NOTICE - Oxford Immunotec
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1. T SPOT Aide au diagnostic de l infection tuberculeuse NOTICE Pour usage diagnostique in vitro Cette notice concerne l utilisation du produit suivant T SPOT TB 8 Format Plaque bandes de 8 puits usage multiple Num ro de catalogue TB 300 Oxford Immunotec Harnessing the power of T cell measurement PI TB IVD FR V2 Table des mati res Utilisation pr vue Introduction Principes de la proc dure Limitations Mises en garde s curitaires et pr cautions Mat riel fourni Conservation Stabilit Equipement et mat riel n cessaires mais non fournis Pr paration du r actif M thode Pr l vement et pr paration des chantillons Comptage des cellules et dilution Pr paration de la plaque et incubation D veloppement et comptage des spots Contr le de la qualit Interpr tation des r sultats et crit res du test Caract ristiques de performance du test R f rences Glossaire des symboles V o Q gt OCDE A ARA D D D PI TB IVD FR V2 Utilisation pr vue Le test T SPOT TB est un outil de diagnostic in vitro de d tection des cellules T effectrices qui r pondent une activation par les antig nes de Mycobacterium tuberculosis il est destin tre utilis comme aide au diagnostic de l infection tuberculeuse TB Le test T SPOT TB est une proc dure immunoenzymatique ELISPOT simplifi e qui comptabilise les cellules T effectrices individuelles activ es par des antig2. antig nes ESAT 6 de M tuberculosis Panel A sont fournis pr ts l emploi Les flacons d antig nes CFP10 de M tuberculosis Panel B sont fournis pr ts l emploi Les flacons de Contr le Positif sont fournis pr ts l emploi Pr parer une solution de travail de conjugu dilu 1 200 Calculer le volume de la solution de travail de conjugu n cessaire voir le calculateur de dilution du conjugu T SPOT sur le CD fourni avec chaque kit et la pr parer juste avant l emploi 6 La solution de substrat est fournie pr te l emploi La sortir de son lieu de conservation et la laisser se stabiliser temp rature ambiante on 8 w D M thode Cet essai doit tre r alis selon les principes des Bonnes Pratiques de Laboratoire et en adh rant rigoureusement ce mode d emploi Oxford Immunotec Ltd a pr par un Guide de formation qui d crit le pr l vement et la pr paration des chantillons le choix du milieu de culture des cellules et les m thodes de comptage des spots Ce document est disponible sur le CD fourni avec chaque kit peut tre obtenu en appelant le 44 0 1235 442780 ou t l charg partir de www oxfordimmunotec com Pr l vement et pr paration des chantillons Les utilisateurs doivent valider leurs propres proc dures de recueil des PBMC d num ration des PBMC et de choix du milieu adapt pour supporter la fonctionnalit des cellules T au cours de l tape d incubation primaire du test No
3. nes sp cifiques de la tuberculose Introduction L Organisation Mondiale de la Sant estime qu un tiers de la population mondiale est infect par M tuberculosis Chaque personne porteuse d une infection tuberculeuse latente LTBI pr sente un risque d environ 10 d volution vers la forme active Ce taux de progression est lev chez certains groupes y compris ceux ayant t r cemment infect s et ceux dont le syst me immunitaire est affaibli La r ponse immunitaire l infection par M tuberculosis est principalement une r ponse immunitaire m diation cellulaire CMI Dans le cadre de cette r ponse les cellules T sont sensibilis es aux antig nes de M tuberculosis Les cellules T effectrices activ es CD4 et CD8 sp cifiquement s par es du sang peuvent tre quantifi es du fait de leur capacit tre stimul es in vitro par ces antig nes L utilisation d antig nes s lectionn s pour le complexe M tuberculosis M tuberculosis M bovis M africanum M microti M canetti am liore la sp cificit du test pour ces microorganismes en diminuant la r activit crois e au BCG et la plupart des mycobact ries environnementales Deux panels d antig nes distincts qui simulent les prot ines ESAT 6 et CFP10 bien caract ris es sont utilis s pour optimiser la sensibilit du test Le test T SPOT TB est une version simplifi e de la technique ELISPOT Les tests ELISPOT sont d une sensibilit except
