DETECTION DE CHLAMYDIA TRACOMATIS PAR PCR
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1. Streptococcus D 11 11 0 11 0 Torulopsis glabrata 1 1 0 1 0 Trichomonas vaginalis 2 2 0 2 0 Ureaplasma urealyticum 14 14 0 14 0 tableau 4 Comparaison de l insensibilit des deux m thodes d autres organismes que C rachomatis chez des patients infect s par ces m mes organismes a spp signifie que Pesp ce n a pas t d termin e Num ro de Ponction PCR sur milieu Roche PCR sur milieu Roche 1 10 Liquide p riton al N 1 N gatif Abs 0 158 N gatif Abs 0 207 Liquide p riton al N 2 N gatif Abs 0 199 N gatif Abs 0 176 Liquide p riton al N 3 N gatif Abs 0 097 N gatif Abs 0 095 Liquide p riton al N 4 N gatif Abs 0 138 N gatif Abs 0 137 Liquide p riton al N 5 N gatif Abs 0 082 N gatif Abs 0 093 Ponction Douglas N 1 N gatif Abs 0 187 N gatif Abs 0 174 Ponction Douglas N 2 N gatif Abs 0 156 N gatif Abs 0 078 Ponction Douglas N 3 N gatif Abs 0 115 N gatif Abs 0 092 Ponction Douglas N 4 N gatif Abs 0 234 N gatif Abs 0 202 tableau 5 R sultats d Amplicor sur les chantillons de ccelioscopies ou de ponctions DISCUTION 1 Les pr l vements La moyenne d age des patients de l tude est de 33 ans soit un age de maturit2. lt 0 5 L chantillon est d clar douteux et doit tre r analys en double Alors si au moins deux des trois analyses ont une D 0 lt 0 25 l chantillon est Pr sum N gatif Si deux des trois ont une D O 45 gt 0 25 l chantillon est d clar comme Positif Cas des c lioscopies et des ponctions Douglas Comme la m thode Amplicor pour ces chantillons n est encore qu au stade de la recherche il est conseill dans la m thode d amplifier le m lange milieu de transport ensemenc Diluant chantillon une fois comme tel et une seconde fois dilu au 1 10 RESULTATS Pendant cette tude des chantillons provenant de 100 femmes et de 4 hommes ont t analys s par le kit Amplicor M C trachomatis de RDS et par Chlamyfast d I M Sur ceux ci 71 chantillons endocervicaux ou ur traux ont t recus sur le milieu de transport Amplicor L analyse en parall le par les deux techniques a t pratiqu e tableau 1 Sur les 71 chantillons aucun chlamydiae n a t trouv Les r sultats de la PCR et de la m thode ELISA sont donc quivalents PCR PCR ELISA 71 0 ELISA 0 0 tableau 1 Comparaison des r sultats obtenus par la m thode ELISA avec la m thode PCR pour les chantillons re us sur le milieu de transport Amplicor Cependant comme tous les chantillons re us ne le sont pas syst matiquement sur Amplicor
3. Chauffert O Laurent E Sednaoui P Gou zel P Goulet V et les biologistes de RENACLA 1997 Surveillance des infections C trachomatis par un r seau de laboratoires http www b3ejussien fr msp beh index _97 hthn s lectionner BEH 15 97 Chout R Vaton S Quist D Bucher R Leguyader Desprees P Sayada C 1995 Improvement of Cervical Detection in Asymptomatic Family Planning Attendees by using Amplicor Chlamydia trachomatis Assay Ce Mol Biol 41 731 736 Hatt C Ward ME Clarke IN 1988 Analysis of the entire nucleotide sequence of the cryptic plasmid of Chlamydia trachomatis serovar L1 Evidence for involvement in DNA replication Nucleic Acids Res 16 4053 4067 Khurana CM Wojack BR Weldon Linne CM Nowak JA 1994 Comparison of Amplicor PCR and Chlamydiazyme EIA for Detection of Chlamydia trachomatis in Endocervical Specimens Abstract Pr sent au congr s de PASM Las Vegas en Mai 1994 Longo MC Beringer MS Hartley JL 1990 Use of uracil DNA glycosylase to control carry over contamination in polymerase chain reactions Gene 93 125 128 Loeffelholz MJ Lewinski CA Silver SR Purohit AP Herman SA Buonagurio DA Dragon EA 1992 Detection of Chlamydia trachomatis in endocervical specimens by Polymerase Chain Reaction J Clin Microbiol 30 2847 2851 Mullis KB Faloona FA 1987 Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalysed chain reaction Methods Enzymol 155 335 350 Palmer L Falkow S 1986 A common plasmid o
