PeliCluster CD69
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1. A Sanquin Reagents Plesmanlaan 125 1066 CX Amsterdam The Netherlands Phone 31 20 512 3599 Fax 31 20 512 3570 E mail reagents sanquin nl Website www sanquinreagents com PeliCluster CD69 R actifs monoclonaux murins anti humains pour l identification des cellules exprimant l antig ne CD69 Forme Clone PE M2282 TP1 55 3 X0033 503fra 1112061459 CE 1 INDICATION Les anticorps PeliCluster sont con us pour le diagnostic in vitro Les r actifs identifient et num rent les cellules exprimant l antig ne CD sur cytom tre de flux Pour viter toute interf rence avec les globules rouges pendant l analyse le traitement du sang complet par r actif de lyse est recommand Pelilyse A1 num ro de commande M7101 6 Le cytom tre de flux doit tre quip pour d tecter la diffusion de la lumi re et la fluorescence appropri e et quip du logiciel ad quat d acquisition et d analyse des donn es Se r f rer au manuel d utilisation de l instrument Applications tudes sur l activation des cellules et les r ponses cellulaires aux stimuli mitog niques et antig niques 2 COMPOSITION Le clone TP1 55 3 a t d riv par hybridation de cellules X63 Ag8 653 avec des cellules de rate d une souris BALB c immunis e avec des PBL humains activ s pendant 24 heures avec des PMA et l anticorps monoclonal anti CD3 Ce clone appartient une sous classe d IgG2b murines L anticorps est conj2. tre rapidement induite en d clenchant le complexe TCR CD3 La majorit des cellules NK de sang p riph rique sont n gatives pour CD69 en revanche elles expriment l AIM peu apr s l activation avec des PMA IL 2 l interf ron alfa ou l anticorps monoclonal CD16 CD69 agit comme une mol cule de d clenchement dans les cellules NK et les plaquettes TP1 55 3 r agit avec lymphocytes T activ s mais a peu ou pas d effet sur l induction de la prolif ration de lymphocytes T et la production d IL 2 Cet anticorps monoclonal immunopr cipite l homodim re de 60 kDa et les sous unit s de 27 kDa et 33 kDa partir de PBL activ s avec des PMA et de l anticorps monoclonal anti CD3 respectivement dans des conditions r ductrices et non r ductrices 7 11 Sensibilit La sensibilit est d finie comme une distinction entre la population CD n gative et la population CD positive diff rente La sensibilit a t mesur e en valuant plusieurs concentrations d anticorps Chaque concentration a t test e sur du sang complet La s paration des populations CD positives des populations CD n gatives a t d termin e partir de chaque chantillon et une moyenne a t calcul e pour chaque concentration La concentration d anticorps en flacon pour chaque r actif a fourni une sensibilit optimale pour la distinction entre les cellules CD positives et les cellules CD n gatives Reproductibilit R p tabilit Les CD
3. O NEG CTRL E PE REMARQUE Un r glage incorrect du canal sur les donn es d chantillon peut donner des r sultats incorrects Contr le de qualit interne L utilisation d un contr le n gatif consulter le catalogue de Sanquin Reagents est recommand e afin de d terminer la fluorescence d arri re plan produite en raison des capacit s de liaison de Fc par les cellules mononucl es La concentration et le rapport F P de ces contr les ont t ajust s selon les anticorps monoclonaux conjugu s de Sanquin Reagents 7 PERFORMANCES Sp cificit L anticorps monoclonal est dirig contre l antig ne CD69 qui est exprim principalement sur une sous population de thymocytes et de plaquettes La mol cule CD69 galement appel e mol cule inductrice d activation AIM est un homodim re de 27 33 kDa avec liaison de disulfure phosphoryl e compos de sous unit s glycosyl es diff remment CD69 est une prot ine membranaire int grale de type Il avec un domaine de lectine de type C extracellulaire Apr s activation in vitro des lymphocytes T des cellules NK et des lymphocytes B CD69 est la premi re glycoprot ine de surface inductible qui appara t CD69 est impliqu dans la transduction de signal lors des premi res tapes de l activation des cellules CD69 est ind tectable sur la plupart des lymphocytes de sang p riph rique Les lymphocytes T au repos n expriment pas CD69 mais son expression peut