4. 2 Avec les tubes CPT de pr l vement de sang suivre les consignes du fabricant pour la s paration des PBMC Avec les autres m thodes de pr l vement de sang s parer les PBMC par centrifugation sur FICOLL PAQUE PLUS en utilisant les proc dures publi es 2 Centrifuger un tube CPT de 8 ml 1600 x g pendant 28 min ou un tube CPT de 4ml 1800 x g pendant 30 min une temp rature de 18C si une centrifugation r frig r e est possible Laisser la centrifugeuse atteindre 18C si une temp rature inf rieure a t utilis e Si une centrifugeuse non r frig r e est utilis e s assurer que la temp rature ne d passe pas les 25 C Ou bien diluer le sang avec un volume gal de milieu RPMI 1640 D poser soigneusement le sang dilu 2 3 volumes sur le FICOLL PAQUE PLUS 1 volume et centrifuger 1000 x g pendant 22 min tout en maintenant la temp rature entre 18 et 25 C Le calculateur de vitesse de centrifugation disponible sur le CD fourni avec le kit peut aider convertir les vitesses de xg en rpm Si les chantillons ont t pr lev s entre 8 et 82 heures plus t t ils devraient tre m lang s au r actif T Cell Xtend avant d tre d pos s sur FICOLL PAQUE PLUS La proc dure est d crite de fa on d taill e dans la notice fournie avec le r actif T Cell Xtena Si des tubes Leucosep ou le r actif T Cell Xtend disponibles aupr s d Oxford Immunotec sont utilis s suivre les protocoles fourni
5. 31 1132 1135 Jafari et al 2009 Am J Respir Crit Care Med 180 7 666 673 Dheda et al 2009 Thorax 64 10 847 853 et Patel et al 2010 Am J Respir Crit Care Med 182 4 569 77 En cas d utilisation d chantillons non sanguins les utilisateurs doivent valider les proc dures pour le pr l vement d une quantit suffisante de cellules mononucl es Les m thodes pour le traitement des chantillons de LBA sont d crites dans les publications mentionn es ci dessus 7 PI TB IVD FR V2 Remarque 1 la valeur seuil pour un r sultat positif et des contr les valides pour le test au moyen d chantillons non sanguins n ont pas fait l objet d une valuation approfondie et peuvent diff rer du test sanguin Les utilisateurs devront d finir leurs propres crit res d interpr tation du test Les cliniciens devront faire appel leur jugement lors de l examen des r sultats Remarque 2 le d lai entre l obtention de l chantillon et le d but du test n a pas t tudi de mani re approfondie Comptage des cellules et dilution Le test T SPOT TB n cessite 2 5 x 10 PBMC viables par puits Au total quatre puits sont requis pour chaque chantillon d un patient Le nombre de cellules introduites dans chaque puits doit tre correct faute de quoi l interpr tation du r sultat risque d tre erron e M thode Notes 1 Effectuer le comptage des cellules viables 1 Les cellules peuvent tre compt es de plusieurs fa
6. fourni Le kit T SPOT TB 8 contient 1 1 plaque de microtitration 96 puits fournis sous forme de 12 bandes de 8 puits dans un cadre enduits d un anticorps monoclonal murin anti cytokine interf ron gamma IFN y 2 2 flacons 0 8 ml chacun Panel A contenant antig nes ESAT 6 albumine bovine et agents antimicrobiens 3 2 flacons 0 8 ml chacun Panel B contenant antig nes CFP10 albumine bovine et agents antimicrobiens 4 2 flacons 0 8 mi chacun Contr le Positif contenant la phytoh magglutinine PHA utilis e comme contr le de la fonctionnalit des cellules albumine bovine et agents antimicrobiens 5 1 flacon 50 ul de r actif conjugu concentr 200 x anticorps monoclonal murin anti cytokine IFN y conjugu la phosphatase alcaline 6 1 flacon 25 ml de solution de substrat solution BCIP NBT pr te l emploi 7 Mode d emploi que lon retrouve sur le CD avec la fiche signal tique des donn es de s curit le Guide de formation le calculateur de dilution cellulaire T SPOT le calculateur de dilution du r actif conjugu le calculateur de vitesse de centrifugation et le programme T SPOT AutoReporter Conservation Conserver tous les composants du kit une temp rature situ e entre 2 et 8 C Eviter l exposition prolong e de la solution de substrat la lumi re Stabilit Ne pas m langer les composants de kits de lots diff rents Conserver le kit non ouvert une temp r