4. sexuelle o les risques de contracter des maladies sexuellement transmissibles sont importants seules 8 personnes ont plus de cinquante ans La majorit des personnes tudi es ayant apparemment un probl me dans la r gion g nitale elles ont une probabilit certaine d avoir une infection due aux chlamydiaes Seules 75 des personnes pr lev es en endocervical ou ur tral Pont t sur le milieu de transport Roche conform ment au d roulement normal de la technique de RDS Cependant l exploitation du milieu 2HC a t copi e sur celle pr conis e par RDS pour les chantillons sur milieu 2SP milieu de transport test par Roche et qui donne des r sultats corrects en PCR protocole vu lors de la formation dans les locaux de Roche de plus apr s renseignements pris aupr s d International Microbio le milieu 2HC ne contient pas d inhibiteurs de la PCR et pourrait donc convenir l amplification des g nes ceci condition de le reprendre dans le milieu Roche qui va permettre l acc s l ADN en lisant les cellules 2 Les techniques La m thode Roche test e est r cente dans le monde du diagnostic en routine Elle permet l utilisation de la Polymerase Chain Reaction dans un simple laboratoire sans installation particuli re ni co teuse comme c est souvent le cas en PCR En effet la m thode d amplification de Roche Diagnostic Systems utilise dans le cas d amplification d ADN trois bases u
5. ELISA 22 0 2 0 ELISA 0 0 0 0 tableau 3 R sultats sur des chantillons re us sur le milieu 2HC ou sur Ecouvillon Donc sous r serve de l acceptation de tous les moyens de transport les r sultats globaux donnent une totale concordance des deux techniques test es avec 95 tests n gatifs et aucun de positif En parall le de Panalyse de la sensibilit celle de la sp cificit a t entreprise tableau 4 Chez 88 personnes ont t trouv s 16 organismes parasitaires et ou infectieux dont L acidophilus qui fait parti de la flore normale vaginale dans les m mes pr l vements que ceux analys s par PCR ou par la m thode ELISA Les r sultats montrent la haute sp cificit des deux techniques vis vis de C trachomatis puisqu aucun des germes r v l s par d autres techniques n a entra n de faux positifs Organismes Nombre de Patients PCR PCR ELISA ELISA Candida albicans 22 22 0 22 0 Citrobacter spp 1 1 0 1 0 Escherichia coli 14 14 0 14 0 Gardnerella vaginalis 20 20 0 20 0 Klebsiel pneumoniae 1 1 0 1 0 Lactobacillus acidophilus 64 64 0 64 0 Mycoplasma hominis 2 2 0 2 0 Proteus mirabilis 2 2 0 2 0 Staphylococcus aureus 2 2 0 2 0 Staphylococcus epidermidis 1 1 0 1 0 Staphylococcus 1 1 0 1 0 saprophyticus Streptococcus agalactiae 9 9 0 9 0
6. l tape d hybridation avec les sondes mais en plus la soude neutralise PUNG et la rend inactive L amplification de R D S cible non pas de PADN nucl aire mais de PADN plasmidique d un plasmide ctyptique de C trachomatis d environ 7500 pb commun tous les s rotypes Les deux amorces CP24 et CP27 amplifient une s quence de 207 pb localis e 195 pb en aval de l unique site de restriction de enzyme BamH1 Hatt e al 1988 Le r sultat obtenu d pend directement du nombre de plasmides dans P chantillon Celui ci varie en fonction du moment o se situe le pr l vement dans l infection si le chlamydiae a commenc se multiplier fortement ou au contraire s