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1. PrP quatre fois moins importante que la souche de tremblante 23 Ces r sultats sugg rent un r le de la prot ine LRP dans la physiopatholo gie des ESST directement li la multiplication de l agent infectieux et l accumulation de prot ine du prion anormale R le hypoth tique d un r cepteur de la prot ine PrP e Le LRP Les cons quences potentielles de l interaction entre LRP et PrP sont multiples et laissent envisager au moins trois diff rents r les possibles pour le LRP figure 2 1 En tant que r cepteur de la PrP normale le LRP interviendrait dans son interna lisation et serait donc un acteur du cycle cellulaire de la prot ine Dans le cas pathologique le d r glage du catabolisme de la PrP convertie en PrPres qui s accumule conduirait une internalisation acc l r e et donc a un apport membranaire accru de LRP 2 le LRP pourrait constituer un r cepteur pour la PrP m s n 5 vol 14 mai 98 LRP unit de 37 kD du Hypoth se 3 r cepteur de la laminine Hypoth se 2 Endocytose de la PrP et ou de la PrP ES relay e par un r cepteur implication des puits mantel s de caveolae Entr e de la PrP es non relay e par un r cepteur V sicule s cr toires f Golgi OLA V sicules d endocytose N SNI NININ ARNM Endolysosomes Lysosomes Conversion de la PrPC en PrPr S intervention de mol cules chaperonnes Figure 2 Cycle cellulaire des pro2. LVS MINI SYNTHESE m decine sciences 1998 14 595 9 Une premiere tape dans l identification de r cepteurs cellulaires de la prot ine du prion spongiformes transmissibles ESST comprennent principale ment la maladie de Creutzfeldt Jakob chez l homme la tremblante du mouton et l enc phalopathie spongi forme bovine ESB Elles sont carac t ris es par leur dualit il s agit de maladies neurod g n ratives li es au d veloppement d un agent infec tieux et leur transmissibilit consti tue un critere nosologique primor dial 1 mais elles peuvent galement se pr senter sous forme de maladies g n tiques et sont dans ce cas li es a des mutations du g ne codant pour la prot ine PrP 2 3 Cette derni re est une prot ine tr s conserv e au cours de l volution pr sente dans de nombreux tissus de l organisme et exprim e en grande quantit dans le cerveau 4 Elle s accumule sous une forme anor male particuli rement r sistante aux prot ases d o la d nomination de PrP dans le cerveau et les autres organes cibles du systeme r ticulo endoth lial SRE chez les individus infect s 5 Cette prot ine PrP est appel e prot ine du prion ana gramme de proteinaceous infectious par ticle 6 et constituerait en soi lorsqu elle est sous sa forme patholo gique un agent infectieux d un type nouveau appel prion dans l hypoth se du m me nom Celle ci stipule q
3. a PrP Une strat gie de recherche consiste identifier des prot ines cellulaires capables d interagir avec la PrP dans le but double de mieux comprendre son role dans le m tabolisme normal de la cellule et ou d identifier des facteurs intervenant dans le cycle de r plication des prions tels que par exemple le facteur X sugg r par S B Prusiner La technique du double hybride consiste a faire expri mer par la levure Saccharomyces cerevi siae deux prot ines coupl es respecti vement un site de liaison ADN et un site d activation de la transcrip tion une interaction entre ces deux prot ines aboutit la transcription du g ne rapporteur consid r 17 En utilisant cette technique avec la prot ine PrP en tant que leurre et 595 596 un ensemble de prot ines exprim es par une banque d ADNc humaine comme proie figure 1A nous avons identifi deux prot ines capables d interagir avec la PrP 18 19 la prot ine de choc thermique Hsp60 et le pr curseur du r cepteur de la laminine ou LRP de 37kDa le r cepteur de la laminine initialement isol a un poids mol culaire de 67 kDa et r sulte tr s probablement soit d une dim risation de deux uni t s de 37kDa soit d une association de cette unit avec une autre mol cule La structure exacte de cette prot ine de 295acides amin s est inconnue mais l analyse de la s quence primaire et les exp riences d imm
