Trousses HISTO SPOT - BAG Health Care GmbH
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1. 1 DESCRIPTION DU PRODUIT Le syst me HISTO SPOT SSO est un test de diagnostic in vitro pour le typage tissulaire des all les HLA par m thode de g n tique mol culaire Les r sultats de typage ont une r solution basse moyenne Le syst me est compos des trousses de typage HISTO SPOT de la trousse de r actifs communs HISTO SPOT Reagent Kit du processeur MR SPOT et du logiciel d interpr tation HISTO MATCH Les trousses de typage HISTO SPOT contiennent tous les composants n cessaires la r action PCR ainsi que les cupules r actionnelles avec des sondes d oligonucl otides sp cifiques de s quence pour la d tection des produits PCR La trousse HISTO SPOT Reagent Kit contient tous les r actifs n cessaires l hybridation et la d tection Elle peut tre utilis e en association avec toutes les trousses de typage HISTO SPOT L instrument MR SPOT est sp cialement con u pour tre utilis avec les trousses HISTO SPOT et traite entre 1 et 96 chantillons par cycle Il automatise l analyse depuis l hybridation jusqu la d tection et la prise d images qui serviront l interpr tation des r sultats Le logiciel HISTO MATCH est n cessaire la lecture des images et l interpr tation des r sultats 2 PRINCIPE DU TEST Le test est divis en quatre tapes de base Isolement de l ADN Amplification par PCR Hybridation et D tection Interpr tation des donn es L isolement de l ADN es2. faibles Erreur de dilution du conjugu ou amplification faible _ Dysfonctionnement de l instrument Recommencer l analyse V rifier la temp rature d hybridation sur l instrument 11 MARQUES COMMERCIALES UTILIS ES e ProClin est une marque commerciale de l entreprise Rohm amp Haas BCIP est une marque commerciale de Sigma Aldrich Co e Veriti est une marque commerciale d Applied Biosystems 13 sur 14 Notice utilisateur des trousses HISTO SPOT SSO 12 EXPLICATION DES SYMBOLES UTILIS S VD Pour usage de diagnostic in vitro rs Temp rature de conservation F OT N de lot ET Utiliser avant D EF Code produit Consulter le Mode d emploi LA TYPIN Destin au Typage HLA Mastermix M lange initial pour l amplification du locus HLA A Mastermix M lange initial pour l amplification du locus HLA B Mastermix M lange initial pour l amplification du locus HLA C Mastermix DRB M lange initial pour l amplification du locus HLA DRB1 Mastermix DQB M lange initial pour l amplification du locus HLA DQB1 Mastermix DQ M lange initial pour l amplification des loci HLA DQB1 amp DQA1 Mastermix DPB M lange initial pour l amplification du locus HLA DPB1 oll l l l l lQ Mastermix DRB3 4 5 M lange initial pour l amplific
3. au sel M thodes d isolation d ADN valid es e Colonnes de marque Quiagen M thodes utilis es avec succ s en pratique e Quick Gene 610L 800 810 amp Mini 80 extracteurs de marque Kurabo e EZ 1 GenoM6 extracteurs de marque Quiagen e Maxwell 16 Promega e QuatroProbe BeeRobotics La pr sence d h parine peut inhiber la PCR De ce fait il est recommand d utiliser du sang recueilli sur EDTA ou sur citrate pour le typage 5 sur 14 Notice utilisateur des trousses HISTO SPOT SSO Version 11 2013 L ADN de l chantillon doit avoir une concentration comprise entre 15 et 30 ng uL et un indice de puret rapport DO26 D02 compris entre 1 5 et 2 0 Des valeurs plus lev es sont le signe de la pr sence d ARN des valeurs plus faibles celui d une contamination par des prot ines 5 3 Amplification de l ADN Utiliser des plaques PCR jupe pour l amplification car elles doivent ensuite tre maintenues au niveau de la jupe par un collier sur le bloc d hybridation du processeur MR SPOT Les plaques HISTO SPOT PCR Frameplates ont t valid es pour cette application les plaques provenant d autres fournisseurs doivent tre valid es par l utilisateur Pour chaque chantillon amplifier ajouter les r actifs suivants chaque tube PCR 10 uL M lange initial 5 uL MgCl 5 uL chantillon d ADN 15 30 ng L Le volume total de chaque r action d amplification est de 20 uL Pr m lange pour plu
