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Manual del usuario

1. eese 65 Congelado de blastocistos Dia nin A 67 Descongelado de blastocistos 70 VItLITiICACI N DSO 73 Explicaciones gr ficas Proteger de la luz Temperatura Temperatura ambiente Platina T rmica Temperatura ambiente con control de CO Mantener en la incubadora Tiempo en segundos Tiempo en minutos Tiempo en horas Recuento de espermatozoides Aspiraci n de espermatozoides Pipeteo hacia arriba y hacia abajo Proceso de lavado Centrifugado Transferencia embrionaria ET Cambio de medio de cultivo Fijado del embri n con la Pipeta de sost n y exposici n de la zona pel cida a la Soluci n Acidulada de Tyrodes Transporte y transferencia al tanque con nitr geno l quido Tubo de ensayo con tapa INTRODUCCION MediCult esta orgulloso de ser la primera y actualmente una de las compa as l deres en producir medios para t cnicas de reproducci n asistida ART listos para utilizar La compa a fundada en el a o 1987 estaba dedicada en el negocio de los medios ART y actualmente sigue ofreciendo al p blico un ptimo y completo rango de productos presentando constantemente nuevos productos y nuevos m todos para control de calidad QC Este manual contiene recomendaciones detalladas que abarcan el uso de los productos MediCult para obtener resultados ptimos Todos los m
2. Prof Y M n zo ha dise ado el medio de cultivo compuesto con HSA y vitaminas para minimizar el estr s oxidativo Las fuentes de los nutrientes son glucosa que ayuda a la capacitaci n del esperma durante los procedimientos piruvato de sodio para el desarrollo temprano del embri n y glucosa piruvato de sodio lactato de calcio para el desarrollo del blastocisto El medio incluye un tamp n de bicarbonato de sodio fisiol gico Fuera de la incubadora el pH del medio incrementar El medio se encuentra disponible con o sin Rojo Fenol BlastAssist System N Cat 1039 y 1040 es un sistema secuencial de medio de cultivo dise ado para cumplir con todos los requerimientos del embri n en cada etapa del desarrollo BlastAssist Medium 1 es utilizado para el proceso de inseminaci n FIV y el cultivo previo a las etapas celulares 4 6 BlastAssist Medium 2 es utilizado para el cultivo de embriones a partir del d a 2 y hasta la etapa de blastocistos y para transferir los embriones cultivados utilizando el BlastAssist System Prof Kjell Bertheussen ha dise ado las composiciones del medio con SSR y HSA Las fuentes del nutriente son glucosa que ayuda a la capacitaci n del esperma durante los procedimientos y el piruvato de sodio para el temprano desarrollo del embri n El medio incluye un sistema tamp n de bicarbonato de sodio fisiol gico Fuera de la incubadora el pH del medio va a incrementar El medio esta
3. ISM1 TM ISM2TM las IS TIS TM Instrucciones de Uso Embryo Thawing Pack 1 Rotular las placas con las soluciones de descongelado y pipetear los vol menes apropiados de las soluciones de descongelado de los Frascos 1 2 3 y 4 dentro de las respectivas cavidades Equilibrar a temperatura ambiente 2 Remover la pajuela s del nitr geno l quido y mantenerla a temperatura ambiente durante 30 segundos Luego colocar la pajuela s en un ba o de agua a 30 C durante 1 minuto 3 Cortar el final de la pajuela colocar una jeringa de 1 ml con aire y luego cortar el otro final de la pajuela 4 Expulsar el contenido de la pajuela a la placa de Petri mientras se observa el fondo de la pajuela desde el microscopio de disecci n 51 los pre cigotos embriones no pueden ser vistos llenar r pidamente la pajuela y lavarla Los pre cigotos embriones pueden pegarse a los lados de la pajuela ocasionalmente 5 Una vez que se visualiza el pre cigoto embri n deber ser recuperado de la soluci n de congelamiento y colocado en el medio del Frasco 1 en temperatura ambiente durante 5 minutos NOTA Los pre cigotos embriones criopreservados son osmoticamente estresados y deber n se manipulados con sumo cuidado 6 Colocar los pre cigotos embriones en el medio del Frasco 2 a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego en el medio del Frasco 3 tambi n a temperatura ambiente durante 10 minutos 7 Los pre cigotos o embriones son
4. Trabajar r pido y eficientemente Denudaci n de ovocitos para ICSI Este procedimiento implica la eliminaci n enzim tica y mec nica de las c lulas del cumulus que rodean el ovocito La denudaci n es requerida para permitir la visualizaci n del cuerpo polar para un correcto alineamiento del ovocito previo a la inyecci n de espermatozoide y para asegurarse que el espermatozoide este correctamente inyectado Los ovocitos son denudados 1 2 horas luego de la recuperaci n y el ICSI es llevado a cabo 1 2 horas luego de la eliminaci n del cumulus Utilizar pipetas con un di metro levemente mayor que el de los ovocitos y evitar el manejo excesivo Luego de la recuperaci n de los ovocitos se recomienda dejarlos descansar con un m nimo de 2 horas previas a la denudaci n Recordar que los ovocitos son fr giles y pueden resultar susceptibles a la lisis sin son aspirados muy vigorosamente SynVitro Hyadase N Cat 1511 es listo para ser utlizado y consiste de un medio b sico puro sint tico conteniendo 80 IU ml de la enzima hialuronidasa El material crudo de hialuronidasa es de origen ovino con licencia para usos terap uticos humanos Manejo SynVitro Hyadase tiene un tamp n HEPES y pH estable para uso fuera de la incubadora sin previo equilibrado Calentar a 37 previo a su uso No exponer los ovocitos por mucho tiempo a la soluci n de hialuronidasa ya que esto puede activarlos partenogeneticamente y
5. Antes de que los ovocitos sean congelados son parcialmente denudados y solo las c lulas del cumulus m s cercanas a la zona pel cida quedan El ICSI se recomienda para la fertilizaci n de los ovocitos congelados descongelados ya que la zona pel cida se endurece luego de la criopreservaci n Hatching asistido del embri n resultante puede mejorar la tasa de implantaci n OocyteFreeze N Cat 1048 es listo para ser utilizado con propanediol 1 2 y sacarosa de acuerdo al m todo Fabbri et al 2001 Las soluciones de congelado son formuladas utilizando Tamp n Fosfato Salino de Dulbecco PBS con HSA y alfa beta globulinas La soluci n de tamp n fosfato es utilizada para que todos los pasos sean llevados a cabo fuera de la incubadora y a temperatura ambiente Manejo Calentar a temperatura ambiente R pida Referencia OocyteFreeze 196 i TM Instrucciones para uso OocyteFreeze 1 Colocar etiquetas en las placas para las soluciones de congelado e Una placa de Petri Placa 1 es preparada utilizando 3 ml del Frasco 1 en el que los ovocitos son lavados e Preparar una placa de 4 cavidades Placa 2 con las dos cavidades de la derecha conteniendo 0 5 ml del Frasco 2 y las dos de la derecha conteniendo 0 5 ml del Frasco 3 Equilibrar a temperatura ambiente 2 Rotular las pajuelas con informaci n del paciente No escribir directamente en las pajuelas ya que los solventes pueden penetrar en
6. El embrion puede ser mantenido en el mismo medio desde el Dia hasta el Dia 3 y es por eso que no se necesitar n cambios extras en el medio en comparaci n con la transferencia del D a 2 Ver procedimiento 1 3 Los embriones son preparados y transferidos al tero en Universal IVF Medium en el D a 3 cuando hayan alcanzado la etapa de 6 8 c lulas Ver la secci n TRANSFERCIA EMBRIONARIA ET Instrucciones de uso B 2 Embriones cultivados en ISMI desde el D a 0 Pasos 1 3 como en el procedimiento Bl Los embriones pueden ser mantenidos en el mismo medio desde el D a 1 hasta el D a 3 y es por eso que no son necesarios cambios extra en el medio en comparaci n con la transferencia del D a 2 Ver procedimiento 1 4 En el D a 3 cuando los embriones han alcanzado la etapa de 6 8 c lulas son colocados en medio UTM pre equilibrado Uterine Transfer Medium en la espera de la transferencia Ver la secci n TRANSFERENCIA EMBRIONARIA Instrucciones de uso C 1 BlastAssist System 1 Llevar a cabo la inseminaci n D a 1 en Medium 1 o Universal Medium N Cat 1030 1031 pre equilibrado Donde ICSI es requerido los ovocitos son transferidos al Medium 1 inmediatamente luego de la inyecci n 2 A las 16 20 horas D a 1 chequear pron cleos luego lavar y transferir cuidadosamente los pre cigotos a un plato de cultivo pre equilibrado conteniendo microgotas de 50 ul o cavidad plato con 0 5
7. OocyteFreeze Preincubation Oocvte Thaw Sperm Preparation Medium MediCult Vitrification IVF ICSI Sperm Injection Universal IVF Medium SynVitro ICSI Holding or BlastAssist Medium Medium Licuid Paraffin Liquid Paraffin Universal IVF Medium or BlastAssist Medium or ISM1 In Vitro Fertilisation Pronuclear stage Embryo Freezing amp Culture ISMI Embryo Replacement Day 2 3 Thawing Universal Medium Embryo Freezing Pack 2 77 UTM Embryo Thawing Pack ewer ao e PN MediCult Vitrification BINDS Medium 2 Extended Culture blastocyst development or ISM2 Embryo Replacement Day 3 4 BlastAssist Medium 2 or BlastAssist Medium 2 UTM Li Zona drilling Acidified Tyrodes Solution Embryo Replacement Day 4 5 6 4 BlastAssist Medium 2 or UTM IM Or ISM2 Embryo Biopsy PGD Biopsy Medium Blastocyst Freezing amp Thawing BlastFreeze BlastThaw MediCult Vitrification Embryo Replacement MANIPULACI N DE GAMETOS Y EMBRIONES Un factor importante para el xito de la tecnolog a de reproducci n asistida es recordar que usted esta trabajando con materiales vivos Por ende usted debe ponerse en lugar del gameto o del embri n cuando usted los esta manipulando Los ovocitos y los embriones son muy sensibles y no deber an ser expuestos a grandes cambios de temperatura o pH Ambos prefieren 37 y un pH neutro L
8. Barcelona Spain Transferencia de Embriones ET Deber ser llevado a cabo con el m s m nimo trauma posible tanto para el embri n s como para el paciente El procedimiento es llevado a cabo en forma transcervical y a menudo sin anestesia Utilizar un cat ter suave no t xico y no traum tico de uso nico Se deber tener mucho cuidado para evitar que la punta del cat ter se contamina en cualquier instante de la operaci n El embri n s es cargado en el cat ter de transferencia justo antes del procedimiento de transferencia Se deber prestar mucha atenci n para minimizar el trauma en la canal cervical y la cavidad uterina Procedimiento Los embriones ser n transferidos en el Transfer Medium UTM especial en el mismos medio que es utilizado en el cultivo UTM contiene hialuron para facilitar la implantaci n del embri n humano El procedimiento actual de la transferencia depende de la experiencia en la cl nica de fertilidad Es de gran importancia que todo el staff implicado sienta comodidad con lo que se est realizando Varios centros utilizan el siguiente procedimiento 1 Una hora antes de lo panificado el ET las jeringas y los cat teres son almacenados en la incubadora 2 El doctor prepara a la paciente higieniza la vagina aplica un esp culo limpio y tibio y lava el orificio del tero con salina tibia y est ril 3 Un cat ter de ensayo ser introducido para evaluar
9. cambie en un corto periodo de tiempo Solo ovocitos 2PN podr n ser contados como fertilizados normalmente Todos los ovocitos 1PN podr n ser cultivados y re evaluados mas tarde en ese mismo d a 3 Lavar todos los presuntos embriones con dos pron cleos 2PN y transferirlos al plato de cultivo Dependiendo del d a en el que se espera hacer la transferencia los embriones son cultivados en el Medio Universal IVF N Cat 1030 1031 BlastAssist Medium 1 Cat 1039 1040 o ISMI N Cat 1050 1150 MEDIO DE CULTIVO Los ovocitos y los embriones son cultivados en un medio que provee condiciones f sicos y qu micas imitando el ambiente in vivo Mientras que el embri n se va desarrollando su dependencia en el ambiente del medio aumenta y es por eso que se recomienda un sistema de medio de cultivo secuencial Los embriones pueden ser transferidos al tero en el D a 2 40 48 horas posteriores a la inseminaci n D a 3 66 74 horas posteriores a la inseminaci n o en la etapa del blastocisto en el D a 5 6 120 144 horas posteriores a la inseminaci n Como elegir el medio de cultivo MediCult ofrece 3 sistemas de cultivo diferentes 1 Universal IVF Medium Un medio de selecci n temprana del embri n es dise ado para fertilizaci n y cultivo de embriones en la etapa de clivage 2 ISMI amp ISM2 ISM1 para fertilizaci n y cultivos ptimos de embriones en la etapa de clivage hasta el d a 3 ISM
10. cleos luego cuidadosamente lavar y transferir pre cigotos a microgotas de 50 ul o 0 5 ml cavidad recipiente de ISM1 cubierta con Parafina Liquida Los embriones deber n ser cultivados unicamente o de manera multiple con un m ximo de 4 por cavidad 4 Al D a 2 cuando los embriones hayan alcanzado 4 5 c lulas son colocados en medio UTM Uterine Transfer Medium pre equilibrado a la espera de la transferencia Revisar la secci n TRANSFERENCIA EMBRIONARIA ET Evaluaci n del embri n en el D a 2 A las 40 48 horas posteriores a la inseminaci n los embriones deber n ser evaluados para su transferencia cultivo extendido o criopreservacion El puntaje m s alto se caracterizar por 4 5 blast meros clivage antes que apariencia blast meros de tama os iguales con citoplasmas homog neos y membranas plasm ticas distinguibles as como n cleos en uno de los blast meros c lulas no multinucleares 4 etapas celulares con un x alineaci n sim trica ning n fragmento o un m ximo de 10 de fragmentos los blast meros llenan la zona zona normal pero desigual D a 3 de la transferencia de los embriones Dependiendo del medio de cultivo elegido en el D a 0 D a 1 el cultivo es llevado a cabo con Universal IVF Medium ISM1 o BlastAssist Medium 2 Instrucciones de uso A 2 Embriones cultivados en Universal IVF Medium desde el dia 0 Paso 1 2 como en el procedimiento Al
11. difieren de las pajuelas y es por eso que los protocolos de congelado dados en esta secci n pueden ser adecuados para los de estas ultimas La criopreservaci n de las gametas y los embriones implica una exposici n inicial a los crioprotectores llev ndolos a temperaturas bajo cero descongelando y finalmente diluy ndolos y removiendo los crioprotectores con un regreso a un ambiente fisiol gico que permite un futuro desarrollo La creciente demanda para m todos de criopreservaci n exitosa resulta de un m s peque o n mero de embriones transferidos en orden de reducir las tasas de embarazos m ltiples en ART Un exitoso procedimiento de congelado y descongelado asegura el mantenimiento de la integridad estructural de la c lula al igual que sus caracter sticas funcionales Un manejo adecuado de la presi n osm tica es crucial para el xito y es importante evitar el da o dado por la formaci n de hielo intracelular S1 el proceso de deshidrataci n ha sido inadecuado cristales largos e intracelulares ser n formados Es por todo lo mencionado que las c lulas son deshidratadas antes y durante el procedimiento de enfriado La formaci n de hielo extracelular es un evento crucial para el comienzo de la perdida controlada de agua de las c lulas Un proceso llamado sembrado induce esto tocando con un algod n pre enfriado o f rceps a la interfase liquida a rea de la pajuela justo cuando la soluci n llega al punto critico de cri
