RealStar® Influenza S&T RT-PCR Kit 3.0
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1. Explications des symboles erret rent zr nnn iru aen RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 y e Des cycles r p t s de d cong lation et de cong lation des r actifs plus de 1 Usage pr vu DS deux doivent tre vit s car ils peuvent affecter les performances du dosage _ Les r actifs doivent tre s par s en aliquotes et congel s si elles doits tre Le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 3 0 est un test de diagnostic in vitro quali M utilis s de facon intermittente tatif bas sur la technologie RT PCR en temps r el pour la d tection des souches saisonni res de grippe A et B ainsi que pour la pand mie actuelle de H1N1nv La conservation a 4 C ne doit pas exc der une dur e de 2 heures e Prot ger les Mastermix A et B de la lumi re 2 Composants du kit 4 Mat riels requis non fournis Couleur du Violet Blanc e Instrument adapt la PCR en temps r el Chapitre 6 Description du produit couvercle zs e Syst me ou kit appropri l extraction des acides nucl iques Con Contr le Contr le Contr le Eau de e Centrifugeuse de bureau avec rotor adapt des tubes de 2 ml tr le positif positif positif qualit mix A mix B e Centrifugeuse avec rotor pour plaques de microdosage si vous utilisez des interne HIN Influenza A Influenza B PCR H p pad H Master Master plaques de 962. Fabricant 30
3. 10 bovine Influenza Influenza Influenza Contr le Organismes TUTE D B interne Virus respiratoires Syncytial RSV A and RSV B 4 l ADN g nomique humain 2 ug PCR Milieu de transport viral 3 fabricants Metapneumovirus humain 11 3 Sensibilit clinique Aucune tude prospective pour la d termination de la sensibilit clinique n a encore t effectu e car il n existe aucun dosage approuv pour comparer En remplace ment un chantillon est d clar comme positif si au moins un des chantillons positifs en technique RT PCR en maison est galement disponible avec une Adenoviruses preuve additionnelle de sa positivit s quencage test des antig nes ou culture Types 1 et 7 virale Ces chantillons sont nomm s chantillons pr test s positifs et pr test s n gatifs respectivement Ces chantillons ont t test s nouveau avec le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR Enterovirus Chlamydia pneumonia Le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR n a pr sent aucune r action crois e avec les organismes ci dessus 26 21 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 Table 6 Resultats du diagnostic d valuation Positifs H1N1nv Neoatte ah P par RealStar Influenza par RealStar Influenza S amp T RT PCR S amp T RT PCR pr test s positifs pr test s n gatifs 12 Limites et pr cautions e L utilisation de ces produits est limit e au personnel comp tent
4. sultats inhabi tuels directement notre service de support technique e mail support altona diagnostics com t l phone 49 0 40 5480676 0 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 NOTE Etant donn l volution mol culaire des virus de la grippe il y a un risque inh rent pour tous les syst mes bas s sur la PCR en temps r el en cas d accumulation de mutations au cours du temps qui pourraient conduire de faux n gatifs 6 Description du produit Le Kit Realstar Influenza S amp T RT PCR 3 0 est un test de diagnostic in vitro quali tatif bas sur la technologie RT PCR en temps r el pour la d tection des souches saisonni res de grippe A et B ainsi que pour la pand mie actuelle de H1N1nv De plus il permet la diff renciation entre les grippes humaines saisonni res A et B et la souche H1N1nv responsable de la pand mie actuelle H1N1nv strain Le dosage inclue up syst me d amplification h t rologue Contr le Interne qui permet d identifier une ventuelle inhibition de la PCR et de confirmer l int grit des r actifs du kit Le kit Realstar Influenza S amp T RT PCR 3 0 est bas sur la technologie de la PCR en temps r el utilisant une reverse transcriptase RT qui permet de convertir de l ARN en ADN compl mentaire ADNC une r action en chaine par polym rase PCR pour l amplification de s quences cibles sp cifiques pour la d tection d ADN amplifi Les sondes sont marqu es avec un marque