4. n tique mol culaire et des tests d histocompatibilit Les r sultats de ces tests ne doivent pas tre utilis s comme seul d terminant pour prendre des d cisions cliniques Les directives de transplantation ainsi que les normes EFI doivent tre respect es de mani re r duire le risque de typages erron s Ceci est particuli rement important dans le cas de r sultats discordants observ s entre les m thodes de s rologie et de g n tique mol culaire Des pr cautions doivent tre prises pour viter la contamination et donc les fausses r actions e Porter des gants pour manipuler sans poudre si possible e Utiliser de nouveaux embouts chaque tape de pipetage avec un filtre int gr e Utiliser des zones de travail s par es pour les t ches avant l amplification isolement de l ADN et pr paration des r actions et pour les t ches apr s l amplification hybridation et d tection De pr f rence utiliser deux pi ces diff rentes zones pr PCR et post PCR e Les amplicons ne doivent pas tre ramen s dans la zone de travail servant la pr paration des PCR e Utiliser les dispositifs et autres mat riels uniquement leur place respective et assurer ce que ne puisse pas les changer 5 2 Isolement de l ADN Pr parer l ADN chantillon par la m thode standard utilis e par le laboratoire pour l isolement des ADN destin s la PCR il est pr f rable de ne pas utiliser la technique du relargage
5. 6100 e Embouts de pipettes pour l instrument MR SPOT 1000 uL R F 726099 et 200 uL R F 726097 e R actifs pour l isolation des ADN N B viter la technique du relargage au sel e Plaques de PCR jupe et bouchons ou films associ s Recommandation HISTO SPOT PCR Frameplate R F 726220 HISTO SPOT PCR Caps R F 726090 ou HISTO SPOT PCR Foils R F 726089 e Thermocycleur e Eau d sionis e e Pipettes volume variable gamme 0 5 1 000 uL et embouts jetables 4 CONSERVATION ET STABILIT Tous les r actifs et composants des trousses doivent tre conserv s une temp rature entre 2 C et 8 C La date de p remption est indiqu e sur l tiquette de chaque composant Elle est valable pour les contenants non entam s La date de p remption indiqu e sur l tiquette externe de la trousse l est en fonction du composant contenu dans la trousse ayant la validit la plus courte Les r actifs ouverts seront utiliser dans les 3 mois La dilution du conjugu doit tre pr par e extemporan ment chaque s rie de test 4 sur 14 Notice utilisateur des trousses HISTO SPOT SSO Version 11 2013 5 PROTOC LE 5 1 Pr cautions et recommandations Les techniques de g n tique mol culaire sont des m thodes particuli rement sensibles qui doivent tre r alis es par du personnel bien form ayant l exp rience des techniques de g
6. ISTO MATCH 5 4 4 Interpr tation des images l aide du logiciel HISTO MATCH Ouvrir le logiciel HISTO MATCH sur un des postes du r seau du laboratoire et interpr ter les images selon la description dans le manuel du logiciel HISTO MATCH Les images doivent ressembler l exemple pr sent la Figure 2 ci dessous La Figure 3 pr sent e la suite donne une illustration sch matique de l image type obtenue et des fonctions des diff rentes sondes si N B la couleur des cercles autour des points obtenus i i re qui sont plus ou moins grands et plus ou moins denses RP ES SE p indique la fonction de chaque point me O6 0 om 0 OR Smati 2 i aore et l illustration sch matique donn e par la figure 3 ci dessous RS OP donne de plus amples d tails We em0e 0e i Moeee0e00e i IBeeeomoeo Q60s00 ee lo ss E CS ru si sondes de position qui r agissent avec les amorces d amplification Elles indiquent amp que les amorces ont bien t pr sentes et que lors du travail automatique les r actifs communs ont t distribu s par l instrument Par ailleurs elles permettent au logiciel de positionner l image avant l interpr tation Tout sch ma correspond un lot de vrac contr les d amplification pour les exons 2 amp 3 trait s en double Ces sondes sont universelles pour les all les du locus cibl et montre ainsi la r ussite de la PCR Leu
