COMUNICACIONES BREVES Empleo del AMPLICOR
Contents
1. DNA test v 1 5 in diagnosis of perinatal infection from HTV 1 in Cuba ABSTRACT INTRODUCTION HIV 1 proviral DNA amplification is the preferential method for HIV diagnosis infection in infants and it has been used in Cuba since 1992 AMPLICOR HIV 1 DNA kit is an in vitro qualitative assay for the detection of HIV 1 proviral DNA in the whole blood OBJECTIVE this paper showed the results of the use of this kit for the first time in Cuba for the perinatal diagnosis of HIV 1 infection METHODS three hundred forty six whole blood samples from children of HIV seropositive women were analyzed by the AMPLICOR HIV 1 DNA kit in the period 2005 2007 ResuLrs among the tested samples six were positive and 340 negative CONCLUSIONS the assay was reproducible under the Cuban conditions and the achieved results made the diagnosis and follow up of children of HIV 1 seropositive mothers possible Keys words HIV 1 molecular diagnosis mother to child trasmission prevention polymerase chain reaction REFERENCIAS BIBLIOGR FICAS e Rakusan TA Parrot R H Sever JL Limitations in the laboratory diagnosis of vertically acquired HIV infection J Acquir Immune Defic Syndr 1991 4 116 21 2 Borkowsky W Krasinski K Pollack H Hoover W Kaul A Moore T Early diagnosis of human immunodeficiency virus infection in children lt 6 months of age comparison of polymerase chain reaction culture and plasma antigen capture techniques J Infect Dis 1992. proviral mediante este estu che a partir de 100 uL contra 500 uL obteniendo 100 de concordancia entre las muestras negati vas y positivas Para el procedimiento de extrac ci n del ADN proviral anteriormente se empleaban 10 mL de sangre total en EDTA y la obtenci n del ADN mediante el m todo fenol cloroformo y pre cipitaci n etan lica demoraba 48 h aproximada mente En cambio el estuche AMPLICOR HIV 1 DNA test v 1 5 permite realizar el procedimiento 156 completo procesamiento inicial de la muestra ex tracci n amplificaci n y detecci n en 8 ho 2 d de trabajo El termociclador PTC 100 empleado para la incubaci n de las muestras en la extracci n y la amplificaci n del material gen tico result til en el procedimiento si bien el fabricante recomienda el empleo de un termociclador Gene Amp PCR System 9700 con placa de oro de 96 pozos de la casa comercial Applied Biosystems adem s de otros equipamientos que son necesarios para la ex tracci n y detecci n del ADN proviral Aunque hay m todos que permiten al usuario realizar la extracci n autom tica del material gen tico y su posterior empleo con el estuche el procedimien to de trabajo es sencillo y consume poco tiempo Los resultados del empleo del estuche AMPLICOR HIV 1 DNA test v 1 5 permitieron realizar el seguimiento y diagn stico de la infec ci n por VIH 1 de ni os nacidos de madres seropositivas al VIH 1 en Cuba Use of Amplicor HIV 1
3. 2 166 616 9 3 Cervia J Kaplan B Schuval S Weiss S Virologic testing in management of perinatal HIV exposure AIDS Read 2003 13 1 39 46 4 Berkner KL Folk WR Polynucleotide T4 kinase exchange reaction Eco RI cleavage and methylation of DNAs containing modified pyrimidines in the recognition sequence J Biol Chem 1977 252 3176 5 Zjenah L Humphrey J Nathoo K Malaba L Zuandasana P Mahomua A et al Evaluation of prototype Roche DNA Amplification Kit incorporating the new SSK145 and SKCCIB primers in detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 DNA in Zimbabwe J Clin Microbiol 1999 37 11 3569 71 6 Rolo FM Miranda L Wainberg M Gu Z Lobaina L Noa E Envelope V3 region sequence of Cuban HIV 1 isolates J Acq Immune Deficiency Syndromes Human Retrovirology 1995 9 122 5 7 Blanco M Rolo F Mart nez N Gessa A D az H Lubi n A Aplicaci n del ensayo de movilidad del heteroduplex en los estudios de epidemiolog a molecular del VIH 1 en Cuba Biotecnolog a Aplicada 2001 18 149 153 Jennings Ch Danalovic A Scianna S Brabbilla D Bremer J Stability of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral DNA in Whole Blood Samples J Clin Microbiol 2005 43 8 4249 50 9 Piwowar Manning E Lugalia L Kafufu B Brooks Jackson J Comparison of Results Obtained with Amplicor HIV 1 DNA PCR Test version 1 5 using 100 versus 500 Microliters of Whole Blood J Clin Microbiol 2008 44 3 1104 5S 10 Germer J Gerads T M
