hydragel 1 bence jones hydragel 2 bence jones hydragel 4 bence
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1. HYDRAGEL 1 BENCE JONES Ref 4821 HYDRAGEL 2 BENCE JONES Ref 4822 HYDRAGEL 4 BENCE JONES Ref 4824 HYDRAGEL 9 BENCE JONES Ref 4883 Masque standard Standard mask 2014 03 HYDRAGEL 1 2 4 amp 9 BENCE JONES 2014 03 Masque standard Standard mask ESPECIFICACIONES DE USO Los kits HYDRAGEL 1 BENCE JONES 2 BENCE JONES 4 BENCE JONES y 9 BENCE JONES est n dise ados para la detecci n de prote nas Bence Jones 6 cadenas ligeras libres kappa o lambda en orina o suero humano respectivamente mediante inmunofijaci n en geles de agarosa tamponados alcalinamente pH 9 2 Son utilizados junto con el sistema semiautom tico HYDRASYS realiz ndose as todo el conjunto de pasos necesarios para la obtenci n de geles listos para su posterior interpretaci n Las prote nas de la muestra son sometidas a electroforesis e inmunofijaci n con antisueros que presentan las siguientes especificidades 1 un antisuero trivalente anti gamma lg G anti alfa Ig A and anti mu lg M cadenas pesadas 2 anti kappa libre o no cadenas ligeras 3 anti lambda libre o no cadenas ligeras 4 anti kappa cadenas ligeras libres y 5 anti lambda cadenas ligeras libres Despu s de la inmunofijaci n las prote nas precipitadas se ti en con violeta cido El exceso de colorante es eliminado con una soluci n cida Cada gel de agarosa est pensado para analizar 1 muestra en el kit HYDRAGEL 1 BENCE JONES 2 muestr2. L para inmunofijaci n Plantilla est ndar SEBIA referencia N 4835 contiene tres viales de antisueros anti cadenas pesadas gamma alfa y mu anti cadenas ligeras kappa libres y ligadas y anti cadenas ligeras lambda libres y ligadas de 1 ml cada uno y un vial de soluci n fijadora de 2 5 ml espec ficos de la t cnica de inmunofijaci n realizada con las plantillas 1 2 4 y 9 BENCE JONES SEBIA 1 1 ANTISUEROS Ver el p rrafo 5 1 2 SOLUCI N FIJADORA Ver el p rrafo 4 2 CAJA DE ANTISUEROS ANTI CADENAS LIGERAS LIBRES para los kits 4821 4822 y 4824 La caja de Antisueros cadenas ligeras libres K y L para inmunofijaci n Plantilla est ndar SEBIA referencia N 4836 contiene dos viales de antisueros de 1 ml cada uno espec ficos de la t cnica de inmunofijaci n realizada con las plantillas 1 2 4 y 9 BENCE JONES SEBIA Preparaci n Utilizaci n Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Ver el p rrafo 5 3 SOLUCI N DECOLORANTE Preparaci n Cada vial de Soluci n Decolorante stock SEBIA PN 4540 10 viales de 100 ml se diluye hasta 100 litros con agua destilada o desionizada Es conveniente diluir s lo 5 ml de la soluci n stock hasta 5 litros volumen del contenedor de la soluci n decolorante Despu s de la diluci n la soluci n decolorante contiene una soluci n cida pH 2 50 HYDRAGEL 1 2 4 amp 9 BENCE JONES 2014 03 Masque standard Standard mask Uso Para decolorar sto
3. amp 9 BENCE JONES 2014 03 Masque standard Standard mask 5 ANTISUEROS Ref N 4883 Preparaci n Los antisueros est n listos para su uso Contienen inmunoglobulinas totales de mam fero anti humanas Cada reactivo tiene un color espec fico para evitar errores al utilizarlos El color es el mismo que el de las etiquetas de los viales Cuando los antisueros presentan una ligera turbidez o precipitados generalmente basta con poner los viales a temperatura ambiente unos 10 minutos antes de su utilizaci n Si la turbidez persiste no perturbar la reacci n inmunol gica Si hay un precipitado insoluble se recomienda centrifugar los antisueros durante 5 minutos a 600 g Uso Para la inmunoprecipitaci n de las prote nas separadas mediante electroforesis NOTA Los antisueros son espec ficos de la t cnica de inmunofijaci n realizada con las plantillas 1 2 4 y 9 BENCE JONES Los antisueros pueden ser de or genes animales diferentes Es por tanto imperativo no mezclar dos viales diferentes de antisueros incluso si son de la misma especificidad y SIEMPRE hay que cambiar la punta de la pipeta al cambiar de vial IMPORTANTE Para evitar cualquier contaminaci n entre los diferentes reactivos es imperativo poner cada tap n sobre el vial correspondiente despu s de usarlo Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Los antisueros deben ser conservados en nevera entre 2 y 8 C Son estables hasta la fecha de caducidad indicada
4. bolsas de 2 10 bolsas de 2 80 bolsas de 2 Colorante Violeta Acido soluci n stock 1 vial de 75 ml 1 vial de 75 ml 8 viales de 75 ml Soluci n Fijadora lista para usar 1 vial de 14 4 mi Inmunoglobulinas de Mamifero anti cadenas pesadas humanas gamma alfa mu trivalente listo para usar 1 vial de 10 8 mi Inmunoglobulinas de mam fero anti cadenas ligeras humanas kappa libres o no listo para usar 1 vial de 10 8 mi Inmunoglobulinas de mam fero anti cadenas ligeras humanas Lambda libres o no listo para usar 1 vial de 10 8 mi Inmunoglobulinas de mam fero anti cadenas ligeras humanas Kappa libres listo para usar 1 vial de 10 8 m Inmunoglobulinas de mam fero anti cadenas ligeras humanas Lambda libres listo para usar 1 vial de 10 8 mi Aplicadores listos para usar 1 caja de 10 2 cajas de 10 24 cajas de 10 Papeles de Filtro finos 1 paquete de 10 1 paquete de 10 8 paquetes de 10 Papeles de Filtro peines 1 caja de 10 2 cajas de 10 24 cajas de 10 Papeles de Filtro gruesos 1 paquete de 10 1 paquete de 10 8 paquetes de 10 MAXI KIT HYDRAGEL 9 BENCE JONES 48 INSTRUCCIONES SEBIA Espa ol HYDRAGEL 1 2 4 8 9 BENCE JONES 2014 03 Masque standard Standard mask NOTA La soluci n fijadora y los antisueros se comercializan por separado excepto en el MAXI KIT consulte REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS Durante el transporte el MAXI KIT puede permanecer a temperatura ambiente entre 15 y 30 C durante 15