7. O BAG eam care OOOO T Notice utilisateur Trousses HISTO SPOT SSO Trousses de test pour le typage des all les HLA par m thode de g n tique mol culaire CE 0123 IVD Lire attentivement les instructions figurant dans le manuel d utilisation du ou des syst me s et sur les tiquetages et ou dans la notice d utilisation du r actif REF 726010 HISTO SPOT A 4D 96 tests Version 11 2013 REF 726020 HISTO SPOT B 4D 96 tests Edition 2013 11 REF 726030 HISTO SPOT C 4D 96 tests REF 726040 HISTO SPOT DRB1 4D 96 tests REF 726045 HISTO SPOT DRB3 4 5 96 tests REF 726050 HISTO SPOT DQB1 4D 96 tests REF 726051 HISTO SPOT DQB1 4D DQA1 96 tests REF 726060 HISTO SPOT DPB1 96 tests REF 726061 HISTO SPOT DPB1 24 tests REF 726098 HISTO SPOT Reagent Kit Table des mati res 14 DESCRIPTION DU PRODUIT se de inde 2 2 PRINCIPE DU TEST airera annees 2 R EL 3 3 1 R actifs fournis avec les trousses HISTO SPOT sp cifiques de IOGUS 3 3 2 R actifs fournis avec la trousse HISTO SPOT Reagent Kit 4 4 CONSERVATION ET STABILIT errirerenenenieseennninininenenenenenenenennnis 4 5a RO OO 5 5 1 Pr cautions et recommandations rennes nennen nnne ennnen nennen nennen nnne nennen ennenen 5 52 Isolement de ADN nnn e E E a r E E 5 5 3 Amplification de ADN iriserai A KEE EEN EE EEA EEEE 6 5 4 Hy
8. POT SSO Applied Biosystems PE 9600 PE 9700 vitesse de rampe du PE 9600 amp Veriti Biorad PTC 100 PTC 200 amp MyCycler Eppendorf Mastercycler EP Gradient S N B en cas d utilisation d autres thermocycleurs une validation doit tre effectu e par l utilisateur De mani re g n rale il est recommand d utiliser jamais une vitesse de rampe autre que 1 2 C seconde Une fois l tape d amplification termin e les chantillons peuvent tre analys s imm diatement ou conserv s entre 2 C et 8 C pendant un maximum de 5 jours sous condition d tre parfaitement scell s Il n est pas n cessaire de r aliser un gel pour contr ler l amplification Cela est d autant plus justifi que l amplification peut tre correcte m me si le gel ne pr sentait qu une bande tr s faiblement visible Si cependant il est pr vu de r aliser un gel ne veuillez pas utiliser plus que 2 3 uL d amplicon Les tailles des diff rents amplicons sont indiqu es sur le CD d information fourni avec chaque trousse fichier xls tableau de correspondance deuxi me onglet intitul Notes 5 4 Hybridation amp D tection automatis es par le processeur MR SPOT 5 4 1 Pr paration des r actifs n cessaires Sortir la trousse HISTO SPOT Reagent Kit et les cupules r actionnelles HISTO SPOT des loci typer du r frig rateur et les laisser se r chauffer temp rature ambiante On peut observer des cristaux de
9. aleurs seuil et correspondant sa calibration Chaque Lot de vrac sert la fabrication de cupules r actionnelles et d finit leur dates de fabrication et de p remption 3 sur 14 Notice utilisateur des trousses HISTO SPOT SSO Version 11 2013 3 2 R actifs fournis avec la trousse HISTO SPOT Reagent Kit Les r actifs communs d une trousse sont en quantit suffisante pour r aliser 96 typages Chaque trousse de r actifs communs contient Tampon de blocage pr t l emploi incolore contient 0 001 de ProClin 150 Tampon d hybridation pr t l emploi contient 0 001 de colorant 0 1 de dod cylsulfate de sodium et 0 001 de ProClin 150 BLOCKBUF HYBBUF Tampon de lavage drastique pr t l emploi contient 0 001 de STRGWASH colorant 0 1 de dod cylsulfate de sodium et 0 001 de ProClin 150 Tampon de lavage TBS Tris Buffered Saline pr t l emploi contient 20 mM de Tris 0 003 de colorants et 0 001 de ProClin 150 Substrat BCIP NBT pr t l emploi bromo 5 chloro 4 indolyl 3 phosphate bleu de chlorure de nitrot trazolium TBSWASH SUBS Conjugu concentr Streptavidine marqu e la phosphatase CONJ alcaline lt 0 1 d azide de sodium diluer au 1 1666 dans du tampon de blocage 3 3 R actifs et quipements n cessaires mais non fournis e Processeur MR SPOT avec le logiciel HISTO MATCH R F 72
