Système de test ANA HEp-2
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1. Plusieurs de ces patients avec un soi disant lupus ryth mateux ANA n gatifs pr senteront un r sultat d immunofluorescence ANA positifs sur un substrat de cellules HEp 2 contenant l antig ne SSA Ro 20 Les anticorps anti SSA Ro peuvent tre pr sents en l absence d ANA classiques avec un LES observ chez des personnes ayant une d ficience g n tique en C4 et parfois aussi d autres d ficiences compl mentaires 21 22 En outre cette d ficience en C4 peut tre associ e une sensibilit accrue au d veloppement de LES apr s un traitement base d hydralazine Si ces patients sont des femmes elles pr sentent un risque lev d avoir des enfants ayant un bloc cardiaque cong nital ou souffrant de dermatite lupique 26 M me si le niveau d ANA n est pas en corr lation avec le d veloppement clinique de l tat d une maladie auto immune particuli re 6 les divers motifs de marquage nucl aire peuvent tre associ s des tats de maladie sp cifiques 3 16 et 28 31 Le tableau suivant r sume les divers auto anticorps mentionn s ci dessus pouvant tre associ s des maladies Tableau 1 Anticorps tat de la maladie Fr quence relative de d tection d anticorps Anti Jo 1 Myosite 25 44 18 Anti Sm LES 30 Anti RNP Syndrome de chevauchement MCTD LES 100 et gt 40 respectivement Anti SSA Ro LES syndrome de Sj gren 15 et 30 402. jour le 10 30 2014 2 Motif d appareil de Golgi Le motif d appareil de Golgi se caract rise par un marquage cytoplasmique positif se concentrant sur un c t de la r gion p rinucl aire Sa signification clinique est incertaine mais des rapports publi s sugg rent une association avec le LES et le syndrome de Sj gren 3 Motif lysosomien Le motif lysosomien se pr 4sente sous forme d un petit nombre de taches espac es observ es dans le cytoplasme Ce motif peut tre observ dans le cytoplasme de cellules en interphase et de cellules mitotiques La signification clinique est inconnue 4 Motif ribosomien Le motif ribosomien se pr sente g n ralement avec plusieurs taches cytoplasmiques et une plus grande concentration autour du noyau Il se distingue du motif mitochondrial par des taches plus petites d un densit plus grande La signification de ce motif est inconnue 5 Motif cytosquelettique Le motif cytosquelettique se caract rise par une toile d araign e distinctive ou par une apparence fibreuse dans l ensemble de la cellule On a signal qu il pouvait tre associ un d sordre auto immune du foie anticorps anti muscle lisse ANA n gatif Un auto anticorps de SSA Ro est fr quemment pr sent dans un sous ensemble clinique de lupus appel lupus ryth mateux syst mique cutan LESC Plusieurs patients souffrant de LESC ont t faussement diagnostiqu s comme ayant un lupus ANA n gatifs
3. t observ chez des patients souffrant de SSP 4 Motif d antig ne nucl aire cellulaire prolif rant ANCP Le motif d antig ne nucl aire cellulaire prolif rant est observ sous forme de taches nucl aires fines ou grosses dans 30 60 des cellules en interphase avec un marquage n gatif de la r gion chromosomique des celles mitotiques Le motif ANCP est tr s caract ristique des patients souffrant de LES et n a pas t d tect chez des patients souffrant d autres maladies de tissus conjonctifs Il a t signal que des patients souffrant de LES ayant un motif ANCP pr sente un taux plus lev de glomerulon phrite diffuse 5 Membrane antinucl aire strate nucl aire Le motif de membrane antinucl aire se pr sente sous forme de couronne autour du noyau et ressemble au motif en couronne sauf que le stade des chromosomes en m taphase est n gatif Cet anticorps doit tre signal car il est associ de fa on reconnue un d sordre auto immune du foie Motifs cytoplasmiques 1 Motif mitochondrial AMA Ce motif se pr sente g n ralement avec plusieurs taches cytoplasmiques et une plus grande concentration autour du noyau Ce motif peut tre observ chez des cellules en interphase et chez des cellules mitotiques La signification clinique du motif AMA est principalement une association avec une cirrhose biliaire primaire particuli rement si le motif AMA est titre lev Syst me de test ANA HEp 2 1 Mis