5. un support technique concernant le pr traitement et la pr paration des chantillons merci de contacter notre support technique e mail support altona diagnostics com t l phone 49 0 40 5480676 0 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 8 3 Pr paration du Mastermix Tous les r actifs doivent tre compl tement d congel s homog n is s la pipette ou vortex s doucement et bri vement centrifug s avant leur utilisation Le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 3 0 contient un contr le interne h t ro logue peut tre utilis aussi bien comme un contr le d inhibition de la RT PCR ou comme un contr le lors de la pr paration de l chantillon extraction de l acide nucl ique et aussi comme un contr le de l inhibition de la RT PCR e Sile contr le interne est utilis comme un contr le d inhibition de la RT PCR mais pas comme un contr le lors de la proc dure de pr paration de l chantillon alors le Mastermix doit tre pr par comme d crit par le sch ma de pipetage ci dessous Nombre de r actions rxns Mastermix A 60 ul Mastermix B 120 pl Contr le interne 12 yl Valiima Mactarmiv V olume MastermmD e Si le contr le interne est utilis comme un contr le lors de la proc dure de pr paration de l chantillon et comme un contr le d inhibition de la RT PCR le contr le interne doit tre ajout au moment de la proc dure d extraction de l acide nucl ique RealStar Influe
6. ISO EN 13485 chaque lot du kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 3 0 est test selon les sp cifications pr d finies afin d assurer la qualit constante du produit 14 Assistance technique Pour le support client merci de contacter notre support technique e mail support altona diagnostics com t l phone 49 0 40 5480676 0 15 Marques d pos es et responsabilit RealStar ExtraStar altona Diagnostics GmbH Mx 3005P Stratagene ABI Prism Applied Biosystems HighPure LightCycler Roche Rotor GeneT QlAamp QIAGEN VERSANT Siemens KingFisher Thermo Scientific Les noms d pos s les marques d pos es etc utilis es dans ce document m me si ils ne sont pas sp cifi es comme tels ne doivent pas tre consid r es comme non prot g es par la loi Le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 3 0 est un test de diagnostic in vitro mar qu CE en accord avec la Directive europ enne 98 79 EC N est pas disponible dans tous les pays 2012 altona Diagnostics GmbH tous droits r serv s 29 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 16 Explications des symboles NOTES EL DE gt EIS Dispositif medical de diagnostic in vitro R f rence produit Num ro de lot Contient le nombre suffisant pour r aliser n tests rxns Limites de temp rature Version Utiliser avant Attention Se reporter au manuel d utilisation
7. angdong 78 516 Influenza A Shangdong 9 93 Influenza A Turkey 07 112 Influenza A Turkey 1 2005 Influenza A Uruguay 08 278 Influenza A Uruguay 716 2007 Influenza A Vietnam 05 204 Influenza A Vietnam 119 04 Influenza B Ann Arbor 1 86 Influenza B Ann Arbor 86 630 Influenza B Florida 08 140 Influenza B Florida 8 2006 Influenza B Harbin 7 94 Influenza B Harbin 97 748 Influenza B Hong Kong 79 568 Influenza B Malaysia 08 184 Influenza B Malaysia 2506 2004 Influenza B Norway 1 84 Influenza B Norway 84 542 Influenza B Brisbane 60 2008 Influenza A Brisbane 10 2007 H3N2 Influenza A Brisbane 59 2007 H3N2 Influenza A Chicken Germany H5N1 R3294 2007 Influenza A Hamburg 2009 H1N1nv Influenza A Bayern 63 2009 H1N1nv Influenza A California 2009 H1N1nv 25 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 11 2 2 R activit crois e 11 2 3 Substances interf rentes La sp cificit analytique du kit RealStar Influenza S amp T RT PCR a t valu e en Table 5 R sultats des chantillons contenant diff rentes substances interf rentes possible testant un testant un panel d ARN g nomique extrait de diff rents pathog nes res Resultat 30 pfu ml Resultat 3 pfu ml piratoires principalement Substances interf rentes possible H1N1nv souche HH H1N1nv souche HH Table 4 Organismes test s afin de d montrer la sp cificit analytique du kit RealStar z Influenza S amp T RT PCR 3 0 Mucine