10. ation des loci HLA DRB3 4 5 estwells Al Cupules r actionnelles avec sondes fix es pour typer le locus HLA A estwells Cupules r actionnelles avec sondes fix es pour typer le locus HLA B estwells Cupules r actionnelles avec sondes fix es pour typer le locus HLA C estwells DRB peg Cupules r actionnelles avec sondes fix es pour typer le locus HLA DRB1 estwells DQB Cupules r actionnelles avec sondes fix es pour typer le locus HLA DQB1 estwells D Cupules r actionnelles avec sondes fix es pour typer les loci HLA DQB1 amp A1 estwells DPB k Cupules r actionnelles avec sondes fix es pour typer le locus HLA DPB1 O estwells DRB3 4 5 Cupules r actionnelles avec sondes fix es pour typer les loci HLA DRB3 4 5 CI2 Solution de Chlorure de magn sium 7 LOCKBU Tampon de blocage I lt ee C 7 Tampon d hybridation Solution de lavage drastique Tampon TBS Tris buffered saline Substrat ONJ SG 2 c l 3 w Lo ao Q Z gt N I Conjugu Streptavidine marqu e la phosphatase alcaline 14 sur 14 Version 11 2013 Notice utilisateur des trousses HISTO SPOT SSO Version 11 2013 N B pour les modes d emploi en d autres langues veuillez utiliser ce lien http www bag healthcare com en Diagnostika Downloads 15 sur 14
11. bridation amp D tection automatis es par le processeur MR SPOT n se 7 5 4 1 Pr paration des r actifs n cessaires snseeeeeeernrresserrrrrrnrressrrrrnrrnnrrssrrrnr ennn 7 5 4 2 D marrage de l instrument MR SPOT iii 8 5 4 3 Transfert des images sur un PC pour l interpr tation 9 5 4 4 Interpr tation des images l aide du logiciel HISTO MATCH 9 6 PRECAUTIONS ET TRAITEMENT DES D CHETS iii 10 7 CARACT RISTIQUES ET PERFORMANCES ire 11 7 14 valuation des D roMaN es nn nana 11 7 2 Amplifications par r action POR 238 Mann nantes teir ending 11 8 LIMITES DE LA M THODE nnnnnnnnnnrnrrnssnsnrnrnrnnsnsnsnsnsneneneeenenenenesnsnsnensnsnenenenennss 11 9 CONTR LE QUALIT INTERNE 4 rcrrnemetnnneenenmeenenennennentnns 12 10 GESTION DES INCIDENTS ep 13 11 MARQUES COMMERCIALES UTILIS ES 13 Distribu en Belgique en France et au Luxembourg par m diane diagnostics Z A de la Cha ne 78370 PLAISIR 33 1 30 07 50 60 info mediane diag fr BAG Health Care GmbH Auftragsannahme Ordering Customer Service Amtsgerichtsstra e 1 5 Tel 49 0 6404 925 0 www bag healthcare com Tel 49 0 6404 925 450 Tel 49 0 6404 925 125 35423 Lich Germany Fax 49 0 6404 925 250 info bag healthcare com Fax 49 0 6404 925 460 Fax 49 0 6404 925 421 verkauf bag healthcare com service bag healthcare com Notice utilisateur des trousses HISTO SPOT SSO Version 11 2013
12. ctions d amplification et d hybridation Il est recommand d utiliser des Contr les n gatifs pour d tecter d ventuelles contaminations Pr parez pour cela un mix initial sans ADN et l utiliser le lors des r actions d amplification et d hybridation comme Contr le n gatif 12 sur 14 Notice utilisateur des trousses HISTO SPOT SSO Version 11 2013 10 GESTION DES INCIDENTS Sympt me Probl me s possible s Solution s ventuelle s __ Dysfonctionnement de l instrument Nombreux Consulter le manuel utilisateur du syst me MR SPOT Message d erreur au transfert de donn es Erreur de transfert des donn es Transf rer les donn es manuellement avec une cl USB Aucun r sultat Erreur d adressage R aliser l adressage manuellement Seuls les spots de contr le sont positifs ADN non ajout la PCR ou erreur d amplification Recommencer toute l analyse et v rifier le produit PCR sur gel __ Sondes faussement positives __ Utilisation d une quantit d ADN trop importante ou conjugu trop concentr non centrifug V rifier la concentration en ADN centrifuger le conjugu avant son utilisation Absence d amplification de lexon Concentration en ADN trop lev e ou ADN d grad V rifier la concentration en ADN tester l ADN sur gel Aucun r sultat ou r sultat non concluant en raison de signaux
