Amplified MTD™
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1. B Temp rature 1 L amplification l hybridation et la s lection sont des r actions thermo d pendantes par cons quent il est imp ratif de maintenir le bain marie ou le bloc chauffant aux temp ratures pr conis es 2 Avant l addition du R actif Enzymatique laisser refroidir les tubes pendant 5 minutes afin qu ils atteignent 42 C Cette temp rature permet d obtenir des performances d amplification optimales 3 Le respect de la temp rature est fondamental pour la phase d amplification 42 1 C C Temps Il est imp ratif de respecter les temps indiqu s dans le paragraphe MODE OPERATOIRE D Bain marie 1 Le niveau de l eau dans le bain marie doit tre maintenu de mani re ce que le m lange r actionnel au fond des tubes soit immerg mais ce que l eau ne p n tre pas dans les tubes 2 Durant la phase d amplification le bain marie ne doit pas tre couvert afin d viter que la condensation ne tombe sur ou dans les tubes E Agitation l aide d un Vortex Il est important de disposer d un m lange homog ne lors des tapes d hybridation et de s lection particuli rement apr s l addition du R actif d Hybridation H reconstitu le m lange prend une couleur jaune uniforme et du R actif de S lection S le m lange prend une couleur rose uniforme L agitation l aide d un Vortex permet d obtenir une suspension uniforme Quand les r actifs sont plac s dans un tube r actionne2. lt 500 000 RLU Homog n isation insuffisante Agiter soigneusement l aide du Vortex apr s ajout du R actif comme sp cifi voir le paragraphe d Hybridation reconstitu Hybridation 2 V rifier la formation d une solution de couleur jaune uniforme apr s agitation Volume de R actif de S lection V rifier le r glage de volume sur la pipette trop important Respecter les 15 minutes d incubation MON TE peau lai ps EES 60 C au cours de l tape de S lection pour l tape de s lection TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 23 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS RESOLUTION D INCIDENTS Amplified MTD OBSERVATION CAUSES POSSIBLES RECOMMANDATIONS La temp rature des tubes est descendue en dessous de 42 C apr s l incubation 95 C Les tubulures amenant le R actif de D tection sont bouch s TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 24 Transf rer directement les tubes du bloc chauffant a 95 C au bain marie bloc chauffant a 42 C Rincer les tubulures a l eau chaude comme indiqu dans le manuel d utilisation de l instrument AW 12601 901 Rev 001 FR Amplified MTD NOTES NOTES A Les blocs chauffants doivent avoir des puits pr vus pour les tubes 12 x 75 mm L utilisation des blocs chauffants est recommand e B Il est recommand d util
3. couvillon dans le tube et m langer doucement Retirer l couvillon en l essorant contre la paroi du tube Jeter l couvillon dans un r cipient contenant une solution d eau de Javel dilu e au 1 2 moiti eau de Javel moiti eau d Distribuer 25 ul de la solution ainsi obtenue dans un tube d amplification contenant 50 ul de R actif d Amplification et 200 ul d huile pour r action d amplification e Suivre les instructions du paragraphe MODE OPERATOIRE pour amplification et la d tection Interpr tation Si les r sultats sont 2 30 000 RLU la surface test e est contamin e et doit tre d contamin e par un traitement a l eau de Javel suivant les instructions du paragraphe MODE OPERATOIRE Pr paration du mat riel Si l on suspecte une contamination du bain marie proc der de la m me fa on que ci dessus avec 25 ul de l eau du bain marie condition que celle ci ne contienne aucun produit antiseptique Pr paration du mat riel 1 L eau du bain ultrasons doit tre d gaz e avant chaque essai afin d optimiser le transfert d nergie des ultrasons a Remplir le r servoir du sonicateur d eau du robinet temp rature ambiante jusqu environ 1cm du bord TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 11 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS MODE OPERATOIRE Amplified MTD b Pour d gazer l eau compl tement faire fonctionner le sonicateur pendant
4. 5 ml avec bouchons vis conserv s 20 C pendant 6 mois ou 70 C pendant un an Ne pas utiliser de cong lateur d givrage automatique Le test avec le contr le cellulaire positif recommand de M tuberculosis ne mettra en vidence seulement que les d faillances importantes des r actifs Le contr le positif est destin suivre les r actions des r actifs durant la pr paration pour des interf rences provenant d un exc s de NaOH ou de tampon phosphate Le contr le cellulaire recommand ne d tecte pas les variations de proc dures concernant les temps ou les temp ratures qui pourraient affecter l efficacit de l amplification ou l ad quation du temps de la s lection Des contr les additionnels peuvent tre test s conform ment aux r glementations en vigueur ou guides de bonnes ex cutions des analyses 2 Contr le d inhibition des chantillons Lorsque le test MTD est n gatif mais que le diagnostic du m decin est en faveur d une tuberculose il est possible de v rifier si l chantillon contient un inhibiteur en utilisant la proc dure suivante a Placer 50 ul de Tampon de Dilution des chantillons dans 2 tubes de lyse LT des mycobact ries surcharg et non surcharg b Introduire 50 ul de T moin Positif d Amplification et 450 ul d chantillon dans un tube surcharg Ajouter 450 d chantillon dans le second tube non surcharg R aliser le test selon le protocole habituel TEST AMPLIF
5. E 1x1 5 ml apr s reconstitution Tampon de Dilution Enzymatique EDB 1x1 5 ml TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 7 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS MATERIEL Amplified MTD Composition du coffret PRESENTOIR DES REACTIFS POUR HYBRIDATION bioM rieux r f 39006 Hologic Cat No 301001F ob Tests R actif d Hybridation H 1x6ml apr s reconstitution Tampon d Hybridation HB 1x6ml R actif de S lection S 1x15ml Tubes de Lyse LT 2 x 25 tubes Cartes de protection feuilles autocollantes 1 paquet B Mat riel n cessaire non fourni Micropipettes capables de distribuer 25 ul 50 ul 100 ul 200 ul 300 ul et 450 ul Vortex Eau st rile filtr e ou autoclav e Tubes de culture Billes de verre st riles de 3 mm Tubes pour microcentrifugeuse avec bouchons vis Portoir pour tubes r actionnels Pointes de pipette munies d un filtre 1000 pl T moins Positifs d Amplification par ex M tuberculosis ATCC 25177 ou ATCC 27294 T moins N gatifs d Amplification par ex M gordonae ATCC 14470 ou M terrae ATCC 15755 Eau de Javel solution d hypochlorite 5 25 Feuilles de protection de paillasse plastifi es Pipettes r p titives TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 8 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD MODE OPERATOIRE C Mat riel suppl mentaire disponible che
6. fa on ce que le m lange r actionnel au fond des tubes soit immerg tout en maintenant les bouchons hors de l eau Mettre le portoir en place LES TUBES NE DOIVENT EN AUCUN CAS ETRE EN CONTACT AVEC LE FOND OU LES PAROIS DU SONICATEUR Faire fonctionner le sonicateur pendant 15 minutes mais pas plus de 20 minutes Les chantillons et t moins ainsi trait s aux ultrasons sont des lysats NE PAS UTILISER LE VORTEX POUR AGITER LES LYSATS Amplification 1 En crivant sur le haut des tubes identifier les tubes polypropyl ne pour amplification 12 x 75 mm avec les num ros correspondant aux num ros d identification des Tubes de Lyse LT Identifier galement des tubes d amplification pour les t moins d amplification positif et n gatif Si on utilise des contr les ARN identifier des tubes d amplification pour les contr les N gatifs et Positifs Introduire 50 ul de R actif d Amplification reconstitu au fond de chaque tube en utilisant une pipette r p titive Ajouter 200 ul d huile pour r action d amplification O dans chaque tube en utilisant une pipette r p titive NE PAS UTILISER LE VORTEX POUR LES LYSATS Transf rer 25 ul de chaque lysat dans le fond du tube d amplification correspondant en utilisant une nouvelle pointe munie d un filtre pour chaque transfert Les lysats restants peuvent tre conserv s 2 C 8 C pendant 7 jours ou congel s une temp rature gale ou inf rieure 20 C pendant 1
