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2. Allgemeiner Teil

1. i Einschr nkungen und Probleme von GOLD wurden bereits ausf hrlich evaluiert Die Resultate k nnen unter http www ccdc cam ac uk prods gold ccdc_test html eingesehen werden Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 26 2 3 3 3 1 Wasserstoffbr ckenbindungen Die Wasserstoffbr cke ist die wichtigste orientierende zwischenmolekulare Wechselwirkungskraft in biologischen Systemen Bei einer Wasserstoffbr cke handelt es sich um die Bindung eines kovalent gebundenen H Atoms an ein zweites Atom Br ckenatome sind ausschlie lich Wasserstoffe weil diese die einzigartige Eigenschaft haben bei physiologischem pH Wert eine positive Teilladung zu tragen und doch noch kovalent gebunden vorliegen Gleichzeitig ist das Wasserstoffatom klein genug um eine relativ enge Bindung an ein zweites elektronegatives Atom zu erlauben Die biologisch relevanten schwachen Wasserstoffbr ckenbindungen sind unsymmetrisch Das H Atom ist deutlich an einen der beiden Br ckenk pfe gebunden Z X a u Xf oi Z N 0 S Fr R Donor OD ss X Carbonyl Ether Alkohole keen sg N Amine Heterozyklen Akzeptor A n Abbildung 13 Zur Charakterisierung und Bewertung von Wasserstoffbr cken werden der Bindungsabstand R und der Winkel o herangezogen Die Wechselwirkung ist prim r elektrostatischer Natur und wird durch das Coulombsche Gesetz beschrieben allerdings werden den Atomen hierbei keine ganzen sondern Partialladungen zugeordnet 2 3 3 3 2 Elektrosta
2. SS Die Prim rsequenz der Kinasedom ne enstammt der SwissProt Dababase Primary Accession Number P04626 Lars Kissau 4 Spezieller Teil 75 IGFIR SV o BONS Y 5 aena H DI E ErbB 2 LRK vk kA BRL 1 Pcenvk1p 9 very tec IGFIR DH H D Dap 4 jazendeiolzuy d o es ks vis LEANN ErbB 2 WR D H eck R Ietckwe D We 9 Wi Di aneron IGFIR EE i BA E ie m Y an ErbB 2 EDVRL EIN I IGFIR cs sta ur Cu ErbB 2 WR D i u 4 mi irch H earner IGFIR YAVI CA4 D DN PER DIR MER Fe ER ErbB 2 DEP IE DR EE RR IA E Abbildung 52 Alignment der Prim rsequenzen von ErbB 2 und IGFIR Auch das Homologiemodell der ErbB 2 Rezeptor Tyrosin Kinase wurde im bereits beschriebenen Verfahren rekursiv optimiert Im Ramachandran Diagramm Anhang V sind weniger als 5 der Aminos uren au erhalb der erwarteten Bereich Ribbon Diagramme der hier erstellten Homologiemodelle von Tie 2 VEGFR 2 VEGFR 3 und ErbB 2 sind in Anhang IV gezeigt 4 2 4 5 Analyse der strukturellen Differenzen Die fertiggestellten Homologiemodelle der Kinasedom nen erlaubten nun die Analyse struktureller Differenzen und deren Konsequenzen f r die inhibitorische Aktivit t der getesteten Kinaseinhibitoren Die in einem Abstand von maximal 8 von ATP gefundenen Substitutionen sind in Tabelle 5 zusammengefasst Der geringe Selektionsdruck auf die Reste in der hydrophoben Tasche
3. Abbildung 56 Nakijichinon C im aktiven Zentrum der ErbB 2 Kinase Dom ne Aus diesen Bindungsmodi ergibt sich eine schl ssige Erkl rung f r die beobachteten Selektivit ten berlagert man die Komplexe aus Kinase und Inhibitor am Computer ist sofort zu erkennen dass die bereits angesprochenen Substitution im Bereich der hydrophoben Tasche deren Form und Gr e ver ndern Versucht man Nakijichinon C in das aktive Zentrum der VEGFR 2 Kinase Dom ne zu docken f hrt dies zwangsl ufig zu einer berlappung der C 2 Methylgruppe mit der Seitenkette von Val 899 In ErbB 2 findet sich an dieser Position hier Serin 779 dessen sterischer Anspruch geringer ist Vermutlich aus dem gleichen Grund zeigen zahlreiche Nakijichinonanaloga aus der Bibliothek mit identischer Konfiguration an C 2 ebenfalls keine Inhibition von VEGFR 2 Umgekehrt erfordert das Docking von 98 in das aktive Zentrum von ErbB 2 eine Drehung des Dekalinsystems im Vergleich zur Bindung an VEGFR 2 um einer berlappung der C 5 Methylgruppe mit Met 770 Leu 889 in VEGFR 2 auszuweichen Diese Drehung bringt jedoch die C 2 Methylgruppen in direkten Kontakt mit Thr 834 und Leu 833 in ErbB 2 Das Cys 1045 bzw Val 916 in VEGFR 2 verursachen hier keine sterische Absto ung Die Differenzen im hinteren Teil des hydrophoben Tasche verursachen also eine Verschiebung der beiden Inhibitoren berlagert man bei Komplexe aus Kinase und Inhibitor so dass die Hinge Regionen sich exakt berdecken
4. Bei der BASF AG insbesondere Herrn Brugger m chte ich mich f r die Durchf hrung der Edman Sequenzierung bedanken Dem Fonds des Verbandes der chemischen Industrie der Studienstiftung des deutschen Volkes und e fellows net m chte ich f r die gro z gige finanzielle Unterst tzung meiner Promotion danken CURRICULUM VITAE PERS NLICHE ANGABEN Name Lars Arne Kissau Geburtsdatum ort 07 05 1973 in Karlsruhe Familienstand ledig Staatsangeh rigkeit deutsch AUSBILDUNG 1983 1986 Kardinal von Galen Gymnasium M nster 1986 1990 Mountain Lakes Highschool Mountain Lakes NJ USA 1990 Highschool Abschluss Graduation 1990 1992 Werner Heisenberg Gymnasium Bad D rkheim 1992 Abitur 1992 Ausbildung zum Rettungssanit ter beim DRK 1993 1998 Chemiestudium an der Universit t Freiburg i Br 1995 Vordiplompr fung Note Sehr Gut 1998 Diplompr fung Note Sehr Gut 1999 2002 Dissertation bei Prof Dr H Waldmann an der Universit t Karlsruhe 02 1999 10 1999 und an der Universit t Dortmund und am Max Planck Institut f r molekulare Physiologie Dortmund 11 1999 12 2002 ERSATZDIENST Zivildienst als Rettungssanit ter beim Deutschen Roten Kreuz Kreisverband Bad D rkheim e V AUSZEICHNUNGEN 1996 1998 Stipendium der Studienstiftung des deutschen Volkes 1999 2001 Kekul Stipendium des Fonds der Chemischen Industrie 1999 2001 Promotionsstipendium der Studienstiftung des deutschen Volkes Seit 2001
5. 118 8 Phe C 4 71 5 d C 1 Jc p 5 38 Hz 70 0 d CH gt CH gt O P Jc p 6 51 Hz 68 1 d CH gt CH5 O P Jc 6 15 Hz 54 6 Phe a CH 53 3 OCH3 49 2 d C 9 Jc 7 69 Hz 38 4 Phe CH3 31P_NMR CDCl 202 5 MHz 5 0 66 C4gHaoNOgP 717 7427 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 186 3 Phosphonomethyl tyrosinyl histidinyl alanyl glycin 67 Tentagel S NH2 versehen mit einem Wang Linker wird mit Fmoc Glycin gem AAV 1 beladen Fmoc Alanin Fmoc Histidin Trt Fmoc Tyrosin und der Spacer X werden nacheinander gem AAV 1 bis AAV 4 aufgekuppelt Anschlie end wird das Harz in DMF suspendiert entgast und mit Pd PPh3 4 und Morpholin versetzt Nach 4 h bei Raumtemperatur werden Palladiumrest mit einer L sung von KCN in DMSO entfernt und das Harz dreimal mit 4 ml DMF und dreimal mit 4 ml Dichlormethan gewaschen Gem AAV 7 wird das Peptid vom Harz abgespalten und mittels HPLC analysiert und gereinigt AAV 8 Methode A AAV 9 Methode A Ausbeute 15 mg 23 umol H NMR CDCl 400 MHz amp 8 55 8 43 m 2H H 2 H 6 8 30 8 22 m 1H His e H 8 18 8 09 m 1H H 5 7 63 7 55 m 1H H 4 7 35 m 1H His 5 H 7 09 d 2H Tyr H 2 H 6 J 8 41 Hz 6 61 d 2H Tyr H 3 H 5 J 8 41 Hz 4 68 4 58 m 1H Tyr a H 4 55 4 48 m 1H His a H 4 35 4 25 m 1H Ala o H 3 91 3 78 m 2H Gly CH2 3 19 2 80 br m 4H Tyr B H His B H 2 49 br s 2H Ph CH P 1 21 d 3H Ala C
6. HH Dies ist graphisch nicht gut darstellbar Beide Dateien befinden sich auf beliegender CD und k nnen mit RASMOL auf einem PC betrachtet werden Lars Kissau 4 Spezieller Teil 99 O Zo NH R e OMe 7 N Oe 116 R OH Le 117 Abbildung 68 Pepticinnamin E Analoga 116 und 117 Das Peptidr ckgrat ist identisch zum R ckgrat des Naturstoffs Diese ist im Wesentlichen auf den C terminalen Baustein zur ckzuf hren die aufgrund der ung nstig ausgerichteten 2 Carbonylgruppe 116 bzw 2 Methylgruppe 117 nicht gut in die Carboxylatbindungstasche passen Ebenso st rend f r die offensichtlich wichtigen Wechselwirkungen zur a Untereinheit des Enzyms d h der Carboxylatbindungsstelle der PFT sind hydrophobe Reste am C Terminus welche m gliche H Br cken Bindungen durch ein Carboxylat verhindern siehe 130 und 131 sowie ein zu gro er sterischer Anspruch Letzteres wird insbesondere beim Vergleich von 125 und 126 deutlich Ein passendes Muster von Wasserstoffbr ckendonoren und Akzeptoren sowie sterische Kompatibilit t sind hingegen urs chlich f r die gute Affinit t von 127 und 132 4 3 2 2 2 Untersuchung der zweiten Gruppe Tetramere mit Naturstoff identischen R ckgrat Innerhalb der zweiten Gruppe von Verbindungen die im Gegensatz zum Naturstoff aus vier Monomeren bestehen und einen freien C Terminus aufweisen sind die Verbindungen 110 und 114 bez glich der gemessenen ICs Werte besonders interessan
7. Wenngleich sich die Rechnerleistung gem Moore s Law immer noch regelm ig verdoppelt ist die ab initio Betrachtung ganzer Proteine noch nicht praktikabel F r die Berechnungen in dieser Arbeit wurde daher ausschlie lich auf semi empirische Methoden und Kraftfeldrechnungen zur ckgegriffen Semi empirische Verfahren erreichen die Beschleunigung der Rechnung durch mehrere Vereinfachungen im Vergleich zu ab initio Verfahren Zum einen werden einige der zu l senden Integrale ignoriert und durch dem Experiment angepasste Parameter substituiert Zum anderen werden lediglich die Valenzelektronen in die Rechnung einbezogen basierend auf der Annahme diese seien haupts chlich f r die molekularen Eigenschaften verantwortlich In der vorliegenden Arbeit wurden die semiempirischen Berechnungen mit dem AM1 Algorithmus durchgef hrt Da signifikante Abweichungen zu den Resultaten der Kraftfeldrechnungen nicht auftraten wurden die meisten Berechnungen jedoch mit letzterer Methode durchgef hrt Im Gegensatz zu quantenmechanischen Verfahren werden bei Kraftfeldrechnungen Kerne und Elektronen ignoriert und die Atome statt dessen als miteinander wechselwirkende Massepunkte betrachtet In Analogie zu makroskopischen Systemen stellen die Atome elastische Kugeln dar die durch Federn verschiedener St rke miteinander verbunden sind Den verschiedenen Atom und Bindungstypen wird durch Parametrisierung verschiedener Atomtypen Rechnung getragen Damit kan
8. 3 12 dd 2H Phe H J 14 05 Hz J 5 35 Hz 2 85 dd 2H Leu y H J 13 88 Hz J 9 37 Hz 1 21 1 08 m 9H Val CH Thr CH C NMR CDC1 100 6 MHz 8 176 6 Gly C O 174 9 Phe C O 172 9 C 1 172 8 Gln C O Leu C O Thr C O 159 3 P CH gt Ph CO NH R 154 3 C 3 152 2 C 8 138 0 Phe C 1 136 9 P CH3 C 1 129 5 C 2 129 0 C 5 127 4 Phe C 2 C 6 126 7 Phe C 3 C 4 C 5 74 0 C 1 71 2 C 2 70 8 C 4 69 7 C 3 65 7 C 5 55 0 Leu a C 49 7 Gly a C 43 7 Leu CH 37 3 Leu CH 16 6 Thr CH3 31P_NMR CDCI 202 5 MHz 8 8 16 1P y P 11 15 1P P 23 17 1P B P CaoHooN 1 104P 1171 89 PEGA Spacer 37 GTP 77b F r die Entwicklung eines Fluoreszenz Assays ist eine GTP beladenes Harz notwendig Hierzu wird gem AAV 1 der Fluorenylphosphat Spacer 75 an PEGA Harz gekuppelt und die Phosphatschutzgruppen gem AAV 4 mit Piperidin entfernt Anschlie end wird wie bereits beschrieben voraktiviertes GDP zum Harz gegeben und 14 h bei 50 C gesch ttelt In analoger Weise k nnen ADP und XDP auf das Harz gekuppelt werden IP_NMR DMSO DMF Dichlormethan 202 5 MHz on bead 10 28 2P a P y P 21 23 1 P B P 2 Bis 9H fluoren 9 ylmethoxy phosphoryloxy ethoxy alanyl phenylalanyl glycin 77a PEGA Harz wird mit dem Allyllinker 87 gem AAV 1 beladen Fmoc Alanin Fmoc Phenylalanin Fmoc Glycin sowie der Spacer 75 werden gem AAV 1 bis
9. 49 8 OCH3 C 14H 1604 FAB MS 3 NBA 249 1 M H 100 248 1 M 97 217 M OCH3 30 HRMS FAB 3 NBA berechnet 248 1049 gefunden 248 1060 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 161 HRMS FAB 3 NBA berechnet f r C14H1704 249 1127 gefunden 249 1165 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 162 3 4 Bisallyloxybenzoes ure 23 Es werden 488 mg 1 78 mmol 3 4 Bisallyloxybenzoes ureallylester in 20 ml THF 2 ml Methanol und 2 ml Wasser gel st Man r hrt 36 h bei Raumtemperatur und extrahiert anschlie end mit ges NH4Cl L sung und Ethylacetat Nach dem Trocknen der organischen Phasen mit NaSO und Einengen im Vakuum erh lt man ein gelbliches Produkt Nach Chromatographie Cyclohexan Ethylacetat 2 1 v v erh lt man 360 mg eines farblosen Feststoffs Ausbeute 360 mg 1 54 mmol 87 d Th Smp 134 136 C Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat 1 2 v v 0 58 H NMR CDC 400 MHz 5 7 73 dd 1H Aromat J 8 41 Hz J 1 96 Hz 7 62 d 1H Aromat J 1 96 Hz 6 92 d IH Aromat J 8 60 Hz 6 13 m 2H CH CH CH 5 47 ddt 2H CH CH CH J 1 56 Hz J 4 89 Hz J 17 20 Hz 5 35 ddt 2H CH CH CHb J 1 56 Hz J 4 89 J 17 20 Hz 4 68 ddt 4H CH CH CH J 8 41 Hz J 5 28 Hz J 1 56 Hz C NMR CDCl 100 6 MHz 8 171 52 C 1 153 45 C 5 148 16 C 4 133 17 C 9 133 10 C 12 124 87 C 2 121 92 C 7 118 41 C 4 118 26 C 3 115 12 C
10. C 4 C 5 C 6 C 7 C 8 70 3 C 1 41 6 C 9 36 3 CH CH3 24 0 CH CHs3 2 31P_NMR CDCl 202 5 MHz 8 147 4 C34H36NOz2P 521 63 Die analytischen Daten stimmen mit den Literaturangaben berein Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 174 3 Bis 9H fluoren 9 ylmethoxy phosphoryloxy benzoes ure allylester 55 Zu einer L sung von 35 mg 0 19 mmol 3 Hydroxybenzoes ureallylester und 15 mg 0 2 mmol Tetrazol in 6 ml abs Dichlormethan wird bei 0 C eine L sung von 200 mg 0 38 mmol Difluorenylmethyl N N diisopropyl phosphoramidit in 9 ml abs Dichlormethan in 5 min zugetropft und 1 h bei 0 C ger hrt Anschlie end wird auf Raumtemperatur erw rmt Nach 3 h wird eine L sung von 18 mg 1 0 mmol t Butylhydroperoxid in n Hexan zugegeben und 2 h bei Raumtemperatur ger hrt Man extrahiert mit ges NaHSO L sung sowie zweimal mit ges NaHCO L sung und trocknet die organische Phase ber Na gt 5SO Nach Chromatographie an Kieselgel werden 10 mg Edukt und 32 mg Produkt isoliert Ausbeute 32 mg 0 05 mmol 38 5 d Th Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat 1 1 v v 0 25 H NMR CDC13 400 MHz 7 87 m 1H H 6 7 79 m 1H H 2 7 71 ddt 4H H 4 H 5 J 7 63 Hz J 1 76 Hz J 0 78 Hz 7 47 dddd 4H H 3 H 6 J 9 38 Hz J 7 43 Hz J 1 76 Hz J 0 98 Hz 7 36 ddt 4H H 1 H 8 J 7 43 Hz J 1 17 Hz
11. DE fJGGFOGRCNKLVBcCCYSFWOAGLEPELHR DT jt WEOHROPs sHGCMKFESELNAS YDOSD JGGFOGRENKF ADT CYAFWCENSEHEUTR iciiwBcERQLP SEGL ERPERE PD ESTER DWKMLCOTI ALHAQGDPAESMS W FHOOABoE TEN Ecoc E VTNYLBBT OKT BiWJDR exERs iPaGGp e QHFGSGAMLHDVVMG PENVIG EGKFNGEf CHEER i GEEQIKPIjsP VrC PEEVIO T DFSKRCCF PAGGLLDMPGKSRDFYETCECHSGLSHa LEGGFSKN ETGGFADRPGBMVDPEHTLEGHAGLSLO DEBDADLYH CLESABLALE PTHPVYN SPDKVIOATTHFLOKPVPGF RVNvopEvs Abbildung 75 Alignment der Sequenzen der Untereinheiten der PFT GGTasel und GGTasell RabGGTase identische Rest sind grau hinterlegt homologe Reste in gr n Aus diesem Alignment wurde analog zu der f r die Homologiemodelle der Rezeptor Tyrosin Kinasen beschriebenen Vorgehensweise mit den Programmen MODELLER und WHATCHECK ein Homologiemodell der B Untereinheit der GGTase I erstellt Zusammen mit dem bekannten a Untereinheit der PFT ergab dies ein Modell der GGTase I Lars Kissau 4 Spezieller Teil 116 Abbildung 76 Vergleich der Strukturen der PFT schwarz GGTase II rot GGTase I gold Homologiemodell berlagert man die in Abbildung 76 gezeigten Strukturen der GGTase II der PFT und des Modells der GGTase I lassen sich folgende Unterschiede erkennen Alal51 und Pro152 der PFT bild
12. lautet ist es dennoch sinnvoll diese Regeln zu beachten denn einem Einsatz in diversen in vitro Assays k nnte auch ein Einsatz in zellul ren oder tierische Testsystemen folgen da auch hier die Konsequenzen einer PFT oder GGTase Inhibition nicht sehr gut verstanden werden Aus den vorangegangenen Analysen und den Lipinski Kopple Regeln ergaben sich folgende Ansatzpunkte f r die Optimierung 1 Reduktion der Zahl frei drehbarer Bindungen 2 Verst rkung hydrophober Wechselwirkungen 3 Verbesserung der L slichkeit in w ssrigen Medien 4 Steigerung der Zahl St rke der Wasserstoffbr cken unter Beachtung der Lipinski Kopple Regeln 5 Verst rkung der Bindung von Histidin an Zn 4 3 4 2 Reduktion der Zahl frei drehbarer Bindungen Wie in Tabelle 13 gezeigt weisen die Pepticinnamin E Analoga bis zu 27 frei drehbare Bindungen auf und sind damit weit von den gem Lipinski und Kopple als ideal definierten l0 bis 12 entfernt Eine Einschr nkung dieser Flexibilit t k nnte entweder durch Einf hrung starrer Bausteine in die Kette oder durch Cyclisierung erfolgen Die Lars Kissau 4 Spezieller Teil 110 Konformation der hier diskutierten peptidischen PFT Inhibitoren kann in einigen F llen mit einer B Turn Konformation vergleichen werden Die Anwendung von Turn Mimetika ist ein oft beschrittener Weg um zu bioverf gbaren Inhibitoren zu gelangen Neben Benzodiazepinen geh ren u a auch cyclische Peptide zu den B Turn Mimet
13. ssssssossssossssssnussnsnssssnsnsnnnsnsnnnsnsnnnnnnnnne 119 Sls ZUsammenlassung es ee ea Ne aa 119 3 2 Ausblick EE 127 6 Experimenteller Lat geet eege Ee 129 6 1 Messserate und Halfsmitel u ae Rasen 129 6 2 Allgemeine Arbeitsvorsehr fen a ii 131 6 3 Allgemeine Arbeitsvorschriften Molecular Modelling AAN MM 133 6 4 Arbeiten zu Kapitel 4 1 EE 152 6 5 Arbeiten zum Kapitel 4 2 RI HI 189 6 6 Arbeiten za Kapitel AG csi ata att ia ers lacie ae taal natant skin 191 Te E e E 5 sis ss Sowsicasadaceas RE 195 AD ES I AT EEEE Ee 202 Lars Kissau 1 Einleitung 1 1 Einleitung Alles was die Natur selbst anordnet ist zu irgendeiner Absicht gut Die ganze Natur berhaupt ist eigentlich nichts anderes als ein Zusammenhang von Erscheinungen nach Regeln und es gibt berall keine Regellosigkeit Immanuel Kant Die Existenz und Funktionsf higkeit eines Organismus sowie einzelner Zellen h ngt entscheidend von pr zisen Regulationsprozessen ab St rungen der inter und intrazellul ren Kommunikation haben weitreichende Konsequenzen f r die Zellen bzw den ganzen Organismus Erkrankungen wie Krebs oder Psoriasis sind auf fehlgeleitete Kommunikationsprozesse zur ckzuf hren In einem multizellul ren Organismus wie dem Menschen werden Signale zwischen Organen und Zellen mittels Botenstoffen ausgetauscht Einerseits existieren Botenstoffe die Zellmembranen passieren und in der Zielzelle direkt die gew nschte Reaktion
14. 12 Ser 1006 Ala 844 Ala 855 Asn 834 Ala 730 13 Glu 1001 Pro 839 Val 850 Val 829 Val 725 14 Gly 1168 Asp 1064 Ser 1012 Met 1012 Val 862 15 Asp 1083 Asn 923 Asn 937 Asn 909 Cys 801 Tabelle 5 Aminos ure Substitutionen innerhalb der Kinasedom nen die f r die vorliegende Analyse bedeutsam sind Neben den hier aufgef hrten Substitutionen k nnten auch die Differenzen im Nucleotide Binding Loop Zeile 12 und 13 eine Rolle bei den beobachteten Selektivit ten spielen Ein sehr interessantes Merkmal der Rezeptor Tyrosin Kinasen der EGF Familie zu denen Her 2 Neu ErbB 2 geh rt ist ein Cystein dass die 2 Hydroxylgruppe von ATP koordiniert An dieser Stelle findet sich in den anderen Rezeptor Tyrosin Kinase Famlien ein Asparagin oder Asparagins ure Zeile 15 Diese Merkmal wurde von Pfizer und Wyeth Ayerst genutzt um irreversible Kinaseinhibitoren zu konstruieren die ein Michael System entsprechend positionieren Ob das Toxizit tsprofil dieser Verbindungen einen klinischen Einsatz zul sst wird gegenw rtig gepr ft F r die bisher synthetisierten und hier untersuchten Inhibitoren spielt diese Substitution jedoch keine Rolle 4 2 5 Aufkl rung der Bindungsmodi Zur Ermittlung der Bindungsmodi als Voraussetzung der Bestimmung molekularer Ursachen f r experimentell bestimmte Aktivit t kann man entweder auf automatische Docking Programme wie GOLD oder FlexX zur ckgreifen oder manuell vorgehen der sogenannte wiss
15. 7 38 t 1H C 6 J 7 81 Hz 7 33 7 25 m 2H aromat 5 93 ddd 2H CH gt CH CH J 5 68 Hz J 11 32 Hz 7J 22 68 Hz 5 37 dt 2H CH CH CHb J 1 38 Hz J 17 11 Hz 5 25 d 2H CH gt CH CH J 10 21 Hz 4 74 4 53 m 4H CH gt CH CH C NMR CDCI 100 6 MHz 5 172 4 C O 146 5 C 3 137 5 CH gt CH CH 131 9 C 1 129 2 C 5 119 7 C 6 120 3 C 4 116 3 C 2 115 2 CH2 CH CHz2 70 6 CH gt CH Ch 31P_NMR CDCI 202 5 MHz 3 75 Ci3Hi6NOsP 297 2436 FAB MS Glycerin 298 5 M H 2 HRMS FAB Glycerin berechnet 297 0766 gefunden 297 0758 3 Bis allyloxy phosphorylamino benzoyl alanin methylester 49 790 mg 2 24 mmol 48 werden unter Argon Ih in 30 ml einer L sung von TFA und Triethylsilan in Dichlormethan 67 33 2 geriihrt und anschlieBend mit Toluol verdiinnt Man enfernt die fl chtigen Bestandteile im Vakuum und l st die S ure in 4 ml DMF 842 mg 2 22 mmol HBTU und 1 37 ml 8 0 mmol N Ethyldiisopropylamin werden hinzugegeben und 3 min ger hrt Man f gt dann eine L sung von 313 mg 2 24 mmol L Alaninmethylester hydrochlorid hinzu und r hrt 5 h bei rt Die Reaktionsl sung wird mit Ethylacetat verd nnt 3 mal mit destilliertem H O ges NaCl L sung und nochmals Wasser gewaschen Die organische Phase wird ber Na2SO getrocknet und im Vakuum eingeengt Man erh lt ein rosafarbenes l welches durch Chromatographie Dichlormethan Methanol Triethylamin 98 2 1
16. Anstelle der linearen Pepticinnamin E Analoga sollten die hier vorgeschlagenen zyklischen Verbindungen ber verbesserte pharmakologische Eigenschaften verf gen Wichtig bei der Entwicklung der optimierten Inhibitoren war das Resultat dass Substituenten die in der Farnesylpyrophosphat Bindungstasche binden nicht nur ber hydrophobe Wechselwirkungen zu Affinit t der Inhibitoren beitragen sondern auch die M glichkeit zur Steigerung der Selektivit t bieten Da nur von der Farnesyltransferase und der Geranylgeranyl Transferase II Kristallstrukturen bekannt sind wurde f r den Entwurf von selektiveren Inhibitoren ein Homologiemodell der Geranylgeranyl Transferase I erstellt Die Analyse der strukturellen Lars Kissau 5 Zusammenfassung und Ausblick 126 Unterschiede insbesondere innerhalb der B Untereinheit ergab dass durch die in Abbildung 91 farbig hervorgehobenen Modifikationen die Selektivit t deutlich zu verbessern w re Die Einf hrung des blau markierten Phenylrestes in 163 w rde die Bindung an die GGTase I und bedingt an die GGTase II beg nstigen Der rot markierte Phenylrest k nnte die Selektivit t ebenfalls zugunsten der GGTase I beeinflussen Der gr n markierte Phenylrest schlie lich w rde mit den Argininresten der PFT und der GGTase II in Konflikt geraten nicht aber mit dem Cystein der GGTase I Eine Selektivit t ausschlie lich zugunsten der GGTase II w re am Besten ber die Variation des Restes R zu erreichen
17. C 3 C 6 69 4 Fm CH 69 3 Ph CH 3 OPO OR gt 62 1 Ph CH gt OH 48 1 C 9 31P_NMR CDCl 202 2 MHz 0 46 C36H3OsP 574 60 FAB MS 3 NBA 574 7 M 9 3 Methyl benzoes ure tert butylester 63 Zu einer L sung von 14 35g 105 5 mmol 3 Methylbenzoes ure in 35 ml 1 4 Dioxan werden unter K hlung 20 ml 2 Methylpropen zugegeben Nach Zugabe von 4 ml konz H2SO 4 wird das Reaktionsgef verschlossen und 24 h bei Raumtemperatur ger hrt Die Reaktionsmischung wird erneut abgek hlt und mit Ethylacetat verd nnt Nach Extraktion mit NazCO3 werden die organischen Phasen mit Na2SOz getrocknet und eingeengt Man erh lt 19 8 g eines braunen ls das durch Flash Chromatographie Cyclohexan Ethylacetat 99 1 v v gereinigt wird Ausbeute 13 7 g 71 7 mmol 68 d Th Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat 99 1 v v H NMR CDC1 400 MHz 7 84 7 77 m 2H H 2 H 6 7 35 7 23 m 2H H 4 H 5 2 39 d 3H Ph CH 3 J 0 36 Hz 1 60 s 9H C CH3 3 C NMR CDCL 100 6 MHz 5 166 1 C O 138 1 C 3 133 4 C 4 132 2 C 1 130 2 C 2 128 3 C 5 126 8 C 6 81 0 C CH3 3 28 4 C CHs3 3 21 5 Ph CHs3 C12H160 3 192 25 FAB MS 3 NBA 193 4 M H 31 3 Bis allyloxy phosphorylmethyl benzoes ure tert butylester 65 10 mg Dibenzoylperoxid werden zu einer L sung von 3 Methylbenzoes uretertbutylester und NBS frisch aus Wasser umkristallisiert und ber Bue am HV getrocknet in
18. Die Ramachandran Plots der Homologiemodelle siehe Anhang I zeigen dass ber 95 der Aminos uren sich in den erwarteten Bereichen befinden Diese Werte stimmen mit denen guter Kristallstrukturen bzw Homologiemodelle berein Keine der Aminos uren die mit den ATP kompetitiven Inhibitoren interagieren liegt au erhalb der erlaubten Bereiche im Ramachandran Diagramm Schwierig ist die Bestimmung der exakten Konformation von Teilen des Activation Loop Die Aminos uren diese Teils der Kinasedom ne fehlen teilweise in den Templatstrukturen Lars Kissau 4 Spezieller Teil 74 aufgrund einer geringen Ordnung im Kristall Dies ist vermutlich auf die hohe Flexibilit t dieses Teils der Kinasedom ne zur ckzuf hren Aus zahlreichen Kristallstrukturen von Kinasedom nen ist bekannt dass die Activation Loops der verschiedenen Kinasen recht unterschiedliche Konformationen annehmen Das Modelling dieses Loops auf Basis der Analogie zu einem hier unvollst ndigen Templat ist daher mit Vorsicht zu genie en Der Anfang dieses Loops die auch an der Katalyse beteiligte hochkonservierte DFG Sequenz ist in den Homologiemodellen sicher korrekt Gleiches gilt f r das ebenfalls konservierte Ende mit der Sequenz X X RLPX3 X WMA Die Amins uren RLP und WMA sind hochkonserviert dazwischen gibt es deutliche Unterschiede Der Rest ist allerdings von der ATP Bindungstasche und der hydrophoben Tasche so weit entfernt dass eine Modellierung nich
19. K 2K 3K 3K 3K FK FK FK K K 2K FK 3K 3K FK FK FK K 3K 2K 2K K ok open write unit 42 card name 1_m pdb write coor pdb unit 42 Minimization of molecule 1 close unit 42 Energy after minimisation energy cutnb 998 0 STOP In WitnotP kann die minimierte Struktur als molek l name m pdb wieder eingelesen werden Das Suffix _m wird auch durch die anderen Minimierungsmethoden erzeugt AAV MMA4 Minimierung einer Proteinstruktur Mit Einschr nkungen Anwendung Alle Atome mit einem Abstand von mehr als 5 A von einem Atom des Inhibitormolek ls werden fixiert N her liegende Atome sind frei beweglich Beschreibung Zur Verk rzung der Rechenzeit kann bei der Minimierung von Protein Liganden Komplexen auf die Minimierung von Teilen des Struktur verzichtet werden Hierzu werden nur diejenigen Atome in die Berechnung mit einbezogen die weniger als 5 A von einem Atom des Inhibitors entfernt sind Skriptname Minim_run Dauer 1 5 h Unix bin sh case in 1 sed s XXXX 1 ocg work mm charmm_templ1 inp gt 1 inp charmm lt 1 inp gt 1 out 2 gt amp 1 echo witnotp host none lt lt EOF echo set gnu off echo read mol 1 mol echo read coord xpdb 1 _m pdb 1 done echo modify mol name 1 _m echo done echo write mol 1 m 1 _m Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 139 echo exit yes echo EOF sh gt gt 1 out 2 gt amp 1 echo nWrong numb
20. M Bian D Wegert S Porreca F Lee D K H J Pharmacol Exp Therap 1999 289 1271 1276 Auch die Kupplung an festphasengebundenes Phosphotyrosin gelang Die Methode zur Synthese von Nucleosidtriphosphat Konjugaten ist daher auch zur Synthese von ATP Peptidkonjugaten einsetzbar Die analytischen Daten wurden von Herrn Dr Courtney Aldrich aufgezeichnet Rensland H John J Linke R Simon I Schlichting I Wittinghofer A Goody R S Biochemistry 1995 34 593 599 Bold G Altmann K H Frei J Lang M Manley W M Traxler P Wood J M J Med Chem 2000 43 2310 2323 Stahl P Doktorarbeit Universitat Karlsruhe 1999 Stahl P Waldmann H Angew Chem Int Ed 1999 38 3710 3713 Stahl P Kissau L Mazitschek R Huwe A Furet P Giannis A Waldmann H J Am Chem Soc 2001 123 11586 11593 Marti Renom M A Stuart A C Fiser A Sanchez R Melo F Sali A Annu Rev Biophys Biomol Struct 2000 29 291 325 McTigue M A Wickersham J A Pinko C Showalter R E Parast C V Tempczyk Russell A Gehring M R Mroczkowski B Kan C C Villafranca J E Appelt K Structure 1999 7 319 330 Mohammadi M Froum S Hamby J M Schroeder M C Panek R L Lu G H Eliseenkova A V Green D Schlessinger J Hubbard S R EMBO J 1998 17 5896 5904 Dies Strukturen sind den PDB Eintr gen 1FGI and 2FGI entnommen Vriend G J Mol Gr
21. PFT PS Harz Rr RTK Smp TBABr TBACI TBAF TBAI TFA THF TLC VEGFR 2 3 WitnotP Zers O 7 Azabenzotriazol 1 yl N N N N tetramethyluronium hexafluorophosphat O Benzotriazol 1 yl N N N N tetramethyluronium hexafluorophosphat 1 Hydroxybenzotriazol High Resolution Mass Spectrometry Ion Exchange Chromatographie Insulin Like Growth Factor 1 Receptor Kinase Molaritat Minute N Bromsuccinimid Polyethylenglykol Acrylamid Copolymer Peptide Engineering Programm Protein Farnesyl Transferase Polystyrol Harz Retentionsfaktor Rezeptor Tyrosin Kinase Schmelzpunkt Tetrabutylammoniumbromid Tetrabutylammoniumchlorid Tetrabutylammoniumfluorid Tetrabutylammoniumiodid Trifluoressigs ure Tetrahydrofuran D nnschichtchromatographie Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 3 What is the name of this program Zersetzung 1 Herr Dr A Widmer Novartis AG der dieses Programm entwickelt hat beantwortete die Frage mit dem Acronym Lars Kissau 8 2 Strukturen von Reagentien 8 2 Anhang II Strukturen von Reagentien und Linkern O Oro Tr Don IS ron HYCRON Linker N uU O Oo AN i N PF6 Wang Linker HBTU oof S Cl N Cl Trityl Linker HOBt 20 5 Lars Kissau 8 3 Homologiemodell der PP2A 206 8 3 Anhang III Homologiemodell der PP2A In einem weiteren kleinen Projekt wurde f r die Aufkl rung der Bindungsstelle von Cytostatin siehe Disserta
22. Phosphorylierung des Allylesters 54 gelang jedoch nicht so dass 54 mit frisch synthetisiertem und destilliertem Bis 2 cyanoethoxyphosphoramidit 52a phosphityliert wurde Durch Lars Kissau 4 Spezieller Teil 45 Oxidation mit tBuOOH wurde die Verbindung 57 erhalten Als bester Scavenger bei der nachfolgenden Entsch tzung zu 58 mit Pd Ph3 4 erwies sich N Methylmorpholin Bei der zweifachen Entsch tzung des Bis cyanoethylphosphates wurde neben dem einfach entsch tzten Hauptprodukt auch 3 Hydroxybenzoes ure isoliert Daher wurde eine leichter abzuspaltende Schutzgruppe f r das Phosphat ausgesucht F r den Einsatz eines Phosphors urefluorenylmethylesters sprach die M glichkeit der milden Entsch tzung mit Piperidin in DMF Die Synthese von Di Fluorenylmethoxy diisopropylphosphoramidit 52b wurde zun chst optimiert Neben dem selbstverst ndlichen Wasserausschluss bei der Synthese war die Reinigung besonders kritisch da sich diese Verbindung nicht in Analogie zu 52a destillieren l sst Die anf nglich beobachtete Zersetzung bei der Flash Chromatographie konnte durch ausf hrliche Deaktivierung mit Aceton und nachfolgend Triethylamin in Cyclohexan Ethylacetat vermieden werden Mit dem gereinigten 52b konnten die Verbindungen 55 und durch Entsch tzung 56 synthetisiert werden Auch die nachfolgende Testkupplung mit Z Alaninmethylester war erfolgreich nicht jedoch die Entsch tzung der Fluorenylmethylester Die begleitend auftretende Phenolestersp
23. Sequenzen GAPME MPPAE und PGPMG ist ein Prolin in der dritten Position gemein Die Sequenzen GAMGA und YMMLL weisen in dieser Position ein Methionin auf Mittels GOLD Docking wurde versucht die Bevorzugung der gefundenen Sequenzen zu rationalisieren Die Probleme der in GOLD implementierten Scoring Function mit der korrekten Bewertung der Interaktion zwischen kleinen hydrophoben Molek len und einem Rezeptor st ren hier nicht vielmehr ist diese Aufgabe jedes der Peptid GTP Konjugate hat ber 30 frei drehbare Bindungen ideal f r einen genetischen Algorithmus Die experimentell nach Screening und Sequenzierung als vorteilhaft bewerteten Sequenzen wurden daher zusammen mit der Kontrollsequenz KKKKK einem Docking mit GOLD unterzogen Hierbei wurde eine kovalente Bindung zwischen dem N Terminus des Peptids und dem GTP definiert so dass GOLD lediglich die optimale Konformation ermitteln musste Die Dockings wurden jeweils dreimal wiederholt um einen Einfluss der bei der Initialisierung des genetischen Algorithmus verwendeten Zufallszahl zu eliminieren Erfreulicherweise wurden die experimentell als aktiv selektierten Peptide deutlich besser bewertet als die Kontrollsequenzen Die GOLD Scores sind in Tabelle 3 aufgef hrt Trotz intensiver Fehlersuche zusammen mit den Technikern bei der BASF AG konnte die Fehlerquelle nicht identifiziert werden Lars Kissau 4 Spezieller Teil 61 Peptidsequenz Bindung an Ras GOLD
24. Solute dielectric 1 0 Solvent dielectric 78 5 Number of most hydrophobic points to save and display 50 Radius of the probe sphere 1 4 Scaling factor for the electrostatic desolvation 1 0 Scaling factor for the vdW interactions 1 0 Path of the GRASP executable xprog bin grasp Die Erstellung von Abbildungen dieser Hydrophobizit tsoberfl chen erfolgt mit Snapshot Die Konversion in ein Windows kompatibles tif oder jpg Format erfolgt mit xv Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 151 AAV MM17 Erweiterung der Monomer Bibliothek von Pep 1 0 Anwendung In silico Screening einer kombinatorischen Peptidbibliothek Beschreibung PEP ben tigt zum Einbau von Monomeren in die wachsende Kette zun chst die 3D Struktur des Monomeren im pdb Format Die Datei pep coor mu daher mit diesen neuen Eintr gen erg nzt werden Bei der Optimierung mittels des genetischen Algorithmus greift PEP auf die CHARMm Parameter zur ck CHARMm kommerzielle Version CHARMM akademische Version Gegebenenfalls m ssen unbekannte Atome parametrisiert und die Datei MSI PARAM erg nzt werden Die MPEOE Ladungen k nnen mit WitnotP berechnet werden und m ssen zusammen mit einer Definition der drehbaren Bindungen in der Datei pep rtf gespeichert werden rtf residues topology file siehe auch PEP 1 0 Dokumentation Dies kann manuell oder noch einfacher automatisch mittels der CHARMM Verkn pfung in WitnotP
25. erh lt man ein leicht gelbes l Ausbeute 688 mg 1 95 mmol 53 d Th Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat Triethylamin 80 18 2 v v v 0 27 H NMR CDCL 400 MHz 7 82 7 75 m 2H H 2 H 6 7 38 t 1H C 5 J 7 81 Hz 7 34 7 26 m 1H H 4 5 93 dd 2H CH gt CH CHb J 5 68 Hz J 11 32 Hz 5 37 dt 2H CH gt CH CH J 1 41 Hz J 17 01 Hz 5 25 d 2H CH5 CH CH J 10 32 Hz 4 63 4 73 m 4H CH2 CH CH y 1 39 s 9H C CHs3 3 C NMR CDCI 100 6 MHz 8 167 2 C O 146 7 C 3 137 5 CH CH CH 132 5 C 1 129 2 C 5 120 3 C 6 119 3 C 4 116 3 C 2 115 2 CH gt CH CH 73 5 C CH3 3 70 6 CH gt CH Ch 29 3 C CH3 3 31P_NMR CDCl 202 5 MHz 4 02 Ci7H24NOsP 353 35 FAB MS 3 NBA 354 6 M H 2 353 4 M 10 HRMS FAB 3 NBA berechnet 353 1392 gefunden 353 1401 3 Bis allyloxy phosphorylamino benzoes ure 48a Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 170 69 mg 0 2 mmol 3 Bis allyloxy phosphorylamino benzoes ure tert butylester werden in 6 ml abs Methylenchlorid 2 ml Triethylsilan gel st und bei O C mit 0 5 ml Trifluoressigs ure versetzt Man r hrt 2h bei Raumtemperatur verd nnt mit 50 ml Toluol und entfernt die fl chtigen Bestandteile im Vakuum Man erh lt ein blassgelbes l Ausbeute 55 mg 0 19 mmol 95 d Th R Wert Cyclohexan Ethylacetat Triethylamin 80 18 2 v v v 0 14 H NMR CDCl 400 MHz 7 83 7 75 m 2H aromat CH
26. gereinigt wird Ausbeute 788 mg 2 06 mmol 92 d Th laf 13 9 c 0 9 in CHCl Rr Wert Dichlormethan Methanol Triethylamin 98 2 1 v v v 0 21 H NMR CDCl 400 MHz 8 7 43 s 1H H 2 7 31 dd 1H H 4 J 1 16 Hz J 7 64 Hz 7 22 dd 1H H 5 J 8 01 Hz J 7 64 Hz 7 15 dt 1H C 6 J 0 96 Hz J 8 01 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 171 Hz 6 95 br d 1H P NH J 7 44 Hz 6 84 br d CONH J 9 02 Hz 5 89 5 76 m 2H CH gt CH CH 5 24 ddd 2H CH CH CH J 1 36 Hz J 17 16 Hz J 2 72 Hz 5 12 ddd 2H CH gt CH CHp J 0 96 Hz J 10 32 Hz J 2 12 Hz 4 72 q 1H Ala a H J 7 24 Hz 4 59 4 38 m 4H CH gt CH CH 3 3 70 s 3H OCH3 1 44 d 2H Ala H J 7 24 Hz BC NMR CDCl 100 6 MHz 173 6 Ester C O 166 6 Amid C O 140 1 C 3 135 1 CH gt CH CH 132 3 C 1 129 4 C 5 120 4 C 4 120 1 C 6 118 3 CH gt CH CH3 116 5 C 2 67 3 CH gt CH CH 52 4 Ala a C 48 4 OCH3 18 3 Ala C 31P_NMR CDCI 202 5 MHz 3 76 C17H23N206P 382 35 FAB MS 3 NBA 383 7 M H 8 HRMS FAB 3 NBA berechnet 382 1294 gefunden 382 1299 3 Hydroxybenzoes ureallylester 54 Es werden 2 5 g 18 1 mmol 3 Hydroxybenzoes ure 3 5 g 18 1 mmol p Toluolsulfons ure und 12 ml 181 mmol Allylalkohol in 100 ml Benzol p A gel st und 14 h am Wasserabscheider zum R ckflu erhitzt Die L sung wird ei
27. llen Die von C Lipinksi aufgestellten und als Pfizer Rule of 5 bekannt gewordenen Regeln sagen voraus dass eine schlechte Aufnahme bzw Wirkung eines Medikaments zu erwarten ist wenn im Molek l mehr als 5 Wasserstoffbr ckendonoren und 10 Wasserstoffbr ckenakzeptoren vorliegen das Molekulargewicht ber 500 g mol liegt und der CLogP Wert ber 5 liegt Die Lipinski Regeln wurden k rzlich durch K D Kopple erg nzt und modifiziert So scheint das Molekulargewicht von 500 eine weniger kritische Grenze f r die unvermittelte Aufnahme in Zellen zu sein Vielmehr werden Verbindungen mit 10 oder mehr frei drehbaren Bindungen und mehr als 12 Wasserstoffbriickendonoren und akzeptoren schlecht aufgenommen Letztere Einschr nkung begrenzt die polare Oberfl che die laut Kopple besser mit der Verf gbarkeit korreliert als die Lipophilie Frei drehbare Bindungen sind solche nicht terminalen Bindungen zwischen nicht H Atomen Amidbindungen wurden hier aufgrund der eingeschr nkten Rotation nicht mitgez hlt Zahlreiche Ver ffentlichungen in den letzten Jahren belegen die Bedeutung der LogP Werte f r die Verf gbarkeit und Wirksamkeit von potentiellen Wirkstoffen und Inhibitoren Der recht genauen Berechnung der ClogP Werte wird dabei der Vorzug vor der experimentellen Bestimmung gegeben Auch wenn das unmittelbare Ziel der Optimierung der Pepticinnamin E Analoga nicht orale Bioverf gbarkeit in der Ratte oder dem Menschen
28. von NH 4OH L sung auf 9 ein Nach Extraktion mit Ether wird die organische Phase ber Na gt SO getrocknet und eingeengt Nach chromatographischer Reinigung an Kieselgel erh lt man ein r tliches l Ausbeute 35 5 mg 0 14 mmol 82 d Th Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat 1 1 v v 0 24 H NMR CDCI 400 MHz 8 7 21 d 1H Aromat J 2 0 Hz 7 14 dd 1H Aromat J 2 0 Hz Te 8 05 Hz 6 68 br s 1H Aromat 6 63 d IH Aromat 3J 8 05 Hz 4 24 q 2H Hexyl J 7 03 Hz 4 18 d 2H Hexyl J 5 02 Hz 3 45 3 55 br s 5 H Hexyl 1 30 t 3H Hexyl CH3 J 7 02 Hz 1 25 s 1H Hexyl C NMR CDCL 100 6 MHz 5 168 3 C O 137 2 C 4 135 6 C 3 124 3 C 1 119 5 C 6 115 2 C 5 114 1 C 2 43 7 C 1 30 0 C 2 C 4 28 5 C 3 22 1 C 5 15 1 C 6 C13H21N30 235 33 ESI MS 236 6 M H 3 4 Bis allyloxybenzoes ureallylester 22 Es werden 280 mg 1 82 mmol 3 4 Dihydroxybenzoes ure 1 9 g 13 6 mmol wasserfreies K CO und 0 5 g 1 5 mmol wasserfreies Cs2CO in 40 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran suspendiert und unter Argon mit 5 5 ml 63 6 mmol Allylbromid versetzt Man erhitzt 14 h zum R ckfluss Der Reaktionsverlauf wird mittels GCMS kontrolliert Ist der Umsatz vollst ndig l sst man langsam abk hlen Nach dem Abk hlen wird die gelbliche Suspension mit Ethylacetat verd nnt und mit ges NaCl L sung extrahiert Die organischen Phasen werden ber Na SO get
29. werden die Koordinaten in WitnotP eingelesen Die Protonierung und Zuordnung der korrekten Parameter erfolgt mit dem Script hydroprep Um Fehler zu vermeiden werden die Atome sequentiell nummeriert Dadurch k nnen sich Abweichungen zur urspr nglichen Datei ergeben Skriptname hydroprep Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 150 bin sh Verwendung f r ein Molek l mymol lt hydroprep mymol echo modify hydrogens 1 done echo modify atom lig current 1 done echo atom charge auto 1 done echo atom type auto charmm 1 done echo done echo atom q 1 done MPEOE echo atom name 1 done auto seq echo resnum 1 1 echo done echo label type 1 echo write mol2 1_hyd mol2 1 Die durch diese Anweisungen erzeugte mymol_hyd mol2 Datei mol2 Format dient als Input f r die eigentlichen Berechnungen mit HYDROMAP Dieses wird von der UNIX Kommandozeile aus ausgef hrt Hierzu mu ein Unterverzeichnis inputs im jeweiligen Arbeitsverzeichnis erstellt werden Dort m ssen die Dateien RvdwEvdw_new mymol inp und mymol_hyd mol2 abgelegt werden Die Oberfl che wird anschlie end mit hydromap inputs myprotein inp berechnet Die graphische Darstellung erfolgt mit GRASP Die Datei mymol inp sollte folgenderma en aussehen File type mol2 m or PDB p m Path ofthe coordinate file inputs mymol_hyd mol2 Path of the parameter file inputs RvdwEvdw_new
30. 1 166 keine Quelle eines systematischen Fehlers Durch berlagerung verschiedener Ras Kristallstrukturen war eine Struktur zug nglich die dem Ras GTP Enzym Substrat Komplex Die Zahl bezieht sich auf den Katalog der Firma Novabiochem 2002 Lars Kissau 4 Spezieller Teil 32 entspricht siehe Experimenteller Teil F r alle folgenden Berechnungen diente diese G12V Ras Struktur als Grundlage GTP in der Bindungstasche 12 A Abbildung 16 Die Hydrophobizit tskarte des Ras GTP Komplexes links siehe auch Experimenteller Teil Blaue Bereiche kennzeichnen hydrophile Regionen von Grau bis Gr n nimmt der hydrophobe Charakter zu Die GTP Bindungstasche ist durch ein schwarzes Oval markiert GTP wurde f r die Berechnung der Oberfl che in die Struktur eingeschlossen Die f r eine Bindung interessanten Stellen sind durch Pfeile markiert Daneben ist das Resultat der Suche nach geeigneten Bindungstasche gezeigt siehe AAV MM21 Die Oberfl che des GTP Molek ls ist rot eingef rbt Zun chst wurde die in Abbildung 16 gezeigte Hydrophobizit tskarte des Ras GTP Komplexes erstellt um m gliche Bindungstaschen zu charakterisieren Parallel wurde mittels des PASS Algorithmus nach geeigneten Bindungstaschen f r Liganden gesucht Aus Abbildung 16 ist ersichtlich dass im relevanten Bereich der Ras Oberfl che in der N he der GTP Bindungstasche keine tiefe hydrophobe Tasche zu finden ist die eine starke Affinit t eines Ligande
31. 1 v v 0 27 H NMR CDCl 400 MHz 7 36 7 32 m 4H H 2 H 3 H 5 H 6 7 32 7 24 m 1H H 4 4 57 s 2H Ph CH O 4 03 s 2H O CH gt CO R 3 73 dd 2H Ph CH2 O CH CH J 4 11 Hz J 2 73 Hz 3 66 dd 2H Ph CH gt O CH gt CH J 4 11 Hz J 2 73 Hz 1 47 s 9H C CH3 3 C NMR CDCI 100 6 MHz 5 169 9 C O Ester 138 4 C 1 128 6 C 3 C 5 127 9 C 2 C 4 C 6 81 7 Ph CH2 O 73 5 C CH3 3 70 9 Ph CH2 O CH2 CHz 69 3 Ph CH gt O CH gt CH 28 3 C CH3 3 C15H2204 266 3328 FAB MS 3 NBA 289 1 M Na 100 267 1 M H 15 211 0 M C CHs3 s 68 HRMS FAB 3 NBA berechnet f r C sH2304 267 1596 gefunden 267 1604 berechnet f r C sH NaO 289 1416 gefunden 289 1406 2 Hydroxy ethoxy essigs ure tert butylester 73 383 mg 1 44 mmol 2 Benzyloxy ethoxy essigs ure tert butylester werden in 10 ml Methanol gel st und mit 50 mg 10 igem Pd C Degussa unter H versetzt Man r hrt 18 h bei Raumtemperatur Der Reaktionsfortschritt wird mittels D nnschichtchromatographie berwacht Die Suspension wird ber Celite filtriert und eingeengt Man erh lt ein farbloses l Ausbeute 229 mg 1 3 mmol 91 d Th Rre Wert Cyclohexan Ethylacetat 4 1 v v 0 22 H NMR CDCL 400 MHz 8 4 0 s 2H O CH CO R 3 72 m 2H HO CH CH 3 65 m 2H HO CH CH 3 2 99 s 1H OH 1 47 s 9H C CH3 BC NMR CDCl 100 6 MHz 5 170 6 C O Ester 82 3 O CH gt
32. 164 6 C O Amid 154 7 C 2 148 5 C 6 138 1 C 4 128 7 C 5 124 5 C 3 83 1 tert Butyl C 42 7 a C 28 3 CHs C12H1sCIN50 270 71 FAB MS 3 NBA 271 3 M H 15 270 2 M 20 HRMS FAB 3 NBA berechnet 270 0771 gefunden 270 064 4 Amino 3 hydroxy benzoyl phenylalanyl phenylalanyl phenylalanin 17 Das Tripeptid wurde auf 100 mg Wang Harz Novabiochem Beladung 0 73 mmol g gem AAV 1 und AAV 3 synthetisiert Nach Entsch tzen AAV 5 wurde das Harz in einer L sung von 34 mg 0 22 mmol 3 eq 4 Nitro 3 hydroxybenzoes ure 76 ul 44 mmol 6 eq DIEA 83 mg 22 mmol 3 eq HBTU und 5 ml DMF suspendiert und 3 5 h gesch ttelt Nach einem negativen Kaiser Test wurde das Harz in einer L sung von 1 5 g SnCl in 5 ml DMF suspendiert und 14 h gesch ttelt Nach Abspaltung vom Harz gem AAV 6 wurden die fl chtigen Bestandteile aus der Abspaltl sung entfernt zweimal mit 20 ml Toluol koevaporiert und das Rohprodukt gem AAV 8 Methode A Retentionszeit 8 52 min gereinigt Ausbeute 25 mg 42 umol 58 d Th IH NMR CDCl 400 MHz 6 7 35 7 10 br m 17 H Aromat CH 6 47 br s 1H H 5 C34H34N4O 594 66 FAB MS 3 NBA 595 13 M H 1 3 ESI MS 595 1 t 9 3 min Methode AAV 7 Methode A 6 Amino pyridine 3 carbonyl phenylalanyl phenylalanyl phenylalanin 18 Das Tripeptid wurde auf 100 mg Wang Harz Novabiochem Beladung 0 73 mmol g gem AAV 1 und AAV 3 synthetisiert Nach Entsch tze
33. 3 C 2 130 5 C 1 128 2 C 6 127 8 C 5 117 7 CHo CH CH 80 8 C CH3 3 66 3 CH gt CH CH3 33 5 d Jc p 137 41 Hz 27 9 C CH3 5 31P_NMR CDCI 202 5 MHz 8 27 44 C1 8H2505P 352 36 FAB MS 3 NBA 353 5 M H 8 352 4 M 3 HRMS FAB 3 NBA berechnet 352 1440 gefunden 352 1463 3 Bis allyloxy phosphorylmethyl benzoes ure 66 7 28 g 20 7 mmol des vorgereinigten tert Butylesters werden in 40 ml abs Methylenchlorid gel st und mit 1 2 ml 100 mmol Triethylsilan versetzt Man gibt innerhalb von 5 min bei 0 C 20 ml TFA hinzu und r hrt 1 h bei Raumtemperatur Die Reaktionsl sung wird mit Toluol verd nnt und die fl chtigen Bestandteile im Vakuum entfernt Das Rohprodukt wird mit einem Gradient von Methylenchlorid Methanol 2 Methanol bis 5 Methanol chromatographiert Man erh lt 4 08 g eines orange farbenen ls Ausbeute 4 08 g 13 8 mmol 66 8 d Th Rer Wert Methylenchlorid Methanol 19 1 v v 0 29 H NMR CDCl 400 MHz 5 8 01 br s 1H H 6 7 98 7 93 m 1H H 2 7 52 d 1H H 4 J 15 16 Hz 7 37 t 1H H 5 J 15 16 Hz 5 74 5 94 m 2H CH gt CH CH 5 31 d 2H Ph CH gt P un 28 32 Hz 5 20 m 2H CH CH CH 4 46 m 4H CH3 CH CH z C NMR CDCL 100 6 MHz 5 169 7 C O 134 6 134 5 CH gt CH CH3 132 4 C 3 131 4 C 4 131 2 C 1 130 5 C 2 128 8 C 5 128 6 C 6 118 3 CH2 CH CHz2 67 1 C CH3 3 66 9 CH CH CH2 34 8 Ph CH P 32
34. 38 8 C 9 31P_NMR CDCI 202 5 MHz 5 3 55 C27H26NO P 475 47 EI MS 70 ev 475 M 1 315 M C3Hs 2PO 8 178 C3Hs 2PONHb 100 165 Cola 14 137 H gt N CgH4 CO gt H 11 120 C6Hs COoH 26 91 C7H7 20 FAB MS 3 NBA 497 15 M Na 42 3 Nitrobenzoes ure 2 trimethylsilanyl ethylester 39 Eine L sung von 1 1 g 6 6 mmol 3 Nitrobenzoes ure 2 5 g 6 6 mmol HBTU und 2 26 ml N Ethyldiisopropylamin in abs Dichlormethan wird 5 min bei Raumtemperatur ger hrt und anschlie end zu einer L sung von 1 15 ml 8 mmol 2 Trimethylsilanylethanol in 5 ml abs Dichlormethan gegeben Nach R hren bei Raumtemperatur 14 h wird mit ges NH4Cl L sung extrahiert und das Rohprodukt ber Kieselgel filtriert Eluent Cyclohexan Man erh lt ein gelbliches l Ausbeute 1 42 g 5 3 mmol 80 3 d Th Re Wert Cyclohexan Ethylacetat 10 1 v v 0 4 H NMR CDCl 400 MHz 6 8 83 8 86 m IH Aromat C 2 8 37 8 41 m 1H Aromat C 5 8 33 8 36 m 1H Aromat C 4 7 64 t 1H Aromat C 6 J 8 01 Hz 4 44 4 50 m 2H CH gt CH3 gt Si CH3 3 1 14 1 19 m 2H CH gt CH gt Si CH3 3 0 09 s 9H CH2 CH2 Si CH3 U3C NMR CDCI 100 6 MHz 5 166 1 C O 149 8 C 3 136 7 C 6 133 9 C 5 131 0 C 4 128 7 C 2 126 0 C 1 65 6 CH2 CH2 Si CHs3 3 19 0 CH gt CH gt Si CH 3 3 0 2 CH gt CH gt Si CH3 C12H17NO Si 267 35 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 167 FAB MS 3 NBA 267 4
35. 4 Spezieller Teil 35 Dihydrat in DMF eingesetzt und bersch ssiges Sn II durch Waschen mit DMF und DCM entfernt F r Synthesen in L sung war dies aufgrund der gro en Mengen bei der Aufarbeitung entstehenden SnO wenig geeignet Statt dessen wurden die Nitrogruppen mit Nickel II borid reduziert 191 Die Verwendung von Natriumdithionit und FeSO ergab deutlich schlechtere Ausbeuten F r die Kupplungen mit 3 Hydroxy 4 Nitrobenzoes ure bzw die 3 Nitro 4 Hydroxybenzoes ure konnte die Reduktion mit SnCl ebenfalls angewandt werden W hrend anf nglich die phenolischen OH Gruppen beider Verbindungen durch Acylierung mit Phenylacetylchlorid oder Acetylchlorid gesch tzt wurden zeigte sich im Laufe der Optimierung der Synthesen dass ein Sch tzen dieser Funktionalit t nicht erforderlich ist Eine unbeabsichtigte Bildung eines Phenylesters mit einer durch HBTU HOBt aktivierten Carbons ure ist zwar m glich der entstehende 5 Carboxy 2 nitro phenylester ist jedoch ausreichend reaktiv um mit einer freien Aminogruppe zu reagieren Die HPLC Analyse der Testpeptide zeigte eine quantitative Umsetzung zum gew nschten Produkt Es wurden keine Nebenprodukte detektiert e o a O N a b HAN a SE ee ER O N O2N 10 HN 11 o c d e CA on SE Q 0 Pne Pne Pne NR o 1 mace x 12 X NO X NO 13 X NO X OH H 0 e 14 X OH X NO Q 0 Pne Pne Pne 2 15 X NH X NH H x2 16 X NH X OH 17 X OH X
36. 7 123 126 Nyilas A Tetrahedron Lett 1997 38 2517 2518 DiStefano G Biochem Pharmacol 1995 49 1769 1776 Hoard D E Ott D G J Am Chem Soc 1965 87 1785 1788 Chow C P Berkman C E Tetrahedron Lett 1998 39 7471 7474 T W Greene P G M W Protective Groups in Organic Synthesis 3 ed John Wiley amp Sons New York 1999 Sieber P Helv Chim Acta 1977 60 2711 2715 Forsch R A Rosowsky A J Org Chem 1984 49 1305 1311 Neises B Steglich W Angew Chem 1978 90 556 557 Silverberg L J Dillon J L Vemishetti P Tetrahedron Lett 1996 37 771 774 ScheppeckII J E Kar H Hong H Tetrahedron Lett 2000 41 5329 5333 Seitz O Kunz H J Org Chem 1997 62 813 826 McCarty J S Walker G C Proc Natl Acad Sci 1991 88 9513 9517 Neckers L Trends Mol Med 2002 8 S55 S61 Lars Kissau 8 Anhang 207 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 Peake P Winter N Britton W Biochim Biophys Acta 1998 1387 387 394 Katalog der Firma Rapp Polymere 2001 Renil M Ferreras M Delaisse J M Foged N T Meldal M J Pep Sci 1998 4 195 210 Meldal M Svendsen I Juliano L Juliano M A Delnery E Scharfstein J J Pep Sci 1998 4 83 91 Owalabi J B Rikalla G Tehim A Ross G M Riopelle R J Kambolj R Ossipov
37. 8 9 3 GTP Peptid Konjugate Lange Winkel Lange Winkel Verbindung Proteinatom Inhibitoratom gemessen gemessen Literatur Literatur 95 GTP_Rib 3OH Gly_5 NH 2 53 107 25 1 9 90 130 GTP_Rib 50 Gly_5 NH 2 98 89 01 1 9 90 130 Asn_85_CONH Met A CO 2 39 146 87 1 9 150 180 Lys_117_NH2 Met_4 CO 2 78 142 93 1 9 150 180 91 GTP_Pur_N2 Glu_5 CO 2 53 169 71 1 9 150 180 Asn_85_CONH Gu pb CO 2 25 133 98 1 9 150 180 Val_12_NH Ala_2_CO 2 98 130 31 1 9 150 180 Val_12_O Ala_2_NH 2 44 117 3 1 9 110 180 Lys_117_NH2 Glu_5 CO 1 95 162 89 1 9 150 180 94 Val_12_CO Met_2_CO 2 09 128 22 1 9 110 180 Lys_117_NH2 Leu_5 CO 1 89 158 51 1 9 150 180 97 Asn_85_CONH Gly_3_CO 2 03 137 39 1 9 150 180 Lys_117_NH2 Gly_3_CO 1 86 143 28 1 9 150 180 ASP_30_CO Glu_5_CO 2 04 99 73 1 9 110 180 GTP_Rib 2 OH Glu_5_CO 2 16 142 72 1 9 90 130 Val 12_ CO AminoPyr_N 2 95 108 15 1 9 110 180 GTP_G_PO4 AminoPyr_NH2 2 31 130 54 1 9 90 130 Lars Kissau 8 9 Tabellen der Wasserstoffbr cken 223 GTP_G_PO4 AminoPyr_NH2 2 92 130 52 1 9 90 130 Lars Kissau 8 10 Bibliothek von Pepticinnamin E Analoga 224 Kapitel 28 10 Anhang Pepticinnamin E Analoga Tabelle A X 1 X Kombinatorische Bibliothek von Diese Liste von Verbindungen wurde freundlicherweise von Herrn Dr Michael Thutewohl zur Verf gung gestellt HO N X N MeO FTase FTase MDCK f3 EA Nummer Verb C
38. AAV 4 aufgekuppelt Der Spacer wird gem AAV 4 entsch tzt und das Harz in abs DMF ber Molsieb suspendiert Man gibt 4 Aquivalente voraktiviertes GDP hinzu und schiittelt 14 h bei 50 C Nach dreimaligem Waschen mit DMF wird das Harz anschlie end in DMF suspendiert entgast und mit Pd PPh3 4 und Morpholin versetzt Das Harz wird abfiltriert und 3 mal mit 3 ml abs DMF gewaschen Das DMF wird im Vakuum entfernt und der lige R ckstand mit 3 ml abs Diethylether versetzt Der wei e Niederschlag wird gem AAV 9 gereinigt 31P_NMR DMSO DMF Dichlormethan 202 5 MHz 8 10 32 d 1P a P J 18 79 Hz 10 65 d 1P y P J 19 54 Hz 22 4 dd 1P B P J 18 79 Hz J 19 54 Hz Synthese der Split Mix Bibliothek Die Reproduzierbarkeit der Synthesen und die Funktionsfahigkeit der Beads im Fluoreszenz Assay h ngen entscheidend von der Integrit t der Beads ab PEGA Beads d rfen keinesfalls Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 190 rasch im Feinvakuum getrocknet werden Zum Trocken ist entweder eine Suspension in Wasser mit anschlie ender Gefriertrocknung zu empfehlen oder ein sukzessives Waschen mit folgenden Mischungen a 100 Dichlormethan b 75 Dichlormethan 25 Diethylether c 50 Dichlormethan 50 Diethylether d 25 Dichlormethan 75 Diethylether e 100 Diethylether Im Vergleich zu Polystyrol Harzes ist die mechanische Stabilit t verringert F r die hier durchgef hrte Synthese mit der Quest 210 ist e
39. ACE Inhibitoren befindet sich ein Peptid Betabloc von Elan zur Behandlung der Alzheimerschen Krankheit in fortgeschrittenen klinischen Phasen Hier steht die Inhibition der Aggregation der B Amyloid Peptide im Fokus HI 2 3 2 Strategien zur Leitstrukturentwicklung 2 3 2 1 Naturstoffe als biologisch validierte Startpunkte In den letzten Jahren wurden wiederholt Naturstoffe mit interessantem Aktivit tsspektrum und ebenso faszinierender Struktur aus den unterschiedlichsten Organismen isoliert Die Organismen aus denen diese Substanzen gewonnen wurden betreiben die teilweise recht aufwendige Biosynthese gewiss nicht zum Selbstzweck sondern verwenden diese Verbindungen als Teil einer Strategie zur Verteidigung ihres Lebensraumes Im Laufe der Evolution konnten diese Verbindungen im Hinblick auf eine bestimmte Aktivit t hin optimiert werden Generell kann man daher Naturstoffe als biologisch validierte Startpunkte im Strukturraum betrachten Den in den letzen Jahren unternommenen Anstrengungen mit Hilfe einer gro en Zahl von Verbindungen und High Throughput Screening neue Wirkstoffe zu entdecken waren prozentual nur geringe Erfolge beschieden M glicherweise deckten die Substanzbibliotheken der Pharmaunternehmen biologisch nicht relevante Bereiche im Strukturraum ab Niedermolekulare Naturstoffe als Startpunkte einer Leitstruktur bzw Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 20 Wirkstoffsuche f r Enzyminhibitoren zu betrachten erscheint daher a
40. Abbildung 51 gezeigt ist f hrte schlie lich zu den besten Modellen Das 3D Modell wurde auf Basis dieses Alignments mit dem Programm MODELLER 4 0 erstellt Die Fehlersuche in den Modellen insbesondere die Analyse der Konformationen der Seitenketten wurde durch die Anwendung der WHATCHECK Software vereinfacht Korrekturen der Prim rmodelle wurden auf Basis der WHATCHECK Analyse manuell in WitnotP durchgef hrt AAV MM20 bis alle relevanten Werte im gew nschten Bereich lagen Die Kinase Insert Domain wurden zur Vereinfachung der Arbeiten gel scht da dieser Bereich in den Kinasen stark divergiert und f r die Analyse von ATP kompetitiven Inhibitoren aufgrund der gro en Distanz zwischen ATP Bindungstasche und KID uninteressant ist Die hier betrachteten Kinasedom nen umfassen ca 300 Aminos uren Es gilt als akzeptabel bzw realistisch wenn 142 143 p Die von ca 5 der Aminos uren au erhalb der erlaubten Bereiche liegen WHATCHECK generierten Ramachandran Plots sowie die Zusammenfassungen der einzelnen Analysen sind in Anhang V aufgef hrt Die fehlenden Wasserstoffatome wurden in WitnotP hinzugef gt Der Algorithmus der diese Addition von Wasserstoffatomen an Strukturen durchf hrt geht rein nach geometrischen Gesichtspunkten vor Eine Ber cksichtigung von Wasserstoffbr cken findet bei der Ausrichtung z B von OH Gruppen nicht statt Daher ist in der Regel eine Kraftfeld Energieminimierung sinnvoll Bei diesen Lars
41. Bruton s Tyrosine Kinase DNA Primase Die Nummerierungen beziehen sich auf die jeweilige Kristallstruktur Neben der Koordination durch Wasser Thiol oder Imidazol Liganden ist auch eine Blockade der Zink Bindungsstelle durch aromatische Reste m glich und in der Tat bereits erfolgreich Lars Kissau 4 Spezieller Teil 94 161 durchgef hrt Bisher betrachtete experimentelle Daten sowie ab initio Berechnungen zeigen dass die Wechselwirkung zwischen einem Kation und einem aromatischen n System rein elektrostatischer Natur ist G Petsko et al zeigten durch Analyse von 33 hochaufgel sten Kristallstrukturen da sp Aminogruppen vorzugsweise zwischen 3 4 A und 6 A oberhalb der n Ebene positioniert ist da hierbei Wechselwirkungen mit dem Rand des Aromaten vermieden werden ID Als prominente Beispiele f r diese Wechselwirkung seien hier die Acetylcholinesterase und die Klasse der Tyrosin spezifischen Phosphatasen genannt Auch die Erkennung von Phosphotyrosinhaltigen Peptiden durch die SH2 Dom ne erfolgt durch eine Wechselwirkung des aromatischen Rings des Phosphotyrosins mit Arg 155 und Lys 203 dieser Domine Die in einigen der PFT Inhibitoren beobachtete Blockade des Zinkions durch aromatische Reste wird auch durch eine derartige Wechselwirkung stabilisiert 165 4 3 1 2 Wahl eines manuellen Dockingverfahrens Ein recht einfaches Verfahren zur Ermittlung potentieller Bindungsmodi ist die Verwendung automat
42. C 4 142 7 C 3 139 7 C 1 131 9 C 6 125 5 C 5 123 7 C 2 40 7 C 1 31 3 C 2 29 3 C 4 26 5 C 3 22 5 C 5 13 9 C 6 C13H17N30s 295 29 FAB MS Glycerin 296 4 M H 18 3 4 Diaminobenzoes ure n hexylamid 11 Methode A Zu einer L sung von 50 mg 0 17 mmol 3 4 Dinitrobenzoes ure N hexylamid in 2 ml DMF werden unter Argon 745 mg 3 3 mmol SnCl Dihydrat gegeben Man r hrt 16 h bei Raumtemperatur und verd nnt mit 100 ml Ethylacetat Nach Waschen mit 50 ml IN HCl und 50 ml ges NaCl L sung wird die organische Phase ber Na2SO getrocknet und eingeengt Das Rohprodukt wird mittels Flash Chromatographie gereinigt Ausbeute 28 mg 0 11 mmol 65 d Th Methode B Zu einer L sung von 1g 4 0 mmol Nickel IDacetat in 15 ml destilliertem Wasser wird bei 10 C langsam unter kr ftigem R hren eine L sung von 605 mg 16 mmol NaBH in 30 min Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 158 zugetropft Der schwarze Niederschlag wird abfiltriert und 2 mal mit je 10 ml Wasser und anschlie end 15 ml Ethanol gewaschen Nach Trocknen im Vakuum erh lt man 300 mg 2 3 mmol Ausbeute 58 d Th eines schwarzen Pulvers das direkt f r die folgende Reduktion eingesetzt wird Hierzu werden 50 mg 0 17 mmol 3 4 Dinitrobenzoes ure N hexylamid mit 50 mg 0 4 mmol Ni2B in 5 ml Methanol und 1 ml IN HCl gel st und 30 min auf 60 C erw rmt Man verd nnt mit 20 ml Wasser und stellt den pH Wert durch Zugabe