13. cupules r actionnelles Chaque barrette des 8 cupules r actionnelles peut tre scind e en puits unitaire ou multiple conform ment la figure 1 si le nombre de tests r aliser est inf rieur 8 Scinder les cupules r actionnelles en les cassant l angle droit PR Casser les extr mit s avec le pouce Ne pas casser les cupules r actionnelles en les pliant vers le haut ou vers le bas et ne pas tordre les puits Figure 1 S paration de cupules r actionnelles unitaires Attention lors de l utilisation de barrettes scind es il est important de s assurer du bon positionnement sur le bloc r actionnel et de veiller ce que les diff rents fragments ou puits unitaire ne se g nent pas au risque d impacter leurs positionnements corrects 5 4 2 D marrage de l instrument MR SPOT Mettre sous tension le processeur MR SPOT l cran de d marrage s affiche Suivez les instructions l cran pour pr parer le lancement de votre s rie N B pour obtenir des d tails consulter le mode d emploi du processeur MR SPOT 8 sur 14 Notice utilisateur des trousses HISTO SPOT SSO Version 11 2013 Remarque viter d exposer le processeur MR SPOT et les r actifs associ s au soleil 5 4 3 Transfert des images sur un PC pour l interpr tation Transf rer les donn es au logiciel HISTO MATCH par l interm diaire du r seau ou d faut d une cl USB selon la description dans le manuel du logiciel H
14. et un indice de puret rapport DO 6DO28 compris entre 1 5 et 2 0 doivent tre utilis s Un soin particulier doit tre pris pour viter la contamination des r actifs de la trousse et des autres produits et quipements de laboratoire avec des amplicons ou de l ADN Il est fortement recommand de r aliser r guli rement des tests de contamination p ex BAG Wipetest r f 7091 et d utiliser des contr les n gatifs dans chaque s rie d analyse 11 sur 14 Notice utilisateur des trousses HISTO SPOT SSO Version 11 2013 L hybridation est un proc d tr s sensible la temp rature De ce fait les trousses HISTO SPOT SSO ne doivent tre utilis es qu en association avec le processeur MR SPOT pour assurer des temp ratures et temps d incubation valides Tous les instruments p ex pipettes thermocycleurs blocs chauffants instrument MR SPOT doivent tre talonn s conform ment aux instructions des fabricants L exactitude et l uniformit de temp rature du thermocycleur peuvent tre test es avec la trousse BAG CyclerCheck r f 7104 9 CONTR LE QUALIT INTERNE Le Contr le qualit des nouveaux lots de trousses HISTO SPOT SSO peut tre r alis l aide d un panel maison d chantillons d ADN typ s pour les crit res HLA dont la trousse est sp cifique C t syst me chaque biopuce cupule r actionnelle renferme des Contr les positifs internes pour pouvoir v rifier la r ussite des r a
15. fi e l aide d ADN d chantillons de r f rence 7 2 Amplifications par r action PCR Les all les amplifi s par chaque trousse HISTO SPOT SSO la version de la nomenclature HLA et les exons amplifi s sont indiqu s avec les informations sp cifiques du lot respectif Ces informations sont rassembl es sur un CD fourni avec chaque trousse 7 3 R solution de la technique Le syst me de typage HISTO SPOT SSO est con u pour fournir au minimum des r sultats sans ambigu t au niveau des groupes d all les c est dire sur une r solution sur 2 digits Des associations d all les diff rentes qui recoupent des groupes d all le mais qui pr sentent le m me sch ma de sondes positives sont consid r es comme ambigu s Les trousses de typage HISTO SPOT 4D donnent en cas