4. ane form of the prion protein in neurodegenerative disease Science 1998 279 827 34 25 Martins VR Graner E Garcia Abreu Souza SJD Mercandante AF Veiga SS Zanata SM Neto VM Brentani RR Com plementary hydropathy identifies a cellular De rotein receptor Nat Med 1997 3 376 82 26 Shyng SL JE Heuser DA Harris A gly colipid anchored prion protein is endocyto sed via clathrin coated pits J Cell Biol 1994 125 1239 50 27 Vey M Pilkuhn S Wille H Nixon R DeArmond SJ Smart EJ Anderson RGW Taraboulos A Prusiner SB Subcellular colocalization of the cellular and scrapie prion proteins in caveolae like membranous domains Proc Natl Acad Sci USA 1996 93 14945 9 28 Kaneko K Vey M Scott M Pilkuhn S Cohen FE Prusiner SB COOH terminal sequence of the cellular prion protein directs subcellular trafficking and controls conversion into the scrapie isoform Proc Natl Acad Sci USA 1997 94 2333 8 29 Caughey B Raymond GJ The scrapie associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease and hospholipase sensitive J Biol Chem 1991 566 18217 23 30 Borchelt DR Taraboulos A Prusiner SB Evidence for synthesis of scrapie prion pro teins in the endocytic pathway J Biol Chem 1992 267 16188 99 Corinne Ida Lasm zas Jean Philippe Deslys Dominique Dormont Service de neurovirologie CEA DSV DRM SSA 60 68 avenue du G n ral Leclerc BP6 92265 Fontenay a
5. ation Science 1994 264 530 1 8 Czub M Braig HR Diringer H Replica tion of the scrapie agent in hamsters infec ted intracerebrally confirms the pathogene sis of an amyloid inducing virosis J Gen Virol 1988 69 1753 6 9 Manuelidis L The dimensions of Creutz feldt Jakob disease Transfusion 1994 34 915 28 10 Dickinson AG Outram GW Genetic aspects of unconventional virus infections the basis of the virino hypothesis Ciba Found Symp 1988 135 63 83 11 Bueler H Fischer M Lang Y Blueth mann H Lipp HP DeArmond SJ Prusiner SB Aguet M Weissmann C Normal deve lopment and behaviour of mice lacking the neuronal cell surface PrP protein Nature 1992 356 577 82 12 Sakaguchi S Katamine S Nishida N Moriuchi R Shigematsu K et al Loss of cerebellar Purkinje cells in aged mice homozygous for a disrupted PrP gene Nature 1996 380 528 31 13 Tobler I Gaus SE Deboer T Acher mann P Fischer M R licke T Moser M Oesch B McBride PA Manson JC Altered circadian activity rhythms and sleep in mice oe of prion protein Nature 1996 380 14 Bueler H Aguzzi A Sailer A Greiner RA Autenried P Aguet M Weissmann C Mice devoid of PrP are resistant to scrapie Cell 1993 73 1339 47 15 Prusiner SB Scott M Foster D Pan KM Groth D et al Transgenetic studies impli cate interactions between homologous PrP isoforms in scrapie prion replication Cell 1990 63 673 86 16 Leh
6. calisa tions membranaires possibles pour la PrP tudi es dans des syst mes de traduction in vitro et chez des souris transg niques pour la PrP Il apparait que physiologiquement c est la forme s cr toire de la PrP en r a lit ancr e a la membrane par un GPI qui est la forme largement majo ritaire voire la seule a arriver au terme de sa maturation Certaines mutations du g ne de la PrP condui sent chez les souris qui l expriment en quantit anormalement lev e une localisation majoritairement transmembranaire de la PrP alors nomm e PrP ainsi qu au d velop pement d une maladie neurod g n a 597 rative Un m canisme du m me type semble tre impliqu dans la patho g nie d une forme familiale humaine d ESST syndrome de Gerstmann Straussler Sheinker li e a une muta tion au codon 117 de la prot ine PrP Dans la figure 2 seule la prot ine PrP ancr e a la membrane par un GPI est repr sent e puisqu elle correspond la topologie rencontr e chez lindi vidu normal Quoi qu il en soit la large distribu tion de la prot ine LRP dans diff rents tissus et organes et en particu lier dans les organes lymphoides cadre bien avec l hypothe se qu elle jouerait un role crucial dans le cycle de r plication de l agent infectieux et cela d s les premi res tapes de l infection dont on sait qu elles se d roulent en dehors du syst me ner veux centra
