GenoType® PST® Extraction et Amplification de l`ADN
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1. HAIN LIFESCIENCE GenoType PST Extraction et Amplification de l ADN du Cluster de G nes de l Interleukine 1 Humaine Introduction Ce protocole d crit la proc dure d amplification multiplex de fragments des g nes humains IL 1A et IL 1B La PCR est couverte par des brevets d tenus par la soci t Hoffmann La Roche Aucune autorisation licence implicite ou explicite pour la pratique de la PCR ni aucune autre m thode utilisant la PCR ne sont couvertes en cas d acquisition de cette trousse Les informations sur l obtention d une licence pour la pratique de la PCR ou sur d autres m thodes utilisant la PCR peuvent tre obtenues en contactant F Hoffmann La Roche AG CH 4002 Basel Conservation et Pr cautions D s r ception conserver le m lange Amorces Nucl otides PNM ainsi que l ADN de contr le HCD 2 8 C et isol s de toute source d ADN potentiellement con taminante Si la dur e de conservation doit exc der 4 semaines conserver 20 C Il est recommand d aliquoter le m lange PN afin d viter les cong lations d con g lations r p t es Ne pas utiliser les r actifs au del de leur date de p remption Tous les chantillons doivent tre consid r s comme potentiellement infectieux et tre manipul s comme tel Observer les pr cautions usuelles pour la pr paration de l amplification IL est essentiel que le mat riel et les r actifs utilis s pour l ex traction de l ADN et pour la pr para2. pour contr ler la sensibilit optimale pour chacun des loci test s une zone Contr le Sp cificit pour contr ler l absence de r sultats faux po sitifs Proc dure Pr paration Pr chauffer bain marie agitateur TwinCubator exactement 45 C 1 C Pr chauffer les solutions HYB et STR 37 45 C avant utilisation Les r actifs ne doivent pr senter aucun pr cipit noter cependant que la solution CON D est opaque Si besoin agiter Equilibrer les autres r actifs l exception de les solu tions CON C et SUB C temp rature ambiante Dans un tube appropri diluer le Conjugu Concentr CON C orange et le Substrat Concentr SUB C jaune au 1 100 dans un volume ad quat du tampon correspondant CON C avec CON D SUB C avec SUB D Bien homog n iser et quilibrer temp rature ambiante Pour chaque chantillon test ajouter 10 pl de concentr 1 ml de tampon Diluer CON C avant chaque utilisation Une fois dilu SUB C reste stable pendant 4 se maines conserv temp rature ambiante et l obscurit 1 D poser 20 pl de Solution de D naturation DEN bleu une extr mit de chaque puit utilis 2 Ajouter 20 pl d chantillon amplifi et m langer les deux solutions par pipetages r p t s Incuber 5 minutes temp rature ambiante Pendant ce temps l aide d une pince sortir du tube le nombre appropri de bandelettes STRIPS et inscrire au crayon leur num ro d identi
3. venir le d veloppement de bandes dues des r actions d hybridation crois es arr ter la r action chromog nique d s que les premi res lignes color es de viennent visibles Contamination des puits voisins par des claboussures lors de l addition du So lution d Hybridation Coloration non homog ne Les bandelettes n ont pas t suffisamment immerg es lors des diff rentes in cubations Le portoir n a pas t correctement agit Bruit de fond important CON C et ou SUB C trop concentr Les tapes de lavage n ont pas t correctement effectu es Les solutions de lavage taient trop froides lors de leur utilisation Composition du Kit Quantit Bandelettes sensibilis es avec les sondes sp cifiques STRIPS 12 M lange PN PNM contient amorces sp cifiques des loci test s nucl otides colorant 0 5 ml ADN Contr le HCD pr t l emploi contient 5 20 ng l d ADN humain 0 025 ml Solution de D naturation DEN pr t l emploi contient lt 2 NaOH colorant 0 3 ml Solution d Hybridation HYB pr t l emploi contient 8 10 de d tergent anionique colorant 20 ml Solution de Lavage Stringent STR pr t l emploi contient gt 25 d un sel d ammonium quaternaire lt 1 d tergent anionique colorant 20 ml Solution de Rin age RIN pr t l emploi Milieu tamponn lt 1 NaCl lt 1 de d tergent anionique 50 ml Conjugu Concentr CON C concentr contient de la p
