Anti-Borrelia rec. IgG ELISA
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1. mordus par une tique et ne manifestant pas de signe de maladie de Lyme ont t test s par le test Anti Borrelia IgM et ou IgG ELISA Parmi eux 90 s rums 9 ont pr sent une r activit pour IgG et 94 s rums 9 une r activit pour IgM La sp cificit des tests Anti Borrelia IgM et IgG ELISA est de 91 R activit crois e Les tests Anti Borrelia IgM et IgG ELISA ont t valu s en utilisant les 75 chantillons suivants potentiellement susceptibles de donner des r actions crois es 10 infections par l EBV 50 s rums positifs pour la syphilis 15 s rums positifs pour le facteur rhumato de Sur les 10 s rums EBV IgM quatre ont r agi dans le test Anti Borrelia IgM ELISA Trois de ces s rums pr sentaient au moins une bande p41 dans le transfert de western Sur les 50 s rums positifs pour la syphilis trois ont r agi dans le test Anti Borrelia IgG ELISA et ceux ci ont pr sent au moins une bande dans le transfert de western Cinq s rums ont r agi dans le test Anti Borrelia IgM ELISA et parmi eux quatre ont pr sent au moins une bande dans le transfert de western Comme il est possible qu il se produise une stimulation polyclonale des lymphocytes B dans les infections par EBV mononucl ose infectieuse une r action non sp cifique ne peut pas tre exclue en particulier pour la d termination d anticorps IgM Il est par cons quent recommand d exclure d abord la possibilit d une infection par l EBV dans le2. Cela peut tre consid r comme la valeur normale Aucune valeur sup rieure 1800 RU mi n a t trouv e dans la population test e D termination graphique Les limites de la courbe d talonnage sont plac es dans un syst me de coordonn es L chelle de l axe des x s tend de la DO 0 000 2 500 et celle de l axe des y de 0 120 RU ml Placer les deux valeurs limites aux coordonn es suivantes x y Coordonn es de la valeur limite inf rieure DO seuil 1 RU mi Coordonn es de la valeur limite sup rieure DO de PC RU mI valeur port e par l tiquette Joindre les deux points par une ligne droite Les valeurs des DO des chantillons sont lues sur la courbe d talonnage en RU mlI par d placement parall le partir de l axe des x en utilisant une r gle Si un chantillon a t dilu plus de 1 21 la valeur d termin e partir du graphe doit tre multipli e par le facteur de pr dilution par exemple valeur mesur e x 10 pour une dilution de 1 210 D termination math matique La valeur RU mI d un chantillon test la dilution de 1 21 est calcul e par l quation suivante DO de l chantillon seuil RU ml de l chantillon RU mI 1x i DO de STD 1 21 seuil M Bio Rad Medical Diagnostics GmbH Industriestr 1 D 63303 Dreieich Germany Tel 49 6103 801 95 Fax 49 6103 801 724 www bio rad com techsupport bmd b
3. chantillons anti syphilis positifs Etude de la pr cision Un chantillon n gatif un chantillon faiblement r actif et un chantillon tr s r actif ont t test s trois jours diff rents dans 6 puits La variabilit moyenne inter s ries de ces s rums a t respectivement de 10 4 4 2 et 6 8 Un chantillon n gatif un chantillon faiblement r actif et un chantillon tr s r actif ont t test s six fois dans une m me s rie La variabilit moyenne intra s ries de ces s rums a t respectivement de 18 5 4 7 et 7 0 Litt rature Stanek G et coll 1996 European Union concerted action on risk assessment in Lyme borreliosis clinical case definitions for Lyme borreliosis Wien Klin Wochenschr 108 23 741 747 2 Craft J et coll 1984 Antibody response in Lyme disease evaluation of diagnostic tests J Infect Dis 149 789 795 3 Empfehlungen zur Diagnostik und Therapie der Lyme Borreliose Epidemiologisches Bulletin 22 159 161 1998 4 Hunfeld K P et coll 2002 Development and laboratory evaluation of a new recombinant ELISA for the serodiagnosis of Lyme disease Wien Klin Wochenzeitschrift 114 13 14 580 585 5 Bruckbauer HR et coll 1992 Cross reactive Proteins of Borrelia burgdorferi Eur J Clin Microbiol Infect Dis 11 224 232 6 DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labelling of medical devices T Bundes rztekammer Richtlinie der Bu
