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47. Secuenciación del DNA

1. Si estuviera instalado el Set B presionar change para que aparezca el Set A Nota cada Set representa un conjunto de cuatro filtros que la m quina emplear para detectar la fluorescencia inducida por el l ser El Set A se utiliza con la qu mica est ndar AmpliTaq o AmpliTagFS y la mayor parte de GeneScan mientras que el Set B se reserva para la qu mica de Sequenase T7 Terminator y GeneScan TET Amidite 19 e Presionar Set up Run Aparecer la siguiente pantalla Scan delay Timer Volt 2500 mAmp 40 Watt 32 01 00 7 00 f En su caso modificar Scan delay a una hora 34 cm WTR u hora y media 48 cm WTR y Timer a un n mero de horas entre 7 y 13 34 cm WTR o 18 48 cm WTR h dependiendo de la longitud de secuencia que se desee leer La potencia estar a 32 W 34 cm WTR o a 38 W 48 cm WTR Para modificar estos valores emplear las teclas con flechas para moverse entre los campos y el teclado num rico para editar los valores Nota el sistema el ctrico del secuenciador se configura siguiendo al par metro m s bajo De modo que si se quiere correr a potencia constante asterisco en 32 38 W conviene que el valor de voltios sea alto p ej 2500 al igual que la intensidad de corriente p ej 40 mAmp De este modo se consigue que el asterisco se vaya al vataje ver m s adelante reconfigur ndose los valor
2. Nota mediante este paso se consigue que se pueda apagar el Mac desde el men del escritorio Apagar Equipo d Cerrar todas las ventanas abiertas en el escritorio y seleccionar Reiniciar del men Especial e Proceder a visualizar los datos generados gel electroferogramas secuencias grabarlos en disco magneto ptico imprimirlos etc 6 13 An lisis de resultados El secuenciador 373 Stretch transfiere los datos obtenidos durante la secuenciaci n al ordenador Apple Macintosh en tiempo real Si este ltimo se ha configurado de forma apropiada al acabar la recogida de datos electroforesis el Mac procede autom ticamente a analizarlos generando la imagen del gel y los fluorogramas y secuencias de las muestras cargadas previamente Al acabar este proceso el Mac mostrar una ventana Error log indicando las incidencias de la secuenciaci n Leerla en su caso y cerrarla Asimismo se mostrar la ventana Sample File Queue que consta de dos subventanas Sample File Queue y Sample File Log donde aparecer n los archivos para ser reanalizados o impresos una vez seleccionad as las opciones correspondientes Add for Printing Add for Analysis En el caso de un nuevo an lisis pueden elegirse varios algoritmos representados por Base Caller Adaptive SemiAdaptive ABI50 ABI100 y ABI200 Generalmente se selecciona el ABI50 34 cm WTR o el ABI100 48 cm WTR aunq
3. El volumen de reacci n debe ser ahora de 20 yl A adir una gota de cera fundida a 70 C en la pared de cada tubo Colocar en ciclador t rmico precalentado a 96 C Elegir el programa apropiado para realizar los siguientes 25 ciclos programa 67 96 C 30 segundos 50 C 15 segundos 60 C 4 minutos Apagar autom ticamente programa 0 Shut Down Purificar mediante precipitaci n con etanol o mejor mediante columnas Sephadex G 50 o conservar a 20 C para su posterior purificaci n Nota como es sabido al pipetear se cometen errores Por una raz n misteriosa al repartir soluciones madre entre los tubos hijos nunca sobra y lo que es peor no suele haber suficiente reactivo para el ltimo tubo Veamos un truco para evitar este problema En la tabla anterior se reparte la mezcla madre a raz n de 18 pl por tubo Asumiendo un error del 5 ello supone 0 9 Ml de error por cada pipeteo Para garantizar que el ltimo tubo tambi n recibe sus correspondientes 18 ul de mezcla de reacci n puede incrementarse el volumen total de la mezcla madre en 0 9 ul por cada pipeteo que se vaya a 8 hacer de la misma entre llaves en la tabla anterior Dicho con otras palabras un tubo ser an 18 pl 2 tubos ser an 36 0 9 x 2 37 8 ul lo cual supone multiplicar la primera columna por 2 1 3 tubos ser an 54 0 9 x 3 56 7 pl lo cual supone multiplicar la primera columna por 3 15 4 tubos se
4. 9 2 ml 9 24554 9 2 ml 9 25082 9 3ml 48cnWTR Agua destilada milli Q 1 15 ml o 1 15 mil 1 15 mil hasta 46 ml 207 yl 231 ul 48 cm WTR 20 7 pl hasta 46 ml 207 yl 20 7 pl Mezclar agitando MUY suavemente Verter entre los cristales Utilizar despu s de 2 h y antes de 24 h Nota el volumen de gel que conviene preparar para los geles de 34 y 48 cm WTR es el mismo 46 ml porque el primero aunque es m s peque o 34 cm 17 WTR tiene espaciadores de 0 4 mm Volumen 40 8 cm alto 22 2 cm ancho e 0 04 cm ancho 36 23 ml El segundo es m s largo 48 cm WTR pero tiene espaciadores de s lo 0 3 mm Volumen 57 6 cm alto 20 2 cm ancho 0 03 cm ancho 34 91 ml As preparando 46 ml sobrar n unos 10 34 cm WTR u 11 48 cn WTR ml Nota en el caso de 34 cm WTR el volumen V de la soluci n de acrilamida al 40 necesario para producir un gel de 46ml 207 20 7 ul 46 2277ml de volumen final y x de acrilamida ser V ml acrilamida al 40 46 2277 x 40 1 1556925 x Por tanto el volumen de agua necesario ser V ml de agua 20 274 V ml acrilamida al 40 Nota en el caso de 48 cm WTR el volumen V de la soluci n de acrilamida al 40 necesario para producir un gel de 46ml 231 23 1 ul 46 2541ml de volumen final y x de acrilamida ser V ml acrilamida al 40 46 2541 x 40 1 1563525 x Por tanto el volumen de agua necesa
5. b Llenar las jeringas con Sephadex G 50 Para ello emplear una pipeta Pasteur provista de tetina succionar la resina del lecho introducir la punta de la pipeta hasta el fondo de la jeringa Liberar la resina mientras se retira la pipeta Pasteur poco a poco procurando que no se formen burbujas de aire Colocar cada jeringa rellena de resina en un tubo de pl stico de 10 ml y 1 5 cm Y para que drene el agua libremente Si fuera necesario generalmente lo es a adir m s resina para rellenar completamente la jeringa c Secar la resina centrifugando las columnas colocadas en el interior de los tubos de pl stico en centr fuga Mixtasel Selecta Barcelona Espa a a 10009 2 500 rpm durante 1 minuto Eliminar el agua drenada d Colocar un tubo Eppendorf de 1 5 ml con el tap n cortado puede ser necesario cortar tambi n el borde de la boca para que quepa en el interior de cada tubo de pl stico Acoplar la jeringa rellena de resina e A adir 80 ul de agua destilada a cada tubo Eppendorf conteniendo la reacci n de secuenciaci n f Usar una micropipeta tipo P200 Gilson Villiers le Bel Francia ajustada a 150 ul para perforar la barrera de cera que separa el producto de reacci n del agua a adida Sacar la punta y expulsar el tap n de cera en el interior del tubo Eppendorf Introducir de nuevo la punta de la pipeta hasta el fundo del tubo y succionar todo el l quido reacci n agua 10 Nota de esta forma se consi
6. mediante columnas de Sephadex G 50 De hecho ste es el nico m todo que funciona bien con la qu mica de terminadores que emplea AmpliTag la cual se realiza con un exceso de terminadores Esta qu mica ha sido abandonada por Perkin Elmer en favor de la que emplea AmpliTagFS y una concentraci n mucho menor de terminadores Ello permite poder usar otros m todos de eliminaci n de los mismos que no estaban aconsejados con la qu mica de la AmpliTag la precipitaci n con etanol Nota debe tenerse en cuenta que el lavado con etanol es m s c modo que la exclusi n molecular pero puede dejar trazas de terminadores en el frente de electroforesis generalmente no afectan la lectura y lo cual puede ser m s grave hacer perder las secuencias m s peque as aspecto que se puede controlar hasta cierto punto en el tiempo de precipitado en etanol Este ltimo inconveniente es irrelevante cuando el primer tramo de la secuencia no es til por ejemplo cuando se secuencia usando cebadores universales las primeras decenas de bases pueden corresponder al vector pero puede ser importante cuando se secuencian productos de PCR directamente o cuando hay poca distancia entre el extremo 3 OH del cebador y la secuencia problema As pues el orden de limpieza y consistencia es exclusi n molecular gt etanol con lavado gt etanol sin lavado Por orden de comodidad el orden ser a justamente el contrario Estos aspectos emp ricos deber n se
7. pantalla del 373 Stretch Alter Monitor Abort Self Cali Run Run Run Test bration Nota para comprobar las condiciones de electroforesis seleccionar Monitor Run Para alterar dichas condiciones presionar Alter Run f Transcurridos los 5 6 minutos abortar la electroforesis presionando Abort Run Confirmar 9 Lavar de nuevo los pocillos h Cargar las muestras pares i Una vez cargada la segunda serie de muestras en el gel presionar Start Pre run en el Main Menu y someter a electroforesis durante 5 34 cm WTR 6 48 cm WTR minutos j Transcurridos los 5 6 minutos abortar la electroforesis presionando Abort Run Confirmar k Lavar de nuevo los pocillos Nota este segundo lavado no es cr tico pero mejora el avance uniforme de las muestras durante la electroforesis ATENCI N al finalizar de cargar las muestras no olvidar lavar la punta de la micropipeta Drummondd con agua destilada y colocarle el canuto protector I Seleccionar Choose Run en Main Menu Aparecer la siguiente pantalla 24 GENESCAN SEQUENCE RUN RUN m Elegir Sequence Run La pantalla cambiar a FULL BASE SCAN SPRINTER n Elegir Full Scan para leer en el gel completo generalmente es la opci n utilizada Elegir Base Sprinter cuando s lo se han cargado los 18 pocillos centrales de un peine de 36
8. s adelante 6 10 Aplicaci n de las muestras al gel de secuenciaci n a A adir a cada reacci n previamente secada de 3 a 4 ul ver tabla siguiente de la mezcla de carga 5 formamida 1 Na EDTA con o sin colorante Agitar vigorosamente con v rtex para disolver el residuo seco Centrifugar durante 5 segundos a m xima velocidad 16 000 g para recoger todo el volumen en el fondo Tabla 6 Vol menes de carga para diferentes geles y peines del ABI 373Stretch Peine Volumen pocillos ml 24 y 34 cm WTR 24 4 6 100 24 y 34 cm WTR 32 6 36 3 4 75 100 48 cm WTR 32 36 2 4 50 100 ATENCI N la muestra disuelta de esta forma debe cargarse en el gel de secuenciaci n en las siguientes horas Nota con AmpliTagFS y peine de 36 pocillos se obtienen buenos resultados disolviendo la muestra en 4 ul y cargando 3 ul en el pocillo del gel b Una vez que el gel este dispuesto para recibir las muestras calentarlas a 90 C durante 2 minutos para desnaturalizar el dsDNA Colocar los tubos inmediatamente en hielo picado Nota para conseguir un enfriamiento m s r pido de las muestras y obtener los mejores resultados desnaturalizar las muestras en una gradilla Colocarla despu s en hielo durante unos segundos Sacarla y volver a pinchar los tubos en otro lugar del hielo picado Realizar este proceso 3 4 veces hasta que los tubos se enfrien c Justo antes de cargar las muestras en el gel lava