7. ons dont le comptage manuel en utilisant du bleu trypan et un h mocytom tre et le comptage automatique laide d un instrument appropri 2 En bref pour le comptage manuel au moyen 2 Faire attention et s assurer que la d un h mocytom tre Neubauer introduire 10 ul suspension de cellules est enti rement de suspension cellulaire finale dans 40 ul de solution de bleu trypan 0 4 p v Placer un volume appropri sur l h mocytom tre et compter les cellules dans la grille Pour les autres types d h mocytom tre et pour les instruments automatiques suivre les consignes du fabricant m lang e juste avant le pr l vement en vue de la dilution ou du comptage car des cellules peuvent se d poser au fond du tube ce qui entra nerait une interpr tation erron e du vrai nombre de cellules 3 Calculer la concentration de cellules viables pr sentes dans la suspension de cellules m re 3 S assurer que le calcul est correct compte tenu du syst me de comptage utilis l utilisation d un nombre de cellules insuffisant ou excessif pouvant entra ner une interpr tation erron e du r sultat Le calculateur de dilution cellulaire T SPOT disponible sur le CD fourni avec chaque kit facilitera ce calcul 4 Pr parer 500 ul de suspension de cellules finale une concentration de 2 5 x 10 cellules 100 ul 4 S assurer que les cellules sont bien m lang es avant le pr l vement en vue de l
8. Immunol 132 2 225 231 14 Apollonj et al 1975 Immunol Commum 4 5 453 463 J O O1 BR ND gt Glossaire des symboles g A utiliser avant Date de p remption An Mois Jour LOT Num ro de lot REF Num ro de catalogue A Attention voir le mode d emploi uil Fabricant y Suffisant pour n tests IVD Dispositif de diagnostic in vitro t Limite de temp rature A conserver entre CA Se r f rer au mode d emploi avant de proc der T SPOT T Cell Xtend et le logo d Oxford Immunotec sont des marques de commerce d Oxford Immunotec Limited AIM V et GIBCO sont des marques de commerce d Invitrogen CPT et Vacutainer sont des marques de commerce de Becton Dickinson FICOLL et FICOLL PAQUE sont des marques de commerce des soci t s du groupe GE Tween est une marque de commerce d Unigema Americas LLC Le test T SPOT TB est prot g par les brevets et les brevets en instance suivants US 7575870 US12 510 594 EP 941478 JP 4094674 AU 728357 CA 2272881 US 7115361 US 7632646 EP 1144447 JP 4633931 ZA 2001 3356 US7901898 US8216795 US13 489 621 US6290969 US6338852 US11 801 112 EP 1203817 JP 2006 034593 AU 727602 CA2653566 CN1200147 CZ300953 HU0900047 NO 9800883 TR2009 01109 ZA 9607394 ZW 10496 US 5955077 EP 0706571 AU 682879 CA 2165949 NZ 267984 US 7579141 US8021832 EP 1214088 JP4820489 AU 773268 CA 2372583 L utilisation du r actif T Cell Xtend est p
9. Panel A ou le Panel B ne soit Positif tel que d crit dans l Interpr tation des r sultats et Crit res du test voir ci dessous auquel cas le r sultat est valide En raison des variations biologiques et syst matiques potentielles lorsque le nombre de spots spots au Panel A moins spots au Contr le n gatif et spots au Panel B moins spots au Contr le 10 PI TB IVD FR V2 n gatif le plus lev est de 5 6 ou 7 le r sultat peut tre consid r comme limite quivoque Les r sultats limites quivoques bien que valides sont moins fiables que les r sultats plus loign s de la valeur seuil Il est donc recommand de retester le sujet concern l aide d un nouveau pr l vement Si le r sultat est toujours limite quivoque apr s ce nouveau test il convient d utiliser d autres tests diagnostiques et ou d autres informations pid miologiques pour aider d terminer le statut infectieux du patient Bien que les antig nes ESAT 6 et CFP10 soient absents dans les souches BCG de M bovis et dans la majorit des mycobact ries environnementales il est possible qu un r sultat Positif au test T SPOT TB soit d une infection par M kansasii M szulgai M marinum ou M gordonae D autres tests sont requis si ces infections sont suspect es Interpr tation des r sultats et crit res du test Veuillez vous r f rer la section Contr le de la Qualit avant d appliquer les crit res suiva