7. m decin traitant Par patient Pourcentage Nombre Intervalle de moyen Total confiance de 95 Sensibilit 93 3 56 60 83 8 98 2 Sp cificit 99 1 221 223 96 8 99 9 VPP 96 6 56 58 88 1 99 6 VPN 98 2 221 225 95 5 99 5 TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 20 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD PERFORMANCES Par chantillon Pourcentage Nombre Intervalle de moyen Total confiance de 95 Sensibilit 90 6 125 138 84 4 94 9 Sp cificit 99 6 564 566 98 7 100 VPP 98 4 125 127 94 4 99 8 VPN 97 7 564 577 96 2 98 8 Sur les 564 chantillons n gatifs en culture et MTD n gatifs pour les mycobact ries du complexe M tuberculosis 114 chantillons contenaient des mycobact ries atypiques mises en vidence par culture 64 provenaient de patients dont d autres chantillons ont permis d isoler des mycobact ries atypiques par culture et 169 provenaient de patients dont aucune mycobact rie n a t isol e en culture B Pr cision Des panels d chantillons consistant en 2 chantillons n gatifs 2 chantillons faiblement positifs 100 UFC test et 2 chantillons mod r ment positifs 81000 UFC test ont t test s sur trois sites Les chantillons positifs on t pr par s en ajoutant des quantit s connues de M tuberculosis un pool d chantillons mod r ment inhibite
8. mois Ne pas utiliser de cong lateur d givrage automatique Si d autres tests doivent tre effectu s sur les lysats les laisser pr alablement revenir temp rature ambiante NE PAS UTILISER LE VORTEX POUR LES LYSATS Incuber les tubes dans un bloc chauffant 95 C pendant 15 minutes mais pas plus de 20 minutes Pr parer la Solution Enzymatique en ajoutant 1 5 ml de Tampon de Dilution Enzymatique EDB au R actif Enzymatique lyophilis E Faire tournoyer pour m langer Ne pas agiter l aide d un Vortex Le R actif Enzymatique reconstitu est utilisable pendant un mois 2 C 8 C ou pendant deux mois une temp rature gale ou inf rieure 20 C s il est aliquot et congel le jour de sa reconstitution Si le test est effectu avec des fractions aliquotes d enzymes congel es les ramener TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 13 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS MODE OPERATOIRE Amplified MTD pr alablement a temp rature ambiante ne pas d congeler les fractions aliquotes en les incubant haute temp rature Pour homog n iser les fractions aliquotes d congel es aspirer et rejeter doucement la solution en utilisant une pipette r p titive avant de l ajouter aux tubes d amplification Transf rer les tubes dans le bloc chauffant ou le bain marie a 42 1 C et les laisser refroidir pendant 5 minutes NE PAS LAISSER LES TUBES ATTEINDRE LA TEM
9. pendant deux mois une temp rature gale ou inf rieure 20 C s il est aliquot et congel le jour de sa reconstitution Si le R actif d Hybridation reconstitu a t r frig r ou congel le r chauffer 60 C en le faisant tournoyer doucement pour s assurer que tous les composants sont solubilis s Ajouter 100 ul de R actif d Hybridation reconstitu dans chaque tube l aide d une pipette r p titive Couvrir les tubes avec des feuilles autocollantes ou des bouchons Agiter les tubes l aide d un Vortex vitesse moyenne 3 fois pendant au moins 1 seconde Pour une bonne homog n isation des tubes r actionnels les maintenir en position verticale et laisser le m lange atteindre la moiti sup rieure de la paroi du tube pendant l agitation pour viter toute contamination ne pas laisser le m lange r actionnel entrer en contact avec les feuilles autocollantes ou les bouchons Lorsque l homog n isation a t correctement effectu e le m lange doit alors avoir une couleur jaune uniforme Incuber 60 C pendant 15 minutes mais pas plus de 20 minutes dans un bloc chauffant ou un bain marie TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 14 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD MODE OPERATOIRE S lection 1 Le R actif de S lection S doit tre a temp rature ambiante avant de commencer le test Retirer les tubes du bain marie ou du bl
10. peut tre v rifi e par culture cellulaire Ces contr les cellulaires seront utilis s dans la pr paration des Contr les d Amplification voir Pr paration des Echantillons TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 9 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS MODE OPERATOIRE Amplified MTD 1 Pr paration recommand e des Contr les Cellulaires a Mettre 3 5 billes de verre st riles de 3 mm dans un tube de culture propre b Ajouter 1 2 ml d eau st rile Ajouter le contenu de plusieurs ses dei ul de la culture appropri e Fermer le tube et l agiter au vortex plusieurs fois grande vitesse c Laisser reposer la suspension pendant 15 minutes d Transf rer le surnageant dans un tube de culture propre Ajuster la turbidit 1 McFarland l aide d un n ph l m tre e Faire une dilution au 1 100 en mettant 100 ul de la suspension 1 McFarland dans 10 ml d eau st rile Fermer et agiter l aide d un Vortex Ceci est la Dilution 1 f Faire une seconde dilution au 1 100 de la suspension en mettant 100 ul de la Dilution 1 dans 10 ml d eau st rile Fermer et agiter l aide d un Vortex Ceci est la Dilution 2 Cette dilution doit contenir approximativement 25 150 CFU pour 50 ul Aliquotage et conservation des Contr les Cellulaires a Les dilutions doivent tre reparties en fractions aliquot es 500 ul usage unique dans des tubes microfuges propres de 1
11. 15 minutes 2 R gler un bloc chauffant 95 5 C un bloc chauffant ou un bain marie 60 1 C et un bloc chauffant ou un bain marie 42 1 C 3 Nettoyer surfaces de travail mat riel et pipettes avec une dilution 1 2 d eau de Javel avant de commencer l analyse L eau de Javel doit rester en contact pendant au moins 15 minutes Rincer l eau la surface de travail pour liminer les traces d eau de Javel Couvrir la surface sur laquelle le test sera r alis avec une feuille de protection de paillasse plastifi e 4 Pr parer le luminom tre Leader S assurer qu il y ait une quantit suffisante de R actifs de D tection et Il pour r aliser les tests et s assurer que les tubulures soient amorc es Consulter le manuel d utilisation du luminom tre pour les instructions de chargement des R actifs de D tection ces r actifs sont vendus s par ment Pr paration du r actif Reconstituer le R actif d Amplification lyophilis A dans son flacon 50 tests avec 3 ml de Tampon d Amplification AB Homog n iser l aide d un Vortex Laisser le r actif reconstitu reposer temp rature ambiante jusqu ce qu il devienne clair Le R actif d Amplification reconstitu peut tre conserv 2 mois 2 C 8 C La solution doit tre remise temp rature ambiante avant utilisation Pr paration des chantillons 1 Identifier un nombre suffisant de Tubes de Lyse de Mycobact ries LT pour tester les c
