Amersham™ ECL™ Prime Western Blotting Detection Reagent
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1. Anticorps Plage de dilution partir de 1 mg ml de solution de stockage Primaires 1 1000 1 30 000 Secondaires 1 50 000 1 200 000 Le tableau ci dessous montre les dilutions initiales sugg r es des anticorps primaires avec diff rents niveaux d affinit Type d anticorps Dilution des anticorps primaires Dilution des anticorps secondaires Anticorps primaires haute affinit 1 5000 1 50 000 Anticorps primaires affinit moyenne 1 3000 1 30 000 basse Incubation de l anticorps primaire tape Action 1 Diluer l anticorps primaire dans du PBS T ou TBS T 2 ncuber la membrane dans la solution d anticorps primaire sur un agitateur orbital pendant une 1 heure temp rature ambiante ou pendant une nuit entre 2 C et 8 C 3 Rincer bri vement la membrane avec deux changements de ampon de lavage 4 Laver la membrane 4 6 fois dans du tampon de lavage pendant 5 minutes chaque fois temp rature ambiante sur un agitateur orbital Remarque L exposition un film radiographique n cessite 6 tapes de lavage afin d viter le bruit de fond 28 9829 42 AF 01 2014 16 Incubation de l anticorps secondaire Etape Action Remarques 1 Diluer l anticorps Augmenter la production de secondaire anticorps lumi re en construisant un conjugu la HRP ou sandwich trois couches au biotinyl dans du PBS T moyen d anticorps secondaires ou2. t compl tement dissous dans le tampon e Lavage insuffisant Ajoutez des tapes de lavage suppl mentaires 28 9829 42 AF 01 2014 26 Probl mes Causes recours possibles Bruits de fond e Des concentrations trop lev es en lev s anticorps primaires et ou secondaires l optimisation est requise e Lavage insuffisant Utilisez une quantit suffisante de tampon de lavage et ajoutez des tapes de lavage suppl mentaires e Les tampons de transfert et d incubation peuvent avoir t contamin s et doivent tre remplac s Utilisez toujours des solutions fra ches e Blocage insuffisant L agent de blocage utilis n a pas t ra chement pr par a t trop dilu ou tait incompatible avec l application Le niveau de Tween utilis dans l agent de blocage n a pas t suffisant pour application ex cut e La membrane a s ch pendant une partie des incubations auvaise qualit du gel auvaise qualit des anticorps et anticorps non sp cifiques La d tection du signal par le film a fait objet d une surexposition Le niveau du signal est si lev que le film a t compl tement surcharg e Produits incompatibles 27 28 9829 42 AF 01 2014 10 Produits connexes Ce chapitre pr sente un sous ensemble de produits connexes Pour plus d informations reportez vous www gelifesciences com 10 1 quipements de transfert Produit Q
3. tape Action 1 Laisser les solutions de d tection atteindre la temp rature ambiante pendant 20 minutes M langer les solutions de d tection A luminol et B peroxyde dans un rapport de 1 1 une solution de travail Le volume final du r actif de d tection exig est 0 1 ml cm de membrane Remarque Si le r actif m lang n est pas utilis imm diatement le prot ger de la lumi re goutter le tampon de lavage en exc s de la membrane lav e et le placer avec le c t prot ine vers le haut dans un r cipient appropri ou sur une feuille de pellicule plastique ou une autre surface propre appropri e Ajouter du r actif de d tection sur la membrane et s assurer qu il la recouvre compl tement Incuber pendant 5 minutes temp rature ambiante goutter le r actif de d tection en exc s en tenant d licatement le bord de la membrane contre une serviette 18 28 9829 42 AF 01 2014 7 6 Analyse des images Deux protocoles d analyse des images sont d crits l un pour la formation d images partir de la cam ra CCD et l autre utilisant le film radiographique Cam ra CCD tape Action Remarques 1 Placer le transfert c t prot ine vers le haut sur un plateau d chantillons 2 Placer le plateau d chantillons dans le compartiment de la cam ra CCD et s lectionner la dur e d exposition et ou la fonction appropri es Le transfert peut tre plac sur un morceau de pellicul