5. burbujas en el mismo 6 Cerrar la tapa del m dulo de migraci n 7 Iniciar el procedimiento inmediatamente presionando la tecla START situada a la izquierda del teclado En pantalla aparece el mensaje INCUBACION INMUNOFIJACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOMATICAS Incubaci n a 20 C durante 10 minutos termostatizaci n mediante efecto Peltier Una se al audible indica que la tapa del m dulo de migraci n se desbloquea El siguiente mensaje que aparece en pantalla es 4 AS ME 4 ANTISUEROS ME NOTA La tapa del m dulo de migraci n debe permanecer cerrada durante la incubaci n Ill ELIMINACI N DEL EXCESO DE REACTIVOS 1 2 3 Abrir la tapa del m dulo de migraci n Elimine los reactivos usando los peines de papel de filtro Fig 7 Un peine para las plantillas 1 BENCE JONES y 2 BENCE JONES dos peines para la plantilla 4 BENCE JONES y 3 peines para la plantilla 9 BENCE JONES Insertar el los peine s formando un ngulo de 30 en los huecos situados en el l mite inferior de los canales de la plantilla de forma que los extremos del peine toquen la cara vertical m s alejada del operador Permitir que el los peine s toque n delicadamente el l quido inclin ndolo s un ngulo de 45 permitiendo la absorci n del mismo Fig 8 IMPORTANTE Los extremos del peine sus dientes no deben tocar el gel Cada peine debe permanecer inclinado 45 Si se coloca derecho puede llegar a da ar
6. el gel Iniciar el procedimiento presionando la tecla START flecha verde situada a la izquierda en el teclado ELIMINACI N DE REACTIVOS DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOMATICAS Los antisueros difunden durante 15 segundos a 20 C Temperatura controlada mediante efecto Peltier En este momento suena una alarma audible El siguiente mensaje que aparece en pantalla es Y PAP Y PAPEL FILTRO GRUESO IV BLOTTING ABSORCI N 1 2 oa Sacar el los peine s Comprobar visualmente que los antisueros se han eliminado de forma correcta lo cual podremos saber por ausencia de antisueros en la superficie del gel los extremos del peine se hallan coloreados en su totalidad Si la absorci n es incompleta introducir de nuevo el mismo peine y en la misma posici n repitiendo de forma manual el procedimiento de eliminaci n Asir la plantilla de aplicaci n de reactivos por la solapa elevarla y sacarla Aplicar un papel de filtro grueso sobre el gel inclinar el papel de filtro 45 o y alinear sus bordes con los del gel colocarlo encima del gel suavemente ATENCI N Asegurarse de apoyar correctamente toda la superficie de la hoja de papel de filtro para conseguir un perfecto contacto entre el gel y el papel Cerrar la tapa del m dulo de migraci n Iniciar el procedimiento presionando la tecla START flecha verde situada a la izquierda en el teclado Lave la plantilla con un cepillo peque o flexible ti
7. en la caja del kit o en las etiquetas de los viales de antisuero NOTA Durante el transporte los antisueros pueden permanecer a temperatura ambiente entre 15 y 30 C durante 15 d as sin que esto afecte a la calidad del test 6 APLICADORES Uso Aplicadores precortados de un solo uso para la aplicaci n de la muestra Almacenamiento Almacenar los aplicadores en un lugar seco a temperatura ambiente o refrigerados 7 PAPELES DE FILTRO FINOS Uso Papeles finos absorbentes precortados de un solo uso para secar el exceso de humedad de la superficie del gel antes de la aplicaci n de la muestra Conservaci n Les papeles de filtro finos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera 8 PAPELES DE FILTRO PEINES Uso Peines de papel de filtro grueso precortados de un solo uso para eliminar el exceso de sol Fijadora y antisueros del gel despu s de haber realizado la inmunofijaci n 9 PAPELES DE FILTRO GRUESOS Uso Papeles de filtro gruesos de un solo uso para la eliminaci n de prote nas no precipitadas del gel despu s de haber realizado la inmunofijaci n Conservaci n Los papeles de filtro gruesos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS ATENCI N Ver las fichas de datos de seguridad 1 CAJA DE ANTISUEROS Y SOLUCI N FIJADORA GAM K L para los kits 4821 4822 y 4824 La caja de Antisueros y Soluci n Fijadora GAM K
8. en menos de 5 minutos En este momento podremos iniciar una nueva migraci n Volver a colocar el portaaplicadores en su ubicaci n original Limpiar la placa de control de temperatura con un pa uelo de papel suave ligeramente humedecido VII FINALIZACI N DEL PROCESADO DEL GEL 1 Retirar el soporte del gel del compartimento abrirlo y extraer el gel ya seco 2 Si procede limpiar el reverso del gel soporte pl stico con un papel suave y h medo NOTA En los geles con varias filas de muestras 2 3 las longitudes de migraci n pueden ser ligeramente diferentes sin ninguna repercusi n en los resultados CONTROL DE CALIDAD Se recomienda analizar un suero control como el Control IT IF SEBIA referencia n 4788 despu s de cada cambio de lote de uno de los reactivos NOTA Si es necesario el Suero Control Normal SEBIA referencia n 4785 puede ser usado como control negativo RESULTADOS Interpretaci n La presencia de una prote na de Bence Jones en la orina se caracteriza por una banda monoclonal detectada con uno de los antisueros anti cadenas ligeras libres y unidas kappa o lambda carriles K o L la misma banda monoclonal detectada con los correspondientes antisueros anti cadenas ligeras libres kappa o lambda carriles KI o LI ausencia de reacci n con antisuero trivalente carril GAM Debido a una diferencia de sensibilidad entre los antisueros los antisueros anti cadenas ligeras libres y ligadas son
