Anyplex II RV16 detection
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1. ES ES ES ES EM ES EN ES ES KOM A Ea ES EON EM KON KION ER ES KON ES ESPE EO ES EI Fig 4 Plate Editor una nueva una existente para el experimento 2 Haga clic en Select Fluorophores para indicar los fluor foros FAM HEX CAL Red 610 Quasar 670 que seran utilizados en el experimento O Seegene A I sem 1004 Mode Charnes wel Grauens 7 a Plate Loading Guide lkaj 3 5 Or 7 ven 2 y Select a ct u mio he ent A Sample 1719 7130 Mepicate 4 uj a txperimem Satirgs A r Dew Mela Fig 5 Select Fluorophores FAM HEX CAL Red 610 y Quasar 670 3 Seleccione los pocillos y haga clic en Sample Type en el men desplegable Unknown Muestras cl nicas Control Negativo Control Positivo 4 Haga clic en las casillas de verificacion apropiadas FAM HEX CAL Red 610 y Quasar 670 para cargar los fluor foros en los pocillos seleccionados 5 Digite el nombre de la muestra y PC PC1 PC2 y presione la tecla enter 6 En settings del menu principal del Plate Editor elija el tamano de la placa 96 pozos y el tipo de placa BR White File Settings Tools B Zoom 100 Mode Chan2. aon amp amp WwW NH ry Completed Scan Mode All Channels Plate Type BR White Analysis Mode Baseline Subtracted Curve Fit Fig 12 Exportacion de las hojas de analisis de datos a la ubicacion especificada 5 Verifique que los resultados se guardaron en la ubicaci n designada File View Settings Tools 1 E zal A detente All Wells Organizar Incluir en biblioteca Compartir con Grabar Nueva carpeta 88 Oil e El admin_2011 12 02 14 17 20 CC014818 STI 1 admin_2011 12 02 14 17 20 CC014818 5 El admin 2011 12 02 14 17 20 CC014818 STI7 EI admin 2011 12 02 14 17 20 CC014818 STI7 E admin 2011 12 02 14 17 20 CC014818 STI7 El admin_2011 12 02 14 17 20_CC014818_STI7 Ei admin 2011 12 02 14 17 20_CC014818_STI7 admin_2011 12 02 14 17 20 CC014818 5 Allelic Discrimination Results Gene Expression Results Melt Curve Amplification Results Melt Curve Derivative Results Melt Curve Peak Results Melt Curve Plate View Results Melt Curve Summary Quantitation Ct Results El admin 2011 12 02 14 17 20 CC014818 STI7 El admin 2011 12 02 14 17 20_CC014818_STT 10 elementos i Nia a n la Tipo Hoja de c lculo de Microsoft Excel Qua Tama o 3 49 Fecha de modificaci n 17 07 2012 11 48 a m aon amp amp wm 6 Regrese al paso 3 s
3. Control Positivo del Panel B FAM HEX Cal Red610 Quasar 670 MPV HBoV 229E NL63 OC43 RSVA RSV HRVB IC erare Nombre Auto interpretacion aaa 7 Seegene CONFIGURACION DEL EQUIPO PARA PCR EN TIEMPO REAL Y ANALISIS DE RESULTADOS 1 Equipo para PCR en tiempo real CFX 96 Bio Rad 1 1 Programacion del Equipo para PCR en tiempo real Nota La programaci n del ensayo en el Equipo de PCR en tiempo real CFX 96 Bio Rad para la deteccion de Flu A Flu B RSV A RSV B MPV AdV 229E NL63 OC43 HRV A B C HEV HBoV PIV1 PIV2 PIV3 PIV4 y el Control Interno IC puede dividirse en tres pasos Programaci n del protocolo Programaci n de la placa Inicio del ensayo A Programaci n del protocolo 1 En el men principal haga clic en Protocol para abrir la ventana de Experiment Setup 25 Open lg Recent Data Files Repeat an Experiment H Gene Study Exit No instrument detected after 120 seconds User admin 17 07 2012 09 24 a m Fig 1 Programaci n del Protocolo Realice un nuevo protocolo cargue un protocolo ya existente para el experimento Seegene 2 En Protocol Editor defina el perfil termico como se menciona a continuaci n Segment No of cycles 1 12 13 14 15 16 17 1 1 30 10 Temperature 50 95 95 60 72 556 Duration 4 min 15 min 30 sec 1 min 30 sec 30 sec Melting
4. I MI eto anan Cure Dame Peet lame Sweteme 0 2 Coma 0 Sete 9 2 Gunter GI Cot im BBBREIGBGEREIRASE Completed 3 Egan Made AB Mate UM Medo Meds Besetre Directas Carve 3 Haga click sobre Step number 8 seleccione exportar todas las hojas de datos a Excel de herramientas del menu vem wor ee su Carve Dora Air een PA BEIN uu Tr di i Flames Gut Ome 4 a LI P 2 3 Fase Comat 0 Sample 0 Lumaj 6 rn hw Kinn om E Under mn 00m DO uova gt 9 GT D Querer Kinn 2t r 007 57d B vet Dor SUl D ve 008 Pu n B ast neo Qusa 67 D se 2 9 I rmpietnt AE Charmels Plate Type Whee Analysis Made Siulvraeted Cura Fa gt 2 2 3 3 4 4 5 5 mo Fig 11 Exportar todos los datos a Excel Seegene 4 guarde el resultado de la carpeta 1 cuando se abra una nueva ventana b aj Bibliotecas gt B Israel gt Equipo gt iu Red gt ERI Panel de control 15 Papelera de reciclaje gt l Clinical Evaluation Agreement
5. muestra COPAN Fabricante Dispositivo de recolecci n de Categoria No COPAN 606CS01P COPAN UTM con hisopos 360C 305C DIAGNOSTIC UTM con hisopo flexible 403 406C l HYBRIDS Nota nosotros recomendamos el uso de UTM o eNat cuando se aplican en el MICROLAM NIMBUS MICROLAB STARTIet B Almacenamiento de muestras La sensibilidad de un ensayo puede disminuir si las muestras son congeladas descongeladas rutinariamente durante periodos de tiempo prolongados e Almacene las muestras a 49 hasta por 72 horas antes de su procesamiento Almacene las muestras restantes a 70 C Transporte de muestras Para asegurar la calidad de las muestras estas deben transportarse tan pronto como sea posible Las muestras deben transportarse en las condiciones de temperatura indicadas 7 Seegene Transporte las muestras respiratorias entre 2 8 e Aseg rese de conocer todas las regulaciones aplicables para el transporte de agentes etiol gicos cuando traslade las muestras respiratorias 2 Aislamiento de cidos Nucleicos Diversos fabricantes ofrecen kits para aislamiento de cidos nucleicos La cantidad de muestra resultante puede variar dependiendo del protocolo utilizado Los kits de aislamiento deben ser validados para usar con este kit A Control Interno Nota El control Interno se incluye en el kit Esto le permite al usuario monitorear el procedimiento de aislamiento de cidos nucleicos y la posibil
