manuel d`utilisation
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1. ce cas 20 noyaux suppl men taires doivent tre compt s et le ratio calcul pour 40 noyaux Si le doute subsiste des tests suppl mentaires doivent avoir lieu pour d finir l tat de l ERBB2 et un dialogue est justifi entre le pathologiste et le m decin f Recommendations and limitations La sonde ERBB2 et Cen17 DNA FISH n est pas pr vue pour le diagnostic de cancer mammaire humain Les informations tir es de l analyse FISH doivent tre interpr t es dans la totalit du contexte des ant c dents cliniques du patient Aucune d cision m dicale ne peut tre prise en se fondant uniquement sur les r sultats de l essai FISH Ce produit a t optimis pour tre utilis sur des lames pr par es partir de sp cimens de tissu FFPE Le fabricant assure que ce produit r pond aux caract ristiques de performance analytique sensibilit sp cificit repro ductibilit et intervalle de validit tablies sur le tissu pr vu Les cellules normales l int rieur du sp cimen doivent tre utilis es com me t moin interne de l essai FISH Il incombe au laboratoire d tablir les intervalles de validit l aide de sp cimens de contr le positifs et n gatifs du tissu pr vu L utilisation de filtres aux caract ristiques spectrales autres que celles sp cifi es peut affecter n gativement la force du signal Par exemple le fluorophore rouge est visible travers un filtre orange mais les signaux apparaissen2. pour l analyse des signaux et doit avoir lieu avec un objectif immersion huile 63X ou 100X Huile d immersion L huile d immersion doit tre adapt e la microscopie en fluorescence Lampe Une lampe mercure de 100 watts avec une dur e de vie maximale de 200 heures est recommand e Remplacer la lampe avant qu elle ne d passe les 200 heures Filtres recommand s Fluorophore Excitation mission max max Visualisation et interpr tation des signaux Le signal doit tre visualis l aide d un microscope pifluorescence qui p des filtres appropri s Remarque sur la proc dure Les signaux peuvent tre diff rents plans focaux c est pourquoi il est important de focaliser vers le haut et vers le bas des sp ci mens afin de s assurer du comptage de tous les signaux Dans la m taphase diplo de normale et dans les noyaux en interphase la ERBB2 et Cen17 DNA FISH Probe g n re deux signaux rouges et deux verts correspondant respectivement aux loci ERBB2 et Cen17 des deux chromosomes 17 normaux La d tection de tels signaux dans des cellules normales l int rieur du sp cimen est cruciale pour un essai FISH r ussi La troncature des noyaux en coupes peut entra ner l observation de cellules partielles comportant moins de signaux que le nombre pr vu Une lame color e en H amp E doit tre pr par e partir d une coupe adja cente celles utilis es pour FISH et la r gion
3. BB2 et Cen17 DNA FISH La sonde Cen17 verte marqu e directement hybride l ADN satellite 17p11 1 q11 La sonde ERBB2 rouge marqu e directement couvre la totalit du g ne indiqu par la barre horizontale rouge dans le sch ma ci dessus approximativement l chelle NCBI Build 36 1 Hg18 2006 Herceptin est une marque d pos e de Roche Conservation l arriv e conserver le produit 20 C l abri de la lumi re jusqu la date de p remption Conservation des lames Conserver les lames hybrid es a 20 C l abri de la lumi re Remarque Ces conditions de conservation s appliquent la fois aux produits non ouverts et ouverts Le nombre de cycles de gel d gel ne doit pas d passer le nombre de tests recommand s par flacon Conserver dans le flacon d origine Les flacons conserv s dans d autres conditions peu vent ne pas offrir de performance optimale et par cons quent affecter les r sultats du test Manipulation Tous les r actifs doivent tre manipul s comme s ils taient capables de trans mettre des agents infectieux Apr s usage tout le mat riel doit tre limin conform ment la loi nationale en vigueur Manipuler tous les r actifs et lames contenant des fluorophores en clairage r duit afin d viter toute d t rioration du signal fluorescent Avertissements et mises en garde Lire le mode d emploi avant toute utilisation Tout transport ou conservation impropr