12. Apr s la lecture des r sultats l aide du luminom tre d contaminer les tubes et les jeter comme d crit dans les paragraphes MODE OP RATOIRE et REMARQUES afin d viter la contamination du laboratoire par les amplicons M Ne JAMAIS r utiliser les feuilles autocollantes et les bouchons utilis s au cours d une pr c dente tape Les bouchons doivent tre jet s dans un r cipient appropri imm diatement apr s leur retrait pour viter toute contamination crois e Les feuilles autocollantes doivent tre fermement appliqu es sur le haut des tubes r actionnels TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 3 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS INTRODUCTION Amplified MTD N Ne pas couvrir le bain marie pendant les incubations particuli rement si des bouchons sont utilis s la condensation sur le couvercle peut tre une source de contamination O Une bonne homog n isation l aide d un Vortex est n cessaire apr s l addition du R actif de S lection pour obtenir des r sultats pr cis P Il est recommand de s lectionner un endroit pour l tape HPA Hybridization Protection Assay pour minimiser la contamination par les amplicons Cet endroit doit tre diff rent de celui des pr parations des chantillons et des r actifs et de l tape d amplification Q Pour pr venir les contaminations par amplicons au laboratoire les emplacements doivent tre orga
13. DIRECTE DES 2 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD PRECAUTIONS D UTILISATION techniques du laboratoire aux erreurs d identification des chantillons et aux erreurs de transcription des r sultats D Le test est r serv a la d tection des mycobact ries du complexe M tuberculosis a partir d chantillons pr par s selon les m thodes NALC NaOH ou NaOH qui sont recommand es par les Centers for Disease Control CDC Ce test doit tre utilis uniquement pour des chantillons concentr s pr par s partir de crachats induits ou expector s d aspirations trach ales ou de pr l vements bronchiques lavages bron cho alv olaires ou aspirations bronchiques Lors de la remise en suspension de l chantillon dans la solution de tampon phosphate v rifier que la concentration de phosphate soit de 67 mM E Eviter tout contact des R actifs de D tection et Il bioM rieux r f 39300 Cat No 201791 avec la peau les yeux et les muqueuses En cas de contact rincer a l eau Si ces r actifs sont renvers s les diluer avec de l eau avant d essuyer F Prendre les pr cautions habituelles lors de la r alisation de ce test La pr paration des chantillons dig r s et d contamin s ainsi que les tapes du test MTD doivent tre r alis es en respectant les r gles de s curit microbiologique de niveau 2 G N utiliser que le mat riel fourni ou du ma
14. HOLOGIC Amplified MTD TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Coffret de 50 tests bioM rieux Best Nr 39006 Hologic Kat Nr 301001F UTILISATION aE E vues duce dceehuabiccececanesscelsnessccesdexadesnnesocescesacdedstenadsnessneieas eles 2 AVERTISSEMENT osincssnnceeseicacestencocestediniesatacacnctescednecsausancvaicedaesuncnunczqacadessuedaceseieaiesseecoeestezes 2 PRECAUTIONS D UTILISATION acer cccsiciscscectescccsceesccetseuseesncestersecevcesduesdsesiendsesciceddesceenstesoeeses 2 INTRODUCTION ivncacececereccanteenacsuseceadsenestcznenesecadecnncssaasaneadiesenveantsanesaqtanceasessesdsdianersacieaeteontacens 4 al let 5 R ACTIFS Coffret de 50 tests s ssssscssssssssssscsssssscssssesessssesessescssssescsssacseseeaeseseacsseseacesees 5 CONSERVATION EELER 6 PRELEVEMENT CONSERVATION TRANSPORT ET TRAITEMENT DES ECHANTILLONS iii 7 Pr l vement et conservation de l chantillon 7 TRANS POM wecssscaivisisesetssaedendesasivneseddeeaistea ceuseuaasecduacvavacsacunsatsiaeanecei serv DEAA aaora raria anvan 7 Traitement d contamination et concentration 7 Stockage des chantillons trait s 7 MATERIE EE 7 MODE OPERATOIRE wiicectseercceisccseccccceitecccsessessseesscesncesecscerscutecutscteacucasexeacessesscvssieusevnsstecreenrsed 9 W ld 9 Pr paration du mat riel 11 Pr paration du r actif icccc
15. IED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 10 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD MODE OPERATOIRE Interpr tation Si le nombre de RLU Relative Light Units obtenu sur le luminom tre avec le tube surcharg est 2 30 000 RLU l chantillon ne contient pas d inhibiteur de l amplification et l chantillon ne contient apparemment pas de cible amplifier Si le nombre de RLU obtenu avec le tube surcharg est lt 30 000 RLU l chantillon contient un inhibiteur de l amplification et un autre chantillon doit tre test Si le test r p t du tube non surcharg est positif le r sultat du test MTD peut tre rendu positif L explication la plus plausible pour ce type de r sultat est la variabilit li e l chantillonnage la premi re prise d essai ne contenait pas de cible amplifier alors que la seconde en contenait Le nombre de RLU du tube non surcharg peut tre positif ou n gatif selon que la prise d essai contient ou ne contient pas d ARNr de mycobact rie appartenant au complexe M tuberculosis 3 Contrdle de la contamination du laboratoire Pour tester la contamination du laboratoire par les amplicons de M tuberculosis proc der comme suit a Mettre 1 ml d eau st rile dans un tube propre Humidifier un couvillon st rile en polyester ou en dacron avec de l eau st rile b Frotter l couvillon sur la paillasse ou le mat riel tester c Placer l
16. PERATURE AMBIANTE NE PAS COUVRIR LE BAIN MARIE Lorsque les tubes sont 42 C ajouter 25 ul de R actif Enzymatique dans chaque tube en utilisant une pipette r p titive Secouer pour m langer Incuber a 42 C pendant 30 minutes mais pas plus de 60 minutes Il faut utiliser des feuilles autocollantes ou des bouchons pendant cette tape d incubation NE PAS COUVRIR LE BAIN MARIE Apres la p riode d incubation de 30 minutes les tubes couverts peuvent tre conserv s a 2 C 8 C pendant 2 heures ou 20 C jusqu au lendemain S ils sont stock s a 20 C jusqu au lendemain les tubes doivent tre totalement d congel s temp rature ambiante ou au maximum 60 C avant l tape d hybridation et doivent tre ferm s avec des bouchons plut t qu avec des feuilles autocollantes Hybridation 1 Reconstituer le R actif d Hybridation lyophilis H avec 6 ml de Tampon d Hybridation HB Le R actif d Hybridation H et le Tampon d Hybridation HB doivent tre temp rature ambiante avant la reconstitution Si le Tampon d Hybridation HB a t r frig r le r chauffer 60 C en le faisant tournoyer doucement pour s assurer que tous les composants sont solubilis s Agiter l aide d un Vortex jusqu ce que la solution devienne claire cela peut prendre jusqu une minute pour s assurer que tous les composants sont solubilis s Le R actif d Hybridation reconstitu est utilisable pendant un mois 2 C 8 C ou
17. RLU e T moin N gatif d Amplification lt 20 000 RLU e T moin Positif d Amplification 2 1 000 000 RLU Les r sultats des tests patient ne doivent pas tre report s si les contr les ne r pondent pas aux crit res ci dessus Se reporter au chapitre RESOLUTION D INCIDENTS pour plus d informations Les valeurs cibles pour les contr les doivent tre d termin es pour chaque laboratoire en fonction des r sultats de chaque s rie de contr les pr par s B R sultats des tests pour les chantillons cliniques Si les contr les ne correspondent pas aux valeurs escompt es les r sultats des chantillons cliniques ne sont pas valides et ne peuvent tre rendus R sultats e 2 500 000 RLU positif pour l ARNr des mycobact ries du complexe M tuberculosis e lt 30 000 RLU n gatif pour l ARNr des mycobact ries du complexe M tuberculosis e de 30 000 499 999 RLU positif probable pour l ARNr des mycobact ries du complexe M tuberculosis test r p ter pour v rification test r p t 2 30 000 RLU positif pour l ARNr des mycobact rie du complexe M tuberculosis test r p t lt 30 000 RLU n gatif pour l ARNr des mycobact rie du complexe M tuberculosis TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 17 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PRESENTATION DES RESULTATS Amplified MTD PRESENTATION DES RESULTATS Les r sultats des tests MTD doiven