7. ire normal L entr e de la PrP dans la cellule se fait par une autre voie Hypoth se 2 Le LRP constitue le r cepteur pour la PrP Il peut constituer un r cepteur exclusif de cette isoforme de la PrP et n intervient donc que lors du processus pathologique Cependant le LRP peut galement relayer de facon ind pendante l entr e de la Pr et de la PrP comme indiqu sur la figure Hypoth se 3 Le LRP serait un co r cepteur de la PrP pour la PrP Dans ce cas l association entre la prot ine nor male et son isoforme pathologique se ferait avant m me l internalisation de ces deux prot ines pathologique ligand exog ne PrP Dans ce cas le LRP serait le r cepteur de l agent infectieux dans le sens classique du terme que l agent infectieux soit constitu uni quement de PrP ou qu il s agisse d un virino c est dire d un acide nucl ique prot g par la PrPres L infection de la cellule conduirait a une r gulation positive du LRP 3 le LRP serait un co r cepteur de la PrP pour l agent infectieux PrP comme indiqu dans la figure 2 m s n 5 vol 14 mai 98 virino ou virus classique Dans l hypoth se virale classique l interac tion identifi e entre PrP et LRP cor respondrait celle d un r cepteur avec un co r cepteur la liaison des deux mol cules engendrant un site accepteur pour le virus Un r cent article publi dans Science 24 fait tat de diff rentes lo
8. it l infection par les agents responsables des ESST E Remerciements Stefan Weiss remercie le BMBF 01 KI9760 la CEE BIOMED PL97 6054 et FAIR T97 3314 pour leur soutien financier R F RENCES mm 1 Gibbs CJ Gajdusek DC Asher DM Alpers MP Beck E Daniel PM Matthews WB Creutzfeldt Jakob disease spongiform encephalopathy transmission to the chim panzee Science 1968 161 388 9 2 Chapman J Brown P Rabey JM Goldfarb LG Inzelberg R Gibbs CJ Gajdusek DC Korczyn AD Transmission of spongiform encephalopathy from a familial Creutzfeldt Jakob disease patient of jewish libyan origin carrying the PRNP Codon 200 mutation Neurology 1992 42 1249 50 3 Goldgaber D Goldfarb LG Brown P Asher DM Brown WT et al Mutations in familial Creutzfeldt Jakob disease and Gerst mann Straussler Scheinker s syndrome Exp Neurol 1989 106 204 6 4 Chesebro B Race R Wehrly K Nishio J Bloom M et al Identification of scrapie prion protein specific mRNA in scrapie infected and uninfected brain Nature 1985 315 331 3 5 Muramoto T Kitamoto T Tateishi J Goto I The sequential development of abnormal prion sae accumulation in mice with Creutzfeldt Jakob disease Am J Pathol 1992 140 1411 20 6 Prusiner SB Novel proteinaceous infec tious particles cause scrapie Science 1982 216 136 44 7 Cohen FE Pan KM Huang Z Baldwin M Fletterick RJ Prusiner SB Structural clues to prion replic
9. l La laminine est une prot ine majeure de la matrice extra cellulaire pr sente dans les lames basales intervenant dans les ph no m nes de diff renciation d attache ment de mobilit cellulaire voire d extravasion lors de processus m ta stasiques Il est concevable que l interaction de la PrP pathog ne avec le LRP d place l quilibre de liaison de la laminine a son r cep teur provoquant une perturbation de l environnement cellulaire de nature favoriser s il s agit des neu rones leur d g n rescence et ou s il s agit des cellules mobiles du sys t me immunitaire la propagation de l agent infectieux e La piste br silienne Des auteurs br siliens ont galement identifi un r cepteur potentiel de la prot ine PrP par la m thode d hydropathie compl mentaire sti pulant que des peptides cod s par des s quences d ADN compl men taires l une de l autre interagissent entre eux 25 Un peptide synth tique correspondant une s quence d ADN compl mentaire de celle d un fragment neurotoxique de la PrP a t utilis pour immuniser des souris L anticorps ainsi obtenu reconnaissait un antig ne la surface des neurones primaires en culture et le Western blot a r v l qu il s agissait d une prot ine de 66 kDa constituant donc un r cepteur candidat mais non identifi pour la PrP Cette pro 598 t ine se fixe sur la PrP recombinante r v l e
10. mann S Le role de la prot ine du pan dans les enc phalopathies spongi ormes transmissibles humaines Med Sci 1996 12 949 58 m s n 5 vol 14 mai 98 R F RENCES mm 17 Plessis A Camonis JH Le syst me double hybride mode d emploi Med Sci 199 10 suppl n 6 7 R1 R9 18 Edenhofer F Rieger R Famulok M Wendler W Weiss S Winnacker EL Prion protein PrPsc interacts with molecular cha erones of the Hsp60 family J Virol 1996 0 4724 8 19 Rieger R Edenhofer F Lasm zas CI Weiss S The human 37 kDa laminin recep tor precursor interacts with the prion pro tein in eukaryotic cells Nat Med 1997 3 1383 8 20 Castronovo V Taraboletti G Sobel ME Functional domains of the 67 kDa laminin receptor precursor J Biol Chem 1991 266 20440 6 21 Wang KS Kuhn RJ Strauss EG Ou S Strauss JH High affinity laminin receptor is a receptor for Sindbis virus in mammalian cells J Virol 1992 66 4992 5001 22 Ludwig GV Kondig JP Smith JF A puta tive receptor for Venezuelan equine ence ae virus from mosquito cells J Virol 996 70 5592 9 23 Lasm zas CI Deslys JP Demaimay R Adjou KT Hauw JJ Dormont D Strain spe cific and common pathogenic events in murine models of scrapie and bovine spon eee Aad uae aa J Gen Virol 1996 m s n 5 vol 14 mai 98 24 Hegde RS Mastrianni JA Scott MR DeFea KA Tremblay P Torchia M DeAr mond SJ Prusiner SB Lingappa VR A transmembr
