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Die spektrale Abhängigkeit der Wirkung von UV

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1. Unbekanntes Protein Vermutliche Glyoxalase Glyoxl e Chlorophylikatabolismus At4937000 At1908110 u d Do 1 ji 1 1 ji Se 4 EE 1 gt O N 3 3 c 2 22 2 2 fos x w 1 S 0 0 5 5 i 2 Hypothetisches Protein Cytochrom P450 ahnliches Protein 5 At1930420 At4937320 CYP81D5 2 4 ggf En 7 E r SE T O GR 3 c 2 9 2t 2 2 Si x s t 1 S 0 i i i i 0 5 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Glyoxalase Il Isoenzym o hnliches Protein At1906130 Glyoxll y d Ge I I I i Ch A O N d c e LH ch o HH Si ir HL 2 0 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Abbildung 3 22 Orginaldaten aus Node 73 Die chloroplastidare FeSOD At4g25100 AtGSTU19 und die Glutathionreduktase GSH RED2 At3g24170 waren ausschlieBlich in Szenario L H aktiv Das erstgenannte entsorgt Superoxid zu Wasserstoffperoxid Van Camp et al 1990 H202 k nnte durch AtGSTU19 At1g78380 zu H2O peroxidiert werden Bartling et al 1993 Cheng et al 1996 Kampranis et al 2000 GSH RED2 w rde f r diese Reaktion das reduzierte Glutathion zur Verf gung stellen G S S G 2GSH Das Protein ist zu einer cytosolischen Glutathionreduktase aus Brassica campestris zu 92 sequenzhomolog und die Transkripte k nnen durch Ozon oder Paraquat 102 Ergebnisse induziert we
2. 70 Ergebnisse g 204 L 204 z 2 2 S ZS 100 x 10 6 E Rem e D g 200 D 2005 gt 2 2 2 z T Y 7 100 4 CO 100 4 u CO I l I 0 S 0 r 7 r r WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Abbildung 3 2 Spektrale Abh ngigkeiten der Gehalte an Quercetin Q und Kaempferolderivaten K H H Links sind die Ergebnisse des Experimentes V318 dargestellt rechts die des Experimentes V321 40 4 40 1 is 30 304 S 20 4 24 bi aT 10 4 d 10 4 ECT H n 0 40 E 40 4 Be _ 304 E S E ai E ai N T _ a a i a E i u oi SE WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Abbildung 3 3 Spektrale Abh ngigkeiten der Konzentrationen an Sinapins ureestern SinGlc SinMal H H Das linke Diagramm zeigt die Konzentrationen an Sinapoylglukose und malat des Versuches V318 Das rechte Diagramm zeigt die Ergebnisse des Versuches V321 Mittelwerte und Standardabweichungen der Balken wurden f r V318 mit n 2 und f r V321 mit n 3 berechnet Ergebnisse 71 3 1 2 Genexpression der Flavonoidbiosynthese Die gemessenen Flavonoidbiosynthese Gene sowie die verwendeten Primer in der RT PCR sind in Tabelle 3 2 zusammengestellt Bei dem Basisbestrahlungsszenario H H zeigte sich nur die Flavonolsynthase 1 9fach induziert Abbildung 3 4 Die rest lichen Gene der Flavonoidbiosy
3. Anhang A UV B reaktive Gene 147 3 Glukosyltransferasen ANOVA Induktion Induktion Induktion Funktion Proben Typ Genbanknummer UV B Abk rzung Medianwe2s5 mitUV B UV A ohneUV B UV A Erh hung Medianwa295 wG305 Medianwea20 350 Erniedrigung Putative 0 0000 4 3 3 2 0 8 glucosyltransferase 3 UTR At2g23210 281 UGT84B3P Glucuronosyl 0 0025 2 1 1 9 0 7 transferase like protein 3 UTR At5g05870 150 UGT76C1 Glucosyltransterase like 0 0052 2 4 2 3 1 0 protein 3 UTR At4g14100 138 UGT75C1 UDP glucose sterol 0 0342 1 5 1 7 0 9 glucosyltransferase 3 UTR At3g07020 84 UGT80A2 Glucuronosyl 0 0001 2 1 1 7 0 9 transferase like protein 3 UTR At5g05880 83 UGT76C4 Putative 0 0203 2 0 1 6 0 9 glucosyltransferase 3 UTR At2g23250 77 UGT84B2 Glucosyltransferase like 0 0266 2 2 1 6 0 9 protein 3 UTR AT5g14860 75 UGT90A4 UGT Nicht 0 0215 1 9 1 6 0 9 Putative protein 3 UTR At3g50760 73 sicher Putative 0 0184 1 4 1 3 0 7 glucosyltransferase 3 UTR At2g15490 70 UGT73B4 Glucuronosyl 0 0034 1 3 1 2 0 8 transferase like protein 3 UTR At3g55710 59 UGT76F1 Putative glucosyl 0 0003 1 8 1 4 0 9 transferase 3 UTR At2g36750 59 UGT73C1 Putative 0 0129 1 5 1 4 0 9 glucosyltransferase 3 UTR At2g31790 57 UGT74C1 Flavonol 3 0 0 0068 1 2 1 3 0 8 glucosyltransferase like 3 UTR At5g54060 53 UGT79B1 UDP rhamnose anthocyanidin 3 glucoside rhamnosyltransferase 0 0035 0 8 0 8 0 6 like protein 3 UTR At4g27570 39 UGT79B3 R
4. WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 V322 fT tt oi V324 ze WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Abbildung 3 17 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 UV Dosis Wirkungsbeziehung bestimmt an Hand der Gehalte an Quercetinderivaten H H M H L H H L Die grauen Balken zeigen die PAR korrigierten Messwerte mit den entsprechenden Standardabwei chungen Die schwarzen Punkte entsprechen den kalkulatorischen Werten der Dosisfunktion qnetto W Hea Ergebnisse 89 3 8 Transkriptomanalyse Die Transkriptomanalyse wurde mit einem DNA Array aus 579 ausgew hlten Stress genen durchgef hrt Die Auswahl von heterologen Sequenzmotiven sowie deren Pr paration zur DNA Array Probe ist in Kapitel 2 3 1 erl utert Die zahlenm ige Verteilung der unterschiedlichen Stoffwechselwege des DNA Arrays ist in Tabelle 3 10 wiedergegeben In dieser Tabelle werden Gene des Sekund rmetabolismus in drei Gruppen eingeteilt Die Gruppen Glukosyltransferasen und CYT P450 Monooxy genasen sind von der AG Molekulare kologie PD Dr Anton Sch ffner aus dem heterologen 3 UTR Bereich des Gens hergestellt worden Diese hochspezifischen Array Proben wurden basierend auf Sequenzhomologien und funktioneller Motive regeneriert Die meisten Gene sind jedoch noch nicht biochemisch charakterisiert Ausnahme Zimts ure 4
5. Abbildung 3 8 Spektrale Abh ngigkeit der Transkription der Flavonoidbiosynthese Gene nach 14 d UV Exposition V323 3 3 Niedrig PAR Hoch UV B L H Die biologisch effektive Strahlung war in diesem Experiment mit 180 mW m in WG295 ann hernd identisch zu Szenario H H Jedoch war der PAR Hintergrund mit 500 umol m s deutlich niedriger als in Szenario H H 1300 umol m s In der Na 76 Ergebnisse tur k nnen vergleichbare Bestrahlungsmodalit ten an beschatteten Pl tzen und an wolkigen Tagen gemessen werden 3 3 1 Schutzpigmente Flavonolderivate W hrend die Gehalte an Quercetinderivaten in dem Basisszenario L H eine signifi kante spektrale Abh ngigkeit aufwiesen war dies nicht bei Kaempferolderivaten zu beobachten Abbildung 3 9 Die Konzentrationen an Quercetinderivaten waren je doch im Vergleich zu den Varianten H H und M H auf einem niedrigerem Niveau Sinapins ureester Die Akkumulation der Sinapins ureester zeigten sich in diesem Versuch nicht UV spektralabh ngig Dies galt sowohl f r die Sinopoylglukose als auch f r Sinapoylma lat Abbildung 3 10 Die Varianzanalyse der phenolischen Pigmente von L H ist in Tabelle 3 5 einzusehen Tabelle 3 5 Varianzanalyse der Pigmentmessungen in Pflanzen an dem Szenario L H n 3 n 3 V325 w g305 n 4 V327 w g320 n 4 Sioniikanz Kaempferolderivate Quercetinderivate 0 003 Sinapoylglukose 0
6. ng ul Gesamt RNA eingestellt Material und Methoden 53 2 3 2 10 Quantitative Real Time PCR Die quantitativen RT PCR basiert auf den Eigenschaften des kinetischen Verlaufs der DNA Synthese mittels der Taq Polymerase der sich in drei Bereiche unterteilen l sst 1 Exponentielle Phase der Amplifikation 2 Limitierende Phase der Amplifiktion 3 Plateauphase der Reaktion Bei der PCR wird ein definiertes St ck cDNA das durch zwei Primer begrenzt ist in immer wieder aufeinander folgenden Reaktionen in vitro vermehrt Durch geeignete Fluoreszenzfarbstoffe kann der Verlauf der Kinetik mit Hilfe eines Detektors aufge zeichnet werden Nach Abzug der Hintergrundfluoreszenz kann der Zyklus bestimmt werden bis zu dem die linearen Bedingungen einer exponentiellen Wachstumskurve g ltig sind Im idealisierten Fall synthetisiert das Enzym in diesem Bereich den cDNA Strang nach der Formel Anzahl der cDNA Strange nach n Zyklen 2 Die etablierte RT PCR bestimmte nicht die Molek lzahl eines Transkripts sondern es wurde durch einen Abgleich mit einer zellul ren endogenen Kontrolle das Expressi onsniveau des Zielgens zu einer UV B freien Variante verglichen Als endogene Kon trolle wurde die ribosomale Untereinheit 18S gew hlt Goidin et al 2001 Von beiden Genen wurde der CT Wert bestimmt Dies war die Zykluszahl bis zu der die linearen Verh ltnisse des exponentiellen Wachstums galten Nur in diesem Be reich war eine zuverl ssige
7. 1997 Sancar 1994 Letzteres behebt UV bedingte Muta tionen in der Pflanze Die auff llige hnlichkeit von UV Reparatur und Rezeption l sst den R ckschluss zu dass beide Proteine aus einer gemeinsamen evolution ren Gabelung hervorgegangen sind Die wichtigsten Funktionen die von Photorezep toren in der Pflanze ausge bt werden k nnen sind zusammenfassend in Abbildung 1 4 dargestellt Strahlung Rezeptor Signaltransduktion Antwort FR p PHYA HY5 Keimung R PHYB COP1 Deetiolierung R PHYC E COP8 9 11 Wachstum UV A CRY1 p DETI UV A CRY2 PHHI G Protein Bl te _ UV A NPH1 cGMP UV Schutz UV B gt Rezeptor __ Ca Calmodulin Phototropismus Abbildung 1 4 Strahlungsart Rezeptor und Signaltransduktion Batschauer 1999 Die Abbildung zeigt vereinfacht die Signalaufnahme unterschiedlicher Strahlung durch bekannte Re zeptoren Weiterhin sind die bekannten Signaltransduktionsfaktoren aufgelistet welche die Signalant wort herbeif hren In unmittelbarem Zusammenspiel mit den Cryptochromen stehen die COP Proteine constitutive photomorphogenetic Diese konnten in dunkel angezogenen Arabi dopsis Mutanten gefunden werden die trotz fehlender Lichtsignale typische PHYA 18 Einleitung initiierte Reaktionen wie Anthocyanbiosynthese und verk rztes Hypokotyl zeigten Deshalb k nnen COP Proteine als negative Lichtregulatoren angesehen werden COP1 interagiert mit dem C Termi
8. Abbildung 2 3 Bestrahlungsspektren f r die polychromatischen Experimente 1500 II 1 I I e Yan Wl AN y vel d ila l E N II Ih d IN y IH ul E N Wall v 1000 N II d WI x It cl di l D p E Al Ur 500 Ary S E fo UVB UVA PAR i Simulator 1 61 432 T 0 Sonne 1 47 40 a 300 400 500 600 700 800 900 Wellenlange nm Abbildung 2 4 Vergleich der spektralen Bestrahlungsstarken von Sonne und Simulator Die Abbildung zeigt die Anpassung der spektralen Bestrahlungsstarken des Simulators an das Son nenspektrum Bereich 300 900 nm Die hohen Strahlungsintensitaten des solaren UV A und PAR Spektrums sind nur durch einen hohen technischen Aufwand nachzustellen 42 Material und Methoden Tabelle 2 1 Polychromatische Bestrahlungsexperimente im Sonnensimulator K13 Die Bestrahlungsbedingungen wurden vor Beginn jedes Versuches spektroradiometrisch bestimmt und daraus die charakteristischen Gr en PPFD Fluenz der photosynthetisch wirksamen Photonen Epar und UV Bge Bestrahlungsst rke Wichtung des Spektrums mit dem generalisierten Pflanzenwir kungsspektrum nach Caldwell 1971 und Normierung bei 300 nm Epp abgeleitet Versuch Szenario PARIUV Se H H 1400 H H 1440 H H 1490 H H wG335 0 o 25 1340 H H lwe3eo 0 o 15 1260 V321 H H JL HDH wes 180 0 95 32
9. Die HPLC Analysen der Schirmpigmente der Blattrosetten zeigten dass die Kon zentrationen der Quercetinderivate unter den oben stehenden Simulationen die deut lichsten UV Spektralabh ngigkeiten zeigten die berdies von der Strahlungsenergie der PAR abh ngig waren Im Szenario H H mit 1300 umol m s PAR war dabei die spektrale Abh ngigkeit im UV Bereich auf einem h heren Niveau als bei vergleichba rer UV B Intensit t und 500 umol m s PAR Hintergrund L H Weiterhin konnte die UV B bedingte Konzentrationserh hung an Quercetinderivaten nicht bei 25 mW UV Bee herbeigef hrt werden H L Es konnte gezeigt werden dass die Akkumulation an Quercetinderivaten in einer ann hernd linearen Beziehung zur Bestrahlungsst r ke der PAR stand Der PAR Beitrag wurde dabei unabh ngig von der UV Strahlung ausgel st Mit Hilfe der UV Nettoakkumulations Werte die um den Synthesebeitrag der PAR korrigiert waren konnte die spektrale Abh ngigkeit im UV Bereich bestimmt werden die in guter Ann herung einem exponentiellen Wirkungsspektrum entsprach Dieses war Basis einer UV Dosisfunktion mit der die Konzentrationen an Quercetin derivaten in Abh ngigkeit von der UV Dosis und den UV Spektralanteilen modelliert werden konnten Im Gegensatz zu den Quercetinderivaten zeigten die Gehalte der Kaempferol und Sinapins urederivate keine signifikanten Spektralabh ngigkeiten Sie m ssen dem Zusammenfassung 127 zufolge als konstitutiver Strahlungssc
10. 1994 Bei UGT83A1 stellt sich die Funktionszuordnung schwierig dar In Phaseolus vulgaris existiert ein schwaches Homolog von 43 auf Protein ebene das der Pathogenabwehr zugeordnet wurde Tang et al 2002 rel Expression zu WG320 rel Expression zu WG320 rel Expression zu WG320 Ergebnisse 107 Glycinreiches RNA Bindeprotein Glutathion S Transferase Atpm24 1 At2g21660 At4g02520 AtGSTF2 3 Si 0 0 4 Vermutliche Glukosyltransferase Vermutliche Glutathion S Transferase At3g02100 UGT83A1 At2g02930 AtGSTF3 3 I a L 2 2 2 al 1 _ 0 i r 0 4 4 Glutathion S Transferase Chlorophylibindendes Protein Typ 1 PSII At1g02920 AtGSTF7 At2g34420 LHb1b 3 LS I E 5 2 A 2 ap WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 e LH e HH HL Abbildung 3 25 Orginaldaten von Node 107 Schlie lich waren die Transkripte des chlorophylibindenden Proteins Lhb1B At2934420 durch UV B unterdr ckt McGrath et al 1992 was eine bekannte typi sche UV B Reaktion ist die z B in Pisam sativum gezeigt wurde Jordan et al 1991 Lhb1B zeigte jedoch keine signifikante Reaktion auf UV B Strahlung in den Szenarien H H und HL 108 Ergebnisse Tab
11. 1999 Regulation of ferulate 5 hydroxylase expression in Arabidopsis in the context of sinapate ester biosynthesis Plant Physiol 119 101 110 Rundel R D 1983 Promotional effects of ultraviolet radiation on human basal and squamous cell carcinoma Photochem Photobiol 38 569 575 Ryan K G Swinny E E Winefield C amp Markham K R 2001 Flavonoids and UV photoprotec tion in Arabidopsis mutants Z Naturforsch 56c 745 754 Sakamoto A Tanaka A Watanabe H amp Tano S 1998 Molecular cloning of Arabidopsis photolyase gene PHR1 and characterization of its promoter region J Sequen Mapp 9 335 340 Sancar A 1994 Structure and function of DNA photolyase Biochem J 33 2 9 Sanchez Fernandez R Davies T G E Coleman J O D amp Rea P A 2001 The Arabidopsis thaliana ABC protein superfamily a complete inventory J Biol Chem 276 30231 30244 Sanger F Nicklen S amp Coulson A R 1977 DNA sequencing with chain terminating inhibitors Proc Nat Acad Sci USA 74 5463 Saslowsky D amp Winkel Shirley B 2001 Localization of flavonoid enzymes in Arabidopsis roots Plant J 27 37 48 Schoenbohm C Martens S Eder C Forkmann G amp Weisshaar B 2000 Identification of the Arabidopsis thaliana flavonoid 3 hydroxylase gene and functional expression of the encoded P450 enzyme Biol Chem 381 749 753 Setlow R B 1974 The wavelength in sunlight effective