8. e 1 Matrice CGTCAGGCCTCCTCAAAGC Amorce 2 Matrice ATTCCATGAGAGCCTCAAGATC Amorce 3 Les amorces et les sondent recherchent les m mes r gions l int rieur de la matrice du g ne des souches des grippes A et B et H1N 1nv Cependant le mar quage diff rent des sondes permet de les mettre en comp tition les unes avec les autres En cas de pr sence d ARN sp cifique la grippe A la sonde marqu e avec le Cy5 se liera alors que si c est la souche sp cfique au H1N1nv qui est pr sente c est la sonde marqu e pour le FAM qui se liera Par cons quent et malgr le fait que la souche H1N nv appartienne la famille des virus de la grippe A un chantillon positif au H1N1nv sera pr sent uniquement dans le canal de d tection FAM et pas dans celui du Cy5 Dans le cas d un chantillon positif la grippe A il n y aura un signal que uniquement dans le canal Cy5 mais pas dans le FAM 11 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 Mises en garde et pr cautions L utilisation de ce produit est limit e au personnel qualifi et form pour les techniques de PCR en temps r el et aux proc dures de diagnostic in vitro Les chantillons doivent tre manipul s comme s ils taient infectieux et ou dangereux en accord avec les proc dure de s curit en vigueur dans le laboratoire Porter des gants jetables non talqu s une blouse de laboratoire et des lu nettes de protection lors de la manipulation des chantillons Eviter l
9. e l ARN L ARN extrait est le mat riel de d part pour le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 3 0 La qualit de l ARN extrait a un impact important sur la performance de l int gralit du test Il est important de s assurer que le syst me d extraction des acides nucl iques utilis est compatible avec la technologie de RT PCR en temps r el RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 Les syst mes d extraction nucl iques et les kits suivants sont recommand s e KingFisher Flex Thermo Scientific with ExtraStar Purification altona Diagnostics e VERSANT Molecular System SP Siemens e HighPure Viral Nucleic Acid Kit Roche e QlAamp Viral RNA Mini Kit QIAGEN Si pour la pr paration des chantillons vous utilisez une colonne comportant des tampons de lavage avec de l thanol une tape de centrifugation suppl mentaire de 10 minutes environ 17000 x g 13000 rpm en utilisant un nouveau tube essai est recommand avant l lution des acides nucl iques NOTE L utilisation d ARN porteur est crucial pour l efficacit de l extraction et la stabilit de l acide nucl ique extrait L thanol est un fort inhibiteur de la PCR en temps r el Si votre syst me de pr paration de l chantillon utilise des tampons de lavage contenant de l thanol assurez vous d liminer toutes les traces d thanol avant de proc der l lution de l acide nucl ique Pour de plus amples informations ou
10. ealtonae DIAGNOSTICS altona Diagnostics GmbH M rkenstr 12 22767 Hamburg Germany phone 49 40 548 06 76 O fax 49 40 548 06 76 10 e mail info altona diagnostics com www altona diagnostics com ealtonae RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 11 2012 always a drop ahead MAN 163010 FR 01 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 Pour utilisation avec m2000rt Abbott Diagnostics Mx 3005P QPCR System Stratagene VERSANT M KPCR Molecular System AD Siemens ABI Prism 7500 SDS and 7500 Fast SDS Applied Biosystems LightCycler 480 Instrument Il Roche Rotor Gene 3000 6000 Corbett Research Rotor Gene Q5 6 plex Platform QIAGEN CFX96 Dx Real Time System BIO RAD M M Usage de diagnostic in vitro R f rence 163013 96 tests Conserver 25 C 15 C Novembre 2012 E 2 g8 altona Diagnostics GmbH M rkenstraf3e 12 D 22767 Hamburg RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 Content 1 SACS prev e a eee ea eee eee 6 2 COMPOSANTS du Kit nee cs de it ea gr Ra vw oia d dS 6 3 Conservation re 6 4 Mat riels requis non fournis ins 7 5 Informations g n rales cesses eeeeeee eene enne nnns 8 6 Description du produit lleeeeeeseeeeseee eese serene nnn nnn nnn 9 T Mises en garde et pr cautions eeeeeeeeeee nnne 12 8 Nee d empli Na rss i