4. du pellet de cellules et remettre les cellules en suspension dans 1 mi de tampon pour une analyse dans les 8 heures ou dans 1 mi de PFA 1 Sanquin Reagents recommande de pratiquer ensuite l analyse dans les 24 heures Cette m thode a t mise au point pour les chantillons sanguins pr sentant une num ration leucocytaire normale et en utilisant PeliLyse A1 solution de lyse num ro de r f rence M7101 6 Il peut tre n cessaire d ajuster la quantit de sang pour des chantillons pr sentant une num ration leucocytaire tr s lev e ou tr s basse C Cytom trie de flux et microscopie de la membrane plaquettaire 1 Transf rer 45 ul de suspension plaquettaire 1 x 10 cellules ml sur la plaque micropuits ou dans des tubes puis ajouter 5 ul d anticorps monoclonal M langer doucement puis incuber pendant 30 minutes entre 2 et 8 C 2 Rincer en m langeant puis en ajoutant un tampon Sequestrine Seq la plaque micropuits 150 ul au premier lavage 200 ul au second ou aux tubes 2 ml Centrifuger 1000 x g pendant 5 minutes aspirer le surnageant puis renouveler une fois cette proc dure 3 Pr parer les cellules pour l analyse Pour la cytom trie de flux remettre les cellules en suspension en ajoutant 200 l de Seq la plaque micropuits ou aux tubes En cas d utilisation d une plaque micropuits le contenu est transf r dans des tubes appropri s Pour une microscopie fluorescenc
5. et remettre les cellules en suspension 7 Ajouter 200 ul de tampon aux puits de microtitration ou 2 ml de tampon aux tubes et centrifuger 500 x g pendant 5 minutes 8 Aspirer le surnageant du pellet de cellules et remettre les cellules en suspension 9 Analyse sur cytom tre de flux Ajouter 200 ul de tampon aux puits de microtitration et transf rer cette suspension finale de cellules dans des tubes essai appropri s ou ajouter 200 ul de tampon dans les tubes 10Si l analyse ne peut tre pratiqu e dans les huit heures qui suivent ajouter 200 ul de PFA 1 au lieu de tampon au point 9 Sanquin Reagents recommande de pratiquer ensuite l analyse dans les 24 heures o A B M thode sur sang total Pr lever le sang dans un tube de recueil de sang contenant de l EDTA 2 Verser 100 l de sang complet soigneusement m lang au fond de chaque tube essai 3 Ajouter 10 yl des anticorps non dilu s au fond du tube essai et m langer fermement pendant 30 secondes 4 Incuber pendant 15 30 minutes temp rature ambiante 5 M langer les tubes et ajouter 2 ml de solution de lyse PeliLyse A1 dilu e 10 x 6 Incuber pendant 10 15 minutes temp rature ambiante jusqu ce que la lyse soit termin e 7 Analyser les chantillons dans les 90 minutes qui suivent _ Si l analyse ne peut tre effectu e dans les 90 minutes centrifuger les tubes 500 x g pendant 5 minutes Aspirer le surnageant
6. chez Madrid F J Exp Med 168 1621 1637 1988 9 Borrego F Galiani M D Garcia Cozar F Madueno J A Perez Bermejo L Santamaria M Pena J Solana R et al Schlossman S F editor et al Leucocyte Typing V Oxford University Press 1133 1136 1995 10 Testti R Pulcinelli F Frati L Gazzaniga P P Santoni A J Exp Med 172 701 707 1990 11 Testi R d Ambrosio D de Maria R Santoni A mmunol Today 15 479 483 1994
7. e remettre les cellules en suspension dans 50 ul de produit d inclusion transf rer les cellules sur une lame de microscope puis d poser une lame de protection En r gle g n rale il est possible d utiliser 5 xl d anticorps monoclonal non dilu Alternativement il est possible de d terminer une dilution optimale Il est n cessaire de toujours utiliser un contr le n gatif de m me isotype pour d terminer la fluorescence d arri re plan R sultats de l analyse Dans le cadre de certaines maladies on peut s attendre observer des nombres anormaux de cellules exprimant cet antig ne ou des niveaux d expression aberrants de cet antig ne Il est important de comprendre le sch ma d expression normal de cet antig ne et sa relation avec l expression d autres antig nes pertinents afin de r aliser une analyse ad quate Cytom trie de flux Agiter les cellules soigneusement faible vitesse pour limiter l agr gation avant de faire passer les cellules sur le cytom tre de flux 6 Acqu rir et analyser les donn es en mode liste l aide d un logiciel appropri Avant l acquisition des chantillons ajuster le seuil pour minimiser les d bris et assurer que les populations concern es sont incluses La figure 1 pr sente des donn es repr sentatives obtenues sur des lymphocytes tri s Excitation du laser 488 nm Fig 1 Profil de fluorescence canaux de dispersion r gl s sur la fraction lymphocytaire R1
