CAPILLARYS IMMUNOTYPING - Annar Diagnóstica Import
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1. Interpretation lg G Kappa 338 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 SCHEMAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES DE SERUMS ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES Profil biclonal Biclonal pattern 19 5 Kappa 19 M Kappa Figure 5 gt Paraprot ine limin e Decreased paraprotein gt Paraprot ine non affect e Not affected paraprotein de ELP lg G e Ig A Interpretation lg G Kappa Ig M Kappa 339 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 SCHEMAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES DE S RUMS ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES Profil biclonal Biclonal pattern lg G Kappa lg G Lambda Figure 6 gt Paraprot ine limin e Decreased paraprotein gt Paraprot ine non affect e Not affected paraprotein ELP IgG To Ig A 19 M e Interpretation lg G Kappa lg G Lambda 340 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 SCHEMAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES DE SERUMS ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES Profil oligoclonal Oligoclonal pattern Figure 7 ELP lg G Ig A 19 M 341 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 02. i Po 1 i Ex d 4 FS A 1 Tee 1 Interpretation Suspicion de cha ne l g re libre Kappa confirmer Kappa free light chain Suspected to confirm 842 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 SCHEMAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES D URINES ELECTROPHORETIC PATTERNS OF URINE SAMPLES Proteine monoclonale Monoclonal component mode de dilution Hypergamma Hypergamma dilution program Figure 9 gt Paraprot ine limin e Decreased paraprotein gt Paraprot ine non affect e Not affected paraprotein Albumin e Alpha 1 Apha2 Beta Gamma Albumin e Alpha 1 Albumin e Alpha 1 Alpha2 Beta Gamma Albumin e Alpha 1 Alpha2 Beta Gamma i i H H H H MAJ 1 H EN see Albumin e Alpha 1
3. CAPILLARYS IMMUNOTYPING Ref 2100 2014 06 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 UTILIZACION El kit CAPILLARYS IMMUNOTYPING permite la detecci n y caracterizaci n en medio alcalino pH 9 9 de las prote nas monoclonales inmunotipado en el suero y la orina humanos mediante electroforesis capilar en el sistema autom tico CAPILLARYS Debe usarse con el kit CAPILLARYS PROTEIN E 6 SEBIA que permite separar las prote nas en seis fracciones principales El sistema CAPILLARYS permite realizar todas las etapas de la electroforesis hasta la obtenci n de los perfiles proteicos para su an lisis cualitativo Cada muestra de suero u orina que se analiza se mezcla con antisueros de diferentes especificidades anti cadenas pesadas gamma lg G alfa Ig A y mu Ig M y anti cadenas ligeras kappa y lambda libres y ligadas Todas las prote nas separadas en capilares de s lice fundido son detectadas directamente en una burbuja existente en el capilar mediante espectrofotometr a de absorbancia a 200 nm Despu s los perfiles electrofor ticos son analizados visualmente para detectar las anomal as y caracterizar las prote nas monoclonales detectadas Para uso en diagn stico In Vitro NOTA En estas instrucciones el nombre CAPILLARYS es usado para designar los sistemas autom ticos CAPILLARYS CAPILLARYS 2 y CAPILLARYS 2 FLEX PIERCING SEBIA PRINCIPIO DEL TEST La electroforesis de prote nas de la orina o el suero humanos e
4. 1 1 i 1 i 1 i l Albumin e Alpha 1 Alpha2 Beta Gamma i Albumin e Alpha 1 Alpha2 Beta Gamma E NE Eod dg Interpretation lg G Lambda suspicion de cha ne l g re libre Lambda confirmer 19 G Lambda Lambda free light chain suspected to confirm 844
5. CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 BANDA MONOCLONAL P MUESTRA LIMITE DE DETECCION TIPO CONCENTRACI N g L 84 Alf 25 1 Ig A K 5 0 0 0 25 G 0 25 2 96 1 20 Lambda 0 25 Mu 0 25 3 lg M K 3 9 Kappa 0 25 El l mite de detecci n de un pico monoclonal es por tanto del orden de 0 25 g L NOTA El l mite de detecci n de un pico monoclonal puede variar en funci n de la posici n del pico monoclonal y del fondo policlonal de la zona de las gamma y beta globulinas 83 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 ANALISIS DE ORINAS TECNICA CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS ATENCION Ver las fichas de datos de seguridad 1 KIT CAPILLARYS PROTEIN E 6 SEBIA referencia 2003 Presentacion conservacion estabilidad y se ales de deterioro Vea las instrucciones del kit ATENCI N No use los segmentos de diluci n contenidos en el kit CAPILLARYS PROTEIN E 6 para la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE 2 KIT CAPILLARYS MINICAP URINE SEBIA referencia 2013 Presentacion conservacion estabilidad y se ales de deterioro Vea las instrucciones del kit Uso Permite preparar las muestras de orina para el an lisis de las prote nas urinarias humanas mediante electroforesis capilar en el sistema autom tico CAPILLARYS 3 AGUA DESTILADA O DESIONIZADA Uso Para la limpieza de los capilares del aparato autom tico pa
6. Alpha2 Beta i Albumin e Alpha 1 Apha2 Beta Gamma i b H H i H 1 1 1 1 H H j Interpretation Suspicion de cha ne l g re libre Lambda confirmer Lambda free light chain suspected to confirm 343 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 SCHEMAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES D URINES ELECTROPHORETIC PATTERNS OF URINE SAMPLES Profil biclonal Biclonal pattern mode de dilution Hypogamma Hypogamma dilution program Figure 10 gt Paraprot ine limin e Decreased paraprotein gt Paraprot ine non affect e Not affected paraprotein Albumin e Alpha 1 Alpha2 Beta Albumin e Alpha 1 Alpha2 Beta i Albumin e Alphai 2 Beta Gamma Albumine Alpha Alpha2 Beta Gamma i MEM i 1
7. orientado hacia la ventana de lectura Si la muestra colocada en el cargador no forma parte de los sueros seleccionados previamente se aplicar el modo de diluci n EST NDAR 7 Para cada muestra que vaya a analizar coja un segmento de antisueros nuevo saque la l mina de pl stico que lo precinta y col quelo en el mismo cargador que el tubo primario en caso de ausencia del segmento el cargador ser expulsado NOTA Los segmentos tienen una forma caracter stica con un saliente que evita colocarlos al rev s en los cargadores de muestras del sistema CAPILLARYS 8 Introduzca el o los cargador es con un tubo primario y el segmento de antisueros en el sistema CAPILLARYS por el orificio de entrada situado en medio del aparato Se pueden introducir hasta trece cargadores de muestras a la vez pudi ndose a adir nuevos cargadores de forma continua a medida que se vaya completando el an lisis de los cargadores ya introducidos 9 Saque de la cinta de salida situada a la izquierda del aparato los cargadores ya analizados 10 Coja con precauci n el segmento de antisueros usado y des chelo ATENCI N Manipule con precauci n los segmentos de antisueros que contengan muestras biol gicas DILUCI N MIGRACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS 1 Lectura de los c digos de barras de cada tubo primario de muestra y del cargador correspondiente 2 Diluci n del suero con el diluyente contenido en el pocillo doble del segmen
8. no hay garant as en cuanto a la detecci n total de todos los componentes monoclonales Vea MUESTRAS PARA EL AN LISIS Resoluci n de problemas Contacte con el Servicio de Asistencia T cnica de SEBIA en caso de que el an lisis sea defectuoso Las fichas de datos de seguridad de los diferentes reactivos del kit as como las informaciones relativas a la eliminaci n de los desechos est n disponibles en el Servicio de Asistencia T cnica de SEBIA CARACTER STICAS T CNICAS Reproducibilidad intraserial Se analizaron cinco muestras patol gicas con una gammapat a monoclonal o biclonal y una muestra normal usando la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE con el modo de diluci n HIPOGAMMA con 2 lotes diferentes de segmentos de antisueros cada segmento conten a el mismo reactivo en todos los pocillos soluci n ELP antisueros anti lg G anti Ig A anti Ig M anti Kappa y anti Lambda Todas las muestras analizadas proporcionaron los mismos resultados con los 2 lotes de segmentos probados y los perfiles obtenidos fueron los caracter sticos de cada una de las muestras En la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE el inmunotipado detect los componentes monoclonales en las 5 muestras patol gicas con gammapat a monoclonal o biclonal y no detect ning n pico en la muestra normal Reproducibilidad interserial e interlotes Se analizaron siete muestras patol gicas con una gammapat a monoclonal o biclonal y una muestra normal que