9. es la eliminaci n del exceso de tinci n y la coloraci n de fondo de los geles Para el lavado del compartimento de coloraci n Para neutralizar la acidez del decolorante introduzca dentro del contenedor de desechos vac o 15 ml de sosa al 50 soluci n comercial Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar la soluci n decolorante stock a temperatura ambiente o refrigerada La soluci n stock de decolorante es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del vial NO CONGELAR La soluci n decolorante de trabajo es estable una semana a temperatura ambiente en un contenedor cerrado No a adir azida s dica Desechar la soluci n decolorante de trabajo si cambia su apariencia p ej si se vuelve turbia debido a contaminaci n microbiana En caso de conservaci n prolongada m s de una semana de la soluci n diluida a ada 50 pL L de ProClin 300 6 de CLEAN PROTECT SEBIA referencia n 2059 1 vial de 5 mL para evitar la proliferaci n microbiana Ver las instrucciones del CLEAN PROTECT para conocer las directrices de uso El decolorante diluido que contenga ProClin 6 CLEAN PROTECT es estable en un contenedor cerrado a temperatura ambiente o en nevera hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de decolorante 4 SOLUCI N DE LAVADO HYDRASYS Preparaci n Cada vial de la Soluci n de Lavado stock HYDRASYS SEBIA PN 4541 10 viales 80 ml cada uno s
10. establecidos de uso en el laboratorio cl nico Las muestras pueden conservarse un m ximo de una semana en nevera entre 2 y 8 C Para conservaciones m s prolongadas Sino se ha a adido ning n conservante se recomienda congelar las muestras a 70 C Si se ha a adido un conservante las orinas pueden congelarse a 20 C La conservaci n de las orinas congeladas a 20 C mejora a adiendo a la muestra tamp n HEPES 0 1 M pH 6 75 y o azida s dica 0 2 g L Las muestras congeladas son estables durante 1 mes como m nimo 51 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 BENCE JONES 2014 03 Masque standard Standard mask Las muestras degradadas o descongeladas pueden dejar una marca en el punto de aplicaci n debido a la desnaturalizaci n de prote nas o en presencia de inmunoglobulinas a la presencia de fragmentos de cadenas pesadas de movilidad an dica alfa 2 6 beta que no tendr n correspondencia con cadenas ligeras IMPORTANTE No use conservantes que contengan cido b rico NOTA No conserve las muestras de orina a temperatura ambiente Si se analiza sueros deben obtenerse de acuerdo con los procedimientos establecidos usados en el an lisis de laboratorio cl nico Si es necesario conservar el suero entre 2 y 8 C hasta 1 semana Para per odos de conservaci n m s largos congelar las muestras Los sueros congelados son estables durante un mes por lo menos Las muestras descongeladas pueden dar lugar a ligeras marcas de a
11. S y en otro gel de agarosa disponible comercialmente Los resultados obtenidos mostraron una perfecta correlaci n entre los dos sistemas Las mismas bandas monoclonales fueron evidenciadas en todos los sueros patol gicos en los dos tipos de geles y las siete muestras sin paraprote na de Bence Jones no presentaron ninguna banda en los dos sistemas de an lisis Sensibilidad Dos orinas con prote nas de Bence Jones han sido diluidas serialmente y analizadas con la t cnica HYDRAGEL 4 BENCE JONES usando los antisueros anti kappa y anti lambda y anti kappa libre y anti lambda libre El l mite de detecci n m nimo de las cadenas ligeras libres kappa y lambda obtenido es del orden de 3 mg l con los antisueros anti kappa y anti lambda y del orden de 12 mg l con los antisueros anti cadenas ligeras libres correspondientes Sin embargo hay que tener en cuanta que seg n la estructura y la naturaleza de la cadena ligera libre esta sensibilidad puede variar manteni ndose en un l mite inferior o igual a 50 mg l para la detecci n con los antisueros anti kappa libre o anti lambda libre 56 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 BENCE JONES 2014 03 Masque standard Standard mask BIBLIOGRAPHIE BIBLIOGRAPHY Didier Le Carrer lectrophor se des Prot ines et Immunofixation Guide d interpr tation Laboratoires SEBIA 1994 120 pp Ed Hatier Paris 2 DF Keren High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation Butte
12. arlo en una superficie plana y posicionar el gel secado con la parte de agarosa hacia arriba en los orificios de las dos varillas y cerrar el soporte Comprobar que el gel est colocado adecuadamente dentro del soporte Fig 9 4 Colocar el soporte del gel en el M dulo de Procesado Tinci n IMPORTANTE Antes de comenzar con el programa de procesado tinci n comprobar lo siguiente el contenedor de soluci n de lavado contiene por lo menos 400 ml de soluci n de lavado el contenedor de colorante se ha llenado con 300 ml de soluci n de tinci n el contenedor de decolorante contiene por lo menos 1 litro de soluci n decolorante el contenedor de deshechos est vac o Para la conexi n de los reactivos Consultar la informaci n que aparece en la pantalla del instrumento seleccionar la tecla VER CANALES IMPORTANTE No olvidar bloquear los canales no utilizados 5 Seleccionar el programa de tinci n IF ACID VIOLET en el men del instrumento e iniciar el proceso apretando la tecla START flecha verde situada a la derecha en el teclado Durante todas las secuencias de coloraci n decoloraci n y secado el sistema permanece bloqueado Despu s del enfriamiento de la cubeta una se al sonora bip suena y el sistema se desbloquea la ventilaci n se mantiene hasta la recuperaci n del porta films NOTAS La temperatura de la placa de migraci n va descendiendo desde que se ha abierto la tapa hasta que alcanza 20 C