4. Syst me de test ANA HEp 2 IVD z us IFA pii c A Product of ZEUS Scientific UTILISATION PR VUE Le syst me de test ZEUS IFA ANA HEp 2 est un essai pr standardis de d tection qualitative et semi quantitative de d tection d anticorps antinucl aires Ce test a pour but d aider diagnostiquer les cas de LES lupus ryth mateux syst mique et diff rencier les autres d sordres semblable de tissus conjonctifs Il a t con u pour un usage diagnostique in vitro SIGNIFICATION ET CONTEXTE L immunofluorescence indirecte est couramment utilis e pour d tecter la pr sence d anticorps antinucl aires ANA en anglais dans le s rum sanguin de patients souffrant de lupus ryth mateux syst mique LES et d autres d sordres des tissus conjonctifs cliniquement semblables 1 5 En outre les ANA sont associ s divers syndromes de lupus induits par l usage de m dicaments 6 7 qui reproduisent cliniquement une forme spontan e de LES L immunofluorescence indirecte a t adapt e aux tests de d tection d ANA par plusieurs chercheurs 8 9 selon les m thodes fondamentales originalement d crites par Coons 10 Les ANA sont principalement compos s d anticorps IgG mais des ANA IgA et IgM peuvent galement tre d tect s 11 II est maintenant reconnu que plusieurs sources de mat riel nucl aire peuvent tre utilis es comme substrat pour des tests d ANA M me si la plupart des recherches originales sur des A
5. respectivement Anti SSB La LES syndrome de Sj gren 15 et 60 70 respectivement Anti Scl 70 scl rose syst mique 20 28 Hautement sp cifique Hautement sp cifique lorsque pr sent seul en titre lev PRINCIPE DU TEST Le syst me de test ZEUS IFA ANA HEp 2 a t con u pour la d tection d anticorps antinucl aires ANA en anglais circulant dans un chantillon de s rum sanguin humain L analyse utilise un substrat de culture cellulaire et de l immunoglobuline de ch vre antihumaine ajust e pour un usage optimal sans marquage d arri re plan non sp cifique La r action se fait en deux temps 1 Dans un premier temps d incubation de l chantillon l ANA pr sent dans l chantillon du patient peut coller au substrat cellulaire formant un complexe antig ne anticorps Les autres composants s riques sont subs quemment lav s 2 Dans un deuxi me temps d incubation du conjugu l immunoglobuline antihumaine marqu e avec du FITC peut r agir avec le l immunoglobuline humaine ayant adh r e au substrat durant l incubation de l chantillon Cette r action formera un complexe antig ne anticorps conjugu stable l endroit o l anticorps initial du patient a adh r au substrat cellulaire Le surplus de conjugu est subs quemment lav Les r sultats de l analyse peuvent tre visualis s avec un microscope fluorescent correctement quip Toute r action positive sera d tect e par un marquage fluor
6. viter les faux r sultats positifs b L intensit de la fluorescence observ e peut varier selon le microscope et le syst me de filtre utilis c Le marquage non nucl aire du substrat cellulaire utilis peut tre observ sur certains s rums humains INTERPR TATION DES R SULTATS 1 L interpr tation des r sultats d pend du motif observ du titre de l anticorps et de l ge du patient Les personnes g es particuli rement les femmes sont sujettes au d veloppement d anticorps titrage faible lt 1 80 en l absence de maladie auto immune clinique Par contre un titre 1 20 d un motif significatif d auto anticorps chez une personne jeune peut sugg rer qu une maladie explicite se manifestera plus tard L exp rience sugg re qu une dilution 1 40 constitue un bon taux de dilution pour la d tection d ANA Des r sultats positifs titre faible peuvent survenir chez des personnes apparemment saines Par cons quent les r sultats d ANA doivent toujours tre interpr t s selon l ensemble des informations cliniques du patient 2 Untitre inf rieur 1 40 est consid r n gatif Syst me de test ANA HEp 2 4 Mis jour le 10 30 2014 3 Test positif Une r action positive correspond la pr sence d un motif de marquage nucl aire vert pomme observ avec une dilution de 1 40 bas sur une chelle d intensit de marquage de 1 4 1 correspond une r action faible et 4 une r action forte
7. Handling and Processing of Blood Specimens NCCLS Document H18 A Vol 10 No 12 Approved Guideline 1990 32 Beck JS Lancet 1 1203 1961 33 Sharp GC Irvin WS Tan EM et al Am J Med 52 48 1972 Syst me de test ANA HEp 2 5 Mis jour le 10 30 2014 34 Burnham TK Neblett TR Fine G Am J Clin Path 50 683 1968 35 Textbook of Immunopathology Vol Il P Miescher and HJ Muller Eberhard Eds Glune amp Stratton NY 1969 36 Wittingham S Irvin J Mackay IR et al Aust Ann Med 18 130 1969 37 U S Department of Labor Occupational Safety and Health Administration Occupational Exposure to Bloodborne Pathogens Final Rule Fed Register 56 64175 64182 1991 38 Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens for Common Laboratory Tests Approved Guidelines 4 Edition 2010 CLSI Document GP44 A4 ISBN 1 56238 724 3 Clinical and Laboratory Standards Institute 950 West Valley Road Suite 2500 Wayne PA 19087 gt ZEUS Scientific sl ZEUS Scientific Inc 200 Evans Way Branchburg New Jersey 08876 USA Toll Free U S 1 800 286 2111 Option 2 International 1 908 526 3744 Fax 1 908 526 2058 Website www zeusscientific com ZEUS IFA et SAVe Diluent sont des marques d pos es de ZEUS Scientific Syst me de test ANA HEp 2 Si vous d sirez une assistance client le aux tats Unis veuillez contacter votre distributeur local Si vous avez besoin d assistance technique aux
