RIA-gnost Trypsin
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1. S rum Standards de S rums Activit ul contr le ul totale ul ul N des tubes So S4 S2 S3 Sa S5 Se C 1 2 3 letc T essai Standards 100100 So 100 100 S 100 100 S2 100100 S3 100 100 S4 100100 S5 100 100 Se S rum de contr le 100 100 S rums 100 100 100 etc 128 trypsine Al 7 200 pl gt S rum anti trypsine 100 pl gt M langer incuber 3 h entre 18 et 25 R actif pr cipitant q 500 pl gt M langer incuber 30 min entre 18 et 25 R actif de lavage 7 1 ml gt Centrifuger 15 min 1 500 g 20 d canter le surnageant Mesurer la radioactivit du pr cipit ro a solution Exemple de courbe d talonnage Groupe de cpm B T B Bo Concentration tubes moyens x 100 x 100 ng ml 100 80 Standard 0 22225 0 Standard 1 43 g 60 Standard 2 85 8 40 Standard 3 13535 38 6 609 171 Standard 4 9779 341 a Standard 5 7445 602 Standard 6 5929 1365 03 200 400 600 800 1000 1200 1400 Contr le 12090 220 PAL TRYE RIA gnost Trypsin Cisbio Bioassays Mars 2011 Mod le 11 5 R gles de base de radioprotection Ce produit radioactif ne peut tre re u achet d tenu ou utilis que par des personnes au2. ce qu on attend Cela offre donc des possibilit s pour d autres diagnostics diff rentiels Des concentrations trypsiques s riques normales plage 140 400 ng ml n excluent pas la possibilit d une affection du pancr as Une augmentation du taux de la trypsine s rine a t observ e dans des cas d insuffisance r nale aussi doit on tenir compte de l tat fonctionnel du rein du malade avant d interpr ter les taux de trypsine Compte tenu de la limitation ci dessus des valeurs inf rieures 140 ng ml ou sup rieures 400 ng ml obtenues lors d un examen de d pistage chez des patients pr sentant des sympt mes abdominaux peuvent tre des valeurs extr mes de la normalite RIA gnost Trypsin Cisbio Bioassays Mars 2011 Mod le 11 Caract ristiques sp cifiques du dosage 2 6 Impr cision Elle a t valu e l aide de 2 chantillons dos s 10 fois dans la m me s rie et dans 15 s ries diff rentes Intra essai Inter essai Echantillons Moyenne ng ml CV Echantillons Moyenne ng ml CV 1 550 2 8 3 162 4 9 2 167 3 3 4 483 6 7 2 7 Limite de d tection La limite de d tection est d finie comme tant la plus petite concentration d tectable diff rente de 0 avec une probabilit de 95 Elle a t valu e 8 0 ng ml 3 Protocole de dosage 3 1 Mat riel n cessaire Tubes essai Micropipettes avec embout plastique interchangeable ou microdistributeu
3. RIA gnost Trypsin Cisbio Bioassays Mars 2011 Mod le 11 Trousse pour la d termination radioimmunologique de la trypsine humaine htrypsin Contenu de la trousse 1 flacon de I trypsine humaine lt 90 kBq contenant 22 ml de tampon d albumine bovine d immunoglobulines de lapin d azoture de sodium et un colorant rouge orang 1 flacon de s rum de lapin anti trypsine contenant 10 5 ml de tampon de l albumine bovine et de l azoture de sodium 7 flacons de standards de trypsine lyophilis s contenant chacun 0 5 ml de s rum de cheval et de l azoture de sodium concentration allant de O 1200 ng ml de trypsine humaine 1 flacon de s rum de contr le de trypsine contenant 0 5 ml de s rum humain et de l azoture de sodium concentration indiqu e sur l tiquette 1 flacon de r actif pr cipitant contenant 55 ml de tampon du s rum de ch vre anti IgG de lapin de l albumine bovine et de l azoture de sodium 1 tube de r actif de lavage 1 comprim 1 mode d emploi Certains r actifs contiennent de l azoture de sodium comme conservateur Eviter toute absorption des r actifs ainsi que tout contact avec la peau ou les muqueuses L azoture de sodium peut r agir avec les canalisations de plomb et de cuivre pour former des azotures de m taux fortement explosifs Les diluer abondamment lors de l vacuation des d chets 1 Introduction Un diagnostic diff rentiel est souvent difficile tablir chez
