RELISA dsDNA Fr - Immuno Concepts
Contents
1. talon 3 en double Un puits est utilis pour un r actif blanc Nous recommandons que chaque contr le et chantillon de patient soit dos en double jusqu ce qu une pr cision acceptable pour le dosage soit tablie dans votre laboratoire PR PARER LA SOLUTION TAMPON DE LAVAGE PBS Tween Dissoudre le contenu d une pochette de poudre tampon dans un litre d eau d sionis e ou distill e Ajouter le contenu entier d une 10 bouteille de concentr de tampon de lavage au contenant de 1L de PBS dissous Bien m langer La solution tampon de lavage peut tre couverte et stock e 2 25 C jusqu quatre semaines DILUER LES ECHANTILLONS DE PATIENTS Diluer les chantillons de patient 1 40 en ajoutant 25 ul de s rum 975 lil de diluant d chantillons Bien m langer Les talons contr les positifs et n gatifs sont fournis la dilution active et ne demandent pas de dilution suppl mentaire PREPARER LES MICROPUITS Retirer le nombre requis de barrettes de micropuits de la pochette et les placer dans le portoir Les micropuits doivent tre 11 positionn s fermement dans le portoir Appuyer fermement vers le bas aux deux extr mit s des barrettes afin qu elles se logent fermement dans le portoir Si on utilise des puits individuels ou moins qu une pleine barrette de puits il faut veiller ce que chaque puits soit fermement log Les puits qui sont log s correctement dans le portoir ne tomberont pas lorsque2. Vedove C D Giglio M D Schena D et al Drug induced Lupus Erythematosus Arch Dermatol Res 301 99 105 2009 15 Egner W The use of laboratory tests in the diagnosis of SLE J Clin Pathol 53 424 432 2000 Au cas o l emballage protecteur est abim veuillez contacter Immuno Concepts avant utilisation JEC REP CE Repr sentant autoris pour la Communaut Europ enne Fabricant Limite de temp rature Contenu suffisant pour lt n gt tests Consulter le mode d emploi Appareil de diagnostic m dical n Vitro MDSS GmbH Schiffgraben 41 D 30175 Hannover Immuno Concepts N A Ltd 9825 Goethe Road Suite 350 Sacramento CA 95827 Assistance technique Aux E U 1 800 251 5115 Hors des E U 1 916 363 2649 Courriel technicalsupport immunoconcepts com Cat 7096 17 I 4 11 02 003 124 Fr 7 Rev 2 0 Copyright 2014 PROC DURE DE TEST RELISA ANTI DSDNA Tous chantillons r actifs y compris solution tampon de lavage et les micropuits doivent tre temp rature ambiante avant leur emploi PR PARER LA FEUILLE DE TRAVAIL 8 tiqueter la feuille de travail qui est jointe dans le kit pour indiquer la position des chantillons dans les micropuits Doser les talons en double Pour utiliser la courbe multi points les quatre s rums talons doivent tre ex cut s Pour la m thode d talonnage 9 facultative point unique n ex cuter que le s rum
3. SENSIBILIT CLINIQUE Des chantillons de s rum de 39 patients atteints de LED ont t test s par le syst me de test Immuno Concepts RELISA anti dsDNA Huit 20 5 de ces chantillons taient positifs pour les anticorps anti dsDNA REPRODUCTIBILIT La pr cision du dosage a t mesur e par trois chantillons qui avaient des valeurs anti dsDNA dans la portion lin aire de la courbe d talonnage Ces chantillons ont t ex cut s 20 fois sur trois num ros de lot diff rents de barrettes de micropuits enduits d antig ne en un seul v nement d analyse et par un technicien La pr cision intra dosage et inter dosage est montr e dans les Tables suivantes PR CISION INTRA DOSAGE n 20 Moyenne Ul ml E T C V Sp cimen 1 610 14 2 Sp cimen 2 315 14 5 Sp cimen 3 114 10 9 PR CISION INTER DOSAGE n 60 Moyenne Ul ml E T C V Sp cimen 1 601 24 4 Sp cimen 2 329 16 5 Sp cimen 3 122 11 9 VALIDATION DE L TALONNAGE POINT UNIQUE L utilisation d un talon point unique a t valid e au moyen du m me panneau de 108 s rums qui ont t utilis s pour comparaison l appareil pr dicats L analyse de r gression de cette comparaison a montr un coefficient de r gression de 97 95 D un point de vue pratique nous n avons vu que trois chantillons dans cette comparaison 2 7 qui ont montr des contradictions diagnostiques entre le syst me d talonnage quatre points et le syst me d talon