9. un cierto riesgo manipulaci n de acrilamida monom rica que es neurot xico y neurocarcin geno Gene ReadIR DNA Sequencing Analysis System Li Cor Lincoln NE USA lt http www licor com gt Se trata de un sistema personal cuya principal ventaja es su costo moderado Su principal desventaja es que permite secuenciar un n mero reducido de muestras Su fundamento es similar al sistema Alf descrito a continuaci n con la salvedad de que utiliza un l ser de infrarrojos que se supone m s fiable para detectar cidos nucleicos y menos sensible a interferencias proteicas de la muestra ALFexpress II DNA Analysis System AmershamPharmaciaBiotech Emplea cebadores marcados con un nico fluor foro para llevar a cabo cuatro reacciones independientes que se cargan en cuatro carriles diferentes del gel de poliacrilamida Su principal desventaja es que al usar un solo fluor foro no permite realizar las cuatro reacciones correspondientes a cada clon en un solo tubo Del mismo modo es necesario cargar cada una de las cuatro reacciones clon en cuatro carriles diferentes en el gel de poliacrilamida que debido a ello debe ser bastante ancho Vistra DNA Labstation 625 AmershamPharmaciaBiotech Puede emplear tanto la qu mica de cebadores marcados como la m s c moda r pida barata y popular de terminadores marcados Su principal desventaja es que no permite la elevada productividad del ABI PRISM 377 descrito a continuaci n ABI PRISM
10. _377 PerkinElmer AppliedBiosystems Foster City CA USA lt http www perkin elmer com gt que sustituye a modelos anteriores ABI 373 373A y 373Stretch Es con diferencia el sistema de secuenciaci n PAGE m s vers til y potente del mercado Permite emplear tanto la qu mica de cebadores como la de terminadores didesoxinucle tidos marcados con cuatro fluor foros diferentes Ello hace posible poder llevar a cabo las cuatro reacciones en un mismo tubo y cargarlas en un solo carril del gel As pueden secuenciarse en cada electroforesis 24 32 36 48 64 y hasta 96 clones diferentes Asimismo soporta diferentes longitudes de gel que permiten leer entre 200 y 1000 bases Con ello se pueden conseguir rendimientos de hasta 96 kpb gel La mayor parte del Proyecto del Genoma Humano y Proyectos Accesorios se llevan a cabo con esta m quina Esta empresa fabrica tambi n otros secuenciadores menos poderosos aunque m s baratos como el ABI PRISM 310 Genetic Analyzer cuya principal ventaja es que est basado en electroforesis capilar por lo que no requiere preparar geles de poliacrilamida ver m s abajo 3 2 Basados en electroforesis capilar CE Los sistemas de secuenciaci n basados en electroforesis capilar CE capillary electrophoresis son muy recientes y est claro que representan la pr xima generaci n de secuenciaci n autom tica Su ventaja principal es justamente sa el proceso se automatiza todav a m s siendo
11. an lisis por software espec fico 6 2 Reacciones Cycle Sequencing con AmpliTaq o con AmpliTagFS Como se ha indicado anteriormente usaremos bien el kit ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit con AmpliTagFS Tambi n se muestra el protocolo para AmpliTaq a Preparar una mezcla madre seg n se indica en la tabla correspondiente compuesta por agua premezcla terminadora y el cebador elegido Repartir a raz n de 15 AmpliTag o 18 AmpliTagFS ul por tubo Eppendorf de 0 6 ml b A adir respectivamente 5 2 pl 1 0 4 ug del DNA a secuenciar pl smido de 3 4 kpb por tubo de reacci n para qu mica con AmpliTaq o AmpliTagFS v anse las tablas correspondientes c A adir una gota de cera fundida a 70 C en la pared interior de cada tubo para evitar la evaporaci n de la reacci n durante su amplificaci n lineal d Colocar los tubos en un ciclador t rmico DNA Thermal Cycler 480 Perkin Elmer Norwalk CT USA lt http www perkin elmer com gt precalentado a 96 C e Activar inmediatamente el siguiente perfil de PCR programa 67 96 C 30 segundos 50 C 15 segundos 60 C 4 minutos durante 25 ciclos Apagar autom ticamente programa 0 Shut Down f Purificar mediante columnas Sephadex G 50 o conservar a 20 C y purificar posteriormente En el caso de la qu mica con AmpliTagFS puede purificarse tambi n mediante precipitaci n del DNA con etanol ver m s adela
12. la referencia 3 200 00 de ATBiochem j Colocar de nuevo el bolsillo para cerrar la zona donde se encuentra el prepeine colocar tres pinzas sobre el mismo y dejar el sandwich en posici n horizontal Nota conviene aislar al m ximo la zona superior del gel del aire ya que el ox geno es un inhibidor de la polimerizaci n de la acrilamida k Guardar el gel a temperatura ambiente Usar el gel despu s de 2 h y antes de 24 h 16 ATENCI N es muy importante usar geles que tengan entre 2 y 24 horas para conseguir resultados ptimos No obstante el mismo gel puede reutilizarse con resultados inferiores para varias electroforesis siempre que se eliminen los restos de la electroforesis precedente ATENCI N en invierno suele suceder un fen meno curioso en laboratorios no climatizados sin calefacci n central Este fen meno ocurre t picamente cuando la temperatura baja a unos 15 C y tiene tres efectos o consecuencias En primer lugar la urea suele polimerizar mientras se est filtrando la mezcla que la contiene junto con las acrilamidas y el TBE El problema se resuelve calentando la mezcla a 37 C durante 5 10 min En segundo lugar el gel no polimeriza bien Aunque aparentemente est perfecto al hacer la electroforesis aparecen bandas gruesas en posiciones no esperadas y otras distorsiones extra as que parecen debidas a interferencias de los sistemas ptico electr nicos del secuenciador autom tico En re
13. o m s horas r Conectar los cables el ctricos de las cubetas superior e inferior 6 9 Preparaci n del secuenciador Macintosh a Enciende el Mac pulsando la tecla de arranque situada en el extremo superior derecho del teclado b Desactiva todos las extensiones del sistema que no sean estrictamente necesarias para el software de recogida y an lisis de datos del 373 Stretch Para ello accede al bot n CC ConflictCatcher de la barra principal de men s y selecciona Set this BEFORE a run Nota aunque no es absolutamente necesario la inactivaci n de las extensiones del sistema p ej antivirus protectores de pantalla red etc elimina posibles riesgos de conflicto y ca da del sistema c Introduce los iconos alias Data Collection y Sequence Analysis que est n sobre el escritorio en la carpeta Items Arranque Mete o saca aqu que es en realidad un alias de la carpeta Items de Arranque situada en la carpeta del sistema del Mac Nota mediante este paso se consigue que arranquen autom ticamente los programas Data Collection y Sequence Analysis despu s de un eventual corte del flujo el ctrico d opcional Usa un destornillador para girar a derechas y meter el tornillo situado en la parte derecha trasera del Mac Se trata en realidad de un interruptor El Mac debe reiniciarse en ese momento arrancando autom ticamente las aplicaciones Data Collection y Sequence An
14. pocillos La pantalla cambiar a 34 cn WTR Intrpt Timer Elapsed Volt mAmp Watt Temp Run 12 59 00 01 1524 21 32 40 0 a 48 cn WTR Intrpt Timer Elapsed Volt mAmp Watt Temp Run 17 59 00 01 2000 19 38 40 Nota el asterisco en el valor de Watt indica que la electroforesis se realiza a potencia constante La temperatura de electroforesis es de 40 C Los dem s valores de cada variable pueden oscilar algo respecto a los indicados arriba Nota para alterar las condiciones de electroforesis seleccionar Alter Run en el Main Menu 0 Desarrollar la electroforesis el tiempo necesario generalmente entre 7 13 18 horas Generalmente la electroforesis se lleva a cabo durante la noche p Activar Collect en el controlador de 373A Collection de la pantalla del Mac Este aparecer como una punta de flecha verde intermitente Tambi n puede activarse seleccionando Start Collecting del men Collect ATENCI N asegurarse que el 373 Stretch muestra un valor de potencia constante en la pantalla de LCD y que Collect est activado e intermitente en el Mac ATENCI N cerrar todas las ventanas de la pantalla del Mac excepto la del controlador q Oscurecer la pantalla del Mac para evitar su desgaste usar los controles situados en el lateral derecho del monitor r Colocar un papel encima del teclado del Mac indicando que se est pr
15. por ello muy c modos Basta colocar las reacciones de secuenciaci n en las placas microtiter y la m quina se encarga del resto Adem s son mucho m s r pidos y el operario no tiene que manipular directamente la acrilamida no hay que preparar gel Su inconveniente es que las lecturas obtenidas unas 500 bases con 99 de precisi n son menores que las que se consiguen mediante PAGE Adem s el costo por reacci n es aproximadamente el doble que el de los sistemas basados en gel ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Perkin Elmer AppliedBiosystems Fue el primer sistema comercial de secuenciaci n mediante electroforesis capilar Cada lectura es de unas 500 bases con un 99 de precisi n realiz ndose en 2 horas Procesa secuencialmente grupos de hasta 48 96 muestras La puesta apunto se lleva a cabo en 10 minutos funcionando despu s sin necesidad del operario Ya ha sido anunciado su sucesor probablemente llamado ABI PRISM 3100 que constar de 12 capilares en paralelo y ser comercializado en 1999 CEQ 2000 DNA Analysis System BeckmanCoulter Fullerton CA USA lt http www beckman com gt y lt http www beckmancoulter com gt Acaba de ser presentado y consta de 8 capilares que trabajan en paralelo secuenciando 8 muestras en 2 horas El sistema est automatizado pudiendo secuenciar hasta 96 muestras en 24 h sin intervenci n del usuario El tiempo requerido para configurar el sistema es de 10 minutos por programa de 2 a 24 h