d utilisation d un filtre qui ne tient compte que des all les fr quents p ex filtre 4D g n ralement des r sultats sans ambigu t au niveau de l all le 4 digits Le crit re pour d finir un all le comme tant fr quent 4D est le suivant la fr quence de cet all le est de gt 0 5 dans au moins une population compos e de gt 1000 chantillons tel que document sur le site www allelefrequencies net 8 LIMITES DE LA M THODE En raison de la grande sensibilit de l analyse par PCR aux variations de concentration et de qualit de l ADN seuls des chantillons d ADN avec une concentration comprise entre 15 et 30 ng uL
16. i re t che du processeur 2 sur 14 Notice utilisateur des trousses HISTO SPOT SSO Version 11 2013 MR SPOT est de traiter chaque puits au pr alable avec le tampon de blocage Apr s une tape de lavage drastique pour liminer tout amplicon non fix le conjugu de la streptavidine marqu e la phosphatase alcaline est ajout aux cupules et se fixe sur la biotine des amplicons ayant hybrid s avec la sonde SSO compl mentaire Suite des tapes suppl mentaires de lavage le substrat de BCIP NBT est ajout et produit une coloration bleu violet quand il est converti par la phosphatase alcaline Les points color s r sultants au fond de chaque cupule r actionnelle sont photographi s par une cam ra int gr e au processeur MR SPOT et chaque image prise au fond de chaque cupule r actionnelle est transmise au logiciel HISTO MATCH install sur le ou les PC de validation du laboratoire Le programme d analyse d image du logiciel HISTO MATCH d termine l intensit de chaque point spot pr sente sur la biopuce et la compare l intensit de son fond partir de ces donn es les r actions positives et n gatives sont d termin es en comparant un seuil commun L application HISTO MATCH calcule partir de ces valeurs le reflet du sch ma d hybridation observ leur correspondance all lique 3 MAT RIEL 3 1 R actifs fournis avec les trousses HISTO SPOTS sp cifiques de locus Cupule r actionnelle emball e indi
17. lav s ou incin r s apr s usage Un renversement de produits potentiellement infectieux doit tre ramass imm diatement avec du papier absorbant et les zones contamin es doivent tre nettoy es avec un d sinfectant standard adapt ou avec de l alcool 70 Les mat riels utilis s pour nettoyer les renversements y compris les gants doivent tre inactiv s avant leur limination ex dans un autoclave Le tampon de blocage le tampon d hybridation le tampon de lavage drastique et le tampon de lavage TBS contiennent du ProClin 150 et la solution de chlorure de magn sium contient du ProClin 300 La concentration en conservateur dans les r actifs est de seulement 0 001 viter toutefois le contact avec la peau et les membranes muqueuses Le tampon PCR et le conjugu contiennent de l azide de sodium comme conservateur Les r actifs contiennent une concentration lt 0 1 d azide de sodium qui n est pas consid r e comme dangereuse viter toutefois le contact avec la peau et les membranes muqueuses L azide de sodium peut r agir avec les tuyauteries de plomb et de cuivre et former des azides m talliques explosifs Au moment d liminer les solutions contenant de l azide de sodium dans les viers de laboratoire rincer les tuyauteries avec de grandes quantit s d eau pour viter la formation d azide Toute la manipulation avec les r actifs doit tre r alis e en respectant les pr cautions adapt es Po