8. s nombreux petits points de fluorescence de grandeur uniforme r partis uniform ment dans le noyau Les nucl oles apparaissent g n ralement non marqu s Les cellules mitotiques peuvent pr senter quelques taches dans leur cytoplasme mais les chromosomes seront n gatifs 2 Motif en taches align es chromosome n gatif Les points de fluorescence de taille moyenne seront parpill s dans le noyau avec des marges cellulaires distinctes Des points de fluorescence plus grands peuvent galement tre observ s mais ils sont trop nombreux et de taille trop variable pour constituer un motif nucl aire Les chromosomes des cellules mitotiques seront n gatifs 3 Taches espac es chromosome positif sp cificit centrom re Les chromosomes seront positifs dans les cellules mitotiques en fait les points espac s seront group s uniquement dans la masse chromosomique d montrant clairement les divers stages de mitose Le motif centrom re a t reconnu comme tant associ au syndrome de CREST qui constitue une variante moins puissante de scl rose syst mique progressive SSP Le motif centrom re se pr sentera sous forme de taches fluorescentes uniformes et espac es r parties uniform ment dans le noyau Les cellules mitotiques seront positives avec des grappes centrom res dans les chromosomes selon diff rentes configurations d pendant du stade mitotique Harmon et al 17 ont d montr que des chantillons de s rum sanguin contena
9. sultats exacts il est essentiel de respecter les d lais et les temp ratures d incubation V rifier que tous les r actifs sont quilibr s temp rature ambiante 20 25 C avant de commencer le test Replacer imm diatement les r actifs inutilis s dans leur r cipient et observer les consignes de stockage Un mauvais lavage peut causer de faux r sultats positifs ou n gatifs S assurer de minimiser la quantit de solution PBS r siduelle par absorption avant d ajouter le conjugu Ne pas laisser les puits s cher entre les incubations La solution SAVe Diluent le conjugu et les solutions de contr le contiennent de l azoture de sodium sous une concentration inf rieure 0 1 volume d eau Il a t signal que l azoture de sodium pouvait former des accumulations de plomb ou d azoture de cuivre dans la tuyauterie de laboratoire lesquelles peuvent causer des explosions ou des d tonations Pour viter ce risque rincer abondamment les viers avec beaucoup d eau apr s y avoir jet une solution contenant de l azoture de sodium Cet agent de conservation peut tre toxique s il est ing r La dilution et l adult ration de ces r actifs peuvent produire des r sultats erron s Ne jamais pipeter la bouche viter tout contact de la peau ou des muqueuses avec des r actifs ou des chantillons humains viter toute contamination microbienne des r actifs Des r sultats incorrects pourraient survenir Toute
10. tre ajout s dans les deux heures suivant la fin du dernier cycle de lavage Examiner imm diatement les lames avec un microscope fluorescence appropri REMARQUE S il n est pas possible d examiner imm diatement les lames appliquer du vernis ongles transparent sur la bande de recouvrement pour fermer herm tiquement les contours et ranger au r frig rateur Il est recommand que les lames soient examin es le jour m me du test DNS CONTR LE DE QUALIT 1 Chaque fois qu un essai est ex cut un contr le positif un contr le n gatif et un contr le tampon doivent tre inclus 2 Il est recommand de lire les contr les avant l valuation des chantillons du test Si les contr les ne sont pas conformes la description il est possible que les r sultats soient invalides a Contr le n gatif Caract ris par l absence de fluorescence sp cifique et un marquage du fond rouge ou vert p le sur toutes les cellules cause du colorant de contraste b Contr le positif motif homog ne Caract ris par une fluorescence vert pomme Le motif de marquage homog ne est un marquage uniforme diffus de tout le noyau 3 Des contr les suppl mentaires peuvent tre test s conform ment aux r glementations gouvernementales en vigueur et aux normes des organisations d accr ditation comp tentes REMARQUE a Il est possible que du r actif non sp cifique soit emprisonn Il est important de bien laver les lames pour