16. s Manual Part number 903205 Rev A May 1994 Applied Biosystems Perkin Elmer Foster City CA USA lt http www perkin elmer com gt Manual de instrucciones del software Analysis del secuenciador autom tico 373 DNA Sequencer Stretch Clasificaci n PROTOCOLOS Applied Biosystems 1995 ABI Prism DNA Sequence Analysis Software User s Manual Part number 903436 Rev A January 1995 Applied 28 Biosystems Perkin Elmer Foster City CA USA lt http www perkin elmer com gt Manual de instrucciones del software Analysis del secuenciador autom tico 373 DNA Sequencer Stretch Clasificaci n PROTOCOLOS Applied Biosystems 1994 373 DNA Sequencing System User s Manual Part number 903204 Rev A June 1994 Applied Biosystems Perkin Elmer Foster City CA USA lt http www perkin elmer com gt Manual de instrucciones del secuenciador autom tico 373 DNA Sequencer Stretch Clasificaci n PROTOCOLOS Applied Biosystems 1994 SeqEd 675 DNA Sequence Editor User s Manual Part number 901415 Rev 1 00A August 1990 Applied Biosystems Perkin Elmer Foster City CA USA lt http www perkin elmer com gt Manual de instrucciones del software SeqEd del secuenciador autom tico 373 DNA Sequencer Stretch Clasificaci n PROTOCOLOS Applied Biosystems 1994 PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit Part number 401388 Rev A June 1994 Applied Biosystems Perki
17. tornillos superiores del soporte de alineamiento ver m s adelante En tal caso no podr a introducirse bien el peine que podr a romperse ATENCI N el peine debe introducirse de forma uniforme en toda su longitud Meterlo hasta que entre 0 5 mm en el gel de acrilamida Esta no debe combarse Nota existen peines con y sin numeraci n Generalmente es conveniente usar los provistos de numeraci n 0 Colocar el soporte de alineamiento Alignment brace o barra de metacrilato y apretar los dos tornillos laterales ATENCI N no apretar demasiado los tornillos podr a romperse el soporte de alineamiento Generalmente basta con que est n ligeramente apretados Nota usar un soporte de alineamiento sin numeraci n en el caso de que el peine estuviera marcado y viceversa p A adir 1X TBE a la cubeta superior hasta que quede 1 5 cm para llegar casi al borde Llegar hasta el borde para electroforesis de 18 o m s horas ATENCI N Comprobar que el electrolito no gotea En caso contrario apretar un poco m s los tornillos Si no dejara de gotear sacarlo con una jeringa o vaso de precipitados limpiar con papel de filtro retirar el sandwich 21 secar todo bien y volver a colocar el sandwich apretando bien los tornillos Repetir hasta que no gotee NUNCA ANADIR GRASA q A adir 1X TBE a la cubeta inferior hasta que quede 1 5 cm para llegar casi al borde Llegar hasta el borde para electroforesis de 18
18. 47 Secuenciaci n del DNA Gabriel Dorado P rez Departamento de Bioqu mica y Biolog a Molecular Campus Universitario de Rabanales Edificio Severo Ochoa 14071 C rdoba RESUMEN El denominado Proyecto del Genoma Humano iniciado en The Human Genome Workshop Santa Fe New Mexico EUA 1986 ha conseguido secuenciar los 3 x 10 pb del genoma humano en 15 a os 2001 Ello ha sido posible gracias a algunos avances t cnicos y mejoras de la t cnica empleada Lario et al 1997 No obstante a n no se sabe con certeza los genes que tenemos el conocimiento de la secuencia no implica el conocimiento de las zonas codificantes Paralelamente se han secuenciando los genomas de organismos modelo El objetivo es tratar de descifrar las claves del fenotipo y desarrollo de los seres vivos en base a su secuencia g nica Adem s ello permitir identificar genes implicados en la aparici n de enfermedades abriendo las puertas de su diagn stico precoz prevenci n terapia e incluso curaci n No obstante el porcentaje de organismos cuyo genoma se ha secuenciado es nfimo en comparaci n con los seres vivos de la Tierra Por tanto no estamos en la Era Posgen mica sino que este siglo ser una aut ntica Era Gen mica en el m s amplio sentido de la palabra Las t cnicas de secuenciaci n empleadas actualmente de forma rutinaria est n basadas en metodolog as publicadas en 1977 el m todo de Sanger y el de Maxam Gilbert siendo el pri
19. Rs m ltiples amplicones que no solapen aunque tengan diferente color al menos deben distanciarse en 3 pb Finalmente el tama o ideal del amplic n debe oscilar entre 130 y 150 pb En estos casos suele usarse como patr n interno de pesos moleculares el GeneScan 350 Tamra Perkin Elmer AppliedBiosystems 34 Nota es importante tener en cuenta que los oligos marcados con fosforoamiditas fluorescentes deben protegerse de la luz guardados en botes mbar o envueltos en papel de aluminio Nota para evitar la degradaci n de los oligos se recomienda alicuotar stos en peque as cantidades de forma que una misma muestra no se congele descongele m s de cinco veces Lo ideal es mantener los oligos que se vayan a usar en un a o o antes en peque os vol menes de forma que en 1 ul p ej de soluci n haya la cantidad necesaria por reacci n El resto debe guardarse seco a 20 C o menos 35
20. a adir azida s dica cuando la resina se va a utilizar el mismo d a es recomendable a adirla si se desea conservar la suspensi n sin que se contamine por bacterias Nota la azida s dica no interfiere con la detecci n en el secuenciador esto es no es necesario lavar la resina al preparar las columnas de purificaci n de las reacciones de secuenciaci n Fibra sint tica Perl n La fibra sint tica Perl n puede adquirirse en acuarios se usa para los filtros de las peceras Es mejor que la lana de vidrio ya que no es t xica y no adhiere cidos nucleicos Tabla 11 Fibra sint tica Perl n Lavar la fibra con agua destilada usar guantes Realizar tres ba os sucesivos Empaquetar en bolsas Esterilizar en autoclave Secar en estufa a 37 C durante toda la noche Guardar a temperatura ambiente Nota dependiendo del origen de la fibra puede no ser necesario lavarla ni esterilizarla previamente El lavado es necesario cuando la fibra presenta sustancias fluorescentes que pudieran interferir con el secuenciador La esterilizaci n es necesaria si la fibra est contaminada con nucleasas Soluci n formamida desionizada Desionizar la formamida en presencia de una resina de intercambio i nico como la Amberlite MB 1 Sigma USA Tabla 12 Soluci n formamida desionizada Para 1 ml Para 10 ml Formamida 1 ml 10 ml Amberlita 0 1g 1g Agitar con mosca magn tica durante 30 minutos F
21. a pella bajo vac o 5 min o mejor en estufa a 37 C 10 min Tambi n puede dejarse secar el tubo boca abajo a temperatura ambiente toda la noche e incluso d as Nota como se desprende de lo dicho los restos de etanol pueden eliminarse manteniendo el tubo boca abajo durante un tiempo dej ndolo escurrir sobre un papel absorbente coloc ndolo boca abajo u horizontal en una estufa a 37 C con la ayuda de un evaporador bajo vac o SpeedVac o incluso usando papel higi nico est ril o bastoncillos de papel o algod n est riles para eliminar manualmente las gotas e l quido que queden Seg n nuestra experiencia un secado prolongado al aire un d a consigue secuencias m s limpias con menos terminadores i Guardar a 20 C 12 Nota las muestras secadas de esta forma son estables durante meses 6 6 Purificaci n de productos eliminaci n de terminadores por precipitaci n con etanol protocolo 2 sin lavado Nota este m todo de purificaci n por precipitaci n con etanol sin lavado es el m s c modo aunque puede dejar trazas de terminadores que pudieran interferir con la detecci n Su eficiencia deber confirmarse emp ricamente por el investigador en cada caso a Para cada reacci n de secuenciaci n preparar un tubo Eppendorf de 1 5 ml que contenga 35 pl de etanol 95 b A adir todo el volumen de reacci n de secuenciaci n 20 pl Agitar mediante v rtex para mezclar bien Incubar en hielo picado du
22. ada para cada caso Las diferentes concentraciones de acrilamida y la longitud del gel se muestran en la tabla siguiente En esta pr ctica prepararemos un gel de 34 cm WTR Full Scan con 4 75 de acrilamida o un gel de 48 cm WTR Full Scan con 4 25 de acrilamida 13 Tabla 3 Tipos de geles soportados por el 373 Stretch Sequencer GeneScan Well To Read Tipo de Scan Concentraci n Volumen de WTR del gel gel a acrilamida preparar 6 GeneScan n 30 12 GeneScan n 40 24 Sequencer 6 00 60 Full Scan 24 Sequencer 4 75 60 BaseSprinter 34 Sequencer 4 75 80 Full Scan 34 Sequencer 4 25 80 BaseSprinter 48 Sequencer 4 00 100 Full Scan Estos datos han sido obtenidos del manual del 373Stretch suministrado por Perkin Elmer Algunos de ellos han sido mejorados como se indica en esta pr ctica Tablas 4 y 5 t Para GeneScan usar las concentraciones descritas en el manual GeneScan 672 Nota Well To Read WTR es la distancia recorrida por la muestra antes de ser detectada por el sensor en otras palabras es la distancia entre el fondo de los pocillos donde se deposita la muestra y la ventana de lectura del l ser detector Nota el modelo 373 Stretch presenta la ventana de lectura m s abajo que el modelo 373A previo incrementando el valor WTR para un cristal dado As los cristales previamente catalogados como de 24 cm para el 373A corre
23. alidad se deben a que la urea ha cristalizado en el interior de la matriz del gel inutiliz ndolo para su funci n Este problema se resuelve preparando y polimerizando el gel en una habitaci n a 220 C En tercer lugar los resultados de la secuenciaci n son tambi n extra os siendo debido a que en las condiciones de arriba baja temperatura el gel necesita 220 horas para polimerizar perfectamente Resumiendo todos estos efectos no deseados se eliminan preparando y polimerizando el gel a temperatura suave y dejando la polimerizaci n m s tiempo Tabla 5 Preparaci n del gel de secuenciaci n ingredientes separados 34 cm WTR 24 cm WTR 12 y 24 cm WTR BaseSprinter BaseSprinter FullScan y y 6 acrilamida 48 cm WTR 34 cm WTR FullScan FullScan 4 25 acrilamida 4 75 acrilamida Urea 239 239 239 40 acrilamida 19 1 4 914498 4 9 ml 5 489539 5 5ml 6 934155 6 9 ml Agua destilada milli Q 15 359502 15 4 ml 14 78446 14 8 ml 13 339845 13 3ml Amberlita 0 46 g 0 46 yg 0 46 yg Agitar con mosca en estufa a lt 37 C hasta disolver completamente 10 min Filtrar a trav s de membrana hidr fila nitrato de celulosa con 0 22 um poro Desgasificar bajo vac o en ba o ultrasonidos durante 5 minutos 10 APS fresco TEMED 3 ml 48 cm WTR hasta 46 ml 207 ulo 20 7 ulo 23 1 ul 48 cm WTR 5x TBE 9 24554 9 2 ml o 9 24554