4. immobilis es sur la membrane lavage stringent et enfin addition d un conjugu streptavidine phosphatase alca line suivie d une r v lation chromog nique Les signaux obtenus sont facilement et rapidement interpr t s l aide d une matrice fournie avec chaque trousse Pr cautions Tous les chantillons doivent tre consid r s comme potentiellement infectieux et tre manipul s comme tel Les chantillons pr lev s sur des patients risques doivent tre identifi s et manipul s dans des conditions de s curit ad quates Suivre les recommandations f d rale nationale locale d hygi ne de s curit et d environment Se prot ger l aide de v tements ad quats et de gants Lors de la manipulation du kit tenir compte des indications de s curit suivantes La Solution de D naturation DEN contient du NaOH lt 2 et est irritante pour la peau et Les yeux R36 38 et S26 S37 39 S45 Le Substrat Concentr SUB C contient Dimethyl Sulfoxide et est irritante R36 37 38 S23 26 36 Pour des informations suppl mentaires consulter les fiches de s curit Contr le de Qualit Afin de contr ler le bon d roulement du test et le bon fonctionnement des r actifs chaque bandelette comporte quatre zones de contr le une zone Contr le Conjugu pour contr ler la fixation du conjugu sur la ban delette et Le bon d roulement de la r v lation chromog nique deux zones Contr le Sensibilit
5. N polym rase thermostable se r f rer au manuel non fourni y d eau niveau de puret pour Biologie Mol culaire qsp 45 pl hors volume de l enzyme non fourni Ajouter 5 pl de solution d ADN 20 100 ng d ADN pour atteindre un volume final de 50 ul hors volume de l enzyme 1 Selon le syst me tampon enzyme utilis la concentration optimale de MgCl peut varier de 1 5 2 5 mM A noter que certains tampons contiennent d j le MgCL D terminer le nombre d chantillons amplifier nombre d chantillons analyser contr les La solution d ADN amplifier est remplac e par 5 pl d eau contr le n gatif ou par 5 pl d ADN contr le HCD contr le positif L ADN de contr le est de type sauvage pour les deux loci examin s La solution d ADN de contr le doit tre consid r e comme potentiellement infectieuse Pr parer une solution m re de m lange r actionnel contenant tous les r actifs l exception de l ADN et bien homo g n iser ne pas vortexer Si le thermocycleur ne poss de pas de couvercle chauffant recouvrir les chan tillons d huile min rale Profil d amplification 5min 95 C 1 cycle 30sec 95 C 2min 58 C ne 25 sec 95 C 40 sec 53 C 20 cycles 40 sec 70 C 8 min 70 C 1 cycle 2 La dur e de cette tape doit tre rallong e en cas d utilisation d ADN polym rase de type hot start se r f rer au manuel de l enzymel Selon le thermocycleur ut
6. d veloppe parall lement dans la zone IL 1B C3953 Les diff rents profils de r sultats et leur interpr tation pour les deux loci test s ainsi que le niveau de risque PST sont r sum s dans Les tableaux ci dessous 1 2131415167 819 Contr le Conjugu x xx x x xx x x Contr le Sp cificit Contr le Sensibilit IL 1A 889 XX IX x x x x x IL 1A C889 all le 1 x x x x x x IL 1A 889T all le 2 x x x x x Contr le Sensibilit IL 1B 3953 x x XX x x x x IL 1B C3953 all le 1 x x x x x IL 1B 3953T all le 2 xixixixi xx IL 1A 889 IL 1B 3953 GenoType PST 1 all le 1 all le 1 n gatif 2 all le 1 all le 2 all le 1 n gatif 3 all le 2 all le 1 n gatif 4 all le 1 all le 1 all le 2 n gatif 5 all le 1 all le 2 all le 1 all le 2 positif 6 all le 2 all le 1 all le 2 positif 7 all le 1 all le 2 n gatif 8 all le 1 all le 2 all le 2 positif 9 all le 2 all le 2 positif Tous les chantillons portant au moins une copie de l all le 2 au niveau des 2 loci est s sont consid r s comme positif pour le GenoType PST L intensit d un signal positif doit tre comparaple l intensit du contr le sensi bilit correspondant Les r sultats restent interpr table m me lorsque la bande de contr le de sp cificit pr sente une faible co