4. SULTATS Les r sultats devraient tre rapport s comme positifs ou n gatifs pour les anticorps anti dsDNA au moyen de la valeur Ul ml Les niveaux d anticorps trouv s dans un chantillon unique ont une signification clinique limit e Des d terminations en s rie de niveaux d anticorps sur un patient peuvent indiquer la mont e ou la chute des niveaux d anticorps 13 LIMITES DE LA PROCEDURE 1 Le diagnostic ne peut tre fait partir de la seule d tection d anticorps anti dsDNA Le m decin doit interpr ter ces r sultats conjointement avec le dossier et les sympt mes du patient les conclusions physiques et d autres proc dures diagnostiques 2 Le traitement ne peut pas commencer bas sur le seule test positif pour les anticorps anti dsDNA Les indications cliniques d autres r sultats de laboratoire et l impression clinique du m decin doivent tre pris en consid ration avant de commencer tout traitement 3 Certains m dicaments y compris la procainamide et l hydralazine peuvent induire une maladie semblable au lupus ryth mateux Les patients souffrant de LE induit par un m dicament peuvent montrer des ANA positifs dirig s commun ment contre des histones nucl aires bien que les anticorps anti dsDNA aient aussi t rapport s 9 10 14 4 Bien qu un haut niveau d anti dsDNA puisse fortement sugg rer un LED il ne peut pas tre consid r comme diagnostique mais doit plut t tre interpr t comme faisant
5. la valeur de densit optique des puits blanc de celles obtenues dans les puits d chantillonnage de contr le et d chantillons du patient Calculer les valeurs moyennes de densit optique des puits en double Diviser la concentration en anticorps sp cifiques en Ul ml de l talon 3 indiqu e sur l tiquette par la valeur de densit optique moyenne des puits talons pour obtenir le Facteur de conversion Multiplier les valeurs de densit optique de chacun des chantillons par le facteur de conversion afin d obtenir la concentration en anticorps sp cifiques en Ul ml 4 4 La forme simplifi e de ces calculs peut tre exprim e de la fa on suivante Valeur talon 3 Ul ml x densit optique de l chantillon Ul ml Valeur pour chantillon densit optique talon 3 Si les talons et les chantillons sont ex cut s en double utiliser la moyenne des densit s optiques des puits en double CONTR LE QUALIT 1 La valeur moyenne de densit optique de l talon 3 doit tre d au moins 0 400 Les valeurs de densit optique inf rieures 0 400 indiquent un d veloppement de couleur inad quat et une ex cution invalide Le d veloppement de couleur inad quate est habituellement d l utilisation de r actifs froids ou une dur e inexacte pour une ou plusieurs tapes du dosage Laisser les r actifs de se r chauffer temp rature ambiante 18 25 C et r p ter l ex cution en faisant particuli
6. le portoir est retourn Si le test requiert moins de huit puits ceux ci peuvent tre s par s par simple rupture Remettre les barrettes non utilis es dans la pochette m tallis e refermer herm tiquement puis r frig rer jusqu 45 jours maximum 12 DISTRIBUER LES DILUTIONS DE SERUM Distribuer 100 ul d talons de contr les et d chantillons dilu s de patients dans les puits appropri s comme d crit sur la feuille de travail Distribuer 100 ul de diluant d chantillon dans le puits du r actif blanc 13 INCUBER LES BARRETTES 30 minutes temp rature ambiante c d 18 25 C Mettre incuber 30 minutes temp rature ambiante Les barrettes devraient tre abrit es des courants d air ou des changements de temp rature pendant l incubation Les barrettes peuvent tre ventuellement recouvertes d une bande transparente ou d une 14 serviette en papier pour les prot ger de la poussi re ou d autres corps trangers LAVAGE DES BARRETTES consulter les notes 5 et 6 de la proc dure g n rale Laver les puits 3 5 fois avec la solution tampon de lavage au PBS Tween Pour le lavage manuel aspirer le contenu des puits puis les remplir de solution tampon de lavage viter la contamination crois e des puits en particulier lors du premier lavage apr s aspiration Vider toute la solution tampon de lavage des puits en les retournant puis en les secouant d un geste sec du poignet afin d limi
7. partie de l historique clinique g n ral d un patient De faibles niveaux d anticorps anti ds DNA sont souvent pr sents dans le s rum de patients atteints de polyarthrite rhumato de de syndrome de Sj gren de scl rose syst mique progressive de dermatomyosite de lupus ryth mateux disco de et de connectivit mixte 2 Les patients sous th rapie aux st ro des peuvent avoir des r sultats n gatifs pour les anticorps anti dsDNA 11 Les r sultats de ce test doivent tre utilis s conjointement aux renseignements disponibles venant de l valuation clinique et d autres proc dures diagnostiques pour permettre de d terminer l tat clinique d un patient VALEURS ATTENDUES La valeur attendue dans la population normale est n gative moins que 35 Ul ml Jusqu 70 des patients atteints de lupus diss min peuvent pr senter des anticorps anti dsDNA 15 Certains m dicaments peuvent induire la production d anticorps anti dsDNA 14 CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE Le syst me de test Immuno Concepts RELISA anti dsDNA ES a t compar un autre syst me de test EIA d IgG anti dsDNA sp cificit rehauss et distribu dans le commerce La population tudi e comprenait 108 chantillons positifs pour ADN double brin et 100 chantillons normaux des donneurs de sang qui ont t test s en parall le sur le dispositif de pr dicat et le dispositif tudi Sur la base de cette comparaison les donn es suivantes o