8. hantillon lymphocytes plaquettes Mauvaise manipulation de la pr paration de cellules V rifier la viabilit des cellules centrifuger les cellules une vitesse plus faible Respecter les proc dures de r glage de l instrument optimiser les r glages de l instrument selon les besoins R glage inad quat de l instrument Coloration faible ou diminuant Peu ou pas de cellules BIBLIOGRAPHIE Concentratio n de cellules trop forte lors de l tape de coloration Quantit insuffisante de r actif Cellules non analys es dans les 8 heures suivant la coloration Pr paration incorrecte du milieu oubli du conservateur Concentratio n de cellules trop faible Mauvais fonctionneme nt du cytom tre V rifier et ajuster la concentration de cellules ou le volume de l chantillon colorer avec de l chantillon frais Refaire la coloration en utilisant une quantit plus importante d anticorps R p ter la coloration avec de l chantillon frais analyser rapidement Utiliser du conservateur dans le milieu de coloration et lors des tapes de lavage Remettre en suspension de l chantillon frais une concentration plus lev e refaire la coloration et l analyse D panner l instrument 1 Clinical Applications of Flow Cytometry Quality Assurance and Immunophenotyping of Lymphocytes Approved Guideline Wayne PA National Committee for Clinica
9. l Laboratory Standards 1998 NCCLS document H42 A 2 Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture Fourth Edition Approved Standard Wayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1998 NCCLS document H3 A4 3 Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue Tentative Guideline Villanova PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1991 NCCLS document M29 T2 4 Centers for Disease Control Update universal precautions for prevention of transmission of human immunodeficiency virus hepatitis B virus and other bloodborne pathogens in health care settings MMWR 1988 37 377 388 5 Nicholson JK Browning SW Orloff SL McDougal JS Inactivation of HIV infected H9 cells in whole blood preparations by lysing fixing reagents used in flow cytometry J Immunol Methods 1993 160 215 218 6 Jackson AL Warner NL Preparation staining and analysis by flow cytometry of peripheral blood leukocytes Rose NR Friedman H Fahey JL eds Manual of Clinical Laboratory Immunology 3 ed Washington DC American Society for Microbiology 1986 226 235 7 Lopez Cabrera M Santis A G Fernandez Ruiz E Sanchez Mateos P Sanchez Madrid F et al Schlossman S F editor et al Leucocyte Typing V Oxford University Press 1133 1136 1995 8 Cebrian M Yag e E Rincon M Lopez Bodet M de Landazuri M O San
10. les Conserver le flacon de r actif sec Ne pas utiliser les r actifs en cas de signe de d t rioration augmentation de compensation ou perte importante de r activit 4 REACTIFS OU MATERIEL NECESSAIRES MAIS NON FOURNIS Solution de lyse PeliLyse num ro de commande M7101 6 Tampon de lavage et de dilution pour cellules mononucl es solution saline tamponn e au phosphate contenant 0 2 d ASB p v PBS ASB Tampon de lavage et de dilution pour plaquettes Tampon Sequestrine Seq conservation 1 mois entre 2 et 8 C Solution m re 10 x dissoudre dans un litre d eau distill e Na2HPO4 H20 31 3 g Na2EDTA 2H20 33 3 g NaCl 90 0 g Avant utilisation diluer dans de l eau distill e ajouter de l ASB jusqu une concentration finale de 0 2 p v M langer et ajuster le pH 6 8 Tampon de fixation PFA ASB Paraformald hyde 1 dans PBS contenant 0 2 d ASB pH 7 2 Plaques micropuits 96 puits fond en V ou tubes en plastique pour cytom trie de flux Cytom tre de flux Se r f rer au manuel d utilisation de l instrument pour plus d informations La proc dure utilise un fixatif le formald hyde Eviter tout contact avec la peau ou les muqueuses 5 ECHANTILLON S Les chantillons de sang peuvent tre pr par s pour l analyse par cytom trie de flux en utilisant des proc dures de pr paration de CMSP La pr paration des CMSP donne des r sultats qui d
11. ont t soumis l un des Ateliers internationaux sur les antig nes de diff renciation des leucocytes humains International Workshops on Human Leukocyte Differentiation Antigens ou remplissent les sp cifications de l atelier Voir composition Pour d terminer la r p tabilit de la coloration avec chaque r actif les chantillons ont t color s avec plusieurs lots de r actifs Les diff rents chantillons utilis s pour l valuation ont donn une valeur d intensit de fluorescence moyenne pr sent e dans le tableau 2 Pour chaque chantillon deux lots diff rents de r actifs ont g n r une paire de r sultats Les carts type individuels ont t d termin s partir des r sultats group s en paire de chaque chantillon Les carts type ont t combin s pour d river un cart type group pour chaque r actif qui fournit une estimation de la reproductibilit intra chantillon Tableau 2 R p tabilit de l intensit de fluorescence moyenne de cellules cibles dans des lots diff rents N et pour des donneurs multiples N Intensit de Ecart type CV nr fluorescence group moyenne 25 7 N nombre d chantillons 8 LIMITES Les conjugu s avec des fluorochromes plus brillants PE PE Cy5 donnent une s paration plus importante que les conjugu s avec d autres colorants FITC Lorsque les populations se chevauchent le calcul du pourcentage positif pour les marqueurs peut