12. llev ndolo a menudo a la fragmentaci n El D a O es el d a de la recuperaci n de ovocito Presi n alta o no controlada puede da ar el ovocito Para impedir que el pH disminuya durante la aspiraci n los ovocitos deber n ser mantenidos en medio tamp n HEPES como SynVitro Flush Flushing Medium Para permitir que durante el procedimiento de lavado se produzca una baja en la temperatura el medio deber ser mantenido levemente por arriba de los 37 usando bloques t rmicos Trabajar r pido y eficientemente Los ovocitos deber n ser transferidos dentro de un medio de cultivo pre equilibrado en una incubadora lo antes posible Evaluaci n de la calidad del ovocito 1 Inmaduro 1 Peque o compacto gris cumulus no expandido C lulas de Corona formando un anillo oscuro alrededor de la zona pel cida Ovocito apenas visible 2A Maduro M Cumulus expandido peque o Corona no irradiada completamente Ovocito parcialmente visible 2B Maduro y excelente M Cumulus grande y expandido Corona irradiada Ovocito claro y visible 3A Sobre maduro O Cumulus peque o y fino con peque os parches de c lulas oscuras Se podr observar un ovocito visible usualmente oscuro 3B Post maduro atr tico Pequefios cumulus totalmente Ovocito oscuro Etapas de maduracion del ovocito ICSI GV Vesicula germinal Ovocito inmaduro Vesicula grande y
13. n para los embriones Est ndares Las instalaciones de manufactura operan con un sistema asegurador de calidad ISO 9001 e ISO 13485 en la sede de Medicult en Jyllinge Dinamarca Este sistema es revisado regularmente para ser renovado Todos los procedimientos operativos son conformes a los principios de GMP Practica de buena manufactura El proceso de manufactura es llevado a cabo en salones limpios clasificados como clase GMP Dy A El monitoreo y los tests de control de calidad son realizados en todos las etapas del proceso desde el recibo de las materias primas hasta el producto final MediCult fue el primer distribuidor de medios ART en obtener certificados basados en estos est ndares Los productos vendidos en USA tienen 510 K aprobaciones de la FDA La seguridad del paciente primero Para MediCult es muy importante distribuir medios que sean seguros para el paciente SSR Reemplazo de suero sint tico en USA Suplemento ART es usado para reemplazar en parte la HSA Materias primas de grado farmac utico como fuente de prote nas ej Alb mina de suero humano y otros ingredientes activos El agua de MediCult cumple con los requisitos de Ph Eur para agua purificada Los m todos farmacopeicos para el control de calidad son aplicados en tanto est n disponibles El periodo de conservaci n es validado la estabilidad es evaluada en condiciones similares a las de uso Los productos s
14. nimo de 2 horas en CO a 37 previo al uso Universal IVF Universal IVF Universal IVF Medium Medium Medium Medium Instrucciones de uso BlastThaw El procedimiento de descongelado se lleva a cabo bajo una corriente de CO en el aire y la intensidad de la corriente se regula de acuerdo al color del medio para mantener estabilidad de pH 1 Rotular la placa con las soluciones de descongelado y pipetear vol menes apropiados de la soluci n de descongelado del Frasco 1 y el Frasco 2 dentro de la placa 2 Remover la pajuela s del nitr geno l quido y mantener a temperatura ambiente durante 10 15 segundos 3 Cortar el final de la pajuela colocar una jeringa de 1 ml con aire y luego cortar el otro extremo de la pajuela 4 Expulsar el contenido de la pajuela dentro de la placa de Petri mientras se observa el extremo de la pajuela desde un microscopio de disecci n Si no se ve el blastocisto rellenar r pidamente la pajuela y lavarla suavemente Los blastocistos se pueden adherir a la pared de la pajuela ocasionalmente 5 Un vez que el blastocisto es visualizado deber ser recuperado de la soluci n de congelamiento y colocado en el medio del pozo 1 durante 10 minutos en temperatura ambiente y bajo una corriente de CO Los blastocistos son almacenados en la oscuridad NOTA Los blastocistos criopreservados son osmoticamente estresados y deber n ser manejados con sumo cuidado 6 Luego el blastocisto es
15. Medium PVP Clinical Grade Liquid Paraffin SynVitro Instrucciones para uso PVP El protocolo requiere que suficiente Parafina Liquida N Cat 1010 sea pre equilibrada la noche anterior en la incubadora con control de CO y temperatura a 37 1 Remover el PVP y el SynVitro ICSI Holding Medium N Cat 1585 del almacenamiento a 2 8 C y dejarlo a temperatura ambiente por 10 minutos 2 Dependiendo del n mero de ovocitos para la inyecci n colocar en una pipeta un n mero correspondiente de 10 ul gotas de SynVitro ICSI Holding Medium dentro del fondo del plato para ICSI 3 En el medio del mismo plato colocar 5 10 ul gotas de PVP Clinical Grade o PVP Medium 4 Cubrir con Parafina Liquida pre equilibrada y colocar el plato en una incubadora con control de CO y a 37 por 30 minutos previos al uso 5 Introducir 2 ul del esperma preparado y lavado a una gota de PVP Clinical Grade o PVP Medium El PVP reducir la motilidad del esperma y facilitar la captura y la carga de un nico espermatozoide en la pipeta de inyecci n 6 Ver la secci n El procedimiento ICSI R pida Referencia SpermSlow SpermSlow M SynVitro ICSI Holding P SynVitro ICS Holding EN Medium 5 10 ul perm 1 5 i Wes e r Sperm Preparation Medium 10 20 mm 2 5 mm Sperm Sperm Preparation Preparation edium 1 sperm cell Instrucciones de uso SpermSlow Recupe
16. SynVitro Hyadase Sistema abierto 20 Sd Ds 1 Preparar un plato de cuatro cavidades con una cavidad de Syn Vitro Hyadase 3 5 00 ul y las otras tres cavidades con Universal IVF Medium 3 500 ul pre equilibrado 2 Humedecer el interior de una pipeta larga y pre calentada con el medio del plato en el que los ovocitos son almacenados 3 Reunir los ovocitos muy cerca unos de los otros con una pipeta para asegurarse de que sean f cilmente colocados dentro de la pipeta 4 Colocar uno o varios complejos ovocitos cumulus en una cavidad con SynVitro Hyadase Luego de 5 10 segundos suavemente aspirar los ovocitos arriba y abajo hasta que la mayor a de las c lulas del cumulus hayan sido aflojadas 5 Transferir los ovocitos a una cavidad con Universal IVF Medium utilizando una pipeta de denudaci n y remover las c lulas de corona restantes de la misma manera 6 Lavar los ovocitos completamente transfiri ndolos a las otras cavidades de la placa conteniendo Universal IVF Medium 7 Clasificar los ovocitos en etapa de metafase II La microinyecci n podr ser llevada a cabo nicamente en ovocitos maduros con una zona pel cida intacta preferentemente sin vacuolas u otras anomal as vistas en el ooplasma 8 Se recomienda dejar los ovocitos en Universal IVF Medium en la incubadora con control de CO ambiente y a 37 C por un per odo de tiempo previo antes de proceder con el ICSI R pida Referencia SynV
17. antes posible 5 Los ovocitos son lavados con SynVitro Flush Flushing Medium o un medio de cultivo pre equilibrado teniendo sumo cuidado al remover los co gulos de sangre y las c lulas de granulosa 6 El n mero de ovocitos es contabilizado y su calidad es determinada 7 Los ovocitos son transferidos a un medio de cultivos pre equilibrado y almacenado en un incubador con control de CO y a 37 para aguardar la inseminaci n Alternativamente los ovocitos pueden ser almacenados en un sistema cerrado conteniendo SynVitro Flush o Flushing Medium a 37 C hasta por 4 horas hasta la inseminaci n El almacenamiento en SynVitro Flush Flushing Medium es utilizado principalmente en caso en el que los ovocitos sean transportados a otra cl nica para cultivos e inseminaci n INSEMINACION Dependiendo en la calidad del semen la inseminaci n es llevada a cabo tanto por FIV como por ICSI en orden de proveer cuantos m s ovocitos fertilizados sea posible Los procedimientos ICSI son descriptos en la secci n MICROMANIPULACION La inseminaci n es llevada a cabo dentro de las 4 horas posteriores a la recuperaci n del ovocito Para la inseminaci n FIV el n mero de los espermatozoides agregados en cada ovocito depende en la historia de cada paciente y la practica del laboratorio Generalmente aproximadamente 100 000 espermatozoides m viles por ml son utilizados El tiempo de la inseminaci n varia entre 1 a 20
18. colocados en el medio del Frasco 4 durante 10 minutos a 37 Esto se realiza para remover los ltimos rastros de sacarosa y permitir que el embri n vuelva a los 37a C gradualmente Nota No colocar los embriones en una incubadora CO dado que la capacidad del tamp n del fosfato EFM es insuficiente para la atm sfera de 8 Los pre cigotos o embriones son colocados en un medio de cultivo que puede ser tanto Universal IVF Medium N Cat 1030 103 1 como ISMI V ISM2 N Cat 1050 105 1 or 1150 1151 o BlastAssist System N Cat 1039 1040 dependiendo de la etapa de desarrollo en la que est n y el d a en que son transferidos La placa es almacenada en la incubadora con control de CO y 37 a la espera de la transferencia del embri n Congelaci n de Blastocistos D a 5 BlastFreeze y BlastThaw ayudan a optimizar los resultados generales del cultivo de blastocistos La Dra Irma Virant Klun y el Dr Tomaz Tomazevic junto con un grupo de IVF en el University Medical Centre de Ljubljana Slovenia han desarrollado el medio y la metodolog a Las f rmulas han sido utilizadas exitosamente para congelar y descongelar m rulas y blastocistos utilizando protocolos basados en el principio de los dos pasos publicado originalmente por Y M n zo y A Veiga en 1997 R pida Referencia BlastFreeze BlastFreeze N Cat 1053 es listo para ser utilizado con glicerol y sacarosa para un protocolo
19. con sucrosa listo para usar medios de disoluci n 1 amp 2 ambos con decrecientes concentraciones de sucrosa y dos viales para lavar el medio con HSA Manipulaci n Los medios que se encuentran en el Thaw Pack est n tamponados con HEPES y tienen un pH estable para que todos los pasos puedan realizarse fuera de la incubadora a temperatura ambiente Calentar a temperatura ambiente previo a su uso con la excepci n del medio de descongelado que debe calentarse a 37 antes de ser usado R pida Referencia MediCult Vitrificaci n Freeze Instrucciones de uso MediCult Vitrification Freeze MediCult recomienda el uso de un recipiente adecuado para el nitr geno l quido LN2 el cual puede ser esterilizado por ejemplo un vaso de precipitados de pirex Tambi n recomienda el uso de LN est ril para evitar todo riesgo de contaminaci n La carga m xima de McGill Cryoleaf recomendada es de 2 3 ovocitos o embriones 1 EM y VM deben estar equilibrados a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos 2 Use 1 ml del medio en una placa Ej 4 pozos adecuada para la vitrificaci n 3 Sumergir la cubierta exterior del McGill Cryoleaf en el ba o de LN 4 Usando una pipeta adecuada transferir 2 3 ovocitos denudados embriones en el EM y dejar que se equilibren por 5 minutos los ovocitos o embriones se reducen en tama o inicialmente y luego vuelven a su forma anterior 5 Transferir los ovocitos o embrio
20. contienen la sangre Flushing Medium se encuentra solo disponible con Rojo Fenol y antibi ticos Manejo SynVitroFlush y Flushing Medium son estables de pH para uso fuera de la incubadora sin previo equilibrio Entibiar a 37 C previamente al uso Nota La tapa de la botella debe ser cerrada fuertemente durante el pre calentamiento R pida Referencia Flushing Medium Flushing Medium Flushing Medium Flushing Medium Flushing Medium Culture Medium Culture Medium Instrucciones de uso Recuperaci n de ovocitos 1 Durante el proceso entero de la recuperaci n de los ovocitos y el transporte al laboratorio de embriolog a SynVitro Flush o Flushing Medium deber n ser preservados a 37 C para evitar interrupci n en el eje de los ovocitos 2 Lavar la cavidad interna de la aguja de recuperaci n y la tubuladura de aspiraci n con 10 ml de SynVitro Flush o Flushing Medium antes de comenzar la recuperaci n del ovocito 3 Las jeringas utilizadas para la recuperaci n de los ovocitos deber n ser cargadas con SynVitro Flush o Flushing Medium Aspirar el fluido folicular y lavar el fol culo cuando sea necesario con un volumen del medio equivalente a la cantidad de fluido folicular recolectado Se deber tener cuidado de no expandir el fol culo con el medio por encima de su tama o original 4 El fluido folicular aspirado es preservado a 37 C utilizando platinas t rmicas deber ser examinado por el laboratorio cuanto
21. despu s de la cri preservaci n Vitrificaci n La vitrificaci n o m todo para llegar al estado v treo 130 para el agua fue concebido como una potencial alternativa en 1985 al congelamiento lento Rall et al 1985 Ya que las lesiones de los ovocitos causadas por el congelamiento aparecen con el tiempo se busca prevenir la formaci n de hielo y las lesiones por congelamiento r pidamente logrando solidificar el agua intracelular antes de que esta se cristalice Martino et al 1996 Las condiciones extra e intracelulares que existen y que permiten la crio supervivencia a 30 en procesos de congelamiento lento son imitadas durante el proceso de vitrificaci n con la diferencia de que estas se realizan a temperatura ambiente Esto es posible mediante un periodo de equilibrio muy corto La exposici n de la c lula a altas concertaciones de crioprotector es seguido de un congelamiento ultra r pido realizado sumergi ndola en nitr geno liquido La alta osmolaridad del medio de vitrificaci n deshidrata r pidamente la c lula y la sumersi n en el nitr geno l quido solidifica la c lula antes de que el agua intracelular restante tenga tiempo de formar cristales de hielo perjudiciales Dos aspectos importantes de esta t cnica son los elevados niveles de toxicidad del crioprotector a temperatura ambiente Shaw et al 1992 y su habilidad para vitrificarse congelarse y calentarse descongelarse lo sufici
22. disponible con o sin Rojo Fenol Manejo Previo al uso equilibrar el medio de cultivo en el recipiente del cultivo por un m nimo de 2 horas en una incubadora con control de y 37 C Cultivo de Embriones Embriones de desarrollo r pido tendr n mayor potencial de implantaci n embriones deber n ser evaluados una vez al d a preferiblemente en tiempos fijados para que la tasa de crecimiento se note cultivo de blastocistos no mejora la calidad pobre del embri n en el D a 2 y el D a 3 pero mejora la selecci n del embri n para transferencia especialmente beneficiosa en caso de transferencia de un nico embri n CEmbriones cultivados hasta el D a 5 deber n ser evaluados en la ma ana conscientes que la temperatura y el pH del medio de cultivo son inestables en el aire Trabajar r pido y eficientemente cuando se traslade el embri n fuera de la incubadora Manejo adecuado de la incubadora es importante para asegurar el re equilibrado del medio de cultivo Cultivos bajo Parafina Liquida retrazan la perdida de temperatura y el cambio del pH en comparaci n con cultivos de platos abiertos Ser conscientes que mientras que la Parafina L quida va a disminuir la velocidad de los tiempos de salida del gas del medio tambi n retardar la velocidad del reingreso del gas Liquid Parafin N Cat 1010 es utilizada como una capa aceitosa para medios de cultivo durante procedimie