12. 3 8 3 UV B responsive Gene EE EE 94 3 8 4 Ween d re dl Te WEE 94 3 8 5 Zellul re Funktionen der Gene aus Mode 78 und 73 een 96 3 8 5 1 Orginaldaten aus Mode 28 98 3 8 5 2 Orginaldaten aus Node 73 100 3 8 6 Gengruppe aus et KE 105 3 8 7 berpr fung der Array Ergebnisse mittels RT PCR cccccccesesesereeeeee 108 3 9 Photosynthetische PigmeNnte u em tree 109 4 DISKUSSION re er ea aa 110 4 1 Biologisches Wirkungsspektrum 224sssssnsnssnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nn 110 4 2 Entwicklungsspezifit t der Pigmentbildung nenn 112 4 3 Interaktion von UV B Strahlung und PAR 22sssssssnsesssnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 113 4 4 Akklimatisierung von Pflanzen an Strahlungsbedingungen 114 4 5 Gene des Gekund metabolemus AEN 115 4 6 Gene des oxidativen Giresees en 118 4 7 Antioxidative Wirksamkeit von Quercetin ceeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeteneeeeeeeees 119 4 3 DNA Rebate acai aa ena a er N rn 121 4 9 PAR Gchwellenwert AEN 123 FEIN AUG DNC onsere 124 ZUSAMMENFASSUNG nee 126 6 LITERATURVERZEICHNIS u ee HEEN ee 128 Anhang A UV B reaktive Gene 2220u04n44an0nnnnnnnnannennnnnnnnnennnnnnnnennnnann 143 Anhang B Photosynthetische Pigmente nn 152 Anhang C Akkumulation der Quercetinderivate in Abh ngigkeit der PAR 153 Anhang D Akkumulation von Sinapoylglukose in Abh ngigkeit der PAR 154 RER EE 155 Ee e ee 157 Abk rzungsverzeich
13. 315 400 nm Die Empfindlich keit ist hier jedoch wesentlich geringer als unterhalb von 315 nm Da die Wirkung auf die Pflanze jedoch aus dem Produkt aus Wirkungsfunktion und spektraler Bestrah lungsst rke bestimmt wird und im Sonnenspektrum die UV A Komponente um zwei bis drei Gr enordnungen intensiver ist als im UV B Bereich darf die UV A Komponente f r die UV Wirkung auf Pflanzen nicht unber cksichtigt bleiben Diskussion 111 10 S 1 E 2 oO IS 0 1 E Uu o lt 0 01 oc 0 001 280 300 320 340 360 380 Wellenlange A nm Abbildung 4 1 Vergleich verschiedener Wirkungsspektren normiert bei 300 nm Rote Linie Akkumulation der Quercetinderivate eigene Daten blaue Line Mesembryanthinbildung Ibdah et al 2002 gr ne Linie Photoinhibition in Dunaliella salina Ghetti et al 1999 gelbe Linie DNA Sch digung Quaite et al 1992 schwarze Linie Allgemeines Pflanzenwirkungsspektrum nach Caldwell 1971 Die Gehalte an Esterverbindungen der Sinapinsaure und die der Kaempferolderivate zeigten keine signifikanten Spektralabhangigkeiten im UV Bereich so dass von die sen Verbindungen keine Wirkungsspektren abgeleitet werden konnten Das ist eine neue Erkenntnis die im Gegensatz zu Ergebnissen aus transienten UV B Expositionsexperimenten steht in denen argumentiert wird dass den Estern der Si napins ure eine wichtigere Funktion im UV B Schutz zukommt als den Flavonoiden Steph
14. 411 420 Cooley N M Higgins J T Holmes M G amp Attridge T H 2001 Ecotypic differences in response of Arabidopsis thaliana L to elevated polychromatic UV A and UV B A radiantion in the natu ral environment a positive correlation between UV B A inhibition and growth rate Photochem Photobiol 60 143 150 Cooley N M Truscott H M F Holmes M G amp Attridge T H 2000 Outdoor ultraviolet poly chromatic action spectra for growth response of Bellis perennis and Cynosurus cristatus Photochem Photobiol 59 64 71 Coupe S A Taylor J E Isaac P G amp Roberts J A 1993 Identification and characterization of a proline rich MRNA that accumulates during pod development in oilseed rape Brassica napus L Plant Mol Biol 23 1223 1232 Crutzen P J 1970 The influence of nitrogen oxides on the atmospheric onzone content Quart J R Met Soc 96 320 325 Cullen J C Neale P J amp Lesser P 1992 Biological weighting function for the inhibition of phyto plankton photosynthesis by ultraviolet radiation Science 258 646 650 Day T A Howells B W amp Rice W J 1994 Ultraviolet absorption and epidermal transmittance spectra in foliage Physiol Plant 92 207 218 Day T A Howells B W amp Ruhland C T 1996 Changes in growth and pigment concetration with leaf age pea under modulate UV B radiation field treatments Plant Cell Environ 19 101 108 De Vetten N
15. Azidradikalen N3 Superoxidanionen 02 und Lipidperoxidradikalen LOO exemplarisch gezeigt werden berdies bekommt die eisenchelatierende Eigenschaft vieler phenolischer Molek le insofern eine pr ventive Funktion als sie die Metallkatalyse von Hydroxylradikalen Haber Weiss Reaktion unterbinden die ihrerseits als Initialradikale f r die Peroxidation von unge s ttigten Fetts uren diskutiert werden da weder das Superoxidanion noch das Pro dukt der Dismutation H202 eine ausreichende Reaktivit t haben um die Peroxidati on unges ttigter Fetts uren einzuleiten d h sie sind nicht in der Lage Wasserstoff atome von unges ttigten Fetts uren zu abstrahieren Hock amp Elstner 1995 Hudson amp Lewis 1983 Quercetin kann in vivo durch die Inhibierung der eisenabh ngigen Hydroxylradikalproduktion f r einen ausreichenden Schutz der Biomembranen ge gen ber Peroxidationsprozessen sorgen Neben dieser pr ventiven Funktion kann 120 Diskussion Quercetin zelltoxische Peroxylradikale abbauen die z B bei der Peroxidation durch ein Hydroxylradikal der Linolens ure entstehen Die chemische Reaktion d rfte nach folgender Reaktionsgleichung ablaufen Erben Russ et al 1987 1 Quercetin OH ROO Quercetin O ROOH 2 Quercetin O ROO ROO Quercetin O Die erste Reaktion hat dabei eine Umsatzrate von ca 10 dm mol sl Die zweite 1 erreichen Reaktion kann demgegen ber eine Rate von ber
16. Der Menge von UV Photonen die auf den Organismus bzw ein bestimmtes Organ treffen 8 Einleitung 2 Der Energie E der einzelnen Photonen Diese ist mit der Wellenl nge A der UV Strahlung eindeutig ber die Beziehung E hc A definiert Planck sches Wirkungsquantum h 6 63 10 J s und Lichtgeschwindigkeit c 3 0108 m s Die Auftragung der Strahlungsmenge ber die Wellenl nge definiert ein Spektrum In der biologischen Anwendung bezieht man die Photonenmenge auf die Zahl der Pho tonen die pro Sekunde auf die Fl cheneinheit trifft und dividiert durch die Avogadro konstante L 6 02 10 Photonen mol und erh lt den Strahlungsfluss in mol m s Alternativ wird mit dem Plank schen Wirkungsquantum die sekundliche Energie pro Fl cheneinheit ermittelt und in W m angeben Typische Spektren der terrestri schen Globalstrahlung bei verschiedenen Sonnenh hen ber dem Horizont zeigt Abbildung 1 1 Charakteristisch f r das terrestrische Sonnenspektrum ist der sehr steile Abfall zu k rzeren Wellenl ngen bei etwa 300 nm siehe Abbildung 1 2 Die Ausd nnung der stratosph rischen Ozonschicht bewirkt eine scheinbar geringf gige Verschiebung dieser Kante zu k rzeren Wellenl ngen hin Ein spezielles Spektrum das sogenannte Wirkungsspektrum bezeichnet die biologi sche Wirkung von Licht oder UV Strahlung in Abh ngigkeit von der Wellenl nge Ein Wirkungsspektrum definiert somit eine quantitative Abh ngigkeit
17. Der Verlust der Pigmentierung k nnte hier durch eine gest rte Biosynthese von Tanninen hervorgerufen sein Focks et al 1999 Tabelle 1 1 Enzyme der Flavonoidbiosynthese in Arabidopsis thaliana Die entsprechenden Gene werden in dieser Arbeit hinsichtlich ihrer Expression untersucht Enzym Abk rzung Aminos uren AS Gen MIPS Code Funktionelle Charakterisierung Chalkonsynthase CHS 395 At5g13930 Feinbaum amp Ausubel 1988 Chalkonisomerase CHI At3g55120 Shirley etal 1995 Flavanon 3 Hydroxylase FHT At3g51240 Wisman etal 1998 Flavonoid 3 Hydroxylase F3 H At5g07990 Schoenbohm et al 2000 Flavonolsynthase FLS At5g08640 Wisman et al 1998 Einleitung Phenylalanin Y PAL Zimtsaure y C4H p Cumars ure y ACL OH HO O D SW CHS OH O Naringeninchalkon ci OH OH Q HO o LX HO O BM F3 H SN SKS Naringenin OH O Eriodictyol FHT FHT OH H O O SI S w OH OH O OH HO O I F3 H OH OH OH O Dihydrokaempferol FLS P HO O I F3 H Sy on OH O SE Flavonolglykoside Kaempferol Quercetin EN Flavan 3 4 diole Leucoanthocyanidine ANS Anthocyanidine Abbildung 1 6 DFR 25 p Cumaroyl CoA 3 Malonyl CoA Abk rzungen PAL Phenylalanin Ammoniumlyase C4H Zimtsaure 4 Hydroxylase 4CL Cumarat CoA Ligase CHS Chalkonsynthase CHI Chalkonisomerase FHT Flavanon 3 Hydroxylase F3 H Flavonoid 3 Hydroxylas
18. Erh hte UV Strahlung in Bayern Folgen und Ma nahmen BayForUV die Dissertation finanziert hat Allen Postdocs Doktoranden und technischen Assistenten des Instituts f r Bioche mische Pflanzenpathologie f r das konstruktive Arbeitsumfeld Meinen Eltern Bekannten und Freunden Besonderer Dank gilt meiner Freundin Ja nine Appelfelder und meinem langj hrigen Freund Dr phil Werner Simon Split Danksagung 157 Lebenslauf Geboren 2 7 1971 in Neumarkt i d Opf als Sohn der Eltern Richard und Hilde G tz geb Reiff Grund und Hauptschule 1977 1983 Grund und Hauptschule Holnstein Realschule 1983 1987 Knabenrealschule Neumarkt i d Opf Mittlere Reife Berufsschule 1987 1990 Berufsschule Neumarkt Landwirtschaftsgehilfe Landwirtschaftsschule 1990 1992 Landwirtschaftsschule Neumarkt i d Opf Staatlich Gepr fter Landwirt Hochschulreife 1992 1993 Fachoberschule Triesdorf Fachhochschulreife 1993 1994 Vordiplom an der FH Triesdorf Hochschulreife Studium 1994 2000 Studium der Agrarwissenschaften an der Technische Universit t M n chen mit den Schwerpunkten Genetik und Phytopathologie 1999 2000 Lehrstuhl f r Pflanzenz chtung AG Molekulare Marker bei Prof Wenzel Entwicklung molekularer Marker zur Unterscheidung des a und B mitochondrialen Genomes sowie des cytoplasmatisch m nnlich sterilen y Chondriomtyps Solanum spp Dipl Ing Univ Promotion 2000 2004 Institut f r Biochemis
19. Hoch ent sprach dabei etwa den Bedingungen die wir in unserem Klima am Mittag eines mitt leren Sonnentags erwarten k nnen mittel am Vor oder Nachmittag und niedrig im Schatten Zus tzlich wurden f nf spektral unterschiedliche UV Varianten mit einer in den Simulator integrierten K vette mit einer Abdeckung aus f nf verschieden WG Kantenfiltern der Firma Schott erreicht Jeder Versuch mit einem bestimmten Strah lungsszenario wurde mit m glichst hnlichen Parametern wiederholt so dass insge samt zweimal 20 Bestrahlungsvarianten ausgewertet werden konnten Die spektro radiometrischen Daten und die dazugeh rigen Numerierung der Versuche V318 V327 sind in Tabelle 2 1 zusammengestellt Unter einer spektralen UV Variante wuchsen ca 50 Pflanzen die i d R in drei Pools aufgeteilt wurden Zur Darstellung der Messwerte der UV Varianten sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen aus den Werten der einzelnen Pools berechnet worden Analysiert wurden die Derivate von Kaempferol und Quercetin sowie die Ester der Sinapins ure Beide Verbindungsklassen sind vergleichsweise hoch konzentriert und vorwiegend in der oberen Epidermis zu finden Dadurch haben sie eine sehr g nstige Lokalisation um das photosynthetisch aktive Mesophyligewebe vor UV B Einwirkung abzuschirmen Die analysierten Pigmente sind wasserl slich und in Arabidopsis tha liana existieren keine zellwandgebundenen Fraktionen W Heller unver ffentlicht D
20. UV B UV A WG 295 WG305 WG320 WG335 WG360 Abbildung 3 18 Differential Displaying mit Hilfe des DNA Arrays Die Abbildung zeigt exemplarisch eine radioaktive Hybridisierungsserie des Szenarios L H Die gr n eingekreisten Spots sind die Hybridisierungssignale der 3 UTR Probe At2g23210 Die rot eingekreis ten Transkripte waren nicht durch UV B Strahlung induziert rel Expression zu WG320 i WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 e At2923210 281 At4g14100 140 At4927570 39 Abbildung 3 19 Unterschiedlich ausgepragte spektrale Abhangigkeiten 39 281 Die drei dargestellten Gene entsprachen den Auswahlkriterien von UV B responsiven Genen 94 Ergebnisse 3 8 3 UV B responsive Gene Die Kategorisierung der Transkripte die auf UV B Strahlung reagierten ergab dass sich die 112 regulierten Gene in folgende Stoffwechselwege unterteilen lie en voll st ndige Liste siehe Anhang A UV B hochregulierte Gene Cytochrom P450 Monooxygenasen 15 Zellulare Transportproteine 29 Glukosyltransferasen 14 Oxidativer Stress 16 Photosynthese 4 Ethylenstoffwechsel 4 Primarstoffwechsel 7 Sekundarstoffwechsel 5 DNA Reparatur 2 Pathogenabwehr und Zellregulation 8 UV B abregulierte Gene Photosynthese 1 GSTs 5 Glukosyltransferase 1 Zellregulation 1 3 8 4 Expressio
21. War das PCR Produkt stabil in den Vektor eingebaut blieben die Bakterien kolonien wei da die codierende Sequenz des Enzyms Galaktosidase durch das eingebrachte DNA Fragment unterbrochen wurde Kolonien die nur Plasmid DNA 50 Material und Methoden aufgenommen hatten wuchsen zwar auf Antibiotika waren aber durch ihre blaue F rbung zu erkennen Diese resultierte aus der Spaltung des halogenierten Disac charides X Gal was durch ein funktionst chtiges B Galaktosidase Gen bewirkt wird Wei e Kolonien wurden mit einem sterilen Zahnstocher gepickt und in 5 ml LB Medium gegeben Die Kulturen wuchsen f r 16 h im Sch ttelinkubator bei 240 Upm und 37 C Zus tzlich wurde die Integration des DNA Fragmentes mit einer PCR ge testet Diese wurde innerhalb der Vektorsequenz mit den Primerpaaren 5 GTA AAA CGA CGG CCA GT 3 M13forward und 5 GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3 M13reverse durchgef hrt Das Reaktionsvolumen betrug 25 ul bestehend aus 2 5 ul 10x PCR Puffer 15 mM MgCl 0 5 ul 10 mM dNTPs 0 75 ul 10 UM M13forward 0 75 ul 10 uM Mi3reverse 0 5 ul Taq Polymerase AGSGold 5 U ul und 19 ul H2Obiaest Zum Reaktionsansatz wurde 1 ul der Bakterienkultur gegeben Das PCR Programm begann mit einem Vorabdenaturierungsschritt von 95 C f r 5 min und 30 sec Im Anschluss folgten 40 Zyklen mit 95 C f r 1min 52 C f r 45 sec und 72 C f r 2 min Zum Abschluss der PCR wurden zus tzlich 72 C f r 7 min eingestellt Ein Ali
22. h u fig mit dem Begriff Ozonloch beschrieben wird Ursache hierf r sind katalytische Ab bauprozesse in der Stratosph re die durch die nat rliche photolytische Bildung von Ozon aus molekularem Sauerstoff nicht ausgeglichen werden k nnen Chapman 1930 Crutzen 1970 Molina amp Rowland 1974 Zellner et al 1999 Der Ozonverlust wird voraussichtlich in der zweiten H lfte dieses Jahrzehnts ein Maximum erreichen und dann wenn die internationalen Vereinbarungen des Montrealer Protokolls zur Begrenzung des Aussto es von Fluorchlorkohlenwasserstoffen eingehalten werden in einigen Jahrzehnten durch die nat rliche Regeneration der Ozonschicht wieder kompensiert werden Ein Unsicherheitsfaktor ist jedoch der zunehmende Flugver kehr Ozon ist ein effizienter Absorber f r kurzwellige UV B Strahlung 280 315 nm Die stratosph rische Ozonschicht stellt daher ein sehr wirksames Schutzschild f r solare UV B Strahlung dar Mit der Ausd nnung der Ozonschicht geht somit der Anstieg der bodennahen UV B Strahlung einher Der energetische Anteil dieser Strahlungskom ponente an der gesamten terrestrischen Sonneneinstrahlung betr gt nur wenige Promille aufgrund ihrer hohen Photonenenergie von etwa 4 eV kann sie jedoch Bio molek le insbesondere die DNA irreversibel ver ndern Britt 1996 1 2 Spektrale Abh ngigkeit der Wirkung von UV Strahlung Die Wirkung von UV Strahlung wird wie erw hnt von zwei physikalischen Faktoren abh ngen 1