4. 615 690 nm La trousse contient MTP 1 Microplaque 12 barrettes s cables de 8 puits chacune tapiss s par OspC rec et la prot ine de fusion de la flagelline p41Pko p41Pbi concentration gt 0 5 ug ml NC 1 2 ml Contr le Borrelia IgG n gatif pr t l emploi humain conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de streptomycine 0 05 de p nicilline V 1 2 ml Contr le Borrelia IgG positif pr t l emploi humain conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de streptomycine 0 05 de p nicilline V STD 1 2 ml Etalon EBV EA IgG pr t l emploi humain conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de streptomycine 0 05 de p nicilline V 45 ml Diluant de l chantillon pr t l emploi conservateur 0 01 de sulfate de n omycine 0 03 de chloramph nicol CONJ 15 ml Conjugu d anti lgG humain pr t l emploi anticorps monoclonal marqu par de la peroxydase Conservateur 0 025 de p nicilline V 0 025 de sulfate de streptomycine 0 2 de Proclin 300 U O N imm diatement apr s usage 2 8 C Enfermer la dans un sachet d aluminium avec un d shydratant et la mettre la temp rature ambiante avant ouverture Remettre les barrettes inutilis es avec le d shydratant dans le sachet refermable et les conserver ainsi 2 8 C Ne pas toucher avec les doigts le bord sup rieur ni le fo
5. DO moyenne de sup rieure gt 0 100 voir 1 et 2 a d a n a pas t pipet apr s le pipetage des chantillons pipeter tous les chantillons avant de pipeter les blancs et les contr les b Contamination par le couvercle du P 187911 06 11 2010
6. cas d une r ponse IgM faible et d une anamn se peu claire Il a t possible de d montrer que en utilisant les antig nes de Borrelia recombinants on peut exclure dans une tr s large mesure une r action crois e avec Treponema pallidum Borrelia recurrentis Borrelia duttonii Borrelia hermsii et Leptospira sp 5 Cependant dans le cas d une infection syphilitique active ou de la pr sence de cicatrices s rologiques de syphilis de faux r sultats positifs peuvent appara tre dans quelques cas individuels Pour cette raison il faut liminer la possibilit d une infection syphilitique La pr sence de facteurs rhumato des peut conduire une interf rence dans le test IgM cependant cette interf rence peut tre r solue dans un transfert de western de confirmation gr ce au profil diff renci des bandes Si n cessaire on peut r aliser une pr absorption en utilisant la proc dure de l absorption des facteurs rhumato des par exemple N cat Bio Rad 807799 conform ment aux instructions Sur 15 s rums avec RF cinq ont r agi dans le test Anti Borrelia IgM ELISA Ces s rums ont pr sent au moins une bande p41 dans le transfert de western En outre 30 chantillons anti HSV et 30 anti toxoplasmose positifs ont t analys s Pour les tests IgM et IgG ELISA une sp cificit de 97 a t d termin e Aucune r action faussement positive n a t observ e avec les tests IgM et IgG de Borrelia ELISA dans l analyse de 30
7. imm diatement tape 1 puits ui A1 B1 C1 D1 E1 F1 Gf Blanc 200 NC double test 200 NC PC double test 200 m Echantillon 1 21 200 Recouvrir la MTP en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 60 2 min 37 1 C Laver 5x voir W1 processeur 60 2 mn 37 1 C WB 550 550 550 550 tape 2 puits pl CONJ 100 100 100 100 Recouvrir la MTP en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 30 1 mn 37 1 C processeur 30 1 mn 37 1 C Acide sulfurique lt 1 N H250 a 1 Sachet de conservation sachet en poly thyl ne pour conserver les barrettes de microplaques inutilis es FOL 3 Feuilles transparentes auto adh sives Feuilles transparentes auto adh sives pour recouvrir les puits des microplaques pendant l incubation BA 1 Notice du coffret Conservateurs concentration totale lt 0 11 Mat riaux n cessaires mais non fournis avec la trousse micropipettes photom tre spectral 450 nm longueur d onde de r f rence 615 690 nm aveur de microplaques avec lavage de fond et incubateur 37 C pour les MTP Avertissement et pr cautions Conjuqu est irritant Proclin 300 Ne pas incorporer de r actifs Eviter le contact a