4. be except ceux de l activit totale agiter pour homog n iser incuber 3 h 3 5 h temp rature ambiante 18 25 l abri de la lumi re directe 5 Distribuer 500 ul de r actif pr cipitant dans chaque tube except ceux de l activit totale agiter pour homog n iser incuber 30 min 30 60 min temp rature ambiante l abri de la lumi re directe 6 Distribuer 1 ml de r actif de lavage dans chaque tube except ceux de l activit totale centrifuger pendant 15 min gt 1500 g et 20 puis d canter le surnageant 7 Mesurer la radioactivit des tubes pendant 1 minute l aide d un compteur gamma Les tubes de l activit totale donnent en g n ral entre 40 000 et 20 000 cpm RIA gnost Trypsin Cisbio Bioassays Mars 2011 Mod le 11 3 6 Exploitation des r sultats La figure pr sente une courbe d talonnage type tablie l aide de la trousse RIA gnost Trypsin Reporter sur du papier millim tre pr par cet effet d une part le nombre de coups par minute des talons So Se et d autre part les concentrations de trypsine correspondantes en ng ml Les points servent tracer la courbe talon Les valeurs mesur es du s rum de contr le et des s rums de patients permettent d obtenir des valeurs moyennes et de lire partir de la courbe d talonnage la concentration de trypsine Protocole de dosage du RIA gnost Trypsin
5. des chantillons de s rum Pr parer le s rum selon le proc d habituel partir du pr l vement sanguin Aspirer le s rum et l utiliser imm diatement ou le conserver une temp rature comprise entre 2 et 8 pendant 3 jours maximum ou le congeler 20 3 4 Mises en garde et pr cautions d emploi Les mati res premi res d origine humaine contenues dans les r actifs de cette trousse ont t test es avec des trousses agr es et trouv es n gatives en ce qui concerne les anticorps anti HIV 1 anti HIV 2 anti HCV et l antig ne HBs Cependant aucune m thode d analyse ne permet ce jour de garantir totalement qu une mati re premi re d origine humaine soit incapable de transmettre l h patite le virus HIV ou toute autre infection virale Aussi faut il consid rer toute mati re premi re d origine humaine y compris les chantillons doser comme potentiellement infectieuse 3 5 Protocole de dosage voir tableau 1 Num roter un nombre suffisant de tubes essai 3 5 ml comme indiqu dans le tableau standards s rum de contr le chantillons de s rum et l activit totale 2 Distribuer au moyen de la pipette 100 ul de standards de s rum de contr le ou d chantillons de s rum au fond des tubes essai pr par s cet effet Distribuer 200 ul de 1251 trypsine dans tous les tubes y compris ceux de l activit totale Distribuer 100 ul de s rum de lapin anti trypsine dans chaque tu
6. ement active au moyen d ent rokinase enzyme form e dans les cellules du duod num L ent rokinase d tache du trypsinog ne l h xapeptide Val Asp 4 Lys en pr sence d ions Ca lib rant ainsi le centre biologiquement actif de la mol cule de trypsine masqu jusque l La trypsine peut en outre activer le trypsinog ne par autocatalyse La trypsine semble tre limin e pour une faible partie telle quelle par l intestin comme des examens coprologiques l ont r v l En outre les trypsinog nes la trypsine et probablement aussi la trypsine li e un inhibiteur pancr atique peuvent passer dans le sang par l interm diaire du liquide interstitiel L activit trypsique est toutefois bloqu e dans le sang par trois inhibiteurs sp cifiques o4 antitrypsine amp 2 macroglobuline et l inhibiteur inter a trypsine Une faible activit prot olytique se maintient toutefois dans le s rum comme le r v le l hydrolyse de substrat synth tique cette activit n est pas imputable la trypsine 1 2 Principe du RIA gnost Trypsine On peut doser la trypsine dans le suc duod nal et pancr atique par spectrophotom trie au moyen de l hydrolyse de substrat synth tique On ne peut toutefois utiliser cette m thode pour doser la trypsine dans le sang tant donn que les trypsinog nes sont biologiquement inactifs et que l activit enzymatique de la trypsine est bloqu e par les inhibiteurs comme indiqu ci dessus Ce probl me ne se po
7. iques sont normales la concentration de la trypsine s rique augmente consid rablement pendant les 20 120 minutes suivant le test de stimulation la s cr tine puis la pancr ozyme Cette augmentation semble tre imputable une plus grande perm abilit des tissus du pancr as due l inflammation En effet on n a pu observer aucune augmentation de la trypsine s rique chez les sujets sains qui l on fait subir le m me test de stimulation 2 3 Pancr atite aigu Chez les patients pr sentant une pancr atite aigu on observe toujours une augmentation sensible du taux de la trypsine s rique Les valeurs obtenues vont de 600 6 500 ng ml 2 4 Carcinome du pancr as On a trouv chez des patients ayant un carcinome du pancr as un taux de trypsine s rique faiblement augment 450 1 200 ng ml mais cette diff rence n est en g n ral pas observ e En l absence de pancr atite et ou d insuffisance r nale il est n cessaire d effectuer d autres examens diagnostiques 2 5 Fibrose kystique du pancr as Il est possible d utiliser le dosage radioimmunologique de la trypsine pour d celer la fibrose kystique du pancr as Pour de plus amples informations cf RIA gnost Trypsin neonatal Remarque Il semble certain que la partie exocrine du pancr as apr s stimulation ne fonctionne pas en tant qu unit puisque la corr lation entre les taux d amylase de lipase et de trypsine s rique ne correspond pas toujours