6. Human nfuenza A virus Human influarnza A vrus H3N2 Human AVANZA A vrus HEN AT PA 544 ATCC VR 547 ATCC VR 822 FluA 7 Seegene 2 Sensibilidad Para determinar la sensibilidad del Anyplex II RV16 se hicieron diluciones seriadas est ndar de 10 a 10 copias de ADN plasm dico por reacci n y se analizaron con el kit Anyplex II RV16 El l mite de detecci n es de 50 copias por reacci n 3 Reproducibilidad Las pruebas de reproducibilidad fueron realizadas en tres diferentes tiempos en el transcurso de 10 d as por tres diferentes experimentadores Los mismos resultados fueron obtenidos en cada prueba confirmando la reproducibilidad del producto 7 Seegene REFERENCIAS 1 Jong Yoon Chun Kyoung Joong Kim In Taek Hwang Yun Jee Kim Dae Hoon Lee In Kyoung Lee and Jong Kee Kim 2007 Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of 2 19 gene Nucleic Acids Research 35 e 40 5 Bellau Pujol A Vabret Legrand J Dina 5 Gouarin J Petitjean Lecherbonnier Pozzetto C Ginevra and F Freymuth 2005 Development of three multiplex RT PCR assays for the detection of 12 respiratory RNA viruses Journal of Virological Methods 126 53 63 Coiras Perez Brena Garcia l Casas 2003 Simul
7. 7 Seegene Manual Usuario Il RV16 Detection V1 1 7 Seegene CE 7 Seegene Anyplex RV16 Detection Sistema de PCR Anyplex Y Il para la detecci n de virus de influenza A virus de influenza B virus sincitial respiratorio A virus sincitial respiratorio B adenovirus metapneumovirus coronavirus 229E coronavirus NL63 coronavirus OC43 parainfluenza virus 1 parainfluenza virus 2 parainfluenza virus 3 parainfluenza virus 4 rinovirus A B C enterovirus y bocavirus 1 2 3 4 a partir de muestras de aspirados nasofar ngeos hisopados nasofaringeos y lavado bronquio alveolar Para su uso con el 1 Sistema de PCR en Tiempo real CFX 96 Bio Rad IVD Uso para Diagnostico In Vitro 7 Seegene TABLA DE CONTENIDOS NOTIFICACIONES AA p PTTTExRRRT T 3 SO IRE OL pereis mar nen A 4 PRINCIPIOS Y DESCRIPCI N GENERAL DEL 4 ANTECEDENTE Susto slam rennen 7 REAG HVO Sis 13 MANEJO Y ALMACENAMIENTO ea nn 14 MATERIAL REQUERIDO NO INCLUIDO sss ssesessssssesssnnusnnnsnnunsnnnss 14 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES ss sssssssesssenssnnsqnncunntunnunnnns 15 TT rTTRRETT 16 CONFIGURACION DEL PARA PCR EN TIEMPO REAL Y AN LISIS DE RESULTADOS s ss s ssss ssu s su
8. HRV tienen 101 serotipos y son conocidos como la causa mas comun de resfriado El tama o del HRV tiene varios numeros de serotipos y el serodiagnostico es dificil Sin embargo este se puede diagnosticar a traves del PCR en la secreci n nasal No todos los HRV presentan los s ntomas unos comunes son rinitis y faringitis que hacen parte de las inflamaciones respiratorias altas Congesti n nasal descarga nasal y dolor de cabeza ocurren durante los 2 4 d as del periodo latente y el 30 40 est acompa ado por tos Fiebre leve puede aparecer en una semana pero dura m s de dos semanas para el 35 de los ni os En algunos casos las enfermedades del tracto respiratorio bajo severas pueden agravarse y resultar en asma para ni os y bronquitis cr nica en adultos 10 Bocavirus HBoV Los HBoV Familia Parvoviridae son virus no envueltos con genoma de ADN de cadena sencilla Los HBoV han sido reportados a nivel mundial con una frecuencia que va del 1 5 al 11 3 en las muestras respiratorias analizadas de individuos con enfermedad respiratoria aguda Se ha observado que los HBoV se asocian con un amplio espectro de enfermedades del tracto respiratorio tanto superior como inferior un tercio de las cuales es neumon a Como una de las causas de bronquiolitis y neumon a este tiene un 4 de oportunidad de asociaci n con otras enfermedades respiratorias y tiene una alta probabilidad de producir ataques de asma 7 Seegene 7 Seegene REAC
9. del pat geno verificar el control interno diluya la muestra en La se al del control PBX 10 100X y repita el paso de extracci n con interno no es la muestra diluida observada Diluya la muestra en Buffer salino 10X y repita el paso de extracci n Si el resultado es inv lido en uno de los dos panel repita el procedimiento usando los mismos m todos Presencia de inhibidores de PCR Descontamine todas las superficies e instrumentos con hipoclorito de sodio y etanol Use solo puntas con filtro durante el procedimiento de extracci n Cambie puntas entre tubos Repita el procedimiento de extracci n de cidos nucleicos con un nuevo set de reactivos Contaminaci n cruzada Reinicie el paso de extracci n o de PCR en entre PC1 y 2 tiempo real u Presencia de contaminaci n Falsos positivos cruzada se al observada en el control positivo 7 Seegene OBSERVACIONES CAUSAS DEL PROBLEMA SOLUCION Descontamine todas las superficies equipos con hipoclorito de sodio y etanol Utilice solamente puntas con filtro coobsemars naleso Presencia de contaminaci n durante el procedimiento de falsos positivos enel cemun extracci n Cambie las puntas Control Negativo entre cada tubo Repita la extracci n de cidos nucleicos con un nuevo set de reactivos Contaminaci n cruzada entre Reinicie el paso de extracci n o la PC1 y PC2 PCR en tiempo real Error en la recolecci n de la Recolecte una nueva
10. fabricacion Consulte instrucciones de uso 7 Seegene INFORMACION DE PEDIDO
11. muestra muestra Almacenamiento incorrecto de Recolecte la muestra y repita todo la muestra proceso Aseg rese de que el producto se almacene seg n las condiciones recomendadas Error en la extracci n de cido Re extraiga el cido nucl ico nucl ico Error en la adici n de cido Verifique el n mero de muestras para nucl ico a los tubos de PCR los tubos que contienen cido correspondientes nucleico y aseg rese de adicionar el cido nucleico en el tubo correcto durante el proceso de detecci n No se observan se ales o falsos negativos en el Control Positivo Diluya la muestra en buffer salino Presencia de inhibidores de PCR 10 y repita el paso de extracci n con la muestra diluida Los fluor foros para el an lisis Seleccione los fluor foros de datos no cumplen con el correctos para el an lisis de datos protocolo Repita el procedimiento de detecci n con los ajustes adecuados Programaci n incorrecta Verifique si todos los componentes Mezclado de la PCR incorrecto fueron o no adicionados Si usa el AZILO precompuesto debe reducir a sensibilidad Cada reactivo usado para la homogenizacion y gire hacia abajo el tubo de reactivo despues de la PCR de tiempo real Los reactivos permanecieron Verifique las condiciones de a temperatura ambiente por un almacenamiento y la fecha de tiempo prolongado O se caducidad ver la etiqueta en el almacenaron en condiciones kit de