23. dos de los m s peque os blastomeros se les practica una biopsia y es colocada en las correspondientes gotas de Biopsy Medium 8 Al finalizar la biopsia el embri n deber ser transferido a otra placa separada de lavado donde ser transferido por microgotas O pozos para cultivo extendido con medio de cultivo BlastAssist Medium 2 o ISM2 para remover todos los rastros de Biopsy Medium y Soluci n Acidulada de Tyrodes 9 Finalmente transferir el embri n dentro de un plato nuevo con microgotas cavidad pre equilibradas del medio de cultivo cubierto con Parafina Liquida pre equilibrada 10 El plato de biopsia con blastomeros aislados esta listo para la preparaci n de la muestra Cuando el PGD esta completado se eval a la morfolog a de cada embri n y se cuenta el numero de c lulas con la m xima exactitud posible para obtener una indicaci n de la divisi n posterior a la biopsia La transferencia del embri n es llevada a cabo usualmente en el D a 5 luego que el diagn stico gen tico se haya completado Se consulta con los otros miembros del equipo PGD y finalmente con las parejas mismas se selecciona un m ximo de dos embriones no afectados con la mejor morfolog a para ser transferidos CRIOPRESERVACION Este es el proceso de congelado almacenaje descongelado de gametas y embriones Las muestras son congeladas en pajuelas ampollas o frascos Las caracter sticas de enfriado de las ampollas y los frascos sin embargo
24. en 20 30 ul del medio 9 Finalmente el cat ter es retirado lavado y examinado para asegurarse que los embriones sean liberados El ultrasonido puede ser utilizado para asegurarse la posici n del tero previo a la transferencia y tambi n puede ser utilizado luego de determinar la posici n de los embriones en medio de las dos burbujas de aire MICROMANIPULACION Introducci n Micromanipulaci n incluye los procedimientos de inyecci n intracitoplasm tica de espermatozoides ICSI hatching asistido y biopsia de embriones Todos los equipos de micromanipulaci n deber n ser posicionados correctamente para lograr una m xima estabilidad Las vibraciones puertas ascensores tr fico etc deber n ser evitadas ya que estas pueden causar interrupciones estresantes Para m ximos resultados utilizar solamente instrumentos de micromanipulaci n de la m s alta calidad El mantenimiento constante de la temperatura durante el procedimiento es importante Por todo lo mencionado es necesario el uso de platinas t rmicas correctamente ajustadas 1 e etapa de calentado del microscopio para mantener el medio cerca de los 76 Luego de 5 10 minutos de micromanipulaci n se puede esperar que la temperatura del medio sea de aproximadamente 5 C m s fr a que la temperatura original de la platina t rmica Utilizar una capa de Parafina L quida pre equilibrada para retrazar la osmolaridad y los cambios en el pH
25. horas y depende en las pr cticas del laboratorio y la calidad del esperma Procedimiento 1 La muestra de esperma preparada es contabilizada exactamente y deber tener una concentraci n cercana a los 10 millones de espermatozoides m viles por ml Esto se llevar a cabo en orden de minimizar el volumen de espermatozoides agregados a las cavidades de inseminaci n gotas 2 El volumen de espermatozoides agregados ser calculado para que la concentraci n final de espermatozoides en cada cavidad de inseminaci n gotas sea la adecuada 100 000 espermatozoide ml 3 Una vez que el espermatozoide ha sido agregado al plato de inseminaci n es chequeado bajo un microscopio para asegurarse de que el espermatozoide m vil este presente El recipiente es luego retornado a la incubadora 4 Luego de un corto per odo de inseminaci n l a 4 horas los ovocitos son lavados en el medio de cultivo y son transferidos a un plato de cultivo Las c lulas de cumulus no deber n ser removidas en esta etapa 5 Para incubaci n nocturna los ovocitos son dejados en el plato de inseminaci n por 16 a 20 horas Todos los medios de cultivos MediCult contienen suficiente concentraci n de glucosa necesaria para lograr tasas de fertilizaci n ptimas y es por eso que pueden ser utilizados como medio de inseminaci n Dependiendo de la inseminaci n utilizada el sistema de cultivo utilizado ser el Universal IVF Medium N Cat 1030 103
26. la comodidad del pasaje por el cervix y dentro del tero S1 el pasaje es sencillo el embri n s podr ser cargado dentro de un cat ter limpio para el procedimiento ET El ET es llevado a cabo posiblemente con la gu a de ultrasonido y con vejiga llena 4 Una jeringa de 1 ml no toxico es enjuagada con UTM o un medio de cultivo y llenado con 0 5 ml del medio para la transferencia No dejar aire en la jeringa y conectarla firmemente al cat ter de transferencia 5 Conectar firmemente la jeringa al cat ter Expulsar todo el medio menos 50 ul por el cat ter 6 Sacar el plato con el embri n del paciente volver a chequear su identidad y asegurarse que los embriones est n en el plato y cerca uno del otro Los embriones son mantenidos en el medio de transferencia 7 Cargar el cat ter Primero aspirar cerca de 10 15 mm del aire dentro del cat ter y luego medio seguido por los embriones y medio adicional 10 15 mm en total Chequear todos los movimientos por el microscopio Finalmente aspirar lentamente cerca de 10 15 mm de aire y 5 mm del medio dentro de la punta del cat ter no deber n haber roturas all de la columna del medio o formaci n de burbujas de aire La ltima proporci n del medio previene que muco cervical entre al cat ter ya que puede dificultar el ET ver dibujo Medio UTM o medio de cultivo 8 El cat ter de transferencia es gentilmente insertado y el embri n es expulsado
27. la zona queda abierta mientras que en la otra mitad de la zona puede ser ensanchada mec nicamente movilizando la micro aguja por la abertura en un movimiento de rompimiento para alcanzar a obtener una perforaci n aun superior 15 20 um 6 Inmediatamente lavar el embri n s enteramente transfiri ndolo a varias gotas de Sperm Preparation Medium y finalmente colocarlo en el medio para transferencia embrionaria El manejo subsiguiente de los embriones deber ser suave para reducidir el riesgo de p rdida de blast meros Biopsia del embri n Este procedimiento usualmente es llevado a cabo en los embriones del D a 3 antes de que ocurra la compactaci n de los embriones y es generalmente es realizada temprano por la ma ana Uno o dos blast meros son removidos del embri n para diagnostico de pre implantaci n gen tica PGD Biopsy Medium N Cat 1062 es libre de Ca y Mg y es por eso que afloja los empalmes entre los blast meros del embri n ya que estos son dependientes de calcio y magnesio Es por eso que se recomienda mantener la exposici n a un m nimo para evitar efectos potencialmente delet reos en el desarrollo del embri n Biopsy Medium contiene HEPES y tamp n de bicarbonato pero este no deber estar fuera de la incubadora por m s de 10 minutos Manejo Equilibrar por un m nimo de 2 horas en incubadora con control de CO y a 37 previos al uso R pida Referencia Biopsy Medium Acidified Biop
28. las pajuelas 3 Aspirar parte de la soluci n de congelado del Frasco 1 seguido por la aspiraci n de los pre cigotos embriones de la placa de cultivo 4 Transferir los pre cigotos embriones con lo menos posible de medio de cultivo al Frasco 1 y marcar timer en 5 minutos NOTA Los pre cigotos embriones flotar n en la superficie del medio y se hundir n lentamente en el fondo de la cavidad Es por eso que se considera una ventaja si usted los atrape con cuidado y los coloca en el fondo de la placa 5 Justo antes de que pasen los 5 minutos colocar parte de la soluci n de congelado del Frasco 2 dentro de la pipeta Cuando suene la alarma del timer con cuidado tomar los pre zigotos embriones y transferirlos a la soluci n de Frasco 2 Los pre cigotos embriones son dejados durante 10 minutos en la soluci n de Frasco 2 6 Justo antes que los pre cigotos embriones sean transferidos a la soluci n del Frasco 3 el interior de las pajuelas es lavado con la misma soluci n pero de otra placa NOTA Sacar aire de la jeringa que facilita remover el remanente de la soluci n de Frasco 3 No permitir que esta soluci n se ponga en contacto con el tap n 7 Tomar la soluci n del Frasco 3 y colocar dentro de una pipeta Cuando suene la alarma con cuidado remover los embriones de all y transferirlos a la soluci n del Frasco 3 Cuando los pre cigotos embriones se hayan hundido en el fondo del recipiente cargar la pajuela c
29. ml del Medium 1 para futuro cultivo El embri n deber ser cultivado unicamente o de manera multiple a un m ximo de 2 por cavidad 3 En la etapa de 5 6 c lulas los embriones son lavados en un Medium 2 pre equilibrado y transferidos a microgotas de 50 ul o cavidades plato con 0 5 ml del mismo medio Los embriones deber n ser cultivados unicamente o en forma multiple con un m ximo de 4 por cavidad en la segunda etapa del medio 4 Los embriones son preparados y transferidos al tero en Medium 2 cuando hayan alcanzado la etapa de 6 8 c lulas en el d a 3 Ver la secci n TRANSFERENCIA EMBRIONARIA Evaluaci n del embri n en el D a 3 A las 66 74 horas posteriores a la inseminaci n los embriones deber n ser evaluados para la transferencia los cultivos extendidos hasta el d a 5 o el 6 o la criopreservaci n El puntaje m s alto se caracterizar por 6 8 blast meros clivage antes que apariencia blast meros de tama os iguales con citoplasmas homog neos y membranas plasm ticas distinguibles as como n cleos en uno de los blast meros gt ninguna c lula multinuclear homogeneidad embri n compactado ning n fragmento o un m ximo de 10 de fragmentos blast meros llenan la zona A 77 PSA N rs zona normal pero desigual Cultivo extendido D a 5 6 Dependiendo del medio de cultivo elegido en el D a 0 D a 1 el cultivo es practicado en ISM2 o BlastAssist Me
30. n en un Sperm Preparation Medium Aspirar 10 20 mm dentro de la pipeta de manejo y 2 5 mm dentro de la pipeta de inyecci n 8 Expulsar el Sperm Preparation Medium de la pipeta de inyecci n dentro del plato de Sperm Preparation Medium 9 Colocar un ovocito en cada gota de SynVitro ICSI Holding Medium 10 Aspirar 5 6 mm SpermSlow dentro de la pipeta de inyecci n 11 Con cuidado seleccionar un espermatozoide maduro cerca del empalme de la gota del SpermSlow en el medio del plato Buscar el espermatozoide que tenga la mejor morfolog a que posea una cola m vil y haya creado un lazo con el grid de Hialuronato Por favor notar que cualquier espermatozoide que circule libremente en la TM q i gota de SpermSlow es un espermatozoide inmaduro y no deber ser seleccionado El procedimiento ICSI La inyecci n intracitoplasm tica de espermatozoides ICSI es el procedimiento donde el espermatozoide es inyectado dentro del ovocito ICSI permite fertilizaci n y embarazos en caso de severos factores de infertilidad masculina La inyecci n es llevada a cabo bajo un microscopio invertido con una platina t rmica para mantener el plato ICSI y su contenido a 37 Si el espermatozoide es dif cil de obtener o el operador es lento las placas deben ser guardadas regularmente en la incubadora para equilibrado Se pueden establecer menor cantidad de ovocitos establecidos por placa cuando el operador es inexperto o el c
31. que usted pueda verla claramente Ajuste la presi n de la pipeta para que el espermatozoide no se mueva 5 Bajar la pipeta de sost n para que pueda ver el ovocito en el mismo campo visual Succionar el medio suavemente dentro de la pipeta de manejo y ajustar la presi n 6 Ajustar el filo en la parte interna del toda la pipeta de sost n que significa que el todo de la pipeta de sost n este a la misma altura que la parte media del ovocito Con cuidado ajustar el ovocito a la pipeta de manejo Ajustar el ovocito para que el cuerpo polar este en la posici n 12 o la 6 en punto Se debe mantener como una regla que la apertura de la pipeta siempre mire al cuerpo polar 7 Enfoque nuevamente 20 x magnificaci n colocar el espermatozoide casi en la punta de la pipeta de inyecci n y penetrar la zona pel cida puede que se necesiten peque os ajustes en el tiempo de la penetraci n 8 Penetrar dentro del ovocito completamente al otro lado de la zona pel cida retirar la pipeta si es necesario y llevar a cabo el estirado del oolema 9 Colocar la pipeta de inyecci n hasta 75 del di metro del ovocito y aspirar el citoplasma 20X Asegurarse que la membrana del plasma se rompa y el espermatozoide sea inyectado dentro del citoplasma 10 Cuidadosamente sacar la pipeta de inyecci n del ovocito y simult neamente reducir la presi n de la pipeta de manejo 11 Liberar al ovocito y levantar la pipeta de manejo al m ximo nive
32. redonda n cleo Nucleolo grande dentro de la ves cula germinal n cleo MI ovocito inmaduro ning n cuerpo polar en el espacio perivitelino PVS ovocito maduro cuerpo polar presente en el PVS SynVitro Flush N Cat 1584 y 1576 es un medio de lavado puramente sint tico dise ado para ser utilizado in vivo El medio es utilizado para lavar los fol culos pero tambi n para aclarar el lumen de la aguja de recuperaci n las l neas de aspiraci n y para lavar manejar los ovocitos hasta transferirlos en medios de cultivo pre equilibrados dentro de la incubadora SynVitro Flush es un medio modificado EBSS con SSR con tamp n bicarbonato y HEPES para mejorar la estabilidad del pH en el aire La formula qu micamente definida exhibe excelentes propiedades de manejo y no contiene alb mina u otros componentes de origen biol gico El medio es listo para ser utilizado con o sin Heparina La Heparina reduce la coagulaci n de aspirados foliculares conteniendo sangre SynVitro Flush no contiene antibi ticos y es por eso que recomendamos que este producto sea utilizado dentro de las 24 horas de ser abierto Flushing Medium N Cat 1084 y 1076 El medio es un medio modificado EBSS con SSR y HSA tamponado con bicarbonato y HEPES para mejorar la estabilidad del pH en el aire El medio es listo para ser utilizado disponible con o sin Heparina Heparina reduce la coagulaci n de los aspirados foliculares que
33. una ventaja atrapar con cuidado el blastocisto y colocarlo en el fondo del plato 5 Justo antes que terminen los 10 minutos sacar parte de la soluci n de congelado del pozo 2 y colocarla en la pipeta Cuando la alarma del timer suene sacar con cuidado el blastocisto y trasferirlo a la soluci n del pozo 2 La placa es colocada una vez m s dentro de la incubadora durante 10 minutos 6 Justo antes que la alarma del reloj suene la parte interna de las pajuelas deben ser lavadas con soluci n de congelaci n del pozo 2 NOTA Cargue un poco de aire en la jeringa para remover el remanente de la soluci n de pozo 2 No permitir que la soluci n se ponga en contacto con el tap n Ver pasos 7 9 en la pr xima p gina r 7 Transferir los blastocitos a las pajuelas un m ximo de 2 blastocitos por pajuela utilizando el medio del pozo 2 como medio de transferencia La pajuela es cargada de la misma manera que cuando se lleva a cabo la ET Cuando la primera columna del medio se pone en contacto con el tap n se sellar impidiendo todo movimiento posible en la pajuela ver diagrama Medium Abertura de la pajuela Connection Plug Air Blastocyst s 8 Sellar la abertura de la pajuela con un tap n para que el nitr geno liquido no entre dentro de la pajuela Repetir esto con todos los blastocistos Nota No se recomienda el sellado de las pajuelas por calor ya que puede formar grietas en las pajuelas y libera