9. soluci n de hipoclorito de sodio y luego valide Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro La soluci n de hipoclorito de sodio diluida puede conservarse 3 meses a temperatura ambiente en un recipiente de pl stico cerrado herm ticamente protegido de los rayos solares y de cualquier fuente de calor o ignici n y alejado de los cidos y del amoniaco 84 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 6 SOLUCION DE LAVADO CAPILLARYS MINICAP Preparacion Cada vial de soluci n de lavado concentrada SEBIA referencia n 2052 2 viales de 75 mL debe completarse hasta 750 mL con agua destilada o desionizada Despu s de la diluci n la soluci n de lavado contiene una soluci n alcalina pH 12 Uso Para lavar los capilares del CAPILLARYS Reactivo adicional en caso de realizar series inferiores a 40 an lisis IMPORTANTE Antes de llenar el contenedor de soluci n de lavado se recomienda lavar con agua destilada o desionizada en abundancia el cuello del contenedor el conector y el tubo para evitar la acumulaci n de sales Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Las soluciones de lavado concentrada y diluida deben conservarse a temperatura ambiente o en nevera en contenedores cerrados para evitar la evaporaci n La soluci n concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial La soluci n diluida es estable durante 3 meses Deseche la soluci n de lavado diluida si camb
10. uno de los antisueros anti cadenas ligeras es caracter stica de una polimerizaci n de las inmunoglobulinas Para confirmar la presencia de un componente monoclonal en la muestra ser necesario realizar un tratamiento reductor con beta mercaptoetanol y repetir el an lisis tras el mismo En este caso prepare una soluci n reductora a adiendo un 1 de beta mercaptoetanol al Fluidil SEBIA referencia n 4587 1 vial de 5 mL Estando el sistema CAPILLARYS preparado para analizar muestras a ada 100 uL de soluci n reductora a 300 uL de suero puro Agite en el v rtex y deje que incube durante 15 minutos como m ximo y luego siga con el procedimiento habitual IMPORTANTE Despu s del tratamiento reductor con beta mercaptoetanol la muestra debe ser analizada inmediatamente no debe haber ning n otro cargador en espera de ser analizado en el sistema CAPILLARYS Despu s del tratamiento reductor con B mercaptoetanol la transformaci n de este perfil bi o tri clonal en perfil monoclonal permite concluir que s lo hay un clon Por otra parte hay que tener presente que el tratamiento del suero con B mercaptoetanol implica una degradaci n del complemento C3 visualizaci n de grandes deformaciones en la zona beta y la posible aparici n de un pico ancho entre las fracciones alfa 1 y alb mina La desaparici n de varios picos m ltiples con uno o varios antisueros anti cadenas pesadas y con los dos antisueros anti cadenas ligeras es cara
11. 6 SCHEMAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES D URINES ELECTROPHORETIC PATTERNS OF URINE SAMPLES Proteine monoclonale Monoclonal component mode de dilution Hypogamma Hypogamma dilution program Figure 8 gt Paraprot ine limin e Decreased paraprotein gt Paraprot ine non affect e Not affected paraprotein Albumin e Alpha 1 Alpha2 Beta Gamma i Albumin e Alpha 1 Alpha 2 Beta Gamma 1 1 H i i i H H i H H i i H H H ku zl MEM EL AA Albumin e Alpha 1 Alpha 2 Beta Gamma d Albumin e Alpha 1 Alpha 2 Beta Gamma y Albumin e 1 Alpha2 Beta Albumin e Alphai Alpha2 Beta Gamma Pow 3 MU i i i i
12. C Muestras a descartar No use muestras de orina antiguas o mal conservadas ya que las fracciones estar an muy modificadas debido a la degradaci n de las prote nas urinarias Se recomienda observar el aspecto de la orina despu s de la primera centrifugaci n por si hay hem lisis o turbidez No use muestras conservadas en un dispositivo de di lisis y concentraci n ya que algunas prote nas podr an haberse adsorbido a la membrana 85 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 NOTA Los tubos de extracci n y los par metros de centrifugaci n de muestras biol gicas estan descritos en la documentaci n disponible sobre la fase preanal tica de los an lisis cl nicos datos suministrados por los fabricantes de tubos gu as y recomendaciones sobre la obtenci n de muestras biol gicas En ausencia de indicaciones en las instrucciones sobre el tipo de tubo a usar o sobre la centrifugaci n consulte esta documentaci n y para las dimensiones del tubo a utilizar consulte el documento de SEBIA Caracter sticas de los tubos a usar seg n el instrumento La fase preanal tica debe realizarse con la tecnolog a m s avanzada y siguiendo las diferentes recomendaciones incluyendo las suministradas por los fabricantes de tubos cumpliendo la reglamentaci n aplicable PROCEDIMIENTO El sistema CAPILLARYS es un instrumento multiparam trico autom tico que permite realizar el an lisis de las prote nas urinarias en 6 capilares en paral
13. CAS Reproducibilidad intraserial Se analizaron cinco muestras de suero patol gicas con gammapat a monoclonal y un suero normal usando la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING con el modo de diluci n est ndar con 2 lotes diferentes de segmentos de antisueros cada segmento conten a el mismo reactivo en todos los pocillos soluci n ELP anti Ig G anti lg A anti lg M anti Kappa y anti Lambda Todas las muestras analizadas proporcionaron los mismos resultados con los 2 lotes de segmentos probados y los perfiles obtenidos fueron los caracter sticos de cada una de las muestras En la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING el inmunotipado detect s lo un componente monoclonal en las 5 muestras patol gicas y no detect ning n pico en el suero normal Reproducibilidad interserial e interlotes Se analizaron nueve muestras de suero patol gicas con gammapat a monoclonal que presentaban concentraciones de inmunoglobulinas lg diferentes con la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING usando el modo de diluci n HIPOGAMMA en 3 sueros cuya concentraci n de lg era a 8 g L con el modo de diluci n EST NDAR en 3 sueros cuya concentraci n de lg estaba comprendida entre 8 y 20 g L y con el modo de diluci n HIPERGAMMA en sueros cuya concentraci n de lg era gt a 20 g L Este an lisis se repiti 4 veces con lotes diferentes de segmentos de antisueros Todas las muestras analizadas proporcionaron los mismos resultados con los 3 lotes de segmen
14. E Se recomienda lavar con agua destilada o desionizada en abundancia el contenedor de limpieza antes de llenarlo LEA DETENIDAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL CAPILLARYS RESULTADOS Interpretaci n para el an lisis de orinas Ausencia de prote na monoclonal La desaparici n de las inmunoglobulinas policlonales en los perfiles de los antisueros con disminuci n de las fracciones gamma y beta sin la desaparici n de otros picos proteicos se observa en el an lisis de una orina normal o que presente una proteinuria glomerular con paso a la orina de inmunoglubulinas policlonales Presencia de una prote na monoclonal La presencia de una inmunoglobulina monoclonal completa se caracteriza por la desaparici n de un pico con uno de los anti cadenas pesadas gamma alfa o mu y con uno de los anti cadenas ligeras kappa o lambda La fracci n monoclonal detectada debe estar situada en la misma posici n de migraci n que la banda detectada en el perfil ELP La desaparici n de un pico con uno de los anti cadenas ligeras kappa o lambda sin desaparici n de ese pico con uno de los anti cadenas pesadas puede significar la presencia de una cadena ligera libre que habr que confirmar con las t cnicas HYDRAGEL BENCE JONES o HYDRAGEL IF SEBIA con los antisueros espec ficos anti cadenas ligeras libres kappa o lambda La desaparici n de un pico con uno de los anti cadenas pesadas sin desaparici n del mismo con los anti cadenas lige
15. S DE S RUMS ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES Figure 1 Serum Normal Normal serum lg G 335 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 SCHEMAS FIGURES PROFILS ELECTROPHORETIQUES DE SERUMS ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES S rum Hypergamma Hypergamma serum Figure 2 Immun complexe Immune complex ELP lg G Ig A lg Immun complexe Immune complex Immun complexe Immune complex 336 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 SCHEMAS FIGURES PROFILS ELECTROPHORETIQUES DE SERUMS ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES Prot ine monoclonale 0 5 g L Monoclonal component 0 5 g L Figure 3 gt Paraprot ine limin e Decreased paraprotein gt Paraprot ine non affect e Not affected paraprotein a Interpretation lg G Lambda EH als 337 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 SCHEMAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES DE S RUMS ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES lg G Kappa mode de dilution Hypergamma Hypergamma dilution program Figure 4 gt Paraprot ine limin e Decreased paraprotein gt Paraprot ine non affect e Not affected paraprotein ELP lg G Ig A lg M