13. as en el kit HYDRAGEL 2 BENCE JONES 4 muestras en el kit HYDRAGEL 4 BENCE JONES 9 muestras en el kit HYDRAGEL 9 BENCE JONES Para uso diagnostico In Vitro NOTA En estas instrucciones el nombre HYDRASYS es usado para designar los sistemas semiautom ticos HYDRASYS e HYDRASYS 2 SEBIA PRINCIPIO DEL ENSAYO La presencia de bandas anormales en los patrones electrofor ticos principalmente en las fracciones correspondientes a beta globulinas y gamma globulinas son siempre sospechosas de ser prote nas monoclonales y por tanto son un indicador de gammapat as Para identificar estas bandas anormales se realiza una inmunofijaci n La inmunofijaci n permite fijar las prote nas in situ despu s de la electroforesis mediante la formaci n de complejos insolubles en combinaci n con el antisuero correspondiente Se realiza en cuatro etapas 1 Separaci n de las prote nas mediante electroforesis en gel de agarosa 2 Fijaci n e inmunoprecipitaci n de las prote nas sometidas a electroforesis La soluci n fijadora y los antisueros son a adidos directamente sobre la superficie del gel en sus pistas de migraci n electrofor tica correspondientes La soluci n fijadora y los antisueros difunden en el gel precipitando todas las prote nas y los correspondientes ant genos respectivamente 3 Las prote nas no precipitadas solubles son eliminadas del gel mediante secado blotting y posterior lavado Los complejos antigeno anticuerp
14. d as sin que la calidad del test se vea afectada PARA OBTENER RESULTADOS PTIMOS Los elementos de un mismo kit deben utilizarse conjuntamente y seg n las instrucciones incluidas LEER ATENTAMENTE LAS INSTRUCCIONES 1 GELES DE AGAROSA Preparaci n Los geles de agarosa est n listos para usar Cada gel contiene agarosa tamp n pH 9 2 0 5 componentes inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Uso Medio de soporte para la electroforesis de prote nas e inmunofijaci n Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar los geles horizontalmente en sus recipientes protectores originales a temperatura ambiente 15 a 30 C o refrigerados 2 a 8 C Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit y en sus recipientes protectores La flecha situada en la cara frontal de la caja del kit debe apuntar hacia arriba Evitar su almacenamiento cerca de una ventana o de una fuente de calor Evitar variaciones importantes de temperatura durante su almacenamiento NO CONGELAR Desechar cuando i haya cristales o precipitados en la superficie del gel o su textura sea muy blanda consecuencias de la congelaci n del gel ii se observe crecimiento bacteriano o f ngico ii se evidencie una cantidad excesiva de l quido en el recipiente del gel consecuencia de la exudaci n del tamp n debida a un almacenamiento inadecuado 2 ESPONJAS TAMPONADAS Preparac
15. e diluye hasta 5 litros con agua destilada o desionizada Despu s de la diluci n la soluci n de lavado contiene tamp n pH 8 7 0 5 Uso La soluci n de lavado HYDRASYS est dise ada para lavar las prote nas no precipitadas de los geles Sirve para limpiar el Compartimento de Tinci n del HYDRASYS Usar peri dicamente p ej si el instrumento se usa a diario lavar el compartimento de tinci n semanalmente Ver la hoja de instrucciones para las indicaciones de uso Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar ambas soluciones de lavado stock y de trabajo a temperatura ambiente o refrigeradas en contenedores cerrados La soluci n stock de lavado es estable hasta la fecha de caducidad indicada en las etiquetas del vial Desechar la soluci n de trabajo de lavado si cambia su apariencia p ej si se vuelve turbia debido a contaminaci n microbiana 5 SALINA Preparaci n Preparar una soluci n de NaCl 0 15 M 9 g l en agua destilada o desionizada Uso Para diluir las muestras si es necesario Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar a temperatura ambiente o refrigerada Desechar despu s de 3 meses o si cambia de apariencia por ejemplo se vuelve turbia debido a contaminaci n microbiana Para per odos de almacenaje m s prolongados a adir azida s dica 1 g l NOTAS Las pruebas realizadas durante la validaci n de los reactivos muestran que para las diferentes soluciones y usa
16. e que no queden burbujas que el agua est extendida bajo toda la superficie del gel y que ste est alineado con el marco serigrafiado 7 Devolver ambos soportes a su posici n original En esta posici n las esponjas tamponadas no tocan el gel NO FORZAR LOS SOPORTES HACIA ABAJO 8 Extraer el los aplicador es de la c mara h meda Asirlo s por el pl stico protector Romper el pl stico protector precortado del peine Ponga el los aplicador es en el soporte de los aplicadores HYDRAGEL 1 BENCE JONES HYDRAGEL BENCE JONES 2 4 2 muestras posici n N 6 HYDRAGEL BENCE JONES 2 4 4 muestras posiciones N 3 y 9 HYDRAGEL 9 BENCE JONES posiciones N 2 6 y 10 Para una perfecta reproducibilidad de la aplicaci n de muestra bloquee los aplicadores en el lado izquierdo del soporte IMPORTANTE Los n meros impresos en el los aplicador es deben quedar de cara al usuario Fig 4 Asegurarse de devolver los soportes a su posici n original Cerrar la puerta del m dulo de migraci n 10 Iniciar el procedimiento inmediatamente presionando la tecla START flecha verde en el lado izquierdo del teclado IMPORTANTE Asegurarse que la toma de aire en el lado derecho del instrumento no est bloqueada MIGRACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Los dos soportes descienden con lo cual esponjas tamponadas y aplicador es entran en contacto con la superficie del gel El soporte del aplicador se eleva Mig