11. par l anticorps correspon dant et entre en comp tition avec un anticorps anti PrP lors du mar quage de la PrP a la surface de cel lules de neuroblastome murin Par ailleurs la neurotoxicit du fragment 106 126 de la PrP est inhib e a la fois par le r cepteur candidat et son anti corps le premier agissant dans ce cas comme un comp titeur soluble du r cepteur cellulaire en se fixant sur la PrP106 126 le second se fixant sur le r cepteur cellulaire et emp chant l action du peptide neuro toxique La diff rence de poids mol culaire entre le LRP et ce r cepteur candidat semble indiquer qu il s agit de deux mol cules diff rentes sugg rant l existence d au moins deux voies d entr e du prion dans la cellule Il est toutefois possible qu il s agisse d une seule et m me mol cule le r cepteur candidat de 66 kDa corres pondant alors au r cepteur de la laminine de 67 kDa La fonction de r cepteur de la pro t ine du prion n a encore t d montr e pour aucune de ces deux prot ines membranaires C est dans cette direction que s inscrivent pr sent les recherches la mise en uvre de techniques de biologie mol cu laire et cellulaire devrait clarifier le r le du LRP dans le cycle cellulaire des prot ines prion normale et pathologique tandis que les tech niques de transgenese chez la souris pourraient permettre de d terminer un lien entre l expression du LRP et la susceptibil
12. ragis sant avec la prot ine PrP B Repr sentation th orique de la prot ine LRP de 37 kDa pr curseur du r cepteur de la laminine et r cepteur pr sum de la prot ine PrP Le rectangle rouge marque le site d interaction de la prot ine avec la laminine mais aussi avec la prot ine PrP table par western blot dans diff rents organes de rongeurs tels que cer veau rate foie et pancr as mais non dans le muscle squelettique qui appartient la cat gorie des organes non infectieux dans la classification de l OMS Chez l animal infect exp rimentalement les concentra tions de LRP taient augment es uni quement dans les organes cibles de l agent infectieux cerveau rate et pancr as et cette augmentation du LRP tait corr l e la quantit de PrP accumul e A titre d exemple le cerveau des hamsters infect s contenait 5 fois plus de LRP que celui des hamsters sains alors que celui des souris infect es par l agent de la tremblante avait une concentra tion qui n tait que doubl e et mul tipli e par 1 1 non significatif chez les m mes souris infect es par l agent de l ESB Or le mod le du hamster infect par l agent de la tremblante est connu pour son caract re tr s neuroinvasif et sa production de grandes quantit s de PrP 10 fois plus que les mod les murins alors que la souche d ESB utilis e dans cette tude ne provoque chez la sou ris qu une faible accumulation de
13. sommeil de troubles lectrophysiologiques ainsi que d une mort pr matur e des cel lules de Purkinje du cervelet m s n 8 9 vol 12 p 1003 Le caract re ubiquitaire et tr s conserv de cette prot ine ne laissait en rien pr sager l impact aussi limit de son absence sur la biologie de ces rongeurs Il est possible que des ph nom nes com pensatoires se mettent en place d s l embryogen se grace d autres pro t ines capables d assurer tout ou par tie du r le de la PrP En revanche le role de la PrP dans la physiopathologie des ESST est bien mieux connu En particulier les exp riences men es chez les souris transg niques pour le g ne de la PrP ont montr que celui ci gouvernait la barri re d esp ce des souris expri mant la PrP de hamster sont sen sibles des souches d agent adapt es au hamster alors que des souris nor males ne le sont pas Par ailleurs la susceptibilit des souris transg niques est fonction du nombre de copies du transg ne et des souris sans PrP ne d veloppent pas la maladie apr s injection exp rimentale de l agent infectieux 14 15 Cette der ni re donn e montre que la PrP dans l hypoth se o elle ne constitue pas tout ou partie de l agent joue tout au moins un r le cl dans son cycle d infection et ou de r plica tion par exemple en tant que r cep teur m s n 8 9 vol 9 p 989 16 Caract risation des interactions prot iques de l