23. multidrug resistance proteins Dudler amp Hertig 1992 und MDDI Subklasse MRP multidrug resistance associated proteins gemeinsam in Node 73 gruppiert Beides sind Volllangentransporter mit unterschiedlicher Dom nenreihenfolge Die MRP Mitglieder verf gen ber die Reihenfolge ABC ABC TM TM Sanchez Fernandez et al 2001 w hrend die MDR Vertreter die vertauschte Reihenfolge TM ABC TM ABC aufweisen Tusnady et al 1997 MRP transportieren glykosidische Flavonoide z B Luteolin 7 O Diglukuronid in die Vakuole w hrend die MDR Mitglieder f r Translokation von degradierten Phospholipiden diskutiert werden Klein et al 2000 Sanchez Fernandez et al 2001 Sidler et al 1998 Wang et al 1996 Neben den ABC Transportern konnten die Transkripte der Membrankanalproteine At3926520 TIP1 2 At2g45960 PIP1 2 und At4g00430 PIP1 4 im Node 78 gruppiert werden Die Gene geh ren zu der MIP Genfamilie membrane intrinsic proteins Sie bef rdern kleine polare Verbindungen ber Biomembranen Wasser Glycerol und nehmen dadurch eine aktive Rolle bei der Regulation des osmotischen Druckes und der Kompartimentierung von Abbauprodukten der Biomembranen ein Johanson et al 2001 Kinoshita et al 1994 Weg et al 1997 E Glyoxalasen Die Glyoxalase At1908110 und II At1906139 waren beide in Node 73 eingeglie dert Glyoxalasen sind w hrend oxidativer Vorg ngen verst rkt aktiv Skipsey et al 2000 Die Aufgabe
24. ngliche Datenbanken vgl Baxevanis 2001 ArrayVision5 1 Interfocus Mering Sequence Detection System Perkin Elmer Langen Vector NTI suite 6 0 InforMax UK Arabidopsis Information Resource TAIR http www arabidopsis org home html GeneCluster und TreeView http rana stanford edu software Haruspex expression database https euklid mpimpgolm mpg de MIPS Arabidopsis thaliana Datenbank http mips gsf de proj thal National Center for Biotechnology Information http www ncbi nim nih gov TIGR Arabidopsis thaliana Datenbank http www tigr org tdb e2k1 ath1 2 1 UV Strahlungssimulation F r die polychromatischen Bestrahlungsexperimente wurde eine K vette mit f nf verschiedenen WG Kantenfiltern WG295 WG305 WG320 WG335 und WG360 der Firma Schott in den Simulator integriert Die W rmeabfuhr in der K vette erfolgte durch ein spezielles Umluftk hlsystem um in den Bestrahlungsversuchen ann hernd eine konstante Temperatur von 25 C zu erzielen Die Bodentemperatur wurde fort laufend mit einer Temperatursonde in 5 cm Bodentiefe kontrolliert Das Sonnen spektrum wurde durch eine geeignete Kombination an Lampen simuliert Abbildung 2 1 Der Versuchsaufbau der Bestrahlungsexperimente und die dazugeh rigen Spektren sind in Abbildung 2 2 und Abbildung 2 3 dargestellt Die Qualit t der An passung der spektralen Bestrahlungsst rke des Simulators an das Sonnenspektrum ist in Abbildung
25. quantitative Aussage m glich Abbildung 2 6 In einer externen Reaktion mit definierten cCDNA Verd nnungsreihen wurden von der endogenen Kontrolle und vom Zielgen die PCR Effizienzen bestimmt Diese waren in erster Linie von der verwendeten Primerkombination abh ngig und schwankten zwi schen 1 6 2 0 Die Effizienzen wurden bei jeder PCR bestimmt Abbildung 2 7 Die Berechnung der relativen Ver nderung eines Zielgens im Vergleich zur 78S rRNA erfolgte nach der Formel Pfaffl 2001 54 Material und Methoden CT x zieigen CT B zielgen rel Expression Zielgener Zielgen CT CT 1854 K 18S B 18S K Kontrolle B Behandlung F r die Parameter CTx Kontrolle f r Zielgen und 18S rRNA wurde der CT Mittel von WG295 360 herangezogen Die cDNA Synthese f r die anschlie ende RT PCR erfolgte leicht abge ndert zu den Herstellerangaben von Omniscript RT Kit Quiagen F r einen zweifachen Markie rungsansatz wurden 10 ul Gesamt RNA 300 ng ul verwendet Ein Reaktionsansatz bestand demnach aus 4 ul 10x RT Puffer 4 ul 5 mM dNTPs 2 ul 50 uM Randomhe xamer 2 ul Reverse Transkriptase 4 U ul 2 ul RNase Out Inhibitor 10 U ul und 16 ul DEPC H2Opidest 10 ul Gesamt RNA 3 ug wurden bei 65 C f r 3 min denaturiert Die Proben wurden danach auf Eis gestellt und mit dem Reaktionsansatz auf 30 ul Volumen aufgef llt F r das Anlagern der Hexamere an die RNA inkorporierte die Reaktion f r 10 min bei 25 C Nach der Anlageru
26. rken durchgef hrt werden m ssen In die sem Zusammenhang ist anzumerken dass die Reziprozit t von UV Effekten auf Pflanzen bisher sehr wenig untersucht ist Reziprozit t bedeutet dass hohe Bestrah lungsst rke und kurze Einwirkungszeit die gleiche pflanzliche Reaktion hervorrufen wie eine geringe Bestrahlungsst rke die entsprechend l nger einwirkt solange nur das Produkt aus beiden Gr en gleich bleibt Wegen der zeitlichen Entwicklung von Pflanzen und der Regulation ihrer Schutzpigmente ist eine Reziprozit t der Effekte allerdings nur in sehr eingeschr nktem Umfang zu erwarten Die polychromatische Wirkungsspektroskopie ist also ein aufwendiges Verfahren und es ist daher kaum verwunderlich dass bisher nur wenige polychromatische bio logische Wichtungsfunktionen bestimmt wurden Ghetti et al 1999 Holmes 1997 Ibdah et al 2002 In der Literatur finden sich biologische Wichtungsfunktionen die formelm ig festge legt sind Die wichtigsten die auch Eingang in die Praxis gefunden haben sind Die Erythembewertung welche die Sonnenbrandaktivitat f r die menschliche Haut bewertet McKinley amp Diffey 1987 Sie ist die Grundlage f r die Angabe des UV Index der ber die Medien verbreitet wird um die Bev lkerung vor starker UV B Belastung durch die Sonnenstrahlung zu warnen Das sogenannte generalisierte DNA Wirkungsspektrum nach Setlow 1974 wel ches urspr nglich mutagene Effekte der UV Strahlung bewer
27. sophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor Neuron 26 493 504 Erben Russ M Bors W amp Saran M 1987 Reactions of linoleic acid peroxyl radicals with phenolic antioxidants a pulse radiolysis study nt J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med 52 393 412 Feinbaum R L amp Ausubel F M 1988 Transcriptional regulation of the Arabidopsis thaliana chal cone synthase gene Mol Cell Biol 8 1985 1992 Fernandez De Simon B Perez llzarbe J Hernandez T Gomez Coroves C amp Estrella I 1992 Importance of phenolic compounds for the characterization of fruit juices J Agric Food Chem 40 1531 1540 Fiscus E L amp Booker F L 1995 Is increased UV B a threat to crop photosynthesis and productiv ity Photosynth Res 43 81 92 Flint S D amp Caldwell M M 2003 Field testing of UV biological weighting functions for higher plants Physiol Plantarum 117 145 153 Focks N Sagasser M Weisshaar B amp Benning C 1999 Characterization of tt15 a novel trans parent testa mutant of Arabidopsis thaliana L Heynh Planta 208 352 357 Frohnmeyer H Bowler C amp Schafer E 1997 Evidence for some signal transduction elements involved in UV light dependent responses in parsley protoplasts J Exp Bot 48 739 750 Frohnmeyer H Loyall L Blatt M R amp Grabov A 1999 Millisecond UV B irradiation evokes pro longed elevation of cytosolic free Ca and stimulates
28. 0 8 0 5 1 1 transferase 3 UTR At2g02930 53 Putative UDP glucosyl 0 0317 0 5 0 5 1 1 transferase 3 UTR At3g02100 53 Glycine rich RNA 0 0121 0 7 0 6 1 2 binding protein EST At2g21660 47 Glutathione S 0 0100 0 8 0 7 1 1 transferase EST At1g02930 40 Glutathione S 0 0071 0 7 0 7 1 1 transferase 3 UTR At1902920 39 Glutathione S 0 0011 0 7 0 6 1 0 transferase EST At1902930 34 Photosystem II type I chlorophyll a b binding 0 0007 1 2 0 9 1 4 protein EST At2g34420 33 gelbe Hinterlegung At1902930 war zweimal auf dem DNA Array lokalisiert Zudem zeigt es eine sehr hohe Sequenzhomologie zu At02920 Referenzen At4902520 AtGSTF2 Glombitza et al 2004 Reinemer et al 1996 Zen et al 1994 Zhou amp Goldsbrough 1993 At2g21660 Heintzen et al 1994 At3g02100 UGT83AT Tang et al 2002 At2934420 Lhb1B McGrath et al 1992 152 Anhang B Photosynthetische Pigmente Anhang B Photosynthetische Pigmente Chlorophyll a b 14000 m 14000 2 2 12000 12000 z g g u H I l I g E 10000 d 8 40000 2 E E S 8000 H 8000 s S 6000 H 6000 S E E 4000 E 4000 3 CH Be E 2000 3 2000 Sg 5 H i i H o 295 305 320 335 360 295 305 320 335 360 Chlorophyll a Chlorophyll b B Carotin Derivat x _ _ 2
29. 11 enthalten siehe Anhang A Se kund rstoffwechsel Die brigen 18 Gene dieser Tabelle entsprachen nicht den Auswahlkriterien UV B responsiver Gene aus Kapitel 3 8 1 Dies sollte aber nicht zu 116 Diskussion der generellen Aussage f hren dass sie keine Reaktion auf UV B zeigten vielmehr k nnen sie wegen schwacher Signale nicht mit der Array Technik detektiert werden Das gro e Problem der DNA Array Technik ist die relativ niedrige Sensitivit t im Vergleich zur RT PCR Trotzdem sind im Anhang A unter der Kategorie Sekund r stoffwechsel zwei bekannte Gene der Flavonoidbiosynthese enthalten die signifikan te PAR Effekte zeigten n mlich die Chalkonsynthase CHS und die Chalkonisome rase CHI Die Expression der Gene wurden mit Hilfe von Northern Blotting bzw RT PCR verifiziert Weiterhin wurden die Gene f r die bekannten Enzyme FHT F3 H und FLS mit RT PCR untersucht so dass f r die Flavonoidbiosynthese ein vollst ndiges Expressionsmuster vorliegt Ein Beispiel f r ein aufgetretenes Problem bei den Ar ray Messungen sei anhand der Flavonolsynthase kurz dargestellt Das Gen ist auf dem DNA Array in der Koordinate E12 zu finden siehe Abbildung 2 8 Position 2 In der Nachbarschaft befinden sich zwei auff llig stark exprimierte Gene die den Hin tergrundwert LB dramatisch anheben Das Gen hat zwar ein Signal liefert aber durch den hohen Hintergrund einen kleinen normalisierten Wert der entsprechend hoch mit einem Fehl
30. 1988 Die Transkription der Chalkonsynthase befindet sich in einem komplexen Netzwerk der verschiedenen Lichtrezeptoren Boccalandro et al 2001 Phytochrom A und B k nnen die CRY1 vermittelte Signalantwort der Expression der CHS verstarken UV A Antwort Andererseits erfolgt eine Supression durch PHYB in der UV B induzierten Kaskade der CHS Wade et al 2001 Synergistische Effekte von Cryptochrom und Phytochromrezeptoren konnten auch an chloroplastidaren Transkripten gezeigt werden UV A Strahlung kann als Hauptsignal in Arabidopsis thaliana angesehen werden um die chloroplastidaren Gene psbA rbcL und 16Srrn Einleitung 17 zu aktivieren In Mutanten ohne PHYA phyA war jedoch der Gehalt an diesen UV A induzierbaren Transkripten um 60 80 niedriger als im Wildtyp Chun et al 2001 Die Cryptochrome besitzen eine andere molekulare Struktur als die Phytochrome Ahmad amp Cashmore 1996 Ahmad 1998 Lin et al 1995 Ninu et al 1999 Die Struktur konnte durch die Isolierung des HY4 Proteins gezeigt werden hy4 ist eine Arabidopsis Mutante die keine blaulichtabh ngige Inhibierung des Hypokotyl wachstums zeigt Das Protein besitzt im N Terminus eine Bindestelle f r das Chro mophor Deazaflavin C terminal abw rts weist es eine Bindestelle f r das Flavin chromophor FADH 3 auf Unterbrochen werden beide Proteinbindestellen von einem Sequenzmotiv das sehr homolog zu dem DNA Reparaturgen Cyclobutanphotolyase CPDII ist Ahmad et al
31. 1999 10 Jahre Deutsche Ozonforschung 1989 1999 Verlag fur Marketing und Kommunikation Worms 142 Literaturverzeichnis Zettl R Schell J amp Palme K 1994 Photoaffinity labeling of Arabidopsis thaliana plasma mem brane vesicles by 5 azido 7 3H indole 3 acetic acid identification of a glutathione S transferase Proc Natl Acad Sci USA 91 689 693 Zhou J amp Goldsbrough P B 1993 An Arabidopsis gene with homology to glutathione S transferases is regulated by ethylene Plant Mol Biol 22 517 523 Zhou N Tootle T L amp Glazebrook J 1999 Arabidopsis PAD3 a gene required for camamlaxin biosynthesis encodes a putative cytochrome P450 monooxygenase Plant Cell 11 2419 2428 Anhang A UV B reaktive Gene 143 Anhang A UV B reaktive Gene UV B hochregulierte Gene 1 Monooxygenasen ANOVA Induktion Induktion Induktion Funktion Proben Typ Genbanknummer UV B Abk rzung Medianwe295 mitUV B UV A ohneUV B UV A Erh hung Medianwe25 w6305 Medianwe320 360 Erniedrigung Cytochrome P450 monooxygenase like 0 0001 1 8 1 5 0 6 protein 3 UTR Probe At1913090 141 CYP71B28 Cytochrome P450 like At2945560 0 0002 1 9 1 9 0 8 protein 3 UTR Probe 141 CYP76C1 Cytochrome P450 0 0001 2 5 1 9 0 9 homolog 3 UTR Probe At4912320 116 CYP706A6 Obtusifoliol 14 alpha At1911680 CYP 51A2 0 0000 1 7 1 5 0 7 demethylase like protein
32. 40 pCi und 9 125 ul H2Obiaest berechnet Die Re aktion wurde bei 37 C f r 30 min durchgef hrt Um die radioaktiv markierten Oligo nukleotide von nicht gebundenen Isotopen zu trennen wurde der Reaktionsansatz auf eine MicroSpin Column G 25 gegeben Amersham Die Pr paration und Zentri fugationszeiten der S ule waren dabei den Herstellerangaben zu entnehmen Ein Aliquot von 1 ul wurde im Szintillationsz hler gemessen Die Aktivit t der Sonde lag in einem Bereich von 250000 300000 cpm ul Der Reaktionsansatz wurde in die Schale zu den Membranen pipettiert um bei 37 C f r 16 h bei leichtem Sch tteln zu hybridisieren Um die nicht gebundenen Oligonukleotide zu entfernen wurden die Filter nach der Hybridisierung mit folgenden L sungen gewaschen Material und Methoden 47 2x SSC 0 1 SDS kurz geschwenkt und wieder abgekippt 20 min bei Raumtemperatur mit 2x SSC 0 1 SDS 0 2x SSC 0 1 SDS kurz inkubiert 20 min bei Raumtemperatur mit 0 2x SSC 0 1 SDS 20 min bei 37 C mit 0 2x SSC 0 1 SDS Um das Austrocknen der Membranen w hrend der Entwicklungszeit zu vermeiden wurden sie auf ein mit 2x SSC Puffer getr nktes 3 MM Papier gelegt und im An schluss mit einer d nnen Haushaltsfolie luftblasenfrei berzogen Auf diese wurde ein ImageScreen Fuji gelegt und f r 15 h in einer Hybridisierungskassette expo niert Die Image Platten wurden mit dem Scanner Fuji FLA3000 mit einer Aufl sung von 50 um eingelesen Die