il a t radiqu par des antibiotiques d o des Densit s Optiques de positivit s allant de 0 25 gt 3 et varie aussi en fonction de la qualit de ce pr l vement en effet les m decins qui font les pr l vements dans leurs cabinets ne le font pas syst matiquement dans les r gles Ainsi ils r alisent souvent des pr l vements vaginaux et non endocervicaux voire endocervicaux et ur traux qui est le cas id al si cela est suffisant pour d tecter bon nombre d agents infectieux ce ne l est pas pour les chlamydiaes La PCR amplifiant de l ADN plasmidique les rares souches de chlamydiaes ayant perdu leurs plasmides ne sont pas d celables par cette m thode La technique de d tection d Amplicor est diff rente de celle utilis e par In
7. quelques PCR sur le milieu Amplicor ont t effectu es en parall le avec d autres moyens de transport comme consign dans le tableau 2 Le petit nombre de cas 6 patients test s et surtout la non r v lation de chlamydiaes ne permet pas une conclusion quand l utilisation possible de ces chantillons pour la PCR Le peu de PCR effectu es dans ce cas s explique par le prix des r actifs ceux ci tant assez lev s il a t vite d cid de privil gier de passer un grand nombre de patients plut t que peu en parall le sur plusieurs moyens de transport ce dernier cas n tant analys qu apr s avoir obtenu un positif sur l un ou l autre de ces moyens de transport PCR 2HC 2HC ECOUVILLON ECOUVILLON AMPLICOR 4 0 3 0 AMPLICOR 0 0 0 0 tableau 2 Comparaison des r sultats de PCR r alis es sur Amplicor et sur d autres pr parations d chantillons pour un m me malade Quand les chantillons ne venaient pas des laboratoires DEFRANCE ils parvenaient seulement sur le milieu 2HC ou des couvillons C est le cas de 24 patients sur lesquels des PCR ont t pratiqu es les r sultats sont retranscrits dans le tableau 3 Tous les examens tants n gatifs les r sultats sont rapprocher de ceux obtenus auparavant PCR 2HC 2HC ECOUVILLON ECOUVILLON
8. des r sultats corrects quand la technique sera install e d finitivement il sera pr f rable de ne traiter que les chantillons re us sur le milieu de transport Roche Les pr l vements sont mal faits Comme il a t dit plus haut quelques m decins r alisent encore de simples pr l vements vaginaux pour la recherche de chlamydiaes Mais la majorit des recueils ont t faits normalement m me si ils n ont pas tous t endocervicaux et ur traux l infection pouvant tre localis e plus ou moins profond ment Ilya pr sence d inhibiteurs de la PCR dans les pr l vements Ceux ci donneraient in vitablement des faux n gatifs Ce probl me a t tudi rescemment deBarbeyrac et B b ar 1997 et il en ressort qu un chantillon faussement n gatif devient g n ralement positif apr s un simple cycle de cong lation d cong lation un m me r sultat est obtenu en r alisant une dilution suppl mentaire du milieu de transport Roche Cependant au laboratoire de nombreux chantillons ont t congel s et d congel s avant traitement Parmi les inhibiteurs cit s par Roche outre le talc des gants ou les prot ines on trouve l h moglobine qui serait un qu lateur Un probl me se pose alors pour l exploitation des r sultats obtenus sur des chantillons recueillis sur des femmes en p riode de menstruation 11 des pr l vements contenaient du sang Pourtant il a t montr que ce type d chantil