17. ejar difundir las muestras durante 5 minutos despu s de la ltima aplicaci n 3 Abrir la puerta del M dulo de migraci n y elevar los soportes de los electrodos y el aplicador ATENCI N Nunca cerrar la puerta cuando los soportes est n elevados 4 Seleccione en el men el programa de migraci n 1 BJ ME MD para el HYDRAGEL 1 BENCE JONES 2 4 BJ UP ME MD para el HYDRAGEL BENCE JONES 2 4 9 BJ ME para el HYDRAGEL 9 BENCE JONES 5 Extraer las esponjas tamponadas de su envoltorio asirlas por los extremos de pl stico Engarzar los extremos de pl stico agujereados con las puntas met licas del soporte de los electrodos los extremos de pl stico deben quedar encarados al soporte Fig 2 6 Abrir el contenedor del HYDRAGEL Extienda un papel de filtro fino de manera r pida y uniforme sobre la superficie del gel para absorber el exceso de l quido Retire el papel inmediatamente ADVERTENCIA No deje que el papel de filtro contacte demasiado rato con el gel para evitar que se deshidrate Dispense 120 pl de agua destilada o desionizada para el HYDRAGEL 1 BENCE JONES 6 200 pl para el HYDRAGEL BENCE JONES 2 4 y HYDRAGEL 9 BENCE JONES en el tercio inferior del cuadro serigrafiado en la placa del m dulo de migraci n Colocar el gel la cara de agarosa hacia arriba con su lado inferior en contacto con el tope inferior del marco serigrafiado Fig 3 Aplicar el gel en la superficie haci ndolo contactar con el agua Fig 3 Asegurars
18. en de suero 4 vol menes de diluyente prediluido o de salina y a 1 2 1 volumen de suero 1 volumen de diluyente prediluido o de salina para los carriles KI y LI Para an lisis de lg D y o de lg E aplicar las mismas diluciones que para las cadenas ligeras libres y ligadas IMPORTANTE Evitar las muestras de plasma El fibrin geno da lugar a una banda cerca del punto de aplicaci n que puede ser confundida con una inmunoglobulina monoclonal Algunas orinas contienen una concentraci n de sales elevada Esto puede causar la deformaci n del gel durante la migraci n y consecuentemente distorsi n de los perfiles de migraci n Si tal distorsi n hace la interpretaci n imprecisa la orina deber a ser dializada para eliminar las sales Las orinas que presenten proteolisis pueden dar lugar a reacciones positivas con el antisuero anti cadenas ligeras libres En tal caso una paraprote na s rica eliminada en la orina puede mostrar una banda monoclonal con el antisuero trivalente y con uno de los antisueros anti cadenas ligeras libres y unidas y con el correspondiente antisuero anti cadenas ligeras libres La polimerizaci n de las prote nas de Bence Jones generalmente disminuye la sensibilidad de detecci n con el antisuero anti cadenas ligeras libres ya que la polimerizaci n puede bloquear los epitopos que normalmente reaccionan con el antisuero anti cadenas ligeras libres Cuando se sospecha la presencia de prote nas de Bence Jones
19. i n Las esponjas tamponadas est n listas para usar Cada esponja tamponada contiene tamp n pH 9 1 0 5 componentes inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Uso Las esponjas tamponadas funcionan como reservorio del tamp n de electroforesis y aseguran el contacto entre el gel y los electrodos Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Las esponjas tamponadas pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera Deben ser conservadas horizontalmente en su bolsa protectora la flecha situada en la parte frontal del kit debe apuntar hacia arriba Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en su bolsa protectora NO LAS CONGELE Deseche las esponjas tamponadas si la bolsa est abierta o si las esponjas est n secas 3 COLORANTE VIOLETA ACIDO Preparaci n El vial del colorante violeta cido concentrado debe completarse hasta 300 mL con agua destilada o desionizada Despu s de la diluci n la soluci n colorante contiene soluci n cida pH 2 violeta cido etil n glicol componentes inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Uso Para la tinci n de geles con separaci n electrofor tica de prote nas y posterior inmunofijaci n IMPORTANTE El colorante est destinado para la coloraci n de 10 geles Cambie el colorante despu s de su utilizaci n en 10 coloraciones Almacenamiento estabilidad y se ales de deter
20. ici n de la plantilla para un alineamiento perfecto entre los perfiles electrofor ticos y los pocillos de la plantilla consulte el kit de accesorios para HYDRASYS 9 BENCE JONES SEBIA PN 1266 para las instrucciones 53 HYDRAGEL 1 2 4 amp 9 BENCE JONES 2014 03 Masque standard Standard mask 5 Aplicar los antisueros del modo siguiente VOLUME pl CANAL plantilla plantilla REACTIVO COLOR 1 2y4BJ 9BJ ELP 40 20 soluci n fijadora amarillo GAM 25 15 antisuero trivalente violeta K 25 15 antisuero anti cadenas ligeras kappa libres o no verde L 25 15 antisuero anti cadenas ligeras lambda libres o no azul KI 25 15 antisuero anti cadenas ligeras kappa libres naranja LI 25 15 antisuero anti cadenas ligeras lambda libres rojo NOTA Para evitar mezclar antisueros sus colores respectivos aparecen en las etiquetas de los viales y en los canales de la plantilla de aplicaci n correspondientes HYDRAGEL 9 BENCE JONES Se recomienda aplicar los antisueros en el orden siguiente lambda libres kappa libres lambda kappa y GAM por ltimo la soluci n fijadora Pipetear los antisueros evitando la formaci n de burbujas de aire en la punta de la pipeta Aplicar los antisueros Fig 6 Mantener la pipeta en posici n perpendicular a la plantilla vertical apoyando la punta suavemente en el centro del pocillo Inyectar el antisuero de forma que se extienda a trav s del canal sin que se formen