8. rement attention au temps de chaque tape 2 Le puits de contr le blanc doit avoir une valeur de densit optique inf rieure 0 150 Les valeurs de densit optique blanc sup rieures 0 150 indiquent un lavage inad quat ou une contamination des r actifs et une ex cution invalide 3 Les valeurs d anticorps anti dsDNA obtenues pour les s rums de contr le positifs et n gatifs doivent tre comprises dans la plage indiqu e sur l tiquette Cette plage a t tablie pour englober 95 des valeurs attendues suite une variation statistiquement normale De faibles carts peuvent occasionnellement tre observ s hors de ces plages Chaque laboratoire doit tablir ses propres crit res d acceptation de rejet en se fondant sur sa propre exp rience avec ce dosage 4 Les chantillons dont les valeurs d anticorps sp cifiques sont plus lev es que la limite sup rieure de l talon 3 devraient tre rapport s comme plus lev s que la valeur de l unit de l talon 3 5 La courbe talon doit tre trac e pour chaque ex cution ou alors un Facteur de conversion doit tre calcul si vous utilisez l talonnage facultatif point unique L utilisation d une courbe talon d une autre analyse invalidera les r sultats 6 Chaque laboratoire doit tablir et conserver ses propres valeurs de plage de r f rence normale en fonction de la population de patients et d autres facteurs locaux 7 Le contr le positi
9. Erythematosus A Long Term Study Using the Farr Test and the DNA Counterimmunoelectrophoretic Method Clin Exp Immunol 22 9 15 1975 5 Wold R T Young F E Tan E M et al Deoxyribonucleic Acid Antibody A Method to Detect its Primary Interaction With Deoxyribonucleic Acid Science 161 806 807 1968 6 Ginsberg B Keiser H A Millipore Filter Assay for Antibodies to Native DNA in Sera of Patients with Systemic Lupus Erythematosus Arthritis Rheum 16 199 207 1973 7 Schur P H DeAngelis D Jackson J M Immunological Detection of Nucleic Acids and Antibodies to Nucleic Acids and Nuclear Antigens by Counterimmunoelectrophoresis Clin Exp Immunol 17 209 218 1974 8 Crowe W Kushner I An Immunofluorescent Method using Crithidia luciliae to Detect Antibodies to Double Stranded DNA Arth Rheum 20 811 814 1977 9 Epstein W V Specificity of SLE Serum Antibody for Single Stranded and Double Stranded DNA Configuration J Rheum 2 215 220 1975 10 Alarcon Segovia D Fishbein E Patterns of Antinuclear Antibodies and Lupus Activating Drugs J Rheum 2 167 171 1975 11 Ballou S P Kushner I Anti Native DNA Detection by the Crithidia luciliae Method Arthritis Rheum 22 321 328 1979 12 Data on file Immuno Concepts N A Ltd 13 Kavanaugh A F Solomon D H et al Guidelines for Immunologic Laboratory Testing in the Rheumatic Diseases Anti DNA Antibody Tests Arthritis Care Res 47 546 555 2002 14
10. ans la composition de ce produit ont t test s au moyen de m thodes approuv es par la FDA am ricaine et se sont r v l s n gatifs non r activit r p t e vis vis des anticorps des virus de l immunod ficience humaine 1 et 2 VIH 1 et 2 des anticorps du virus de l h patite C HCV et de l antig ne de surface de l h patite B HBSAg N anmoins aucune m thode de test ne peut offrir la certitude de l absence de VIH 1 VIH 2 HCV HBV ou d autres agents infectieux Par cons quent tous les mat riels du kit doivent tre manipul s comme si potentiellement infectieux 2 Tous les chantillons de patients doivent tre manipul s conform ment aux recommandations de niveau 2 de bios curit comme recommand pour tout chantillon de s rum ou de sang humain potentiellement infectieux dans le manuel du Centers for Disease Control National Institutes of Health Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 1999 Edition 3 La dilution des composants ou la substitution par des composants autres que ceux fournis avec ce syst me peut donner lieu des r sultats incoh rents 4 L azide de sodium 0 09 est utilis comme agent de conservation L azide de sodium peut r agir au contact des canalisations en plomb ou en cuivre et former des sels d azides m talliques explosifs Lors de l limination des r actifs rincer abondamment les canalisations l eau du robinet afin d viter toute accumulation de r sidu
