Manual de usuario
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1. Cycle Rev 08 03 2011 9 12 plied meg ri MI S sens En la siguiente tabla se representan gr ficamente los resultados que se pueden obtener a partir del an lisis de una muestra as como la interpretaci n que se debe hacer a partir del resultado obtenido Cuantificable Cuantificable Cuantificable No cuantificable No detectado No cuantificable Cuantificable No detectado No se ha detectado la presencia de soja Roundup Ready en la muestra La cantidad de soja Roundup Ready detectada en la muestra es inferior al l mite de cuantificaci n La cantidad de soja Roundup Ready respecto a la soja total presente en la muestra es de X No se ha detectado la presencia de soja Roundup Ready en la muestra la cantidad de soja presente en la muestra es inferior al l mite de cuantificaci n No cuantificable No cuantificable Las cantidades de soja y soja Roundup Ready detectadas en la muestra son inferiores al l mite de cuantificaci n No detectado No detectado No se ha detectado la presencia de soja ni la presencia de soja Roundup Ready en la muestra Es posible que el hecho de no detectar ADN de soja en una muestra sea debido a la presencia de inhibidores en el ADN empleado Para verificar la ausencia de le aconsejamos que emplee un control de inhibici n consistente en una amplificaci n con el Master Mix de Soja en un pocillo donde se han mezclado el ADN de la muestra2. TaqMan Roundup Ready Quantification Kit Part No 4466335 ABEE Sems egen KA AB sen applied imegen m moze 1 Introducci n Los organismos modificados gen ticamente OMG se encuentran ampliamente distribuidos siendo la soja y el ma z los vegetales que ocupan mayor extensi n de cultivo a nivel mundial La cantidad de soja transg nica Roundup Ready constituye aproximadamente el 77 de la soja cultivada a nivel mundial Es el evento transg nico m s extendido y el que genera una mayor problem tica La Uni n Europea ha establecido un marco legal que regula el empleo la liberaci n al medio ambiente y sobre todo el etiquetado de los productos alimenticios que contienen organismos modificados gen ticamente El TaqMan Roundup Ready Quantification Kit permite determinar el porcentaje de soja Roundup Ready respecto a la soja total presente en una muestra Este kit emplea tecnolog a Real Time PCR y contiene todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la cuantificaci n de la soja Roundup Ready en ADN obtenido a partir de cualquier alimento o pienso Adem s el kit contiene ADN plasm dico que se emplea como est ndar frente al que comparar las muestras con el objetivo de determinar el porcentaje de soja Roundup Ready Rev 08 03 2011 2 12 applied SZ ten WNN 2 Descripci n del kit El TaqMan Roundup Ready Quantification Kit permite determinar el porcentaje de soja Roundup Ready respecto a la soj
3. a total presente en una muestra El an lisis de cada muestra incluye dos reacciones de PCR a tiempo real Una de ellas permite cuantificar la cantidad de soja total presente en la muestra y la otra reacci n permite determinar la cantidad de soja Roundup Ready que contiene la muestra Reacci n para determinar la cantidad de Soja total Esta reacci n incluye dos cebadores y una sonda tipo TaqMan marcada con el fluor foro FAM La reacci n permite amplificar de forma espec fica un gen end geno de la soja denominado lectina Reacci n para determinar la cantidad de Soja Roundup Ready Esta reacci n incluye dos cebadores y una sonda tipo TaqMan marcada con el fluor foro FAM La reacci n permite amplificar de forma espec fica el evento transg nico GTS 40 3 2 de la soja Roundup Ready Este fragmento es espec fico de evento es decir amplifica la zona de uni n del genoma de la soja con la construcci n introducida en la soja Roundup Ready El kit incluye un est ndar que consiste en ADN plasm dico con una copia de cada una de las dianas empleadas en el an lisis La comparaci n del resultado obtenido a partir de las muestras con este est ndar permite llevar a cabo la cuantificaci n relativa y obtener as el porcentaje de soja Roundup Ready respecto a la soja total presente en cada muestra L mites de detecci n y cuantificaci n L mite de cuantificaci n 20 copias de ADN L mite de detecci n de la PCR sistema soja 3 co