12. o El PIV tipo 4 ha sido categorizado como el virus que m s f cil se transforma en formas m s severas La duraci n de los s ntomas es diversa El promedio es de 4 5 d as pero la detecci n puede tomar 2 3 semanas despu s de la infecci n con el virus debido a la baja potencia previniendo su r pido descubrimiento Si la fiebre tarda m s de 5 d as infecciones secundarias por virus tales como timpanitis y neumon a pueden ocurrir Para adultos las enfermedades en el tracto respiratorio alto son comunes pero puede resultar en la muerte por neumon a para pacientes con sistema inmune deprimido tales como los que tienen trasplante de m dula sea 8 Enterovirus HEV 7 Seegene Los enterovirus no tienen envoltura con un genoma de una cadena simple y positiva de ANA El HEV tiene 70 serotipos que se dividen en los grupos poliovirus coxsackievirus A otros enterovirus El HEV usualmente entra a los humanos via oro fecal pero tambien pueden viajar a traves del sistema respiratorio por infecciones a traves de las gotas En su mayorla los sintomas son similares al resfriado comun pero pueden presentarse otros sintomas tales como paralisis meningitis aseptica encefalitis inflamacion respiratoria baja salpullido enfermedades en manos pies boca mocarditis pericarditis y dolor de pecho 9 Rinovirus HRV Los HRV Familia Picornaviridae son virus no envueltos con genoma de ARN positivo de cadena sencilla Los
13. se forman f cilmente Adem s el CoV tiene diversos tipos de variaci n antig nica El CoV tiene s ntomas similares al resfriado com n tales como descarga nasal irritaci n nasal congesti n y estornudos En el caso de los ni os los s ntomas usuales incluyen dolor de garganta adenitis cervical fiebre leve y en ocasiones ataques de asma El CoV junto al 229E y OC43 produce enfermedades del tracto respiratorio alto en ni os y adultos el rango de frecuencia y grado de severidad son diferentes en cada temporada 7 Virus de la Parainfluenza PIV Los PIV Familia Paramyxoviridae son virus envueltos con un genoma de ARN negativo de cadena sencilla Los 4 tipos existentes del 1 al 4 se presentan en humanos y se transmiten por contacto directo con los pacientes y gotas infectadas Estos virus tienen 2 4 d as de periodo latente Los s ntomas son similares a la enfermedad respiratoria Tambi n hay fiebre y s ntomas generales raros El 80 resulta en enfermedades del tracto respiratorio alto El 50 de pacientes hospitalizados con bronquitis 15 de pacientes hospitalizados con bronquiolitis y el 15 de pacientes hospitalizados con neumon a y todos desarrolladas por PIV Los PIV del tipo 1 y 2 son la causa principal de laringo traqueo bronquitis en ni os de entre 2 y 4 a os de edad El PIV tipo 3 puede causar laringitis pseudomembranosa pero es la mayor causa de bronquiolitis y neumon a la cual es m s severa en ni os menores de 1 a
14. Seegene Anyplex II RV16 Detection AA Temperature lermperature Fluoro phore 2 NL63 lermperature Temperature FluB ER PU Temperature Temperature Temperature 2 Interpretaci n de Resultados Resultados Resultado u Control Interno Interpretacion 7 Seegene Acido nucleico objetivo detectado boe Virus respiratorios adicionales que no fueron detectados pueden estar presentes Inv lido Se al d bil o negativa del control interno es indicativa de una 0 toma de muestra inadecuada o errores en el procedimiento o presencia de inhibidores Procese otra al cuota de la muestra original y repita la prueba cyclic CMTA Result Cyclic Catcher Melting Temperature Analysis First CMTA point Second CMTA point Third point O O O o o o o EEE Si el control Interno o alguna otra se al no es detectada ver solucion de problemas La deteccion del control interno en el canal Quasar 670 no es requerida para resultados positivos Un alto titulo de otro analito puede llevar a una se al del control interno reducida o ausente Si el resultado es inv lido en uno del set A y el set B realizar repetici n 3 Aplicaci n a Muestras Cl nicas lt Muestra 1 Set A gt 7 Seegene Pico de fusi n 1 primer punto inti Melt eal FAM IE lad hli ra st lota nd otal 31d lotal M 1 l Pico de fusion 2 segundo pu
15. TIVOS Los reactivos contenidos en un kit son suficientes para 50 determinaciones REF RV7GO1Y SIMBOLO CONTENIDO VOLUMEN DESCRIPCION TOCE Oligo Mix TOM Reactivo para la amplificaci n y detecci n TOCE Oligo Mix TOM Reactivo para la amplificacion deteccion 4X Anyplex PCR ADN Polimerasa Master Mix 250 ul x 2 UDG Uracil DNA Glicosilasa con UDG Tamp n conteniendo dNTPS Control Positivo PC CONTROL RV16 PC1 80 ul Mezcla de clones de pat genos positivos Control Positivo PC ONTROL RV16 PC2 80 ul Mezcla de clones de pat genos positivos Ultrapura Grado PCR Agua libre de Control negativo Agua Water DNA RNasas een esterilizada como control negativo RV16 IC 500 uL Control Interno Ex geno IC Manual de usuario TM es una marca registrada de Seegene Inc 7 Seegene MANEJO Y ALMACENAMIENTO Los componentes de Anyplex II RV16 Detection almacenarse 20 son estables hasta la fecha de caducidad marcada en la etiqueta congelamiento descongelamiento repetido debe evitarse ya que podria reducir la sensibilidad Si los reactivos seran usados manera intermitente deberan almacenarse en alicuotas MATERIAL REQUERIDO NO INCLUIDO e Guantes desechables libres de talco latex o nitrilo e Pipetas ajustables y puntas est riles e Microcentr fuga para tubos 1 5 ml e Kit para aislamiento de cidos nucleicos ver Aislamiento de cidos Nucle
16. a recoger el liquido residual de las paredes de los tubos 2 Realice las reacciones de sintesis CADN como se muestra a continuacion Segmento Numero de ciclos Temperatura Duracion 1 1 25 C 5 min 2 1 37 C 60 min 3 1 95 C 2 min Nota Almacene todas las muestras de cADN a 20 C hasta su uso 4 Preparaci n del PCR en tiempo real Nota deben usarse los tubos y tapas correctas ver MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS Nota las puntas resistentes a los aerosoles y guantes ajustados deben usarse para la preparaci n de las muestras Tenga precauci n para evitar la contaminaci n cruzada Nota Descongelar completamente Nota Centrifugue brevemente los tubos de reactivos para remover las gotas del iterior de la tapa A Preparaci n de la PCR Master Mix 5 ul 4X RV16 A TOM o B TOM 5 ul 4x Anyplex PCR Master Mix con UDG 2 ul Agua libre de RNasa 12 ul Volumen Total de PCR Mastermix Nota Calcular la cantidad necesaria de cada reactivo necesitado basado en el nimero de reacciones muestras y controles B Mezcle por inversion 5 veces o en el vortex C Tome una alicuota de 12 ul de la PCR Mastermix en tubos de PCR y cierre las tapas D Adicione 8 ul de cada muestra de acidos nucleicos dentro del tubo 12 ul PCR Master Mix 8 ul Muestra de cido nucleico 20 ul Volumen Total de reaccion Nota Utilice una punta de pipeta nueva con cada muestra diferente Nota Para el Control Negativo utilice 8