8. les deux limites sont d termin es graphiquement ou math matiquement Interpr tation et autres informations Les valeurs sont calcul es en unit s relatives de quantification RU ml Ces unit s sont sp cifiques du test Anti Borrelia ELISA de Bio Rad Les r sultats ne sont pas comparables avec les valeurs d termin es en utilisant les tests d autres fabricants La d finition des RU mI est bas e sur un s rum talon sp cifique du test ELISA pour Borrelia utilis par Bio Rad en interne pour standardiser l talon PC fourni avec la trousse de est Les r sultats communiqu s doivent souligner ce point par l addition d une remarque par exemple unit s du test ELISA pour Borrelia de Bio Rad Cependant la constance des r sultats de cette m thode quantitative obtenus pour les divers lots de trousses de est est garantie par des tol rances de fabrication normales La valeur quantitative ne correspond pas au titre au point de virage de l chantillon En premi re approximation cependant la valeur quantitative est proportionnelle au titre au point de virage La distribution de valeurs quantitatives dans un panel d adultes sains infection par Borrelia latente N 1007 donneurs de sang tait la suivante 3 9 1 100 RU mi 0 5 101 500 RU ml 1 1 501 1000 RU mI et 1 1 1001 1800 RU mIl Approximativement 93 4 N 941 des adultes sains ont des concentrations d anticorps lt 1 RU mI
9. pour la d termination quantitative Pour effectuer une d termination quantitative il faut que le r sultat du standard se situe dans l intervalle valide indiqu sur l tiquette Ce test est r alis comme d crit pour la m thode qualitative Les et sont oujours mesur s une dilution finale de 1 21 Les contr les doivent tre mesur s en double Un chantillon inconnu doit d abord tre test une dilution de 1 21 La sensibilit exig e pour d finir l tat immunitaire ne peut tre obtenue qu cette dilution Si la DO de chantillon d passe la DO STD il faut nouveau mesurer l chantillon une plus grande dilution par exemple pr dilution de 1 10 dilution finale de 1 210 On peut aussi par exemple dans le cas d une s ropositivit inconnue r aliser le test d embl e une dilution de 1 210 Si les valeurs sont inf rieures la valeur de seuil ou si la valeur de DO est sup rieure au contr le positif il faut tester nouveau l chantillon une dilution de 1 21 ou 1 2100 respectivement Pour que la quantification soit correcte les conditions suivantes doivent tre respect es Valeur seuil lt DO de l chantillon lt DO d etalon 1 21 La d termination quantitative se fonde sur un talonnage en deux points la courbe d talonnage tant d termin e entre la valeur seuil et la valeur moyenne d etalon STDx conform ment aux informations sp cifiques donn es pour le lot utilis Les valeurs entre
10. 0 550 550 tape 2 puits ui CONJ 100 100 100 100 Recouvrir la MTP en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA 187911 06 11 2010 ncubation 30 1 mn 37 1 C Laver 5x voir W1 processeur 30 1 mn 37 1 C WB 550 550 550 550 tape 3 puits ul SUB 100 100 100 100 ncubation 30 1 mn la temp rature processeur 20 1 mn la temp rature ambiante dans l obscurit ambiante dans l obscurit STOP 100 100 100 100 Mesurer l extinction imm diatement ou dans les 15 mn suivant l arr t 450 nm en utilisant un spectrophotom tre spectral longueur d onde de r f rence 615 690 nm En cas d utilisation de processeurs ELISA l op rateur doit valider le test sous sa propre responsabilit Calcul de la d termination qualitative Apr s mesure des valeurs d extinction 450 nm dans tous les puits filtre de r f rence 615 690 nm soustraire la valeur moyenne des blancs des valeurs d extinction des contr les et des chantillons Extinction moyenne des blancs lt 0 060 Apr s soustraction du blanc les valeurs des contr les doivent satisfaire les crit res de validit suivants DO moyenne de NC lt 0 100 DO moyenne de Pc Calcul de la d termination quantitative Le kit comprend une solution standard conforme aux directives RiliB K de