4. cautions de s curit l est recommand de lire la fiche signal tique FS avant d utiliser le r actif de d tection Amersham ECL Prime MISE EN GARDE Substances dangereuses Lors de l utilisation de produits chimiques dangereux prendre toutes les mesures de protection appropri es comme le port de lunettes de protection et de gants r sistant aux substances utilis es Respecter les r glementations locales et ou nationales pour une exploitation s re 4 2 Stockage la r ception tous les composants doivent tre conserv s au r frig rateur entre 2 C et 8 C Le r actif de d tection Amersham ECL Prime est sensible l exposition prolong e la lumi re Toujours conserver les r actifs individuels dans les r cipients tanches la lumi re dans lesquels ils sont fournis 4 3 Expiration Les composants sont stables pendant au moins trois 3 mois lorsqu ils sont conserv s dans les conditions recommand es Voir la date d expiration sur l emballage 28 9829 42 AF 01 2014 5 Composants n cessaires 5 1 Composants de la trousse Les composants suivants sont inclus dans la trousse du r actif de d tection Amersham ECL Prime RPN2232 Solution A solution de luminol 50 ml Solution B solution de peroxyde 50 ml Suffisante pour 1 000 cm de membrane RPN2236 Solution A solution de luminol 3x50 ml Solution B solution de peroxyde 3 x 50 ml Suffisante pour 3 000 cm de memb
5. Prime est optimis pour une utilisation avec la membrane de PVDF Amersham Hybond o le rendement par rapport des substrats chimiluminescents standards est tr s rehauss mais il est galement compatible avec la membrane de nitrocellulose Amersham Protran 28 9829 42 AF 01 2014 3 Informations importantes pour l utilisateur 3 1 Utilisation pr vue Le r actif de d tection Amersham ECL Prime est destin la d tection par chimioluminescence dans le transfert Western blotting Il est r serv uniquement a des fins de recherche et ne doit pas tre utilis dans des proc dures cliniques ou des fins de diagnostic 3 2 Consignes de s curit Le pr sent manuel d utilisation contient des MISES EN GARDE concernant l utilisation s curitaire du r actif de d tection Amersham ECL Prime Voir les d finitions ci dessous Mises en garde MISE EN GARDE AN MISE EN GARDE indique une situation dangereuse qui si elle n est pas vit e pourrait provoquer des blessures mineures ou mod r es I est important de ne rien entreprendre tant que toutes les conditions indiqu es ne sont pas remplies et clairement comprises 3 3 Contr le de la qualit Le r actif de d tection Amersham ECL Prime est fabriqu conform ment notre syst me de gestion de la qualit certifi ISO 9001 et est en conformit avec les crit res d acceptation d finis pour le produit 28 9829 42 AF 01 2014 4 Manipulation 4 1 Pr
6. marques d pos es de General Electric Company Amersham ECL ECL DualVue ECL Plex Hybond Hyperfilm ImageQuant et Rainbow sont des marques d pos es de GE Sant Amersham ECL Prime est fabriqu et vendu sous licence de Cyanagen Srl et fait l objet des demandes de brevets am ricaines canadiennes et de l UE num ros US7803573 EP1962095 US7855287 EP1950207 US2012009603 A1 CA2742025 EP2405016 ainsi que d autres brevets quivalents accord s et demandes de brevets dans d autres pays Tween est une marque d pos e de ICI Americas Inc 2010 2014 General Electric Company Tous droits r serv s Edition pr c dente septembre 2010 Tous les biens et services vendus sont sous r serve des modalit s de vente de la soci t au sein de GE Sant qui les fournit Un exemplaire des pr sentes modalit s est disponible