KBBL™ Seven H11 Agar Slants With Aspartic Acid and Sodium
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1. BD BBL Seven H11 Agar Slants CE with Aspartic Acid and Sodium Pyruvate L007501 Rev 07 Octobre 2006 PROCEDURES DE CONTROLE DE QUALITE I INTRODUCTION La Seven H11 Agar est un milieu servant l isolement et la culture des mycobact ries L acide aspartique et le pyruvate de sodium incorpor s favorisent la croissance bact rienne et la production de niacine I MODE OPERATOIRE DU TEST A Pr paration des inoculums 1 A l aide d couvillons st riles ensemencer des g loses inclin es Lowenstein Jensen avec des cultures m res des souches de mycobact ries concern es 2 Incuber les tubes avec les bouchons desserr s a 35 2 C en atmosph re a robie enrichie en dioxyde de carbone jusqu a obtention d une croissance bact rienne importante habituellement en 2 a 3 semaines 3 R colter les colonies l aide d un couvillon bout vif en veillant ne pas emporter de milieu de culture avec les cellules a Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177 1 2 3 4 5 6 7 Transf rer les colonies dans 5 0 mL de bouillon Middlebrook 7H9 Broth with Glycerol dans un tube de verre bouchon vis st rile contenant des billes de verre st riles Homog n iser la suspension l agitateur vortex pendant plusieurs min jusqu disparition des agr gats de grande taille Comparer la turbidit de cette suspension celle d un standard de turbidit McFarland n 1 La suspension obte2. 50 100 colonies au minimum la production de niacine est test e l aide de bandelettes r actives Taxo TB Niacin Test Strips Une coloration jaune dans le bouillon extrait indique un r sultat positif de M tuberculosis M intracellulare donne un r sultat n gatif le bouillon demeure incolore XIII CONDITIONNEMENT N r f Description 221958 BBL Seven H11 Agar Slants with Aspartic Acid and Sodium Pyruvate coffret de 10 tubes de tailles A LO07501 5 Fran ais XIV REFERENCES 1 Middlebrook G and M L Cohn 1958 Bacteriology of tuberculosis laboratory methods Am J Public Health 48 844 853 2 Middlebrook G M L Cohn W E Dye W B Russell Jr and D Levy 1960 Microbiologic procedures of value in tuberculosis Acta Tuberc Scand 38 66 81 3 Cohn M L R F Waggoner and J K McClatchy 1968 The 7H11 medium for the cultivation of mycobacteria Am Rev Resp Dis 98 295 296 4 Kent P T and G P Kubica 1985 Public health mycobacteriology a guide for the level III laboratory USDHHS Centers for Disease Control Atlanta 5 National Committee for Clinical Laboratory Standards 2001 Approved Guideline M29 A2 Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections 2nd ed NCCLS Wayne Pa 6 Garner J S 1996 Hospital Infection Control Practices Advisory Committee U S Department of Health and Human Services Centers for Disease Control and Prevention Guideline for
3. isolation precautions in hospitals Infect Control Hospital Epidemiol 17 53 80 7 U S Department of Health and Human Services 1999 Biosafety in microbiological and biomedical laboratories HHS Publication CDC 4th ed U S Government Printing Office Washington D C 8 Directive 2000 54 EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work seventh individual directive within the meaning of Article 16 1 of Directive 89 391 EEC Official Journal L262 17 10 2000 p 0021 0045 9 Cernoch P L R K Enns M A Saubolle and R J Wallace Jr 1994 Cumitech 16A Laboratory diagnosis of the mycobacterioses Coordinating ed A S Weissfeld American Society for Microbiology Washington D C 10 Forbes B A D F Sahm and A S Weissfeld 2002 Bailey amp Scott s diagnostic microbiology 11th ed Mosby Inc St Louis 11 Metchock B G F S Nolte and R J Wallace Jr 1999 Mycobacterium p 399 437 In P R Murray E J Baron M A Pfaller F C Tenover and R H Yolken ed Manual of clinical microbiology 7th ed American Society for Microbiology Washington D C 12 Lutz B 1992 Identification tests for mycobacteria Part 6 Niacin accumulation p 3 12 11 3 12 14 In H D Isenberg ed Clinical microbiology procedures handbook vol 1 American Society for Microbiology Washington D C ud Becton Dickinson and Company eclr