9. 30 cycles de 30 secondes 95 C puis 1 minute 60 C un temps infini 72 C Hybridation la fin de amplification les amplicons sont imm diatement d natur s par 100 u 1 de Solution de D naturation Amplicor RMS 1 6 d hydroxyde de sodium dans une solution d EDTA 25 u l du m lange sont transf r s sur une microplaque rev tue d une sonde d ADN compl mentaire de la portion amplifi e et de s quence 5 Bovine Serum Albumin CATAGCACTATAGAACTCTGCAAGCC auxquels on rajoute 100 u 1 de Tampon d Hybridation solution de phosphate de sodium contenant lt 0 2 de solubilisant et lt 25 de chaotrope Le tout est incub 1 heure 37 C D tection Apr s une s rie de cing lavages on incube 100 u 1 de Conjugu Amplicor RMS avidine peroxidase de Raifort dans une solution Tris HCl pendant 15 minutes 37 C Apr s une autre s rie de lavages sont ajout s 100 u 1 de Substrat Amplicor RMS H202 et t tram thylbenzidine TMB Incubation 10 minutes l obscurit un complexe color se forme alors Puis ajout de 100 u 1 de R actif d Arr t Amplicor RMS contenant 4 9 d acide sulfurique et lecture de la densit optique dans les 10 minutes 450 nm GR sultats OD O 45 gt 0 5 L chantillon est Positif en ce qui concerne la pr sence de ADN plasmidique de Chlamydia trachomatis OD O 450 lt 0 2 L chantillon est Pr sum N gatif 0 2 lt D O
10. DETECTION DE CHLAMYDIA TRACOMATIS PAR PCR par Mathieu Pied tude r alis e en 1997 MATERIELS ET METHODES L tude repose sur examen en parall le de patients potentiellement infect s par Chlamydia trachomatis en utilisant deux techniques Chlamyfast et Amplicor Pr l vements 100 femmes et 4 hommes g s de 16 70 ans pour une moyenne d 4ge de 33 ans sont entr s dans l tude de Mars 1997 Ao t 1997 Tous ces patients ont subit des pr l vements endocervicaux ur traux coelioscopiques ou des ponctions Douglas qui ont fait l objet d une recherche syst matique de Chlamydia trachomatis Les milieux de transport ont t diff rents suivants les cas Les couvillons destin s lELISA ont directement ensemenc le milieu 2HC d International Microbio du groupe Stago Il contient des antibiotiques ampicilline cholymicine bactrine de acide glutamique et du saccharose dans un tampon phosphate Mais parfois l couvillon arrivait au laboratoire sans avoir t d charg Les pr l vements destin s la technique PCR ont voyag dans la mesure du possible dans le milieu de transport fourni par Roche Diagnostic Systems Inc Il s agit d une solution de Tris HCI contenant lt 1 de solubilisant Quand ce milieu n tait pas disponible notamment pour les pr l vements r alis s chez le praticien l tude a t faite partir des chantillons pr c dents ELISA Il a
11. ement est effectu l h pital 5 3 que lorsqu il est effectu en ville 2 2 ceci rejoint la remarque du probl me de la bonne ex cution du pr l vement En outre il ne faut pas oublier que la majorit des pr l vements viennent de patients vivant dans le Pays de Bray qui reste une r gion tr s rurale et qui est donc moins confront e globalement aux maladies sexuellement transmissibles Sp cificit En ce qui concerne la sp cificit des deux techniques les r sultats semblent encourageants En effet sur les 95 personnes pr lev es en r gion g nitale de l tude 88 taient infect es ou parasit es par un ou plusieurs des 16 germes r pertori s Pourtant ni la m thode PCR ni la m thode ELISA n a d tect ceux ci et donn des faux positifs Ceci s explique ais ment par le choix des cibles recherch es la m thode ELISA recherche l antig ne LPS sp cifique du chlamydiae tandis que la PCR cible une s quence d ADN plasmidique exclusive Chlamydia trachomatis BIBLIOGRAPHIE deBarbeyrac B B b ar C 1997 Biologie mol culaire appliqu e en bact riologie Actualit s et perspectives en biologie praticienne Dans Feuillets de biologie Vol XXXVIII N 214 pp 53 61 deBarbeyrac B Pellet I Dutilh B B b ar C Dumon B G niaux M B b ar Ch 1994 Evaluation of the Amplicor Chlamydia trachomatis test versus culture in genital samples in various prevalence population Genitourin Med 70 162 166