10. a dilution Pr paration de la plaque et incubation Le test T SPOT 7B n cessite quatre puits pour chaque chantillon d un patient Un Contr le N gatif et un Contr le Positif de la fonctionnalit des cellules doivent tre effectu s sur chaque chantillon individuel Il est recommand d organiser les chantillons verticalement sur la plaque comme illustr ci dessous O Contr le N gatif Panel A Panel B O Contr le Positif 8 PI TB IVD FR V2 M thode Notes 1 Dans le cas du test T SPOT TB 8 sortir les bandes de 8 puits pr enduites de l emballage clipper sur un cadre pour plaque et laisser stabiliser temp rature ambiante 1 Ne sortir que le nombre de bandes requis et remettre le reste dans le lieu de conservation Clipper les bandes qui seront utilis es sur un cadre pour plaque vide muni d une protection et d un couvercle Les cadres protections et couvercles sont r utilisables et doivent tre conserv s 2 Quatre puits sont n cessaires pour chaque chantillon d un patient i Introduire 50 ul de milieu de culture AIM V dans chaque puits de Contr le N gatif ii Introduire 50 ul de solution du Panel A dans chaque puits n cessaire iii Introduire 50 ul de solution du Panel B dans chaque puits n cessaire iv introduire 50 ul de solution de Contr le Positif dans chaque puits de contr le de la fonctionnalit des cellules 2 Ne pas toucher la membra
11. ature de 2 8 C Les composants du kit sont stables jusqu la date de p remption indiqu e sur l emballage du kit s ils sont conserv s et manipul s dans les conditions recommand es Le kit ne doit pas tre utilis apr s la date de p remption indiqu e sur l tiquette Conserver les composants ouverts du kit une temp rature de 2 8 C Les composants ouverts doivent tre utilis s dans les 8 semaines apr s ouverture Equipement et mat riel n cessaires mais non fournis 1 Cadre pour plaque bandes de 8 puits disponible chez Oxford Immunotec pour une utilisation avec un kit T SPOT TB 8 2 Hotte microbiologique de classe Il recommand 3 Tubes de pr l vement sanguin tels que Vacutainer CPT disponibles aupr s d Oxford Immunotec ou tubes h parin s 4 FICOLL PAQUE PLUS ou autre milieu de s paration des PBMC 4 PI TB IVD FR V2 5 R actif T Cell Xtend disponible aupr s d Oxford Immunotec pouvant tre utilis avec les chantillons recueillis plus de 8 heures auparavant 6 Tubes Leucosep pouvant tre utilis s pour simplifier la s paration des PBMC avec la m thode FICOLL 7 Centrifugeuse pour la pr paration des PBMC capable d au moins 1800 x g et de maintenir les chantillons temp rature ambiante 18 25 C 8 Equipement et r actifs permettant de compter les PBMC soit manuellement avec du bleu trypan et un h mocytom tre au microscope soit automatiquement l aide d un ana
12. ec intervalles de confiance de 90 8 99 9 La reproductibilit a t valu e comme marqueur de substitution de la variation intra essai par une analyse des chantillons sanguins effectu e en duplicat sur la m me plaque Au total 145 chantillons sanguins provenant de 140 donneurs diff rents ont t test s en duplicat deux puits pour le Panel A et deux puits pour le Panel B en utilisant le test T SPOT TB Une concordance clinique a t observ e dans 142 145 97 9 analyses des duplicats Deux duplicats ont donn des r sultats marginalement discordants et 1 145 chantillons a donn des r sultats en d saccord 11 PI TB IVD FR V2 R f rences Janeway and Travers 1996 Immunobiology 2 Ed Staines et al 1999 Introducing Immunology 2 Ed Chapman et al 2002 AIDS 16 17 2285 2298 Ewer et al 2003 Lancet 361 1168 1173 Voir www elispot analyzers de english science elispot assays html Pathan et al 2001 J Immunol 167 5217 5225 Lalvani et al 2001 Lancet 357 2017 2021 Lalvani et al 2001 Am J Resp Crit Care Med 163 824 828 Lalvani et al 2001 J Infect Dis 183 469 477 10 Meier et al 2005 Eur J Clin Microbiol Infect Dis 24 529 536 11 Zellweger et al 2005 Int J Tuberculosis and Lung Dis 9 11 1242 1247 12 Directive approuv e par le NCCLS Performance of single Cell Immune Response Assays l LA26 A 13 Koller et al 2003 Clin Exp