43. CO R 73 7 C CH3 3 69 0 HO CH2 CHz 61 8 HO CH2 CHz2 28 3 C CH3 CgH 1604 176 2102 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 183 FAB MS 3 NBA 199 0 M Na 100 177 1 M H 23 176 1 M 5 HRMS FAB 3 NBA M H berechnet 177 1127 gefunden 177 1119 M Na berechnet 199 0946 gefunden 199 0959 2 Bis 9H fluoren 9 ylmethoxy phosphoryloxy ethoxy essigs ure tert butylester 74 Zu einer L sung von 626 mg 3 56 mmol 73 und 498 mg 7 12 mmol Tetrazol in Acetonitril Dichlormethan 1 1 40 ml werden bei Raumtemperatur 2 04 g Phosphoramidit in 20 ml Dichlormethan gegeben und bei Raumtemperatur ger hrt Das Verschwinden des Eduktes wird mittels TLC verfolgt Das Produkt zersetzt sich auf dem TLC Nachweis durch 2D TLC Nach 3h wird die Reaktion auf 30 C abgek hlt und zwei quivalente 1 42 ml 7 82 mmol einer 5 5 M L sung von tBuOOH in Decan zugegeben Man erw rmt auf Raumtemperatur verd nnt mit Ethylacetat extrahiert mit 10 NaHSO ges NaCl L sung und trocknet die organischen Phasen ber Na5S04 Nach dem Einengen und der Chromatographie des Rohproduktes Cyclohexan Ethylacetat 3 2 v v erh lt man ein farbloses sehr viskoses l Ausbeute 1 86 g 3 04 mmol 84 d Th Rer Wert Cyclohexan Ethylacetat 3 2 v v 0 29 H NMR CDCI 400 MHz 7 72 t 4H C 4 C 5 J 7 44 7 53 dd 4H C 1 C 8 J 7 44 Hz J 21 28 Hz 7 37 dt 4H C 3 C 6 J 7
44. Elutionsprogramme sind den einzelnen Vorschriften zu entnehmen Die UV Messungen wurden an einem Dynatech MR 5000 Photometer gemessen Die verwendeten Chemikalien wurden bei den Firmen Fluka Aldrich oder Acros erworben L sungsmittel wurden vor Gebrauch destilliert Ausnahmen siehe unten Die L sungsmittel wurden wie folgt absolutiert Dichlormethan Triethylamin Acetonitril und Diisopropylethylamin wurden ber Calciumhydrid Diethylether ber einer geschmolzenen Natrium Kalium Legierung THF ber geschmolzenem Kalium Toluol ber geschmolzenem Natrium destilliert Methanol Aceton und 2 Propanol wurden in p a Qualit t erworben und ohne weitere Reinigung eingesetzt Absolutes DMF wurde von der Firma Fluka bezogen und ohne weitere Behandlung eingesetzt F r Peptidkupplungen wurde DMF Peptide Grade der Firma Biosolve verwendet Alle Reaktionen wurden unter einer Argonatmosph re durchgef hrt Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 131 6 2 Allgemeine Arbeitsvorschriften AAV 1 Festphasen Peptidkupplung mit HBTU HOBt DIPEA Die angegebenen quivalente beziehen sich auf die Anzahl freier Aminogruppen am Harz 2 5 quivalente Aminos ure werden mit 5 eq N Ethyldiisopropylamin und 2 ml DMF Peptide Grade pro mmol Aminos ure versetzt und 30 Sekunden mit Ultraschall behandelt Die L sung wird nach 1 min Voraktivierung zum Harz gegeben Nach 3 h Reaktionszeit wird die Reaktionsl sung aus dem Reaktor entfernt AAV 2 Waschen des
45. Fitness KKKKK 96 2 93 MPFEM 93 22 04 GAMGA 90 29 30 GAPME 91 28 14 MPPAE 92 25 81 PGPMG 95 25 40 YMMLL 94 23 51 Tabelle 3 Resultate des GOLD Dockings Die Bindungsmodi von MPPAE YMMLL und PGPMG sind exemplarisch in Abbildung 42 dargestellt Die anderen Peptide binden in vergleichbaren Konformationen Das Resultat des Dockings von KKKKK zeigt dass einige der Seitenketten keinerlei Wechselwirkung mit Ras eingehen w hrend die Bindungsmodi der in der Sequenzierung gefundenen Peptide sehr gut zur in Abschnitt 4 1 2 gezeigten Hydrophobizit tskarte passt Beide markierten hydrophoben Stellen finden im Peptid an Position 3 ihr passendes Gegenst ck Entweder findet sich hier ein Prolin oder ein Methionin Die Bevorzugung dieser Aminos uren in dieser Position k nnte auch erkl ren warum die mittels PEP entworfenen und anschlie end synthetisierten Peptide siehe Kapitel 4 1 3 offenbar nicht in ausreichendem Ma e an Ras binden konnten Keine der synthetisierten Sequenzen weist ein Prolin oder Methionin an der besagten Stelle auf Lars Kissau 4 Spezieller Teil 62 Abbildung 41 Bindungsmodi der Peptide a Struktur von PGPMG b Bindung von YMMLL and Ras c Bindung von PGPMG an Ras d Hydrophobizit tskarte von Ras zum Vergleich e Bindung von KKKKK an Ras f Bindung von MPPAE an Ras 4 1 5 N chster Entwicklungsschritt Peptidmimetika Die vorgeschlagene Bindungskonformation von PGPMG zeigt
46. Fragmental Constant Elsevier Amsterdam 1977 Sites W E Chem Rev 1997 97 1233 1250 Jones S Thornton J M Proc Natl Acad Sci 1996 93 13 20 Cochran A G Chem Biol 2000 7 R85 R94 Burgess K Acc Chem Res 2001 34 826 835 Loffet A J Peptide Sci 2002 8 1 7 Sawyer T K Biopolymers 1998 47 243 261 Finch A Wong A K Paczkowski N J J Med Chem 1999 42 1965 1974 Schreiber S L Bioorg Med Chem 1998 6 1127 1152 Ludolph B Eisele E Waldmann H J Am Chem Soc 2002 124 5954 5955 Merrifield B J Am Chem Soc 1963 85 2149 2153 Merrifield B Prot Sci 1996 5 1947 1951 Merrifield B Biopolymers 1995 37 3 4 Bagno A Bicciato S Dettin M Dibello C Int J Pep Prot Res 1997 50 231 237 Lars Kissau 8 Anhang 205 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 Lam K S Lebl M Krchnak V Chem Rev 1997 97 411 448 Czarnik A W Curr Op Chem Biol 1997 1 60 66 Gohlke H Klebe G Curr Op Struct Biol 2001 17 231 235 Moore G E Electronics 1965 38 475 478 Brauer M Kunert M Dinjus E Klussmann M Doring M Gorls H Anders E Theochem J Mol Struct 2000 505 289 301 A D MacKerell J Brooks B C L Brooks I Nilsson L Roux B Won Y Karplus M In The Encyclopedia of Computational Che
47. Harzes zwischen Syntheseschritten bei der Festphasensynthese ohne Capping Die angegebenen L sungsmittelmengen beziehen sich auf 1 g Tentagel oder PS Harz Bei PEGA Harz ist die L sungsmittelmenge zu verdoppeln Nachdem die L sung mit den Reagenzien aus dem Reaktor entfernt wurde werden unter Argon 10 ml DMF zugegeben Nach 1 min Sch tteln wird das DMF entfernt und erneut 10 ml DMF zugegeben Man sch ttelt 2 min entfernt die L sungsmittel und wiederholt den Vorgang mit DCM Methanol erneut DMF und nochmals DCM Anschlie end kann das Harz getrocknet werden PEGA Harz ist nach dem letzten Waschschritt in Wasser zu suspendieren und wird durch Gefriertrocknung ber Nacht getrocknet F r eine Lagerung im feuchten Zustand wird das Harz nach dem letzten DMF Waschschritt im Reaktor unter Argon im K hlschrank gelagert AAV 3 Waschen des Harzes zwischen Syntheseschritten bei der Festphasensynthese Capping mit Acetanhydrid Pyridin Nach dem letzten Waschschritt mit Dichlormethan wird das Harz in einer L sung von 10 Acetanhydrid in abs Pyridin suspendiert und der Reaktor 10 min gesch ttelt Anschlie end wird das Harz wie unter AAV 2 beschrieben sorgf ltig gewaschen AAV 4 Fmoc Bestimmung Das Harz wird mit DMF DCM Methanol DCM je 2 mal gewaschen und ber Nacht im Feinvakuum getrocknet 5 mg des getrockneten Harzes werden in 10 ml DMF Piperidin suspendiert und 30 min gesch ttelt Bei Verwendung von Chlortrityl PS Harz sol
48. K Reinecke am MPI in Dortmund wurden zahlreiche Parameter Detektion im positiven oder negativen Modus Verwendung verschiedener Matices variiert Eine reproduzierbare zuverl ssige Analysenmethode konnte jedoch nicht entwickelt werden Schlie lich zeigte sich dass jede der phosphorhaltigen Zwischenstufen auf dem Harz im P Gel Phasen NMR charakterisiert werden konnte Zwar sind insbesondere bei Verwendung von PS Harz oder Tentagel die Linien deutlich verbreitert die starken chemischen Verschiebungen lassen dennoch eine klare Aussage zu F r eine akzeptable Linienbreite sind der Quellzustand des Harzes sowie die L sungsmittelviskosit t von entscheidender Bedeutung Letztere beeinflusst die Sedimentationsgeschwindigkeit der Beads im NMR R hrchen In einer Mischung von DMF ds DMSO Methylenchlorid im Verh ltnis 6 3 1 ist die Sedimentation so langsam dass eine gute Messung im NMR m glich Lars Kissau 4 Spezieller Teil 53 ist Die in Abbildung 38 gezeigten Spektren wurden mit 1000 Scans in jeweils etwa 30 Minuten aufgenommen Aus der relativen Integration des GDP bzw der GTP Signal zum Signal des Phosphats kann der Umsatz berechnet werden Die Isolierung der auf diese Weise an der festen Phase charakterisierten Peptide best tigte die Interpretation der NMR Daten Die Kopplung von a zum Phosphat GDP wird im Produkt durch eine Kopplung vom y zum B Phosphat erg nzt Letztere belegt dass keine Reaktion z B mit der OH Gruppe des Thre
49. Kissau 4 Spezieller Teil 73 Homologiemodellen zeigte sich jedoch dass eine Minimierung in Abwesenheit von Inhibitoren im aktiven Zentrum zu einem Kollaps der ATP Bindungstasche in Abwesenheit von Inhibitoren f hrte Daher wurden zun chst nur Seitenketten minimiert siehe AAV MM9 Vollst ndige Minimierungen AAV MM3 oder AAV MMS5 wurden erst nach manuellem Docking von Inhibitoren in das aktive Zentrum durchgef hrt FGF1 R Ep PR ROBE BGR EN Beat Rr Bur Rs Deki spe Tie 2 TIYPVLDWNMIKFOD V IRR RR Kos H Su Kr VEGFR 2 DASHWEFPRDRLELGK gt RER Base oK rA TCE TV sears VEGER 3 DAS SRR RE Ge Ol WR Rs REG Ro ss 6 RUSS SBR FGFI R Eee Eet Ya EE Tie 2 He ii gei a a 3 RY Pa GE rk s VLerpparar VEGFR 2 SSR Da er Re S VRS AE veDLyKp VEGFR 3 SEE ER EV O et reet o sonn anno BSS Ben o ORe Mann N Tie 2 Datt Del HF AD DE Ki N RER VEGFR 2 DE a io E S May BEB GC ier EIG thm SR FGF1 R naem deue go Oen SEE gt Ve Tie 2 Da ET RT TTT cu E DEN VEGFR 2 Bee ua I 7 me DD I SB ET E GE VEGFR 3 Bee el 1 D Sean m I TT E FGF1 R L psen E EON Tie 2 rz Ee p oz gd Da O Oz a S OAS VEGFR 2 Be BG u a mo DENG gt u Cana VEGFR 3 HESS Sr RES Abbildung 51 Alignment der Prim rsequenzen von FGFI R Tie 2 TEK und VEGFR 2 KDR und VEGFR 3 Konservierte Reste sind rot gef rbt identische Reste sind gr n gekennzeichnet und hnliche Aminos uren sind gelb hinterlegt
50. L sungsmittel und Konzentrationen in g 100 ml sind bei den jeweiligen Substanzen angegeben Die Schmelzpunkte wurden mit einer Schmelzpunktmessapparatur B 540 der Firma B chi ermittelt und sind nicht korrigiert F r die analytische D nnschichtchromatographie wurden aluminiumbeschichtete Kieselgel 60 F254 Platten der Firma Merck verwendet Zur Detektion wurde UV Licht der Wellenl nge 254 nm und zur Anf rbung nachfolgende Reagenzien eingesetzt Reagenz A 12 g Phosphormolybd ns ure in 250 ml Ethanol Reagenz B 0 5 g Kaliumpermanganat in 100 ml Wasser Reagenz C 1 D mpfe Reagenz D 1 5 g Phosphormolybd ns ure 1 g Cer IV sulfat 6 ml konzentrierte Schwefels ure und 94 ml Wasser Die pr parative S ulenchromatographie erfolgte mit Flash Kieselgel Korngr e 40 64 uM der Firma Merck Aluminiumoxid Typ 506C neutral mit einem berdruck von 0 3 0 5 bar Lars Kissau 6 Experimenteller Teil 130 F r die gaschromatographische Analyse wurde ein HP 5890 Series II Gaschromatograph mit HP 5972 Series Mass Selective Detector der Firma Hewlett Packard und einer Kapillars ule Optima 1 0 2 mm x 25 m der Firma Macherey Nagel mit Helium als Tr gergas verwendet HPLC Trennungen wurden mit einer Varian Pro Star mit einem Varian Detektor Model 340 durchgef hrt Das verwendete Acetonitril wurde in HPLC Gradient Grade Qualit t von der Firma Biosolve erworben das Wasser wurde in MILLIPORE Qualit t verwendet Die verwendeten S ulen und
51. L H H 240 gt 30 6 140 i Imid L H H gt 50 gt 30 7 141 i Imid L Me H 133 305 8 142 i Imid D Me H 80 6 4 S 143 x D H H 579 1l 9 I Imid ON l 10 144 FRE D H H gt 30 A Imid 11 145 Imid D H H 81 12 146 2 D H H 93 Pore eas Imid e 13 147 e Imid L H H 71 1 1 a 14 148 e Imid L Me H 116 169 15 112 e Imid D Me H 105 2 16 149 Nr D H H 310 S 17 150 F Sy D H H 312 RA Imid E 18 151 N D H H 244 Sy Imid a 19 152 D H H 316 Imid eh 20 153 Ne D H H 524 Imid m 21 154 ze D Me H 77 22 1 O Imid n 22 155 ortho D H H 133 10 e NS Vy Imid VL BnO 0 23 109 ortho o Imid L H H 64 192 2 24 156 meta 0 Imid L H H 125 25 157 meta 0 Imid D H H gt 50 7 6 26 158 para o Imid L H H 8 2 27 159 para o Imid D H H 231 41 Fluorescence Test mit Ratten PFT Radioaktivitatstest mit humaner PFT keine Inhibition bei 50 uM Konzentration keine Inhibition bei 100 uM Substanzkonzentration Lars Kissau 8 10 Bibliothek von Pepticinnamin E Analoga Lars Kissau Literaturverzeichnis 228 Kapitel 3 8 11 Anhang XI bersicht ber die f r die vorliegende Arbeit relevanten Signalwege Danksagungen Ich danke Herrn Prof Dr H Waldmann f r die interessante Themenstellung sowie den Freiraum und die Unterst tzung bei der Gestaltung der Arbeit Herrn Dr Timo Kr mer Herrn Dr Oliver Huttenloch Herrn Dr Michael Thutewohl Herrn Dipl Chem Laurent Bialy Herrn Dr Courtney Aldrich und Herrn Dr Laurent Soulere dan
52. LDT THR D sed St DN VAL D sed LDW TRP D sed s LDY TYR D sed LDJ HSD D gt 2 echo Conversion successfull the output has been saved to alig 1 0 _ 2 pdb AAV MM19 Vereinfachte Erstellung graphischer Ansichten von Proteinstrukturen Anwendung Erstellung von tif oder jpg Ansichten von Proteinen und Liganden Diese Dateien k nnen anschlie end in Word Dokumente etc integriert werden Beschreibung Aus einer PDB Datei kann mittels des Skriptes Makepic rasch eine Molscript Darstellung erzeugt werden Die ebenfalls automatisch erstellt molscr Datei mu lediglich durch Eintr ge zur gew nschten F rbung erg nzt werden siehe Molscript Bedienungsanleitung Anschlie end kann aus der molscr Datei eine hochaufgel ste Graphik im TIFF Format erstellt werden Skriptname Makepic rasmol 1 pdb lt lt EOF cartoon wireframe off colour structure write molscript 1 molscr exit EOF molscript gl in 1 molscr Nach Einstellung der Farben sowie der Optionen Helix vs Zylinder kann die TIFF Graphik mit dem Skript Maketiff erstellt werden Skriptname Maketiff molscript r 1 molscr render tiff 1 tif imageworks 1 tif Die Eingaben von der UNIX Kommandozeile f r eine Datei Protein pdb lauten Makepic Protein oder Maketiff Protein AAV MM20 Manuelle Korrektur von Bindungsl nge Bindungswinkeln und Torsionswinkeln mit WitnotP Bei manuellem Docking v
53. M 15 3 Aminobenzoes ure 2 trimethylsilanyl ethylester 40 Eine L sung von 1 42 g 5 3 mmol 3 Nitrobenzoes ure 2 trimethylsilanylethylester in 150 ml Methanol p A wird durch Durchleiten von Argon 45 min entgast Anschlie end wird eine Spatelspitze Pd C 10 Pd Degussa zugegeben und unter Hz Atmosph re 24 Stunden bei Raumtemperatur ger hrt Man filtriert ber Celite und engt im Vakuum ein Man erh lt ein farbloses l Ausbeute 970 mg 3 9 mmol 73 5 d Th Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat 4 1 v v 0 32 H NMR CDC 400 MHz 6 7 37 7 32 m 1H Aromat C 2 7 18 7 12 m 1H Aromat C 5 t IH Aromat C 6 J 8 07 Hz 6 75 6 67 m 1H Aromat C 4 7 34 4 32 4 39 m 2H CH gt CH3 gt Si CH3 1 12 1 15 m 2H CH gt CH gt Si CH3 3 0 09 s 9H CH2 CH2 Si CH3 3 BC NMR CDCI 100 6 MHz 5 166 1 C O 145 8 C 3 131 3 C 1 129 7 C 5 121 4 C 6 120 3 C 4 115 7 C 2 63 5 CH2 CH2 Si CHs3 3 18 7 CH2 CH2 Si CHs3 3 0 2 CH gt CH gt Si CH3 Cj2Hi9NO2Si 237 37 FAB MS 3 NBA 238 6 M H 100 3 Bis allyloxy phosphorylamino benzoes ure 2 trimethylsilanyl ethylester 41 Es werden 210 mg 0 8 mmol 3 Aminobenzoes ure 2 trimethylsilanyl ethylester und 300 pl 2 mmol Triethylamin in 15 ml frisch absolutiertem Toluol gel st und mit 200 ul 1 mmol Diallylphosphorchloridat versetzt Man erhitzt 14 h auf 80 C Die Reaktionsl sung wird auf ca 5 ml eingeengt und mit Ethylaceta
54. Mutanten des H Ras Proteins hydrolysiert werden kann Damit war nahe gelegt dass kleine Molek le dieselbe Wirkung erzielen k nnten wie GAP Diese Entdeckung gab Anla zur Suche nach einem kleinen Molek l das die intrinsische GTPase Reaktion beschleunigen k nnte Die anf ngliche Vermutung die 4 Aminogruppe am Benzophenon k nnte mittels allgemeiner Basenkatalyse den Angriff eines Wassermolek ls auf das y Phosphat beg nstigen konnte durch NMR Untersuchungen und die Isolierung des Reaktionsproduktes 8 siehe Abbildung 9 widerlegt werden o N NH 7 g SE OF o o N NI NH H H I lt 6 P O O NP O k J X Nou H J OH OH H G12V Ras o 7 8 zZ l l O l l Abbildung 9 Hydrolyse von DABP GTP 7 durch G12V Ras Da die Affinit t von Ras zu DABP GTP 7 im Vergleich zu GTP um den Faktor 400 geringer ist muss der Benzophenon Einheit ein negativer Bindungsbeitrag zugeschrieben werden Die Kristallstrukturen der G12P Mutante PDB Code 1CLU und der G12V Mutante PDB Code IRVD zeigen deutlich dass zwischen den Phenylringen und Ras keine bindende Wechselwirkung besteht 3 4 Diaminobenzophenon scheidet daher als Leitstruktur f r die Entwicklung eines Ersatz GAP aus 2 2 2 1 6 Ansatzpunkte f r die Signaltransduktionstherapie Um die transformierende Wirkung einer GTPase hemmenden Mutation aufzuheben w re die Blockade der GTP Bindungstasche ein scheinbar vielversprechender Ansatz Die Entwicklung
55. NazSO3 L sung Man w scht 2 mal mit pH 7 Phosphatpuffer und ges NaCl L sung trocknet die organischen Phasen ber Na gt 5SO engt im Vakuum ein und reinigt mittels Flash Chromatographie 500 ml CH EE 9 1 250 ml CH EE 1 1 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 177 Ausbeute 313 mg 0 40 mmol 75 d Th R Wert Cyclohexan Ethylacetat 9 1 0 1 H NMR CDCI 400 MHz 7 68 7 74 m 8H H 4 H 5 TBDPS H 2 H 6 7 47 ddd 4H H 2 H 7 J 8 62 Hz J 1 76 Hz J 0 98 Hz 7 41 7 46 m 2H H 4 H 6 7 30 7 40 m 10H TBDPS H 3 H 4 H 5 H 1 H 8 H 3 H 6 7 25 dd 4 H H 2 H 7 J 3 32 Hz J 7 43 Hz 7 15 7 21 m 2H H 2 H 5 4 92 d 2H Ph CH3 gt OPO OR gt J 8 02 Hz 4 75 s 2H Ph CH gt OTBDPS 4 24 t 4H Fm CH J 6 06 Hz 4 13 m 2H H 9 1 11 s 9H Si Ph C CH C NMR CDCL 100 6 MHz 8 143 3 C 8a C 9a 141 7 C 1 C 3 135 9 C 2 C 6 135 8 C 4a C 4b 133 6 C 1 129 9 C 4 128 8 C 3 C 5 128 1 C 5 128 0 C 1 C8 127 9 C 2 Gm 127 6 C 4 C 5 126 3 C4 C 6 125 6 125 2 120 2 C 2 C 3 C 6 69 4 Fm CH3 69 3 Ph CH gt OPO OR 65 4 Ph CH gt Si 48 1 C 9 27 2 SiC CH3 3 14 4 SiC CH 31P_NMR CDCI 202 2 MHz 8 0 42 Cs2H4905PSi 813 00 FAB MS 3 NBA 813 1 M 4 Phosphors ure bis 9H
56. Note Summary report for users of a structure This is an overall summary of the quality of the structure as compared with current reliable structures This summary is most useful for biologists sccking a good structure to use for modelling calculations The second part of the table mostly gives an impreasion of how well the model conforms to common refmement constraint values The first part of the table shows a number of constraint independent quality indicators Structure Z scores positive is better than average 2nd gencration packing quality 2 583 Ramachandran plot appearance 0 241 2 11 Final summary 2 11 1 Note Summary report for users of a structure This is an overall summary of the quality of the structure as compared with current reliable structures This summary is most useful for biologists sccking a good structure to use for modelling calculations The second part of the tahle mostly gives an impression of how well the model conforms to common refmement constraint values The first part of the table shows a number of constraint independent quality indicators Structure Z scores positive is better than average 2nd generation packing quality 2 374 Ramachandran plot appearance 0 163 x 1 x 2 rotamer normality 0 095 Backbone conformation 0 714 x 1 x 2 rotamer nomality 0 420 RMS Z scores should be close to 1 0 Backbone conformation 0 095 Bond lengths 0 958 RMS Z sc
57. Peptid SFLG 69 Peptid MAPG el Allyl o S o a c d Pau EA Peptid d SOH H 0 Abbildung 32 Synthese von Testpeptide mit Spacer 36 zur Optimierung der GTP Konjugatsynthese a SPPS b 66 HBTU DIEA DMF c TFA CH2Ch PhSiH d Pd PPh 4 Mit Hilfe dieses Spacers 66 konnte nach der erfolgreichen Synthese von Testverbindungen die erste Split Mix Bibliothek von GTP Konjugaten am Harz synthetisiert werden Nachteilig im Bezug auf eine Anwendung in der Festphasensynthese war das Fehlen einer Methode die Effizienz der Kupplung des Spacers an das Peptid zu messen F r die Synthese weiterer kombinatorischer Split Mix Bibliothek an der festen Phase unter Anwendung der mit dem Spacer 66 etablierten Methoden sollte daher ein flexibler chemisch stabiler Spacer Lars Kissau 4 Spezieller Teil 48 synthetisiert werden Dieser sollte au erdem eine l ckenlose Kontrolle aller Syntheseschritte erm glichen Ein Spacer der Struktur 37 erf llt diese Anforderungen 4 1 4 6 6 Synthese des Phosphat Spacers 37 Monobenzylierung von Ethylenglykol 70 mit Benzylchlorid in THF mit einer katalytische Menge TBAI zu 71 und nachfolgende Umsetzung mit Bromessigs uretertbutylester lieferte 72 in 43 Ausbeute ber 2 Stufen Nach hydrogenolytischer Entsch tzung konnte aus 73 durch Reaktion mit Diisopropyldifluorenylmethylphosphoamidit 52b und Tetrazol in Acetonitril Dichlormethan Verbindung 74 in 84 Ausbeute erhalten werden Entsch tzung mit TFA i
58. Peptidkette erforderlich ist sollte daher bei der Kupplung der letzten Aminos ure eine 9 1 Mischung von Fmoc und Boc gesch tzter Aminos ure eingesetzt werden Die Fmoc Aminos uren k nnen nach der Entsch tzung mit dem Spacer und GTP gekuppelt werden Die Boc gesch tzte Sequenz erlaubt sp ter die Durchf hrung der Sequenzierung I ei Abbildung 21 Aufbau der Zielverbindungen an der festen Phase Die allgemeine Struktur der Bibliothek ist in Abbildung 21 schematisch dargestellt Ein Linker zum Harz ist f r die Validierung der Chemie erforderlich Da die Einzel berpr fung aller Beads nicht m glich ist muss die Leistungsf higkeit der chemischen Methoden vor der Synthese der Bibliothek gesichert sein Ansonsten besteht die Gefahr in einem Assay nur solche Beads zu berpr fen bei denen die chemischen Transformationen einwandfrei funktioniert haben Neben der Synthese geeigneter Spacer und Linker mussten daher nun Methoden zur Synthese und Analyse von GTP und GTP Konjugaten an der festen Phase etabliert werden 4 1 4 4 Synthese von Triphosphat Konjugaten Die von A Wittinghofer et al verwendeten caged GTP Analoga aus deren Reihen auch das DABP GTP stammt wurden durch Umsetzung eines gro en berschusses des Amins mit dem aus GTP durch Aktivierung mit EDC synthetisierten Trimetaphosphat in w ssrigem Puffer hergestellt 1277 bei der Umsetzung mit wasserunl slichen Aminen keine Reaktion statt die Ausbeuten Diese Me
59. Protein und Ligand erfolgt gem AAV MM13 Berechnung der Uberlappungsvolumina Die Vorhersagen des Inhibitionsmechanimus sowie die Quantifizierung der hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Pepticinnamin E Analoga und der Farnesyltransferase erfordern eine Berechnung der Uberlappungsvolumina gem AAV MM12 Lars Kissau 8 Anhang 202 7 Literaturverzeichnis 1 Ward N L Dumont D J Sem Cell Dev Biol 2002 13 19 27 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Mason J Mason A R Cork M J Bri J Derm 2002 146 351 364 Voet D Voet J G Biochemistry VCH Wiley Weinheim 1994 Toogood P L J Med Chem 2002 45 1 16 Deubel D V J Am Chem Soc 2002 124 5834 5842 Nicolaou K C Ritzen A Namoto K Buey R M Diaz J F Andreu J M Wartmann M Altmann K H O Brate A Giannakakou P Tetrahedron 2002 58 6413 6432 Audran G Uttaro J P Monti H Synlett 2002 1261 1264 Groom C R Hopkins A L Drug Discov Today 2002 7 801 802 Knighton D R Zheng J H Eyck L F T Ashford V A Xuong N H Science 1991 253 407 414 Cohen P Nature Rev Cancer 2002 1 309 315 Davies S P Reddy H Caivano M Cohen P Biochem J 2000 351 95 105 Takai Y Kishimoto M Inoue Y Nishizuka Y J Biol Chem 1977 252 7603 7609 Tamaoki T Nomat
60. Richtung und die Distanzen fest ber die die Atome in einem Schritt bewegt werden Diese Methode eignet sich f r die anf ngliche Korrektur einer groben Struktur In der N he des Energieminimuns sind die Rechnungen jedoch sehr langsam b Conjugate Gradient Bei dieser Methode werden die Informationen ber die Minimierungsschritte gesammelt um die Umkehr vom zuvor gemachten Fortschritt zu verhindern Dieser Extra Aufwand vergr ert zwar Rechenzeit und Speicherbedarf liefert aber im Bereich eines Minimums eine rasche Konvergenz Daneben gibt es zahlreiche Modifikationen dieser Methode die aber in der vorliegenden Arbeit keine Anwendung fanden Bei Kraftfeldrechnungen werden Molek le normalerweise im Vakuum betrachtet d h es gilt e 1 F r den Fall unpolarer Kohlenwasserstoffe ist der Fehler hierbei vernachl ssigbar Geladene oder polarisierte Molek le k nnen jedoch nicht so einfach behandelt werden Das Ignorieren von Solvenzeffekten w rde zu einer starken berbewertung von elektrostatischen Interaktionen f hren Neben der Definition einer korrigierten Dielektizit tskonstante oder dem Hinzurechnen von L sungsmittelmolek len gibt es auch Ans tze die Solvatation in die Parametrisierung einzubeziehen PEP Gul verwendet ein solches Implicit Solvation Model H 2 3 3 2 2 Homology Modelling Zur Betrachtung von Proteinen mittels Molecular Modelling sind dreimensionale Informationen unerl sslich Fehlen Strukturinformatione
61. Torsionswinkel und eventuell fehlende Wasserstoffbr ckenpartner gelegt werden da diese ein Hinweis auf ein teilweise inkorrektes Alignment oder falsche Konformationen sein k nnen Hier sollte das Alignment berpr ft korrigiert und die Schritte 1 bis 3 erneut durchgef hrt werden AAV MM15 Berechnung der Schnittvolumina zweier Molek le WitnotP Die Strukturen beider Molek le werden unter Anwendung des Skriptes USE bereinandergelegt entsprechend den Bindungsmodi Nach Aktualisierung der Koordinaten beider Molek le mit freeze m ssen die Oberfl chen der beiden Molek le manuell getrennt und zusammen berechnet werden Hierzu wechselt man in das Men Surface Parallel zur graphischen Darstellung siehe WitnotP Bedienungsanleitung wird das Volumen des von der Oberfl che umschlossenen K rpers angezeigt Die Berechnung der Volumina erfolgt automatisch gem AAV MM11 Die Kalkulation der Schnittvolumina erfolg auf die in Kapitel 4 3 5 beschriebene Weise Diese Arbeitsvorschrift entspricht AAV MMI3 und ist anzuwenden wenn das Connolly Software Paket nicht zur Verf gung steht AAV MMI6 Berechnung von Hydrophobizitatsoberflachen mit WitnotP und HYDROMAP Anwendung Die beschriebene Vorgehensweise setzt die Installation von HYDROMAP Witnotp und GRASP auf einem Netzserver voraus Die angegebenen Pfade beziehen sich auf das interne Netzwerk des MPI in Dortmund Beschreibung Mit read xpdb oder read mol2
62. Verfahrensweise bei den Verbindungen aus Tablle 17 Anhang X wurden f r die Ermittlung des wahrscheinlichsten Bindungsmodus die Hydrophobizit tskarten analysiert und des weiteren die Annahmen einer Wechselwirkung des Histidins mit den Zinkion sowie des freien Carboxylates mit der durch Arg 202 Glu 198a und Gln 167a begrenzten polaren Tasche get tigt Wie bei den Verbindungen mit Naturstoff R ckgrat gelang es auch f r die Analoga mit abgewandeltem R ckgrat diese Struktur Aktivit ts Daten mittels Molecular Modelling zu rationalisieren Zun chst wurde die Gruppe der einfach N methylierten Verbindungen untersucht Der f r Verbindung 109 vorgeschlagene Bindungsmodus repr sentativ f r diese Gruppe ist in Abbildung 71 gezeigt Das Histidin koordiniert an das Zinkatom wobei Koordinations 156 Die freie geometrie und Bindungsabstand 2 4 Literaturwerten recht nahe kommen Carboxylatgruppe bildet eine Wasserstoffbr cke mit Gln 1670 Diese Wasserstoffbr cke findet sich auch im Komplex der PFT mit dem nat rlichen CAAX Substrat Gut zu erkennen ist das der meta Benzyloxycinnamoylrest einen Teil der Bindungstasche f r FPP blockiert und zugleich die hydrophobe Wechselwirkung die im nat rlichen Substrat zwischen der zweiten unpolaren Aminos ure und Trp 106 Trp 102 Trp 303 und Tyr 361 ausgeht imitiert Das C terminale Tyrosin von 109 bildet eine Wasserstoffbr cke zum Backbone von Ala 98a das zusammen mit Pro97a f r die B
63. Verschiebung ist die Substitution von Ala 981 in Tie 2 zu Cys 1045 in VEGFR 2 verantwortlich Cys 993 VEGFR 3 und Thr 843 ErbB 2 w ren demnach f r den gleichen Effekt bei den anderen Kinasen verantwortlich Die k nnte die Ursache f r die Selektivit t sein Im Bezug auf die fehlende Wirkung gegen IGFIR k me die Substitution von Ile 902 in Tie 2 durch Met 1076 in Betracht Dies erscheint allerdings nicht zwingend da 99 aufgrund des geringen sterischen Anspruches auch anders an IGFIR binden k nnte Die Selektivit t von 99 ist im Bezug auf IGFIR durch rein sterische Argumente nicht so eindeutig zu erkl ren wie dies f r die vorangegangenen Inhibitoren der Fall war 4 2 5 4 Bindung von 100 an IGFIR VEGFR 3 und Tie 2 W hrend viele der Verbindungen aus der Nakijichinon C Bibliothek aufgrund ihres Aufbaus Dekalin Chinon Aminos ure in vergleichbaren Bindungsmodi mit den Kinasen wechselwirken passt Verbindung 100 nicht in dieses Bild Anstelle eines hydrophoben Teils Lars Kissau 4 Spezieller Teil 84 findet sich eine zweite Aminos ure die kaum geeignet erscheint in der hydrophoben Tasche zu binden Das Muster von Wasserstoffbr ckenakzeptoren und donoren erm glich aber einen komplett anderen Bindungsmodus bei dem die Verbindung die Triphosphat Bindungstasche belegt und dadurch ebenfalls zu ATP kompetitiv wirken kann Die kinetische Untersuchungen von Herrn Dr R Mazitschek an der Universit t Karlsruhe best tigen eine ATP kompet
64. Wie aus dem Schema in Anhang XI ersichtlich hat das Protein Ras eine zentrale Bedeutung als molekularer Schalter in der Zelle inne Dass Fehler in der Regulation der Aktivit t eines solchen zentralen Schalters in intrazellul ren Signalkaskaden erhebliche Auswirkungen haben k nnen wird durch die H ufigkeit von Mutationen in f r Ras codierenden Genen ca 30 aller menschlichen Tumore eindrucksvoll belegt Ras wurde als zentrales Gen in Tumorviren von Nagern entdeckt der Name leitet sich von Rat Sarcoma ab Das Ras p21 Protein geh rt zu einer Ras Superfamilie von GTP bindenden Proteinen zu der auch Rho Rac Rab und Ran geh ren Diese zu mindestens 30 homologen Proteine ben hnliche Funktionen aus Rho Rac fungieren downstream von Ras und spielen f r die Morphogenese und Organisation des Cytoskelets eine Rolle Rab Proteine spielen beim Targeting von Vesikeln f r die entsprechenden zellul ren Kompartimente eine Rolle Wie Ras m ssen alle diese Proteine in ihrer GTP gebundenen Form vorliegen um aktiv zu sein Im Falle der Ras MAP Kinase Signaltransduktionskaskade werden die phosphorylierten Rezeptoren vom growth factor receptor binding protein Grb2 erkannt Die phosphorylierte Sequenz der Rezeptor Tyrosin Kinase wird ber die SH2 Dom ne des Grb2 gebunden Grb2 lokalisiert in der Folge das Protein Sos mittels zweier SH3 Dom nen an der Innenseite der Zellmembran Der Komplex aus Grb2 und Sos wirkt auf die inaktiven GDP
65. an IGFIR w re ein Rotation um die Bindung zwischen Chinon und Stickstoff erforderlich was jedoch den Verlust der Wasserstoffbr cke zu Asp 1083 in IGFIR verursachen w rde Dies spricht f r die Bedeutung die Substitutenten haben welche die Wechselwirkungen der ATP Ribose mit der Kinase imitierren 4 2 5 3 Bindung von 99 an Tie 2 Ein weiteres interessantes Mitglied der Nakijichinonbibliothek ist Verbindung 99 Das generelle Muster der Inhibitoren findet sich hier nur unvollst ndig wieder Ein hydrophober Teil wird zwar erg nzt durch eine polare Einheit mit 3 Wasserstoffbr ckenakzeptoren Das Donor Akzeptor Motif charakteristisch f r viele Kinaseinhibitoren fehlt jedoch Auffallend ist weiterhin dass 99 keinen Aminos uresubstituenten hat der die Wechselwirkungen zwischen Kinase und Ribose imitiert 99 passt sehr gut in die hydrophobe Tasche von Tie 2 wobei auch hier das Modell B bessere Resultate ergab Bei einer CHARMM Minimierung des Komplexes wurde in der Tat ein hydrophober Kollaps beobachtet wie in A Bridges f r viele Kinaseinhibitoren postulierte Dies best tigt erneut den Ansatz der Flexibilit t der Kinasen durch die Konstruktion verschiedener Homologiemodelle Rechnung zu tragen 99 kann auch in die hydrophobe Tasche von KDR einpasst werden Daf r ist allerdings eine leichte Verschiebung in Relation zur Position in Tie 2 erforderlich die jedoch das Ausbilden von Wasserstoffbr cken zur Hinge Region verhindert F r diese
66. b Ribbondiagramm des Homologiemodells der PP2A Lars Kissau 8 4 Ribbon Darstellung der Homologiemodelle 208 8 4 Anhang IV Ribbon Darstellung der Homologiemodelle Diese Abbildungen wurden gem AAV MM19 erstellt Hierf r wurden die Programme RASMOL MOLSCRIPT und RASTER3D verwendet Merritt 1997 140 Tie 2 Modell A Tie 2 Modell B VEGFR 2 Modell A VEGFR 2 Modell B VEGFR 3 Lars Kissau 8 4 Ribbon Darstellung der Homologiemodelle 209 Lars Kissau 8 5 Ramachandran Diagramme der Homologiemodelle 210 8 5 Anhang V Ramachandran Diagramme der Homologiemodelle 8 5 1 Tie 2 Templat RGD 8 5 2 Tie 2 Templat 2FGI GC KC 8 5 3 VEGFR 2 Templat 1FGI 8 5 4 VEGFR 2 Templat 2FGI Lars Kissau 8 5 Ramachandran Diagramme der Homologiemodelle 211 8 5 5 ErbB 2 Templat IGRIR 8 5 6 VEGFR 3 Templat 2FGI Hy t 2 A R I Ye 4 R g A i D Lars Kissau 8 6 WHATCHECK Analyse der Kinasemodelle 212 8 6 Anhang VI WHATCHECK Analyse der Kinasemodelle Die kompletten WHATCHECK Analysen aller Homologiemodelle ca 25 30 DIN A4 Seiten pro Modell sind auf der beiliegenden CD gespeichert Auszugsweise seien hier die wichtigsten Resultate abgedruckt 8 6 1 Erkl rungen der Bewertungen 8 6 1 1 Ramachandran Score und Ramachandran Plot Die Auftragung der Phi und Psi Winkel Ramac
67. berechnet 593 67 lar 12 4 c 1 1 in CHC Retentionszeit AAV 7B 11 3 min H NMR CDCl 400 MHz 7 29 7 11 br m 16H Phe H 6 6 88 m 1H H 2 6 61 m 1H H 5 5 01 4 73 m 3H a H 3 22 3 11 m 6H B H OFFF C34H34N40 Ausbeute 19 mg 33 umol HPLC MS ESI gefunden 595 7 M H berechnet 594 66 lef 9 7 c 0 9 in CHC1 Retentionszeit AAV 7B 12 5 min H NMR CDCl 400 MHz 7 27 7 03 br m 17H Phe H 6 H 2 6 52 m 1H H 5 4 99 4 71 m 3H a H 3 25 3 15 m 6H B H UFFF C34H34N40 Ausbeute 11 mg 20 umol HPLC MS ESI gefunden 595 8 M H berechnet 594 66 lar 9 1 c 1 0 in CHC Retentionszeit AAV 7B 12 5 min H NMR CDCl 400 MHz 7 33 7 12 br m 17H Phe H 6 H 2 6 81 m 1H H 5 5 10 4 95 m 3H a H 3 21 3 13 m 6H B H JADFG C2sH28N4010 Ausbeute 4 mg 7 umol HPLC MS ESI gefunden 545 7 M H berechnet 544 51 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 196 Retentionszeit AAV 7A 16 2 min JNDFG C26H29N5011 Ausbeute 6 mg 8 umol HPLC MS ESI gefunden 588 8 M H berechnet 587 54 Retentionszeit AAV 7A 13 5 min JNYFG C31H33NsO10 Ausbeute 4 mg 4 umol HPLC MS ESI gefunden 636 7 M H berechnet 635 62 Retentionszeit AAV 7B 11 5 min Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 197 JAYFG C30H32N409 Ausbeute 5 mg 8 umol HPLC MS ESI gefunden 593 8 M H berechnet 592 60 Retent
68. chst eine Analyse der Bindung der nat rlichen Substrate bzw des Katalysemechanismus erforderlich Die PFT wurde mehrfach kristallisiert mit und ohne Substrate bzw Liganden Die Erkennung des Farnesylpyrophosphats durch das Enzym erfolgt ber die lange lipophile Farnesylkette blau gef rbt in Abbildung 66b die in einer hydrophoben Tasche der PFT gebunden wird w hrend ber die Wechselwirkung mit einem hydrophilen Bereich die Pyrophosphat Gruppe im Vordergrund rot gef rbt fixiert und in unmittelbare N he zu einem Zn violett im aktiven Zentrum der PFT gebracht wird D Carboxylat nd Bindungstasche all FPP Bindungs tasche Pyrophosphattasche Abbildung 66 a Hydrophobizit tskarte der PFT b Farnesylpyrophosphat und CVFM Peptid im aktiven Zentrum der PFT An dieses Metallion bindet das Cystein der CAAX Box des Proteins Eine wichtige Rolle spielt weiterhin die Seitenkette der aliphatischen Aminos ure As die in eine hydrophobe mit aromatischen Resten ausgekleidete Tasche bindet linkere obere H lfte und die Aminos ure X hier ein Methionin oben rechts welche ber die Carboxyl Funktion mit basischen Aminos uren des Enzyms wechselwirkt und ber den Charakter seine Seitenfunktionalit t die Selektivit t gegen ber verschieden Prenyltransferasen determiniert In dem in Abbildung 66b gezeigten Ausschnitt aus der Kristallstruktur der Rattenfarnesyltransferase ist die Peptidbindungsstelle gelb eingef
69. da Zeile 5 die beiden Tryptophan Reste in der PFT und der GGTase II hier mehr Platz beanspruchen als das Glycin in der GGTase I Der gr n markierte Phenylrest schlie lich w rde mit den Argininresten der PFT und der GGTase I in Konflikt geraten nicht aber mit dem Cystein der GGTase I Eine Selektivit t ausschlie lich zugunsten der GGTase II w re am Besten ber die Variation des Restes R zu erreichen Ein sehr hydrophober Rest w rde weniger gut f r eine Bindung in der Carboxylatbindungstasche der GGTase I oder der PFT geeignet sein Lars Kissau 5 Zusammenfassung und Ausblick 119 5 Zusammenfassung und Ausblick 5 1 Zusammenfassung Ziel des ersten Projektes der vorliegenden Arbeit war es durch die Verwendung von Methoden der kombinatorischen Chemie erg nzt durch Molecular Modelling Arbeiten eine Leitstruktur f r Molek le zu entwickeln die durch Beschleunigung der GTPase Reaktion GTP gt GDP P die sogenannte Switch Off Reaktion von Mutanten des Ras Proteins die gest rte Wechselwirkung mit dem GTPase activating protein GAP kompensieren Ein solches GAP ersetzendes kleines Molek l muss einerseits die Bindung im Bereich der GTP Tasche an Ras f rdern und andererseits die GTP Hydrolyse beschleunigen EE eee Abbildung 78 Strategie zur Entwicklung und Optimierung einer Leitstruktur wenn ein R ckgriff auf 63 95 einen bereits validierten Startpunkt nicht m glich ist Gem der in Abbildung 78 gezeig
70. dargestellt Als ATP kompetitive Inhibitoren bilden Nakijichinon und die untersuchten Analoga essentielle Wasserstoffbr cken zur sogenannten Hinge Region der Rezeptor Tyrosin Kinasen aus wie sie auch vom Purin des ATP gebildet werden Die Aminos uresubstituenten imitieren die Wechselwirkungen zwischen der Ribose des ATP und der Kinase Abbildung 87 Nakijichinon C und die biologisch aktiven Analoga k nnten hnlich an die Rezeptor Tyrosin Kinasen binden wie ATP Die Hinge Region ist rot dargestellt Aus dem in dieser Arbeit aufgekl rten Bindungsmodus folgt auch die Ursache f r die Selektivit t Das hydrophobe Dekalinger st der Nakijichinon Analoga bindet in einer Lars Kissau 5 Zusammenfassung und Ausblick 124 hydrophoben Tasche der Rezeptor Tyrosin Kinase Viele Reste innerhalb der Kinasedom nen verschiedener Rezeptor Tyrosin Kinasen sind hoch konserviert Diese hydrophobe Tasche ist jedoch eine sehr variable Region Zahlreiche Substitutionen ver ndern die Form und Gr e der hydrophoben Taschen Dem entsprechend ist die Gr e und Form des hydrophoben Dekalinger stes ausschlaggebend f r die F higkeit einer Verbindung eine bestimmte Kinase zu inhibieren F r alle in Abbildung 85 gezeigten Verbindungen konnten die molekularen Ursachen der Selektivit t auf Basis dieses Bindungsmodells aufgekl rt werden Exemplarisch ist in Abbildung 88 die Bindung von Verbindung 98 in der VEGFR 2 Kinasedom ne gezeigt Hervor zu heben ist d
71. die Konstruktion verl sslicher Homologiemodelle gilt ein Wert von 30 als untere Grenze so dass beide Strukturen f r alle Modelle als Template denkbar w ren F r das Modell der Kinasedom ne Lars Kissau 4 Spezieller Teil 71 von ErbB 2 wurde die Struktur des IGF1 Rezeptors aufgrund des gr eren Identit ts und hnlichkeitsgrades ausgew hlt Aufgrund der jeweils etwas gr eren hnlichkeit zu FGFIR wurde f r Tie 2 VEGFR 2 und VEGFR 3 jedoch der FGF Rezeptor 1 als Templat f r die Konstruktion der Homologiemodelle gew hlt Diese Wahl wird auch dadurch best tigt dass FGFIR bei der L sung der Kristallstruktur von VEGFR 2 als Search Modell gedient hat Der gleichen Argumentation folgten unabh ngig von diesen Arbeiten auch G Bold et al Vom FGF1 Rezeptor sind mehrere Kristallstrukturen in der PDB deponiert Der Vergleich der Kristallstrukturen des FGFIR ohne Ligand PDB Code 1FGK mit den Strukturen mit Liganden PDB Code 1FGI und 2FGI belegt erneut die Konformations nderungen als Konsequenz der Bindung eines Liganden allerdings ist das Ausma der nderungen von der Art und Struktur des Liganden abh ngig Die beiden von M Mohammadi et al gel sten Strukturen des FGFIR im Komplex mit Inhibitoren sind in Abbildung 50 gezeigt H Die sogenannte C Helix der Activation Loop und der Nucleotide Binding Loop zeigen eine ausgepr gte Flexibilit t die deutlich unterschiedlichen Konformationen des Nucleotide Binding Loops si
72. done echo modify mol name 1 mi echo done echo write mol 1 m 1 mi echo exit yes echo EOF sh gt gt 1 out 2 gt amp 1 echo nWrong number of arguments echo Usage minall run Molecule name n esac Inputdatei charmm_templ3 inp Minimization of a single small molecule set 1 XXXX open unit 11 read form name ocg work mm medlib AMINOH RTF read rtf cards unit 11 close unit 11 open unit 12 read form name ocg work mm mcdlib PARM PRM read param cards unit 12 close unit 12 open unit 30 read card name 1 psf read psf card unit 30 Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 138 close unit 30 open unit 30 read card name 1 pdb read coor pdb unit 30 close unit 30 3K K 2K K K K K K 3K 3K 3K 2K 2K 2K K K I 3K 3K 2K FREE K ok Dieser Abschnitt variiert von Input Datei zu Input Datei siehe auch CHARMM doc IWW 8 88 588 FIG IS k k k k k k k k k k k k k EFF k k k K k k k k K K k k k K K kK k k K FF EEE 2k mini conj rdiel nstep 9000 tolgrad 0 05 3K K 2K K K K K K 3K 3K 3K 2K 2K K K K K 3K 3K 3K 2K FK K K K K 3K 3K 3K FK FK K K K OIE K 3K FK FK FK K K K OIE 3K 3K FK FK FK K K 2K 3K FK 3K FK FK FK K Eee ok Der Rest der Input Datei regelt das Abspeichern der minimierten Struktur und ist f r alle Input Dateien identisch 3K K 2K 2K 2K K K K K 3K 3K 3K 2K 2K K K K 3K 3K 3K 2K 2K K K K OIE 3K 3K 3K FK FK K K K 2K 3K 3K FK FK FK K K K 3K 3K 3K FK FK FK K
73. experimentelle Bestimmung ist theoretisch zwar einfach praktisch jedoch oft mit Schwierigkeiten verbunden Beim Design neuer Wirkstoffe am Computer entf llt diese M glichkeit komplett Um diese Probleme zu berwinden wurden Verfahren entwickelt mittels einer Incrementen Methode die Log P Werte von Verbindungen zu berechnen In der vorliegenden Arbeit wurde f r diesen Zweck das f r diese Zwecke gebr uchliche Programm CLogP verwendet Wirkstoffe die diesen Anforderungen entsprechen sollten durch Diffusion in hohen Konzentrationen zu ihrem intrazellul ren Wirkort gelangen und dort kompetitiv zu nat rlichen Substraten auf Zielproteine wirken k nnen 2 3 1 2 Beeinflussung der Protein Protein Wechselwirkung Die durchschnittliche Oberfl che die an einer Protein Protein Bindung beteiligt ist betr gt 800 A Die Annahme diese Wechselwirkung sei die Summe einer Vielzahl von schwachen Wechselwirkungen ist jedoch nicht korrekt wie am Beispiel des Human Growth Hormon deutlich wird Mutationsexperimente belegen dass 8 der 31 beteiligten Aminos uren f r 85 t Eine kostenlose Version ist unter www daylight com abrufbar Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 19 der Bindungsenergie verantwortlich sind DIE Bei stark assoziierenden Homodimeren finden sich an der Bindungsfl che eher unpolare Reste die eine Dimerisierung beg nstigen Im Gegensatz dazu weisen Proteine deren Assoziation und Dissoziation durch Umweltver nderungen beein
74. fluoren 9 ylmethyl ester 3 hydroxymethyl benzylester 81 16 8 mg 20 umol 438 wurden in 10 ml abs THF gel st und in einem 2 ml Eppendorf SafeLock mit 174 ul einer 70 igen L sung von Fluorwasserstoff in Pyridin versetzt Der Reaktionsfortschritt wird mittels D nnschichtchromatographie berwacht Nach 5 Stunden R hren bei Raumtemperatur wird mit 20 ml Ethylacetat verd nnt und mit je 10 ml ges ttigter NaHCO L sung ges ttigter NH4Cl L sung ges ttigter NaCl L sung und H2O gewaschen Die organischen Phasen werden ber Na2SO getrocknet und im Vakuum eingeengt Das gelbe Rohprodukt wird s ulenchromatographisch an Kieselgel Eluent Cyclohexan Ethylacetat 1 1 v v gereinigt Ausbeute 10 2 mg 17 7 umol 86 d Th Rre Wert Cyclohexan Ethylacetat 1 1 v v 0 13 H NMR CDCI 400 MHz 7 72 t 4H H 4 H 5 J 6 65 Hz 7 49 dd 4H H 1 H 8 J 7 43 Hz J 11 34 Hz 7 33 7 43 m 4H H 3 H 6 7 23 7 33 m 7H H 2 H 7 H 4 H 5 H 6 7 17 br s 1H H 2 4 69 d 2H Ph CH3 OPO OR Jun 8 6 Hz 4 63 s 2H Ph CH OH 4 22 d 4H Fm CH J 6 43 Hz 4 10 t 2H H 9 J 6 43 Hz Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 178 C NMR CDCl 100 6 MHz 143 7 C 8a C 9a 141 1 C 1 C 3 135 8 C 4a CAb 128 1 C 5 128 0 C 1 C 8 127 9 C 2 C 7 127 6 E2 C59 1263 C 4 125 7 C 6 125 4 124 9 120 2 C 2
75. getrocknet und eingeengt Das Rohprodukt wird mittels Flash Chromatographie gereinigt Ausbeute 1 66 g 8 6 mmol 62 1 d Th Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 169 Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat 2 1 v v 0 26 H NMR CDCl 400 MHz 8 7 38 ddd 1H H 6 J 0 96 Hz J 1 56 Hz J 7 61 Hz 7 31 ddd 1H H 2 J 0 65 Hz J 1 56 Hz J 1 92 Hz 7 18 dt 1H H 5 J 0 65 Hz J 7 61 Hz 6 82 ddd 1H H 4 4J 0 96 Hz 4J 1 92 Hz J 7 61 Hz 1 58 s 9H C CH3 3 C NMR CDCL 100 6 MHz 5 167 2 C O 146 6 C 3 133 5 C 1 129 0 C 5 120 1 C 6 119 2 C 4 116 8 C 2 78 5 C CH3 3 28 3 C CH3 3 C11H sNO 193 24 FAB MS 3 NBA 194 4 M H HRMS FAB 3 NBA berechnet 194 1181 gefunden 194 1201 3 Bis allyloxy phosphorylamino benzoes ure tert butylester 48 820 mg 3 7 mmol 3 Aminobenzoes ure tert butylester werden durch azeotrope Destillation getrocknet 2 x 15 ml Toluol und in 10 ml Methylenchlorid unter Argon gel st Nach Zugabe von 0 89 ml 6 4 mmol Triethylamin werden 1 1 ml 3 7 mmol Diallylphosphorchloridat in 3 ml Methylenchlorid zugegeben und 18 h zum R ckflu erhitzt Der Reaktionsverlauf wird mittels TLC berwacht Man gibt etwas Celite zur Reaktionsl sung und entfernt das L sungsmittel im Vakuum Der R ckstand wird direkt auf eine Kieselgels ule aufgetragen Nach Flash Chromatographie an Kieselgel mit Cyclohexan Ethylacetat 4 1 1 Triethylamin
76. halten um die Ergebnisse zuk nftiger Apoptose Assays sicherer analysieren zu k nnen 4 3 4 6 Steigerung der Zahl und St rke der Wasserstoffbr cken unter Beachtung der Lipinski Kopple Regeln Die Werte in Tabelle 13 fassen die genannten Parameter f r die bereits getesteten Verbindungen und die Optimierungsvorschl ge zusammen F r Letztere liegen die Zahl der Wasserstoffbr cken ebenso innerhalb der von Lipinski und Kopple determinierten Limits wie die Zahl potentieller Wasserstoffbr ckendonoren und Akzeptoren Ebenfalls aus Tabelle 13 zu ersehen ist die Verbesserung der CLogP Werte der Optimierungsvorschl ge Drehbare HB Donoren Bindungen IC50 CLogP Akzeptoren Summe CAAX kompetitive Inhibitoren 112 21 11 4 917 5 6 11 115 16 13 2 534 Shs 2 FPP kompetitive Inhibitoren 114 20 5 5 437 3 8 11 110 22 9 7 329 3 8 11 129 19 16 5 642 3 7 10 130 20 gt 100 5 205 3 7 10 Bisubstrat inhibitoren 109 18 6 3 843 6 6 12 156 18 5 3 843 6 6 12 124 19 16 6 872 3 7 10 159 18 23 3 843 6 6 12 9 27 40 7 477 5 9 14 Optimierte Inhibitoren 160 10 4 904 3 9 12 161 11 4 861 6 5 11 161 10 4 635 3 08 12 Tabelle 13 ClogP Werte Wasserstoffbr ckendonoren und akzeptoren und Anzahl drehbarer Bindungen der interessantesten Inhibitoren 4 3 4 7 Verst rkung der Bindung von Histidin an Zn Die N Methylierung des Imidazols bewirkt eine Verst rkung der Wechselwirku
77. o o H 1 TFA DCM ON K LNIp N ka Sager AN AN o e H 6 2 L AlaninOMe HBTU DIEA K Q 49 S48 Abbildung 27 Alternative Synthesestrategie fiir den Spacer 33 Bei der geplanten Entsch tzung der Phosphors ureester trat ein quantitativer Verlust der Phosphatgruppe auf Auch der Einsatz von Silanen als F nger statt des basischen Morpholins f hrte zu keinem positiven Resultat Daher wurden an dieser Stelle die Phosphoramidatlinker aufgrund mangelnder Stabilit t nicht weiter verfolgt und statt dessen die Entwicklung alternativer Strukturen vorangetrieben 4 1 4 6 2 3 Phosphatidylbenzoes ure Als Ursache f r die Instabilit t des Spacers 33 wurde die Labilit t des Phosphoamidates bedingt durch die NH Gruppe angenommen Die naheliegendste Alternative war der Ersatz der NH Gruppe durch ein Sauerstoffatom Zun chst wurde ausgehend von 3 Hydroxybenzoes ure durch azeotrope Veresterung der Allylester 409 synthetisiert Eine elegante Methode zur Phosphorylierung von Phenolen wurde von Silverberg et al entwickelt Hierbei wird ein Phosphorigs urediester in Gegenwart von CBr direkt zum Phosphat umgesetzt HOP CH Ph CCI CBr4 O PD DIEA DMAP SP OH m O HO CH CN 10 C H HO 50 45 min 50a Abbildung 28 Synthese von Phenylphosphaten nach Silverberg et al 3 Hydroxybenzoes ure 53 wurde mit Allylalkohol verestert Die Literaturausbeuten der Phosphorylierung konnten zwar f r einfache Phenole wie 50 reproduziert werden Eine
78. p120 siehe Abbildung 8 lieferte einen entscheidenden Beitrag zur Aufkl rung der molekularen Ursachen der transformierenden Wirkung von Mutationen im f r Ras codierenden Gen die zu einem Austausch von Glycin 12 zu Valin oder Prolin f hren Abbildung 8 Struktur des Ras GAP Komplexes In der Vergr erung rechts sind die wichtigen Aminos uren in der N he des GTP Bindungstasche gezeigt Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 15 Aus der Kristallstruktur ist zu erkennen dass die Seitenkette von Arginin 789 von GAP 334 in die GTP Bindungstasche von Ras ragt Dort neutralisiert die Guanidiniumgruppe die im Verlauf der GTP Hydrolyse entstehenden negativen Ladungen Des Weiteren stabilisiert GAP die sogenannte Switch II Region von Ras wodurch es Glu 61 erm glicht wird im Sinne einer allgemeinen Basenkatalyse die Hydrolyse von GTP zu GDP und P zu beschleunigen Eine Betrachtung der vdW Radien belegt dass Gly 12 im bergangszustand in direktem Kontakt zu Arg 789 und Glu 61 steht Bei den Ras Mutanten G12V und G12P ist also eine korrekte Orientierung von GAP Arg 789 und Ras Glu 61 nicht m glich Damit kann der st rende Einflu der G12V und G12P Mutationen auf die Bildung des Ras GAP Komplexes als die molekulare Ursache f r die transformierende Wirkung dieser Mutationen betrachtet werden 2 2 2 1 1 Ausgangspunkt der Untersuchungen 1999 machten A Wittinghofer et al die Entdeckung dass DABP GTP 7 von den G12V und G12P
79. r set coulombic fileName coul ene set vdW accessType r set vdW repFileName gl2v_vdw_rep ene set vdW attFileName gl2v_vdw_att ene display all ENERGY_END GROWING set param length global 5 set param seed global 12345 set param growingMode global N display all run GROWING_END exit 8 7 3 GOLD GOLD CONFIGURATION FILE POPULATION popsiz 100 select_pressure 1 100000 Lars Kissau 8 7 Input Dateien f r Molecular Modelling Arbeiten 217 n_islands 5 maxops 100000 niche_siz 2 GENETIC OPERATORS pt_crosswt 95 allele_mutatewt 95 migratewt 10 FLOOD FILL radius 20 origin 000 do_cavity 1 floodfill_atom_no 8401 cavity_file cavity atoms floodfill_center atom DATA FILES protein_datafile hero work kissau ftase ftase4docking mol2 ligand_data_file hero work kissau ftase hugil mol2 10 ligand_data_file hero work kissau ftase hugi2 mol2 10 ligand_data_file hero work kissau ftase hugi3 mol2 10 ligand_data_file hero work kissau ftase hugi4 mol2 10 ligand_data_file hero work kissau ftase hugi5 mol2 10 ligand_data_file hero work kissau ftase hugi6 mol2 10 ligand_data_file hero work kissau ftase hugi8cbounddyn mol2 10 ligand_data_file hero work kissau ftase peptamine mol2 10 param file DEFAULT set _ligand_atom_types 1 set_protein_atom_types 1 directory claudio work kissau ftdockingneu tordist_file DEFAULT make_subdirs 1 save_lone_pairs 1 fit_points file fit_p
80. und verd nnt dann mit Ethylacetat Nach Waschen mit IN HCl ges NaHCO H20 ges NaCl und Trocknen ber Na2SO engt man die organische Phase ein und erh lt ein farbloses l Das Produkt wird durch S ulenchromatographie an Kieselgel Cyclohexan Ethylacetat 4 1 v v gereinigt Ausbeute 78 3 mg 84 d Th Rre Wert Cyclohexan Ethylacetat 4 1 v v 0 28 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 185 H NMR CDCI 400 MHz 7 80 ddd 4H H 4 H 5 J 0 78 Hz J 1 56 Hz J 7 43 Hz 7 48 7 58 ddd 4H H 1 H 8 J 0 78 Hz J 7 6 Hz J 13 0 Hz 7 39 m 4H C 3 C 6 7 37 d 1H Phe H 4 J 7 43 Hz 7 31 ddd 4H C 2 C 7 J 7 43 Hz 7 26 7 20 m 2H Phe H 3 Phe H 5 7 20 7 15 m 2H Phe H 2 Phe H 6 4 64 dd 1H Phe a CH J 5 67 Hz J 8 21 Hz 4 29 m 4H H 1 4 13 dd 2H CH gt CH gt O P 3J 5 56 7J 13 29 Hz 3 80 s 2H O CH CONH 3 81 3 86 m 4H H 9 3 63 s 3H OMe 3 38 3 50 m 2H CH gt CH gt O P 3 12 dd 1H Phe B CHb J 5 67 Hz J 13 71 Hz 2 99 dd 1H Phe B CHb J 8 21 Hz J 13 71 Hz BC NMR CDCl 100 6 MHz 172 2 Ester C O 169 5 Amid C O 145 0 C 8a C 9a 143 0 Phe C 1 130 7 C 4a C 4b 129 9 C 1 C 8 129 3 C 4 C 5 128 7 Phe C 2 Phe C 6 128 3 C 2 C 7 126 5 Phe C 3 Phe C 5 121 5 C 3 C 6
81. von 98 in die von Val 916 Val 914 Val 899 Leu 889 Cys 1045 und Phe 1047 begrenzte hydrophobe Tasche von VEGFR 2 Der L Serin Teil des Molek ls tr gt durch Wasserstoffbr cken zu Leu 840 und Asn 923 zur Bindung und korrekten Orientierung des Inhibitors bei Asn 923 steuert bei der Bindung des nat rlichen Substrates ATP eine Wasserstoffbr cke zur 2 OH Gruppe der Ribose bei In dem hier vorgeschlagenen Bindungsmodus tragen die phenolische OH Gruppe sowie eine der Chinon Carbonylgruppen durch Wasserstoffbr ckenbindungen zu Glu 917 und Cys 919 zur Bindung bei Diese Wasserstoffbr cken zur Hinge Region werden wie in Abbildung 54 gezeigt auch vom Purinrest des ATPs ausgebildet Der hier vorgeschlagene Bindungsmodus befindet sich daher in vollem Einklang mit den experimentellen Daten die eine ATP kompetitive Inhibition von VEGFR 2 durch das C 2 Epimer von Nakijichinon C bzw von ErbB 2 durch den Naturstoff belegen Abbildung 55 Verbindung 98 im aktiven Zentrum der VEGFR 2 Kinase Dom ne Abbildung 56 zeigt den Naturstoff 6 im aktiven Zentrum des ErbB 2 Modells Auch hier finden sich die essentiellen Wasserstoffbr cken zur Hinge Region Der L Serin Rest imitiert auch hier die Wasserstoffbr cken der Ribose allerdings ist aufgrund einer etwas anderen Lars Kissau 4 Spezieller Teil 80 Konformation des Nucleotide Binding Loop eine Wasserstoffbr cke zu Ser 720 g nstiger als die bei VEGFR 2 und 98 gefundene Wechselwirkung mit Leu 840
82. von Peptiden Die Substanzbezeichnungen folgen dem erweiterten Ein Buchstaben Code wie er auf Seite X definiert wurde Die Kupplungschritte erfolgen gem AAV 1 anschlie end werden freie AMinogruppen mit Acetanhydrid gecapped AAV 3 Das Entfernen der N terminalen Fmoc Schutzgruppen erfolgt gem AAV 5 Zur Synthese wird zun chst 2 g Wang PS Harz 1 03 mmol g Advanced ChemTech mit Fmoc Glycin beladen Nach Capping wird das Harz aufgeteilt Die erste H lfe wird mit Fmoc Arginin Pmc gekuppelt die zweite mit Fmoc Phenylalanin Nach Capping werden beide Chargen erneut in gleiche Teile aufgeteilt und jeweils mit Fmoc Tyrosin tBu bzw Fmoc Glutamin Trt gekuppelt Nach erneuter Aufteilung wurden die Aminos uren Glycin Alanin Aspargins ure und Phenylalan n auf die Peptidkette gekuppelt Nach Capping und Fmoc Entsch tzung werden die Chargen ein letztes Mal aufgeteilt und mit den Kopfgruppen B U O J und Z gekuppelt Im Falle der J Kopfgruppe wird das Harz nach der Kupplung gewaschen und in DMF suspendiert Die Allylschutzgruppen werden mit 10 mol Pd und Morpholin als Allylf nger entfernt Anschlie end werden alle einzelnen Verbindungen gem AAV 6 von Harz abgespalten und Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 195 mittels HPLC ESI analysiert Die Reinigung erfolgt mittels pr parativer HPLC Die Substanzen wurden mittels HPLC ESI charakterisiert BFFF C34H35N505 Ausbeute 12 mg 20 umol HPLC MS ESI gefunden 594 8 M H
83. von Wechselwirkungen eine besondere Rolle Welche Ligandengruppen nun f r die Wechselwirkung geeignet sind l sst sich durch eine Untersuchung derjenigen Aminos uren kl ren die eine Tasche des Proteins begrenzen F r eine orientierende Analyse eines Proteins ebenfalls geeignet ist das Programm HYDROMAP das die Berechnung der Hydrophobizitatskarte eines Proteins gestattet und dies auf einer Solvent Accessible Surface graphischen darstellt Hydrophobizit t wird als ein sehr wichtiger Faktor bei der molekularen Erkennung und Bindung von Liganden betrachtet Hydrophobizit tskarten sind graphische Darstellungen der Bindungsenergie einer unpolaren kugelf rmigen Sonde die ber die Proteinoberfl che gerollt wird Diese Bindungsenergie beinhaltet neben einem elektrostatischen Anteil auch hydrophobe Wechselwirkungen Letztere werden im Programm HYDROMAP ber die Gleichung f r van der Waals Wechselwirkungen berechnet Lars Kissau 3 Ziele der Arbeit 29 3 Ziele der Arbeit Aufgabe der Naturwissenschaft ist es nicht nur die Erfahrungen zu erweitern sondern in diese Erfahrungen eine Ordnung zu bringen Niels Bohr Die zuvor skizzierten zellul ren Vorg nge verlangen zweifelsohne eine weitere Aufkl rung und sind f r die Anwendung von Methoden der biologischen Chemie Chemical Genetics ideal geeignet Das Verst ndnis von Signaltransduktionsprozessen kann sehr gut mittels selektiver Inhibitoren f r an diesen Prozessen beteiligte