18. UBERCULOSIS Amplified MTD VALEURS ATTENDUES La qualit des r sultats du test est li e a la qualit du pr levement et de son transport ala variabilit de la prise d chantillons aux erreurs techniques du laboratoire aux erreurs d identification des chantillons et aux erreurs de transcription des r sultats Un test n gatif n exclut pas la pr sence d une mycobact rie du complexe M tuberculosis dans l chantillon VALEURS ATTENDUES A Eventail des valeurs de contr le relev es au cours des essais cliniques L vantail des valeurs obtenues pour les contr les RLU lors d essais cliniques r alis s sur 7 sites a t RLU N 704 Intervalle Moyenne st TSN GES 556 245 to T moin Positif d Amplification gt 2 000 000 gt 2 000 000 T moin N gatif d Amplification 904 4 18 754 3 041 B Eventail des valeurs obtenues pour les chantillons cliniques Pour les 127 chantillons MTD positifs les valeurs taient comprises entre 35 777 et gt 2 000 000 RLU Pour les 577 chantillons MTD n gatifs les valeurs taient comprises entre 573 et 19 176 RLU L occurrence des r sultats en RLU pour tous ces chantillons apr s r solution des discordances figure cidessous la r solution des discordances est bas e sur l analyse d autres chantillons positifs en culture provenant d un m me patient et ou sur le diagnostic final du m decin traitant PERFORMANCES A Evaluation clinique Les perform
19. ances du test MTD dans sa forme originale ont t valu es au cours d essais cliniques r alis s dans six laboratoires en comparant les r sultats obtenus par examen de frottis aux r sultats de la culture sur 6 079 chantillons provenant de 2 609 patients Parmi ceux ci 4 000 chantillons provenaient de 1 898 patients ne recevant pas de traitement anti tuberculeux Les six sites repr sentaient des zones g o graphiques diff rentes cinq centres hospitaliers de grandes villes am ricaines poss dant un service sp cialis pour la tuberculose et un laboratoire public Les performances du test MTD dans sa forme actuelle ont t valu es sur sept sites en comparant les r sultats du test MTD aux r sultats de la culture Les sept centres participant au test repr sentaient des zones g ographiques diff rentes six centres hospitaliers de grandes villes am ricaines poss dant un service sp cialis pour la tuberculose et un laboratoire public national de mycobact riologie Les chantillons test s provenaient de patients ne recevant pas de traitement anti tuberculeux 132 ont donn des r sultats positifs en culture pour les mycobact ries du complexe M TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 19 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PERFORMANCES Amplified MTD tuberculosis MTD a d tect 119 de ces chantillons culture positifs 7 chantillons contenaient des mycobact
20. cas de tuberculose chez les patients atteints de SIDA et les immigr s et d une augmentation de la transmission de la maladie au sein des populations haut risque On observe galement l augmentation du nombre de souches r sistantes voire multi r sistantes aux anti tuberculeux Les cons quences sont consid rables dans le domaine de la sant publique Les m thodes de culture conventionnelles permettent d observer la croissance de M tuberculosis dans un d lai de 1 8 semaines Le test MTD quant lui permet la d tection de l ARNr des mycobact ries du complexe M tuberculosis en 2 5 3 5 heures Bien qu il ne permette pas de r aliser d antibiogramme le test MTD d tecte M tuberculosis de mani re fiable et rapide Ceci permet d utiliser au mieux les services d isolement des h pitaux de d buter rapidement un traitement appropri et de pr venir la propagation de la maladie gr ce l identification pr coce et l isolement des individus contamin s TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 4 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD PRINCIPE PRINCIPE Le test MTD est un test en deux phases l amplification et la d tection qui sont r alis es dans un m me tube Tout d abord la sonication provoque la lib ration des acides nucl iques des mycobact ries La chaleur est utilis e pour d naturer ces acides nucl iques et rompre la structure secondair
21. cscccecccccsnscecetssccsceceesceceescecesnececuecesanccocetssctecnsetsseccseneeesntazeceeess 12 Pr paration des chantillons 12 Lyse des chantillons issnnennnnnenennennens 13 AMPIIFICARIQN E 13 Hybridation ss issnsssssnnennnnnnnnnennnennsnnnennnnnnnenennenenesnnneeneneneennnnnee 14 Gelee 110 1 PAPERS Rene Eege 15 D tection 2 15 R p tition du teSt isccscccicc cscs cccceecseccdecessctecescetscoonsaccesenctecceessasdeaguesseccenanesscbeecacedescastoeesse 15 TEL UT NE 6 UT OR 16 INTERPRETATION O TEST scsi sssssssanssscsennennennesonesonmnnnenacneegnnanemeseagepegenaneassanses 17 PRESENTATION DES RESULTATG ccscccscesseeeeeceeeeseeeseesseenaeenseeeaeseneeeeeeeeeeeeeneeseesseaseness 18 II e E E E E E E 18 VALEURS ATTENDUES eiscsstesscescccssevearetaccterstecectentecucessnessecsetesucesteacucccetaduescceacusnsctesvteucseavice 19 PERFORMANCES occcscnsacceseccccteccesetsecccatsecvsctesscescesssecscesuedsacsstesttcecteacissabenteesteesuesseseeussocesnczes 19 RESOLUTION D INCIDENT Se icccisccscsccescseateccescecssccsvecsaccceesnes ccvedei cetvetencctvacetsutesinezerstesseensncees 23 NOTES i sccscccsstscet E E T E E 25 BIBLIOGRAPHIE iscciscsisccesesscisncssncseacesscaus cas sesuecstacavecaaccccesatscaveanscesvecstacivacesscevacssserveessbersnceas 26 TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 1 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS UTILISATION Amplified MTD UTILISATION Le test Holo
22. ct Test for the Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis Am J Respir Crit Care Med 153 1606 1610 4 Centers for Disease Control 1988 United States Morbid and Mortal Weekly Rep 37 377 382 387 388 5 Centers for Disease Control and Prevention and National Institute of Health May 1993 3rd Edition Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories pp 93 96 6 Collins F M 1989 Mycobacterial disease immunosuppression and acquired immunodeficiency syndrome Clin Microbiol Rev 2 360 377 7 Kent P T and G P Kubica 1985 Public Health Mycobacteriology A Guide for the Level III Laboratory U S Department of Public Health and Human Services Public Health Service Centers for Disease Control Atlanta GA 8 National Committee for Clinical Laboratory Standards Internal quality control Principles and definitions Approved Guideline NCCLS document C24 A Villanova PA NCCLS 1991 9 Pitchenik A E D Fertel and A B Block 1988 Mycobacterial Disease Epidemiology Diagnosis Treatment and Prevention Clin Chest Med 9 425 441 10 Roberts G D E W Koneman and Y K Kim 1991 Mycobacterium pp 304 339 In A Balows et al eds Manual of Clinical Microbiology American Society for Microbiology Washington D C 11 Simone P M and Iseman M D 1992 Drug resistant Tuberculosis A Deadly and Growing Danger J Resp Dis 13 960 971 12 Wayne L G 1982 Microbiology of the tubercle bacilli Am Rev Res