13. ionnelle dans la mesure o la cytokine cible est captur e directement autour de la cellule s cr trice avant qu elle ne soit dilu e dans le surnageant captur e par les r cepteurs de cellules adjacentes ou encore d grad es Ceci rend les tests ELISPOT beaucoup plus sensibles que les mesures ELISA conventionnelles Le test T SPOT TB est con u pour d tecter les cellules T effectrices qui r pondent une activation par des antig nes sp cifiques de M tuberculosis Ce test quantifie individuellement les cellules T activ es par des antig nes sp cifiques de la tuberculose Il est adapt pour tous les patients risque de LTBI ou suspect s de tuberculose quel que soit leur ge leur sexe leur groupe ethnique leur th rapie ou leur statut immunologique Principes de la proc dure Les cellules mononucl es de sang p riph rique PBMC sont s par es de l chantillon de sang total et lav es pour liminer toutes les sources de bruit de fond Les PBMC sont ensuite compt es de sorte qu un nombre standardis de cellules soit utilis Ceci permet de garantir qu un nombre ad quat de cellules est introduit dans les puits de microtitration et cela m me chez ceux dont les titres de cellules T sont faibles en raison de l affaiblissement de leur syst me immunitaire individus immunocompromis ou immunosupprim s Les tapes de lavage et de comptage ainsi que la technique d ELISPOT permettent d obtenir des r sultats su
14. loppement et comptage des spots Pendant les tapes de lavage de la plaque et de d veloppement ne pas toucher la membrane avec l embout des pipettes ou les canaux du laveur de puits automatis Les indentations de la membrane caus es par l embout des pipettes ou du laveur de puits peuvent se r v ler comme des artefacts dans les puits ce qui pourrait perturber le comptage des spots M thode Notes 1 Sortir la plaque de l incubateur et liminer le milieu de culture des cellules 1 ce moment l sortir la solution de substrat du kit et laisser se stabiliser temp rature ambiante 2 introduire 200 ul de solution D PBS dans chaque puits 8 Eliminer la solution D PBS R p ter le lavage du puits encore 3 fois avec de la 4 Diluer le r actif conjugu concentr au 1 200 me avec le D PBS pour obtenir la solution de travail solution fra che pour chaque lavage absorbant avant de continuer 8 Eliminer tout le D PBS de la derni re tape de lavage en retournant la plaque sur du papier 4 Ne pas utiliser de D PBS contenant du Tween ou d autres d tergents car cela entra ne un bruit de fond lev S assurer de ne pr parer qu une petite quantit exc dentaire PI TB IVD FR V2 de la solution de travail pour permettre une perte Ainsi avec le test T SPOT TB 96 pour lequel chacun des 96 puits n cessite 50 ll pr parer 5ml de la solution de travail en ajoutant 25
15. lyseur h matologique 9 Incubateur humidifi 5 de CO 37 1 C 10 Laveur de plaques de microtitration ou mat riel pour le lavage manuel des plaques 11 Pipettes et embouts de pipette st riles 12 D PBS st rile tel que GIBCO 1 x D PBS Invitrogen num ro de catalogue 14040 091 13 Eau distill e ou eau d ionis e 14 Un moyen de lecture des plaques tel qu un microscope un microscope num rique une loupe ou un lecteur de plaque 15 Milieu de culture cellulaire st rile tel que GIBCO AIM V Invitrogen num ro de catalogue 31035 025 l utilisation de ce milieu sans s rum dans l tape d incubation est fortement recommand e Le milieu RPMI 1640 Invitrogen num ro de catalogue 21875 034 ne peut tre utilis que pour les tapes initiales de pr paration des chantillons Il est recommand de conserver le milieu de culture cellulaire dans des aliquotes appropri es et d liminer le mat riel exc dentaire apr s emploi Le milieu de culture cellulaire doit tre r chauff 37 C avant de l utiliser avec le test T SPOT TB Pr paration du r actif 1 Plaque de microtitration La plaque de microtitration T SPOT 7TB 8 est fournie pr te l emploi Sortir le nombre requis de bandes de 8 puits du lieu de conservation et laisser se stabiliser temp rature ambiante Refermer herm tiquement les bandes restantes dans l emballage ext rieur en aluminium avec le sachet de d shydratant Les flacons d