33. 62 C von der Primerpaarung abh ngig f r 30 sec und 72 C f r 30 sec 56 Material und Methoden Das Maximum an doppelstr ngiger DNA ist nach dem Polymerisationsschritt vorhan den Deshalb wurde die Fluoreszenz nach diesem Schritt gemessen 72 C 300 s00 Too 600 500 4 00 300 200 100 o SL Baseline 100 D 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 25 30 32 34 36 35 40 42 44 Zyklus PCR Effizienz 18S Er 18 16 14 12 10 5 8 6 4 2 0 3 2 5 2 1 5 1 0 5 0 Verd nnung log10 Abbildung 2 7 Ermittlung der exponentiellen Basis einer PCR Kinetik Pfaffl 2001 Die obere Abbildung zeigt die Kalibrierungskurven der 18S rRNA mit einer cCDNA Verd nnungsreihe von 1 1 bis 1 500 Durch logarithmische Auftragung der cCDNA Verd nnungen gegen die ermittelten 1 Steigung CT Werte l sst sich die Basis der exponentiellen Funktion mit 185 4 10 berechnen Material und Methoden 57 2 3 2 11 Northern Blotting Gesamt RNA wurde unter denaturierenden Bedingungen in Formamidgelen elektrophoretisch getrennt Hierbei sind je Gelspur 20 ug photometrisch vermessene Gesamt RNA aufgetragen worden Der RNA Laufpuffer war dabei 1x konzentriert Bevor man die Proben auf das Gel auftrug wurde die RNA f r 5 min bei 65 C hitze denaturiert und dann auf Eis abgek hlt Die Elektrophorese erfolgte in Horizontalgelapparaturen bei 7 V cm Gelbreite Als Laufpuffer diente 1x MOP
34. B Wager Smith K Kay S A Rosbash M amp Hall J C 1998 The cryb mutation identifies cryptochrome as a circadian photoreceptor in droso phila Cell 95 681 692 Stapleton A E amp Walbot V 1994 Flavonoids can protect maize DNA from the induction of ultravio let radiation damage Plant Physiol 105 881 889 Steinm ller D amp Tevini M 1985 Action of ultraviolet radiation UV B upon cuticular waxes in some crop plants Planta 164 557 564 Stephan J J 1996 Sinapate esters provide greater UV B attenuation than flavonoids in Arabidopsis thaliana Brassicaceae Am J Bot 83 679 686 Strid A 1993 Alteration in expression of defence genes in Pisum sativum after exposure to supple mentary ultraviolet B radiation Plant Cell Physiol 34 949 953 Strid A Chow W S amp Anderson J M 1994 UV B damage and protection at the molecular level in plants Photosynth Res 39 475 489 Sullivan T A Jakobek J L amp Lindgren P B 2001 Cloning and characterization of a bean UDP glucosyltransferase cDNA expressed during plant bacterial interactions Mol Plant Microbe In teract 14 90 92 Sun Z Gantt E amp Cunningham F X J 1996 Cloning and functional analysis of a beta carotene hydroxylase of Arabidopsis thaliana J Biol Chem 271 24349 24352 Surplus S L Jordan B R Murphy A M Carr J P Thomas B amp Mackerness S A H 1998 Ultraviolet B induced res
35. B radia tion enhances a phytochrome B mediated photomorphogenic response in Arabidopsis Plant Physiol 126 780 788 Borevitz J O Xia Y Blount J Dixon R A amp Lamb C 2000 Activation tagging identifies a con served MYB regulator of phenylpropanoid biosynthesis Plant Cell 12 2383 2393 Bornman J F amp Teramura A H 1993 Effects of UV B radiation on terrestial vegetation In Envi ronmental UV Photobiology eds A R Young L O Bj rn J Moan amp W Nultsch Plenum London pp 427 472 Bors W Heller W Michel C amp Saran M 1990 Flavonoids as antioxidants determination of radi cal scavenging efficiencies Meth Enzymol 186 343 355 Bowler C amp Chua N H 1994 Emerging themes of plant signal transduction Plant Cell 6 1529 1541 Briggs W R amp Huala E 1999 Blue light photoreceptors in higher plants Annu Rev Cell Dev Biol 15 33 62 Britt A B 1996 DNA damage and repair in plants Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47 75 100 Bruce W Folkerts O Garnaat C Crasta O Roth B amp Bowen B 2000 Expression profiling of the maize flavonoid pathway genes controlled by estradiol inducible transcription factors CRC and P Plant Cell 12 65 79 Burchard P Bilger W amp Weissenb ck G 2000 Contribution of hydroxycinnamates and flavonoids to epidermal shielding of UV A and UV B radiation in developing rye primary leaves as as sessed
36. Firma Qiagen durchgef hrt Die Reinigung der DNA erfolgt bei diesem Sys tem durch die Bindung an das Saulenmaterial unter hohen Salzkonzentrationen und einem pH Wert lt 7 5 Die Konzentrationsbestimmung der PCR Produkte die mit 30 Ul HoObidest eluiert wurden erfolgte gelelektrophoretisch durch Vergleich mit einem DNA Langenstandard Um PCR Banden aus einem Agarosegel zu reinigen wurde der QlAquick Gel Extraction Kit der Firma Quiagen verwendet siehe Herstelleran gaben 2 3 2 3 Vektorligation des PCR Produkts Bei einer Standardligation wurde ein molares Verhaltnis von Vektor zu Insert von 1 1 eingesetzt Die einzusetzende Menge an PCR Produkt lieB sich mit PCR ng Vek tor ng PRC Produkt bp Vektor bp berechnen Der Reaktionsansatz wurde laut Herstellerangaben von Promega hergestellt GEM T Vector System 2 3 2 4 Transformation rekombinanter Plasmide Der rekombinante Vektor wurde gem den Herstellerangaben von Promega trans formiert Bakterienstamm JM109 Der Ansatz wurde ohne Antibiotika mit 900 ul SOC Medium versetzt und f r 90 min bei 37 C und 240 Upm in Sch ttelkultur gege ben Im Anschluss wurden davon 300 ul entnommen und auf eine LB Platte gleich m ig ausgestrichen Diese enthielt f r die Insertionskontrolle 50 ug ml Ampicillin IPTG 0 5 mM und X Gal 32 mg l Die Bakterien wuchsen im Brutschrank bei 37 C f r 16 h Der Transformationserfolg konnte an der F rbung der Kolonien erkannt werden
37. Hydroxylase Die dritte Gruppe enth lt haupts chlich ESTs mit gr tenteils bekannter Funktion Diese Gengruppe ist detailliert in Tabelle 3 11 zusammengestellt Die Normalisierung und Datenverarbeitung der Expressionswerte erfolgte laut Kapitel 2 5 Die Induktionsfaktoren beider Experimente eines Szenarios wurden in Analogie zu den Ergebnissen der RT PCRs aus den Kapiteln 3 1 3 4 zusammengef hrt Von den urspr nglichen 579 Sequenzen konnten ber alle Simulationsexperimente hin weg noch 401 Gene als gemeinsam detektiert geltend gemacht werden F r jedes Strahlungsszenario wurden insgesamt 30 Arrays hybridisiert Das Pflanzenmaterial wurde zu diesem Zweck aus drei unterschiedlichen Positionen eines Schachtes be erntet 3 Pools x 5 Sch chte x 2 Experimente 30 Arrays Mit den normalisierten Werten wurden Induktionsfaktoren gebildet Als Kontrollexpressionswert diente der Median der normalisierten Werte aus Schacht WG320 90 Ergebnisse Tabelle 3 10 Metabolische Kategorien des DNA Arrays Kategorie Anzahl Array Proben Sekund rstoffwechsel Mitglieder der Glukosyltransferasen AG PD Dr Sch ffner 126 ESTs und genomisch regenerierte Proben mit gr tenteils bekannter Funktion Dr Ernst 23 Cytochrom P450 Monooxygenasen AG PD Dr Sch ffner 66 Zellul re Transportproteine 108 Oxidativer Stre 31 Glutathion S Transferasen 54 Glutathion Peroxidasen 11 Gluthation Reduktasen 3 Prim rs
38. Ma gebend f r die biologische Wirkung ist also der ber lappungsbereich zwischen dem Spektrum der einfallenden Strahlung und dem Wir kungsspektrum bzw der BWF Eine kleine Verschiebung der kurzwelligen Kante des Bestrahlungspektrums kann damit einen berproportionalen Anstieg der biologischen Wirkung zur Folge haben Wirkungsspektren und BWFs sind die Voraussetzung f r die Bewertung der UV Wirkung auf Pflanzen daher gibt es verschiedene Ans tze zur Ermittlung solcher Funktionen Holmes 1997 1 2 1 Monochromatische Wirkungsspektroskopie Der naheliegendste Ansatz ist die monochromatische Wirkungsspektroskopie Mit einem sehr schmalen in der Wellenl nge ver nderlichen Spektralband erzeugt z B mit einer starken Lampe mit vorgeschaltetem Monochromator oder mit einem Satz sehr schmalbandiger Interferenzfilter wird die infrage kommende m glichst gut quantifizierbare pflanzliche Reaktion spektral abgetastet Diese relativ einfache Me thode entspricht zwar nicht den nat rlichen Gegebenheiten bei denen stets das ge samte Sonnenspektrum pr sent ist aber sie liefert immerhin ein grobe Vorstellung von der spektralen Empfindlichkeit der biochemischen Reaktion und es lassen sich unter Umst nden sogar bestimmte Strahlungsrezeptoren identifizieren Briggs amp Hu ala 1999 Als Beispiel seien hier das Wirkungsspektrum f r DNA Sch den in Luzer ne Quaite et al 1992 und das Wirkungsspektrum f r die stomatale ffnung bei Vi
39. Prof Strack Halle Indol 3 acetat B glukosyltransferase SGT At4g15480 Prof Strack Halle Indol 3 acetat B glukosyltransferase SGT At4g15490 Prof Strack Halle Indol 3 acetat B glukosyltransferase SGT At4g15500 Prof Strack Halle Sinapoylglukose Malattransferase SMT At2g22990 aus genomischer DNA BIOP Ergebnisse 91 Die hohe Anzahl an Messwerten war f r eine statistische Absicherung der Daten n tig weil UV Langzeitbestrahlungen erheblich niedrigere UV B Induktionen hervorru fen als transiente Expositionen Bei einer chronischen UV B Behandlung n hert sich der mRNA Gehalt auf ein physiologisch relevantes Niveau hingegen ist bei Kurzzeitexperimenten nach wenigen Stunden UV B Applikation oft bei relativ niedri gen UV Bestrahlungsst rken bei vielen UV responsiven Genen ein Maximum an mRNA transkribiert Dieses hohe Niveau wird jedoch nicht dauerhaft synthetisiert sondern es f llt rasch wieder ab Schoenbohm et al 2000 3 8 1 Statistische berpr fung UV B responsiver Gene Die statistische berpr fung der Induktionsfaktoren wurde durch eine einfaktorielle Varianzananlyse bewerkstelligt Der Test sollte zeigen ob zwischen den verschiede nen Spektralkomponenten WG295 360 der UV Strahlung signifikante Unterschiede bestanden Die Vorgehensweise f r die Berechnung der p Werte f r die detektierten Gene erfolgte nach Precht amp Kraft 1993 Die deutlichsten UV B Wirkungen waren offensichtlich in de
40. Ter Horst J Van Schaik H P De Boer A Mol J amp Koes R 1999 A cytochrome b5 is required for full activity of flavonoid 3 5 hydroxylase a cytochrome P450 involved in the formation of blue flower colors Proc Natl Acad Sci USA 96 778 783 Literaturverzeichnis 131 DeLucia E H Day T A amp Vogelmann T C 1992 Ultraviolet B and visible light penetration into needles of two species of subalpine conifers during foliar development Plant Cell Environ 15 921 929 Doebley J 1993 Genetics development and plant evolution Curr Opin Genet Dev 3 865 872 Dudler R amp Hertig C 1992 Structure of an mdr like gene from Arabidopsis thaliana evolutionary implications J Biol Chem 267 5882 5888 Eckardt N A 2001 Some like it with nitriles a nitrile specifying protein linked to herbivore feeding behavior in Arabidopsis Plant Cell 13 2565 2568 Eisen M B amp Brown P O 1999 DNA arrays for analysis of gene expression Meth Enzymol 303 179 204 Eisen M B Spellman P T Brown P O amp Botstein D 1998 Cluster analysis and display of ge nome wide expression patterns Proc Natl Acad Sci USA 25 14863 14868 Eisinger W Swartz T E Bogomolni R A amp Taiz L 2000 The ultraviolet action spectrum for stomatal opening in broad bean Plant Physiol 122 99 105 Emery P Stanewsky R Helfrich F rster C Emery Le M Hall J C amp Rosbash M 2000 Dro
41. beobachten ist Surplus et al 1998 Die UV B Induktion der CHS wird aber nicht dieser allgemei nen Stressantwort zugeschrieben Mackerness 2001 Der oxidative Status der Zelle ist aber trotzdem in der fr hen Phase der CHS Aktivierung notwendig da PcGST7 das bei oxidativem Stress aktiviert wird im fr hen Stadium der CHS Induktion coexprimiert vorgefunden wurde Frohnmeyer et al 1997 Dieser Sachverhalt widerlegt aber nicht die These dass die Induktion der CHS durch einen UV B Rezeptor angesteuert wird da die alleinige Aktivierung Ober reaktive Sauerstoff spezies nicht in Frage kommt Mackerness 2001 1 3 2 3 Transkriptionsfaktoren Die molekularen Grundlagen der Lichtregulation des Sekund rmetabolismus durch Transkriptionsfaktoren werden momentan erst ansatzweise verstanden Als Modell system hat sich in der Vergangenheit die Promotorregion der CHS in Petersilie her auskristallisiert Christie amp Jenkins 1996 Feinbaum amp Ausubel 1988 Jenkins et al 2001 Leyva et al 1995 Loyall et al 2000 Oberholzer et al 2000 Shimizu et al 1999 Wade et al 2001 In diesen befinden sich molekulare Lichtschalter Darunter sind DNA Sequenzmotive zu verstehen an denen cis regulatorische Elemente bin den In Petersilie ist der Promotor in zwei Einheiten eingeteilt Beide bestehen jeweils aus zwei Boxen die bindetypische Sequenzmotive aufweisen Wirksam ist vor allem die erste Einheit und zwar dann wenn die Pflanze mi
42. ber UV B Sch den sind als dikotyle Arten Caldwell amp Flint 1994 14 Einleitung Landwirtschaftliche Kulturen k nnen durch zus tzliches UV B in ihrem Ertrag negativ beeinflusst werden Fiscus amp Booker 1995 Bestimmte Sorten von Sojapflanzen brachten nach erh hter UV B Bestrahlung im Freiland deutlich niedrigere Ertr ge Andere Variet ten von Soja hingegen zeigten sich dadurch in ihrer Ertragskraft un beeinflusst Teramura amp Murali 1986 Indirekte Auswirkungen erh hter UV B Strahlung sind in der Ver nderung des Se kund rstoffwechsels zu sehen Sowohl in Sonnensimulatoren als auch im Freiland konnte gezeigt werden dass erh hte UV B Strahlung einen Anstieg an Flavonoiden und verwandten Verbindungen ausl st Die Entwicklung der Stoffe gilt als Schutz gegen ber UV B Strahlung da die Molek le im UV Bereich absorbieren Erh hter Gehalt an Flavonoiden in der Epidermis wie in Abbildung 1 3 dargestellt verleihen der Pflanze einen besseren Schutz gegen ber UV B Einwirkung Caldwell et al 1983 Tevini et al 1991 Die UV B bedingte Erh hung von Flavonoiden und ande ren Klassen sekund rer Pflanzeninhaltsstoffe kann indirekte Auswirkungen auf die Anf lligkeit gegen ber Pathogenen und Pflanzenfressern haben Berenbaum 1988 In der Vergangenheit konnte in Citrus jambhiri gezeigt werden dass die UV B induzierte Erh hung der Konzentration an Psoralen sekund r die Widerstandsf hig keit gegen ber Bakterieninfektionen
43. eine gewisse Zeit ben tigt um Absorpti onsmolek le f r den Strahlungsschutz zu bilden In Spirodela oligorrhiza dauert die Synthese der Schutzpigmente etwa zwei Tage Die deutlichen Reaktionen von Ge nen des antioxidativen Stoffwechsels am ersten Tag sind somit nur Ursache man gelnder Schutzm glichkeiten die im Laufe der Zeit durch die Akkumulation von phe nolischen Inhaltsstoffen abgeschw cht werden Jansen et al 1996 Die zirkadiane Rhythmik der Pflanze unterliegt ebenfalls einer Art Akklimatisierung Nahezu alle mRNA Spezies des Phenylpropanoidstoffwechsels zeigen eine zirkadia nen Tagesrhytmik dessen Amplitute am zweiten Tag abnimmt Harmer et al 2000 Diskussion 115 Ob dieser Rhythmus nach mehreren Tagen weiter abnimmt ist nicht bekannt Es deutet sich aber an dass der zirkadianen Regulation einer Akklimatisierung unter liegt deren Ausma berdies von PAR abh ngig sein k nnte Es ist vorstellbar dass die Akklimatisierung der zellul ren Rhythmik ebenfalls mit der Zeitverz gerung der Absorptionsausstattung der Pflanze in Zusammenhang steht Insgesamt wurde in den Simulationsexperimenten eine Strahlungsperiode von 14 Tagen UV B eingehalten Die in Kapitel 3 dargestellten Ergebnisse k nnen als Integ ral der Bestrahlungszeit angesehen werden F r die zeitliche Entwicklung von Schutzmolek len ist zu vermuten dass bei der H H Variante im fr heren Stadium der Bestrahlung durch die begleitende hohe Bestrahlungsst rke