24. alysis Nota mediante este paso se consigue que arranque el Mac despu s de un corte del flujo el ctrico De hecho en estas circunstancias es imposible apagar el Mac desde el men del escritorio Apagar Equipo Nota este paso puede eliminarse si se dispone de un SAI Sistema de Alimentaci n Ininterrumpida de 20 000 voltios y con una autonom a de media hora a pleno rendimiento y de 5 a seis horas cuando est conectado el 373Stretch s lo que es lo que sucede por ejemplo al dejar secuenciando durante la noche e Si no lo hubiera hecho reiniciar el Mac Acceder a Data Collection Seleccionar Settings del men Edit Teclear los datos requeridos duraci n de electroforesis matriz a usar Instrument File tipo de peine empleado y qu mica terminadores cebadores Marcar con una X la opci n Analyze all samples No seleccionar el resto de opciones Plot Raw Data Plot Analyzed Data 22 f Abrir New Sample Sheet del men File Rellenar la hoja con los datos requeridos nombre de la muestra comentarios y qu mica Los auto settings se autoconfiguran como su nombre indica S lo hay que tener en cuenta que si en un carril se escribe algo y luego se deja vac o conviene ir a auto settings y borrar la X de automatic analysis que el Mac habr puesto autom ticamente g El Mac ya est listo para recoger datos s lo hace falta activar Collect ver m
25. az n de 15 pl por tubo Asumiendo un error del 5 ello supone 0 75 Ml de error por cada pipeteo Para garantizar que el ltimo tubo tambi n recibe sus correspondientes 15 ul de mezcla de reacci n puede incrementarse el volumen total de la mezcla madre en 0 75 ul por cada pipeteo que se vaya a hacer de la misma entre llaves en la tabla anterior Dicho con otras palabras un tubo ser an 15 pl 2 tubos ser an 30 0 75 x 2 31 5 ul lo cual supone multiplicar la primera columna por 2 1 3 tubos ser an 45 0 75 x 3 47 25 pl lo cual supone multiplicar la primera columna por 3 15 4 tubos ser an 60 0 75 x 4 63 ul lo cual supone multiplicar la primera columna por 4 2 y 5 tubos ser an 75 0 75 x 5 78 75 lo cual supone multiplicar la primera columna por 5 25 Tabla 2 Reacci n de secuenciaci n ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit con AmpliTagFS Para Para Para Para Para 1 clon 2 clones 3 clones 4 clones 5 clones e o ue 6 ul 12 pl 12 6 18 ul 18 9 24 pul 25 2 30 ul 31 5 Terminator Premix 8 ul 16 ul 16 8 24 ul 25 2 32 pl 33 6 40 pl 42 21M13 Forward Primer 4 ul 8 ul 8 4 112 pl 12 6 16 ul 16 8 20 pl 21 0 8 pmol pl 3 2 pmol 6 4 pmol 9 6 pmol 12 8 pmol 16 pmol Mezclar bien y a adir a raz n de 18 ul por tubo Eppendorf de 0 6 ml dsDNA de 3 4 Kpb 0 2 ug l 2 ul 0 4 ug por tubo de reacci n
26. btenido y purificado el DNA recombinante puede procederse a su secuenciaci n Para ello emplearemos el secuenciador autom tico 373 Stretch PerkinElmer AppliedBiosystems 6 1 Metodolog a general El 373 Stretch ofrece la posibilidad de emplear diferentes qu micas y estrategias de secuenciaci n En nuestro caso usaremos el ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit de terminadores ste utiliza la enzima AmpliTagFS sustituyendo al PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing y al Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing que usaban la AmpliTaq o la AmpliTagCS La mezcla de reacci n contiene entre otros componentes la DNA polimerasa termoestable p ej AmpliTagFS ANTP y ddNTP marcados con cuatro fluor foros diferentes terminadores La DNA polimerasa termoestable copiar el DNA molde partiendo de cebadores universales que aparean con secuencias del vector o espec ficos de la secuencia clonada En la reacci n de PCR asim trica lineal no exponencial que se repite 25 veces en un ciclador t rmico se sintetizan cadenas de ssDNA de diferentes longitudes terminadas con un ddNTP fluorescente El exceso de terminadores fluorescentes libres se elimina mediante columnas de exclusi n molecular o por precipitaci n del DNA en etanol A continuaci n las muestras se secan y se almacenan en congelador o se disuelven en la soluci n de carga y se someten a electroforesis detecci n y
27. con el ABI 373 Stretch DNA Sequencer Soluci n stock coloreada La soluci n stock coloreada consta de Na EDTA y azul dextrano Tabla 15 Soluci n stock coloreada Para 1 ml Para 10 ml Na2 EDTA 50 mM pH 8 1 mil 10 ml Azul dextrano 0 03 g 0 3 g Mezclar Guardar a 20 C Nota otros protocolos usan 50 mg en vez de 30 mg de dextrano azul por cada ml de soluci n stock coloreada para dar una tonalidad m s fuerte Soluci n de carga con colorante La soluci n de carga con colorante consta de Tabla 16 Soluci n de carga con colorante 33 Para 6 ul Para 6 ml ul mi Formamida desionizada 5 5 Soluci n stock coloreada 1 1 Mezclar Guardar a 20 C Nota la utilizaci n de soluci n de carga con o sin colorante s lo depende de las preferencias del usuario Facilita la carga de las muestras al hacerlas visibles y no afecta la detecci n por parte del secuenciador autom tico Es por ello muy recomendable al menos para los que se inician en la t cnica de secuenciaci n en gel Almacenamiento de oligos Es importante realizar un almacenamiento correcto de los oligos ya que ello permitir una mayor vida til de los mismos En general las empresas garantizan stos durante un a o pero es sabido que su vida til puede ser significativamente mayor si se almacenan correctamente o menor en caso contrario El mejor m todo para almacenar o
28. dorf de 1 5 ml que contenga 2 ul de acetato de sodio 3M pH 4 6 y 50 pl de etanol 95 b A adir todo el volumen de reacci n de secuenciaci n 20 pl Agitar mediante v rtex para mezclar bien Incubar en hielo picado durante 10 min Nota la incubaci n en hielo es importante para favorecer la precipitaci n de los fragmentos de DNA m s peque os Si se incubara m s de 24 h se incrementar a tambi n la precipitaci n de terminadores Algunos protocolos recomiendan incubar a temperatura ambiente en vez de en hielo picado deber ser determinado por el investigador seg n las condiciones ambientales de su laboratorio c Centrifugar a m xima velocidad 16 000 g durante 15 30 min p ej 20 min d Decantar o aspirar con sumo cuidado el sobrenadante Eliminar todo el sobrenadante o sea terminadores que sea posible con cuidado de no perder la pella Para ello dejar drenar boca abajo sobre papel de filtro Nota a veces la pella puede ser dif cil de ver a simple vista e Lavar la pella a adiendo 250 pul de etanol 70 Algunos protocolos usan etanol fr o sacado del congelador a 20 C f opcional Centrifugar a m xima velocidad 16 000 g durante 15 30 min Otros protocolos indican 5 min g Decantar o aspirar con sumo cuidado el sobrenadante Eliminar todo el sobrenadante que sea posible con cuidado de no perder la pella Para ello dejar drenar boca abajo sobre papel de filtro h Acabar de secar l
29. e el estado del Proyecto del Genoma Humano puede consultarse The Genome Database GDB disponible en la siguiente direcci n de InterNet lt http gdbwww gdb org gt 2 PRINCIPIO EN QUE SE BASA LA SECUENCIACI N DEL DNA Las t cnicas de secuenciaci n empleadas actualmente de forma rutinaria est n basadas en metodolog as publicadas en 1977 el m todo de Sanger y el de Maxam Gilbert siendo el primero el m s popular Ambos se basan en la generaci n de una poblaci n de mol culas marcadas radiactivamente que representan todos los tama os y combinaciones posibles El producto de cada una de las cuatro reacciones se somete en cuatro carriles independientes a electroforesis en gel de poliacrilamida y se revela siguiendo los m todos cl sicos de autorradiograf a Las manchas aparecidas indican la bases presentes en cada posici n de la secuencia El m todo de Maxam Gilbert se basa en la rotura qu mica de DNA de cadena sencilla ssDNA cuyo extremo 5 est marcado radiactivamente Las roturas se realizan de forma controlada y espec fica Controlada esto es limitada para que se genere una poblaci n de fragmentos con todas las posibles combinaciones y longitudes Espec fica rompiendo la cadena nucleot dica de cuatro formas diferentes en C en C o T en G y finalmente en GoA El procedimiento de Sanger emplea una DNA polimerasa que copia la cadena molde a ssDNA en presencia de una mezcla de reacci n que contiene los cuatr
30. ectrolito por si fuera necesario desmontar el sistema para su limpieza ver m s adelante 0 Cerrar la c mara de electroforesis 6 8 Preparaci n del secuenciador 373 Stretch a Levantar el interruptor Circuit Breaker del transformador del secuenciador colocado a la derecha del mismo b Una vez realizado este paso y s lo entonces pulsar el interruptor general del secuenciador situado en la parte izquierda frontal abajo El secuenciador debe ponerse en marcha Nota si el secuenciador no se pusiera en marcha apagar la m quina y el transformador comprobar que el magnetot rmico situado en una caja en la pared se encuentra activado y que hay corriente en la l nea Volver al apartado a Tras arrancar la m quina y despu s de un minuto y 35 segundos la pantalla de cristal l quido del secuenciador se debe activar mostrando el estado del mismo ABI DNA SEQUENCER VER 2 10 Press Main Menu to begin c Presionar Main Menu La pantalla mostrar Set up Start Choose Self Cali Run Pre run Run Test bration d Comprobar el tipo de filtro seleccionado en la m quina Para ello presionar Calibration Configure y more Debe obtenerse la siguiente lectura Filter sequence 531 560 580 610 Set A change more En caso contrario deber verse Filter sequence 531 545 560 580 Set B change more
31. endable Clasificaci n TEOR A DIVULGATIVO Nota las referencias fundamentales para la preparaci n de la sesi n se indican con el s mbolo AGRADECIMIENTOS Proyecto PAFPU FORMAPROFE UCO N 031 de Formaci n del Profesorado Universitario Junta de Andaluc a ANEXO 1 MEDIOS SOLUCIONES Y MATERIAL BIOL GICO EMPLEADO Pesar y a adir las cantidades que se indican en las tablas correspondientes disolver previamente en agua en el caso de que se desee repartir entre botes y esterilizar en autoclave autoclavar a 120 C y 1 bar 1 kg cm de presi n durante 20 minutos ATENCI N comprobar que el autoclave tiene agua en el fondo En caso contrario a adir agua destilada hasta la rejilla del fondo de la m quina Asimismo comprobar que las salidas de agua y de aire se encuentran cerradas Si no se toman estas precauciones podr a quemarse el autoclave ATENCI N como norma general no se deben autoclavar soluciones concentradas de cidos clorh drico sulf rico o lcalis NaOH Como es obvio estas soluciones son est riles per se Adem s pueden da ar la estructura de acero del autoclave Tampoco se autoclavan soluciones concentradas ni diluidas de disolventes org nicos acetona tolueno ter metanol etanol etc En estos casos se autoclava la soluci n sin el disolvente org nico vol til ste se a ade posteriormente cuando la temperatura de la muestra es igual a la ambiente En caso c
