NOTICE
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1. T SPOT Aide au diagnostic de l infection tuberculeuse Format Plaque 96 puits TB 200 NOTICE Pour usage diagnostique in vitro QQQ Oxford OO 900 Immunotec Harnessing the power of T cell measurement PI TB96 IVD FR V8 T SPOT TB 96 Format Plaque 96 puits TB 200 Table des mati res Utilisation pr vue Introduction Principes de la proc dure Limitations Mises en garde s curitaires et pr cautions Mat riel fourni Conservation Stabilit Equipement et mat riel n cessaires mais non fournis Pr paration du r actif M thode Pr l vement et pr paration des chantillons Comptage des cellules et dilution Pr paration de la plaque et incubation D veloppement et comptage des spots Contr le de la qualit Interpr tation des r sultats et Crit res du test Caract ristiques de performance du test R f rences Glossaire des symboles COCHON BP A ARAR D D D TT age PI TB96 IVD FR V8 Utilisation pr vue T SPOT TB est un test de diagnostic in vitro de d tection des cellules T effectrices qui r pondent une activation par les antig nes de Mycobacterium tuberculosis il est destin tre utilis comme aide au diagnostic de l infection tuberculeuse T SPOT TB est une proc dure ELISPOT simplifi e qui comptabilise les cellules T effectrices individuelles activ es par des antig nes sp cifiques de la tuberculose Introduction La r ponse immunitaire l infecti2. apr s leurs ant c dents m dicaux et les renseignements personnels ont t jug s comme pr sentant un faible risque d infection par M tuberculosis La sp cificit de T SPOT TB a t calcul e comme tant de 100 93 93 niveau de confiance 95 avec intervalles de confiance de 95 8 100 La sensibilit a t valu e en testant 87 chantillons provenant de cas d infection par M tuberculosis confirm s par culture comprenant des groupes immunod prim s La sensibilit de T SPOT TB a t calcul e 98 8 86 87 niveau de confiance 95 avec intervalles de confiance de 90 8 99 9 La reproductibilit a t valu e comme marqueur de substitution de la variation intra essai par une analyse des chantillons sanguins effectu e en duplicat sur la m me plaque Au total 145 chantillons sanguins provenant de 140 donneurs diff rents ont t test s en duplicat deux puits pour le Panel A et deux puits pour le Panel B en utilisant T SPOT TB Une concordance clinique a t observ e dans 142 145 97 9 analyses des duplicats Deux duplicats ont donn des r sultats marginalement discordants et 1 145 chantillons a donn des r sultats en d saccord La r p tabilit a t valu e comme marqueur de substitution de la variation inter essai par une analyse des chantillons sanguins effectu e en duplicat sur deux plaques diff rentes En tout 208 chantillons sanguins provenant de donneur
3. t Limite de temp rature A conserver entre ca Se r f rer au mode d emploi avant de proc der T SPOT et le logo d Oxford Immunotec sont des marques d pos es d Oxford Immunotec Limited AIM V RPMI et GIBCO sont des marques d pos es d Invitrogen CPT et Vacutainer sont des marques d pos es de Becton Dickinson Ficoll Paque est une marque d pos e de GE Health Technologies Tween est une marque d pos e de ICI Americas T SPOT TB est prot g par les brevets et les brevets en instance suivants EP 0941478 US 09 308 725 AU 728357 CA 2272881 JP 524410 98 EP 1152012 AU 765013 EP1144447 US 09 830 839 JP 2000 579635 US 09 916 201 WO 02 054072 WO 9709428 US 6290969 US 6338852 US 09 724 685 AU 727602 BR 9610262 CA 2230885 CN 1200147 CZ 9800628 HU 9900902 IL 123506 NO 9800883 PL 325373 TR 9800411 ZA 9607394 WO 9709429 AU 9671587 JP 11514217 BR 9610268 CA 2230927 CN 1200146 WO 9501441 US 5955077 EP 706571 AU 682879 CA 2165949 NZ267984 T SPOT TB int gre une technologie brevet e accord e sous licence par le Statens Serum Institut Copenhague Danemark et Isis Innovation Limited Oxford RU T SPOT TB est commercialis avec l autorisation du Public Health Research Institute et ne peut tre exclusivement utilis selon les droits de brevet du PHRI qu des fins de diagnostic in vitro chez l humain Oxford Immunotec Limited 2007 Tous droits r serv s Fabricant Oxford Immunotec Ltd 94C Milton Par