11. 2 1O00 WOI UT R W e e e O Observer les pr cautions normalement applicables lors de toute manipulation de r actif de laboratoire En cas de contact oculaire rincer imm diatement les yeux avec beaucoup d eau et consulter un m decin Porter des v tements protecteurs appropri s ainsi que des gants et une protection des yeux du visage Ne pas respirer les vapeurs de ce produit Jeter conform ment toutes les lois applicables Les puits de lame ne contiennent pas d organismes viables Cependant les lames doivent tre consid r es comme des mat riaux biologiques dangereux et tre manipul es en cons quence Les solutions de contr le sont des mat riaux biologiques dangereux Les mat riaux d origine de ces produits ont fait l objet de tests approuv s n ayant r v l aucune pr sence d antig ne du VIH 1 de HBsAg et d anticorps contre le VHC et le VIH Cependant puisqu aucune m thode de test n offre une garantie absolue d absence de tout agent infectieux ces produits doivent tre manipul s selon les consignes du niveau 2 de bios curit conform ment aux recommandations applicables aux chantillons de sang et aux s rums humains potentiellement infectieux dans le manuel des centres am ricains de contr le des maladies intitul Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories derni re dition et conform ment aux normes de l OSHA concernant les agents pathog nes sanguins 20 Pour obtenir des r
12. FA ANA HEp 2 ont obtenu un r sultat positif 1 20 avec la proc dure de r f rence avec foie de rat R F RENCES 1 Barnett EV Mayo Clin Proc 44 645 1969 2 Burnham TK Fine G Neblett TR Ann Int Med 63 9 1966 3 Casals SP Friou GJ Meyers LL Arthritis Rheum 7 379 1964 4 Condemi JJ Barnett EV Atwater EC et al Arthritis Rheum 8 1080 1965 5 Dorsch CA Gibbs CB Stevens MB Shelman LE Ann Rheum Dis 28 313 1969 6 Dubois EL J Rheum 2 204 1975 7 Alarcon Segovia D Fishbein E J Rheum 2 167 1975 8 Friou GJ J Clin Invest 36 890 1957 9 Friou GJ Finch SC Detre KD J Immunol 80 324 1958 10 Coons AH Creech H Jones RN et al J Immunol 80 324 1958 11 Barnett EV North AF Condemi JJ Jacox RF Vaughn JH Ann Intern Med 63 100 1965 12 Lachman PJ Kunkel HG Lancet 2 436 1961 13 Friou GJ Arthritis Rheum 7 161 1964 14 Beck JS Scot Med J 8 373 1963 15 Anderson JR Gray KG Beck JS et al Ann Rheum Dis 21 360 1962 16 Luciano A Rothfield NF Ann Rheum Dis 32 337 1973 17 Harmon C Deng JS Peebles CL et al The importance of tissue substrate in the SS A Ro antigen antibody system Arthritis Rheum 27 166 173 1984 18 Peebles CL Molden DP Klipple GL Nakamura RM An antibody to histone H3 which produces a variable large speckled VLS immunofluorescent pattern on mouse kidney Arthritis Rheum 27 S44 1984 19 Ritchie RF Antinucleolar antibodies Their frequency and diagnos
13. NA ont t r alis es avec des substrats base de sections de tissu de foie ou de rein provenant de rats ou de souris l utilisation de substrats base de cultures cellulaires de tissus embryonnaires humains ou animaux a permis de r aliser des tests d ANA avec des r sultats fiables et faciles interpr ter La lign e cellulaire HEp 2 est un substrat recommand pour la d tection d anticorps centrom res dont la pr sence est hautement indicative de la variante CREST de scl rose syst mique progressive 27 Il existe plusieurs motifs d immunofluorescence nucl aire et cytoplasmique Ces motifs et les bases sur lesquelles ils reposent sont d crits ci dessous Homog ne Les motifs de marquage homog nes ou diffus du noyau correspondent des anticorps d histones d ADN natif ADNn et ou de d soxyribonucl oprot ine DNP 12 13 Les chromosomes de cellules mitotiques cellules en mitose sont d importants indicateurs de motif homog ne car ils produisent un marquage sous forme de masses irr guli res avec un marquage plus intense sur les rebords ext rieurs Motif tachet Le motif tachet est le plus fr quemment observ en d tection d ANA Un motif tachet uniforme peut tre observ chez des anticorps centrom res d anticorps de cellules qui ne sont pas en mitose Un motif tachet en grappes peut tre observ chez des anticorps de prot ines n RNP Sm et SSB La 1 Motif en taches fines chromosome n gatif Tr