4. r le important dans le m tabolisme des mycobact ries Le r le principal de l albumine est de prot ger le bacille tuberculeux des agents toxiques et par cons quent de favoriser sa mise en vidence sur les milieux d isolement primaire Le vert malachite inhibe partiellement la croissance des bact ries Le pyruvate de sodium est un facteur de croissance L acide aspartique est incorpor pour favoriser la production de niacine Toutes les mycobact ries produisent de l acide nicotinique niacine En raison du blocage d une voie m tabolique de conversion de la niacine libre en mononucl otide d acide nicotinique M tuberculosis accumule la niacine et l excr te dans le milieu de culture une caract ristique qui le distingue de la plupart des autres mycobact ries REACTIFS Seven H11 Agar with Aspartic Acid and Sodium Pyruvate Formule approximative par litre d eau purifi e Digestion pancr atique de cas ine ccccceeeeeeees 1 0 Sulfate de magn sium 0 05 Citrate d ammonium ferrique 0 04 Citrate de SOGIUM mmnnnnnnnnrnnrnrrrrrrnnrrnnrnnnnsnsennennennnns 0 4 Sulfate d ammonium 0 5 Glutamate monosodique 0 5 Phosphate disodique Eu Fo Phosphate monopotassique Acide aspartique 0 1 0 Pyruvate de sodium cc cceeceeeteceeeeceeeceeeeeeeereaeeeeeeeaes 5 0 G IOSE rss 13 5 Chlorure de sod
5. 0 01 mL M thode de test du milieu Ensemencer des chantillons repr sentatifs avec les cultures r pertori es ci dessous a S assurer que les surfaces de la g lose sont exemptes d humidit avant de les ensemencer b A l aide d ensemenceurs anse calibr e de 0 01 mL st riles jetables ensemencer les tubes avec les cultures de mycobact ries pr par es comme ci dessus c Incuber les tubes avec les bouchons desserr s 35 2 C en atmosph re a robie enrichie en dioxyde de carbone Examiner les tubes apr s 7 14 et le cas ch ant 21 jours pour valuer la croissance bact rienne et valuer les r actions Une culture doit comporter au moins 50 100 colonies pour qu un test de la niacine donne les r sultats escompt s Test de la niacine a Ajouter 1 0 mL de bouillon Middlebrook 7H9 Broth avec polysorbate 80 la g lose de culture inclin e b Perforer en plusieurs points la surface de la g lose inclin e afin de mettre le liquide au contact du milieu La niacine ventuellement pr sente est extraite du milieu et non des colonies c Incliner les tubes de sorte que le bouillon couvre la g lose inclin e Laisser l extraction se poursuivre pendant 30 min d Pr lever environ 0 6 mL d extrait et le d poser dans un tube de 12 x 75 mm Ajouter 0 6 mL de bouillon Middlebrook 7H9 avec polysorbate 80 a un autre tube de 12 x 75 mm comme contr le n gatif Ajouter 0 6 mL de bouillon un autre tube de 1
6. 2 x 75 mm ainsi qu un disque Taxo TB Niacin Test Control comme contr le positif e A chacun des tubes ci dessus ajouter une bandelette r active Taxo TB Niacin Test Strip Boucher herm tiquement le tube imm diatement apr s avoir ajout la bandelette car l oxyg ne influe sur les r sultats f Patienter 12 15 min sans d passer 30 min puis examiner le bouillon dans chaque tube L apparition d une coloration jaune indique un test de la niacine positif L absence de coloration indique un test n gatif R sultats attendus Mycobacterium tuberculosis Positif coloration jaune H37Ra ATCC 25177 Mycobacterium intracellulare N gatif aucun changement de couleur Groupe III ATCC 13950 Souche de microorganisme recommand e pour le contr le de qualit par l utilisateur Ili CONTROLE DE QUALITE SUPPLEMENTAIRE 1 2 3 Examiner les tubes comme d crit a la rubrique D t rioration du produit Inspecter visuellement des tubes repr sentatifs pour s assurer qu aucun d faut physique ne peut interf rer avec leur utilisation Incuber des tubes repr sentatifs non ensemenc s entre 20 et 25 C et 30 et 35 C et les examiner apr s 7 jours pour d celer une contamination microbienne ventuelle INFORMATIONS PRODUIT IV APPLICATION La Seven H11 Agar with Aspartic Acid and Sodium Pyruvate g lose Seven H11 avec acide aspartique et pyruvate de sodium sert l isolement et l identification des mycobact ries non chr