4. oxfordimmunotec com Il sera peut tre n cessaire de pr lever un autre chantillon et de refaire le test Normalement le nombre de spots pour le Contr le Positif de la fonctionnalit des cellules devrait tre 2 20 ou montrer une saturation spots trop nombreux pour les compter Il est possible que les cellules T d une faible proportion de patients ne montre qu une r action limit e la PHA Le Contr le Positif sera consid r comme Ind termin quand le nombre de spot est lt 20 spots moins que le Panel A ou le Panel B ne soit R actif tel que d crit dans l Interpr tation des r sultats et Crit res du test voir ci dessous auquel cas le r sultat est valide En raison des variations biologiques et syst matiques potentielles lorsque le Contr le N gatif comporte 0 5 spot s et le nombre de spots au Panel A ou au Panel B le nombre de spots dans le Contr le N gatif 5 7 ceci peut tre consid r comme une zone grise et doit tre consid r conjointement l ensemble des informations cliniques disponibles Il peut tre jug n cessaire de pr lever un autre chantillon et de refaire le test pour l individu concern Bien que les antig nes ESAT 6 et CFP10 soient absents dans les souches BCG de M bovis et dans la majorit des mycobact ries environnementales il est possible qu un r sultat R actif au T SPOT TB soit d une infection par M kansasii M sz
5. par des antig nes sp cifiques de la tuberculose Le test est adapt pour tous les patients risque d infection tuberculeuse latente LTBI ou suspect s de tuberculose Cn quel que soit leur ge leur sexe leur groupe ethnique leur th rapie ou leur statut immunologique Principes de la proc dure Les cellules mononucl es de sang p riph rique PBMC sont s par es de l chantillon de sang total et lav es pour liminer toutes les sources de bruit de fond Les PBMC sont ensuite compt es pour s assurer qu un nombre standardis de cellules est ajout pour la d tection Ceci permet de garantir qu un nombre ad quat de cellules est introduit dans les puits de microtitration et cela m me chez ceux dont les titres de cellules T sont faibles en raison de l affaiblissement de leur syst me immunitaire individus immunocompromis ou immunosupprim s Les tapes de lavage et de comptage ainsi que la technique d ELISPOT permettent d obtenir des r sultats sup rieurs dans la d tection de la tuberculose ou d infection tuberculeuse latente Quatre puits voir Figure 1 sont n cessaires pour chaque pr l vement 1 Un Contr le N gatif pour identifier l activation cellulaire non sp cifique 2 Des antig nes sp cifiques de la TB Panel A ESAT 6 3 Des antig nes sp cifiques de la TB Panel B CFP10 4 Un Contr le Positif la phytoh magglutinine PHA un activateur polyclonal connu comme test de la fonctionnalit des
6. 8 25 C 8 Recueillir la bande blanche et trouble de PBMC l aide d une pipette et transf rer dans un tube centrifuger conique de 15 ml Ajouter le milieu de culture cellulaire pour obtenir un volume de 10 ml 3 Divers milieux peuvent tre utilis s pour laver les cellules durant ce processus Dans nos laboratoires les milieux AIM V et RPMI 1640 ont tous deux t utilis s avec succ s et sont recommand s 4 Centrifuger 600 x g pendant 7 min Vider le surnageant et resuspendre le culot dans 1 ml de milieu 4 Voir 3 ci dessus 5 Ajouter du milieu neuf pour obtenir un volume de 10 ml et centrifuger 350 x g pendant 7 min 5 Voir 3 ci dessus 6 Vider le surnageant et resuspendre le culot dans 0 7 ml de milieu 6 A ce stade le culot doit tre resuspendu dans le milieu de culture s lectionn pour l incubation de nuit Dans nos laboratoires le milieu sans s rum AIM V a t utilis avec succ s et est fortement recommand Comptage des cellules et dilution T SPOT TB n cessite 2 5 x 10 PBMC viables par puits Au total quatre puits sont requis pour chaque chantillon d un patient Le nombre de cellules introduites dans chaque puits doit tre correct faute de quoi l interpr tation du r sultat risque d tre erron e M thode Notes 1 Effectuer le comptage des cellules viables 1 Les cellules peuvent tre compt es de plusieurs fa ons don