17. adultos y bronquiolotis en bebes Usualmente el VSR causa neumon a en infantes y m s pacientes quienes son diagnosticados como infecciones del tracto respiratorio bajo son m s j venes que 2 a os en su mayor a m s j venes de 6 meses de edad Aunque los adultos tienen buenos niveles de inmunidad por las repetidas infecciones por virus respiratorios desde su infancia el sistema inmune es limitado imperfecto y vulnerable a los virus respiratorios Sin embargo los pacientes con sistema inmune deca do pueden desarrollar infecciones del tacto respiratorio bajo tales como neumon a En casos por Influenza hay variaci n en el tama o antig nico viral pacientes con enfermedades subyacentes pueden dar como resultado la muerte del paciente Investigaciones recientes afirman que el VSR produce los mismos s ntomas que la gripe 2 Virus de la influenza Los virus de la influenza Familia Orthomyxoviridae presentan un genoma de cadena sencilla de ARN que contiene 8 segmentos distintos y separados de ribonucleoproteinas Esta segmentaci n del genoma es poco com n entre los virus y muy probablemente contribuye al r pido desarrollo de nuevas variedades de influenza a trav s del intercambio de segmentos gen micos entre virus diferentes que infectan la misma c lula Existen 3 tipos A B y C A y B son los virus m s comunes Especialmente el virus tipo A es conocido como el m s com n por infectar no solo humanos tambi n aves y varios tipos d
18. curve 55 85 5510 5 95 60 72 55C 30 sec 1 min 30 sec 30 sec Melting curve 55C 85C 5510 5 95C 60 726 55C 30 sec 1 min 30 sec 30 sec Melting curve 55C 85C 5510 5 Nota Lectura de placa en el segmento 7 12 y 17 Fluorescencia es detectada durante la disociacion Foto non I RA File Settings Tools Insert Step Sample Volume eaj Insert Step 2 950 for0 30 20 ul Est Run Time 02 58 00 TE Insert Gradient Insert GOTO Insert Melt Curve for 0 05 Plate Read EN Add Plate Read to Step 2h Step Options 7 Delete Step 3 Haga clic en Sample Volume modifique el valor a 20 uL 4 Haga clic en OK se abrira la ventana Experiment Setup 7 Seegene ions Protocol gt Start Run Selected Protocol Prueba protocolo prel Preview Est Run Time 02 58 00 96 Wells All Channels Fig 3 Experiment Setup Protocol Programacion de la placa 1 En Experiment Setup Plate haga clic en Create New para abrir la ventana Plate Editor para crear una nueva placa ress Load QuickPlate_96 wells_All Channels pltd Selected Plate QuickPlate 96 wells All Channels pltd Preview Fluorophores FAM HEX Texas Red Cy5 Quasar 705 4 y
19. e mam feros Entre los virus de influenza que invaden humanos el H1N1 y H3N2 son un problema por infectar ni os y ancianos El tipo B y C se conocen solamente en el humano Inician los s ntomas por influenza son descarga nasal congesti n nasal dolor de 7 Seegene garganta tos fiebre nasofaringitis o s ntomas similares por rinitis aguda escalofri y dolor muscular los cuales pueden representar un resfriado m s severo que regular Caracter sticamente los s ntomas de influenza llevan alta fiebre y desarrolla complicaciones acompa adas de infecciones bacterianas 3 Virus Sincitial Respiratorio RSV El virus sincitial respiratorio Familia Paramyxoviridae es un virus envuelto con un genoma de ARN negativo de cadena sencilla el VSR tiene alta frecuencia de ocurrencia entre otras enfermedades respiratorias Est caracterizada como cl nicamente significativa por causar muertes en bebes con malformaciones cong nitas cardiacas infantes prematuros y bebes con reciente cirug a de coraz n abierto La bronquiolitis es la tipo m s com n de VSR en infantes pero no aparece tan a menudo despu s de un a o de edad De otra mano la neumon a es un problema para todos los infantes El VSR es el responsable de desarrollar el 45 75 de bronquiolitis 15 25 de neumon a en infantes y 6 8 de tos El VSR fue originalmente conocido como pat genos que desarrollaban enfermedades en bebes pero estudios recientes mostraron que el VSR ocurre
20. eleccione Paso numero 14 Repita pasos 4 5 guarde en archivo 2 Regrese al paso 3 seleccione Paso numero 20 Repita pasos 4 y 5 y guarde el archivo 3 7 Seegene Step number Designated folder 8 14 2 20 3 C Ajustes para el an lisis de datos en el Seegene Viewer 1 Abra en pantalla el programa Seegene Viewer haga clic en Open para encontrar los archivos guardados ero Qstar Ora Met Peak Wel rt Sar Well Sample No Patient Id 000000 00 0000000 00000000 fie Edi KI Re A EN SA EO O sf 0 Men A Fig 14 Seegene viewer 2 Despu s de abrir el archivo de resultados 1 Seleccione los pocillos de las muestras 2 Haga clic en el bot n Menu y seleccione la prueba realizada de las opciones de la lista Haga clic en Apply para obtener el resultado final 7 Seegene Fig 15 Ajustes para el an lisis de datos en el Seegene viewer 3 Verifique el resultado en cada pozo File Edt Option 2348567 a SOOOVOGE 9000000 RE wer rue Menu bom Open 9 Votos Aryples 8 RV16 Detechon 8 stro Imegration Rents Ase Beet SampleNo Patentid Name Well Tamet Rest Interpretation se Pry PIV PO FILE Fig 16 Resultados de la prueba en el CFX 96 mediante el Seegene viewer 7 Seegene RESULTADOS 1 Informacion de analitos