16. aci n de los picos monoclonales detectados en la electroforesis El sistema CAPILLARYS posee 8 capilares en paralelo En este sistema la muestra que se va a analizar es inyectada por aspiraci n en el nodo simult neamente en seis capilares Para el inmunotipado el perfil proteico de referencia perfil ELP se obtiene mediante inyecci n de la muestra en presencia de la soluci n ELP en el capilar n 1 Los perfiles de los antisueros se obtienen por inyecci n de la misma muestra en presencia de los antisueros de diferentes especificidades anti lg G anti lg A anti lg M anti Kappa y anti Lambda en los cinco capilares siguientes n 2 a 6 La separaci n se realiza a continuaci n aplicando una diferencia de potencial de varios miles de voltios en los extremos de cada capilar y la detecci n directa de las prote nas se efect a a 200 nm en el lado cat dico Los capilares se lavan entre cada an lisis con una soluci n de lavado y luego con tamp n de an lisis La superposicion de uno de los perfiles de antisuero con el perfil ELP permite visualizar la desaparici n y o la disminuci n de un pico monoclonal en el perfil del antisuero y tipar una gammapatia NOTA Con el tampon de pH alcalino usado el orden de migraci n de las prote nas es el siguiente del c todo al nodo gamma globulinas beta 2 globulinas beta 1 globulinas alfa 2 globulinas alfa 1 globulinas y alb mina Cada fracci n contiene uno o varios constituyentes El comp
17. alizado durante el inmunotipado y permite obtener el perfil proteico de la muestra nativa perfil Ref Esta curva suplementaria permite comprobar la concordancia entre el an lisis de prote nas y el inmunotipado Estas comparaciones permiten identificar y caracterizar el o los componentes monoclonales IMPORTANTE El perfil proteico nativo perfil Ref no se superpone ni tampoco puede superponerse sobre ning n perfil de antisueros del inmunotipado FIN DE DE LA SECUENCIA DEL AN LISIS Hay que realizar un procedimiento de extinci n al acabar la sesi n de trabajo para conservar los capilares en condiciones ptimas IV LLENADO DE LOS CONTENEDORES DE REACTIVO El aparato autom tico CAPILLARYS permite una gesti n autom tica de los reactivos IMPORTANTE Es necesario seguir el procedimiento previsto para el cambio de los contenedores si no se hace correctamente los contenedores pueden despresurizarse y los an lisis pueden verse afectados y respetar el c digo de colores del contenedor conector en cada cambio de contenedor La aparici n de la ventana de gesti n de los reactivos indica que es necesario cambiar uno o varios reactivos colocar un nuevo contenedor de tamp n de an lisis y o llenar el contenedor de lavado con la soluci n de lavado reconstituida y o llenar el contenedor de limpieza con agua destilada o desionizada filtrada y o vaciar el contenedor de desechos ATENCI N No use agua destila
18. cada d a para evitar contaminaciones microbianas Para un funcionamiento ptimo se recomienda a adir 350 uL L de CLEAN PROTECT SEBIA referencia n 2059 1 vial de 5 mL IMPORTANTE Se recomienda lavar el contenedor de limpieza con agua destilada o desionizada en abundancia antes de llenarlo 3 CAPICLEAN Presentaci n El vial de la soluci n enzim tica concentrada CAPICLEAN SEBIA referencia n 2058 1 vial de 25 mL contiene enzimas proteoliticos surfactantes y componentes inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Uso Para la limpieza de la c nula de muestras del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA durante el ciclo de limpieza CAPICLEAN IMPORTANTE Cuando se realicen menos de 500 an lisis a la semana haga un ciclo de limpieza con CAPICLEAN al menos una vez por semana Cuando se realicen menos de 500 an lisis al d a pero m s de 500 an lisis a la semana haga un ciclo de limpieza con CAPICLEAN cada 500 an lisis Cuando se realicen m s de 500 an lisis al d a haga un ciclo de limpieza con CAPICLEAN una vez al d a Consulte la hoja de instrucciones del CAPICLEAN SEBIA IMPORTANTE Despu s de la limpieza de la c nula de muestras no reutilice el segmento de diluci n Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro El CAPICLEAN debe conservarse en nevera entre 2 y 8 C Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiq
19. ciones permiten identificar y caracterizar el o los componentes monoclonales En el an lisis de orinas las posiciones de las diferentes zonas proteicas Alb mina Alfa 1 Alfa 2 Beta y Gamma son indicadas en la pantalla de edici n y en el informe de resultados FIN DE LA SECUENCIA DEL AN LISIS Hay que realizar un procedimiento de extinci n al acabar la sesi n de trabajo para conservar los capilares en condiciones ptimas IV LLENADO DE LOS CONTENEDORES DE REACTIVO El aparato autom tico CAPILLARYS permite una gesti n autom tica de los reactivos IMPORTANTE Es necesario seguir el procedimiento previsto para el cambio de los contenedores si no se hace correctamente los contenedores pueden despresurizarse y los an lisis pueden verse afectados y respetar el c digo de colores contenedor conector en cada cambio de contenedor La aparici n de la ventana de gesti n de los reactivos indica que es necesario cambiar uno o varios reactivos colocar un nuevo contenedor de tamp n de an lisis y o llenar el contenedor de lavado con la soluci n de lavado reconstituida y o llenar el contenedor de limpieza con agua destilada o desionizada filtrada y o vaciar el contenedor de desechos ATENCI N No use agua destilada o desionizada comercial como por ejemplo el agua para planchar riesgo de deterioro importante de los capilares Use exclusivamente agua de calidad ultrapura como el agua para inyecci n IMPORTANT
20. co obtenido usando la tecnica CAPILLARYS PROTEIN E 6 ha permitido detectar un pico anormal despu s del analisis cualitativo 2 Encienda el CAPILLARYS y el ordenador de control 3 Abra el programa de gesti n PHORESIS CAPILLARYS y valide el nivel de los reactivos tras lo cual el aparato se iniciar autom ticamente Despues de unos 10 minutos el sistema CAPILLARYS estara listo para trabajar 4 Debe seleccionar el modo de diluci n que se aplicar autom ticamente a cada muestra seg n su concentraci n de inmunoglobulinas HIPERGAMMA si la concentraci n de inmunoglobulinas es superior a 20 g L caso de hipergammaglobulinemia HIPOGAMMA si la concentraci n de inmunoglobulinas es inferior a 8 g L caso de hipogammaglobulinemia EST NDAR en el resto de casos es el modo de diluci n seleccionado por defecto 5 Para el analisis de sueros use el kit CAPILLARYS IMMUNOTYPING con el programa de analisis IMMUNOTYPING 6 y el tampon de analisis CAPILLARYS PROTEIN E 6 Para seleccionar el programa de an lisis MMUNOTYPING 6 y colocar en su sitio el contenedor del tamp n CAPILLARYS PROTEIN E 6 lea detenidamente el manual de instrucciones del CAPILLARYS NOTA El paso de la t cnica CAPILLARYS PROTEIN E 6 a la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING e inversamente no requiere cambiar el contenedor del tamp n 6 Coloque 1 solo tubo primario en la posici n 1 de cada cargador de muestras de forma que el c digo de barras del tubo est
21. cter stica de un perfil oligoclonal Casos especiales En caso de desaparici n incompleta de un pico monoclonal en los perfiles de antisueros Repita el an lisis diluyendo m s el suero Seleccione el modo de diluci n EST NDAR en lugar del modo HIPOGAMMA e HIPERGAMMA en lugar de EST NDAR Muestras que contengan una o m s prote nas monoclonales de concentraci n muy elevada en modo de diluci n HIPERGAMMA En este caso el complejo formado con los antisueros aparece en forma de un pico ancho y grande entre las fracciones alb mina y alfa 1 la desaparici n del o de los pico s monoclonal es puede no ser completa en los perfiles de antisueros Muestras que contengan una o m s prote nas monoclonales polimerizadas En este caso el complejo formado con los antisueros puede aparecer en forma de un pico ancho y grande entre las fracciones alb mina y beta 1 Prote nas monoclonales que migran en las zonas beta 1 o beta 2 caso de ausencia de prote na monoclonal en la zona gamma seleccione el tipo de diluci n adaptado a la concentraci n de inmunoglobulinas de la muestra Encaso de sospecha de que haya una prote na monoclonal adicional en la zona gamma seleccione el tipo de diluci n adaptado a la intensidad de esta prote na monoclonal Presencia de biclonales Las biclonales pueden ser debidas a inmuncomplejos o a gammapat as biclonales o lo que es extremadamente raro a reacciones cruzadas ver Interfer