23. de mycobact rie du complexe M tuberculosis non d tect Culture compl mentaires pour la recherche des BAAR en attente L chantillon ne contient apparemment pas de mycobact ries du complexe M tuberculosis mais le r sultat peut tre faussement n gatif du la pr sence d inhibiteurs dans l chantillon La recherche sur un autre chantillon est recommand e si une tuberculose active est cliniquement suspect e ou si la pr sence d inhibiteurs est envisag e LIMITES Ce test n est destin qu la d tection des mycobact ries du complexe M tuberculosis partir d chantillons pr par s selon les proc dures NALC NaOH ou NaOH recommand es par le CDC Ce test ne peut tre utilis qu avec des chantillons pr par s partir de crachats induits ou expector s de pr l vements bronchiques lavages broncho alv olaires ou aspirations bronchiques ou d aspirations trach ales Le test MTD est sp cifique des mycobact ries du complexe M tuberculosis a savoir M tuberculosis M bovis M bovis BCG M africanum M microti et M cannetti mais ne diff rencie pas ces esp ces entre elles M celatum et M terrae like peuvent provoquer des r actions crois es s ils sont pr sents a des concentrations sup rieures a 30 UFC par test Toutefois M celatum et M terrae like sont rarement isol es en clinique TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 18 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM T
24. e 50 chantillons Le panel de reproductibilit a t test sur quatre sites Au total 100 120 120 des chantillons n gatifs et 98 8 79 80 des chantillons positifs ont donn les r sultats attendus D Sp cificit analytique La sp cificit du test MTD a t valu e l aide de bact ries de champignons et de virus Dans le cas des bact ries et des champignons les tests de sp cificit ont port sur 160 souches 151 esp ces provenant de 62 genres de mycobact ries tr s proches de M tuberculosis d autres microorganismes responsables de maladies respiratoires et d un panel phylog n tique de microorganismes de la flore commensale de l appareil respiratoire Les souches types taient des cultures ATCC American Type Culture Collection et 5 souches avaient t fournies par des laboratoires d analyses Les lysats pr par s a partir de cultures en phase active de croissance ou d ARNr dans trois cas ont t analys s selon le protocole du test MTD environ 5 x 10 UFC par test Seules les souches du complexe M tuberculosis ont donn des r sultats positifs l exception de souches de M celatum et M terrae like A des concentrations sup rieures 30 UFC par test les souches de M celatum et certaines souches M terrae like ont donn des r sultats positifs 26 772 RLU pour M celatum et de 19 470 49 976 RLU pour M terrae like E Limite de d tection Trente souches de M tuberculosi
25. e couleur rose d Amplification ou les de R actif de S lection uniforme apr s l agitation Contr les N gatifs d Amplification gt 20 000 RLU Amplification de contaminants Un grand soin doit tre apport introduits par manque de la distribution des r actifs l aide des pr caution au cours de la pipettes Les tubes usag s doivent tre pr paration des r actions d contamin s avec une solution d eau de Javel dilu e au 1 10 comme indiqu dans le paragraphe MODE OP RATOIRE Les paillasses blocs chauffants bains marie et pipettes doivent tre d contamin s avec une solution d eau de Javel dilu e au 1 2 comme indiqu dans le paragraphe MODE OPERATOIRE Omission de l tape de refroidissement de 5 minutes Contamination du laboratoire ou des r actifs Omission de l essuyage des tubes avant lecture l aide du luminom tre Non respect des temp ratures Les tubes doivent tre essuy s avec du pr conis es lors de l tape papier absorbant ne peluchant pas humide d amplification avant lecture l aide du luminom tre Valeurs faibles pour les Ajout du R actif d Amplification en V rifier la temp rature du bain marie et ou Contr les Cellulaires versant le liquide sur les parois du du bloc chauffant et l ajuster si n cessaire Positifs tube et non directement au fond pour respecter les temp ratures d Amplification ou les du tube pr conis es Contr les Positifs d Amplification
26. e de l ARNr La m thode d amplification TMA amplifie ensuite une cible sp cifique d ARNr mycobact rien via un interm diaire d ADN une temp rature constante de 42 C De multiples copies de l ARNr mycobact rien amplicons sont ainsi produites Les s quences de l amplicon d ARNr sp cifiques des mycobact ries du complexe M tuberculosis sont ensuite d tect es gr ce la m thode d hybridation d acides nucl iques HPA Le R actif d Hybridation du test MTD contient une sonde ADN monocat naire conjugu e a un marqueur chimiluminescent Cette sonde est compl mentaire des s quences d ARN sp cifiques des mycobact ries du complexe M tuberculosis La sonde forme avec ces s quences sp cifiques des hybrides stables ARN ADN Apr s l tape de s lection le signal lumineux mis par les sondes hybrid es est mesur l aide du luminom tre Leader R ACTIFS Coffret de 50 tests Remarque Pour obtenir des informations sur les mentions de danger et de mise en garde qui pourraient tre associ es ces r actifs consultez la Safety Data Sheet Library Biblioth que des fiches techniques de s curit l adresse www hologic com sds Les r actifs pour le test MTD sont fournis comme suit PRESENTOIR DES R ACTIFS POUR AMPLIFICATION Nom du r actif Volume Tampon de Dilution des Echantillons SDB 1x 2 5 ml Solution tampon Tris contenant lt 3 de d tergent R actif d Amplification A 1x3ml Acides nucl iques lyoph
27. es autres marques commerciales qui peuvent apparaitre dans ce notice sont des marques commerciales de leurs d tenteurs respectifs Ec rer Authorized Representative EMERGO EUROPE Molenstraat 15 2513 BH The Hague The Netherlands AW 12601 901 Rev 001 FR 1995 2015 Hologic Inc Tous droits r serv s 2015 03 TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 27 MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS AW 12601 901 Rev 001 FR
28. es essais cliniques des pr l vements r alis s sur des enfants des patients VIH positifs et des patients infect s par des mycobact ries atypiques ont t soumis au test Toutefois le nombre de ces essais n a pas permis de comparer statistiquement les performances du test pour ces diff rents groupes Les performances du test sur des pr l vements provenant de patients sous traitement anti tuberculeux dans le but de r aliser un suivi th rapeutique ou de confirmer une gu rison n ont pas t valu es Les chantillons forte concentration sanguine ne doivent pas tre test s avec le coffret MTD PR CAUTIONS D UTILISATION A A usage diagnostic in vitro seulement B Le test MTD est sp cifique des mycobact ries du complexe M tuberculosis savoir M tuberculosis M bovis M bovis BCG M africanum M microti et M canetti mais ne diff rencie pas ces esp ces entre elles M celatum et M terrae like peuvent provoquer des r actions crois es s ils sont pr sents des concentrations sup rieures 30 UFC Unit s Formant Colonie par test Toutefois M celatum et M terrae like sont rarement isol es en clinique C Un r sultat n gatif n exclut pas la pr sence d une mycobact rie du complexe M tuberculosis dans l chantillon La qualit des r sultats est li e la qualit du pr l vement et de son transport la variabilit de la prise d chantillons aux erreurs TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION
