negativa altamente especializada se compone de cuatro especies C trachomatis C pneumoniae TWAR C psittaci y C pecorum C trachomatis incluye 15 serotipos que comparten ep topos inmunog nicos en diferentes grados C trachomatis es uno de los agentes causales de las enfermedades de transmisi n sexual m s comunes y est asociado con la uretritis no gonoc cica NGU y epididimitis en el hombre cervicitis uretritis y enfermedad inflamatoria p lvica en la mujer s ndrome de Reiter en individuos con haplotipo HLA B27 conjuntivitis neonatal y neumon a en el reci n nacido 2 6 C pneumoni
5. En casos puntuales pueden observarse part culas muy peque as inferiores a los EB con una tinci n clara y densa en uno o m s de los ant genos de Chlamydia Esta imagen podr a significar interferencias debidas a la presencia de LPS Deber a realizarse un ensayo para anticuerpos IgG e IgM o realizarse un segundo ensayo con una muestra de suero extra da transcurridos 14 21 d as Si la IgM y la IgG son negativas y se repiten los resultados de la IgA la muestra deber a considerarse negativa 513 018 10 10 13 4 Si se requiere un resultado semicuantitativo o si se detecta reactividad tinci n fluorescente con m s de una especie de Chlamydia el ant geno que muestre el t tulo m s elevado correspondiente al punto de corte que suponga al menos un incremento de 4 veces ser considerado como el responsable de la infecci n LIMITACIONES DEL ENSAYO 1 No debe utilizarse nicamente un ensayo serol gico para realizar un diagn stico final Deben tenerse en cuenta todos los datos cl nicos y de laboratorio 2 Las muestras extra das al inicio de una infecci n primaria pueden no contener cantidades detectables de anticuerpos Si se sospecha de una infecci n por Chlamydia deber obtenerse una segunda muestra transcurridos 14 21 d as y ensayarse en paralelo con la muestra original 3 La reactividad del suero con m ltiples especies de Chlamydia puede deberse a la exposici n a m s de una especie de Chlamydia o a
6. ae es un importante pat geno respiratorio humano que causa hasta el 10 de los casos de neumon a adquirida en la comunidad Est asociado a enfermedades respiratorias agudas neumon a asma bronquitis faringitis s ndrome agudo de pecho de la anemia falciforme enfermedad coronaria y s ndrome de Guillan Barre 7 9 C psittachi infecta a un rango diverso de especies hospedadoras que va de moluscos a aves y a mam feros y tambi n causa neumon a severa 513 018 10 10 13 1 Las pruebas serol gicas se utilizan de forma rutinaria para el diagn stico de las infecciones de chlamydia Sirven como herramienta no invasiva para la identificaci n de infecciones por chlamydia distales y cr nicas 10 11 donde los m todos directos son raramente eficientes Adem s la presencia de cierto tipo de anticuerpos puede indicar el estad o de la enfermedad La infecci n primaria debida a chlamydia se caracteriza por una respuesta predominante de lgM en las semanas 2 a 4 y una respuesta retardada de IgG e IgA en las semanas 6 a 8 Despu s de una infecci n aguda con C penumoniae los anticuerpos IgM se suelen perder en los meses 2 a 6 12 los anticuerpos IgG aumentan y despu s decrecen lentamente mientras que los anticuerpos IgA tienden a desaparecer r pidamente 13 Las reinfecciones con chlamydia se caracterizan por la ausencia de una respuesta IgM y una respuesta r pida de IgG e IgA 9 Los anticuerpos IgA han mostrado ser un mar
7. ala P Kujala and P Saikku 1991 Serological diagnosis of Chlamydiae pneumoniae Cpn pneumoniae in adults In Abstracts of 31st ICAAC Chicago Illinois Sept 29 Oct 2 1991 Washington D C Aner Soc Microbiol p 209 CL ous European Authorized Representative Obelis s a Boulevard G n ral Wahis 53 1030 Brussels BELGIUM Tel 32 2 732 59 54 Fax 32 2 732 60 03 E Mail mail obelis net