84. 0 Lars Kissau 8 Anhang 206 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 Geyer M Schweins T Herrmann C Prisner T Wittinghofer A Kalbitzer HR Biochemistry 1996 35 10308 10320 Oivanen M Kuusela S Lonnberg H Chem Rev 1998 98 961 990 Berkessel A Riedl R J Comb Chem 2000 2 215 219 Seltzman H H Berran B D Tetrahedron Lett 1993 34 3083 3086 Park K K Oh C H Joung W K Tetrahedron Lett 1993 34 7445 7446 Rouden J Bernard A Lasne M C Tetrahedron Lett 1999 40 8109 8112 Carpino L A Imazumi H El Faham A Ferrer F J Angew Chem Int Ed 2002 41 442 445 Sieber P Tetrahedron Lett 1987 28 1637 1638 Ramage R Tetrahedron Lett 1987 28 2287 2289 Vaino A R Janda K D J Comb Chem 2000 2 579 596 Hudson D J Comb Chem 1999 1 334 360 Marshall M Oncogene 1995 10 1283 1290 Kapoor T M Andreotti A H Schreiber S L J Am Chem Soc 1998 120 23 29 Morken J P Kapoor T M Feng S B Shirai E Schreiber S L J Am Chem Soc 1998 120 30 36 Xiao X Zhao C Potash H Nova M P Angew Chem Intl Ed 1997 36 87 91 Morr M WaBmann A Wray V Tetrahedron 1999 55 2985 2996 Desaubry L Johnson R A Bioorg Med Chem Lett 1997
85. 0 C CH3 3 31P_NMR CDCl 202 5 MHz 5 28 08 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 180 C14H1705P 296 26 FAB MS 3 NBA 319 0 M Na H 82 297 0 M H 100 HRMS FAB 3 NBA berechnet f r C14H1sO5P 297 0892 gefunden 297 0899 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 181 2 tert Butyl dimethyl silanyloxy ethanol 71a 6 08 ml Ethylenglykol werden langsam und unter Eisk hlung zu einer Suspension von 4 0 g 100 mmol NaH in 150 ml abs THF addiert Nach 30 min R hren bei Raumtemperatur wird unter K hlung TBDMSCI 13 7 g 91 mmol 1 eq gegeben und Ih bei Raumtemperatur ger hrt Man verd nnt die Reaktionsmischung mit Ethylacetat und gie t in eine ges L sung NaHCO Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen und ber Na2SO4 getrocknet Durch Destillation bei 2 4 mbar erh lt man bei 53 58 C das Produkt als farbloses l Ausbeute 12 1 g 68 6 mmol 76 R Wert Cyclohexan Ethylacetat 7 1 v v 0 26 H NMR CDCI3 400 MHz 5 3 98 t 2H H 1 3 72 t 2H H 2 1 0 s 9H tButyl CH 0 08 s 6H Si CH3 C NMR CDC13 100 6 MHz 8 69 9 C 2 68 7 C 1 22 5 Butyl CH3 15 3 Butyl C 0 8 Si CHs3 CgH2902Si 176 33 2 Benzyloxy ethanol 71 Zu einer Suspension von 2 90 g NaH in 200 ml abs THF werden langsam 7 36 ml Ethylenglykol addiert Nach 30 min R hren bei Raumtemperatur wird Benzylchlorid 7 6 ml 8 36g 1 quivalent und eine katalytische Menge TBAI zugegeben und zum R ckfluss erhit
86. 02 B Thr 82 B Ser 600 B 5 Trp 106 B Gly 86 B Trp 604 B 6 Tyr 205 Val 135 Ser 516 B Tabelle 14 Unterschiede in den Prenylbindungstasche der GGTase I GGTase II und PFT Lars Kissau 4 Spezieller Teil 117 Der L nge des Geranylgeranylrestes erfordert die Substitution von Trp 102 B und Trp 106 B in der PFT durch kleinere Reste in den Geranylgeranyltransferasen Zeilen 4 und 5 Hierdurch ist die Prenylbindungstasche tiefer Dies kann f r das Design von Inhibitoren ausgenutzt werden die zwischen GGTase I und II einerseits und PFT andererseits differenzieren k nnten Eine Differenzierung zugunsten der PFT w re hingegen nur m glich wenn z B die Substitution des Ala 151 B in der PFT gegen das Leu 648 B der GGTase II ausgenutzt w rde Zwischen Prenylbindungstasche und Carboxylatbindungstasche finden sich bei der PFT und GGTase II ein Arginin In der GGTase I wird diese Position durch ein Cystein besetzt so dass auch dieser Bereich zur Verbesserung der Selektivit t von Inhibitoren verwendet werden kann Die Pyrophosphatbindungstasche hingegen ist in allen Enzymen nahezu identisch Dieser Bereich kann daher nur als Quelle von Affinit t nicht aber von Selektivit t dienen Daraus k nnten folgende Eigenschaftsprofile f r selektive Inhibitoren abgeleitet werden PFT Eine sehr polare Gruppe oder ein freies Carboxylat f r die Bindung in der Carboxylat Bindungstasche der PFT gepaart mit einem kleineren hydrophoben Rest zur B
87. 1 9 133 31 110 180 B N834 ND Val C O 1 9 1 9 147 25 150 180 A IGF1R 101 M1079 N H C O 1 92 1 9 147 55 150 180 A E1077 C O OH 2 68 1 9 138 63 110 180 B D1083 N H Val OH 1 97 1 9 163 56 150 180 A D1083 OD Val OH 2 00 1 9 125 26 110 180 A Tie 2 99 A905 N H C O 1 89 1 9 167 23 150 180 A VEGFR 2 98 E562 C O OH 2 43 1 9 139 35 110 180 B C563 N H C O 1 98 1 9 172 19 150 180 A Ser N568 N H OH carb 2 97 1 9 107 78 90 130 B L840 Ser OH 2 24 1 9 127 48 110 180 B ErbB 2 6 Met82 BBNH C O 2 175 1 9 163 47 150 180 Lars Kissau 8 9 Tabellen der Wasserstoffbr cken 222 Ser9 BBNH SerCO2H 1 892 1 9 133 06 150 180 A Asp144 CO2H SerCO2H 2 455 1 9 132 47 110 180 B Arg130 BBCO SerOH 1 805 1 9 140 42 110 180 A Asn131 CONH SerOH 2 985 1 9 142 2 110 180 B IGF1R 100 Met1079C O CO2H 3 18 1 9 132 98 110 180 B GLY1003NH CO2H 2 914 1 9 154 46 150 180 B ASP1083CO2H OH 1 84 1 9 111 5 110 180 A ASN1137C O CO2H 1 84 1 9 107 92 110 180 A LYS1030 Chinon 1 64 1 9 142 11 150 180 B ASP1150CO2H OH 2 69 1 9 58 71 110 180 B ASP1150CO2H NH 1 96 1 9 141 1 110 180 A Tie 2 104 Glu hinge C O NH 2 14 1 9 129 31 110 180 A ALA hinge NH CO 1 91 1 9 162 71 150 180 A ASN rib R O R 1 97 1 9 157 22 90 130 B VEGFR 2 104b Glu hinge NH 2 28 1 9 112 12 110 180 A CYS hinge C O 2 19 1 9 123 22 150 180 ASN rib R O R 1 99 1 9 171 2 90 130
88. 14 86 g 73 9 mmol 72 d Th eines farblosen ls Dichlor N N diisopropyl phosphoramidit das weiter umgesetzt oder bei 30 C bis zu 6 Wochen gelagert werden kann 2 0 g 10 mmol Dichlor N N diisopropyl phosphoramidit werden in 10 ml abs THF gel st und bei 0 C in 15 min mit einer L sung von 3 93 g 20 mmol Fluorenylmethanol und 5 0 ml 30 mmol N Ethyldiisopropylamin in 70 ml THF versetzt Man r hrt weitere 30 min bei Raumtemperatur verd nnt mit 300 ml Ethylacetat und extrahiert mit pH 7 0 Phosphatpuffer 3 mal mit je 50 ml Die organische Phase wird mit ges NaCl L sung gewaschen ber Na gt SO getrocknet und im Vakuum eingeengt Nach Flash Chromatographie an deaktiviertem Kieselgel 10 Triethylamin Eluent Cyclohexan Ethylacetat Triethylamin 20 1 1 v v v erh lt man ein blassgelbes hochviskoses l Ausbeute 2 5 g 4 8 mmol 48 d Th Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat 20 1 v v 0 21 H NMR CDCL 400 MHz 8 7 78 t 4H Fm J 6 84 Hz 7 72 7 65 m 4H Fm 7 45 7 36 m 4H Fm 7 33 ddd 4H Fm J 1 17 Hz J 7 63 Hz J 15 05 Hz 4 12 t 2H H 2 H 7 J 7 04 Hz 4 06 dt 2H H 1 J 6 65 Hz J 9 78 Hz 3 86 dt 2H H J 7 23 Hz J 9 97 Hz 2 40 br s 2H CH CH3 1 20 d 6H CH CH3 J 6 84 Hz BC NMR CDCL 100 6 MHz 8 141 9 C 8a C 9a 137 1 C 4a C 4b 128 9 128 9 127 3 126 5 C 1 C 2 C 3
89. 2 Auswahl von Templatstrukturen Da die Qualit t des Homologiemodells auch von der Wahl des geeigneten Templates abh ngt wurde zun chst untersucht welche der zug nglichen Kristallstrukturen aktivierter Kinasen verwendet werden k nnten Die Einteilung der Rezeptor Tyrosin Kinasen in Familien erfolgt wie eingangs erw hnt nach dem Aufbau der extrazellul ren Dom ne Da diese f r die vorliegende Arbeit nicht von Interesse ist wurden die Templatstrukturen anhand maximaler Sequenzhomologie innerhalb der Kinasedom nen ausgew hlt Von den kristallisierten Kinasen mit hinreichend hoher hnlichkeit zu den gegebenen Prim rsequenzen liegen von der Kinasedom ne des FOE Rezeptors und des IGF1 Rezeptors Strukturen vor welche die Kinase in einem aktivierten Zustand zeigen Sequenzvergleich 80 0 70 0 60 0 50 0 B Identit t zu FGFIR E hnlichkeit zu FGF1R O Identit t zu IGF1R 30 0 O hnlichkeit zu IGF1R 20 0 10 0 0 0 40 0 Prozent ErbB 2 Tie 2 VEGFR 2 VEGFR 3 Kinasen Abbildung 49 Vergleich der Prim rsequenzen von ErbB 2 Tie 2 VEGFR 2 VEGFR 3 mit den Templatsequenzen der IGF1 und FGF1 Rezeptoren Mit dem Programm BLAST wurden f r Prim rsequenzen der Kinasedom nen von Tie 2 VEGFR 2 VEGFR 3 und ErbB 2 die prozentuale Identit t und hnlichkeit jeweils zur Kinasedom ne des FGF1 Rezeptors und IGF1 Rezeptors errechnet F r
90. 23 H NMR CDCL 400 MHz 5 7 41 dd 1H arom J 1 98 Hz J 7 33 Hz 7 21 d 1H arom J 1 98 Hz 6 59 d 1H arom J 7 33 Hz 3 95 s 3H OCH 3 CsHs0O 168 15 Die analytischen Daten stimmen mit Literaturwerten berein 3 4 Bisallyloxybenzoes uremethylester 21 Es werden 150 mg 0 89 mmol 3 4 Dihydroxybenzoes uremethylester und 1 25 g 8 9 mmol wasserfreies KCO in 25 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran suspendiert und unter Argon mit 1 5 ml 17 8 mmol Allylbromid versetzt Man erhitzt 14 h zum R ckflu Der Reaktionsverlauf wird mittels GCMS kontrolliert Ist der Umsatz vollst ndig l t man langsam abk hlen Nach dem Abk hlen wird die gelbliche Suspension mit Ethylacetat verd nnt und mit ges NaCl L sung extrahiert Die organischen Phasen werden ber Na5SO4 getrocknet und eingeengt Man erh lt einen schwach gelben Feststoff Ausbeute 183 mg 0 74 mmol 83 d Th Smp 120 122 C R Wert Cyclohexan Ethylacetat 4 1 v v 0 41 H NMR CDCl 400 MHz amp 7 68 dd 1H arom J 2 06 Hz J 8 42 Hz 7 58 d 1H arom J 2 06 Hz 6 89 d 1H arom J 8 42 Hz 6 06 5 91 m 2H CH CH CH 5 53 5 44 m 4H CH CH CH 4 62 4 68 m 4H CH CH CH 3 3 75 s 3H OCH3 C NMR CDCL 100 6 MHz 168 2 C O 153 1 C 4 147 8 C 3 138 5 137 9 CH gt CH CH 3 124 8 C 1 123 7 C 6 117 2 C 2 116 1 C 5 115 9 115 2 114 3 CH gt CH Ch 73 9 O CH2 CH CH z
91. 4 und der Wechselwirkung mit Phe 835 d rfte 101 den Nucleotide Binding Loop von Tie 2 in einer Konformation stabilisieren wie sie in Abbildung 58 gezeigt et TTT Diese zus tzliche Bindungsenergie erkl rt auch warum hier das Analogon mit L Valin nicht aktiv ist Bei der f r die Bildung der Wasserstoffbr cke erforderlichen Drehung des Valin Restes k me es zu einer sterischen Absto ung mit dem Nucleotide Binding Loop Die gleichen Wasserstoffbr cken und hydrophoben Wechselwirkungen wie sie im Komplex von Tie 2 und 101 auftreten finden sich auch im Komplex von IGFIR und 101 Wie aus Tabelle 5 Zeile 10 ersichtlich entspricht Ala 981 aus Tie 2 das Gly 1149 in IGFIR Eine TTT Die unterschiedlichen Konformationen der Nucleotide Binding Loops der Tie 2 Modelle A und B sind auch aus den Abbildungen in Anhang IV ersichtlich Lars Kissau 4 Spezieller Teil 83 sterische Absto ung wie bei VEGFR 2 wird daher auch nicht beobachtet Analog zu Tie 2 findet durch die Wasserstoffbr cke zu Ser 1006 im Nucleotide Binding Loop von IGFIR eine Verst rkung der hydrophoben Wechselwirkung des Dekalins mit Phe 1007 statt Die 18 fach st rkere Inhibition von IGFRIR durch 101 verglichen mit Tie 2 k nnte auf st rkere Wechselwirkungen mit den Aminos uren in der hydrophoben Tasche zur ckzuf hren sein siehe hierzu Abschnitt 4 2 6 2 Aus den gezeigten Bindungsmodus ergibt sich auch warum das Analogon zu 101 mit L Valin IGFIR nicht inhibiert Zur Bindung
92. 40 ml CC gegeben und die L sung zum R ckfluss erhitzt Gleichzeitig wird mit einer 200 W Wolfram Lampe belichtet Nach 3 h wird die Reaktion auf Raumtemperatur abgek hlt filtriert und eingeengt L ngere Reaktionszeiten sind zu vermeiden Dibromierung Man erh lt ein oranges l Produkt Edukt 7 2 Eine saubere Trennung von Edukt und Produkt ist nicht m glich daher wird das Rohprodukt 3 Bromomethyl benzoic acid tert butyl ester ohne weitere Aufreinigung direkt weiter umgesetzt Zwei quivalente Triallylphosphit und 8 89 g 30 5 mmol Brombenzoes uretert butylester werden ohne L sungsmittel unter Argon auf 80 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 179 C erhitzt Nach 18 h wird bersch ssiges Triallylphosphit im Vakuum abdestilliert und der R ckstand durch Chromatographie an Kieselgel Cyclohexan Ethylacetat 1 1 gereinigt Ausbeute 7 28 g 20 66 mmol 67 7 d Th Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat 1 1 v v 0 34 H NMR CDCL 400 MHz 5 7 68 m 2H H 2 H 6 7 28 d 1H H 4 J 7 62 Hz 7 14 t 1H H 5 7 62 Hz 5 65 d 2H CH CH CH J 5 44 Hz Jz 10 92 Hz Jp 16 61 Hz 5 08 ddd 2H CH gt CH CH Jr 16 61 Hz J 2 16 Hz J 0 96 Hz 4 95 dd 2H CH CH CHh Jz 10 92 Hz J 0 96 Hz 4 24 m 4H CH gt CH CH 3 04 d 2H Ph CH gt P use 21 68 Hz 1 38 s 9H C CH3 3 C NMR CDCI 100 6 MHz 5 165 1 C O 136 3 C 3 133 5 CH CH CH 132 6 Ph CH gt P 132 0 C 4 131
93. 44 Hz J 21 28 Hz 7 25 m 4H C 2 C 7 4 29 t 4H H 1 J 6 45 Hz 4 16 t 2H P O CH gt CHb J 6 64 Hz 4 08 m 2H P O CH CHp 3 90 s 2H O CH gt CO R 3 65 t 2H H 9 J 6 45 Hz 1 44 s 9H C CHs3 3 C NMR CDCl 100 6 MHz amp 169 5 C O 143 5 C 8a C 9a 141 6 C 4a C 4b 128 1 C 1 C 8 127 3 C 2 C 4 125 4 C 5 C 7 120 2 CAT C 6 81 9 C CH3 3 70 3 d C 1 enz 6 92 Hz 69 5 d CH gt CH gt O P Jc p 6 51 Hz 69 0 O CH COoR 67 0 d CH gt CH gt O P Jc p 6 15 Hz 48 2 d C 9 Jc p 7 69 Hz 28 3 C CHs 31P NMR CDCl 202 5 MHz 8 0 47 C36H3707P 612 6485 FAB MS 3 NBA 613 4 M H 12 HRMS FAB 3 NBA berechnet f r C36H3g07P 613 6565 gefunden 613 6582 2 Bis I9H fluoren 9 ylmethoxy phosphoryloxy ethoxy essigs ure 75 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 184 Zu einer L sung von 706 mg 1 14 mmol 74 in 20 ml abs Dichlormethan und 0 4 ml Triethylsilan werden bei Raumtemperatur unter Argon 20 ml TFA gegeben Nach 2 h ist laut TLC das Edukt quantitativ umgesetzt Man verd nnt mit 30 ml Toluol und entfernt die fl chtigen Bestandteile im Vakuum Das Rohprodukt wird mit Dichlormethan Methanol 95 5 an Kieselgel chromatographiert Man erh lt einen farblosen Feststoff Ausbeute 584 4 mg 1 05 mmol 92 d Th Smp 68 69 C Rre Wert Dichlorme
94. 50 IC50 Apoptose uM uM Inhib Konz 1 9 S 2 112 2 2 118 e e S Q s 3 116 S a sl e Ge gt 30 f N SO H be s 4 117 a aa F gt 30 G N 5 119 a OH gt 50 57 i 6 120 Gen OH gt 50 6 4 508 100 b L 7 121 ee OH gt 30 100 g L S an Pew aer OH gt 30 100 d 9 113 eee OH z gt 30 100 e Sg 10 110 Sa OH 93 57 f f 11 124 Fm g OH 16 0 SMe ch 12 125 42 4 Lars Kissau 8 10 Bibliothek von Pepticinnamin E Analoga 225 13 126 h 14 127 h 15 128 h x 16 114 om NS m CT 18 130 EES 19 131 k 20 132 k 21 133 22 134 O Sg ae OH H o OAI OH gt 50 gt 50 5 3 gt 50 gt 50 gt 30 6 7 gt 30 gt 30 gt 30 gt 30 gt 30 Fluorescence Test mit Batten PETIT PRadioaktivit tstest mit humaner PET keine Inhibition bei 200 uM Konzentration keine Inhibition bei 50 uM Substanzkonzentration 57 Inhibition bei 50 uM Substanzkonzentration keine Apoptose ei 100 uM SubstanzKonzentration Apoptose bei 50 uM Substanzkonzentration Apoptose bei 100 uM Substanzkonzentration Teil 2 OH OILS S i N OH N N H oz YY Nr Verbindu R R R R PFT PFT MDCK B ng ICs ICs Apoptose uM uM Inhibitor Konz 1 135 x D Me H gt 50 gt 30 D HOPh i 2 136 i HOPh D H H an n 3 137 i HOPh H OH gt 30 4 138 i HOPh L H OH gt 30 Lars Kissau 8 10 Bibliothek von Pepticinnamin E Analoga 226 5 139 i Ph
95. 5J 0 59 Hz 7 32 ddd 1H H 5 2 J 8 21 Hz J 7 63 Hz J 0 59 Hz 7 24 ddd 4H H 2 H 7 J 15 45 Hz J 7 63 Hz J 1 17 Hz 7 26 m 1H H 4 5 99 m 1H CH2 CH CH 5 3 ddd 1H CH gt CH CH J 1 56 Hz J 17 20 Hz 7J 2 54 Hz 5 27 ddd 1H CH gt CH CHb J 1 17 Hz J 10 32 Hz 7J 2 54 Hz 4 81 dt 2H CH gt CH CH J 5 87 Hz J 1 56 Hz 4 36 dd 4H Fm CH J 6 06 Hz J 1 17 Hz 4 14 t 2H C 9 J 6 06 Hz C NMR CDCI 100 6 MHz 165 3 C O 150 70 C 3 143 0 C 8a C 9a 142 98 C 4a b 141 67 CH2 CH CH z 132 2 C 1 130 0 C 1 C 8 127 9 C 5 127 6 C 2 C 7 127 3 C 4 C 5 124 7 C 3 C 6 121 4 C 6 120 2 C 4 118 8 CH2 CH CH 117 5 C 2 70 2 Fm CH3 66 1 CH2 CH CHz 48 0 C 9 31P NMR CDCI 202 2 MHz 8 0 68 C38H3106P 614 62 FAB MS 3 NBA 614 7 M H 3 4 Bis 9H fluoren 9 ylmethoxy phosphoryloxymethyl benzoes ure 61 220 mg 1 45 mmol 4 Hydroxymethylbenzoes ure und 203 mg 2 9 mmol frisch getrocknetes Tetrazol werden in 17 ml abs Acetonitril gel st und langsam mit einer L sung von 756 mg 1 45 mmol Amidit in 3 ml abs Methylenchlorid versetzt Nach 4 h R hren bei Raumtemperatur werden bei 30 C langsam 580 ul 2 9 mmol einer 5M L sung von tBuOOH in Decan zugetropft und 1 h bei Raumtemperatur ger hrt Die Reaktionsmischung Lars K
96. 6 112 64 C 10 112 60 C 13 75 8 C 8 C 11 Cou 234 25 EI MS 70 ev 234 M 100 217 M OH 7 193 M Allyl 26 163 18 153 M 2 Allyl 8 91 C7H7 6 41 Allyl 92 6 Chloro pyridine 3 carbonyl aminoessigs ure tert butylester 18a 80 mg 0 51 mmol 6 Chlornicotins ure werden in 5 ml abs Dichlormethan gel st und bei Raumtemperatur mit 194 mg 0 51 mmol HATU und 350 ul 1 53 mmol N Ethyldiisopropylamin versetzt Nach 4 min wird eine L sung von 95 mg 0 56 mmol Glycin tert butylester hydrochlorid in 5 ml abs Dichlormethan zugegeben und 3 h bei Raumtemperatur ger hrt Man verd nnt mit 50 ml Ethylacetat und w scht zwei mal mit 50 ml ges NaCl L sung und einmal mit 50 ml destilliertem H20 Die organische Phase wird ber Na gt SO getrocknet und im Vakuum eingeengt Das Rohprodukt wird durch Flash Chromatographie Cyclohexan Ethylacetat 3 1 v v gereinigt Man erh lt einen farblosen Feststoff Ausbeute 131 mg 0 48 mmol 95 d Th Smp 114 115 C Zersetzung Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 163 Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat 1 1 v v 0 61 H NMR CDCL 400 MHz 5 8 73 dd 1H Aromat C 6 J 0 59 Hz J 2 54 8 03 dd 1H Aromat C 4 J 2 54 Hz J 8 21 Hz 7 34 dd 1H Aromat C 3 J 0 59 Hz J 8 21 Hz 6 77 t 1H N H J 4 89 Hz 4 06 d 2H Gly CH J 4 89 Hz 1 43 s 9H tert Butyl CHs3 BC NMR CDCL 100 6 MHz 5 169 1 C O Ester
97. 68 233 239 Bargmann C I Hung M C Weinberg R A Nature 1986 226 230 Beerli R R Wels W Heynes N E J Biol Chem 1994 269 23931 23936 Cheatham B Vlahos C J Cheatham L Wang L Blenis J Mol Cell Biol 1994 14 4902 4911 Okada T Kawano Y Sakakibara T Hazeki O Uli M J Biol Chem 1994 269 3568 3573 Slamon D J Leyland Jones B Shak S Fuchs H Paton V Bajamonde A N Engl J Med 2001 344 783 792 Wittinghofer A Waldmann H Angew Chem Int Ed 2000 39 4193 4214 Schimmoller F Simon I Pfeffer S R J Biol Chem 1998 273 22161 22164 Leonard D M J Med Chem 1997 40 2971 2990 Schweins T Geyer M Scheffzek K Warshel A Kalbitzer H R Wittinghofer A Nature 1995 2 36 44 Cepus V Scheidig A J Goody R S Gerwert K Biochemistry 1998 37 10263 10271 Maegley K A Admiraal S J Herschlag D Proc Natl Acad Sci 1996 93 8160 8165 Scheffzek K Ahmadian M R Kabsch W Wiesmuller L Lautwein A Schmitz F Wittinghofer A Science 1997 277 333 338 Zor T Halifa I Kleinhaus S Chorev M Selinger Z Biochem J 1995 306 253 258 Zor T Baryaacov M Elgavish S Shaanan B Selinger Z Eur J Biochem 1997 249 330 336 Zor T Andorn R Sofer I Chorev M Selinger Z FEBs Lett 1998 433 326 330 Ahmadian M R Zor T Vogt D Kabsch W Selinger Z Wittingho
98. Alanin Prolin Phenylalanin Methionin Isoleucin und Glycin eine gro e Zahl von Peptiden synthetisiert und gescreent werden Hydrophobe aromatische und aliphatische Aminos uren sowie positiv und negativ geladene Reste werden hier erg nzt durch Prolin und Glycin die die Zahl der zug nglichen Konformationen beeinflussen Damit ist ein breites Spektrum m glicher Interaktionen mit dem Rezeptor abgedeckt F r die Split Mix Synthese von Pentapeptiden ergeben sich daraus 32768 verschiedene Sequenzen Diese Zahl schlie t die tt RafRBD ist die Ras Binding Domain des Raf Proteins Diese wurde hier mit dem Farbstoff Alexa 488 gelabelt Lars Kissau 4 Spezieller Teil 39 Isolierung und Einzelcharakterisierung aller Peptide und damit die Anwendung des von Dipl Biol R Gail entwickelten Fluoreszenz Assays mit Alexa488 markiertem RafRBD aus Neben den Synthesen war daher ein neuer Assay zu etablieren Der von M Marshall et al erbrachte Nachweis dass von Raf abgeleitete Peptide an Ras binden k nnen best tigt den Ansatz dieses Projektes Gleichzeitig ist dies jedoch Hinweis darauf dass selbst ein von Hydrolyse unabh ngiger Affinit ts Assay die Peptide die in der N he von GTP binden nicht von solchen Peptiden unterscheiden kann die in einer anderen flachen Kerbe auf der Ras Oberfl che binden Die von Marshall et al synthetisierten Peptide binden offenbar nicht in der GTP Bindungstasche Es musste daher sichergestellt werden dass di
99. Die vorminimierten Inhibitoren wurden gem AAV MMIO in das aktive Zentrum der jeweiligen Kinasen gedockt Die sonstigen Eingaben sind hier am Beispiel Nakijichinon und ErbB 2 exemplarisch dargestellt WitnotP Read xpdb erb_model09 pdb Read xpdb NakiC pdb Move molecule erb_model09 pdb erb done Move molecule NakiC pdb INHB done lt use INHB siehe AAV MM 10 freeze INHB done freeze erb done Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 2 202 move molecule INHB erb done lt pdb2c erb siehe AAV MM Unix Minharmfix_run erb siehe AAV MMS5 Bei den von 1FGI abgeleiteten Modellen reicht ein Radius von 5 A aus so dass hier gem AAV MM4 mit minim run model x gearbeitet wurde Vor den Minimierungen muss in jedem Fall eine Kontrolle der Parameter f r Histidine und Lysine erfolgen Ebenso ist die Protonierung von Asparaten und Glutamaten zu kontrollieren Berechnung der Volumina der hydrophoben Taschen Zun chst werden die Proteinstrukturen auf m gliche Taschen untersucht und gem AAV MM21 mit Wassermolek len ausgef llt Als Begrenzung der hydrophoben Tasche wird eine Ebene definiert durch F1007 Ca F1007 C M1076 Ca und M1076 N verwendet Die Angaben beziehen sich auf die 1IR3 pdb Strukur Bei anderen Kinasen wurden die entsprechenden Atome verwendet Alle PASS Pseudo Atome Probe Spheres innerhalb der so definierten Begrenzung werden in WitnotP als separates Molek l definiert WitnotP Copy atoms Ps
100. Enzyme erweitert werden Neben der Entwicklung von Werkzeugen zum Studium zellul rer Prozesse sollten dabei auch die Grundlagen f r die Entwicklung von Wirkstoffen f r die Signaltransduktionstherapie gelegt werden In den vier Teilprojekten dieser Arbeit sollten die Erkenntnisse auf dem Gebiet der Signaltransduktion erweitert und im Bohr schen Sinne auch rationalisiert werden F r die einzelnen Projekte sollen daher neben chemischen Methoden auch Rechner gest tzte Verfahren zur Erreichung der folgenden Ziele verwendet werden 3 1 GTPase Aktivatoren Ein potentieller Angriffspunkt der Signaltransduktionstherapie ist die Switch Off Reaktion des Ras Proteins W hrend f r die Entwicklung von Wirkstoffen und Werkzeugen bei den unter in Kapitel 4 2 und 4 3 beschriebenen Projekten Naturstoffe als biologisch validierte Startpunkte bekannt sind muss bei der Entwicklung eines Ras GTPase Aktivators eine Leitstruktur erst entwickelt werden Gem der in Abbildung 12 gezeigten Vorgehensweise zur Identifikation der Schl sselstellen auf der Proteinoberfl che sollen hierf r Peptide als Sonden zum Einsatz kommen PT Auf dieser Stufe sind Molecular Modelling Arbeiten zur Unterst tzung und Beschleunigung einzusetzen Durch die Verwendung von Methoden der kombinatorischen Chemie erg nzt durch Molecular Modelling Studien soll somit eine erste Leitstruktur f r ein Ras GAP ersetzendes kleines Molek l ermittelt werden Der prim re Fokus dieses Proje
101. Ethylacetat 1 1 v v 0 19 H NMR CDC1 400 MHz 7 52 dd 1H H 6 J 1 56 Hz J 0 98 Hz 7 49 7 47 m 1H H 2 7 21 H 5 7 00 ddd H 4 J 0 98 Hz J 2 54 Hz J 8 21 Hz 5 95 m 1H CH CH CH 5 34 ddd 1H CH gt CH CH J 1 56 Hz J 17 20 Hz J 3 01 Hz 5 21 ddd 1H CH2 gt CH CHb J 1 37 Hz J 10 35 Hz 7J 3 01 Hz 4 73 dt 2H CHb CH CH J 1 56 Hz J 5 67 Hz 4 28 dt 2H NC CH gt CH gt 0 J 6 06 Hz Ju p 8 02 Hz 2 75 dt 2H NC CH gt CH gt 0 J 6 06 Hz Jyp 1 17 Hz P NMR CDCl 202 5 MHz 2 1 Ci6Hi7N206P 364 29 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 173 Difluorenylmethyl N N diisopropyl phosphoramidit 52b 50 ml PCl werden mittels Durchleiten von Argon f r 30 min entgast und anschlie end unter striktem Feuchtigkeitsausschlu destilliert Eine L sung von 29 32 ml 21 02 g 207 74 mmol Diisopropylamin frisch ber KOH getrocknet in 80 ml abs Diethylether wird bei O C langsam in 30 min zu einer kr ftig ger hrten L sung von 22 19 ml 13 87 g 102 7 mmol PCl in 300 ml abs Diethylether zugetropft Es entsteht ein wei er Niederschlag Die Suspension wird weitere 2h bei 0 C ger hrt danach Ih bei Raumtemperatur Der Niederschlag wird mit einer Schlenk Fritte abgetrennt und das Filtrat im Vakuum bis auf ca 50 ml Volumen eingeengt Das Produkt wird durch Destillation bei 17 mbar Siedepunkt 74 76 C isoliert Man erh lt
102. Fmoc G Cs CO dann Piperidin DMF b Fmoc F HBTU DIEA dann Piperidin DMF c Fmoc A HBTU DIEA dann Piperidin DMF d 37 HBTU DIEA ei Piperidin DMF f GDP Im DMF 50 C g Pd PPh Morpholin DMF 4 1 4 6 7 Synthese des Spacers 35 Ein weiterer im Rahmen dieser Untersuchungen synthetisierter Spacer ist Verbindung 35 Aus der engen Verwandtschaft zur Benzyloxycarbonyl Schutzgruppe folgt die Labilit t von 35 gegen ber Hydrogenolyse bzw starken S uren Mit 35 w re eine Deblockierung aller N Termini auf einem Bead nach der biologischen Evaluierung m glich Ausgehend von 3 Hydroxymethylbenzylalkohol 78 wurde durch Umsetzung mit tert Butyldiphenylsilylchlorid und Imidazol im DMF der mono silylierte Alkohol 79 erhalten Durch Umsetzung mit Difluorenylmethyl N N diisopropyl phosphoramidit 52b konnte 80 quantitativ erhalten werden Versuche die Silylgruppe mit TBAF in THF zu entfernen f hrten zu kompletter Zersetzung Entsch tzung mit HF Pyridin ergab jedoch in 86 Ausbeute Verbindung 81 welche nach chromatographischer Reinigung mit Phosgen zur Reaktion gebracht und als Testreaktion mit L Phenylalaninmethylester zum Amid 83 umgesetzt werden konnte S Die Synthesen dieses Spacer wurden parallel zum Screening der nachfolgend beschreibenen Bibliothek durchgef hrt Der Linker wurde noch nicht eingesetzt sollte aber f r zuk nftige Bibliotheken den Vorteil bieten dass bei der Edman Sequenzierung keine eventuell st rende Spezies au
103. GTP kompetitiver Inhibitoren die den Wechsel in die aktive Konformation verhindern sollten ist aufgrund der millimolaren Konzentration von GTP in der Zelle und dessen hoher Affinit t Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 16 zu Ras Ka 10 pM nicht praktikabel Des Weiteren w re hier die M glichkeit zur Differenzierung zwischen verschiedenen GTP bindenden Proteinen aufgrund des hohen Konservierungsgrades der beteiligten Aminos uren stark eingeschr nkt und w rde zu einer Problematik f hren wie sie f r ATP kompetitive Kinaseinhibitoren bereits diskutiert wurde Die aus den Versuchen mit DABP GTP entstandene Idee einer Restoration der GTPase Aktivit t durch ein kleines Molek l das bei Mutanten des Ras Proteins die Rolle von GAP einnehmen k nnte unterliegt hingegen keinen solchen Einschr nkungen und wurde daher in einem weiteren Projekt in dieser Arbeit aufgegriffen Das Konzept eine durch Mutationen gest rte biologische Aktivit t eines Proteins durch ein kleines Molek l wiederherzustellen wurde bereits von P G Schultz et al sowie J T Koh et al realisiert Der entscheidende Unterschied zu diesem Projekt liegt darin dass in beiden F llen bekannte und sehr spezifische Bindungstaschen f r kleine Molek le durch Mutationen abgewandelt wurden und anschlie end ver nderte Liganden in diesen modifizierten Taschen binden konnten Um die GTPase Aktivit t von Ras zu verbessern ist jedoch die Bindung an der Oberfl che notwendig un
104. H J 7 04 Hz 31P_NMR CDCI 202 5 MHz 5 21 81 Cy9H35N6010P 658 60 ESI MS 659 8 M H 3 Phosphonomethyl serinyl phenylalanyl leucyl glycin 68 Die Synthese erfolgt analog zur Synthese von X HPLC Analytik folgt AAV 8 Methode A Nebenprodukte werden gem AAV 9 Methode A abgetrennt Ausbeute 12 mg 0 18 mmol H NMR CDCI 400 MHz 5 7 75 br s 1H H 6 7 72 7 67 m 1H H 2 7 53 7 42 m 2H H 4 H 5 7 35 7 18 br m 5H Phe 4 68 dd 1H Phe a H J 5 47 Hz J 7 43 Hz 4 62 t 1H Ser a H 3J 5 74 Hz 4 50 dd 1H Leu a H J 4 69 Hz J 10 36 Hz 3 95 m 4H Gly CH2 Ser B H 3 77 s 2H Ph CH P 3 45 3 40 m 2H Phe B H 1 80 1 70 m 1H Leu CH CH3 2 1 68 1 54 m 2H Leu H 0 89 d 6H Leu CH CH3 J 6 45 Hz 31P_NMR CDCl 202 5 MHz 28 72 C29H39N4010P 634 61 ESI MS 635 7 M H Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 187 3 Phosphonomethyl methionyl alanyl prolyl glycin 69 Die Synthese erfolgt analog zur Synthese von X HPLC Analytik folgt AAV 8 Methode A Nebenprodukte werden gem AAV 9 Methode A abgetrennt Ausbeute 10 mg 0 17 mmol H NMR CDCl 400 MHz amp 8 40 8 35 m 1H H 6 8 23 8 18 m 1H H 2 7 84 7 72 m 1H H 5 7 46 7 39 m 1H H 4 4 55 4 48 m 1H Ala aH 4 30 4 26 m 1H Met oH 3 85 3 75 m 1H Pro aH 3 71 3 65 m 2H Gly CH2 Pro H Met y H 2 10 s 2H Ph CH P 2 05 1 78 br m 7H Met CH Pro y H P
105. H3 gt CH 31P_NMR CDCI 202 5 MHz 8 5 d 1 P B P Jp p 17 84 Hz 9 8 d 1 P a P Inn 17 84 Hz CssH120N8010P2 1151 5688 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 188 GTP Spacer 36 TLFNG OH 702 mg Tentagel S NH gt Harz Novabiochem Beladung 1 13 mmol g 0 81 mmol NH2 Gruppen wird in 10 ml abs Dichlormethan suspendiert 423 mg 1 06 mmol des Allyllinkers 87 werden in 5 ml abs DMF gel st und mit 396 mg 1 04 mmol HBTU und 2 37 ml 2 12 mmol DIEA versetzt Nach 2 Minuten Voraktivierung wird diese L sung zu der Suspension von Tentagel in 5 ml Dichlormethan gegeben und 11 Stunden bei Raumtemperatur gesch ttelt Die Beladung betr gt gem AAV 4 0 63 mmol g Gem AAV 1 wurden mit HBTU und DIEA die Aminos uren Asparagin Trt N Phenylalan n F Leucin L und Threonin OtBu OH T und der Spacer 2 Bis 9H fluoren 9 ylmethoxy phosphoryloxy ethoxy essigs ure an das Harz gekuppelt Die Beladung nach der letzten Kupplung entspricht 0 34 mmol g 94 Ausbeute pro Kupplung Durchschnitt Nach dem Entsch tzen der Seitenketten mit TFA Dichlormethan TIPS 75 20 5 und Entfernen der Fluorenylmethylester gem AAV 4 wird das Harz mehrfach mit abs DMF gewaschen und 8 h ber frisch aktiviertem Molsieb 4A in abs DMF gesch ttelt Zu einem Drittel dieser Mischung wird die L sung des aktivierten GDP in DMF gegeben und 14h auf 50 C erhitzt Der Reaktionsfortschritt wird mittels Gel Phasen P NMR kontrolliert Da
106. I NH g O o 3 Conte Phe Phe N 2 H 4 e x i Ber o wi Con Phe Phe Phe N H x Abbildung 18 Synthese von Testverbindungen mit verschiedenen Kopfgruppen a HBTU DIEA DMF n Hexylamin R C H 3NH b SnCl x 2H 0 DMF c Fmoc Phe OH DIC DMAP d 2 x Fmoc Phe OH HBTU DIEA e Piperdin DMF f HBTU DIEA g SnCl x 2H 0 h TFA CH Ch Lars Kissau 4 Spezieller Teil 36 Die zur Guanidiniumgruppe isostere 6 Aminonicotins ure sollte ebenfalls als Kopfgruppe verwendet werden um Ladungen bei der GTP Hydrolyse kompensieren zu k nnen F r deren Einf hrung ist unter Anderem die Verwendung von 6 Chlornicotins ure und nachfolgende 102 Der direkte Einsatz von 6 Palladium katalysierte Aminierung eine g ngige Methode Aminonicotins ure w re zweifelsfrei eleganter und k rzer Vorversuche zeigten dass I Effekte des Ringstickstoffes und der Carbonylgruppe die Reaktivit t der prim ren Aminogruppe deutlich verringern Die Einf hrung einer Schutzgruppe war damit nicht erforderlich Problematisch im Bezug auf den Einsatz in der Festphasensynthese war die schlechte L slichkeit von 6 Aminonicotins ure in Dichlormethan DMF oder NMP Bei einer hohen Verd nnung ist unter Umst nden mit einer Verl ngerung der Reaktionszeiten und der m glichen Zunahme von Nebenreaktionen zu rechnen Verschiedene Kupplungsmethoden wurden untersucht wie die DIC oder EDC vermittelte Kupplung Da keine Racemisierungsgefahr bestand wurde anf
107. K 3K 3K K 3K 2K 2K K 3K K 3K K cons fix sele all and not segid INHB end force 50 0 mini conj rdiel nstep 9000 tolgrad 0 05 open write unit 42 card name 1_m pdb write coor pdb unit 42 close unit 42 Calculate interaction energy between protein and inhibitor cons fix sele none end interactions sele not segid INHB end sele segid INHB end 3K K 3K 2K K K K K 3K 3K 3K 3K 2K FI 3K 3K 3K FF FFIR FK K 3K FK FK K K AAV MM7 Minimierung einer Proteinstruktur Mit Einschr nkungen der Backbone Atome Anwendung Minimierung der Atome der Seitenketten einer Proteinstruktur Um eine Kollaps einer Tasche o zu vermeiden werden die Backbone Atome in ihren Anfangsposition mit einer zu ihrer Masse proportionalen Kraftkonstante zur ckgehalten Dies erlaubt geringf gige Bewegungen Ein hydrophobic collaps wird so vermieden Beschreibung Alle Backbone Atome werden mit einer virtuellen Feder zur ckgehalten Die Anweisung cons 2 0 mass bewirkt die Anwendung einer mit der Masse gewichteten R ckstellkraft d h ein Kohlenstoffatom wird mit 24 kcal mol A zur ckgehalten F r die Minimierung wird die Methode des Conjugate Gradient angewendet Skriptname Minfixbb_run Dauer 45 min Unix bin sh case in 1 sed s XXXX 1 hero work kissau charmm charmm_tempfixbb inp gt 1 inp charmm lt 1 inp gt 1 out 2 gt amp 1 echo witnotp host none lt lt EOF Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 142
108. Kinasedom nen von ErbB 2 VEGFR 2 Tie 2 und IGFIR berlagert und die Inhibitoren in die jeweiligen aktiven Zentren gedockt Auch die fehlende Inhibition von Tie 2 oder IGFIR durch Nakijichinon C bzw das C 2 Epimer ist auf sterische Gr nde zur ckzuf hren Nakijichinon C kann aufgrund absto ender Wechselwirkungen der C 2 Methylgruppe mit Met 1139 nicht an IGFIR binden Die Inhibition von IGFIR durch 98 wird durch absto ende Wechselwirkungen mit Met 1076 und Met 1051 verhindert St rende Wechselwirkungen sowohl von Nakijichinon C als auch dem C 2 Epimer insbesondere durch die C 4a Methylgruppe am Dekalinger st mit Ile 886 und Ile 902 von Tie 2 welche die hydrophobe Tasche im Vergleich zu VEGFR 2 verkleinern und deren Form ndern sind die Gr nde f r die fehlende Inhibition von Tie 2 durch diese Substanzen 4 2 5 2 Bindung von 101 and Tie 2 und IGFIR Analog zu den bisher analysierten Inhibitoren bindet auch 101 ber Wasserstoffbr cken an die Hinge Region der Rezeptor Tyrosin Kinasen Neben der Wechselwirkung mit Glu 903 und Ala 905 wird eine Wasserstoffbr cke zu Asn 909 gebildet Das Dekalinger st findet in der hydrophoben Tasche Platz Verbindung 101 inhibiert Tie 2 im niedrigen micromolaren Bereich zeigt aber zugleich keine inhibierende Wirkung auf VEGFR 2 VEGFR 3 oder ErbB 2 Die Numerierung bezieht sich auf Tie 2 Glu 903 entspricht Glu 917 in VEGFR 2 Die Substitution von Cys 919 VEGFR 2 f r Ala 905 findet sich i
109. Kombinatorische Festphasensynthese und Molecular Modelling Studien von Inhibitoren und Aktivatoren Signal transduzierender Enzyme Zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften im Fachbereich f r Chemie der Universit t Dortmund angenommene DISSERTATION von Diplom Chemiker Lars Kissau aus Karlsruhe 1 Gutachter Prof Dr H Waldmann 2 Gutachter Prof Dr P Eilbracht Tag der m ndlichen Pr fung 11 12 2002 Die vorliegende Arbeit wurde unter Betreuung von Prof Dr H Waldmann am Institut f r Organische Chemie an der Universit t Karlsruhe TH und an der Universit t Dortmund sowie am Max Planck Institut f r molekulare Physiologie Dortmund in der Zeit von Februar 1999 bis September 2002 angefertigt Meinen Eltern Susanne und Kathrin 1 Einleitung Eege 1 2 Allgemeiner Teil EE 2 2 1 Rezeplor Tyresin Kinasen aan an HE 3 SN ENEE 13 2 3 Entwicklung von Leitstrukturen und Optimierung von Inhibitoren e 18 3 Ziele der Arbeit EN 29 3 1 GTPase ne EE 29 3 2 Rezeptor Tyrosin inase Inhibitoren au Le 30 3 3 Farnesyltransferase Inhibitoren nuslsneefen een and na 30 4 8pezieller Tal 31 4 1 Entwicklung einer keitst ktur asus aaa 31 4 2 Rezeptor Tyrosin Kinase Inhibitoren 200 00 cecceeeescessseesseceseceeeceescecsaeeeeeeeseecaeeneeeeeeennees 65 4 3 Untersuchung einer Bibliothek von Pepticinnamin E Analog 92 5 Zusammenfassung und Ausblick
110. Lars Kissau 4 Spezieller Teil 106 Abbildung 73 a Pepticinnamin E rot CVIM Peptid gelb und FPP gr n im aktiven Zentrum der PFT b Seitliche Ansicht ohne Proteinoberfl che F r die Quantifizierung hydrophober Wechselwirkungen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neue Methode entwickelt die in leicht abgewandelter Form bereits bei der Analyse der Nakijichinon Analoga beschrieben wurde Basierend auf der Annahme dass die Farnesylpyrophosphat Bindungstasche der PFT f r FPP im Laufe der Evolution optimiert wurde wurde der Grad der berlappung des vdW Volumens des Inhibitors mit dem vdW Volumen von FPP als Ma f r die St rke der hydrophoben Wechselwirkung verwendet siehe auch Experimenteller Teil und gleichzeitig als Indiz f r eine FPP kompetitive Inhibition gewertet Ebenso unterlag die F higkeit der PFT eine CAAX Sequenz von anderen Sequenzen zu unterscheiden einem deutlichen Selektionsdruck Im Laufe der Evolution d rfte daher auch diese Bindungstasche optimiert worden sein Daher diente das Ausma der berlappung eines Inhibitors mit dem Peptid CVFM aus der Ratten PFT Kristallstruktur als Ma f r die St rke der Wechselwirkung mit der PFT sowie als Indiz f r eine m gliche Peptid kompetitive Wirkung Dieser Ansatz erlaubt eine separate Betrachtung beider Bindungsregionen W hrend bei der Beschreibung der hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Nakijichinon Analoga und Kinasen die hydrophobe Tasche von nat rlichen Substr
111. Mikromanipulator durchgef hrt werden da die Genauigkeit manueller Selektion f r die gegebene Beadgr e nicht ausreichend ist Gegen die Verwendung des konfokalen Mikroskops f r dieses Screening sprach das Fehlen eines Objektivs mit geringer Vergr erung sowie das Nicht Vorhandensein eines fein justierbaren Mikromanipulators Anstelle des konfokalen Laser Mikrokops wurde f r die Isolierung der Beads daher ein f r Mikroinjektionen gebautes Mikroskop mit Mikromanipulator verwendet Als Lichtquelle diente eine Quecksilber H chstdrucklampe Anstelle der computergesteuerten Photomultiplier wurde das inverse Mikroskop mit einem Cy5 Filtersatz versehen der auch f r die Untersuchung von Atto655 markierten Objekten geeignet ist F r die manuelle Selektion der Beads wurde an die Spitze des Mikromanipulators eine kleine Nylonschlinge Hampton Research Cryo Loop montiert Die Schlinge wurde unter optischer Kontrolle um die fluoreszierenden Beads gelegt und diese dann zun chst von den nicht fluoreszierenden Beads separiert Die so vereinzelten Beads wurden mit einer Pipette in ein Eppendorf SafeLock transferiert und dort gewaschen Lars Kissau 4 Spezieller Teil 59 Abbildung 40 Bilder der Split Mix Bibliothek Die fluoreszierenden Beads heben sich deutlich vom Rest ab der kein Atto655 Ras gebunden hat Durch Behandlung mit Guanidiumchorid Natrium dodecylsulfat und EDTA konnte das Protein von den Beads entfernt werden Durch Behandeln m
112. NON n ri o P O P 0 o gt N P O F 07 _ a o CDI JK O OH OH O_O 28 S 2 X 1 u o R P 0 O NH NH 7 d KA A KA A gg NN NH E V va R P O P 0 P O R P O P O P O 1 0 a oO O O O NEt 7 O OH OH 0 0 31 30 Yr O Abbildung 23 Neue Synthese von GTP Analoga Der durch C markierte Schnitt k nnte m glicherweise in zuk nftigen Projektstufen verfolgt werden z B f r die Synthese hydrolysestabiler GppNHp Analoga Lars Kissau 4 Spezieller Teil 42 Aus dieser Wahl der Verkn pfungsmethode folgt zwingend die allgemeine Struktur der Spacer die ber eine S urefunktion mit dem N terminus des Peptides gekuppelt werden sollten und gleichzeitig ber eine Phosphatgruppe die Reaktion mit aktiviertem GDP erm glichen sollten 4 1 4 5 Auswahl und Synthese der Spacer Abgesehen von der M glichkeit den Spacer in hohen Ausbeuten an das Peptid zu kuppeln sollte eine gewisse Flexibilit t des Spacers den Einfluss auf die Bindungskonformation der Peptide minimieren Der Spacer sollte des Weiteren durch eine Distanz von mindestens 4 C C Bindungen zwischen y Phosphat und Peptid der Rolle als Platzhalter f r die sp ter einzuf hrenden hydrolyseaktiven Gruppen gerecht werden Verschiedene Spacer Geometrien sollten dar ber hinaus unterschiedliche Positionen der Peptide an der Ras Oberfl che erm glichen Da die hier unerw nschte Hydrolyse von GTP durch Ras im Falle von 3 4 Diaminobenzophenon GTP durch den aromatisc
113. Online Stipendium von e fellows net
114. RI 3 kontrolliert Der zweite Entwicklungsschritt die Angiogenese h ngt von anderen Faktoren und Rezeptoren ab unter Anderem von Angiopoetin 1 einem Liganden f r die Rezeptor Tyrosin Kinase Tie 2 Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 10 Vasculogenese Angiogenese Ve VEGF VEGFR Hemangioblast ei 1 Proteolyse Hematopoiesie Endothelzelle Ki JL 2 Migration gt Zellteilung Einfaches Gef system 3 Reifung Differenzierung gee Endothelzelle a Abbildung 6 Schematische bersicht der Vasculo und Angiogenese Perizyt Angiogenese mn 2 1 3 1 VEGFR 2 KDR VEGFR 2 leitet Wachstumssignale auf den Ras Pfad ber die Bindung von Grb2 weiter Daneben bindet der aktivierte VEGF Rezeptor 2 auch PLCy und aktiviert ber die Aussch ttung von Diacylglycerin DAB und Inositoltriphosphat IP3 die Protein Kinase C Deren Bedeutung f r das Tumorwachstum f hrte wie bereits erw hnt zu intensiven Untersuchungen und der Entdeckung von Staurosporin 1 als PKC Inhibitor 2 1 3 2 VEGFR 3 VEGFR 3 ist insbesondere f r die Lymphangiogenese bedeutsam was diese Rezeptor Tyrosin Kinase in Anbetracht der Verbreitung von Metastasen ber das Lymphsystem zu einem ebenfalls hochinteressanten Target macht Kaipainen et al konnten zeigen dass dieser Rezeptor zun chst nur w hrend bestimmter Phasen der Entwicklung des menschlichen Embryos exprimiert wird und sp ter ausschlie lich im lymphatischen Gewebe zu finden ist Dies m
115. S ulendurchmesser 4cm H 15 cm 300 ml Cyclohexan Ethylacetat 9 1 dann 500 ml Cyclohexan Ethylacetat 1 1 danach 500 ml Ethylacetat erh lt man 820 mg eines farblosen ls Ausbeute 820 mg 2 17 mmol 60 d Th R Wert Cyclohexan Ethylacetat 1 1 v v 0 71 Cyclohexan Ethylacetat 9 1 v v 0 18 H NMR CDC 400 MHz 7 75 7 80 m 4H Aromat 7 40 7 52 m 6H Aromat 7 32 7 39 m 3H Aromat 7 26 7 32 m 1H Aromat 4 85 s 2H Ph CH2 O Si 4 69 s 2H Ph CH OH 2 05 s 1H OH 1 18 s 9H Si C CHs3 3 C NMR CDCl 100 6 MHz 5 141 6 C 1 141 1 C 3 135 89 Si Ph ortho 133 8 Si Ph meta 130 0 Si Ph para 128 7 C 5 128 0 C 4 125 6 C 6 124 9 C 2 65 8 CH gt 0O Si 27 2 Si C CH3 19 6 Si C CHs3 3 C24H2g02Si 376 56 FAB MS 3 NBA 377 8 M H 5 Phosphors ure 3 tert butyl diphenyl silanyloxymethyl benzyl ester bis 9H fluoren 9 ylmethyl ester 80 Zu einer L sung von 200 mg 0 52 mmol 79 und 74 mg trockenem Tetrazol in 7 ml abs Acetonitril werden bei Raumtemperatur in 2 min 3 ml einer L sung von 277 mg 0 53 mmol 52b in 3 ml abs Methylenchlorid getropft und 4 h ger hrt Der Reaktionsfortschritt wird mittels TLC kontrolliert Cyclohexan Ethylacetat 9 1 Anschlie end wird eine L sung von 5 quivalenten BuOOH in Decan bei 30 C zugetropft und die L sung 1 h bei Raumtemperatur ger hrt Man verd nnt die Reaktionsmischung mit 50 ml Ethylacetat und gie t in 50 ml 10
116. V MM3 als pdb Dateien abgespeichert Da PEP einen 3 Buchstaben Code verwendet wurden die Namen nach folgendem Schema vergeben LDA L Lars D D Aminos ure A Einbuchstabencode f r die Aminos ure hier Alanin Letztlich wurde auch die Struktur der y Aminobutters ure entsprechend gezeichnet und minimiert F r beide Histidin Enantiomere wurden jeweils die und e protonierten Formen eingegeben da eine Umprotonierung von PEP nicht durchgef hrt werden kann Die Definition drehbarere Bindungen Torsionwinkel und Berechnung der MPEOE Ladungen wurden mit WitnotP durchgef hrt Und die mit CHARMm rtf erstellten Dateien an die vorhandenen Monomere in der Strukturbibliothek PEP rtf angeh ngt Die im pdb Format abgespeicherten Koordinaten wurden in die Datei PEP coor eingef gt Als Beispiel sei hier das Vorgehen f r D Alanin gezeigt Alle anderen Monomere wurden auf analoge Weise in die Bibliothek eingef gt WitnotP Build fragment amino acids alanine get LDA done Invert center CA HA CB done lt prea LDA UNIX minall_ run LDA WitnotP delete molecule LDA done Read molecule xpdb LDA_m pdb done Move molecule LDA_m pdb LDA done Write xpdb LDA LDA done CHARMm psf LDA done Label charges MPEOE LDA done Mit den anderen Resten wurde in analoger Weise verfahren Da die in der Ras Struktur enthaltene GTP Struktur nicht Bestandteil der Standardbibliothek war musste dieser Rest ebenfalls auf die beschriebene Weise parame
117. Ward K W Kopple K D J Med Chem 2002 45 2615 2623 Hollosy F Lorand T Orfi L Eros D Keri G Idei M J Chromat 2002 768 361 368 Bell I M Gallichio S N J Med Chem 2002 45 2388 2394 Renil M Meldal M Tetrahedron Lett 1995 36 4647 4650 Kaiser E Anal Biochem 1970 34 595 598 Widmer A WitnotP ist ein Molecular Modelling Programm dass bei Novartis entwickelt wurde Aufbau und Funktion sind mit InsightlI von Accelrys Inc vergleichbar Cho K H Kang Y K No K T Scheraga H A J Phys Chem 2001 105 3624 3634 Claus Ehrhardt Novartis Pharma AG Pers nliche Mitteilung Vetter I Pers nliche Mittelung Casella L Gulotti M J Chem Soc Chem Comm 1991 22 1611 1612 Volkmer Engert R Hoffmann B Schneider Mergener J Tetrahedron Lett 1997 38 1029 1032 Lars Kissau 8 Anhang 202 8 Anhang Anhang I Anhang II Anhang III Anhang IV Anhang V Anhang VI Anhang VII Anhang VIII Anhang IX Anhang X Anhang XI Abk rzungen Strukturen von Kupplungsreagentien und Linkern Homologiemodell der PP2A Ribbon Diagramme der Kinasemodelle Ramachandran Plots der Kinasemodelle Whatcheck Analyse der Kinasemodelle Input Dateien f r Molecular Modelling Arbeiten PEP GOLD Inhaltsverzeichnis der beigef gten CD PDB Dateien der Modelle etc Tabellen der Wasserstoffbr cken zwischen Liganden und Rezeptoren Kombinatorische Bibliothek von Pepticinnam
118. Werten aus Tabelle 10 wird ersichtlich dass die optimierten Inhibitoren nicht nur ein besseres Ausf llen der beiden Taschen erreichen auch die vordere hydrophobe Lars Kissau 4 Spezieller Teil 112 Tasche wird von 162 belegt Nach Abschlu dieser Arbeiten wurden die Belegung dieser Tasche in unabh ngigen Arbeit von Schlitzer et al ebenfalls vorgeschlagen FPP CAAX vordere Optimierte Inhibitoren Tasche Tasche Tasche 160 FPP komp 62 32 0 161 Bisub 41 64 0 162 CAAX komp 0 51 25 Tabelle 11 Ausf llung von Bindungstellen in der PFT durch die vorgeschlagenen optimierten Inhibitoren Begrenzend auf die weitere Einf hrung lipophiler Reste wirkt das Ziel die L slichkeit zu verbessern Die vorgeschlagenen Strukturen stellen einen Kompromiss zwischen diesen Zielen dar 4 3 4 5 Verbesserung der L slichkeit in w ssrigen Medien Wenngleich die hohe Hitrate aus der Bibliothek von Pepticinnamin E Analoga ermutigend war sind die Resultate aus dem Apoptose Assay nicht eindeutig Die hier von Dr O M ller verwendeten MDCK 13 Zellen sollten eigentlich nur bei Beeinflussung des Ras Signalweges in einen programmierten Zelltod bergehen Verbindung CLogP 110 8 49 113 9 07 111 9 17 121 8 45 120 8 49 Tabelle 12 Inhibitoren die Apoptose von MDCK 13 Zellen ausl sen Wie aus Tabelle 12 ersichtlich weisen alle Verbindungen die im Zellassay Apoptose ausl sten
119. Xu X Murphy J E Chaindaroglou A Kantrowitz E R Biochemistry 1993 32 1603 1611 159 Hyvonen M Saraste M EMBO J 1997 16 3396 3401 160 Pan H Wigley D B Structure 2000 8 231 239 161 Bohm M Mitsch A Wissner P Sattler I Schlitzer M J Med Chem 2001 44 3117 3124 162 Scrutton N S Raine A R C Biochem J 1996 319 1 8 163 Cubero E Luque F J Orozco M Proc Natl Acad Sci 1998 95 5976 5980 164 Burley S K Petsko G A FEBS Lett 1986 203 139 143 165 Sakowski J Sattler I Schlitzer M Bioorg Med Chem 2002 10 233 239 166 Shiomi K Yang H Inokoshi J Pyl D v d Nakagawa A Takeshima H Omura S J Antibiotics 1993 46 229 234 167 Nummerierung J 168 Thern B Rudolph J Jung G Angew Chem Int Ed 2002 41 2307 2309 169 Thutewohl M Doktorarbeit Universitat Dortmund 2002 Lars Kissau 8 Anhang 209 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 Pompliano D L Gomez R P Anthony N J J Am Chem Soc 1992 114 7945 7946 Vedani A Dunitz J D J Am Chem Soc 1985 107 7653 7658 G rbitz C H Acta Cryst 1989 B45 390 397 Murray Rust P Glusker J P J Am Chem Soc 1984 106 1018 1023 Taylor R Kennard O Acc Chem Res 1984 17 320 329 Veber D F Johnson S R Cheng H Y Smith B R
120. Zellen durch die Expression sogenannter Survival Factors unterdr ckt Der IGF1 ist ein solcher Survival zur Zellmembran die nachfolgend die Glucoseaufnahme in die Zelle erleichtern Factor Die Rezeptor Tyrosin Kinase IGFIR bt die anti apototische Wirkung ber die Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 12 Phosphorylierung von Substraten aus die wiederum die Aktivit t von Mitgliedern der Bcl 2 Enzymfamilie modulieren Zwischen der Her 2 Kinase und dem IGFI Rezeptor besteht eine k rzlich entdeckte hochinteressante Verbindung Das von der Firma Genentech vertriebene Herceptin bindet als polyklonaler Antik rper an Her 2 Rezeptoren auf der Oberfl che von Krebszellen Es induziert dadurch eine Reihe von Folgeerscheinungen die zur Apoptose der Zelle f hren Die klinische Anwendung bei Her 2 berexprimierenden Brusttumoren wurde leider oft durch die Bildung von Resistenzen der Krebszellen gebremst K rzlich wurde gezeigt dass die anti apoptotische Wirkung des IGF1 vermittelt durch den in den Tumorzellen nach Herceptin Behandlung berexprimierten IGF1 Rezeptor f r diese Resistenzentwicklung verantwortlich ist Wird IGFIR durch einen Antik rper blockiert ist die Krebszelle wieder gegen Herceptin empfindlich Daraus folgt unmittelbar dass die Entwicklung eines IGFIR Inhibitors f r die Krebstherapie insbesondere bei Her 2 berexprimierendem Brustkrebs von gro er Bedeutung ist 2 1 4 Startpunkt der Untersuchungen Ausgangspunkt der in K
121. a b Abbildung 91 a berlagerung der Untereinheiten der GGTase I blau Homologiemodell GGTase II weinrot Kristallstruktur und PFT gr n Kristallstruktur b Modifikation eines PFT selektiven Inhibitors Die qualitativen Analysen der Bindungsmodi und Erkl rungen f r die beobachteten Selektivit ten der Nakijichinon und Pepticinnamin E Analoga wurden erg nzt durch quantitative Analysen Hierbei wurden sowohl Wasserstoffbriicken als auch hydrophoben Wechselwirkungen untersucht F r Erstere kann die St rke der Wechselwirkung durch Vergleich mit in der Literatur als optimal bewerteten Parametern beurteilt werden Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Verfahren verwendet zwei Ans tze 1 Basierend auf der Annahme dass die Bindungstasche eines Enzyms f r die Bindung des nat rlichen Substrates im Laufe der Evolution optimiert wurde wird die Wechselwirkung eines Inhibitors mit dem Zielenzym mit der Wechselwirkung zwischen Enzym und seinem nat rlichen Substrate verglichen Das Ausma in dem ein Inhibitor eine Bindungstasche belegt kann so bewertet werden Hierzu werden die van der Waals Volumina der Verbindungen verglichen Dieses Verfahren ist in Abbildung 92 graphisch dargestellt 2 Fehlt ein nat rliches Substrat als Referenz kann wie hier im Falle der Rezeptor Tyrosin Kinasen durchgef hrt das van der Waals Volumen einer hydrophoben Bindungstasche bestimmt werden Anschlie end wird Lars Kissau 5 Zusammenfassung
122. acht VEGFR 3 zu einem hochattraktiven Target f r anti Tumorwirkstoffe da Einfl sse auf andere Gewebe Nebenwirkungen nicht zu erwarten sind Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 11 2 1 3 3 Tie 2 TEK W hrend die Aktivierung von VEGFR 2 f r die Initiierung der Vaskulogenese und Angiogenese erforderlich ist f hrt die Aktivierung von Tie 2 zu Modifikationen von Zell Zell und Zell Matrix Interaktionen wodurch das die Gef e umgebende Gewebe ver ndert wird Diese Ver nderungen beinhalten die Aufl sung alter Strukturen der die Endothelzellen umgebenden Matrix wodurch erst Platz f r neue Gef e entsteht Tie 2 kontrolliert danach auch die Differenzierung der Zellen beim Aufbau von Strukturen die neue Blutgef e st tzen M glicherweise sind diese Effekte auf die in Anhang XI angedeutete Verbindung von Tie 2 mit der Fokal Adhesion Kinase FAK einem zentralen Element der Integrin abh ngigen Signalwege zur ckzuf hren Letztere sind f r Modifikationen von Zell Zell und Zell Matrix Interaktionen von gro er Bedeutung Neben der Inhibierung der VEGFRs um die Differenzierung von Endothelzellen zu unterdr cken ergibt sich aus dieser Rolle ein weiterer potenter Ansatzpunkt f r die Bek mpfung von Tumoren 2 1 3 4 ErbB 2 Die Bedeutung einer sorgf ltigen Regulation dieses gesamten Prozesses und insbesondere der Dimerisierung wird am Beispiel der ErbB 2 Rezeptor Tyrosin Kinase besonders deutlich ErbB 2 auch Her 2 Neu genannt bilde
123. aktiven Zentrum von Tie 2 F r die hier gezeigten Verbindungen wurde gem dem in Abschnitt 4 2 6 2 erl uterten Verfahren das Ausma bestimmt in dem die hydrophoben Taschen ausgef llt werden Verbindung 104a f llt die Tasche demnach zu 70 aus w hrend 104b die Tasche zu 55 ausf llt Das Hinzuf gen weiterer Substituenten am Naphthalinger st w re daher denkbar Erg nzt wird dieses Bild der Bindungsmodi von Nakijchinon Analoga durch den andersartigen Bindungsmodus von 100 Neben der in Abbildung 65 gezeigten M glichkeit der Einf hrung eines selektivit ts verbessernden hydrophoben Substituenten R 107 Lars Kissau 4 Spezieller Teil 91 k nnte diese auch ber Veresterung einer der beiden Carboxylatfunktionen eingef hrt werden 108 Auch hier w re eine Abkehr vom der chinoiden Struktur sinnvoll i Ch HN NH d DI 107 R HO o OH C H 100 a I N re ea S oo 108 R Abbildung 65 Modifikation von 101 als neue Leitstruktur Die Selektivit t k nnte durch Einf gen eines hydrophoben Restes blau gesteigert werden Die rot markierten Sauerstoffatome binden in der Triphosphatbindungsregion Lars Kissau 4 Spezieller Teil 92 4 3 Untersuchung einer Bibliothek von Pepticinnamin E Analoga Efficient library design is best achieved through dialogue between a combinatorial chemist and a computational chemist S Rose 4 3 1 Vor berlegungen Um die Wirkungsweise von Inhibitoren der PFT aufzukl ren ist zun
124. alb einer Wellenl nge von 620 nm durch ein HQ Cy5 Filterset der Firma AHF Analysentechnik Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 193 T bingen bestehend aus einem Anregungsfilter HQ 620 60 einem Strahlenteiler Q660 LP und einem Sperrfilter HQ700 75 herausgefiltert so dass im f r Atto 655 relevanten Bereich keine st renden Einfl sse auftreten Hierzu entfernt man den Standard Filter und Reflektorschieber und setzt den F41 008 HQ Cy 5 Filtersatz von AHF Analysetechnik ein Der Mikromanipulator des Axiovert 135 TV wird ber ein Ger t der Firma Zeiss gesteuert AIS Automated Injection System das normalerweise vorbereitende Manipulationen f r die Mikroinjektion vornimmt Die 50 W Hg H chstdrucklampe wird eingeschaltet der Shutter bleibt zun chst geschlossen Man pipettiert etwa 100 150 ul einer Suspension von Ras inkubierten PEGA Beads auf eine kleine Petrischale und befestigt diese auf dem Mikroskoptisch Der Rechner zur Steuerung des Mikromanipulators wird eingeschaltet und die Position des Mikroskoptisches kalibriert Achtung Der Mikromanipulator muss in der obersten Position sein da der Rechner den Mikroskoptisch zun chst automatisch bewegt Ein Hampton Research Cryo Loop 100 um Loop Durchmesser 5 um Dicke wird mit 2 cm Tesafilm umwickelt und in das Bohrfutter an der Spitze des Mikromanipulators eingespannt Der Fokus wird im Durchsichtmodus eingestellt anschlie end wird die obere Lampe abgedeckt und der Shutter der Hg La
125. altung gab Anlass dazu einen alternativen Linker der unempfindlich gegen ber Hydrolyse sein sollte zu entwickeln 52a R B Cyanoethyl CE 52b R Fluorenylmethyl FM f f 0 oO 0 oO DIE RO lO FmO p CT a P EN OF OR d 56 58 Abbildung 29 1 Synthese der Dialkoxyphosphoramidite 52a und 52b 2 Synthese der Spacer 56 und 58 a HniPr Et O b DIEA R OH THF c Allylalkohol PTSA Toluol R ckflu d 52b Tetrazol BuOOH e 52a Tetrazol BuOOH f Pd PPh Morpholin DMF Lars Kissau 4 Spezieller Teil 46 4 1 4 6 4 Synthese des para Benzylphosphatspacers 34 Anstelle des problematischen Phenyoxyphosphors urelinkers 33 sollte ein Linker der Struktur 34 eingesetzt werden da Benzylphosphate ber eine gr ere Stabilit t als Phenylphosphate verf gen Ausgehend von 4 Hydroxymethylbenzoes ure 59 konnte der Spacer 34 direkt durch Phosphorylierung mit 52b erhalten werden Die moderate Ausbeute von 32 gab jedoch Anlass zur Optimierung Durch Veresterung der Carbons urefunktion mit Allylalkohol zu 60 Phosphorylierung und nachfolgender Esterspaltung konnte die Ausbeute von 61 auf 59 ber 2 Stufen gesteigert werden el O HO E RS OH OH 59 60 b c O ge OF m O_ Porm O 61 Abbildung 30 Synthese des Spacers 34 a Allylalkohol PTSA Toluol R ckfluss b 52b Tetrazol CH Ch CH CN d 1 52b Tetrazol CH Cl CH CN 2 BuOOH 3 Pd PPh Morpholin DMF 4 4 6 5 Synthese des Arylph