14. Tous les s rums positifs 1 40 doivent tre titr s la dilution d extr mit cette op ration est r alis e en faisant des dilutions en s rie de 1 40 1 80 1 160 etc avec uniquement des r sultats positifs Le titre d extr mit est le taux de dilution le plus lev produisant une r action positive 1 4 Des motifs homog nes avec une accentuation p riph rique sont fr quemment rencontr s dans le s rum de patients souffrant de LES Maladie la plus fr quemment d couverte R f rence Homog ne Titre lev LES 3 8 9 et 16 Titre faible Arthrite rhumato de et autres maladies 1 Centrom re Syndrome de CREST variante de SSP 27 Tachet Scl rodermie syndrome de Raymond syndrome de Sj gren 34 36 maladie mixte de tissus conjonctifs Nucl olaire Scl rodermie 37 P riph rique LES 2 8 9 et 16 LIMITES DE L ESSAI 1 Le syst me de test ZEUS IFA ANA HEp 2 est un outil d aide au diagnostic pour usage en laboratoire et ne suffit pas pour poser un diagnostic d finitif Un r sultat d ANA positif peut tre obtenu chez des personnes apparemment saines Il est donc essentiel que les r sultats soient interpr t s par une autorit m dicale comp tente en tenant compte des informations cliniques globales du patient 2 Les patients souffrant de LES suivant un traitement base de st ro des peuvent avoir un r sultat n gatif 3 Plusieurs m dicaments d usage courant ven
15. bles jusqu la date de p remption imprim e sur l tiquette dans la mesure o les conditions de stockage recommand es sont rigoureusement respect es Ne pas utiliser apr s la date de p remption Ne pas congeler Le colorant de contraste bleu Evans est potentiellement canc rig ne En cas de contact cutan rincer abondamment sous l eau Jeter les r sidus conform ment aux r glementations locales en vigueur Ne pas laisser les lames s cher durant la proc dure Selon les conditions ambiantes du laboratoire il est possible qu il soit n cessaire de placer les lames dans une pi ce humide durant les p riodes d incubation MAT RIAUX N CESSAIRES MAIS NON FOURNIS Petites pipettes s rologiques Pasteur capillaires ou automatiques Embouts de pipettes jetables Petits tubes d essai de 13 x 100 mm ou de dimensions comparables Supports pour tubes d essai Plateau de marquage Un grand plateau de marquage avec un petit dispositif de m lange magn tique sera id al pour laver les lames entre les incubations Bandes de recouvrement 24 x 60 mm paisseur n2 1 Eau distill e ou d ionis e Microscope fluorescence correctement quip Cylindre gradu d un litre Minuterie de laboratoire pour mesurer les tapes d incubation Bassin de r sidus et de d sinfectant p ex 10 de javel domestique 0 5 d hypochlorite de sodium Les syst mes de filtres suivants ou des syst mes quivalents sont satisfaisants pour un u
16. contamination des r actifs ou des chantillons pourrait fausser les r sultats Les r cipients en verre r utilisables doivent tre lav s et abondamment rinc s de fa on enlever tout r sidu de d tergent viter les claboussures et la g n ration d a rosols Ne pas exposer les r actifs une lumi re puissante durant leur stockage ou durant une incubation Laisser le paquet de lames arriver temp rature ambiante avant d ouvrir l enveloppe protectrice afin de prot ger les puits et le tampon absorbant de toute condensation R cup rer la solution de lavage dans un bassin r sidus Traiter la solution r siduelle avec un d sinfectant p ex 10 de javel domestique 0 5 d hypochlorite de sodium viter d exposer les r actifs aux vapeurs de javel Ne pas exposer les r actifs des solutions contenant de la javel ni m me aux odeurs fortes s chappant d une solution contenant de la javel De tr s petites quantit s de javel hypochlorite de sodium peuvent d truire l activit biologique de plusieurs r actifs de ce syst me de test Ne pas appliquer de pression sur l enveloppe de lame Une telle op ration risquerait d endommager le substrat Les composants de ce syst me de test sont assembl s pour procurer une sensibilit et une reproductibilit optimale Ne pas remplacer les r actifs par des produits d autres fabricants Lire attentivement la notice dans l emballage Composants non ouvert ouvert sont sta