11. corps antihumain conjugu de la peroxydase de raifort li e des anticorps anti dsDNA humains eux m mes li s l antig ne stabilis sur la surface en plastique Apr s un deuxi me lavage ce complexe est d tect par ajout d une solution de t tram thylbenzidine TMB et de H202 servant de substrat chromog ne Le degr de d veloppement de la couleur dans chaque puits est proportionnel la concentration en anticorps anti dsDNA dans chaque chantillon de s rum Chaque micropuits est lu 450 nm au moyen d un spectrophotom tre immuno concepts COMPOSITION DES SYSTEMES MATERIELS FOURNIS Conservation Tous les composants doivent tre conserv s au r frig rateur entre 2 10 C Ne pas congeler Stabilit Tous les composants sont stables pendant 12 mois compter de la date de fabrication Ne pas utiliser de composants au del de leur date de p remption RE ACTIFS Barrettes de micropuits enduits de dsDNA PLATE No de r f rence 7008 17 Un cadre de micropuits qui contient douze barrettes de huit puits enduit de dsDNA Si le test requiert moins de huit puits ceux ci peuvent tre s par s par simple rupture Remettre les barrettes non utilis es dans le sachet m tallis en pr sence du sachet absorbeur d humidit refermer herm tiquement puis r frig rer jusqu 45 jours maximum Diluant pour chantillon SSOLNIDIL No de r f rence 7100 100 ml Diluant tamponn brevet utilis pou
12. de chlorhydrique et sulfurique moins de 3 chacun par volume et doit tre manipul avec pr caution Conserver hors de port e des enfants En cas de contact avec les yeux laver imm diatement et abondamment avec de l eau et consulter un m decin Ne jamais ajouter d eau ce r actif PRELEVEMENT D ECHANTILLONS Pr l vement Le s rum est l chantillon pr f rentiel Environ 5 ml de sang entier doivent tre pr lev s aseptiquement par ponction veineuse l aide d un tube pr l vement sous vide st rile ou tout autre syst me de pr l vement ad quat Laisser le sang coaguler temp rature ambiante 18 25 C Le s rum doit tre s par du caillot par centrifugation aussi rapidement que possible de fa on limiter l h molyse Substances interf rentes Les s rums pr sentant un degr lev d h molyse d ict re de lip mie ou de prolif ration microbienne doivent tre cart s car ces anomalies peuvent donner lieu de faux r sultats Les chantillons contenant des particules visibles doivent tre clarifi s par centrifugation avant de proc der au test Conservation Les s rums peuvent tre conserv s entre 2 et 10 C jusqu une semaine maximum Si le test est report ils seront congel s 20 C minimum Le s rum ne peut pas tre conserv dans un r frig rateur ou un cong lateur d givrage automatique ATTENTION Les cong lations et d cong lations successives d chantillon
13. f est un s rum humain qui contient des anticorps anti dsDNA II s agit d un contr le qualitatif qui devrait donner une valeur plus lev e que 35 Ul ml 8 Le contr le n gatif est un pool de s rum humain qui ne contient pas d anticorps anti dsDNA Ce contr le devrait donner des valeurs inf rieures 35 Ul ml INTERPR TATION DES R SULTATS DE PATIENTS Les niveaux d anticorps anti dsDNA ont montr des augmentations et des chutes au cours de la maladie mais la signification clinique d un seul niveau d anticorps est encore l tude 13 Les valeurs d unit obtenues dans ce dosage ont t con ues simplement pour s parer les patients dans les groupes g n raux suivants Les puits d chantillons de patients qui ont des valeurs calcul es plus lev es ou gale 35 Ul ml sont consid r s comme positifs Les puits d chantillons de patients qui ont des valeurs calcul es inf rieures 35 Ul ml sont consid r s comme n gatifs Chaque laboratoire doit tablir ses propre plage de r f rence et valeurs seuils sur base de la population de patients qui sont test s Les valeurs d unit sont affect es par des facteurs de patient des consid rations m caniques telles que pr cision et exactitude du pipetage et des conditions de dosage telles que temp rature et dur e des tapes Des d terminations en s rie de niveaux d anticorps sur un patient peuvent indiquer la mont e ou la chute de niveaux d anticorps RAPPORT DES R