sur demande Contactez votre repr sentant GE Sant local pour obtenir les informations les plus r centes http www gelifesciences com ecl GE Sant UK Limited Amersham Place Little Chalfont Buckinghamshire HP7 9NA UK 28 9829 42 AF 01 2014 2 Description Amersham ECL Prime Western Blotting detection reagent de GE offre une haute sensibilit pour la d tection par chimioluminescence des antig nes sp cifiques immobilis s conjugu s aux anticorps marqu s de peroxydase de raifort HRP 2 1 Introduction La chimioluminescence est d finie comme l mission de lumi re produite par une r
7. meilleure sensibilit et lin arit possible il est important d optimiser le proc d et de s lectionner les produits compatibles Consid rez ce qui suit e La qualit de l chantillon et la quantit de chargement est important que l chantillon soit de bonne qualit et que des niveaux d tectables de prot ine cible soient pr sents e Membrane et blocage S lectionnez les membranes et les agents de blocage compatibles avec l chantillon et les anticorps e Anticorps primaires et secondaires Choisissez toujours des anticorps sp cifiques de haute qualit et optimisez la dilution d anticorps 11 e D tection et imagerie S lectionnez le r actif de d tection selon votre besoin d application Un capteur CCD offre une haute sensibilit et une large gamme dynamique et assure une meilleure quantification que le film radiographique Ce chapitre d crit les produits recommand s pour une utilisation avec le r actif de d tection Amersham ECL Prime 6 2 Marqueurs de poids mol culaire Des marqueurs de poids mol culaire sont utilis s pour d terminer la taille de la prot ine En outre des marqueurs pr color s permettent la confirmation du transfert et l orientation des prot ines tant donn que les bandes color es sont transf r es la membrane e Les marqueurs Amersham Rainbow sont des marqueurs multicolores pr color s pour surveiller la progression de l lect
8. 2 28 9829 42 AF 01 2014 Etape Action 2 Incuber dans une solution de blocage pendant 1 heure a temp rature ambiante avec agitation Rincer les membranes bri vement avec deux changements de tampon de lavage Couper la membrane pour mettre chaque s rie d chantillons sur une bande de membrane distincte Pr parer diff rentes solutions d anticorps primaire dans la plage d anticorps recommand e Incuber chaque bande de membrane dans une solution d anticorps pendant 1 heure a temp rature ambiante avec agitation Rincer bri vement la membrane avec deux changements de tampon de lavage Laver la membrane par mise en suspension dans du tampon de lavage et agiter pendant 5 minutes temp rature ambiante Remplacer le tampon de avage au moins 4 6 fois Diluer l anticorps secondaire en utilisant une seule concentration et incuber les membranes pendant 1 heure temp rature ambiante avec agitation Rincer les transferts dans deux changements de tampon de avage puis laver 4 6 fois dans de nouveaux changements de tampon de lavage D tecter l aide du r actif de d tection Amersham ECL Prime d crit dans D tection la page 18 du protocole La dilution d anticorps qui donne le meilleur signal au bruit de ond minimal doit tre s lectionn e 23 28 9829 42 AF 01 2014 Optimisation de l anticorps secondaire Etape Action 1 D poser des quantit s diff rentes de l chantillon de prot in
9. 29 42 AF 01 2014 30 GE Sant offices GE Sant Bio Sciences AB Bj rkgatan 30 751 84 Uppsala Sweden GE Sant Europe GmbH Munzinger Strasse 5 D 79111 Freiburg Germany GE Sant Bio Sciences Corp 800 Centennial Avenue PO Box 1327 Piscataway NJ 08855 1327 USA GE Sant Japan Corporation Sanken Bldg 3 25 1 Hyakunincho Shinjuku ku Tokyo 169 0073 Japan Pour obtenir des informations sur les personnes contacter en cas de besoin consultez le site www gelifesciences com contact GE Sant UK Limited Amersham Place Little Chalfont Buckinghamshire HP7 9NA UK http www gelifesciences com imagination l oeuvre 29 1362 48 AF 01 2014
10. Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent Livret du produit Code RPN2232 RPN2236 Table des mati res 1 2s Mentions l gales Description 2 1 Introduction 2 2 Conception et caract ristiques 2 3 Compatibilit de la membrane Informations importantes pour l utilisateur 3 1 Utilisation pr vue 3 2 Consignes de s curit 3 3 Contr le de la qualit Manipulation 41 Pr cautions de s curit 42 Conservation 4 3 Dates d expiration Composants n cessaires 5 1 Composants de la trousse 5 2 Solutions 5 3 Membrane 5 4 R actifs de blocage 5 5 R actifs d immunod tection Optimisation Western blotting 6 1 Introduction 6 2 Marqueurs de poids mol culaire 6 3 Membranes 64 Transfert 6 5 Blocage 6 6 Manuel Western blotting Protocole 7 1 Aper u du protocole D D EH kH O 0 O OO CO WOM D NNNN OAOA gt 10 7 2 13 7 4 7 5 7 6 lectrophor se et transfert Blocage Sondage des anticorps D tection Analyse des images Informations suppl mentaires 8 1 8 2 D capage et resondage des membranes D termination de la concentration optimale en anticorps Guide de d pannage Produits connexes 10 1 quipements de transfert 10 2 Amersham ECL HRP linked secondary antibodies 10 3 R actifs de d tection 15 15 15 18 19 21 21 22 25 28 28 29 30 28 9829 42 AF 01 2014 1 Mentions l gales GE imagination l oeuvre et GE monogram sont des
11. TBS T biotinyl s et de streptavidine 2 Incuber la membrane conjugu e la HRP dans la solution d anticorps secondaire pendant 1 heure emp rature ambiante sur un agitateur orbital 3 Rincer bri vement a membrane avec deux changements de ampon de lavage 4 Laver la membrane 4 L exposition un film n cessite 6 fois dans du tampon 6 tapes de lavage afin d viter de lavage pendant 5 le bruit de fond minutes chaque fois temp rature ambiante sur un agitateur orbital Si vous utilisez un anticorps secondaire conjugu la HRP passez directement D tection la page 18 Si vous utilisez un anticorps biotinyl proc dez avec le protocole d incubation de passerelle de la streptavidine qui suit 17 28 9829 42 AF 01 2014 Incubation de passerelle de la streptavidine Etape Action 1 Diluer le conjugu HRP de streptavidine ou le complexe HRP biotinyl de streptavidine dans une solution saline tampon phosphate Tween PBS T ou tris tamponn e Tween TBS T Incuber la membrane dans la solution dilu e pendant une 1 heure a temp rature ambiante sur un agitateur orbital Rincer bri vement la membrane avec deux changements de tampon de lavage Laver la membrane par mise en suspension dans du tampon de lavage en quantit suffisante pour recouvrir la membrane et agiter pendant 5 minutes temp rature ambiante Remplacer le tampon de lavage au moins 4 6 fois 7 5 D tection
12. action tapes multiples dans laquelle la peroxydase catalyse l oxydation du luminol En pr sence des activateurs et des catalyseurs chimiques l intensit de la lumi re et la dur e de l mission lumineuse sont consid rablement accrues dans un processus connu sous le nom de chimioluminescence amplifi e ECL L ECL fond es sur des anticorps secondaires conjugu s la peroxydase de raifort HRP est un proc d de d tection sensible o l mission de lumi re est proportionnelle la quantit de prot ine La r action tapes multiples est illustr e ci dessous N N peroxyde is N SN N HRP activateur N luminol radical anionique de luminol peroxyde N G Aminophthalate N O N Li mission ON de lumi re endoperoxyde du luminol 28 9829 42 AF 01 2014 2 2 Conception et caract ristiques Le r actif de d tection Amersham ECL Prime est con u pour offrir une longue dur e du signal 24 heures et une sensibilit lev e taux de l ordre du picogramme Le r sultat lumineux de forte intensit signifie que des anticorps fortement dilu s peuvent tre utilis s ce qui permet une d tection optimale l aide d une cam ra CCD par exemple les syst mes ImageQuant LAS de GE Il peut galement tre d tect en utilisant un film d autoradiographie par exemple la gamme de produits Amersham Hyperfilm 2 3 Compatibilit de la membrane Le r actif de d tection Amersham ECL