4. ERBB2 Cen17 DNA FISH Probe Sonde d num ration bicolore 22 003 CE Mode d emploi JC 6 Usage pr vu La sonde ERBB2 et Cen17 DNA FISH de Cancer Genetics Italia est con ue pour d tecter l amplification du g ne ERBB2 aussi appel HER2 neu sur le chromosome 17q12 par rapport au t moin Cen17 par hybridation in situ en fluorescence FISH Fluorescence in situ hybridization sur un tissu de cancer du sein fix au formol et inclus en paraffine FFPE formalin fixed paraffin embedded Une surexpression du g ne ERBB2 survient dans 25 30 des carcinomes mammaires humains et environ 90 95 de ces cas proviennent directement de l amplification du g ne Les patients r v lant ce r arrange ment courent un risque lev de rechute et ont un taux de survie global inf rieur L amplification du g ne ERBB2 pr dit une r ponse favorable certains r gimes de chimioth rapie et traitements s lectifs par anticorps monoclonaux avec le trastuzumab Herceptin i L amplification du g ne ERBB2 est observ e galement dans d autres tumeurs solides y compris les cancers gastriques sophagiens gyn cologiques v sicaux et pulmonaires non petites cellules et correspond un pauvre pronostic fl l ITALIA Er ERBB2 Cen17 n 3 joie ERBB2 17q12 centrom re 5 elomere EE 162kb 17 Repr sentation sch matique de la sonde DNA FISH ERBB2 Cen17 L id ogramme du chromosome 17 illustre les sites d hybridation de la sonde ER
5. de cancer invasif doit tre d termin e par un pathologiste qualifi Seuls les noyaux de tumeurs dans la r gion invasive doivent recevoir un score ne pas donner de score aux cellules inflammatoires aux cellules musculaires aux fibroblastes ou autres cellules stromales Donner un score un minimum de 20 noyaux dans la r gion invasive enregistrer le nombre de signaux verts et rouges vus dans chaque noyau 46 Calculer le ratio de signaux ERBB2 Cen17 en divisant le nombre total de signaux ERBB2 rouges par le nombre total de signaux Cen17 verts Des r gions invasives discontinues peuvent tre identifi es par le pa thologiste et celles ci peuvent toutes recevoir des scores et tre combi n es dans l analyse Une amplification peut galement tre pr sente sous forme de r gion color e de mani re homog ne observ e sous forme de masse de signal rouge fluorescence tr s brillante En enregistrant ce mod le estimer la taille luminosit de la masse du signal en multiple de la taille du signal normal par ex une masse dix fois la taille du signal normal plus un seul signal rouge normal dans la m me cellule serait en registr e comme 11 rouges Selon les directives publi es un ratio ERBB2 Cen17 sup rieur 2 2 est associ une amplification du g ne ERBB2 KI Un ratio inf rieur 1 8 est consid r n gatif pour une amplification de g ne ERBB2 Un ratio dans la plage 1 8 2 2 est consid r limite Dans
6. e en fonction des conditions de fixation et de l ge de la coupe 9 Rincer la lame pendant 5 min dans de l eau distill e TA Rincer la lame en deux bains de SSC 2X de 5 min chacun TA Plonger bri vement dans de l eau distill e et s cher l air Incuber la lame dans du formol neutre tamponn 10 pendant 15 min TA 12 Rincer la lame en 2 changements de SSC 2X de 5 min chacun TA 13 Plonger bri vement dans de l eau distill e et s cher l air D naturation hybridation de la sonde DNA FISH 1 Vortexer la sonde DNA FISH pendant 2 3 secondes et centrifuger le tube dans une microcentrifugeuse 2 Appliquer 10 uL de sonde DNA FISH la zone cible sur la lame et la recou vrir d une lamelle couvre objet 22 x 22 mm Remarque sur la proc dure Prendre soin d viter toute formation de bulles d air Des lamelles couvre objets plus petites ou plus grandes peuvent tre utilis es en fonction du changement proportionnel de volume de la sonde DNA FISH 11 3 Sceller soigneusement les bords de la lamelle couvre objet l aide de colle de caoutchouc 4 Co d naturer la lame et la sonde DNA FISH pendant 5 min 90 C sur une plaque chauffante temp rature contr l e 5 Incuber pendant 12 18 heures dans une chambre humidifi e 37 C l abri de toute lumi re directe Lavage post hybridation Remarque sur la proc dure Ne pas laisser la lame s cher avant la fin des lavages 1 1 Retire