16. ne avec l embout de la pipette Les indentations dans la membrane caus es par l embout des pipettes peuvent causer des artefacts dans les puits Il sera peut tre n cessaire de tapoter la plaque pour s assurer que les solutions couvrent la membrane au fond de chaque puits Eviter de l agiter vigoureusement pour minimiser la possibilit de contamination crois e des antig nes entre les puits 8 Dans chacun des 4 puits qui sera utilis pour l chantillon d un patient introduire 100 pl de suspension de cellules finale du patient contenant 250 000 cellules viables 3 M langer la suspension de cellules en pipetant soigneusement plusieurs fois avant de pr lever chaque aliquote de 100 pi Il est recommand d utiliser un nouvel embout pour chaque pr l vement de cellules T de chaque patient pour viter la possibilit de contamination entre les 4 puits 4 Incuber la plaque 37 C dans un incubateur humidifi 5 de CO pendant 16 20 heures 4 Eviter de remuer la plaque une fois qu elle se trouve dans l incubateur Ne pas empiler les plaques car cela peut entra ner une r partition in gale de la temp rature et de la ventilation Le non respect des conditions et du temps d incubation recommand s peut entra ner une interpr tation erron e du r sultat V rifier que l incubateur contienne suffisamment d eau pour maintenir l humidit pendant la p riode d incubation D ve
17. nts Le test T SPOT TB s interpr te en soustrayant le nombre de spots du Contr le N gatif du nombre de spot dans chacun des panels selon l algorithme suivant e Le r sultat du test est Positif si Panel A moins Contr le N gatif et ou Panel B moins Contr le N gatif est z 6 spots e Le r sultat du test est N gatif si Panel A moins Contr le N gatif et Panel B moins Contr le N gatif sont lt 5 spots Ceci comporte les valeurs inf rieures z ro Un r sultat Positif indique que l chantillon contient des cellules T effectrices r agissant M tuberculosis Un r sultat N gatif indique que l chantillon ne contient probablement pas de cellules T effectrices r agissant M tuberculosis Caract ristiques de performance du test La sp cificit a t valu e en testant 93 chantillons de donneurs qui d apr s leurs ant c dents m dicaux et les renseignements personnels ont t jug s comme pr sentant un faible risque d infection par M tuberculosis La sp cificit du test T SPOT TB a t calcul e comme tant de 100 93 93 niveau de confiance 95 avec intervalles de confiance de 95 8 100 La sensibilit a t valu e en testant 87 chantillons provenant de cas d infection par M tuberculosis confirm s par culture comprenant des groupes immunod prim s La sensibilit du test T SPOT TB a t calcul e 98 8 86 87 niveau de confiance 95 av
18. p rieurs dans la d tection de la tuberculose ou d infection tuberculeuse latente Quatre puits voir Figure 1 sont n cessaires pour chaque pr l vement 1 Un Contr le N gatif pour identifier l activation cellulaire non sp cifique 2 Des antig nes sp cifiques de la TB Panel A ESAT 6 3 Des antig nes sp cifiques de la TB Panel B CFP10 4 Un Contr le Positif la phytoh maggjlutinine PHA un activateur polyclonal connu pour confirmer la fonctionnalit des PBMC 2 PI TB IVD FR V2 Plasma au _Centifuger veineux entriiuger p riph rique y Globules rouges Pr lever PBMC laver et compter Introduire PBMC Incuber pendant la nuit et antig nes OO0OO00O0O dans 4 puits Compter les spots color s dans chaque puits Laver d velopper et s cher la plaque Figure 1 Principales tapes du test T SPOT TB Veuillez noter que chaque plaque contient 96 puits Les PBMC sont incub es avec les antig nes pour permettre la stimulation des cellules T sensibilis es ventuellement pr sentes La cytokine produite est captur e par des anticorps sp cifiques sur la membrane qui forme la base du puits et les cellules et autres mat riels ind sirables sont limin s par lavage Un second anticorps conjugu la phosphatase alcaline et dirig sur un diff rent pitope de la cytokine est ajout et se fixe sur la cytokine captur e la surface de la membrane Tout conj