13. andes prot ines e Le transfert semi sec est plus rapide que le transfert humide et consomme moins de tampon Le transfert semi sec fonctionne bien pour la plupart des prot ines mais le transfert peut tre moins efficace pour les grosses prot ines Il a pu r duire la sensibilit des prot ines tr s peu abondantes 6 5 Blocage Apr s le transfert des prot ines la membrane doit tre mise en incubation dans une solution de blocage pour emp cher la liaison non sp cifique des anticorps ce qui peut provoquer du bruit de fond et des bandes de prot ine non sp cifiques sur le transfert L agent de blocage doit tre optimis pour obtenir les meilleurs r sultats mais il n y a aucun agent de blocage unique et optimal pour l ensemble des prot ines et anticorps GE Sant recommande les agents de blocage suivants compatibles avec Amersham ECL Amersham ECL Prime et Amersham ECL Select e Agent de blocage Amersham ECL Prime e Agent de blocage Amersham ECL e Agent de blocage BSA e Lait sec d graiss 6 6 Manuel Western blotting Davantage d aide technique de conseils et de bonnes pratiques sont disponibles dans le manuel Western Blotting Principles and Methods de GE Sant n de code 28 9998 97 28 9829 42 AF 01 2014 7 Protocole 7 1 Apercu du protocole Voici un apercu du protocole de d tection du Western blotting Gel electrophoresis Transfer Blocking Antibody probing De
14. capage et resondage des membranes L limination compl te des anticorps primaires et secondaires partir de la membrane est possible en suivant le protocole d crit ci dessous Les membranes peuvent tre d cap es et resond es plusieurs fois tape Action Remarques 1 Placer la membrane Si des conditions plus strictes dans du tampon de sont exig es l incubation peut d capage 100 mM de tre r alis e 70 C ou pendant 2 mercapto thanol 2 de SDS 62 5 mM de Tris HCI pH 6 7 et incuber 50 C pendant 30 minutes avec agitation occasionnelle une dur e plus longue 2 Laver la membrane Les membranes peuvent pendant 3 x 10 minutes tre incub es avec r actif dans du PBS T ou TBS T de d tection Amersham ECL temp rature ambiante Prime et expos es un film ou en utilisant de grands volumes de tampon de lavage La membrane peut tre utilis e imm diatement ou conserv e dans du PBS T ou TBS T entre 2 et 8 C 3 Bloquer la membrane dans une solution de blocage appropri e pendant 1 heure temp rature ambiante 4 R p ter le protocole d immunod tection au Chopitre 7 de 7 4 Sondage des anticorps 7 6 Analyse des images imag es par la cam ra CCD pour assurer l limination des anticorps 21 28 9829 42 AF 01 2014 8 2 D termination de la concentration optimale en anticorps En raison de la haute sensibilit du r actif de d tection Amersham ECL Prime l optimisation de
15. e de pr f rence une s rie de dilutions sur une membrane de PVDF ou de nitrocellulose et laisser s cher l air Sinon utiliser un dot blot ou un collecteur slot blot Cr er une s rie d chantillons pour chaque dilution ester Remarque Les membranes de PVDF doivent tre pr mouill es dans du m thanol ncuber dans une solution de blocage pendant 1 heure emp rature ambiante avec agitation ncuber dans un anticorps primaire dilu concentration optimis e pendant 1 heure temp rature ambiante avec agitation Rincer bri vement la membrane avec deux changements de tampon de lavage Laver la membrane par mise en suspension dans du tampon de lavage et agiter pendant 5 minutes temp rature ambiante