8. cador inmunol gico fiable de infecciones primarias cr nicas y recurrentes Estos anticuerpos normalmente decaen r pidamente hasta niveles basales tras el tratamiento y erradicaci n de la infecci n por chlamydia 1 6 10 11 La persistencia de un t tulo elevado de anticuerpos IgA se considera normalmente como un signo de infecci n cr nica 13 En un estudio realizado en pacientes de edad avanzada con infecciones respiratorias se estim que una quinta parte de los casos de infecci n por C pneumoniae habr an pasado inadvertidos sin la determinaci n de IgA 14 Los anticuerpos IgG persisten durante largos periodos de tiempo y decaen lentamente Por lo tanto la presencia de anticuerpos lgG es sobre todo indicativo de infecci n por chlamyidia desde un tiempo indeterminado Sin embargo un aumento de cuatro veces en el nivel de lgG o niveles elevados de anticuerpos IgG podr an indicar una infecci n sist mica o cr nica en curso El test de Savyon Chlamydia IgA SeroFlA es un ensayo de micro IF basado en los principios de la MIF SeroFIA utiliza como ant geno cuerpos elementales purificados de C pnemoniae TW 183 C trachomatis L2 y C psittaci SZ 1 Cada porta de SeroFlA contiene 3 filas de 7 pocillos cada fila contiene ant genos de C pnemoniae de C trachomatis o de C psittaci Esta separaci n entre cada uno de los ant genos de Chlamydia evita una posible confusi n entre las diferentes especies y hace que
9. es a los controles para asegurar una correcta interpretaci n de los resultados Realizar una lectura de la fluorescencia e intensidad de las muestras cl nicas como se indica a continuaci n Los cuerpos elementales aparecen con una fluorescencia moderada a intensa definida o difusa de color verde manzana Los cuerpos elementales muestran una fluorescencia definida pero d bil deber a considerarse como el t tulo correspondiente al punto de corte del suero El t tulo correspondiente al punto de corte de un suero determinado se define como la ltima diluci n que todav a proporciona una tinci n perceptible La siguiente diluci n mostrar a un aspecto id ntico al del control negative EE Sin fluorescencia o con una d bil fluorescencia de fondo sin una morfolog a clara de Chlamydia Interpretaci n de los resultados a diluci n 1 32 Apreciaci n de la ETE C pn Presencia de anticuerpos IgA espec ficos frente a C pn C tro C ps respectivamente Para que exista evidencia de infecci n se requiere un t tulo que sea gt a 1 32 Presencia de anticuerpos IgA frente a Chlamydia Puede significar m ltiples infecciones o reacciones cruzadas entre especies Se deber a establecer el t tulo del punto de corte con objeto de determinar la especie de Chlamydia predominante Negativo No se detectan anticuerpos IgA frente a ninguna de las especies de Chlamydia C pn C tr o C ps ADVERTENCIA
10. la interpretaci n de los resultados sea simple y libre de errores Principio del Ensayo e Los cuerpos elementales EB purificados de C pnemoniae C pn C trachomatis C tr y C psitacci C ps utilizados como ant geno est n fijados en el interior de los pocillos cada uno de ellos en una fila diferente del porta e Los sueros diluidos de los pacientes se incuban durante 30 minutos a 37 C en cada una de las filas con los ant genos respectivos e Los componentes del suero que no se han unido se eliminan mediante lavados e Se a ade anticuerpo anti lgA humana conjugado con fluoresce na y se incuba durante 30 minutos a 37 C e El conjugado que no se haya unido se elimina mediante lavados e Se secan los portas y se montan a adiendo 3 gotas de Fluido de Montaje e Los portas se examinan utilizando un microscopio de fluorescencia Las reacciones positivas aparecen como EB brillantes de color verde manzana fluorescente sobre un Materiales requeridos que no se proporcionan fondo oscuro e Para determinaciones cualitativas es suficiente una nica 4 dilucion de suero Para resultados semicuantitativos debe realizarse una titulacion para definir el punto de corte 2 Microplacas o tubos limpios para la diluci n de los sueros de los pacientes Centr fuga Micropipetas ajustables rango en ul 5 40 40 200 200 1000 y puntas desechables oo 4 Probeta 1 litro 5 Vortex Referencia 6 Ba o con tapa a 37