18. r fonction principale est de fixer le seuil pour les sondes sp cifiques d all le oloobloolo ele 60b0cobockebce olooblo lebce oloolo locole 660c0bbibo olololololo 60b0cbololblole 60cobcbkebLbe b0cbobocebboele o l o o0 lolol sonde sp cifique d all le signal positif 2 O sonde sp cifique d all le signal n gatif Figure 3 Illustration sch matique du r sultat et de la fonction des sondes 9 sur 14 Notice utilisateur des trousses HISTO SPOT SSO Version 11 2013 6 PRECAUTIONS ET TRAITEMENT DES DECHETS Le syst me HISTO SPOT est con u pour une utilisation de diagnostic in vitro et doit tre manipul par du personnel qualifi et form Toute utilisation doit respecter les bonnes pratiques de laboratoire Les produits biologiques utilis s pour l extraction de l ADN par exemple le sang ou un tissu humain doivent tre manipul s comme des substances potentiellement infectieuses Il est donc recommand de respecter les pr cautions de s curit adapt es pour manipuler les produits biologiques ne pas pipeter la bouche utiliser des gants jetables pour manipuler les produits biologiques et r aliser le test se d sinfecter les mains une fois la manipulation termin e Les d chets biologiques doivent tre inactiv s avant leur limination ex dans un autoclave Les produits jetables doivent tre autoc
19. rter une protection oculaire une blouse de laboratoire et des gants jetables pour manipuler les r actifs Eviter le contact de ces produits avec la peau les yeux et les membranes muqueuses En cas de contact rincer imm diatement avec une grande quantit d eau Sinon une br lure pourrait se produire Si des r actifs sont renvers s les diluer avec de l eau avant de les ponger Ne pas exposer le substrat aux m taux ni aux agents oxydants L limination de tous les chantillons des r actifs non utilis s et des d chets doit respecter les r glementations nationales f d rales et locales viter la contamination microbienne des r actifs au moment de pr lever un aliquot dans les flacons L utilisation de pipettes et de pointes de pipettes st riles jetables est recommand e Ne pas utiliser de r actifs pr sentant une turbidit ou une contamination microbienne apparente 10 sur 14 Notice utilisateur des trousses HISTO SPOT SSO Version 11 2013 Les Fiches de Donn es de S curit peuvent tre t l charg es l adresse www bag healthcare com 7 CARACT RISTIQUES ET PERFORMANCE 7 1 valuation des performances Toutes les trousses HISTO SPOT SSO ont t valu es lors d une tude portant sur des chantillons auparavant typ s avec d autres m thodes ex SSP S quen age Aucune discordance n a t observ e entre les m thodes de typage Pour chaque lot la sp cificit de chaque sonde a t v ri
20. sel dans le Tampon d hybridation et dans la Solution de lavage drastique Dans ce cas r chauffer les r actifs 30 C pour dissoudre les cristaux N B r chauffer tout le contenu du flacon et pas seulement un aliquote Le conjugu doit tre dilu au 1 1666 dans du tampon de blocage La dilution du conjugu doit tre pr par e extemporan ment chaque s rie de test N B le conjugu doit tre m lang au vortex et centrifug chaque fois avant l tape de dilution Les volumes n cessaires de r actifs communs varient selon le nombre de barrettes utiliser Le processeur MR SPOT affiche les volumes n cessaires pour le nombre de barrettes choisi sur son cran tactile suivez l aide en ligne Verser les volumes n cessaires de r actifs dans les r servoirs marqu s en cons quence nom et code couleur tout en suivant l aide en ligne 7 sur 14 Notice utilisateur des trousses HISTO SPOT SSO Version 11 2013 Ouvrir soigneusement la plaque ou la les barrette s PCR en provenance du thermocycleur et la les placer sur le bloc chantillon S assurer du bon positionnement et de la bonne orientation de la plaque ou de la les barrette s suivez l aide en ligne S assurer galement de l absence de salet ou de particules de plastique sur le bloc chantillon car celles ci peuvent perturber le transfert de chaleur pendant l hybridation Ouvrir soigneusement les emballages en aluminium des