11. Anti Borrelia rec IgG ELISA Test immunoenzymatique pour la d tection in vitro des anticorps IgG dirig s contre l antig ne de Borrelia burgdorferri dans le s rum ou le plasma Conditionnement REF 807 024 96 tests x Irritant Usage pr vu Le test Anti Borrelia rec IgM ELISA est un test de diagnostic in vitro pour la d tection des anticorps IgG dirig s contre les antig nes de Borrelia burgdorferi agent pathog ne de la maladie connue sous le nom de borr liose de Lyme 1 Dans 30 60 de cas il se forme un anneau rouge qui s tend excentriquement partir du site de p n tration ryth me migrant EM Une trois semaines apr s l apparition de l ryth me on peut d tecter des anticorps IgG Il a t d montr que la moiti environ des patients ayant un EM d veloppent exclusivement des anticorps IgM Dans le cas de patients d veloppant aussi des anticorps IgG l augmentation du titre d IgG peut dans certaines circonstances ne pas tre mesurable avant 5 6 semaines apr s l infection 2 Cependant pour la d tection d anticorps le fait que le titre en anticorps d pende de la dur e d infection et du stade clinique doit tre pris en compte En outre des cas s ron gatifs pr sentant des sympt mes cliniques distincts ont galement t d crits Enfin l interpr tation des donn es du laboratoire peut tre compliqu e en outre par des anticorps IgM persistants par des r actions crois es et par de
12. de Dit Bien m langer Dilution des chantillons au 1 21 avec dilution directement dans la plaque Pipeter 200 ul de dans chaque puits Cette dilution directement dans la microplaque convient tout particuli rement bien en cas d utilisation de dispositifs de pipetage automatiques Si la dilution est effectu e directement dans la plaque manuellement il est important d viter la fixation non sp cifique de prot ines en observant les tapes suivantes Pipeter premi rement 200 pI de Dir dans le puits puis ajouter 10 pl d chantillon ou de t moins M langer de 5 7 fois quand on ajoute les 10 pl d chantillon ou de t moins Proc dure de lavage La proc dure de lavage constitue un point critique Un lavage insuffisant entra nerait une mauvaise pr cision et des r actions non sp cifiques L1 lavage manuel laver 5 fois avec la solution tampon aspirer le contenu du puits et ajouter 250 ul de solution tampon R p ter cette tape 5 fois L2 lavage automatique laver 3 fois avec 250 ul de solution tampon en utilisant le programme de lavage automatique Tapoter bri vement sur la plaque apr s lavage Ne pas laisser la plaque s cher Proc dure de pipetage pour la d termination qualitative d IgG dilution en tube Laisser tous les r actifs atteindre la temp rature ambiante avant emploi Pipeter les contr les et le blanc en dernier Apr s pipetage des contr les et des chantillons mettre la plaque incuber
13. io rad com Pour la d termination quantitative d un chantillon dilu plus de 1 21 la valeur obtenue par le calcul ci dessus doit tre multipli e par le facteur de pr dilution Exemple pour un chantillon mesur une dilution de 1 210 facteur de pr dilution 10 RU mi de l chantillon 1 210 RU mI de l chantillon calcul d apr s la formule x 10 Limites de la m thode Un r sultat n gatif dans le test Anti Borrelia 1gG ELISA n exclut pas avec une certitude absolue la possibilit d une infection par Borrelia Les r sultats du test doivent toujours tre consid r s en association avec les donn es cliniques du patient et les autres m thodes de diagnostic Performance Au total 45 chantillons cliniques provenant de patients atteints d ryth me migrant ont t tudi s Parmi ces s rums 36 chantillons 80 taient positifs dans le test Anti Borrelia IgM et ou IgG ELISA Au total 92 chantillons cliniques provenant de patients atteints d arthrite de Lyme ont t tudi s Tous les s rums 100 taient positifs dans le test Anti Borrelia IgM et ou IgG ELISA Dans une tude portant sur 22 chantillons de patients atteints de neuroborr liose en majorit des enfants 14 s rums 68 taient positifs dans le test Anti Borrelia IgM et ou IgG ELISA Dans une autre tude au total 1007 s rums provenant de donneurs de sang sains de la r gion du Rhin et du Main n ayant pas t