32. entre diez y cien veces Como ejemplo podr a citarse secuenciadores autom ticos con cientos o incluso miles de capilares en fase de desarrollo por Perkin Elmer AppliedBiosystems Por otra parte se est investigando en tecnolog as radicalmente diferentes cuyo objetivo es alcanzar rendimientos entre cien y mil veces superiores a los disponibles con las t cnicas actuales Cabe destacar las basadas en la secuenciaci n de mol culas nicas de DNA La mayor parte de estos proyectos representan secretos industriales por lo que su estado actual de desarrollo es desconocido 5 PREPARACI N DEL DNA RECOMBINANTE Nota como es habitual la manipulaci n del material biol gico debe realizarse bajo las oportunas medidas de esterilidad a fin de evitar contaminaciones y degradaci n de las muestras El DNA a secuenciar fragmento amplificado del gen araA de Salmonella typhimurium fue previamente insertado en el vector pGEM 5Zf o pBluescript SK y clonado en Escherichia coli DH5aF El primer paso para secuenciar dicho DNA es la purificaci n y cuantificaci n del mismo Para ello se han empleado los kits QlAprep Spin Miniprep o Magic Miniprep purificaci n y DNA DipStick o espectrofotometr a cuantificaci n seg n se ha descrito detalladamente en las Sesiones 9 a 13 Clonaci n del DNA amplificado mediante PCR y 14 a 15 Purificaci n y an lisis del DNA recombinante 6 SECUENCIACI N Una vez o
33. es de diferencia de potencial y amperaje proporcionalmente como es sabido W V Amp g Activar Start Pre run en la pantalla del Main Menu y luego Plate Check Tras unos segundos el l ser comenzar a funcionar y el secuenciador enviar al Mac datos correspondientes a cuatro barridas usando los cuatro filtros previamente seleccionados Nota en este momento el Mac debe estar activo y con la aplicaci n Data Collection en pantalla ver m s abajo h Activar Scan en la pantalla del Mac Aparecer un sistema de coordenadas cuyo eje Y representa el valor de la fluorescencia inducida por el l ser mientras que el eje X corresponde a la anchura del gel i Aparecer n cuatro l neas de colores que representan la respuesta del sensor a cada uno de los filtros empleados Colocar la punta de la flecha del cursor rat n tocando la l nea cuyo valor de Y sea menor generalmente corresponde con el color azul El valor de Y debe estar entre 800 y 1000 aparece en el margen inferior izquierdo de la ventana En caso contrario debe incrementarse o reducirse el voltaje del fotomultiplicador Nota el valor de Y suele incrementar un poco una vez que la m quina se calienta Conviene pues dejar el Scan funcionando durante unos cinco minutos para asegurarse de que la lectura es correcta j Para alterar el valor del fotomultiplicador presionar Calibration en la pantalla del Main Menu aparece
34. gue recuperar la pr ctica totalidad de la reacci n de secuenciaci n ya que el agua a adida sobre la cera acaba lavando el fondo del tubo al ser succionada por la pipeta g Aplicar lentamente y con sumo cuidado la soluci n conteniendo la reacci n de secuenciaci n al centro de la resina Sephadex G 50 contenida en la jeringa ATENCI N es muy importante que la resina Sephadex G 50 no se seque en las columnas En caso contrario no se eliminar an completamente los terminadores Evitar por consiguiente dejar las columnas rellenas al aire durante mucho tiempo Si fuera necesario stas pueden almacenarse a 4 C en un vaso de precipitados herm ticamente cerrado y provisto de un fondo de agua para mantener la humedad ATENCI N es muy importante aplicar las muestras en el centro de la resina contenida en la jeringa Asimismo el flujo debe ser lo suficientemente bajo como para permitir que el l quido sea absorbido por la resina sin llegar a drenar hacia el espacio entre el cilindro de resina y la pared de pl stico de la jeringa Si ello sucediera los terminadores que contuviera no ser an retenidos por la resina contaminando la muestra h Centrifugar las columnas a 1000g durante 1 minuto en la centr fuga basculante previamente utilizada 1 Eliminar las columnas y recoger en tubos Eppendorf nuevos de 0 6 1 5 ml el l quido drenado que debe contener las muestras purificadas Nota para sacar los tubos Eppendorf cortados
35. ichas mol culas pueden acoplarse a un anticuerpo para producir una reacci n quimioluminiscente o coloreada Las bandas generadas se interpretan como en el caso de los sistemas cl sicos radiactivos Estos sistemas pueden complementarse con el uso de nuevas enzimas como la ThermoSequenase equivalente a la AmpliTaqFS descrita m s abajo y los cebadores y terminadores fluorescentes DYEnamic ET de transferencia de energ a desarrollados por AmershamPharmacia Biotech Uppsala Suecia lt http www apbiotech com gt producto de la fusi n entre AmershamLifeSciences Little Chalfont Reino Unido lt http www amersham co uk gt lt http www amersham com gt lt http www nycomed amersham com gt y PharmaciaBiotech Uppsala Suecia lt http www biotech pharmacia se gt Entre los sistemas automatizados no radiactivos existen b sicamente dos opciones la electroforesis en gel de poliacrilamida y la electroforesis capilar 3 1 Basados en electroforesis en gel de poliacrilamida PAGE La ventaja principal de los sistemas de secuenciaci n basados en la electroforesis de geles de poliacrilamida PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis es que permiten leer un mayor n mero de bases El l mite actual para geles de unos 90 cm es de unas 1400 bases con un 99 de precisi n Su principal inconveniente es que son tediosos hay que preparar el gel limpiar los cristales y cargar manualmente las muestras lentos y entra an
36. ida FullScan FullScan pre mezcla con 4 25 acrilamida pre mezcla con 4 75 acrilamida Pre mezcla con 4 25 acrilamida 46 ml Pre mezcla con 4 75 acrilamida 46 mil Pre mezcla con 6 00 acrilamida 46 ml 10 APS fresco 230 pl 230 ul 230 ul Mezclar agitando MUY suavemente Verter entre los cristales Utilizar despu s de 2 h y antes de 24 h como se indica en el texto las pre mezclas al 4 25 4 75 6 00 constan de todos los componentes del gel excepto el APS b Seg n se indica en la tabla siguiente pesar 23 g de urea a adir 5 5 34 cm WTR o 4 9 48 cm WTR ml de 40 acrilamida 19 1 y 14 4 34 cm WTR o 14 8 48 cm WTR ml de agua c A adir 0 46 g de una resina de intercambio i nico Amberlita d Calentar suavemente no m s de 37 C y agitar con mosca hasta disolver completamente 10 min e Filtrar a trav s de una membrana hidrof lica con 22 um de di metro de poro f Desgasificar bajo vac o en ba o de ultrasonidos durante 5 minutos 9 A adir 9 3 34 cm WTR o 9 2 48 cm WTR ml de 5x TBE y 1 15 34 cm WTR o 3 48 cm WTR ml de agua volumen final 46 ml h A adir los activadores de la polimerizaci n de la acrilamida 207 34 cm WTR o 231 48 cm WTR pl de APS fresco con menos de una semana y 20 7 34 cm WTR o 23 1 48 cm WTR de TEMED N N N N Tetramethyle
37. iltrar a trav s de membrana hidr fila nitrato de celulosa con 0 22 um Y poro Guardar a 20 C Soluci n 50 mM EDTA pH 8 La soluci n de la sal dis dica del cido etilendiamino tetraac tico ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt se prepara como sigue 32 Tabla 13 Soluci n 50 mM EDTA pH 8 Para 10 ml Para 100 ml Na2 EDTA PM 372 2 0 19 g 1 86 g Agua destilada milli Q 8 ml 80 ml Disolver con mosca ajustar pH a 8 con una soluci n saturada de NaOH y llevar volumen final a 10 100 mi respectivamente Esterilizar en autoclave Guardar a temperatura ambiente Nota tambi n puede usarse EDTA cido libre PM 292 25 En tal caso se a adir n 0 146 y 1 46 g respectivamente para preparar 10 y 100 ml Adem s ser preciso a adir sosa para conseguir la disoluci n del cido libre Realmente generalmente siempre se usa la sal dis dica cuando se dice o escribe EDTA pr cticamente en todos los casos se hace referencia a su sal dis dica Ser a m s correcto escribir Naz EDTA Soluci n de carga sin colorante La soluci n de carga sin colorante consta de Tabla 14 Soluci n de carga sin colorante Para 6 ul Para 6 ml pl mi Formamida desionizada 5 5 Na2 EDTA 50 mM pH 8 1 1 Mezclar Guardar a 20 C Nota con el modelo ABI Prism 377 DNA Sequencer se usa EDTA 25 mM en vez de 50 mM empleado
38. inting generados mediante GeneScan Genotyper Para convertir los datos de fingerprinting generados mediante GeneScan en genotipos y rboles geneal gicos Finalmente las secuencias generadas pueden ser tambi n analizadas con el paquete LaserGene DNAStar Madison WI USA seg n se coment en la Sesi n 1 En esta pr ctica realizaremos un an lisis de restricci n de la secuencia obtenida mediante MapDraw as como una comparaci n de la misma frente a la base de datos GeneMan EMBL mediante GeneMan cuyo resultado debe ser el oper n araBAD de Salmonella typhimurium y m s espec ficamente una porci n del gen araA Finalmente puede realizarse una comparaci n de ambas secuencias mediante Align o MegAlign 7 BIBLIOGRAF A COMENTADA Applied Biosystems 1996 Comparative Sequencing Applied Biosystems Perkin Elmer Foster City CA USA lt http www perkin elmer com gt Libro sobre las diferentes estrategias de secuenciaci n fluorescente con los equipos 310 373 y 377 Clasificaci n TEOR A ESPEC FICO Applied Biosystems 1995 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit Part number 402078 Rev A August 1995 Applied Biosystems Perkin Elmer Foster City CA USA lt http www perkin elmer com gt Manual de instrucciones del kit de secuenciaci n mediante terminadores PRISM y AmpliTaqFS Clasificaci n PROTOCOLOS Applied Biosystems 1994 373 DNA Sequence Analysis Software User