4. applied gt blosystems HA irmegen Una vez verificados los controles se analizan los resultados obtenidos a partir de las muestras En el caso de que se hayan realizado duplicados los resultados de ambas r plicas deben ser similares Para cada reacci n de amplificaci n hay tres posibles resultados tanto para las reacciones de soja como para las de soja Roundup Ready No detectado No hay amplificaci n en la muestra La curva de amplificaci n es plana No cuantificable Se detecta amplificaci n en la muestra pero en una cantidad inferior al ltimo punto de la recta Cuando el Ct de la muestra es mayor que el Ct del est ndar de 20 copias se puede concluir que existe la presencia del analito pero la cantidad no es cuantificable Cuantificable Se detecta amplificaci n en la muestra en una cantidad superior al ltimo punto de la recta Cuando el Ct de amplificaci n de la muestra est interpolado entre los valores de los puntos del est ndar el resultado cuantitativo es fiable y se puede emplear para calcular el porcentaje de soja Roundup Ready Para el c lculo del porcentaje de soja Roundup Ready respecto a la soja total presente en una muestra se emplea la siguiente f rmula N de copias soja RR x 100 Soja RR N de copias soja Amplification Plot 2 50 2 25 1 2 00 1 1 75 1 1 50 1 25 1 00 7 0 75 0 50 4 0 25 4 0 00 ARn 2 6 8 10 12 14 16 1480 22 8 8 Y IS m 3 O 4 44 46 4
5. ex Vortex Vortex Vortex Vortex Spin Spin Spin Spin Spin 45 u H O 45 yl H O 45 ul H O 45 u H O Estandar Estandar Estandar Estandar Estandar 200 000 copias 20 000 copias 2 000 copias 200 copias 20 copias 2 Descongelar los Master Mix los controles negativos y los ADNs de las muestras en caso de que se conserven congelados Dar un v rtex a cada uno de los reactivos y mantener en fr o En un tubo de 1 5 ml a adir 7 5 ul del Master Mix Soya por cada una de las reacciones Rev 08 03 2011 6 12 applied e ad e g e nN 5 En otro tubo de 1 5 ml a adir 7 5 ul del Master Mix RR soya por cada una de las reacciones 6 A adir por cada reacci n 12 5 ul del Master Mix General a cada una de los tubos anteriores Dar un v rtex y pipetear 20 ul en cada pocillo o tubo 7 A adir 5 ul del ADN 10 25 ng ul de las muestras en los pocillos correspondientes 8 A adir 5 ul de cada diluci n del Est ndar y de los controles negativos en los pocillos correspondientes 9 Tapar la placa con film ptico y dar un spin 7 Programa de amplificaci n Someter las reacciones de amplificaci n al siguiente programa de amplificaci n 952C 10 minutos 1 952C 15 segundos 50 602C 1 minuto Nota Este programa ha sido validado en un equipo StepOne Real Time PCR System de Applied Biosystems Si se emplea en otra marca o modelo de termociclador es posible que se deba ajustar el programa de amplificaci n P n
6. gase en contacto con nuestro servicio t cnico si necesita recibir asesoramiento Rev 08 03 2011 7 12 applied e g A partot Life technologies 8 An lisis de los resultados Antes de analizar los resultados de las muestras se comprobar gue el resultado obtenido a partir de los diferentes controles es el esperado Controles negativos No se debe detectar amplificaci n ni en la reacci n correspondiente a soja ni en la reacci n correspondiente a soja Roundup Ready La amplificaci n en un control negativo indicar a la presencia de contaminaci n lo que conllevar a la repetici n del ensayo Est ndar RR soya Se debe detectar amplificaci n en los cinco puntos del est ndar de soja y en los cinco puntos correspondientes a la soja Roundup Ready Adem s las rectas obtenidas a partir de los distintos puntos del est ndar deben cumplir los siguientes requisitos o La eficiencia de la recta debe tener un valor comprendido entre 90 y 105 o La pendiente de la recta debe tener un valor comprendido entre 3 1 y 3 9 o El coeficiente de correlaci n R debe tener un valor superior a 0 98 Plot Settings Target Al Plot Color Defaut x a Fa gE Standard Curve c M 8 1 2 345 b 22 w am 1000 10000 100000 100004 Quantity Target RR Slope 3 378 Y Inter 40 801 RZ 1 Eff 97 724 Target Soja Slope 3 319 Y Inter 41 034 R 0 999 Effx 100 114 Rev 08 03 2011 8 12
7. pias de ADN L mite de detecci n de la PCR sistema soja Roundup Ready 3 copias de ADN Este kit permite realizar cuantificaciones relativas de hasta el 0 01 de soja Roundup Ready respecto a la soja total presente en una muestra El l mite de cuantificaci n relativo var a en funci n de la muestra analiza Rev 08 03 2011 3 12 im g ri IM AB 3 Componentes y almacenamiento del kit Este kit contiene los reactivos necesarios para la realizaci n de 48 reacciones de cada una de las regiones analizadas ver apartado anterior Master Mix RR soya Disco verde 396 ul 202C Master Mix Soya Disco morado 396 ul 202C Master Mix General Disco blanco 2 x 660 ul 42C Est ndar RR soya Tap n verde 6 x 50 ul 202C 4 Equipamiento necesario La siguiente tabla muestra el equipamiento necesario para utilizar el TaqMan Roundup Ready Quantification Kit Termociclador Real time PCR con canal de detecci n para el fluor foro FAM 520 nm 2 Juego de micropipetas 10 20 y 200 ul Centr fuga de sobremesa con adaptadores para placas de 96 y o tubos 4 V rtex Rev 08 03 2011 4 12 applied partot Life technologies l e g e nN 5 Material fungible necesario La siguiente tabla muestra el material fungible necesario para utilizar el TaqMan Roundup Ready Quantification Kit Placas de PCR pticas aptas para el termociclador empleado o tubos 1 pticos de 0 2 ml Film