7. PBMC 2 PI TB96 IVD FR V8 Plasma Pr lever sang Centrifuger gt veineux 2 p riph rique U Globules rouges Pr lever PBMC laver et compter Introduire PBMC OOOUOOOO Incuber pendant la nuit et antig nes OO0000O dans 4 puits Puits pr enduits 0000000 Laver d velopper et 8688806 ee s cher la plaque CSO0808 puits 006006 Figure 1 Diagramme illustrant les principales tapes de T SPOT TB Les PBMC sont incub es avec les antig nes pour permettre la stimulation des cellules T sensibilis es ventuellement pr sentes La cytokine produite est captur e par les anticorps sp cifiques la surface de la membrane qui forme la base du puits et les cellules et autres mat riels ind sirables sont limin s par lavage Un second anticorps conjugu la phosphatase alcaline et dirig sur un diff rent pitope de la cytokine est ajout et se fixe sur la cytokine captur e la surface de la membrane Tout conjugu non fix est limin par lavage Un substrat soluble est ajout dans chaque puits il est cliv par l enzyme qui lui est li e et forme ainsi un spot de pr cipit insoluble au site de la r action Chaque spot repr sente l empreinte d une cellule T individuelle s cr trice de cytokines et le comptage des spots obtenus donne une mesure de la quantit de cellules T effectrices sensibles M tuberculosis dans le sang p riph rique Limitations e Pour diagn
8. Un Contr le N gatif et un Contr le Positif de la fonctionnalit des cellules doivent tre effectu s sur chaque chantillon individuel Il est recommand d organiser les chantillons verticalement sur la plaque comme illustr ci dessous Contr le N gatif 3 Panel A O Panel B O Contr le Positif 6 PI TB96 IVD FR V8 M thode Notes 1 Sortir la plaque de microtitration pr enduite de son emballage et laisser stabiliser temp rature ambiante 1 La plaque de microtitration fournie comporte une base de protection en plastique qui ne doit pas tre enlev e aucune tape de la proc dure 2 Quatre puits sont n cessaires pour chaque chantillon d un patient i introduire 50 ul de milieu de culture cellulaire dans chaque puits de Contr le N gatif ii Introduire 50 ul de solution du Panel A dans chaque puits n cessaire iii Introduire 50 ul de solution du Panel B dans chaque puits n cessaire iv Introduire 50 ul de solution de Contr le Positif dans chaque puits de contr le de la fonctionnalit des cellules 2 Ne pas toucher la membrane avec l embout de la pipette Les indentations dans la membrane caus es par l embout des pipettes peuvent causer des artefacts dans les puits Il sera peut tre n cessaire de tapoter la plaque pour s assurer que les solutions couvrent la membrane au fond de chaque puits Eviter de l agiter vigoureusement pour minimiser
9. dant 7 min 7 Le non respect du temps d incubation recommand peut entra ner une interpr tation erron e du r sultat 8 Laver la plaque abondamment avec de l eau distill e ou d ionis e pour arr ter la r action de d tection 9 Laisser s cher la plaque en la mettant dans un endroit bien a r ou dans un four une temp rature maximale de 37 C 9 Les spots deviennent plus visibles avec le s chage de la plaque Laisser s cher 4 heures 37 ou jusqu au lendemain temp rature ambiante 10 Compter et noter le nombre de spots bleu fonc distincts sur la membrane de chaque puits Appliquer l Interpr tation des r sultats et Crit res du test voir ci dessous pour d terminer si l chantillon du patient est R actif ou Non R actif aux antig nes TB 10 Les spots peuvent tre visualis s de plusieurs fa ons savoir une loupe main un microscope ad quat ou un lecteur de plaque ELISPOT d di Contr le de la qualit Dans un r sultat type on s attend ce qu il y ait peu ou pas de spots dans le Contr le N gatif et plus de 20 spots dans le Contr le Positif Le Contr le N gatif sera consid r comme Ind termin si le nombre de spots compt s est sup rieur 10 Les r sultats d un tel chantillon peuvent tre difficiles interpr ter Se r f rer au Manuel technique T SPOT TB pour les causes possibles t l charger partir de www