12. f Chlamydia trachomatis Plasmid 16 52 63 Peterson EM DelaMaza LM 1988 Restriction endonuclease analysis of DNA from Chlamydia trachomatis biovars J Clin Microbiol 26 625 629 Quenin P 1992 Chlamydia Dans Manuel de Bact riologie Clinique Edit par Freney J Renaud F Hansen W Bollet C Elsevier Paris Vol 2 pp 1183 1203 Ridgway GL Taylor Robinson D 1991 Current problems in microbiology 1 chlamydial infections which laboratory test J Cn Pathol 44 1 5 Skulnick M Chua R Simor AE Low DE Khosid HE Fraser S Lyons E Legere EA Kitching DA 1994 Use of the Polymerase Chain Reaction for the Detection of Chlamydia trachomatis from Endocervical and Urine Specimens in an Asymptomatic Low Prevalence Population of Women Diagn Microbiol Infect Dis 20 195 201 Thompson SE Washington AE 1983 Epidemiology of sexually transmitted Chlamydia trachomatis infections Epidiol Rev 5 96 123 Veringa EM Zuyderwijk MAM Schellekens H 1994 Detection of Chlamydia trachomatis in clinical specimens Comparison of culture direct antigen detection DNA probe hybridisation and PCR J Microbiol Methods 19 117 125
13. lons donne des r sultats de densit s optiques comparables aux autres chantillons notamment en ce qui concerne les positifs Loeffelholz ef a l 1992 Il n y a pas de chlamydiaes dans la r gion dans laquelle se d roule l tude C est le seul point contre lequel on ne puisse rien C est cette derni re hypoth se qui semble la plus probable ainsi que le d montre un rapport d un r seau de laboratoires d analyses de biologie m dicale le r seau RENACLA R seau national des chlamydiae Chauffert et al 1997 Ce r seau est constitu de 65 laboratoires priv s et de 26 laboratoires hospitaliers Les r sultats sont significatifs entre 1990 et 1995 il est observ une diminution de 45 du nombre d identifications de C frachomatis dans le m me temps le nombre de recherches n a baiss que de 9 En conclusion le taux de recherches positives a chut de 4 9 2 9 pendant ces 5 ann es Cette baisse est constat e galement dans toute l Europe de l ouest et les Etats Unis alors que les techniques de d tection n ont fait que progresser On peut expliquer ces r sultats par une prise de conscience de la population dans Putilisation des pr servatifs et une meilleure prise en charge des malades De plus les laboratoires hospitaliers identifient plus de cas en moyenne que les laboratoires priv s 29 d tections par an contre 15 et le taux de pr l vements positifs est plus lev quand le pr l v
14. niversellement rencontr es dans les acides nucl iques ad nine guanine cytosine plus Puracile qui elle n est retrouv e normalement que dans les ARN Ainsi dans l ADN amplifi les d soxythymidines triphosphates dTTP sont remplac es par des d soxyuridines triphosphates dUTP L utilisation de ces 4 bases ainsi que celle de PUracyl N Glycosylase permet de supprimer la plupart des faux positifs dans les r sultats Longo ef al 1990 En effet PUNG a la particularit de reconna tre sp cifiquement l ADN uracil provenant d amplifications ant rieures et de le lyser en laissant intact PADN natif qui seul sera amplifi Cela ma trise en grande partie la diss mination des amplicons pouvant contaminer des chantillons sains puisque PUNG inactive jusqu 10 copies d ADN amplifi de Chlamydia trachomatis source Manuel d Utilisation du test Amplicor M C rachomatis Cette inactivation se d roule juste avant l amplification pendant 2 minutes 50 C temp rature pour une action optimale de PUNG Le cycle d amplification se termine 72 C pendant un temps infini pour que la temp rature ne rechute pas 50 C et du coup pour que les produits de l amplification ne soient pas d truits avant d avoir t analys s C est pour r soudre ce probl me que la soude est utilis e imm diatement apr s la sortie des tubes du thermocycleur non seulement la soude deshybride les ADN bicat naires et les pr pare donc