19. r la membrane de chaque puits Appliquer l Interpr tation des r sultats et Crit res du test voir ci dessous pour d terminer si l chantillon du patient est Positif ou N gatif aux antig nes TB 10 Les spots peuvent tre visualis s de plusieurs fa ons savoir une loupe main un microscope ad quat un microscope num rique ou un lecteur de plaque ELISPOT d di Un guide de formation au comptage des spots le programme T SPOT 7Tutor peut tre obtenu sur le site internet d Oxford Immunotec Contr le de la qualit Dans un r sultat type on s attend ce qu il y ait peu ou pas de spots dans le Contr le N gatif et plus de 20 spots dans le Contr le Positif Le Contr le N gatif sera consid r comme Ind termin si le nombre de spots compt s est sup rieur 10 Se r f rer au Guide de formation T SPOT TB pour les causes possibles t l charger partir de www oxfordimmunotec com Il est recommand de pr lever un autre chantillon sur l individu et de refaire le test Normalement le nombre de spots pour le Contr le Positif de la fonctionnalit des cellules devrait tre 2 20 ou montrer une saturation spots trop nombreux pour les compter Il est possible que les cellules T d une faible proportion de patients ne montre qu une r action limit e la PHA Le Contr le Positif sera consid r comme Ind termin quand le nombre de spot est lt 20 spots moins que le
20. rmalement chez un sujet immunocomp tent il est possible d obtenir suffisamment de PBMC provenant de pr l vements de sang veineux pour r aliser l essai selon les directives suivantes e Adultes et enfants de plus de 10 ans un tube CPT de 8 ml deux tubes CPT de 4 ml ou un tube h parine de 6 ml e Enfants de 2 9 ans un tube CPT ou h parine de 4 ml e Enfants de moins de 2 ans un tube p diatrique de 2 ml 5 PI TB IVD FR V2 Les chantillons de sang doivent tre conserv s temp rature ambiante et test s dans les 8 heures suivant le pr l vement ou apr s 32 heures et conserv s 10 25 C si l chantillon est trait par le r actif T Cell Xtend Le milieu de culture cellulaire doit tre r chauff 37 C avant de l utiliser avec le test T SPOT TB M thode Notes 1 Pr lever un chantillon de sang selon le mode d emploi fourni avec le dispositif de pr l vement Conserver le sang pr lev temp rature ambiante 18 25 C ou entre 10 et 25 si le r actif T Cell Xtend est utilis Ne pas r frig rer ni congeler 1 Les chantillons de sang peuvent tre recueillis dans divers tubes Dans nos laboratoires nous avons utilis avec succ s des tubes Vacutainer CPT citrate des tubes CPT h parine et des tubes h parine standards Seuls les tubes h parine peuvent tre utilis s avec le r actif T Cell Xtend Les tubes EDTA ne sont pas recommand s PI TB IVD FR V2
21. rot g e par les brevets et brevets en instance suivants EP2084508 US13 253 598 CN101529221 AU2007 303994 JP2009 530943 IN2165 DELNP 2009 CA2665205 Le test T SPOT TB int gre une technologie brevet e accord e sous licence par le Statens Serum Institut Copenhague Danemark et Isis Innovation Limited Oxford RU Oxford Immunotec Limited 2013 Tous droits r serv s Fabricant Oxford Immunotec Ltd 94C Innovation Drive Milton Park Abingdon Oxfordshire OX14 4RZ RU www oxfordimmunotec com Oxford Immunotec Ltd QQQ Oxford pasig neorston Drive Milton Park O00 t Tel 44 0 1235 442780 OOO m m u n 0 ec a pA an LS Harnessing the power of T cell measurement WWW oxford imm u notec com 12 PI TB IVD FR V2
22. s avec ces produits 8 Recueillir la bande blanche et trouble de PBMC l aide d une pipette et transf rer dans un tube centrifuger conique de 15 ml Ajouter le milieu de culture cellulaire pour obtenir un volume de 10 ml 3 Divers milieux peuvent tre utilis s pour laver les cellules durant ce processus Dans nos laboratoires les milieux AIM V et RPMI 1640 ont tous deux t utilis s avec succ s et sont recommand s 4 Centrifuger 600 x g pendant 7 min Vider le surnageant et resuspendre le culot dans 1 ml de milieu 4 Voir 3 ci dessus 5 Ajouter du milieu neuf pour obtenir un volume de 10 mi et centrifuger 350 x g pendant 7 min 5 Voir 3 ci dessus 6 Vider le surnageant et resuspendre le culot dans 0 7 ml de milieu de culture AIM V 6 ce stade le culot doit tre resuspendu dans le milieu de culture pour l incubation de nuit Dans nos laboratoires le milieu sans s rum AIM V a t utilis avec succ s et est fortement recommand Les cellules T obtenues partir d autres liquides organiques tel qu un lavage broncho alv olaire LBA un panchement pleural EP ou un liquide c r brospinal LCS ont t utilis es avec succ s avec le test T SPOT TB afin d identifier une tuberculose ou une infection TB Jafari et al 2006 Am J Respir Crit Care Med 174 1048 1054 Jafari et al 2008 Eur Resp J 31 261 265 Strassburg et al 2008 Eur Resp J