12. pendent plus de la technique 1 Pr lever le sang de mani re aseptique par ponction veineuse 1 2 dans des tubes de recueil de sang st riles K3EDTA Au moins 1 ml de sang complet est n cessaire pour la m thode sur sang complet et au moins 2 ml de sang complet sont n cessaires pour la pr paration des CMSP Conserver le sang anti coagul temp rature ambiante 18 25 C AVERTISSEMENT Consid rer tous les chantillons biologiques ainsi que le mat riel qui entre en contact avec eux comme pr sentant un risque biologique Les chantillons doivent tre manipul s comme des chantillons potentiellement infectieux 3 4 et limin s conform ment aux r glementations f d rales d tat et locales Ne pas pipeter la bouche Porter des v tements et des gants de protection adapt s Il a t rapport que la fixation d sactive le VIH 5 6 PROCEDURES A M thode avec cellules purifi es ficoll 1 Pr parer une suspension de cellules mononucl es une concentration de 1 x 10 cellules ml 2 Ajouter 40 ul de suspension de cellules dans des puits de microtitration ou des tubes 3 Ajouter 10 ul de l anticorps non dilu aux puits de microtitration ou aux tubes et m langer doucement Incuber pendant 30 minutes entre 2 et 8 C Ajouter 150 ul de tampon aux puits de microtitration ou 2 ml de tampon aux tubes et centrifuger 500 x g pendant 5 minutes 6 Aspirer le surnageant du pellet de cellules
13. tre affect par le choix du fluorochrome L utilisation d anticorps monoclonaux dans le cadre du traitement du patient peut interf rer avec la reconnaissance d antig nes cible par ce r actif Cela doit tre pris en compte lors de l analyse d chantillons de patients trait s de cette mani re Sanquin Reagents n a pas caract ris l effet de la pr sence d anticorps th rapeutiques sur les performances de ce r actif Les r actifs uniques ne peuvent fournir que des informations limit es pour l analyse des leuc mies et des lymphomes L utilisation d associations d autres r actifs et l application d autres proc dures diagnostiques peuvent fournir plus d informations que l utilisation de ces r actifs uniquement L analyse multicolore utilisant des associations ad quates de r actifs est fortement recommand e Comme les r actifs peuvent tre utilis s dans diff rentes associations les laboratoires doivent se familiariser avec les propri t s de chaque anticorps en association avec d autres marqueurs dans des chantillons normaux et anormaux Les performances des r actifs ont t classiquement valu es sur sang trait l EDTA Les performances des r actifs peuvent tre affect es par l utilisation d autres anticoagulants DEPANNAGE Probl me Cause Solution possible Faible Interaction Pr parer et distinction avec d autres colorer un entre les cellules et autre d bris et les avec les c
14. ugu la phyco rythrine R PE Le rapport molaire F P est compris entre 1 0 et 2 0 Les anticorps ont t purifi s partir de surnageant de culture tissulaire par chromatographie sur colonne chromatographie d affinit Ingr dients du r actif Le r actif est fourni dans 1 ml de solution saline tamponn e au phosphate PBS contenant de l ASB 0 2 p v et du NaNs 0 1 p v servant de conservateurs voir le tableau 1 Tableau 1 Contenu des flacons 100 tests par ml dans du PBS AVERTISSEMENT L azide de sodium est nocif s il est ing r R22 Conserver hors de port e des enfants S2 Conserver l cart de tout aliment boisson et aliment pour animaux S13 Porter des v tements de protection adapt s S36 En cas d ingestion consulter imm diatement un m decin et lui montrer cette bo te ou la notice S46 Le contact avec des acides lib re un gaz tr s toxique R32 Les compos s d azide doivent tre limin s avec de grandes quantit s d eau afin d viter des d p ts sur les conduites de plomb ou de cuivre qui constituent des risques d explosion 3 CONSERVATION ET MANIPULATION Le r actif l anticorps est stable jusqu la date de p remption imprim e sur l tiquette lorsqu il est conserv entre 2 et 8 C Ne pas utiliser au del de la date de p remption Ne pas congeler le r actif ni l exposer la lumi re directe lors de son stockage ou de l incubation avec des cellu
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