11. es chantillons Si l chantillon ne doit pas tre utilis pour une culture virale des tests d antig nes et ou de pathologies l couvillon doit tre rinc pendant au moins 10 minutes dans un tampon de lyse contenant au moins 4M d un agent chaotropique comme lhydrochloride de Guanidinium ou hydrochloride ou du thyocianate de Guanidini um L efficacit et la sensibilit de cette m thode est significativement plus haute par rapport aux m thodes qui n cessitent le rin age de l couvillon avec des agents non d naturants comme le NaCl ou le PBS De plus l chantillon n est plus infectieux apr s l incubation de l couvillon dans le tampon de lyse Bow et al Virus Inactivation by Nucleic Acid Extraction Reagents In Journal of Virological Methods 119 2004 195 198 Il est bien connu que le genre d couvillon utilis pour pr lever l chantillon a un impact important sur les r sultats de diagnostic Les couvillons en alginate de calcium ou ceux avec du bois ou des parties en aluminium et ou les coton tiges sont de potentiels inhibiteurs Ils peuvent porter atteinte la PCR et dans certains cas plus graves conduire des faux n gatifs Par cons quent nous recomman dons fortement l utilisation d couvillons en plastiques et les embouts en mati res synth tiques comme le Rayon ou le Dacron L utilisation d couvillons bact ri ologique contenant un gel d agarose noir ou transparent n est pas adapt 8 2 Extraction d
12. es contaminations microbiennes et nucl aires par ADN ARN de l chantillon et des composants du kit Toujours utiliser avec les a rosols des c nes de pipettes jetables non con tamin s par l ADNase et l ARNase Toujours porter des gants de protection non talqu s lors de la manipulation des composants des kits Utiliser des aires de travail s par es les unes des autres pour i la pr para tion des chantillons ii la pr paration de la r action et iii l amplification et la d tection de l activit Le flux de travail dans le laboratoire doit tre unidi rectionnel Porter des gants dans chaque aire de travail et les changer avant d entrer dans une aire diff rente Consacrer les fournitures et le mat riel aux diff rentes aires de travail et ne pas les d placer d une aire une autre Conserver le mat riel positif oubien potentielle positif s par des autres com posants du kit Ne pas ouvrir les tubes plaques de r action apr s l amplification afin d viter les contaminations avec les amplicons Des contr les additionnels doivent tre faits en accord avec les lignes direc trices aux exigences locales ou gouvernementales ou des organismes d accr ditation Ne pas utiliser des composants au del de leur date d expiration Eliminer les chantillons et les d chets d essai selon la r glementation de s curit s locales RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 8 Mode d emploi 8 1 Pr traitement d
13. et form aux techniques de PCR en temps r el et aux proc dures de diagnostic in vitro e Le respect des Bonnes Pratiques de Laboratoire est essentiel pour assurer la performance du dosage Une attention particuli re doit tre donn e la pr paration des chantillons afin de pr server la puret des composants du kit Tous les r actifs doivent tre minutieusement suivis afin d viter les impuret s et les contaminations Le moindre r actif douteux doit tre cart e l est n cessaire de respecter les proc dures de pr l vement de l chantillon de transport et de conservation afin d assurer les