10. de 2 ans un tube p diatrique de 2 ml Les chantillons de sang doivent tre conserv s temp rature ambiante et test s le jour du pr l vement Le milieu de culture cellulaire doit tre r chauff 37 C avant de l utiliser avec T SPOT TB M thode Notes 1 Pr lever un chantillon de sang selon le mode d emploi fourni avec le dispositif de pr l vement Conserver le sang pr lev temp rature ambiante 18 25 C Ne pas r frig rer ni congeler 1 Les chantillons de sang peuvent tre recueillis dans divers tubes Dans nos laboratoires nous avons utilis avec succ s des tubes Vacutainer CPT citrate de sodium des tubes CPT h parine sodique et des tubes h parine de lithium standards Les tubes EDTA ne sont pas recommand s 2 Avec les tubes CPT de pr l vement de sang suivre les consignes du fabricant pour la s paration des PBMC Avec les autres m thodes de pr l vement de sang pr parer les PBMC par centrifugation sur Ficoll Paque Plus en utilisant les proc dures publi es 2 Centrifuger un tube CPT de 8 ml 1600 xg pendant 28 min ou un tube CPT de 4 ml 1800 x g pendant 30 min temp rature ambiante 18 25 C Ou bien diluer le sang avec un volume gal de milieu RPMI 1640 D poser soigneusement le sang dilu 2 3 volumes sur Ficoll Paque Plus 1 volume et centrifuger 1000 x g pendant PI TB96 IVD FR V8 22 min temp rature ambiante 1
11. des plaques tel qu un microscope une loupe ou un lecteur de plaque 12 Milieu de culture cellulaire st rile tel que GIBCO AIM V Invitrogen num ro de catalogue 31035 025 l utilisation de ce milieu sans s rum dans l tape d incubation est fortement recommand e Le milieu RPMI 1640 Invitrogen num ro de catalogue 21875 034 ne peut tre utilis que pour les tapes initiales de pr paration des chantillons Il est recommand a 4 PI TB96 IVD FR V8 de conserver le milieu de culture cellulaire dans des aliquotes appropri es et d liminer le mat riel exc dentaire apr s emploi Le milieu de culture cellulaire doit tre r chauff 37 C avant de l utiliser avec T SPOT TB Pr paration du r actif 1 Plaque de microtitration La plaque de microtitration T SPOT TB 96 est fournie pr te l emploi La sortir du lieu de conservation et la laisser se stabiliser temp rature ambiante Enlever l emballage ext rieur en aluminium et liminer le sachet de d shydratant 2 Les flacons d antig nes ESAT 6 de M tuberculosis Panel A sont fournis pr ts l emploi 3 Les flacons d antig nes CFP10 de M tuberculosis Panel B sont fournis pr ts l emploi 4 Les flacons de Contr le Positif sont fournis pr ts l emploi 5 Pr parer une solution de travail de conjugu dilu 1 200 Calculer le volume de la solution de travail de conjugu n cessaire et la pr parer juste avant l emploi 6 La solution d
12. e substrat est fournie pr te l emploi La sortir de son lieu de conservation et la laisser se stabiliser temp rature ambiante M thode Cet essai doit tre r alis selon les principes des Bonnes Pratiques de Laboratoire et en adh rant rigoureusement ce mode d emploi Oxford Immunotec Ltd a pr par un ensemble de documents techniques d crivant certaines options valu es dans nos laboratoires concernant le pr l vement et la pr paration des chantillons le choix du milieu de culture des cellules et les m thodes de comptage des spots En plus des Points Cl s et Notes de la pr sente notice un Guide de la M thode visuel et un Manuel technique sont galement disponibles Tous ces documents techniques peuvent tre obtenus en appelant le 44 0 1235 442780 ou t l charg s partir de www oxfordimmunotec com Pr l vement et pr paration des chantillons Les utilisateurs doivent valider leurs propres proc dures de recueil des PBMC d num ration des PBMC et de choix du milieu adapt pour supporter la fonctionnalit des cellules T au cours de l tape d incubation primaire du test Normalement chez un sujet immunocomp tent il est possible d obtenir suffisamment de PBMC provenant de pr l vements de sang veineux pour r aliser l essai selon les directives suivantes e Adultes et enfants de plus de 10 ans un tube de 8 ml ou deux tubes de 4 ml e Enfants de 2 9 ans un tube de 4 ml e Enfants de moins