21. en adultos puede producir resultados tan grave como la gripe tales como la transferencia y llevando a la muerte Adem s si los pacientes tienen el sistema inmune suprimido y son infectados por VSR que causa neumon a la probabilidad de que se produzca la muerte es de un 50 4 Adenovirus AdV Los adenovirus Familia Adenoviridae son virus no envueltos con ADN de doble cadena De estos hay siete especies divididas de la A a la G y 57 n meros de serotipos El s ntoma m s com n de la infecci n por adenovirus es infecci n en el tracto respiratorio superior la cual se relaciona con las especies B y C Junto con AdV inflamaci n de ojos amigdalitis timpanitis laringitis y gastro enteritis aparecen en los pacientes Si los ni os son infectados por AdV pueden desarrollar bronquioloitis o neumon a la cual puede ser severa M s personas tienen la habilidad de cuidarse ellos mismos pero el AdV puede causar la muerte en pacientes con deficiencia en la inmunidad y raramente algunos individuos saludables mueren por la infecci n 5 Metapneumovirus MPV Los Familia Paramyxoviridae son virus envueltos con un genoma de ARN negativo de cadena sencilla El MPV es un pat geno viral respiratorio que se ha expandido por todo el mundo y tiene un 5 a 10 de oportunidad de co infecci n con otros virus respiratorios Sus s ntomas son similares con los del VSR El MPV puede producir infecciones respiratorias menores tales como bronquiolit
22. icos e ProteinasaK para SEEPREP12 No De Cat P4850 SIGMA e Kit de Transcripci n reversa No De Cat SGRT801 Seegene e M quina de hielo e Centr fuga de mesa e Agitador vortex e Equipo para PCR en tiempo real cFX 96 Bio Rad e Tiras de 8 tubos de bajo perfil de 0 2 ml sin tapas color blanco No Cat TLS0851 Bio Rad e Tiras de 8 tapas planas de grado ptico No Cat TCS0803 Bio Rad Plato de 96 pozos pozo blanco cat No HSP 9655 Bio Rad 7 Seegene PROTOCOLO 1 Toma de Muestra Almacenamiento y Transporte Nota Todas las muestras tienen que ser tratadas como materiales potencialmente infecciosos S lo las muestras que sean recogidas transportadas y almacenadas atiendan estrictamente las siguientes normas e instrucciones ser n permitidas Nota Para garantizar una alta calidad de las muestras se deben transportarse lo m s r pidamente posible Las muestras tienen que ser transportadas en las condiciones de temperatura indicadas A Recolecci n de las muestras Aspirado nasofar ngeo hisopado nasofar ngeo lavado bronquioalveolar e El aspirado nasofaringeo el hisopado nasofar ngeo y el lavado bronqueoalveolar son examinadas rutinariamente para patogenos respiratorios comunes e Obtener las muestras puede ser dif cil en algunos pacientes En tales casos el hisopado nasofar ngeo puede recolectarse simple y eficientemente con el hisopo de nylon El medio universal de transporte UTM y el eNat
23. idad de inhibici n de la PCR e Agregar 10 uL de IC a cada mezcla de la soluci n de muestra y buffer de lisis o directamente al buffer de lisis Nota En el caso de adicionarlo directamente al buffer de lisis es posible que se formen burbujas debe ser cuidadoso B Kits de Preparaci n manual Kit de Aislamiento Kitde Aislamiento Fabricante _ Fabricante No De Cat Vol Recomendado QlAamp MinElute Virus Spin Kit QIAGEN 57704 Muestra 190 uL Eluci n 40 uL Ribo spin vRD GeneAll 302 150 Muestra 290 uL Viral RNA DNA Extraction kit 561701 Eluci n 40 uL Para ambos virus respiratorios y muestras con bacterias respiratorias Equipos de Purificaci n Automatizada SEEPREP12 Equipo de Extracci n Automatizada Vol Recomendado SEEPREP12 NorDiag SPN1200 SEEPREP12 Viral NA Kit NorDiag SPN1004 Muestra 530 uL Elucion 60 uL SI usted desea adquirir los productos mencionados a traves de Seegene Inc por favor use este numero de catalogo 7 Seegene C 1 SEEPREP12 1 Adicione 10 uL de Proteinasa 20mg mL cada tubo esteril para muestra de 1 5 mL debidamente etiquetado 2 Transfiera 540 uL de muestra incluyendo los 10 uL del RV16 IC al tubo que contiene los 10 uL de Proteinasa K mezcle el contenido mediante ligeros golpecillos Coloque el tubo de elucion de 1 5 mL en el interior del equipo Presione Continue en la primera pantalla para permitir q
24. ireccional Siempre use guantes desechables en cada rea y c mbielos antes de ingresar a las diferentes reas Cambie los guantes inmediatamente si se contaminan o tr telos con reactivo DNA decontaminante Dedicar suministros y equipo a las reas de trabajo separadas y no moverlos de un rea a otra No pipetee con la boca No coma beba o fume en las reas de trabajo del laboratorio Use guantes desechables libres de polvo bata de laboratorio y gafas protectoras cuando manipule muestras y reactivos Lave las manos despu s de manipular muestras y los reactivos de la prueba Evite contaminar los reactivos al extraer al cuotas de los tubos de reactivos Se recomienda el uso de puntas para pipetas est riles desechables y con filtro resistente a aerosoles No mezcle los reactivos de diferentes lotes o de tubos diferentes del mismo lote No use este producto despu s de la fecha de vencimiento Use tubos de tapa rosca y evite las salpicaduras o contaminaci n cruzada de muestras durante la preparaci n Se cuidadoso para no contaminar los reactivos con cidos nucleicos extraidos productos de la PCR y control positivo Para prevenir la contaminaci n delos reactivos se recomienda usar puntas con filtro Use reas separadas para cada experimento Use un set diferente de pipetas para cada rea extracci n de ADN mezcla de reactivos la adici n de cido nucleico de molde y la adici n del producto de PCR Solo en un espacio designado abra
25. is crup neumon a infecciones respiratorias severas y es conocida por estar relacionada con el deterioro del asma Entre los ni os que son hospitalizados por infecciones en el tracto respiratorio bajo los pacientes con MPV positivas tienen fiebre 86 tos 90 y disnea 80 como s ntomas comunes Sin embargo las sibilancias 56 se muestran en ni os que eran sanos antes de la infecci n y ni os con historia m dica de asma El 12 de los pacientes 7 Seegene que fueron tratados por infecciones en el tracto respiratorio bajo se les detect MPOV positivo Este porcentaje es alto despu s de la de VSR Tambi n el MPV es una de las mayores causas de ataque de asma bronquial en ni os y adultos 6 Coronavirus CoV Los CoV Familia Coronaviridae son virus envueltos con un genoma de ARN positivo de cadena sencilla Los CoV tienen varios tipos y cada uno puede producir infecciones a mam feros y aves El CoV se divide serol gicamente en tres grupos l 1 de acuerdo a su antigenicidad Sin embargo despu s del descubrimiento del s ndrome respiratorio agudo en 2003 fue originado en animales y se cre un cuarto grupo Entre el CoV que fue aislado en humanos HCoV 229E es el pat geno representativo para el grupo l el cual tiene antigenicidad HCoV OC43 es la cadena representativa patogena del grupo Il Ambos debido al gran tama o del genoma y el m todo nico de composici n virus resultantes de la recombinaci n de genes