Remplacer le tampon de lavage au moins 4 6 fois Couper la membrane pour mettre chaque s rie d chantillons sur une bande de membrane distincte Pr parer des solutions d anticorps secondaire diff rentes dans la plage d anticorps recommand e Incuber chaque bande de membrane dans une solution d anticorps pendant 1 heure temp rature ambiante avec agitation Rincer bri vement la membrane avec deux changements de tampon de lavage Laver la membrane par mise en suspension dans du tampon de lavage et agiter pendant 5 minutes temp rature ambiante Remplacer le tampon de lavage au moins 4 6 fois D tecter l aide du r actif de d tection Amersham ECL Prime d crit dans D tection la page 18 du pro
16. e plastique c t prot ines vers le haut pour faciliter le d placement du film sur le plateau d chantillons Utilisez la fonction d exposition automatique ou s lectionnez la dur e d exposition manuellement La dur e d exposition initiale recommand e est de 60 secondes Augmentez ou diminuez la dur e d exposition en fonction de l intensit du signal obtenu 19 28 9829 42 AF 01 2014 Film radiographique Etape Action Remarques 1 Placer le transfert c t prot ine vers le bas sur un nouveau morceau de pellicule plastique envelopper les transferts et lisser d licatement pour retirer les bulles d air 2 Placer le transfert enroul avec le c t prot ine vers le haut dans une cassette de film radiographique 3 Placer le film radiographique gamme de produits Amersham Hyperfilm sur le dessus de la membrane Fermer la cassette et activer l exposition La dur e d exposition initiale ad quate est de 1 minute 4 D velopper le film imm diatement et selon l intensit du signal obtenu estimer a dur e d exposition pour le deuxi me film 28 9829 42 AF 01 2014 Assurez vous qu il n y a pas de r actif de d tection libre dans la cassette le film ne doit pas tre mouill Cette tape doit tre effectu e dans une chambre noire en utilisant des lumi res rouges s res Ne d placez pas le film pendant qu il est expos 8 Informations suppl mentaires 8 1 D
17. ovoquer une perte de signal La croissance de bact ries inhibe le r actif 25 28 9829 42 AF 01 2014 Probl mes Causes recours possibles Signal e L efficacit du transfert peut avoir t m diocre faible e Une quantit insuffisante de prot ine a t charg e sur le gel e La concentration en anticorps primaires et secondaires pourrait tre trop faible l optimisation est requise e Mauvaise qualit et ou anticorps primaire non sp cifique e La dur e d exposition peut avoir t trop courte Signal e Une quantit excessive de prot ine a t charg e excessif sur le gel diffus o e Les concentrations en anticorps primaires evanoui et secondaires pourraient tre trop lev es ssement optimisation est requise rapide du signal Bandes e Les bandes n gatives se produisent g n ralement blanches orsque la prot ine cible est en exc s et les n gatives concentrations en anticorps sont trop lev es sur L effet est provoqu par l appauvrissement du le film substrat Chargez une quantit moindre de prot ine Diluez encore les anticorps primaires et secondaires Bruit de e Des zones du transfert peuvent avoir s ch fond pendant une partie des incubations non e Une mauvaise manipulation peut entra ner une uniforme contamination des transferts et ou des dommages tachet la membrane qui peuvent fournir un signal non sp cifique e L agent de blocage n a pas