44. en experimentel len Aufwands sehr beschr nkt bleibt in dieser Arbeit waren es 20 Varianten wurde die Modellierung mit m glichst einfachen Funktionen in folgenden Schritten versucht a Die spektrale Abh ngigkeit wurde als Exponentialfunktion angesetzt siehe Ib dah et al 2002 b s A exp k 1 4 wobei Ao 300 nm die allgemein verwendete Normierungswellenl nge ist Die loga rithmische Steigung k war dabei der Fit Parameter c Die Bestrahlung Hga wird damit H p dt dd s A E At d s A H A wobei E A t und H A t die spektrale Bestrahlungsstarke bzw Bestrahlung der je weiligen Versuchsvariante darstellen d Die Dosisfunktion W Hga setzt die biologisch wirksame UV Dosis mit den ge messenen und reduzierten Quercetingehalten quy in Beziehung Wenn ein line Ergebnisse 87 arer Zusammenhang mit der Proportionalit tskonstanten w angenommen wird so ist duy W H p w Ha Die Proportionalitatskonstante w ist dabei der zweite E Parameter Die Modellie rung lief auf die Sch tzung der logarithmischen Steigung k der BWF und des Dosis faktors w hinaus wobei der Bereich dieser Parameter aus Plausibilit tsgr nden ein geschr nkt werden konnte ke lum 500um und nmol cm nmol cm we 0 01 m 43 2J m Die numerische Analyse basierte auf einem Zufallssampling mit 10 Parameters tzen und einer anschlie enden Optimierung der Parameter mit dem SOLVER Makro vo
45. gebundenen Sonden wurden bei 68 C f r 30 min von der Membran entfernt Als L sung wurde Strip EZ RT Kit verwendet siehe Hersteller angaben Um die vollst ndige Entfernung der Sonden zu kontrollieren wurden die Membranen erneut mit einem Image Screen f r 15 h exponiert Waren die Filter frei von radioaktiven Signalen konnten sie mit cDNA hybridisiert werden 2 3 1 3 CDNA Hybridisierung F r die Hybridisierung wird die mRNA mittels des viralen Enzyms Reverse Transkrip tase in cDNA bersetzt und dabei radioaktiv markiertes Adenosintriphosphat a 33P dATP eingebaut Die markierte cDNA wird dann in einer Hybridisierung eingesetzt Die Markierung der cDNA erfolgte mit untenstehenden Reaktionsansatz der h here RNA Mengen enthielt als dies vom Hersteller empfohlen wurde vgl Handbuch Strip EZ RT Ambion und Johannes et al 1999 Die Pr hybridisierung der Memb ranen erfolgte bei 68 C f r 4 h 11 ul total RNA 10 ug 2 ul Oligo dT Primer 13 ul Gesamtvolumen in DEPC H2Opbidest 5 min bei 65 C 2 3 min auf Eis 2 ul 10 x RT Puffer 2 ul dNTPs 1 ul MuLV Reverse Transkriptase 200 U ul 48 Material und Methoden Zuletzt wurden 4 ul a P dATP gt 2500 uCi mmol 40 uCi Amersham Pharmacia dazupipettiert Die CDNA Synthese fand bei 40 C f r 1 h 30 min im Thermoblock statt Die CDNA Probe wurde vor der S ulentrennung mit 1 ul 0 5 M EDTA pH 8 0 und 77 ul H3Opidest auf 100 ul Gesamtvolumen aufgef llt Die
46. gene expression in transgenic parsley cell cultures Plant J 20 109 117 Fujiyama K Takemura H Shinmyo A Okada H amp Takano M 1990 Genomic DNA structure of two horseradish peroxidase encoding genes Gene 89 163 169 Gachotte D amp Benveniste P 1996 Cloning of a glutathione peroxydase homolog in Arabidopsis thaliana Plant Physiol 110 713 Ghetti F Herrmann H Hader D P amp Seidlitz H K 1999 Spectral dependence of the inhibition of photosynthesis under simulated global radiation in the unicellular green alga Dunaliella salina J Photochem Photobiol 48 166 173 132 Literaturverzeichnis Glombitza S 2002 Expressionsprofile von ABC Transportern in Arabidopsis thaliana Reaktionen auf Xenobiotika im Kontext mit anderen Genfamilien der Entgiftung Dissertation LMU M n chen Glombitza S Dubuis P H Thulke O Welzl G Bover L G tz M Affenzeller M Geist B Hehn A Asnaghi C Ernst D Seidlitz H K Martinoia E Werck Reichhart D Mauch F amp Sch ffner A R 2004 Crosstalk and differential response to abiotic and biotic stressors re flected at the transcriptional level of effector genes from secondary metabolism Plant Mol Biol 54 817 835 Goidin D Mamessier A Staquet M J Schmitt D amp Berthier Vergnes O 2001 Ribosomal 18S RNA prevails over glyceraldeyde 3 phosphate dehydrogenase and actin genes as internal standard for quanti
47. her charakterisiert werden Das Modell f r den zeitlichen Ver lauf der UV B abh ngigen Synthese der Quercetinderivate mit verschiedenen PAR Bestrahlungsstarken sowie die daf r notwendige Genaktivitat der Flavonoid 3 Hydroxylase sind in Abbildung 4 2 dargestellt Ve a k e Ly e 2 13 14 1 10 11 1 t d Quercetinkonzentration F3 H UV B Induktion Abbildung 4 2 Postulierter Verlauf der Akkumulation an Quercetinderivaten und der Genaktivitat der F3 H Die durchgezogenen Linien stellen die t gliche Akkumulation der Quercetinderivate dar Die gestri chelten Linien entsprechen der Genaktivitat der F3 H Rote Linien sind dem Szenario H H zugeordnet w hrend die blauen Linien das Szenario L H andeuten 4 6 Gene des oxidativen Stresses Die deutlich ausgepr gten UV B Induktionen von 28 Genen des zellul ren Detoxifi kationssystems in der Simulation L H lassen r ckschlie en dass die Aktivierung die ser Gene ebenfalls in Zusammenhang mit der verminderten epidermalen Abschir mung steht Die Akkumulation der Quercetinderivate war im Szenario L H schw cher ausgepr gt als in H H was die Transmission von UV B erh hen k nnte und wahr scheinlich im Mesophyligewebe die Induktion dieser Gene bewirkt Die Pflanze be findet sich hier in einem Zustand in dem sie auf die Anwesenheit des Entsorgungs Diskussion 119 systems zelltoxischer Produkte angewiesen ist w hrend bei der Strahlungsvariante mit h herem PAR Hintergru
48. hung an Flavonoiden findet zu Diskussion 113 diesem Zeitpunkt vor allem in der vierten Blattetage statt Lois 1994 Das j ngste Blatt scheint demnach dasjenige zu sein das die ausgepr gteste Reaktion auf UV B Einwirkung zeigt Lois 1994 Eigene Quercetinderivat Analysen aus unterschiedli chen Blattregionen liefern gute Hinweise daf r dass die Verbindungen ebenfalls in den j ngeren Bl ttern der oberen Blattetagen h her konzentriert vorliegen als in den lteren Bl ttern Das Wirkungsspektrum aus Abbildung 4 1 resultiert somit aus dem Mittelwert der Akkumulation an Quercetinderivaten verschiedener Blattetagen 4 3 Interaktion von UV B Strahlung und PAR Die Abh ngigkeit des Grundschutzes vor UV B Strahlung von PAR ist grunds tzlich seit l ngerem bekannt Caldwell amp Flint 1994 Mirecki amp Teramura 1984 Die neuen Versuche unterscheiden sich jedoch von vielen Studien der Vergangenheit die sich mit dem Einfluss des sichtbaren Strahlungsbereiches auf die UV B Sch digung durch verschiedene PAR Stufen und anschlie ender UV B Exposition besch ftigten In den eigenen Experimenten hingegen gingen die Spektralkomponenten des sicht baren und des UV Bereiches immer parallel einher Die PAR Abstufung wurde dar berhinaus in vielen Studien unrealistisch gew hlt So konnte z B gezeigt werden dass bei einer PAR von 250 umol m s im Vergleich zu einer niedrigeren mit 100 umol m s PAR die UV B Absorptionskapazitat in der P
49. ist ein Dihydroflavonol Akkumulator die keine rotf rbenden Pelargonidine bildet und da durch farblose Bl tenbl tter besitzt Durch Einbringen des AT Gens Dihydroquerce tin 4 reduktase DFR aus Zea mays konnten die Transformanten Pelargonidine her stellen und die Bl ten der Pflanzen waren wieder rot Meyer et al 1987 Neben der roten Verf rbung konnte die Gelbf rbung auf die Flavonoide der Bl ten bl tter zur ckgef hrt werden Die F rbung wird chemisch durch die enolische Tau tomerform der acetylierten Flavonol 7 O Glykoside bewirkt Zudem scheint f r die gelbe Farbgebung die cytoplasmatische Lokalisation dieser Strukturen von Bedeu tung zu sein Markham et al 2001 Neben den Farbcharakteristiken besitzen die Flavonoide f r die Pflanze die essen tielle Funktion des UV Schutzes Die Molek le nehmen die Strahlung im Bereich von 270 340 nm auf und geben die Energie gr tenteils als W rme wieder ab Sheahan amp Rechnitz 1999 Die Flavonoide absorbieren im Spektralbereich der UV Strahlung und beeintr chtigen damit nicht die photosynthetische Energieumsetzung der Chlo rophylle Lois 1994 Ryan et al 2001 Stapleton amp Walbot 1994 Stephan 1996 Die Biosynthese ist in Abbildung 1 6 dargestellt Die Enzyme welche in Kapitel 3 auf der Ebene der Genexpression untersucht werden sind in Arabidopsis thaliana be reits bestens biochemisch charakterisiert Tabelle 1 1 fasst die verwendeten Se 24 Einleitung quenzen
50. kann ist nach derzeitigem Wissensstand nicht eindeutig beantwortet da ein gro er Teil der UV B Studien in Klimakammern oder in Gew chsh usern durchgef hrt wurde Die Simulationszeit war bei sehr vielen Stu dien k rzer als eine Woche und sie sind demzufolge f r eine realistische Einsch t zung des langfristigen Risikos erh hter bodennaher UV B Strahlung unzureichend Caldwell amp Flint 1994 Voraussetzung f r eine gesicherte Bewertung des Risikos einer dauerhaft erh hten UV B Belastung w ren Risikostudien ber einen Zeitraum von mehreren Jahrzehnten kologisch ausgerichtete Untersuchungen ber eine l nger anhaltende Periode hinweg zeigten bisher dass die zunehmende UV B Bestrahlung einen Einfluss auf die Artenzusammensetzung haben kann Caldwell amp Flint 1994 Zahlreiche Studien weisen darauf hin dass UV B Strahlung Auswirkungen auf die Entwicklung und das Wachstum der Pflanze hat Bornman amp Teramura 1993 Cald well amp Flint 1993 Jansen 1998 Jordan 1996 Tevini 1993 wobei die Reaktionen zwischen verschiedenen Pflanzenarten sehr unterschiedlich sein k nnen Einige morphologische Auswirkungen sind bei vielen Pflanzenarten sehr hnlich wie z B eine verst rkte Kutikula oder eine verkleinerte Blattfl che Barnes et al 1987 Gro Be Unterschiede gegen ber UV B Strahlung k nnen hingegen zwischen mono und dikotylen Pflanzenarten festgestellt werden wobei monokotyle Pflanzen generell re sistenter gegen
51. miniaturisierte Techniken erlauben sogar die genomweite Analyse von bis zu 20000 Transkripten In den letzten Jahren haben sich zahlreiche verschiedene Methoden auf diesem Gebiet entwickelt Das Prinzip ist aber bei allen Verfahren das gleiche Eisen amp Brown 1999 Die Gensequenzen werden auf eine Matrix gebracht die aus Glas oder Nylon besteht Sie werden mit Hilfe von Robotern an eine definierte Position gebracht Durch anschlie ende Hybridisierung von mar kierten Transkripten von unterschiedlichen Behandlungen k nnen Expressionsunter schiede mit Hilfe von Bildverarbeitungsprogrammen gemessen werden Im Rahmen dieser Arbeit wurden bekannte Stressgene aus Arabidopsis thaliana ausgew hlt Insgesamt wurde eine Kollektion von 579 Genen zusammengestellt Diese umfasste Gene aus dem Sekund rmetabolismus des antioxidativen Stoffwechsels der Photo synthese Transportproteine die Genfamilie der Glutathion S Transferasen zellregu latorische Sequenzen Sequenzen aus Multigenfamilien z B Transportproteine Glukosyltransferasen CYT P450 Monooxygenasen Glutathion S Transferasen sind in Arabidopsis thaliana z T sehr homolog W rde die kodierende homologe Region eines Gens auf die Matrix aufgetragen hatte das zur Folge dass Hybridisierungs signale zwischen diesen Genen nicht mehr zuzuordnen waren An Expressionsstu dien mit CYT P450 Monooxygenasen ist gezeigt worden dass zwischen zwei Genen ab einer Homologie von 85 Kreuzhybridisierung s
52. signifikant p lt 0 001 82 Ergebnisse 3 5 Expression der Chalkonsynthase Die CHS ist im Vergleich zu den Flavonoidbiosynthese Genen der RT PCR Messungen in der Pflanze st rker exprimiert Deshalb konnten die mRNAs der Chal konsynthase mittels Northern Blotting untersucht werden Die Transkripte der Chal konsynthase zeigten sich in den Experimenten in ihrer UV B Induzierbarkeit deutlich von der PAR abh ngig Die Tendenzen der UV B Induzierbarkeit der CHS waren sehr hnlich zu den Ergebnissen von CHI FHT F3 H und FLS Als Sonde wurde ein EST verwendet Abbildung 3 15 Auf eine Zusammenf hrung der beiden Experi mente des Szenarios M H wurde analog zu den RT PCR Ergebnissen verzichtet V320 und V323 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 H H Hi i M H V320 25S TED m M H V323 P ep L H 25S Free Ths Abbildung 3 15 Spekirale Abh ngigkeit der Transkription der Chalkonsynthase nach 14 d UV Exposition Die Abbildung zeigt die Expression der Chalkonsynthase At5g13930 F r den Northern Blott wurden 20 ug Gesamt DNA auf jede Spur aufgetragen Um eine gleichm ige Beladung der Membran sicher zustellen ist die 25S rRNA in einem mit Ethidiumbromid versetzten Agarosegel photografiert worden Ergebnisse 83 3 6 PAR Abh ngigkeit f r die Akkumulation an Quercetinderivaten Neben der statistischen Absicherung der spektralen Abh ngigkeit der Wirkung von UV Strahlung auf die Akkumulation von Quercetinderivaten musste zus t
53. synthase in cell cul tures Plant Cell 12 1939 1950 Lu Y P Li Z S Drozdowicz Y M H rtensteiner S Martinoia E amp Rea P A 1998 AtMRP2 an Arabidopsis ATP binding cassette transporter able to transport glutathione S conjugate and chlorophyll catabolites functional comparisons with AtMRP1 Plant Cell 10 267 282 Mackerness S A H 2000 Plant response to ultraviolet B UV B 280 320 nm stress what are the key regulators J Plant Growth Reg 32 27 39 Mackerness S A H John C F Jordan B and Thomas B 2001 Early signaling components in ultraviolet B response distinct roles for different reactive oxygen species and nitric oxide FEBS Lett 489 237 242 136 Literaturverzeichnis Mackerness S A H Surplus S L Blake P John C F Buchanan Wollaston V Jordan B R amp Thomas B 1999 Ultraviolet B induced stress and changes in gene expression in Arabidop sis thaliana role of siganalling pathways controlled by jasmonic acid ethylene and reactive oxygen species Plant Cell Environ 22 1413 1423 Markham K R Gould K S amp Ryan K G 2001 Cytoplasmic accumulation of flavonoids in flower petals and its relevance to yellow flower colouration Phytochemistry 58 403 413 McCloud E S amp Berenbaum M 1994 Stratospheric ozone depletion an plant insect interactions effects of UVB radiation on foliage quality of Citrus jambhiri for Trichoplusia ni J Chem Ecol