7. fication dans l espace situ sous la ligne de rep re Toujours porter des gants pour manipuler les bandelettes 3 Ajouter dans chaque puit 1 ml de Tampon d Hybridation HYB vert pr chauff et homog n is Homog n iser jusqu ce que Le m lange devienne une couleur homog ne Eviter les claboussures vers les autres puits 4 D poser une bandelette dans chaque puit utilis Les bandelettes doivent tre enti rement recouvertes par le liquide avec la face sensibilis e identifiable par la ligne de rep re tourn e vers le haut Les ban homozygote pour cet all le une ligne color e se d veloppe uniquement dans cette zone Lorsque le patient est porteur d une mutation h t rozygote une ligne color e se d veloppe parall lement dans la zone IL 1A C889 Contr le Sensibilit IL 1B 3953 Sens IL 1B Une ligne color e doit se d velopper dans cette zone indiquant que le test pr sente une sensibilit optimale IL 1B C3953 Le d veloppement d une ligne color e dans cette zone indique la pr sence de l all le 1 C en position 3953 du g ne IL 1B IL 1B 3953T Le d veloppement d une ligne color e dans cette zone indique la pr sence de l all le 2 T en position 3953 du g ne IL 1B Lorsque le patient est porteur d une mutation homozygote pour cet all le une ligne color e se d veloppe uniquement dans cette zone Lorsque le patient est porteur d une mutation h t rozygote une ligne color e se
8. hosphatase alcaline conjugu la streptavidine colorant 0 2 ml Tampon Conjugu CON D Milieu tamponn 1 agent bloquant lt 1 NaCl 20 ml Substrat Concentr SUB C concentr contient Dimethyl Sulfoxide compos chromog nique 0 2 ml Tampon Substrat SUB D Milieu tamponn lt 1 NaCl lt 1 MgCl 20 ml manuel d utilisation portoir matrice feuille de lecture 1 de chaque Mat riel Requis mais Non Fourni Bain marie agitateur TwinCubator Gants usage unique Chronom tre Papier absorbant Eau distill e Pincettes Embouts de pipettes Pipettes r glables pour 10 20 200 de pr f rence st riles avec filtre et 1000 pl Eprouvette Plateau agitateur Thermom tre calibr Donn es Techniques Echantillon requis sang total pr lev sur EDTA ou citrate de so dium pr l vement buccal 20 ul de solution d ADN amplifi par chantillon approximativement 2 heures 2 8 C pour conserver gt 4 semaines le m lange PN et l ADN Contr le doivent tre con serv s 20 C Volume n cessaire Dur e du test Conservation Art No 5001 12 tests Fabricant Hain Lifescience GmbH Hardwiesenstrafie 1 72147 Nehren Allemagne http www hain lifescience de 2 LOT in vitro pre HAIN LIFESCIENCE Packungsbeilage lesen consult operating instructions Consulter le manuel d utilisation Chargennummer batch code Num ro de lot Positivkontrolle posit
9. ilis le profil d amplification peut demander des modi fications contacter votre distributeur Les produits de l amplification peuvent tre conserv s 4 ou 20 C La r action d amplification peut tre contr l e par lectrophor se en gel d agarose 2 en d posant directement 5 ul de chaque chantillon sans aucun tampon addi tionnel Les amplicons ont une taille de 187 pb g ne IL 1A et de 192 pb g ne IL 1B Fabricant Hain Lifescience GmbH Hardwiesenstrafie 1 72147 Nehren Allemagne http www hain lifescience de HAIN LIFESCIENGCE GenoType PST Test d Analyse G n tique pour la D tection Combin e des Polymorphismes IL 1A 889 et IL 1B 3953 du Cluster du G ne de l Interleukine 1 Principe Le test GenoType PST est bas sur la technologie DNA STRIP qui permet la caract risation combin e des polymorphismes en position 889 du g ne humain interleukine IL 1A et en position 3953 du g ne humain IL 1B La proc dure com pl te comporte trois phases extraction de l ADN partir d chantillons de patients mat riel requis pour l extraction de l ADN non fourni une amplification multiplex l aide d amorces biotinyl es ADN polym rase thermostable non fournie et d tection de l ADN amplifi par hybridation inverse Cette derni re phase comporte les tapes suivantes d naturation chimique de l ADN amplifi hybridation des amplicons simples brins biotinyl s aux sondes pr
10. ive control Contr le positif Temperaturbereich temperature limitation Limite de temp rature Haltbar bis use by A utiliser avant Bestellnummer catalogue number R f rence Nur f r den in vitro Gebrauch for in vitro use only Pour usage n vitro uniquement