11. n un chorro de soluci n de lavado diluida utilizando un frasco lavador Lavar los portas sumergi ndolos en una jarra de tinci n que contenga soluci n de lavado diluida Mantener los portas inmersos durante 10 minutos Sumergir los portas lavados en agua doblemente destilada Extraer y secar al aire Pipetear 10 ul del conjugado FITC a cada pocillo Incubar a 37 1 C durante 30 minutos Repetir el lavado de los portas como en el paso 5 Colocar tres gotas de medio de montaje en el centro del porta Montar con el cubre Eliminar las burbujas de aire presionando suavemente sobre el cubre 10 Leer los resultados en un microscopio de fluorescencia con aumentos de 400X y 1000X Para optimizar los resultados leer los portas en el mismo d a en el que se realiza el ensayo Si esto no fuera posible los portas montados pueden almacenarse de 2 8 C en obscuridad hasta 3 d as OO Oo VALIDACI N DEL TEST El ensayo es v lido siempre que Controles Positivos Los EB de las diferentes especies de Chlamydia muestran una tinci n fluorescente verde manzana de intenso a moderado No muestran reactividad tinci n con ninguna de las especies de Chlamydia Controles Negativos Si los controles no muestran estas caracter sticas el ensayo deber a considerarse como no v lido INTERPRETACION Y SIGNIFICADO DE LOS RESULTADOS SIGNIFICADO DEL TITULO DEL PUNTO DE CORTE Se recomienda comenzar leyendo los pocillos correspondient
12. o contaminantes potenciales Deben esterilizarse o inactivarse tras su uso y antes de su eliminaci n o limpieza La inactivaci n puede realizarse con un ciclo de autoclave a 121 C durante al menos 1 hora o por tratamiento con una soluci n de hipoclorito s dico a una concentraci n final del 5 durante al menos 30 minutos 8 El conjugado FITC contiene Azul de Evans el cual es carcin geno Evitar el contacto con la piel y con los ojos 9 El medio de montaje contiene componentes corrosivos Evitar el contacto con la piel y no inhalar En caso de contacto con la piel y con los ojos enjuagar inmediatamente con abundante agua CONSERVACI N Y VIDA MEDIA DE LOS REACTIVOS 1 Todos los materiales que se proporcionan deben almacenarse de 2 8 C Si se mantienen a esta temperatura los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el kit No utilizar los reactivos despu s de la fecha de caducidad 2 La exposici n de los componentes del kit a temperatura ambiente durante unas pocas horas no produce ning n da o 3 No exponer los reactivos a fuentes luminosas potentes 4 No congelar los reactivos EXTRACCI N Y PREPARACION DE LAS MUESTRAS Extracci n de las muestras Las muestras deber n extraerse as pticamente utilizando las t cnicas est ndar almacenarse de 2 8 C con azida s dica al 0 05 NaN3 como conservante y el ensayo deber realizarse en los siguientes d as Para almacenamientos prolongados la
13. reacciones cruzadas de los anticuerpos 4 El microscopio ptico y las condiciones de la fuente de luz y el tipo pueden afectar a la intensidad total de fluorescencia y a la determinaci n del t tulo correspondiente al punto de corte CARACTERISTICAS DEL ENSAYO El test de IgA SeroFIA se contrast con un m todo de referencia por MIF El estudio se realiz en un centro m dico independiente con sueros de pacientes con sospecha de infecci n por C trachomatis C pneumoniae o C psittaci Chlamydia trachomatis Resultados obtenidos con el kit IgA seroFIA en comparaci n con el m todo Tabla 1 de referencia por MIF Positivo CI ETA SeroFIA Positiva SeroFIA Negativa a Sensibilidad 11 13 X 100 84 6 Especificidad 52 58 X 100 89 7 Concordancia entre ambos m todos 63 71 X 100 88 7 Tabla 2 Chlamydia pneumoniae Resultados obtenidos con el kit IGA SeroFlA en comparaci n con el m todo de referencia por MIF Positivo ERA AE E SeroFIA Positiva SeroFIA Negativa oe Sensibilidad 39 39 X 100 100 Especificidad 74 74 X 100 100 Concordancia entre Ambos m todos Tabla 3 113 113 X 200 100 Chlamydia psittaci Resultados obtenidos con el kit IgA SeroFlA en comparaci n con el m todo de referencia por MIF Positivo Negativo SeroFIA Positiva 1 4 5 SeroFIA Negativa 1 24 25 Total 2 28 30 Especificidad 24 38 X 100