21. sieurs chantillons x 10 uL x 5 pL MgCl nb d chantillons 2 nb d chantillons 2 m lange initial par chantillon utiliser ensuite 15 uL de ce pr m lange pour chaque PCR N B il est important que la concentration en ADN soit comprise pour tous les chantillons entre 15 et 30 ng L Des concentrations plus lev es peuvent conduire des r actions de sondes faussement positives et des concentrations plus faibles peuvent entra ner des checs d amplification Pour r aliser un Contr le n gatif pr parer une r action PCR avec de l eau d sionis e la place de l ADN chantillon Sceller les barrettes PCR avec les bouchons les centrifuger rapidement les placer dans le thermocycleur et lancer l amplification dans les conditions suivantes tape de programme Dur e Temp rature Nb de cycles Premi re d naturation 2 mn 96 C 1 cycle D naturation 155 96 C 10 cycles Hybridation extension 60s 65 C D naturation 10s 96 C 20 cycles Hybridation 50 s 61 C Extension 30s 72 C Maintien ee 22 C 6 sur 14 Notice utilisateur des trousses HISTO SPOT SSO Version 11 2013 Ces conditions sont identiques pour tous les thermocycleurs Toutefois le temps total n cessaire pour cette tape varie selon la vitesse de rampe de chaque mod le de thermocycleur Les mod les suivants de thermocycleurs ont t valid s pour tre utilis s avec le test HISTO S
22. t r alis sur l chantillon clinique par une m thode d isolement d ADN d finie au laboratoire ou avec une trousse commerciale L ADN est ensuite amplifi par une s rie de r actions PCR chacune sp cifique d un locus HLA barrettes PCR pr t l emploi tampon PCR et solution de MgCl sont fournis dans la trousse La sp cificit de l amplification est obtenue par un ensemble d amorces biotinyl es con ues pour amplifier sp cifiquement le locus HLA cibl Apr s le processus d amplification PCR les barrettes PCR contenant les amplicons marqu s la biotine sont transf r es sur l instrument Le processeur MR SPOT ajoute le tampon d hybridation chaque puits et transf re chaque m lange amplicon amp tampon d hybridation dans sa cupule r actionnelle contenant des sondes SSO immobilis es l aide de la biopuce coll e au fond SSO oligonucl otides sp cifiques d une s quence Ces sondes sont soit de simples sondes d oligonucl otides soit une association d au moins 2 sondes individuelles immobilis es dans la m me zone sonde mosa que et con ues pour am liorer l identification des polymorphismes situ s en position cis Les amplicons marqu s la biotine se fixent aux sondes SSO qui contiennent une s quence cible compl mentaire et ils peuvent ensuite tre d tect s par une simple r action colorim trique Pour viter la fixation non sp cifique d amplicons dans les cupules r actionnelles la toute prem
23. viduellement par barrette Testwells X chaque barrette renferme 8 tests cupules et chaque cupule contient des sondes d oligonucl otides sp cifiques de s quence M lange initial pr t l emploi contenant des amorces biotinyl es du locus cibl des dNTP de la Taq polym rase du tampon et 0 05 Mastermix X Chlorure de magn sium 6 mM pr t l emploi Mgcl2 contient 0 001 de ProClin 300 N B X A B C DRB1 DRB3 4 5 DQB1 DQ o DPB1 Chaque trousse est livr e avec un CD d information comportant le fichier relatif aux sondes pr sentes sur les biopuces qui doit tre enregistr dans la base de donn es du logiciel d interpr tation HISTO MATCH s il s agit d un nouveau lot pour le laboratoire N B pour obtenir des d tails consulter le mode d emploi du logiciel HISTO MATCH A ce sujet il convient de diff rencier les notions Trousse amp n de Lot de la trousse Vrac de sondes puis Lot du vrac utilis dans une trousse e Trousse p ex HISTO SPOT A d finit le locus analys Lot de la trousse e Vrac p ex A084 A085 d finit la sp cificit des sondes dudit vrac et leurs positions sur les biopuces contenues dans les cupules r actionnelles Un m me vrac Lot de sondes peut tre utilis pour plusieurs productions de trousses e Lot de vrac p ex A085 1 A085 2 A085 3 d finit comment une sonde donn e r agit par rapport aux sondes de contr le v
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