7. e peut d truire ou d t riorer la perfor mance du produit En cas de r ception d emballage ou de flacon endommag de d faillance du dispositif apr s utilisation conforme au mode d emploi ou de blessure de l utilisateur contacter le fabricant Tout flacon endommag doit tre limin conform ment la loi nationale en vigueur et aucun essai ne doit tre r alis partir d un tel r actif Manipuler tous les r actifs avec soin et porter un quipement de protection in dividuelle appropri Le formamide la solution saline de citrate de sodium SSC Saline Sodium Citrate et le dod cyl sulfate de sodium SDS peuvent avoir des effets t ratog nes et mutag nes viter toute inhalation ingestion ou contact avec la peau Le DAPlestunirritant Consulter le Material Safety Data Sheet MSDS du produit pour les informations concernant la s curit R actif fourni Sonde DNA FISH pr te l emploi 100 uL par flacon 10 tests Un test est d fini comme suffisant pour une aire de 22mm x 22mm Sonde tiquet e au fluorophore pour le locus ERBB2 rouge et au fluo rophore pour le locus centrom re 17 vert pr m lang e avec de l ADN bloquant et un tampon d hybridation formamide sulfate de dextran SSC et SDS R actifs et mat riel n cessaire mais non fournis Equipements Reactifs Bocal coplin Microtube centrifuger tanol 100 Lamelles couvre objets 0 5 mL PBS 10X 22x22 e 25x25 Micro
8. osphate M langer 100 mL de PBS 10X et 900 mL d eau distill e Ajuster le pH 7 0 Conserver TA SSC 2X M langer 100 mL de SSC 20X et 900 mL d eau distill e Ajuster le pH 7 0 Conserver temp rature ambiante TA SSC 2X Tween 20 0 1 Ajouter 100 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 899 mL d eau distill e Bien m langer en tournoyant Conserver TA MgCL 100X Chlorure de magnesium dans PBS 1X Ajouter 50 uL de MgCI2 1M a 450 uL de PBS 1X Proc dure pour section FFPE Remarque Produit pr t l emploi Ne pas reconstituer ni diluer Pour usage professionnel uniquement Seul un e technologiste familiaris e avec les m thodes de cytog n tique et form e la technique FISH peut r aliser le test Tout l quipement doit tre talonn avant la r alisation du test Le tissu vis correspond des sections FFPE de 4 5 um d paisseur Les lames doivent tre pr par es conform ment aux directives des m thodes cytog n tiques standards du laboratoire r alisant le test Pr paration des lames Remarque sur la proc dure Simultan ment aux coupes s ri es utilis es pour l analyse FISH une ou des coupe s doivent tre pr par es pour coloration l h matoxyline et l osine H amp E 1 Les coupes pour essai FISH doivent tre mont es sur des lames Plus en rob es 2 Cuire les lames sur la nuit 12 18 heures 55 C avant l hybridation Utilise sous 3 jours Pr trai
9. pipettes 1 200mL HCIIN Microscope pifluores Parafilm MgCl 1M cence pH m tre NaOH 1M Pinces Lames plus NaSCN 1M Hotte aspirante Colle de caoutchouc SSC 20X Gants Plateau pour lames Formaline 10 Chambre humidifi e Thermom tre calibr DAPI et Antifade Huile d immersion 37 C to 80 C Eau distill e Incubateur Plaque chauffante Pepsine Lampe mercure 100 watts Bain marie 20 Tween Microcentrifugeuse Citrisolv est une marque enregistr e de Fisherbrand Pr paration des r actifs Remarque Utiliser de l eau distill e pour la pr paration de toutes les solutions m res et de toutes les solutions de travail S rie d thanol 70 85 et 100 Pr parer des dilutions vol vol d thanol 100 et d eau distill e Conserver TA HCI 0 01N acide chlorhydrique Ajouter 0 5 mL de HCI 1N 49 5 mL d eau distill e Conserver TA Pr chauffer la solution 37 C dans un bain marie avant usage Solution m re de pepsine 0 4 4 mg mL Dissoudre 100 mg de pepsine dans 25 mL de HCL O 2N Conserver des aliquots de 500 uL 20 C Formald hyde 1 Ajouter 12 5 mL de formaline 10 4 formaldehye 37 mL de PBS 1X Ajouter 500 uL de MgCl 100X Conserver 4 C jusqu une semaine SSC 0 5X Citrate de sodium salin Tween 20 0 1 Ajouter 25 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 974 mL d eau distill e Bien m langer en tour noyant Conserver TA PBS 1X solution saline dans un tampon ph