54. trankribierten Genen und n steht f r die Anzahl an wiederholten Arrays aus einer UV Bestrahlungsvariante Das Intervall m wurde so lange ausgeweitet bis 95 der schwach exprimierten Gene f r die Berechnung von o herangezogen waren MW 20 MW 20 Material und Methoden 65 0 12 0 11 T 0 10 fs u MVAREST G i 0 09 T Gen var 1 gt Pi Gen 2 var 1 var 2 2 E 0 08 amp Gen3 var 1 var 2 var 3 3 gt 0 07 u Genn var 1 var 2 var n n 0 06 0 05 0 04 O 100 150 200 250 LFNR Abbildung 2 9 berpr fung der Anwendbarkeit eines additiven Fehlermodells Die Abbildung zeigt den Fehler aus WG295 von 250 Genen in Abh ngigkeit ihrer Signalst rke F r jedes der zehn hybridisierten Arrays wurde RNA aus unterschiedlichem biologischen Material gewon nen Die detektierten Gene sind gegen ihre mittlere Varianz aufgetragen MVAREST blaue Kurve Das Fehlermodell setzt eine Einteilung der MVAREST in drei Bereiche voraus schwarze Kurve 1 Approximativ konstanter Bereich 2 Substantielle Ver nderung der Varianz 3 Lineare Zunahme der Varianz mit Zunahme der Signalst rke F r die Sch tzung des Parameters S wurde analog zu der von o vorgegangen Die Daten wurden vor der Berechnung logarithmiert Die Berechnung erfolgte nach m m S n m Y s ni 1 ni Zahl der Wiederholungen jedes Gens 10 n ni i 1 i 1 Nach dieser Berechn
55. und die entsprechenden Literaturstellen zusammen in denen die Funktionalit t der Gene gezeigt wurde Die Flavonoide werden durch UV B Strahlung vorwiegend in der oberen Epidermis und im Palisadenparenchym gebildet Kolb et al 2001 F r den UV Schutz sind haupts chlich glykosidische Flavonole von Bedeutung Sheahan A Rechnitz 1999 Veit amp Pauli 1999 Die Notwendigkeit der Flavonoide als UV B Schutz konnte an zahlreichen tt Mutanten transparent testa in Arabidopsis thaliana gezeigt werden Die tt Loci f h ren bei allen Mutanten wegen fehlender Pigmentierung zu gelblichen Samen Koorneef 1990 Koorneef amp Stam 1992 tt4 kann keine Chalkonsynthase herstel len und tt5 produziert keine funktionst chtige Chalkonisomerase Die Mutanten sind gegen ber UV B Strahlung wesentlich empfindlicher als Wildtypen Li et al 1993 Neben diesen beiden Mutanten sind in Arabidopsis thaliana tt3 tt6 tt7 tt8 und seit neuestem 115 bekannt tt3 tr gt eine Mutation in der Dihydroflavonolrekuktase tt6 eine in der Flavanon 3 Hydroxylase und tt7 ist defizient in der Flavonoid 3 Hydroxylase Peer et al 2001 Die Insertionsmutante tt8 kann keine Dihydroflavo nolrekuktase transkribieren Bei dieser Mutante handelt es sich aber nicht um einen direkten Funktionsverlust des Enzyms sondern es fehlt dort ein essentieller MYC Transkriptionsfaktor der die DFR Expression regelt vgl Kapitel 1 3 2 3 Bei tt15 ist die genaue Funktion nicht bekannt
56. v 8 T 3 4000 j T E S 3000 T E a amp 2000 E S ZS E 1000 e H 0 295 305 320 335 360 Lutein a Carotin Derivate 2 S 5 4000 4000 g 3 gt E D 5 3000 E 3000 S S S T e I Sg amp 2000 I R amp 2000 g 3 d _ 5 SZ 1000 1000 o ei e 295 305 320 335 360 295 305 320 335 360 B Carotene Violaxanthin E gt 4000 2 4000 3 8 2 2 3000 amp 3000 J Fy S S E 2000 amp 2000 E 5 S S Sg S S e Sg S _ 1000 1000 i 8 E 5 5 e ee ENT A a I l 295 305 320 335 360 295 305 320 335 360 Anteraxanthin Neoxanthin UV spektrale Abh ngigkeit der Konzentrationen der Pigmente des Photosystems II Die grauen Balken entsprechen den Messwerten des Versuches V320 PAR 1000 umol m s schwarze Balken repr sentieren die des Versuches V318 PAR 1300 umol m s Die HPLC Analytik wurde in Zusammenarbeit mit der Abteilung Experimentelle Umweltsimulation durchgef hrt Anhang C Akkumulation der Quercetinderivate in Abh ngigkeit der PAR 153 Anhang C Akkumulation der Quercetinderivate in Abh ngigkeit der PAR Epar Hmol m s 1310 1030 540 1270 Basisszenario H H M H L
57. verst rkte McCloud et al 1992 Ein weiterer indirekter Einfluss den UV B Strahlung auf die Pflanzen Pathogen Interaktion aus ben kann konnte an der Entwicklungszeit von Insekten festgestellt werden Ern hr ten sich Raupen von UV B behandelten Pflanzen so entwickelten sich diese lang samer als Raupen von Pflanzen mit moderater UV B Behandlung McCloud amp Be renbaum 1994 Verantwortlich daf r sind phenolische Inhaltsstoffe die bei den Raupen die Verdaulichkeit des Pflanzenmaterials herabsetzten und dadurch eine verlangsamte Entwicklung verursachten berdies wirken manche phenolische Ver bindungen im Insekt hormonell und beeinflussen dadurch die Entwicklungszeit eben falls negativ Neben der insektiziden Wirkung konnte an Zuckerr be und Cucumis sativus bedingt durch eine UV B induzierte Erh hung phenolischer Verbindungen die Widerstandskraft gegen ber Pilzen verbessert werden Orth et al 1990 Pana gopoulos et al 1992 Einleitung 15 Verst rkte _ Wachsschicht Reflektion E id Antioxidative UV B ee Substanzen bn biosynthese ea Absorption AG N Ver nderungen E 9 x N DNA Reparatur UV B i der zellul ren SE en ISA Kutikula N ei Obere Epidermis A Ver nderungen des Ver nderungen der Palisadenparenchym g z SR P y Zellmetabolismus Genexpression Mesophyll Schlie ung der Stomata Abbildung 1 3 UV B Sch digungen und Schutzma nahmen im Blattgewebe abge ndert nach Jordan 1
58. visible light J Exp Bot 41 1489 1495 Century K S Shapiro A D Repetti P P Dahlbeck D Holub E amp Staskawicz B J 1997 NDR1 a pathogen induced component required for Arabidopsis disease resistance Science 278 1963 1965 Chang S Puryear J amp Cairney J 1993 A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees Plant Mol Biol Reptr 11 113 116 Chapman S 1930 A theory of upper atomospheric ozone Mem Roy Met Soc 3 103 125 Chapple C S Vogt T Ellis B E amp Somerville C R 1992 An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway Plant Cell 4 1413 1424 Cheng W Chao G amp Singh K B 1996 The promoter of a H2O2 inducible Arabidopsis glutathione S transferase gene contains closley linked OBF and OBP1 binding sites Plant J 10 955 966 Christie J M amp Jenkins G 1996 Distinct UV B and UV A blue light signal transduction pathways induce chalcone synthase gene expression in Arabdiopsis cells Plant Cell 8 1555 1567 Chun L Kawakami A amp Christopher D A 2001 Phytochrome A mediates blue light and UV A dependent chloroplast gene transcription in green leaves Plant Physiol 125 1957 1966 Colebatch G Kloska S Trevaskis B Freund S Altmann T amp Udvardi M K 2002 Novel as pects of symbiotic nitrogen fixation uncovered by transcript profiling with cDNA arrays Mol Plant Microbe Interact 15
59. zu bewerten Ein Wirkungsspektrum kann hierbei allgemein als Strah lungsdosimetrie angesehen werden bei der das Ausma der Antwort dadurch getes tet wird dass die Flussraten an Photonen bekannter Wellenl ngen variiert werden Die biochemische Antwort resultiert hierbei aus den Komponenten UV Spektral s A UV Dosisabh ngigkeit W Hga und dem Synthesebeitrag der Energiemenge an Photonen des sichtbaren Spektralbereiches qpar Holmes 1997 Die Ergebnisse der Schirmpigmentanalysen der vier Basisszenarien zeigten dass unter den verschiedenen Behandlungsbedingungen die Konzentrationen an Kaempferol und Sinapins urederivaten nur geringe Unterschiede aufwiesen die au erdem nicht statistisch signifikant waren Hingegen konnten f r die Konzentratio nen an Quercetinderivaten klare Abh ngigkeiten beobachtet werden die sich wie folgt zusammenfassen lassen vgl Anhang C und D a Zunahme des Gehalts mit zunehmender PAR Bestrahlungsst rke Die Abwei chung von Variante WG295 M H k nnen auf die relativ gro e statistische Streu ung dieser Werte zur ckgef hrt werden b Zunahme des Gehalts mit zunehmendem Anteil der kurzwelligen UV Komponenten Die Gehalte unter der Filtervariante WG295 hoher UV B Anteil waren mindestens um den Faktor Drei h her als diejenigen unter WG360 ohne UV B c In einem Zusatzexperiment mit der PAR Variante H und Schott Filtern WG335 und 360 sowie GG400 und 420 wurde gezeigt dass die UV A Komponenten
60. zwi schen 360 und 400 nm keinen Einfluss auf den Gehalt an Inhaltsstoffen haben und demnach nur noch der PAR Anteil von Bedeutung ist Dies wird auch durch die geringen Unterschiede zwischen den Werten der Filtervarianten WG335 und WG360 deutlich Abbildung 3 16 Ergebnisse 85 Die Gehalte an Sinapoylglukose zeigten tendenziell einen hnlichen Verlauf als die der Quercetinderivate hnlich den Kaempferol Daten waren die Fehlerbalken f r eine Modellierung der Strahlungsabh ngigkeit zu gro Des weiteren zeigten Sina poylmalat und ein drittes Sinapins urederivat keine erkennbare UV Abh ngigkeit d 200 o 2 2 gt ro ET 100 E WG335 WG360 GG400 GG420 Abbildung 3 16 Akkumulation der Quercetinderivate mit abnehmenden UV Anteilen PAR 1300 pmol m s Mit GG420 ist die UV Strahlung vollst ndig ausgeschlossen worden Unter GG400 WG360 und WG335 wurden abnehmend k rzerwelligere UV A Komponenten appliziert 5 Analysefehler in der HPLC Mit den Quercetinderivatkonzentrationen wird im Folgenden die spektrale Abh ngig keit der Produktbildung mathematisch beschrieben und eine geeignete biologische Wichtungsfunktion abgeleitet BWF Dazu wurde von der Gesamtkonzentration Ost der durch PAR Strahlung bedingte Gehalt qpar abgezogen Zur Parametrisierung von qrar wurden mit den Quercetingehalten unter den Filtervarianten WG360 eine linea ren Regressionsanalys
61. 006 1 7 1 4 0 6 transporter EST At2934660 113 AtMRP2 0 0146 2 2 1 7 1 0 Hypothetical protein 3 UTR Probe _ At1g30420 76 AtMRP12 0 0000 1 6 1 4 0 8 AtMRP1 EST At1930400 75 AtMRP1 Putative ABC 0 0019 1 3 1 3 0 8 transporter EST AT4904770 68 AtNAP1 Putative ABC 0 0143 1 7 1 4 0 8 transporter 3 UTR Probe At2936910 64 AtMDR1 ABC transporter like 0 0046 2 6 1 8 1 1 protein 3 UTR Probe At3953480 64 AtPDR9 ABC transporter 0 0030 1 3 1 3 0 8 homolog PnATH like EST AT5g60790 53 AtGCN1 0 0120 1 6 1 3 0 9 P glycoprotein putative EST AT3g28860 53 AtMDR11 ABC transporter protein 0 0057 1 5 1 5 1 0 putative 3 UTR Probe At1964550 53 AtGCN3 ABC transport protein 0 0005 1 5 1 2 0 8 like EST AT5g61730 52 AtATH11 ABC transporter 0 0018 2 4 1 4 0 9 homolog PnATH like EST AT5g60790 51 _ AtGCN1 0 0021 1 1 1 2 0 8 Putative protein EST AT4g25450 51 AtNAP8 ABC transporter 0 0018 1 2 1 1 0 8 homolog PnATH like EST AT5g60790 46 AtGCN1 0 0387 1 3 1 3 0 9 P glycoprotein 5 partial EST At3g28344 45 AtMD13 ATP dependent transmembrane 0 0041 1 5 1 1 0 8 transporter putative EST At1951500 45 AtWBC12 Putative ABC 0 0081 1 2 1 1 0 8 transporter EST At2g26910 40 AtPDR4 gelbe Hinterlegung AtGCNT war auf drei unterschiedlichen Positionen auf dem DNA Array vorhanden Referenzen Zellul rer Transport von Glutathion Konjugaten und Flavonoiden At1930420 AtMRPT At1930420 AtMRP12 und At34660 AtMRP2 Klein et al 2000 Muller et al 1
62. 01 Identification of gluco syltransferase genes involved in sinapate metabolism and lignin synthesis in Arabidopsis J Biol Chem 294 4344 4399 Lin C Anmad M Gordon D amp Cashmore A R 1995 Expression of an Arabidopsis cryptochrome gene in transgenic tobacco results in hypersensitivity to blue UV A and green light Proc Natl Acad Sci USA 92 8423 8427 Liu Z Hall J D and Mount D W 2001 Arabidopsis UVH3 gene is homolog of the Saccharomy ces cerevisiae RAD2 and human XPG DNA repair genes Plant J 26 329 338 Liu Z Hossain G S Islas Osuna M A Mitchell D L amp Mount D W 2000 Repair of UV dam age in plants by nucleotide excision repair Arabidopsis UVH1 DNA repair gene is a homolog of Saccharomyces cerevisiae Rad 1 Plant J 21 519 528 Loebler M 1996 An Arabiopsis cDNA Accession No U37697 homologous to glutathione reduc tase PGR96 053 Plant Physiol 111 1353 Lois R 1994 Accumulation of UV absorbing flavonoids induced by UV B radiation in Arabidopsis thaliana L Planta 194 498 503 Long J C amp Jenkins G I 1998 Involvement of plasma membrane redox activity and calcium ho meostasis in the UV B und UV A blue light induction of gene expression in Arabidopsis Plant Cell 10 2977 2086 Loyall L Uchida K Braun S Furuya M amp Frohnmeyer H 2000 Glutathione and a UV light induced glutathione S transferase are involved in signalling to chalcone
63. 10 dm mol s Erben Russ et al 1987 Das Quercetin O Radikal wird dabei generell als Aroxyl radikal bezeichnet Die n tigen Strukturen f r die Radikalentsorgung k nnen am Fla vonolger st an der Position A und 4 durch mesomere Intermediate entstehen Bors et al 1990 Erben Russ et al 1987 Flavonoide bieten ein hohes antioxidatives Po tential wenn sie folgende chemische Strukturen aufweisen Rice Evans et al 1997 3 4 dihydroxylierter B Ring z B Catechin Luteolin und Quercetin 5 7 dihydroxylierter A Ring z B Kaempferol Apigenin und Quercetin 2 3 Doppelbindung in Kombination sowohl mit der 4 Keto als auch der 3 Hydroxygruppe am C Ring Damit diese Struktur vom Radikalpartner Elektro nen delokalisieren kann ist parallel der 3 4 o Dihydroxystruktur am B Ring erforderlich z B Luteolin oder Quercetin Quercetin verf gt demnach ber alle drei notwendigen chemischen Strukturelemen te um Radikale zu detoxifizieren Kaempferol hingegen besitzt keinen o dihydoxylierten B Ring was dessen M glichkeiten als Antioxidans stark eingrenzt Glykosidische Analoga von Quercetin sind jedoch weniger antioxidativ wirksam Rice Evans et al 1997 Dieser Sachverhalt l sst r ckschlie en dass Quercetin in vivo die antioxidative Funktion im Cytoplasma wahrnimmt w hrend den Quercetinde rivaten bei der Entsorgung von Radikalen eine untergeordnete Funktion zukommt Die in der HPLC erfassten Quercetinderivate m s
64. 1350 LI DH w 20 o 0 058 30 1330 LI DH weas o o 26 1260 Oo HI waseo o o 15 1120 JL MH w 3o5 120 0 75 24 990 LI MH was20l 1 0042 22 950 Oo MH weas o o 19 920 O MH Iweseol o o 11 Gen JL MH wGsoS 160 0 86 25 810 JL MH O20 o 0 058 22 790 LI MH weas o o 18 ap Oo MH wee 0 o 11 6o V325 LH wG 295 170 096 15 560 540 0 LH 20920 0 10011 27 1340 pT CAG 0 o 24 1260 LH wessol o o 15 1180 LH wesos 14 10085 19 1280 He 20920 o 10006 20 1350 HE G 0 o 16 1190 LL DL jwesco o o 11 sg Die Bestrahlungsst rken f r die Wiederholungen V325 und V327 w urden nur einmal gemessen Material und Methoden 43 2 2 Pflanzenanzucht Die Bestrahlungsversuche mit Arabidopsis thaliana wurden mit dem genetischen Hin tergrund Columbia Col 0 durchgef hrt Die Samen wurden von der Firma Lehle Seeds bezogen Das gesiebte Bodensubstrat wurde mit 1 16 Volumen Kiessand und dem gleichen Anteil an Quarzsand versetzt und gr ndlich gemischt Die Erde wurde 12 h bei 130 C autoklaviert Der abgek hlte Boden wurde ca 1 cm angedr ckt und erneut eben mit Substrat gef llt und dann nochmals verdichtet Vor Aussaat wurde jedes T pfchen mit 50 ml destilliertem Wasser angegossen Die Aussaat erfolgte mit Hilfe einer abgek hlten 0 1 igen Agarosel sung in der die Arabidopsis Sam