21. ioro Almacenar ambas soluciones stock y de trabajo del colorante a temperatura ambiente o refrigeradas en contenedores cerrados para evitar la evaporaci n La soluci n stock del colorante es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del vial La soluci n de trabajo es estable 6 meses 4 SOLUCI N FIJADORA Ref N 4883 Preparaci n La soluci n fijadora est lista para su uso Contiene una soluci n cida pH 2 y componentes inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Para una f cil identificaci n y como control de su aplicaci n la soluci n fijadora est coloreada con un colorante no t xico del mismo color que la etiqueta del vial y la pista determinada de la plantilla de aplicaci n de reactivos Uso Fijaci n de las prote nas separadas electrofor ticamente en la pista de referencia ELP NOTA La soluci n fijadora es espec fica de la t cnica de inmunofijaci n realizada con las plantillas 1 2 4 y 9 BENCE JONES IMPORTANTE Para evitar cualquier contaminaci n entre los diferentes reactivos es imperativo poner cada tap n sobre el vial correspondiente despu s de usarlo Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar a temperatura ambiente o refrigerada Es estable hasta la fecha de caducidad del kit o la que muestra la etiqueta del vial La soluci n fijadora debe estar exenta de precipitados 49 HYDRAGEL 1 2 4
22. m s sensibles que los antisueros anti cadenas ligeras libres la presencia de una prote na de Bence Jones en la orina tambi n se caracteriza por una banda monoclonal revelada por un anti cadenas ligeras libres y ligadas kappa o lambda carriles K 6 L la ausencia de reacci n con el anti cadenas ligeras libres kappa o lambda correspondiente carriles KI LI y la ausencia de reacci n con el antisuero trivalente carril GAM El suero debe analizarse previamente para descartar la presencia de una Ig D o una lg E Para confirmar la presencia de la prote na de Bence Jones la muestra de orina tambi n debe ser analizada concentrada La paraprote na s rica eliminada en la orina sin la prote na de Bence Jones se caracteriza por una banda monoclonal detectada con el antisuero trivalente la misma banda detectada con uno delos antisueros anti cadenas ligeras libres y unidas y ausencia de reacci n con el antisuero anti cadenas ligeras libres correspondiente La paraprote na s rica eliminada en la orina asociada con la prote na de Bence Jones se caracteriza por una banda monoclonal detectada con el antisuero trivalente dos bandas detectadas con uno de los antisueros anti cadenas ligeras libres o unidas u ocasionalmente una banda detectada con uno de los antisueros anti cadenas ligeras libres y unidas y una banda detectada con el otro antisuero anti cadenas ligeras libres y unidas una banda revelada con uno de l
23. ndo material adaptado al volumen a reconstituir una variaci n del volumen final de un 5 no tiene ning n efecto adverso en el an lisis El agua destilada o desionizada usada para la reconstituci n de las soluciones debe estar exenta de contaminaci n bacteriana o f ngica use un filtro lt 0 45 um y debe tener una resistividad superior a 10 Megohms x cm EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS 1 Sistema HYDRASYS SEBIA HYDRASYS 2 SCAN PN 1200 HYDRASYS 2 PN 1201 HYDRASYS 2 SCAN FOCUSING PN 1202 HYDRASYS 2 FOCUSING PN 1203 HYDRASYS PN 1210 o PN 1211 o HYDRASYS FOCUSING PN 1212 2 Micropipeteador manual o automatico como el HYDRAPLUS SEBIA PN 1216 HYDRAPLUS 2 SEBIA PN 1217 o ASSIST SEBIA PN 1218 para cargar los aplicadores de muestra de una forma alternativa C mara h meda PN 1270 suministrada con HYDRASYS Kit de Contenedores suministrado con HYDRASYS Barra de Guia de la Plantilla SEBIA suministrada con HYDRASYS Kit de Accesorios HYDRASYS IF SEBIA PN 1260 Kit de Accesorios HYDRASYS 9 BENCE JONES SEBIA PN 1266 Kit de Accesorios HYDRASYS 1 IF 1 BENCE JONES SEBIA PN 1267 Pipetas 10 pl y 200 pl SoNDaA Row MUESTRAS PARA ANALISIS Extracci n y conservaci n de las muestras El an lisis se realiza preferentemente con orinas frescas de 24 horas cuando esto no sea posible analice las orinas de la primera o segunda micci n matinal Las orinas deben obtenerse seg n los m todos
24. o quedan atrapados en la matriz del gel 4 Las prote nas precipitadas se visualizan mediante coloraci n Las bandas inmunoprecipitadas son entonces comparadas con las bandas anormales correspondientes presentes en el patr n electrofor tico de la muestra Para detectar e identificar las bandas monoclonales sospechosas la muestra es sometida a separaci n electrofor tica en seis pistas de forma simult nea Despu s de la electroforesis la pista ELP sirve de referencia al mostrar el patr n electrofor tico de las prote nas presentes en la muestra Las cinco pistas restantes permiten la detecci n del los componente s monoclonal es o su ausencia mediante un antisuero trivalente anti cadenas pesadas gamma alfa y mu antisueros individuales anti cadenas ligeras kappa y lambda libres o no y antisueros individuales anti cadenas ligeras kappa y lambda libres Esta t cnica r pida y simple proporciona una imagen clara y f cilmente interpretable REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS EN EL KIT HYDRAGEL 1 BENCE JONES HYDRAGEL 2 BENCE JONES HYDRAGEL 4 BENCE JONES E HYDRAGEL 9 BENCE JONES ATENCI N Ver las fichas de datos de seguridad KIT HYDRAGEL 1 BENCE JONES REF 4821 KIT HYDRAGEL 2 BENCE JONES REF 4822 KIT HYDRAGEL 4 BENCE JONES REF 4824 KIT HYDRAGEL 9 BENCE JONES REF 4883 Geles de Agarosa listos para usar 10 geles 10 geles 80 geles Esponjas tamponadas listas para usar 10