34. y HEPES para mejorar la estabilidad en el aire del pH El medio contiene glucosa piruvato SSR y HSA Medio de Preparaci n de Esperma es listo para ser utilizado y disponible con o sin Rojo Fenol La versi n con Rojo Fenol esta disponible con o sin antibi ticos Penicilina Estreptomicina Manejo Equilibrar en por un m nimo de 2 horas a 37 previo al uso El Medio de Preparaci n de Esperma mantendr estable su pH fuera de la incubadora hasta por 15 minutos Si es tapado la estabilidad del medio aumentar a 1 hora dentro de la incubadora R pida Referencia Sperm Preparation Medium Sperm Preparation Medium 1 2 mi 0 2 1 mi P LLILLD T Sperm Preparation Medium 5 ml Instrucciones para uso Swim up 1 Despu s de la recolecci n del esperma la muestra es mezclada Ej mover el tubo durante 20 minutos a temperatura ambiente Si la muestra no se licua pude ser necesario pasarla a trav s de una pipeta angosta y o mezclarla con una peque a cantidad de Sperm Preparation Medium 2 Despu s que el proceso de licuado es completo se deber evaluar la concentraci n y motilidad esperm tica en el microscopio y determinar el m todo de lavado 3 Rotule un la cantidad necesaria de tubos con la identidad del paciente 4 Cuidadosamente coloque 0 5 1 ml de esperma licuado en cada tubo por debajo de 1 2 ml de Sperm Preparation Medium pre equilibrado 5 Los tubos son coloca
35. y transferir los pre cigotos a un plato de cultivo pre equilibrado conteniendo 50 ul microgotas o 0 5 ml cavidad plato del Universal IVF Medium para futuros cultivos El embri n deber ser cultivado unicamente o de manera multiple con un m ximo de 4 por cavidad 3 Los embriones son preparados y transferidos al tero en Universal Medium en el D a 2 cuando hayan alcanzado la etapa celular 4 5 Revisar la secci n TRANSFERENCIA EMBRIONARIA ET Instrucciones de uso B 1 15 1 1 Llevar a cabo la inseminaci n D a 0 ISM 1 pre equilibrado o Universal IVF Medium N Cat 1030 1031 Donde ICSI es requerido la inseminaci n es llevada a cabo en un SynVitro ICSI Holding Medium pre tibio N Cat 1585 2 51 Universal Medium es el medio de inseminaci n para FIV se recomienda un temprano enjuague en ISM1 las 4 horas para obtener una mejor morfolog a en el embri n Una vez que los ovocitos son cuidadosamente transferidos a un plato de cultivo pre equilibrado conteniendo 50 ul microgotas o 0 5 ml cavidades plato de ISM1 cubiertos con Parafina Liquida N Cat 1010 b Donde ICSI sea requerido los ovocitos ser n transferidos al plato de cultivo pre equilibrado de ISM1 inmediatamente luego de la inyecci n Los embriones deber n ser cultivados unicamente o de manera multiple con un m ximo de 4 por cavidad 3 A las 16 20 horas D a 1 chequear la formaci n de pron
36. 1 BlastAssist Medium 1 Cat 1 039 1040 ISMI N Cat 1050 1150 Evaluaci n de la Fertilizaci n D a 1 La fertilizaci n debe ser controlada en la primera Procedimiento hora de la ma ana antes de llevar a cabo alguna otra 1 Colocar los recipientes con los ovocitos inseminados y tarea Es de extrema importancia evaluar si los el recipiente del cultivo bajo el flujo laminar con control ovocitos han sido fertilizados normalmente dado que de temperatura de lo contrario los ovocitos anormales 1PN 3PN pueden dividirse en la etapa embrionaria 2 Evaluar el n mero de pro n cleos cuerpos polares nucleolos y la morfolog a general El Ser conscientes que la temperatura y el puntaje mas alto se caracterizara por pH del medio de cultivo son inestables l pron cleos localizados en el centro del ovocito en el aire trabajar r pido y eficientemente dos pron cleos polarizados de igual tama o a m nucleolos dentro del pron cleo Mantener el recipiente de inseminaci n bajo el flujo laminar con control de temperatura previo a la evaluaci n el nucleolo polariza contra otros pron cleos Ps m Dc os aureola de la mitocondria dos zonas dentro del m dt citoplasma La evaluaci n de la fertilizaci n examina P un n mero din mico de par metros y es Membranas citoplasm ticas distinguidas por eso que deber ser tomado en 4 consideraci n que la morfolog a puede que zona pel cida intacta
37. 2 para cultivo de blasticistos luego de la selecci n de embriones ISMI C mo elegir un medio de cultivo Universal IVF Medium Usted realiza la transferencia del embrion solamente en el Dia 2 Usted realiza la transferencia del embri n primariamente el D a 2 y un m nimo porcentaje del D a 3 Usted realiza la transferencia del embri n el D a 2 D a 3 Usted realiza la transferencia del embri n los D as 2 3 y 5 y elige el cultivo de blastocistos dependiendo del n mero de embriones D a 2 y D a 3 Usted realiza la transferencia del embri n los D as 2 3 y 5 y elige el cultivo dependiendo del n mero de ovocitos recolectados D a 2 Usted realiza la transferencia de embriones el D a 3 y el D a 5 Para pacientes transferidos el 3 BlastAssist System para cultivos dedicado a blastocistos Porque hay 3 sistemas de cultivo diferentes La selecci n de embriones para transferencia sigue aun bas ndose en el desarrollo del embri n y su morfolog a El desarrollo de los embriones esta influenciado tanto positiva como negativamente por los mismos componentes del ambiente El efecto depende de ambas concentraciones y etapas del desarrollo del embri n Las composiciones del medio tienen fuertes influencias en el desarrollo del embri n y su morfolog a ofreciendo diferentes posibilidades para la selecci n del embri n en las diferentes etapas del desarrollo Las condiciones ptimas del cultivo dep
38. 2 cuando hayan alcanzado la etapa del blastocisto Ver la secci n TRANSFERENCIA EMBRIONARIA ET Evaluaci n de embriones en el D a 4 96 100 horas posteriores a la inseminaci n los embriones se han transformado en m rulas o blastocistos tempranos Evaluaci n del embri n en los D as 5 6 120 144 horas posteriores a la inseminaci n los embriones deber n ser evaluados para la transferencia de embriones o la criopreservaci n Blastocistos con un n mero alto de c lulas y masa celular interna ICM bien definida deber n ser seleccionados para la transferencia Generalmente los blastocistos son formados durante los D as 4 y 5 y es por eso que para obtener resultados ptimos los blastocistos deber n ser transferidos en el D a 5 Blastocistos formados en el D a 6 son demorados y es por eso que normalmente no son ni transferidos ni congelados La clasificaci n de blastocistos deber ser llevado a cabo mientras se mantiene pH fisiol gico y temperatura La mayor a de los blastocistos deber n ser clasificados 4AA en el d a 5 Gardner DK amp Schoolcraft WB 1999 Towards Reproductive Certainty Infertility y Genetics Beyond 1999 Eds Jansen amp Mortimer D Parthenon Press Carnforth pp 378 388 Consultar los sistemas de clasificaci n en la siguiente p gina 32 Embrvo Culture amp Embrvo Transfer ET Clasificaci n inicial Clasificaci n num rica 1 a 6 basado en el grado de expansi n status
39. 4 cuando son equilibrados en 5 6 El pH es una medida de la concentraci n de Cuanto m s alta es la concentraci n de pH se mide la concentraci n de H Cuanto m s alta es la concentraci n de CO en el medio m s bajo es el pH Nosotros generalmente recomendamos un 5 de CO Otra consideraci n a tener en cuenta al tomar una decisi n sobre la concentraci n de CO en la cantidad de trabajo de la incubadora Cuantas m s veces se abra y se cierre la incubadora menor va a ser la concentraci n de CO en la incubadora y mayor va a ser el tiempo de equilibrio Por ende ser recomienda tener incubadoras diferentes para el equilibrio y el cultivo aumentando la concentraci n de CO al 6 mientras el nivel de trabajo aumenta Oxigeno El consumo de oxigeno es relativamente constante desde la etapa unicelular hasta la etapa m rula para crecer abruptamente en la etapa de blastocisto Thompson JG et al 1996 Houghton FD et al 1996 La concentracion de en el oviducto es 40 menos de la que se encuentra en la atm sfera Leese HJ 1995 El tero tiene una concentraci n aun menor Fisher amp Bavister 1993 Por ende los embriones se encuentran con un cambio de concentraci n de oxigeno al progresar por el tracto reproductivo Se ha demostrado que en condiciones en las que la concentraci n de oxigeno est en el rango del 5 7 durante la incubaci n se produce un aumento en la proporci n de los e
40. Aspirar el sobrenadante Repetir este procedimiento de lavado dos veces 8 Agregar una peque a cantidad de Medio de Preparaci n de Esperma y determinar motilidad y concentraci n de espermatozoides en la muestra lavada 9 Finalmente re suspender el esperma lavado en un volumen conveniente de Medio de Preparaci n de Esperma pre equilibrado En circunstancias normales la fertilizaci n ocurrir si la inseminaci n FIV es llevada a cabo en una concentraci n final de 100 000 espermatozoides ml m viles NOTA Los tiempos de centrifugado pueden cambiar a 15 minutos en todos los pasos si se tienen varias muestras de esperma en un d a y ninguna posibilidad de utilizarlos a todos paralelamente Cuando las tapas de los tubos son apretadas el semen preparado puede ser mantenido a temperatura ambiente 20 25 por hasta una hora previa a la inseminaci n Se recomienda que la muestra de esperma sea envuelta en papel de aluminio Alternativamente la muestra del esperma que no ha sido envuelta puede ser almacenada en la incubadora con control de CO y a 37 Recuperaci n del Ovocito El prop sito de este procedimiento es de reunir cuantos m s ovocitos sean posibles y de minimizar la exposici n de los ovocitos a condiciones no fisiol gicas Fluctuaciones r pidas en la temperatura y el pH pueden causar efectos delet reos en la habilidad del ovocito para fertilizarse normalmente y seguir el desarrollo normal de la pre implantaci n
41. Cuando la primera columna del medio toca el tap n se sellar impidiendo todo movimiento futuro de la pajuela Ver diagrama a continuaci n Medium Vial 3 Opening of straw Connection Plug Air Oocytes 7 Sellar la abertura de la pajuela con un tap n para que el nitr geno liquido no penetre en la pajuela Repetirlo para todos los ovocitos Nota No se recomienda que se sellen las pajuelas con calor ya que esto formar a grietas y liberar a materiales t xicos de las mismas 8 Las pajuelas son colocadas en la maquina de congelamiento y mantenidas durante 15 minutos en temperatura ambiente 20 C antes de que comience el programa de enfriado Enfriar desde temperatura ambiente hasta 7 C en pasos de 2 C por minuto Cristalizar manualmente a 7 y mantener la temperatura durante 10 minutos NOTA Cuando las soluciones son blancas el seeding ha sido iniciado No cristalice la pajuela cerca del ovocito y no la deje caer ni sacudir Si entra aire a las pajuelas se reduce la supervivencia del ovocito 1 Enfriar desde 7 C hasta 30 en pasos de 0 3 por minuto Enfriar de 30 C a 150 en pasos de 50 por minuto Luego de estabilizar la temperatura durante 10 12 minutos las pajuelas son transferidas al tanque de nitr geno liquido y almacenadas hasta su descongelado NOTA Se debe tener mucha precauci n durante el manejo de las pajuelas en las temperaturas bajas dado que estas
42. Cult requiere un m nimo incremento de 10 veces en el conteo de c lulas despu s de 4 d as Materias primas criticas est n sujetas a inspecci n con el Hybritest Test de endotoxinas LAL Ph Eur frecuencia de latido La incubaci n en el medio MediCult ofrece productos con en menor limite de toma hasta 18 horas endotoxinas en medios ART listos para usar en el Test de inmovilizaci n del espermatozoide mercado Los medios de cultivo MediCult tienen un nivel de endotoxinas de 0 1 EU ml para asegurar las mejores condiciones para los embriones La esperma con caracter sticas motrices normales son mezcladas con el medio Para aprobar el test el VAP VSL y VCL de la esperma suspendida Test de esterilidad Ph Eur edici n actual en el medio debe estar por debajo de los 30 Todos los productos son filtrados de modo est ril y um seg cada serie es testeada por su esterilidad Test de supervivencia del espermatozoide Este test tiene como intenci n demostrar la ausencia de sustancias que reducir an la viabilidad de los espermatozoides El test de supervivencia del espermatozoide esta basado en el CASA An lisis de semen automatizado por computadora en resoluci n con VAP velocidad de camino VSL velocidad progresiva promedio VCL rapidez de camino y VARIEDAD DE PRODUCTOS Sistemas tamp n Bicarbonato de sodio Tamp n de fosfato La criopreservaci n de embriones en etapa de divisi n celular es rea
43. Manual del usuario Medios de Cultivo para Reproducci n Asistida electr nica edici n 010905 2 0 MediCult Innovation with Care Abreviaturas usadas en el manual SSR Reemplazo del suero sint tico En USA Suplemento ART HSA Alb mina de suero humano 55 Soluci n salina balanceada de Earle PBS Tamp n salino de fosfato Dulbecco Agradecimientos MediCult agradece al Dr Lars Johansson por su ayuda en la preparaci n de este manual Copyright MediCult a s Denmark 2005 CONTENIDO Explicaciones OU ANC AG iii iia 2 A 3 TECOS I 3 Control de calidad constataron 4 Rango d DroductO Sana seas EEE 6 SISTEMAS TAMP N 6 BAN 6 Manipulaci n de gametos y embriones ccccssscccssssccsssssccsssscccsssccessssccesssccsssssccsesscceeeess 8 Aute dela ACUDA 8 Preparaci n y pre equilibrio de los medios i eno cniin aima etes terea iii 9 Exeparacionidel esperma aa 10 Nomenclatura variables del semen 10 A RD ERR e 10 Densidad as masa EEE RR RR 13 Evaluaci n de la calidad de los ovocitos eene 16 Etapas de maduraci n de los o
44. aso presenta dificultades Inmovilizar el espermatozoide correctamente golpeando la cola con la pipeta de inyecci n Aplastar la cola cuando se utiliza el PVP y gentilmente raspar la cola cuando se utiliza SpermSlow Si se aplasta la cola en SpermSlow la cola puede hincharse dificultando su manejo en la pipeta de Inyecci n Inyectar el espermatozoide en lo profundo del citoplasma 75 del di metro de los ovocitos y asegurarse de que el espermatozoide no sea sacado para afuera con la pipeta de inyecci n Asegurarse de que el oolemma se rompa para que el espermatozoide no sea expulsado al espacio perivitelino Inyectar un m nimo volumen de PVP junto con el esperma alternativamente utilizar SpermSlow Procedimiento 1 Colocar un ovocito en cada gota de SynVitro ICSI Holding Medium 2 Golpear la cola del espermatozoide nadador con la pipeta de inyecci n Es importante no da ar el cuello de la regi n del espermatozoide ya que este contiene el centriolo que es crucial para la migraci n de cromosomas en la divisi n celular Inmovilizaci n ineficiente de espermatozoides puede reducir las tasas de fertilizaci n Cargar el espermatozoide con su cola en primer lugar dentro de la pipeta de inyecci n 3 Levantar la pipeta de inyecci n moverla a la gota del ovocito superior localizar el ovocito y ajustar el filo en la membrana del plasma del ovocito 4 Bajar la pipeta con el espermatozoide para
45. ba exponiendo la punta Asegurarse que el McGill Cryoleaf se mantenga sumergido en Sacar el McGill Cryoleaf del LN y transferir r pidamente los ovocitos o embriones al TM 2 ml a 37 C Los ovocitos o embriones se separaran del McGill Cryoleaf ser n transferidos al TM donde deben permanecer por un m ximo de 3 minutos en este punto los ovocitos o embriones siguen estando reducidos en tama o Usando la pipeta adecuada transferir los ovocitos o embriones a 2 ml DM por tres minutos en este punto los ovocitos o embriones han recuperado parcialmente su forma Transferir los ovocitos o embriones a 2 ml DM 2 por tres minutos en este punto los ovocitos o embriones siguen recuperando su forma Transferir los ovocitos y embriones a 2 ml WM Lavar por 3 minutos en este punto los ovocitos o embriones recobran completamente su forma original Transferir los ovocitos o embriones a 2 ml WM por 3 minutos 10 Transferir los ovocitos o embriones a un medio de cultivo pre equilibrado Permitir que reposen en la incubadora por 2 horas antes del pr ximo paso