29. gic AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS MTD est un test utilisant une sonde d acide nucl ique dirig e contre une cible amplifi e permettant la d tection in vitro des acides nucl iques des mycobact ries du complexe Mycobacterium tuberculosis Ce test est r alis partir d chantillons provenant de crachats induits ou expector s de pr l vements bronchiques lavages broncho alv olaires ou aspirations bronchiques ou d aspirations trach ales AVERTISSEMENT L efficacit de ce test n a pas encore t d montr e pour la d tection directe d ARNr de M tuberculosis a partir d autres chantillons cliniques sanguins urinaires ou coprologiques par exemple Les performances du test MTD n ont t tudi es que pour des chantillons trait s selon la technique d crite et conserv s pour des dur es et aux temp ratures sp cifi es dans la pr sente notice Les chantillons donnant des r sultats positifs doivent tre mis en culture pour d terminer la pr sence ventuelle de mycobact ries autres que celles du complexe M tuberculosis ou mycobact ries atypiques Des tests de sensibilit aux agents anti mycobact riens doivent galement tre effectu s Des cultures pour la recherche de bacilles acido alcoolo r sistants BAAR doivent tre r alis es afin de pr ciser quelle sousesp ce du complexe M tuberculosis M bovis par exemple est pr sente Au cours d
30. hantillons et chacun des Contr les Cellulaires d Amplification positif et n gatif ou des T moins d Amplification positifs et n gatifs Retirer et conserver les bouchons 2 Distribuer 50 ul du Tampon de Dilution des Echantillons SDB dans tous les tubes de lyse LT Suivre les paragraphes ci dessous A et B pour les contr les et C pour les chantillons A T moins d Amplification des Echantillons Pour chaque contr le ajouter 1 ml de solution CLNA NaOH et 3 ml de tampon phosphate utilis pour pr parer les crachats avec 1 ml d eau st rile dans le tube chantillon Agiter pour m langer Il Transf rer 450 ul de solution tampon phosphate CLNA NaOH et 50 ul de la dilution du Contr le Cellulaire dans le Tube de Lyse identifi LT B Si on utilise les Contr les Cellulaires d Amplification transf rer 450 ul du flacon de Contr le Cellulaire d Amplification au Tube de Lyse LT correspondant TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 12 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD MODE OPERATOIRE 3 4 C Echantillons Transf rer 450 ul d chantillon bien agit au vortex et d contamin de son flacon dans le Tube de Lyse LT identifi correspondant Reboucher les Tubes de Lyse apr s addition de chaque chantillon Agiter sous Vortex pendant 3 secondes Lyse des chantillons 1 Ins rer les Tubes de Lyse dans le portoir du sonicateur de
31. ilis s dans une solution tampon Tris contenant apr s reconstitution 5 d agent liant Tampon d amplification AB 1x3ml Solution aqueuse contenant des conservateurs R actif d amplification huileux huile pour r action d amplification 1x10ml 0 Huile silicone R actif Enzymatique E 1x1 5 ml Transcriptase inverse et ARN polym rase lyophilis es dans une solution apr s reconstitution tampon HEPES contenant lt 10 d agent liant et 15 mM de N Ac tyl L Cyst ine Tampon de Dilution Enzymatique tampon de dilution des enzymes 1x 1 5 ml EDB Solution tampon Tris contenant un surfactant et du glyc rol TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 5 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS CONSERVATION Amplified MTD PRESENTOIR DES REACTIFS POUR HYBRIDATION Nom du r actif Volume R actif d Hybridation H 1x6ml lt 100 ng flacon de sonde ADN non infectieuse conjugu e un marqueur apr s reconstitution chimiluminescent lyophilis e dans une solution tampon succinate contenant un agent liant et un d tergent Tampon d Hybridation HB 1x6ml Solution tampon succinate contenant lt 4 de d tergent R actif de S lection S 1x15ml Solution tampon borate contenant un surfactant Tubes de Lyse LT 2 x 25 tubes Billes de verre agent liant CONSERVATION A Les solutions ou les composants non reconstitu s suivants doivent tre conserv s a 2 C 8 C et sont
32. is l analyse termin e retirer les tubes du luminom tre Apr s la lecture des tubes les remplir avec pr caution d une solution d eau de Javel dilu e au 1 10 un volume d eau de Javel 9 volumes d eau l aide d une pissette Laisser l eau de Javel en contact pendant au moins une heure avant de jeter les tubes pour viter la contamination du laboratoire par les amplicons Les portoirs de tubes doivent tre d contamin s par immersion compl te dans une solution d eau de Javel dilu e au 1 2 pendant au moins 15 minutes Ils doivent ensuite tre rinc s l eau et essuy s ou s ch s l air D contaminer le laboratoire et le mat riel l aide d une solution d eau de Javel dilu e au 1 2 R p tition du test 1 2 Si le test doit tre r p t laisser revenir les lysats pr par s a temp rature ambiante NE PAS UTILISER LE VORTEX POUR LES LYSATS Suivre ensuite le mode op ratoire en commen ant par l tape d amplification TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 15 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS REMARQUES Amplified MTD REMARQUES A R actifs 1 Le R actif Enzymatique ne doit pas rester a temp rature ambiante plus de 15 minutes apr s avoir t reconstitu 2 Le Tampon d hybridation HB peut pr cipiter Chauffer et agiter le Tampon d Hybridation HB ou le R actif d Hybridation reconstitu 60 C pour dissoudre le pr cipit
33. iser des tubes microfuges munis d un bouchon a vis pour conserver les fractions aliquotes congel es Les fractions aliquot es ne peuvent tre congel es et d congel es qu une seule fois NE PAS utiliser de cong lateurs d givrage automatique C Pour le stockage des fractions aliquotes congel es il est recommand d utiliser des flacons pour r frig ration de 5 ml Les fractions aliquotes congel es ne peuvent tre d congel es qu une seule fois Ne pas utiliser de cong lateur d givrage automatique D Les performances des VORTEX pouvant diff rer selon le mat riel utilis il peut tre n cessaire d adapter le temps d agitation R gler la vitesse de l appareil et suivre les instructions du REMARQUES paragraphe E pour permettre au m lange r actionnel d atteindre la moiti sup rieure de la paroi du tube Une bonne homog n isation est indispensable l obtention de r sultats pr cis Les temps d agitation peuvent tre port s 15 secondes sans affecter les r sultats TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 25 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS BIBLIOGRAPHIE Amplified MTD BIBLIOGRAPHIE 2 Arnold L J P W Hammond WA Wiese and N C Nelson 1989 Assay formats involving acridinuim ester labeled DNA probes Clin Chem 35 1588 1594 3 Bradley S T S L Reed and A Catanzaro 1996 Clinical Efficacy of the Amplified Mycobacterium Tuberculosis Dire
34. l et qu ils sont expos s une source d nergie ext rieure il se produit une rotation rapide de la solution autour de l axe du tube Il en r sulte une suspension uniforme Pour que l homog n isation soit correctement effectu e l aide d un Vortex les tubes doivent tre tenus verticalement par le haut du tube Le liquide doit alors atteindre la moiti sup rieure du tube au cours de l agitation Au cours des tapes d hybridation et de s lection cette agitation est r alis e 3 fois de suite et doit durer au moins 1 seconde chaque fois TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 16 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD INTERPRETATION OU TEST INTERPRETATION OU TEST Les r sultats des chantillons test s par le coffret Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct MTD sont interpr t s sur la base d un r sultat initial n gatif lt 30 000 RLU d un r sultat initial positif 2 500 000 RLU ou d un r sultat initial equivoque de 30 000 a 499 999 RLU Le test MTD doit tre r p t partir du lysat conserv lorsque le r sultat initial est quivoque Un r sultat r p t du lysat gt 30 000 est consid r comme positif A Contr le de qualit et acceptation des r sultats Les contr les doivent satisfaire aux valeurs suivantes e Contr le Cellulaire N gatif d Amplification lt 20 000 RLU e Contr le Cellulaire Positif d Amplification z 500 000