65. 19 726 Reinemer P Prade L Hof P Neuefeind T Huber R Zen R Palme K Schell J Koelln l Bartunik H D amp Bieseler B 1996 Three dimensional structure of glutathione S transferase from Arbidopsis thaliana at 2 2 A resolution structural glutathione S transferases and a novel active site architecture J Mol Biol 255 289 309 Rice Evans C A Miller N J amp Paganga G 1997 Antioxidant properties of phenolic compounds Trends Plant Sci 2 152 159 Rice Evans C A Miller N J amp Paganga G 1996 Structure antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids Free Rad Biol Med 20 933 956 138 Literaturverzeichnis Ries G Buchholz G Frohnmeyer H amp Hohn B 2000 UV damage mediated induction of ho mologous recombination in Arabidopsis is dependent on photosynthetically active radiation Proc Natl Acad Sci USA 97 13425 13429 Ries G Heller W Puchta H Sandermann H Seidlitz H K amp Hohn B 2000 Elevated UV B radiation reduces genome stability in plants Nature 406 98 101 Rocke D M amp Durbin B 2001 A model for measurement error for gene expression arrays J Comp Biol 8 557 569 Romero l Fuertes A Benito M J Malpica J M Leyva A amp Paz Ares J 1998 More than 80 R2R3 MYB regulatory genes in the genome of Arabidopsis thaliana Plant J 14 273 284 Ruegger M Meyer K Cusumano J C amp Chapple C
66. 1986 Die Bedeutung der Hydroxyzimts uren als UV B Schutz konnte in A thaliana durch einen Gendefekt des Enzyms Ferulas ure 5 Hydroxylase demonstriert werden fahT Mutante Pflanzen welche diese Mutation tragen k nnen keine sch tzenden Sina pins ureester bilden und zeigen daher die UV B induzierbare rote Chlorophyllfluo reszenz sehr ausgepr gt Chapple et al 1992 Welcher Stellenwert den Hydroxy zimts uren im Vergleich zu den Flavonoiden f r den UV B Schutz der Pflanze einzu r umen ist kann nicht eindeutig beantwortet werden Es ist jedoch festgestellt wor den dass die Chlorophyllfluoreszenz von fah1 Mutanten h her ist als bei tt4 Mutanten Daraus ist r ckzuschlie en dass Sinapins ureester die UV B Strahlung st rker abschw chen als die Flavonoide Dieser Aussage steht allerdings gegen ber dass die tt4 Mutante eine positive R ckkopplung zu den Hydroxyzimts uren besitzt Li et al 1993 Die niedrigere Chlorophyllfluoreszenz der flavonoiddefizienten Pflan zen d rfte sich demnach durch die erh hte Absorption der indirekt erh hten Hydro xyzimts uren ergeben Der R ckschluss dass Sinapins ureester den besseren UV B Schutz bieten als Flavonoide ist deswegen fragw rdig Stephan 1996 F r die Flavonoide spricht jedoch deren hohe Konzentration in den Bl ttern die bei glykosi dischen Flavonolen um etwa den Faktor Zehn h her liegen als bei den Sinapins u reestern wobei beide chemischen Strukturen etwa die g
67. 1997 Frohnmeyer et al 1999 Als zentraler Regulator hinter PHYA befindet sich das heterodimere G Protein Nach diesem verzweigt sich die Signalkette Ein Ca Calmodulin abh ngiger Weg f hrt zur Aktivierung des CAB Promotors des Photosystems Il Der zweite Weg PHYA abh ngig ist auf zykliches GMP angewiesen cGMP ist f r die Signalweiterleitung zum CHS Promotor erforderlich Die Kaskade f hrt zu einer Erh hung der Anthocya ne und kann als Lichtschutz f r die Pflanze angesehen werden Beide Signalwege sind f r die Biogenese der Chloroplasten notwendig was an dunkel angezogenen phyA Tomaten Mutanten gezeigt werden konnte die nach Belichtung keine Chlo roplasten bildeten und deutlich an den photosynthetischen Redox quivalenten NADP Ferredoxinoxidoreduktase FNR und Cytochrom bsf des Photosystems re duziert waren Wurde extern Ca Calmodulin und cGMP injiziert bildeten die phyA Einleitung 19 Mutanten die Chloroplasten vollst ndig aus Neuhaus et al 1993 Neben der PHYA Antwort ist Ca Calmodulin bei der Regulation der CHS nach UV Bestrahlung involviert Der f r die Induktion der CHS notwendige cytosolische Pool an Ca lonen wird hierbei durch die erh hte Aktivit t von spezifischen Ca ATPasen unter st tzt Long amp Jenkins 1998 Der UV B Strahlung konnte bis heute kein Rezeptor zugeordnet werden Nach bishe rigen experimentellen Erfahrungen wird das UV B Signal an der Plasmamembran aufgenommen Dieses wird da
68. 2 4 dargestellt Die spektralen Bestrahlungsst rken des Simulators aus Tabelle 2 1 wurden mit ei nem Doppelmonochromator System vor Beginn jedes Experiments gemessen Die Wellenl ngenaufl sung und schritte betrugen 1 nm im UV Bereich und 2 nm im sichtbaren Bereich des Spektrums Die Kalibrierungsdaten zur Bestimmung der A0 Material und Methoden spektralen Empfindlichkeit des Detektors wurde von der Physikalisch Technischen Bundesanstalt erhalten W hrend der Expositionszeit wurden PAR UV A und UV B Bestrahlungsst rke fortlaufend berwacht Ibdah et al 2002 UV A VIS IR UV C UV B LV Elter S UV B UV A VIS Abbildung 2 1 GSF Sonnensimulator Das linke Photo zeigt den GSF Sonnensimulator Rechts ist schematisch dargestellt mit welchen Lampen und Strahlungsfiltern dort die einzelnen Spektralanteile des Sonnenspektrums m glichst realistisch nachgestellt wurden Abbildung 2 2 Polychromatisches Bestrahlungsexperiment mit Arabidopsis thaliana Zum oberen Schacht der K vette hin WG295 ist die Absorptionskante der Filter so gew hlt worden dass zunehmend UV Strahlung aus dem kurzwelligen Bereich auf die Pflanzen traf Die Abbildung zeigt Arabidopsis zu Beginn der Bestrahlungsperiode Material und Methoden 41 1e 3 E E S E 1e 2 4 E Je a je KI um uv D S 1e 0 5 oO 5 Ir d o 1e 1 5 x ZS 1e2 260 280 300 320 340 360 380 400 Wellenlange nm
69. 20 525 539 McCloud E S Berenbaum M R amp Tuveson R W 1992 Furanocourmarin content and phototox icity of rough lemon Citrus jambhiri foliage exposed to enhanced ultraviolet B UVB irradia tion J Chem Ecol 18 1125 1137 McGrath J M Terzaghi W B Sridhar P Cashmore A R amp Pichersky E 1992 Sequence of the fourth and fifth Photosystem II type chlorophyll a b binding protein genes of Arabidopsis thaliana and evidence for the presence of a full complement of the extended CAB gene family Plant Mol Biol 19 725 733 McKinley A F amp Diffey B J 1987 A reference action spectrum for ultraviolet induced erythema in human skin In Human exposure to ultraviolet radiation risks and regulations eds W F Pa schier amp B F M Bosnajakovic Elsevier Amsterdam pp 83 86 Meyer P Heidmann l Forkmann G amp Saedler H 1987 A new petunia flower colour generated by transformation of a mutant with a maize gene Nature 330 677 678 Mirecki R M amp Teramura A H 1984 Effects of ultraviolet B on soybean the dependence of plant sensitivity on the photosynthetic photon flux density during and after leaf expansion Plant Physiol 74 475 480 Mizutani M Ohta D amp Sato R 1997 Isolation of a cDNA and a genomic clone encoding cinna mate 4 hydroxylase from Arabidopsis and its expression manner in planta Plant Physiol 113 755 763 Mock H P amp Strack D 1993
70. 20 ml 5 Ammoniumformiat gel st in 98 iger Ameisens ure Der Gradient wurde folgenderma en ausgef hrt 0 5 min 0 B 5 45 min 0 100 B linear 45 48 min 100 B 48 50 min 100 0 B und 50 58 min 0 B Die Detekti on der Verbindungen fand bei einer Wellenl nge von 280 nm Beckman Modell 168 und mit einem Spektrofluorimeter Anregung bei 300 nm Emission bei 400 nm Shi madzu Modell RF530 statt Die folgenden wasserl slichen Phenole wurde durch Vergleich ihrer Retentionszeit und der UV Spektren bestimmt Sinapoylglukose 23 4 min Sinapinderivat unbekannte Struktur 25 5 min Querce tin 3 Glc 6 1 Glc 7Rha 26 6 min Kaempferol 3 Glc 6 gt 1 Glc 7Rha 27 5 min Sinapoylmalat 27 9 min Quercetin 3Glc 7Rha 29 5 min Kaempferol 3Glc 7Rha 31 0 min Quercetin 3 7Rhaz 31 3 min Kaempferol 3 7Rha 33 1 min Material und Methoden 59 2 4 2 HPLC von photosynthetischen Pigmenten Die Analysen der photosynthetischen Pigmente erfolgte in Zusammenabeit mit dem Pigmentanalyselabor der Abteilung Experimentelle Umweltsimulation Die Proben aufbereitung wurde dort gem Siefermann Harms 1988 durchgef hrt 2 5 Expressionsdaten Normalisierung und statistische Aspekte 2 5 1 Normalisierung Die Normalisierung von Arrays ist notwendig um unterschiedliche Hybridisierungen miteinander vergleichen zu k nnen Sie soll die Signalintensit ten verschiedener cDNA Synthesen abgleichen Die bei der Auswertung der Arrays verwend
71. 3 UTR Probe 115 steroIDM Putative cytochrome 0 0364 1 0 1 1 0 5 P450 3 UTR Probe At2922330 114 CYP79B3 Putative cytochrome 0 0037 1 1 1 0 0 5 P450 3 UTR Probe At3g26830 93 CYP71B15 Cytochrome P450 like At4g37320 0 0147 1 9 1 8 1 0 protein 3 UTR Probe 82 CYP81D5 Cytochrome P450 like At4g37370 0 0121 2 0 1 7 1 0 protein 3 UTR Probe 68 CYP81D8 Cinnamate 4 0 0358 1 8 1 6 1 0 hydroxylase 3 UTR Probe At2930490 61 CYP73A5 C4H 0 0066 1 0 1 0 0 6 Putative protein 3 UTR Probe Atig78490 55 CYP708A3 Cytochrome P450 0 0384 1 8 1 8 1 2 putative 3 UTR Probe At3920080 50 CYP705A15 Cytochrome P450 like 0 0372 1 6 1 3 0 9 protein 3 UTR Probe At4937310 41 CYP81H1 0 0265 1 8 1 5 1 1 Cytochrome P450 3 UTR Probe At5g57220 36 CYP81F2 0 0310 2 0 1 5 1 1 Cytochrome P450 3 UTR Probe At5g06900 31 CYP93D1 Cytochrome P450 monooxygenase like 0 0160 2 1 1 4 1 0 protein 3 UTR Probe At4g37400 31 CYP81F3 Referenzen At2g30490 CYP73A5 Mizutani et al 1997 At3g26830 CYP71B15 Zhou et al 1999 At4g12320 CYP706A6 De Vetten et al 1999 144 Anhang A UV B reaktive Gene 2 Zellul re Transportproteine a ABC Transporter ANOVA Induktion Induktion Induktion Funktion Proben Typ Genbanknummer UV B Abk rzung Medianya2es mitUV B UV A ohneUV B UV A Erh hung Medianyc295 wG305 Medianwe320 360 Erniedrigung MRP like ABC 0 0
72. 45 0 773 3 36 n s Sinapoylmalat 1 45 0 282 3 36 n s HO Pigmentkonzentration ist nicht spektralabh ngig im UV Bereich signifikant p lt 0 05 H1 Pigmentkonzentration ist spektralabh ngig im UV Bereich hoch signifikant p lt 0 01 sehr hoch signifikant p lt 0 001 Ergebnisse 77 Q 200 D 2005 al bal 2 2 be N N y 1005 y 100 a x L Dap Bale oO 04 0 O E E A 200 g 200 4 2 2 O b 9 e KH O 100 CO 100 4 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Abbildung 3 9 Spekirale Abhangigkeiten der Gehalte an Quercetin Q und Kaempferolderivaten K L H Links sind die Ergebnisse des Experimentes V325 dargestellt rechts die des Experimentes V327 SinGlc Uno i Mt nmol cm SinMal sinnn En WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 o Abbildung 3 10 Spektrale Abh ngigkeiten der Konzentrationen an Sinapins ureestern SinGlc SinMal L H Das linke Diagramm zeigt die Konzentrationen an Sinapoylglukose und malat des Versuches V325 Das rechte Diagramm zeigt die Ergebnisse des Versuches V327 Mittelwerte und Standardabweichungen der Balken wurden f r V325 mit n 3 und f r V327 mit n 3 berechnet 78 Ergebnisse 3 3 2 Genexpression der Flavonoid biosynthese Die Transkripte der Flavonoidbiosynthese waren bei diesem Versuch durch UV B Strahlung signifikant induziert Die Induktionsfaktoren de
73. 5 Referenzen Glyoxalasen Atig08110 At1953580 und At1906130 Hou et al 1995 Skipsey et al 2000 West wood amp Thornalley 1995 At4g30190 Harper et al 1989 150 Anhang A UV B reaktive Gene 8 Sekund rstoffwechsel ANOVA Induktion Induktion Induktion Funktion Proben Typ Genbanknummer UV B Medianwaass mit UV B UV A ohne UV B UV A Erh hung Medianwaze5 wasos Medianwes20 360 Erniedrigung ei Indole 3 acetate beta 0 0030 1 8 1 5 0 7 glucosyltransferase cDNA AT3g21560 110 0 0007 2 2 1 4 0 8 Chalcone synthase EST At5g13930 66 Putative flavanone 3 0 0136 1 7 1 3 0 8 beta hydroxylase genomisch At4g10490 54 Putative NADPH 0 0004 1 6 1 4 1 0 oxidoreductase EST At1975280 48 0 0284 1 4 1 3 1 0 Chalcone isomerase EST At3g55120 32 Referenzen At3g21560 UGT84A2 Lim et al 2001 At5g13930 CHS Feinbaum amp Ausubel 1988 At1975280 FR Baldridge et al 1998 Paiva et al 1994 At3g55120 CHI Kuittinen amp Aguade 2000 9 DNA Reparatur ANOVA Induktion Induktion Induktion Funktion Proben Typ Genbanknummer UV B Me dianwez95 mitUV B UV A ohneUV B UV A Erh hung Medianwez95 wea0s Medianwe320 360 Erniedrigung 0 0251 1 7 1 6 0 9 6 4 photolyase UVR3 genomisch At3g15620 75 Putative type II CPD 0 0103 1 8 1 7 1 0 photolyase genomisch At1912370 67 Referenzen At8g1
74. 5620 UVR3 Nakajima et al 1997 At1g12370 CPDIl Takahashi et al 2002 10 Pathogenabwehr und Zellregulation ANOVA Induktion Induktion Induktion Funktion Proben Typ Genbanknummer UV B Medianwazs mitUV B UV A ohneUV B UV A Erh hung Medianwe2s5 w6305 Medianwea20 360 Erniedrigung 0 0207 2 1 1 9 0 9 PEARLI 1 EST At4g12480 111 Predicted GPl anchored 0 0345 2 2 1 9 1 1 protein EST At1908500 85 0 0023 1 8 1 6 0 9 Nitrilase 3 EST At3g44320 65 Non race specific disease resistance 0 0004 1 3 1 4 0 87 protein NDR1 EST At3g20600 56 0 0062 1 0 1 0 0 7 Unknown protein EST At1976890 50 0 0240 1 8 1 7 1 1 Putative lectin EST At3g16450 47 Vegetative storage 0 0065 1 2 1 2 0 9 protein Vsp1 EST At5g24780 38 Ubiquitin conjugating 0 0141 1 6 1 3 1 0 enzyme E2 17kD 8 EST AT5g41700 31 Referenzen At5g24780 VSP Utsugi et al 1998 At3g20600 NDRT Century et al 1997 At3g16450 Capella et al 2001 Eckardt 2001 Atlg76890 GmGt 2 O Grady et al 2001 At3g44320 NIT3 Hillebrand et al 1998 At4g12480 PEARLI1 Coupe et al 1993 Anhang A UV B reaktive Gene 151 UV B abregulierte Gene ANOVA Induktion Induktion Induktion Funktion Proben Typ Genbanknummer UV B Medianyaass mitUV B UV A ohneUV B UV A Erh hung Medianya295 wa305 Medianwg320 360 Erniedrigung Atpm24 1 glutathione S 0 0004 0 4 0 5 1 0 transferase 3 UTR At4g02520 55 Putative glutathione S 0 0006
75. 6 KA 2 Q u 4 2 2 0 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 CHI FHT y F3 H y FLS Abbildung 3 5 Spekirale Abhangigkeit der Transkription der Flavonoidbiosynthese Gene nach 14 d UV Exposition V320 74 Ergebnisse 200 200 gt hu 5 2 ZS y 100 A 100 a e N 5 Deg Ai Q 0 o 0 E E D 200 Q 200 oO KZ 2 S D je ke 100 BE O g 100 7 oo ET 0 0 P WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Abbildung 3 6 Spektrale Abh ngigkeiten der Gehalte an Quercetin Q und Kaempferolderivaten K M H Links sind die Ergebnisse des Experimentes V320 dargestellt rechts die des Experimentes V323 4 40 2 H Q 20 204 Po a a 10 10 4 em Bail Al Ka BE mm al E 40 40 4 _ 9 _ 30 ba 20 204 Wu Ka i i i i i u E H WII WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Abbildung 3 7 Spektrale Abh ngigkeiten der Konzentrationen an Sinapins ureestern SinGlc SinMal M H Das linke Diagramm zeigt die Konzentrationen an Sinapoylglukose und malat des Versuches V320 Das rechte Diagramm zeigt die Ergebnisse des Versuches V323 Mittelwerte und Standardabweichungen der Balken wurden f r V320 mit n 10 und f r V323 mit n 3 berechnet Ergebnisse 75 rel Expression WG295 WG305 WG320 WG335 WG360