14. rpos IgA frente a C psittaci alg n componente biopeligroso y de forma id ntica o Contiene azida s dica lt 0 1 Listo para usar similar a las recomendaciones publicadas en el manual 1 vial 0 2 ml CDC NIH Biosafety in Microbiological and Biomedical 513 13M_ CONJUGADO FITC Anticuerpo de conejo anti IgA Laboratories 1988 normativa espa ola R D 664 1997 humana marcado con fluoresce na espec fico de sobre Protecci n de los Trabajadores contra Riesgos cadena a Listo para usar relacionados con la Exposici n a Agentes Biol gicos en el 1 vial 3 3 ml Trabajo 510 06M MEDIO DE MONTAJE Contiene azida s dica 3 Se ha descrito que la azida s dica forma complejos de lt 0 1 azida con el plomo y con el cobre de las ca er as del 1 frasco gotero 1 5 ml laboratorio que son explosivos Para evitar la 010 04M CUBRES 1 unidad 15 pcs unidad acumulaci n de estos componentes dejar correr abundante agua por el fregadero y las ca er as tras la FICHA TECNICA 1 eliminaci n de los componentes que contengan azida 4 No pipetear con la boca 5 Evitar el contacto con la piel de cualquiera de los 513 01S 10 10 13 2 componentes del kit 6 Utilizar guantes mientras se manejan los sueros y se PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO realiza el ensayo Lavar las manos vigorosamente despu s de quitarse los guantes 7 Cualquier equipamiento l quidos u otras substancias que entren en contacto con el suero humano deber n considerarse com
15. s muestras de suero deber n alicuotarse y congelarse a 20 C No se recomienda ensayar sueros turbios hemolizados o lip micos ya que pueden dar resultados err neos Preparaci n de las muestras Para realizar un sondeo inicial realizar una diluci n de los sueros 1 32 en Diluyente de Suero a adiendo 10 ul de suero a 310 ul de Diluyente de Suero Para determinar el t tulo del punto de corte realizar diluciones en serie en Diluyente de Suero comenzando por 1 32 Advertencia En cada ensayo se recomienda incluir un pocillo con el Control Negativo y un pocillo con el Control Positivo para C pneumoniae C trachomatis y C psittaci en cada una de sus filas respectivas Control positivo puede utilizarse como un control del punto de corte si se utiliza a la diluci n 1 128 513 018 10 10 13 3 1 Antes de comenzar con el procedimiento de la t cnica los portas reactivos y sueros de los pacientes deben alcanzar la temperatura ambiente 2 Diluir la Soluci n de Lavado Concentrada 1 20 a adiendo 50 ml de esta soluci n a 950 ml de agua doblemente desionizada o destilada La soluci n diluida puede almacenarse de 2 8 C hasta 2 semanas 3 Pipetear 10 ul de los controles o de las muestras de suero diluidas en los pocillos adecuados de cada una de las tres filas 4 Incubar los portas en un ba o o en una c mara h meda a 37 1 C durante 30 minutos 5 Sacar los portas de la c mara h meda y enjuagar con cuidado co
16. tory tract pathogen Chlamydia pneumoniae strain TWAR J Infect Dis 161 618 625 513 018 10 10 13 5 8 Hahn D L Dodge R W and Golubjatnikow R 1991 Association of Chlamydia pneumoniae strain TWAR infection with wheezing asthmatic bronchitis and adult onset asthma JAMA 266 225 230 9 Saikku P Mattila K Nieminen M S Huttunen J K Leinonen M Ekman M R Makela P H and Valtonen V 1988 Serological evidence of an association of a novel Chlamydia TWAR with chronic coronary heart disease and acute myocardial infection Lancet Il 983 986 10 Sarov l Kleinman D Cevenini R Holcberg G Potashnik G Sarov B and Insler V 1986 Specific IgG and IgA antibodies to Chlamydia trachomatis in infertile women Int J Fertil 31 3 193 197 11 Puolakkainen M Saikku P Leinonen M Nurminen M Vaananen P and Makela P H 1984 Chlamydia pneumonitis and its serodiagnosis in infants J Infect Dis 149 598 604 12 Grayston J T L A Campbell C H Mordhorst P Saikku D Thom and S P Wang 1989 A New Respiratory Pathogen Chlamydia pneumoniae Strain TWAR J Inf Dis 161 618 25 13 Saikku P M Leinonen L Tenkanen E Linnanmaki M R Ekman V Manninen M Manttari M H Frick J K Huttunen 1992 Chronic Chlamydiae pneumoniae Infection as a Risk Factor for Coronary Heart Disease in the Helsinki Heart Study Ann of Int Med 116 273 278 14 Leinonen M H Sryj
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