46. da que el contenido entero del frasco sea mezclado agitando el medio hacia arriba y abajo en una pipeta est ril Cuando se utiliza PVP es importante controlar la velocidad de la disposici n de espermatozoides dentro de los ovocitos ya que esto asegura la m nima cantidad de PVP que se inyecta dentro de los ovocitos PVP es una sustancia org nica polim rica que ha aumentado la preocupaci n acerca de sus potenciales efectos en los espermatozoides y en los ovocitos durante el ICST SpermSlow N Cat 1094 es un medio de selecci n de esperma para ICSI En lugar de inmovilizar simplemente toda la muestra de semen SpermSlow distingue activamente entre espermatoizoides maduros e inmaduros El protocolo de usuario de SpermSlow por lo tanto difiere de los protocolos de tipo de inmovilizaci n est ndar PVP SpermSlow presenta una alternativa natural a la polivinilpirrolidona PVP Una creciente preocupaci n con respecto al uso de PVP en ICSI se encuentra presente dado que es un pol mero sint tico que no puede ser digerido y quedara en el ovocito por un periodo prolongado El ingrediente activo en SpermSlow hialuronato HA que es presente en el cuerpo humano incluyendo los alrededores del ovocito 51 durante el ICSI el HA es colocado dentro del ovocito es metabolizado naturalmente y no presenta riesgos al zigoto que se esta desarrollando m TM Funci n del SpermSlow Refi rase al protocolo para un procedim
47. de dos pasos de acuerdo con el m todo de 1 Virant Klun et al 2003 Optima supervivencia se logra post descongelado con blastocistos d a 5 Las soluciones de congelado son formuladas utilizando una modificaci n del tamp n bicarbonato EBSS con SSR y HSA Nota Todos los pasos son llevados a cabo en una incubadora de CO y 37 Equilibrar un m nimo de 2 horas CO2 a 37 C previo al uso 35 C min 1 96 Instrucciones de uso BlastFreeze 1 Rotular las placas para las soluciones de congelaci n y pipetear vol menes apropiados de las soluciones de congelaci n del Frasco 1 y el Frasco 2 a la placa Equilibrar en incubadora de a 37 2 Rotular las pajuelas con informaci n especifica No escribir directamente en las pajuelas ya que los solventes pueden penetrarla y da ar los embriones Utilizar cinta para proteger la pajuela Si los tapones son utilizados la informaci n del paciente podr ser transferida directamente a los tapones antes de que sean insertados dentro de la pajuela 3 Aspirar parte de la soluci n del pozo 1 y luego el blastocisto desde el medio de cultivo 4 Transferir el blastocisto con la menor cantidad posible de medio de cultivo al pozo 1 y colocar la placa en una incubadora de durante 10 minutos NOTA El blastocisto flotara en la superficie del medio y se hundira lentamente en el fondo de la placa Es por eso que es
48. de Parafina Liquida pre equilibrada para evitar la evaporaci n y almacenar las placas a 37 C en un incubador de CO hasta ser requerido Al mismo tiempo preparar micro gotas adicionales o cavidades platos del medio de cultivo extendido correspondientemente etiquetado lavar y cultivar el embri n mientras el diagn stico es llevado a cabo Lista de materiales 1 placa de biopsia por embri n 1 placa por embri n para el lavado Numero apropiado de micro gotas o cavidad recipiente para el cultivo final del embri n al que se le practico la biopsia 4 Tomar el apropiado pre equilibrado y etiquetado plato de la biopsia y transferir as pticamente el embri n dentro de la gota en la mitad del plato e Pos os 5 Purgue las pipetas con las soluciones apropiadas e inmovilice el embri n para que se le practique la biopsia La de compactaci n deber ser completada en un corto periodo 1 10 minutos y el embri n deber ser observado durante el proceso 6 Poner la pipeta de Solucion Acidulada de Tyrodes en contacto con la zona del embri n Tener cuidado de utilizar nicamente el volumen m s peque o posible de la Soluci n Acidulada de Tyrodes para facilitar el proceso de perforaci n Ver la secci n Perforaci n de la zona 7 Una vez que una peque a perforaci n en la zona es obtenida los blastomeros deber n estar accesibles a la pipeta de muestreo Para minimizar la reducci n en la masa uno
49. de pre zigotos 2PN embriones en etapa de clivage Los embriones deber n ser descongelados el d a en el que son transferidos o el d a previo si el centro desea evaluar el potencial de desarrollo del embri n Se realiza temprano por la ma ana el ultra sonido US en los pacientes a los que se le practica Reemplazo de embri n congelado FER para localizar la presencia del cuerpo luteo visible y una t pica l nea triple de endometrio sin hidrosalpinx El d a del US va a depender del largo del ciclo menstrual El FER es llevado a cabo en ciclos naturales en mujeres con ciclos regulares En mujeres de ciclos irregulares o ciclos largos se puede hacer reemplazo hormonal para sincronizar el endometrio R pida Referencia Embryo Thawing Pack Universal Medium ist System lastAss SM1 ISM2 Embryo Thawing Pack N Cat 1098 es listo para ser utilizado con 1 2 propanediol y protocolos de sacarosa de acuerdo con el m todo J Testart et al 1986 El Pack de descongelado de embriones esta tambi n formulado utilizando fosfato Embryo Thawing Pack es formulado usando un tamp n EFM y es por eso que provee un sistema complementario para el uso del Freezing Pack para congelaci n del embri n Manejo Calentar a temperatura ambiente previo al uso Universal Medium BlastAssist SystemI5M Vial 4 Vial 3 n Hs Universal Medium Universal VF Medium tAssist System Assist System las
50. dium 2 La transferencia de blastocistos puede incrementar las tasas de embarazos e implantaciones Cultivo de blastocistos y criopreservaci n requieren un control riguroso de las condiciones del laboratorio El cultivo extendido puede que necesite cambios en las tareas y equipos de uso Instrucciones de uso Embriones cultivados en ISM1 Paso 1 3 como en las instrucciones de uso B 1 4 En el D a 3 los embriones son lavados con cuidado en ISM2 pre equilibrado y son transferidos a 50 ul microgotas frescas o 0 50 ml cavidad plato del mismo medio Los embriones deber n ser cultivados independientemente o de forma multiple hasta un m ximo de 4 por cavidad en la segunda etapa del medio hasta la formaci n de los blastocisto en el D a 5 aproximadamente 5 En el D a 5 cuando los embriones hayan alcanzado la etapa del blastocisto son puestos en medio UTM Uterine Transfer Medium pre equilibrado a la espera de la transferencia Ver la secci n TRANSFERENCIA EMBRIONARIA ET Instrucciones de uso C 2 Embriones cultivados en BlastAssist System Paso 1 3 como en las instrucciones de uso C 1 4 En el D a 4 los embriones son transferidos cuidadosamente a 50 ul microgotas 0 5ml cavidad plato de Medium 2 fresco y pre equilibrado Los embriones deber n ser cultivados individualmente o en forma m ltiple con un m ximo de 4 por cavidad 5 Los embriones son preparados y transferidos al tero en Medium
51. dos en un porta tubos si es posible angularmente para poder incrementar la interfase entre la muestra de semen y el Sperm Preparation Medium Esto es llevado a cabo para incrementar la recuperaci n de la mayor a de espermatozoides m viles mientras ellos migran dentro del medio Colocar el porta tubos en un incubador con CO y a 37 C por 30 60 minutos dependiendo de la calidad del semen El swim up tambi n puede ser llevado a cabo a temperatura ambiente en ese caso las tapas de los tubos son apretadas para mantener el pH del medio estable 6 Despu s del swim up aspire 0 2 1 ml de la porci n superior del medio para evaluar concentraci n y motilidad Si el conteo es bajo agregue los pr ximos 0 5 ml Junte todos los sobrenadantes Nota Durante la aspiraci n del sobrenadante se debe tener cuidado en no alterar la interfase entre el esperma y el medio 7 Determine la motilidad y concentraci n del esperma en la muestra lavada 8 Sise necesita concentrar la muestra adicione 5 ml de medio pre equilibrado mezcle y centrifugue a 400 x g por 10 minutos 9 Aspire el sobrenadante y de acuerdo al procedimiento del laboratorio resuspenda el pellet en un volumen adecuado de medio En circunstancias normales la fertilizaci n a trav s de FIV se har con una concentraci n final de 100 000 espermatozoides moviles ml Cuando las tapas de los tubos son cerradas el semen preparado puede ser mantenido en temperatura ambiente 20 25 C p
52. e la perforaci n sea lo suficientemente grande para que el embri n escape durante la etapa de hatching sin embargo no deber ser demasiado amplio ya que los blast meros pueden llegar a escapar de la zona previo a la compactaci n Instrucciones de uso hatching asistido 1 Preparar una placa de Petri con una microgota de Soluci n Acidulada Tyrodes y varias gotas de Sperm Preparation Medium N Cat 1069 1070 pre equilibrado Cubrir la placa con Parafina L quida N Cat 1010 pre equilibrada y colocar la placa en una incubadora con control de CO y a 37 por 30 minutos previos al uso 2 Colocar cada embri n en una microgota de Sperm Preparation Medium 3 Cargar la pipeta de perforaci n de zona con Soluci n Acidulada Tyrodes y estabilizar el movimiento del fluido 4 Sostener el embri n con la pipeta de sost n sistema de jeringa de succi n para que la micropipeta llena con Soluci n Acidulada de Tyrodes sea expuesta en la rea de las 3 en punto Con la pipeta rozando la zona moverla levemente para adelante y para atr s mientras suavemente se expulsa una peque a cantidad de Soluci n Acidulada de Tyrodes La succi n es recomendada en este punto para aspirar todo la soluci n acida expulsada Nota El tiempo total para romper la zona deber ser aproximadamente de 5 7 segundos 5 Es crucial seguir el procedimiento cuidadosamente para no herir a los blast meros En la mitad de los casos aproximadamente
53. e las microgotas puedan pegarse a la superficie pl stica 51 se utilizan platos revestidos se debe utilizar Sperm Preparation Medium en microgotas y con cobertura de Parafina Liquida Remueva el Sperm Preparation Medium necesario de las microgotas bajo el microscopio dejando la cavidad para que cada gota se llene con ICSI Holding medium Inmovilizaci n del espermatozoide El espermatozoide necesita ser inmovilizado previo a la inyecci n y esto se logra rompiendo la cola con la pipeta de inyecci n MediCult ofrece 3 medios alternativos utilizados para disminuir la velocidad del movimiento del esperma con lo cual facilita su captura por medio de la pipeta de ICSI PVP Clinical Grade N Cat 1090 y PVP Medium N Cat 1089 contiene 10 polivinilpirrolidona PVP diluida en Sperm Preparation Medium PVP Clinical Grade ofrece la ventaja de un pack de 5 200 ul con la habilidad de congelar los frascos por hasta 8 semanas d ndole a uno un stock m s flexible 51 se congela inmediatamente el d a que es recibido su fecha de expiraci n se extiende a 8 semanas Previo al congelamiento chequear que las capas se mantengan cerradas a presi n bien ajustadas y envolver frascos individuales en el film sellado del laboratorio Ej ParaFilm para evitar la evaporaci n que pueda originar viscosidad en el PVP Clinical Grade una vez descongelado Manejo Equilibrar por un m nimo de 30 minutos en CO a 37 C previo al uso Se recomien
54. eden haber pegado a los costados de las pajuelas 5 Una vez que los ovocitos son visualizados deber n ser recubiertos de la soluci n de congelado y colocados en Cavidad A durante 5 minutos a temperatura ambiente NOTA Los ovocitos criopreservados son estresados osmoticamente y deber n ser manejados con sumo cuidado 6 Los ovocitos son transferidos en una Cavidad y mantenidos por unos 5 minutos adicionales en temperatura ambiente 7 Los ovocitos son transferidos a una Cavidad C y mantenidos durante 10 minutos en temperatura ambiente 8 Los ovocitos son transferidos a una Cavidad D y mantenidos en temperatura ambiente durante 10 minutos y a 37C durante un tiempo adicional de 10 minutos Esto se lleva a cabo para remover los ltimos rastros de sacarosa y permitir gradualmente que el ovocito regrese a los 37 9 Finalmente los ovocitos son colocados en Universal IVF Medium N Cat 1030 1031 en una incubadora con control de CO y a 37 C hasta la inseminaci n Congelado de pre cigotos 2PN embriones de etapa de clivage Selecci n de embriones Los embriones no deber n estar en etapa impar de clivage o dividi ndose lentamente lt 4 c lulas a 48 h 6 c lulas a 72 h Los blast meros deber n ser de tama o suficiente con citoplasmas homog neos y membranas plasm ticas distinguibles como tambi n se deber distinguir el n cleo en alguno de los blast meros Un m ximo de 30 de fragmentos Z
55. ellas y da ar al ovocito por eso utilizar cinta especial para protegerlas Si se utilizan tapones la informaci n del paciente puede ser directamente transferida dentro de los tapones previos a la inserci n dentro a las pajuelas 3 Aspirar una parte de la soluci n de congelado del Frasco 2 seguido por la aspiraci n de los ovocitos de la placa 1 1 2 ovocitos por placa son transferidos de la placa 1 a la placa 2 donde son colocados en las cavidades en la derecha y mantenidos durante 10 minutos NOTA Los ovocitos flotaran a la superficie del medio y lentamente se hundir n al fondo de la placa Es por eso que es una ventaja si usted captura cuidadosamente a los ovocitos y los coloca en el fondo del plato 4 Justo antes de que los ovocitos sean transferidos a la soluci n del Frasco 3 la parte interna de las pajuelas es lavada con la misma soluci n pero de otro plato NOTA Juntar aire en la jeringa ya que esto facilita remover el remanente de la soluci n del Frasco 3 No permitir que la soluci n se ponga en contacto con el tap n 5 Colocar la soluci n del Frasco 3 en una pipeta Cuando la alarma del reloj suene cuidadosamente sacar los ovocitos y transferirlos a la cavidad del lado derecho de la placa Ver los pasos 6 8 de la pr xima p gina 9 6 Utilizando este medio como un medio de transferencia cargar r pidamente los ovocitos en la pajuela de la misma manera en la que se lleva a cabo el ET
56. enden por eso de las rutinas del laboratorio ISMI ISM2 BlastAssist System Para pacientes transferidos el D a 3 y el D a 5 Universal Medium N Cat 1030 1031 y 1095 ha sido dise ado especialmente para cumplir con los requerimientos de los embriones m s tempranos El medio es utilizado para el procedimiento de inseminaci n FIV para cultivos hasta embriones de 2 8 c lulas y para transferencia de embrionaria Universal IVF Medium es un modificado EBSS con SSR y HSA Las fuentes del nutriente son glucosa que ayuda a la capacitaci n del esperma durante los procedimientos FIV y piruvato de sodio para el temprano desarrollo del embri n El medio tiene un tamp n de bicarbonato de sodio fisiol gico Fuera de la incubadora el pH del medio va a incrementar El medio esta disponible con o sin Rojo Fenol La versi n con Rojo Fenol esta disponible con o sin los antibi ticos Penicilina Estreptomicina ISMI ISM2 y UTM N Cat 1050 1150 1051 1151 y 1052 1152 es un sistema secuencial de medio dise ado para cumplir con todos los requerimientos de los embriones en todas las etapas del desarrollo ISM1 puede ser utilizado tanto por el procedimiento de inseminaci n como por el cultivo del embri n hasta el D a 3 ISM2 es para el cultivo de embriones desde el D a 3 hasta la etapa de blastocisto UTM esta dise ado especialmente para transferir al embri n cultivado en ISMI e ISM2