23. ts de sang doivent tre conserv s et transport s vers le laboratoire temp rature ambiante 18 25 C Si le r actif T Cell Xtend est utilis les chantillons peuvent tre transport s et conserv s une temp rature comprise entre 10 et 25 C Ne pas r frig rer ou congeler les chantillons de sang total e Le test T SPOT TB doit tre utilis et interpr t uniquement dans le contexte du tableau clinique global e Un r sultat n gatif du test n exclut pas la possibilit d une exposition ou d une infection par M tuberculosis 3 PI TB IVD FR V2 e Les antig nes ESAT 6 et CFP10 sont absents dans les souches BCG et dans la plupart des mycobact ries environnementales except M kansasi M szulgai M marinum et M gordonae Mises en garde s curitaires et pr cautions Des pr cautions doivent tre prises lors de la manipulation de produits d origine humaine Tous les chantillons de sang doivent tre consid r s comme potentiellement infectieux La manipulation des chantillons de sang et des composants de l essai ainsi que leur utilisation conservation et limination doivent se faire conform ment aux proc dures stipul es dans les directives ou r glements nationaux appropri s sur la protection contre les biorisques Des pr cautions doivent tre prises lors du travail avec des produits chimiques Tous les produits chimiques doivent tre consid r s comme potentiellement dangereux Mat riel
24. ugu non fix est limin par lavage Un substrat soluble est ajout dans chaque puits il est cliv par l enzyme qui lui est li e et forme ainsi un spot de pr cipit insoluble au site de la r action Chaque spot repr sente l empreinte d une cellule T individuelle s cr trice de cytokines et le comptage des spots obtenus donne une mesure de la quantit de cellules T effectrices sensibles M tuberculosis dans le sang p riph rique Limitations e Pour diagnostic in vitro uniquement e Emploi professionnel uniquement e Le kit T SPOT TB 96 est con u pour un usage unique alors que le kit T SPOT 7B 8 permet un usage multiple e Ne pas m langer les composants de kits de lots diff rents Lire attentivement la notice d utilisation avant l emploi e Travailler de mani re aseptique afin d viter de contaminer les r actifs les puits les suspensions cellulaires et les milieux de culture cellulaire e Tout cart par rapport aux techniques de pipetage et de lavage et aux temps et ou temp ratures incubation indiqu s peut influencer les r sultats obtenus et doit tre vit e Le sang pr lev pour le test doit tre utilis dans les 8 heures Ce d lai peut tre prolong en utilisant le r actif T Cell Xtend disponible aupr s d Oxford Immunotec Lorsque le r actif T Cell Xtend est utilis conjointement au test T SPOT TB le d lai de conservation de l chantillon est port 32 heures e Les pr l vemen
25. ul de r actif conjugu concentr 4975 ul de D PBS Pour le test T SPOT 7TB 8 et pour chaque bande de 8 puits chaque puits n cessitant 50 ul pr parer 500 ul de la solution de travail en ajoutant 2 5 ul de r actif conjugu concentr 497 5 ul de D PBS Le calculateur de dilution du conjugu disponible sur le CD fourni avec chaque kit de test peut tre utilis pour effectuer ce calcul 5 introduire 50 ul de solution de travail du r actif conjugu dans chaque puits et incuber 2 8C pendant 1 heure 5 Le non respect du temps d incubation recommand peut entra ner une interpr tation erron e du r sultat 6 Eliminer le conjugu et effectuer quatre lavages au D PBS comme d crit aux tapes 2 et 3 ci dessus 7 Introduire 50 ul de solution de substrat dans chaque puits et incuber temp rature ambiante pendant 7 min 7 Le non respect du temps d incubation recommand peut entra ner une interpr tation erron e du r sultat 8 Laver la plaque abondamment avec de l eau distill e ou d ionis e pour arr ter la r action de d tection 9 Laisser s cher la plaque en la mettant dans un endroit bien a r ou dans un four une temp rature maximale de 37 C 9 Les spots deviennent plus visibles avec le s chage de la plaque Laisser s cher 4 heures 37 C ou jusqu au lendemain temp rature ambiante 10 Compter et noter le nombre de spots bleu fonc distincts su
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