39. iochemistry 247 30 33 Optimizaci n del protocolo de secuenciaci n para 373 Stretch Clasificaci n TEOR A ESPEC FICO Maxam AM Gibert W 1977 A new method of sequencing DNA Proc Natl Acad Sci USA 74 560 564 Descripci n del protocolo de secuenciaci n mediante degradaci n qu mica de Maxam Gilbert Clasificaci n TEOR A ESPEC FICO Promega 2005 Magic Minipreps DNA Purification System Plasmid Miniprep Instructions for isolating plasmid DNA from bacteria Catalog number A7100 Promega Madison WI USA lt http www promega com gt Manual de instrucciones del kit Magic Miniprep Clasificaci n PROTOCOLOS 29 Sambrook J Russell D 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd edition Vols 1 3 New York CSH Laboratory Press Manual de protocolos La Biblia cl sica del Bi logo Molecular Clasificaci n PROTOCOLOS Sanger F Nicklen S Coulson AR 1977 DNA Sequencing with chain terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci USA 74 5463 5467 Descripci n del protocolo de secuenciaci n mediante an logos de nucle tidos didesoxinucle tidos o de Sanger Clasificaci n TEOR A ESPEC FICO Watson JD Gilman M Witkowski J Zoller M 1992 Recombinant DNA New York Freeman and Company Divulgativo y a la vez con nivel y rigor cient fico Cl sico sobre Ingenier a Gen tica y sus aplicaciones Claro did ctico y con numerosos esquemas e ilustraciones explicativas Muy recom
40. l ha estado previamente en contacto con la goma basta a adir agua y comprobar si sta corre libremente cristal virgen o forma una l nea a 1 cm del borde del cristal cristal con goma Nota para facilitar el vertido del gel ver m s adelante preparar un bolsillo en la apertura del sandwich con cinta amarilla o blanca Nota a continuaci n se describe la receta para preparar un gel de secuenciaci n Actualmente es posible comprar soluciones pre mezcladas que simplifican mucho su preparaci n Una de ellas que usaremos en esta sesi n es la denominada Gel Mix 4 25FA Sequencing Gel Solution de Life Technologies antes GibcoBRL Rockville MD USA lt http www lifetech com gt Consta de acrilamida 4 04 p v bis acrilamida 0 21 p v urea 6 M tris borato 89 mM Na2 EDTA 2 2 mM TEMED 3 7 mM Se presenta en forma de soluci n de modo que para convertirla en gel s lo es necesario a adir 5 ul de persulfato am nico APS al 10 p v por cada ml de gel preparado Este protocolo se resume en la tabla siguiente y sustituye los apartados a a h y la Tabla 5 que se mantienen como referencia o por si se desea preparar un gel en ausencia de la pre mezcla comercial Tabla 4 Preparaci n del gel de secuenciaci n ingredientes pre mezclados 34 cm WTR 24 cm WTR 12 y 24 cm WTR BaseSprinter BaseSprinter FullScan y y pre mezcla con 48 cm WTR 34 cm WTR 6 acrilam
41. ligos es sec ndolos en una centr fuga evaporadora SpeedVac o mejor mediante liofilizaci n Luego se guardan a temperatura ambiente o mejor congelados a 20 C o menos Los oligos tambi n son estables en una soluci n de 5 de acetonitrilo y 20 C no llegan a congelar Algunas empresas los suministran de sta forma Aunque esta concentraci n de acetonitrilo es soportada en la PCR generalmente se elimina por desecaci n o liofilizaci n y se procede como se indica en el apartado anterior o posterior El siguiente m todo por orden de estabilidad es disueltos en agua destilada oligos sin marcar biotinilados o fosforilados o disueltos en TE pH 8 oligos marcados con fosforoamiditas fluorescentes de Perkin Elmer Rox Tamra 6 Fam Hex Tet etc Nota las fosforoamiditas para marcar oligos suelen ser Rox rojo Tamra rojo 6 Fam azul Hex amarillo y Tet verde Rox y Tamra suelen reservarse para los est ndares internos de peso molecular Estos fluor foros pueden usarse con la qu mica de cebadores marcados para secuenciaci n o bien en GeneScan La experiencia indica que Tet es el que m s r pidamente se degrada y el que da m s problemas de fondo sobre todo en presencia de otros en PCRs m ltiples 6 Fam da m s se al que Hex siendo ambas buenas opciones para PCRs m ltiples Otra lecci n de la experiencia es que en el caso de an lisis con GeneScan deben elegirse en las PC
42. mente se han secuenciando los genomas de organismos modelo tales como la bacteria Escherichia coli 3 x 10 pb la levadura Saccharomyces cerevisise 14 x 10 pb el nem todo Ceenorhabditis elegans 80 x 10 pb la mosca de la fruta Drosophila melanogaster 165 x 10 pb y el rat n dom stico Mus musculus 3 x 10 pb entre otros El estado de estos y otros proyectos de secuenciaci n puede comprobarse en el NCBI de EUA lt http www ncbi nlm nih gov Entrez Genome org html gt El objetivo es tratar de descifrar las claves del fenotipo y desarrollo de los seres vivos en base a su secuencia g nica C mo a partir de un vulo fecundado puede generarse y diferenciarse un organismo adulto con m s de 10 c lulas Adem s ello permitir identificar genes implicados en la aparici n de enfermedades abriendo las puertas de su diagn stico precoz prevenci n terapia e incluso curaci n En otras palabras el Proyecto del Genoma no es un fin en s sino una v a para conocer y entender la vida en nuestro planeta sus or genes evoluci n los misterios del desarrollo fisiolog a comportamiento e interacciones con el medio ambiente No obstante el porcentaje de organismos cuyo genoma se ha secuenciado es nfimo en comparaci n con los seres vivos de la Tierra Por tanto no estamos en la Era Posgen mica sino que este siglo ser una aut ntica Era Gen mica en el m s amplio sentido de la palabra Para obtener informaci n actualizada sobr
43. mero el m s popular Ambos se basan en la generaci n de una poblaci n de mol culas marcadas radiactivamente que representan todos los tama os y combinaciones posibles En este cap tulo se describir n las diferentes metodolog as y en especial las variaciones del m todo de Sanger T tulo corto 60 caracteres como m ximo Secuenciaci n del DNA clonado Palabras clave acrilamida cebadores didesoxinucle tidos fluorescencia inducida por l ser fluorograma gel terminadores Abreviaturas empleadas APS persulfato de amonio CE electroforesis capilar ddNTP didesoxinucle sido trifosfato DNA cido desoxirribonucleico dNTP desoxinucle sidos trifosfato LB medio rico Luria Bertani Na2 EDTA sal dis dica del cido etil n diamino tetra ac tico PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida PCR reacci n en cadena de la polimerasa PM peso molecular SDS dodecil sulfato s dico WTR distancia del pocillo a la zona de lectura 1 INTRODUCCI N Y OBJETIVOS El denominado Proyecto del Genoma Humano iniciado en The Human Genome Workshop Santa Fe New Mexico EUA 1986 ha conseguido secuenciar los 3 x 10 pb del genoma humano en 15 a os 2001 Ello ha sido posible gracias a algunos avances t cnicos y mejoras de la t cnica empleada Lario et al 1997 No obstante a n no se sabe con certeza los genes que tenemos el conocimiento de la secuencia no implica el conocimiento de las zonas codificantes Paralela
44. n Elmer Foster City CA USA lt http www perkin elmer com gt Manual de instrucciones del kit de secuenciaci n mediante terminadores PRISM y AmpliTaq Clasificaci n PROTOCOLOS Ausubel FM Brent R Kingston RE Moore DD Seidman JG Smith JA Struhl K eds 2005 Current Protocols in Molecular Biology Vols 1 a 4 New York Greene amp John Wiley New York Manual de protocolos La nueva Biblia del Bi logo Molecular actualizada trimestralmente Clasificaci n PROTOCOLOS Brown TA ed 1991 Molecular Biology LabFax Oxford Bios Scientific Publishers Blackwell Scientific Publications Compendio de datos tiles en biolog a molecular Clasificaci n DATOS Cooper NG 1994 The Human Genome Project Deciphering the Blueprint of Heredity Mill Valley USA Divulgativo y a la vez con nivel y rigor cient fico Explica exhaustivamente el Proyecto del Genoma Humano y aspectos relacionados Interesante e instructivo Recomendable Clasificaci n TEOR A DIVULGATIVO DNAStar 2005 LaserGene for the Macintosh and PowerMacintosh User s Manual DNAStar Madison WI USA lt http www dnastar com gt Manual de instrucciones del paquete de software de biolog a molecular LaserGene Clasificaci n PROTOCOLOS Lario A Gonz lez A Dorado G 1997 Automated laser induced fluorescence DNA sequencing equalizing signal to noise ratios significantly enhances overall performance Analytical B
45. n posici n vertical el cristal al que se encuentra adherido y enrollarlo hacia abajo con un poco de papel Lavar con agua del grifo primero y destilada despu s los cristales separadores peine y cubetas de electroforesis Dejarlos escurrir en el soporte de pl stico apropiado ATENCI N No usar esp tulas con secci n corta pues romper an el cristal Emplear esp tulas de alba il con al menos 5 cm de hoja ATENCI N colocar una bayeta o mejor una alfombrilla de caucho o goma en el fondo y lateral del fregadero donde se limpien los cristales para evitar romperlos f Secar y cerrar la c mara de electroforesis 6 12 Post secuenciaci n Macintosh Proceder de forma inversa a como se ha descrito anteriormente a Activa las extensiones del sistema Para ello accede al bot n CC ConflictCatcher de la barra principal de men s y selecciona Set this AFTER a run 26 Nota este paso es esencial por ejemplo para poder imprimir los resultados de la electroforesis b Sacar los iconos alias Data Collection y Sequence Analysis de la carpeta Items Arranque Mete o saca aqu y dejarlos en el escritorio Nota mediante este paso se evita que los programas Data Collection y Sequence Analysis arranquen autom ticamente cada vez que se encienda el Mac c en su caso Usar un destornillador para girar a izquierdas y sacar el tornillo situado en la parte derecha trasera del Mac
46. nte Tabla 1 Reacci n de secuenciaci n PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator con AmpliTaq Para Para Para Para Para 1 clon 2 clones 3 clones 4 clones 5 clones Agua destilada milli O hasta 20 pl 1 5 ul 3 ul 3 15 4 5p1 4 725 6 ul 6 3 7 5 pl 7 875 Terminator Premix 95ul 19 yl 19 95 28 5 ul 29 925 38 pl 39 9 47 5 ul 49 875 21M13 Forward 4 ul 8 ul 8 4 12 ul 12 6 16 pl 16 8 20 pl 21 Primer 0 8 pmol ul 3 2 pmol 6 4 pmol 9 6 pmol 12 8 pmol 16 pmol Mezclar bien y a adir a raz n de 15 ul por tubo Eppendorf de 0 6 ml dsDNA de 3 4 Kpb 0 2 ug pl 5 ul 1 ug por tubo de reacci n El volumen de reacci n debe ser ahora de 20 yl A adir una gota de cera fundida a 70 C en la pared de cada tubo Colocar en ciclador t rmico precalentado a 96 C Elegir el programa apropiado para realizar los siguientes 25 ciclos programa 67 96 C 30 segundos 7 50 C 15 segundos 60 C 4 minutos Apagar autom ticamente programa 0 Shut Down Purificar mediante columnas Sephadex G 50 o conservar a 20 C Nota como es sabido al pipetear se cometen errores Por una raz n misteriosa al repartir soluciones madre entre los tubos hijos nunca sobra y lo que es peor no suele haber suficiente reactivo para el ltimo tubo Veamos un truco para evitar este problema En la tabla anterior se reparte la mezcla madre a r