13. ilieu de culture des cellules 1 A ce moment l sortir la solution de substrat du kit et laisser se stabiliser temp rature ambiante 2 Introduire 200 ul de solution PBS dans chaque puits 8 Eliminer la solution PBS R p ter le lavage du puits encore 3 fois avec de la solution fra che pour chaque lavage 8 Eliminer tout le PBS de la derni re tape de lavage en retournant doucement la plaque sur du papier absorbant avant de continuer 4 Diluer le r actif conjugu concentr au 1 200 me avec le PBS pour obtenir la solution de travail 4 Ne pas utiliser de PBS contenant du Tween M ou d autres d tergents car cela entra ne un bruit de fond lev S assurer de ne pr parer qu une petite quantit exc dentaire de la solution de travail pour permettre une perte Ainsi pour 96 puits n cessitant 50 ul chacun pr parer 5 ml de la solution de travail en ajoutant 25 ul de r actif conjugu concentr 4975 ul de PBS PI TB96 IVD FR V8 5 introduire 50 ul de solution de travail du r actif conjugu dans chaque puits et incuber 2 8 C pendant 1 heure 5 Le non respect du temps d incubation recommand peut entra ner une interpr tation erron e du r sultat 6 Eliminer le conjugu et effectuer quatre lavages au PBS comme d crit aux tapes 2 et 3 ci dessus 7 Introduire 50 ul de solution de substrat dans chaque puits et incuber temp rature ambiante pen
14. k Abingdon Oxfordshire OX14 4RY RU www oxfordimmunotec com OQO Oxford Immunotec Limited 94C Milton Park oxroro IMMUNOTECLTD OO X O r Abingdon Oxon OX14 4RY UK Soo Immunotec mens uam E y 1809001 2000 FILE NO A13242 FILE NO A13242 Harnessing the power of T cell measurement Www oxfo rd i mm u notec com 10 PI TB96 IVD FR V8
15. l emploi 7 Mode d emploi que l on retrouve sur le CD avec la fiche signal tique des donn es de s curit le Manuel technique le Guide de la M thode visuel et le T SPOT Reporter Conservation Conserver tous les composants du kit une temp rature situ e entre 2 et 8 C Eviter l exposition prolong e de la solution de substrat la lumi re Stabilit Les composants du kit sont stables jusqu la date de p remption indiqu e sur l emballage du kit s ils sont conserv s et manipul s dans les conditions recommand es Equipement et mat riel n cessaires mais non fournis 1 Hotte microbiologique de classe Il recommand 2 Tubes de pr l vement sanguin tels que Vacutainer CPTTM ou tubes h parin s 3 Ficoll ou autre milieu de s paration des PBMC 4 Centrifugeuse pour la pr paration des PBMC capable d au moins 1800 x g et de maintenir les chantillons temp rature ambiante 18 25 C Equipement et r actifs permettant de compter les PBMC soit manuellement avec du bleu trypan et un h mocytom tre au microscope soit automatiquement l aide d un analyseur h matologique 6 Incubateur humidifi 5 de CO 37 1 C 7 Laveur de plaques de microtitration ou mat riel pour le lavage manuel des plaques 8 Pipettes et embouts de pipette st riles 9 PBS st rile tel que GIBCO 1 x D PBS Invitrogen num ro de catalogue 14040 091 10 Eau distill e ou eau d ionis e 11 Un moyen de lecture
16. la possibilit de contamination crois e des antig nes entre les puits 8 Dans chacun des 4 puits qui sera utilis pour l chantillon d un patient introduire 100 ul de suspension de cellules finale du patient contenant 250 000 cellules viables 3 M langer la suspension de cellules en pipetant soigneusement plusieurs fois avant de pr lever chaque aliquote de 100 ul Il est recommand d utiliser un nouvel embout pour chaque pr l vement de cellules T de chaque patient pour viter la possibilit de contamination entre les 4 puits 4 Incuber la plaque 37 C dans un incubateur humidifi 5 de CO pendant 16 20 heures 4 Eviter de remuer la plaque une fois qu elle se trouve dans l incubateur Ne pas empiler les plaques car cela peut entra ner une r partition in gale de la temp rature et de la ventilation Le non respect du temps d incubation recommand peut entra ner une interpr tation erron e du r sultat D veloppement et comptage des spots Pendant les tapes de lavage de la plaque et de d veloppement ne pas toucher la membrane avec l embout des pipettes ou les canaux du laveur de puits automatis Les indentations de la membrane caus es par l embout des pipettes ou du laveur de puits peuvent se r v ler comme des artefacts dans les puits ce qui rendra le comptage des spots difficile M thode Notes 1 Sortir la plaque de l incubateur et liminer le m