57. ensidad del gradiente 55 SupraSperm 2 mi 80 SupraSperm 1 2 mi 1 Para cada muestra de semen preparar gradientes separados para cada volumen de 1 ml Cada gradiente es preparado utilizando una capa baja 1 2 ml de 55 SupraSperm con 1 2 ml de 80 de SupraSperm y pre equlibrado en 37 NOTA Los gradientes deber n ser preparados inmediatamente antes de ser utilizados para obtener los m s ptimos resultados 2 La muestra de semen es mezclada por completo 1 e repitiendo el mezclado por 20 minutos a temperatura ambiente 51 la muestra no se licua ser necesario pasarla por una pipeta angosta y o mezclarla con una peque a cantidad de Medio de Preparaci n de Esperma pre equilibrado 3 Luego que el proceso de mezclado sea completado la concentraci n de esperma y motilidad ser evaluada 4 Con cuidado distribuir 1 ml de muestra de semen licuado por encima del gradiente ya preparado NOTA Agregando demasiado esperma podr a resultar un sobrecargo y de pobre separaci n saturando el gradiente 5 El gradiente es centrifugado a 300 x g por 20 minutos 6 Remover el sobrenadante de la pastilla y tener cuidado de no dejar residuos en las paredes del tubo Transferir la pastilla con lo menos posible del 80 de la soluci n posible en un tubo centr fugo limpio 7 Re suspender la pastilla en 5 ml de Medio de Preparaci n de Esperma pre equilibrado y centrifugar nuevamente a 300 x g por 10 minutos
58. entemente r pido para evitar la formaci n de cristales y la desvitrificaci n Vatja et al 1998 Ya se han producido ni os sanos de ovocitos vitrificados por diversos m todos demostrando as que estas preocupaciones pueden ser superadas Otra ventaja de la vitrificaci n es que es posible observar todo el procedimiento en el laboratorio El McGill Cryoleaf es un dispositivo de vitrificaci n y almacenamiento Este dispositivo cuenta con un sistema muy efectivo de manipulaci n que facilita la carga y el almacenamiento de ovocitos embriones La seguridad durante el almacenamiento ha sido mejorada los ovocitos y los embriones est n doblemente protegidos del estr s y la contaminaci n mediante un sistema de cubierta cerrada El Dr Chian y el Prof Tan de la Universidad McGill de Montreal desarrollaron el McGill Cryoleaf y los medios de vitrificaci n para MediCult MediCult vitrificaci n congelada Freeze Pack Cat No 1118 Contiene 5x McGill Cryoleaf un medio de equilibrado y vitrificaci n listo para usar suficiente para el tratamiento de un paciente Los medios contienen etilen glicol y 1 2 propandiol en HTF en concentraciones crecientes Manipulaci n Los medios en Freeze Pack est n tamponados con HEPES y tienen un pH estable para que todos los pasos puedan realizarse fuera de la incubadora a temperatura ambiente MediCult Vitrificaci n Thaw El Thaw Pack Cat No 1119 incluye un medio de descongelado
59. eussen et al en 1997 mostraron que el medio Universal IVF libre de suero y el medio M3 fueron capaces de soportar el desarrollo in vitro de embriones humanos hasta la etapa de blastocisto sin perjudicar el proceso de fertilizaci n o el ndice de implantaci n Hoy los medios de MediCult contienen SSR su composici n ha sido patentada en todo el mundo Todos los productos SynVitro son puramente sint ticos y definidos qu micamente Estos productos no contienen HSA u otros componentes de origen biol gico Tampoco contienen antibi ticos o Rojo Fenol La formula contiene SSR que aumenta la consistencia y la estabilidad del producto durante su periodo de conservaci n Referencias Las referencias mencionadas est n a su alcance y por pedido a MediCult Control de Calidad La calidad es nuestra piedra angular Para MediCult ofrecer productos de alta calidad que aseguran resultados consistentes y ptimos y a su vez son Seguros para nuestros pacientes es esencial Las quejas son tratadas de acuerdo a procedimientos documentados para asegurar una r pida respuesta para las observaciones del cliente Acciones correctivas y preventivas pueden ser implementadas en caso de necesidad La reacci n del cliente es crucial Usted es la fuente de inspiraci n para que nuestros productos sigan mejorando d a a d a Los medios de cultivo de MediCult tienen un nivel de endotoxina de 0 1 EU ml que asegura la mejor condici
60. gametos y la selecci n del embri n el manejo as como el equipo de congelaci n Utilizar solo la maquina de m s alta calidad de criopreservaci n dispositivos de almacenado pajuelas ampollas frascos y medios de criopreservaci n Usted nunca deber tocar la pajuela en la que las gametas y los embriones son localizados Todos los equipos de congelado deben ser perfectamente mantenidos y calibrados La cantidad de nitr geno liquido utilizado es dependiente de cada equipo y del sistema de almacenado Criopreservaci n del espermatozoide Para evitar los efectos citot xicos del espermatozoide muerto etc se recomienda que la muestra de semen se congele justo despu s de la recolecci n Evitar la exposici n de pajuelas al aire despu s del congelado ya que esto puede causar el descongelado de la pajuela La membrana plasm tica del espermatozoide es muy sensible y el manejo descuidado de la pajuela puede matarlo dando como resultado una tasa baja de supervivencia de espermatozoides El glicerol es toxico para espermatozoides y es por eso que la supervivencia posterior al descongelado deber ser r pidamente evaluada y la muestra de esperma deber ser lavada y los rastros de glicerol deber n ser removidos Sperm Freezing Medium SFM N Cat 1067 es un medio listo para ser utilizado con glicerol Un protocolo de trabajo sigue el tradicional 1 1 mix con plasma seminal El medio es formulado utilizando una soluci
61. hatching masa celular interna y trofectodermo Estas evaluaciones pueden ser llevadas a cabo en un microscopio de disecci n 1 Blastocisto Temprano blastocele lt que la mitad del volumen del embri n 2 Blastocisto blastocele gt que la mitad del embri n 3 Blastocisto completo blastocele ocupa completamente el embri n 4 Blastocisto expandido volumen del blastocele gt que el del embri n temprano La zona se esta afinando 5 Blastocisto en hatching el trofectodermo ha empezado a salirse de la zona pel cida 6 Blastocisto extruido el blastocisto ha escapado completamente de la zona Segunda etapa de la clasificaci n Para blastocistos graduados 3 a 6 i e blastocistos completos en adelante el desarrollo de la masa celular interna ICM y el trofectodermo es evaluado Estas evaluaciones deber n ser llevadas a cabo en un microscopio invertido Clasificaci n del ICM A Fuertemente compacto varias c lulas B Agrupadas de manera floja varias c lulas C Muy pocas c lulas Clasificaci n del trofectodermo A Varias c lulas formando un epitelio cohesivo B Pocas c lulas formando un epitelio flojo C Muy pocas c lulas A o Im genes de c lulas proporcionadas por Department of Obstetrics and Gynecology University Medical Centre en Ljubljana Slovenia y el IVF Laboratory of The Reproductive Medicine Service Department of Obstetrics y Gynecology Institut Universitary Dexeus
62. iento detallado SpermSlow permite que se produzca una activa selecci n de espermatozoides cuando se lleva a cabo el ICSI SpermSlow no es un agente de inmovilizaci n como el PVP y es por eso que posee caracter sticas ventajosas HA forma un grilla con el que los espermatozoides maduros crearan lazos Es por todo esto que solo los espermatozoides maduros son frenados por SpermSlow mientras que los espermatozoides inmaduros circulan libremente Un estudio reciente muestra que los lazos HA seleccionan la poblaci n de espermas maduros Huszar G et al 2003 Cuando los espermatozoides son completamente maduros est n listos para crear un lazo con HA 51 la muestra de espermatozoides es agregada al medio conteniendo HA el movimiento hacia adelante se dificulta para el espermatozoide maduro TM Es por todo esto que en SpermSlow los espermatozoides maduros crearan lazos con HA disminuyendo la velocidad mientras que el espermatozoide inmaduro continuara movi ndose libremente Visualmente un esperma maduro mostrara buena motilidad pero esta cerrado en su lugar por el HA sin poder moverse hacia adelante Ahora usted esta capacitado a seleccionar espermatozoides maduros con buenas caracter sticas morfol gicas para el ICSI Por favor refi rase al protocolo en las siguientes p ginas para un detallado procedimiento R pida Referencia PVP Medium 5 1 PVP Clinical Grade PVP
63. itro Cumulase Sistema abierto SynVitro Cumulase SynVitro Culture Medium SynVitro Cumulase Culture Medium Culture Medium 0 3 0 5 ml Culture Medium Culture Medium SynVitro ICSI Holding Medium Instrucciones para uso SynVitro Cumulase Sistema abierto Antes de utilizarlo pre calentar SynVitro Cumulase a 37 C por 2 horas con la tapa puesta Sr Ira Cumulasa 1 Llenar una de las cavidades en un plato de cuatro SynVitro Culture Cumulase Medium cavidades con SynVitro Cumulase 0 5 ml y otras tres 0 5 ml 0 3 0 5 cavidades con su medio de cultivo elegido pre equilibrado 2 Colocar uno o varios complejos ovocitos cumulus en una cavidad con SynVitro Cumulase Remover el complejo del cumulus agitando suavemente el ovocito arriba y abajo con una pipeta SynVitro Cumulase 3 Transferir los ovocitos a una cavidad con el medio de cultivo y remover las c lulas de la corona restantes utilizando la pipeta de denudacion de la misma manera 4 Lavar los ovocitos por completo transfiri ndolos a varias cavidades conteniendo el medio de cultivo Cultura Culture Culture Medium Medium Medium 5 Los ovocitos son transferidos al recipiente de inyecci n y son colocados en micro gotas individuales cubiertas de Parafina L quida pre equilibrada Se recomienda dejar el ovocito en el medio de Culture Medium SynVitra ICSI Holdi
64. l con el bot n cursor La pipeta de manejo nunca deber a tocar la gota del espermatozoide 12 Mover la pipeta de inyecci n a la gota del esperma moviendo la platina del microscopio Repetir pasos 2 12 13 Luego de la inyecci n los ovocitos deber n ser lavados e incubados en el medio de cultivo preferido por 16 18 horas R pida Referencia Soluci n Acidulada Tyrodes referir a p gina 48 Acidified Tyrodes Solution Acidified Sperm o Tyrodes Preparation Liquid Paraffin Solution Medium Acidified Tyrodes Solution Sperm Preparation Preparation Preparation Medium Medium Medium Perforaci n de Zona Durante este procedimiento una perforaci n es producida nicamente en la zona pel cida del embri n utilizando una soluci n cida La perforaci n se realiza para permitir la biopsia del embri n o facilitar su hatching Soluci n Acidulada Tyrodes N Cat 1060 es una soluci n cida lista para ser utilizada que disuelve las glicoproteinas de la zona pel cida donde son aplicadas La soluci n incluye PVP para facilitar el control de la aspiraci n Nota Para lograr una exitosa perforaci n de la zona Cada zona difiere en consistencia y es por eso el producto no deber ser diluido que deber ser tratada independientemente Exposici n excesiva a la soluci n cida es perjudicial para el embri n Manejo Calentar a 37 previo al uso En caso de hatching asistido es importante qu
65. lizada en soluciones de tamp n de fosfato que mantendr an un pH de 7 2 7 4 en el arre El bicarbonato es un tamp n intracelular muy importante y ha demostrado ser esencial para el desarrollo del embri n al ser combinado con Bavister et al 1995 El bicarbonato no solo forma parte de los medios de cultivo sino tambi n en nuestros medios tampones HEPES para gametos Para aquellos procedimientos que requieren un medio tamp n de bicarbonato las formulaciones han sido dise adas para dar un pH de 7 2 7 4 en una atm sfera de 5 6 CO a 37 HEPES El medio tamp n HEPES ha sido formulado para dar un Los medios Todos los medios son formulados con soluciones salinas fisiol gicas con el fin de minimizar el estr s osm tico o por pH producido al cambiar de una soluci n a otra Al ser el nico proveedor de medios en el mundo MediCult ofrece un rango de productos con y sin Fenol Rojo No ajuste el pH usando HCI NaOH o NaHCOs ya que el fluido agregado puede alterar la concentraci n de otros ingredientes importantes como el piruvato u los amino cidos tambi n puede alterar la pH de 7 3 7 5 en el aire a 37 Esto hace posible manipular gametos fuera de la incubadora Con Rojo Fenol HEPES tamp n de bicarbonato Flushing Medium Medio de preparaci n de la esperma SupraSperm 90 Sistema SupraSperm Medio PVP Sin Rojo Fenol HEPES Tamp n de bicarbonato SynVitro Flush Medio de
66. mbriones de rat n que est n por alcanzar la etapa de blastocisto y en el numero de c lulas en el blastocisto La actividad metab lica del embri n cultivado bajo tensi n correlaciona mejor con condiciones in vivo Los embriones muestra un incrementada recepci n de oxigeno y oxidaci n de piruvato en comparaci n con embriones cultivados en 20 O Hooper et al 2001 Aunque se le reduzca el O la tensi n al 2 ha demostrado ser beneficiosa para los avances en los embriones bovinos luego de la compactaci n Thompson et al 2000 La reducci n de la concentraci n de O en la incubadora al 2 7 puede resultar beneficiosa durante el cultivo in vitro de embriones humanos Recomendamos utilizar el 5 O2 Preparaci n del medio amp pre equilibrio 0 5 1 ml cavidades con o sin capa de Parafina Liquida 10 100 ul microgotas cubiertas con Parafina Liquida EE Primero etiquetar los recipientes con ID de cada paciente y luego agregar el medio y la Parafina Liquida utilizando pipetas esterilizadas Cuando se preparan las microgotas asegurarse de cubrir inmediatamente con Parafina Liquida para evitar evaporaci n Todos los recipientes del cultivo cavidades o microgotas deben ser preparados en la tarde previa al d a de uso D a 1 Esto se llevara a cabo para dar suficiente tiempo para el pre equilibrado en un ambiente de CO y O Tiempo m nimo de equilibrio es 1 hora por cm altura de medio Es
67. ml Congelaci n de ovocitos Dado que el almacenado de los ovocitos posee claras ventajas especialmente para j venes pacientes recibiendo quimioterapia o atravesando una ovariectomia ha sido un desafi para los investigadores del ART para encontrar un m todo efectivo para la criopreservaci n de ovocitos Uno de los pioneros en este campo la Dra Raffaella Fabbri ha desarrollado formulas que contienen varias concentraciones de sacarosa junto con un procedimiento lento de congelado Este trabajo ha resultado en las formulas de OocyteFreeze y OocyteThaw que han sido desarrollados y evaluados por la Dra Fabbri en el centro IVF en la Universidad de Bologna Italia Esto muestra las tasas de supervivencia que son altas como en un 82 Los resultados fueron publicados en Human Reproduction 2001 El estudio ha mostrado que la tasa de supervivencia depende de la cantidad de tiempo en que los ovocitos son expuestos al crioprotector antes de que la temperatura baje La tasa de supervivencia de los ovocitos aumenta de 56 70 51 se prolonga el tiempo de exposici n de 10 15 minutos La Dra Fabbri et a 2001 tambi n ha comparado varias concentraciones de sacarosa y ha observado que la tasa de supervivencia aumenta en proporci n con la concentraci n de sacarosa La tasa de supervivencia de ovocitos humanos fue de 82 utilizando una soluci n de sacarosa de 0 3 M en OocyteFreeze Congelar solo los ovocitos maduros MIT