8. isante pour doser 42 chantillons de patients en double l aide d une courbe d talonnage Le s rum de contr le de trypsine sert effectuer le contr le analytique du dosage La plage de mesure s tend de 0 1200 ng ml de s rum avec un maximum de pr cision entre 80 et 500 ng ml A l exception des standards et du r actif de lavage les r actifs de la trousse sont pr ts l emploi Ils doivent tre conserv s entre 2 et 8 Le dosage radioimmunologique RIA gnost Trypsin permet de mesurer la trypsine s rique en tant que prot ine les inhibiteurs pr sentes ne g nent pas le test Le dosage est sp cifique de la trypsine du trypsinog ne et des formes inhib es par les enzymes Il n existe pas l heure actuelle de standard de r f rence reconnu l chelle internationale pour la trypsine Une comparaison des r sultats fournis par le RIA gnost Trypsin et de ceux d autres examens de la trypsine n est possible que dans une mesure limit e 2 R sultats cliniques et caract ristiques sp cifiques obtenus avec la trousse RIA gnost Trypsin R sultats cliniques 2 1 Valeurs normales On ne conna t pas la fonction de la trypsine s rique enzymatiquement inactiv e mais on peut mettre celle ci en vidence dans le s rum tant que le pancr as exocrine exerce son activit Chez les sujets sains la concentration de trypsine s rique oscille entre 140 et 400 ng ml m diane 200 ng ml La concentration de la tr
9. les patients pr sentant un syndrome abdominal notamment lorsqu il s agit d affections pancr atiques Les moyens analytiques permettant d examiner les fonctions pancr atiques et les contr les ult rieurs de ces derni res sont donc d un grand int r t du point de vue diagnostic Les enzymes du pancr as exocrine telles que l amylase la lipase et la trypsine qui participent la digestion intestinale des hydrates de carbone des graisses et des prot ines rev tent dans ce cas une tr s grande importance De ces enzymes toutefois seule la trypsine est secr t e uniquement dans le pancr as la d tection de cette enzyme constitue donc un test sp cifique en ce qui concerne le pancr as exocrine 1 2 Donn es chimiques et biologiques de la trypsine La trypsine est une enzyme prot olytique une endopeptidase dot e d une sp cificit vis vis des liaisons carboxyliques des groupements L arginyle et L lysyle Elle participe la digestion des prot ines dans l intestin Du point de vue chimique la trypsine est une prot ine se composant de 201 acides amin s et dont le poids mol culaire est de 22 900 Comme d autres enzymes prot olyptiques d origine pancr atique la trypsine est labor e dans les cellules acineuses du pancr as exocrine sous forme de trypsinog ne proenzyme inactive et d vers e dans le duod num en passant par le canal pancr atique Le trypsinog ne existe sous deux formes qui sont dissoci es en trypsine enzymatiqu
10. rs de 100 200 et 500 ll Distributeur de 1 0 ml prouvette gradu e b cher Agitateur centrifugeuse gt 1500 g compteur gamma r gl pour la mesure de l iode 125 3 2 Pr paration des r actifs Avant utilisation porter temp rature ambiante 18 25 les composants de la trousse qui ont t conserv s entre 2 et 8 Reconstituer les standards avec de l eau distill e selon les indications suivantes D coller les particules de lyophilisat qui pourraient adh rer au bouchon en tapant les flacons de standards sur une surface dure Puis ouvrir les flacons avec pr caution et poser les bouchons l envers sur la paillasse Reconstituer avec exactement 500 Li d eau distill e l aide d une micropipette appropri e reboucher les flacons et attendre la reconstitution compl te des lyophilisats environ 10 min Pour aider la dissolution et l homog n isation de la solution imprimer au flacon un mouvement circulaire et ou le rouler entre les mains Pour pr parer le tampon de lavage dissoudre le comprim tampon dans 100 ml d eau distill e Conserver tous les r actifs entre 2 et 8 Pour r aliser un test plus important il faut rassembler les r actifs provenant de diff rents coffret d un m me lot Une seule courbe d talonnage suffira pour tous les chantillons tester Il est galement possible d tablir deux courbes d talonnage avec un plus petit nombre d chantillons de s rum 3 3 Pr paration