17. on par M tuberculosis est principalement une r ponse immunitaire m diation cellulaire CMI Dans le cadre de cette r ponse les cellules T sont sensibilis es aux antig nes de M tuberculosis Les cellules T effectrices activ es CD4 et CD8 sp cifiquement s par es du sang peuvent tre quantifi es du fait de leur capacit tre stimul es in vitro par ces antig nes L utilisation d antig nes s lectionn s pour le complexe M tuberculosis M tuberculosis M bovis M africanum am liore la sp cificit en diminuant la r activit crois e au BCG et de nombreuses mycobact ries environnementales Deux panels d antig nes distincts qui simulent les prot ines ESAT 6 et CFP10 bien caract ris es sont utilis s pour optimiser la sensibilit du test T SPOT TB est une version simplifi e de la technique ELISPOT enzyme linked immunospot Les tests ELISPOT sont d une sensibilit exceptionnelle dans la mesure o la cytokine cible est captur e directement autour de la cellule s cr trice avant qu elle ne soit dilu e dans le surnageant captur e par les r cepteurs de cellules adjacentes ou encore d grad es Ceci rend les tests ELISPOT beaucoup plus sensibles que les mesures ELISA conventionnelles T SPOT TB est con u pour d tecter les cellules T effectrices qui r pondent une activation par des antig nes sp cifiques de M tuberculosis T SPOT TB quantifie individuellement les cellules T activ es
18. ostic in vitro uniquement e Emploi professionnel uniquement e Conserver le kit non ouvert une temp rature de 2 8 C Le kit ne doit pas tre utilis apr s la date de p remption indiqu e sur l tiquette Ne pas m langer les composants de kits de lots diff rents T SPOT TB 96 est con u pour un usage unique Lire attentivement la notice d utilisation avant l emploi Travailler de mani re aseptique afin d viter de contaminer les r actifs les puits les suspensions cellulaires et les milieux de culture cellulaire e Tout cart par rapport aux techniques de pipetage et de lavage et aux temps et ou temp ratures d incubation indiqu s peut influencer les r sultats obtenus et doit tre vit e Le sang pr lev pour le test doit tre utilis dans les 8 heures e Les pr l vements de sang doivent tre conserv s et transport s vers le laboratoire temp rature ambiante 18 25 C Ne pas r frig rer ou congeler les chantillons de sang total e T SPOT TB doit tre utilis et interpr t uniquement dans le contexte du tableau clinique global e Un r sultat n gatif du test n exclut pas la possibilit d une exposition ou d une infection par M tuberculosis e Les antig nes ESAT 6 et CFP10 sont absents dans les souches BCG et dans la plupart des mycobact ries environnementales except M kansasii M szulgai M marinum et M gordonae 3 PI TB96 IVD FR V8 Mises en garde s curitaires et
19. pr cautions Des pr cautions doivent tre prises lors de la manipulation de produits d origine humaine Tous les chantillons de sang doivent tre consid r s comme potentiellement infectieux La manipulation des chantillons de sang et des composants de l essai ainsi que leur utilisation conservation et limination doivent se faire conform ment aux proc dures stipul es dans les directives ou r glements nationaux appropri s sur la protection contre les biorisques Des pr cautions doivent tre prises lors du travail avec des produits chimiques Tous les produits chimiques doivent tre consid r s comme potentiellement dangereux Mat riel fourni T SPOT TB 96 contient 1 1 plaque de microtitration 96 puits enduits d un anticorps monoclonal murin anti cytokine interf ron gamma IFN y 2 2 flacons 0 7 ml chacun Panel A contenant antig nes ESAT 6 albumine bovine et agents antimicrobiens 3 2 flacons 0 7 ml chacun Panel B contenant antig nes CFP10 albumine bovine et agents antimicrobiens 4 2flacons 0 7 ml chacun Contr le Positif contenant la phytoh magglutinine PHA utilis e comme contr le de la fonctionnalit des cellules albumine bovine et agents antimicrobiens 5 1 flacon 50 ul de r actif conjugu concentr 200 x anticorps monoclonal murin anti cytokine IFN y conjugu la phosphatase alcaline 6 1 flacon 25 ml de solution de substrat solution BCIP NBT pr te