18. rane 5 2 Solutions Les solutions obligatoires sont indiqu es ci dessous e Solution saline tamponn e au phosphate PBS pH 7 5 e Solution saline tris tamponn e TBS pH 7 6 e Tampon de dilution et de lavage PBS Tween PBS T et TBS Tween TBS T Une concentration de Tween 20 de 0 1 est appropri e pour la plupart des applications de transfert 5 3 Membrane Utiliser un protocole appropri pour s parer les prot ines par lectrophor se et les transf rer sur une membrane de PVDF ou de nitrocellulose 5 4 R actifs de blocage Les r actifs de blocage sont typiquement dilu s entre 2 et 5 v v dans du tampon PBS T ou du tampon TBS T Les r actifs de blocage suivants sont recommand s e Agent de blocage Amersham ECL Prime e Agent de blocage Amersham ECL e Lait sec d graiss e Albumine de s rum bovin BSA 28 9829 42 AF 01 2014 5 5 R actifs d immunod tection e Un anticorps primaire sp cifique la ou aux prot ines cibles e Un anticorps secondaire conjugu la HRP sp cifique l anticorps primaire Voir Amersham ECL HRP linked secondary antibodies la page 29 Diluer les anticorps dans du PBS T ou TBS T selon les recommandations dans Plages de dilution la page 16 28 9829 42 AF 01 2014 10 6 Optimisation Western blotting 6 1 Introduction Pour obtenir un r sultat optimal de Western blotting avec un rapport signal bruit lev et la
19. rophor se des prot ines 28 9829 42 AF 01 2014 confirmant l efficacit du transfert et la d termination du poids mol culaire des prot ines transf r es Les marqueurs Amersham ECL DualVue sont des marqueurs optimis s pour une utilisation avec Amersham ECL Amersham ECL Prime et Amersham ECL Select et contiennent une combinaison de marqueurs de prot ines pr color s et marqu s Ces marqueurs permettent la surveillance de I lectrophor se ce qui confirme l efficacit du transfert et la d termination du poids mol culaire des prot ines transf r es sans coloration sur du gel et la membrane ainsi que dans la d tection en chimioluminescence 6 3 Membranes e Les membranes Amersham Hybond sont de PVDF avec une grande capacit de liaison de la prot ine et une forte r sistance m canique ce qui les rend id ales pour les applications de Western 28 9829 42 AF 01 2014 12 blotting o le d capage et le resondage sont n cessaires La membrane est optimale pour une utilisation avec les r actifs de d tection Amersham ECL Prime et Amersham ECL Select e Les membranes Amersham Protran sont de nitrocellulose compatibles avec tous les substrats de Western blotting chimiluminescents Le principal avantage est le faible bruit de fond habituel 6 4 Transfert e Le transfert humide est la m thode de transfert la plus couramment utilis e Il assure un transfert efficace des petites aux gr
20. s concentrations en anticorps est recommand e afin d assurer les meilleurs r sultats En g n ral des concentrations plus faibles d anticorps primaires et secondaires sont n cessaires avec le r actif de d tection Amersham ECL Prime par rapport des substrats chimiluminescents standards Des protocoles permettant de d terminer les concentrations optimales en anticorps sont d crits ci dessous Plages de dilution Les plages de dilution suivantes sont recommand es Anticorps Plage de dilution partir de 1 mg ml de solution de stockage Primaires 1 1000 1 30 000 Secondaires 1 50 000 1 200 000 Optimisation de l anticorps primaire La m thode de transfert de t che ou dot blot est rapide et efficace pour d terminer la dilution optimale d un anticorps primaire En variante un transfert Western peut tre pr par puis d coup en plusieurs bandes I convient de noter que certains des anticorps peuvent n cessiter des tapes de blocage et de lavage alternatives celles propos es comme suit tape Action 1 D poser des quantit s diff rentes de l chantillon de prot ine de pr f rence une s rie de dilutions sur une membrane de PVDF ou de nitrocellulose et laisser s cher l air Sinon utiliser un dot blot ou un collecteur slot blot Cr er une s rie d chantillons pour chaque dilution tester Remarque Les membranes de PVDF doivent tre pr mouill es dans du m thanol 2