35. nis s pour un travail sens uni directionnel Par example proc der la pr paration des chantillons et des r actifs puis l tape d amplification et ensuite passer l tape HPA Les chantillons le mat riel et les r actifs ne doivent pas retourner dans les endroits ou a eu lieu l tape pr c dente De m me le personnel ne doit pas retourner dans les aires de travail sans des pr cautions d anticontamination Il est fortement recommand que la hotte utilis e pour la pr paration des chantillons ne soit pas utiliser pour r aliser le test MTD INTRODUCTION Le test MTD utilise les m thodes TMA Transcription Mediated Amplification et HPA Hybridization Protection Assay pour d tecter qualitativement l ARN ribosomal ARNr des mycobact ries du complexe M tuberculosis Le test MTD d tecte l ARN des organismes cultivables et non cultivables Le complexe M tuberculosis comprend les sous esp ces M tuberculosis M bovis M bovis BCG M africanum M microti et M canetti 1 Le test MTD d tecte tous les microorganismes du complexe M tuberculosis Toutefois M microti n infecte que les animaux M bovis est rarement transmis des animaux infect s aux humains M africanum quant a lui est responsable de tuberculose pulmonaire en Afrique tropicale M tuberculosis est de loin le membre le plus commun responsable d une morbidit importante dans le monde entier Le CDC a r cemment fait tat d une augmentation des
36. oc chauffant a 60 C et ajouter 300 ul de R actif de S lection S l aide d une pipette r p titive Couvrir les tubes avec des feuilles autocollantes ou des bouchons Agiter a l aide d un Vortex vitesse moyenne 3 fois pendant au moins 1 secondeD Pour une bonne homog n isation des tubes r actionnels les maintenir en position verticale et laisser le m lange atteindre la moiti sup rieure de la paroi du tube pendant l agitation pour viter toute contamination ne pas laisser le m lange r actionnel entrer en contact avec les feuilles autocollantes ou les bouchons Lorsque l homog n isation a t correctement effectu e le m lange doit alors avoir une couleur rose uniforme Incuber 60 C pendant 15 minutes mais pas plus de 16 minutes dans un bloc chauffant ou un bain marie Retirer les tubes du bain marie ou du bloc chauffant Laisser les tubes revenir temp rature ambiante pendant au moins 5 minutes mais pas plus d une heure Retirer les feuilles autocollantes ou les bouchons juste avant la phase de d tection D tection 1 Programmer le protocole appropri sur le luminom tre Choisir une lecture 2 secondes Pour liminer tout r sidu de la surface des tubes les essuyer l aide de papier absorbant ne peluchant pas humide puis les introduire dans le luminom tre en suivant les instructions du manuel d utilisation Les tubes doivent tre lus moins d une heure apr s l tape de s lection Une fo
37. pir Dis 125 3 pt 2 31 41 13 Van Soolingen D et al 1997 A novel pathogenic taxon of the Mycobacterium tuberculosis complex canetti characterization of an exceptional isolate from Africa Intl J Syst Bacteriol 47 1236 1245 14 Kerleguer A Koeck J L Fabre M G r me P Teyssou R Herv V 2002 Application of a Grey Zone for the Interpretation of The Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test for the Rapid Diagnosis of Respiratory Tuberculosis Esm May 2002 15 Coll P Garrig6 M Moreno C Marti N 2002 Routine Use of E MTD Hologic For Direct Detection of Mycobacterium Tuberculosis in Clinical Samples Esm 2002 TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 26 AW 12601 901 Rev 001 FR Thoracic Society Medical Section of the American Lung Association 1983 Levels of laboratory services for mycobacterial diseases Am Rev Respir Dis 128 213 MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD mi CE IVD Hologic Inc 10210 Genetic Center Drive San Diego CA 92121 USA Service clients 1 844 Hologic 1 844 465 6442 customersupport hologic com Service technique 1 888 484 4747 molecularsupport hologic com Pour obtenir des coordonn es suppl mentaires visitez le site www hologic com Hologic et Amplified MTD sont des marques commerciales et ou des marques d pos es d Hologic Inc et ou de ses filiales aux Etats Unis et ou dans d autres pays Toutes l
38. ries non tuberculeuses en plus de M tuberculosis ECHANTILLONS PROVENANT DE PATIENTS NON TRAITES Comparaison MTD culture N 704 PAR PATIENT PAR PATIENT avant r solution des discordances avant r solution des discordances Culture Culture MTD 54 4 MTD 56 2 MTD 4 221 MTD 4 221 PAR ECHANTILLON PAR CHANTILLON avant r solution des discordances avant r solution des discordances Culture Culture MTD 119 8 MTD 125 2 MTD 13 564 MTD 13 564 Les patients suspect s d tre atteints d une tuberculose pulmonaire active et n tant pas sous traitement ont t inclus dans cette tude La pr valence totale des patients ayant eu une culture positive pour M tuberculosis tait de 20 5 Par patient une sensibilit moyenne de 93 3 et une sp cificit moyenne de 99 1 ont t d termin es par rapport la culture Par chantillon une sensibilit moyenne de 90 6 et une sp cificit moyenne de 99 6 ont t d termin es par rapport la culture Le tableau ci dessous donne la sensibilit la sp cificit la valeur pr dictive positive VPP et la valeur pr dictive n gative VPN avec des intervalles de confiance de 95 pour les estimations de performances Toutes les donn es affich es sont pr sent es apr s r solution des discordances bas e sur l analyse d autres chantillons positifs en culture provenant du m me patient etlou sur le diagnostic final du
39. s provenant de r gions g ographiques tr s vari es y compris des repr sentants de souches r sistantes et de souches sensibles aux antibiotiques ont t d tect es par le test MTD Le test MTD a pu d tecter jusqu 1 UFC par test de chacune des 30 souches F Test de surcharge De l ARNr de Mycobacterium tuberculosis une concentration de 25 fg quivalant 5 UFC par test ont t test s en pr sence d environ 540 000 UFC par test 450 ul des organismes non cibles suivants Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Legionella pneumophila Pseudomonas aeruginosa Mycobacterium gordonae M avium M kansasii M terrae Nocardia asteroides N otitidis caviarum Corynebacterium pseudotuberculosis C diphtheriae Gordona sputi et Rhodococcus bronchialis Tous les r sultats ont t positifs pour l ARNr de M tuberculosis en pr sence de ces organismes non cibles qui n ont donc pas cr d interf rence TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 22 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Amplified MTD RESOLUTION D INCIDENTS RESOLUTION D INCIDENTS OBSERVATION CAUSES POSSIBLES RECOMMANDATIONS Valeurs lev es pour les Homog n isation insuffisante R homog n iser correctement Veiller Contr les Cellulaires apr s ajout du R actif de respecter les volumes indiqu s V rifier N gatifs S lection S ou trop faible volume l apparition d une solution d