14. f humain qui contient des anticorps anti dsDNA Ce s rum est dilution active et est pr t l emploi S rum talon anti dsDNA 1 4 can R f rences catalogue 7261 17 7262 17 7263 17 7264 17 1 5 ml chacun S rum talon humain qui contient des anticorps anti dsDNA Ces s rums talons sont dilution active et pr ts l emploi L talon 3 peut tre utilis comme talon point unique Ces s rums calibrateurs ont t test s avec OMS de r f rence Wo80 pr paration afin de d terminer la concentration en anticorps en unit s internationales mI UI ml Voir les tiquettes des flacons pour les concentrations anticorps anti ADN double brin en UI ml COMPOSANTS NON R ACTIFS Portoir de micropuits Solution tampon de lavage Tampon PBS PwDrpes No de r f rence 1011 Solution saline en poudre tamponn e au phosphate 0 01 M pH 7 4 0 2 Chaque sachet contient une quantit suffisante de poudre tampon pour pr parer un litre de solution Chaque syst me complet contient deux sachets de poudre tampon pour chaque plateau de 96 micropuits Concentr tampon de lavage ISOLNIWASH No de r f rence 1031 10 ml Solution de Tween 20 5 utiliser dans le tampon de lavage Dans les kits complets il y a deux flacons de poudre tampon concentr pour chaque plateau de 96 micropuits Pr paration Dissoudre une pochette de poudre tampon dans un litre d eau d sionis e ou distill e Ajouter le contenu entier d u
15. iC immuno concepts Syst me de test RELISA anti dsDNA Pour diagnostique in vitro Pour usage professionnel No de r f rence 7096 17 96 puits et 7696 17 576 puits USAGE PR CONIS II s agit d un syst me de test par immunodosage enzymatique pour d tecter des anticorps anti dsDNA dans le s rum humain Ce syst me de test sera utilis pour faciliter le diagnostic du lupus ryth mateux diss min RESUME ET DESCRIPTION DU TEST Les patients lupus ryth mateux diss min LED peuvent produire des anticorps dirig s contre une vari t d antig nes nucl aires mais les anticorps dirig s contre Sm antig ne Smith et l ADN double brin ds DNA montrent la meilleure corr lation avec la maladie 1 Les anticorps anti Sm d montrent un motif de coloration ANA tachet alors que les anticorps anti dsDNA d montrent g n ralement un motif de coloration ANA homog ne Bien que des niveaux faibles d anticorps anti dsDNA peuvent tre pr sents dans le s rum de patients atteints de polyarthrite rhumato de de syndrome de Sj gren de scl rodermie de dermatomyosite de lupus ryth mateux disco de et de connectivit mixte 2 des niveaux lev s d anticorps anti dsDNA sont retrouv s presque exclusivement dans le LED Les anticorps anti dsDNA seraient impliqu s dans la pathog nie des variantes les plus graves du LED lorsque d pos s sous forme de complexes immuns 3 Les anticorps anti dsDNA ont un titre
16. iner toute trace r siduelle de tampon de lavage DISTRIBUER LA SOLUTION DE SUBSTRAT Avec une minuterie pour assurer des intervalles r guliers distribuer 100 ul de solution de substrat dans chacun des puits La solution de substrat doit tre ajout e aux puits un rythme stable afin que chaque puits soit incub pendant exactement la m me dur e 30 minutes La solution de substrat dans les puits incub s avec les chantillons positifs tournera au bleu et la solution dans les puits incub s avec des chantillons n gatifs sera incolore ou bleue tr s p le INCUBER LES BARRETTES Exactement 30 minutes temp rature ambiante c d 18 25 C Mettre incuber 30 minutes exactement temp rature ambiante Les barrettes devraient tre abrit es des courants d air ou des changements de temp rature pendant l incubation DISTRIBUER LE REACTIF D ARRET Apr s que le premier puits a incub pendant exactement 30 minutes ajouter 100 ul de r actif d arr t chacun des puits dans le m me ordre et au m me rythme que pour la solution de substrat Au moment de l addition du r actif d arr t la solution bleue de substrat virera au jaune et la solution incolore restera incolore LIRE LES DENSITES OPTIQUES DES PUITS Dans les 30 minutes qui suivent l addition du r actif d arr t les puits doivent tre lus dans un spectrophotom tre de lecture de plaque Les puits sont lus 450 nm contre le contr le vierge Si un spectr