performances optimales du test e Ce dosage n est pas destin tre r alis directement sur l chantillon L extraction des acides nucl iques doit avoir t r alis e au pr alable La pr sence des inhibiteurs de RT PCR peut tre une cause de faux n gatifs ou de r sultats erron s e De potentielles mutations dans les r gions du g nome de la grippe couvertes par les amorces et ou les sondes peuvent conduire de mauvais r sultats pour la d tection du virus e Comme avec tous les tests de diagnostic les r sultats du kit RealStar Influ enza S amp T RT PCR 3 0 doivent tre interpr t s en prenant en consid ration tous les sympt mes cliniques 28 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 13 Contr le de qualit D apres le syst me de management de la qualit d altona Diagnostics GmbH selon
14. ipetant Couvrir la plaque de 96 puits avec un film adh sif opaque appropri et les tubes essai avec un couvercle appropri Centrifuger les plaque de 96 puits avec un rotor microplaque pendant 30 secondes environ 1000 x g 3000 rpm Pr paration de la r action Mastermix Echantillon ou contr le Volume totale RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 9 Programmation des instruments de PCR en temps r el Pour des informations basiques concernant l installation et la programmation des diff rents instruments de PCR en temps r el merci de vous r f rer au manuel d utilisation des diff rents instruments Pour des instructions de programmation d taill es concernant l utilisation du kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 3 0 sur un instrument de PCR en temps r el sp cifique merci de contacter notre support technique 9 1 Param tres e D finir les param tres suivants Param tres Volume de r action 25 yl Taux de rampe par d faut R f rence passive None 9 2 Traceurs de fluorescence dyes e D finir les tra eurs de fluorescence dyes RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 9 3 Profil de temp rature et aquisition des dyes e D finir le profil de temp rature et l aquisition des dyes Transcription inverse D naturation Amplification Nombre cycles Aquisition Temperature 50 C Cyclique 10 Analyse des donn es 10 00 min 2 00 min 0 15 min 0 45
15. ler 480 Instrument II Roche e Rotor Gene 3000 6000 Corbett Research e Rotor Gene Q 5 6 plex Platform QIAGEN e CFX96 V Dx Real Time System BIO RAD Le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 3 0 est compos de e Deux r actifs Mastermix A et Mastermix B e Le mod le de contr le interne CI e Deux contr les positifs Contr le positif de d pistage Grippe A Contr le positif de d pistage Grippe B Contr le positif de typing H1N1nv Eau de qualit PCR RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 Les r actifs du Mastermix A et du Mastermix B contiennent tous les composants tampon enzymes amorces sondes afin de r aliser la transcription inverse la PCR par amplification et la d tection de la cible grippe humaine A grippe humaine B H1N1nv Contr le Interne dans une seule mise en place de r action Les amorces et les sondes sp cifiques utilis es pour les grippes humaines A et B et pour H1N1nv dans le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 3 0 ont t con ues par le Prof Dr Christian Drosten Institute of Virology University of Bonn Germany Les s quences de ces amorces et sondes sont list es dans le tableau suivant Table 1 Amorces et sondes utilis es pour l amplification sp cifique et la d tection des souch es des grippes humaines A et B et de H1N1nv Sequence 5 3 Matrice AGAGACTTGAAGATGTATTTGCTGGGAAGAT Sonde 1 Matrice TCCTGCAAAGACACTTTCCAGT Sonde 2 Matrice CAGGCCCCCTCAAAGC Amorc