26. l Red 610 Quasar 670 d RFU dT FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 t 7 Seegene SOLUCION DE PROBLEMAS ANYPLEX RV 16 DETECCION OBSERVACION CAUSA PROBABLE SOLUCION Los fluoroforo para analisis de datos no cumplen con el protocolo Seleccione los fluoroforos correctos para el analisis de datos Temperatura de la maquina Verifique la condiciones de la PCR y repita la o ciclos de PCR incorrectos PCR bajos lo nuevos ajustes si es necesario Se dejaron los reactivos por largo tiempo a temperatura Verifique las condiciones de almacenamiento y ambiente o se fecha de vencimiento de los reactivos repita el almacenaron en ensayo con kits nuevos si es necesario condiciones no apropiadas a Repita el procedimiento de detecci n con una Programaci n incorrecta P configuraci n correcta Si el IC ha sido adicionado a la extracci n una ausencia de la se al de IC puede indicar la perdida de cidos nucleicos durante la extracci n Fallo en la extracci n de aseg rese de usar un m todo de aislamiento cidos nucleicos recomendado Re extraiga la muestra original o de la muestra diluida con buffer salino por 1 10 y adicione RV16 IC a la muestra diluida Control Interno a alguna otra se al no son observadas Si la se al del blanco es observada es probable que sea positiva para el pat geno aunque la Alta carga del cido se al del control interno no se observe Si desea nucleico
27. los reactivos utilice un kit incorrectas nuevo de ser necesario 7 Seegene RENDIMIENTO 1 Especificidad La alta especificidad del Anyplex 1 RV16 detection es asegurado por los primers espec ficos designados para los objetivos de inter s y las condiciones de reacci n Anyplex Il RV16 Detection ha sido evaluado para reacci n cruzada con 81 pat genos diferentes el resultado ilustra las amplificaciones de PCR en los nicos objetivos Organism Strain No 5 meumonde Borie Haemophilus influenzae DIeumoniae CAT oooh ia Pau 41782 ATCC BAA 255D ATCC BAA 589D ATCC 519070 ATOC 20342 Korean isolate Fee DELETE a Tala Enlerobacier clhacad Enterobaci rn aerogenes Proteus mesis Pseudomonas fluorescens Pseudamon as drugs Cara Staphlococcus aureus Straptococcus mis Siranlococcus agalachee Feen herDbesvrfus 1 Human herpas rus 2 7007210 5 7003240 SS 271370 5 KGTU 13047 150380 124530 ALO 470850 40642 ALGIO 14053 ATCC 7006990 5 ATCC 3556 ATCC 6110 ATGE 255988115 ATCC VR 260 ATCO VA F34
28. los tubos de reacci n o tiras despu s de la amplificaci n para evitar la contaminaci n con amplicones Almacene el material positivo aparte de los reactivos del kit 7 Seegene e Los procedimientos de seguridad en el laboratorio se deben tener en cuenta para manipular las muestras e Limpie desinfecte a fondo todas la superficies de trabajo con hipoclorito de sodio al 0 5 en agua desionizada o destilada USO PREVISTO La prueba RV16 Detection de Anyplex Y II V1 1 es un ensayo cualitativo in vitro para la detecci n de virus respiratorios en muestras de aspirados nasofar ngeos hisopados nasofaringeos y lavados bronquio alveolares de pacientes sintom ticos La prueba Anyplex II RV16 V1 1 consiste en dos reacciones de PCR set A y set B El Set A es un ensayo multiplex que permite la amplificaci n simult nea del cido nucl ico objeto de 8 virus respiratorios El Set B es un ensayo multiplex que permite la amplificaci n simult nea del cido nucleico objetivo de 8 virus respiratorios Set A Set B Influenza A Flu A Virus sincitial respiratorio A RSV A Influenza B Flu B Virus sincitial respiratorio B RSV B Adenovirus humano Adv Metapneumovirus MPV Parainfluenza 1 PIV1 Coronavirus 229E 229E Parainfluenza 2 PIV2 Coronavirus NL63 NL63 Parainfluenza 3 PIV3 Coronavirus OC43 OC43 Parainfluenza 4 PIV4 Bocavirus 1 2 3 4 HBoV Rinovirus A B C HRV A B C Enterovirus HEV Flu A Los primer
29. movirus is a leading cause of respiratory tract infection in 7 Seegene infants BMJ 328 7434 10 M Hindiyeh V Levy R Azar N Varsano L Regev Y Shalev Z Grossman and Mendelson 2005 Evaluation of a multiplex real time reverse transcriptase PCR assay for 39 10 2011 1 01 Anyplex II RV16 Detection detection and differentiation of influenza viruses A and B during the 2001 2002 influenza season in Israel Journal of Clinical Microbiology 43 589 595 11 A J Easton J Domachowske and F Rosenberg 2004 Animal Pneumoviruses molecular genetics and pathogenesis Clinical Microbiology Reviews 17 390 412 12 Medimmune progress development of respiratory syncytial virus and parainfluenza virus type 3 vaccines Pharmaceutical News Oct 13 2004 13 Respiratory syncytial virus Microbiology and Bacteriology Aug 6 2000 14 http www cbsnews com stories 2003 09 16 heat main573644 shtml 15 http www astdhpphe org infect rsv html 16 http www answers com topic common cold 17 http www wikipedia org 7 Seegene SIMBOLOGIA Explicacion de los simbolos utilizados en las etiquetas Simbolo Explicacion Para Diagnostico in vitro Numero de Lote Numero de catalogo Fecha de vencimiento Temperatura de Almacenamiento Precaucion Mezcla de oligonucleotidos para amplificaci n y deteccion Agua libre de Rnasas ONTROL Control Positivo Mezcla Maestra para PCR Anyplex Fecha de
30. nels amp Wel Groups E Plate Loading Guide Sample Type Load Y FAM HEX Y Cal Red 610 Plate Type BR White Fig 6 Plate Setup 7 Haga clic en OK y guarde el archivo de la nueva placa 8 Se abrir la ventana de Experiment Setup 7 Seegene Fig 7 Experiment Setup Plate C Inicio del ensayo 1 En Experiment Setup Start Run haga clic en Close Lid para cerrar la tapa del equipo DANERBUGRE Select Al Blocks Rash Bock J Open ud LI oe ud Fig 8 Close Lid 2 Haga clic en Start Run 3 Guarde el archivo del ensayo en la carpeta que usted designe El equipo iniciara una vez que el archivo se haya guardado 7 Seegene 1 2 Analisis de datos A Creacion de la carpeta especifica para guardar los datos 1 Para guardar los datos de cada punto de fusion del archivo de resultados cree tres folderes 2 El Nombre del folder para el primer dato de punto de fusion es 1 para el segundo 2 y para el tercero 3 B Pre ajustes para el analisis de datos en el CFX 96 1 Despues del ensayo haga clic en la pesta a Melt curve para confirmar los resultados de las curvas de disociacion Fig 9 Resultados Picos de fusion 2 Seleccione solo Quasar 670 la franja umbral debe ser ajustada a cero tw emen 4a vencazoiam