17. lev et du fait qu ils correspondent l activit de la maladie 4 leur d tection est importante dans la prise en charge des patients LED Plusieurs dosages sont disponibles pour la d tection d anticorps anti dsDNA Les m thodes les plus commun ment utilis es comprennent l immunofluorescence indirect le radioimmuno dosage la contre immuno lectrophor se et limmunodiffusion 5 8 Le syst me de test Immuno Concepts RELISA anti dsDNA est un dosage immunoenzymatique EIA qui d tecte des anticorps anti dsDNA dans le s rum PRINCIPE DU TEST Ce test est un EIA indirect Les antig nes stabilis s du dsDNA ont t peints sur la surface de micropuits pour servir de substrat antig nique dans ce syst me Des dilutions d chantillons de patient sont plac es dans les micropuits et mises incuber ce qui permet aux anticorps de l chantillon de r agir avec l antig ne sur la phase solide Apr s un lavage visant liminer les anticorps non li s et d autres prot ines s riques les puits sont mis incuber avec des anticorps antihumains de ch vre marqu s la peroxydase de raifort La pr paration d anticorps conjugu s la peroxydase de raifort inclus dans le syst me de test est sp cifique des chaines gamma d IgG humaine Apr s incubation avec le conjugu la peroxydase de raifort si les r sultats sont positifs on observe la formation d un complexe tripartite stable Ce complexe se compose d un anti
18. mplie sans pr cipitation dans ce laps de temps L utilisation d une pipette multicanaux facilite le maniement des chantillons et des r actifs et est recommand e l exception de la derni re incubation solution de substrat chaque p riode d incubation commence d s la fin de la distribution de l chantillon ou du r actif L incubation de la solution de substrat doit durer exactement 30 minutes pour chaque puits Tous les chantillons et r actifs doivent tre distribu s dans le m me ordre et un rythme constant INTERPRETATION DES RESULTATS CALCULS 1 2 Soustraire la valeur de densit optique du puits blanc de celle obtenue dans les puits standards de contr le et d chantillons de patient Calculer les valeurs moyennes de densit optique des puits en double Porter les valeurs de densit optique moyennes de chaque s rum talon 1 4 sur la feuille de travail de la courbe talon RELISA en utilisant O D blanc ajust pour laxe y et les valeurs marqu es en Ul ml pour laxe x Tracer une droite de meilleur ajustement entre les points de l talon Obtenir la valeur en Ul ml de l chantillon de chaque patient en interpolant partir de la courbe talon Si vous utilisez un logiciel utilisez un ajustement 4 param tres coordonn es log lin pour densit optique et concentration et une courbe de meilleur ajustement M THODE D TALONNAGE POINT UNIQUE FACULTATIF 1 2 3 Soustraire
19. nage facultatif point unique Tous ces chantillons avaient des valeurs anti dsDNA Ul ml pr s du seuil de 35 Ul m1 entre 33 et 40 Ul mI Ce type d chantillon est un probl me diagnostique dans tout syst me de dosage et doit tre consid r avec soin par les professionnels de laboratoire qui analysent les chantillons et interpr tent les r sultats TUDES DE R ACTIVIT CROIS E Onze s rums qui contenaient des autoanticorps y compris Sm RNP SSA SSB Scl 70 et Jo 1 ont t test s au moyen du syst me de test Immuno Concepts RELISA anti dsDNA Aucun de ces chantillons n a produit de r sultat positif dans le syst me de test Immuno Concepts RELISA anti dsDNA BIBLIOGRAPHIE 1 Nakamura R M Greenwald C A Peebles C L et al Autoantibodies to Nuclear Antigens ANA Immunochemical Specificities and Significance in Systemic Rheumatic Disease Chicago American Society of Clinical Pathologists 1978 2 Notman D D Kurata N Tan E M Profiles of Antinuclear Antibodies in Systemic Rheumatic Diseases Ann Int Med 83 464 469 1975 3 Stingl G Meingassner J G Swelty P et al An Immunofluorescence Procedure for the Demonstration of Antibodies to Native Double Stranded DNA and of Circulating DNA Anti DNA Complexes Clin Immunol Immunopathol 6 131 140 1976 4 Edmonds J P Johnson G D Ansell B M et al The Value of Tests for Antibodies to DNA in Monitoring the Clinical Course of Systemic Lupus
20. ne bouteille de tampon de lavage concentr au PBS dissous Bien m langer et conserver au entre 2 et 25 C jusqu 4 semaines ou jusqu ce que des signes de contamination ou d autres changements visibles se produisent La solution tampon de lavage doit tre temp rature ambiante 18 25 C avant son emploi Utilisation Tous les composants sont pr ts l emploi sans n cessit de diviser en partie aliquote ou de reconstitution sauf le tampon PBS qui doit tre dissous dans de l eau d sionis e ou distill e avant utilisation Stabilit Tous les composants sont stables pendant 12 mois compter de la date de fabrication Ne pas utiliser de composants au del de leur date de p remption MATERIEL SUPPLEMENTAIRE REQUIS MAIS NON FOURNI Pipeteurs volum triques de pr cision permettant de pr lever des volumes de 25 1 000 pl Pissette en plastique pour distribuer la solution tampon de lavage dans les micropuits ou syst me automatis et semi automatis de lavage des micropuits R cipient d un litre pour la solution PBS de tampon de lavage Eau d sionis e ou distill e Spectrophotom tre lecteur de microplaques capable de lire la densit optique 450 nm Tubes essai pour pr parer les dilutions de s rum Papier absorbant ou serviettes en papier Pipeteur multicanaux capable de remplir 8 puits la fois Gants jetables Minuterie de laboratoire PRECAUTIONS 1 Tous les mat riels d origine humaine utilis s d