16. min 0 15 min D tection Nom de tra eur Reporteur l ARN sp cifique Influenza A Inf A l ARN sp cifique Influenza B Inf B l ARN sp cifique H1N1nv grippe porcine Contr le interne CI 18 Quencher Pour des informations basiques concernant l analyse des donn es sur des instru ment sp cifique de PCR en temps r el merci de se r f rer au manuel concern Pour des informations d taill es concernant l analyse des donn es avec le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 3 0 sur diff rents instruments de PCR en temps r el merci de contacter notre support technique 19 10 1 Validit des tests de diagnostic RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 10 1 1 Validit des tests de diagnostic qualitatif Pour un test de diagnostic valide qualitatif les valeurs suivantes des contr les doivent tre respect s Nom du Contr le Contr le positif de la grippe A Contr le positif de la grippe B Contr le positif de H1N1nv Contr le n gatif FAM Canal de d tection NEGATIF NEGATIF POSITIF NEGATIF Cy5 Canal de d tection POSITIF NEGATIF NEGATIF NEGATIF ROX Canal de d tection NEGATIF POSITIF NEGATIF NEGATIF 10 1 2 Invalidit des tests de diagnostic qualitatif RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 10 2 Interpr tation des r sultats Nombre de chantillon JOE Canal de d tection POSITIE POSITIF POSITIF POSITIF Un tes
17. nits PFU 11 1 1 Analyse Probit e Influenza A HK 1 68 H3N2 Limite de d tection 95 LoD 0 3 PFU ml 95 CI 0 2 0 7 PFU ml e Influenza A HH 09 H1N nv Limite de d tection 95 LoD 0 7 PFU ml 95 CI 0 5 1 8 PFU ml e Influenza A Texas 91 H1N1 Limite de d tection 95 LoD 1 6 PFU 95 CI 1 1 3 8 PFU ml e Influenza B Brisbane 60 2008 Limite de d tection 95 LoD 1 1 FFU 95 96 CI 0 5 1 8 FFU ml 23 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 11 2 Sp cificit analytique 11 2 1 Souches de grippe Table 3 Souches de la grippe analys es avec le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 3 0 Souche Soustype Influenza A Anhui 07 290 Influenza A Anhui 1 105 Influenza A Bangkog 1 79 Influenza A Bangkog 80 517 Influenza A Brazil 11 78 Influenza A Brazil 83 550 Influenza A Brisbane 08 100 Influenza A Brisbane 10 2007 Influenza A Brisbane 59 2007 Influenza A England 427 88 Influenza A England 88 654 Influenza A Equine Kentucky 1 81 Influenza A Equine Kentucky 85 520 Influenza A Equine Miami 63 Influenza A Equine Miami 87 510 Influenza A Equine Newmarket 1 93 Influenza A Equine Newmarket 97 596 Influenza A Guizhou 54 89 Influenza A Guizhou 90 502 Influenza A Johannesburg 33 94 Influenza A Johannesburg 95 516 Influenza A Philipines 2 82 Influenza A Philipines 94 516 24 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 Table 3 suite Souche Soustype Influenza A Sh
18. ntenses a aa iles ii 13 8 1 Pr traitement des chantillons 19 8 2 zlmien APiu MC E PE 13 8 3 Pr paration du Mastermix ennemies e YES PR Eses EO eua ue de 15 8 4 Pr paration de la r action ES dictus sc vMc Disk tanum raus cci ums Rue neuccae 17 9 Programmation des instruments de PCR en temps r el 18 9 1 PO E A E A E 18 9 2 Tra eurs de fluorescence dyes nsssssnsssnrrrssrrrresrrrresrrrresrrrererrrenn 18 9 93 Profil de temp rature et aquisition des dyes 19 10 Analyse des donn es ceeeeeesseeeeeeeeee enne nennen nnn nnn nnn 19 10 1 Validit des tests de diagnostic eseeeeeseeeeee 20 10 1 1 Validit des tests de diagnostic qualitatif 20 10 1 2 Invalidit des tests de diagnostic qualitatif 20 10 2 Interpr tation des r sultats 21 4 11 11 1 11 1 1 11 2 11 2 1 11 2 2 11 2 3 11 3 12 13 14 15 16 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 Evaluation des performances sn Sensibilit analytique sseeeesseseeeeeeeeeennnnennnn menn Aa E Sp cificit E ae UC Souches SONDE Hee EE Substances EE Sensibilit clinique Limites et pr cautions ns nrrrrnnrrnennrenenneenennnennns Controle de qualit i ds Assistance technique si ssissenrrrenrrnernnnnnnnnns Marques d pos es et responsabilit