11. se n anmoins pas si l on se sert des propri t s immunologiques de la mol cule de trypsine au lieu de ses propri t s enzymatiques pour effectuer le dosage La trousse RIA gnost Trypsin permet le dosage radioimmunologique de l enzyme trypsique dans le s rum humain et d autres liquides biologiques d apr s le principe de l analyse par comp tition Il s agit d un dosage radioimmunologique par double anticorps La trypsine libre est s par e de celle li e aux anticorps sp cifiques l aide d un anticorps anti IgG Lors de la premi re incubation la trypsine s rique et le traceur trypsine marqu l se fixent sur des anticorps hautement sp cifiques de la trypsine le degr de fixation du traceur l trypsine aux anticorps tant inversement proportionnel la trypsine s rique pr sente Au cours de la deuxi me incubation le complexe de la trypsine et 128l trypsine avec l anticorps entre en r action avec une gammaglobuline anti lapin Il se forme un pr cipit Apr s centrifugation on d cante le surnageant et on mesure l aide du compteur gamma scintillation l activit du traceur marqu 128 pr sente dans le pr cipit L activit servant de mesure de la concentration s rique de trypsine est valu e par comparaison avec des standards pr par s dans les m mes conditions 3 RIA gnost Trypsin Cisbio Bioassays Mars 2011 Mod le 11 Chaque trousse RIA gnost Trypsin contient une quantit de r actifs suff
12. toris es cette fin et dans des laboratoires couverts par cette autorisation Cette solution ne peut en aucun cas tre administr e ni l homme ni aux animaux L achat la d tention l utilisation et l change de produits radioactifs sont soumis aux r glementations en vigueur dans le pays de l utilisateur L application des r gles de base de radioprotection assure une s curit ad quate Un aper u en est donn ci dessous Les produits radioactifs seront stock s dans leur conteneur d origine dans un local appropri Un cahier de r ception et de stockage de produits radioactifs sera tenu jour La manipulation de produits radioactifs se fera dans un local appropri dont l acc s doit tre r glement zone contr l e Ne pas manger ni boire ni fumer ni appliquer des cosm tiques en zone contr l e Ne pas pipeter des solutions radioactives avec la bouche Eviter le contact direct avec tout produit radioactif en utilisant des blouses et des gants de protection Le mat riel de laboratoire et la verrerie qui ont t contamin s doivent tre limin s au fur et mesure afin d viter une contamination crois e de plusieurs isotopes Chaque cas de contamination ou perte de substance radioactive devra tre r solu selon les proc dures tablies Toute limination de d chets radioactifs se fera conform ment aux r glementations en vigueur
13. ypsine s rique ne varie pratiquement pas selon le sexe mais semble par contre d pendre de l ge du sujet car on a relev des valeurs un peu plus faibles chez les enfants 2 2 Pancr atite chronique Dans les pancr atites chroniques les m thodes diagnostiques dont on dispose aujourd hui permettent d observer des variations de concentration de la trypsine de l amylase de la lipase du bicarbonate dans le suc duod nal ou du volume de celui ci En outre une calcification du pancr as peut tre mise en vidence par radiographie Les examens diagnostiques sont assez difficiles effectuer d sagr ables pour le patient et de plus peu fiables Aussi le dosage radioimmunologique est il d un int r t consid rable Chez les patients pr sentant une pancr atite chronique on observe des valeurs de trypsine s rique inf rieures 140 ng ml dans 50 des cas Cela est certainement d une l sion importante des cellules acineuses du pancr as Par contre dans 20 des cas de pancr atite chronique les valeurs ont t sup rieures la limite des valeurs normales de 400 ng ml ce qui indique vraisemblablement une phase aigu de la pancr atite cf 2 3 La violence des douleurs abdominales ne correspond pas au taux de trypsine s rique mais une st arrh e est souvent accompagn e d une diminution sensible du taux de la trypsine s rique Chez les patients pr sentant une pancr atite chronique mais dont les valeurs basales tryps
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