25. os antisueros anti cadenas ligeras libres Esta banda generalmente no migra al mismo nivel que la detectada con el antisuero trivalente 55 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 BENCE JONES 2014 03 Masque standard Standard mask La prote na de Bence Jones en diferentes formas de polimerizaci n se caracteriza por falta de reacci n con el antisuero trivalente varias bandas reveladas con uno de los antisueros anti cadenas ligeras libres y unidas las mismas bandas detectadas con los correspondientes antisueros anti cadenas ligeras libres Interferencias y limitaciones La utilizaci n de antisueros distintos a los especificados para la t cnica de inmunofijaci n realizada con la plantilla est ndar puede afectar a la calidad de los resultados Teniendo en cuenta los principios anal ticos de las t cnicas actuales principios de la electroforesis de zona resoluci n y sensibilidad no puede darse ninguna garant a respecto a la detecci n de la totalidad de todos los componente monoclonales Resoluci n de problemas Avisar al Servicio de Atenci n T cnica del distribuidor cuando el test no funcione pese a haber seguido cuidadosamente las instrucciones para la preparaci n y almacenaje de los materiales y para el procedimiento a seguir Las hojas de seguridad de los diferentes reactivos del kit as como las informaciones relativas a la eliminaci n de los desechos est n disponibles en el Servicio de Asistencia T cnica de su dis
26. plicaci n debidas a la desnaturalizaci n de prote nas o lipoprote nas Preparaci n de las muestras Orinas El an lisis se realiza en orinas no concentradas Bajo estas condiciones el nivel de detecci n de la prote na de Bence Jones es de 50 mg l Para una mayor sensibilidad concentrar las muestras lo que sea necesario NOTA En caso de orinas turbias concentradas o no se recomienda eliminar las part culas centrifugando las muestras Siga las recomendaciones habituales sobre la fase preanal tica aplicada al an lisis de las orinas o por filtraci n en un filtro de 0 45 um para obtener una buena difusi n en los aplicadores Sueros Para investigar la presencia de las prote nas de Bence Jones en la orina y el suero simult neamente diluya el suero con salina o con diluyente para inmunofijaci n prediluido a 1 4 1 volumen de diluyente 3 vol menes de agua destilada o desmineralizada a 1 10 para los carriles ELP GAM K y L 1 volumen de suero 9 vol menes de diluyente prediluido o de salina y a 1 3 1 volumen de suero 2 vol menes de diluyente prediluido o de salina para los carriles KI y LI NOTA Si la concentraci n total de inmunoglobulinas es inferior a 5 g l se recomienda diluir menos la muestra de suero con salina o con diluyente de inmunofijaci n prediluido a 1 4 1 volumen de diluyente 3 vol menes de agua destilada o desionizada Por ejemplo diluya el suero a 1 5 para los carriles ELP GAM K y L 1 volum
27. po cepillo de dientes seg n el protocolo indicado en las instrucciones MANTENIMIENTO DE LA PLANTILLA La plantilla debe estar completamente seca antes de volver a usarla Para eliminar las gotas de agua que hayan podido quedar atrapadas en los pocillos golpee la plantilla con cuidado sobre un papel suave y s quela BLOTTING DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOMATICAS Blotting a 40 C controlado mediante efecto Peltier durante 3 minutos Suena una se al audible El siguiente mensaje que aparece en pantalla es 4 PAP 4 PAPEL FILTRO GRUESO NOTA La tapa del m dulo de migraci n permanece cerrada durante el blotting 54 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 BENCE JONES 2014 03 Masque standard Standard mask V SECADO DEL GEL 1 Abrir la tapa del m dulo de migraci n 2 Extraer el papel de filtro dejando el gel en su posici n actual 3 Cerrar la tapa 4 Iniciar el procedimiento presionando la tecla START flecha verde situada a la izquierda en el teclado SECADO DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOMATICAS Secado a 50 C controlado mediante efecto Peltier durante 6 minutos Un pitido nos indica que la tapa se desbloquea El gel permanecer a 50 C mientras la tapa permanezca cerrada NOTA El m dulo de migraci n permanece cerrado mientras se produce el proceso de secado VI PUESTA EN MARCHA DEL PROCESADO DEL GEL 1 Abrir la tapa 2 Extraer el gel secado para su procesado posterior 3 Abrir el soporte del gel Coloc
28. raci n a 10 W constantes para el HYDRAGEL 1 BENCE JONES y a 20 W constantes para el HYDRAGEL BENCE JONES 2 4 hasta que se hayan acumulado 42 Vh durante unos 9 minutos y a 20 W constantes hasta que se hayan acumulado 31 Vh durante unos 7 minutos para el HYDRAGEL 9 BENCE JONES a 20 C siendo la temperatura controlada por efecto Peltier El soporte de los electrodos se eleva para desconectar los electrodos Un pitido audible se produce al finalizar la migraci n En pantalla aparece el siguiente mensaje Y AS Y ANTISUEROS NOTA El m dulo de migraci n permanece con la puerta cerrada durante todas las etapas de la migraci n ll PUESTA EN MARCHA DE LA INMUNOFIJACI N 1 Abrir la tapa del m dulo de migraci n 2 Extraer los aplicador es y desechar 3 Elevar ambos soportes extraer las esponjas tamponadas por sus extremos de pl stico y desechar Extraer ambos soportes Limpiar los electrodos son un pa uelo de papel h medo Mantener el gel en su posici n dentro de la c mara de migraci n 4 Colocar la plantilla de aplicaci n de antisueros como sigue Fig 5 Posicionar la gu a de la plantilla de aplicaci n en los dos pernos de anclaje interiores la gu a puede permanecer en el m dulo de migraci n todo el tiempo Sostener la plantilla por la solapa superior e insertarla en la gu a situando el gancho derecho en la muesca Hacer descender la plantilla hasta que se ponga en contacto con el gel Ajuste la pos
29. rworth Heinemann Woburn MA USA 1994 397 pp 3 JB Oudart et al 2014 Place des explorations urinaires dans le diagnostic et le suivi des gammapathies monoclonales en pratique quotidienne Ann Biol Clin 72 2 147 152 232 HYDRAGEL 1 2 4 amp 9 BENCE JONES 2014 03 Masque standard Standard mask SCH MAS FIGURES Figure 1 Figure 3 Figure 2 Figure 4 Figure 5 Figure 6 233 Masque standard Standard mask HYDRAGEL 1 2 4 amp 9 BENCE JONES 2014 03 SCH MAS FIGURES Figure 8 Figure 7 Figure 9 234