14. l ordre f d ral de m dicins allemands 7 pour la d termination quantitative Apr s mesure des valeurs d extinction 450 nm dans tous les puits filtre de r f rence 615 690 nm soustraire la valeur moyenne des blancs des valeurs d extinction des contr les et des chantillons Extinction moyenne des blancs lt 0 100 Apr s soustraction du blanc les valeurs des contr les doivent satisfaire les crit res de validit suivants DO moyenne de Nc 0 200 DO moyenne de STD 20 800 Calcul de la valeur seuil et de la zone grise La valeur seuil est calcul e partir de la DO moyenne des contr les n gatifs NC X laquelle on ajoute 0 250 Valeur seuil NC X 0 250 La zone grise s tend entre la valeur seuil et la valeur seuil moins 10 Interpr tation du r sultat Les chantillons ayant une valeur d extinction inf rieure la zone grise sont consid r s comme n gatifs Si un chantillon a une valeur d extinction gale ou sup rieure la zone grise il est consid r comme positif pour les anticorps IgG sp cifiques de Borrelia Si la valeur de DO de l chantillon retest est dans la zone grise r sultat douteux nous recommandons de demander un nouveau pr l vement Analyse quantitative d chantillons positifs dans le test d IgG anti Borrelia Le kit comprend une solution standard conforme aux directives RiliB K de l ordre f d ral de m dicins allemands 7
15. nd des puits Pr paration des r actifs Diluer le tampon de lavage avec de l eau d min ralis e ou d sionis e 1 501 Le tampon ainsi pr par est stable pendant une semaine conserv 2 8 C En cas de cristallisation apr s stockage entre 2 et 8 C remettre le tampon de lavage concentr en solution en le portant 37 C Tous les autres composants du test sont pr ts l emploi Tous les r actifs sont sp cifiques d un lot ne pas les utiliser avec des trousses d autres lots Ne pas utiliser de r actifs d autres fabricants Pr paration des chantillons Utiliser des chantillons de s rum ou plasma frais sans h molyse Des chantillons de s rum ou de plasma forte lip mie ict riques ou contamination microbienne et des pr parations d immunoglobuline concentr es risquent de donner des r sultats de test non fiables Eviter de congeler et d congeler les chantillons plusieurs reprises Si les chantillons doivent tre transport s les emballer conform ment aux exigences r glementaires pour le transport de mati res infectieuses Ne pas inactiver les chantillons car il pourrait se produire des r actions non sp cifiques Performance du test Suivre strictement le protocole voir la proc dure de pipetage Dilution des chantillons au 1 21 avec pr dilution dans des tubes Diluer les contr les D et les chantillons au 1 21 dans un tube par exemple 25 ul de contr le ou d chantillon 500 pl
16. ndes rztekammer zur Qualit tssicherung labormedizinischer Untersuchungen 2008 Guide de d pannage 1 Taux lev et inattendu de r sultats r actifs Des chantillons ou des contr les ont t pipet s avant le pipetage de ou bien le m lange a t insuffisant 2 Valeur moyenne du blanc sup rieure au crit re de validit DO gt 0 060 a devenue bleue par oxydation ou contamination b Erreur de lavage Effectuer l tape des 5 cycles de lavage Si l on utilise un dispositif de lavage manuel effectuer 7 cycles de lavage de l tape de lavage Utiliser le de Bio Rad contenu dans la trousse c Erreur d incubation temp rature trop haute dur e d incubation d pass e ou plaque non incub e directement apr s la fin du pipetage d Erreur de longueur d onde une mesure sans filtre de r f rence augmentera les valeurs de DO d approximativement 0 120 3 Coloration jaune dans tous les puits voir 2a 2b amin pr parer un nouveau tampon de lavage contamin r p ter le test avec des r actifs provenant de flacons encore ferm s Utiliser les r actifs dans des conditions plus aseptiques 4 Valeur de DO moyenne de PC STD inf rieure lt 0 400 a Date de p remption d pass e b Temp rature trop basse ou dur e d incubation trop faible c Erreur de lavage lavage trop intensif ou contact m canique entre le distributeur et la phase solide du puits d Contamination de STD ou 3b 5 Valeur de