126. antiert dass die GTP Peptidkonjugate nur im Bereich der GTP Bindungstasche binden W hrend bei der ersten Bibliothek die Affinit t der Peptide selbst die Messgr e war ist hier der Referenzpunkt die Affinit t von GTP bzw DABP GTP 7 zu Ras Die reduzierte Affinit t von DABP GTP 7 ist auf den st renden Einfluss der Substitution am y Phosphat zur ckzuf hren Bindet ein GTP Peptid Konjugat nun st rker an Ras so d rfte dies auf einen positiven Beitrag des peptidischen Teils zur ckzuf hren sein und R ckschl sse auf Peptidsequenzen erlauben die eine Affinit t in der N he der GTP Bindungstasche vermitteln 4 1 4 3 Design der Split Mix Bibliothek Die gew hlte Methode zur Bestimmung der Struktur der aktiven Bestandteile einer Split Mix Bibliothek Encoding bestimmt neben der N terminalen Verkn pfung der Peptide mit GTP Lars Kissau 4 Spezieller Teil 40 auch den Aufbau der Bibliothek Anstelle des apparativ sehr aufwendigen Electronic Encoding z B IRORI oder graphical Encoding wurde ein chemical Encoding ausgew hlt Im vorliegenden Fall sollte eine Affinit t der Marker zu Ras a priori ausgeschlossen werden Da die Pr senz einer zweiten Verbindung wie z B codierende DNA Sequenzen oder andere Peptide auf einem Bead m glicherweise die Aussage eines Bindungsassays beeinflusst h tte fiel die Wahl daher auf die Edman Sequenzierung zur Analyse der aktiven Verbindungen Da hierzu ein freier N Terminus einer
127. aph 1990 8 52 56 Hooft R W W Vriend G Sander C Abola E E Nature 1996 381 272 274 Fernandez A Colubri A Appignanesi G Phys Rev 2001 6402 1901 Lars Kissau 8 Anhang 208 145 H ltje H D Folkers G Molecular Modeling Basic Principles and Applications VCH Weinheim 1996 Vol 5 146 Bolton J L Trush M A Penning T M Dryhurst G Monks T J Chem Res Tox 2000 73 135 160 147 Sunazuka T Handa M Nagai K Shirahata T Harigaya Y Otoguro K Kuwajima I Omura S Org Lett 2002 4 367 9 148 Taniguchi M Watanabe M Nagai K Suzumura K Suzuki K Tanaka A J Antibiotics 2000 53 844 7 149 Weinz C Blaschke G J Chromat 1995 674 287 292 150 Rose S Drug Discov Today 2002 7 133 138 151 Long S B Casey P J Beese L S Biochemistry 1998 37 9612 9618 152 Long S B Casey P J Beese L S Structure 2000 8 209 222 153 Long S B Hancock P J Kral A M Hellinga H W Beese L S Proc Natl Acad Sci 2001 98 12948 12953 154 Thutewohl M Kissau L Popkirova B Karaguni I M Nowak T Bate M Kuhlmann J M ller O Waldmann H Angew Chem 2002 114 3768 3772 155 Klug A Rhodes D Trends Biochem Sci 1988 12 45 51 156 Dudev T Lim C J Am Chem Soc 2000 122 11146 11153 157 Barrett D Barlocco D Drug Disc Today 2002 7 325 326 158 Janeway C M L
128. apitel 4 2 beschreibenen Arbeiten war die erfolgreiche Totalsynthese der ErbB 2 Kinaseinhibitors Nakijichinon C siehe Abbildung 5 durch Dr P Stahl im Arbeitskreis von Prof Dr H Waldmann sowie die im Anschlu durchgef hrte Synthese einiger Analoga Ip ER L Serin L Threonin D Threonin D Valin Glycin HN COOH Ee O ye Ree id d NakijichinonC 6 Abbildung 7 Struktur des Naturstoffes Nakijichinon C 6 F r die Synthese der Analoga wurden die drei Bestandteile wie gezeigt variiert Aus der Evaluierung dieser Bibliothek in Koorperation mit Dr R Mazitschek im Arbeitskreis von Prof A Giannis Universit t Karlsruhe stammen die in dieser Arbeit angegebenen ICso Werte Demnach befinden sich in der Substanzbibliothek von 74 Verbindungen insgesamt 7 Inhibitoren f r IGFIR Tie 2 VEGFR 2 und VEGFR 3 und ErbB 2 Her 2 Diese Verbindungen fungieren als ATP kompetitive Inhibitoren allerdings kann aus den Strukturen keine Ursache f r die vielversprechende Selektivit t abgeleitet werden Die micromolare Aktivit t der Inhibitoren ist zwar beachtlich in Anbetracht der intrazellul ren millimolaren Konzentrationen von ATP f r eine Anwendung in vivo aber nicht ausreichend Ein detailliertes Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 13 Verst ndnis der Wirkung der Nakijichinon Analoga ist Voraussetzung f r die Steigerung der Aktivit t 2 2 Ras als Target 2 2 1 Stellung in der Signaltransduktionskaskade und Regulation
129. aragins ure in letzterer Sequenz ist f r die Katalyse essentiell da sie entweder durch Ausbildung einer Wasserstoffbr cke zum Substrat den Phosphorylierungsschritt beg nstigt oder durch elektrostatische Absto ung die Freisetzung des Produktes beschleunigt Betrachtet man die Kinasedom ne so dass die Hinge Region links liegt findet man hinter der ATP Bindungstasche eine hydrophobe Tasche die keine erkennbare Rolle bei der Bindung von ATP oder einem Substrat spielt Da offenbar eine Selektionsdruck in diesem Bereich fehlt ist diese Tasche einer der am wenigsten konservierten Bereiche innerhalb der Kinasedom ne und ist daher f r die Entwicklung von selektiven Inhibitoren von gro er Bedeutung Anstelle des deutschen Begriffes Scharnier Region wird auch in der deutschsprachigen Literatur die angels chsische Bezeichnung verwendet Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 7 Abbildung 4 Struktur der der o katalytischen Untereinheit der Protein Kinase A PKA Kinasedom ne PDB Code 1C1Y In der ATP Bindungstasche befindet sich der Inhibitor Staurosporin 1 Dieser bindet in der Furche zwischen N und C terminalem Lobes an die Hinge Region N terminal Lobe blau C terminal Lobe rot Hinge Region gelb Die hydrophobe Tasche hinter der ATP Bindungsstelle ist unbesetzt 2 1 2 2 Mechanismus Trotz der vorhandenen Aktivierung der Bindung zwischen der und y Phosphatgruppe des ATP sind die Reaktionen mit einem Alkohol oder Ph
130. asche von der Purin Bindungstasche wurde eine Ebene als Schnittstelle definiert Die Atome Phe 1007 Ca und C sowie Val 1075 Ca sowie C definierte Ebene ist in Abbildung 60 rot dargestellt Alle Solvensmolek le die sich in Abbildung 60 rechts der Ebene befanden wurden zur hydrophoben Tasche gerechnet Die links der Ebene liegenden Solvensmolek le belegen die Purin Bindungsstelle Gem AAV MM11 wurde nun das Volumen der hydrophoben Taschen des IGF1 Rezeptors berechnet Die Werte f r die anderen Kinasen wurden auf die gleiche Weise berechnet in dem die jeweils korrespondierenden Aminos uren zu Definition der begrenzenden Ebene herangezogen wurden Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgef hrt Lars Kissau 4 Spezieller Teil 87 Kinase Tie 2 IGFIR VEGFR 2 VEGFR 3 ErbB 2 Volumen 273 48 121 55 272 32 273 51 253 95 Tabelle 6 Gr e der hydrophoben Taschen der verschiedenen Rezeptor Tyrosin Kinasen in Zur Veranschaulichung wurden die SA Oberfl chen dieser Taschen AAV MM21 berechnet Sie sind in Abbildung 61 gezeigt Gut zu erkennen sind die Unterschiede im Bezug auf Form und Gr e Diese spiegeln sich in gleicher Weise in den Dekalinsystemen wieder Abbildung 61 a Die SA Oberfl chen der hydrophoben Taschen von IGFIR gr n VEGFR 2 gelb und Tie 2 rot b Vergleich der hydrophoben Taschen von ErbB 2 rot und VEGFR 2 gelb c wie b Ansicht um 90 gedreht Mit den auf diese Weise def
131. aten korreliert werden Neben der zuvor diskutierten St rke der Wasserstoffbr cken stellt dieser Ansatz eine sehr einfache aber dennoch zuverl ssige M glichkeit dar die Bindung hydrophober Teile zu quantifizieren Lars Kissau 4 Spezieller Teil 108 Ausf llung des Ausf llung des Peptid FPP Volumens FPP komp Peptidvolumens komp CAAX kompetitive Inhibitoren 112 0 65 115 0 65 FPP kompetitive Inhibitoren 114 69 27 110 63 19 129 75 15 130 63 18 Bisubstratinhibitoren 109 35 65 156 32 54 124 62 42 157 36 50 9 55 54 Tabelle 10 Korrelation der Uberlappungsvolumina der Inhibitoren mit Fpp bzw CVLS Peptid Die nicht kompetitive Wirkung ist durch oder gekennzeichnet Vorhergesagte aber gegenw rtig noch nicht experimentell bestimmte kinetische Eigenschaften sind rot unterlegt bestimmt durch kinetische Messungen 4 3 4 Optimierung Design einer 2 Generation von Analoga Das Ziel der Verbesserung der Affinit t der Pepticinnamin E Analoga zur PFT sowie die Steigerung der Selektivit t dieser Klasse von PFT Inhibitoren schlie t sich an die abgeschlossenen Synthesen und Molecular Modelling Analysen an Bedingt durch den modularen Aufbau kann man bei den Pepticinnamin E Analoga leicht Modifikationen einf hren um Affinit ten und Selektivit ten im Bezug auf PFT und GGTase VII zu verbessern Neben
132. aten nicht belegt wird und daher die Gr e der Tasche mit PASS und PQMS siehe Experimenteller Teil berechnet werden musste konnte hier ein anderer Ansatz verfolgt werden Das Vorliegen von Kristallstrukturen mit FPP und Peptidsubstrat erlaubt eine einfachere und gleichwohl elegante Vorgehensweise Diese ist zudem hier auch exakter da im Gegensatz zur klar definierten hydrophoben Tasche der Kinasen die FPP und Peptid Bindungsregionen in der PFT nicht so scharf und ohne Willk r von einander zu trennen sind Anstelle einer Neuberechnung der hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Enzym und Ligand durch Addition aller enthalpischen und entropischen Effekte wird in diesem Verfahren Lars Kissau 4 Spezieller Teil 107 ein Ligand in Relation zu einem biologisch bereits als bindend validierten Substrat bewertet Programme wie WitnotP oder PQMS sind in der Lage vdW Oberfl chen von Molek len zu berechnen und darzustellen Aus dem f r die graphische Darstellung berechneten Satz von Koordinaten l sst sich ebenfalls das vdW Volumen eines solchen unter der vdW Oberfl che verborgenen Molek ls berechnen Besetzt nun ein Inhibitor beispielsweise die Bindungstasche f r Farnesylpyrophosphat so kann man nach bereinanderlegen der Strukturen des Inhibitors und des Farnesylpyrophosphates in der Proteinstruktur sowohl das Volumen der einzelnen Verbindungen berechnen als auch das Volumen das beide Molek le besetzen Die in Tabelle 10 angegebenen Pr
133. auch die erfolgreich Co Kristallisation eines optimierten Kinaseinhibitors mit einer der hier betrachteten Rezeptor Tyrosin Kinasen die Homologiemodelle best tigen bzw zu deren weiteren Verfeinerung betragten A model must be wrong in some respects else it would be the thing itself The trick is to see where it is right Henry A Bent Lars Kissau 6 Experimenteller Teil 129 6 Experimenteller Teil 6 1 Messger te und Hilfsmittel Die H C und P NMR Spektren wurden auf folgenden Ger ten aufgenommen Varian Mercury 400 400 MHz H NMR 100 6 MHz C NMR 162 0 MHz P NMR Bruker AM 400 400 MHz H NMR 100 6 MHz C NMR Die chemischen Verschiebungen sind in ppm angegeben und beziehen sich auf Tetramethylsilan TMS 0 als internen Standard Die Signalmultiplizit ten sind wie folgt abgek rzt s Singulett d Dublett t Triplett q Quartett m Multiplett br verbreitertes Signal Die EI und FAB Massenspektren wurden mit einem Finnigan MAT MS 70 oder einem Jeol SX 102A Spektrometer gemessen Angegeben sind die m z Werte und die relativen Intensit ten Die FAB Spektren wurden in einer 3 NBA Matrix gemessen Die MALDI TOF Massenspektren wurden auf einer Voyager DE Pro BioSpectrometry Workstation der Firma PerSeptive Biosystems aufgenommen mit 2 5 Dihydrobenzoes ure als Matrix Die spezifischen Drehwerte Dis wurden mit einem Perkin Elmer Polarimeter 341 bestimmt und beziehen sich auf die Na D Linie Die
134. aus Von den zu Beginn erw hnten Methoden der R ntgenstrukturanalyse ab initio Rechnungen semi empirische Rechnungen oder Geometrieoptimierungen durch Kraftfeldrechungen wurden f r die Generierung der Inhibitorstrukturen semi empirische Verfahren AM1 und Kraftfeldrechnungen CHARMM ausgew hlt Da nicht f r alle betrachteten Kinasen geeignete R ntgenstrukturen vorlagen wurden diese im Rahmen der vorliegenden Arbeit mittels Homology Modelling generiert 4 2 3 3D Strukturen von Nakijichinon C und dessen Analoga Von f nf biologisch aktiven und strukturell interessanten Verbindungen wurden zun chst dreidimensionale Strukturen erstellt Gem AAV MMI wurden die Strukturen gezeichnet und mit CHARMM optimiert F r das unges ttigte und mehrfach methylierte Dekalinger st von 6 und 98 ist die Energie minimale Konformation in Abbildung 45 gezeigt Diese durch CHARMM Kraftfeldrechnung erhaltenen Konformationen wurden durch AM1 Rechnungen best tigt tt TTT Die AM1 Rechnungen wurden auf einem PC Intel Celeron 400 MHz Windows 98 mit dem Programm Hyperchem durchgef hrt Alle anderen Berechnungen wurden auf einer SGI O2 Workstation bzw einer Origin 2000 durchgef hrt Lars Kissau 4 Spezieller Teil 67 GS BO Abbildung 45 Konformationen von 98 links und 6 rechts nach CHARMM Minimierung Wasserstoffatome sind nicht gezeigt Auffallend war die offenbar gr ere Einschr nkung der Rotation um die Bindung zwischen dem C
135. bei eine positive Korrelation ergeben Eine determinierten ICs Werten und den Fitness Werten aus der Scoring Funktion besteht Dies zeigt auch der Korrelationskoeffizient 0 10 Lars Kissau 4 Spezieller Teil 95 Verbindung IC50 Fitness 109 6 73 6 115 8 35 8 110 9 53 9 112 10 70 3 114 16 58 4 9 40 47 4 113 gt 100 46 9 111 gt 100 64 5 Tabelle 9 IC Werte und GOLD Fitness ausgew hlter PFT Inhibitoren Neben den unbefriedigenden Zahlen ist zus tzlich noch festzustellen dass in einigen F llen offenbar unwahrscheinliche Konformationen als Resultat erschienen Betrachtet man die Strukturen der von Pepticinnamin E abgeleiteten Inhibitoren und vergleicht diese mit Literatur bekannten Inhibitoren und deren Bindungsmodi kann es als sehr wahrscheinlich gelten dass das freie Carboxylat nicht in der hydrophoben Bindungstasche f r Farnesylpyrophosphat zu finden sein wird Einige gedockte Konformationen zeigen jedoch genau diese Orientierung Auch die als Kontrolle gedachten Verbindungen 111 und 113 die in vitro keine nennenswerte Inhibition der PFT zeigten wurden mit mittleren bis hohen Fitness Scores bewertet Zu den Ursache f r diese Fehler z hlt neben der Schwierigkeit der Bewertung von hydrophoben Wechselwirkung auch GOLD spezifische Probleme die Koordination des Zinks korrekt vorherzusagen und zu bewerten Bekannt ist dass GOLD Probleme mit dem Docken hydrophober Verbindungen hat da die i
136. ben wurde Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 194 Die durch manuelle Bead Picking selektierten Beads wurden in einem Multisyntec Reaktor gesammelt und je 2mal mit folgenden L sungen f r jeweils 30 min gewaschen 6M Guanidiumchlorid 1M Natriumdodecylsulfat Wasser und DMF Anschlie end wurde 5 mal f r jeweils 10 Minuten mit Dichlormethan gewaschen und anschlie end die Boc gesch tzten N Termini abgespalten Hierzu wurden die Beads 3 Stunden in TFA Dichlormethan iPr3SiH im Verh ltnis 95 2 5 2 5 gesch ttelt Kontrollen unter dem Fluoreszenzmikroskop zeigten dass kein Bead mehr fluoreszierte d h das markierte Protein war entfernt Ein Kaisertest an einem Bead belegte die Existenz freier Aminogruppen Die Beads werden bei 4 C in Wasser suspendiert und zur Sequenzierung mittels Edman Abbau gebracht GOLD Docking Die Input Datei f r das Docking der GTP Peptidkonjugate an G12V Ras ist in Anhang VII wiedergegeben F r das Docking wird GTP in der Bindungstasche in der Position fixiert die es in den verschiedenen Kristallstrukturen bereinstimmen innehat Peptid und Linker werden eingedockt Hierbei wird der Ligand kovalent mit GTP verbunden d h f r GOLD wird ein covalent link zwischen dem Peptid dem Linker und dem y Phosphat definiert Da der kovalente Link nur jeweils f r einen Liganden definiert werden kann ist das Docking der verschiedenen Liganden sukzessive durchzuf hren Parallelsynthese einer kleinen Bibliothek
137. bindende Form von Ras als Guaninnucleotid Austauschfaktor guanine nucleotide exchange factor GEF Durch den Austausch von GDP gegen GTP wird Ras aktiviert und leitet als molekularer Schalter das von der Rezeptor Tyrosin Kinase ber nicht kovalente Protein Protein Wechselwirkungen eintreffende Signal auf eine Kaskade von Protein Phosphorylierungen ins Zellinnere um Die aktivierte GTP bindende Form von Ras vermag den N Terminus der S T spezifischen Proteinkinase Raf zu binden und dieses Protein dadurch an der Innenseite der Zellmembran zu lokalisieren Raf bindet und phosphoryliert mit seinem C Terminus die MAP Kinase Kinase welche das Signal ber weitere Phosphorylierungen transmittiert F r das Ausschalten des Schalters ist ebenfalls ein zweites Protein erforderlich Die intrinsischen GTPase Aktivit t von Ras ist sehr niedrig und wird durch GTPase aktivierende Proteine GAP beschleunigt Dieser Signalweg ist in Anhang XI rot markiert Die drei humanen Ras Proteine werden posttranslational durch Lipidierung am C Terminus modifiziert und sind erst nach dieser Modifikation an der Zellmembran lokalisiert Dies ist eine f r die biologische Aktivit t notwendige jedoch nicht hinreichende Voraussetzung Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 14 2 2 2 Ansatzpunkte f r Signaltransduktionstherapie Aus seiner Stellung in der Signalkaskade der Tatsache dass die Lipidierung des C Terminus f r die Aktivi t essentiell ist sowie dem bekannten Wech
138. bs THF gegeben Nach 2h wird die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur erw rmt und nach weiteren 30 Minuten mit 0 1 M Phosphatpuffer pH 7 extrahiert Ausbeute 436 mg 1 6 mmol 46 d Th H NMR CDC13 400 MHz 3 81 m 4H NC CH CH gt O 3 59 m 2H N CH CH3 2 63 t 4H NC CH gt CH gt 0 J 6 27 Hz 1 17 d 12 H N CH CH3 J 6 84 Hz 31P_NMR CDCI 202 5 MHz 150 15 Die analytischen Daten stimmen mit den Literaturangaben berein 3 Bis 2 cyano ethoxy phosphoryloxy benzoic acid allyl ester 57 Zu einer L sung von 60 mg 0 33 mmol 54 in 6 ml Dichlormethan wird bei 0 C eine L sung von 436 mg 1 6 mmol 52a und 280 mg 4 mmol Tetrazol 14 h am Feinvakuum getrocknet in 6 ml Dichlormethan gegeben und 30 min ger hrt Anschlie end wird auf Raumtemperatur erw rmt und weitere 4 h ger hrt Die Reaktionsmischung wird auf 30 C abgek hlt und langsam 330 ul 1 65 mmol emer 5M L sung von tBuOOH in Decan zugetropft und 1 h bei Raumtemperatur ger hrt Die Reaktionsmischung wird mit 10 iger NaSO L sung gewaschen und mit pH 7 Phosphatpuffer und Ethylacetat extrahiert Die organischen Phasen werden ber NaSO getrocknet und eingeengt Bei der chromatographischen Reinigung werden unpolare Nebenprodukte zun chst mit Cyclohexan eluiert danach mit 1 1 das Produkt eluiert Man erh lt nach Einengen der Fraktionen ein farbloses l Ausbeute 58 mg 0 16 mmol 49 d Th Rr Wert Cyclohexan
139. ch 101 4 2 7 Vorschl ge zur Optimierung Die Zahl und hnlichkeit der in einer Zelle exprimierten Kinasen sowie die Selektivit tsprofile der bislang bekannten Inhibitoren machen es schwer die Folgen der Inhibition einer einzelnen Kinase exakt zu bestimmen Insofern stellen die Nakijichinon Analoga und die durch Aufkl rung der Bindungsmodi gewonnenen Erkenntnisse eine interessante M glichkeit dar nach Optimierung der Inhibitoren mittels sehr selektiver molekularer Werkzeuge verschiedene zellul re Signalkaskaden getrennt zu untersuchen Ziel einer weiteren Optimierung sollte die Verbesserung von Affinit t und Selektivit t bei gleichzeitiger Reduktion der Strukturen auf essentielle Merkmale sein Daneben ist bei einer weiteren Entwicklung auch die Kompatibilit t der Strukturen mit zellul ren Systemen zu beachten Strukturmerkmale welche die Bindung an und Inhibition von Kinasen positiv beeinflussen sind einerseits eine hydrophile Gruppe die orientierende Wasserstoffbr cken zur Hinge Region beitr gt und andererseits ein hydrophober Teil der nicht nur einen Gro teil der Affinit t bedingt sondern auch f r die Selektivit t hauptverantwortlich scheint Ein Molek lteil welches als Ribose Mimic weitere Wechselwirkungen mit der Kinasedom ne betr gt scheint ebenfalls von Vorteil zu sein Ein Vorteil einer Nakijichinon verwandten Bibliothek w re die M glichkeit das Sub stitutionsmuster des Dekalinsystems einerseits aufgrund der Mol
140. ch Gefriertrocknung erh lt man ein wei es Pulver Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 134 6 3 Allgemeine Arbeitsvorschriften Molecular Modelling AAV MM Die angegebenen Rechenzeiten beziehen sich auf den Origin 2000 Rechner am MPI f r molekulare Physiologie in Dortmund bei durchschnittlicher Auslastung Rechnungen auf einer SGI O dauern in der Regel l nger Die Zahlen dienen als Referenzwerte und beziehen sich auf Rechnungen mit der Struktur der Ratten Farnesyltransferase PDB Code 1JCR Die verwendeten Pfadbezeichnungen beziehen sich auf das Netzwerk des MPI in Dortmund Die 180 beschriebenen Skripts sind f r die Verwendung mit WitnotP geeignet Skripts die von der UNIX Kommandozeile auszuf hren sind sind also solche gekennzeichnet AAV MMI Zeichnen einer Molek lstruktur mit WitnotP Minimierung mit CHARMM Anwendung Erstellen der 3 dimensionalen Struktur einer Verbindung sowie deren Vorbereitung zur Kraftfeldminimierung Beschreibung Mit den im WitnotP Untermen Build vorhandenen Optionen werden entweder Fragmente zusammengef gt oder mit Sketch neu erstellt Da mit den Fragmenten bereits Atomparameter abgespeichert sind ist dieser Methode der Vorzug zu geben Nach Beendigung der Zeichnung wechselt man in das Untermen Modify und w hlt Hydrogens um fehlende Wasserstoffatom hinzuzuf gen Mit Label Bond Order werden schlie lich alle Bindungsordnungen angezeigt und berpr f
141. cht durch Hintergrundfluoreszenz verf lscht werden Vor der Synthese und Evaluierung Lars Kissau 4 Spezieller Teil 55 einer Split Mix Bibliothek stand daher die Auswahl einer geeigneten festen Phase sowie eines geeigneten Fluorophors Der Erfolg von CPG Beads CPG controlled pore glass bei der DNA Synthese ihre hohe mechanische Stabilit t und die aufgrund des relativ gro en Durchmessers gute M glichkeit zu manueller Selektion sowie das Fehlen von UV aktiven Funktionalit ten lie eine Untersuchung dieser Festphase sinnvoll erscheinen Es zeigte sich jedoch dass unter den f r den Assay notwendigen Bedingungen eine Denaturierung des Ras Proteins auf der Oberfl che der CPG Beads stattfand Die gute Verf gbarkeit gab Anlass zur Verwendung von Dansyl markiertem H Ras als Testprotein Leider zeigten sowohl Tentagel S Tentagel Makrobeads als auch das ebenfalls getestete PEGA Harz im Bereich der Dansylfluorezenz eine starke Hintergrundfluoreszenz Die Verwendung eines bei gr eren Wellenl ngen absorbierenden Farbstoffes war also notwendig Cy5 w re eine Option gewesen die Wahl fiel jedoch auf Atto 655 siehe Abbildung 39 das im Bezug auf Preis und Photostabilit t Cy5 berlegen ist Es wurde daher im Hinblick auf die Anwendung leistungsstarker Kryton LASER verwendet Im Bereich der Absorption 647 nm und Emission 680 nm zeigen weder Tentagel noch PEGA Beads eine Hintergrundfluoreszenz Trotz der guten Quelleigenschaften von Tentagel
142. constraint independent quality indicators Structure Z scores positive is better than average Structure Z scorea Liam z j i Aa positive is better than average 2nd generation packing quality 2 930 2nd generation packing quality 3 121 poor Ramachandran plot appearance 0 120 Ramachandran plot appearance 0 401 x 1 x 2 rotamer nomality 0 588 x 1 x 2 rotamer normality 1 585 Backbone conformation 1 107 Backhone conformation 0 855 RMS Z scores should he close to 1 0 RMS Z scores should he close to 1 0 Bond lengths 0 946 Bond lengths 0 972 Bond angles 1215 Bond angles 1 284 Omega angle restraints 0 610 tight Omega angle restraints 0 658 tight Side chain planarity 0 459 tight Side chain planarity 0 560 tight Improper dihedral distribution 0 821 Improper dihedral distribution 0 938 B factor distribution 0 364 B factor distribution 0 355 Inside Outside distribution 1 131 Inside Outside distribution 1 128 Lars Kissau 8 7 Input Dateien f r Molecular Modelling Arbeiten 215 8 7 Anhang VII Input Dateien f r Molecular Modelling Arbeiten 8 7 1 HYDROMAP Diese Input Datei wurde f r die Berechnungen der Hydrophobizit tskarten von Ras verwendet Die gleichen Einstellungen wurden f r alle anderen Berechnungen mit HYDROMAP verwendet Die entsprechenden Dateien sind im Verzeichnis HYDROMAP auf der beiliegenden CD enthalten File type mol2 m or PDB p
143. d der nat rliche Ligand ist kein kleines Hormon sondern ein 337 kDa Protein GAP Auch ist hier das Ziel nicht eine artifiziell erzeugte Mutante sondern eine biologisch relevante Mutation 2 2 2 2 Posttranslationale Lipidierung durch die PFT Bei der Biosynthese der lipidierten Ras Proteine wird zun chst der Cysteinrest der C terminalen CAAX Sequenz durch PFT katalysierte Reaktion mit Farnesylpyrophosphat farnesyliert anschlie end der AAX Teil durch eine spezifische Protease abgespalten und schlie lich der freie C terminale Cysteinrest in den Methylester berf hrt Im Falle von H und N Ras erfolgt eine zweite Lipidierung mit Palmitins ure w hrend bei K Ras die Interaktion mit der Membran durch eine positiv geladene poly Lysin Sequenz verst rkt wird SH SFar r Far P207 r PFT C Cystein A aliphatische Aminos ure X Methionin Serin Glutamin Far Q Q Vs Abbildung 10 PFT katalysierte Farnesylierung von Ras Fir die transformierende Wirkung von mutierten Ras Proteinen ist die Farnesylierung essentiell da hierdurch die f r die biologische Aktivit t erforderliche Lokalisierung an der Plasmamembran sichergestellt wird Tats chlich zeigen Inhibitoren der PFT Anti Tumoreffekte sie hemmen das Wachstum von transformierten Zellen oder bewirken Tumorregression wobei letztere Wirkung auf das Ausl sen von Apoptose den programmierten Zelltod zur ckgef hrt wird Dennoch ist die Wirkung nicht einheitlich und h ngt von Wirks
144. das Design einer fokussierten Peptidbibliothek Ersetzt man das zentrale Prolin durch 2R 4R 4 Hydroxyprolin k nnen C und N terminus variiert werden Interessant k nnte in diesem Zusammenhang der Einbau der in Abbildung 79 gezeigten und in dieser Arbeit synthetisierten Hydrolyse f rdernden Kopfgruppen sein Der Verbleib der Hydroxygruppe am Prolin sollte sich kaum Affinitats mindernd auswirken da im relevanten Bereich der Ras Oberfl che auch Wasserstoffbr cken Akzeptoren zu finden sind und eine sterische Absto ung nicht zu erwarten ist Lars Kissau 5 Zusammenfassung und Ausblick 128 o e b Eer ES N AT AN tome Br N Oo D Fmoc E Oo O R 1 C und N terminale Verl ngerung riX N z ee gt N H 2 Verkn pfung mit Kopfgruppen 3 Entsch tzung und Abspaltung 5H Abbildung 93 Optimierung der Leitstruktur durch kombinatorische Festphasensynthese F r die weitere Entwicklung der Kinaseinhibitoren stellen die in Abbildung 89 gezeigtn y Pyrone einen interessanten Ausgangspunkt dar Dieses Grundger st w rde es erm glichen den Selektivit ts steuernden Einfluss der Dekalinsysteme weiterhin zu nutzen Gleiches gilt f r diie Lactame 105 und 106 Eine Synthese und biologische Evaluierung dieser Verbindungen wie auch der optimierten Farnesyltransferase Inhibitoren k nnte die hier erarbeiteten Bindungsmodelle best tigen und dadurch die Pr zision von Molecular Modelling Vorhersagen verbessern Letztlich k nnte
145. das Molek l in einer Turn hnlichen Form F r diese Strukturelement gibt es zahlreiche bioisostere Strukturen F r das Design von Mimetika f r 95 wurden die in Abbildung 42a gezeigten Strukturen ausgew hlt da diese analog zu Prolin hydrophobe Wechselwirkungen beg nstigen k nnten und eine hnlichen Orientierung der Substituenten erm glichen Die Strukturen wurden manuell in die Ras Struktur in einer Weise gedockt die eine hnliche Orientierung der Substituenten R R und R R wie im Prolinpeptid erlauben Neben der hydrophoben Wechselwirkung sollten Lars Kissau 4 Spezieller Teil 63 weitere wichtige Interaktionen zwischen Peptid und Ras erhalten bleiben Eine Analyse der m glichen Wasserstoffbr cken zwischen 91 95 und Ras zeigte dass eine Wechselwirkung mit Lys 117 und Asn 85 bei allen Peptiden gefunden wurde siehe Tabelle 19 Anhang IX Ebenso scheint die Wechselwirkung des C terminus mit der Purinbase oder Resten in der Switch II Region vorteilhaft zu sein Diese sollten daher auch in den Mimetika zu finden sein Versucht man bei Verwendung der Struktur B die Substituenten mit den Resten in PGPMG zu berlagern resultiert eine berlappung der blau markierten Atome mit Ala 83 Ser 89 oder Asn 86 von Ras Das Grundger st C ist besser geeignet als B das in Abbildung 42 gezeigte Mimetikum A imitiert die durch Prolin bedingte Konformation jedoch am Besten Die erste Aminos ure war in der Split Mix Bibliothek kovalent an GTP gebun
146. de NH Do E DM ge EE o H re Oo O O OH OH Pd PPh3 4 DMF Morpholin GTP Peptid Konjugate 2h AA Phenylalanin Threonin Glutamin Leucin Alanin Methionin Glutamins ure Tyrosin Valin Lysin Abbildung 37 Synthese von GTP Peptidkonjugaten mit dem Linker 84 und dem Spacer 37 Parallel zur Etablierung der Synthesemethoden an der festen Phase mussten auch die analytischen Verfahren optimiert werden Der Aufbau der Pepide am Harz konnte durch UV Bestimmung des Dibenzofulven Piperidin Adduktes durch Abspaltung einer kleinen Probe und Nachweis durch HPLC ESI MSsowie durch Kontrolle der Kupplungen durch Kaiser Test AAV 7 berwacht werden Auch die Ausbeute bei der Kupplung des oben beschriebenen Phosphatlinkers konnte UV spektrometrisch gemessen werden F r den letzten Syntheseschritt an der festen Phase fehlte jedoch zun chst eine geeignete analytische Methode Gesucht wurde eine Methode die eine Echtzeit berwachung der Reaktion erm glichte so dass eine m glicherweise unvollst ndige Kupplungsreaktion durch Zugabe von weiteren quivalenten aktiviertem GDP zur Vollst ndigkeit gebracht werden konnte Sowohl die Monophosphate als auch die GTP Konjugate lie en sich nicht routinem ig im ESI nachweisen Eine Reinigung und Charakterisierung einer kleinen Probe mittels HPLC ESI scheiterte ebenfalls Der Nachweis im MALDI war trotz Variation zahlreicher Parameter nicht m glich In Zusammenarbeit mit Dr H Prinz und
147. definiert ist wobei der Phenylring eine Kation r Wechselwirkung mit Lys 164a eingeht Die gleiche Tasche wird bei 154 durch den zweiten Lars Kissau 4 Spezieller Teil 104 Phenylring ausgef llt Die genannte Aminos uren sind in Abbildung 72b unten rechts beschriftet a b Abbildung 72 a 112 in PFT mit SA Oberfl chen b 112 in PFT f r die Bindung wichtige Aminos uren sind explizit bezeichnet Im Gegensatz zu 114 und 142 zeigt 135 keine ausgepr gte Wechselwirkung mit der PFT Der Einflu der N Methylierung auf die Konformation des Backbones konnte ebenso erkl rt werden wie die Folgen einer Substitution eines Tyrosins durch ein Histidin Analog zum bereits erw hnten Unterschied zwischen 142 und 135 ist auch die Differenz zwischen 146 und 145 auf die fehlende starke Koordination des Zinks durch das Histidin zur ckzuf hren Gest tzt wurde die Vermutung eines anderen Bindungsmodus durch die kinetischen Daten wonach 112 und 115 nicht FPP kompetitiv wirken In diesem Fall wurden die kinetischen Untersuchungen parallel zu den Molecular Modelling Studien durchgef hrt Aus den Modelling Untersuchungen alleine w re eine Pr ferenz f r einen der beiden denkbaren Bindungsmodi hier nicht abzuleiten gewesen Auf Basis aus kinetischen Daten und Modelling Arbeiten abgeleiteten Bindungsmodus l sst sich auch erkl ren warum 111 und 113 trotz sehr hnlicher Struktur keine Inhibition der PFT zeigen Zwischen den beiden N Methylgruppen de
148. den F r das Design eines Mimetikums wurde diese Aminos ure und der Spacer wie beim Design der Split Mix Bibliothek beabsichtigt durch eine Hydrolyse f rdernde Kopfgruppe ersetzt In der vorgeschlagenen Struktur 97 findet die 2 Aminopyridylgruppe die in der ersten Peptidbibliothek eingesetzt wurde erneut Verwendung Die magenta gef rbten Atome sollten in Analogie zum Arginin des GAP Proteins durch Kompensation der Ladungen an und y Phosphat eine Beschleunigung der GTP Hydrolyse bewirken Die Bindung wird durch Wasserstoffbr cken zu den Phosphaten beg nstigt siehe Anhang IX Die in Abbildung 41 blau markierten Atome sollten in dem eingangs beschriebenen hydrophoben Patch auf der Ras Oberfl che in der N he der GTP Bindungstasche ebenso binden wie das zentrale Prolin von PGPMG Die Wechselwirkung mit der Purinbase durch das freie Carboxylat wird beim vorgeschlagenen Peptidmimetikum durch die Seitenkette der Glutamins ure bernommen Der Bindungsbeitrag des Methionins erschlie t sich nicht aus dem vorgeschlagenen Bindungsmodus Daher sollte die Methylgruppe gr n markiert im Peptidmimetikum variiert werden Lars Kissau 4 Spezieller Teil 64 Er Abbildung 42 a Ausgehend von 95 wurden verschiedene Grundger ste f r Peptidmimetika untersucht b Mimetikum 97 gebunden an Ras c gleiche Ansicht wie b GTP nicht unter der Oberfl che verborgen d Wechselwirkungen von Mimetikum 97 mit Ras GTP Lars Kissau 4 Speziell
149. den F r einen fehlerfreien Ablauf der anschlie enden Minimierung ist die korrekte Benennung aller Atome sehr wichtig CHARMM toleriert keine zweideutigen Bezeichnungen und st rzt sofort ab Die Namensarchitektur in WitnotP kann bertragen werden Alle Atome sollten einen Namen mit folgender Struktur haben Protein Name Bezeichnung der Kette Bezeichnung des Restes Atom_Bezeichnung Beispiel PFT A PRO_105 CA Hat man ein kleines Molek l in die gew nschte Position gebracht und m chte diese gemeinsam mit dem Protein minimieren sind die Ligandenatome VOR der Erstellung der CHARMM Input Datei umzubenennen F r Minimierungen bei denen der Inhibitor separat minimiert werden soll z B mit dem Skript mimim_run oder bei denen der Inhibitor als Referenz f r die Fixierung von Proteinatomen gilt z B minharmfix_run die Atome des Inhibitors unbedingt folgende Namensstruktur aufweisen m ssen Protein Name INHB Bezeichnung des _Restes Atom Bezeichnung Ohne INHB f hrt die Anwendung der genannten Skripten im ung nstigsten Fall zum Systemabsturz Man erreicht die korrekte Benennung durch folgende Eingabe WitnotP Move Molecule name_des_inhibitor_molekiils Protein_Name INHB done AAV MM2 Vorbereitung einer Proteinstruktur f r die Minimierung mit dem CHARMM Kraftfeld Anwendung Minimierung einer Kristallstruktur zu der Wasserstoffatome zugef gt wurden oder Minimierung eines Protein Liganden Komplexes Lars Kissau Allgemein
150. der langfristigen Perspektive als Drugs sind diese Verbindungen als Molekulare Werkzeuge zur weiteren Beleuchtung der in Kapitel 2 erw hnten Signalkaskaden interessant Insbesondere sind Bisubstratinhibitoren viel versprechend da man von ihnen eine erh hte Aktivit t und Selektivit t erwarten kann Die vorliegende Analyse der Bindungsmodi der Pepticinnamin E Analoga auf Basis manuellen Dockings und unterst tzender kinetischer Daten erm glicht nun optimierte Inhibitoren der 2 Generation zu entwerfen Hierbei k nnen gezielt verbesserte Bisubstratinhibitoren aber auch Fpp kompetitive oder CAAX kompetitive Inhibitoren entworfen werden die sich f r eine detailierte Untersuchung zellul rer Vorg nge bestens eignen 4 3 4 1 Ansatzpunkte f r Optimierung Im Verlauf der biologischen Evaluierung zeigte sich dass die eingeschr nkte L slichkeit einiger Verbindungen ihre Evaluierung beeintr chtigten M Thutewohl beschreibt in seiner Lars Kissau 4 Spezieller Teil 109 19 Diese Resultate Dissertation Abweichungen zwischen zwei verschiedenen PFT Assays sowie einige Resultate eines Apoptose Assays k nnten unter Anderem auf die unterschiedlichen L slichkeiten zur ckzuf hren sein F r den Einsatz kompetitiver Inhibitoren in zellul ren Systemen w re eine Aktivit t im nanomolaren Bereich w nschenswert Auch hier besteht also Optimierungsbedarf F r eine Anwendung in einem ganzen Organismus w ren weitere Kriterien zu erf
151. die Minimierung wird die Methode des Steepest Descent angewendet und die maximalen Iterationen auf 500 begrenzt Dies erlaubt eine kurze Minimierung auch gro er Strukturen Bsp FTase 12000 Atome in ca 5 Minuten Skriptname Minfixbb_rigid_sd_run Dauer 15 min Unix bin sh case in 1 sed s XXXX 1 ocg work mm charmm_tempfixbb_rigid_sd inp gt 1 inp charmm lt 1 inp gt 1 out 2 gt amp 1 echo witnotp host none lt lt EOF echo set gnu off echo read mol 1 mol echo read coord xpdb 1 _m pdb 1 done echo modify mol name 1 mi echo done echo write mol 1 m 1 mi echo exit yes echo EOF sh gt gt 1 out 2 gt amp 1 echo nWrong number of arguments echo Usage minfixbb_rigid ad run Molecule name n esac Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 144 Input Datei charmm_tempfixbb_rigid_sd inp 3K K 2K 2K 2K K K K 3K 3K 3K 2K 2K K K K K 3K 3K 3K 2K 2K K K K 3K 3K 3K 3K FK 2K K K K K 3K 3K FK FK FK K K 2K 3K 3K 3K FK FK 2K K K 2K K FK 3K FK FK FK K K 2K FK 3K 3K FK FK FK K 3K FK FK K ok cons fix sele atom CA end comp cons fix sele atom C end comp cons fix sele atom N end comp cons fix sele atom O end comp cons fix sele atom H end comp mini sd rdiel nstep 500 tolgrad 0 05 kK k k k k k k k k k k K k k EFF EFF FE FF K K K k k k 2K K K k k K K K EFF EEE AAV MM10 Manuelles Docking mit WitnotP Anwendung Manuelles Docking er
152. die Zahl der zur Markteinf hrung gelangten neuen Wirkstoffe und Behandlungsmethoden bedauerlicherweise recht gering Als Ursache ist der geringe Gehalt pharmakologisch relevanter Gruppen in den Bibliotheken zu sehen Naturstoffe hingegen stellen biologisch validierte Startpunkte im Strukturraum dar die von ihren Produzenten als Abwehrstrategie gegen Feinde im Laufe der Evolution erzeugt und optimiert wurden Da die Tumorentstehung auf eine Fehlsteuerung von Wachstums und Differenzierungsprozessen zur ckzuf hren ist stellen Enzyme die an solchen Regulationswegen beteiligt sind attraktive Targets f r die sogenannte Signaltransduktionstherapie da Zu diesen Targets z hlen Rezeptor Tyrosin Kinasen das Protein Ras sowie die Farnesyl und Geranylgeranyltransferasen Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 3 2 1 Rezeptor Tyrosin Kinasen 2 1 1 Historie der Suche nach Kinaseinhibitoren Nach der Aufkl rung der ersten Kristallstruktur einer Kinase PKA und der Entwicklung erster ATP kompetitiver Kinase Inhibitoren galt es aufgrund des hohen Konservierungsgrades bei den an der ATP Bindung beteiligten Aminos uren zun chst als schwierig bis unm glich selektive Kinase Inhibitoren zu entwickeln In der Tat zeigen viele der bekannten und teilweise sehr aktiven Kinase Inhibitoren eine eingeschr nkte Selektivit t Nach der Charakterisierung der PKC und der Entdeckung des ersten PKC Inhibitors Staurosporin 1 im Jahre 1986 widmeten sich verschieden
153. e Abbildung 15 Schematische Darstellung der Arbeitsweise von PASS a Beschichten der Oberfl che mit Wassermolek len b Entfernen aller solvent accessible probes c Beschichten der vorhandenen Molek le mit einer weiteren Schicht aus Wassermolekiilen d Erneutes Entfernen des bersch ssigen Wassermolek le Kann keine weitere Schicht aufgebracht werden endet das Programm Der PASS Algorithmus f llt Taschen in einer Proteinstruktur mit kugelf rmigen Sonden An diese Sonden werden weitere angelagert Diejenigen Sonden die ein definiertes Limit f r Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 28 Kontakte mit L sungmittelmolek len berschreiten werden wieder entfernt Dieser Prozess wird solange wiederholt bis alle neuen Sonden das Limit f r L sungsmittelkontakte berschreiten Die verbleibenden Sonden f llen die Taschen komplett aus und werden als Atomkoordinaten in einer PDB Datei ausgegeben Die Notwendigkeit zu diesen Untersuchungen entf llt wenn aufgrund kinetischer Studien beispielsweise eine Bindung in einem bekannten aktiven Zentrum nachgewiesen werden konnte F r die Arbeiten mit Analoga der Naturstoffe Nakijichinon C und Pepticinnamin E Kapitel 4 2 und 4 3 ist Letzteres der Fall Eine Kristallstruktur eines Enzym Ligand Komplexes ist als Beweis optimal geeignet allerdings eher selten vorhanden Wie zuvor beschrieben spielen Wasserstoffbr cken als orientierende Wechselwirkungen und hydrophobe Interaktionen bei der St rke
154. e Arbeitsvorschriften 136 Beschreibung F r ein automatisches oder manuelles Docking ist eine Energie minimierte Struktur erforderlich Ein gegebenes Protein kann wie folgt f r die Minimierung mit CHARMM vorbereitet werden WitnotP delete atom mol_name atom symbol H done modify atom charge 0 mol_name done atom ligance mol_name done atom ligance 1 mol name atom name ASP OD1 0D2 GLU OE1 OE2 OXT OT1 0T2 done atom ligance 4 mol_name atom name LYS NZ done atom ligance 3 mol_name atom name ARG NE NHI NH2 done atom ligance 4 mol_name atom name N done not mol_name zone 1 4 mol_name atom name C done done done hydrogens mol_name atom name mol_name done auto hheav atom charge automatic mol_name atom type auto charmm mol_name done done atom q mol name done MPEOE done write mol2 mol_name mol_name write xpdb mol_ name mol_name CHARMm psf mol name mol name Auch diese Anweisungen k nnen gesammelt und der WitnotP Kommandozeile mit lt pdb2c mol name ausgef hrt werden Hierbei wird noch zus tzlich eine Sicherungskopie des unver nderten Molek ls erstellt Ein Abspeichern der Molek ls als mol2 Datei ist dennoch vor dem Ausf hren dieses Skripts empfehlenswert Sofern die Proteinstruktur bereits korrekt mit Wasserstoffatomen versehen wurde und auch die Protonierung von funktionellen Gruppen in Aminos ureseitenketten korrigiert wurde kann man auch verk rzt das erforderliche Umbennenen und Zuweisen von Lad
155. e Unternehmen diesem Gebiet Die hohen Erwartungen wurden jedoch entt uscht es befinden sich heute nur wenige Verbindungen in einer klinischen Phase der Evaluierung ee OEntwickluung PhaseI Phase H Phasel Zulassung Verkauf E Klinische Tests Kinasen eal alll 12 00 10 00 8 00 6 00 4 00 JS 2 00 Andere Tage 0 00 Phase I Basell De D Zuassng Verka Abbildung 1 Erfolgsquoten bei der Entwicklung von Wirkstoffen gegen Kinasen und gegen andere Targets Von den industriell verfolgten Targets ist im Bereich der Kinasen der Prozentsatz derer f r die sich Wirkstoffe in der klinischen Evaluierung oder gar auf dem Markt befinden deutlich geringer als bei anderen Forschungsbereichen trotz der gewaltigen finanziellen An strengungen Mehr Verst ndnis der molekularen Grundlagen und neue Leitstrukturen sind dringend erforderlich Die erste Euphorie nach der Staurosporin Entdeckung wich bald der Ern chterung da die experimentellen Daten durch die 12 Isoformen der PKC alle mit unterschiedlichen Rollen verf lscht wurden und Staurosporin nahezu alle bis dato getesteten Kinasen mit guter bis sehr guter Affinit t inhibiert und damit die genannten Bef rchtungen best tigt Aus der in Abbildung 4 gezeigten Kristallstruktur des PKA Staurosporin Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 4 Komplexes ergibt sich eine Erkl rung Staurosporin bindet kompetitiv zu ATP aber ausschlie lich in einem Bereich der in allen Kinas
156. e conformation BRECH Side x p y A 0 02 tight RMS Z scores should be close to 1 0 Improper dihedral distribution 0 821 Bond lengths 0 955 1 A Lat j KE Steeg 1 200 Inside Outside distribution 1 155 Omega angle restraints 0 624 tight Side chain planarity 0 337 tight Improper dihedral distribution 0 845 B factor distribution 0 354 Inside Outside distribution 1 053 Lars Kissau 8 6 WHATCHECK Analyse der Kinasemodelle 214 8 6 2 5 Tie 2 Modell B 8 6 2 6 ErbB 2 2 11 Final summary 2 11 Final summary 2 11 1 Note Summary report for users of a structure 2 11 1 Note Summary report for wers of a structure This is an overall summary of the quality of the structure as compared with current reliable structures This summary is most useful for biologists sccking a good structure to use for modelling calculations This is an overall summary of the quality of the structure as compared with current reliable structures This summary is most useful for biologista sccking a good structure to use for modelling calculations The second part of the tahle mostly gva an impression of how well the model The second part of the tahle mostly gives an impression of how well the model conforms to common refinement constraint values The first part of the table conforms to common refinement constraint values The first part of the table shows a number of constraint independent quality indicators shows a number of
157. e erforderlich Einfacher und effizienter als die hierf r zun chst angewendete Veresterung mit Methanol Thionylchlorid ist die Umsetzung mit 5 eq Allylbromid in Gegenwart von Cs2CO3 und K gt CO Mit LiOH in Methanol Wasser THF kann anschlie end der Allylester 22 selektiv und quantitativ verseift werden Nach der Kupplung von 23 an ein festphasengebundenes Tripeptid konnten die Allylgruppen mit Pd Ph3 4 und PhSiH als Allylf nger abgespalten werden Palladiumreste wurden mit einer L sung von KCN in DMSO entfernt und das Peptid mit 95 TFA in DCM vom Harz abgespalten 0 0 0 HO HO 7 b O 7 wo a we fg cr HO HO o 19 20 I oO N De E EE EEN Qo Yo 22 Abbildung 20 Synthese der DHBA Kopfgruppe a MeOH SOCI 98 b Allylbromid K CO THF 86 c Allylbromid K CO3 Cs CO THF R ckfluss 98 d LiOH MeOH THF H O gt 99 4 1 3 3 Peptidsynthese Der etablierte Zugang zu den f nf Kopfgruppen und die reproduzierbaren Kupplungen an Testpeptide erlaubten nun die Synthese einer kleinen Peptidbibliothek Die Synthese der in Tabelle 1 gezeigten Sequenzen erfolgte unter Anwendung etablierter Verfahren auf Polystyrolharz versehen mit einem s urelabilen Wang Linker Die Voraktivierung der Fmoc gesch tzten Aminos uren erfolgte mit HBTU HOBt Seitenketten der Aminos uren wurden mit s urelabilen Schutzgruppen versehen Durch Die funktionellen Gruppen in den Asparagins ure verursachte Nebenreaktionen lassen sich sehr gu
158. e im Rahmen der vorliegenden Arbeit synthetisierten Liganden an der richtigen Stelle der Proteinoberfl che binden 4 1 4 2 Verwendung von GTP als Anker Das Fehlen einer ausgepr gten tiefen Bindungstasche erschwert es die Bindung von m glicherweise schwach affinen Liganden an der richtigen Stelle der Proteinoberfl che sicherzustellen Der Weg schwach bindende Liganden zun chst durch kovalente Verkn pfung mit dem Rezeptor zu selektieren wurde bereits von S L Schreiber et al erfolgreich beschritten wobei er diese Verkn pfung treffend als biasing element e 109 110 bezeichnete 7 In der Arbeit von S L Schreiber bildeten Thiolgruppen in den Liganden zu einem oberfl chlichen Cystein eine Disulfidbr cke aus und stellten so die Bindung an der gew nschten Stelle der Proteinoberfl che sicher Hierf r ist jedoch eine Proteinmutante erforderlich die an der entsprechenden Stelle der Oberfl che ein Cystein tr gt Einfacher und eleganter ist im hier betrachteten Fall die Verwendung von GTP selbst als Anker f r solche Peptide wobei die Verkn pfung ber einen Spacer geschehen sollte In diesem Sinne w re GTP ein Supramolecular Biasing Element Anstelle des Spacers kann sp ter eine Hydrolyse stimulierende Kopfgruppe eingef hrt werden Durch die Ankn pfung der Peptide an GTP ist zwar keine kovalente Bindung an Ras gegeben die picomolare Affinit t von GTP an Ras sichert jedoch eine ausreichend starke Wechselwirkung und gar
159. e von Kinaseinhibitoren dienen die nicht notwendigerweise Wasserstoffbr cken zur Hinge Region bilden sondern Wechselwirkungen in der Triphosphatbindungstasche f r die Affinit t nutzen Allerdings sollte durch Anf gen hydrophober Gruppen und Belegung der hydrophoben Taschen die Selektivit t zugunsten bestimmter Kinasen verbessert werden siehe Kapitel 4 2 7 Als D F r eine bessere bersicht wurde die Kinase im rechten Bild um 20 nach links gedreht 8888 Die hierf r relevanten Aminos uren sind in Tabelle 5 gr n markiert Lars Kissau 4 Spezieller Teil 85 Hinweis f r die Richtigkeit und Plausibilit t diese Bindungsmodus kann die Bindung von Geldanamycin an das ATP bindende Hitzeschock Protein HSP 90 betrachtet werden Auch hier wird die Triphosphatbindungsstelle blockiert und die Wirkung des Proteins beeintr chtigt Geldanamycin war urspr nglich als EGFR Inhibitor propagiert worden Mittlerweile ist bekannt dass die Wirkung auf eine Inhibition der ATPase Aktivit t von HSP 90 zur ckzuf hren ist Dies verhindert die Lokalisierung von EGFR an der Plasmamembran so dass der Rezeptor in die Lysosomen transportiert wird 7 4 2 6 Quantitative Analyse der Bindungsmodi Neben der vorstehend beschriebenen qualitativen Analyse der Bindungsmodi wurden in der Folge Anstrengungen unternommen diese durch quantitative Bewertungen zu st tzen W hrend die Charakterisierung und Bewertung einzelner Wasserstoffbr cken wie hier d
160. echo set gnu off echo read mol 1 mol echo read coord xpdb 1 _m pdb 1 done echo modify mol name 1 _m echo done echo write mol 1 m 1 _m echo exit yes echo EOF sh gt gt 1 out 2 gt amp 1 echo nWrong number of arguments echo Usage minfixbb_run Molecule name n esac Input Datei charm_tempfixbb inp 3K K IR 2K K K K K 3K 3K 3K 3K 2K K K K K FF FFIR RR K 2s 2K FK K ok cons harm force 2 0 mass sele atom CA end comp cons harm force 2 0 mass sele atom C end comp cons harm force 2 0 mass sele atom N end comp cons harm force 2 0 mass sele atom O end comp mini conj rdiel nstep 9000 tolgrad 0 05 3K K 3K 2K K K K K K 3K 3K 2K 2K 2K K K K 3K 3K 3K 2K 2K K K K OIE 3K 3K 3K FK 2K K K K OIE 3K 3K FK FK FK K K K 3K 3K 3K FK FK K FK K 2K 3K 3K 3K FK FK FK K K 2K FK Eee ok AAV MM8 Minimierung einer Proteinstruktur Mit Einschr nkungen der Backbone Atome Anwendung Minimierung der Atome der Seitenketten einer Proteinstruktur Die Einschr nkungen sind st rker als bei AAV MM7 Dies verk rzt die Rechenzeit konserviert aber etwaige Ungenauigkeiten aus der Kristallstruktur Diese Methode ist daher nur f r eine erste Betrachtung geeignet Beschreibung Um eine Kollaps einer Tasche o zu vermeiden werden die Backbone Atome in ihren Anfangsposition fixiert F r die Minimierung wird die Methode des Conjugate Gradient angewendet Skriptname Minfixbb_r
161. ecular Modelling Ergebnisse zu ver ndern und andererseits verschiedene Verfahren zum Aufbau von Dekalinsystemen in kombinatorischen Synthesen zu verwenden Damit w re immer noch die strukturelle N he zum bereits biologisch validierten Startpunkt Nakijichinon C gegeben Im Hinblick auf die angesprochene Kompatibilit t zu zellul ren Systemen ist das Chinonger st als eher bedenklich einzustufen In einem in vitro Test wie er hier vorgenommen wurde ist diese Struktur weniger st rend In einer Zelle k nnen Chinone jedoch toxisch wirken was die Interpretation nicht nur erschwert sondern die Verbindung auch von einer weitergehenden Entwicklung d h klinischen Evaluierung ausschlie t Zu den mit Chinonen in Verbindung gebrachten in vivo Effekten geh ren Zytotoxizit t Immunotoxizit t und Krebsentstehung Die Ursachen sind sehr komplex Chinone k nnen als Michael Akzeptoren wichtige Proteine oder die DNA alkylieren oder durch Redox Prozesse zur Bildung von Superoxid und Peroxidradikalen f hren Zu den Resultaten dieses oxidativen Stresses geh ren unter Krk Die reduzierte Aktivit t ist auch auf sterische Gr nde zur ckzuf hren Lars Kissau 4 Spezieller Teil 89 Anderem die Aktivierung der PKC und Ras sowie DNA Modifikationen Bildung von 8 Oxodesoxyguanosin und damit verbundenen Alterungsprozessen oder Transformationen Die Suche nach Strukturen welche die Hydroxychinon Einheit bioisoster ersetzen k nnen f hrte zur Subst
162. ed Aminos uren durchgef hrt Einerseits wurde Glycin an verschiedenen Stellen der flachen Bindungskerbe als Startpunkt platziert andererseits diente das Arginin 789 des GAP Proteins aus der Struktur des Ras GAP Komplexes als Vorlage Es ist eng an die Phosphatgruppen des GTP sowie Reste in der Switch II Region koordiniert und hat im Sinne der angestrebten Hydrolyse eine bevorzugte Position inne Die bei diesen Runs wiederholt als bevorzugt erscheinenden Aminos uren wurden f r die Synthese einer ersten Peptidbibliothek ausgew hlt Hierzu geh ren Glycin Phenylalanin Glutamin Asparagin Serin Asparagins ure und Tyrosin Die dabei generierten Daten sind auf der beiliegenden CD im Verzeichnis pep gespeichert Die ausgew hlten Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgef hrt BFFF OFFF UFFF ZFFF JFFF BANRG JANRG BGNRG JGNRG BFNRG BAYFG JAYFG ZAYFG BNYFG JNYFG ZNYFG BADFG JADFG ZADFG BNDFG JNDFG ZNDFG ZSQRG ZYQRG BGNFG BFNFG BGDFG BFDFG BANFG JFNRG XFAFG OFNFG UYQRG OFNRG OSQRG UGDFG Tabelle 1 Mitglieder der ersten Peptidbibliothek siehe auch Abbildung 17 4 1 3 Synthese einer kleinen Peptid Bibliothek 4 1 3 1 Auswahl der Kopfgruppen y Phosphatgruppen von Nucleosidtriphosphaten werden in biologischen Systemen entweder auf Serin Threonin Tyrosin oder Wasser bertragen Um die Spaltung der Phosphors ureanhydrid Bindung zwischen dem und y Phosphat von GTP zu bewirken muss die entstehende Ladu
163. egenden Regeln vergr ern k nnte Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 2 2 Allgemeiner Teil Das Arsenal der Methoden die heute der Medizin bei der Behandlung von Tumorerkrankungen zur Verf gung stehen besteht neben radiologischen Verfahren Bestrahlungstherapie aus chirurgischen Eingriffen zur Entfernung des betroffenen Gewebes und dem Einsatz von Chemotherapeutika Neben anorganischen Verbindungen cis Platin finden hier vermehrt komplexe organische Verbindungen Taxol Epothilone Anwendung Einschr nkend wirkt sich jedoch aus dass Bestrahlung und operative Entfernung des Tumorgewebes nicht bei allen Krebsarten m glich sind und Chemotherapie oft unselektiv und von starken Nebenwirkungen gepr gt ist Die Ausbreitung von Tumor Zellen in einem Organismus Metastasierung kann mit diesen Methoden ebenfalls nur unzureichend gehemmt werden Zur Entwicklung besonders wirksamer Methoden der selektiven Bek mpfung von Tumorgewebe ist zun chst ein detailliertes Verst ndnis der molekularen Ursachen der Tumorerkrankungen erforderlich Hieraus ergeben sich Hinweise auf diejenigen Enzyme die eine selektive und wirksame Therapie erm glichen k nnten Der von vielen Pharmaunternehmen verfolgte Ansatz Wirkstoffe zur Inhibition dieser Enzym Targets mittels High Throughput Screenings von riesigen kombinatorisch erzeugten Bibliotheken zu finden hat sich als wenig effektiv und sehr kostspielig erwiesen Trotz enormer Forschungsanstrengungen ist
164. einen sehr hohen ClogP Wert auf Gleichzeitig zeigen die Verbindungen 111 121 und 113 keine Inhibition von PFT und GGTase I was den Vorhersagen der Molecular Modelling Arbeiten entspricht Lediglich 120 wies eine sehr schwache PFT Inhibition in einem der beiden Assays aber nicht in einem Zweiten auf Diese Verbindung k nnte gem den oben diskutierten Bindungsmodi sehr wohl in das aktive Zentrum der PFT passen allerdings w re aufgrund der Analogie zu 110 eine deutlich schw chere Bindung zu erwarten Die ICso Werte best tigen auch hier die Vorhersagen der Molecular Modelling Arbeiten Auff llig ist auch dass Verbindungen wie 109 und 157 trotz sehr guter Inhibition der PFT keine Apoptose im zellul ren Assay ausl sten Bei diesem Assay wurden die zu testenden Substanzen gel st zu den transformierten Zellen in das Medium gegeben Vorbedingung zur eine Apoptose induzierenden Wirkung ist also die Diffusion durch die Plasmamembran Durch die stark differierenden ClogP Werte wird in den Apoptose Assays eine zus tzliche Variable eingef hrt Fehlende Wirkung kann also nicht nur mit fehlender Affinit t zu Target Enzym erkl rt werden sondern m glicherweise auf eine starke Neigung zum Verbleib in Lars Kissau 4 Spezieller Teil 113 einer Membran oder das Erreichen unterschiedlicher intrazellul rer Inhibitorkonzentrationen zur ckgef hrt werden Ziel der Optimierung muss es daher sein auch diesen Parameter konstant im gew nschten Bereich zu
165. elegt Insbesondere bewirkt die Verktirzung der Sequenz dass die Carboxylatbindungsstelle frei bleibt so dass die gleichzeitige Bindung eines CAAX Peptides durchaus m glich w re Aus den hier beschriebenen Bindungsmodi f r Mitglieder der Bibliothek mit Naturstoff identischem R ckgrat folgen auf sehr deutliche Weise auch Erkl rungen f r die Aktivit tsunterschiede innerhalb der in Tabelle 1 gezeigten Verbindungsreihe Interessant ist dass bei 121 111 und 113 trotz freiem C Terminus und sonstiger Identit t zu 110 keine Inhibition beobachtet wurde Dockt man diese Verbindungen in einer zu 110 analogen Weise in das aktive Zentrum der PFT ein berlappen die meta und para Substituenten der Zimts ure mit Cys 206 oder Tyr 2058 Diese Absto ung d rfte Ursache f r die fehlende Aktivit t in beiden in vitro Assays sein Auch die Abstufung in der Aktivit t von 134 und 128 ber 129 bis 114 l sst sich mit diesem Bindungsmodell sehr gut erkl ren W hrend f r 114 eine intramolekulare H Br cke zwischen dem Carbamat O und der C OH Gruppe des Carboxylats in Frage kommt fehlt diese Option bei den schw cher bindenden Analoga Hydrocinnamoyl und Zimts urerest erfordern des Weiteren eine leicht ver nderte Geometrie welche die Bindung in der FPP Bindungstasche schw cht Letztlich ist bei 134 die Nitrogruppe f r eine repulsive Wechselwirkung mit Cys 206 Ala 450 und Arg 401 f r die im Vergleich zu 114 reduzierte Affinit t verantwortlich Bei