20. s diff rents ont t test s en duplicat deux puits pour le Panel A et 2 puits pour le Panel B avec un puits sur chacune des deux plaques en utilisant T SPOT TB Une concordance clinique a t observ e dans 206 208 99 0 analyses des duplicats R f rences Janeway and Travers 1996 Immunobiology 2 Ed Staines et al 1999 Introducing Immunology 2 Ed Chapman et al 2002 AIDS 16 17 2285 2298 Ewer et al 2003 Lancet 361 1168 1173 Voir www elispot analyzers de english science elispot assays html Pathan et al 2001 J Immunol 167 5217 5225 Lalvani et al 2001 Lancet 357 2017 2021 Lalvani et al 2001 Am J Resp Crit Care Med 163 824 828 Lalvani et al 2001 J Infect Dis 183 469 477 10 Meier et al 2005 Eur J Clin Microbiol Infect Dis 24 529 536 11 Zellweger et al 2005 Int J Tuberculosis and Lung Dis 9 11 1242 1247 O J O O1 OU IN 9 PI TB96 IVD FR V8 12 Directive approuv e par le NCCLS Performance of single Cell Immune Response Assays LA26 A 13 Koller et al 2003 Clin Exp Immunol 132 2 225 231 14 Apollonj et al 1975 Immunol Commum 4 5 453 463 Glossaire des symboles H A utiliser avant Date de p remption An Mois Jour LOT Num ro de lot REF Num ro de catalogue A Attention voir le mode d emploi sl Fabricant y Suffisant pour n tests IVD Dispositif de diagnostic in vitro
21. t le comptage manuel en utilisant du bleu trypan et un h mocytom tre et le comptage automatique l aide d un instrument appropri 2 En bref pour le comptage manuel au moyen d un h mocytom tre Neubauer introduire 10 pl de suspension cellulaire finale dans 40 ul de solution de bleu trypan 0 4 p v Placer un volume appropri sur l h mocytom tre et compter les cellules dans la grille Pour les autres types d h mocytom tre et pour les instruments automatiques suivre les consignes du fabricant 2 Faire attention et s assurer que la suspension de cellules est bien m lang e juste avant le pr l vement en vue de la dilution ou du comptage car des cellules peuvent se d poser au fond du tube ce qui entra nerait une interpr tation erron e du vrai nombre de cellules 8 Calculer la concentration de cellules viables pr sentes dans la suspension de cellules m re 8 S assurer que le calcul est correct compte tenu du syst me de comptage utilis l utilisation d un nombre de cellules insuffisant ou excessif pouvant entra ner une interpr tation erron e du r sultat 4 Pr parer 500 ul de suspension de cellules finale une concentration de 2 5 x 10 cellules 100 pl 4 S assurer que les cellules sont bien m lang es avant le pr l vement en vue de la dilution Pr paration de la plaque et incubation T SPOT TB n cessite quatre puits pour chaque chantillon d un patient
22. ulgai M marinum o M gordonae D autres tests seront requis si ces infections sont suspect es Interpr tation des r sultats et Crit res du test Veuillez vous r f rer la section Contr le de la Qualit avant d appliquer les crit res suivants Le r sultat du test est R actif si le Panel A ou le Panel B ou les deux Panels r pondent conform ment aux crit res suivants PI TB96 IVD FR V8 Lorsque le Contr le N gatif pr sente 0 5 spot s et le nombre de spots au Panel A ou au Panel B le nombre de spots dans le Contr le N gatif 2 6 Lorsque le Contr le N gatif pr sente 6 10 spots et le nombre de spots au Panel A ou au Panel B 2 2 x le nombre de spots dans le Contr le N gatif Le r sultat du test est Non r actif si les crit res ci dessus sont respect s et le Contr le Positif est valide Lorsque le Contr le Positif est Ind termin et que le Panel A et le Panel B sont tous deux Non r actif le test doit tre consid r comme Ind termin et doit tre refait Un r sultat R actif indique que l chantillon contient des cellules T effectrices r agissant M tuberculosis Un r sultat Non r actif indique que l chantillon ne contient probablement pas de cellules T effectrices r agissant M tuberculosis Caract ristiques de performance du test La sp cificit a t valu e en testant 93 chantillons de donneurs qui d
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