19. nza S amp T RT PCR Kit 3 0 e Peu importe la m thode ou le syst me utilis pour l extraction de l acide nucl ique le contr le interne ne doit pas tre ajout directement l chantillon Le CI doit toujours tre ajout au m lange chantillon tampon de lyse Le volume de CI ajouter d pend toujours et uniquement du volume d lution Il repr sente 10 du volume d lution Par exemple si l acide nucl ique va tre lu dans 60 ul de tampon d lution ou de tampon 6 yl de CI par chantillon doivent tre ajout s au m lange chantillon tampon de lyse NOTE Ne jamais ajouter le Contr le Interne directement avec l chantillon e Si le CI a t ajout pendant la phase de pr paration de l chantillon le Mastermix doit tre pr par selon le sch ma de pipetage suivant Nombre de r actions rxns Mastermix A S 60 yl Mastermix B 10 ul 120 yl Volume Mastermix 15 pl 180 pl 8 4 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 Pr paration de la r action Pipeter 15 ul de Mastermix dans chacun des puits n cessaires de la plaque 96 puit ou d un tube essai permettant les r actions optiques Ajouter 10 ul de l chantillon lu partir de l extraction d acide nucl ique ou 5 yl des contr les contr les positifs ou n gatifs Assurez vous qu il y a au moins un contr le positif et un n gatif par essai Homog n iser avec soin les chantillons et les contr les avec le Mastermix en p
20. puits de r action e Vortex e Plaques de 96 puits de r action ou tubes de r action avec le mat riel corre spondant pour leur fermeture optique e Pipettes r glables e Cones de pipettes avec filtres jetables 3 Conservation e Ecouvillons pour pr l vement d chantillon e Gants non talqu s jetables Le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 3 0 est exp di sous carboglace Les composants du kit doivent arriver congel s Si un ou plusieurs composants ne sont pas congel s au moment de la r ception ou si l un des tubes a t NOTE abim lors de la livraison contacter altona Diagnostics GmbH pour demander conseil e Tous les composants doivent tre conserv s 25 C 15 C d s la Merci de vous assurer que les instruments ont t install s livraison calibr s v rifi s et entretenus selon les instructions et les recom mandations du fabricant RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 5 Informations g n rales L Influenza commun ment appel e la grippe est une maladie infectieuse caus e par un virus ARN de la famille des Orthomyxoviridae virus de la grippe Les virus de la grippe sont caract ris s par le continuel changement de leur agent principal de surface les antig nes hemaglutinines H et les neuraminidases N d rive antig nique Ils infectent les oiseaux ainsi que les mammif res par les a rosols Les virus de la grippe humaine de type A et B causent de s rie
21. t conduire des signaux du contr le interne r duits ou absents Ceci n a aucune influence sur le r sultat du test 21 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 La souche H1N1 v apparatient la famille des virus de la grippe A N anmoins cause de la conception du dosage les chantillons positifs H1N1nv g n rent un signal positif dans le canal du FAM mais pas dans le Cy5 Pour de plus amples d tails concernant l interpr tation des r sultats merci de contacter notre support technique NOTE En d pit du fait que la souche H1N1nv appartienne au groupe du virus de la grippe A d la conception des essais les chantillons positifs au H1N1nv donneront un signa positif dans le canal FAM mais pas dans le Cy5 Les chantillons positifs la grippe saisonni re A donneront un r sultat positif dans le canal Cy5 mais pas dans le FAM 22 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 11 Evaluation des performances 11 1 Sensibilit analytique Pour valuer la sensibilit analytique des dilutions en s rie ont t effectu es sur des plaques positives quantifi es la grippe A H1N1 A H3N2 et A H1N nv Table 2 Taux de succ s des analyses pour les diff rentes souches Influenza A Influenza A Influenza A F PFU ml TT H3N2 TT Influenza B 104 Focus forming units FFU au lieu de plaque forming u