4. COMUNICACIONES BREVES REV CUBANA MED TROP 2010 62 2 154 6 LABORATORIO DE INVESTIGACIONES DEL SIDA LISIDA Empleo del AMPLICOR HIV 1 DNA test v 1 5 en el diagn stico de la infecci n perinatal por el VIH 1 en Cuba Liuber Y Machado Zaldivar Madeline Blanco de Armas Ana Luisa Lubi n Caballero y H ctor M D az Torres RESUMEN INTRODUCCI N la amplificaci n del ADN proviral del VIH 1 constituye un m todo preferencial para el diagn stico perinatal empleado en Cuba desde 1992 El estuche AMPLICOR HIV 1 DNA es un ensayo cualitativo in vitro para la detecci n del ADN proviral de VIH 1 en sangre total OBJETIVO en el presente trabajo se reportan los resultados del empleo de este estuche por primera vez en Cuba para el diagn stico perinatal de VIH 1 M ropos entre 2005 y 2007 se trabajaron mediante el estuche AMPLICOR HIV 1 DNA 346 muestras de sangre total de ni os nacidos de madres seropositivas al VIH 1 ResuLtapos del total de muestras trabajadas 6 resultaron positivas y 340 fueron negativas CONCLUSIONES El estuche fue reproducible en las condiciones cubanas y los resultados obtenidos permitieron realizar el diagn stico y seguimiento de ni os nacidos de madres seropositivas Palabras clave VIH 1 diagn stico molecular prevenci n de la transmisi n vertical de madre a hijo reacci n en cadena de la polimerasa La transmisi n vertical de madre a hijo constituye una de las v as de infecci n del virus de la inmun
5. abana Cuba Especialista de I Grado en Medicina Interna M ster en Infectolog a Investigador Auxiliar LISIDA La Habana Cuba aparici n de reacciones inespec ficas impuso el empleo de estuches comerciales En este trabajo se reportan los resultados del diagn stico perinatal de la infecci n por VIH 1 en Cuba mediante el empleo del estuche AMPLICOR HIV 1 DNA test v 1 5 Roche Molecular Diagnostics Entre 2005 y 2007 se trabajaron mediante el estuche AMPLICOR HIV 1 DNA test v 1 5 Roche Molecular Diagnostics 346 muestras de sangre total de ni os nacidos de madres seropositivas comprendidos entre los 3 y 18 meses de edad Las muestras se colectaron por punci n venosa en tubos est riles con EDTA A partir de 500 uL de sangre total se obtuvieron las c lulas mononucleares de sangre perif rica CMSP se g n las instrucciones de uso del fabricante El ADN proviral se obtuvo a partir de la adi ci n de 200 uL del tamp n de extracci n suminis trado por el estuche a las CMSP y posterior incubaci n por 30 min consecutivos a 60 y 100 C respectivamente Despu s se adicionaron 50 uL de ADN extra do a 50 uL de la mezcla de reacci n suministrada por el estuche la cual contiene dATP dCTP dGTP dUTP AmpErase AmpliTaq sales y los cebadores biotinilados SK145 y SKCCIB espec ficos para la regi n gag del VIH 1 y un control interno que determina la presencia de inhibidores de la RCP respectivamente Para la amplificaci n d
6. andrekar JN Mitchell SP and Yao JDC Detection of HIV 1 proviral DNA with the AMPLICOR HIV 1 DNA Test version 1 5 following sample processing by the MagNA Pure LC instrument J Clin Virol 2006 37 3 195 8 o0 Recibido 21 de septiembre de 2009 Aprobado 8 de febrero de 2010 Lic Liuber Y Machado Zaldivar Laboratorio de Investigaciones del sida Carretera de Jamaica y Autopista Nacional San Jos de las Lajas La Habana Cuba CP 32 007 Fax 574009 Correo electr nico lisida infomed sld cu liuberyans infomed sld cu