15. outes les analyses r alis es par le kit Chlamyfast d I M donnent des r sultats n gatifs l exploitation des r sultats est facile puisque soit le r sultat est n gatif pas de coloration soit le r sultat est positif coloration rouge franche Pour la m thode de RDS c est plus d licat En effet tout chantillon dont la densit optique est comprise entre 0 2 et 0 5 est d clar douteux Ceci tant arriv par 4 fois des tests en double ont t faits tous les r sultats sont devenus n gatifs passant tr s souvent sous la barri re de 0 2 Donc pour la suite de l tude les repassages en double n ont t effectu s que sur des chantillons qui d passaient la barre de 0 25 unit d absorbance il a t montr par ailleurs que la zone d incertitude pouvait tre estim e une fourchette entre 0 5 et 0 8 A Skulnick e7 4 1994 Ceci est arriv deux fois mais par deux fois les chantillons se sont av r s n gatifs Ce semblant de positivit devait tre du des contaminations ponctuelles Dans toute l tude aucun Chlamydiae n a t d cel Si cela corrobore bien avec les r sultats obtenus avant le d but du stage avec Chlamyfast il y va autrement des r sultats de la PCR par rapport aux r sultats de beaucoup de publications Ainsi sans aller jusqu aux 25 44 de pr valence retrouv s dans une tude r alis e il y 5 ans aux Etats Unis Loeffelholz ef al 1992 o la maladie est t
16. r s r pandue de nombreuses tudes r centes montrent un taux de pr valence qui varie de 3 5 Khurana ef al 1994 11 Chout e al 1995 en passant par 6 7 Veringa ef al 1994 ou 8 2 deBarbeyrac e al 1994 A partir de cette constatation plusieurs hypoth ses peuvent tre mises La manipulation de la technique Amplicor est mal faite Cependant tous les t moins ayant donn des r sultats corrects le probl me ne vient ni de amplification ni de la d tection La partie concernant la pr paration des chantillons consiste en une simple dilution de P chantillon et ne pr sente aucune difficult De plus cela n expliquerait pas qu on ne trouve pas de positivit avec Chlamyfast Les diff rents moyens de transports autres que celui de Roche ne conviennent pas Ainsi l tude porterait simplement sur 71 tests et non plus sur 95 L hypoth se est int ressante surtout que comme aucun chantillon positif n a t trouv aucune v ritable comparaison entre les milieux n a t faite Cependant m me si les chlamydiaes sont laiss s trop longtemps sur un couvillon st rile la mort de ceux ci ne devrait pas entra ner de probl mes court terme Pour le milieu 2HC c est encore plus simple car dans ce milieu les chlamydiaes sont maintenus en vie pendant 24 heures soit un temps largement n cessaire pour reprendre le tout dans le milieu de transport Roche N anmoins par soucis de rendre