40. serv s a 2 C 8 C avant leur transport et leur traitement Au cours des essais cliniques les chantillons ont t stock s moins de 4 jours g n ralement moins de 24 heures avant leur traitement Transport Transporter les chantillons au laboratoire le plus rapidement possible conform ment aux r glementations en vigueur Traitement d contamination et concentration Les chantillons forte concentration sanguine ne doivent pas tre soumis au test MTD Ce test est con u pour d tecter l ARNr des mycobact ries du complexe M tuberculosis en utilisant des chantillons pr par s selon les m thodes de d contamination NALC NaOH ou NaOH utilisant 1 1 5 de NaOH pendant 15 20 minutes et une centrifugation une vitesse sup rieure ou gale 2 3 000 g Stockage des chantillons trait s Les chantillons peuvent tre stock s au maximum 3 jours 2 C 8 C avant le test Ils peuvent galement tre stock s entre 20 C et 70 C pendant 6 mois au plus Ne pas utiliser de cong lateur d givrage automatique MAT RIEL A Mat riel fourni PRESENTOIR DES R ACTIFS POUR AMPLIFICATION Composition du coffret bioM rieux r f 39006 Hologic Cat No 301001F SO TESIS Tampon de Dilution des Echantillons SDB 1x2 5ml R actif d Amplification A 1x3ml apr s reconstitution Tampon de Reconstitution AB 1x3ml R actif huileux huile pour r action d amplification O 1x10ml R actif Enzymatique
41. t tre interpr t s avec l ensemble des donn es cliniques et autres tests du laboratoire disponibles pour le clinicien On peut consid rer de tester d autres chantillons en fonction du degr d appr ciation de l tat clinique Si le r sultat initial est positif avec une RLU 2 500 000 ou que le test MTD r p t est 2 30 000 RLU alors pr senter les r sultats de la mani re suivante Interpr tation ARNr de mycobact ries du complexe Mycobacterium tuberculosis d tect R sultat microscopique positif ou n gatif Information Culture pour la recherche de BAAR en cours L chantillon peut contenir a compl mentaires la fois des mycobact ries non tuberculeuses et M tuberculosis ou M tuberculosis seul Ce test ne doit pas tre la seule base du diagnostic de tuberculose La valeur pr dictive pour un patient avec un examen microscopique n gatif est inf rieure a celle d un patient avec un examen microscopique positif Ceci est particuli rement important dans les populations test s ou la pr valence de la tuberculose est faible et que les valeurs pr dictives positives des m thodes de diagnostic sont r duites de fagon correspondante Si le r sultat initial ou le test r p t MTD est n gatif lt 30 000 RLU alors pr senter les r sultats de la mani re suivante Interpr tation ARNr de mycobact rie du complexe M tuberculosis non d tect R sultat microscopique positif ou n gatif Information ARNr
42. t riel de laboratoire usage unique H Les paillasses les pipettes et le mat riel doivent tre d contamin s avec une solution d eau de Javel dilu e au 1 2 moiti eau de Javel moiti eau comme d crit dans le paragraphe MODE OP RATOIRE Laisser l eau de Javel en contact pendant 15 minutes puis rincer l eau et essuyer pour liminer les traces d eau de Javel I Des pipettes d placement positif ou des pipettes d placement d air quip es de pointes munies d un filtre doivent tre utilis es pour r aliser ce test Lors du transfert du lysat des tubes de lyse aux tubes d amplification des pointes extra longues doivent tre utilis es Changer de pointe entre chaque tape Eviter de passer au dessus des autres tubes du portoir Les pointes usag es doivent tre imm diatement jet es dans un r cipient destin aux d chets biologiques J Lors de l utilisation d une pipette r p titive pour la distribution des r actifs apr s l introduction du lysat dans les tubes viter de toucher le tube avec la pointe de la pipette afin de r duire les risques de contamination entre tubes Les r actifs doivent tre distribu s contre la paroi du tube afin d viter les projections Le soin apport la distribution des r actifs permettra de r duire les risques de contamination crois e K Ne pas utiliser les m mes pipettes pour les tapes pr c dant l amplification et les tapes suivant l amplification L
43. urs Les chantillons ainsi que des t moins d amplification positif et n gatif ont t test s en triple deux fois par jour pendant 3 jours sur les trois sites La variabilit des r sultats n tant pas significative d un site l autre ou d un jour l autre les r sultats des trois sites ont pu tre consolid s et sont pr sent s ci dessous Les valeurs de lecture mesur es en RLU sont limit es par la r solution du tube photomultiplicateur du luminom tre Pour cette raison les valeurs sup rieures 2 000 000 RLU sont ramen es 2 000 000 RLU Ni les carts types ni les coefficients de variation ne sont indiqu s Pr cision Nombre de r sultats Plage RLU Moyenne RLU d observations corrects Echantillons 1 108 100 154 103 gt 2 000 000 gt 2 000 000 Forts positifs Echantillons 2 108 99 1 16 324 gt 2 000 000 gt 2 000 000 Faibles positif Echantillons 3 108 100 2 004 5 693 2 689 N gatifs T moin positif 54 100 gt 2 000 000 gt 2 000 000 T moin n gatif 54 100 2 272 4 241 2 944 Un r sultat n gatif observ TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 21 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PERFORMANCES Amplified MTD C Reproductibilite L tude de reproductibilit a t effectu e en testant 25 chantillons des t moins d amplification n gatifs tant intercal s entre chaque chantillon pour former un total d
44. utilisables jusqu la date de p remption indiqu e e Tampon de Dilution des Echantillons SDB e R actif d Amplification A e Tampon d Amplification AB e R actif Enzymatique E e Tampon de Dilution Enzymatique EDB e R actif d Hybridation H Le R actif d Amplification reconstitu A est utilisable pendant 2 mois s il est conserv 2 C 8 C Le R actif d Hybridation H et le R actif Enzymatique E sont utilisables un mois 2 C 8 C apr s reconstitution ou deux mois une temp rature gale ou inf rieure 20 C s ils sont aliquot s et congel s le jour de leur reconstitution Les fractions aliquotes congel es doivent tre utilis es le jour o elles sont d congel es Ne pas utiliser de cong lateur d givrage automatique B Les composants suivants doivent tre conserv s entre 2 C et 25 C et sont utilisables jusqu la date de p remption indiqu e e R actif d amplification huileux 0 e Tampon d Hybridation HB e R actif de S lection S e Tubes de Lyse LT TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES 6 AW 12601 901 Rev 001 FR MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PRELEVEMENT CONSERVATION Amplified MTD TRANSPORT ET TRAITEMENT DES ECHANTILLONS PRELEVEMENT CONSERVATION TRANSPORT ET TRAITEMENT DES ECHANTILLONS Pr l vement et conservation de l chantillon Les chantillons doivent tre plac s dans des r cipients en plastique st riles et con
45. z votre distributeur Hologic Cat No Sonicateur 901104 bioM rieux r f 39409 Blocs chauffants 42 C 1 C 60 C 1 C 105524 105524F 95 C 5 C 4 bioM rieux r f 39405 39406 39407 105524J Luminom tre Leader 50i 103100i bioM rieux r f 39400 Coffret de R actifs de D tection 201791 bioM rieux r f 39300 Contr les d Amplification MTD 301043F bioM rieux r f 39223 Portoir de tubes pour le sonicateur 104027 bioM rieux r f 39313 Portoir de tubes r actionnels 104769 bioM rieux r f 39311 Pointes de pipette longues munies d un filtre 1250 ul 104316 bioM rieux r f 39315 Tubes en polypropyl ne 12 x 75 mm 102440 bioM rieux r f 39308 Bouchons en polypropyl ne pour tubes de 12 x 75 mm 400713 bioM rieux r f 39320 MODE OPERATOIRE Contr les Les souches utilis es comme Contr le Positif d Amplification doivent faire parties du complexe M tuberculosis par exemple comme souche non virulente H37Ra ATCC 25177 ou comme souche virulente H37Rv ATCC 27294 Les souches utilis es comme Contr le N gatif doivent tre des souches de mycobact ries non tuberculeuses MOTT par exemple M gordonae ATCC14470 ou M terrae ATCC 15755 Les t moins doivent tre pr par s avant de tester les chantillons Les contr les cellulaires doivent contenir de 25 150 CFU par 50 ul pour atteindre une concentration finale de 1 10 CFU par test Cette concentration
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