17. dus sous ordonnance peuvent cr er des ANA 6 7 4 Il est possible qu un motif d anticorps cache compl tement ou partiellement les caract ristiques de diagnostic d un autre motif Dans un tel cas il sera n cessaire de titrer le s rum 5 Ce produit ne vise pas proposer une association d finitive entre un motif de fluorescence nucl aire et un tat de maladie quelconque R SULTATS ESP R S La valeur esp r e dans une population normale est un r sultat n gatif c est dire inf rieur 1 40 Il est cependant possible que des personnes apparemment saines aient des ANA dans leur s rum sanguin 36 Ce pourcentage augmente avec l ge particuli rement apr s 70 ans CARACT RISTIQUES DE PERFORMANCE Le syst me de test ZEUS IFA ANA HEp 2 a t test en parall le avec une proc dure de r f rence utilisant un substrat de foie de rat Des tests d ANA routiniers ont t effectu s avec les deux proc dures sur 434 sp cimens de patients Des 434 chantillons de s rum 116 ont produit un r sultat positif avec les deux proc dures Le syst me de test ZEUS IFA ANA HEp 2 a t en accord avec le r sultat positif ou n gatif dans 97 des cas avec une concordance parfaite 100 au niveau des motifs de marquage Des 21 diff rences de r sultats de titre la proc dure ZEUS IFA ANA HEp 2 a affich une dilution de moins chez 18 sp cimens Cinq de ces 18 sp cimens ayant produit un r sultat n gatif avec la proc dure ZEUS I
18. eloppe protectrice 2 Identifier chaque puits selon le s rum de patient et les contr les REMARQUE Les contr les doivent tre utilis s non dilu s Pr parer une dilution 1 40 p ex 10 ul de s rum 200 ul de SAVe Diluent ou du tampon PBS pour chaque patient La solution SAVe Diluent changera de couleur pour confirmer que l chantillon a t combin avec le diluant Options de dilution a S ils le d sirent les utilisateurs peuvent pr parer les dilutions initiales d chantillon avec du PBS ou Zorba NS Zorba NS est disponible s par ment Ordre Num ro de produit FAO25 2 30 ml b Les utilisateurs peuvent titrer le contr le positif jusqu l extr mit pour l employer comme contr le semi quantitatif 1 minimalement r actif Dans un tel cas le contr le doit tre dilu avec deux volumes de SAVe Diluent ou du tampon PBS Lorsque l valuation est r alis e par ZEUS Scientific la dilution d extr mit est tablie et imprim e sur l ampoule de contr le positif 1 dilution Il est important de signaler qu cause des variations propres chaque laboratoire quipement etc le laboratoire doit tablir son propre titre d extr mit attendu pour chaque lot de contr le positif c Lors du titrage des sp cimens pr lev s sur des patients les dilutions initiales doivent tre pr par es dans du SAVe Diluent du tampon PBS ou du Zorba NS et toutes les dilutions subs quentes doivent tre pr
19. escent vert pomme dans la cellule Si l chantillon ne contenait aucun ANA sp cifique aucun marquage nucl aire distinct ne sera visible au niveau de la cellule COMPOSANTS DU SYST ME DE TEST Mat riel inclus Chaque syst me de test contient les composants suivants en quantit suffisante pour r aliser le nombre de tests indiqu sur l tiquette du conditionnement REMARQUE Le conjugu et les solutions de contr le contiennent une combinaison de Procline 0 05 v v et d azoture de sodium lt 0 1 volume d eau comme agents de conservation Le SAVe Diluent contient de l azoture de sodium comme agent de conservation sous une concentration inf rieure 0 1 volume d eau 1 Lames de substrat ANA HEp 2 Dix lames de 12 puits avec un tampon absorbant et un sachet de dessiccation Conjugu Immunoglobuline de ch vre antihumaine polyvalente marqu e avec de l isothiocyanate de fluoresc ine FITC Contient une solution N 2 a CEN tampon de phosphate avec BSA et colorant de contraste Un flacon de 3 5 ml avec bouchon ambre Pr t l emploi i Contr le positif s rum humain Produira un marquage homog ne positif couleur vert pomme du noyau humain Une ampoule de 0 5 ml avec NTROL ALS 5 bouchon rouge Pr t l emploi 3 CONTROL Contr le n gatif s rum humain Ne produira aucun marquage nucl aire d tectable Une ampoule de 0 5 ml avec bouchon vert Pr t l emploi gt SAVe Dil
20. nction veineuse aseptique de cette analyse 30 31 Ne pas ajouter d anticoagulant ni d agent de conservation viter d utiliser du s rum sanguin h molys lib mique ou expos des bact ries 3 Les chantillons peuvent tre conserv s temp rature ambiante pendant un maximum de 8 heures Si aucun test n est effectu dans un d lai de 8 heures le s rum sanguin peut tre stock 2 8 C pendant un maximum de 48 heures Si l ex cution du test est retard e le s rum sanguin peut tre stock 20 C ou moins viter les cycles multiples de gel d gel pouvant causer une perte d activit anticorps et produire des r sultats erron s Les laboratoires utilisateurs ont la responsabilit de consulter tous les documents de r f rence disponibles et ou leurs propres tudes afin de d terminer les crit res de stabilit appropri s pour leur laboratoire 38 CONDITIONS DE STOCKAGE 8 C Syst me de test non ouvert 20 1 Support de montage conjugu SAVe Diluent lames contr les n gatifs et positifs colorant de contraste bleu Evans PBS r hydrat stable 30 jours 29 C C Paquets de tampon phosphate salin PBS PROC DURE D ESSAI 1 Sortir les lames de leur lieu de stockage r frig r et laisser les lames se r chauffer temp rature ambiante 20 25 C D chirer l enveloppe protectrice et sortir les lames Ne pas appliquer de pression sur les c t s plats de l env