30. stras patol gicas dos orinas presentando respectivamente una cadena ligera libre Kappa d bil y una cadena ligera libre Lambda fuerte y un suero con una paraprote na de cadena ligera Lambda y una cadena ligera libre Lambda fueron analizadas repetidamente en tres geles HYDRAGEL 9 BENCE JONES de dos lotes diferentes Cada muestra analizada dio los mismos resultados en los dos lotes de geles comprobados Los perfiles obtenidos son t picos de cada muestra analizada y la inmunofijaci n evidencia las bandas monoclonales esperadas Reproductibilidad inter ensayo Ocho muestras patol gicas cinco orinas y tres sueros con prote nas de Bence Jones y una muestra de orina sin prote na de Bence Jones fueron analizadas repetidamente en 10 geles HYDRAGEL 9 BENCE JONES de tres lotes diferentes a raz n de nueve muestras diferentes por gel Cada muestra analizada dio los mismos resultados en los tres lotes de geles comprobados Los perfiles obtenidos son t picos de cada muestra y la inmunofijaci n evidencia las bandas monoclonales esperadas Adem s la inmunofijaci n de la muestra de orina sin prote na de Bence Jones no revel ninguna banda monoclonal en ninguno de los diez geles testados Exactitud Veintinueve muestras de orina y sueros patol gicos 21 orinas y 8 sueros con una o m s cadenas ligeras libres Kappa Lambda y siete muestras 6 orinas y 1 suero sin prote na de Bence Jones fueron analizadas en paralelo en el gel HYDRAGEL 9 BENCE JONE
31. trate las muestras como sigue mezcle 100 pl de orina y 5 ul de B mercaptoetanol diluido previamente a 1 10 con soluci n salina o con agua destilada o desionizada y aplique la muestra en el aplicador NOTA Los tubos de extracci n y los par metros de centrifugaci n de muestras biol gicas est n descritos en la documentaci n disponible sobre la fase preanal tica de los an lisis cl nicos datos suministrados por los fabricantes de tubos gu as y recomendaciones sobre la obtenci n de muestras biol gicas En ausencia de indicaciones en las instrucciones sobre el tipo de tubo a usar o sobre la centrifugaci n consulte esta documentaci n y para las dimensiones del tubo a utilizar consulte el documento de SEBIA Caracter sticas de los tubos a usar seg n el instrumento La fase preanal tica debe realizarse con la tecnolog a m s avanzada y siguiendo las diferentes recomendaciones incluyendo las suministradas por los fabricantes de tubos cumpliendo la reglamentaci n aplicable PROCEDIMIENTO El sistema HYDRASYS es un instrumento semiautom tico multiparam trico Las etapas autom ticas incluyen el procesado de los geles de agarosa HYDRAGEL en la siguiente secuencia aplicaci n de la muestra migraci n electrofor tica incubaci n con soluci n fijadora y antisueros secado tinci n destinci n y secado final Las etapas manuales incluyen el manejo de las muestras y los geles aplicaci n de la soluci n fijadora y antisueros y la p
32. tribuidor CARACTERISTICAS TECNICAS HYDRAGEL 4 BENCE JONES Reproducibilidad Entre geles Cuatro muestras de orina que conten an cadena ligera Bence Jones no polimerizada ya fuese kappa o lambda fueron analizadas en 10 geles del mismo lote usando el procedimiento habitual y el kit HYDRAGEL 4 BENCE JONES Entre lotes Se usaron dos muestras de orina que conten an cadena ligera Bence Jones no polimerizada ya fuese kappa o lambda Cada muestra se aplic en todas las pistas 24 de dos geles HYDRAGEL BENCE JONES 2 4 Un gel de los dos fue sometido a inmunofijaci n con el antisuero anti cadenas ligeras libres y unidas apropiado y el otro gel con el antisuero anti cadenas ligeras libres Para cada muestra se usaron de este modo geles procedentes de tres lotes diferentes Resultados Las prote nas de Bence Jones fueron identificadas correctamente en cada muestra y en todos los geles no hubieron falsos positivos y no se observaron diferencias entre las r plicas Exactitud Detecci n e Identificaci n de las Prote nas de Bence Jones Se analizaron treinta y seis orinas y diez muestras de suero patol gicas y normales usando el kit HYDRAGEL 4 BENCE JONES y otro sistema comercial de inmunofijaci n Los resultados de los dos procedimientos de inmunofijaci n estaban en perfecta concordancia entre ellos y con los resultados y diagn stico proporcionados por un hospital HYDRAGEL 9 BENCE JONES Reproductibilidad intra ensayo Tres mue
33. uesta en marcha del instrumento para la operaci n LEER CUIDADOSAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL HYDRASYS HYDRASYS 2 l PUESTA EN MARCHA DE LA MIGRACI N 1 Encender el HYDRASYS 2 Coloque un aplicador para el HYDRAGEL 1 BENCE JONES HYDRAGEL BENCE JONES 2 4 2 muestras dos aplicadores para el HYDRAGEL BENCE JONES 2 4 4 muestras 3 aplicadores para el HYDRAGEL 9 BENCE JONES en una superficie plana con los n meros de los pocillos hacia arriba Fig 1 Aplicar 10 yl de la muestra en cada pocillo Cargar cada aplicador en el plazo de 2 minutos 52 HYDRAGEL 1 2 4 amp 9 BENCE JONES 2014 03 Masque standard Standard mask PISTA MIGRACI N IMMUNOFIJACI N POCILLOS DE APLICACI N ELP GAM K L KI LI HYDRAGEL 1 BENCE JONES 1 2 3 4 5 6 HYDRAGEL BENCE JONES 2 4 MUESTRA N 1 3 2 3 4 5 6 7 MUESTRA N 2 64 9 10 11 12 13 14 HYDRAGEL 9 BENCE JONES MUESTRA N 1 407 1 2 3 4 5 6 MUESTRA N 2 508 7 8 9 10 11 12 MUESTRAN 3 609 13 14 15 16 17 18 IMPORTANTE En el an lisis hecho con HYDRAGEL BENCE JONES 2 4 no utilice los pocillos 1 8 y 15 se recomienda identificarlos previamente con un rotulador para evitar aplicar muestra en ellos por error Colocar el los aplicador es en la c mara h meda con el peine hacia arriba asirlos por el pl stico protector del peine Ver la hoja de instrucciones de la c mara h meda para m s detalles D
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