21. ner tout r sidu R p ter ces tapes de remplissage et vidange jusqu effectuer 3 5 lavages au total Frapper ensuite vigoureusement les puits sur une serviette en papier ou une autre mati re absorbante pour liminer toute trace r siduelle de tampon de lavage DISTRIBUER LE REACTIF ANTICORPS ENZYME Distribuer 100 ul de r actif Anticorps Enzyme dans chacun des puits INCUBER LES BARRETTES 30 minutes temp rature ambiante c d 18 25 C Mettre incuber 30 minutes temp rature ambiante Les barrettes devraient tre abrit es des courants d air ou des changements de temp rature pendant l incubation Les barrettes peuvent tre ventuellement recouvertes d une bande transparente ou d une serviette en papier pour les prot ger de la poussi re ou d autres corps trangers LAVER LES BARRETTES Laver les puits 3 5 fois avec la solution tampon de lavage au PBS Tween Pour le lavage manuel aspirer le contenu des puits puis les remplir solution tampon de lavage viter la contamination crois e des puits en particulier lors du premier lavage apr s aspiration Vider toute la solution tampon de lavage des puits en les retournant puis en les secouant d un geste sec du poignet afin d liminer tout r sidu R p ter ces tapes de remplissage et vidange jusqu effectuer 3 5 lavages au total Frapper ensuite vigoureusement les puits sur une serviette en papier ou une autre mati re absorbante pour lim
22. nt t obtenues en utilisant le point talonnage de la m thode multi Do Pr dicat Test IgG anti dsDNA Positifs N gatifs Immuno Concepts Positifs 105 6 RELISA anti dsDNA N gatifs 3 94 Ces donn es donnent les statistiques suivantes accord positif 97 2 accord n gatif 94 0 et un accord global 95 7 Sur base de cette comparaison les donn es suivantes ont t obtenues au moyen de la m thode facultative point unique Pr dicat Test IgG anti dsDNA Positifs N gatifs Immuno Concepts Positifs 103 5 RELISA anti dsDNA N gatifs 5 95 Ces donn es donnent les statistiques suivantes accord positif 95 4 accord n gatif 95 0 et un accord global 95 2 Normal Gamme Les limites de la normale pour ce dosage a t d termin e en testant des chantillons de s rum de 261 donneurs de sang sains Seuls deux de ces chantillons avaient des valeurs sup rieures 35 UI ml anticorps anti ADN double brin SP CIFICIT CLINIQUE Le syst me de test Immuno Concepts RELISA anti dsDNA a t utilis pour tester des chantillons de s rum de 117 patients qui ont t vus en consultation de rhumatologie Cette population de patients a t s lectionn e cause de maladies rhumatismales cliniques mais pas pour un tat de maladie sp cifique quelconque Parmi cette population quatre chantillons 3 4 se sont montr s positifs pour anticorps anti dsDNA
23. ophotom tre de longueur d onde double est disponible la longueur d onde pour le filtre de la r f rence doit tre mise sur 600 650 nm La lecture des micropuits 450 nm sans filtre de r f rence r sultera en des valeurs de densit optique plus lev es POUR L ASSISTANCE TECHNIQUE 1 916 363 2649 ou messagerie lectronique technicalsupport immunoconcepts com immuno concepts
24. r diluer les chantillons de patients R actif immuno enzymatique Sp cifique de l IgG chaine gamma humaine CONJIHRP No de r f rence 7009 17 14 ml IgG anti humain sp cifique de la cha ne gamma conjugu e la peroxydase de raifort HRP Le r actif est pr t l emploi Solution de substrat SSOLN SUBI No de r f rence 7035 14 ml Solution de substrat enzymatique sp cifique de la HRP contenant de la 3 3 5 5 t tram thylbenzidine TMB stabilis e et du peroxyde d hydrog ne H202 Le r actif est pr t l emploi R actif d arr t ISOLNISTOPI No de r f rence 7033 14 ml R actif d arr t brevet pour les syst mes de test IDE d Immuno Concepts Le r actif est pr t l emploi ATTENTION Corrosif Ce r actif contient des acides chlorhydrique et sulfurique moins de 3 chacun par volume et doit tre manipul avec pr caution Conserver hors de port e des enfants En cas de contact avec les yeux laver imm diatement et abondamment avec de l eau et consulter un m decin Ne jamais ajouter d eau ce r actif Contr le positif anti dsDNA ICONTROL No de r f rence 7021 17 2 ml S rum de contr le positif humain qui contient des anticorps anti dsDNA Ce s rum est dilution active et est pr t l emploi Voir l tiquette du tube pour plage attendue en Unit s Internationales ml Ul ml Contr le n gatif CONTROL No de r f rence 7031 2 ml S rum de contr le n gati