10. r la colle de caoutchouc de la lame l aide de pinces 2 Tremper la lame dans la solution SSC 2X TA et retirer la lamelle couvre objet 3 Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 2X Tween 20 0 1 45 C 4 Rincer la lame en la trempant dans de l eau distill e 5 Laisser s cher la lame l air libre l abri de la lumi re directe Appliquer 20 uL de DAPI antifade la zone hybrid e et recouvrir d une lamelle couvre objet 25 x 25 mm Remarque sur la proc dure Selon la fixation l ge de la coupe et les conditions de pr traitement on peut apercevoir un bruit de fond vert Si le bruit de fond vert est excessif ou interf re avec l attribution de score les lames peuvent tre re lav es de mani re plus stringente 0 Avant le relavage retirer l antifade en enlevant la lamelle couvre objet et en proc dant au lavage en deux changements de solution SSC 2X Tween 20 0 1 de 5 min chacun avec agitation TA Proc der imm diatement au relavage ne pas laisser la lame s cher La stringence peut tre accrue en ajoutant une tape de lavage de 2 x 5 min dans une solution de SSC 0 5X Tween 20 0 1 45 C Une stringence sup pl mentaire peut tre obtenue en augmentant la dur e de lavage et ou la tem p rature jusqu 65 C Accessoires pour microscope Objectifs Un objectif 10X est adapt au balayage de la zone cible Un grossissement sup rieur s av re n cessaire
11. t faibles Suite la page suirante Glossaire des symboles Num ro de lot Dispositif m dical de diagnostic in Cancer Genetics Italia S r l D Risques biologiques vitro Viale Luigi Majno 17 20122 Milano Italia www cancergeneticsitalia com support cancergeneticsitalia com PAT gt K REF Num ro de catalogue Conserver l abri de la lumi re du Attention consulter la documenta soleil tion d accompagnement Fabricant CE Marquage CE de conformit Limite sup rieure de temp rature DNA FISH Probe fabriqu e dans la communant europ enne par Cancer Genetics Italia S r l LS E YY Contient suffisamment pour 10 tests Utiliser avant le Bibliographie Casalini P et al www AtlasGeneticsOncology org Pauletti G et al J Clin Oncol 2000 18 21 3651 64 Harries M et al Endocr Relat Cancer 2002 9 2 75 85 Kallioniemi O P et al Proc Natl Acad Sci U S A 1992 89 12 5321 5 Slamon D J et al Science 1987 235 4785 177 82 Wolff A et al J Clin Oncol 2007 Jan 25 1 118 145 Mano M S et al Cancer Treat Rev 2007 33 1 64 77 DEON en A 2012 Cancer Genetics Italia S r l Version 05 31 12
12. tement des lames r aliser sous une hotte aspiration 1 D paraffiner la lame dans 3 bains de CitriSolv de 10 min chacun TA Remarque sur la proc dure Les bocaux de CitriSolv peuvent tre utilis s deux fois Toutefois le troisi me bocal doit contenir du r actif encore inutilis 2 D shydrater la lame en l incubant dans deux bains d thanol 100 de 5 min chacun TA S cher l air peut rester a TA pendant plusieurs heures Remarque sur la proc dure La lame peut tre conserv e s che TA pendant plus ieurs heures 3 Incuber la lame dans du HCI 0 2N pendant 20 min TA 4 Rincer la lame dans un bain d eau distill e pendant 1 min TA et 2 bains de SSC 2X de 5 min chacun TA Suite la page suirante Proc dure pour section FFPE 5 Incuber la lame dans une solution de NaSCN 1M pr chauff e pendant 10 min 80 C Remarque sur la proc dure Certain types de tissus tel le tissue mammaire n ces sitent un temps d incubation plus long 30 60 minutes 6 Rincer la lame dans un bain d eau distill e et 2 bains de SSC 2X de 5 min chacun TA 7 Mettre la lame soit dans une chambre humide ou dans un Thermobrite Couvrir la zone cible avec au moins 100 mL de pepsine 0 4 garder la lame en cours d incubation dans des conditions humides Ne pas laisser l chantillon se dess cher 8 Incuber pendant 10 min 37 C Remarque sur la proc dure Cette dur e peut devoir tre ajust
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