22. da o desionizada comercial como por ejemplo el agua para planchar riesgo de deterioro importante de los capilares Use exclusivamente agua de calidad ultrapura como el agua para inyecci n 80 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 IMPORTANTE Se recomienda lavar con agua destilada o desionizada en abundancia el contenedor de limpieza antes de llenarlo LEA DETENIDAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL CAPILLARYS CONTROL DE CALIDAD Se recomienda analizar un suero control como el Control IT IF SEBIA referencia n 4788 despu s de cada cambio de lote de uno de los reactivos NOTA Si es necesario el Suero Control Normal SEBIA referencia n 4785 puede ser usado como control negativo RESULTADOS Interpretaci n para el an lisis de sueros Ausencia de prote na monoclonal La desaparici n de las inmunoglobulinas policlonales en los perfiles de los antisueros con disminuci n de las fracciones gamma y beta sin desaparici n de otros picos proteicos se observa en el an lisis de un suero normal o que presente una hipergammaglobulinemia Presencia de una prote na monoclonal Una gammapat a presencia de una inmunoglobulina monoclonal se caracteriza por la desaparici n de un pico con uno de los antisueros anti cadenas pesadas gamma alfa o mu y con uno de los antisueros anti cadenas ligeras kappa o lambda La fracci n monoclonal detectada debe estar situada en la misma posici n de migraci n que la banda detectada en
23. de pl stico cerrado herm ticamente protegido de los rayos solares y de cualquier fuente de calor o ignici n y alejado de los cidos y del amoniaco 5 SOLUCI N DE LAVADO CAPILLARYS MINICAP Preparaci n Cada vial de soluci n de lavado concentrada SEBIA referencia n 2052 2 viales de 75 mL debe completarse hasta 750 mL con agua destilada o desionizada Despu s de la diluci n la soluci n de lavado contiene una soluci n alcalina pH 12 Uso Para lavar los capilares del CAPILLARYS Reactivo adicional necesario en caso de realizar series inferiores a 40 an lisis IMPORTANTE Antes de llenar el contenedor de soluci n de lavado se recomienda lavar con agua destilada o desionizada en abundancia el cuello del contenedor el conector y el tubo para evitar la acumulaci n de sales 78 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 Conservacion estabilidad y se ales de deterioro Las soluciones de lavado concentrada y diluida deben conservarse a temperatura ambiente o en nevera en contenedores cerrados para evitar la evaporaci n La soluci n concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial La solucion diluida es estable durante 3 meses Deseche la solucion de lavado diluida si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminacion microbiana NOTAS Las pruebas realizadas durante la validacion de los reactivos muestran que para las diferentes soluciones y usando material adapta
24. do al volumen a reconstituir una variaci n del volumen final de un 5 96 no tiene ning n efecto adverso en el an lisis El agua destilada o desionizada usada para la reconstituci n de las soluciones debe estar exenta de contaminaci n bacteriana o f ngica use un filtro lt 0 45 um y debe tener una resistividad superior a 10 Megohms x cm EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS 1 Sistema de electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA CAPILLARYS referencia n 1220 CAPILLARYS 2 referencia n 1222 6 CAPILLARYS 2 FLEX PIERCING referencia n 1227 2 Cargadores de muestras suministrados con el sistema CAPILLARYS 3 Contenedores de pl stico suministrados con el sistema CAPILLARYS contenedor para la limpieza de los capilares debe llenarse con agua destilada o desionizada contenedor de soluci n de lavado y contenedor de desechos MUESTRAS PARA EL AN LISIS Extracci n y conservaci n de las muestras El an lisis se hace con sueros frescos Los sueros deben obtenerse seg n los procedimientos establecidos de uso en el laboratorio cl nico Las muestras pueden conservarse un m ximo de 10 d as en nevera entre 2 y 8 C Para conservaciones m s prolongadas congele las muestras r pidamente como m ximo durante las 8 horas siguientes a su obtenci n Los sueros congelados son estables 1 mes NOTA No conserve los sueros a temperatura ambiente Las prote nas de los sueros conservados entre 2 y 8 C se degradan en particular e
25. ecauci n los segmentos de antisueros que contengan muestras biol gicas Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Los segmentos de antisueros deben conservarse en nevera entre 2 y 8 C Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el kit NO LOS CONGELE NOTA Durante el transporte los segmentos de antisueros pueden permanecer a temperatura ambiente entre 15 y 30 C durante 15 d as sin que la calidad del test se vea afectada ATENCI N No use agua destilada o desionizada comercial como por ejemplo el agua para planchar riesgo de deterioro importante de los capilares Use exclusivamente agua de calidad ultrapura como el agua para inyecci n a CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 ANALISIS DE SUEROS TECNICA CAPILLARYS IMMUNOTYPING REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS ATENCION Ver las fichas de datos de seguridad 1 KIT CAPILLARYS PROTEIN E 6 SEBIA referencia 2003 Presentacion conservacion estabilidad y se ales de deterioro Vea las instrucciones del kit ATENCI N No use los segmentos de diluci n contenidos en el kit CAPILLARYS PROTEIN E 6 para la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2 AGUA DESTILADA O DESIONIZADA Uso Para la limpieza de los capilares del aparato automatico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA Se recomienda usar agua destilada o desionizada filtrada con un filtro de porosidad lt 0 45 um y con una resistividad superior a 10 Megaohmios x cm Renueve el agua
26. el perfil ELP La desaparici n de un pico con uno de los antisueros anti cadenas ligeras kappa o lambda sin desaparici n de ese pico con uno de los antisueros anti cadenas pesadas puede significar a la presencia de una gammapatia de lg D 6 lg E que habr que confirmar con las t cnicas HYDRAGEL IF SEBIA con los antisueros anti cadenas pesadas delta o psilon b la presencia de una cadena ligera libre que habr que confirmar con las t cnicas HYDRAGEL BENCE JONES HYDRAGEL IF SEBIA con los antisueros espec ficos anti cadenas ligeras libres kappa lambda La desaparici n de un pico con uno de los antisueros anti cadenas pesadas sin desaparici n del mismo con los anti cadenas ligeras es rara Habr que confirmar la presencia de una enfermedad de cadenas pesadas gamma alfa o mu Presencia de varias prote nas monoclonales En presencia de varias prote nas monoclonales se aplica la misma interpretaci n Estos casos menos frecuentes corresponden a la proliferaci n de varios clones de c lulas B Una gammapat a biclonal ser detectada por la presencia de dos cadenas pesadas id nticas o diferentes y de dos cadenas ligeras id nticas o diferentes es decir por la desaparici n de los 2 picos con uno de los antisueros anti cadenas pesadas id nticas o diferentes y con uno de los antisueros anti cadenas ligeras id nticas o diferentes La desaparici n de varios picos con uno de los antisueros anti cadenas pesadas y con
27. elo con la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE seg n las etapas siguientes lectura de los c digos de barras del cargador y de la muestra de orina que se va a analizar diluci n de la muestra mezcla de la orina con la soluci n ELP y con los antisueros de las diferentes especificidades lavado de los capilares inyecci n de la muestra diluida separaci n y detecci n directa de las prote nas en los capilares Las etapas manuales son las siguientes colocaci n de los microtubos sin tap n que contienen las muestras de orina preparadas que se van a analizar en tubos de hem lisis que sirven de soporte y permiten colocar las muestras en los cargadores cada tubo de soporte debe estar identificado con el c digo de barras correspondiente a la muestra que se vaya a analizar colocaci n de un segmento de antisueros destapado en cada cargador de muestras introducci n en el sistema CAPILLARYS recuperaci n de los cargadores despu s del an lisis Un an lisis electrofor tico previo realizado en el sistema CAPILLARYS con el kit CAPILLARYS MINICAP URINE habr permitido seleccionar las muestras en las que el perfil proteico presenta un pico anormal mediante examen visual de los resultados LEA DETENIDAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL CAPILLARYS 1 PREPARACI N DEL AN LISIS ELECTROFORETICO 1 Seleccione las muestras cuyo perfil proteico obtenido con la t cnica CAPILLARYS URINE ha permitid