68. n modificada Tyrodes con SSR y HSA SFM ha sido comparada con medios basados en la yema del huevo utilizando el ensayo de la Hemizona No se vieron diferencias de motilidad en el medio de descongelado pero los n meros de espermatozoides adheridos a la zona fue 50 mas alta con SFM Mahony MRB Laboratory 1999 Manejo Calentar a temperatura ambiente previo al uso R pida Referencia Sperm Freezing Medium Congelado Sperm Freezing Medium Sperm Freezing Medium 1 1 E TE VEM EO DA VR 2 196 N2 196 C Descongelado Instrucciones de uso Sperm Freezing Medium Congelado Descongelado 1 Luego de la licuefacci n medir el volumen total del eyaculado y llevar a cabo el an lisis del semen como es requerido 2 Asegurarse que la muestra de semen y Sperm Freezing Medium est n a temperatura ambiente y diluir el semen 1 1 v v con el Sperm Freezing Medium El medio deber ser agregado en cuentagotas al semen y la soluci n deber se cuidadosamente mezclada luego de cada adici n 3 La mezcla se deja a temperatura ambiente por un m nimo de 10 minutos 4 Cargar el semen diluido en pajuelas o cr o viales y sellarlos de acuerdo a lo recomendado por el fabricante NOTA Es de mucha importancia que usted deje espacio de aire en la parte mas baja de la pajuela para dejar lugar a la expansi n de la soluci n durante el congelado 5 Suspe
69. nas t rmicas por ejemplo y platinas t rmicas para microscopio pueden compensar esta perdida Los cambios en la osmolaridad ocurren lentamente por ende es importante mantener los medios en un ambiente correctamente h medo o cubierto con parafina liquida El tiempo de manipulaci n de los gametos especialmente los ovocitos y embriones fuera de la incubadora debe ser el m nimo Estar alerta de la potencial toxicidad de los embriones por las placas IVF ICSI Use materiales testeados por MEA preferentemente Condiciones de la incubadora Por muchos a os las condiciones de una incubadora est ndar en la mayor a de los laboratorios ART ha sido 5 CO en aire con peque os ajustes dependiendo de la altura sobre el nivel del mar Los medios MediCult son dise ados para dar resultados ptimos usando un 5 de CO ambiente pero tambi n pueden ser usados en 6 de CO Es recomendable usar 5 de O particularmente para cultivo de blastocistos aunque los medios MediCult contengan Reemplazos de Suero Sint tico SSR para minimizar el estr s oxidativo Si es posible minimice el n mero de aperturas teniendo diferentes incubadoras para medios de equilibrandose y cultivo Di xido de Carbono CO El CO es una parte del sistema tamp n de bicarbonato con la reacci n equilibrante HO HCO Los medios MediCult contienen en una concentraci n correspondiente al pH 7 2 7
70. nder las pajuelas horizontalmente por 30 minutos justo sobre la superficie del nitr geno l quido Los cr o viales deber n ser adheridos a un porta viales y luego suspenderlos sobre la superficie de nitr geno liquido por el mismo periodo de tiempo Alternativamente utilizar el programa de criopreservaci n de esperma disponible en su maquina de congelaci n 6 Finalmente transferir las pajuelas o cr o viales dentro del nitr geno liquido y almacenar a 196 C 1 Remover pajuelas o cr o viales del nitr geno l quido y colocarlos en agua corriente durante 5 minutos 2 Abrir las pajuelas o cr o viales de acuerdo con las instrucciones del fabricante y remover el semen descongelado 3 Diluir el semen con Sperm Preparation Medium 1 1 para reducir el efecto toxico del glicerol 4 R pidamente evaluar la supervivencia del esperma 51 es necesario descongelar pajuelas adicionales para la preparaci n 5 Inmediatamente preparar el esperma por el m todo de densidad del gradiente utilizando SupraSperm Cat 1091 1092 o 1097 o el procedimiento swim up utilizando Sperm Preparation Medium N Cat 1069 1070 Por favor referirse al protocolo espec fico recomendado para el uso de cada producto Nota Concentrando el esperma previo al congelado puede aumentar la recuperaci n posterior al descongelado de las muestras de semen con baja concentraci n espermatozoides Se recomienda una concentraci n final de un minimo de 10 millones
71. nes al VM donde deben quedarse durante menos de un minuto los ovocitos o embriones vuelven a reducirse en tama o 6 Cargar r pidamente los ovocitos o embriones en la punta del McGill Cryoleaf usando la misma pipeta y la menor cantidad de VM posible El McGill Cryoleaf debe estar seco durante el proceso Asegurarse de remover el exceso de VM cuidadosa y r pidamente usando la pipeta 7 Insertar el McGill Cryoleaf con los ovocitos o embriones directamente en el nitr geno liquido LN2 8 Deslizar cuidadosamente la manga protectora verde sobre la punta con los ovocitos o embriones y cerrar girando Tener en cuenta que el McGill Cryoleaf debe estar sumergido LN todo el tiempo 9 Insertar el McGill Cryoleaf en la cubierta externa y presionar con fuerza Tener en cuenta que el McGill Cryoleaf debe estar sumergido en LN todo el tiempo 10 Transferir al tanque de almacenamiento R pida Referencia MediCult Vitrification Thaw DM1 DM2 WM WM Instrucciones de uso MediCult Vitrification Thaw 9 Precalentar el TM a 37 C mientras los otros medios se mantienen a temperatura ambiente Recoger el McGill Cryoleaf del contenedor de almacenamiento y ubicarlo en un ba o de LN Utilizando forceps remover la cubierta exterior del McGill Cryoleaf Tener en cuenta que el McGill Cryoleaf debe estar sumergido en LN2 todo el tiempo Abrir la parte interna con la punta y deslizarla hacia arri
72. ng Medium cultivo por un corto per odo antes de proceder con el ICSI Preparaci n para el recipiente de inyecci n A pesar de que hay varias maneras de hacer el ICSI todas incluyen la manipulaci n de los ovocitos usando un tamp n HEPES o medio con tamp n de bicarbonato El portafolio de los productos MediCult cumple con cualquier combinaci n de HEPES y de medio de bicarbonato que requiera Si el operador ICSI es experimentado y la manipulaci n es llevada a cabo en Universal IVF Medium bajo Parafina L quida luego ella el tendr aproximadamente 5 minutos para conducir el ICSI antes que el pH del medio se convierta en cr tico El operador posee levemente m s tiempo 51 utiliza el medio con tamp n HEPES pero aun debe considerar la p rdida de temperatura Es por eso que el procedimiento no deber tomar m s de 10 minutos por plato Manejo del ovocito SynVitro ICSI Holding Medium N Cat 1585 se utiliza para el manejo de ovocitos cuando se lleva a cabo la inyecci n de espermatozoides durante el procedimiento ICSI El medio es listo para ser utilizado y puramente sint tico consistiendo de un EBSS modificado con SSR y sin HSA Manejo SynVitro ICSI Holding Medium tiene un tamp n HEPES y pH estable para ser utilizado fuera de la incubadora sin previo equilibrado Calentar a 37 C previo al uso Por favor notificar que este producto no contenga prote nas Platos no revestidos son por eso recomendados en orden para qu
73. ntos FIV e ICSI Adem s de ser evaluada con el Hybritest y ser materia prima altamente refinada MediCult Parafina L quida es pre lavada utilizando Universal IVF Medium El balance de sales inorg nicas y alb mina de suero humano HSA en los procedimientos de lavado ayuda a la HSA a enlazar potenciales componentes t xicos para el embri n y saturar el aceite de la parafina con l pidos esenciales para el embri n La Parafina L quida entonces no agotar los l pidos vitales presentes el medio cuando sea utilizada en cultivos del laboratorio FIV MediCult Parafina L quida tiene el nivel mas bajo de endotoxinas 0 1 EU ml Manejo Previo al uso equilibrar la Parafina Liquida en CO a 37 por un m nimo de 12 horas R pida Referencia Universal IVF Medium SynVitro ICSI Holding Medium pcm E 3 Universal IVF Medium R pida Referencia ISM SynVitro ICSI Holding Medium R pida Referencia BlastAssist System SynVitro ICSI Holding Medium pS Medium 1 Transferencia de embriones de D a 2 El cultivo es realizado en ambos Universal IVF Medium o ISMI Instrucciones de uso A 1 Universal IVF Medium 1 Llevar a cabo la inseminaci n D a 0 en Universal Medium pre equilibrado Donde el ICSI es requerido los ovocitos ser n transferidos al Universal IVF Medium inmediatamente luego de la inyecci n 2 A las 16 20 horas D a 1 chequear la formaci n de pron cleos
74. ntre 30 60 minutos posteriores a la eyaculaci n Incubando el esperma en el plasma seminal por demasiado tiempo reducir a la recuperaci n del esperma m vil y dejara al espermatozoide incapaz de que experimente los cambios que hacen posible la fertilizaci n No se recomienda centrifugar el semen solo dado que potenciales c lulas redondas toxicas y espermatozoides muertos se concentrar an alrededor del espermatozoide m vil Para manipular muestras de semen viscoso se puede mezclar el Medio de Preparaci n de Esperma con la muestra de semen previo a la preparaci n de la muestra Nomenclatura variables de semen Normospermia 2 ml semen Normozoospermia 20 mill espermatozoides ml 40 mill espermatozoides en total gt 25 a o gt 50 a b 15 espermatozoides normales WHO Asthenozoospermia 50 a b or 25 a Oligozoospermia lt 20 mill ml Severa oligozoospermia lt 10 mill ml Teratozoospermia lt 15 formas normales Aspermia No eyaculado Azoospermia No espermatozoides en el eyaculado Necrozoospermia Solo espermatozoides muertos OAT Oligoastenoteratozoospermia Swim up Este m todo es comunmente utilizado en muestras de semen con cantidad de espermatozoides moviles y para seleccionar al espermatozoide bas ndose en su motilidad idealmente seleccionando los espermatozoides vivos Sperm Preparation Medium N Cat 1070 1069 y1068 es un medio tamp n modificado EBSS con bicarbonato
75. on el pre cigoto embri n de la misma manera utilizada en el ET Cuando la primera columna del medio toca el tap n la sellara impidiendo todo movimiento futuro en la pajuela ver el diagrama Medium Abertura de la Vial 3 pajuela Connection Plug N Air Pre zygotes embryos 8 Sellar la abertura con un tap n para que el nitr geno liquido no penetre dentro de la pajuela Repetir esto mismo para todos los pre cigotos embriones Nota No se recomienda el sellado por calor ya que esto puede causar grietas en las pajuelas y liberar materiales embriot xicos de las mismas 9 Colocar las pajuelas en la maquina de congelaci n e iniciar el programa de enfriado Enfriar desde temperatura ambiente hasta 7 en pasos de 2 C por minuto Cristalice manualmente y mantener la temperatura durante 5 minutos NOTA Cuando la soluci n sea blanca el seeding ha sido iniciado No cristalice la pajuela cerca del pre zigoto embri n y no la deje caer o sacudirla La presencia de burbujas de aire en la pajuela pueden reducir la supervivencia del pre cigoto embri n Enfriar desde 7 C a 30 C en pasos de 0 3 C por minuto Enfriar desde 30 C 190 C en pasos de 50 C por minuto o sumergir en Transferir las pajuelas directamente al nitr geno liquido y almacenarlas a 196 C NOTA Se debe tener cuidado con el manejo de las pajuelas a bajas temperaturas ya que pueden descongelarse r pidamente Descongelado
76. on empacados en cajas a prueba de violaciones con un prospecto completo adicional El env o de los productos se realiza en cajas aislantes con elementos que aseguran condiciones t rmicas ptimas Test de control de calidad Los productos finales son testeados con una combinaci n de los siguientes tests QC de acuerdo con nuestras especificaciones Test de pH Ph Eur Edici n actual Test de osmolaridad Ph Eur Edici n actual Ensayo de embriones de rat n MEA Embriones de ratones de 1 c lula o de 2 c lulas son cultivados de acuerdo al uso destinado Los embriones son cultivados en un medio de testeo y en un medio de control por 72 horas para 2 c lulas o por 96 horas para una c lula respectivamente MediCult requiere un m nimo de 80 de ndice de formaci n para blastocistos expandidos Las pautas de FDA requieren un 70 de indice de formaci n para blastocistos expandidos Todos los resultados finales relevantes son testeados por un test de MEA Hybritest El patentado Hybritest es empleado en condiciones libres de proteinas Esto incrementa la sensibilidad del test a las sustancias toxicas sin efectos de enmascarado de proteinas particularmente alb mina La combinaci n nica del Hybritest del test MEA asegura que la cl nica puede estar segura que los medios no son t xicos para los embriones Las c lulas del hibridoma son cultivadas en medio de testeo por 4 d as Medi
77. ona pel cida normal S1 se lleva un registro detallado cada unidad IVF podr rastrear los embriones congelados y desarrollar as su propio criterio de selecci n basado en resultados cl nicos Embryo Freezing Pack N Cat 1026 es listo para ser utilizado con 1 2 propanediol y protocolo de sacarosa de acuerdo con el m todo de J Testart et al 1986 Una supervivencia optima de post congelamiento es lograda con los zigotos en los embriones del dia 2 2 4 c lulas Las soluciones de congelado son formuladas utilizando tamp n fosfato EFM una modificaci n de PBS SSR y HSA La soluci n tamp n de fosfato es utilizada para que todos los pasos sean llevados a cabo fuera de la incubadora a temperatura ambiente Manejo Calentar a temperatura ambiente previo al uso R pida Referencia Embryo Freezing Pack 196 Instrucciones de uso Embryo Freezing Pack 1 Rotular las placas para las soluciones de congelado y pipetear vol menes apropiados de la soluci n de congelado del Frasco 1 2 y 3 Equilibrar a temperatura ambiente 2 Rotular las pajuelas con la informaci n correspondiente No escribir directamente en las pajuelas dado que los solventes pueden penetrarlas y da ar los pre cigotos embriones Utilizar cinta especial para poder potejer la pajuela 51 se utilizan tapones la informaci n del paciente deber ser transferida directamente a los tapones previamente a que estos se inserten en
78. or no m s de una hora previa a la inseminaci n Se recomienda que la muestra de esperma sea envuelta en un papel de aluminio Alternativamente la muestra de esperma no envuelta puede ser almacenada en una incubadora con conrol de CO y a 37 Gradiente de Densidad Este m todo es com nmente utilizado en muestras de semen con calidad pobre y o un n mero grande de otras c lulas Los espermatozoides son seleccionados bas ndose en su densidad espec fica y bajo fuerza centrifugas idealmente seleccionando solo los espermatozoides maduros SupraSperm Cat 1091 1092 y 1097 es una suspensi n coloidal de part culas de s lice establecidas con silane de enlace covalente hidrofilico y diluida en Medio de Preparaci n de Esperma Soluciones de diferentes densidades son puestas en capas en un tubo centr fugo que va creando una densidad de gradiente SupraSperm esta disponible en soluciones en venta o como el listo para ser utilizado SupraSperm System N Cat 1092 que consiste en dos soluciones 55 y 80 Manejo Equilibrar por un minimo de 2 horas en CO a 37 C previos al uso SupraSperm mantendr el pH estable fuera de la incubadora hasta por 15 minutos Cuando se le coloca una tapa la estabilidad del pH del medio aumenta hasta hora de mantenimiento fuera de la incubadora R pida Referencia SupraSperm LLILLID SL 1 1 1 55 SupraSperm 1 2 ml 80 SupraSperm 1 2 mi Instrucciones de uso D