21. nt des anti SSA Ro hautement monosp cifiques produisaient un motif de d tection d ANA par IF sous forme de taches nucl aires espac es sur une grande vari t de cellules humaines et de noyaux de tumeurs Ces chantillons de s rum sanguin avec anti SSA Ro monosp cifiques ont produit tr s peu de taches cytoplasmiques sur des substrats cellulaires Un motif distinct de 3 10 grandes taches variables dans le noyau a d j t d crit Ces patients pr sentant de grandes taches variables souffraient de syndromes rhumatismaux se caract risant par des anticorps antihistones IgM H 3 18 Motif nucl aire Le motif nucl aire se pr sente sous forme de marquage homog ne ou tachet des nucl oles Ce motif est souvent associ avec une fluorescence homog ne et terne du reste du noyau Les chromosomes des cellules mitotiques seront n gatifs Le motif nucl aire sugg re la pr sence d anticorps d ARN 4 65 La fluorescence nucl aire peut tre uniforme agr g e en grappes ou tachet e selon l antig ne auquel r agit l anticorps Les anticorps antinucl aires sont observ s principalement dans le s rum de patients souffrant de scl rodermie de lupus ryth mateux syst mique LES de syndrome de Sj gren ou du ph nom ne de Raymond 19 P riph rique couronne Le marquage du noyau est pr dominant en p riph rie Les chromosomes des cellules mitotiques sont marqu s sous forme de masses irr guli res avec un marquage plus in
22. par es uniquement avec du SAVe Diluent ou du tampon PBS Les titrages ne doivent pas tre pr par s avec du Zorba NS Avec un distributeur appropri indiqu ci dessus distribuer 20 40 ul de chaque contr le et de chaque s rum de patient dilu dans les puits appropri s Incuber les lames temp rature ambiante 20 25 C pendant 20 30 minutes Rincer d licatement les lames avec du tampon PBS Ne pas appliquer directement un jet de PBS dans les puits d essai Laver les lames deux le temps suppl mentaire en changeant entre les lavages PBS Les lames peuvent tremper pendant chaque lavage pendant cinq minutes REMARQUE Pour ceux qui utilisent rondelles automatiques r gler la machine laver pour laver chaque puits trois fois avec un trempage de z ro cinq minutes 7 Retirez une une les lames du tampon PBS Inverser la lame et les puits principaux dans les trous des buvards fournis pongez la lame en essuyant le c t oppos avec une serviette absorbante ATTENTION Placer le buvard et la lame sur une surface plane et dure L utilisation de serviettes essuie tout pour ponger risquerait de d truire la matrice de lames Ne pas laisser les lames s cher durant la proc dure de test 8 Ajouter 20 40 pl de conjugu dans chaque puits 9 R p ter les tapes de 4 7 10 Appliquer 3 5 gouttes de support de montage sur chaque lame entre les puits et une bande de recouvrement Support de montage doivent
23. sage routinier avec des assemblages de microscopie sur fond noir avec lumi re transmise ou incidente Lumi re transmise Source lumineuse Vapeur de mercure 200 W ou 50 W Filtre d excitation Filtre barri re Filtre de suppression rouge KP490 K510 ou K530 BG38 BG12 K510 ou K530 BG38 FITC K520 BG38 Source lumineuse Tungst ne Halog ne 100W KP490 K510 ou K530 BG38 Lumi re incidente Source lumineuse Vapeur de mercure 200 100 50 W Filtre d excitation Miroir dichro que Filtre barri re Filtre de suppression rouge KP500 TK510 K510 or K530 BG38 FITC TK510 K530 BG38 Source lumineuse Tungst ne Halog ne 50 et 100 W KP500 TK510 K510 ou K530 BG38 FITC TK510 K530 BG38 Syst me de test ANA HEp 2 3 Mis jour le 10 30 2014 PR L VEMENT DES CHANTILLONS 1 ZEUS Scientific recommande que l utilisateur pr l ve les chantillons conform ment au document M29 du CLI intitul Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infectious Diseases Aucune m thode de test connue ne peut offrir une garantie totale qu un chantillon de sang humain ne causera aucune transmission d infection Par cons quent tous les d riv s d chantillons sanguins doivent tre consid r s comme possiblement infectieux 2 Utiliser uniquement du s rum sanguin fra chement pr lev et correctement r frig r obtenu selon la proc dure de po