31. nto CMTA ww nto Melt Peal HF ii Hed bil asar ira 1 st lata otal rd Total AM cc n 74 1 Pico de fusion 3 Tercer punto A U 1531 l 114 ri rj Fl 1 t 7 Seegene lt Muestra 1 Set gt Pico de fusi n 1 primer punto CMTA FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 d RFU dT 58 60 62 64 6 68 7 72 7 5 80 04 Temo Pico de fusion 2 segundo punto CMTA Well Info Peak FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 2 2 ne Ist 12 4 34 11 2nd Total 3rd Total 600 MPV 480 FAM 300 HEX Cal Hed 610 hy Quasar 670 Pico de fusi n 3 Tercer punto CMTA Well Info Melt Peak FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 11 st Total 2nd Total 3 rd Total Red 610 Quasar 570 7 Seegene lt Muestra 2 Set A gt Pico de fusi n 1 primer punto CMTA lelt 15 1 4 ra l at lata end lota 310 Pico de fusi n 2 Segundo punto CMTA 7 Seegene lt Muestra 2 Set gt Pico de fusi n 1 primer punto CMTA Well info Peak FAM HEX Cal 610 Quasar 670 Ist 2nd 13rd 1 st Total 2nd Total 3 rd Total 200 IC 160 120 8 Red 610 40 670 0 FAM HEX Ca
32. o de manejo de l quidos Fabricante de Transcripcion Reversa No De Cat cDNA Synthesis Automix SGRTAO1 Nota para las instrucciones detalladas de operacion refierase al Manual de Operacion del STARlet y NIMBUS para Anyplex II RV16 Detection 1 Ponga los tubos de reactivos y de muestras en el instrumento Prepare la siguiente mezcla en un tubo de PCR 2 ul Random Hexamer 8 ul RT Buffer 2 ul RT Enzima Mix 8 ul Acido nucleico de muestra 20 ul Volumen Total Nota Mezcle los reactivos mediante ligeros golpecillos Centrifugue brevemente para recuperar los liquidos remanentes de las paredes de los tubos 2 Realice las reacciones de sintesis de CADN como se muestra a continuacion Segmento Numero de ciclos Temperatura Duracion 1 1 25 C 5 min 2 1 37 C 60 min 3 1 95 C 2 min Nota Almacene todas las muestras de cADN a 20 C hasta su uso 7 Seegene Kit de sintesis CDNA para uso manual Fabricante Kit de Transcripcion Reversa No De Cat Nota Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas Nota El kit se compone de tubos de 8 tiras los cuales son alicuotas del master mix 7 Seegene 1 Prepare la siguiente mezcla en un tubo de PCR que contiene el premix 10 ul Premix alicuotado 2 ul Random Hexamer 8 ul Acido nucleico de muestra 20 ul Volumen Total Nota use una pipeta nueva para cada muestra Nota Mezcle los reactivos por golpecitos Centrifugue brevemente par
33. os en muestras co infectadas Es un ensayo de PCR multiplex en tiempo real que permite la amplificaci n detecci n y diferenciaci n simult nea del material gen tico de virus de influenza A Flu A virus de influenza B Flu B virus sincitial respiratorio A respiratory syncitial virus A RSV A virus sincitial respiratorio B RSV B adenovirus AdV metapneumovirus MPV coronavirus 229E 229E coronavirus NL63 NL63 coronavirus OC43 OC43 parainfluenza virus 1 PIV1 parainfluenza virus 2 PIV2 parainfluenza virus 3 PIV3 parainfluenza virus 4 PIV4 rinovirus A B C HRV A B C enterovirus HEV bocavirus 1 2 3 4 HBoV y el Control Interno Internal Control IC En la PCR la eficiencia puede reducirse por inhibidores que se pueden presentar en las muestras clinicas Un control interno IC es incorporado dentro del producto como un conjunto en el control del proceso para monitorear el aislamiento de acidos nucleicos y verificar una posible inhibici n de la PCR El IC es co amplificado con los cidos nucleicos objetivos en las muestras cl nicas El sistema Uracil DNA glicosilasa UDG dUTP es empleado en el AnyplexTM RV16 El sistema UDG dUTP es usado com nmente cuando se realiza la PCR para eliminar los amplicones por arrastre usando residuos de uracil del ADN por ensici n de la uni n N glicosil Seegene 2 Procedimiento General Muestra Aspirados nasofaringeos hisopado nasofaringeo lavado bronquio al
34. s detectan todos los subtipos del virus de influenza A incluyendo el subtipo H5N1 el cual ocasiona gripa aviar altamente contagiosa y el nuevo subtipo de influenza A H1N1 de origen porcino que fue detectado por primera vez en abril del 2009 AdV Los primers est n dise ados para detectar la mayor a de los tipos Cy E y algunos tipos de A D Y F de adenovirus humanos HEV los primers est n dise ados para detectar todos los tipos A B y algunos C D de Enterovirus humanos PRINCIPIOS Y DESCRIPCI N GENERAL DEL PROCEDIMIENTO 1 Principios La prueba de detecci n RV16 de Anyplex Y Il es representativa de la tecnolog a de Seegene y est basada en la nueva tecnolog a TOCE la cual permite detectar m ltiples pat genos en un solo canal de fluorescencia en los instrumentos para PCR en tiempo real En los ensayos de curvas de disociaci n actuales se observan con frecuencia diferencias de temperatura entre los ADN que muestran una gran variaci n en sus Seegene secuencias lo que resulta problematico en el area de diagnostico clinico donde es critica la exactitud y reproducibilidad de las pruebas No obstante la tecnologia TOCE esta dise ada para no verse afectada por variaciones en la secuencia por lo tanto garantiza valores de Tm consistentes La prueba RV16 Detection de Anyplex Il representa una nueva clase de pruebas moleculares por multiplexado El m todo de CMTA c clico puede discriminar mayor pat gen