21. tection Image analysis 14 28 9829 42 AF 01 2014 7 2 Electrophor se et transfert Etape Action 1 Effectuer l lectrophor se et transf rer les prot ines sur une membrane appropri e selon les protocoles standards Les transferts sont de pr f rence utilis s imm diatement mais peuvent tre stock s dans du PBS T ou TBS T entre 2 C et 8 C Remarque Les membranes de Amersham Hybond PVDF doivent tre pr mouill es dans 100 de m thanol avant l quilibrage dans un tampon de transfert 7 3 Blocage tape Action 1 Incuber la membrane dans une solution de blocage appropri e dans un agitateur orbital pendant 1 heure temp rature ambiante ou pendant une nuit entre 2 C et 8 C 2 Rincer bri vement la membrane avec deux changements de tampon de lavage Remarque Pour la pr paration du tampon de lavage voir Solutions la page 9 7 4 Sondage des anticorps En raison de la sensibilit accrue du r actif de d tection Amersham ECL Prime l optimisation des concentrations en anticorps est recommand e afin d assurer les meilleurs r sultats La dilution optimale varie en fonction de l affinit et de la qualit des anticorps L optimisation de la dilution des anticorps peut tre effectu e par analyse dot blot voir D termination de la concentration optimale en anticorps la page 22 15 28 9829 42 AF 01 2014 Plages de dilution Les plages de dilution suivantes sont recommand es
22. tocole La dilution d anticorps qui donne le meilleur signal au bruit de fond minimal doit tre s lectionn e 24 28 9829 42 AF 01 2014 9 Guide de d pannage Probl mes Causes recours possibles Pas de e Quantit s non d tectables de prot ine cible signal e L anticorps primaire n est pas li la prot ine cible ce qui peut tre d une mauvaise qualit et ou un anticorps primaire non sp cifique e Une esp ce incorrecte d anticorps secondaire a t utilis e e Membrane de PVDF non pr mouill e dans du m thanol e V rifiez que l quipement de transfert fonctionne correctement et que la proc dure correcte a t suivie e V rifiez le transfert de la prot ine par coloration de la membrane et ou du gel e Confirmez l efficacit du transfert en utilisant le Rainbow marker pr color e Certaines prot ines peuvent tre affect es par les traitements requis pour l lectrophor se e Les r actifs de d tection ne fonctionnent pas correctement Pour tester l activit du r actif de d tection pr parez 1 2 ml de solution de travail de r actif de d tection dans un tube essai transparent dans une chambre noire Ajoutez 1 ul de solution d anticorps conjugu e la HRP non dilu e La solution doit imm diatement mettre une lumi re bleue visible qui s estompe au cours des prochaines minutes e Un stockage incorrect du r actif de d tection Amersham ECL Prime peut pr
23. uantit N de code Amersham Protran Supported 0 2 NC 25 feuilles 10600053 20 x 20 cm Amersham Protran Supported 0 2 NC 25 feuilles 10600099 8 x 9 cm Amersham Hybond LFP 0 2 PVDF 10 feuilles 10600060 20 x 20 cm Amersham Hybond j LFP 0 2 PVDF 8 x 9 cm ep teues uaa Amersham Hybond 0 2 p PVDF 20 x 20 cm 25 feuilles 0600057 Amersham Hybond 0 2 25 feuilles 10600101 PVDF 8 x 9 cm 28 28 9829 42 AF 01 2014 10 2 Amersham ECL HRP linked secondary antibodies Produit Quantit N de code Amersham ECL Mouse IgG Ab HRP Li rom she n ed Whole ep NA931 1ML Amersh HRP Li rom she IgG Ab n am ECL Human ed Whole ep NA933 1ML Amersh HRP Li IgG Ab n am ECL Rabbit ed Whole rom donkey NA934 1ML Amersh HRP Li fragment IgG n am ECL Mouse ed F ab rom sheep NA9310 1ML Amersh IgG HRP Lin am ECL Rabbit ed F ab fragment from donkey NA9340 1ML Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate 100 pl RPN1231 100UL 29 28 9829 42 AF 01 2014 10 3 R actifs de d tection Detection Reagent Produit Quantit N de code Amersham ECL Prime Western Blotting pour 1 000 cm RPN2232 Detection Reagent Amersham ECL Prime Western Blotting pour 3 000 cm RPN2236 28 98
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