24. tats Unis veuillez contacter ZEUS Scientific au num ro de t l phone gratuit indiqu EMERGO EUROPE ou par courriel support zeusscientific com Molenstraat 15 Les clients ayant besoin d assistance commerciale ou technique EC 2513 BH The Hague hors des tats Unis doivent contacter leur distributeur r gional The Netherlands Tel 31 0 70 345 8570 2014 ZEUS Scientific Inc Tous droits r serv s Fax 31 0 70 346 7299 6 Mis jour le 10 30 2014
25. tense sur les rebords ext rieurs Ce motif est souvent observ sur des anticorps d ADNn 3 14 16 Si les chromosomes des cellules mitotiques sont n gatifs le motif sugg re alors la pr sence d auto anticorps de membrane nucl aire et non d ADNhn ce qui ne correspond pas un motif p riph rique voir l interpr tation de membrane nucl aire ci dessous Autres motifs 1 Motif en fibres fusiformes chromosome positif Le motif en fibres fusiformes est caract ristique de cellule en mitose o seulement la partie fusiforme est fluorescente Ce motif a souvent une apparence de toile d araign e s talant du centriole vers les centrom res Ce motif sugg re la pr sence d auto anticorps de microtubules et sans signification est incertaine Cependant une association entre le motif en fibres fusiformes et le syndrome du tunnel carpien a t sugg r e 2 Motif mi corps Le motif mi corps correspond une zone dens ment marqu e pr s du blastoc le de cellules t lophases c est dire o les deux cellules filles se s parent La signification clinique de ce motif est inconnue Cependant ce motif a t reconnu chez certains patients souffrant de scl rose syst mique 3 Motif centriolaire Le motif centriolaire est caract ris par deux points distincts de fluorescence dans le noyau des cellules mitotiques ou par un point distinct de fluorescence dans la cellule au repos La signification de ce motif est inconnue mais il a
26. tic association N Engl J Med 282 1174 1178 1970 20 Deng JS Sontheimer RD Gilliam JN Relationships between antinuclear and anti Ro SS A antibodies in subacute cutaneous lupus erythematosus J Am Acad Dermatol 11 494 499 1984 21 Meyer O Hauptmann G Tappeiner G Ochs HD Mascart Lemone F Genetic deficiency of C4 C2 or C1q and lupus syndromes Association with anti Ro SSA antibodies Clin Exp Immunol 62 678 684 1985 22 Provost TT Arnett FC Reichlin M Homozygous C2 deficiency lupus erythematosus and anti Ro SS A antibodies Arthritis Rheum 26 1279 1282 1983 23 Speirs C Fielder AHL Chapel H et al Complement system protein C4 and susceptibility to hydralazine induced systemic lupus erythematosus Lancet 1 922 924 1989 24 Watson RM Scheel JN Petri M et al Neonatal lupus erythematosus syndrome Analysis of C4 allotypes and C4 genes in 18 families Medicine 71 84 95 1992 25 Tan EM Rodnan GP Garcia l Moroi Y Fritzler MJ Peebles C Arthritis Rheum Vol 23 No 6 617 1980 26 Hall AP Bardawil WA Bayles TB et al N Engl J Med 263 769 1960 27 Pollack VE N Engl J Med 271 165 1964 28 Raskin J Arch Derm 89 569 1964 29 BeckJS Anderson JR Gray KG Rowell NR Lancet 2 1188 1963 30 Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture Second edition Approved Standard 1984 Published by the National Committee for Clinical Laboratory Standards 31 Procedures for the
27. uent Deux flacons de 30 ml bouchon vert contenant une solution de tampon phosphate salin Pr t l emploi REMARQUE La solution DIL S SAVe Diluent change de couleur lorsqv elle est combin e du s rum Tampon phosphate salin PBS pH 7 2 0 2 Pour pr parer le tampon vider le contenu de chaque sachet de tampon dans un litre d eau distill e ou d ionis e M langer jusqu ce que tous les sels soient bien dissous Quatre sachets suffisants pour pr parer 4 litres MNTMED 7 Support de montage glyc rol tamponn Deux ampoules de 3 0 ml avec bec verseur et bouchon blanc D REMARQUES 1 Les composants suivants ne doivent pas n cessairement tre utilis s avec des syst mes de test ayant un num ro de lot correspondant et peuvent donc tre librement utilis s avec des syst mes de test ZEUS IFA tant que les num ros de produits sont identiques SAVe Diluent produit n FA005CC support de montage produit n FA0009S et PBS produit n 00085 2 Le syst me de test contient galement a Une tiquette de composant contenant des informations sp cifiques de lot l int rieur de la bo te du syst me de test b Un CD contenant toute la documentation du produit ZEUS IFA dont le mode d emploi PR CAUTIONS Pour utilisation diagnostique in vitro uniquement Syst me de test ANA HEp 2 2 Mis jour le 10 30 2014 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 2
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