47. o desoxinucle sidos trifosfato ANTP y una peque a cantidad de un didesoxinucle sido trifosfato ddNTP que es un an logo del primero El an logo se diferencia del dNTP normal en que el carbono 3 de la desoxirribosa tambi n presenta al igual que el 2 un H en vez de OH Se llevan a cabo cuatro reacciones en paralelo cada una de las cuales contiene un ddNTP ddATP ddCTP ddGTP ddTTP respectivamente La DNA polimerasa es capaz de incorporar el an logo en la cadena que se sintetiza pero como ste carece de extremo 3 OH dicha enzima es incapaz de unirle el siguiente nucle tido y por consiguiente se termina la reacci n Es por ello que esta t cnica recibe tambi n el nombre de terminaci n de dides xidos y los ddaNTPs suelen denominarse terminadores 3 SISTEMAS COMERCIALES NO RADIACTIVOS Recientemente se han desarrollado m todos no radioactivos para secuenciar cidos nucleicos que generan resultados comparables e incluso superiores a los producidos con is topos Incluyen sistemas manuales y automatizados Los sistemas manuales no radiactivos son similares a los isot picos con la diferencia de que emplean marcadores como la digoxigenina de BoehringerMannheim Biochemicals Mannheim Alemania lt http www boehringer mannheim com gt y lt http biochem boehringer mannheim com gt ahora parte de Roche Molecular Biochemicals F Hoffmann La Roche Basel Switzerland lt http www roche com gt D
48. ocediendo a secuenciar s Encender el aparato de aire acondicionado Basta presionar una vez el interruptor on off del mando a distancia 25 ATENCI N es muy importante encender el aire acondicionado que siempre se fija en el m nimo tanto en invierno como en verano En caso contrario la temperatura de la habitaci n se elevar demasiado pudiendo afectar a los sistemas electr nicos del secuenciador 6 11 Post secuenciaci n 373 Stretch Una vez realizada la secuenciaci n es importante dejar la m quina en perfectas condiciones para los siguientes usuarios Proceder del siguiente modo a Apagar el interruptor del 373 Stretch situado en la parte delantera izquierda baja del mismo b Bajar el interruptor del transformador c Abrir la c mara de secuenciaci n y succionar con trompa de agua o jeringa la soluci n amortiguadora de las c maras superior e inferior Secar con papel absorbente la zona de contacto de la c mara superior con el cristal para evitar que gotee y ensucie el ca n del l ser d Desenchufar las conexiones de las c maras de electroforesis Desatornillar el soporte de alineamiento y retirarlo Retirar la cubeta superior Aflojar las sujeciones del gel laterales y c mara de lectura y retirar el conjunto gel cristales e Utilizar dos esp tulas anchas para separar los cristales Retirar los espaciadores y el peine de dientes de tibur n Tirar el gel de acrilamida Para ello basta colocar e
49. ontrario el disolvente vol til se evaporar completamente durante el proceso de esterilizaci n en el autoclave Generalmente las soluciones se preparan en botes de vidrio tipo Pyrex excepto los que contienen lcalis que se guardan en pl stico Mezcla s lida acrilamida bis acrilamida 19 1 ATENCI N la acrilamida y la bis acrilamida N N Methylene bis acrylamide o N N Methylene di acrylamide en estado de mon meros son 30 neurot xicos y neurocarcin genos Para m s informaci n consultar las monograf as de la Agencia Internacional para la Investigaci n sobre el C ncer International Agency for Research on Cancer IARC lt http www iarc fr gt y las publicaciones de la Organizaci n Mundial de la Salud World Health Organization WHO lt http www who org gt Manipular el material s lido monom rico con guantes y mascarilla dentro de una campana extractora Est terminantemente prohibido pesar la acrilamida fuera de la campana extractora La poliacrilamida o sea los mon meros polimerizados no es peligrosa Tabla 7 Mezcla s lida acrilamida bis acrilamida 19 1 Para 20 y Para 100 g Para 200 g g g g Acrilamida 19 95 190 Bis acrilamida 1 5 10 Mezclar bien los polvos Guardar a temperatura ambiente ATENCI N la acrilamida y bis acrilamida son higrosc picas por lo que se apelmazan y forman grumos Por tanto es esencial
50. oras MegaBACE 1000 DNA Seguencing System Molecular Dynamics Sunnyvale CA USA lt http www mdyn com gt Tambi n acaba de ser presentado y consta de 96 capilares que secuencian en paralelo 96 muestras en 2 horas Cada lectura es de unas 500 bases con un 99 de precisi n El sistema est automatizado pudiendo secuenciar hasta 1 100 muestras 500 x 1 100 550 000 bases en 24 h sin intervenci n del usuario El tiempo requerido para configurar el sistema es de 10 minutos por programa de 2 a 24 horas de 1 a 1 100 muestras La tecnolog a MegaBACE 1000 ha sido licenciada por diversas empresas entre las que se encuentran AmershamPharmaciaBiotech y BeckmanCoulter ABI PRISM_3700 DNA Analyzer PerkinElmer Applied Biosystems Es probablemente el mejor sistema del mercado Estar disponible a principios de 1999 siendo muy parecido al MegaBACE aunque con una mayor productividad El sistema puede procesar 1 536 muestras en 16 grupos de 96 32 horas sin intervenci n del operario El tiempo requerido para configurar el sistema es de 10 minutos por programa de 2 a 32 horas de 1 a 1 536 muestras 4 PERSPECTIVAS FUTURAS DE LA SECUENCIACI N Debido al mpetu generado por el Proyecto del Genoma Humano se est investigando intensamente para desarrollar sistemas de secuenciaci n mucho m s eficientes que los actuales Por una parte se investiga en la optimizaci n de los sistemas autom ticos existentes para incrementar su eficacia
51. pulverizar perfectamente ambos componentes para obtener una mezcla correcta 19 1 Soluci n 40 acrilamida bis acrilamida 19 1 ATENCI N la acrilamida es neurot xica Manipular la soluci n con guantes Tabla 8 Soluci n 40 acrilamida bis acrilamida 19 1 Para 50 ml Para 100 ml Para 200 ml Mezcla s lida acrilamida bis acrilamida 19 1 209 40 y 80 g Agua destilada milli Q 31 5 ml 63 ml 126 ml Guardar a 4 C Soluci n persulfato am nico APS Disolver en agua seg n se indica en la tabla Tabla 9 Soluci n persulfato am nico APS Para 0 5 ml Para 1 mil Para 15 ml Persulfato am nico 0 05 g 0 1g 1 59 Agua destilada milli Q 500 ul 1 mi 15 mi Guardar a 4 C USAR SOLUCIONES FRESCAS lt 1 SEMANA ATENCI N la soluci n de persulfato am nico debe prepararse fresca No deben usarse soluciones con m s de una semana Suspensi n Sephadex G 50 La suspensi n de Sephadex G 50 Pharmacia Suecia se prepara en agua seg n se indica en la tabla siguiente Tabla 10 Suspensi n Sephadex G 50 Para 100 ml Para 500 ml 31 Azida s dica 0 02 g 0 1g Agua destilada milli Q Hasta 10 ml Hasta 500 ml A adir un poco de Sephadex G 50 agitar para que se hidrate y seguir a adiendo hasta que s lo queden 2 cm de agua por encima del lecho de la resina Guardar a 4 C ATENCI N aunque no es necesario
52. que contienen las muestras purificadas del interior de los tubos de pl stico utilizar unas pinzas est riles j Concentrar las muestras en un evaporador tipo SpeedVac SVC100 Savant Farmingdale NY USA durante unas 2 horas ATENCI N es muy importante encender la trampa de vac o del evaporador al menos dos horas antes de su uso para asegurar que no entren vapores en el aceite de la bomba ATENCI N para evitar la p rdida de las muestras es esencial seguir el siguiente orden en el manejo del evaporador para concentrar colocar las muestras cortar el circuito de aire activar la centr fuga arrancar la bomba abrir el circuito de aire Para recoger las muestras cortar el circuito de aire apagar la bomba abrir lentamente la entrada de aire apagar la centr fuga y acceder a las muestras k Guardar a 20 C Nota las muestras secadas de esta forma son estables durante meses 6 5 Purificaci n de productos eliminaci n de terminadores por precipitaci n con etanol protocolo 1 con lavado 11 Nota este m todo de purificaci n por precipitaci n con etanol y lavado no proporciona resultados tan consistentes como la purificaci n por exclusi n molecular pero generalmente es suficiente cuando se trabaja secuenciando con la enzima AmpliTagFS y no se requiere leer el m ximo de bases en la zona inicial de la secuencia Es el que seguiremos en esta sesi n a Para cada reacci n de secuenciaci n preparar un tubo Eppen
53. r la siguiente ventana Set Version Fluor Gain Con Clock 2 10 Check Set figure k Presionar Fluor Check Aparecer la siguiente pantalla PMT voltage is 495 volts 20 change I Utilizar las teclas num ricas para introducir el valor deseado Presionar change Volver al apartado h Repetir el proceso tantas veces como sea necesario para obtener una lectura de Y entre 800 y 1000 m Por otra parte si las l neas observadas en la pantalla del Mac tras realizar el Scan presentaran picos debe volverse a limpiar la zona de lectura del l ser incluyendo los cristales y la propia tapa de cierre de la ventana Una vez realizada la limpieza proceder de nuevo a comprobar el Scan apartado h Repetir el proceso tantas veces como sea necesario para conseguir l neas lo m s rectas posibles y sin picos marcados Nota los papeles tipo Kleenex son excelentes porque no dejan rastro de celulosa ATENCI N conviene usar agua y no alcohol para la limpieza de los cristales ya que el alcohol puede llevar sustancias contaminantes que fluorezcan n Una vez conseguido un gel limpio y con un valor de Y correcto colocarle el peine apropiado generalmente 24 o 36 dientes de tibur n con cuidado ATENCI N asegurarse que la anchura del gel corresponde con la de los espaciadores usados para crearlo ATENCI N asegurarse que el gel no est apretado por los
54. r an 72 0 9 x 4 75 6 ul lo cual supone multiplicar la primera columna por 4 2 y 5 tubos ser an 90 0 9 x 5 94 5 lo cual supone multiplicar la primera columna por 5 25 6 3 Purificaci n de productos eliminaci n de terminadores La reacci n de secuenciaci n se realiza en presencia de un exceso de nucle tidos y didesoxinucle tidos Este exceso es particularmente significativo en el caso de la qu mica de terminadores y AmpliTag Con la AmpliTagFS se utiliza una concentraci n mucho menor de terminadores en la reacci n Al estar los terminadores marcados fluorescentemente es necesario eliminarlos de las muestras antes de someterlas a electroforesis en el secuenciador autom tico ATENCI N es muy importante eliminar completamente los terminadores fluorescentes En caso contrario producir n un exceso de fluorescencia que saturar al detector del secuenciador ocultando los datos tiles Nota los terminadores presentan carga el ctrica e interaccionan con la acrilamida por lo que su migraci n es de hecho bastante err tica distribuy ndose principalmente en el frente de la reacci n pero tambi n en diferentes tramos de sta Describiremos tres protocolos para purificar las reacciones de secuenciaci n antes de ser cargadas en el gel de poliacrilamida para ser sometidas a electroforesis y detecci n por fluorescencia inducida por l ser El m todo mejor para eliminar los terminadores es la exclusi n molecular