166. em diesem Modell m ssen sich hierf r sowohl His 201a als auch Tyr 166a geringf gig aus den Positionen in der 1JCR Kristallstruktur verschieben Auch bei der Bindung des natiirlichen Substrates bewegen sich diese beiden Seitenketten wie durch Lars Kissau 4 Spezieller Teil 98 den Vergleich der IFTI und 1JCR Strukturen der PFT ersichtlich wird 27777 Das 2 Chlor 3 hydroxy 4 methoxyphenylalan n liefert einen Bindungsbeitrag durch hydrophobe Wechselwirkungen mit Tyr 2008 und Tyr 251 sowie vier Wasserstoffbr cken mit Arg 291 und f llt dadurch die Pyrophosphatbindungsstelle gut aus Eine Rotation um die BC yC Achse w re denkbar Das unsubstituierte Tyrosin blockiert den Zugang zum Zinkion Der Abstand und die Lage des Zinks mittig oberhalb der n Ebene 3 5 legen eine gute Kation n Wechselwirkung nahe 4 3 2 2 Bindungsmodi der Pepticinnamin E Analoga Aus der von Dr Michael Thutewohl synthetisierten Bibliothek von Pepticinnamin E Analoga wurden f r eine tiefergehend Analyse diejenigen Verbindungen ausgesucht die in 154 einem biologischen Test eine interessante Aktivit t zeigten Zur Kontrolle wurden auch einige inaktive Verbindungen analysiert Die biologischen Daten stammen aus einem Fluoreszenz basierten Assay in dem PFT katalysiert ein Farnesylrest auf ein Dansyl markiertes Pentapeptid Dansyl GCVLS bertragen wurde wobei die letzten vier Aminos uren des Peptids der CAAX Box von H Ras ents
167. en belegt wird Beschreibung Das Overlay beider Strukturen wird sinnvollerweise in WitnotP unter Anwendung des Skripts USE durchgef hrt Die im graphischen Front End von WitnotP auf diese Weise erzeugten Koordinaten werden durch den Befehl freeze gespeichert Dadurch werden alle Molek le im gleichen Koordinatensystem abgespeichert Mit write xpdb moleculel pdb moleculelname wird das mit moleculelname bezeichnete Molek l als pdb Datei abgespeichert Auf die gleiche Weise wird mit dem zweiten Molek l verfahren Mittels eines Texteditors jot oder nedit werden beide pdb Dateien in ein einziges File kopiert wobei die Koordinaten beider Molek le durch ein TER keinesfalls durch END getrennt werden m ssen Diese Datei wird als Moleculeland2 pdb abgespeichert Die Berechnung mit PQMS kann manuell erfolgen wird jedoch sinnvollerweise mit dem Skript Volume_overlap durchgef hrt Von der UNIX Kommandozeile wird nun die Berechnung gestartet Volume overlap Moleculeland2 pdb In dem automatisch erzeugten Unterverzeichnis volumes finden sich nun die Dateien Moleculeland2 12 area l area sowie 2 area Hier Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 146 sind die Volumina gespeichert Die Berechnung der Schnittvolumina erfolg auf die in Kapitel 4 3 5 beschriebene Weise Skriptname volume_overlap bin csh f set angle 1 0 set sphere 1 4 set id echo 1 cut d f1 split pdb file in two fi
168. en d rfte F r das Modell wurde folgendes Alignment zugrundegelegt das zum Vergleich auch die Sequenz der GGTase II enth lt Lars Kissau 4 Spezieller Teil 115 PFT GGTasel GGTasell PFT GGTasel GGTasell PFT GGTasel GGTasell PFT GGTasel GGTasell PFT GGTasel GGTasell PFT GGTasel GGTasell PFT GGTasel GGTasell PFT GGTasel GGTasell PFT GGTasel GGTasell PVWS PLYSLRPEHARERLODDSVETVTSIEQAKVEEKIOEVFSSYKFNHLVPRLVLORB MCOA BERBH K TOMKEVTiK p pt E GIEL Deele ET e BES ER SP PO VER KARK FERHEOLEPS SHOGHDVNRMAG sis esarvYEDaLsumRKAYIKT Mapas ycsxxp VLDDTENTVISGFVGSLVMNI PHATT INLPNTLFALLSMIMLRDY BMF Ell TG DYEBYcMBeEYLRMSGVYw Bic oFBe LG6s PDGEr EP ZN bRRSIR RES KEORBBRGSFV amp c E LD YKTNCG ISVDSDDLRFC IAV GLTVMDLMGQLHR INKE BEL Er pont CG Bergen eg up LSAV atcT1Gt BBAYNVINREKDLOYBySLKo ANDRE NI TPDLEF Ei W in GC es GK DAINVERA ER s EMAED Ec ABGGYTHCELBALVIDKKERSENLKSE PHSGYTSCBESTEABDUSsDEKESDRFKE SEET Ce TEE TB ER TS HH EI E doc He ht vk PDGSPIL up Bean un 2 br RSKEDF DEY EDTERULSYEMSOOcYNGAFRAA Birk SmiNV RE St i UI
169. en einen Teil der Bindungstasche f r die Methioninseitenkette der CVIM Sequenz K Ras bzw die Serinseitenkette der CVLS Sequenz H Ras In der GGTase I ist Pro152 durch Argl133 ersetzt Dies und der Ersatz von Met193 in der PFT durch Tyr169 in der GGTase I lassen vermuten dass hier die C terminale Aminos ure in einer anderen Konformation bindet und dadurch das freie Carboxylat andere Wasserstoffbr cken ausbildet In diesem Bereich findet man in der GGTase II Leu96 und Tyr97 die keinen Platz f r eine Methionin oder Serinseitenkette lassen Gln167 in PFT bildet mit dem freien Carboxylat der C terminalen Aminos ure ein Wasserstoffbr cke An dieser Stelle findet man in der GGTase II Gly108 Der Bereich der Carboxylat Bindungstasche in der PFT und GGTase I ist daher im Bezug auf das Design selektiver Inhibitoren f r eines der untersuchten Enzyme von gro em Interesse Auch in der Prenylbindungstasche gibt es Unterschiede die f r das Design selektiver Inhibitoren ausgenutzt werden k nnten Die Prenylbindungstasche in der GGTase II Untereinheit wird von sieben hydrophoben Aminos uren begrenzt Trp52 Phe147 Tyr195 Trp243 Trp244 Phe289 und Phe293 hnliche Reste finden sich in der PFT und der GGTase Die Unterschiede sind in Tabelle 14 zusammengestellt Nr PFT GGTase I GGTase II 1 Tyr 105 Ser 85 B Tyr 603 2 Ala 151 B Ala 132 B Leu 648 3 Ser 99 H Thr 79 Leu 597 B 4 Trp 1
170. en hochkonserviert und fast identisch ist Zu den wenigen echten Erfolgen z hlt der Kinaseinhibitor STI 571 3 Handelsname Gleevec siehe Abbildung 2 zur Behandlung der Chronisch Myelotischen Leuk mie CML Diese Erkrankung ist auf eine einzige Genver nderung zur ckzuf hren Durch eine sogenannte Philadelphia Translokation wird das BCR Gene vom Chromosom 22 mit dem c ABL Gene auf Chromosom 9 fusioniert Es resultiert eine konstitutiv aktive Kinase STI 571 inhibiert zwar auch andere Kinasen die Selektivit t ist aber offenbar ausreichend um Nebenwirkungen weitestgehend zu vermeiden Die Inhibition des BCR c ABL Fusionsproteins bewirkt eine eindeutig positive Beeinflussung des Krankheitsverlaufs Das Hauptproblem der Selektivit t von Kinaseinhibitoren kann indes nicht als gel st betrachet werden oy Q NH y Hu any O b oc HN 5 HNS Staurosporin 1 Anilinophthimid Ciba 2 STI 571 CGP 57148 3 HO OTO DO H cn H HO CN HO AG 490 AG 556 4 5 Abbildung 2 Staurosporin und andere Kinaseinhibitoren Aus der Analyse der Strukturen ergeben sich neben der Konkurrenz zu ATP auch andere Ansatzpunkte f r eine Signaltransduktionstherapie auf der Stufe der Rezeptor Tyrosin Kinasen Einerseits kann die Diversit t der extrazellul ren Dom ne ausgenutzt werden Diesen Ansatz verfolgt der von Genentech Inc entwickelte polyklonale Antik rper Herceptin Andererseits kann intrazellul r die Aktivit t der Kinasedom ne auch mit substratko
171. energy cutnb 998 0 mini conj rdiel nstep 9000 tolgrad 0 05 3K K 3K 2K K K K K 3K 3K 3K FI 3K 3K 2K IF FF FF RR Eee ok AAV MM6 Minimierung einer Proteinstruktur Mit Einschr nkungen Anwendung Diese Methode eignet sich f r die schnelle Minimierung von Protein Liganden Komplexen wenn die Proteinstruktur bereits minimiert wurde Andernfalls ist die Verwendung von AAV MM3 AAV MM4 oder AAV MMS besser geeignet Beschreibung Alle Protein Atome werden mit einer fiktiven Feder zur ckgehalten Durch die Einstellung von force 50 0 werden kleinere Ver nderungen der Koordinaten der betroffenen Atome zugelassen Skriptname Minfix_run Dauer Ih Unix bin sh case in 1 sed s XXXX 1 ocg work mm charmm_templ2h inp gt 1 inp charmm lt 1 inp gt 1 out 2 gt amp 1 Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 141 echo witnotp host none lt lt EOF echo set gnu off echo read mol 1 mol echo read coord xpdb 1 _m pdb 1 done echo modify mol name 1 _m echo done echo write mol 1 m 1 _m echo exit yes echo EOF sh gt gt 1 out 2 gt amp 1 echo nWrong number of arguments echo Usage minfix_run Molecule name n esac Input Datei charmm_templ2h inp Minimization of a Protein Ligand Complex 3K KK 2K K 3K K 3K 3K 3K 2K 3K 3K K 3K K 3K 2K K 3K K 3K K 3K 2K K 3K K 3K K K 2K K 3K K 3K K 3K 2K K FK K 3K 2K 3K FK K 3K K 3K K 3K 2K K FK 3K 3K K 3K FK K 3
172. enol sowie die Hydrolyse langsame Prozesse Auch die Spaltung der entsprechenden Phosphors ureester ist recht langsam so dass beide Reaktion in biologischen Systemen einer Katalyse bed rfen Solche langsamen katalyse abh ngigen Reaktionen sind ideal f r die Regulation von biologischen Vorg ngen und in der Tat gilt die reversible Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Proteinen als einer der wichtigsten regulatorischen Vorg nge in Zellen Die beteiligten Enzyme werden gew hnlich ihrer Substrat Spezifit t entsprechend klassifiziert Den Serin Threonin Kinasen S TK Tyrosin Kinasen TK und und Dual Function Kinasen DFK entsprechen die Serin Threonin Phosphatasen Tyrosin Phosphatasen bzw die Dual spezifischen Phosphatasen Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 8 NH NH NN N S Ge N an J ae H H Q H N N u u O P 0 P 0 P 0 0 o P 0 P 0 o O O O O O o Oo n oN Peptid i e Peptid o Peptid SY o7 Portis Kinase Q HO 0 P 0 Abbildung 5 Reaktion die durch Rezeptor Tyrosin Kinasen katalysiert wird Rezeptor Tyrosin inasen sind in Abwesenheit eines extrazellul ren Liganden inaktiv Eine Blockade durch andere Proteine hnlich zur Wirkung der Rinder Pancreas Trypsin Inhibitors oder der PKA konnte bislang nicht nachgewiesen werden eine Autoinhibition scheint plausibel In den Kristallstrukturen der Kinasedom nen von Tie 2 und des FGF1 Rezeptors finden sich Hinweise auf m gliche Autoinhibitions
173. ensbasierte Ansatz II Der Vorteil automatischer Docking Programme liegt zum Einen in der hohen Geschwindigkeit mit der zahlreiche Liganden an einen Rezeptor gedockt werden k nnen in silico screening und zum Anderen kann aufgrund integrierter Scoring Funktionen Lars Kissau 4 Spezieller Teil 77 auch eine relativ objektive Bewertung in Anbh ngigkeit von der Person die die Scoring Funktion erstellt hat verschiedener Inhibitoren durchgef hrt werden Als Validierung f r die Resultate eines automatischen Dockings gilt ein linearer Zusammenhang der Bewertung mit den ICs Werten Daher wurde mit den minimierten Strukturen der interessantesten Mitglieder der Nakijichinon Bibliothek ein automatisches Docking mit GOLD durchgef hrt Als Rezeptor diente das Homologiemodell A des VEGFR 2 Ein linearer Zusammenhang wurde nicht gefunden Korrelationskoeffizient ICs9 Gold Score 0 23 Auch wird z B f r Verbindung 101 ein nicht sehr wahrscheinlicher Bindungsmodus am Besten bewertet Hier findet sich die Carboxylatgruppe in der hydrophoben Tasche und das Dekalinsystem in der Purinbindungstasche Anstelle eines Bindungsmodus der mit experimentellen Daten in Einklang zu bringen ist scheint GOLD hier mehr ein Shape Fit zu produzieren Auch werden beim Ermitteln der gebundenen Konformation nur Rotationsfreiheitsgrade der Inhibitoren ber cksichtigt Die Proteinatome werden jedoch als starre Massepunkte behandelt GOLD dockt die Liganden I
174. ente diese Analyse in einem iterativen Prozess der Verfeinerung der Bindungsmodi Gem AAV MM13 wurden die Wasserstoffbr cken zwischen PFT und den Pepticinnamin E Analoga bestimmt Die Werte sind zusammen mit den relevanten Literaturwerten in Anhang IX aufgef hrt Daraus wird ersichtlich dass die hier gefundenen L ngen und Winkel in den meisten F llen den in der Literatur als optimal betrachteten Werten entsprechen TTT Auf eine Einzelanalyse aller Wasserstoffbr cken sei an dieser Stelle zugunsten der Lesbarkeit verzichtet Es sei jedoch angemerkt dass insbesondere die Wasserstoffbr cken zu den Resten in der Carboxylatbindungsstelle bei allen Inhibitoren nur minimal von den Idealwerten im Bezug auf L nge und Winkel abweichen Besonders starke Wasserstoffbr cken sind in Anhang IX mit A gekennzeichnet 4 3 3 2 Der Beitrag hydrophober Wechselwirkungen bei der Bindung von Inhibitoren an die Farnesyltransferase Die zuvor beschriebenen gedockten Konformationen der PFT Inhibitoren geben bei einer visuellen Analyse d h berlagerung von Kristallstruktur mit Peptid und FPP einerseits und Protein und Inhibitor andererseits bereits Aufschluss ber den zu erwartenden Inhibitionstyp In Abbildung 73 ist eine solche berlagerung gezeigt Es ist gut zu erkennen dass Pepticinnamin E sowohl Teile der Peptidbindungsregion als auch Teile der FPP Bindungstasche belegt Diese steht mit der Wirkung als Bisubstratinhibitor in vollem Einklang
175. enzen im FASTA Format wurden mit dem Editor jot in eine Input Datei f r DIALIGN kopiert Diese ist in Anhang X gezeigt Unix dialign FGFhomol p a lt Return gt dialign ERBhomol p a lt Return gt Die so angeordneten Sequenzen wurden fiir MODELLER 4 0 in folgende Dateien siehe CD kopiert Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 2 201 TIE2 ali VEGFR2 ali VEGFR3 ali ERB ali Die Programmeingaben Auswahl von Algorithmen etc f r MODELLER wurden in folgenden Dateien zusammengefasst siehe CD TIE2 top VEGFR2 top VEGFR3 top und ERB top Damit konnten die Modelle berechnet werden hier am Beispiel eines Tie 2 Modells beschrieben Unix mod4 Tie2 bzw Modi VEGFR2 etc cp Tie2 B999999 Te mod01 pdb whatcheck Te mod01 pdb latex_ old pdbout tex dvips o Tie2_mod01_analyse ps pdbout dvi ghostview Tie2_mod01_analyse ps In analoger Weise wurden die Modelle der anderen Kinasen erstellt und der WHATCHECK Output mit Ghostview visualisiert und analysiert Verbesserungen wurden durch Ver nderungen des Alignments erzielt Die von WHATCHECK erstellten Ramachandran Plots sowie weitere wichtige Bewertungen sind in Anhang V und Anhang VI wiedergegeben Die in Anhang VI aufgef hrten Analysen waren bei der Konstruktion der Modelle anf nglich au erhalb der erwarteten Bereiche Durch schrittweise Verbesserungen des Alignments und der Seitenketten konnten die Modelle verbessert werden Bindungsmodi der Kinaseinhibitoren
176. er Protein Puffer entfernt und ein Mg haltiger Puffer zugegeben In Gegenwart von Magnesiumionen sinkt die Dissoziationsrate des Ras GTP Komplexes drastisch ab so dass durch diese Vorgehensweise das Protein am Bead fixiert wurden Diese Beads wurden zun chst mit einen konfokalen Laser Fluoreszenzmikroskop untersucht Zur berpr fung ob die gemessene Fluoreszenz tats chlich mit der GTP Beladung der Beads korreliert wurden ADP und XDP an den PEGA gebundenen Phosphatspacer 35 gekuppelt und mit Atto655 Ras in Abwesenheit von freiem GTP gekuppelt Die Affinit t von ATP und XTP zu Ras ist um den Faktor 10 XTP bzw 10 ATP niedriger als GTP Erwartungsgem zeigten die ATP und XTP beladenen Beads nur eine sehr schwache bzw keine Fluoreszenz Bei der Durchf hrung des Assays sollte ein Lars Kissau 4 Spezieller Teil 58 gro er berschuss von GTP sicherstellen dass nur solche Liganden mit guter Affinit t auch durch die Fluoreszenz detektiert werden Die Konzentration von Atto655 Ras in der L sung wurde auf ImM eingestellt 0 03 umol in 30ul die Gesamtkonzentration an GTP war mit 1 M deutlich h her siehe Experimenteller Teil Durch die Anwesenheit von GTP in der L sung Konzentration 1 mM konnten Konjugate mit sehr geringer Affinit t nicht an Atto655 Ras binden Die Zahl der stark fluoreszierenden Beads lag unter 1 o Nur diese GTP Peptiden verf gen ber eine ausreichende Affinit t zu Ras um mit dem GTP in L sung konk
177. er Teil 65 4 2 Rezeptor Tyrosin Kinase Inhibitoren 4 2 1 Vor berlegungen Aus den in Kapitel 2 1 1 beschriebenen Erfahrungen mit Staurosporin kann abgeleitet werden dass von einem ATP kompetitiven Inhibitor der nur die hochkonservierte ATP Bindungsstelle belegt wenig Selektivit t zu erwarten ist Wie eingangs erw hnt findet sich hinter der Purin Bindungsstelle eine sehr variable hydrophobe Tasche Die zahlreichen strukturellen Unterschiede machen diesen Bereich f r die Entwicklung von selektiven Kinaseinhibitoren attraktiv Die ersten Kristallstrukturen und Modelling Arbeiten von G Bold et al zeigten dass viele ATP kompetitive Kinase Inhibitoren Wasserstoffbriicken zu R ckgrat Atomen in der Hinge Region bilden wie sie auch vom Purin des ATP gebildet werden Da von den hier untersuchten Kinaseinhibitoren die ATP kompetitive Wirkung vor Beginn der vorliegenden Arbeit nachgewiesen war galt diese Wechselwirkung als einer der wichtigsten Anhaltspunkte bei der Analyse dieser Verbindungen Locri 2 Glu 1047 Lys 1030 Abbildung 43 a Wasserstoffbr cken zwischen IGFIR und ATP b Wasserstoffbr cken zwischen Staurosporin und PKA 4 2 2 Biologisch Validierter Startpunkt der Untersuchungen Mit der erfolgreichen Totalsynthese des ErbB 2 Inhibitors Nakijichinon C 6 und der damit verbundenen synthetischen Zug nglichkeit struktureller Analoga war ein biologisch validierter Startpunkt f r die Entwicklung neuer Rezeptor Tyrosin Kina
178. er abweichende Bindungsmodus von Verbindung 101 die in der Triphosphatbindungstasche der Kinasen bindet und damit eine Leitstruktur f r eine neue Klasse von Kinaseinhibitoren sein k nnte Abbildung 88 Verbindung 98 im aktiven Zentrum der VEGFR 2 Kinase Dom ne Auf Basis des entwickelten Bindungsmodells wurden Vorschl ge f r optimierte Kinaseinhibitoren erarbeitet Hierbei wurde die f r in vivo Experimente problematische Chinon Einheit bioisoster ersetzt 0 Rs NH HO o Cr HO N we I u Lan rk Cr a a oO o Ry R R2 103 105 106 108 Abbildung 89 Strukturvorschl ge f r optimierte Kinaseinhibitoren Gr n markierte Reste sollten die Wechselwirkungen die ATP Ribose imitieren blau markierte Reste k nnten in der hydrophoben Tasche binden und zur Steuerung der Selektivit t herangezogen werden Rot markierte Atome sind f r die Wechselwirkung mit der Hinge Region essentiell Die magente markierten Atome sichern die Bindung in der Triphosphatbindungstasche F r die Molecular Modelling Analyse der Verbindungen einer Bibliothek von Pepticinnamin E Analoga die von Dr M Thutewohl synthetisiert wurde konnte auf zahlreiche Kristall strukturen des Zielenzyms der Farnesyltransferase zur ckgegriffen werden Die Strukturen Lars Kissau 5 Zusammenfassung und Ausblick 125 der zu untersuchenden Verbindungen siehe Anhang X wurden mit CHARMM berechnet und die Inhibitoren anschlie end manuell in das aktive Zentrum der Farnes
179. er die das Grid ber den Rand des Proteins hinaus ragt Werte kleiner als 0 5 oder gr er als 3 5 f hren zu einer erheblich gr eren Anforderung an die Rechenleistung und sind i Allg nicht sinnvoll Skriptname sasurf Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 145 echo Surface grid create around mol_name done 0 5 3 5 echo Compute SaSDist 1 4 mol_name done echo Contour color ausw hlen add mol_ name surface_name end Skriptname vdwsurf echo Surface grid create around mol_name done 0 5 3 5 echo Compute vdwdist 1 4 mol name done echo Contour color ausw hlen add mol name surface_name end Alternativ zur Angabe eines gesamten Molek ls k nnen auch einzelne Atome mit der Maus ausgew hlt werden Nach beendeter Auswahl kann durch die Eingabe done die Berechnung der Oberfl che gestartet werden Eine Oberfl che kann einfach durch die Eingabe Surface delete surface _ name entfernt werden Ein wiederholtes Ein und Ausblenden geschieht entweder innerhalb des Surface Untermen s mit toggle oder direkt im Haupmen mit dem Script TS Skriptname TS bin sh TS toggles a precreated surface Use lt ts surface_name echo Surface toggle echo 1 done end AAV MM12 Berechnung der berlappenden Volumina Connolly Package Anwendung Berechnung des Anteils einer Tasche die von einem Liganden ausgef llt wird oder des Bereichs der von zwei Ligand
180. er drei Prenyltransferasen erlauben von gro em Interesse 2 2 2 2 1 Ausgangspunkt der Untersuchungen Von den vielen in vitro hochaktiven PFT Inhibitoren haben nur wenige die klinischen Phasen Trotz der teilweise bemerkenswerten der Evaluierung erreicht bzw berstanden Wirksamkeit ist die Hemmung der Ras Farnesylierung in vivo vermutlich nicht das relevante Ziel Die Ursachen f r die Tatsache dass verschiedene Tumorzelllinien unterschiedlich auf diese Inhibitoren reagieren sind auch nicht hinreichend bekannt Neben neuen Wirkstoffen sind Werkzeuge zur detaillierten Aufkl rung der von Lipidierungen beeinflussten Signalkaskaden notwendig Nach der erfolgreichen Totalsynthese des peptidischen Naturstoff Pepticinammin EZ und dem Nachweis der Inhibition der PFT wurde diese Verbindung als biologisch validierter Startpunkt f r das Design einer Bibliothek von PFT Inhibitoren zugrunde gelegt Die biologische Evaluierung dieser ersten Generation von Inhibitoren zeigte einige interessante Resultate allerdings waren diese nicht einfach zu rationalisieren Die weitere Verbesserung der Aktivit t und Selektivit t und die damit verbundene Entwicklung optimierter Wirkstoffe und Werkzeuge ist f r ein detailliertes Verst ndnis der Wirkungsweise essentiell OH Cl OMe no SC o N N No NH z O Ne 30 HN A O 9 OH Abbildung 11 Struktur des nat rlichen PFT Inhibitors Pepticinnamin E Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 18 2 3 Entwicklung von Lei
181. er fiktiven Feder Kraftkonstante 50 kcal mol A zur ckgehalten Skriptname Minharmfix_run Dauer 2 5 h Unix bin sh case in 1 sed XXXX 1 ocg work mm charmm_templ1h inp gt 1 inp charmm lt 1 inp gt 1 out 2 gt amp 1 echo witnotp host none lt lt EOF echo set gnu off echo read mol 1 mol Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 140 echo read coord xpdb 1 _m pdb 1 done echo modify mol name 1 _m echo done echo write mol 1 _m 1 _m echo exit yes echo EOF sh gt gt 1 out 2 gt amp 1 echo nWrong number of arguments echo Usage minharmfix_run Molecule name n esac Input Datei charmm_templih inp Minimization of a Protein Ligand Complex 3K K 2K 2K K K K K K 3K 3K 2K 2K 2K K K K 3K 3K 3K FK 2K K K K K FRI FREE ok define FROZEN sele all and not byres segid INHB around 8 0 end define ACTIVE sele not FROZEN and not segid INHB end cons fix sele FROZEN end cons harm sele ACTIVE end force 50 0 mini conj rdiel nstep 9000 tolgrad 0 05 open write unit 42 card name 1_m pdb write coor pdb unit 42 Minimization of complex 1 5 A around INHB close unit 42 Calculate interaction energy between protein and inhibitor cons fix sele none end interactions sele not segid INHB end sele segid INHB end Minimize Inhibitor only starting from its bound conformation delete atom sele not segid INHB end Energy before minimisation
182. er of arguments echo Usage minim_run Molecule name n esac Input Datei charmm_templl inp stimmt mit charmm_templ3 inp bis auf den markierten Bereich berein Minimization of a Protein Ligand Complex 3K K K K K K K K 3K 3K 3K 2K FF FF FF FF FF RR 3K FK FK 2K K K FK 2K K ok define FROZEN sele all and not byres segid INHB around 5 0 end cons fix sele FROZEN end mini conj rdiel nstep 9000 tolgrad 0 05 open write unit 42 card name 1_m pdb write coor pdb unit 42 Minimization of complex 1 5 A around INHB close unit 42 Calculate intereatcion energy between protein and inhibitor cons fix sele none end interactions sele not segid INHB end sele segid INHB end Minimize Inhibitor only starting from its bound conformation delete atom sele not segid INHB end Energy before minimisation energy cutnb 998 0 mini conj rdiel nstep 9000 tolgrad 0 05 KRAFT EEE k k k k k k K k k k k K kK k k k K K k k k k K K k k k 2K k K k k 2K K K k fg 2K K FK K K 2k 2s 2k AAV MMS5 Minimierung einer Proteinstruktur Mit Einschr nkungen Anwendung Minimierung eines Protein Liganden Komplexes Die Zahl der frei beweglichen Atome um den Inhibitor bzw Liganden herum ist gr er als bei AAV MM4 die Genauigkeit dadurch verbessert Die Rechenzeit wird dadurch jedoch verl ngert Beschreibung Alle Atome mit einem Abstand von mehr als 8 A von einem Atom des Inhibitormolek ls werden fixiert Alle anderen Proteineatome werden mit ein
183. erbindung ErbB2 EGF IGFIR VEGFR 2 VEGFR 3 Tie 2 6 29 98 i i i 20 99 i i 14 100 z 44 6 3 5 101 0 3 9 Tabelle 4 ICs Werte der Kinaseinhibitoren HI Der Messung der ICs Werte ging ein grobes Screening voraus Nur die Verbindungen die in diesem ersten Screening durchgef hrt von R Mazitschek Universit t Karlsruhe eine Aktivit t aufwiesen wurden hier genauer untersucht Lars Kissau 4 Spezieller Teil 69 4 2 4 Konstruktion der Homologiemodelle 4 2 4 1 Vor berlegungen Zur vollst ndigen Erkl rung der Aktivit ten und Selektivit ten von Nakijichinon C und dessen Analoga waren dreidimensionale Strukturen der Rezeptor Tyrosin Kinasen Tie 2 IGFIR VEGFR 2 und VEGFR 3 und ErbB 2 erforderlich Kristallstrukturen der Kinasedom nen der ersten drei genannten Proteine sind zwar bekannt allerdings fehlt in den Tie 2 und VEGFR 2 Strukturen ein Ligand Gem der in Kapitel 2 1 2 1 beschriebenen Konformations nderungen bei der Bindung von Liganden macht diese Tatsache die Strukturen f r Docking Experimente unbrauchbar Im Falle der Tie 2 Kristallstruktur kommt zur offenen Konformation und der durch die Verschiebung der C Helix bedingten falschen Positionierung wichtiger Reste wie Lysin 855 und Glutamins ure 872 auch noch eine vermutlich durch Packungseffekte bedingte autoinhibitorische Konformation des Nucleotide Binding Loops hinzu In Abbildung 48 ist der rot eingef rbte Teil des Nucleotide Binding Loops i
184. erten FGF Rezeptor 1 weisen eine ge ffnete Form auf Die Rotation beider Dom nen im Vergleich zur phosphorylierten aktiven Kinase betr gt 20 Diese Beweglichkeit ist Grund f r die angels chsische Bezeichnung der Furche als Hinge Region Scharnier Region Alle Rezeptor Tyrosin Kinasen ben tigen ein Mg um den Transfer des Phosphates zu katalysieren Die Spezifit t der Kinasen wird durch jeweils drei Reste C und N Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 9 terminal von der zu phosphorylierenden Aminos ure des Substrates bestimmt Die Affinit t des Substrates wird jedoch auch teilweise von Dom nen kontrolliert die bis zu 100 3 Trotz Aminos uren N terminal zur Phosphorylierungstelle im Substratprotein liegen zahlreicher kinetischer Untersuchungen ist der genaue Reaktionsverlauf noch nicht bekannt Vieles spricht f r einen random Bi Bi Mechanismus bei dem entweder Substrat oder ATP zuerst binden Eine Generalisierung f r alle Kinasen ist auf Basis der vorliegenden Daten nicht m glich Die Reaktion verl uft ohne ein Phosphoenzym Intermediat Im Gegensatz zur GTPase Reaktion siehe Abschnitt 2 2 2 1 die ber eine assoziativen Mechanismus verl uft sprechen experimentelle Daten im Falle der Rezeptor Tyrosin Kinasen f r einen dissoziativen Mechanismus bei dem die Bindung des y Phosphates zum ADP im bergangszustand bereits weitgehend gebrochen ist 2 1 3 Rolle in der Signaltransduktion In Anhang XI Doppelseite zu
185. etter Zersetzung des Eduktes so dass eine Revision der Schutzgruppenstrategie aussichtsreich einzustufen war erforderlich wurde 0 oO O N TMS ON D Er er 2 na Be 38 39 O H HN in c i dy 40 E 41 Abbildung 25 Synthese des Spacers 32 a TMS CH CH OH HBTU DIEA b H Pd C Methanol ec AllylO POCI Die Wahl des Fluorenylmethylesters wurde aufgrund der M glichkeit einer sehr milden Abspaltung getroffen Nach der DCC DMAP vermittelten Veresterung von 38 konnte durch Reduktion mit SnCl aus 42 in 76 Ausbeute das Anilin 43 erhalten werden Aufgrund der durch die erneute Zersetzung des Eduktes 44 bei der Abspaltung des Fluorenylmethylesters belegten Basenlabilit tt wurden nun s urelabile Schutzgruppen eingesetzt 5 o o HAN ON ST a O2N we b oma 38 42 c o H 2 O_n N N P OFm en oO X 4 CET Abbildung 26 Synthese des Spacers 33 a Fm OH DIC DMAP b SnCl2 DMF e AllylO POCI d Piperidin DMF Auf die s urekatalysierte Veresterung von 38 mit Isobuten zum tert Butylester 46 folgte nun die Reduktion der Nitrogruppe zu 47 Die Umsetzung mit Diallylphosphochloridat ergab 48 in 53 Ausbeute Erfreulicherweise war das Phosphoramidat unter den Bedinungen der tert Lars Kissau 4 Spezieller Teil 44 Butylesterspaltung stabil so dass 48 in einer Testreaktion nach HBTU HOBt Aktivierung mit L Alaninmethylester SC zu 49 werden konnte O ON OH oo Dioxan LL ye HN LL rt ae 38 KE o H
186. eudo Atome mit der Maus markieren igflr_pocket Set radii 1 4 igflr_pocket done Modify atom type igflr_pocket Osp3 done Modify hydrogens igflr_pocket done Write xpdb igflr_pocket igflr_pocket done AnschlieBend kann das Volumen bzw die Uberlappung mit dem hydrophoben Teil eines Inhibitors gem AAV MM12 durchgef hrt werden 6 6 Arbeiten zu Kapitel 4 3 Vorbereitung einer Farnesyltransferasestruktur fiir Molecular Modelling Arbeiten Die Strukturdaten der Ratten Farnesyltransferase wurden aufgrund der Verwendung dieses Enzyms im in vitro Assay fiir die Molecular Modelling Arbeiten ausgesucht Aus der Protein Data Base stammen die Koordinaten fiir 1D8D und 1JCR jeweils mit CAAX Peptid und FPP bzw FPP Analogon sowie f r 1FT1 Letztere Struktur enth lt keine Liganden und diente als Referenz um Ver nderungen des Enzyms bei Bindung von Liganden zu verstehen Zur Vorbereitung der Strukturen sind folgende Arbeitsschritte in durchzuf hren WitnotP Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 2 203 Read xpdb 1d8d pdb done Move molecule 1d8d pdb ftase done Move atoms Cystein s anklicken connected done peptid done Move atoms FPP P anklicken connected done fpp done lt pdb2c ftase Zur Vorbereitung f r eine Kraftfeldminimierung gem AAV MM2 Label type ftase done berpr fung der korrekten Parametrisierung der Atome Die Minimierung erfolgt von der Unix Kommandozeile gem AAV MM9 In WitnotP erfol
187. euge im oben genannten Sinne daher nur eingeschr nkt brauchbar da die Ergebnisse eines Zelltests unweigerlich verf lscht w rden Die Existenz der strukturell verwandten GGTase II die f r Geranylgeranylierung von Rab Proteinen verantwortlich ist wirkt sich in diesen Sinne auch negativ auf die Aussagekraft von in vivo Testresultaten aus Im Anschluss an eine Validierung der Aktivit t der hier vorgeschlagenen Verbindungen w re daher eine Verbesserung der Selektivit t innerhalb der Gruppe der Prenyltransferasen erforderlich 4 3 5 1 Vergleich von PFT GGTase I und GGTase II F r das Design selektiver Inhibitoren ist ein Vergleich der Strukturen der GGTase I GGTase II und der PFT hilfreich F r GGTase II und PFT liegen Kristallstrukturen vor f r die GGTase I jedoch nicht Die a Untereinheit der GGTase I ist mit dem der PFT identisch Nat rliche Selektivit ten und regulatorische Vorg nge sind daher prim r mit den Unterschieden in der Untereinheit assoziiert F r die im folgenden beschriebenen Untersuchungen wurde ein Homologiemodell der B Untereinheit der GGTase I erstellt Der Grad der Identit t zwischen der PFT und der GGTase I ist mit etwa 30 deutlich niedriger als bei den Rezeptor Tyrosin Kinasen die in Kapitel 4 2 beschrieben wurden Dennoch konnte hier ein erstes Modell erstellt werden das zumindest im unmittelbaren Bereich des aktiven Zentrums aufgrund der dort recht hohen Sequenzidentit t eine akzeptable Genauigkeit aufweis
188. f dem Bead ist Lars Kissau 4 Spezieller Teil 50 Fre a el ee b gt 78 79 prop Ai Fro Ai PY PY e Fond gt ER FmO De 81 80 I por z2 0 FmO cl ses Ki ee ell e DEn SS N o oy roo 82 83 Abbildung 35 Synthese des Spacers 35 a TBDPSCI Imidazol DMF 24 h Raumtemperatur b 52b Tetrazol tBuOOH 30 C 3h ch HF Pyridin 1h d Phosgen THF 3h e PheOMe THF DIEA 2h 4 1 4 7 Linker zwischen Harz und Peptid Ein Nachweis des Syntheseerfolges kann bei einer Split Mix Bibliothek nicht ftir jede einzelne Verbindung erbracht werden Die Synthese und vollstandige Charakterisierung einzelner GTP Peptid Konjugate mit den f r die Split Mix Synthese relevanten Aminos uren wurde daher zun chst in Angriff genommen Die f r eine vollst ndige Charakterisierung notwenige Abspaltung der Produkte vom Harz macht Verwendung eines GTP kompatiblen Linkers erforderlich Trotz umfangreicher Variation der Reaktionsbedingungen trat unter sauren Abspaltbedingungen wie sie f r 2 Chlortrityl Wang oder Sasrin Linker erforderlich sind jeweils komplette Zersetzung der Triphosphate auf In Anlehnung an den von H Kunz und O Seitz etablierten HYCRON Linker wurde in Zusammenarbeit mit Dr Laurent Soulere der in Abbildung 36 gezeigt Linker synthetisiert Der Einbau eines Triethylenglykolspacers in den Linker wie dies f r den HYCRON Linker durchgef hrt wurde war wegen der hier beabsichtigten Verwendung von PEGA 1900 Harz Copoly
189. fer A Scheffzek K Proc Natl Acad Sci 1999 96 7065 7070 Gail R Costisella B Ahmadian M R Wittinghofer A Chembiochem 2001 2 570 575 Lars Kissau 8 Anhang 204 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 Guo Z Zhou D Schultz P G Science 2000 288 2042 2045 Ye H F O Reilly K E Koh J T J Am Chem Soc 2001 123 Willumsen B M C A Hubert N L Papageorge A G Lowry D R Nature 1984 310 583 586 Sebti S M Hamilton A D Oncogene 2000 19 6584 6593 Lerner E C Qian Y M Hamilton A D Sebti S M J Biol Chem 1995 270 26770 26773 Gibbs R A Zahn T J Sebolt Leopold J S J Med Chem 2001 8 1437 1465 Waldmann H Thutewohl M Top Curr Chem 2001 211 117 130 Hinterding K Hagenbuch P Retey J Waldmann H Angew Chem Int Ed 1998 37 1236 1239 Hinterding K Hagenbuch P Retey J Waldmann H Chemistry Eur J 1999 5 227 236 Lipinski C A Lombardo F Dominy B W Feeney P J Adv Drug Del Rev 1997 23 3 25 Lipinski C A Lombardo F Dominy B W Feeney P J Adv Drug Del Rev 2001 46 3 26 Tewari Y Miller M Wasik S Martire D J J Chem Eng Data 1982 27 451 455 Fujita T Iwasa J Hansch C J Am Chem Soc 19864 86 5157 5159 Rekker R The Hydrophobic
190. flusst wird wie dies f r die meisten signaltransduzierenden Proteine der Fall ist eine schw chere Bindung und hydrophilere Reste an den Bindungsstellen auf Bereits ein schwacher Ligand vermag Protein Protein Wechselwirkungen signifikant zu beeinflussen Da Enzyminhibitoren oft kompetitiv zu nat rlichen Substraten wirken sollen die oft in hohen intrazellul ren Konzentrationen vorliegen ist eine hohe effektive Konzentration der Inhibitoren in der Zelle erforderlich Diese Anspr che sind daher auch auf die Leitstrukturen anzuwenden Dem gegen ber stehen die Anforderungen f r Wirkstoffe die Protein Protein Wechselwirkungen beeinflussen sollen Hier gelten die von Lipiniski et al vorgeschlagenen Einschr nkungen nicht Von gr ter Bedeutung ist es hier zun chst die Hot Spots der Wechselwirkung zu identifizieren Die Bioverf gbarkeit und intrazellul re Konzentration ist von untergeordneter Bedeutung da die Konzentration der an Signalkaskaden beteiligten Enzyme deutlich geringer ist als z B f r ATP als Substrat einer Kinase Die Entwicklung eines Wirkstoffes der eine Protein Protein Wechselwirkung beeinflusst erfordert also einen Paradigmenwechsel weg von den Lipinski RegeIn Diese ge nderten Anforderungen erlauben auch etwas mehr peptidischen Charakter der Verbindungen Beleg f r diese Tatsache ist der wenn auch vergleichsweise kleine Markt f r peptidische Wirkstoffe Neben den bereits kommerziellen Somatostatin Analoga und
191. folgt mittels des Skripts USE der Anweisung freeze sowie Tastaturanweisungen und Mausbewegungen Beschreibung F r das manuelle Docking eines Liganden in eine bestimmte Position ist es erforderlich die Bewegungen der Maus mit den Atomen des Liganden zu verkn pfen und die Atome des Proteins unbewegt zu belassen Die Bewegung in x y und z Richtung erfolgt in WitnotP durch Mausbewegungen wobei verschiedene Kombinationen der linken mittleren und rechten Maustaste gedr ckt werden m ssen siehe WitnotP_help doc Nach Ausf hrung des Skripts USE wird bei gedr ckter STRG Taste die Mausbewegung nur mit dem Liganden gekoppelt Ansonsten werden alle Atome synchron bewegt Ver nderte Koordinaten m ssen mittels der Anweisung freeze aktualisiert werden da WitnotP die Atome bei der n chsten Anweisung zur ck in die Ausgangsposition setzt UNDO Skriptname Use bin sh USE sets the pivot point of a molecule to its center of mass and connects the dials or mouse movements to that molecule echo set pivot 1 COM 1 done echo select 1 AAV MMI1 Berechnung und graphische Darstellung von vdW oder solvent accessible Oberfl chen Anwendung Vorbereitung von Proteinen f r die Erstellung von Bildern bzw zur optischen Analyse von Bindungstaschen Beschreibung Das Protein muss protoniert und korrekt minimiert vorliegen Die Zahlen 0 5 und 3 5 definieren die Aufl sung bzw die Distanz b
192. ftfeldrechnung CHARMM Parameter und Molecular Dynamics Simulated Annealing Die Bewertung der G te eines solchen Homologiemodells erfolgt z B mittels WHATCHECK Dieses Programm stellt eine Sammlung von Berechnungsroutinen dar die die Qualit t einer 3D Struktur beurteilen Aus der Analyse von Bindungs und Torsionswinkeln der Verteilung hydrophober Aminos uren zwischen dem Inneren des Proteins und der Oberfl che sowie der berpr fung interatomarer Abst nde kann auf die Qualit t des Modells geschlossen werden An das Hinzuf gen von Wasserstoffatomen und essentiellen Metallionen schlie t sich der letzte Schritt des Homology Modelling an die strukturelle Verfeinerung der Struktur mittels Energieminimierung Bedingt durch die Zahl von Atomen in vielen Proteinen kommen hierf r nahezu ausschlie lich Kraftfeldrechnungen in Frage Zu den leistungsstarken vielseitigen und st ndig aktualisierten Programmen geh rt das von M Karplus et al konzipierte CHARMM siehe Abschnitt 2 3 3 2 1 2 3 3 2 3 Docking Zur Vorhersage der gebundenen Konformationen werden vermehrt automatische Docking Programme wie GOLD verwendet Hierbei werden verschiedene m gliche Konformationen der Liganden an einen Rezeptor gedockt und ihre Bindungsaffinit t ermittelt Die Oberfl che des Rezeptors wird nach Art der potentiellen Interaktionsstellen charakterisiert Anschlie end sucht das Programm eine Position des Liganden bei der m glichst viele Interak
193. g die weitere Bearbeitung WitnotP Delete molecule ftase pb2_save_ftase done Read xpdb ftase_m pdb done Move molecule ftase_m pdb ftase done Write xpdb ftase ftase done Eine zus tzliche Minimierung gem AAV MMS8 verfeinert die Struktur ist aber bei der Verwendung f r Docking Experimente nicht unbedingt n tig da die betroffenen Atome bei einer Minimierung eines Protein Liganden Komplexes gem AAV MMS ohnehin in die Optimierung einbezogen sind Mit dieser Struktur k nnen die Bindungsmodi von Farnesyltransferaseinhibitoren ermittelt werden Hierf r recht n tzlich ist eine Hydrophobizitatskarte die wie folgt zu erstellen ist WitnotP lt hydroprep ftase Unix Move ftase_hyd mol ftase_hyd mol2 done Hydromap ftase inp done siehe Anhang VII GRASP Bild mit Snapshot und XV in TIFF Format konvertieren und abspeichern Abbildungen wie X etc k nnen mit der ftase Struktur wie folgt erstellt werden WitnotP Define set ftase rzone 4 peptid done peptidepocket done Define set ftase rzone 4 fpp not set peptidepocket done fpppocket done Define set ftase rzone 12 fpp done proteinsurface done lt sasurf peptidepocket siehe AAV MM11 lt sasurf fpppocket siehe AAV MM11 lt sasurf proteinsurface siehe AAV MM11 Anschlie end k nnen die Farben im Surface Color Untermen individuell ver ndert werden Es ist empfehlenswert f r die Graphiken das Zinkion berproportional darzustellen Wit
194. g kann nur mit aufwendigen Apparaturen IRORI System durchgef hrt werden Bei der Synthese von Peptid Split Mix Bibliotheken bietet sich die Sequenzierung durch Edman Abbau an da dieses Verfahren gut etabliert ist G ngige automatisierte Systeme k nnen selbst wenige Femtomol eines Peptids auf einem Bead sicher analysieren 2 3 3 2 Computer gest tzte Verfahren Molecular Modelling In der modernen biologischen Chemie haben rechnergest tzte Methoden mittlerweile einen festen Platz neben biologischen und chemischen Verfahren erobert Molecular Modelling ist a priori keine Computerwissenschaft jedoch w re die von einem einfachen Protein verursachte Datenflut sicher nicht ohne schnelle Prozessoren zu bew ltigen Unter dem berbegriff sind solche Methoden gesammelt die es erlauben dreidimensionale Strukturen von kleinen Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 22 Molek len und Proteinen zu berechnen sowie die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Liganden zu analysieren Die Quantifizierung der Wechselwirkung zwischen Ligand und Rezeptor stellt die gr te Herausforderung auf dem Gebiet des Molecular Modelling dar Zahlreiche Ans tze f r die hier ben tigten Scoring Functions sind bereits ver ffentlicht Einige sind in kommerziellen Programmen integriert und erlauben eine vom Nutzer unabh ngige aber auch nicht beeinfluss und korrigierbare Bewertung von Wechselwirkungen 2 3 3 2 1 Kraftfelder und Semi empirische Verfahren
195. gen sollten Vorhersagen f r verbesserte Inhibitoren abgeleitet werden 6 98 99 100 101 Abbildung 85 Strukturen von Nakijichinon 6 und den hier untersuchten biologisch aktiven Analoga F r die Analyse mittels Molecular Modelling sind dreidimensionale Strukturen der Inhibitoren und Protein erforderlich Die Strukturen der Inhibitoren wurden durch Kraftfeldrechnungen mit dem Programm CHARMM bestimmt Da nicht f r alle Rezeptor Tyrosin Kinasen Kristallstrukturen vorlagen wurden Homologiemodelle der Kinasedom nen mit dem Programm MODELLER und manueller Optimierung erstellt Da Rezeptor Tyrosin Kinasen sehr flexibel sind und bei der Bindung von Liganden ausgepr gt Konformations nderungen durchlaufen wurden Modelle verschiedener Konformation erstellt und zur Analyse der Bindungsmodi der Nakijichinon Analoga herangezogen Lars Kissau 5 Zusammenfassung und Ausblick 123 Abbildung 86 a Ribbon Diagramm eines der Homologiemodelle der Kinasedom ne von VEGFR 2 b Ribbon Diagramm der Kinasedom ne Homologiemodell von VEGFR 3 c berlagerung der Kinasendom nen von IGFIR blau VEGFR 2 rot und Tie 2 gelb Diese und hnliche berlagerungen dienten zur Analyse der molekularen Ursachen der Selektivit ten Weitere Strukturen sind in Anhang IV gezeigt Stellvertretend f r die f nf untersuchten Verbindungen ist in Abbildung die Wechselwirkung des Naturstoffes Nakijichinon C 6 mit der Kinase ErbB 2 schematisch
196. geschehen Mit folgender Anweisung wird eine rtf Datei mit den Namen mx molt erstellt CHARMm rtf mx mol my_mol done Diese Datei mu anschlie end an die pep rtf Datei angef gt werden Die Benennung der Monomere drei Buchstaben muss eineutig sein AAV MM18 Graphische Analyse der PEP Liganden Anwendung Modifikation des PEP Outputs dass dieser in WitnotP betrachtet werden kann Beschreibung Die Autobond Funktion von WitnotP verkn pft automatisch die Atome bekannter Fragmente wie z B Aminos uren Die D Aminos uren und andere PEP Monomere sind nicht bekannt daher werden die Monomere nach Ende der PEP Rechnung umbenannt Mit dem folgendem Skript ist dies automatisch m glich Skriptname LigConvert bin sh Script LigConvert modifies the names of D Aminoacid residues For example LDR is converted to ARG so that WitnotP can draw the autobonds Usage for a ligand called ligand 1 0 _1 pdb Ligconvert 1 Created February 8th 2001 by Lars Kissau Designed for use in conjunction with the pepd coor and pepd rtf files sed LDA ALA D ligand_ 1 _0_ 2 pdb sed s LDC CYS D sed LDD ASP D sed LDE GLU D sed st DE PHE D sed at DH HIS Di sed s LDI ILE D sed LDK LYS D sed LDL LEU Di sed LDM MET D sed LDN ASN D sed s LDP PROD sed LDQ GLN D sed LDR ARG D sed LDS SER Di Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 152 sed
197. gsmodus von ATP vergleichbare Konformationen der aktivierten Kinasen bedingen w rde war auch Basis anderer Arbeiten zur Erstellung von Kinasemodellen und auch dort von Erfolg gekr nt 134 4 2 4 3 Konstruktion der Homologiemodelle von VEGFR 2 VEGFR 3 und Tie 2 Einsatz des FGF1 Rezeptors als Templat Die Homologiemodelle f r Tie 2 und VEGFR 2 und VEGFR 3 konnten nun auf Basis beider FGFIR Kristallstrukturen mit Inhibitoren erstellt werden Die Prim rsequenzen f r Tie 2 VEGFR 2 und VEGFR 3 wurden der SwissProt Database entnommen Die Prim rsequenzen sind dort unter folgenden primary accession numbers gespeichert P35968 VEGFR 2 P35916 VEGFR 3 und Q02763 Tie 2 Das Alignment mit den Templatsequenzen wurde zun chst mit dem DIALIGN Algorithmus durchgef hrt Insbesondere in SVR Bereichen f hrte der Einsatz dieses Alignments aufgrund gr erer Restraints siehe Kapitel 2 3 3 2 2 zu schlechteren Modellen Daher wurde das Alignment manuell korrigiert und der Zyklus aus Alignment und Modellkonstruktion so lange wiederholt bis diese Fehler minimiert und nahezu alle Reste nach einer Analyse durch WHATCHECK in erlaubten Bereichen des Ramachandran Plots lagen Die hochkonservierten Bereiche im Nucleotide Binding Loop sowie das in der Katalyse involvierte HRDLAARN Motif wurden dabei als Fixpunkte betrachtet und die Sequenzl cken zwischen diesen Fixpunkten verschoben Das Alignment der Prim rsequenzen wie es in
198. gt und in Toluol aufgenommen Nach dreifacher Koevaporation mit Toluol kann das Rohprodukt gereinigt werden AAV 8 Analyse von Peptiden mittels HPLC ESI MS Methode A S ule Macherey Nagel EC 250 4 Nucleosil 100 5 C18 PPN Flu 1 ml min Detektion 254 nm und IC Gradient 0 min 10 Acetonitril 90 H2O 8 min 20 Acetonitril 80 H2O 18 min 95 Acetonitril 5 H2O 25 min 95 Acetonitril 5 H2O 30 min 10 Acetonitril 90 H20 Methode B S ule Macherey Nagel CC 250 4 Nucleosil 100 5 C8 Flu 1 ml min Detektion 254 nm und IC Gradient 0 min 5 Acetonitril 95 HO 4 min 10 Acetonitril 90 H20 23 min 100 Acetonitril 0 H20 25 min 100 Acetonitril 0 H20 30 min 5 Acetonitril 95 H20 Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 133 AAV 9 Reinigung von Peptiden mittels pr parativer HPLC Methode A S ule Macherey Nagel VP 250 21 Nucleosil 100 5 C18 PPN Flu 15 ml min Detektion 215 nm Gradient Methode B S ule Macherey Nagel VP 250 21 Nucleosil 100 5 C18 PPN Flu 15 ml min Detektion 215 nm Gradient AAV 10 Reingung von GTP Peptid Konjugaten mittels Ionen Austausch Chromatographie Die Probe wird auf eine Sephadex G75 S ule angeschlossen an ein Varian ProStar HPLC System aufgetragen und mit einem IM NH4HCO Puffer pH 7 5 linearer Gradient 3 100 in 120 min eluiert Das Produkt wird bei einer Konzentration von 0 48 0 53 M von der S ule eluiert 60 66 Minute Na
199. handran Plot ist die lteste Methode der Qualit ts berpr fung f r Proteinstrukturen Da selbst in den besten Kristallstrukturen einige Nicht Glycin Reste au erhalb der erwarteten Bereich zu finden sind bewertet WHATCHECK den Gesamteindruck in einem Ramachandran Score Die Bewertung ist so geeicht dass die Werte nahe an Null liegen sollten Werte unter 3 zeigen eine falsche Backbone Struktur an 8 6 1 2 Chi 1 Chi 2 Score Verschiedene Seitenketten bevorzugen unterschiedliche Konformationen in Abh ngigkeit von der lokalen Umgebung ob Helix oder Faltblatt etc WHATHCHECK analysiert jede Aminos ure und berechnet auch hier einen Wert f r den Gesamteindruck Da MODELLER bei der Konstruktion der Modelle auch eine Optimierung dieser Konformationen durchf hrt kann durch diese Analyse eine recht wahrscheinliche Seitenkettenkonformation ermittelt werden 8 6 1 3 Inside outside Profil In globul ren Proteinen finden sich hydrophobe Aminos uren eher im Inneren als auf der Oberfl che F r hydrophile Aminos ure gilt das Umgekehrte Diese berpr fung validiert die korrekte Anordnung der Aminos uren auf dem Templat sowie die richtige Position der Seitenketten F r normale globul re Proteine sollte die WHATCHECK Berechnung einen Wert nahe 1 0 ergeben Lars Kissau 8 6 WHATCHECK Analyse der Kinasemodelle 213 8 6 2 Ausschnitte aus den Analysen 8 6 2 1 VEGFR 2 Modell A 8 6 2 2 VEGFR 2 Modell B 2 11 Final summary 2 11 1
200. hase an ein Phe Phe Phe Peptid auf Wang PS Harz gekuppelt Zun chst sollte 3 4 Diaminobenzoes ure N terminal an Peptide gekuppelt werden Die Reaktivit t der meta Aminogruppe machte die Einf hrung einer Schutzgruppe erforderlich Sowohl Versuche zur Acylierung als auch die Versuche verschiedene Urethanschutzgruppen einzuf hren resultierten jeweils in schwer trennbaren Produktgemischen mit geringem Anteil des gew nschten Produkts Die Reaktivit t der para Aminogruppe entspricht der eines Amides was gem dem Vinylogie Prinzip nicht berraschend ist Umgekehrt erkl rt dies auch die schlechte Reaktivit t der Carbonylgruppe bei Kupplungen wie in Vergleichsversuchen mit 4 Aminobenzoes ure festgestellt wurde Die Maskierung der Aminogruppen als Nitrogruppen und die Kupplungen der Peptide mit 3 4 Dinitrobenzoes ure brachten schlie lich den Erfolg Die Absenkung der Energien der n Orbitale durch die Nitrogruppen und die damit verbundene geringere Elektronendichte am Carbonylkohlenstoffatom beschleunigen die Kupplungen mit 3 4 Dinitrobenzoes ure Die anschlie end erforderliche Reduktion der Nitrogruppen bedurfte zun chst einiger Optimierung konnte aber letztlich auf zweierlei Weise bewerkstelligt werden Idealerweise wurden f r die Reaktionen an der festen Phase 20 Aquivalente einer 0 7 M L sung von SnCl An dieser Stelle sei die fruchtbare Kooperation mit der Abteilung von Prof Wittinghofer am MPI dankend erwahnt Lars Kissau
201. he bei den Kinasen ein Teil abgegrenzt werden geschieht dies mit WitnotP copy atoms Anklicken pocket done modify atom type C 3 pocket done modify hydrogens pocket done write xpdb pocket pocket done Anschlie end wird das so definierte Molek l mit dem Inhibitor berlagert die Koordinaten aktualisiert und gem AAV MMI2 die berlappung berechnet Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 154 6 4 Arbeiten zu Kapitel 4 1 Vorbereitung einer Ras Struktur f rs Modelling F r die molecular Modelling Arbeiten in diesem Projekt wurde die Struktur des Ras Proteins aus dem Ras RasGAP Komplex PDB Code 1WQ1 extrahiert und mit der Struktur der G12V Mutante berlagert Aus der unvollst ndigen Ras Struktur PDB Code 5P21 wird das GTP extrahiert und in die Ras Struktur anstelle des GDP AF kopiert Die resultierende Struktur wird f r die weiteren Molecular Modelling Arbeiten verwendet Sie entspricht der Struktur die in L sung bzw in der Zelle vorliegt aufgrund der GTP Hydrolyse aber nicht kristallisiert werden kann Anderer Ras Kristallstrukturen waren deshalb nicht geeignet da hier die Atome von Teilen des Switch II Region nicht lokalisiert werden konnten Aus der Analyse der GTPase Reaktion ist bekannt dass die Switch II Region in einer bestimmten Konformation vorliegen mu bzw durch GAP oder einen anderen Effektor in dieser Orientierung gebracht werden mu Die in Abbildung 16 gezeigten Strukturen wurden anschlie end mi
202. hen Ring gest rt wurde sollten neben flexiblen aliphatischen Strukturen auch substituierte Aromaten als Spacer eingesetzt werden Spacer wie 32 erlauben dar ber hinaus aufgrund der hnlichkeit einen direkten Vergleich zu DABP GTP o o H O o o N P OH O P OH HO HO i HO i OH OH OH oy OH 32 33 34 o o JL o OH OH O O R HO P Jo P OH we O o s OH HO mon o OH 35 36 37 Abbildung 24 Untersuchte Spacer zwischen Peptid und GTP 4 1 4 6 Synthesen der Spacer 4 1 4 6 1 3 Phosphorylaminobenzoes ure Analog zur literaturbekannten Synthese von N Phosphoryl Aminos uren sollte der Spacer 32 ausgehend von 3 Aminobenzoes ure synthetisiert werden Da diese Experimente wenig erfreulich verliefen wurde in Anlehnung an die in Abschnitt 4 3 2 beschriebenen Erfahrungen 3 Nitrobenzoes ure 38 als Edukt eingesetzt Die Veresterung von 38 verlief mit 80 zufriedenstellend Bei der nachfolgenden Reduktion waren die Ausbeuten bei Verwendung von H und Pd C besser als bei Reduktion mit SnCl in DMF Der Phosphorylierung von 40 mit Diallylphosphochloridat wurde hier der Vorzug vor der Lars Kissau 4 Spezieller Teil 43 Standard Phosphoramidit Chemie gegeben da eine Umamidierung am Phosphat als wenig 118 In der Tat konnte die Verbindung 41 in 56 Ausbeute isoliert werden Bei der nachfolgenden Entsch tzung des TMS Ethylesters f hrten jedoch alle Verfahren TBAF in DMF oder DMSO KF in Wasser DMF oder TBACI zu kompl
203. hervorrufen k nnen Die Wirkung von Steroiden auf die Gentranskription ist ein prominentes Beispiel Andererseits bertragen Botenstoffe ein Signal auf membranst ndige Rezeptoren die dieses Signal in das Zellinnere weiterleiten den prim ren Botenstoff jedoch nicht passieren lassen Molekulare Schalter wie das Protein Ras spielen im Prozess der intrazellul ren Signalweiterleitung eine entscheidende Rolle Diese Signaltransduktion erfolgt nicht nur ber kovalente posttranslationale Modifikationen von Proteinen wie Phosphorylierungen Dephosporylierungen sondern auch ber verschiedene Protein Protein Wechselwirkungen Die Regulation der Aktivit t von Ras erfolgt einerseits ber Konformations nderungen als auch post translationale Lipidierungen wie sie etwa von der Protein Farnesyl Transferase PFT oder der Geranylgeranyl Transferasen I durchgef hrt werden Solche auf dem second messenger Prinzip beruhende Signaltransduktionsprozesse erfreuen sich steigenden Interesses seitens der Wissenschaft und Industrie Das gezielte Eingreifen in die Funktion einer Rezeptor Tyrosin Kinase als Anfang solcher Signalkaskaden sowie die gezielte Beeinflussung der Aktivit t des Ras Proteins durch Blockade seiner Lipidierung bzw durch Umwandlung in eine inaktive Konformation sind Gegenstand dieser Arbeit die zum besseren Verst ndnis f r zellul re Vorg nge f hren soll und damit im Sinne Kants die Kenntnis der den Erscheinungen in der Natur zugrundeli
204. hinon und dem C 1 Atom des Dekalins Hierf r k nnte der sterische Anspruch der beiden benachbarten Methylgruppen verantwortlich sein Sowohl Nakijichinon als auch das C 2 Epimer sind daher vergleichsweise starre Systeme Bei beiden Substanzen liegt der unges ttigte Ring in einer Twist Konformation vor der zweite Ring nimmt eine Sesselkonformation ein Durch 1 3 diaxiale Wechselwirkungen der Methylgruppen im ges ttigten Ring ist die Sesselform leicht verzerrt F r die Verbindung 99 und 100 ist die Sessel Sessel Konformation des trans Dekalins unstrittig die Verzerrung durch die exocyclische Doppelbindung bei 99 ist gering N No i OH o Wm o O o o OH 99 100 101 Abbildung 46 Strukturen der biologisch aktiven Nakijichinon Analoga Ein Vergleich der CHARMM minimierten Geometrien mit den Resultaten der AMI Berechnungen ergab eine weitgehende bereinstimmung Die Resultate sind als Kugel Stab Modelle in Abbildung 47 gezeigt Lars Kissau 4 Spezieller Teil 68 Abbildung 47 Kugel Stab Modelle der Verbindungen 99 100 und 101 nach CHARMM Minimierung Zweifelsohne liegen die genannten Verbindungen in zahlreichen Konformationen unterschiedlicher Energie vor F r die weiteren Arbeiten ist es ein plausibler Ansatz mit Energie minimalen Konformationen zu arbeiten da diese einen signifikanten Anteil der Gesamtpopulation darstellen d rften Die gemessenen ICs Werte der Nakijichinon Analoga sind in Tabelle 4 zusammengefasst V
205. hzeitig starke Wasserstoffbriicken zu Arg 291 Lars Kissau 4 Spezieller Teil 101 gebildet werden Der Abstand des Zn zum aromatischen Ring des N terminalen Tyrosins 3 64 f r 110 und 3 56 f r 114 l sst auf eine Wechselwirkung der Kations mit den Elektronen des n Systems schlie end Die Position des Tyrosins wird des Weiteren durch H Br cken der phenolischen OH Gruppe zu Lys 356 und Asp 352 sowie His 362 fixiert Die L ngen und relevanten Winkel der Wasserstoffbr cken der hier betrachteten Verbindungen sind in aus Gr nden der bersichtlichkeit in Anhang IX zusammengefasst Letztlich wird die hydrophobe FPP Bindungstasche durch den Z Substituenten bzw ortho Benzyloxyzimts urerest effektiv blockiert Diese hydrophoben Wechselwirkungen wurden in hnlicher Form beim Bindungsmodus von Pepticinnamin E beschrieben Die Benzyloxygruppe von 114 tr gt zus tzlich noch hydrophobe Wechselwirkungen mit Trp 102 und Trp 106 zur Affinit t bei In diesem Bereich bindet auch die Seitenkette Phenylalanins im CVFM Peptid aus der Kristallstruktur der Ratten PFT 1JCR Anstelle der Wechselwirkung mit Gln 167 bilden die Carboxylatgruppen von 110 und 114 jedoch Wasserstoffbriicken zu Arg 2028 und Tyr 550 aus Vom ortho Benzyloxyzimts ureamid gehen zwei H Br cken zu Tyr 3618 und Tyr 166a aus Sowohl bei 110 als auch 114 ist der untere Teil des aktiven Zentrums effektiv blockiert allerdings ist die Peptidbindungstasche nur teilweise b