28. encias y limitaciones Desaparici n de lg M en los perfiles de los antisueros Kappa y Lambda En caso de sustracci n completa de un pico con los antisueros anti lgM anti cadenas ligeras Kappa y Lambda se recomienda realizar un tratamiento reductor de la muestra con beta mercaptoetanol ver el p rrafo anterior y repetir el inmunotipado En caso de reacciones m ltiples simult neas con los antisueros anti cadenas pesadas G A y M se recomienda repetir el an lisis de la muestra de suero seleccionando el modo de diluci n OPTIMIZADO sai CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 Interferencias y limitaciones Numerosos estudios han mostrado que la reaccion antigeno anticuerpo en fase liquida es diferente a la reaccion que ocurre en un gel La tecnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING se desarrolla totalmente en medio liquido y puede suceder que algunos antisueros den lugar a reacciones cruzadas con algunas proteinas monoclonales presentes en la muestra No hay ning n riesgo de falsos negativos es decir de no detectar una gammapatia pero esta reacci n cruzada extremadamente poco frecuente se presenta como un diagn stico de gammapatia biclonal cuando en realidad s lo hay una gammapatia monoclonal En cualquier caso la literatura indica que no hay diferencias entre los tratamientos de una gammapat a monoclonal y una gammapat a biclonal Kyle et al 1981 En caso de duda sobre un perfil biclonal se recomienda confirmar el res
29. entes recomendaciones incluyendo las suministradas por los fabricantes de tubos cumpliendo la reglamentaci n aplicable PROCEDIMIENTO El sistema CAPILLARYS es un instrumento multiparam trico autom tico que permite realizar el an lisis de las prote nas s ricas en 6 capilares en paralelo con la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING seg n las etapas siguientes lectura de los c digos de barras de los tubos primarios y del cargador de muestras diluci n de las muestras a partir del tubo primario mezcla del suero con la soluci n ELP y con los antisueros de las diferentes especificidades lavado de los capilares inyecci n de las muestras diluidas separaci n y detecci n directa de las prote nas en los capilares Las etapas manuales son las siguientes colocaci n de los tubos primarios en los cargadores de muestras colocaci n de un segmento de antisueros destapado en cada cargador introducci n en el sistema CAPILLARYS recuperaci n de los cargadores despu s del an lisis Un an lisis electrofor tico previo efectuado en el sistema CAPILLARYS con el kit CAPILLARYS PROTEIN E 6 habr permitido seleccionar las muestras en las que el perfil proteico presenta un pico anormal mediante un examen visual LEA DETENIDAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL CAPILLARYS 79 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 1 PREPARACI N DEL AN LISIS ELECTROFORETICO 1 Seleccione las muestras cuyo perfil protei
30. ia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana NOTAS Las pruebas realizadas durante la validaci n de los reactivos muestran que para las diferentes soluciones y usando material adaptado al volumen a reconstituir una variaci n del volumen final de un 5 no tiene ning n efecto adverso en el an lisis El agua destilada o desionizada usada para la reconstituci n de las soluciones debe estar exenta de contaminaci n bacteriana o f ngica use un filtro 0 45 um y debe tener una resistividad superior a 10 Megohms x cm EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS 1 Sistema de electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA CAPILLARYS referencia n 1220 CAPILLARYS 2 referencia n 1222 6 CAPILLARYS 2 FLEX PIERCING referencia n 1227 Cargadores de muestras suministrados con el sistema CAPILLARYS Contenedores de pl stico suministrados con el sistema CAPILLARYS contenedor para la limpieza de los capilares debe llenarse con agua destilada o desionizada contenedor de soluci n de lavado y contenedor de desechos 4 Tubos de hem lisis de 75 mm de altura y 13 mm de di metro MUESTRAS PARA EL AN LISIS Extracci n y conservaci n de las muestras El an lisis se hace preferentemente con orinas frescas de 24 horas Las orinas deben obtenerse seg n los procedimientos establecidos de uso en el laboratorio cl nico Las muestras de orina puede conservarse una semana en nevera entre 2 y 8 C Para conservaciones m s pr
31. l complemento C3 Preparaci n de las muestras Use directamente muestras de suero sin diluir Despu s de conservarlos en nevera entre 2 y 8 C o congelarlos algunos sueros especialmente aquellos que contengan una crioglobulina o un criogel se vuelven viscosos o turbios Una vez que hayan alcanzado el estado l quido se pueden analizar directamente Igualmente los sueros que contengan una inmunoglobulina polimerizada pueden analizarse directamente sin ning n tratamiento previo Se recomienda observar el aspecto del suero antes del an lisis por si hay hem lisis presencia de crioglobulinas o turbidez Muestras a descartar No use muestras de suero antiguas o mal conservadas ya que las fracciones beta estar an muy modificadas No use muestras de plasma El fibrin geno migra en posici n beta 2 pico adicional contenido en beta 2 NOTA Los tubos de extracci n de muestras biol gicas est n descritos en la documentaci n disponible sobre la fase preanalitica de los an lisis cl nicos datos suministrados por los fabricantes de tubos gu as y recomendaciones sobre la obtenci n de muestras biol gicas En ausencia de indicaciones en las instrucciones sobre el tipo de tubo a usar consulte esta documentaci n y para las dimensiones del tubo a usar consulte el documento de SEBIA Caracter sticas de los tubos a usar seg n el instrumento La fase preanalitica debe realizarse con la tecnolog a m s avanzada y siguiendo las difer
32. la ventana de lectura En caso de que la muestra colocada en el cargador no forme parte de las orinas seleccionadas previamente se aplicar el modo de diluci n HIPOGAMMA 10 Para cada muestra que vaya a analizar coja un segmento de antisueros nuevo saque la l mina que la precinta y col quelo en el mismo cargador en el que est el tubo de hem lisis que sirve de soporte al microtubo con la muestra preparada en caso de ausencia del segmento el cargador ser expulsado NOTA Los segmentos tienen una forma caracter stica con un saliente que evita colocarlos al rev s en los cargadores del sistema CAPILLARYS 86 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 11 Introduzca el o los cargador es en el sistema CAPILLARYS por el orificio de entrada situado en medio del aparato Se pueden introducir hasta trece cargadores de muestras a la vez pudi ndose a adir nuevos cargadores de forma continua a medida que se vaya completando el an lisis de los cargadores ya introducidos 12 Saque de la cinta de salida situada a la izquierda del aparato los cargadores ya analizados 13 Coja con precauci n el segmento de antisueros usado y des chelo ATENCI N Manipule con precauci n los segmentos de antisueros que contengan muestras biol gicas DILUCI N MIGRACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS 1 Lectura de los c digos de barras del cargador y de la muestra de orina correspondiente 2 Diluci n de la orina dializada con el di
33. lejo inmunoglobulinas de la muestra orina o suero inmunoglobulinas del antisuero espec fico aparece en una posici n muy an dica en la zona entre alfa 1 alb mina o m s an dico que la alb mina El innunotipado se realiza en cuatro etapas 1 Diluci n del suero o de la orina dializada con un diluyente espec fico contenido en el pocillo doble del segmento de antisueros La diluci n se adapta a la concentraci n de inmunoglobulinas de la muestra 2 Mezcla de la muestra diluida con los diferentes antisueros El complejo antigeno anticuerpo se forma rapidamente en el medio liquido sin etapa de incubaci n ni de precipitaci n 3 Inyecci n de las muestras tratadas por aspiraci n en 6 capilares en la parte an dica seguida de separaci n electrofor tica de las prote nas en medio alcalino mediante la aplicaci n de una diferencia de potencial de varios miles de voltios en los extremos de los capilares La detecci n directa de las prote nas se efect a a 200 nm en el lado cat dico 4 Superposici n del perfil ELP en los perfiles de los antisueros lg G lg A lg M Kappa y Lambda lo que permite la caracterizaci n de la proteina monoclonal REACTIVOS SUMINISTRADOS EN EL KIT CAPILLARYS IMMUNOTYPING ATENCI N Ver las fichas de datos de seguridad SEGMENTOS DE ANTISUEROS Preparaci n Los 60 segmentos de antisueros est n listos para usar y permiten analizar una muestra cada uno Est n compuestos por 7 pocillos que contiene