17. oncentr 500 x conservateur 0 01 de 2 bromo 2 nitro 1 3 propanediol Laver 5x voir W1 SUB 13ml Solution de substrat pr te l emploi WB 550 550 550 550 Solution de 3 3 5 5 t tram thylbenzidine TMB lt 0 05 dans H20 Voir avertissement et pr cautions tape 3 puits ui TOP 15ml Arr t pr te l emploi SUB 100 100 100 100 Incubation 30 1 mn la temp rature processeur 20 1 mn la temp rature ambiante dans l obscurit ambiante dans l obscurit STOP 100 100 100 100 Mesurer l extinction imm diatement ou dans les 15 mn suivant l arr t 450 nm en utilisant un spectrophotom tre spectral longueur d onde de r f rence 615 690 nm Proc dure de pipetage pour la d termination quantitative d IgG dilution en tube Laisser tous les r actifs atteindre la temp rature ambiante avant emploi Pipeter les contr les et le blanc en dernier Apr s pipetage des contr les et des chantillons mettre la plaque incuber imm diatement tape 1 puits ui A1 B1 C1 D1 E1 F1 Git Blanc 200 DIL NC double test 200 PC STD double test 200 PC STD Echantillon 1 21 200 Recouvrir la MTP en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 60 2 min 37 1 C processeur 60 2 mn 37 1 C Laver 5x voir W1 WB 550 55
18. s cicatrices s rologiques Un diagnostic par tape dans lequel la d tection de l infection est r alis e en utilisant un ELISA au stade 1 et les r sultats positifs sont confirm s au stade 2 par un immunotransfert 3 est accept g n ralement On peut utiliser le test Anti Borrelia IgG ELISA comme test de stade 1 pour le diagnostic de Borrelia coffret de tests complets Principe de la m thode Le test Anti Borrelia IgG ELISA est un test immunoenzymatique indirect avec antig ne adsorb ELISA tr s sensible pour la d tection d anticorps sp cifiques de Borrelia dans e s rum ou le plasma Pendant la premi re tape d incubation les anticorps IgG de chantillon vont se lier aux antig nes recombinants rec OspC et la prot ine de fusion de la flagelline interne p41PKo p41PBi 4 tapissant la MTP La mati re non sp cifique sera limin e par lavage Le complexe anticorps antig ne obtenu est d tect en utilisant un anticorps monoclonal sp cifique marqu par une enzyme peroxydase dirig contre IgG humaine Le conjugu li de fa on non sp cifique est limin par une autre tape de avage Pendant la derni re incubation la solution de substrat TMB 3 3 5 5 tram thylbenzidine est introduite dans les puits La r action enzymatique est arr t e par addition d acide sulfurique et la densit optique est mesur e avec un spectrophoto m tre 450 nm et avec une longueur d onde de r f rence de
19. vec les yeux et la peau Traiter tous les chantillons et les mati res utilis es pour le test comme des produits potentiellement infectieux et prendre les mesures de s curit appropri es Les contr les sont n gatifs pour anti HIV 1 2 anti HCV HBsAg anti syphilis et les transaminases lev es Ne pas pipeter la bouche Conform ment aux bonnes pratiques de laboratoire porter des gants une blouse de laboratoire et des lunettes de s curit D contaminer les mati res liquides et non combustibles avec de l hypochlorite de sodium concentration finale 3 temps d action au moins 30 minutes Neutraliser obligatoirement les d chets liquides contenant des acides avant leur limination Autoclaver obligatoirement les utilis es et les mati res r employer pendant 1 heure 121 C La SUB est sensible la lumi re et doit tre mise l abri de celle ci Le test doit tre ex cut par des techniciens de laboratoire bien form s et agr s Ex cuter le test dans des conditions aseptiques et microbiologiqumenet contr l es En cas de trousse d origine d t rior e en informer le fabricant Stockage Les r actifs s ils sont stock s 2 8 C sont stables jusqu aux dates de p remption figurant sur chaque tiquette individuelle Apr s ouverture des r actifs ceux ci doivent tre utilis s dans les 30 jours En cas de r p tition de tests conserver les r actifs WB 6ml Tampon de lavage c
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