17. sport Roche La proc dure est ensuite la m me que pr c demment Fi le pr l vement a t transport sur un couvillon sans milieu de transport L couvillon est d charg le plus rapidement possible dans le Milieu de Transport Roche et trait comme pr c demment Amplification 50 u l de P chantillon trait sont plac s dans un tube PCR contenant 50 u 1 du milieu r actionnel Amplicor RMS contenant lt lt 0 001 de d soxyribonucl otides triphosphates dATP dCTP dGTP et dUTP la place des dTTP lt lt 0 001 d amorces biotinyl es CP24 5 biotine GGGATTCCTGTAACAACAAGTCAGG et CP27 5 biotine CCTCTTCCCCAGAACAATAAGAACAC qui s hybrident un plasmide cryptique de Chlamydia trachomatis La s quence cible de ce couple d amorces mesure 207 pb Palmer et Falkow 1986 Peterson et DelaMaza 1988 lt lt 0 01 d AmpliTaq Taq polym rase AmpliTaq est une marque d pos e de RMS exploit e sous licence par RDS lt 1 d EDTA KCI Tout ceci dans une solution Tris HCl contenant 20 de glyc rol dans lequel on a rajout de l Uracile N Glycosylase UNG Longo ef al 1990 raison de 100 u 1 pour 1 5 ml L amplification s effectue dans un thermocycleur GenAmp PCR System de Perkin Elmer Norwalk Conn Il s agit d une amplification utilisant des cycles de deux phases dont le d roulement est le suivant 2 minutes 50 C 4 minutes 30 a 95 C
18. t r alis par le kit Chlamyfast R f rences 11060 11006 d International Microbio du groupe Stago Il s agit d une technique du type enzyme linked immunosorbent assay ELISA comprenant trois phases 1 Extraction enzymatique de l antig ne LPS lipopolysaccharide de Chlamydia trachomatis et son immobilisation sur une membrane filtrante 1 Fixation de Panticorps monoclonal de souris anti LPS coupl la peroxydase 1 R v lation de l immun complexe form gr ce un substrat chromog ne la positivit se voit par une coloration rouge du filtre qui est initialement blanc Test Amplicor de Roche Diagnostic Systems Amplicor est une marque de Roche Molecular Systems Inc RMS exploit e sous licence par Roche Diagnostic Systems Inc RDS Il s organise en trois phases amplification Mullis et Faloona 1987 hybridation et d tection colorim trique Il s agit d une alliance entre une technique PCR et d une enzyme oligoassay Pr paration des pr l vements CSi le milieu Roche a t ensemenc Le milieu de transport d un volume de 1 ml est repris dans 1 ml de Diluant d Echantillons Amplicor RMS Solution Tris HCl contenant 6mM de MgCl 2 gt 10 de d tergent et 0 05 d azide de sodium Le tout est vort x et mit incuber 10 minutes temp rature ambiante MSi le milieu ensemenc est le milieu 2HC 100 u 1 d chantillon sont repris dans 900 u 1 de Milieu de Tran
19. ternational Microbio Dans cette derni re ce sont des prot ines que l on recherche on applique alors une m thode ELISA avec des anticorps monoclonaux Mais ici astuce de Roche consiste lier l extr mit 5 des deux primer de la biotine qui une extr me affinit avec Pavidine Cette avidine li e avec la peroxydase de Raifort constitue le conjugu qui donnera un substrat color par l action coordonn e de la t tram thylbenzydine et du peroxyde d hydrog ne T moins Le test Amplicor M incorpore l analyse de t moins positifs et n gatifs en parall le avec Pexploitation des chantillons pr lev s sur les malades Le t moin positif contient de l ADN non infectieux du plasmide cibl et le t moin n gatif est constitu d ADN non sp cifique Cela permet de v rifier que amplification et la d tection se sont bien d roul es puisque ces t moins ont des valeurs cibles d absorbance De plus on peut visualiser en partie les contaminations le t moin n gatif donnant alors un r sultat positif Cependant rien ne permet de dire si les chantillons ont t correctement pr lev s et pr par s Pour I M le contr le positif se fait par ajout d antig ne LPS puis du conjugu immunoglobuline G anti LPS coupl la peroxydase puis du substrat Le contr le n gatif est pratiquement identique seul immunoglobuline G ne reconnaissant pas l antig ne LPS 3 Les r sultats Sensibilit T
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