7. act ries non chromog nes voir Il B 3 ci dessus seules les souches non chromog nes d aspect rugueux doivent tre test es pour la production de niacine La culture doit tre g e de 3 4 semaines et compter au moins 50 100 colonies M tuberculosis et M simiae plus rare donnent habituellement un r sultat positif au test de production de niacine La plupart des autres mycobact ries donnent un r sultat n gatif ce test LIMITES DE LA PROCEDURE Certaines souches de M simiae du BCG et d autres mycobact ries accumulent galement la niacine Il est recommand d effectuer un test de r duction des nitrates et un test de la catalase 68 C pour confirmer l identit de M tuberculosis CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES Les caract ristiques de performances de tous les lots de Seven H11 Agar Slants with Aspartic Acid and Sodium Pyruvate sont test es en usine A l aide d un ensemenceur anse calibr e de 0 01 mL des chantillons repr sentatifs du lot sont ensemenc s par striage avec des cultures de Mycobacterium intracellulare Group III ATCC 13950 and M tuberculosis ATCC 25177 dilu es 10 unit s formant colonies UFC par mL Les tubes ensemenc s sont incub s bouchons desserr s 35 2 C en atmosph re enrichie de 5 10 de dioxyde de carbone Les tubes sont examin s apr s 7 14 et 21 jours d incubation pour appr cier la croissance bact rienne Lorsque la croissance obtenue est suffisante
8. ant environ 10 min jusqu disparition des agr gats de grande taille dans la suspension Ajouter 15 mL de Mycobacterium Diluent st rile et bien m langer Comparer la turbidit de cette suspension celle d un standard de turbidit McFarland n 1 La suspension obtenue doit pr senter une turbidit sup rieure celle du standard Laisser reposer le tube dans un portoir pendant 2 3 h temp rature ambiante pour faire s dimenter les particules de grande taille Aspirer le surnageant et le transf rer dans un r cipient st rile La suspension obtenue doit pr senter une turbidit sup rieure celle du standard McFarland n 1 sans 1 Fran ais particules de grande taille S il reste de telles particules m langer et laisser reposer pendant encore 1 h Transf rer le surnageant dans un r cipient st rile 8 Ajouter lentement du Mycobacterium Diluent st rile pour ajuster la turbidit de la suspension celle du standard McFarland n 1 Bien agiter 9 Aliquoter la suspension dans des flacons supportant la cong lation Reporter l identit du microorganisme et la date de pr paration sur l tiquette 10 Congeler les flacons 60 C Les suspensions se conservent jusqu 6 mois 11 Pour d congeler la suspension placer le flacon congel au bain marie entre 30 et 35 C Diluer 10 UFC mL avant l emploi Bien m langer et ensemencer par striage le milieu de test l aide d un ensemenceur anse calibr e de
9. duit Ne pas utiliser les tubes s ils pr sentent des signes de contamination microbienne d coloration ou dessiccation ou d autres signes de d t rioration Vill PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS Diff rents couvillons et r cipients ont t con us pour recueillir les chantillons Pr lever les chantillons avant l administration d agents antimicrobiens Veiller les transmettre sans d lai au laboratoire Consulter les publications cit es en r f rence pour plus d informations METHODE Mat riaux fournis Seven H11 Agar Slants with Aspartic Acid and Sodium Pyruvate Mat riaux requis mais non fournis Milieux de culture auxiliaires r actifs souches de contr le de qualit et mat riel de laboratoire requis Mode op ratoire du test Respecter les techniques d asepsie Le mode op ratoire du test est celui recommand par le CDC U S Centers for Disease Control and Prevention pour r aliser un isolement primaire partir d chantillons contenant des mycobact ries La N ac tyl L cyst ine hydroxyde de sodium NALC NaOH est l agent recommand pour obtenir une digestion et une d contamination douces mais efficaces Ces r actifs sont fournis dans la trousse de d contamination digestion d chantillons BBL MycoPrep Pour plus d informations sur la m thode de d contamination et de culture consulter les publications cit es en r f rence Incuber les tubes ensemenc s en atmosph re a robie enric
10. eP BENEX Limited 7 Loveton Circle Bay K 1a d Shannon Industrial Estate Sparks Maryland 21152 USA Shannon County Clare Ireland 800 638 8663 Tel 353 61 47 29 20 Fax 353 61 47 25 46 ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD BD Logo BBL MycoPrep and Taxo are trademarks of Becton Dickinson and Company 2006 BD L007501 6 Francais