206. ichen 42 Fmoc S Aminos uren und synthetisiert Pentapeptide w rde dies die Synthese und Evaluierung von 130 691 232 Verbindungen notwendig machen Einschr nkungen sind daher ebenso erforderlich wie auch die Etablierung einer effizienten Synthese sowie entsprechend leistungsf higer Evaluierungsmethoden Die Untersuchung des Target Proteins mittels Computer gest tzter Methoden wurde daher bereits in der ersten Phase des Projektes durchgef hrt um erste Einschr nkungen bei der Wahl der Aminos uren zu erlauben Aufgrund der dennoch zu erwartenden gro en Zahl von Zielsequenzen schied eine L sungssynthese der Peptide als Option aus 4 1 2 Molecular Modelling Analyse der potentiellen Bindungsstelle Da wegen einer fehlenden Leitstruktur oder anderen Informationen zu positiven Bindungseinfl ssen zun chst keine a priori Einschr nkungen bei der Wahl von Strukturelementen gemacht werden konnten sollte zun chst versucht werden mittels Molecular Modelling die Zahl der Zielverbindungen einzuschr nken Zur Bearbeitung dieser Fragestellung am Computer musste eine geeignete 3D Struktur des Ras Proteins ausgew hlt werden Wenngleich mehrere Kristallstrukturen von menschlichen Ras Proteinen bekannt sind 2697 gelang bislang nur die Kristallisation eines C terminal verk rzten Proteins Da aber die C terminalen Reste nicht in der N he der GTP Bindungstasche liegen ist die Verwendung der Kristallstrukturen der verk rzten Ras Proteine Aminos uren
207. ierte Harz wird mittels Eppendorf Pipette aliquotiert und erneute gewaschen s o Auf diese Weise werden alle Aminos uren und der Spacer aufgekuppelt An die Kupplung des Spacers schlie t sich eine Reaktionskontrolle mittels P NMR an die nach Entsch tzen des Spacers wiederholt wird Vor der Kupplung mit GDP werden alle Harzportionen in den Reaktoren dreimal mit abs DMF gesp lt Die Kupplung mit voraktiviertem GDP erfolgt bei 50 C und langsamer Agitation Nach 14 h Reaktionszeit wird die Reaktion durch P NMR kontrolliert Nach einem letzten Waschen so kann das Harz f r das Screening eingesetzt werden Der Einsatz von 10 quivalenten reduziert die Kupplungszeiten auf unter 1h ist allerdings angesichts der damit verbundenen Kosten nicht empfehlenswert Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 191 Labeln von H Ras mit Atto 655 Eine L sung von verk rztem H Ras Aminos uren 1 166 300 ul 39 8 mg ml H Ras 30 mM Tris HC1 pH 7 5 5 mM Met 3 mM DTE wird in einem Vivaspin Filter Durchl ssig bis 5 kD mit 4 ml Ascorbat Puffer 50 mM Tris HCl pH 7 5 5 mM MgCl2 1 2 mM Ascorbins ure versetzt und 30 min bei 0 C und 2000 g zentrifugiert Das Restvolumen von 50 ul wird erneut mit 4 ml Ascorbat Puffer versetzt und 30 min bei 0 C und 2000 g zentrifugiert Die verbleibenden 50 ul werden mit Ascorbat Puffer auf 100 ul verd nnt und die Proteinmenge mittels Bradford Test bestimmt Man erhalt 21 4 mg ml H Ras Die H Ras L sung w
208. igid run Dauer 30 min Unix bin sh case in 1 sed s KXXXX 1 ocg work mm charmm_tempfixbb_rigid inp gt 1 inp charmm lt 1 inp gt 1 out 2 gt amp 1 echo witnotp host none lt lt EOF echo set gnu off echo read mol 1 mol echo read coord xpdb 1 _m pdb 1 done echo modify mol name 1 mi echo done echo write mol 1 m 1 mi Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 143 echo exit yes echo EOF sh gt gt 1 out 2 gt amp 1 echo nWrong number of arguments echo Usage minfixbb_rigid run Molecule name n esac Input Datei charmm_tempfixbb_rigid inp 388 K 2K 2K K K K K K 3K 3K 3K 2K IF I 3K 3K 2K FFIR RE Eee ok cons fix sele atom CA end comp cons fix sele atom C end comp cons fix sele atom N end comp cons fix sele atom O end comp mini conj rdiel nstep 9000 tolgrad 0 05 3K K K 2K K K K K 3K 3K 3K FI 3K 3K 2K I FF FF RER IRRE 2 FK ig ok AAV MM9 Minimierung einer Proteinstruktur Mit Einschr nkungen der Backbone Atome Anwendung Minimierung der Atome der Seitenketten einer Proteinstruktur Die Einschr nkungen sind st rker als bei AAV MM7 Dies verk rzt die Rechenzeit konserviert aber etwaige Ungenauigkeiten aus der Kristallstruktur Diese Methode ist daher nur f r eine erste Betrachtung geeignet Beschreibung Um eine Kollaps einer Tasche o zu vermeiden werden die Backbone Atome in ihren Anfangsposition fixiert F r
209. ika Da manche cyclische Tetra Penta oder Hexapeptide in Abh ngigkeit von der Sequenz synthetische Probleme bereiten k nnen und die bereits etablierte Chemie f r die Synthese optimierter PFT Inhibitoren weiterhin verwendet werden sollte wurden die in Abbildung 74 gezeigten 14 16 gliedrigen Ringsysteme am Computer untersucht 14 gliedrige Makrocyklen sind aufgrund geringer Ringspannung nicht nur synthetisch besser zug nglich als beispielsweise zyklische Tetrapeptide sondern erm glichen die Erhaltung einer Turn hnlichen Konformation wobei die Alkylkette auch zur Beeinflussung der L slichkeit bzw in sp teren Phasen biologischer Evaluierung zur Beeinflussung die Bioverf gbarkeit modifiziert T 6 werden k nnte 4 3 4 3 M gliche Grundstrukturen f r eine zweite Generation a b N JA O HO H 0 N N O e NH IN el O 160 Lars Kissau 4 Spezieller Teil 111 Abbildung 74 Optimierungsvorschl ge a b FPP kompetitiver Inhibitor c d Bisubstratinhibitor e f Peptid kompetitiver Inhibitor 4 3 4 4 Verst rkung hydrophober Wechselwirkungen Eines der Ziele der Optimierung ist die Verst rkung der Affinit t auch durch Verbesserung hydrophober Wechselwirkungen zwischen Inhibitor und PFT Die Quantifizierung wurde hier in der bereits beschriebenen Weise durchgef hrt siehe Kapitel 4 3 3 2 In Tabelle 11 sind die entsprechenden Werte f r die in Abbildung 74 gezeigten Vorschl ge aufgef hrt Durch Vergleich mit den
210. in BGNRG C1 H32N 1907 Ausbeute 9 mg 16 umol HPLC MS ESI gefunden 537 7 M H berechnet 536 54 Retentionszeit AAV 7A 7 5 min Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 199 BANRG C H34N 1007 Ausbeute 5 mg 9 umol HPLC MS ESI gefunden 551 8 M H berechnet 550 57 Retentionszeit AAV 7B 7 1 min Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 2 200 6 5 Arbeiten zum Kapitel 4 2 3D Strukturen von Nakijichinon C und den biologisch aktiven Analoga Beispiel Nakijichinon C WitnotP Build fragment group keto get Naki_C done Durch entsprechendes Markieren werden folgende Fragment mit den jeweils vordefinierten Atomparametern angef gt Ethylene 3mal Keto mal Serine 1mal C sp3 8mal cyclohexan chair 1mal lt prca Naki_C done Unix Minall run Naki_C done WitnotP Delete molecule Naki_C done Read xpdb Naki_C _m pdb done Write xpdb NakijichinonC Naki_C done Analog dazu wurden die Analoga gezeichnet und minimiert Entscheidend f r korrekte Ergebnisse ist die richtige Parametrisierung der Atome Erstellung der Alignments Konstruktion der Homologiemodelle und Analyse Die Koordinaten folgender Kristallstrukturen wurden der Protein Data Bank entnommen 1 Fibroblast Growth Factor 1 Receptor FGFIR IFGI und 2FGI 2 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 VEGFR 2 1VR2 3 Insulin like Growth Factor 1 Receptor IGFIR 1IR3 4 Insulin Receptor Kinase IRK IIRK Die Prim rsequ
211. in E Analoga Signalkaskaden die f r die vorliegende Arbeit relevant sind Doppelseite zum Ausklappen Lars Kissau 8 1 Abk rzungsverzeichnis 203 8 1 Anhang I Abk rzungsverzeichnis AA 3 NBA AAV AAV MM Abs AMPS AppNHp Aq ATP Boc CDI CHARMM DIC DIEA DMAP DMF DMSO EGFR EI ESI FAB FGFIR Fmoc ges GGTase GOLD GST GTP H Aminos ure 3 Nitrobenzylalkohol Allgemeine Arbeitsvorschrift Allgemeine Arbeitsvorschrift Molecular Modelling Absolut Aminomethyl Polystyrol Adenosin 5 y imido triphosphat quivalente Adenosin 5 triphosphat N tert Butyloxycarbonyl Carbonyl Diimidazol Chemistry at Harvard Molecular Mechanics N N Diisopropylcarbodiimid N Ethyldiisopropylamin 4 N N Dimethylaminopyridin N N Dimethylformamid Dimethylsulfoxid Endothelial Growth Factor Receptor Elektronensto Ionisation Elektronenspray Ionisation Fast Atom Bombardment Fibroblast Growth Factor 1 Receptor Kinase N Fluorenylmethoxycarbonyl Gesattigt Geranylgeranyltransferase Genetic Optimisation for Ligand Design Glutathion S Transferase Guanosin 5 triphosphat Stunde F r diese Arbeiten wurde ausschlie lich die f r akademische Institutionen herausgegebene Version 27b verwendet Dieser Satz von Parametern unterscheidet sich von dem der von Accelrys Inc als CHARMm vertrieben wird Lars Kissau 8 1 Abk rzungsverzeichnis 204 HATU HBTU HOBt HRMS IEC IGFIR M min NBS PEGA PEP
212. in w ssrigen Medien erwies sich Tentagel als Harz f r den on bead Assay als unbrauchbar Exploratorische Versuche mit GTP beladenem Tentagel zeigten zwar eine Wechselwirkung des Proteins mit dem GTP auf der Oberfl che Schichtaufnahmen im konfokalen Lasermikroskop belegten jedoch dass Tentagel entgegen der Herstellerangaben f r ein 128 Gut geeignet f r den Assay ist Protein von 21 kD Ras nicht ausreichend permeabel ist das von M Meldal entwickelte PEGA Harz Aufgrund der wesentlich geringeren Beladung bei gleichzeitem starken Aufquellen des Harzes in DMF mussten die Reaktionsbedingungen geringf gig angepasst werden Die L sungen der Reagentien wurden verd nnt die Reaktionszeiten f r die Kupplungen von 2 Stunden auf 4 Stunden heraufgesetzt Die Kupplungen mit GDP wurden wie zuvor bei 50 C f r 14 Stunden durchgef hrt Lars Kissau 4 Spezieller Teil 56 Absorption Fluoreszenz Absorption Fluoreszenz 300 400 500 600 Abbildung 39 Eine Anregung des Dansyl Farbstoffes f hrt zu intensiver Hintergrundfluoreszenz aller Beads linke Seite Bei Anregung von Atto 655 zeigen nur Beads mit GTP beladen mit Atto655 Ras eine Fluoreszenz rechte Seite 4 1 4 10 Synthese einer Split Mix Bibliothek und biologische Evaluierung Da s mtliche Bestandteile der in Abbildung 21 gezeigten Struktur der Split Mix Bibliothek nun vorlagen konnte diese unter Kontrolle durch die ebenfalls etablierten Methoden syn
213. inatom Inhibitoratom gemessen Literatur gemessen Literatur 109 Y 110 Ph OH H 3 BB CO 2 84 1 9 129 87 110 180 Br Y 110 BB NH Y 1 CO2H 2 56 1 9 157 62 150 180 B Q 113 CONH Y 1 CO2H 1 99 1 9 149 17 150 180 A IA 397 BB CO Y 1 Ph OH 1 83 1 9 123 89 110 180 A 112 ID 596 CO2H H3 NH 2 91 1 8 129 98 100 140 B Q 113 CONH Y 1 CO2H 2325 1 9 118 1 110 180 B Q 113 CONH Y 1 CO2H 2 62 1 9 147 91 150 180 B IA 397 BB CO Y 1 Ph OH 1 72 1 9 85 23 110 180 A S398 OH Y 1 Ph OH 1 92 1 9 111 72 90 130 A 114 K655 NH2 Y3 Ph OH 2 82 1 9 122 36 150 180 B R 590 NEH Y3 Ph OMe 1 96 1 9 146 45 150 180 A R 590 NZH Y 3 Ph OMe 1 93 1 8 146 82 150 180 A Y 660 Ph OH Z 4 BB CO 1 76 1 9 161 03 150 180 A Y 112 Ph OH F 1 CO2H 1 91 1 9 95 9 90 130 A R501 NZH F1CO2H 1 72 1 8 139 91 150 180 A 110 Y 660 Ph OH Z 4 BB CO 1 83 1 9 136 68 150 180 A R 590 NEH Y 3 Ph OMe 2 1 9 147 54 150 180 A R 590 NZH Y 3 Ph OMe 2 1 8 146 51 150 180 B Y 550 Ph OH F 1 CO2H 1 86 1 9 121 49 90 130 A IK 655 NH2 Y3 Ph OH 1 7 1 8 157 99 150 180 A D 596 CO2H Y 3 Ph OH 1 9 1 8 91 59 100 140 B 11 Zur Bezeichnung der Atome wurden folgende Abk rzungen verwendet BB Backbone CONH Seitenkette Amid Ph OH Phenolisches OH Tyrosin CO2H Carboxyatgruppe NEH e Stickstoff Arginin NZH 2 Stickstoff der Guanidyleinheit Arginin NH Aminogruppe DKP Diketopiperazin gt A Winkel und L nge weichen max 10 vom Idealwert ab B Winkel und L
214. indung der Seitenkette der C terminalen Aminos ure besonders wichtig ist Neben der hydrophoben Wechselwirkung zwischen dem Phenylalanin und der Alkylkette Lys 164a tr gt auch eine Wasserstoffbriicke des Inhibitorbackbones zu Tyr 166a zur guten Bindung an die PFT bei Die im Rahmen diese Projektes durchgef hrten Untersuchungen ergeben f r die Verbindungen 109 155 156 147 158 und 159 einen hnlichen Bindungsmodus Das gleiche Grundger st findet sich auch bei Verbindung 143 Die Position der polaren Nitrogruppe in der hydrophoben Tasche ist jedoch weniger vorteilhaft und d rfte zusammen mit der fehlenden Wechselwirkung mit Trp 102 und Trp 106 ausschlaggebend f r die reduzierte Affinit t von 143 sein Die Tatsache dass bei dieser Subbibliothek gro e Substituenten in para Stellung des N terminalen Z oder Lars Kissau 4 Spezieller Teil 103 Hydrocinnamoylrest nicht zu einem Verlust an Aktivit t f hren wie dies f r die zweifach methylierten Analoga Tabelle 17 Anhang X der Fall war ist nach diesem Bindungsmodell auf die ge nderte Backbonekonformation zur ckzuf hren die etwas mehr Raum f r solche Substituenten in der hydrophoben Tasche l sst a b Abbildung 71 a 109 in PFT mit SA Oberfl chen b 109 in PFT f r die Bindung wichtige Aminos uren sind explizit bezeichnet Die hier f r Verbindung 109 gezeigte Position bei der sowohl Teile der FPP als auch der CVLS Bindungstasche belegt werden l sst auf eine Wirku
215. indung in der Farnesyl Bindungstasche sollten sich g nstig auf die Inhibition der PFT und ung nstig auf die Inhibition der GGTase I und II auswirken GGTase I Eine weniger polare Gruppe und ein freies Carboxylat fiir die Bindung in der Carboxylat Bindungstasche alleine w rden zwar aufgrund der identischen a Untereinheit keine Differenzierung zwischen PFT und GGTase I erlauben die GGTase II sollte bereits durch dieses Strukturelement ausgeschlossen sein F r die Differenzierung zwischen GGTase I und der PFT k nnte ein entsprechend gro er sterische Anspruch des hydrophoben Restes sorgen GGTase I Das Fehlen einer Gruppe die in die Carboxylat indungstasche passt sollte die Affinitat zur GGTase I und PFT senken Durch ein Ausnutzen der Unterschiede im hinteren Teil der Prenylbindungstasche Zeilen 4 und 5 k nnte die Selektivit t zugunsten der GGTase II beeinflusst werden 4 3 5 2 Strukturvorschl ge Auf Basis dieser Analyse k nnten die bereits gezeigten Strukturen f r optimierte Inhibitoren zu Selektivit tssteigerung ver ndert werden Lars Kissau 4 Spezieller Teil 118 Abbildung 77 Modifikation eines PFT selektiven Inhibitors Die Einf hrung des blau markierten Phenylrestes in 163 w rde die Bindung an die GGTase I und bedingt an die GGTase II beg nstigen Zeile 6 da das Tyr 205 der PFT hier st ren w rde Der rot markierte Phenylrest k nnte die Selektivit t ebenfalls zugunsten der GGTase I beeinflussen
216. ine langsame Agitation daher unabdingbar und folgendes optimiertes Syntheseprotokoll sehr zu empfehlen Von den eingesetzten Aminos uren sowie von HBTU werden Ma l sungen hergestellt Die Konzentration wird so gew hlt dass bei einem Einsatz von vier quivalente Aminos ure und 3 97 quivalenten HBTU je 2 ml Aminos urel sung und 1 ml HBTU L sung pro Quest Reaktor ben tigt werden Nach der Zugabe von sechs 6 quivalenten DIEA wird das L sungsmittelvolumen auf 4ml mit DMF Peptide Grade aufgef llt Nach einer Kupplungszeit von 4 h und negativem Kaiser Test wurde das Harz gewaschen Sorgf ltiges Waschen ist essentiell f r gute Ausbeuten bei der GDP Kupplung Das automatische Waschprogramm der Quest ist folgenderma en zu programmieren 3 x 4 ml DMF je 5 min 2 x 4 ml Dichlormethan je 5 min 2 mal 4 ml THF 1 x 4 ml DMF 5 min Anschlie end wird sicherheitshalber ein Capping durchgef hrt 10 quivalente Acetanhydrid in 3 5 ml Pyridin Dichlormethan 1 1 Reaktionsdauer 5 min Das Entsch tzen der Fmoc Gruppen erfolgt mit 20 Piperidin in DMF 2 mal 15 min Die Beads aus allen Reaktoren werden anschlie end in einen einzelnen Reaktor gef llt und in 6 ml DMF suspendiert Durch langsame Agitation werden die Beads 30 min durchmischt Die Beads werden in einen 100 ml Rundkolben gesp lt und Dichlormethan und Methanol zugegeben bis das L sungsmittelverh ltnis DMF Dichlormethan Methanol 80 15 5 betr gt Das in dieser Mischung suspend
217. inierten Taschen konnte das Ausma quantifiziert werden in dem die Dekalinsysteme der Inhibitoren die jeweiligen Tasche ausf llen Das vom Inhibitor belegte Volumen innerhalb der hydrophoben Tasche ergibt sich aus berlappungsvolumen Vgemein Volumeninisitor VoluUMenNTasche VOIUMEN inhibitor Tasche Dividiert man das Resultat durch das zuvor berechnete van der Waals Volumen der hydrophoben Tasche erhalt man den angegebenen Prozentwert Dieser zeigt an in welchem Ausma die hydrophoben Tasche durch den Inhibitor ausgef llt wird ist So f llt das Dekalinsystem von Nakijichinon C 6 die hydrophobe Tasche von ErbB 2 zu 95 7 aus w hrend das Dekalinsystem von 98 die entsprechende Tasche von VEGFR 2 zu 92 ausf llt Diese steht im Einklang mit den sehr hnlichen IC aa Werten und den vergleichbar starken Wasserstoffbr cken Erfreulicherweise gelang es auf diese Weise eine Erkl rung f r die gemessenen ICs Werte f r Verbindung 101 zu finden Die bereits erw hnte 18 fach st rkere Affinit t zu IGFIR d rfte demnach auf st rkere Wechselwirkungen in der hydrophoben Tasche zur ckzuf hren sein wie sie durch den h heren Belegungsgrad siehe Tabelle 7 best tigt wird Lars Kissau 4 Spezieller Teil 88 Kinase ICso von 101 der hydrophoben Tasche belegt IGFIR 0 5 uM 84 Tie 2 9 uM 63 VEGFR 2 gt 50 uM d n 7 Tabelle 7 Ausma der Belegung der hydrophoben Taschen von IGFIR Tie 2 und VEGFR 2 dur
218. ionszeit AAV 7A 14 6 min BADFG C25sH30N60s Ausbeute 7 mg 12 umol HPLC MS ESI gefunden 543 7 M H berechnet 542 54 Retentionszeit AAV 7B 10 4 min BAYFG C30H34N607 Ausbeute 3 mg 5 umol HPLC MS ESI gefunden 591 8 M H berechnet 590 63 Retentionszeit AAV 7A 16 5 min BNDFG C26H31N709 Ausbeute 8 mg 13 umol HPLC MS ESI gefunden 586 7 M H berechnet 585 57 Retentionszeit AAV 7B 9 4 min GFYNB C31H35N708 Ausbeute 12 mg 19 umol HPLC MS ESI gefunden 634 8 M H berechnet 633 65 Retentionszeit AAV 7B 11 7 min GFYNZ C30H33N70s Ausbeute 15 mg 24 umol HPLC MS ESI gefunden 620 7 M H berechnet 619 63 Retentionszeit AAV 7A 14 2 min Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 198 GFYAZ C29H32N607 Ausbeute 8 mg 13 umol HPLC MS ESI gefunden 577 8 M H berechnet 576 60 Retentionszeit AAV 7B 10 8 min GFDNZ C25H29N709 Ausbeute 7 mg 12 umol HPLC MS ESI gefunden 572 6 M H berechnet 571 54 Retentionszeit AAV 7A 10 3 min GRQYZ CgH3gN 100s Ausbeute 3 mg 5 umol HPLC MS ESI gefunden 643 8 M H berechnet 642 66 Retentionszeit AAV 7B 8 5 min GFDAZ Cr4H2gNo6Ox Ausbeute 18 mg 34 umol HPLC MS ESI gefunden 529 7 M H berechnet 528 51 Retentionszeit AAV 7A 12 2 min GRQSZ Cx2H34N 1008 Ausbeute 2 mg 4 umol HPLC MS ESI gefunden 567 8 M H berechnet 566 57 Retentionszeit AAV 7A 6 3 m
219. ird mit 300 ul einer L sung von Maleimido Atto 655 5 mg ml versetzt und 16 Stunden im K hlschrank bei 4 C zur Reaktion gebracht Erneut wird mit einem Vivaspin Filter der Puffer gewechselt Das zweimalige Waschen erfolgt mit einem Tris Puffer 30 mM Tris HCl pH 7 5 5 mM MgCh 3 mM DTE Die Bestimmung der Proteinmenge erfolgt erneut durch einen Bradford Test Man erh lt 17 6 mg ml Atto 655 gelabeltes H Ras Dieser Werte korreliert mit der UV Bestimmung Atto 655 11000 bei 650 nm Die Proteinl sung wird in 30 ul Portionen bei 78 C gelagert Bradford L sung 100 ml 50 mg ml Coomassie Blue G 25 ml Methanol 42 5 ml H3PO4 32 5 ml Millipore H2O Hier wird eine Mutante von H Ras verwendet die in Position 39 ein Cystein tr gt Diese einzige freie Thiolgruppe auf der Oberfl che des Proteins reagiert mit dem Fluorophor Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 192 Blocking Puffer 1 30 mM Tris pH 7 5 2 mM DTE 1 w v BSA Sigma 0 1 w v Tween 20 Blocking Puffer 2 30 mM Tris pH 7 5 2 mM DTE 1 w v BSA Sigma 0 1 w v Tween 20 5 mM MgCl Inkubationspuffer 10 ul einer 300 uM Ras Atto 655 UV Bradford Test werden mit Blocking Puffer auf 3 0 ml verd nnt Man gibt 300 ul einer 100 mM EDTA L sung hinzu Durchf hrung des Assays Pro Eppendorf Safe Lock werden ca 2 mg beladenes PEGA Harz DMF befeuchtet eingewogen Die Beads werden je 2 mal mit DMF Dichlormethan und zuletzt THF gewaschen Anschlie end
220. ischer Dockingprogramme Als Input werden lediglich Strukturdaten des Proteins und der zu dockenden Liganden ben tigt Wie in Abschnitt 4 2 5 wurde das Programm GOLD hierf r anf nglich verwendet F r die Versuche mit GOLD wurden die Strukturen der Verbindungen 109 110 111 112 113 114 115 siehe Abbildungen 68 und 69 und von Pepticinnamin E 9 mit den entsprechenden Werkzeugen aus WitnotP erstellt siehe AAV MMI und mit CHARMM minimiert AAV MM3 Da GOLD aus der eingegebenen Konformation durch Rotation um frei drehbare Bindungen viele weitere Konformationen erzeugt und mittels des genetischen Algorithmus bewertet war es hierbei von untergeordneter Bedeutung ob die Anfangskonformationen einem lokalen oder globalen Minimum der potentiellen Energie entsprechen F r das Docking wurden die vom Hersteller empfohlenen Einstellungen bez glich der Anfangspopulation sowie der Mutations und Crossover Operatoren verwendet Aus der Kristallstruktur der Ratten PFT wurden von GOLD die active atoms extrahiert Jede Verbindung wurde 20 Docking Experimenten unterworfen Die von GOLD errechneten Optimalwerte f r jede Verbindung wurden anschlie end gegen die experimentell bestimmten ICso Werte aufgetragen Gem den Literaturangaben zur Zuverl ssigkeit von GOLD Analyse des GOLD Outputs siehe Tabelle 9 zeigt dass bei dem hier durchgef hrten Docking der Pepticinnamin E Analoga keine Korrelation zwischen den experimentell sollte sich hier
221. issau Arbeiten zu Kapitel 4 1 175 wird mit 10 iger NazSO3 L sung gewaschen und mit pH 7 Phosphatpuffer und Ethylacetat extrahiert Die organischen Phasen werden ber NaSO getrocknet und eingeengt Bei der chromatographischen Reinigung werden unpolare Nebenprodukte zun chst mit Cyclohexan eluiert danach mit Cyclohexan Ethylacetat 1 1 v v das Produkt eluiert Man erh lt nach Einengen der Fraktionen ein farbloses l Ausbeute 310 mg 0 55 mmol 38 d Th R Wert Cyclohexan Ethylacetat 1 2 v v 0 34 H NMR CDC13 400 MHz 5 8 08 8 03 m 2H H 2 H 6 7 72 dd 4H H 4 H 5 J 6 65 Hz J 7 43 Hz 7 50 ddd 4H H 1 H 8 J 15 84 Hz J 7 43 Hz J 0 59 Hz 7 37 dt 4H H 3 H 6 J 7 23 Hz J 12 12 Hz 7 31 7 28 m 6H H 3 H 5 H 2 H 7 4 89 d 2H Ph CH O P Jy p 8 41 Hz 4 36 4 26 m 4H Fm CH3 4 18 4 08 m 2H C 9 C NMR CDCL 100 6 MHz 5 170 6 C O 142 2 C 3 141 6 C 8a C 9a 141 4 C 4a C 4b 130 6 C 1 129 9 C 1 C 8 128 7 C 5 127 5 C 2 CO 127 3 C 4 C 5 125 3 C 3 C 6 121 4 C 6 120 2 C 4 118 5 C 2 69 6 Fm CH 68 1 Ph CH2 O 48 5 C 9 31P_NMR CDCI 202 2 MHz 8 0 68 C36H2906P 588 59 FAB MS 3 NBA 589 8 M H 4 Hydroxymethyl benzoes ureallylester 60 204 mg 1 3 mmol 4 Hydroxymethylbenzoes ure werden in 3
222. ist in dieser Datei abzuspeichern und gegebenenfalls manuell zu korrigieren sehr empfehlenswert Die Ausf hrung des Programms erfolgt anschlie end mit mod4 name wobei name f r die jeweils gew hlte Bezeichnung der Dateien steht Modeller 4 0 erzeugt mehrere Dateien von denen in der Datei name B9999999 die Koordinaten des Homologiemodells gespeichert sind Da es sich hierbei um eine Datei im PDB Format handelt ist eine Umbenennung in name pdb sehr sinnvoll und f r die weitere Analyse notwendig WitnotP ben tigt die korrekte Dateiendung Dies ist am Einfachsten von der Unix Kommandozeile mit cp name B9999999 name pdb Enter 3 Schritt Analyse des Modells Neben PROCHECK kann auch das Softwarepaket WHATCHECK angewendet werden a Mit whatcheck name pdb wird die Analyse gestartet Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 149 b Mit latex_old pdbout tex wird aus dem WHATCHECK Output welches aus mehreren Dateien besteht ein zusammenh ngendes Latex Dokument erstellt c Mit dvips o name ps pdbout dvi wird diese Dokument in ein Postscript Format berf hrt d Mit gv name ps kann diese Datei nun betrachtet bzw ausgedruckt werden 4 Schritt Korrektur und Wiederholung der Schritte 1 3 Die in name ps gespeicherten Informationen sollten Aminos ure f r Aminos ure berpr ft werden Einige Fehlermeldungen sind nur f r Kristallographen relevant besonderen Wert sollte aber auf
223. it 95 TFA in Dichlormethan wurden die N terminalen Boc Gruppen entfernt und die Beads damit f r die automatische Edman Sequenzierung vorbereitet 4 1 4 12 Edman Sequenzierung Nach dem Entfernen der Boc Schutzgruppe wurden die Beads in Wasser suspendiert und bei 4 C zur Sequenzierung bei der BASF AG in Ludwigshafen gebracht Die nach dem Waschen in einem Eppendorf SafeLock gelagerten Beads wurden dazu unter mikroskopischer Kontrolle vereinzelt und auf einer Teflonmembran fixiert Insgesamt konnten 7 Beads sequenziert werden Die detektierten Sequenzen sind in Tabelle 2 aufgef hrt Sequenz AIAPA GAMGA GAP ME M PPA E MPF E M Y MM LL PGPMG 89 90 91 92 93 94 95 Menge Bead pmol 25 40 45 30 15 15 25 Tabelle 2 Resultate der Edman Sequenzierung bei der BASF AG Die Aminos uren in Klammern konnten in der Sequenzierung nicht eindeutig bestimmt werden Diese Sequenzen wurden daher bei der weitergehenden Analyse weniger stark gewichtet Die erste Sequenz diente zur Kontrolle der Bibliothek Dieser Bead wurde vor der Inkubation entnommen und mit TFA behandelt Bei 32768 theoretisch m glichen Sequenzen und einer Hitrate von ca 1 o 33 Hits stellen die sechs sequenzierten Beads eine repr sentative Probe dar Die bei der Sequenzierung gemessene Beladung von 15 bis 45 pmol entspricht exakt den Berechnungen Gem Herstellerangaben haben die Beads eine Ausgangsbeladung von ca 150 300 pm
224. itive Inhibition durch 100 Die Triphosphatbindungstasche z hlt zu den hochkonservierten Bereichen der Kinasedom nen und 100 zeigt daher erwartungsgem auch eine reduzierte Selektivit t Sowohl IGFIR als auch VEGFR 3 und Tie 2 werden im einstelligen Mikromolaren Bereich inhibiert Der ermittelte Bindungsmodus ist in Abbildung 59 gezeigt Abbildung 59 a Vorgeschlagene Bindungsmodus von 100 hier an IGFIR Die leere hydrophobe Tasche ist gr n dargestellt AAV MM13 b Bindung von ATP an IGFIR zum Vergleich Interessant ist in diesem Zusammenhang die Selektivit t zwischen VEGFR 2 und VEGFR 3 Innerhalb der Kinasedom ne sind beide Rezeptoren zu 78 4 identisch so dass die beobachtete Selektivit t zun chst berraschen mag Am Ende des Activation Loops in einem Bereich dessen Konformation bei allen betrachteten Rezeptoren sehr hnlich ist findet sich jedoch der entscheidende Unterschied 277 100 bindet in dem Bereich in dem das y Phosphat von ATP auf das Substratpeptid bertragen wird VEGFR 3 hat an der relevanten Stelle einen Serinrest in VEGFR 2 findet sich hier jedoch eine Asparagins ure Unter physiologischen Bedingungen d rfte dies eine elektrostatische Absto ung zwischen dem Carboxylat von 100 und dem Carboxylat der Seitenkette von Asp 1064 in VEGFR 2 verursachen die destabilisierend auf die Bindung von 100 an VEGFR 2 wirkt Verbindung 100 k nnte daher aufgrund dieses Bindungsmodus als Leitstruktur f r eine neue Klass
225. itution des Chinons durch ein y Pyron siehe Abbildung 62 das generell weniger toxisch ist und dennoch hnliche Subsitutionsmuster erlaubt wodurch die Erkenntnisse ber die Beeinflussung der Selektivit t durch die Substituenten direkt weiter verwendet werden k nnten Pyrone sind als Bestandteile oral verf gbarer Wirkstoffe bekannt 1 X X 2 1 OH D O j Es wN E 5 Os 102 103 f HN Cou R2 kein Bindungsbeitrag R R Abbildung 62 Modifikation des Nakijichinon Geriistes Uber die Substitution im blau gekennzeichneten hydrophoben Teil k nnte die Selektivit t gesteuert werden IGF IR selektiv X H X CH oder CH CH X H und Tie 2 selektiv X CH X H X CH oder CH CH D Wasserstoff br ckendonor ber die in Abbildung 62 markierten Positionen Ki X2 und X3 sollte sich die Selektivit t der Inhibitoren zugunsten von Tie 2 oder IGFIR einstellen lassen Keines der hier untersuchten Nakijichinon Analoga wies ein Heteroatom im hydrophoben Dekalinsystem auf Die unmittelbare Nachbarschaft der in Abbildung 62 durch X gekennzeichneten Position zu den f r die Katalyse essentiellen und daher konservierten Aminos uren Lys 855 und Glu 872 er ffnet die M glichkeit beispielsweise durch Einbau eines Stickstoffatoms in den Ring anstelle eines Substitutenten X gt siehe Abbildung 62 ber eine Wechselwirkung mit Glu 872 die gesamte Kinasedom ne in einer geschlossenen Konformatio
226. ke ich f r die angenehme Laboratmosph re Bei der gesamten Arbeitsgruppe m chte ich mich f r die gute Arbeitsatmosph re und die hohe Einsatzbereitschaft w hrend des Umzuges nach Dortmund bedanken Besonderen Dank schulde ich Herrn Dr Armin Widmer Novartis AG f r die gro z gige Bereitstellung der Software WitnotP sowie seine Ratschl ge f r die Installation auf einer SGI O2 Irix 6 5 Maschine Herrn Dr Claus Ehrhardt Novartis AG danke ich f r die zahlreichen Hilfestellungen beim Auffinden versteckter WitnotP Funktionen sowie f r das berlassen einiger Scripte zur Arbeit mit WitnotP Herrn Dr Pascal Furet Novartis AG danke ich f r die Zusammenarbeit und wertvolle Tipps f r die Arbeit mit Rezeptor Tyrosin Kinasen Bei den Mitarbeitern von Prof Dr Wittinghofer m chte ich f r die konstruktive Zusammenarbeit danken Der EDV Abteilung des Max Planck Institutes f r molekulare Physiologie danke ich f r die prompte und stets kompetente Hilfe bei der Beseitigung von Windows spezifischen Problemen Frau Dr Ingrid Vetter und Herrn Dr Christoph Schwittek danke ich f r die freundliche Unterst tzung beim Bew ltigen der Spezialit ten von UNIX sowie Systemabst rzen Den analytischen Abteilungen der Universit ten Karlsruhe und Dortmund danke ich f r die Messung zahlreicher Spektren Herrn Dr Albert danke ich f r die tatkr ftige Hilfe bei der Organisation des Umzuges der Arbeitsgruppe von Karlsruhe nach Dortmund
227. ktes soll zun chst die Affinit t des Molek ls zu Ras im Bereich der GTP Bindungstasche sein Daneben sollen in Zusammenarbeit mit der Abteilung von Prof Dr Wittinghofer am MPI in Dortmund exploratorische Versuche zur GTP Hydrolyse durchgef hrt werden Lars Kissau 3 Ziele der Arbeit 30 3 2 Rezeptor Tyrosin Kinase Inhibitoren Um das Verst ndnis f r die Wirkung und insbesondere f r die Selektivit t des Naturstoffs Nakijichinon und dessen Analoga auf Rezeptor Tyrosin Kinasen auf molekularer Ebene zu erweitern sollte aufbauend auf den synthetischen Arbeiten von Dr Petra Stahl aufgekl rt werden wie diese Verbindungen mit den Kinasedom nen der untersuchten Rezeptor Tyrosin Kinasen wechselwirken Neben den dreidimensionalen Strukturen der Liganden werden hierf r die Strukturen der Kinasedom nen ben tigt Fehlende Kristallstrukturen sollen hier durch die Konstruktion von Homologiemodellen der Rezeptor Tyrosin Kinasen Tie 2 VEGFR 2 VEGFR 3 und erbB 2 ersetzt werden Diese sollten anschlie end zur Aufkl rung der Bindungsmodi der Nakijichinon Analoga eingesetzt werden die mit den vorhandenen Struktur Aktivit ts Daten in Einklang zu bringen sind Dar ber hinaus soll die Grundlage f r die Entwicklung optimierter synthetisch gut zug nglicher Kinaseinhibitoren geschaffen werden was in Anbetracht der in Abbildung 1 gezeigten Erfolgsquote auf diesem Gebiet ein wichtiges Ziel darstellt 3 3 Farnesyltransferase Inhibitoren Unter Ver
228. len f r Proteine die Phosphotyrosinreste in spezifischen Sequenzen erkennen wie z B Grb2 oder Grb7 Das Herunterregulieren einer aktivierten Rezeptor Tyrosin Kinase erfolgt entweder ber Endocytose Ubiquitin abh ngigen Abbau oder die Dephosphorylierung durch bestimmte Phosphatasen Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 6 Wachstumsfaktor Leucin reiche Dom ne Cystein reiche Q Dom ne Fibronectin Typ M Dom ne KID Kinase Dom ne C Terminus EGFR IRK Tie ErbB 2 IGFIR VEGFR FGFR Tie 2 TEK Abbildung 3 Dom nen einiger Familien der Rezeptor Tyrosin Kinasen F r die vorliegende Arbeit ist die Struktur der Kinasedom ne von besonderem Interesse Wie in Abbildung 4 gezeigt trennt eine tiefe Furche die als N bzw C terminal Lobes bezeichneten Subdom nen Der N terminal Lobe besteht aus einer Faltblattregion und einer a Helix Der etwas gr ere C terminal Lobe besteht nahezu ausschlie lich aus a Helices ATP bindet in einer Tasche zwischen diesen beiden H lften die durch die sogenannte Hinge Region verbunden sind Einige Reste in dieser Dom ne sind in allen Protein Kinasen hochgradig konserviert Dazu geh ren zwei Glycinreste im Nucleotide Binding Loop ein Lysin im Faltblatt 3 und eine Glutamins ure in der a Helix des N terminal Lobe der sog C Helix F r Bindung und Katalyse ebenfalls wichtig ist die DFG Sequenz am Anfang des Activation Loop und die HRDLAARN Sequenz im C terminal Lobe Die Asp
229. les containing the two molecules nawk if 1 TER exit else print 1 gt moll pdb nawk BEGIN i 0 if 1 TER i next ifG 1 print ifGi 2 exit 1 gt mol2 pdb if e volumes pqms log rm volumes pqms log pdb2ms lt lt EOF gt gt amp volumes pqms log read moll pdb write elements radii radius write volumes id 1 ms ms quit EOF pqms lt lt EOF gt gt amp volumes pqms log molecule volumes id 1 ms elements radii probe sphere calculate area volumes id 1 out area volumes id 1 c out bac volume volumes id 1 area quit EOF grep Abnormal volumes pqms log gt volumes ab log if s volumes ab log goto stop echo finished PQMS of Ist molecule pdb2ms lt lt EOF gt gt amp volumes pqms log read mol2 pdb write elements radii radius write volumes id ms ms quit EOF pqms lt lt EOF gt gt amp volumes pqms log molecule volumes id ms elements radii probe sphere calculate area volumes id 2 out area volumes id 2 c out bac volume volumes id 2 area quit EOF grep Abnormal volumes pqms log gt volumes ab log if s volumes ab log goto stop echo finished 2nd molecule now doing overall surface cat moll pdb mol2 pdb gt mol12 pdb pdb2ms lt lt EOF gt gt amp volumes pqms log read mol12 pdb write elements radii radius Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 147 write volumes id ms ms quit EOF pqms lt lt EOF gt gt amp volu
230. liegt der Abstand zwischen korrespondierenden C Atomen der Dekalinsysteme bei 2 6 2 8 Diese Verschiebung wiederum bedingt einen sterischen Konflikt der C 2 Methylgruppen mit Resten im vorderen Teil der hydrophoben Tasche nahe der Purin Bindungsstelle Dies erkl rt die Umkehr der Selektivit t Aus diesen Bindungsmodi folgt auch warum die strukturell hnlichen Analoga aus der Bibliothek mit D Aminos uren als Substituenten keine Inhibition von ErbB 2 und VEGFR 2 bei den biologischen Tests zeigten Eine sterische Absto ung mit Val 848 und Leu 840 im Nucleotide Binding Loop w re die Folge Anzumerken ist hier dass die Konstruktion zweier Homologiemodelle f r VEGFR 2 sehr hilfreich war da dadurch die Bewegung der C Helix in Richtung des Inhibitors besser Lars Kissau 4 Spezieller Teil 81 zu verstehen war In den Abbildungen ist ein Ausschnitt aus dem Modell A von VEGFR 2 gezeigt Nucleotide Binding Loop Hinge Region Abbildung 57 C 2 a 98 im aktiven Zentrum von VEGFR 2 b Nakijichinon verursacht eine repulsive Wechselwirkung mit Leu 1035 rot in VEGFR 2 die C 2 Methylgruppe ist magenta gef rbt 4 2 5 1 1 Wechselwirkung von 6 und 98 mit Tie 2 und IGFIR Eine weitere Best tigung f r die Richtigkeit des hier vorgeschlagenen Bindungsmodells f r Nakijichinon C 6 und dessen C 2 Epimer 98 folgte aus der bereinstimmung mit experimentellen Daten bez glich einer Inhibition von Tie 2 oder IGFIR Hierzu wurden die Strukturen der
231. ls eine vielversprechende Strategie ee Abbildung 12 Strategie zur Entwicklung und Optimierung einer Leitstruktur wenn ein R ckgriff auf einen bereits validierten Startpunkt nicht m glich ist 2 3 2 2 Verwendung von Peptiden als Sonden f r die Leitstrukturentwicklung In Abwesenheit eines bereits validierten Startpunktes bedarf es jedoch eines anderen Ansatzes um aus der unendlichen Zahl denkbarer Strukturen solche zu identifizieren die der L sung der gestellten Aufgabe zutr glich sind Aufgrund ihrer Vielfalt im Bezug auf funktionelle Gruppen und in Anbetracht der in Abschnitt 2 3 1 1 erw hnten Eigenschaftsprofile sind Peptide als Sonden f r eine solche Leitstruktursuche geradezu pr destiniert Wie erfolgreich dieser Ansatz sein kann wird durch zahlreiche Literaturbeispiele belegt ber Peptide und Peptidomimetika sind beispielsweise Inhibitoren der SH2 Dom ne zug nglich Auch der Rezeptor f r den Komplementfaktor C5a konnte mit einem zyklischen Peptid inhibiert werden das als Vorstufe eines Entz ndungshemmers evaluiert wird Die im Laufe der weiteren Entwicklung gesuchten Peptidomimetika m ssen nicht nur die geeigneten funktionellen Gruppen tragen sondern auch die Strukturen der Peptide Helix Faltblatt B Turns imitieren Hierf r sind ebenfalls einige vielversprechende Systeme entwickelt worden 2 3 3 Methoden zur Leitstrukturentwicklung Der Ansatz mit chemischen Liganden die Rolle einzelner Gene bzw de
232. lte zur Bestimmung der Beladung das Harz 3 h mit DMF Piperidin gesch ttelt werden 500 ul dieser L sung werden in einer UV K vette mit 2 5 ml DMF Piperidin verd nnt und vermessen Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 132 AAV 5 Entfernen der Fmoc Schutzgruppen Nach Waschen und Capping wird das Harz in einer L sung von 20 Piperidin in DMF suspendiert 10 ml L sung pro 1 g Harz Nach 10 min Sch tteln wird die L sung entfernt und das Harz erneut in einer L sung von 20 Piperidin in DMF suspendiert Anschlie end wird das Harz gem AAV 2 gewaschen AAV 6 Kaiser Test L sung 1 5 g Ninhydrin in 100 ml abs Ethanol L sung 2 80 g Phenol in 20 ml abs Ethanol L sung 3 2 ml einer 0 001 M L sung von KCN in Wasser wird zu 98 ml Pyridin gegeben Durchf hrung Einige Beads werden 2 mal mit Ethanol gewaschen und mit je 2 Tropfen der 3 L sungen versetzt Man erhitzt vorsichtig Abzug f r etwa 4 Minuten auf ca 120 C Blau gef rbte Beads zeigen ein positives Resultat an AAV 7 Spaltung des Wang Linkers Das trockene Harz wird in Dichlormethan suspendiert Nach 30 Minuten Sch tteln wird das L sungsmittel entfernt und das Harz in einer L sung von TFA Dichlormethan Wasser 95 2 5 2 5 suspendiert Nach 1 h Sch tteln wird die L sung entfernt und das Harz erneut in einer L sung von TFA Dichlormethan Wasser 95 2 5 2 5 suspendiert Anschlie end wird 5 mal mit Dichlormethan gewaschen Das Filtrat wird eingeen
233. m Path of the coordinate file inputs ras_hyd mol2 Path of the parameter file if mol2 format inputs RvdwEvdw_new inputs RvdwEvdw_new Solute dielectric Solvent dielectric 18 3 Number of most hydrophobic points to save and display 50 Radius of the probe spher 1 4 Scaling factor for the electrostatic desolvation Scaling factor for the vdW interactions Path of the GRASP executable xprog bin grasp 8 7 2 PEP RECEPTOR read param hero work kissau pepruns pepparam MSI PARAM read topo hero work kissau pepruns pepparam PEP_ligand rtf read pdb hero work kissau pepruns 18060 1 g12vpep180601 pdb set binding site 88 0 1 1 0 7 1 1 0 8 1 1 0 9 1 1 0 Lars Kissau 8 7 Input Dateien f r Molecular Modelling Arbeiten 216 In der selben Weise sind die Aminos uren 12 40 55 99 und 111 125 und 144 156 genannt Damit kann PEP auch Wechselwirkungen berechnen die etwas weiter weg liegen 156 1 1 0 RECEPTOR_END LIBRARY read library read param hero work kissau pepruns pepparam msi_param_old read topo hero work kissau pepruns pepparam pepd rtf read pdb hero work kissau pepruns pepparam pepd coor LIBRARY END SEED read param hero work kissau pepruns pepparam msi_param_old read topo hero work kissau pepruns pepparam pepd rtf set defaultLinkAtom 2 2 N2 C6 Cl C5 CA N CA C read pdb hero work kissau pepruns 180601 g12vseed180601 pdb SEED_END ENERGY set coulombic accessType
234. m Ausklappen sind die in dieser Arbeit betrachteten Rezeptor Tyrosin Kinasen als Bestandteil verschiedener Signaltransduktionskaskaden gezeigt Die in dieser Arbeit verfolgten Ansatzpunkte f r einen gezielten Eingriff sind durch rote Balken gekennzeichnet Aus der Menge der bekannten Rezeptor Tyrosin Kinasen wurden folgende Enzyme aufgrund ihrer Rolle in verschiedenen Signalkaskaden ausgew hlt IGFIR Tie 2 TEK VEGFR 2 KDR VEGFR 3 ErbB 2 Wie eingangs erw hnt stellt die Ausbreitung von Tumorzellen in einem Organismus ein gro es Problem dar Ein Tumor ben tigt ab einer gewissen Gr e eine direkte Versorgung mit Sauerstoff und N hrstoffen Die Tumorzellen produzieren entsprechende Wachstumsfaktoren z B die VEGFs und veranlassen dadurch Endothelzellen benachbarter Gef e zur Differenzierung F r die Metastasierung ist es bedeutsam dass auf diesem Weg nicht nur eine Verbindung zu den Blutgef en des Organismus sondern auch zum Lymphsystem entsteht Das Gef system wird durch einen zweistufigen Prozess aufgebaut siehe Abbildung 6 Zun chst werden Endothelialzellen zur Differenzierung angeregt und bilden eine grobes Netzwerk verbundener Gef e Nach dieser Vaskulogenese erfolgt ein weiterer Umbau dieser Zellen das Netzwerk wird erweitert und nicht endotheliale Zellen werden zur strukturellen Unterst tzung rekrutiert Die Vasculogenese wird durch den vascular endothelial growth factor VEGF und die entsprechenden Rezeptoren VEGF
235. m hier gezeigten Bindungsmodus bleiben weite Teile der Peptidtasche frei insbesondere die Carboxylatbindungsstelle ist wie erw hnt unbesetzt Eine gleichzeitige Bindung von Inhibitor und CAAX Peptid w re m glich wenngleich die Koordination des Cysteins an das Zink sicher verhindert w re Nach diesem Bindungsmodell sollten 110 und 114 zwar zu FPP kompetitiv wirken nicht aber zu einem CAAX Peptid Eine berpr fung dieses Bindungsmodells durch kinetische Untersuchungen best tigte diese Vorhersagen in vollem Lars Kissau 4 Spezieller Teil 102 Umfang Dies kann im Zusammenhang mit der in Abschnitt 4 3 3 beschriebenen quantitativen Analyse als Beleg f r die Richtigkeit des vorgeschlagenen Bindungsmodus gelten 4 3 2 2 3 Untersuchung der dritten Gruppe Tetramere mit modifiziertem R ckgrat Auch f r diese dritte Gruppe von Verbindungen wurden zun chst einfache Struktur Aktivit ts Beziehungen aufgestellt Ein Vergleich der N terminalen Substituenten bei den Verbindungen 111 121 113 114 126 127 und 128 zeigte dass eine para Substitution der Phenylpropionyl oder Cinnamoyl Reste zu einer Abnahme der Aktivit t f hrte Die Verbindungen 112 147 148 149 und 158 hingegen zeigen trotz eines Substituenten in dieser Position eine recht gute Inhibition Dies legt einen grunds tzlich anderen Bindungsmodus nahe Neben der Einf hrung eines Histidins k nnte dies durch die fehlende 2 fache N Methylierung bedingt sein Analog zur
236. mechanismen Im Falle des FGF1 Rezeptors blockieren Teile des Activation Loop in der Struktur der inaktiven Kinase die Bindungsstelle f r Substratpeptide In der Struktur von Tie 2 ist die ATP Bindungstasche durch Teile des Nucleotide Binding Loops belegt Durch die Dimerisierung und damit verbundene Konformations nderungen wird die Autoinhibition aufgehoben und die Phosphorylierung von Tyrosinresten z B in der KID erm glicht Hierdurch entstehen Bindungsstellen f r die Downstream Effektoren Beim Vergleich der phosphorylierten und nicht phosphorylierten Strukturen der verschiedenen Kinasen wird deutlich dass Enzyme aus dieser Klasse sehr flexibel sind und auf die Bindung von Liganden mit deutlichen Konformations nderungen reagieren So ist der Abstand der f r die Koordination der Phosphate essentiellen Aminos uren Lysin 855 sowie Glutamins ure 872 in der unphosphorylierten Tie 2 Struktur mit 7 2 A deutlich gr er als die aus Strukturen aktivierter Kinasen bekannte Distanz von 3 4 A hnliche Differenzen findet man in den inaktiven und aktiven Form der Cdk2 Kinase 8 5 und 3 6 A Grund ist jeweils die Verschiebung der gesamten a Helix im N terminal Lobe teilweise um bis zu 5 Nicht nur innerhalb einer Subdom ne ist die Flexibilit t signifikant auch die relative Orientierung der N und C terminalen Subdom nen zeigt in verschiedenen Protein Kinase Strukturen eine betr chtliche Variabilit t Die beiden Subdom nen im unphosphoryli
237. mer aus Acrylamid und Polyethylenglykol enth lt Polyethylenglykolketten aus 1900 Monomeren als Spacer nicht erforderlich Die Linkersynthese konnte daher vereinfacht und optimiert werden Durch Reduktion von Butindiol mit LiAIH in THF wurde trans 1 4 Butendiol 85 erhalten dass nach Reaktion mit Bromessigs ure tert butylester direkt mit Fmoc Glycin verestert wurde Nach Entsch tzung des tert Butylesters 87 mit TFA in Methylenchlorid konnte das PEGA Harz mit dem vorbeladenen Linker verkn pft werden Das Harz 88 diente in der Folge als Basis f r die Synthese von Testsequenzen Lars Kissau 4 Spezieller Teil 51 HO LiAIH Ho A o HLA SIT Y 84 97 85 60 86 DCC DMAP CH Cl 71 er M E nand NHFmoc HBTU HOBt oe DMF CH Cl 80 ber 2 Stufen 1 TFA CH Cl o o HAL ned nme Gs H 88 Abbildung 36 Synthese der Pd 0 labilen Linkers vorbeladen mit Fmoc Glycin 4 1 4 8 Analytische Methoden und Testsequenzen Das mit dem Palladium 0 labilen Linker und der ersten Aminos ure beladene Harz 88 wurde in der Folge dazu verwendet durch die Synthese von Testsequenzen die Grenzen der Synthesemethoden festzustellen Mit Standardmethoden AAV 1 bis AAV 3 wurden mehrere Peptide synthetisiert Die Seitenketten der Aminos uren waren entweder Allyl Aloc gesch tzt Lysin und Glutamins ure oder s urelabile Schutzgruppen tert Butyl oder Trityl Letztere Schutzgruppen wurden aufgrund der bereits erw hn
238. mes pqms log molecule volumes id ms elements radii probe sphere calculate area volumes id 12 out area volumes id 12 c out bac volume volumes id 12 area quit EOF grep Abnormal volumes pqms log gt volumes ab log if s volumes ab log goto stop echo finished overall surface rm volumes ms if e moll pdb rm moll pdb if e mol2 pdb rm mol2 pdb if e moll2 pdb rm mol12 pdb if e elements radii rm elements radii exit stop echo Abnormal termination of pqms com rm volumes ms if e moll pdb rm moll pdb if e mol2 pdb rm mol2 pdb if e moll2 pdb rm mol12 pdb if e elements radii rm elements radii In einem neuen Unterverzeichnis volumes befinden sich nun die Dateien Mol A and Mol B l area Mol A and Mol B 2 area und Mol A and Mol B 12 area Die hier enthaltenen Volumina werden gem der in Kapitel xx beschriebenen Methode in Wert der prozentualen berlappung umgerechnet AAV MM13 Analyse von Bindungsmodi Skript INHB HB Anwendung Analyse der gedockten Konformation eines Liganden Beschreibung Zur Bewertung eines Bindungsmodus ist es ratsam die Geometrie der Wasserstoffbr cken zu berpr fen Die kann manuell geschehen Untermen Measure in WitnotP oder vereinfacht durch das script INHB HB Voraussetzung ist die korrekte Benennung der Molek le Der Ligand mu als INHB bezeichnet sein das Protein als PROT Skriptname INHB HB echo display
239. mistry P et v R S Eds John Wiley amp Sons Chichester 1998 Vol 1 p 271 277 Brooks B R Bruccoleri R E Olafson B D States D J Swaminathan S Karplus M J Comp Chem 1983 4 187 217 Budin N Ahmed S Majeux N Caflisch A J Comb Chem 2001 4 661 673 Altschul S F Gish W Miller W Myers E W Lipmann D J J Mol Biol 1990 215 403 410 Morgenstern B Bioinformatics 1999 15 211 218 Eddy S R Bioinformatics 1998 14 755 763 Sali A Mol Med Today 1995 1 270 277 Jones G Willet P Glen R C Leach A R Taylor R J Mol Biol 1997 267 727 739 Jones G Willet P Glen R C J Mol Biol 1995 245 43 48 Holland J Adaptation in Natural and Artificial Systems second edition ed M LT Press Cambridge MA 1992 Lucasius C B K G Chemometr Intell Lab 1993 19 1 9 Klebe G Universitat Heidelberg 1991 Schmid R Monatsh 2001 132 1295 1326 Southall N T Dill K A Haymet A D J J Phys Chem 2002 106 521 533 Colmenarejo G Alvarez Pedraglio A Lavandera J L J Med Chem 2001 44 4370 4378 Brady G P Stouten P F W PASS Manual 1997 Majeux N Scarsi M Apostolakis J Ehrhardt C Caflisch A Proteins 1999 37 88 105 Reineke U Schneider Mergener J Angew Chem Int Ed 1998 37 769 771 Pai E F Krengel U Petsko G A Goody R S Kabsch W Wittinghofer A EMBO J 1990 9 2351 236
240. ml abs DMF gel st und mit 423 mg 1 3 mmol Cs gt CO und 115 ul 1 4 mmol Allylbromid versetzt Man r hrt 14 h bei Raumtemperatur und verd nnt die Reaktionsmischung mit 50 ml Ethylacetat Nach Extraktion mit IN HCl 2 mal 30 ml und Wasser 2 mal 40 ml wird die organische Phase ber Na2SO getrocknet und eingeengt Nach s ulenchromatographischer Reinigung erh lt man ein farbloses l Ausbeute 240 mg 1 25 mmol 96 d Th Re Wert Cyclohexan Ethylacetat 1 1 v v 0 58 H NMR CDCI 400 MHz 7 92 d 2H C 2 C 6 J 7 32 Hz 7 33 d 2H C 3 C 5 3J 7 32 Hz 6 02 m 1H CH CH CH 5 17 m 2H CH gt CH CH 4 99 m 2H CH3 CH CH 3 4 72 s 2H Ph CH2 OH Cat 192 21 ESI MS 193 41 M H Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 176 Die Me werte stimmen mit den Literaturangaben berein 3 tert Butyl diphenyl silanyloxymethyl phenyl methanol 79 In einem 25 ml Zweihalskolben werden bei Raumtemperatur 500 mg 3 62 mmol 3 Hydroxymethylbenzylalkohol und 493 mg 7 24 mmol frisch getrocknetes Imidazol in 2 ml wasserfreiem Dimethylformamid gel st und bei Raumtemperatur mit 0 95 ml tert Butyl diphenylsilylchlorid versetzt Nach 2 h R hren bei 50 C und 2 h R hren bei Raumtemperatur wird mit 50 ml s urefreiem Ethylacetat verd nnt und mit ges NaCl L sung 3 x 50 ml extrahiert Die organische Phase wird ber NaSO getrocknet und im Vakuum eingeengt Nach Reinigung durch Flash Chromatographie
241. mpe ge ffnet Mittels Mausbewegung wird im Move Plate Men die Petrischale bewegt bei gleichzeitiger visueller Kontrolle Das Sichtfeld ist schwarz fluoreszierende Beads werden als helle rote Punkte wahrgenommen Die Abdeckung der oberen Lampe wird entfernt und die Schlinge zu dem als Hit identifizierten Bead maneuvriert Im Men Adjust wird mittels Mausbewegung der Mikromanipulator unter st ndiger visueller Kontrolle abgesenkt bis die Schlinge um den Bead herum liegt Erneut wird in das Move Plate Men gewechselt und der Bead in der Schlinge aus dem Ensemble herausgezogen bis in einen zuvor markierten Bereich auf der Petrischale der frei von anderen Beads ist Der auf diese Weise isolierte Bead wird mit 5 ul Blocking Puffer versetzt und mit einer Eppendorf Pipette aufgenommen Die Beads werden in einem Eppendorf SafeLock gesammelt und zur Sequenzierung vorbereitet su Edman Sequenzierung Ein HQ Cy5 Langpass Filterset der Firma AHF Analysentechnik wurde ebenfalls getestet die Resultat waren jedoch nicht besser 8 Ebenfalls getested wurde das Aufspie end der fluoreszierenden Beads mit einer Glaskapillare Der Durchmesser der Spitze lag bei ca 1 um Die ausgezogenen Kapillaren wurden an einem semi automatischen Puller der Firma Narishenge Scientific Instruments hergestellt Die mechanische Instabililt t der Beads f hrte jedoch oft zur Zerst rung der Beads so dass dem Cryo Loop Verfahren der Vorzug gege
242. mpetitiven Inhibitoren blockiert werden Ihre Entwicklung setzt allerdings genaue Kenntnisse ber Ort und Art der Bindung der Substrate voraus Die von A Levitzki entwickelten Verbindungen AG 490 4 und AG 556 5 siehe Abbildung 2 wirken Substrat kompetitiv und geh ren damit zu den wenigen in vitro und in vivo erfolgreichen Resultaten dieses Ansatzes Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 5 2 1 2 Strukturelle Eigenschaften und Mechanismus 2 1 2 1 Struktur Rezeptor Tyrosin Kinasen RTK sind Transmembran Glycoproteine die nach Bindung ihrer peptidischen Liganden an die glykosylierte extrazellul re Dom ne dimerisieren und das extrazellul re Signal durch Phosphorylierung von Tyrosinresten verschiedener Substrat Proteine in das Cytoplasma weiterleiten RTKs aktivieren dadurch zahlreiche Signaltransduktionskaskaden resultierend in Zellwachstum differenzierung oder Ver nderungen des Zellmetabolismus Zu dieser Familie von Proteinen geh ren Rezeptoren f r Insulin und Insulin hnliche Wachstumsfaktoren sowie andere Wachstumsfaktoren wie den Epidermal Growth Factor EGF Vascular Endothelial Growth Factor VEGF oder Fibroblast Growth Factor FGF Daneben gibt es noch zahlreich NRTKs Nonreceptor tyrosine kinases die integrale Bestandteile der durch die RTKs aktivierten Signalwege sind Hierzu geh ren z D Src Abl die Janus Kinasen Jaks und die MAP Kinasen Wie in Abbildung 3 gezeigt schlie t sich an die extrazellul re Dom
243. n ber diese Wechselwirkung mit der C Helix zu stabilisieren Die Position von Ser 779 und Thr 843 in ErbB 2 Zeile 3 und Zeile 10 in Tabelle 5 bieten die M glichkeit selektive und verbesserte Inhibitoren f r ErbB 2 durch Inkorporation geeigneter H Br cken Akzeptoren zu synthetisieren Dieser Wasserstoffbr ckenakzeptoren w re hierf r in den mit X und in X3 in Abbildung 62 markierten Positionen zu platzieren Neben der Variation des Nakijichinon Ger stes w re es auch denkbar die hier gewonnenen Erkenntnisse auf andere Strukturen zu bertragen Lactame wie in Abbildung 63 gezeigt k nnten die erforderlichen Wasserstoffbr cken beisteuern Eine ebenfalls interessante Variante w re ein R ckgriff auf die Struktur von Thalidomid Contergan Hier w re die Addition eines Ribose Mimics ebenso sinnvoll wie die Eliminierung einer der beiden Carbonylgruppen ttttt Die Nummerierung bezieht sich auf Tie 2 Lars Kissau 4 Spezieller Teil 90 Thalidomid 106 Abbildung 63 Vorschl ge f r Strukturen optimierter Kinaseinhibitoren Verbindung 104 k nnte wie in Abbildung 64 dargestellt an Tie 2 oder VEGFR 2 in Abh ngigkeit von den Resten R bis R4 binden Aufgrund ihrer modularen Struktur eignet sich die vorgeschlagene Struktur ideal zur weiteren Optimierung mittels der Synthese eine fokussierten kombinatorischen Bibliothek Abbildung 64 104a links im aktiven Zentrum von VEGFR 2 und 104b rechts im
244. n AAV 5 wurde das Harz in einer L sung von 50 mg 0 36 mmol 5 eq 6 Aminonicotins ure 137 mg 0 36 mmol 5 eq HBTU 125 ul 0 73 mmol 10 eq DIEA und 5 ml DMF suspendiert und 4 h gesch ttelt Nach Abspaltung vom Harz gem AAV 6 wurden die fl chtigen Bestandteile aus der Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 164 Abspaltl sung entfernt zweimal mit 20 ml Toluol koevaporiert und das Rohprodukt gem AAV 8 Methode B Retentionszeit 6 43 min gereinigt Ausbeute 28 2 mg 48 umol 67 d Th IH NMR CDC 400 MHz 6 8 60 br s IH Aminonicotins ure H 2 7 90 7 80 m 7H Phe H 2 H 6 Aminonicotins ure H 4 7 79 7 54 m 9 H Phe H 3 H 4 H 5 7 38 d IH Aminonicotins ure H 5 y 9 38 Hz C33H33Ns5Os 579 6458 FAB MS 3 NBA 580 2 M H 1 7 HRMS FAB 3 NBA berechnet 580 2560 gefunden 580 261 1 3 Nitro benzoesaure 9 H fluoren 9 ylmethylester 42 1 g 5 98 mmol 3 Nitrobenzoes ure in 5 ml abs Methylenchlorid und 200 ul DMF werden unter R hren mit 60 mg 0 5 mmol DMAP und 1080 mg 6 0 mmol Fluorenylmethanol versetzt Man k hlt auf 0 C ab und setzt 1 02 ml 6 6 mmol Diisopropylcarbodiimid zu Nach 10 min R hren bei 0 C erw rmt man auf Raumtemperatur und r hrt weitere 180 min Der ausgefallenen Harnstoff wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt Das Rohprodukt wird erneut in 100 ml Methylenchlorid gel st mit 30 ml 0 5 N HCl und 50 ml ges NaHCO L sung gewaschen und ber NaSO ge
245. n Dichlormethan ergab 75 Diese Verbindung wurde als Test an L Phenylalaninmethylester gekuppelt Auch die nachfolgende Entsch tzung von 76 mit Piperidin in DMF verlief erfolgreich so dass 75 f r die Festphasensynthese eingesetzt werden konnte Dieser bis Fluorenylmethyl gesch tzten Phosphatlinker ist nicht nur gut zug nglich sondern auch unter milden Bedingungen zu entsch tzen Des Weiteren erf llt er die Anforderung an eine l ckenlose Reaktionskontrolle da die Effizienz der Kupplung des Linkers auf die letzte Aminos ure an der festen Phase per Fmoc Bestimmung quantifiziert werden kann 177 BnCl Brg K Aon __ TPA BEE ee RI ay _ 212 HO NaH 70 THF 71 P 67 73 H2 Pd C MeOH 91 1 FmO PNiPr A e Tetrazol o X CHL CH3 CN K oO F oo A on pN AQ mO OFM 2 tBOOH Goal 75 ra 73 3 TFA CHCl 78 ber 3 Stufen o Fm BE e He P o Hoc y a D ORO Abbildung 33 Synthese der Spacers 37 Der Linker ist auch in L sung bei 50 C mindestens 48 Stunden stabil so dass eine f r die Festphasensynthese ausreichende Stabilit t attestiert werden konnte F r die Synthese der Lars Kissau 4 Spezieller Teil 49 Test Verbindungen wurde daher der Spacer 37 sowie der von H Kunz und O Seitz entwickelte HYCRON Linker verwendet d VERON obera erg TE RER IR reg AH NN N AFG 77 O o o NH rod er 5 o k OH OH Abbildung 34 Synthese von Testverbindungen wie 77a mit dem Spacer 37 a