25. s L azide de sodium est un poison et peut tre toxique en cas d ingestion 5 Ce kit est destin une utilisation diagnostique in vitro 6 Ne pas pipeter la bouche et viter tout contact de la peau et des muqueuses avec les r actifs et les chantillons En cas de contact laver abondamment avec un savon germicide et de l eau 7 Ne pas fumer ni manger ni boire dans les zones o des chantillons ou des r actifs du kit sont manipul s 8 viter toute claboussure ou la production d a rosols tout moment 9 Les dur es et temp ratures d incubation autres que celles sp cifi es peuvent donner lieu des r sultats erron s 10 La contamination crois e de r actifs ou d chantillons peut donner lieu de faux r sultats Les chantillons doivent rester confin s aux micropuits pendant le test 11 Avant r utilisation la verrerie doit tre lav e et rinc e soigneusement afin d liminer tout d tergent Toute la verrerie doit tre propre et s che avant utilisation 12 Porter les r actifs micropuits et chantillons temp rature ambiante 18 25 C avant utilisation 13 Mettre des gants jetables pour manipuler les chantillons et les r actifs et se laver soigneusement les mains en fin de proc dure 14 La contamination microbienne des r actifs ou des chantillons peut donner lieu de faux r sultats 15 Le r actif d arr t est corrosif et peut causer des br lures Ce r actif contient de l aci
26. s de patient peuvent donner lieu des r sultats faussement positifs ou faussement n gatifs REMARQUES GENERALES RELATIVES A LA PROCEDURE Il est extr mement important que tous les composants du kit et les chantillons de s rum soient temp rature ambiante 18 25 C avant leur utilisation Il faut plusieurs heures pour qu un litre de tampon de lavage atteigne 20 C une fois sorti du r frig rateur Des temp ratures d incubation au dessus ou en dessous de la plage indiqu e peuvent donner lieu des r sultats inexacts Remettre les chantillons et les r actifs non utilis s au r frig rateur apr s utilisation Bien m langer les r actifs en les retournant doucement Ne pas passer les r actifs au vortex ni les secouer viter de faire mousser Lors de la pr paration des dilutions d chantillon essuyer les embouts des pipettes avant de distribuer le s rum dans le diluant pour chantillons Si un exc s d chantillon adh re l embout de la pipette les r sultats s en trouveront affect s L utilisation d un pipeteur multicanaux est recommand e car il permet d uniformiser la distribution du r actif ainsi que les dur es d incubation et de r action Un lavage ad quat des puits est extr mement important Des puits mal lav s afficheront des valeurs de bruit de fond lev es ainsi que des valeurs faussement positives Pour le lavage manuel aspirer le contenu des puits et ensuite les remplir de solution tampon de la
27. vage viter la contamination crois e des puits en particulier lors du premier lavage apr s aspiration Vider toute la solution tampon de lavage des puits en les retournant puis en les secouant d un geste sec du poignet afin d liminer tout r sidu R p ter ces tapes de remplissage et vidange jusqu effectuer 3 5 lavages au total Frapper ensuite vigoureusement les puits sur une serviette en papier ou une autre mati re absorbante pour liminer toute trace r siduelle de tampon de lavage Pour un lavage homog ne des puits il est conseill d utiliser un syst me automatis REMARQUE En raison des divers types de techniques de lavage et de syst mes automatis s le nombre de lavages peut tre adapt pour obtenir des r sultats optimums Chaque laboratoire doit d terminer le nombre de lavages le plus efficace pour son syst me de lavage Une limination inad quate de r sidus du tampon de lavage peut conduire un d veloppement variable de la couleur ponger les barrettes de micropuits sur du papier ou des serviettes absorbants afin d liminer au maximum les r sidus de tampon de lavage Le respect du minutage de toutes les tapes est essentiel Tous les chantillons de s rum doivent tre dilu s avant le d but de la proc dure et d pos s dans les micropuits aussi rapidement que possible moins de cinq minutes La taille des lots doit tre d finie de fa on ce que la manipulation des chantillons puisse tre acco
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