34. luyente contenido en el pocillo doble del segmento seguido de la dispensaci n de la muestra diluida en los 6 pocillos restantes soluci n ELP anti lg G anti Ig A anti lg M anti Kappa y anti Lambda con limpieza de la c nula de muestras entre cada diluci n El modo de diluci n seleccionado previamente para esa muestra se aplicar autom ticamente Si no se ha definido el modo de diluci n se aplicar el modo de diluci n HIPOGAMMA Lavado de los capilares Inyecci n de las muestras diluidas en los capilares Migraci n a voltaje constante con temperatura controlada por efecto Peltier durante unos 4 minutos Lectura a 200 nm y aparici n simult nea de los perfiles proteicos en la pantalla del ordenador NOTA Estas etapas se realizan consecutivamente para el primer cardador de muestras introducido los perfiles correspondientes a la primera muestra analizada se obtienen despu s de 10 minutos Para el cargador de muestras siguiente las fases 1 y 2 lectura de los c digos de barras y diluci n de la orina dializada se realizan durante la etapa 5 del cargador de muestras anterior oros ll AN LISIS DE LOS RESULTADOS Al acabar el an lisis cada uno de los perfiles obtenidos con los antisueros lg G lg A lg M Kappa y Lambda se superpone sobre el perfil ELP En caso de reacci n entre la prote na monoclonal y el antisuero espec fico el pico correspondiente desaparecer del perfil electrofor tico del antisuero Estas compara
35. m proteins Clin Chem 49 1909 1915 2003 5 Henskens Y et al Detection and identification of monoclonal gammopathies by capillary electrophoresis Clin Chem 44 1184 1190 1998 6 Jellum E et al Journal of Chromatography Biomedical Applications Diagnostic applications of chromatography and capillary electrophoresis J Chromatogr B 689 155 164 1997 7 Jenkins MA and Guerin MD Journal of Chromatography Biomedical Applications Capillary electophoresis procedures for serum protein analysis comparison with established techniques J Chromatogr B 699 257 268 1997 8 Joachim GR Cameron JS Chwartz M Belker EL 1964 Selectivity of protein excretion in patients with the nephrotic syndrome J Clin Invest 43 2332 2346 9 Katzmann JA et al Identification of monoclonal proteins in serum A quantitative comparison of acetate agarose gel and capillary electrophoresis Electrophoresis 18 1775 1780 1997 10 Keren DF Detection and characterization of monoclonal components in serum and urine Clin Chem 44 6 1143 1145 1998 11 Kyle RA Robinson RA Katzmann JA The clinical aspects of biclonal gammopathies Review of 57 cases Am J Med 71 6 999 1008 1981 12 Landers JP Clinical Capillary Electrophoresis Clin Chem 41 495 509 1995 13 Le Bricon T 2002 Identification et dosage des proteines urinaires au laboratoire d analyses Ann Biol Clin 60 525 540 14 Le Carrer D 1990 Pro
36. n respectivamente un medio de base soluci n ELP amarilla inmunoglobulinas totales de mam fero anti cadenas pesadas gamma rosa inmunoglobulinas totales de mam fero anti cadenas pesadas alfa azul oscuro inmunoglobulinas totales de mam fero anti cadenas pesadas mu verde amarillento inmunoglobulinas totales de mam fero anti cadenas ligeras kappa libres y ligadas verde claro inmunoglobulinas totales de mam fero anti cadenas ligeras lambda libres y ligadas azul claro un diluyente espec fico para la diluci n de los sueros y las orinas dializadas que contiene un marcador que permite superponer los perfiles de forma ptima 76 INSTRUCCIONES SEBIA Espa ol CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 Cada reactivo tiene un color especifico Los segmentos tienen una forma caracteristica y un saliente que evita colocarlos al reves en los cargadores de muestras del sistema CAPILLARYS Uso Segmentos de un solo uso para el inmunotipado de las prote nas mediante electroforesis en el sistema autom tico CAPILLARYS Deben colocarse en el cargador de muestras despu s de haber retirado la l mina que los recubre IMPORTANTE Antes de sacar la l mina que cubre el segmento compruebe que no haya gotas de reactivo en lo alto de los 6 pocillos y si se observan gotas gire el segmento con un movimiento r pido para que las gotas se re nan con el resto de la soluci n en el fondo del pocillo ATENCI N Manipule con pr
37. nsibilidad del 100 y una especificidad del 100 respecto a la t cnica de referencia calculadas seg n el m todo recomendado Wendling 1986 En las 6 muestras de orina normales correlaci n perfecta En las 22 muestras de orina con perfil policlonal correlaci n perfecta En las 33 muestras patol gicas correlaci n perfecta Se detect la presencia de paraprote nas o de cadenas ligeras libres en todas las muestras patol gicas con los dos sistemas de an lisis Sensibilidad La sensibilidad o l mite de detecci n m nimo de la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE para la detecci n de las cadenas ligeras libres Kappa y Lambda obtenida mediante diluci n serial de muestras de orina con prote nas de Bence Jones es del orden de 25 mg L para las muestras analizadas con los antisueros anti Kappa y anti Lambda del kit CAPILLARYS IMMUNOTYPING 88 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 BIBLIOGRAPHIE BIBLIOGRAPHY 1 Cameron JS 1987 The nephrotic syndrome Am J Kidney Dis 10 157 171 2 Chopin 1991 Etude de la prot inurie Inf Tech Biol 1 23 28 3 Clark R et al Rapid capillary electrophoretic analysis of human serum proteins qualitative comparison with high throughput agarose gel electrophoresis J Chromatogr A 744 205 213 1996 4 Gay Bellile C Bengoufa D Houze Le Carrer D Benlakehal M Bousquet B B Le Bricon T Automated multicapillary electrophoresis for analysis of human seru
38. o detectar un pico anormal despu s del an lisis cualitativo 2 Encienda el CAPILLARYS y el ordenador de control 3 Abra el programa de gesti n PHORESIS CAPILLARYS y valide el nivel de los reactivos tras lo cual el aparato se iniciar autom ticamente Despu s de unos 10 minutos el sistema CAPILLARYS estar listo para trabajar 4 Para cada muestra en el perfil proteico obtenido con el programa de an lisis URINE determine el valor del Ratio orina del pico anormal que quiera caracterizar vea el p rrafo Tratamiento de los datos de las instrucciones del kit CAPILLARYS MINICAP URINE EI Ratio orina se define a partir del cociente entre la superficie del pico anormal y la superficie total de las prote nas del Suero Control Normal 5 Seleccione el modo de diluci n que se aplicar autom ticamente seg n el valor del Ratio orina HIPOGAMMA si el valor del Ratio orina es inferior a 0 55 EST NDAR si el valor del Ratio orina est comprendido entre 0 55 y 1 55 si el valor del Ratio orina es superior a 1 55 NOTA Cuando el Ratio orina est situado a un 10 del valor l mite 0 55 6 1 55 se recomienda seleccionar el modo de diluci n en funci n del pico proteico anormal que se quiera caracterizar con la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE para mejorar la sensibilidad de detecci n de un pico de intensidad d bil diluya menos la muestra es decir seleccione el modo de dil
39. olongadas se recomienda congelar las muestras a 70 C las orinas congeladas son estables 1 mes como m nimo IMPORTANTE No congele las orinas a 20 C Las muestras degradadas o descongeladas pueden presentar fracciones deformadas con aparici n de peque os picos suplementarios como consecuencia de la degradaci n de las prote nas NOTA No conserve las muestras de orina a temperatura ambiente Preparaci n de las muestras Prepare previamente las muestras de orina seg n el protocolo de preparaci n di lisis y concentraci n indicado en las instrucciones del kit CAPILLARYS MINICAP URINE vea el p rrafo Reactivos necesarios no suministrados Use directamente las muestras de orina preparadas IMPORTANTE Para analizar las orinas mediante electroforesis capilar es necesario dializar y concentrar las muestras usando el sistema de di lisis SEBIA tubos de 20 mL Use un tubo por muestra La muestra dializada y concentrada con este sistema puede ser analizada a continuaci n con las t cnicas CAPILLARYS URINE y CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE Las muestras deben analizarse como mucho al d a siguiente de su preparaci n Para limitar la adsorci n de las prote nas urinarias a la membrana del dispositivo de di lisis y concentraci n sistema de di lisis SEBIA se recomienda no conservar la muestra dentro del sistema de di lisis tras la centrifugaci n sino dentro de un microtubo que puede guardarse en nevera entre 2 y 8