246. n Zeile 8 Tabelle 5 Lars Kissau 4 Spezieller Teil 82 Abbildung 58 Bindung von 101 an IGFIR links und Tie 2 rechts Grund f r die beobachtete Selektivit t d rften ung nstige Wechselwirkungen des Dekalinger sts mit Cys 1045 in VEGFR 2 bzw Cys 993 in in VEGFR 3 bzw Thr 843 in ErbB 2 sein Ala 981 in Tie 2 st rt hier nicht siehe Zeile 10 in Tabelle 5 Zu den sterischen Gr nden kommt bei der Bindung an Tie 2 die M glichkeit zur Bildung einer Wasserstoffbr cke zwischen der Carboxylatgruppe von 101 und Asn 834 von Tie 2 Nucleotide Binding Loop An dieser Stelle findet man in VEGFR 2 und VEGFR 3 ein Alanin so dass die zus tzliche Bindungsenergie nicht zu Verf gung steht Verbindung 101 und der hier vorgeschlagene Bindungsmodus best tigen auch die Hypothese dass die Struktur der Kinase auch von Art und Gr e des Inhibitors abh ngt In diesem Fall war das Modell A von Tie 2 nicht geeignet die Selektivit t vollst ndig zu erkl ren Das manuelle Docking in das aktive Zentrum von Modell B f hrte jedoch zu schl ssigen Erkl rungen Die gute Affinit t zu Tie 2 wird demnach nicht alleine durch den zus tzlichen Beitrag einer weiteren Wasserstoffbr cke bedingt Die hydrophoben Wechselwirkungen des Dekalinger stes mit Ile 902 und Ile 866 in der hydrophoben Tasche werden erg nzt durch die Interaktion mit Phe 835 In Modell A ist dieser Rest zu weit vom Inhibitor entfernt Aufgrund der zus tzlichen Wasserstoffbr cke zu Asn 83
247. n aus Kristallen oder entsprechen diese aufgrund kristallographischer Besonderheiten z B Packungseffekte nicht der nativen Struktur kommen Verfahren zur Berechnung dieser Strukturen zum Einsatz Der wissensbasierte Ansatz auch Homology Modelling genannt gr ndet auf der vergleichbaren Faltung sequenzhomologer Proteine Der Prozess besteht aus mehreren Einzelschritten Ausgehend von der Prim rsequenz des Zielproteins m ssen homologe Proteine gesucht werden Ihre bekannte dreimensionale Struktur soll als Templat dienen Je h her der Grad der Homologie desto zuverl ssiger ist das Homologiemodell F r diesen Arbeitsschritt gibt es mittlerweile zahlreiche Programme F r die vorliegende Arbeit wurde die Software BLAST verwendet die ber das Internet Datenbanken wie die SwissProt Database nach Proteinen durchsucht die zu einer vorgegebenen Sequenz homolog sind Die Prim rsequenz des Zielproteins wird durch Vergleich mit der Templatsequenz in strukturell konservierte Regionen SCR und strukturell variable Regionen SVR unterteilt Die Sequenzen werden so aneinander angepasst dass SCRs parallel liegen und innerhalb der SVRs m glichst viele Aminos uren homolog sind W hrend BLAST und hnliche Programme prim r nach SCRs Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 24 suchen erlauben Programme wie DIALIGN auch die korrekte Anordnung von Aminos uren innerhalb der SVRs Verwendet werden hierf r mathematische Such Methoden wie das Hidden Markov M
248. n bedingen k nnte In der markierten flachen Kerbe finden sich jedoch hydrophobe Stellen die unpolare Wechselwirkungen mit einem Liganden eingehen k nnten 4 1 2 1 Berechnungen mit PEP 1 0 Um die gro e Zahl der m glichen peptidischen Liganden vor der Synthese sinnvoll zu reduzieren wurde mit dem Programm PEP Peptide Engineering Program ein in silico screening einer kombinatorischen Peptid Bibliothek durchgef hrt Die Verwendung von Peptiden als Sonden f r geeignete Kombinationen von Funktionalit ten bzw hydrophoben Resten sowie deren geometrische Anordnung kann nur dann optimal funktionieren wenn ein m glichst gro er Bereich des Funktionalit ts Strukturraumes erreichbar ist In der von Prof Caflisch bereitgestellten Version von PEP waren nur S Aminos uren in der Monomer Bibliothek enthalten Der Algorithmus des Programmes erlaubt jedoch auch den Einsatz von R Aminos uren als Monomere sowie die Verkn pfung nicht peptidischer Fragmente Daher Lars Kissau 4 Spezieller Teil 33 wurde die Monomer Bibliothek die mit PEP 1 0 geliefert wurde erweitert AAV MMI7 Neben den bereits vorhandenen 20 nat rlichen Aminos uren wurden die D Enantiomere sowie einige nicht nat rliche Aminos uren hinzugef gt Da die Position des Seeds d h der ersten Aminos ure einen erheblichen Einfluss auf das Resultat der Berechnungen haben kann wurden mehrere Runs jeweils mit verschiedenen Seed Positionen und unterschiedlichen Se
249. n dar Aus dem Vergleich der beiden Hydrophobizit tskarten leitet sich die Arbeitshypothese ab das Dekalinger st der Inhibitoren in der hydrophoben Tasche zu platzieren Das Muster der Wasserstoffbr cken sowie die Position des Dekalinger sts in der hydrophoben Tasche waren die Grundlagen des in der vorliegenden Arbeit verfolgten wissensbasierten Ansatzes zur Aufkl rung der Bindungsmodi der Nakijichinon Analoga Hydrophobe Tasche Nakijichinon C Abbildung 54 Hydrophobizit tskarte von ErbB 2 links oben Hervorgehoben ist die hydrophobe Tasche hinter der ATP Bindungsstelle Aus der Struktur von Nakijichinon C und dessen Hydrophobizit tskarte wird der Fit des Naturstoffes in die Tasche verdeutlicht Aus Gr nden der bersichtlichkeit sind keine Wasserstoffatome gezeigt Lars Kissau 4 Spezieller Teil 79 4 2 5 1 Wechselwirkung von Nakijichinon C 6 und dessen C 2 Epimer 98 mit ErbB 2 und VEGFR 2 Zu den interessantesten Resultaten der biologischen Evaluierung von Nakijichinon C und dessen Analoga geh rt sicherlich die Inhibition von ErbB 2 durch den Naturstoff und die Inhibition von VEGFR 2 durch das C 2 Epimer wobei die beiden Epimere jeweils vollst ndig selektiv f r eine der beiden Rezeptor Tyrosin Kinasen sind Nakijichinon C und dessen C 2 Epimer konnten mit den vorliegenden Homologiemodellen manuell in die aktiven Zentren gedockt werden Wie aus Abbildung 55 ersichtlich passt das substituierte Dekalinger st
250. n der Tie 2 Kristallstruktur gelb abgeknickt und die Purinbindungstasche wird durch einen Glutamins urerest im Nucleotide Binding Loop blockiert Die Seitenketten von Glu 903 Tyr 904 und Ala 905 in der Hinge Region sind explizit gezeigt ebenso die f r die Koordination der B Phosphatgruppe essentiellen und daher strikt konservierten Reste Lys 855 und Glu 872 Im Gegensatz zum Homologiemodell von Tie 2 blau Konstruktion siehe Kapitel 4 2 4 3 ist die Kristallstruktur f r Docking Experimente unbrauchbar Lys 855 Glu 872 Homologiemodell Kristallstruktur Abbildung 48 Modell der aktiven Form von Tie 2 blau und Kristallstruktur der inaktiven Form gelb Im biologischen Test wurden anstelle der membrangebundenen Rezeptoren lediglich die als GST Fusionsproteine exprimierten Kinasedom nen der Rezeptor Tyrosin Kinasen verwendet Eine Wechselwirkung der Inhibitoren mit extrazellul ren oder trans Membran Dom nen Lars Kissau 4 Spezieller Teil 70 wurde nicht untersucht Dies rechtfertigt es f r die vorliegende Arbeit Homologiemodelle der Kinasedom nen und nicht der gesamten Rezeptoren zu erstellen und zur Aufkl rung der molekularen Ursachen der beobachteten Aktivit ten heranzuziehen F r die Analyse der Nakijichinon Analoga mussten daher abgesehen von der f r Molecular Modelling Arbeiten geeigneten Struktur des IGFIR Homologiemodelle f r Tie 2 VEGFR 2 VEGFR 3 und Erb B2 auch HER 2 Neu genannt erstellt werden 4 2 4
251. n die potentielle Energie eines Molek ls berechnet werden die sich aus verschiedenen Energien zusammensetzt Etot Estr Ebend Etors Evaw Eelec Neben reinen Schwingungs oder van der Waals Termen werden auch Cross Terme z B fiir Drehschwingungen berechnet Grundgedanke ist dass Abweichungen von Idealwerten im Aufbau von Spannungsenergien resultieren Kraftfeldprogramme versuchen daher eine Funktion ftir die Gesamtenergie zu minimieren und alle Bindungen den Idealwerten anzun hern Eine weitere implizite Annahme ist die bertragbarkeit von experimentellen Bindungsparametern auf andere Molek le Da sich jedoch z B nicht alle Sauerstoffatome in hnlichen Umgebungen befinden sind f r CHARMM Rechnungen alleine hierf r mehr als 20 Parameters tze f r verschiedene Umgebungen definiert CHARMM Chemistry at Harvard 78 79 Molecular Mechanics ist ein von M Karplus et al entwickeltes Kraftfeldeprogramm In gleicher Weise wird unterschiedlichen Hybridisierungen oder Bindungsordnungen durch Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 23 Parametrisierung weitere Atomtypen Rechnung getragen Die Minimierung der Gesamtenergiefunktion erfolgt nach verschiedenen Methoden wobei die zwei Folgenden am gebr uchlichsten sind a Steepest Descent Bei dieser Methode wird die erste Ableitung der Energiefunktion berechnet nachdem jeweils ein Atom aus der Ursprungsposition verschoben wurde Anhand der ersten Ableitung legt das Programm die weitere
252. nd in Abbildung 50 farbig hervorgehoben Hinge Region hy Activation DL s Loop 2 d we lt o 5 Abbildung 50 Kristallstrukturen der Kinasedom ne des FGF1 Rezeptors mit Sugen links und Parke Davis rechts Inhibitoren Der flexible Teil des Nucleotide Binding Loop ist Rot eingefarbt Dies belegt die Bedeutung des induced fit Konzeptes insbesondere bei der Arbeit mit hochflexiblen Strukturen wie den Kinasedom ne der Rezeptor Tyrosin Kinasen Die Konformation der Kinasedom ne ndert sich nach Bindung eines Liganden wobei das Ausma der nderung von der Struktur des Liganden ATP oder ein Inhibitor stark abh ngig ist Diese Erkenntnis f hrte zur Aufstellung der Arbeitshypothese dass die Konstruktion verschiedener Homologiemodelle auf Basis beider FGFIR Strukturen f r eine Analyse der Inhibitoren von Nakijichinon Typ vorteilhaft sein k nnte Nach der Ver ffentlichung erster Resultate wurde eine hnliche Hypothese auch von A J Brigdes Head of Cancer Research Pfizer Inc propagiert Er geht ebenfalls davon aus dass sehr aktive Inhibitoren einen hydrophoben Kollaps um den Inhibitor herum beg nstigen Lars Kissau 4 Spezieller Teil 72 Die teils deutlichen Unterschiede der Kristallstrukturen der inaktiven Kinasen Tie 2 und VEGFR 2 bzw FGFIR k nnte Anlass sein die Wahl des Templats in Frage zu stellen Die in der vorliegenden Arbeit gemachte Annahme dass der konservierte Bindun
253. ndungstest RasG12V GTP beladen Das verwendete GTP war am y Phosphat mit P markiert Das durch einen Hydrolyse Aktivator freigesetzte radioaktive P bindet jedoch nicht an den Cellulosefilter Die Detektion von Radioaktivit t erlaubt R ckschl sse auf die Hydrolyse von GTP Daneben wurde in einem Fluoreszenz Polarisation Assay die Bindung von Alexa488 RafRBD an RasG12V GTP gemessen Die freie Ras Bindungs Dom ne RBD hat eine hohe Beweglichkeit Bindung an RasG12V GTP senkt die Beweglichkeit und erh ht die gemessene Polarisation Da RafRBD nur an Ras bindet wenn GTP gebunden ist kann hier gemessen werden ob die Hydrolyse von Ras GTP durch die Testsubstanzen beschleunigt wurde Leider bewirkte keines der getesteten Peptide eine Beschleunigung der GTP Hydrolyse durch G12V Ras im ersten Assay Dieses Resultat wurde durch den zweiten Assay best tigt Da weder fehlende hydrolytische Aktivit t der Kopfgruppen noch eine zu geringe Affinit t zu Ras als Ursachen ausgeschlossen werden konnten sollten nun ber eine neue Synthesestrategie Peptide synthetisiert und in einem neu zu entwickelnden Assay zun chst nur hinsichtlich ihrer Affinit t zu Ras evaluiert werden 4 1 4 Synthese einer Split Mix Bibliothek und Aufbau eines High Throughput Assays 4 1 4 1 Vor berlegungen Anstelle einer Einzelsynthese und evaluierung von Verbindungen sollte durch die Synthese einer Split Mix Bibliothek bestehend aus den Aminos uren Glutamins ure Lysin
254. ne eine Transmembranhelix an Auf der cytosolischen Seite folgen die Kinase Dom ne und der konformativ flexible C Terminus Eines der Unterscheidungsmerkmale von Rezeptor Tyrosin Kinasen ist die Existenz und L nge einer innerhalb der Kinasedom ne eingeschobene Subdom ne von bis zu 100 Aminos uren der sogenannte Kinase Insert Domain KID Hier sowie am C terminalen Ende finden sich einige der Tyrosinreste die nach Bindung des extrazellul ren Liganden einer Autophosphorylierung durch die Rezeptor Tyrosin Kinase unterliegen und f r die Bindung von Downstream Effektoren eine entscheidene Bedeutung besitzen Auf der extrazellul ren Seite findet man bei EGFR und ErbB2 sog Cystein reiche Dom nen bei den VEGF und FGF Rezeptoren Immunglobulin hnliche Dom nen und bei Tie und Tie 2 TEK sowohl Immunglobulin hnliche als auch EGF hnliche und Fibronectin Typ 3 hnliche Dom nen Die Aktivierung einer Rezeptor Tyrosin Kinase durch Autophosphorylierung beeinhaltet zwei Prozesse die Verbesserung der katalytischen Aktivit t und die Ausbildung von Bindungsstellen f r Downstream Effektoren Die Autophosphorylierung von Tyrosinresten im sogenannten Activation loop der Kinase Dom ne verursacht eine Konformations nderung in folge derer die ATP Bindungsstelle ge ffnet und eine Bindungsstelle f r Tyrosin haltige Pepidketten gebildet wird Durch die Autophosphorylierung von Tyrosinresten in der KID und der C terminalen Region enstehen Bindungstel
255. nem H O Sauerstoff betr gt demnach 1 97 w hrend der Stickstoff des Histidins idealerweise etwa 2 01 vom Zink Ion entfernt ist Die Bindung eines Imidazol Liganden ist nach diesen Berechnungen g nstiger als die eines Wassermolek ls da hierdurch die postive Ladung am Zink offenbar st rker vermindert wird Diese Wechselwirkung wird durch die N Methylierung des Imidazols noch verst rkt Dies d rfte nebst positiver pharmakodynamischer Effekte der Grund f r den Einbau N Alkylierter Imidazole in vielen literaturbekannten PFT 157 Der Austausch eines Wassermolek ls durch einen Imidazol Liganden Inhibitoren sein wird laut den Berechnungen von Dudev et al um etwa 3 kcal mol beg nstigt Diese Rechnungen werden durch die Analyse von Kristallstrukturen aus der Protein Data Bank verifiziert Wie in Tabelle 8 gezeigt finden sich in Proteinen neben der tetraedrischen Koordination durch 4 Cysteinreste auch Histidine und Tyrosine Die experimentellen Abst nde entsprechen den erw hnten Berechnungen Enzym PDB Code Reste Abst nde in A Alkalische Phosphatase 1ANJ Zn 450 His 412 1 90 Zn 450 His 331 2 05 Zn 451 His 370 2 22 Bruton s Tyrosine Kinase 1BTK Zn 2 His 143 2 04 Zn 2 Tyr 152 CG 4 35 DNA Primase 1D0Q Zn 151 His 43 2 28 Tabelle 8 Bindungsabst nde und Koordination von Zinkionen in ausgew hlten Kristallstrukturen Die Strukturen wurden der PDB entnommen Alkalische Phosphatase
256. ng dieser Verbindung als Bisubstratinhibitor schlie en Gleiches gilt f r Verbindungen 109 155 156 147 158 und 159 Eine berpr fung dieser Vorhersage mittels kinetischer Studien best tigte dieses das Bindungsmodell Das Fehlen einer zweiten N Methylgruppe macht f r einige Verbindungen aus Tabelle 18 Anhanb X eine zur nat rlichen Peptidsubstrat analogen Bindungskonformation m glich Der zu 109 differierende Bindungsmodus f r 142 und 112 ergab sich aus der Tatsache dass die strukturell eng verwandte Verbindung 154 nicht zufriedenstellend in einer zu 109 analogen Weise in das aktive Zentrum der PFT gedockt werden konnte Aus der Analyse der HYDROMAP Oberfl che war die Existenz weiterer hydrophober Taschen bekannt Daher wurde versucht 112 und 115 so in das aktive Zentrum einzuf gen dass das C terminale Tyrosin die vor der Pyrophosphattasche gelegene hydrophobe Stelle belegte Die berlagerung des Peptidbackbones mit dem des CVLS Peptids aus der 1JCR Struktur zeigte die M glichkeit auf dass hier ein Bindungsmodus vorliegen k nnte der keine kompetitive Bindung zu FPP beinhaltet Durch das Histidin ist zwar f r weitere Substrate der Zugang zum Zink blockiert aber eine Blockade der FPP Tasche ergibt sich aus diesem Vorschlag nicht In analoger Weise w re f r 142 und 112 ein zweiter Bindungsmodus denkbar Der para Pentylhydrocinnamoylrest erreicht die zweite hydrophobe Tasche die durch Leu 295 Val 43B Lys 198a sowie Lys 164
257. ng gem den eingangs diskutierten Erkenntnissen ber den Mechanismus kompensiert werden In der Vergangenheit wurden zahlreiche Strukturen wie Diamine Diole Polyamine sowohl aliphatischer als auch aromatischer Natur als Bestandteile synthetischer Phosphatasen und Phosphodiesterasen evaluiert Auf Basis dieser Vorbilder wurden die in Abbildung 17 gezeigten Strukturen als Kopfgruppen ausgew hlt Diese sollten als voraktivierte S uren auf den freien N terminus der Peptide an der festen Phase gekuppelt werden Lars Kissau 4 Spezieller Teil 34 e o e HN HO OH ah OH OH H2N HO HN B Q LU U o o 30 OH Nr Don 4 HO HN N SE gz Abbildung 17 Kopfgruppen f r die Peptidbibliothek Zur Vereinfachung der Nomenklatur sind den einzelnen Resten Buchstaben f r den Ein Buchstaben Code zugeordnet siehe auch Tabelle 1 Auf Basis der PEP Berechnungen wurden die in Tabelle 1 gezeigten Sequenzen f r eine erste kleine Bibliothek von Peptiden mit verschiedenen Kopfgruppen ausgew hlt und synthetisiert Die nachfolgende biologische Evaluierung hinsichtlich einer Beschleunigung der GTP Hydrolyse durch G12V Ras wurde von Herrn Dipl Biol Robert Gail durchgef hrt 4 1 3 2 Synthese der Kopfgruppen Der Synthese der Peptide aus Tabelle 1 wurde die Synthese von Testverbindungen vorangestellt In L sung wurden die Kopfgruppen an L Phenylalaninmethylester oder aliphatische Amine und bei Versuchen an der festen P
258. ng mit dem Zinkion vermutlich ber eine st rkere Ladungskompensation Gleichzeitig ist die Alkylierung auch als Mittel zur Steigerung der Membranpenetrationsf higkeit und der Lars Kissau 4 Spezieller Teil 114 Bioverf gbarkeit bereits verwendet worden Aus den in Abbschnitt 4 3 3 gezeigten Bindungsmodi geht hervor dass eine Alkylierung des Histidines ohne sterische Komplikationen m glich sein sollte Die in den Pepticinnamin E Analoga der ersten Generation gefundenen g nstigen Bindungsabst nde des Imidazolringes zum Zinkion konnten in den vorgeschlagenen Inhibitoren der zweiten Generation erhalten werden Die N Methylierung und der damit verbundene verst rkte Ladungstransfer d rften diese Wechselwirkung verbessern Eine k rzlich ver ffentlichte Kristallstruktur eines PFT Inhibitor Komplexes best tigt den Vorschlag zur Verwendung zyklischer Verbindungen und alkylierter Imidazole 4 3 5 Verbesserte Selektivit t Vergleich PFT GGTase I GGTase H Eines der Ziele dieses Kooperationsprojektes war die Entwicklung von molekularen Werkzeugen zur Analyse von Signaltransduktionsprozessen Wie in Kapitel 2 erw hnt kann die bertragung eines Geranylgeranyl Restes auf K Ras durch die GGTase I die Wirkung einer Inhibition der PFT kompensieren Nat rliches Substrat der GGTase I ist unter anderem das Protein Rho Einige der hier untersuchten Verbindungen inhibieren sowohl die PFT als auch die GGTase 1 Sie sind als Werkz
259. nge weichen zwischen 10 und 20 vom Idealwert ab Lars Kissau 8 9 Tabellen der Wasserstoffbr cken 221 115 Y 112 BB NH Y 1 CO2H 2 79 1 9 161 16 150 180 B Q 113 CONH IY 1 CO2H 1 91 1 9 124 27 110 180 A Q 113 CONH JY 1 CO2H 2 72 1 9 128 54 150 180 B IA 397 BB CO IY 1 Ph OH 1 8 1 9 147 24 110 180 A PepticinamminE Y 660 Ph OH Z 4 BB CO 1 85 1 9 119 44 90 130 A K 655 NH2 Y 3 Ph OH 1 6 1 8 169 57 150 180 A D 596 CO2H Y 3 Ph OH 1 92 1 8 98 72 100 140 A R 590 NEH IY 2 Ph OH 1 96 1 9 151 94 150 180 A R590 NZH IY 2 Ph OH 1 87 1 8 151 19 150 180 A IR 590 NEH IY 2 Ph OMe 2 52 1 9 95 29 150 180 B R590 NZH IY 2 Ph OMe 2 62 1 8 90 82 150 180 B IN 111 CONH IDKP SCO 2 04 1 9 131 62 150 180 A Q 113 CONH DKP G NH 1 9 1 9 110 51 110 180 A Q 113 CONH DKP G NH 2 35 1 9 136 31 150 180 B R501 NZH IDKP GCO 2 12 1 8 112 69 150 180 B 157 Y 112 BB NH Y 1 CO2H 2 06 1 9 162 56 150 180 A Q 113 CONH JY 1 CO2H 1 79 1 9 131 36 110 180 A Q 113 CONH JY 1 CO2H 2 97 1 9 120 72 150 180 B H 448 N JY 1 Ph OH 1 62 1 9 138 7 150 180 B IH 147 NH H 3 BB CO 2 8 1 9 175 97 150 180 B 8 9 2 Nakijichinon Analoga Enzym Inhibit Inhibitorato L nge L nge Winkel Winkel Bemerkung or Proteinatom m gemessen Literatur gemessen Literatur Tie 2 101 A905 N H C O 1 75 1 9 146 18 150 180 B E903 C O OH 2 12 1 9 103 11 110 180 B N834 OD Val OH 2 29
260. ngeengt mit 50 ml Ethylacetat verd nnt und zweimal mit jeweils 30 ml ges ttigter Natriumhydrogencarbonat L sung und 30 ml ges ttigeter Natriumchloridl sung extrahiert Die organische Phase wird ber Natriumsulfat getrocknet eingeengt und ber Kieselgel filtriert Eluent Cylohexan Ethylacetat 3 1 v v Nach Trocknen im lpumpenvakuum erh lt man 3 1 g eines farblosen Feststoffes Ausbeute 3 1 g 17 4 mmol 96 d Th Smp 76 77 C Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat 1 1 v v 0 73 H NMR CDC 400 MHz 7 87 m 1H Aromat 7 79 m 1H Aromat 7 32 ddd 1H Aromat C 2 J 8 21 Hz J 7 63 Hz J 0 59 Hz 7 26 m 1H Aromat 5 99 m 1H CH gt CH CH 5 3 ddd 1H CH CH CH J 1 56 Hz J 17 20 Hz J 2 54 Hz 5 27 ddd 1H CH2 CH CHb J 1 17 Hz J 11 18 Hz 7J 2 54 Hz 4 81 dt 2H CH2 CH CH J 5 87 Hz J 1 56 Hz C NMR CDCL 100 6 MHz 165 3 C O 150 70 C 3 141 67 CH gt CH CH 132 2 C 1 127 9 C 5 121 4 C 6 120 2 C 4 118 8 CH gt CH Ch 117 5 C 2 66 1 CH gt CH Ch CjoH1003 178 18 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 172 FAB MS 3 NBA 179 3 M H Di 2 cyanoethoxy N N diisopropyl phosphoramidit 52a Zu einer L sung von 580 ul 0 58 g 3 5 mmol Dichlor N N diisopropylphosphoramidit in 10 ml abs THF wird bei 78 C langsam eine L sung von 470 wl 7 0 mmol 2 Hydroxypropionitril und 1 2 ml 7 0 mmol DIEA in 15 ml a
261. nglich auf den Zusatz von HOBt verzichtet Es zeigte sich jedoch schlie lich dass frisch zerm rserte und im Feinvakuum getrocknete 6 Aminonicotins ure in DMF durch Zugabe von f nf quivalenten DIPEA und je einem quivalent HBTU und HOBt bei einer Konzentration von 0 07 mol l gel st werden und direkt auf ein Peptid gekuppelt werden konnte Dies ist zu vergleichen mit einer L slichkeit f r die meisten Fmoc Aminos uren von 0 5 bis 1 0 mol l DMF Nach der Abspaltung vom Harz zeigte sich dass dieser Kupplungsschritt nahezu quantitativ verlaufen war da keine Abbruchsequenzen detektiert werden konnten 0 Phe Pne Phe nh i o o Qro Pte Phe ze EN H S N b JH PS Wang Harz Phe Phe Phe N H 18 N NH Abbildung 19 Synthese einer Testsequenz mit Aminonicotins ure Kopfgruppe a HBTU DIEA b TFA CH Ch Als f nfte Kopfgruppe sollte 3 4 Dihydroxybenzoes ure 19 verwendet werden Da eine direkte Kupplung der ungeschiitzten 3 4 Dihydroxybenzoes ure an das jeweilige Peptid nicht zum Produkt f hrte oder mit schlechten Ausbeuten verlief wurde eine gesch tzte Vorstufe verwendet Orthogonal zum verwendeten s urelabilen Wang Linker und den basenlabilen Lars Kissau 4 Spezieller Teil 37 Fmoc Schutzgruppen f r die Peptidsynthesen sind Pd 0 labile Schutzgruppen Um ausgehend von 3 4 Dihydroxybenzoes ure die 3 4 Allyloxybenzoes ure 23 zu erhalten war die Differzierung von phenolischen OHs und der Carbons uregrupp
262. nhibitoren nicht an das gesamte Protein sondern extrahiert aus der vorgegebenen Struktur zun chst nur die active atoms in einem vordefinierten Radius um das aktive Zentrum herum und f hrt die Berechnungen nur mit diesen Atomen in fixierten Positionen durch Genau die Annahme eines relativ starren Proteins f hrt bei hochflexiblen Enzymen wie Kinasen zu Problemen Daher wurde f r dieses Projekt die weitere Arbeit manuell durchgef hrt Abbildung 53 Nakijichinon C und die biologisch aktiven Analoga k nnten hnlich an die Rezeptor Tyrosin Kinasen binden wie ATP Erster Ansatzpunkt f r die Bestimmung der Bindungsmodi war die M glichkeit der Ausbildung der gleichen Wasserstoffbr cken zur Hinge Region wie diese von ATP gebildet werden siehe Abschnitt 4 2 1 Die daraus resultierende grobe Orientierung von Nakijichinon im aktiven Zentrum von VEGFR 2 ist beispielhaft in Abbildung 53 dargestellt Lars Kissau 4 Spezieller Teil 78 Weitere Ansatzpunkte f r die Position der Nakijichinone und deren Analoga im aktiven Zentrum einer Kinase ergab sich aus einer Betrachtung der Hydrophobizit t der Oberfl che Die Oberfl chen der Rezeptor Tyrosin Kinase in Abbildung 54 wurde gem AAV MMI6 mit HYDROMAP erstellt Hinter dem aktiven Zentrum von ErbB 2 hier exemplarisch ausgew hlt findet sich eine gr n grau eingef rbte hydrophobe Tasche Die wei en Kugeln stellen berechnete Interaktionspunkte f r lipophile Wechselwirkunge
263. notP Move atom Zink anklicken zn done Cpk on zn done Set radii zn 1 0 done Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 2 204 lt cast Inhibitor F hrt zur einer anschaulicheren Dargestellung der gedockten Inhibitoren Anschlie end kann der Screenshot mit Snapshot und XV als TIFF Format abgespeichert werden Anmerkung gilt auch f r alle folgenden Minimierungen von PFT Liganden Komplexen Probleme mit der Parametrisierung des Zinkatoms f hren bei CHARMM Minimierungen unter Umst nden zu einer Verschiebung des Zinkatoms unter Aufl sung der tetraedrischen Koordination Es ist empfehlenswert die Inputdatei f r CHARMM durch folgende Zeilen zu erg nzen Define LIG sele resi 669 and resi 731 and resi 606 and resi 604 end Cons fix sele LIG end Dies geschieht am einfachsten mit dem Editor jot Hierdurch werden das Zinkion und die f r die Koordination des Zn essentiellen Reste korrekt fixiert Zuvor muss die Nummerierung der Reste in WitnotP ge ndert werden In der Datei aus der PDB beginnt die Nummerierung der Reste im o und B Subunit jeweils bei 1 Eine doppelte Belegung wird von CHARMM nicht toleriert Deshalb ist die Nummerierung in WitnotP zu ndern WitnotP Modify resnum ftase 1 done Die Reste Cys 299 8 His 362 B Asp 297 B und Zn 1001 werden umbenannt zu Cys 606 Asp 604 His 669 und Zn 731 3D Strukturen von Pepticinammin E und den biologisch aktiven Analoga Beispiel Pepticinnamin E Witn
264. ntegrierte Scoring Funktion zun chst die Anzahl und Geometrie von Wasserstoffbr cken sowie Coulomb Wechselwirkung ber cksichtigt Hydrophobe Wechselwirkungen werden sekund r bewertet W hrend GOLD bei der Anwendung auf Kinasen an der Flexibilit t der Enzyme scheiterte waren hier die hydrophoben Eigenschaften der Inhibitoren f r die negativen Resultate ausschlaggebend Daher wurde auf die Anwendung von automatischen Dockingprogrammen verzichtet Durch manuelles Docking sollten daher die potentiellen Bindungsmodi ermittelt werden 4 3 2 Qualitative Analyse der PFT Inhibitoren 4 3 2 1 Bindungsmodus von Pepticinnamin E Ausgangspunkt der vorliegenden Arbeiten war der Naturstoff Pepticinnamin E 9 der als Bisubstratinhibitor die Ubertragung eines Farnesylrestes auf ein Cystein durch PFT inhibiert Ausgehend von der Kristallstruktur der Ratten PFT im Komplex mit CVFM und FPP wurde zun chst der bislang unbekannte Bindungsmodus von Pepticinnamin E 9 untersucht Der Weg zum Bindungsmodus von Pepticinnamin E an die PFT ist in Abbildung 67 dargestellt Analog zur Vorgehensweise bei der Analyse der Nakijichinon Analoga Lars Kissau 4 Spezieller Teil 96 Kapitel 4 2 3 wurde mittels Kraftfeldrechnung die 3D Struktur von Pepticinnamin E bestimmt Die Berechnung von der MHydrophobizit t der Proteinoberfl che der Farnesyltransferase PFT und Pepticinnamin E mit HYDROMAP ergab erste Hinweise auf wahrscheinliche Wechselwirkungen des Nat
265. o H Takahashi I Kato Y Morimoto F T M Biochem Biophys Res Commun 1986 135 397 402 Gescher A Crit Rev Oncol Hematol 2000 34 127 138 Lopez Talavera J C Levitzki A Martinez A Gazit A Esteban E Guardian J J Clin Invest 1997 100 664 673 Liebmann C Cell Signalling 2001 13 777 785 Hubbard S R Till J H Annu Rev Biochem 2000 69 373 398 Madhusudan E A T Xuong N H Adams J A Ten Eyck L F Taylor S S Sowadski J M Prot Sci 1994 3 176 181 Bridges A J Chem Rev 2001 101 2541 2571 Kraus G Biochemie der Regulation und Signaltransduktion Wiley VCH Weinheim 1997 Johnson L N Noble M E M Owen D J Cell 1996 85 149 158 Mohammadi M Schlessinger J Hubbard S R Cell 1996 86 577 587 Adams J A Chem Rev 2001 101 2271 2290 Cook P F Neville M E Vrana K E Hartl F T Roskoski J R Biochemistry 1982 21 5794 Lars Kissau 8 Anhang 203 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 Cole P A Grace M R Phillips R S Burn P Walsh C T J Biol Chem 1995 270 22105 22121 Ho M F Bramson H N Hansen D E Knowles J R Kaiser E T J Am Chem Soc 1988 110 2680 2684 Jussila L Alitalo K Phys Rev 2002 82 673 700 Clark E A Brugge J S Science 1995 2
266. oben Effektes Eine genaue Berechnung wird durch mehrere gegenl ufige Effekte erschwert Die Ausbildung eines Hohlraumes ist erschwert und tr gt deutlich zum hydrophoben Effekt bei Dies wird jedoch durch die F higkeit des Wassers abgeschw cht einen L sungsmittelk fig um ein unpolares Molek l herum zu bilden ohne dabei zu viele Wasserstoffbr cken zu verlieren Wie diverse Rechnungen und Experimente belegen werden Wasserstoffbr ckennetzwerke durch die Anwesenheit von Gastmolek len sogar gest rkt Den Schwierigkeiten bei der Quantifizierung steht die experimentelle Erkenntnis gegen ber dass das Verdr ngen von Wassermolek len aus einer hydrophoben Tasche einen erheblichen Gewinn von Bindungsenergie bedeutet und f r die Affinit t eines Liganden an einen Rezeptor ungleich wichtiger ist als z B Wasserstoffbr cken Letztere sind offenbar f r die Orientierung eines Liganden in einer Bindungstasche von Bedeutung 2 3 3 3 4 Charakterisierung von Oberfl chen und Taschen Verl sst man sich nicht auf automatische Design Programme steht bei einer systematischen Vorgehensweise zun chst die Identifikation von geeigneten Interaktionspunkten zwischen Ligand und Protein Bindungstaschen im Vordergrund Dies kann einerseits durch visuelle Inspektion der Strukturen an einer Workstation geschehen oder mit Computer Unterst tzung F r die Identifikation von Bindungstaschen sind Algorithmen wie PASS geeignet Protein Wassermolek l
267. odell Schwierigkeiten bereiten insbesondere die unter Umst nden unterschiedliche L nge homologer Regionen Auch in der vorliegenden Arbeit traten diese Schwierigkeiten auf so dass auch hier eine manuelle Feinabstimmung der Aminos ureanordnung unerl sslich war Die Aminos uren des Zielstruktur werden auf Basis dieser Vorgabe an die Templatstruktur angepasst MODELLER ist ein Programm zur Erstellung von Homologiemodellen auf Basis einer Templatstruktur und den parallel angeordneten Prim rsequenzen Die Konformation der Aminos uren wird durch ein Verfahren ermittelt in dem die Einhaltung r umlicher Beschr nkungen Restraints vorgegebenen Positionen der SCRs und sterische Limitationen optimiert wird N chster Schritt ist die Positionierung der Seitenketten Aus der gro en Zahl denkbarer Rotationsisomere m ssen hierbei die realistischen identifiziert werden Eine vollst ndige L sung diese Gleichungssystems ist mit heutigen Computern nicht realisierbar da theoretisch ein Rotamer einer Aminos ure konstant gehalten und s mtliche Rotamere der anderen Aminos uren permutiert werden m ssten Das Programm MODELLER greift hier zun chst auf die in einer Datenbank gespeicherten statistisch am h ufigsten auftretenden Konformationen zur ck In sp teren Phasen der Berechnungen wird ausgehend von dieser Konformation eine Geometrieoptimierung unter Beachtung der lokalen Umgebung durchgef hrt Dies geschieht durch eine Kombination von Kra
268. ol Bei der f nften Kupplung wurden 10 Boc Aminos ure verwendet Dies best tigt auch die spektroskopischen Messungen die eine quasi quantitative Umsetzung bei allen Peptidkupplungen angezeigt hatten Da keine der Sequenzen dem N Terminus von Lars Kissau 4 Spezieller Teil 60 Ras MTEYKLVV entspricht reicht das Waschen der Beads und die nachfolgende Behandlung mit TFA aus um jegliche Proteinreste vom Bead abzul sen Die Aminos uren in Klammern ergaben zwar bei der HPLC Analyse der Edman Aminos uren ein eindeutiges Signal dies konnte jedoch nur einer modifizierten Aminos ure zugeordnet werden In einigen F llen k nnte diese Aminos ure dem oxidierten Methionin entsprechen eine Oxidation bei der ohne Luftausschlu durchgef hrten Boc Entsch tzung w re denkbar Da aber die Bibliothek kein Tyrosin enthielt muss die sechste Sequenz zumindest in dieser einen Position angezweifelt werden 4 1 4 13 Analyse der Sequenzen Gem Abbildung 12 in Kapitel 2 3 2 1 dient die Synthese von Peptiden zur Identifikation von Schl ssel Interaktionen der Liganden mit dem Protein Um den n chsten Schritt die Synthese von Peptidmimetika vorzubereiten mussten die vorliegenden Ergebnisse rationalisiert werden Neben einer deutlichen Bevorzugung hydrophober Aminos uren ist das Fehlen von Lysin in den Peptidsequenzen auff llig Offenbar eignet sich eine Amino oder Ammoniumgruppe nicht f r die Bindung im Bereich der GTP Bindungstasche Den
269. on INHB PROT done echo modify hydrogens INHB PROT done echo measure monitor hbonds 3 0 INHB done PROT done done Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 148 Anschlie end kann mit der Anweisung Measure angle und sukzessivem Anklicken der drei beteiligten Atome der relevante Winkel o vermessen werden AAV M14 Konstruktion eines Homologiemodells mit Modeller 4 0 Vorgehensweise 1 Schritt Alignment der Prim rsequenzen Automatische Verfahren zur Erstellung dieser Alignments sind unter den Namen BLAST DIALIGN ALIGN bekannt Ein erstes grobes Alignment kann folgenderma en erstellt werden a Mit pdb2seq lt templat pdb gt templat seq wird aus der PDB Datei des Templatproteins die Prim rsequenz in eine Textdatei ohne Nummerierung abgespeichert b Aus Quellen wie der SwissProt Database wird die zu modellierende Sequenz im FASTA Format abgespeichert c Mit align wird das entsprechende Programm gestartet und die Namen der Sequenzdateien entsprechend den Eingabeaufforderungen eingegeben 2 Schritt Erstellung der Input Dateien und Konstruktion des Modells Zur Ausf hrung des Programms Modeller 4 0 m ssen neben der 3D Templatstruktur auch 2 weitere Input Dateien vorliegen In der name top Datei sind allgemeine Anweisungen sowie die zu verwendenden Routinen f r Modeller festzulegen In der name ali Datei ist das Alignment der Sequenzen anzugeben Das von ALIGN erstellte Alignment
270. on Liganden der Korrektur von Proteinmodellen etc kann eine Korrektur einiger Bindungsparameter erforderlich sein beispielsweise die Rotation einer Aminos ureseitenkette Mit der Eingabe Bond twist wird die Funktion zur Ver nderung der Torsionswinkel aufgerufen Mit der Maus sind nun die beiden Atome anzuklicken Vorsicht Die Substituenten des zweiten Atomes werden ebenfalls gedreht d h beim Drehen einer Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 153 Seitenkette mu zuerst das a C Atom und danach das B C Atom markiert werden sonst bleibt die Kette fixiert und das Protein dreht sich Durch die Eingabe von Zahlenwerten kann nach aufrufen des Men s Modify torsion auch der Torsionswinkel auf ein Grad genau modifiziert werden AAV MM21 PASS Analyse von Protein Oberfl chen Identifikation von Bindungstasche sowie die Berechnung deren vdW Volumina Vorgehensweise Die Struktur des Proteins wird gem AAV MM2 und AAV MM7 mit Wasserstoffatomen versehen und unter Fixierung der Backbone Atome minimiert Die resultierende Struktur wird als pdb Datei protein pdb abgespeichert Von der Unix Kommandozeile aus wird die Berechnung Installation von PASS vorausgesetzt mit Pass protein pdb gestartet In WitnotP werden nun die Atome in der Datei Protein Probes pdb eingelesen Diese stellen die Schwerpunkte von Wassermolek len dar und werden daher manuell mit einem vdW Radius von 1 4 versehen Soll wie f r die Definition der hydrophoben Tasc
271. onins stattgefunden hat 6 0 85 E TE Nut RN MEE OPE A E E A dalle AVA peter ra EEN Verbindung 77a Gel Phasen NMR nach der Kupplung mit GDP 5 0 74 nicht umgesetztes Phosphat 10 3 B und y P 21 23 B P Lars Kissau 4 Spezieller Teil 54 Integral 3110322 W i e 1 Gel Phasen NMR der Split Mix Bibliothek vor dem Screening 5 8 16 y Phosphonat 11 15 B P 23 17 a P Abbildung 38 P NMR Spektra von GTP Peptid Konjugaten Die Isolierung und Charakterisierung der Modellverbindungen validierte die verwendeten Synthesemethoden und analytischen Verfahren Damit war auch die Annahme berechtigt dass die Beads der Split Mix Bibliothek tats chlich die Zielverbindungen enthielten In kleinen Testans tzen siehe Kapitel 4 1 4 11 konnte gezeigt werden dass die hier beschriebene Methodik auch zur kombinatorischen Festphasensynthese von ATP Peptidkonjugaten verwendet werden kann Diese k nnten als Werkzeugen zur Studie ATP bindender Proteine z B Kinasen und Hitzeschockproteine Anwendung finden Ba 4 1 4 9 Auswahl der festen Phase und des Fluoreszenzfarbstoffes F r einen on bead Assay ist es vorteilhaft wenn das fluoreszenzmarkierte Protein auch in die Poren des Beads gelangen kann und daneben auch eine selektive Bindung eingeht Die gemessene Fluoreszenz sollte direkt mit der Proteinbeladung der Beads zusammenh ngen und ni
272. ores should be close to 1 0 Bond angles 1 261 Bond lengths 0 947 Omega angle restraints 0 721 tight Bond angles 1 195 Side chain planarity 0 309 tight Omega angle restraints 0 527 tight Improper dihedral distribution 0 900 Side chain planarity 0 329 tight B factor distribution 0 357 Improper dihedral distribution 0 836 Inside Outside distribution 1 047 B factor distribution 0 357 Inside Outside distribution 1 095 8 6 2 3 VEGFR 3 8 6 2 4 Tie 2 Modell A 211 Final summary i l Structure Z acorea positive is better than average 2 11 1 Note Summary report for users of a structure 2nd generation packing quality Br poor This is an overall summary of the quality of the structure as compared with Ramachandran plot appearance 0 550 current reliable structures This summary is most useful for biologists sccking x 1 fy 2 rotamer nomality K A 183 s e We e Ewe eeng eg Backhone conformation 2 914 he second part of the table mostly gives an impreasion of well the mo q conforms to common refmement constraint valuca The first part of the table RMS Z acorts should he close to 1 0 shows a mumber of constraint independent quality indicators Bond lengths z 0 942 Structure Z scores positive is better than average Bond angles 1290 2nd generation packing quality 2 034 Ramachandran plot appearance 0 093 Omega angle restraints 0 656 tight x 1 x 2 rotamer normality 0 049 ide chai anarity i Backhon
273. osphonatspacers 36 Parallel zur Synthese von 34 wurde die Synthese des Linkers 35 durchgef hrt Dieser sollte nicht nur noch etwas stabiler sein als 34 sondern auch gleichzeitig eine andere geometrische Anordnung von Peptid und GTP zueinander erm glichen 3 Methylbenzoes ure 62 wurde daher s urekatalytisch mit Isobuten zum tert Butylester 63 umgesetzt und radikalisch mit NBS bromiert Eine Trennung des bromierten Produktes 64 vom zweifach bromiertem Nebenprodukt und verbliebenem Edukt war auf dieser Stufe nicht m glich Lars Kissau 4 Spezieller Teil 47 O O O we Zn kr Waff ey 63 64 62 c A0 O lt Uno RE OH d S Ce 65 Abbildung 31 Synthese des Spacers 36 a Isobuten H SO Dioxan 24 h 68 b NBS CCl DBP hv 3h 78 c Triallylphosphit 80 C 18 h 68 d TFA TES CH Ch 1h 67 Nach chromatographischer Vorreinigung wurde durch Erhitzen von 64 mit Phosphorigs uretriallylester Arbusov Reaktion das Phosphonat 65 erhalten Auf dieser Stufe konnten die Nebenprodukte aus der Bromierungsreaktion chromatographisch abgetrennt werden Nach Entsch tzung mit Trifluoressigs ure in Methylenchlorid konnte der gesch tzte Phosphonatspacer 66 in 24 Ausbeute ber 4 Stufen bezogen auf eingesetzte 3 Methylbenzoes ure erhalten werden Dieser Spacer wurde aufgrund seiner guten Stabilit t f r die Versuche zur Etablierung der GTP Konjugatsynthese eingesetzt o a id b Qo Qn Peptid NH 67 Peptid YHAG 68
274. otP Build fragment aminoacid phenylalanin get Pepte done Durch entsprechendes Markieren werden folgende Fragmente mit den jeweils vordefinierten Atomparametern angef gt Tyrosine 2 mal Ethylene 2mal Keto 1mal C sp3 8mal benzene 1mal chlorine 1mal WitnotP lt prca peptde Unix Minall run pepte done WitnotP Delete molecule pepte done Read xpdb pepte_m pdb done Write xpdb Pepticinammin_E pepte done Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 2 205 Analog dazu wurden die Analoga gezeichnet und minimiert Entscheidend f r korrekte Ergebnisse ist die richtige Parametrisierung der Atome Manuelles Docking der Inhibitoren und Analyse der Bindungsmodi Die vorminimierten Inhibitoren wurden gem AAV MMIO in das aktive Zentrum der jeweiligen Kinasen gedockt Die sonstigen Eingaben sind hier am Beispiel Pepticinnamin E und Ratten Farnesyltransferase exemplarisch dargestellt WitnotP Read xpdb ftase pdb Read xpdb pepte pdb Move molecule ftase pdb ftase done Move molecule pepte pdb INHB done lt use INHB siehe AAV MM 10 freeze INHB done freeze ftase done move molecule INHB ftase done lt pdb2c ftase siehe AAV MM2 Unix Minharmfix_run Tase siehe AAV MMS5 Vor den Minimierungen muss in jedem Fall eine Kontrolle der Parameter f r Histidine und Lysine erfolgen Ebenso ist die Protonierung von Asparaten und Glutamaten zu kontrollieren Die Analyse der Wasserstoffbr cken zwischen
275. ozentwerte wurden folgenderma en errechnet Das vom Inhibitor und FPP gemeinsam belegte Volumen ergibt sich aus berlappungsvolumen Vgemein Volumeninnibitor Volumenppp Volumen nhibitor EPP Dividiert man das Resultat durch das van der Waals Volumen von FPP erh lt man den angegebenen Prozentwert Fiir das CAAX Peptid wurde in analoger Weise verfahren Die Relation dieses Schnittvolumens zum Volumen des FPP zeigt an in welchem Ausma die FPP Bindungstasche besetzt ist Der Prozentwert kann als Ma daf r betrachtet werden wie gut die Bindungsstelle fiir einen Liganden ausgef llt wird Das gleiche Vorgehen ist nat rlich auch auf alle Enzyme anwendbar bei denen eine Struktur mit dem nat rlichen Substrat im aktiven Zentrum vorliegt Die nach dieser Methode siehe auch AAV MM12 berechneten Werte f r die hier betrachteten Mitglieder der Pepticinnamin E Bibliothek sind in Tabelle 10 dargestellt W hrend die Peptid kompetitive Wirkung von 142 und 112 sehr deutlich wird zeigt sich beim Vergleich der ICs Werte von 129 114 und 110 mit denen der 3 Gruppe Bisubstratinhibitoren dass Wechselwirkungen mit Resten der Peptidbindungsregion zwar Affinit ts steigernd wirken Werte unter 30 jedoch nicht ausreichen einem CAAX Peptid den Zugang zum aktiven Zentrum zu versperren Dies war bereits bei der qualitativen Analyse festzustellen Wie aus Tabelle 10 ersichtlich k nnen die berechneten berlappenden Volumina gut mit den kinetischen D
276. prachen Durch selektive Messung der Produkt Fluoreszenz mit und ohne Inhibitorzusatz wurde der Inhibitionsgrad bestimmt Hierbei wurden beide Substratkomponenten und Inhibitor vorgelegt und die Reaktion durch Enzymzugabe gestartet Bei Verbindungen mit Aktivit ten unter 50 umol l wurden die 19 Diese Substanzbibliothek Strukturen und ICso Werte sind in Anhang X aufgef hrt kann in drei Substanzgruppen eingeteilt werden Die erste Gruppe jeweiligen ICso Werte ermittelt enthielt Pentamere wie Pepticinnamin E Die zwei anderen Gruppen enthielten Verbindungen die C terminal um einen Baustein verk rzt waren In einer Gruppe war dabei das Peptidr ckgrat konserviert ein der anderen Gruppe finden sich neben Histidin auch nicht N methylierte Aminos uren Zur Aufkl rung der Bindungsmodi und Art der Inhibition der PFT durch die Pepticinnamin E Analoga wurden zun chst die vorhandenen Struktur Aktivit ts Daten analysiert Anschlie end konnten entsprechend der in Abbildung 67 illustrierten Methode die Bindungsmodi einiger Vertreter der Pepticinnamin E Bibliothek untersucht werden 4 3 2 2 1 Untersuchung der ersten Gruppe Pentamere der Struktur 116 Die erste Gruppe der in Anhang X gezeigten Verbindungen besteht wie der Naturstoff aus 5 Monomeren Das manuelle Docking dieser Verbindungen in das aktive Zentrum der PFT in einer zu Pepticinnamin E analogen Konformation gab Aufschlu ber die Ursachen der fehlenden Aktivit t von 116 und 117
277. r codierten Proteine aufzukl ren und durch gezielte Beeinflussung Therapien gegen Krankheiten zu entwickeln wird abwechselnd mit biologischer Chemie oder chemischer Biologie bezeichnet Die hierzu equivalenten Begriffe Chemical Genetics oder Chemical Genomics deuten die Absichten etwas besser an Das Syntheserepertoire an Methoden wurde in den letzten Jahren durch zunehmend verfeinerte computer gest tzte Verfahren erg nzt Beide Ans tze finden in der vorliegenden Arbeit Anwendung Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 21 2 3 3 1 Chemische Verfahren Festphasensynthese von Peptiden Wie in Abbildung 12 aufgezeigt spielen Peptide nicht nur bei der Partial oder Totalsynthese biologischer Strukturen eine Rolle Auch zur Identifikation f r die Wechselwirkung mit dem Target wichtiger funktioneller Gruppen sind Peptide ein wertvolles Werkzeug Die durch Reinigungs und L slichkeitsprobleme erschwerte L sungssynthese von Peptiden wird seit den revolution ren Arbeiten von B Merryfield in zunehmendem Ma e durch Festphasensynthese ersetzt Den Problemen der Racemisierung sowie sinkender Ausbeuten bei Kupplung anspruchsvoller Aminos uren konnte in den letzten Jahren durch die Entwicklung hochleistungsf higer Kupplungsreagentien begegnet werden Auch ohne die hochtoxischen und cancerogenen BOP Reagentien k nnen N terminal gesch tzte Aminos uren mit HOBt und HBTU voraktiviert und in hohen Ausbeuten auf die wach
278. rbt die FPP Bindungstasche dagegen gr n Daneben ist die Hydrophobizit tskarte des aktiven Zentrums gezeigt Abbildung 66a siehe auch Lars Kissau 4 Spezieller Teil 93 Experimenteller Teil Neben einer hydrophoben gr n grau Farnesyl Bindungstasche sind die sehr hydrophilen blau Bindungsstellen f r das Pyrophosphat und das C terminale Carboxylat gezeigt F r die hier gezeigten Arbeiten wurde die Kristallstruktur der Ratten PFT verwendet da diese auch in den biologischen Assays eingesetzt wurde Innerhalb des aktiven Zentrums gibt es keinen Unterschied zur menschlichen PFT 4 3 1 1 Wechselwirkungen zwischen Zink haltigen Proteinen und den Inhibitoren Zus tzlich zu Wasserstoffbr cken und hydrophoben Wechselwirkungen spielt bei der Farnesyltransferase die Wechselwirkung zwischen Ligand und Zink Ion eine zentrale Rolle Das Zn Kation zeigt eine gewisse Flexibilit t hinsichtlich der bevorzugten Koordinationsgeometrie W hrend in w ssriger L sung ein hexakoordiniertes Ion vorliegt ist Zink in Proteinen meist tetraedrisch koordiniert Einige der ersten Versuche die bevorzugte Geometrie zu berechnen k nnen nicht direkt auf Proteinstrukturen bertragen werden da sich die Kalkulationen auf die Gasphase beziehen Dudev et al unternahmen umfangreiche DFT Rechnungen und konnten die Komplexe in einer Hydrath lle simulieren Demzufolge ist die tetraedrische Geometrie deutlich bevorzugt Der optimale Bindungsabstand zu ei
279. re 9 H fluoren 9 ylmethylester 43 120 mg 0 25 mmol 42 werden in vollkommener Analogie zu 11 Methode A mit 20 eq SnCl Dihydrat in DMF 14 h bei Raumtemperatur reduziert Man erh lt ein dunkelrotes Ol welches durch Chromatographie an Kieselgel Eluent Cyclohexan Ethylacetat 3 1 v v gereinigt wird Ausbeute 57 mg 0 18 mmol 52 d Th Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat 1 1 v v 0 42 H NMR CDC1 400 MHz 7 87 7 72 m 4H C 4 C 5 7 51 dt 2H C 1 C 8 J 1 17 Hz J 7 43 Hz 7 38 7 25 m 5H C 2 C 3 C 6 C 7 C 6 7 17 7 10 m 2H C 2 C 5 6 61 m 1H C 4 4 91 d 2H Fm CH O J 7 23 Hz 4 32 t 1H C 1 J 7 23 Hz C NMR CDCI 100 6 MHz 5 167 1 C O 146 6 C 3 141 9 C 8a C 9a 136 7 C 4a C 4b 131 3 C 1 129 2 C 5 128 9 C 1 C 8 127 8 C 2 C 7 127 6 C 4 C 5 125 9 C 3 C 6 120 0 C 6 119 5 C 4 115 9 C 2 79 8 C 1 38 1 C 9 C21H 7NO 315 37 FAB MS 3 NBA 316 2 M H 100 3 Bis allyloxy phosphorylamino benzoes ure 9H fluoren 9 ylmethylester 44 Zu einer L sung von 79 ul 0 5 mmol Chlorphosphors urediallylester in 5 ml abs Diethylether werden 243 mg 1 0 mmol 3 Aminobenzoes ure 9H fluoren 9 ylmethylester in 5 ml abs Diethylether gegeben und nach Zugabe von weiteren 5 ml abs Diethylether 14 h bei Raumtempera
280. ro B H 1 19 d 3H Ala CH3 3 6 84 Hz 31P_NMR CDCl 202 5 MHz 8 22 55 C24H35N409PS 586 60 ESI MS 587 7 M H Guanosin 5 B imidazolium diphosphat 29 Guanosin 5 diphosphat Dinatrium Salz wird durch folgende Schritte in das Tris tetrabutylammonium Salz berf hrt 1 0 g 2 05 mmol Guanosin 5 diphosphat Dinatrium Salz werden in 200 ml Millipore H gt O gel st und mit 5 g Dowex 50WX2 100 Ionentauscher versetzt Nach 5 h Sch tteln wird der Ionentauscher abfiltiert und zum Filtrat 1 60 g 6 16 mmol Tetrabutylammoniumhydroxid 6 16 ml einer 1M Fluka Standardl sung gegeben Man r hrt 1h bei Raumtemperatur und entfernt das Wasser durch Gefriertrocknung Zu einer L sung von 40 mg GDP 0 5 mmol in ml abs DMF werden unter Argon 42 3 mg Carbonyldiimidazol 2 5 mmol gegeben und 5 h bei Raumtemperatur ger hrt bersch ssiges CDI wird mit 10 quivalenten Methanol 0 2 ml entfernt Nach 45 min R hren bei Raumtemperatur werden die fl chtigen Bestandteile im Hochvakuum entfernt die L sung auf 0 5 ml Gesamtvolumen eingeengt und direkt zum zu kuppelnden Phosphat gegeben Ausbeute 2 03 g 1 76 mmol 86 d Th H NMR CDCl 400 MHz 8 8 18 s 1H H 8 6 01 br s 1H H 1 4 95 4 78 m 2H H 4 H 3 4 55 4 23 m 3H H 5 H 2 3 10 m 24H N CH gt CH gt CH3 gt CH 3 1 80 br s 24 H N CH2 CH2 CH2 CHs3 1 52 br s 24H N CH gt CH gt CH3 gt CH3 1 07 br s 36 H N CH gt CH gt C
281. rocknet und eingeengt Man erh lt einen farblosen Feststoff Ausbeute 488 mg 1 78 mmol 98 d Th Smp 128 C R Wert Cyclohexan Ethylacetat 2 1 v v 0 88 H NMR CDCl 400 MHz 5 7 68 dd 1H arom J 2 01 Hz J 8 54 Hz 7 58 d 1H arom J 2 01 Hz 6 89 d 1H arom J 8 53 Hz 6 01 6 14 m 3H CH CH CH Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 159 5 36 5 48 m 6H CH CH CH 4 79 dt 2H CH CH CH J 5 78 Hz fJ 1 51 Hz 4 63 4 69 m 4H CH CH CH BC NMR CDCL 100 6 MHz amp 167 3 C O 153 2 C 4 146 8 C 3 138 1 137 8 137 6 CH CH CH3 124 1 C 1 123 5 C 6 116 7 C 2 115 8 C 5 115 5 115 1 114 8 CH gt CH CH 3 75 8 Ph O CH gt CH CH 70 2 COO CH gt CH CH3 C 6H1s04 274 3117 FAB MS 3 NBA 274 4 M 30 HRMS FAB 3 NBA berechnet 274 1205 gefunden 274 1199 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 160 3 4 Dihydroxybenzoes uremethylester 20 300 mg 1 95 mmol 3 4 Dihydroxybenzoes ure werden in 20 ml abs Methanol gel st und bei 0 C mit 709 ul 9 75 mmol 5 eq SOCh versetzt Nach 30 min wird auf Raumtemperatur erw rmt und 3h ger hrt Man entfernt die fl chtigen Bestandteile im Vakuum Nach zweifacher Koevaporation mit Toluol wird der R ckstand s ulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt Man erh lt einen wei en Feststoff Ausbeute 315 mg 1 87 mmol 96 d Th Smp 94 95 C Rre Wert Cyclohexan Ethylacetat 1 1 v v 0
282. s Harz wird 4 mal mit je 10 ml abs DMF gewaschen und erneut in 5 ml abs DMF suspendiert und entgast die Suspension f r 30 min durch Durchleiten eines Argonstroms Man gibt 36 mg 0 03 mmol 20 mol Pd PPh3 4 sowie 175 ul 1 6 mmol N Methylanilin hinzu und sch ttelt bei Raumtemperatur 14 h Das Harz wird abfiltriert und 3 mal mit 3 ml abs DMF gewaschen Das DMF wird im Vakuum entfernt und der lige R ckstand mit 3 ml abs Diethylether versetzt Der wei e Niederschlag wird gem AAV 9 gereinigt Ausbeute 46 mg 0 037 mmol 61 d Th H NMR CDCl 400 MHz 5 7 98 s 1H H 8 7 24 7 08 m 9H Phe C 2 C 4 C 5 C 6 5 81 d 1H H 1 J 6 19 Hz 4 58 t 1H Phe o H J 9 54 Hz 4 67 4 62 m 1H Thr a H 4 55 t 1H Gln a H 3J 4 52 Hz 4 45 dd 1 H Leu a H 3J 5 02 Hz 3J 3 18 Hz 4 26 m 1H Thr H 4 20 m 2 H Gly a H 4 16 4 12 m 2H H 4 H 2 4 05 3 99 m 2 H H 5 H 3 3 64 d 2H Ph CH gt P Jy p 17 41 Hz 3 61 m 2H Gln 4 Im Rahmen dieser Arbeit wurden weitere Peptidsequenzen f r die Validierung des Synthesekonzeptes synthetisiert Aus Zeitgr nden wurden diese Peptide jedoch im Rahmen der engen Kooperation von Herrn Dr Courtney Aldrich mit GDP gekuppelt und charakterisiert Die spektroskopischen Daten entsprechen den Erwartungen und sind im Laborjournal von Dr Courtney Aldrich verzeichnet Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 189 H
283. s R ckgrates k me es zu einer sterischen Absto ung 111 und 113 k nnen die f r 109 gezeigte Konformation nicht einnehmen 4 3 3 Quantitative Analyse der Pepticinnamin E Analoga Die bisher aufgef hrten qualitativen Erkl rungen f r die biologischen Aktivit ten einiger Pepticinnamin E Analoga sollten durch quantitative Beschreibungen untermauert werden In einer Vorgehensweise wie sie bereits f r die Analyse der Nakijichinon Analoga angewandt wurde Kapitel 4 2 6 konnten die Wechselwirkungen zwischen den Pepticinnamin E Lars Kissau 4 Spezieller Teil 105 Analoga und der PFT charakterisiert werden Neben der Zahl und Geometrie der Wasserstoffbr cken wurden hydrophobe Wechselwirkungen betrachtet Diese Analyse ist f r die Weiterentwicklung dieser Verbindungsklasse ebenso wichtig wie das qualitative Verst ndnis der Wirkung 4 3 3 1 Der Beitrag von Wasserstoffbr cken bei der Bindung von Inhibitoren an die Farnesyltransferase Einige automatische Dockingprogramme GOLD oder LUDI bewerten die St rke von Wasserstoffbr cken anhand geometrischer Abweichung von statistisch aus Kristallstrukturen abgeleiteten Idealwerten meist erg nzt um diverse Korrekturfaktoren Diese lteren Scoring Modelle oder k rzlich vorgeschlagene konnten nicht in WitnotP integriert werden so dass stattdessen ein manueller Abgleich mit den als ideal betrachteten Werten vorgenommen wurde hnlich wie bei der Betrachtung der Kinase Inhibitoren di
284. schlagenen Bindungsmodi und allen untersuchten Inhibitoren angewandt Wie im experimentellen Teil detailliert beschrieben war es f r die CHARMM Minimierung erforderlich das Zinkion und die koordinierenden Aminos uren in ihren Positionen zu fixieren da in CHARMM Gr e und Koordinationsgeometrie des Zn Kations nicht ausreichend parametrisiert sind Die Bindungsmodi der Liganden wurden hierdurch jedoch nicht verf lscht Lars Kissau 4 Spezieller Teil 97 Pepticinnamin E cl OMe CHARMM H 9 o0 o ZN N NA NH mp o Se A 3 wg OH g HYDRO aktives Zentrum Polares Zimts ure Diketo rest piperazin Carboxylat Bindungstasche WitnotP CHARMM FPP Bindungs tasche Pyrophosphattasche Abbildung 67 Vorgehensweise zur Ermittlung des Bindungsmodus von Pepticinnamin E an die PFT unten rechts gezeigt Entsprechend den eingangs angestellten berlegungen blockiert der unpolare Zimts urerest die FPP Bindungstasche w hrend die polareren Tyrosine und das sehr polares Diketopiperazin in hydrophilen Regionen der Pyrophosphattasche und der Tasche die den C Terminus des Substratpeptides aufnehmen soll binden Die N terminale Diketopiperazin einheit bindet ber H Br cken sowohl an Gln 167qa als auch an Arg 202a Diese Wasserstoffbr cken sind auch in der Kristallstruktur zwischen der PFT und dem Peptidsubstrat zu finden Der Phenylalaninrest f llt eine hydrophobe Tasche zwischen Gln 167a und Tyr 2008 G
285. se Inhibitoren 135 Der in Abbildung 44 gezeigte marine Naturstoff Nakijiquinon C 6 und dessen C 2 gegeben Epimer 98 waren Ausgangspunkt dieser Untersuchungen Nach seiner Isolierung aus einem Schwamm vor Okinawa fiel Nakijiquinon C 6 durch eine Inhibition der ErbB 2 Rezeptor Tyrosin Kinase auf Das C 2 Epimer 98 zeigt keine Aktivit t gegen ErbB 2 inhibiert jedoch VEGFR 2 ICs 18 uM Lars Kissau 4 Spezieller Teil 66 ou O Non Nou O 98 Nakijichinon C C 2 Epimer Abbildung 44 Strukturen des Naturstoffes Nakijichinon C und des C 2 Epimers An die erfolgreiche Totalsynthese von Nakijichinon C schloss sich die Synthese einer kleinen Bibliothek von Analoga an 617 Nakijichinon C 6 sowie diese Analoga wurden nachfolgend als potentielle ATP kompetitive Inhibitoren von Rezeptor Tyrosin Kinasen in einem Fluoreszenz basierten Assay untersucht Von den 74 getesteten Verbindungen zeigten 7 eine Aktivit t gegen verschiedene Rezeptor Tyrosin Kinasen teils mit ausgezeichneter Selektivit t Die inhibierten Rezeptor Tyrosin Kinasen Erb B2 Tie 2 VEGFR 2 VEGFR 3 und IGFIR sind aufgrund der eingangs erw hnten Schl sselrolle in Signaltransduktionsprozessen von hohem Interesse Voraussetzung f r eine weitere Verbesserung dieser Inhibitoren ist eine Rationalisierung der beobachteten Aktivit tsmuster Die Anwendung von Molecular Modelling setzt die Existenz einer geeigneten dreidimensionalen Struktur der Inhibitoren und Proteine vor
286. sel zwischen der inaktiven GDP bindenden Konformation und der aktiven GTP bindenden Konformation leiten sich einige vielversprechende Ans tze zur Entwicklung von anti Tumor Therapeutika ab Neben der Inhibition der durch das Enzym Farnesyltransferase katalysierten Prenylierung sollte auch durch Beeinflussung der GTPase Reaktion ein Unterbinden der unerw nschten Weiterleitung von Signalen m glich sein 2 2 2 1 GTP GDP Austausch Ras besitzt eine intrinsische GTPase Aktivit t wobei im Sinne einer Substrat beschleunigten Katalyse GTP selbst als allgemeine Base fungiert FTIR Untersuchungen st tzen die Annahme eines assoziativen Mechanismus ber ein pentavalentes Phosphoratom an in dessen Verlauf sich am y Phosphat eine negative Ladung aufbaut Die intrinsische GTPase Reaktion ist jedoch sehr langsam Das Protein GAP GTPase activating protein erh ht die intrinsische GTPase Aktivit t von Ras und sorgt dadurch daf r dass Ras wieder deaktiviert wird die sogenannte Switch off Reaktion des molekularen Schalters Der Mechanismus dieser Wirkung wurde von Wittinghofer et al in zahlreichen Experimenten beleuchtet F r die GAP katalysierte GTPase Reaktion von Ras konnte ein k Wert von 5 20 s ermittelt werden der ca 10 mal gr er ist als der der nichtstimulierten Reaktion Die 1997 von K Scheffzek et al aufgekl rte Struktur des Komplexes zwischen dem menschlichen H Ras Protein und dem GTPase aktivierenden Protein