8. problema con 1 ul del control de inhibici n que se corresponde con la diluci n de 20 000 copias del est ndar Paralelamente se amplifica otro pocillo con 5 ul de agua y 1 ul del mismo control de inhibici n Si la amplificaci n de ambas reacciones es similar se puede concluir que la muestra no inhibidores en la muestra est inhibida Rev 08 03 2011 10 12 applied b sster WIM EG partot Life technologies Jg 9 Control de calidad Todos los productos comercializados por el Instituto de Medicina Gen mica son sometidos a un riguroso control de calidad El TaqMan Roundup Ready Quantification Kit ha superado todas las pruebas de validaci n internas que garantizan la fiabilidad y reproducibilidad de cada ensayo Puede consultar el Certificado de An lisis correspondiente a su kit introduciendo el n mero de lote del producto en la secci n de Kits de An lisis de la web www imegen es 10 Garant as y responsabilidades El Instituto de Medicina Gen mica le garantiza que todos sus productos est n libres de defectos tanto en los materiales empleados como en su proceso de su fabricaci n Esta garant a se hace extensible a un per odo de un a o desde la fecha de env o del producto siempre que se observen las condiciones de conservaci n especificadas en este Manual Nuestros productos est n dise ados para uso en investigaci n El usuario de los productos es responsable de validar la utilidad de los protocolo prop
9. s pticos para cubrir las placas de PCR o tapas pticas para los tubos empleados 3 Puntas con filtro desechables para micropipetas 4 Tubos est riles de 1 5 ml 5 Guantes de latex sin talco Rev 08 03 2011 5 12 plied A AS ens megen 347 BA 6 Preparaci n de las reacciones de amplificaci n Para llevar a cabo la cuantificaci n relativa de soja Roundud Ready presente en una muestra se llevan a cabo dos cuantificaciones absolutas Por una parte se determina la cantidad de soja total presente en la muestra y por otra parte determinaremos la cantidad de soja Roundup Ready La preparaci n de las reacciones de amplificaci n incluye e Diluciones del est ndar e Controles negativos de PCR y o extracci n e An lisis de las muestras por duplicado Para estimar la cantidad de reactivos necesaria se tendr en cuenta el n mero de muestras y controles a analizar simult neamente Recomendamos realizar los c lculos considerando una reacci n m s o bien incrementando un 10 el volumen de cada reactivo Se preparar n 2 masters de PCR distintos uno para la soja y otro para la soja Roundup Ready A continuaci n se muestra el protocolo recomendado para la preparaci n de las reacciones de amplificaci n 1 Descongelar un vial del est ndar RR soya y preparar 4 diluciones seriadas 1 10 del est ndar De este modo obtendremos los patrones cuantitativos frente a los que comparar las muestras Vort
10. uestos por el Instituto de Medicina Gen mica Dichos protocolos se consideran nicamente una gu a El Instituto de Medicina Gen mica no le ofrece ninguna otra garant a expresa o impl cita que se extienda m s all del funcionamiento correcto de los componentes de este set La nica obligaci n del Instituto de Medicina Gen mica respecto de las garant as precedentes ser la de reemplazar los productos o bien devolver el precio de la compra de los mismos a voluntad del cliente siempre y cuando se pruebe la existencia de un defecto en los materiales o bien en la elaboraci n de sus productos El Instituto de Medicina Gen mica no ser responsable de ning n da o directo o indirecto que resulte en p rdidas econ micas o en da os que pudieran producirse por el uso de este producto por parte del comprador o usuario 13 Servicio de atenci n al cliente Para cualquier consulta sobre las aplicaciones de este producto o sobre sus protocolos puede contactar con nuestro Departamento T cnico Tel fono 963 212 340 Mail infoQimegen es Rev 08 03 2011 11 12 ep applied e g e n part ot L fe technologies
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