40. presentaban concentraciones proteicas diferentes con la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE usando el modo de diluci n HIPOGAMMA para 4 muestras cuyo ratio orina era lt a 0 55 con el modo de diluci n EST NDAR para 2 muestras cuyo ratio orina estaba comprendido entre 0 55 y 1 55 y con el modo de diluci n HIPERGAMMA para 2 muestras cuyo ratio orina era gt a 1 55 Este an lisis se repiti 4 veces con 3 lotes diferentes de segmentos de antisueros Todas las muestras analizadas proporcionaron los mismos resultados con los 3 lotes de segmentos probados y los perfiles obtenidos eran los caracter sticos de cada una de las muestras analizadas En la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE el inmunotipado detect los picos monoclonales esperados en cada una de las 7 muestras patol gicas El an lisis de la muestra normal permiti detectar un fondo policlonal sin presencia de pico anormal Exactitud Se analizaron en paralelo treinta y tres 33 muestras de orina patol gicas diferentes con paraprote nas o con cadenas ligeras libres Kappa o Lambda 22 muestras con un perfil policlonal y 6 muestras normales usando la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE y la t cnica de inmunofijaci n en gel de agarosa HYDRAGEL 9 BENCE JONES SEBIA t cnica de referencia para investigar la presencia de paraproteinas y cadenas ligeras libres Los resultados obtenidos mostraron una correlaci n perfecta entre los dos sistemas de an lisis con una se
41. ra electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA Se recomienda usar agua destilada o desionizada filtrada con un filtro de porosidad lt 0 45 um y con una resistividad superior a 10 Megaohmios x cm Renueve el agua cada d a para evitar contaminaciones microbianas Para un funcionamiento ptimo se recomienda a adir 350 uL L de CLEAN PROTECT SEBIA referencia n 2059 1 vial de 5 mL IMPORTANTE Se recomienda lavar el contenedor de limpieza con agua destilada o desionizada en abundancia antes de llenarlo 4 CAPICLEAN Presentaci n El vial de la soluci n enzim tica concentrada CAPICLEAN SEBIA referencia n 2058 1 vial de 25 mL contiene enzimas proteoliticos surfactantes y componentes inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Uso Para la limpieza de la c nula de muestras del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA durante el ciclo de limpieza CAPICLEAN IMPORTANTE Cuando se realicen menos de 500 an lisis a la semana haga un ciclo de limpieza con CAPICLEAN al menos una vez por semana Cuando se realicen menos de 500 an lisis al d a pero m s de 500 an lisis a la semana haga un ciclo de limpieza con CAPICLEAN cada 500 an lisis Cuando se realicen m s de 500 an lisis al d a haga un ciclo de limpieza con CAPICLEAN una vez al d a Consulte la hoja de instrucciones del CAPICLEAN SEBIA IMPORTANTE Despu s de la limpieza de la c nula de mue
42. ras es rara Habr que confirmar la presencia de una cadena pesada gamma alfa o mu Presencia de varias prote nas monoclonales La desaparici n de varios picos con uno de los antisueros anti cadenas ligeras puede observarse en caso de polimerizaci n de las cadenas ligeras libres AB CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 Casos especiales En caso de desaparici n incompleta de un pico monoclonal en los perfiles de los antisueros repita el an lisis diluyendo mas la orina Seleccione el modo de diluci n EST NDAR en lugar del modo HIPOGAMMA e HIPERGAMMA en lugar de EST NDAR Muestras que contienen una o m s prote nas monoclonales de concentraci n muy elevada en modo de diluci n HIPERGAMMA En este caso el complejo formado con los antisueros aparece en forma de un pico ancho y grande en las zonas alb mina y alfa 1 la desaparici n del o de los pico s monoclonal es puede no ser completa en los perfiles de antisueros La desaparici n de 2 picos con uno de los antisueros anti cadenas ligeras y de un solo pico con uno de los antisueros anti cadenas pesadas es debida a la presencia de una inmunoglobulina completa asociada a una cadena ligera libre Se recomienda seleccionar el modo de diluci n en funci n de la intensidad del pico proteico anormal que quiera caracterizar para mejorar la sensibilidad de detecci n de un pico de intensidad d bil o el inmunotipado de un pico de intensidad fuerte ver el p
43. rrafo Preparaci n del an lisis electrofor tico Interferencias y limitaciones Numerosos estudios han mostrado que la reacci n ant geno anticuerpo en fase l quida es diferente de la reacci n que ocurre en un gel La t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE se desarrolla totalmente en medio l quido y puede suceder que algunos antisueros den lugar a reacciones cruzadas con algunas prote nas monoclonales presentes en la muestra No hay ning n riesgo de falsos negativos es decir de no detectar una gammapatia pero esta reacci n cruzada extremadamente poco frecuente se presenta como un diagn stico de gammapat a biclonal cuando en realidad s lo hay una gammapat a monoclonal En cualquier caso la literatura indica que no hay diferencias entre los tratamientos de una gammapat a monoclonal y una gammapat a biclonal Kyle et al 1981 En caso de duda sobre un perfil biclonal se recomienda confirmar el resultado con las t cnicas de inmunofijaci n HYDRAGEL En ocasiones pueden observarse leves desplazamientos entre el perfil ELP y los perfiles de antisueros superpuestos especialmente en la zona beta 1 No deben confundirse con la desaparici n de un pico monoclonal en uno o varios perfiles de antisueros Use nicamente los antisueros espec ficos para la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE Teniendo en cuenta los principios anal ticos de las t cnicas actuales principios de la electroforesis de zona resoluci n y sensibilidad
44. s un an lisis muy til en el laboratorio de an lisis cl nicos para investigar las modificaciones del perfil proteico Paralelamente a las t cnicas de electroforesis en diferentes soportes entre los que est el gel de agarosa se ha desarrollado la t cnica de la electroforesis capilar que ofrece las ventajas de una automatizaci n completa del an lisis separaciones r pidas y una buena resoluci n Se define como una t cnica de separaci n electrocin tica realizada en un tubo de diametro interno inferior a 100 um lleno de un tamp n compuesto por electrolitos Se considera una tecnolog a intermedia entre la electroforesis de zona en soporte y la cromatograf a l quida El sistema CAPILLARYS usa el principio de la electroforesis capilar en soluci n libre que representa la forma m s corriente de electroforesis capilar Permite la separaci n de mol culas cargadas en funci n de su movilidad electrofor tica propia en un tamp n de un pH dado y seg n el pH del electrolito de un flujo electroendosm tico m s o menos importante Las inmunoglobulinas monoclonales marcadores de gammapat as son detectadas durante la electroforesis de prote nas En la electroforesis capilar se presentan en forma de picos anormales situados esencialmente en las zonas beta o gamma del perfil electrofor tico En las t cnicas CAPILLARYS IMMUNOTYPING y CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE el inmunotipado se realiza usando antisueros monoespec ficos y permite la identific
45. stras no reutilice el segmento de diluci n Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro CAPICLEAN debe conservarse en nevera entre 2 y 8 C Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial NO LO CONGELE Pueden observarse un precipitado o part culas agregadas en suspensi n fl culos en el vial del CAPICLEAN sin que su funcionamiento se vea afectado No resuspenda el precipitado o las part culas Se recomienda pipetear s lo el sobrenadante 5 SOLUCI N DE HIPOCLORITO DE SODIO para la limpieza de la c nula de muestras Preparaci n Prepare una soluci n de hipoclorito de sodio lej a con un 2 3 de cloro a partir de una dosis concentrada de 250 mL con un 9 6 de cloro diluida hasta 1 litro volumen final con agua destilada o desionizada fr a Uso Para la limpieza de la c nula de muestras del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA mantenimiento semanal para eliminar prote nas adsorbidas a la c nula Vea las instrucciones de uso del CAPILLARYS SEBIA Use el cargador n 100 espec fico para el mantenimiento Coloque en el cargador en la posici n 1 un tubo de hem lisis que contenga 2 mL de soluci n de hipoclorito de sodio preparada con anterioridad Introduzca el cargador n 100 de mantenimiento en el sistema CAPILLARYS En el men de la ventana MANTENIMIENTO que aparecer en pantalla seleccione la opci n Iniciar la limpieza de la c nula