287. sende Kette aufgekuppelt werden Die Strukturen der in dieser Arbeit verwendeten Reagentien und Linker sind aus Gr nden der bersichtlichkeit im Anhang II wiedergegeben Steht hierbei keine einzelne Zielsubstanz sondern maximal Diversit t als Ziel fest so k nnen in dem von K S Lam und K Furka entwickelten Split and Mix Verfahren rasch gro e Zahlen von Verbindungen synthetisiert werden Durch die Anwendung orthogonaler Schutzgruppen ist eine schrittweise Entsch tzung der Aminos ureseitenketten und letzlich die Abspaltung der Zielpeptide vom Harz m glich Die Verfahrenweise in der kombinatorischen Chemie besteht aus drei Schritten 1 der Synthese der Bibliothek 2 dem Screening der Verbindungen bez glich einer bestimmten Aktivit t 3 die Aufkl rung der Struktur der aktiven Verbindungen Das Screening kann direkt am Harz on bead screening oder in L sung durchgef hrt werden Die Strukturaufkl rung ergibt sich bei einer kombinatorischen Parallelsynthese aus der Abfolge der Bausteine Bei der Synthese einer kombinatorischen Split Mix Bibliothek ist die Auswahl einer Encoding Methode notwendig da die r umliche Trennung von Einzelverbindungen nicht mehr m glich ist Ein graphisches Encoding erfordert die Beschriftung z B von Tea Bags Ein chemisches Encoding meist durch DNA Sequenzen die nach PCR Amplifizierung analysiert werden erfordert die parallele Synthese zweier Verbindungen pro Bead Elektronisches Encodin
288. spiegelt sich in der Tabelle wieder da fast alle Substitutionen in diesem Bereich zu finden sind Die Nummerierung der Aminos uren in den Homologiemodellen bezieht sich auf die Nummerierung der Prim rsequenzen wie sie in der Swissprot Database aufgef hrt sind Auff llig ist zun chst die vollkommene Identit t von VEGFR 2 und VEGFR 3 im Bereich der ATP Bindungstasche Lediglich im Nucleotide Binding Loop am C terminalen Ende und in Teilen des Activation Loops X XaRLPX3X4WMA Sequenz finden sich Substitutionen was im Einklang mit der in Kapitel 2 1 2 1 erw hnten selektiven Bindung von Downstream Effektoren in diesem Bereich steht Die bei Verbindung 100 beobachtete Selektivit t zwischen VEGFR 2 und VEGFR 3 bei gleichzeitig fehlender Selektivit t zwischen IGFIR und Tie 2 ist in diesem Zusammenhang bemerkenswert und wurde sorgf ltig analysiert Lars Kissau 4 Spezieller Teil 76 Nummer IGFIR VEGFR 2 VEGFR 3 Tie 2 ErbB 2 1 Leu 1002 Leu 840 Leu 851 Ile 830 Leu 726 2 Met 1076 Val 916 Val 927 Ile 902 Thr 794 3 Val 1060 Val 899 Val 910 Ile 886 Ser 779 4 Val 1065 Val 914 Val 925 Leu 900 Ile 784 5 Phe 1054 Ile 892 Ile 903 Leu 879 Val 773 6 Met 1051 Leu 889 Leu 900 Leu 876 Met 770 7 Val 1050 Ile 888 Ile 899 Val 875 Val 769 8 Met 1079 Cys 919 Cys 930 Ala 905 Met 797 9 Met 1139 Leu 1035 Leu 983 Leu 971 Leu 833 10 Gly 1149 Cys 1045 Cys 993 Ala 981 Thr 843 11 Gln 1004 Arg 842 Tyr 853 Glu 832 Ser 728
289. systematisches Durchsuchen des Konformationsraumes ist sehr zeitraubend da die Rechenzeit mit zunehmender Zahl drehbarer Bindungen stark ansteigt Ein Ansatz um m glichst viele L sungen des Problems mathematisch zu evaluieren sind genetische Algorithmen Sowohl PEP als auch GOLD bedienen sich zur Ermittlung optimaler Geometrien eines sogenannten genetischen Algorithmus In Analogie zum nat rlichen Vorbild wird jeder Geometrie des evaluierten Liganden ein Chromosom zugeordnet Diese werden durch Mutations und Cross Over Operatoren ver ndert und erneut evaluiert Chromosomen mit einer h heren Fitness ersetzen die Chromosomen der Eltern Generation Durch ihre stochastische Natur gibt es bei genetischen Algorithmen eine endliche Wahrscheinlichkeit die optimale L sung nicht zu finden Allerdings ist ihre Effektivit t als Such bzw Optimierungsalgorithmen mehrfach nachgewiesen Die Chromosomen in GOLD oder PEP enthalten Informationen ber Wasserstoffbr cken zum Rezeptor hydrophobe Wechselwirkungen und die potentielle Energie der gew hlten Konformationen PEP erlaubt keine weiteren manuellen nderungen GOLD erm glicht beispielsweise Ver nderungen in der Zahl der Chromosomen oder des Selektionsdrucks was sich prim r auf die Rechenzeit auswirkt 2 3 3 3 Auswahl von Einflussfaktoren Bei der Untersuchung der Bindung von Liganden an einen Rezeptor m ssen einige wichtige Wechselwirkungsarten ber cksichtigt und korrekt gewichtet werden
290. t F r eine CHARMM Minimierung m ssen ein pdb und ein psf File erzeugt die korrekten Ladungen berechnet und Atomtypen zugeordnet werden Zur Ladungsberechnung wird die Konnektivit t der einzelnen Atome betrachtet Die Berechnung der MPEOE Modified Partial Equalization of Orbital Electronegativity Ladungen kann von WitnotP automatisch durchgef hrt werden Namen und Nummerierung der Atome und Reste werden ebenfalls ge ndert und uneindeutige Zuordnungen die CHARMM zum Abst rzen bringen zu vermeiden Von der WitnotP Kommandozeile sind folgende Eingaben zu t tigen mol name bezieht sich auf die Bezeichnung des Molek ls auf das diese Operation angewendet werden soll Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 135 WitnotP modify atom lig current mol_name done atom charge auto mol_name done atom type auto charm mol_name done atom q mol name done MPEOE atom name mol name done auto seq resnum mol_name 1 write mol2 mol_name mol_name write xpdb mol_name mol_name CHARMm psf mol name mol name Diese Schritte sind im WitnotP Scripts PRCA zusammengefasst Nach dem Erstellen der Dateien mol name pdb und mol_name psf kann von der UNIX Kommandozeile aus eine CHARMM Minimierung gestartet werden Die erforderlichen Eingaben k nnen manuell vorgenommen oder in einem Input File gespeichert werden Durch die Verwendung der unter AAV MM3 AAV MM beschriebenen Minimierungsmethoden kann dieser Prozess gestartet wer
291. t HYDROMAP und PASS berechnet und mit WitnotP und Snapshot dargestellt bzw im TIFF Format exportiert Hier sind nur die Tastatureingaben wiedergegeben Die meisten Mausbewegungen k nnen nicht beschrieben werden WitnotP Read xpdb 1 WQ1 pdb done Move atom click on GAP ARG 789 connected done GAP done Move molecule IWQ1 pdb Ras done Delete atom Ras A HOH done Read xpdb 5P21 pdb done use 5P21 pdb done lt bb 5P21 und Ras berlagern Move atom click on GTP connected done GTP done Delete atom click on Ras GDP AIF4 connected done Move molecule GTP Ras done lt pdb2c Ras Unix Minfixxbb_ridgid_ ad run Ras WitnotP Delete molecule Ras pb2_save_ Ras done Read xpdb Ras_m pdb done Move molecule Ras _m pdb Ras done Write xpdb Ras Ras done lt hydroprep Ras done Unix Pass Ras done Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 155 Move Ras_hyd mol Ras_hyd mol2 done Hydromap Ras inp done siehe Anhang X GRASP Bild mit Snapshot und XV in TIFF Format konvertieren und abspeichern WitnotP Read Ras probes pdb Set radii Ras probes pdb 1 4 done Cpk on Ras probes pdb done lt sasurf Ras siehe AAV MM11 Screenshot mit Snapshot und XV als TIFF Format abspeichern Erweiterung der Monomerbibliothek von PEP 1 0 Die 19 chiralen nat rlichen Aminos uren sowie Phenylglycin und Ornithin wurden als D Enantiomere mit WitnotP AAV MMI gezeichnet und nach Kraftfeldminimierung AA
292. t durch den Einsatz des tert Butylesters verhindern Tyrosin Serin und Glutamin wurden jeweils Trityl gesch tzt verwendet Von den zahlreichen M glichkeiten f r das Sch tzen der Guanidinofunktion des Arginins wurde die Pmc Schutzgruppe ausgew hlt da diese weder aggressiver Abspaltungsbedingungen bedarf noch aus sterischen Gr nden schlecht zu kuppeln ist wie 105 dies f r Bis Boc gesch tztes Arginin beispielsweise der Fall ist Die s urelabilen Schutzgruppen sollten bei der Abspaltung des Peptides von der festen Phase gleichzeitig entfernt werden Da die Quelleigenschaften des Harzes sich im Laufe der Synthese deutlich 106 107 ver ndern war es von Vorteil zun chst in reinem Dichlormethan und nach Ankn pfung der zweiten Aminos ure in einem 1 1 Gemisch von Dichlormethan und DMF zu arbeiten F r Lars Kissau 4 Spezieller Teil 38 die manuelle Parallel Synthese der einzelnen Peptide wurden jeweils 100 mg Wang Harz verwendet Nach der Aufreinigung mittels pr parativer HPLC zeigte sich bei der Lagerung der Produkte bei 30 C dass insbesondere die Peptide mit der Diaminobenzoes ure Kopfgruppe zur Zersetzung neigten HPLC ESI MS Untersuchungen ergaben Hinweise auf eine langsame Oxidation der aromatischen Aminogruppen 4 1 3 4 Biologische Evaluierung Die durch pr parative HPLC gereinigten Peptide wurden von Dipl Biol Robert Gail getestet Hierzu wurden zwei Assays verwendet Zun chst wurde in einem Filterbi
293. t ist auf der CD als ras240402 pdb abgespeichert Die Ergebnisse aller Runs wurde verglichen und solche Reste f r die Bibliothek ausgew hlt die wiederholt positiv bewertet wurden Alle Output Dateien sind auf der beiliegenden CD im RTF Format abgespeichert Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 157 Synthese der Kopfgruppen sowie Kupplung mit Testsequenzen 3 4 Dinitrobenzoes ure n hexylamid 10 120 mg 0 57 mmol 3 4 Dinitrobenzoes ure werden in 10 ml abs Dichlormethan gel st und mit 210 mg 0 56 mmol HATU und 110 mg 145 ul 0 85 mmol N Ethyldiisoproylamin versetzt Nach 4 min R hren bei Raumtemperatur werden 63 mg 83 ul 0 62 mmol n Hexylamin zugegeben und bei Raumtemperatur 14 h ger hrt Man verd nnt mit 40 ml Dichlormethan und w scht drei mal mit ges NH4Cl L sung und einmal mit ges NaCl L sung Die organische Phase wird ber Na5SO getrocknet und eingeengt Das Rohprodukt wird durch Chromatographie and Kieselgel Eluent Cylohexan Ethylacetat 4 1 v v gereinigt Man erh lt ein gelbes l Ausbeute 110 mg 0 37 mmol 65 4 d Th Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat 1 1 v v 0 76 H NMR CDCl 400 MHz 8 29 d 1H Aromat J 1 74 Hz 8 15 dd 1H Aromat 3J 8 32 Hz 7J 1 7 Hz 7 98 d 1H J 8 32 Hz 6 37 br s 1H N H 3 48 dt 2H CH 3J 5 9 Hz J 7 2 Hz 1 64 ytt 3H J 7 2 Hz 1 25 1 45 m 7H Hexyl 0 87 0 93 m 3H Hexyl C NMR CDCI 100 6 MHz 5 162 9 C O 143 9
294. t neben Homodimeren auch Heterodimere mit anderen Rezeptor Tyrosin Kinasen und moduliert dadurch eine Vielzahl von Signalkaskaden Ein Austausch von Valin 664 in Her 2 Neu zu Glutamins ure f hrt zu konstitutiver Dimerisierung und entsprechend gesteigerter Kinaseaktivit t Da kein f r Her 2 spezifischer Wachstumsfaktor gefunden werden konnte gilt die Bildung von Heterodimeren mit anderen RTKs aus der EGF Familie und die dadurch bedingte Verst rkung von Wachstumssignalen als Hauptaufgabe von Her 2 Her 2 Heterodimere sind f r die Transmission eines Signals an Ras und MAPK nicht nur essentiell sondern steuern offenbar auch die St rke des Signals 30 Eine neuere Untersuchung belegt die Wichtigkeit der EGF Her 2 Heterodimere Demnach sind in 60 aller soliden Tumore diese Rezeptorsysteme am fehlgesteuerten Wachstum beteiligt 2 1 3 5 IGFIR Ein Beispiel f r die angesprochenen durch RTKs gesteuerten metabolischen Ver nderungen ist die Insulin Rezeptor Tyrosin Kinase IRK die nach Bindung von Insulin an die extrazellul re Dom ne durch Phosphorylierungen sogenannter IRS Proteine an der Innenseite der Zellmembran lokalisiert Die Aktivierung der Phosphoinositol 3 Kinase PI 3K durch phosphorylierte IRS gilt als kritischer Schritt bei der Translokation von Glucosetransportern 3132 Eng verwandt mit dem Insulin Rezeptor 80 Identit t innerhalb der Kinasedom ne ist der Insulin like Growth Factor Receptor 1 IGFIR Die Apoptose wird in
295. t und wurden daher detailliert untersucht OMe O H Me S Fach N Non om O Oo 3 LI Q OH 114 Abbildung 69 C terminal verk rzte Pepticinnamin E Analoga 110 und 116 Lars Kissau 4 Spezieller Teil 100 Auch f r die Untersuchung der biologisch aktiven Mitglieder der Bibliothek von Pepticinnamin E Analoga gab die mit HY DROMAP erstellte Hydrophobizit tskarte der PFT wertvolle Hinweise Wie beim Naturstoff sind auch hier sterische Gr nde Wechselwirkung der beiden N Methylgruppen als Ursache f r eine im Vergleich zum CAAX Peptid ver nderte Konformation zu nennen Bei der Ermittlung der Bindungsmodi dienten auch hier die Hydrophobizit tskarten von 110 und 114 als erste Orientierung nicht gezeigt F r das manuelle Docking wurden die Wechselwirkung der freien Carboxylatgruppen mit der durch Arg 202 Glu 198a und Gln 167a begrenzten polaren Tasche sowie die Blockade der Zink Bindungstasche durch den N terminalen Tyrosinrest als Startpunkte betrachtet a c Abbildung 70 Bindungsmodi der Pepticinnamin E Analoga 110 und 114 a 114 in PFT mit SA Oberfl chen b 114 in PFT wichtige Aminos uren sind explizit benannt c 110 in PFT mit SA Oberfl chen d 110 in PFt wichtige Aminos uren sind explizit benannt Wie aus Abbildung 70 ersichtlich binden 110 und 114 in vergleichbarer Weise an PFT Analog zum Bindungsmodus von Pepticinnamin E blockiert der Methoxyphenylalaninrest die Pyrophosphatbindungstasche wobei gleic
296. t verd nnt Nach Extraktion mit 0 1 M Phosphatpuffer pH 7 wird die organische Phase mit Na SO getrocknet und das erhaltene Rohprodukt an Kieselgel chromatographiert Eluent Cyclohexan Ethylacetat 2 1 v v Ausbeute 178 mg 0 45 mmol 56 d Th Rre Wert Cyclohexan Ethylacetat 2 1 v v 0 23 H NMR CDCI 400 MHz 5 7 69 t 1H Aromat J 1 76 Hz 7 62 dt 1H Aromat J 1 37 Hz J 7 43 Hz 7 29 t 1H Aromat 3J 8 02 Hz 7 23 ddd 1H Aromat J 1 37 Hz J 2 35 Hz J 8 02 Hz 7 03 brd 1H N H J 9 38 Hz 5 90 dddd 2H CH2 CH CH Jyp 0 78 Hz Jz 17 20 Jz 10 36 Hz 3J 5 67 Hz 5 32 ddd 2H CH gt CH CH trans a y 1 56 Hz Je 17 20 Hz J 2 93 Hz 5 18 ddd 2H CH gt CH CH cis Jay 1 17 Hz Jz 10 36 Hz J 2 93 Hz 4 48 4 67 br m 4H CH CH CH Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 168 4 36 4 42 m 2H CH gt CH gt Si CH3 5 1 07 1 14 m 2H CH gt CH gt Si CH3 3 0 06 s 9H CH CH Si CH3 BC NMR CDCL 100 6 MHz 167 9 C O 141 4 C 3 133 8 133 7 Allyl C 2 133 2 C 1 130 6 C 5 124 2 C 6 123 3 C 4 120 0 119 9 Allyl C 3 119 8 C 2 68 8 68 7 Allyl C 1 64 7 CH gt CH gt Si CH3 18 8 CH gt CH gt Si CH3 0 1 CH gt CH Si CH3 3 31P_NMR CDCI 202 5 MHz 8 3 74 C1sH2sNOsPSi 397 48 FAB MS 3 NBA 397 6 M H 5 3 Nitro benzoes ure tert butylester 46 Z
297. te Strategie sollten durch die Synthese und Evaluierung von Peptiden Schl sselstellen der Interaktion zwischen Ras und einem niedermolekularen Effektor identifiziert werden Unterst tzt durch Molecular Modelling sollten diese Resultate rationalisiert und zum Design von Peptidmimetika herangezogen werden Basierend auf einem in silico screening einer kombinatorischen Peptidbibliothek von 40 2 560 000 Verbindungen wurde zun chst eine fokussierte Bibliothek von 36 Tetrapeptiden synthetisiert und mit den in Abbildung 79 gezeigten Hydrolyse fordernden Kopfgruppen verkniipft O O O O O CT CT CT CT wr HN HO HN HO HN N Abbildung 79 Kopfgruppen f r die Peptidbibliothek die die Hydrolyse von GTP beschleunigen sollten Da bei der biologischen Evaluierung jedoch keine Hydrolyse von GTP gemessen werden konnte wurde eine kombinatorische Split Mix Biblithek von ca 32 000 Peptiden synthetisiert die anschlie end in einem neu zu entwickelnden On Bead Assay evaluiert werden sollte Um die Bindung der Peptide an Ras im Bereich der GTP Bindungstasche zu Lars Kissau 5 Zusammenfassung und Ausblick 120 gew hrleisten wurden diese Peptide kovalent ber einen Spacer mit GTP verkn pft Aufgrund seiner hohen Affinit t zu Ras Ka 10 M verankert GTP die Verbindungen sicher im gew nschten Bereich O 0 H O oO 0 N P OH O P OH HO HO 1 HO 1 OH OH OH OY d OH 34 oO H d OH Horn ON EH OH 37 Abbildung 80 Strukturen der syn
298. teine wie Ras 21 kDa ausreichend permeabel ist und ber ein ausgezeichnetes Quellverhalten in Wasser bzw w ssrigen Puffersystemen verf gt Lars Kissau 5 Zusammenfassung und Ausblick 121 SPPS 2 Mi V H 1 2 3 4 pro sell NHFmoc Diyos AA AAT AAT AA NH H H 1 A HBTU HOBt 3 Piperidin DMF DMF CH CI 4 GDP Im DMF 2 TFA CHL o seu lt Oo o H OO Oo N vun ei BAAR AR N o 9 P 0 P O P O o N ro NAAT AA2 AA2 AM TI ern Pd PPh OH OH DMF Morpholin GTP Peptid Konjugate 2h Abbildung 82 Synthese von GTP Peptidkonjugaten mit einen Pd 0 labilen Linker blau markiert und dem Spacer 37 rot markiert Nach der Synthese wurden die GTP Peptid beladenen PEGA Beads mit fluoreszenzmarkiertem H Ras inkubiert Unter den gew hlten Bedingungen konnten nur solche GTP Peptid Konjugate das Protein binden die ber eine hohe Affinit t zu Ras verf gen Weniger als 1 o der Beads ca 30 von 32 000 Peptiden zeigten eine Affinit t zu Ras Die fluoreszierenden Beads wurden manuell unter dem Mikroskop selektiert und durch Edman Abbau sequenziert Abbildung 83 Bilder der Split Mix Bibliothek Die fluoreszierenden Beads heben sich deutlich vom Rest ab der kein Atto655 Ras gebunden hat Die bei der BASF AG durchgef hrte Edman Sequenzierung der manuell selektierten fluoreszierenden Beads ergab folgende Sequenzen GAMGA YMMLL GAPME PGPMG MPFEM und MPPAE Offenbar besteht eine Bevorzugung f r Prolin oder Me
299. ten S urelabilit t der Triphosphateinheit vor der Kupplung entfernt Nach N terminaler Entsch tzung mit Piperidin wurde der Spacer 37 nach Voraktivierung mit HBTU auf die Peptide aufgekuppelt und entsch tzt Die in Abschnitt 4 4 4 beschriebene Methode der Aktivierung des GDP bedurfte einiger Optimierung bis diese Methode reproduzierbare Resultate sowohl in L sung als auch an der festen Phase ergab Nach der Entsch tzung der Spacers wurde das Harz in absolutem DMF ber Nacht in Gegenwart von frisch aktiviertem Molsieb getrocknet Das kommerzielle Guanosin 5 diphosphat dinatrium Salz wird zun chst in das Tris tributylammonium Salz berf hrt Letzteres ist in DMF l slich und kann gel st mit CDI aktiviert werden bersch ssiges CDI muss vor der Reaktion mit dem Phosphat durch Addition eines quivalents Methanol entfernt werden Das aktivierte GDP 29 wird zum entsch tzten Phosphat gegeben und ber Nacht bei 50 C vorsichtig gesch ttelt Hierbei trat keine Reaktion des voraktivierten GDPs mit der freien OH Gruppe des bereits entsch tzten Threonins auf Wie erwartet bte das prim re Amid von Glutamin ebenfalls keinen st renden Einflu auf die Reaktion aus Die Vorgehensweise ist in Abbildung 37 dargestellt Lars Kissau 4 Spezieller Teil 52 SPPS R I O H 1 2 3 4 OOo NHFmoc A 0 sell AAT AAAA AAS NHS H H 1 A HBTU HOBt 3 Piperidin DMF DMF CH2Cl 4 GDP Im DMF 2 TFA CH Cl 0 DON S e H o o e
300. than Methanol 95 5 v v 0 19 H NMR CDCL 400 MHz 7 70 t 4H H 4 H 5 J 8 21 Hz 7 49 dd 4H H 1 H 8 J 7 43 Hz J 6 43 Hz 7 36 dd 4H H 3 Her J 8 21 Hz J 12 79 Hz 7 26 ddd 4H C 2 C 7 J 0 98 Hz J 7 43 Hz J 12 71 Hz 4 27 ddd 4H H 1 Jyp 2 74 Hz J 6 45 Hz J 12 90 Hz 4 10 t 2H H r J 6 45 Hz 4 03 s 2H O CH gt CO R 4 02 3 96 m 2H P O CH CH 3 59 t 2H P O CH CHb J 4 30 Hz C NMR CDCI 100 6 MHz amp 172 1 C O 143 1 C 8a C 9a 141 6 C 4a C 4b 128 1 C 1 CS 127 4 C 2 C 7 125 3 C 3 C 6 120 2 C 4 C 5 70 5 d C 1 Je 3 84 Hz 69 8 d CH2 CH O P J 5 38 Hz 68 8 O CH gt CO R 67 2 d CH gt CH gt O P Jc p 6 15 Hz 48 0 d C 9 Jc p 8 46 Hz 31P_NMR CDCl 202 5 MHz 5 0 67 C32H2907P 556 5422 FAB MS 3 NBA 579 0 M Na 39 557 0 M H 8 HRMS FAB 3 NBA berechnet ftir C32H29NaO7P 579 1549 gefunden 579 1554 2 Bis 9H fluoren 9 ylmethoxy phosphoryloxy ethoxy glycinylphenylalaninmethyl ester 76 80 mg 0 14 mmol S ure werden mit 52 6 mg 0 138 mmol HBTU und 72 ul 0 413 mmol DIPEA in 1 5 ml Dichlormethan DMF 2 1 bei Raumtemperatur 3 Minuten voraktiviert und anschlie end mit 27 8 mg Phenylalaninmethylester hydrochlorid versetzt Man r hrt 3 5h bei Raumtemperatur
301. thetisiert werden Die acht ausgew hlten Aminos uren Glutamins ure Lysin Alanin Prolin Phenylalanin Methionin Isoleucin und Glycin bieten die M glichkeit von hydrophilen lipophilen und Coulomb Wechselwirkungen Die Verwendung von Prolin und Glycin sollte verschiedene Konformationen erm glichen siehe Kapitel 4 1 4 1 Anstelle der Reaktionskontrolle durch Fmoc Bestimmung wurde bei der Split Mix Synthese jede Kupplung durch einen Kaiser Test berpr ft Bei einem Einsatz von 4 quivalenten Lars Kissau 4 Spezieller Teil 57 voraktivierter Aminos ure war eine Reaktionszeit von 4 Stunden f r einen quantitativen Umsatz bei den Kupplungsreaktionen ausreichend Bei der Synthese einer Split Mix Bibliothek wird stets eine statistische Verteilung der m glichen Sequenzen angestrebt Um zu gew hrleisten dass alle m glichen Sequenzen tats chlich in vergleichbaren Mengen bei der Split Mix Synthese entstehen muss das Harz nach den Misch Schritten gleichm ig auf alle Reaktoren verteilt werden PEGA Harz sollte normalerweise nicht getrocknet werden um Form und Funktion nicht zu beeintr chtigen Das Trocknen und Abwiegen des PEGA Harzes schied also als M glichkeit aus Ein Abwiegen des feuchten Harzes f hrte stets zu ungleichen Mengen in den einzelnen Reaktoren Als Suspension in einem Gemisch von DMF CH gt Ch und Methanol 80 15 5 konnte das Harz mittels Eppendorf Pipette bestens aliquotiert werden Auch der humane Einfluss auf die Effizien
302. thetisierten und getesteten Spacer Die Spacer sollten als Platzhalter f r sp ter einzuf hrende Hydrolyse f rdernde Gruppen dienen Es wurden verschiedene Spacer entwickelt und synthetisiert siehe Abbildung 80 Daneben wurde auch die Methode der Synthese von GTP Konjugaten verbessert und f r die Festphasensynthese angepasst Anstelle GTP mit den Peptiden EDC vermittelt zu verkn pfen wird GDP hierbei mit CDI voraktiviert und ergibt nach Umsetzung mit substituierten Monophosphaten das gew nschte GTP Konjugat in hohen Ausbeuten o N NH C ocr GE NH2 4 CDI sooth Sa NEN o P 0 P 0 o p R P 0 P 0 P 0 o o o 2 9 o o R P o gg OH OH p Ge OH OH Abbildung 81 Neue Synthese von GTP Analoga Vor der Synthese der Split Mix Bibliothek wurden verschiedene GTP Peptid Konjugate einzeln synthetisiert um die allgemeine Anwendbarkeit der Synthesemethoden zu validieren Um eine milde Abspaltung der GTP Peptid Konjugate vom Harz zu erm glichen wurde in Zusammenarbeit mit Dr L Soulere ein Pd 0 labiler Linker synthetisiert Die auf diese Weise getesteten Methoden und Reagentien wurden zur Synthese der Split Mix Bibliotheken verwendet wobei die Verfahren soweit standardisiert werden konnten dass die Synthesen auch auf einem Synthese Halbautomaten Quest 210 durchgef hrt werden k nnen Als polymerer Tr ger wurde nach Evaluierung verschiedener M glichkeiten das von M Meldal et al entwickelte PEGA Harz ausgew hlt S da es f r Pro
303. thionin in der Position 3 Diese Resultate konnten im Anschluss durch Docking Experimente rationalisiert werden Die Seitenketten von Methionin und Prolin binden demnach in einer hydrophoben Stelle auf der Ras Oberfl che Die Peptide weisen eine Turn Konformation auf Auf Basis der gefundenen Bindungsmodi wurde daher das in Abbildung 84 gezeigte Peptidmimetikum als Lars Kissau 5 Zusammenfassuns und Ausblick 122 erste Leitstruktur entwickelt die als Grundlage f r die weitere Entwicklung eines GAP ersetzenden Molek ls dienen kann SE D ne Abbildung 84 Aus den Peptidsequenzen hier PGPMG gezeigt konnten R ckschl sse auf wichtige Wechselwirkungen gezogen und ein Peptidmimetikum als neue Leitstruktur durch Molecular Modelling entworfen werden In weiteren Projekten der vorliegenden Arbeit sollten die Aktivit ten und Selektivit ten von Inhibitoren verschiedener Rezeptor Tyrosin Kinasen sowie der Protein Farnesyl Transferase durch Molecular Modelling Studien rationalisiert und zur Entwicklung optimierter Inhibitoren herangezogen werden Um das Verst ndnis f r die Wirkung und die Selektivit t des Naturstoffs Nakijichinon C 6 und dessen Analoga auf Rezeptor Tyrosin Kinasen auf molekularer Ebene zu erweitern sollte aufgekl rt werden wie die in Abbildung 85 gezeigten Verbindungen mit den Kinasedom nen der Rezeptor Tyrosin Kinasen Tie 2 VEGFR 2 VEGFR 3 und erbB 2 und IGFIR wechselwirken Aus den Struktur Aktivit ts Beziehun
304. thode weist einige schwerwiegende Nachteile auf So findet bezogen auf das nicht gerade preiswerte GTP sind mit 10 f r chemische Synthesen nicht akzeptabel und die Reinigung erfordert eine langwierige Ionen Austausch Chromatographie um nicht umgesetztes GTP abzutrennen so dass die Synthese auf sehr stabile Verbindungen beschr nkt ist Bei der Ankn pfung zuvor synthetisierter Peptide ist die Verwendung eines berschusses wenig ratsam beim Einsatz von einem quivalent GTP sinkt die Ausbeute auf unter 2 Lars Kissau 4 Spezieller Teil 41 o a Dy Je i O Zs RI xH P OFP 0 Re E NE ne e HO P 0 B 0 P 0 0 o 24 OH OH A B C 1 EDC 2 R NH o R NH o N NH Ch OH r NH o o 0 N ON NH O O P 0 S 4 HO P 0 P 0 P 0 o HO R DO N RBS HN NH O O Z O F O o OH OH o H 7 25 OQ e 26 Abbildung 22 a Retrosynthese von GTP Analoga b Synthesestrategie nach Morr et al Neben dieser Vorgehensweise die dem in Abbildung 22 angedeuteten Retrosyntheseschnitt A entspricht ist der Aufbau von GTP Konjugaten auch aus GDP Schnitt B oder GMP Schnitt C Vorl ufern m glich Ein sukzessiver Aufbau ausgehend vom Nucleosid ber 114 Eleganter ist die wiederholte Phosphorylierung mit POCI wurde ebenfalls bereits erprobt Aktivierung von GDP mittels Carbonyl diimidazol CDI und Kupplung mit einem Phosphat Schnitt Bulli o o N NH NH l I KAA o N Mu o N NH 1 ri
305. tion Laurent Bialy eine Homologiemodell der PP2A unter Verwendung der Struktur der PP1 als Templat erstellt Dieses Modell kann f r die weitere Aufkl rung der Wirkung von Cytostatin hilfreich sein allerdings sind zun chst weiterf hrende Messung zur Aufkl rung des Inhibitionsmechanismus erforderlich Die Koordinaten des Modells sind auf der beiliegenden CD im Verzeichnis PP2A gespeichert Zum Vergleich sind hier die Ribbon Diagramme der katalytischen Untereinheiten der PP2A und der PP1 abgebildet Ebenfalls gezeigt ist das zur Erstellung der Homologiemodelle verwendete Alignment der beiden Prim rsequenzen SH KLNIDSTIORDEEEVRSSKPERN VE eko WE D st oh er PP2A MDERVFTREJBOW TEOLNER SEES BEE FF TE sv IR viv PPI ee ee ie Pe PP2A ae oe eo a i TO on PPI BEN ne u ke mu 5 Bae PP2A Be U a u a RR WW str PP OBER Me Tol IE OR BEEN ORs EEE vari Male m m PP2A WR of Weg E Wee EEN 9 d e RH PP Ce EE ee 2 Me eee PP2A RTE TEE ee armen 1 ee Abbildung A3 1 Alignment der Prim rsequenzen von PP1 und PP2A Die gr n unterlegten Reste k nnten laut Modelling Analyse f r die Selektivit t von Cytostatin zugunsten PP2a verantwortlich sein In Abbildung A3 2 sind die Ribbon Diagramme der PP1 a und PP2A b gezeigt In der PP Struktur belegt Okadas ure das aktive Zentrum Lars Kissau 8 3 Homologiemodell der PP2A 207 Abbildung A3 2 a Ribbon Diagramme der PP1
306. tionsstellen mit passenden Stellen auf der Ligandenoberfl che interagieren Zur Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 25 Quantifizierung bedarf es einer sog Scoring Function Leider k nnen die g ngigen Programme die Flexibilit t des Rezeptors nicht ber cksichtegen 2 3 3 2 4 De Novo Design von Liganden Das de novo Design von Liganden f r einen vorgegebenen Rezeptor kann manuell im Sketch Modus von Programmen wie InsightII oder WitnotP erfolgen oder automatisch mit PEP oder LUDI PEP ist ein Programm f r struktur basierendes Docking und das Design von peptidischen Liganden Die Konstruktion der Software erlaubt es auch selbst nicht nat rliche Aminos uren oder andere Fragmente in die Fragment Bibliothek einzutragen PEP baut die Liganden in einem iterativen Verfahren ausgehend von einem Seed auf Bei jeder Stufe wird die Geometrie des neuen Monomers optimiert Beim Design eines Liganden ist die Zahl der Variablen recht gro da man gleichzeitig im Sequenz oder Konstitutionsraum und dem Konformationsraum suchen muss Programme wie LUDI PRO_LIGAND oder GROW schr nken daher oft die Zahl der Konformationen auf solche ein die in Kristallstrukturen gefunden wurden Dadurch k nnten unter Umst nden vorteilhafte Konformationen eines neuen Liganden unber cksichtigt bleiben PEP unterwirft sich diesen Einschr nkungen nicht Eine Bewertung s mtlicher m glicher Konformationen ist ab einer gewissen Ligandengr e nicht mehr m glich Ein
307. tische Wechselwirkungen Aufgrund seiner hohen Dielektrizit tskonstante e 78 schw cht Wasser elektrostatische Wechselwirkungen um einen Faktor von 78 gegen ber der gleichen Wechselwirkung im Vakuum Dies kann bei Kraftfeldrechnungen die gew hnlich im Vakuum durchgef hrt werden zur berbewertung dieser Wechselwirkung f hren Problematisch ist die Bewertung auch deshalb da sich die Dielektizit tskonstante von der Protein Oberfl che ins Innere des Proteins deutlich ver ndert 2 3 3 3 3 Hydrophobe Wechselwirkungen Neben den Van der Waals Wechselwirkungen z hlen hierzu auch n n Stapel Wechsel wirkungen r stacking und T f rmige edge to face Wechselwirkungen F r die Bindung von Liganden an einen Rezeptor sind entropische und enthalpische Beitr ge von besonderer Bedeutung die oft als Hydrophober Effekt zusammenfassend beschrieben werden Zur Beschreibung des hydrophoben Effekts gibt es in der Literatur zwei Modelle das Clathrat K fig Modell und das Cavity based Modell Demnach tragen zu diesem Effekt die besonderen Eigenschaften des Wassers d h die kleine Molek lgr e oder besser die geringe Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 27 Gr e der Zwischenr ume zwischen Wassermolek len sowie das geringe Ausdehnungs verm gen und die Struktur des Wassermolek ls mit einer tetraedrischen Anordnung von Wasserstoffbr ckendonor und akzeptorstellen bei Abbildung 14 Schematische Darstellung des hydroph
308. tive entwickelt Wie in Kapitel 2 3 3 3 3 beschrieben beruht der hydrophobe Effekt zumindest teilweise auf der Verdr ngung von Wassermolek len aus einer hydrophoben Tasche und der liphophilen Interaktion des Inhibitors mit dem Rezeptor in dieser Tasche Je besser der Inhibitor diese Tasche ausf llt desto st rker ist die Wechselwirkung Auf diesem Ansatz aufbauend wurden die Volumina der hydrophoben Taschen der hier betrachteten Kinasen Lars Kissau 4 Spezieller Teil 86 berechnet und mit den van der Waals Volumina der Dekalinsysteme in Relation gesetzt Die in AAV MMI6 zusammengefassten Programmanweisungen erlauben eine fast vollst ndig automatisierte Berechnung des Ausma es in dem ein Inhibitor die hydrophobe Tasche einer Kinase belegt Die Berechnung der Volumina der hydrophoben Taschen wurde folgenderma en durchgef hrt Mittels des im Programm PASS implementierten Algorithmus siehe Kapitel 2 3 3 3 4 wurde das Volumen der hydrophoben Tasche mit sph rischen Solvensmolek len von 1 4 Durchmesser gef llt Dies entspricht dem Volumen das theoretisch von in dieser Tasche befindlichen Wassermolek len ausgef llt w rde Hydrophobe Tasche Abbildung 60 Kristallstruktur des IGF1R Rezeptors a Frontalansicht entspricht den anderen Abbildungen b Drehung nach links um 90 F r die Abgrenzung der hydrophoben Tasche wurde die im Text beschriebene Ebene hier rot eingezeichnet verwendet Zur Abgrenzung der hydrophoben T
309. toff Tumorzelle und Art der Mutation ab Es gibt Hinweise dass PFT Lars Kissau 2 Allgemeiner Teil 17 Inhibitoren auch die Funktionsf higkeit anderer Proteine in der Ras Superfamilie au er Ras selbst beeinflussen RhoA und Racl m ssen um ihre volle Funktion zu entfalten beispielsweise geranylgeranyliert werden Die beobachteten anti Tumor Aktivi ten von PFT Inhibitoren k nnten ihre Wirkung also auch anders entfalten M glicherweise ist die Apoptose induzierende bzw die anti Tumor Wirkung einiger PFT Inhibitoren nicht auf die Inhibition der PFT sondern auf die Inhibition anderer Enzyme zur ckzuf hren F r die Kl rung dieser Fragestellung bedarf es hochselektiver Inhibitoren die andere Prenyltransferasen wie z B die GGTase I nicht beeinflussen Da PFT und GGTase I identische a Untereinheiten aufweisen und sich lediglich in einigen Resten in der B Untereinheit unterscheiden ist letzteres Ziel nicht leicht zu erreichen Daneben ist bekannt dass K Ras aufgrund der etwas unpolareren CAAX Box auch ein Substrat der GGTase I sein kann und daher trotz PFT Inhibition mittels Geranylgeranylierung an der Plasmamembran lokalisiert werden kann Eng verwandt mit den Prenyltransferasen PFT und GGTase I ist die GGTase II oder RabGGTase die zwei Geranylgeranylreste auf den C terminus der Rab Proteine bertr gt Da auch diese eine Rolle in den hier betrachteten Signalkaskaden spielen sind Substanzen die eine gezielte Inhibition einer d
310. trisiert werden damit PEP die Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 156 Wechselwirkungen der Liganden mit dem gesamten Rezeptor Ras und GTP berechnen konnte Die CHARMm Strukturdatei ist auf der beiliegenden CD enthalten PEP Kalkulationen mit G12V Ras im Komplex mit GTP Die vorbereitete Ras Struktur wird mit Wasserstoffatomen erg nzt und gem AAV MM9 minimiert Als Seed wird Glycin manuell gem AAV MM1O0 positioniert und im gleichen Koordinatensystem wie das Protein abgespeichert Die Namen der Protein und Seeddateien werden in die Inputdatei Pep Input Datei siehe Anhang VII eingetragen Damit kann PEP ausgef hrt werden Unix Nohup pep lt pep inp gt pep_output rtf amp Die Output Datei kann mit einem Texteditor oder Word betrachtet werden Da die Output Datei ein Protokoll aller Rechenschritte enthalt ca 60 DIN A4 Seiten ist hier nur ein Ausschnitt der 10 besten Liganden einer der 8 PEP Runs wiedergegeben final stack data stack data 1 stacks GLY THR LEU TYR ASN 12 22 0 2302 11 21 1 GLY THR LEU TYR LDM 35 98 0 2304 9 259 3 GLY THR LEU SER SER 14 54 0 2305 8 293 1 GLY THR LEU TYR LDT 24 0 2306 7 117 3 GLY SER LDM CYS LDR 13 81 0 2306 11 41 3 THR LEU TYR SER 24 91 0 2306 6 85 1 GLY THR LEU PHE THR 19 01 0 2306 6 67 1 GLY THR LEU LDS GLY 19 02 0 2307 6 896 1 GLY THR LEU TYR GLN 20 26 0 2307 5 793 1 GLY THR LEU TYR THR 19 73 0 2307 5 683 1 vo A Ch E L H ro SO Q e lt 1 Das Resulta
311. trocknet Nach s ulenchromato graphischer Reinigung an Kieselgel Eluent Cyclohexan Ethylacetat 9 1 v v erh lt man einen gelben Feststoff Ausbeute 1 23 g 3 57 mmol 60 d Th Smp 148 C Zersetzung Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat 9 1 v v 0 36 H NMR CDCI 400 MHz 5 8 84 ddd 1H Aromat H 2 J 0 39 Hz J 1 56 Hz J 2 15 Hz 8 42 ddd 1H H 4 J 1 17 Hz J 2 15 Hz J 8 21 Hz 8 33 ddd 1H H 6 J 1 17 Hz J 1 56 Hz J 7 63 Hz 7 81 dt 2H H 4 H 5 J 0 81 Hz J 7 63 Hz 7 65 d 1H H 5 J 7 63 Hz 7 64 ddd 2H H 1 H rr J 0 78 Hz J 1 76 Hz J 7 43 Hz 7 43 ddt 2H H 3 Her J 0 59 Hz J 0 98 Hz J 7 43 Hz 7 34 dt 2H H 2 H 7 J 1 17 Hz J 7 43 Hz 4 71 d 2H H 1 J 6 84 Hz 4 40 t 1H Ha 3J 6 84 Hz C NMR CDCI 100 6 MHz 5 164 6 C O 148 6 C 3 143 7 C 9a C 8a 135 4 C 6 132 0 C 4a C 4b C 1 129 9 C 5 128 2 C 1 C 8 127 7 C 2 C 7 127 4 C 4 C 5 125 1 C 3 C 6 124 8 C 2 120 4 C 4 67 9 C 9 47 1 C 1 C21H 5NO 345 3481 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 165 EI MS 70 eV 345 M 9 178 M Fm 100 165 Fluoren 25 150 a Spaltung 10 104 a Spaltung NOs 6 76 C6H4 4 HRMS EI berechnet 345 1001 gefunden 345 0990 3 Amino benzoesau
312. ts mol2 read_fitpts 0 FLAGS display 0 internal ligand h_bonds 1 n_ligand_bumps 0 flip_free_corners 1 flip_amide_bonds 1 flip planar n 1 use_tordist 1 Lars Kissau 8 7 Input Dateien f r Molecular Modelling Arbeiten 218 start_vdw_linear_cutoff 2 5 initial_virtual_pt_match_max 4 TERMINATION early_termination 1 n top_solutions 5 rms_tolerance 1 5 CONSTRAINTS COVALENT BONDING covalent 0 PARALLEL OPTIONS hostfile gold hosts 8 7 4 CHARMM Die Inputdateien sind Teil der allgemeinen Arbeitsvorschriften AAV MM1 bis AAV MM9 Sie werden automatisch durch die dort angegebenen Skripte erzeugt Lars Kissau 8 8 Verzeichnis der Dateien auf der beigef gten CD 219 8 8 Anhang VIII Verzeichnis der Dateien auf der beigef gten CD Ftase Alle Dateien zu Kapitel 4 3 Homologie Alle Dateien zu Kapitel 4 2 Pep Alle Dateien zu Berechnungen mit PEP Kapitel 4 1 inklusive der Skripte PP2A Alle Dateien zum PP2A Homologiemodell Skripts siehe AAV MM Ras Alle Dateien zu Kapitel 4 1 Lars Kissau 8 9 Tabellen der Wasserstoffbr cken 220 8 9 Anhang IX Tabellen der Wasserstoffbr cken zwischen Liganden und Rezeptoren 8 9 1 Pepticinnamin E Analoga Es wurden nur solche Wasserstoffbr cken ber cksichtigt deren gemessene Winkel innerhalb der in der Literatur angegebenen Spanne lag L nge L nge Winkel Winkel Bemerkung Prote
313. ts zur Betrachtung der ATP kompetitiven Inhibitoren beitragen kann Ein de novo Loop Modelling ist zwar m glich f r die in der vorliegenden Arbeit durchgef hrte Analyse von ATP kompetitiven Inhibitoren jedoch unbedeutend da einerseits Deletionsmutanten von Kinasen ohne Activation Loop ein normale Aktivit t zeigen und lediglich regulatorische Prozesse gest rt sind und andererseits dieser Loop an der Erkennung und Bindung der von den Kinasen phosphorylierten Peptidsequenz beteiligt ist und daher die Struktur lediglich f r die Entwicklung von Bisubstratinhibitoren von Interesse sein d rfte F r die Analyse der Bindungsmodi der ATP kompetitiven Nakijichinon Analoga blieb daher der mittlere Teil der Activation Loops unber cksichtigt 4 2 4 4 Homologiemodell von ErbB 2 Einsatz des IGF1 Rezeptors als Templat In vollkommener Analogie zu der f r die Homologiemodelle von VEGFR 2 VEGFR 3 und Tie 2 beschriebenen Vorgehensweise wurde auch das Modell f r die Kinasedom ne der ErbB 2 Rezeptor Tyrosin Kinase erstellt Das nach manueller Korrektur hierf r verwendete Alignment mit der Prim rsequenz des IGF1 Rezeptors ist in Abbildung 52 gezeigt Als dreimensionales Templat diente die IGFIR Struktur der Kinasedom ne im Komplex mit AppNHp und einem Tyrosinpeptid PDB Code 1IR3 Auch in diesem Modell wurden KID und Activation Loop nicht durch de novo Modelling berechnet da dies zur Aufkl rung der Bindungsmodi nicht erforderlich war
314. tstrukturen und Optimierung von Inhibitoren 2 3 1 Leitstrukturentwicklung Beim Design und der Entwicklung von Leitstrukturen f r Wirkstoffe ist es von grundlegender Bedeutung die Art der zu beeinflussenden Wechselwirkung zu ber cksichtigen Das geforderte Eigenschaftsprofil f r Wirkstoffe die die enzymatische Wirkung eines Proteins inhibieren sollen unterscheidet sich deutlich von dem Profil das f r Modulatoren von Protein Protein Wechselwirkung ben tigt wird 2 3 1 1 Enzyminhibitoren C A Lipinski analysierte 1996 die Eigenschaften zahlreicher Wirkstoffe und stellte folgende Liste von Eigenschaften f r Enzyminhibitoren auf auch als Pfizer Rules bekannt 1 Maximal 5 Wasserstoffbr ckendonoren Summe von OH und NH 2 Maximal 10 Wasserstoffbr ckenakzeptoren Summe von N und O 3 Molekulargewicht unter 500 4 Berechneter LogP CLogP unter 5 5 Ausnahmen stellen Verbindungen dar die Substrate biologischer Transporter sind Diese Bedingungen resultieren aus Erfahrungswerten f r Enzyminhibitoren die in hohen Konzentrationen in der Zelle angereichert werden und am Besten zus tzlich noch stark an ihr Target binden sollten Molekulargewicht und Zahl der Wasserstoffbr cken sind mit der F higkeit korreliert zum Zielort gelangen zu k nnen Der Verteilungskoeffizient LogP ist das Verh ltnis der Gleichgewichtskonzentrationen einer Substanz in einer unpolaren Phase meist 1 Octanol und einer polaren Phase meist Wasser Die
315. tur ger hrt Die fl chtigen Bestandteile werden im Vakuum entfernt und das Rohprodukt s ulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt Man erh lt ein schwach gelbes l Ausbeute 93 mg 0 2 mmol 40 d Th Rr Wert Cyclohexan Ethylacetat 1 9 v v 0 1 Die Verbindung wurde von Herrn Dr Courtney Aldrich synthetisiert und ein Teil davon f r diesen Versuch zur Verf gung gestellt Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 166 H NMR CDCI 400 MHz 7 82 7 76 m 2H H 4 H 5 7 71 dt 2H HI H 8 J 1 17 Hz J 7 43 Hz 7 67 ddd 2H H 3 Her J 0 98 Hz J 1 76 Hz J 7 43 Hz 7 42 t 1H H 6 J 7 43 Hz 7 36 7 32 m 2H H 2 H 5 7 28 ddd 2H H 2 H 7 J 2 35 Hz J 1 17 Hz J 8 02 Hz 6 81 d 1H C 4 J 9 19 Hz 5 98 5 86 m 2H CH gt CH CH 5 33 ddd 2H CH CH CHp J 2 93 Hz J 17 01 Hz J 1 56 Hz 5 18 ddd 2H CH gt CH CHp J 1 37 Hz 3J 10 56 Hz 7J 2 54 Hz 4 70 4 52 m 6H CH gt CH CH H 1 4 36 t 1H Fm CH J 7 23 Hz C NMR CDCI 100 6 MHz 5 168 5 C O 146 6 C 3 142 0 C 8a C 9a 137 8 CH CH CH3 136 7 C 4a C 4b 131 2 C 1 129 2 C 5 128 9 C 1 C 8 127 8 C 2 C 7 127 6 C 4 C 5 125 9 C 3 C 6 120 0 C 6 119 5 C 4 116 3 C 2 115 2 CH2 CH CHp 75 2 C 1 70 4 CH gt CH CH gt
316. u einer L sung von 10 38 g 62 1 mmol 3 Nitrobenzoes ure in 35 ml 1 4 Dioxan werden unter K hlung 20 ml 2 Methylpropen zugegeben Nach Zugabe von 4 ml konz H2SO wird das Reaktionsgef verschlossen und 24 h bei Raumtemperatur ger hrt Die Reaktionsmischung wird erneut abgek hlt und mit Ethylacetat verd nnt Nach Extraktion mit Na gt CO werden die organischen Phasen mit NaSO getrocknet und eingeengt Man erh lt 13 4 g eines braunen ls das durch Flash Chromatographie Cyclohexan Ethylacetat 4 1 v v gereinigt wird Ausbeute 11 5 g 51 5 mmol 82 9 d Th gelbes l R Wert Cyclohexan Ethylacetat 4 1 v v 0 31 H NMR CDCL 400 MHz 5 8 72 t 1H H 2 J 1 76 Hz 8 33 ddd 1H H 4 J 2 36 Hz J 1 76 Hz J 8 21 Hz 8 27 ddd 1H H 6 J 1 61 Hz J 1 56 Hz J 7 8 Hz 7 59 dt 1H H 5 J 2 36 Hz J 8 21 Hz 1 59 s 9H C CH3 3 C NMR CDCL 100 6 MHz 5 163 4 C O 148 1 C 3 135 0 C 6 133 7 C 1 129 3 C 5 126 8 C 4 124 2 C 2 82 4 C CH3 3 28 0 C CHs3 s Ci Hi3NOq 223 2253 FAB MS Glycerin 223 4 M 30 3 Amino benzoes ure tert butylester 47 Zu einer L sung von 3 10 g 13 9 mmol 3 Nitrobenzoes ure tertbutylester in 15 ml DMF werden 12 54 g 55 6 mmol SnCl Dihydrat gegeben Man r hrt 16 h bei Raumtemperatur und verd nnt mit 300 ml Ethylacetat Nach Waschen mit 100 ml IN HCl und 100 ml ges NaCl L sung wird die organische Phase ber Na SO4
317. und Ausblick 127 auch hier das Ausma bestimmt in dem ein Inhibitor diese Tasche ausf llt Je gr er der ermittelte Wert desto st rker d rften die unter dem Begriff hydrophob zusammengefassten Wechselwirkungen sein Die st rkere Affinit t von Verbindung 101 zu IGFIR im Vergleich zu Tie 2 konnte durch diese Methode sehr gut erkl rt werden Abbildung 92 a Pepticinnamin E rot CVIM Peptid gelb und FPP gr n im aktiven Zentrum der PFT b Seitliche Ansicht ohne Proteinoberfl che Pepticinnamin belegt sowohl die FPP Bindungstasche als auch die Peptidbindungstasche zu mehr als 50 Dies erkl rt die Wirkung als Bisubstratinhibitor Durch die Kombination von qualitativer und quantitativer Analyse konnte die Aktivit ten und Selektivit ten von Inhibitoren verschiedener Rezeptor Tyrosin Kinasen sowie der Protein Farnesyl Transferase durch Molecular Modelling Studien rationalisiert werden Auf dieser Basis wurden Optimierungsvorschl ge erarbeitet 5 2 Ausblick Durch die Einzelsynthese der beim Screening der Split Mix Bibliothek von GTP Peptid Konjugaten identifizierten Verbindungen sollte die Messung der exakten Affinit t dieser Verbindungen an Ras m glich werden Dar ber hinaus bietet die Leitstruktur 95 einen guten Anhaltspunkt f r die weitere Entwicklung eines kleinen Molek ls das als Ersatz f r GAP die GTPase Reaktion von Ras Mutanten stimulieren k nnte Die Struktur von 95 liefert auch Anhaltspunkte f r
318. ungen folgenderma en durchf hren WitnotP modify atom lig current mol_name done atom charge automatic mol_name atom name mol_name done auto hheav atom type auto charmm mol_name done done atom q mol name done MPEOE done write mol2 mol_name mol_name write xpdb mol_name mol_name CHARMm psf mol name mol name Lars Kissau Allgemeine Arbeitsvorschriften 137 Auch diese Anweisungen k nnen gesammelt und der WitnotP Kommandozeile mit lt pdbh2c mol name ausgef hrt werden Die Minimierung erfolgt in der f r AAV MMI beschriebenen Weise Ein manuelles Docking von Liganden wird mittels des Skripts USE und der Maus durchgef hrt AAV MM3 Minimierung einer Proteinstruktur ohne Einschr nkungen Conjugate Gradient Anwendung Minimierung einer Proteinstruktur oder eines kleinen Molek ls Beschreibung Die zuvor erstellten pdb und psf Dateien werden automatisch in eine CHARMM Inputdatei integriert und die Minimierung durchgef hrt Das Script ruft WitnotP auf um neben der von CHARMM erzeugten pdb Datei auch eine mol2 Datei zu erstellen Rechenzeit Beispiel Humane Farnesyltransferase im Komplex mit Pepticinammin E 4h Skriptname Minall run Dauer 4h Unix bin sh case in 1 sed s XXXX 1 ocg work mm charmm_templ3 inp gt 1 inp charmm lt 1 inp gt 1 out 2 gt amp 1 echo witnotp host none lt lt EOF echo set gnu off echo read mol 1 mol echo read coord xpdb 1 _m pdb 1
319. urchgef hrt auch manuell m glich ist bleibt die Summierung aller Wechselwirkungen die mit dem Begriff hydrophober Bindungsbeitrag in der Literatur aufsummiert werden computergest tzten Verfahren Scoring Function vorbehalten Um auch hydrophobe Wechselwirkungen bewerten zu k nnen wurde eine neues Verfahren entwickelt 4 2 6 1 Beitrag der Wasserstoffbr cken Die zahlreichen Wasserstoffbr cken die bei der Beschreibung der Bindungsmodi erw hnt wurden unterscheiden sich im Bezug auf L nge und Geometrie Als Ma f r die G te der vorgeschlagenen Bindungsmodi wurden daher die Wasserstoffbr cken hinsichtlich L nge und Geometrie charakterisiert Dieser Ansatz wurde von G B hm und G Klebe im Programm LUDI verwirklicht Die dort integrierte Scoring Funktion eignet sich allerdings nicht f r eine isolierte Bewertung von Wasserstoffbr cken Der Vergleich mit den in der Literatur als optimal akzeptierten Werten ergab Hinweise auf die St rke der Wechselwirkung Diese diente in einem iterativen Prozess zur berpr fung und Verbesserung der vorgeschlagenen Bindungsmodi Die gem AAV MM13 bestimmten Werte sind in Anhang III aufgelistet 4 2 6 2 Beitrag von hydrophoben Wechselwirkungen Anstelle einer Scoring Funktion die nach Berechnung und Addition der van der Waals Wechselwirkungen f r jedes Atom diese in Relation zu anderen Wechselwirkungen setzt wurde f r die vorliegende Arbeit eine einfach durchzuf hrende und schnelle Alterna
320. urrieren zu k nnen Die Konzentration dieser Verbindungen lag bei etwa ImM und entspricht der Konzentration des freien GTP Die Affinit t dieser festphasen gebundenen GTP Peptid Konjugate d rfte daher im Bereich von GTP oder dar ber liegen also um unteren picomolaren Bereich Als Referenzpunkt f r die Bewertung der sequenzierten Hits ist jedoch nicht GTP sondern DABP GTP zu verwenden Die Affinit t von DABP GTP zu Ras ist jedoch um den Faktor 400 geringer als die von GTP siehe Kapitel 2 2 2 1 1 Somit wird durch die gute Affinit t der Peptide der Affinit ts reduzierende Einfluss der Substitution am y Phosphat kompensiert Da im verwendeten Assay die Menge des festphasengebundenen Atto655 Ras nicht quantifiziert werden konnte ist die Angabe einer exakten Dissoziationskonstante f r den Komplex aus Ras und GTP Peptid nicht m glich Dieser k nnte zuk nftig durch Messung in L sung bestimmt werden siehe Kapitel 5 2 In Abbildung 40 sind Aufnahmen der Split Mix Bibliothek nach der Inkubation mit Atto655 Ras gezeigt Die Anregung der Fluoreszenz erfolgte in diesem Falle durch einen Kr Ar Laser bei 647 nm Die Emission wurde bei 680 nm registiert Gezeigt sind stark vergr erte Ausschnitte mit fluoreszierenden Beads Hits Die mit dem konfokalen Mikroskop gemachten Schichtaufnahmen best tigen dass sich auch fluoreszenzmarkiertes Protein im Inneren des Beads befindet Die Selektion einzelner Beads musste unter einem Mikroskop mit einen
321. urstoffs mit der PFT Demnach k nnte der 2 Pentenylzimts urerest in der unpolaren Farnesylbindungstasche Platz finden w hrend das sehr polare Diketopiperazin in der Carboxlat Bindungstasche zu platzieren w re Erg nzt wurde dies durch die berlegung dass Pepticinnamin E als Bisubstratinhibitor sowohl kompetitiv zu FPP als auch kompetitiv zum CAAX Peptid wirkt und daher beide Bindungsstellen in geeigneter Weise blockieren sollte Der naheliegendste Ansatz f r Pepticinnamin E aufgrund seiner peptidischen Struktur einen Bindungsmodus anzunehmen der auf einer Kombination der Bindungsmodi des CAAX Peptids mit einem kovalent gebundenem FPP Analogon basiert erwies sich rasch als falsch Durch die zweifache N Methylierung kann Pepticinnamin E keinesfalls in einer Konformation analog zu CVFM oder vergleichbaren Substraten im aktiven Zentrum binden da in diesem Fall eine intramolekulare van der Waals Absto ung zwischen diese Methylgruppen resultieren w rde Statt dessen steht der in Abbildung 67 gezeigte Bindungsmodus am Besten mit den vorliegenden Daten im Einklang Die Plausibilit t der hier vorgeschlagenen Turn Konformation wird durch literaturbekannte Ergebnisse anderer Gruppen best tigt wonach N methylierte Aminos uren Turn Konformationen beg nstigen a Nach manuellem Docking geleitet durch die eben aufgeftihrten Vorgedanken wurde der Komplex aus Pepticinnamin E und PFT mit CHARMM minimiert Diese Vorgehensweise wurde bei allen hier vorge
322. wendung der bekannten Kristallstrukturen der Ras Farnesyltransferase sollten mittels Molecular Modelling die Bindungsmodi f r den Naturstoff Pepticinammin E sowie einige der von Dr Michael Thutewohl synthetisierten Inhibitoren ermittelt werden Hierbei sollten auch die experimentell bestimmten Aktivit tsunterschiede rationalisiert werden Dar berhinaus sollten Pepticinammin E Analoga der zweiten Generation entworfen und hinsichtlich der Aktivit t und Selektivit t bez glich der Farnesyltransferase oder der Geranylgeranyltransferasen I und II optimiert werden Lars Kissau 4 Spezieller Teil 31 4 Spezieller Teil 4 1 Entwicklung einer Leitstruktur zur Verbesserung der intrinsischen GTPase Aktivit t von Ras Mutanten Holzhacken ist deshalb so beliebt weil man bei dieser T tigkeit den Erfolg sofort sieht Albert Einstein 4 1 1 Vor berlegungen Das Fehlen eines biologisch validierten Startpunktes f r dieses Projekt f hrte zur Anwendung der in Abbildung 12 Abschnitt 2 3 2 1 illustrierten Strategie Die eingangs erw hnten Arbeiten von A Wittinghofer et al lieferten zwar die Idee dass eine Restoration der GTPase Aktivit t von Ras Mutanten durch kleine Molek le m glich sein k nnte aber auch die Erkenntnis dass das eingesetzte 3 4 Diaminobenzophenon jedoch leider nicht als Leitstruktur verstanden werden kann Verwendete man beispielsweise zur Entwicklung einer Leitstruktur nach der genannten Strategie die kommerziell erh ltl
323. wird das THF durch dreifaches Waschen mit Blocking Puffer entfernt Man inkubiert die Beads 2 h bei 4 C im Blocking Puffer Dieser wird sorgf ltig entfernt und 30 ul Ras Inkubationspuffer zugegeben Nach 30 min Inkubation bei 0 C wird der Puffer entfernt und Blocking Puffer 2 zugegeben Bei 0 C k nnen die Beads ohne Verlust von Fluoreszenz bis zu 4 Wochen im K hlschrank gelagert werden Screening am Konfokalen Laser Fluoreszenz Mikroskop F r die erste Untersuchung der Bibliothek nach der Inkubation wird ein Laser Rastermikroskop MRC 1024 der Firma BioRad ausger stet mit drei Detektionskan len Photomultiplier verwendet Man pipettiert etwa 50 ul einer Suspension von Ras inkubierten PEGA Beads auf einen Objektr ger Die Fluoreszenz wird mit der Emissionslinie 647 nm des Kr Ar Lasers angeregt Die Fluoreszenz wird bei 680 nm detektiert Aufgrund der intensiven Fluoreszenz ist die Anregung mit maximal 3 Laserpower zu empfehlen Durch Verwendung des Kalman Filters wird die Kontrastsch rfe verbessert Screening und Bead Picking am Mikroinjektionsger t Axiovert 135 TV inverse Microscope Das Screening der Split Mix Bibliothek wird nach Inkubation mit Atto 655 gelabeltem H Ras an einem Axiovert 135 TV inversen Mikroskop der Firma Zeiss versehen mit einer Hitachi KP 140 Kamera durchgef hrt Als Lichtquelle dient eine Quecksilberh chstdruck Lampe der Firma Osram Die charakteristischen Linien und das Grundkontinuum werden unterh
324. yltransferase gedockt Die hierbei als vorteilhaft bewerteten Bindungsmodi siehe Abbildung 90 stehen in vollem Einklang mit den im Anschluss von Dr M Thutewohl durchgef hrten kinetischen Studien Abbildung 90 Vorgeschlagene Bindungsmodi ausgew hlter Verbindungen aus der Bibliothek von Pepticinnamin E Analoga Einige der Inhibitoren aus der Bibliothek binden demnach kompetitiv zum Substratpeptid des Enzyms oder kompetitiv zum zweiten Substrat dem Farnesylpyrophosphat Den Vorhersagen des Modelling entsprechend finden sich in der Bibliothek auch Bisubstratinhibitoren die sowohl kompetitiv zum Substratpeptid als auch kompetitiv zu Farnesylpyrophosphat wirken Gem der im Rahmen dieser Arbeit aufgekl rten Bindungsmodi ist f r die Bindung der Inhibitoren eine starke Wechselwirkung mit dem Zinkion entweder durch Histidin oder ein Tyrosin vermittelt essentiell Neben der Rationalisierung der Aktivit tsunterschiede sollten auch Pepticinammin E Analoga der zweiten Generation entworfen und hinsichtlich der Aktivit t und Selektivit t bez glich der Farnesyltransferase oder der Geranylgeranyl Transferasen I und II optimiert werden Hierbei wurden auch die pharmakologischen Eigenschaften der Verbindungen LogP Wert Molekulargewicht ber cksichtigt Ein solcher Inhibitor der zweiten Generation k nnte Verbindung 163 siehe Abbildung 91b sein Durch die N Methylierung sollte die Wechselwirkung des Imidazols mit dem Zink verst rkt werden
325. z der Durchmischung und der Wasch Schritte konnte eliminiert werden in dem die Synthese f r die Durchf hrung auf einem Quest 210 Synthese Halbautomaten adaptiert wurde 4 1 4 11 Durchf hrung des On bead Screening Vor dem Screening wurde eine Probe von G12V Ras mit Atto 655 gelabelt siehe Experimenteller Teil Das Protein wurde von Lars Blumenstein Abteilung Prof Wittinghofer in E Coli berexprimiert und gereinigt und f r diesen Assay freundlicherweise zur Verf gung gestellt Die Wahl eines kompetitiven Bindungsassay als geeignetes Werkzeug um die Wechselwirkung kleiner Molek le mit Proteinoberfl chen zu evaluieren wird durch Untersuchungen von J B Owalabi et al best tigt Hier gelang es in vollkommen analoger Weise ein kleines Molek l zu identifzieren mit dem die Interaktion des Nerve Growth Factor mit der Kinase Trk A inhibiert werden konnte Um unspezifische Bindungsstellen am Polymerbead zu blockieren wurden die mit GTP Peptid Konjugaten beladenen PEGA Beads vor der Inkubation mit fluoreszenzmarkiertem Ras mit einem BSA Puffer fiir 3 Stunden inkubiert Die guten Quelleigenschaften von PEGA in w ssrigen Medien machten ein organisches Cosolvens f r alle Inkubationsschritte unn tig Anschlie end wurde der Puffer entfernt und ein Puffer mit Atto655 Ras f r 30 Minuten zugegeben Die Anwesenheit von ETDA hierbei sollte sicherstellen dass ein schneller Austausch der GTP Liganden gew hrleistet ist Nach 30 Minuten wurde d
326. zt Nach 15 h wird auf Raumtemperatur abgek hlt und mit Ethylacetat verd nnt Nach Extraktion mit NaHCO und Wasser wird ber NazSO4 getrocknet und das Rohprodukt chromatographisch gereinigt Cyclohexan Ethylacetat 70 30 Ausbeute 6 74 g 67 Rre Wert Cyclohexan Ethylacetat 4 1 v v 0 38 H NMR CDCL 400 MHz 7 40 7 25 m 5H Phenyl 4 56 s 2H Ph CH2 3 75 t 2H CH gt CH gt OH J 4 30 Hz 3 59 m 2H CH CH OH J 4 30 Hz C NMR CDCl 100 6 MHz 5 138 2 C 1 128 6 C 3 C 5 128 0 C 2 C 4 C 6 73 5 Ph CH gt O 71 7 CH2 CH2 OH 62 1 CH2 CH2 OH CoH120 gt 152 1904 FAB MS 3 NBA 153 3 M H 2 175 19 M Na 6 HRMS FAB 3 NBA berechnet f r CoH12NaO 175 1802 gefunden 175 1789 2 Benzyloxy ethoxy essigs ure tert butyl ester 72 Lars Kissau Arbeiten zu Kapitel 4 1 182 Zu einer L sung von 0 74 ml 976 mg 5 mmol Bromessigs ure tert butylester 760 mg 5 mmol Benzyloxyethanol und einer katalytischen Menge Tetrabutylammoniumbromid in 20 ml Dichlormethan werden 20 ml einer 30 igen w ssrigen KOH L sung gegeben und 14 h bei Raumtemperatur ger hrt Die Reaktionsmischung wird mit Dichlormethan verd nnt und die organische Phase mit NaHCO und ges NaCl L sung gewaschen und ber Na2SO4 getrocknet Nach Flash Chromatographie Cyclohexan Ethylacetat 9 1 erh lt man 680 mg eines farblosen ls Ausbeute 680 mg 2 55 mmol 51 d Th Rre Wert Cyclohexan Ethylacetat 9

2. Allgemeiner Teil

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