11. es et tester les cultures sous une hotte biologique de s curit AU CONTACT D UN ACIDE LE BROMURE DE CYANOGENE DEGAGE DU CYANURE TOXIQUE JETER LES TESTS DE LA NIACINE DANS UNE SOLUTION GERMICIDE RENDUE ALCALINE PAR AJOUT DE SOUDE Dissoudre 5 g de bromure de cyanog ne dans 50 0 mL d eau purifi e Conserver dans un flacon en verre teint bien bouch entre 2 et 8 C Si un pr cipit se forme cette temp rature porter temp rature ambiante pour le dissoudre Pr parer de petites quantit s car le r actif est volatile et perd de sa r activit Les solutions faiblement r actives risquent de donner de faux n gatifs La bandelette r active BBL Taxo TB Niacin Test Strip est pr f rable des r actifs de test pr par s au laboratoire bandelettes r actives r f 231741 contr le Taxo TB Niacin Test Control r f 231735 Suivre le mode d emploi correspondant Contr le de qualit par l utilisateur Voir Proc dures de contr le de qualit Effectuer les contr les de qualit conform ment aux r glementations nationales et ou internationales aux exigences des organismes d homologation concern s et aux proc dures de contr le de qualit en vigueur dans l tablissement Il est recommand l utilisateur de consulter les directives CLSI et la r glementation CLIA concern es pour plus d informations sur les modalit s de contr le de qualit RESULTATS Tester la production de niacine par toutes les mycob
12. hie en dioxyde de carbone en les maintenant l abri de la lumi re Incuber 35 2 C Ensemencer les milieux en g loses inclin es sur un plan horizontal et laisser l inoculum s absorber Desserrer les bouchons vis des tubes pendant les 3 premi res semaines d incubation pour permettre une circulation du dioxyde de carbone et la mise en route de la culture Visser ensuite les bouchons pour viter la d shydratation les desserrer bri vement une fois par semaine Incuber les tubes verticalement si l espace est limit REMARQUE Si l on suspecte la pr sence de M marinum ou M ulcerans dans des chantillons provenant de l sions cutan es l isolement primaire doit s effectuer par incubation des cultures L007501 4 Francais XI XI une temp rature comprise entre 25 et 33 C dans le cas de M avium ou M xenopi la temp rature id ale d incubation est de 40 42 C Incuber un double de la culture entre 35 et 37 C Pr paration des r actifs du test de la niacine 1 Pr paration de l aniline 4 Ajouter 4 0 mL d aniline incolore 96 mL d alcool thylique 95 Conserver dans un flacon en verre teint entre 2 et 8 C Si la solution vire au jaune la jeter et en pr parer une nouvelle 2 Pr paration du bromure de cyanog ne 10 ATTENTION Les vapeurs de bromure de cyanog ne sont tr s irritantes et extr mement toxiques pr parer la solution sous une hotte de captation des vapeurs chimiqu
13. ium 0 85 Dextrose wii 2 0 ul MwnNnnaaennaeaanaaeana Albumine bovine V Catalase is back nee ees RS PY PIG OXIM EEE A scenic sense nine tete sens sente Sulfate de zinc z Sulfate de cUlivre s nonan neede araa aaia BIOtiNE ein apa a aea SE mit nasale Chlorure de calcium Vert malachite seinere reni d i aaa E SEET Acide ol igue ea aran nodes Ea EE A GIye ro l ea nine Se Sa E ESAE Ajust e et ou compl ment e en fonction des crit res de performances impos s Avertissements et pr cautions R serv au diagnostic in vitro Ouvrir avec pr caution les tubes troitement bouch s pour ne pas risquer d tre bless par un bris de verre Des microorganismes pathog nes notamment les virus de l h patite et de l immunod ficience humaine sont susceptibles d tre pr sents dans les chantillons cliniques Respecter les Pr cautions standard et les consignes en vigueur dans l tablissement pour manipuler tout L007501 3 Fran ais objet contamin avec du sang ou d autres liquides organiques Apr s utilisation st riliser l autoclave les tubes pr par s les r cipients ayant contenu des chantillons et tout autre mat riel contamin avant de les liminer Les manipulations non susceptibles de produire des a rosols d chantillons cliniques comme la pr paration de frottis acido r sistants n cessitent des pratiques et des m thodes de s curit biologique de nivea