55. r determinados por el investigador para elegir el mejor m todo de purificaci n para cada aplicaci n de secuenciaci n Nota recientemente Perkin Elmer ha desarrollado un m todo para eliminar los terminadores presentes en la muestra mediante una incubaci n de los productos de reacci n con fosfatasa alcalina de gamba o ternera Actualmente se encuentra en fase de experimentaci n y disponible en internet a trav s del Dr Shiaw Min Chen v a eMail en lt chensmOperkin elmer com gt o lt chensmOccmail apldbio com gt El Dr Chen trabaja para Perkin Elmer AppliedBiosystems cuyo servidor WWW es lt http www perkin elmer com gt 6 4 Purificaci n de productos eliminaci n de terminadores por exclusi n molecular columnas Sephadex G 50 Nota este m todo de purificaci n por exclusi n molecular es el m s consistente aunque tambi n requiere una mayor inversi n de tiempo y costo Generalmente se emplea en la qu mica de terminadores con AmpliTaq as como con la AmpliTagFS cuando se quiere leer el m ximo de bases en la zona inicial de la secuencia a Preparar jeringas con tapones de fibra sint tica Perl n disponible en acuarios esterilizada en autoclave Para ello arrancar un poco muy poco de fibra sint tica con unas pinzas est riles y colocarla sobre una jeringa de insulina de 1 ml desprovista de mbolo Introducir la fibra hasta el fondo de la jeringa con la ayuda de una pipeta Pasteur suficientemente larga
56. r los pocillos con una jeringa conteniendo soluci n amortiguadora de la cubeta superior para eliminar la urea presente ATENCI N es muy importante lavar bien los pocillos justo antes de cargar las muestras La omisi n de este paso provocar la aparici n de bandas borrosas en la imagen del gel debido a la presencia de urea en el pocillo d Cargar todas las muestras impares usando la micropipeta de secuenciaci n Drummond 25 pl Sigma Saint Louis MO USA 23 ATENCI N es esencial lavar bien la punta en el electrolito inferior despu s de cada muestra cargada Nota no debe cambiarse la punta de la micropipeta Drummond est dise ada para ser reutilizada ATENCI N es muy importante NO cargar dos pocillos contiguos de forma sucesiva Deben cargarse de forma alterna por ejemplo primero impares luego pares Si no se cumplen esta regla el software puede tener problemas para interpretar d nde acaba y donde empieza cada muestra carril Asimismo es muy importante no dejar huecos carriles sin cargar entre las muestras Al menos no dejar huecos de m s de dos carriles En caso contrario el software puede tener problemas a la hora de asignar el n mero correcto a cada carril cargado e Una vez cargada la primera serie de muestras en el gel ver m s abajo presionar Start Pre run en el Main Menu y someter a electroforesis durante 5 34 cm WTR 6 48 cm WTR minutos Aparecer el siguiente men en la
57. rante 10 min c Centrifugar a m xima velocidad 15 000 g durante 15 30 min d Decantar o aspirar con sumo cuidado el sobrenadante Eliminar todo el sobrenadante o sea terminadores con cuidado de no perder la pella Para ello dejar drenar boca abajo sobre papel de filtro Nota en este protocolo es especialmente importante asegurarse de que todo el sobrenadante es eliminado En caso contrario los terminadores contaminantes interferir n con la detecci n y an lisis de las secuencias Nota a veces la pella puede ser dif cil de ver a simple vista e Acabar de secar la pella bajo vac o 1 a 3 min en termobloque a 90 C 1 min o mejor en estufa a 37 C 10 min Nota los restos de etanol pueden eliminarse manteniendo el tubo boca abajo durante un tiempo dej ndolo escurrir sobre un papel absorbente coloc ndolo boca abajo u horizontal en una estufa a 37 C con la ayuda de un evaporador bajo vac o SpeedVac o incluso usando papel higi nico est ril o bastoncillos de papel o algod n est riles para eliminar manualmente las gotas e l quido que queden f Guardar a 20C Nota las muestras secadas de esta forma son estables durante meses 6 7 Preparaci n del gel de secuenciaci n ATENCI N el 373 Stretch soporta geles con diferentes longitudes Debido a ello los vol menes de gel necesarios as como su concentraci n de acrilamida pueden ser diferentes Es muy importante utilizar la concentraci n apropi
58. rio ser V ml de agua 20 274 V ml acrilamida al 40 Nota los vol menes de la tabla anterior est n ajustados para preparar un gel de 34 48 cm WTR Para geles menores puede prepararse menos volumen reduciendo proporcionalmente los componentes Nota los geles deben prepararse bajo condiciones constantes para asegurar la reproducibilidad de la polimerizaci n Factores como la pureza de los reactivos y agua el tiempo de desgasificaci n la presi n parcial de ox geno o la temperatura ambiente pueden afectar la polimerizaci n y consiguientemente las caracter sticas f sicas y el ctricas del gel l Cuando se vaya a utilizar el gel quitarle las pinzas y cintas adhesivas Colocar bajo el grifo y lavar completamente los restos de acrilamida Retirar el prepeine con cuidado y volver a lavar con agua del grifo y finalmente con agua destilada Dejar escurrir unos segundos y secar con papel de filtro m Lavar bien el prepeine Secar y guardar n Colocar la cubeta inferior en la c mara de secuenciaci n del 373 Stretch y el gel sobre la misma Fijar el gel con las sujeciones laterales Cerrar la ventana de lectura del l ser ATENCI N cuando se empleen cristales de 34 cm WTR comprobar que el cristal descansa sobre los dos bloques atornillados del fondo de la cubeta Para el resto de electroforesis aflojar el tornillo y desplazar el bloque para que los cristales descansen m s abajo ATENCI N no a adir a n el el
59. sponden ahora a cristales 34 cm cuando se usan con el 373 Stretch a Preparar los cristales para recibir el gel Para ello lavarlos con detergente Alconox de Sigma Aldrich Steinheim Alemania lt http www sigma aldrich com gt y una esponja aclararlos con agua del grifo y finalmente con agua destilada Dejarlos secar al aire Lavar el prepeine y los espaciadores en su caso con agua Dejarlos secar Colocar los espaciadores en los laterales de los cristales y fijar el sandwich mediante tres pinzas en cada lateral del sandwich Nota con el protocolo que se describe a continuaci n ya no es necesario sellar el sandwich con cinta adhesiva amarilla de Sigma Aldrich Saint Louis MO USA lt http www sigma aldrich com gt como se hac a antes ahora el gel se carga horizontalmente y no verticalmente ATENCI N colocar una bayeta o mejor una alfombrilla de caucho o goma en el fondo y lateral del fregadero donde se limpien los cristales para evitar romperlos 14 ATENCI N es MUY importante que la zona externa del cristal peque o que presenta las orejas quede siempre hacia el exterior del sandwich Ello es as porque dicha zona se pone en contacto con una cinta de goma del secuenciador y queda impregnada de dicha goma de forma que se crear an burbujas de aire al formarse el gel si dicha zona se coloca dentro del sandwich de cristales Es muy f cil determinar qu zona del crista
60. thylenediamine Agitar muy suavemente para mezclar i Colocar el sandwich horizontalmente o mejor levemente levantado por la parte superior Asegurarse de que la cinta que forma el bolsillo est bien pegada Verter la soluci n del gel en el centro de la zona creada por el bolsillo Rellenar el bolsillo con gel no dejar que se seque a la vez y esto es importante que se dan golpecitos en rgicos y breves en la zona del frente para ayudar al avance de la soluci n y evitar la formaci n de burbujas Una vez relleno el sandwich despegar el bolsillo y meter el prepeine hasta el fondo con cuidado de que no se formen burbujas de aire Nota con el protocolo antiguo que todav a algunos prefieren se colocaba el sandwich formando un ngulo de unos 45 y se vert a la soluci n del gel entre los cristales sellados por cinta amarilla Cuando quedaban unos 3 cm por rellenar se despegaba el bolsillo se tumbaba el sandwich hasta que la acrilamida saliera al exterior y se met a el prepeine hasta el fondo con cuidado de que no se formen burbujas de aire Nota en el protocolo antiguo si se formaran burbujas dejar de a adir acrilamida y volcar el sandwich lateralmente hasta eliminarlas Continuar a adiendo la soluci n del gel entre los cristales Nota en ambos protocolos pueden eliminarse burbujas introduciendo un alambre suficientemente fino en forma de ojiva desde el fondo del sandwich Por ejemplo
61. ue en situaciones especiales productos cortos de PCR espaciamientos anormales etc puede ser mejor elegir otros Seg n nuestra experiencia los pl smidos secuenciados con geles de 48 cm WTR se analizan mejor en el 373Stretch siguiendo el siguiente orden de algoritmos ABI100 gt Adaptive 2 SemiAdaptive gt ABI50 gt ABI200 Los resultados generados pueden utilizarse tal cual o reanalizarse manualmente si se desea alterar alguno de los par metros del an lisis autom tico eliminar la parte inicial o final de la lectura alterar la numeraci n de los carriles o la gu a de lectura tracking cambiar la qu mica si se cometi un error en la hoja de datos etc 27 El secuenciador 373 Stretch dispone de manuales expl citos del funcionamiento de la m quina 373 DNA Sequencing System y del software est ndar correspondiente 373 DNA Sequence Analysis Software Asimismo existe software espec fico de PerkinElmer Inherit Se trata de un software muy potente de ensamblaje de secuencias generadas por el 373 Stretch as como an lisis comparaci n y b squeda de secuencias en bases de datos SeqgEd Para an lisis de las secuencias y fluorogramas generados con el 373 Stretch SeguenceNavigator Ideal para detectar polimorfismos y mutaciones en gran cantidad de secuencias AutoAssembler Como su nombre indica permite ensamblar las secuencias generadas mediante el 373 Stretch Factura Para an lisis de fingerpr

47. Secuenciación del DNA

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