7. el material gen tico se emple el termociclador PTC 100 MJ Research Inc el cual no est referido por el fabricante en las instrucciones de uso con las condiciones de ciclado siguientes 2 min 50 C 5 ciclos de 10 s a 95 C 10 s 52 C y 10 s a 72 C seguido de 35 ciclos de 10 s a 90 C 10 sa 55 C y 10 s a 72 C y una extensi n final de 15 min a 72 C La detecci n del material amplificado se realiz por el sistema avidina biotina mediante el empleo de sondas de hibridaci n espec ficas al VIH 1 y al control inter no La lectura de los resultados se realiz a una densidad ptica DO de 450 nm y los valores de DO se interpretaron seg n la instructiva de uso del estuche En el transcurso del estudio se obtuvieron 340 98 27 muestras negativas y 6 1 73 mues tras positivas al ADN proviral del VIH 1 respec tivamente Los resultados positivos y negativos corresponden a ni os a los cuales se les realiz un seguimiento cl nico y serol gico seg n lo establece 155 el algoritmo para el diagn stico de la infecci n perinatal por VIH 1 en Cuba Zjenah y otros demostraron que el estuche presenta 100 de sensibilidad y especificidad para la detecci n de ADN proviral de VIH 1 5 Su f cil manipulaci n y la reducci n de falsos positivos por la presencia de la N uracil glicosidasa AMPERASE que cataliza la destrucci n del material amplificado de procedimientos anteriores permite la obtenci n de resul
8. odeficiencia humana tipo 1 VIH 1 por lo que un diagn stico temprano de la entidad posi bilitar un accionar m dico temprano Los m to dos serol gicos empleados para el diagn stico de la infecci n no resultan tiles puesto que los anticuerpos maternos espec ficos al VIH 1 per manecen en los ni os hasta los 18 meses de edad La amplificaci n del ADN proviral mediante reac ci n en cadena de la polimerasa RCP constituye un m todo preferencial para el diagn stico perinatal de la infecci n por VIH 1 a partir de los pau 15 d de nacido porque desde ese instante la de tecci n del ADN integrado presenta 50 de sensi bilidad que llega a 100 a los 2 meses de edad por lo que se recomienda mantener un seguimiento al menos hasta los 18 meses de edad En Cuba comenz el empleo de la RCP con estos prop si tos desde 1992 se utiliz una RCP dom stica que amplificaba el gen gag y el sistema de detecci n era a trav s de marcaje radiactivo Posteriormente en 1996 se comenzaron a amplificar 3 regiones consensos importantes del virus gag env y pol mediante una RCP anidada dom stica pero la alta manipulaci n el consumo de tiempo as como la Licenciado en Bioqu mica Aspirante a Investigador Laboratorio de Investigaciones del SIDA LISIDA La Habana Cuba Licenciada en Bioqu mica Investigador Auxiliar LISIDA La Habana Cuba Especialista de I Grado en Epidemiolog a Investigadora Auxiliar LISIDA La H
9. tados certeros y confiables Adem s la incorporaci n de un con trol interno en cada muestra posibilita evaluar el desempe o del usuario y la calidad de los procedi mientos de extracci n y amplificaci n del material gen tico Manual del usuario del estuche AMPLICOR HIV 1 DNA test v 1 5 Roche Molecular Diagnostic 2005 Estudios realizados en Zimbabwe mostraron la capacidad del estuche para detectar diversos subtipos del grupo M del VIH 1 5 lo que hace m s atractivo su empleo para el diagn stico de la transmisi n vertical de madre a hijo y ensayos clinicos a diferentes terapias teniendo en cuenta la amplia variedad de subtipos que circulan en Cuba Las muestras a realizarle el diagn stico perinatal se almacenaron y proce saron seg n las especificaciones del fabricante el cual plantea la posibilidad de almacenar la mues tra de sangre total a 4 C hasta 4 d aunque Jenning y otros 2005 demostraron que la sangre puede procesarse hasta 10 d despu s de colectada man teni ndola en condiciones ambientales 2 a 25 C detect ndose la presencia de ADN proviral en las muestras Una de las bondades del estuche es la posibilidad de procesar poco volumen de sangre total 500 uL se obtienen rendimientos acepta bles de c lulas mononucleares de sangre perif rica CMSP para la obtenci n del ADN viral integra do No obstante hay reportes en la literatura don de se comparan los resultados obtenidos de la extracci n del ADN
Download Pdf Manuals
Related Search