14. t ines prions normales et pathologiques La prot ine PrP normale synth tis e par la cellule Pr subit des modifications post traductionnelles N glycosylations ajout d une ancre GPI dans le r ti culum endoplasmique et les saccules de Golgi puis est transport e la surface cellulaire o elle reste accroch e la membrane par son ancre GPI Elle est ensuite r internalis e endocytose relay e par des puits mantel s ou des caveolae selon les auteurs 26 28 puis d grad e dans le compartiment lysosomial Dans le processus pathologique survenant au cours des ESST l association entre des mol cules de PrP et des mol cules de PrP anormales se fait dans la seconde partie du cycle de la prot ine 29 30 soit la surface cellulaire soit dans les v sicules d endocy tose soit dans les lysosomes et conduit avec ou sans l intervention d un composant de type viral une conversion de la PrP en PrP amp Les mol cules chaperonnes telles que Hsp60 jouent tr s probablement un r le dans ce proces sus La cellule n est alors plus capable de d grader ces prot ines qui s accumulent La prot ine LRP en tant que r cepteur de la PrP peut intervenir dans le cycle cellulaire normal de la PrP et ou dans le processus pathologique ce qui a t r sum sous la forme des trois hypoth ses repr sent es dans cette figure Hypoth se 1 Le LAP est le r cepteur permettant l internalisation de la prot ine PrP dans son cycle cellula
15. ue le prion serait constitu de PrP anormalement repli e se multipliant gr ce l association entre une mol cule de PrP anormale PrP et une mol cule de PrP native la premi re induisant un changement conformationnel chez la seconde 7 Cependant d autres hypoth ses sur la nature des agents tiologiques des ESST soutiennent es enc phalopathies subaigu s m s n 5 vol 14 mai 98 l existence soit d un virus conven tionnel amyloidog nique 8 9 soit d un acide nucl ique associ a la PrP anormale hypoth se du virino 10 Ces hypoth ses permettent en effet d expliquer certaines propri t s de type viral des agents responsables des ESST telles que la variabilit observ e entre les diff rentes souches d agent le ph nom ne de comp tition de souches exclusion de surinfection ainsi que le tro pisme de l agent infectieux pour les organes lymphoides dans un premier temps pour le syst me nerveux cen tral dans un second temps La prot ine PrP Le role physiologique de cette pro t ine de l h te reste inconnu des souris dont le g ne codant pour la PrP a t invalid souris knock out se d veloppent et se comportent norma lement m s n 6 vol 8 p S06 mais pr sentent n anmoins un certain nombre d anomalies diff rant en fonction des lign es de souris knock out 11 13 Il s agit principalement d anomalies du rythme circadien et de l alternance veille
16. unofluorescence 20 21 Weiss et al r sultats non publi s sugg rent une localisation transmem A Domaine de liaison l ADN de Lex A GST PrPC Site de liaison Lex A 295 Banque de prot ines ADNc branaire telle qu elle est repr sent e sch matiquement dans la figure 1B Du fait de sa localisation membra naire et de sa fonction de r cepteur non seulement de la laminine mais aussi des alphavirus virus Sindbis virus de l enc phalite quine v n zu lienne 20 22 on a suspect pour le LRP un r le de r cepteur de la PrP la surface des neurones L interaction entre LRP et PrP a donc t v rifi e dans deux autres systemes d expression le systeme baculovirus cellules d insecte et les cellules de mammif re Cos 7 La car tographie du site d interaction de la PrP sur le LRP a montr que celui ci coincidait avec le site de liaison de la laminine La pertinence de cette interaction in vivo a alors t appro ch e La prot ine LRP tait d tec Domaine d activation de B42 Transcription du gene rapporteur Leu 2 croissance en milieu sans leucine Lac Z gt colonies bleues en pr sence de X GAL Extr mit carboxy terminale Site d interaction avec la lamine et la PrP Membrane cellulaire Extr mit amino terminale Figure 1 Isolement et structure de prot ines interagissant avec la PrP A Syst me double hybride permettant l identification de prot ines inte
17. ux Roses Cedex France Stefan Weiss Laboratorium fur Molekulare Biologie Genzentrum Institut fur Biochemie der LMU M nchen Feodor Lynen Strasse 25 D 81377 Munich Allemagne TIRES PR C I Lasm zas 599
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