46. t inuries Mise au point sur leur exploration biologique en 1990 L Eurobiologiste 190 395 405 15 Le Carrer D Nicolas A Ducasse L 1992 L analyse des prot inuries au laboratoire de biologie en 1992 Revue francaise des laboratoires 225 41 47 16 Le Carrer D Chopin N 1994 Profil prot ique urinaire Proposition d un protocole d exploration biologique des prot inuries Revue francaise des laboratoires 269 29 37 17 Philipon C 1989 Prot ines urinaires Int r t clinique et interpr tation Technique et Biologie 6 239 249 18 Oda RP et al Capillary electrophoresis as a clinical tool for the analysis of protein in serum and other body fluids Electrophoresis 18 1715 1723 1997 19 Waller KV Ward KM Mahan JD Wismatt DK 1989 Current concepts in proteinuria Clin Chem 35 755 765 20 Westermeier R Electrophoresis in Practice A Guide to Theory and Practice VCH Publishers New York NY 1993 21 Wendling A Proc dures de diagnostic ou de d pistage Justification et validit d un test de diagnostic ou de d pistage sensibilit sp cificit Impact Internat 1986 Sept 93 97 22 L Guis A Chaumier V Le Gall S Havrez F vrier 2013 Int gration du Capillarys 2 Flex Piercing Sebia dans un laboratoire de biologie m dicale sp cialis e Revue Francophone des Laboratoires 449 47 56 334 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2014 06 SCHEMAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUE
47. to seguido de la dispensaci n de la muestra diluida en los 6 pocillos restantes soluci n ELP anti lg G anti Ig A anti lg M anti Kappa y anti Lambda con limpieza de la c nula de muestras entre cada diluci n El modo de diluci n seleccionado previamente para esa muestra se aplicar autom ticamente Si no se ha definido el modo de diluci n se aplicar el modo de diluci n EST NDAR Lavado de los capilares Inyecci n de las muestras diluidas en los capilares Migraci n a voltaje constante con temperatura regulada por efecto Peltier durante unos 4 minutos Lectura a 200 nm y aparici n simult nea de los perfiles proteicos en la pantalla del ordenador NOTA Estas etapas se realizan consecutivamente para el primer cargador de muestras introducido los perfiles correspondientes a la primera muestra analizada se obtienen despu s de 10 minutos Para el cargador de muestras siguiente las etapas 1 y 2 lectura de los c digos de barras y diluci n del suero se realizan durante la etapa 5 del cargador anterior mo pO ll ANALISIS DE LOS RESULTADOS Al acabar el an lisis cada uno de los perfiles obtenidos con los antisueros 19 G lg A lg M Kappa y Lambda se superpone al perfil ELP En caso de reacci n entre la proteina monoclonal y el antisuero espec fico el pico correspondiente desaparecer del perfil electrofor tico del antisuero El an lisis del suero diluido con el diluyente contenido en el segmento de antisueros es re
48. tos probados y los perfiles obtenidos eran los caracter sticos de cada una de las muestras analizadas En la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING el inmunotipado detect los picos monoclonales esperados en cada muestra Exactitud Se analizaron 135 muestras de suero 119 muestras patol gicas diferentes y 16 sueros normales en paralelo usando la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING y la t cnica de inmunofijacion en gel de agarosa HYDRAGEL 9 IF SEBIA Los resultados obtenidos mostraron una correlaci n del 95 entre las dos t cnicas En los 16 sueros normales correlaci n perfecta En los 119 sueros patol gicos 112 sueros mostraron una correlaci n perfecta 4 sueros que presentaban una prote na monoclonal en muy baja cantidad sobre un fondo policlonal importante mostraron una correlaci n parcial 3 sueros con un perfil oligoclonal con bandas m ltiples tambi n mostraron una correlaci n parcial En todos los casos el diagn stico cl nico obtenido muestra una correlaci n perfecta entre los dos sistemas de an lisis en todas las muestras analizadas con una sensibilidad del 100 y una especificidad del 100 respecto a la t cnica de referencia calculadas seg n el m todo recomendado Wendling 1986 Sensibilidad Se diluyeron serialmente tres sueros con una gammapatia monoclonal en un suero normal y se analizaron usando la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING 82 Los resultados obtenidos se indican en la tabla siguiente
49. uci n HIPOGAMMA en lugar del EST NDAR o el EST NDAR en lugar del HIPERGAMMA para mejorar el inmunotipado de un pico de intensidad fuerte aumente la diluci n de la muestra es decir seleccione el modo de diluci n EST NDAR en lugar del HIPOGAMMA o el HIPERGAMMA en lugar del EST NDAR 6 Para el an lisis de orinas use el kit CAPILLARYS IMMUNOTYPING con el programa de an lisis IMMUNOTYPING URINE y el tampon de an lisis CAPILLARYS PROTEIN E 6 Para seleccionar el programa de an lisis IMMUNOTYPING URINE y colocar el contenedor de tampon CAPILLARYS PROTEIN E 6 lea detenidamente el manual de instrucciones del CAPILLARYS NOTA El paso de la t cnica modo de trabajo CAPILLARYS URINE a la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE e inversamente no requiere cambiar el contenedor de tamp n 7 Ponga 1 tubo de hem lisis vac o que servir de soporte en la posici n 1 de cada cargador y luego coloque el microtubo que contiene la muestra de orina dializada en el tubo de hem lisis asegur ndose de haber cortado el tap n del microtubo 8 Conserve el tap n de cada microtubo para la conservaci n posterior de la muestra en caso de que sea necesario IMPORTANTE Se recomienda identificar los tubos de hem lisis que sirven de soporte a los microtubos que contienen las muestras de orina a analizar con los c digos de barras correspondientes a las muestras de orina 9 Coloque el c digo de barras del tubo orientado hacia
50. ueta del vial NO LO CONGELE Pueden observarse un precipitado o part culas agregadas en suspensi n fl culos en el vial del CAPICLEAN sin que su funcionamiento se vea afectado No resuspenda el precipitado o las part culas Se recomienda pipetear s lo el sobrenadante 4 SOLUCI N DE HIPOCLORITO DE SODIO para la limpieza de la c nula de muestras Preparaci n Prepare una soluci n de hipoclorito de sodio lej a con un 2 3 de cloro a partir de una dosis concentrada de 250 mL con un 9 6 de cloro diluida hasta 1 litro volumen final con agua destilada o desionizada fr a Uso Para la limpieza de la c nula de muestras del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA mantenimiento semanal para eliminar prote nas adsorbidas a la c nula Vea las instrucciones de uso del CAPILLARYS SEBIA Use el cargador espec fico para el mantenimiento n 100 Coloque en el cargador en la posici n 1 un tubo de hem lisis con 2 mL de la soluci n de hipoclorito de sodio preparada anteriormente Introduzca el cargador n 100 de mantenimiento en el sistema CAPILLARYS En el men de la ventana MANTENIMIENTO que aparecer en pantalla seleccione la opci n Iniciar la limpieza de la c nula soluci n de hipoclorito de sodio y luego valide Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro La soluci n de hipoclorito de sodio diluida puede conservarse 3 meses a temperatura ambiente en un recipiente
51. ultado con las t cnicas de inmunofijaci n HYDRAGEL En ocasiones pueden observarse leves desplazamientos entre el perfil ELP y los perfiles de antisueros superpuestos especialmente en la zona beta 1 No deben confundirse con la desaparici n de un pico monoclonal en uno o varios perfiles de antisueros Use nicamente los antisueros espec ficos para la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING Teniendo en cuenta los principios anal ticos de las t cnicas actuales principios de la electroforesis de zona resoluci n y sensibilidad no hay garant as en cuanto a la detecci n total de todos los componentes monoclonales Ver MUESTRAS PARA EL AN LISIS Cuando una prote na monoclonal es detectada mediante las t cnicas de an lisis de prote nas en el CAPILLARYS t cnica CAPILLARYS PROTEIN E 6 y no es caracterizada mediante la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING se recomienda repetir el inmunotipado de la muestra trat ndola previamente con beta mercaptoetanol vea el p rrafo anterior y si persiste la duda confirmar el resultado obtenido usando una t cnica de inmunofijaci n en gel de agarosa Resoluci n de problemas Contacte con el Servicio de Asistencia T cnica de SEBIA en caso de que el an lisis sea defectuoso Las fichas de datos de seguridad de los diferentes reactivos del kit as como las informaciones relativas a la eliminaci n de los desechos est n disponibles en el Servicio de Asistencia T cnica de SEBIA CARACTER STICAS T CNI
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