22. t de diagnostic qualitatif est invalide i si l essai na pas t r alis com Canal de d tection FAM POSITIF NEGATIF NEGATIF NEGATIF NEGATIF Canal de d tection Cy5 NEGATIF POSITIF NEGATIF NEGATIF NEGATIF Canal de d tection ROX NEGATIF NEGATIF POSITIF NEGATIF NEGATIF Canal de d tection JOE POSITIE POSITIF POSITIF POSITIF NEGATIF Interpr tation r sultats ARN sp cifique de H1N1nv d tect ARN sp cifque du grippe saisonni re d tect ARN sp cifque du grippe saisonni re B d tect Pas d ARN sp cifique de la grippe A B ou du H1N1nv d tect L chantillon ne contient pas de quantit d tectable de ces ARN sp cifiques Inhibition de la RT PCR ou chec de le r actifs R p ter le test partir de l chantillon pl tement ou ii si l une des conditions de contr le pour l un des tests de validit du test de diagnostic n est pas respect En cas de test de diagnostic invalide r p ter le test en utilisant les acides nucl iques purifi s restants ou recommencer avec l chantillon de d part 20 original ou bien pr lever et tester un nouvel chantillon La d tection du contr le interne dans le canal de d tection JOE n est pas requise pour les r sultats positifs dans le canal de d tection FAM ou dans le canal de d tection Cy5 De hautes charges en virus de la grippe dans l chantillon peuven
23. ur fluorescent et un quencher Les sondes sp cifiques aux souches saisonni res de la grippe humaine A sont marqu es avec un fluorophore qui montrent les m mes caract ristiques que le Cy5 les sondes sp cifiques aux souches saisonni res de la grippe humaine B sont marqu es avec un fluorophore ROX tandis que les sondes sp cifiques aux la pand mie actuelle du H1N1nv sont marqu es avec le fluorophore FAM La sonde sp cifique ayant pour cible le Contr le Interne CI est marqu e avec le fluorophore JOE RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 3 0 L utilisation de sondes li es des dyes distingu s permet la d tection en parall le des souches saisonni res de grippe A et B de l actuelle pand mie du H1N1nv et du contr le interne dans les canaux de d tecteur correspondants de l automate PCR en temps r el Le test se compose de trois processus dans un tube essai unique e transcription inverse de l ARN cible pour g n rer des ADNc e amplification par PCR du Contr le interne et de la cible d ADNc La d tection simultan e des amplicons par un colorant fluorescent des sondes marqu es Le Kit Realstar Influenza S amp T RT PCR 3 0 a t d velopp et valid pour tre utilis avec les automates PCR en temps r el suivants e m2000rt Abbott Diagnostics e Mx 3005P QPCR System Stratagene e VERSANT kPCR Molecular System AD Siemens e ABI Prism 7500 SDS and 7500 Fast SDS Applied Biosystems e LightCyc
24. uses infections sur tout dans les voies respiratoires avec de la fi vre de la toux comme sympt mes pr dominants Dans certains cas plus s rieux la grippe peut causer des pneumo nies qui peuvent tre fatales en particulier chez les enfants et les personnes ag es En Avril 2009 une nouvelle souche de grippe volua combinant des g nes de souches de grippe de l homme du cochon et des oiseaux Cette souche a merg au Mexique aux Etats Unis et dans d autres pays du monde entier Elle fut dans un premier temps nomm e la grippe porcine Aujourd hui ces souches sont nom m es H1N1nv Les kits d amorces sondes utilis es dans le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 3 0 pour la d tection des souches de grippe A et B sont bas es sur le g ne de la prot ine de matrice de la souche cible Les kits d amorces sondes utilis es pour la d tection de la souche de la grippe H1N1nv sont bas s sur un alignement multiple de souches connues de la grippe porcine combin es des s quences connues d isolats de la nouvelle H1N1 pand mique Le dosage a t con u pour r sister des mutations nouvelles ou venir N an moins dans le cas ou la souche en circulation voluerait et accumulerait des muta tions un kit mis jour pourrait tre requis Afin d tre capable de r agir vite aux mutations venir nous comptons fortement sur l acc s aux informations les plus r centes Cela inclut que l utilisateur du dosage reporte tous les r
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