14. nue doit pr senter une turbidit sup rieure celle du standard Laisser reposer le tube dans un portoir pendant 2 3 h temp rature ambiante pour faire s dimenter les particules de grande taille Transf rer le surnageant dans un r cipient st rile Ajouter lentement du Middlebrook 7H9 Broth with Glycerol st rile pour ajuster la turbidit de la suspension celle du standard McFarland n 1 Bien agiter Diluer 10 UFC mL avant l emploi Bien m langer et ensemencer par striage le milieu de test l aide d un ensemenceur anse calibr e de 0 01 mL b Autres souches de mycobact ries 1 2 3 4 5 6 7 L007501 Transf rer les colonies pr lev es dans un tube a centrifuger a bouchon a vis de 50 mL contenant 8 a 12 billes de verre st riles 2 mm de diam tre et 5 mL de diluant Mycobacterium Diluent pr par comme suit M langer les ingr dients suivants dans une fiole de 1 L et ajuster le pH 6 7 a 7 0 avec de la soude 1 N Albumine bovine sans acide gras 1 09 Polysorbate 80 0 1 mL Eau purifi e 500 mL St riliser par filtration sur membrane porosit de 0 2 micron Distribuer en conditions aseptiques 5 5 mL de solution dans des tubes bouchon vis st riles A l aide d un couvillon mulsifier les colonies de mycobact ries sur la paroi d un tube centrifuger bouchon vis M langer les colonies avec le diluant Boucher le tube et m langer l agitateur vortex pend
15. omog nes notamment Mycobacterium tuberculosis LO07501 2 Fran ais VI VII RESUME ET EXPLICATION Middlebrook et Cohn ont am lior la formulation de la g lose base d acide ol ique et d albumine et obtenu une croissance plus rapide et plus abondante de Mycobacterium sp sur leur milieu appel 7H10 Cohn et al ont modifi la formulation de la g lose 7H10 en y incorporant 1 g de produits de digestion pancr atique de cas ine par litre afin de favoriser la croissance des souches de Mycobacterium tuberculosis qui pr sentaient une croissance faible ou nulle sur 7H10 et d autres milieux d isolement conventionnels Cette formulation est appel e Seven H11 Agar L acide aspartique ajout am liore le taux de production de la niacine tandis que le pyruvate de sodium favorise la croissance PRINCIPES DE LA METHODE La grande vari t de sels inorganiques pr sents dans la Seven H11 Agar apporte des substances indispensables la croissance des mycobact ries Converti en acide citrique le citrate de sodium sert maintenir certains cations inorganiques en solution Le glyc rol est une source abondante de carbone et d nergie Les produits de digestion pancr atique de cas ine sont une source abondante d azote n cessaire la croissance du bacille tuberculeux et apportent plusieurs autres facteurs de croissance L acide ol ique ainsi que d autres acides gras longue cha ne assimilables par le bacille tuberculeux jouent un
16. u 2 ainsi que les installations et le mat riel de confinement correspondants Toutes les manipulations susceptibles de produire des a rosols doivent tre effectu es sous hotte biologique de s curit de classe ou II Les activit s de laboratoire impliquant la propagation et la manipulation de cultures de M tuberculosis et M bovis n cessitent des pratiques de s curit biologique de niveau 3 ainsi que les installations et le mat riel de confinement correspondants Les tudes chez l animal n cessitent galement des proc dures particuli res Les m thodes de laboratoire impliquant des mycobact ries n cessitent un quipement et des techniques particuli res afin de minimiser les risques microbiologiques Voir Pr paration du bromure de cyanog ne 10 tape 2 la rubrique Mode op ratoire du test Pr paration des r actifs du test de la niacine pour conna tre les pr cautions compl mentaires Instructions pour la conservation D s r ception conserver les tubes dans l obscurit une temp rature de 2 8 C Ne pas les congeler ni les surchauffer Ne pas ouvrir pr matur ment Maintenir l abri de la lumi re Conserv s comme indiqu sur l tiquette les milieux en tube peuvent tre ensemenc s jusqu la date de p remption et incub s pendant les dur es d incubation recommand es Laisser le milieu s quilibrer temp rature ambiante avant de l ensemencer D t rioration du pro
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