11. l de Substrat dilu voir ci dessus dans chaque puit et incuber sans agitation l obscurit Le temps de r v lation peut varier en fonction des conditions de d roulement du test de 3 20 minutes notamment de la temp rature de la pi ce Des temps de r v lation trop longs peuvent entrainer un bruit de fond qui peut g ner l inter pr tation des r sultats 13 Arr ter la r action en rincant bri vement deux fois l eau distill e 14 A l aide de pincettes r cup rer Les bandelettes et les s cher entre deux cou ches de papier absorbant Lecture et Interpr tation des R sultats Classer et ranger les bandelettes l abri de la lumi re Une feuille de lecture est fournie avec le kit mais peut galement tre t l charg e l adresse suivante http www hain lifescience de pdf pst_evaluation pdf La matrice fournie avec la trousse permet d identifier chaque zone r actionnelle par superposition Chaque bandelette comprend 8 zones r actionnelles voir figure re Contr le Conjugu CC ms Contr le Sp cificit Spec C D Contr le Sensibilit IL 1A 889 Sens IL 1A sl IL 1A C889 sa IL 1A 889T aos Contr le Sensibilit IL 1B 3953 Sens IL 1B es IL 1B C3953 no IL 1B 3953T Contr le Conjugu CC Une ligne color e doit se d velopper dans cette zone Cette ligne t moigne de la bonne fixation du conjugu et d
12. loration N anmoins les bandes pr sentant une intensit comparable celle de la bande de contr le de sp cificit doivent tre consid r es non sp cifiques Limitations En vue de l amplification l ADN doit avoir t extrait l aide d une m thode appro pri e L ADN cible doit avoir t correctement amplifi Causes d Erreurs R sultats faibles ou absence de signal incluant la zone de contr le conjugu Temp rature ambiante trop basse ou r actifs mal quilibr s CON C et ou SUB C trop dilu ou CON D et ou SUB D utilis sans dilution pr alable R sultats faibles ou absence de signal except dans la zone de contr le conjugu La qualit et ou la quantit de l ADN extrait n ont pas permis une amplification correcte Analyser l ADN amplifi sur un gel agarose 2 Si aucun amplicon n est visible r p ter les tapes d extraction et d amplification Essayer ventuellement une autre m thode d extraction de l ADN se reporter au manuel Extraction et Amplification du Cluster de G ne de l Interleukine 1 Humaine Temp rature d incubation trop lev e Signaux faux positifs delettes mal orient es doivent tre remises en position l aide de pincettes pro pres Afin d viter toute contamination bien nettoyer les pincettes apr s chaque utilisation Cella vaut aussi pour tous Les tapes suivantes 5 Placer la plaque dans bain marie agitateur TwinCubator et incuber 30 minu te
13. s 45 C Pour le bain marie agitateur s lectionner une fr quence d agitation suffisante pour assurer un bon brassage de tampon Ajuster Le niveau de l eau dans le bain marie agitateur mi hauteur des puits de fa on assurer un bon transfert de chaleur Cela vaut aussi pour tous les tapes suivantes 6 Aspirer le contenu des puits Utiliser par exemple une pipette pasteur reli e une pompe vide 7 Ajouter chaque puit 1 ml de Solution de Lavage Stringent STR rouge et incuber 15 minutes 45 C dans bain marie agitateur TwinCubator 8 A partir de cette tape travailler temp rature ambiante Eliminer la Solution de Lavage Stringent Vider la Solution de Lavage Stringent dans un container d chets Eliminer tout le liquide r siduel en retournant les puits sur du papier absorbant effectuer de m me pour les autres tapes de lavage 9 Laver chaque puit avec 1 ml de Solution de Rincage RIN et incuber pendant une minute sous agitation Vider la Solution de Rincage 10 Ajouter chaque puit 1 ml de Conjugu dilu voir ci dessus et incuber sous agitation 30 minutes 11 Vider le contenu des puits et rincer sous agitation 1 minute l aide de 1 ml de Solution de Rin age RIN Vider RIN R p ter ce rin age une nouvelle fois puis rincer une fois avec environ 1 ml d eau distill e l aide d une pissette Bien liminer toute trace d eau dans les puits apr s cette derni re tape 12 Ajouter 1 m