79. os espermatozoides son mucho m s tolerantes a la temperatura osmolaridad y pH Sin embargo toleran mejor el pH alcalino que el acido Consideraciones generales Organizar y preparar con tiempo Asegurarse que todo el equipamiento este bien mantenido y sea controlado regularmente Todos los procedimientos deben ser realizados en un ambiente de trabajo limpio Se recomienda el uso de filtros de carbono para purificar los gases entrantes Asegurarse que los guantes no sean t xicos Estar alerta de la presencia de potenciales contaminantes ambientales como alcohol u otros agentes de limpieza Los carbones org nicos vol tiles pueden ingresar por medio del aire acondicionado Utilizar solamente productos de calidad controlada para cualquier procedimiento de ART Mantener un registro de todos los productos y de los procedimientos realizados T cnicas as pticas deben ser utilizadas con todas los recipientes viales abiertos Los medios deben ser manipulados en un gabinete de flujo laminar La fecha de uso debe ser escrita en una etiqueta los contenidos deben mantenerse a 2 8 y deben ser usados en 1 7 d as Anteriormente al uso todos los medios deben ser pre calentados completamente o pre equilibrados dependiendo del sistema tamp n Las perdidas de temperatura ocurren r pidamente y est n relacionadas a la cantidad de tiempo que una placa de cultivo pasa fuera de la incubadora El uso de plati
80. preparaci n de la esperma SupraSperm 100 Grado cl nico PVP SynVitro Cumulase solo HEPES SynVitro Hyadase Medio de cultivo ICSI SynVitro Medio de biopsia Medio de congelado de esperma Vitrificaci n MediCult Tamp n de bicarbonato Medio Universal IVF ISMI ISM2 UTM Sistema Blast Assist BlastFreeze BlastThaw Tampon de bicarbonato Medio Universal IVF ISMI ISM2 UTM Sistema BlastAssist SperrmSlow osmolaridad y la esterilidad del medio Tamp n de fosfato OocyteFreeze OocyteThaw pack de congelado de embriones pack de descongelado de embriones MediCult provee una linea completa de Medios para ART Un producto para cada etapa de las Tecnologias de Reproducci n Asistida HMM Sperm Con y sin Rojo Fenol Oocyte Retrieval 10 60 125 ml Sperm Preparation SynVitro Flush or perni Mim Flushing Medium ios Seman g Envios Semanales SupraSperm 100 and Sperm Prep Medium or SupraSperm System Rinsing of Oocytes Swim up SynVitro Flush or Sperm Preparation Medium Flushing Medium or Universal Medium Sperm Immobilisation ICSI only Preincubation PVP Medium or Universal IVF Medium or PVP Clinical Grade or BlastAssist Medium SpermSlow or ISM W Removal of Granulosa Cells Sper ICSI only Sperm Preparation Medium SynVitro Cumulase lt a SynVitro Hyadase perm Freezing x Sperm Freezing Medium Oocyte Freezing amp Thawing
81. pueden descongelarse con velocidad Descongelado de ovocitos OocyteThaw N Cat 1049 es listo para ser utilizado con 1 2 propanediol y protocolo de sacarosa de acuerdo con el m todo Fabbri et al 2001 Las soluciones son formuladas utilizando PBS con HSA y R pida Referencia OocyteThaw 196 2 30 alfa amp betaglobulinas y es eso que son un sistema de medio complementario para el uso con OocyteFreeze Manejo Calentar a temperatura ambiente previo al uso Vial 4 Vial 3 Universal IVF Medium Instrucciones de uso OocyteThaw 1 Preparar una placa de 4 cavidades con las soluciones de descongelado A 0 5 ml del Frasco 1 cavidad B 0 5 ml del Frasco 2 cavidad C 0 5 ml del Frasco 3 cavidad D 0 5 ml del Frasco 4 Equilibrar a temperatura ambiente 2 Remover las pajuelas del nitr geno l quido y mantenerlas a temperatura ambiente durante 30 segundos Luego colocar las pajuelas en ba os de agua a 30 durante 40 segundos hasta que hayan desaparecido los rastros de hielo 3 Cortar el final de la pajuela colocar una jeringa de 1 ml con aire y luego cortar el otro final de la pajuela 4 Expulsar el contenido de la pajuela dentro de una placa de Petri mientras se observa por un microscopio de disecci n o lupa el final de la pajuela Si no se ven todos los ovocitos rellenar la pajuela r pidamente y lavarla suavemente Los ovocitos se pu
82. r materiales t xicos de las mismas 9 Comenzar el programa de enfriado como se describe a continuaci n Enfriar desde temperatura ambiente hasta 6 en pasos de 2 por minuto Seeding manual a 6 NOTA Cuando la soluci n es blanca el seeding ha sido iniciado No haga el seeding en la pajuela cerca del blastocisto s y no la deje caer o la agite Si se producen burbujas de aire en la pajuela se va a reducir la supervivencia del blastocisto Enfriar desde 6 C hasta 40 C en pasos de 0 3 C por minuto Enfriar desde 40 C 150 C en pasos de 35 C por minuto Transferir las pajuelas al nitr geno liquido y almacenar a 196 C NOTA Se deber tener sumo cuidado con el manejo de las pajuelas en temperaturas bajas ya que pueden descongelarse r pidamente Descongelado de blastocistos BlastThaw N Cat 1054 es listo para ser utilizado con glicerol y sacarosa para un protocolo de dos pasos de acuerdo con el m todo de 1 Virant Klun ef al 2003 Se alcanzar una supervivencia ptima del blastocisto post descongelado D a 5 Las soluciones de descongelado son formuladas utilizando un tamp n de bicarbonato modificado EBSS con SSR y garantiza un sistema para uso con BlastFreeze R pida Referencia Blastlhaw 2 196 Nota Todos los pasos son llevados a cabo a temperatura ambiente bajo una corriente de CO y con los embriones protegidos de la luz Manejo Equilibrar por un m
83. rar los ovocitos como se realiza normalmente y preparar el esperma de acuerdo al procedimiento elegido Luego de la recuperaci n y la evaluaci n los ovocitos son incubados en el medio de cultivo elegido Ej ISM1 N Cat 1050 1150 hasta la denudaci n utilizando Ej SynVitro Cumulase N Cat 1512 Este protocolo requiere que suficiente Parafina L quida N Cat 1010 y Sperm Preparation Medium N Cat 1069 o 1070 deberan ser pre equilibrados por la noche en una incubadora con control de CO y a 37 1 Remover el SpermSlow y SynVitro ICSI Holding Medium Cat 1585 del almacenaje a 2 8 y dejarlo a temperatura ambiente por 10 minutos 2 Colocar una pipeta de 2x10 ul de SpermSlow dentro del fondo de un plato ICSI que podr ser mantenido a 37 C durante el procedimiento entero 3 Dependiendo en el n mero de ovocitos utilizados en el procedimiento ICSI colocar en una pipeta un n mero correspondiente de 5 10 ul gotas de SynVitro ICSI Holding Medium 4 Introducir una pequefia cantidad de Ej 1 5 ul del esperma preparado y lavado cerca del SpermSlow dejarlo caer en el centro del plato 5 Utilizar la punta de la pipeta para crear un empalme entre la gota de esperma y la gota de SpermSlow en el centro 6 Inmediatamente cubrir el plato con Parafina L quida pre equilibrada y colocarla en un CO con la incubadora a 37 durante 15 minutos previos al uso 7 Lavar enjuagar la pipeta de inyecci
84. stalizaci n El sembrado puede ser inducido en la temperatura incorrecta si hay part culas o impurezas en las pajuelas Algodones pre enfriados o f rceps son sumergidos en nitr geno l quido previo al sembrado Todos los m todos de congelamiento desarrollados hoy se apoyan en la presencia de uno o m s crioprotectores 1 2 propanediol glicerol DMSO dimetil sulfoxido y etilen glicol son crioprotectores intracelulares o penetrantes Su peso molecular es relativamente bajo MW lt 100 Otros compuestos que como resultado del tama o o polaridad quedan en la soluci n extracelular incluyen la sacarosa las prote nas y las lioproteinas El modo de la acci n del crioprotector es complejo Crean lazos con el agua y reducen los efectos t xicos de las altas concentraciones de los compuestos Adem s protegen las c lulas durante el lento congelado cuando las c lulas est n bastante deshidratadas y son rodeadas por sales concentradas En concentraciones altas los crioprotectores minimizan el da o causado por la formaci n de hielo ya que estos hacen que el agua forme estructuras de vidrio antes que cristales de hielo Los resultados de la cryopreservacion dependen de la tasa de xito de base de la cl nica 51 los resultados frescos de FIV ICSI son bajos esto ser reflejado en los resultados luego de la transferencia de embriones congelados descongelados FER Los resultados de la criopreservaci n son dependientes de los
85. sy Tyrodes Medium Solution Acidified Tyrodes Solution Biopsy Medium BlastAssist Medium 2 ISM27TM Instrucciones de uso Biopsia del embri n D a 0 al 2 1 Seguir el protocolo recomendado para la fertilizaci n y el cultivo de la etapa de clivage en BlastAssist System N Cat 1039 1040 ISM1 N Cat 1050 1150 D a 2 2 d as despu s de la recolecci n de los ovocitos 2 En una placa de cultivo de tejido colocar un volumen de Biopsy Medium suficiente para la biopsia del embri n cubrir con Parafina Liquida N Cat 1010 pre equilibrada y calentar a 37 C en incubador de CO por un m nimo de 2 horas permitir 30 ul por embri n mas 100 ul para lavar la punta de la pipeta si es necesario Recordar pre equilibrar suficiente Parafina Liquida para el procedimiento de la biopsia permitir 4 ml por embri n D a 3 d a de la biopsia del embri n La biopsia en etapa del clivage es llevada a cabo temprano por la ma ana del d a 3 posterior a la inseminaci n 3 Media hora antes de la biopsia preparar la placa de la biopsia para cada embri n y etiquetarla con el nombre del paciente y el n mero de embri n Tomar una pipeta autom tica regulada a 10 ul con una punta est ril y lavar la punta x10 con Biopsy Medium Pipetee 3 gotas de Biopsy Medium y una gota de Soluci n Acidulada de Tyrodes N Cat 1060 como muestra el diagrama Soluci n Acidulada Tyrodes Cubrir inmediatamente la placa con 4 ml
86. tambi n puede afectar la habilidad de clivage del futuro embri n SynVitro Cumulase N Cat 1512 es listo para ser utilizado y consiste de un medio b sico puramente sint tico con 80 U ml de enzima hialuronidasa Esta hialuronidasa es un producto 100 recombinante humano rHuPH20 La hialuronidasa recombinante humana es producida en un sistema que no posee ning n derivado de producto animal Esto permite la purificaci n de glicoproteina humana homogenea con una pureza 100 veces mayor que las preparaciones m s com nmente utilizadas SynVitro Cumulase es por eso la m s segura para utilizar del mercado La enzima Cumulase ha demostrado que es segura y efectiva en la eliminaci n de las matrices del cumulus humano previa a la inyecci n intracitoplasm tica de esperma Manejo SynVitro Cumulase contiene un tamp n HEPES y pH estable para uso fuera de la incubadora sin previa equilibraci n Calentar a 37 C previo al uso Una de las mayores ventajas en utilizar ue SynVitro Cumulase es que el tiempo de exposici n para los ovocitos a la hialuronidasa recombinante humano es mucho menos cr tico por lo tanto se elimina un factor estresante en el procedimiento ICSI R pida Referencia Syn Vitro Hyadase Sistema abierto IVF Medium SynVitro Universal IVF Universal IVF Universal IVF Medium Medium Medium Universal IVF Medium SynVitro ICSI Holding Medium Instrucciones de uso
87. to corresponde a un m nimo de 2 horas de equilibrio de placas de Petri o platos con microgotas cubiertas con Parafina Liquida pre equilibrada El medio de cultivo debe ser reemplazado como m nimo cada 48 horas para mantener condiciones de cultivo ptimas El medio solo optimiza los resultados si el pH y la estabilidad de la temperatura son mantenidos estrictamente Preparaci n de Esperma La preparaci n de esperma es llevada a cabo para remover el plasma seminal los espermatozoides muertos y otras c lulas as como la selecci n del mejor espermatozoide La selecci n del m todo de preparaci n de esperma esta basada en la historia del paciente y en previos an lisis de semen as como la evaluaci n de la actual muestra Otro aspecto que debe ser considerado es 51 la fertilizaci n ser llevada a cabo por FIV o ICSI dado que m s espermatozoides son necesitados para la inseminaci n para FIV La primera porci n de eyaculaci n contiene la mayor a de los espermatozoides fracci n alta mientras que el resto de la eyaculaci n consiste mayoritariamente de secreci n de la ves cula seminal fracci n baja Es por lo tanto de m xima importancia que las primeras gotas de eyaculaci n sean recolectadas en probetas proporcionados para la recolecci n de esperma El tiempo desde la eyaculaci n hasta el comienzo de la preparaci n de esperma no deber a exceder los 60 minutos Una muestra de semen se licua de e
88. todos descriptos est n basados en experiencias cl nicas con nuestros productos MediCult les agradece a los t cnicos de laboratorio y a los cient ficos que contribuyeron con su experiencia Tecnolog a SSR Reemplazo de suero sint tico USA ARTS Suplemento ART Tradicionalmente el suero de pacientes fue usado como una fuente de prote nas para el cultivo de embriones Sin embargo el uso del suero paciente tiene bastantes inconvenientes Por ejemplo las prote nas del suero tienen macromol culas adosadas las cuales incluyen hormonas vitaminas cidos grasos iones met licos quelados y pir genos La concentraci n de esas macromol culas puede variar dependiendo del paciente y del ciclo menstrual Esto hace que la comparaci n entre series de medio que contienen suero paciente sea pr cticamente imposible Asimismo hay evidencia que el suero paciente contiene sustancias que son perjudiciales para embriones in vitro El uso de HSA de grado farmac utico supera estas desventajas SSR esta completamente definido qu micamente y esta libre de prote nas l pidos y glicanos excepto por la presencia de insulina humana recombinante En 1990 Holst et al uso un medio con SSR de MediCult complementado con un 1 de HSA en una prueba cl nica Usando este sistema obtuvieron ndices de fertilizaci n divisi n celular e implantaci n equivalentes comparados la complementaci n de suero Forsdahl et 1994 y Berth
89. transferido al medio del pozo 2 durante 10 minutos a temperatura ambiente y bajo una corriente de CO Los blastocistos son almacenados en la oscuridad 7 Luego del descongelado colocar los blastocistos en Universal IVF Medium N Cat 1030 1031 pre equilibrado y aspirarlos 5 veces en la pipeta arriba y abajo para asegurarse un lavado completo Nota Esto deber hacerse en unos pocos segundos 8 Transferir a Universal IVF Medium pre equilibrado y permitir la recuperaci n del blastocisto por un m nimo de 30 60 minutos en una incubadora CO previo a la transferencia del embri n Blastocistos humanos no contra dos post Blastocistos en soluciones de congelaci n descongelamiento Ninguno presenta da os Blastocisto en soluci n 1 Mismo blastocisto en la Blastocistos humanos contra dos post BlastFreeze soluci n 2 BlastFreeze descongelado Ninguno presenta da os Se ha contra do Blastocisto en soluci n 1 Mismo blastocisto en BlastFreeze soluci n 2 BlastFreeze Se ha contraido Blastocistos humanos contra dos expandidos post descongelado Ninguno presenta da os Completamente re Parcialmente re expandidos 30 minutos expandidos 30 minutos post incubaci n en post incubaci n en incubadora de incubadora de Para mas informaci n consultar el Mini atlas de MediCult esponsorizado por la Dra Irma Virant Klun Fertilizaci n in vitro del blastocisto humano antes y
90. vocitos ICD 16 InSenilac Ol gecscsescscsestesseecsesasecenenvecssnneedecstecetsasaesateaesersteaseenedecevanetenseesseineeecsteactenstecaeetseees 19 Evaluaci n de la fertilizaci n D a 1 1 1 1 1 20 Medios de cultivo sa a Ett t bases 21 Como elegir un medio de cultivo cerraran 21 Cultivo de CUTIES es 23 D a 2 transterenci de oy 00 0 21 Dis AS CCA eC IAG IN eS pio MIU 29 Cultivo c wendtdo DE 50 dana 31 Transferencia embrionaria 1 2 34 raro eI UM Ente 35 io o m 35 Denudaci n de los ovocitos para el 35 Preparaci n del recipiente de inyecci n 40 Inmovilizaci n del esperma 2121 2 2 0 40 46 PENA cion E 48 Biopsia sigo lo 49 Criopreservaci n de espermatozoides 2 53 Concelado OVOCIO 56 SSC OMe AAS E 60 Congelado pre cigotos 2PN y embriones en etapa de divisi n celular trees 62 Descongelado pre cigotos 2PN y embriones en etapa de divisi n celular

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