35. taneous detection of influenza A B and C viruses respiratory syncytial virus and adenoviruses in clinical samples by multiplex reverse transcription nested PCR assays Journal of Medical Virology 69 132 144 Coiras J Aguilar L Garcia l Casas and Perez Brena 2004 Simultaneous detection of fourteen respiratory viruses in clinical specimens by two multiplex reverse transcription nested PCR assays Journal of Medical Virology 72 484 495 A Purkayastha 5 E Ditty J Su J Mcgraw Handfield Tibbetts and D Seto 2005 Genomic and bioinformatics analysis of HAdV 4 a human adenovirus causing acute respiratory disease implication for gene therapy and vaccine vector development Journal of Virology 79 2559 2572 W Syrmis D M Whiley M Thomas M Mackay J Williamson D J Siebert M D Nissen and T P Sloots 2004 A sensitive specific and cost effective multiplex reverse transcriptase PCR assay for the detection of seven common respiratory viruses in respiratory samples Journal of Diagnostics 6 15 131 Y Jinno K Yoshiura and N Niikawa 1990 Use of psoralen as extinguisher of contaminated DNA in PCR Nucleic Acids Research 18 6739 C E Corless M Guiver R Borrow V Edwards Jones E B Kaczmarski and A J Fox 2000 Contamination and sensitivity issues with a real time universal 16S rRNA PCR Journal of Clinical Microbiology 38 1747 1752 S Gottlieb 2004 Metapneu
36. uL de agua libre de RNasa en lugar de muestra de acido nucleico Nota Para el Control Positivo utilice 8 uL de RV16 PC RV16 PC 2 vea la siguiente pagina 7 Seegene Nota Evite la contaminaci n cruzada del PCR Mastermix y las muestras con el Control Positivo Nota el tubo de PCR debe ser mezclado y centrifugado antes de la reacci n de PCR Esto se necesita para comprobar el l quido que contiene todos los componentes de la PCR que est en el fondo de cada tubo de PCR Nota En el caso del 96 no etiquete la tapa de los tubos de reacci n ya que la fluorescencia es detectada a trav s de la tapa e Control Positivo Se incluyen dos tubos de control positivo en el kit RV16 PC RV16 PC 2 RV16 PC 1 incluye las clonas de 5 pat genos para el panel A PIV4 AdV PIV1 PIV2 PIV3 y 5 pat genos para el panel MPV HBoV CoV 229E CoV NL63 CoV 0043 RV16 PC 2 incluye las clonas de 3 pat genos para el panel A Flu A Flu B HRV 3 pat genos para el panel B RSVA RSVB HEV y el control interno Nota Para correr la reacci n del control positivo prepare dos tubos de PCR para cada panel cuatro tubos de PCR en total Para el panel A un tubo con el RV16 PC 1 y otro con el RV16 PC 2 Para el panel B un tubo con el RV16 PC 1 y otro con el RV16 PC 2 ver RESULTADOS Control Positivo del Panel A FAM Cal Red 610 Quasar 670 PIVA AdV PIV1I PIV2 FluA FluB HRV Nombre Autointerpretacion
37. ue el equipo se inicie 5 Presione Start protocol en el men principal del SEEPREP12 En el men de selecci n de protocolos presione SPN Viral NA el menu de selecci n de volumen de muestra presione 550 uL en la seleccion del volumen de eluci n presione 60 uL 8 Siga las instrucciones en pantalla para cargar el instrumento 9 Despues de que todos los pasos se han completado cierre la puerta y comience el C 2 MICROLAB NIMBUS IVD Nota Mirar el manual de operaci n del MICROLAB NIMBUS IVD Sistema de Purificacion Fabricante Vol recomendado Automatizado MICROLAB NIMBUS IVD Hamtm Muestra 600 ul C 3 MICROLAB STARlet Nota Observar el manual de operacion del MICROLAB ST ARlet Sistema de Purificacion Fabricante Vol recomendado Automatizado MICROLAB STARIet Hamilton q Muestra 600 ul 7 Seegene 3 Transcripcion reversa Nota las puntas resistentes a los aerosoles y guantes ajustados deben usarse para la preparaci n de las muestras Tenga precauci n para evitar la contaminaci n cruzada Nota Descongelar completamente Nota Establecer todas las reacciones en el hielo para minimizar el riesgo de degradaci n de ARN Nota Centrifugue brevemente los tubos de reactivos para remover las gotas del iterior de la tapa A S ntesis del kit de cDNA para el usuario de configuraci n autom tica mediante un instrument
38. ussusaununaunanannanannunannuannnnunanannuanannuanannunanns 22 RESULTADOS s ss s ss ssssusssnunuununannunuanannanannuannnnannnaunnunuananannunnnnunnnananns 31 SOLUCI N DE PROBLEMAS s ss s sssssssss snunusnunaunnnuanaunanannunannuannnnunannass 38 REFERENCIAS s sssssssssssssnusannunannnnanannannunanannuanannunannuanannunuannunanannanannanns 39 SIMBOLOGIA s s sssssss sssuusunnunasaunuanannuanannanannunnunnnannunanannunannuanannansnnasas 41 INFORMACION DE PEDIDO ss ssscssssssssssnsssnnussnnnsnnnnsennnsnnnennntnnnnns 42 7 Seegene NOTIFICACIONES Este producto se puede utilizar con prop sitos de diagn stico in vitro IVD In Vitro Diagnostics en UE dado que la marca IVD CE esta aprobada por la Directiva UE 98 79 Los tipos de muestras aplicables son aspirados nasofaringeos hisopados nasofaringeos y lavado bronquio alveolar Esta prueba no se ha validado para otro tipo de muestras Almacene las muestras de ADN ARN a 70 hasta su uso y mant ngalas hielo durante el tiempo que sean utilizadas La sensibilidad del ensayo puede disminuir en muestras que son repetidamente congeladas y descongeladas o almacenadas por largos periodos de tiempo La confiabilidad de los resultados depende de la recolecci n adecuada de la muestra el transporte almacenamiento y procesamiento El flujo de trabajo en el laboratorio debe procesarse en una manera unid
39. veolar Aislamiento de acidos nucleicos ADN ARN Viral Transcripcion Reversa Primera hebra ADN cADN Amplificaci n y detecci n mediante el Sistema Anyplex Il Analisis de Resultados lt Procedimiento general con el kit RV16 V1 1 Detection gt 7 Seegene ANTECEDENTES 1 Infeccion por Virus Respiratorios La infeccion respiratoria tiene dos categorias infecciones del tracto respiratorio alto e infecciones del tracto respiratorio bajo La infeccion del tracto respiratorio alto es causada por pat genos que invaden por via nasal faringea auris media espenculus etc Alguna infecci n detectada en el tracto respiratorio que es bajo como la laringe es categorizada como infeccion del tracto respiratorio bajo Entre las infecciones del tracto respiratorio bajo las infecciones virales pueden dividirse en cuatro grandes grupos llamados pneumonia bronquiolotis tos y ttaqueobronquitis Las diferencias de edad para cada virus estan presentes en las victimas que se infectan Ademas los sintomas pueden diferir en pacientes que tienen el mismo tipo de virus Aunque cada virus puede causar sintomas para todos los tipos de infecciones del tracto respiratorio bajo algunos sintomas aparecen con frecuencia en unas infecciones espec ficas que en otras Por ejemplo el VSR puede aparecer en todas las edades desde infantes a adultos pero este causa infecci n respiratoria en el tracto respiratorio superior de
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