14. suffisante pour l amplification 1 Placer l couvillon buccal dans un tube de 1 5 ml et couper la tige environ 1 5 cm de la t te de l couvillon la tige doit emerger de la solution durant l tape 2 2 Ajouter 200 ul de NaOH 50 mM chaque chantillon et vortexer au moins 30 secondes 3 Incuber 5 minutes 95 C 4 Vortexer 15 secondes et centrifuger 1 seconde R cuperer l couvillon l aide de pincettes Presser la t te de l couvillon contre les parois du tube pour en ex traire tout le liquide 5 Ajouter 20 ul de tampon Tris 1M pH 8 0 6 Vortexer bri vement et centrifuger 1 minute en pleine vitesse dans une centri fugeuse de paillase 7 Transf rer le surnageant dans un tube propre et tiquett 8 Utiliser 5 pl pour la PCR Un protocole d taill peut tre obtenu chez votre distributeur ou l adresse internet http www hain lifescience de pdf dnaisol_swabs pdf Pr paration de La PCR Pr parer le m lange r actionnel 45 ul dans une pi ce exempte d ADN L chan tillon d ADN doit tre rajout dans une pi ce s par e Il est recommand d utiliser une ADN polym rase de type hot start Si cette enzyme n est pas utilis e r aliser toutes Les op rations de pipetage sur de la glace Pr parer Le m lange suivant par tube 35 pl de m lange Amorces Nucl otides PNM 5 pl de tampon d incubation de la polym rase 10x non fourni x pl de MgCL non fourni 1 2 unit s d AD
15. tion de la PCR soient exempts de DNases Ne pas m langer les r actifs provenant de diff rents lots de trousses Mat riel Requis mais Non Fourni ADN polym rase thermostable avec tampon enzyme de type hot start recom mand e taux d extension 2 4 kb min 72 C demi vie 10 min 97 C 60 min 94 C rendement d amplification gt 105 Bloc chauffant pr cision 1 C Centrifugeuse de paillasse Eau niveau de puret pour Biologie Mol culaire Embouts de pipettes st riles avec filtre Gants usage unique Huile min rale niveau de puret pour Biologie Mol culaire pour thermocycleur sans couvercle chauffant Kit pour l extraction de l ADN et r actifs associ s Micro tubes pour extraction de l ADN 1 5 ml et tubes pour thermocycleur ex empt de contamination par DNase et RNase Pipettes r glables pour 10 20 200 et 1000 pl Thermocycleur taux de chauffage 3 C sec taux de refroidissement 2 C sec pr cision 0 2 C Extraction de l ADN L ADN doit tre extrait partir de sang pr lev en tube EDTA citrate ou partir de pr l vements buccaux L espace de travail doit tre exempt de toute trace d ADN amplifi Toutes les proc dures d extraction de l ADN produisant de l ADN ampli fiable peuvent tre employ es Lorsque les pr l vements buccaux sont utilis s comme mat riel de d part le protocole rapide ci apr s permet de r cup rer une quantit d ADN
16. u bon d roulement de la r v lation Contr le Sp cificit Spec C Aucune ligne color e ne doit se d velopper dans cette zone Le d veloppement d une ligne color e de forte intensit t moigne de conditions r actionnelles suboptimales par exemple temp rature trop basse durant l tape de lavage stringent et indique une r action non sp cifique Dans ce cas r p ter Le test Contr le Sensibilit IL 1A 889 Sens IL 1A Une ligne color e doit se d velopper dans cette zone indiquant que le test pr sente une sensibilit optimale IL 1A C889 Le d veloppement d une ligne color e dans cette zone indique la pr sence de l all le 1 C en position 889 du g ne IL 1A IL 1A 889T Le d veloppement d une ligne color e dans cette zone indique la pr sence de l all le 2 T en position 889 du g ne IL 1A Lorsque le patient est porteur d une mutation Temp rature d incubation basse Tampon d Hybridation et ou Solution de Lavage Stringent incorrectement qui libr s ou homog n is s Contamination de l ADN extrait et ou des r actifs d amplification avec de l ADN pr c demment extrait ou amplifi Lorsque les r actifs d amplification sont con tamin s un chantillon de contr le n gatif entra ne galement le d veloppe ment des lignes tests Dans certaines conditions de test une forte concentration d ADN amplifi peut entra ner une r action chromog nique tr s rapide En pareil cas afin de pr
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