76. 95 WG305 WG320 WG335 WG360 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Ergebnisse 99 rel Expression zu WG320 rel Expression zu WG320 rel Expression zu WG320 rel Expression zu WG320 Glutathion S Transferase At1g10370 AtGSTU17 CYP706A6 Zimtsaure 4 Hydroxylase C4H ABC Tansporter At2g30490 CYP73A5 At1g30400 AtMRP1 5 Transmembran Protein Vermutliches Cytochrom P450 At4g00430 PIP1 4 At2g22330 CYP79B3 Glutathion S Transferase ahnliches Protein At5g17220 AtGSTF12 0 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 WW Bezeichnung aus MIPG Datenbank Proteinvergleich ergab jedoch 61 Homologie zu einem Myro sinase bindenden Protein 100 Ergebnisse A Vermutliche Glukosyltransferase Indol 3 acetat B glukosyltransferase At2g23210 UGT84B3P At3g21560 UGT84A2 N Ki rel Expression zu WG320 o WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Vermutliche Flavanon 3 Hydroxylase At4g10490 FHT e LH e HH HL rel Expression zu WG320 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Abbildung 3 21 Orginaldaten aus Node 78 3 8 5 2 Orginaldaten aus Node 73 Superoxiddismutase Glutathion S Transferase ahnliches At4g25100 FeSOD Protein At1978380 4 4 o N E oO N 3 S E 2 a 2 2 a x u 1 1 0 5 PERLI1 Se At4g12480 a4 4 E 33 3 c 2 E 2 1 i g WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Ergebnisse 101 5
77. 994 Tommasini et al 1996 Tommasini et al 1993 Tommasini et al 1998 Zellul re Translokation von Phospholipiden At2936910 AtMDRT At3928860 AtMDRT1T und At3928344 AtMDR13 Dudler amp Hertig 1992 Sanchez Fernandez et al 2001 Sidler et al 1998 Xenobiotika Entgiftung At2g26910 AtPDR4 und At3953480 AtPDR9 Balzi amp Goffeau 1994 Smart amp Flemings 1996 Anhang A UV B reaktive Gene 145 Phylogenetische Einordung der UV B reaktiven ABC Transporter PDR1 port d PDR7 WG PDR6 WBC18 WBZ17 wBci9 WC W WCS WB WP WBC Gae wees WBC 21 MRP15 j WBC23 WBC28 MRP4 MRP10 ATM2 ATM1 ATH15 MDPS MH ut Phylogenetische Einordnung UV B reaktiver ABC Transporter gelb eingekreist Abbildung enth lt nur Sequenzen mit trans membraner Dom ne Die UV B responsiven Transportproteine AtGCN1 AtGCN3 AtNAP1 und AtNAP8 besitzen aber keine solche Dom ne und sind deshalb nicht im Stammbaum enthalten Glombitza 2002 Sanchez Fernandez et al 2001 146 Anhang A UV B reaktive Gene 2 Zellul re Transportproteine b Membrankanalproteine ANOVA Induktion Induktion Induktion Funktion Proben Typ Genbanknummer UV B Nomenklatur Medianyaass mitUV B UV A ohneUV B UV A Erh hung Johanson et al Medianwa295wa305 Medianwesz0 360 Erniedrigung 2001 0 0000 2 0 1 8 0 8 Transmembrane protein 3 UTR At4g00430 144
78. 996 Die Abbildung zeigt die physiologischen Ver nderungen nach UV B Einwirkung innerhalb eines Blatt querschnittes Die UV B Abschirmung durch die Flavonoide findet haupts chlich in der Epidermis und im Palisadenparenchym statt Im Zusammenhang mit einer durch UV B verursachten Erh hung des Sekund rme tabolismus innerhalb von Pflanzenpopulationen konnte ferner gezeigt werden dass eine UV B bedingte Konzentrationserh hung von Verbindungen der Shikimatbio synthese Auswirkungen auf die Nahrungsmittelqualitat hat Weiterhin k nnen erh hte Gehalte an Sekund rstoffen die Zersetzung von Pflanzenmaterial verz gern was dazu f hren kann dass sich die botanische Zusammensetzung in einer Pflanzenpo pulation ver ndert Caldwell et al 1989 kologische Folgen erh hter UV B Belastung auf Pflanzengemeinschaften sind also in erster Linie indirekter Natur obgleich in j ngster Zeit gezeigt werden konnte dass in Arabidopsis thaliana eine direkte Korrelation von UV B bedingten Mutationen und UV B Dosis besteht Ries et al 2000 berdies konnte in dieser Studie gezeigt werden dass die Mutationsrate der Folgegeneration verst rkt wurde was bedeuten 16 Einleitung k nnte dass dramatische Folgen erh hter UV B Strahlung erst im Laufe der n chs ten Generationen auftreten werden 1 3 2 Biochemische Regulation des Sekund rstoffwechsels 1 3 2 1 Signalaufnahme Photorezeptoren Damit Strahlung auf Pflanzen wirken kann muss zwischen de
79. Abbildung 3 12 dargestellt Sinapins ureester Die Sinapins ureester waren bei diesem Szenario nicht spektralabh ngig Abbildung 3 13 Die statistische Auswertung der Pigmentanalyse des Basisszenarios H L ist in der Tabelle 3 7 zusammengefasst Tabelle 3 7 Varianzanalyse der Pigmentmessungen in Pflanzen an dem Szenario H L Kaempferolderivate Quercetinderivate 0 867 Sinapoylglukose 2 03 0 166 3 48 n s Sinapoylmalat 4 63 0 023 3 48 H0 Pigmentkonzentration ist nicht spektralabh ngig im UV Bereich signifikant p lt 0 05 H1 Pigmentkonzentration ist spektralabh ngig im UV Bereich hoch signifikant p lt 0 01 sehr hoch signifikant p lt 0 001 80 Ergebnisse EE 200 bal 2 2 o 9 gt X 100 4 X 100 a e i S WW Ee 0 0 O E D 200 5 D 200 bal 2 2 o F 4 10 O 100 l O 00 ae _ Tit WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 o i WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Abbildung 3 12 Spektrale Abh ngigkeiten der Gehalte an Quercetin Q und Kaempferolderivaten K H L Links sind die Ergebnisse des Experimentes V322 dargestellt rechts die des Experimentes V324 2 O E Ka a 10 H em 0 O E 40 7 o Kal 0 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 SinGlc SinMal Di 30 4 20 e 0 40 30 4 20 4 So 0 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 A
80. B W 1996 A potato cDNA encodes a homologue of mammal ian multidrug resistance P glycoprotein Plant Mol Biol 31 683 687 Waterworth W M Jiang Q West C E Nikaido M amp Bray C M 2002 Characterization of Arabidopsis photolyase enzymes and analysis of their role in protection from ultraviolet radia tion J Exp Bot 53 1005 1015 Weber S Kay C W M M gling H M bius K Hitomi K amp Todo T 2002 Photoactivation of the flavin cofactor in Xenopus laeves 6 4 photolyase observation of a transient tyrosyl radical by time resolved electron paramagnetic resonance Proc Natl Acad Sci USA 99 1319 1322 Weig A Deswarte C amp Chrispeels M J 1997 The major intrinsic protein family of Arabidopsis has 23 members that form three distinct groups with functional aquaporins in each group Plant Physiol 114 1347 1357 Literaturverzeichnis 141 Weisshaar B Armstrong G A Block A Da Costa e Silva amp Hohlbrock K 1991 Light induc ible and constitutively expressed DNA binding proteins recognizing a plant promotor element with functional relevance in light responsiveness EMBO J 10 1777 1786 Westhoff P Jeske H J rgens G Kloppstech K amp Link G 1996 Molekulare Entwicklungsbiolo gie Vom Gen zur Pflanze Georg Thieme Verlag Stuttgart Westwood M E amp Thornalley P J 1995 Molecular characteristics of methylglyoxal modified bo vine and human serum alb
81. CR Produkte als auch dem Abgleich ver schiedener Signalintensit ten die durch unterschiedliche DNA Mengen bedingt wa ren Die Normalisierung unterteilte sich in zwei Bereiche 60 Material und Methoden Interne Normalisierung Abgleich unterschiedlicher CDNA Markierungsreaktionen Vollst ndige Normalisierung Abgleich verschiedener DNA Mengen eines Spots Interne Normalisierung Mit der internen Normalisierung wurde berpr ft ob bei der CDNA Hybridisierung ein gemessener Punkt S mindestens 50 h her lag als der dazugeh rige Hintergrund wert LB War dies nicht der Fall wurde das Gen als nicht detektiert betrachtet Ein gemessenes Signal GV lie t sich demnach mit Si LB wenn S gt LB 1 5 war GVi a ansonsten 0 und N LB GVmw 1 siehe c definieren LB war dabei der jeweilige Hintergrundwert eines Subgrids S waren die Rohsignalintensit ten der Gene die diesem Hintergrundwert zugeordnet wurden je weils zw lf Signalwerte von sechs verschiedenen Genen Abbildung 2 8 GV uw war die durchschnittliche Signalintensit t eines detektierten Gens auf dem Array Diese lie sich nach GC GVw I_ l b GE Lav berechnen GC entsprach der Anzahl an detektierten Spots Ein intern normalisier tes cCDNA Signal N erhielt man durch N GV EN c N 1 bedeutete dass das gemessene Gen dem Durchschnitt aller Signalintensit ten der detektierten Spots entsprach Ein nichtgemesse
82. CR aus genomischer DNA Mullis amp Faloona 1987 51 2 3 2 10 Quantitative Real Time POR 222444ssnnnnnnnennnennnnnnnnnnnn 53 2 4 Biochemische Meth denassasinsesetenhe ee 58 2 4 1 HPLC phenolischer Inhaltsstoffe AAA 58 2 4 2 HPLC von photosynthetischen Pigmenten sen 59 2 5 Expressionsdaten Normalisierung und statistische Aspekte 59 2 5 1 Normallsier ng ayesu2esaresresea ee 59 2 5 2 Problembehandlung bei fehlenden Mesewerten 22 gt 61 E NEE 63 JERGEBNISSE soei EN E EAEE E E E EE S 67 3 1 Hoch PAR OCI UY RE ee 69 SN Dale elle Late 69 3 1 2 Genexpression der Flavonoidbiosvnthese sn 71 3 2 Mittel PAR Hoch UV BIN Hassan 72 Ore Een De elle Lut 72 3 2 2 Genexpression der Flavonoidbiosvnthese nenn 73 3 3 Niedrig PAR Hoch UV BIL 75 3 3 1 OCMUIZDIGINGMIC E 76 3 3 2 Genexpression der Flavonoidbiosvnthese nenn 78 3 4 Hoch PAR Niedrig UV B Crile cisco ci es es cee he ce eas ea ee 79 3 4 1 Sch tzpigme E 79 3 4 2 Genexpression der Flavonoidbiosvnthese nennen 81 3 5 Expression der Chalk hsynithasesa nsiee ei 82 3 6 PAR Abh ngigkeit f r die Akkumulation an Quercetinderivaten 83 3 7 Wirkungsspektrum f r die Akkumulation an Quercetinderivaten 84 3 8 Transktiplomanalyse a EE 89 3 8 1 Statistische berpr fung UV B responsiver Gene s s seseseeieiseeeere 91 3 8 2 Induzierte Gene Probleme in Folgeanalysen nn 92
83. Die Primer hatten eine L nge zwischen 19 25 Nukleotiden 500 400 300 ARn 200 100 Ge 8S Ci gdes CT k zielgen CT gtzieigen 100 O 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 Zyklus Abbildung 2 6 Relative Expressionsver nderung eines Gens In der quantitativen PCR wurde der Zyklus bestimmt bis zu dem die linearen Bedingungen der expo nentiellen Amplifikation ihre G ltigkeit hatten Durch Abgleich einer zellul ren endogenen Kontrolle erfolgte ein Ausgleich unterschiedlicher Gesamt RNA Mengen und verschiedener Effizienzen in der cDNA Synthese Sind die endogenen Kontrollen wie die rote und blaue Kurve in der Abbildung zeigt in ihrem CT Wert ann hernd gleich bedeuteten vier Zyklen Unterschied von behandelter und unbe handelter Probe gr ne und gelbe Kurve eine Erh hung der Transkription des untersuchten Gens um den Faktor 16 2 Ein Reaktionsansatz bestand aus 10x Quantitect Puffer 0 75 ul 10 uM Primer a 0 75 ul 10 uM Primer b und H2Obidest Das Gesamtvolumen einer Reaktion betrug 25 ul Das einzusetzende Volumen an cDNA des Zielgens war aus dem Vorlauf zu bestimmen Es war so zu w hlen dass die CT Werte in einem Bereich von 20 30 lagen F r die 78S rRNA wurde 1 ul cDNA in einer Reaktion eingesetzt Das PCR Programm am TaqMan begann f r 15 min mit einem 95 C Aktivierungsschritt Hot sart Polymerase Im Anschluss folgten 45 Zyklen mit 94 C f r 15 sec 58
84. Energetics of uridine 5 diphosphoglucose hydroxy cinnamic acid acyl glucotransferase reaction Phytochemistry 32 575 579 Molina M J amp Rowland F S 1974 Stratospheric sink for chlorofluoromethanes chlorine atom catatlysed destruction of ozone Nature 249 810 Muller M Meijer C Zaman G J R Borst P Scheper R J Mulder N H De Vries E G E amp Jansen P L M 1994 Overexpression of the gene encoding the multidrug resistance asso ciated protein results in increased ATP dependent glutathione S conjugate transport Proc Natl Acad Sci USA 91 13033 13037 Mullis K B amp Faloona F A 1987 Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase chain reac tion Meth Enzymol 155 335 350 Nakajima S Sugiyama M Iwai S Hitomi K Otoshi E Kim S T Jiang C Z Todo T Britt A B amp Yamamoto K 1997 Cloning and characterization of a gene UVR3 rquired for photorepair of 6 4 photoproducts in Arabidopsis thaliana Nucl Acid Res 26 638 644 Neuhaus G Bowler C Kern R amp Chua N H 1993 Calcium calmodulin dependent and independent phytochrome signal transduction pathways Cell 73 937 952 Nielsen H B amp Knudsen S 2002 Avoiding cross hybridization by choosing nonredundant targets on cDNA arrays Bioinf Appl Note 18 321 322 Ninu L Ahmad M Miarelli C Cashmore A R amp Giuliano G 1999 Cryptochrome 1 controls tomato development in r
85. Ertr ge f hren kann Fiscus amp Booker 1995 Proteine in der Thylakoidmembran des Photosystems Il zeigen sich durch UV B Strahlung be sonders negativ beeinflussbar Jordan et al 1991 Das Photosystem Il ist ein hochmolekularer Protein Pigment Komplex in der Thylakoidmembran an dem der Transfer der freigesetzten Elektronen von H20 entlang eines elektrochemischen Gra dienten l uft um schlie lich im PSI NADP zu reduzieren UV B Strahlung st rt diesen Vorgang durch die Degradierung der D1 und D2 Proteine Jansen et al 1996 Die Neusynthese turn over der Proteine tritt aber sehr schnell ein und es wird angenommen dass die de novo Synthese Teil eines Reparatursystems ist der f r die Aufrechterhaltung der Funktion des PSII notwendig ist Aro et al 1993 UV B bedingte Repression des D1 D2 Komplexes ist generell begleitet von einer ernied rigten O Freisetzung und einer erh hten Chlorophylifluoreszenz Weiterhin hat UV Strahlung Einfluss auf die oxidierenden und reduzierenden Prozesse im PS Il Unter diese Kategorie fallen vor allem redoxaktive Tyrosine Z und D Proteine die UV B Chromophore Qa und Qg und das manganhaltige Reaktionszentrum des wasser spaltenden Komplexes im PSII Vass et al 1996 UV B Strahlung f hrt im PSII zur Erniedrigung der Chlorophylle Xanthine und der chlorophylibindenden Proteine Des weiteren konnte eine erniedrigte Aktivit t der RUBISCO und eine absinkende Konzentration der l slichen Prot
86. Fla vonol und Sinapins urederivate Diese liegen in den Bl ttern in sehr hohen Konzent rationen vor und absorbieren spezifisch im UV Bereich Stephan 1996 Veit amp Pauli 1999 Weiterhin sind sie gr tenteils in der Epidermis lokalisiert und zwar in gel ster Form W Heller unver ffentlicht und k nnen dadurch das darunter liegende Gewe Einleitung 23 be vor UV Einwirkung abschirmen Aus diesem Sachverhalt heraus konzentriert sich die Analytik der Schutzpigmente in Kapitel 3 auf diese beiden Verbindungsklassen In den nachfolgenden Kapiteln 1 3 3 1 1 3 3 2 werden experimentelle Details aus UV Studien der Vergangenheit vorgestellt die den Flavonole Flavonoide und auch den Estern der Sinapins ure eine essentielle Funktion bei der UV Abschirmung zu geschrieben haben Die Funktion der Anthocyane zur Abschirmung von Strahlung wird in Kapitel 1 3 3 3 er rtert Diese sind nah verwandt zu den Flavonolen und sind in der Pflanze eben falls in vergleichsweise hohen Konzentrationen vorhanden 1 3 3 1 UV Abschirmung duch Flavonoide Das Interesse an Flavonoiden lag in der Vergangenheit prim r an deren farbgeben den Eigenschaften f r die Bl ten Heller amp Forkmann 1988 Meyer et al 1987 In den 80er Jahren bestand gro es Interesse daran durch gezieltes Einbringen von Genen des Flavonoidstoffwechsels die Farbgebung der Bl tenbl tter zu manipulie ren Erstmals ist das bei der Petunia Mutante RLOT gelungen Diese Pflanze
87. Gene 149 6 Ethylenstoffwechsel Induktion Induktion Induktion Proben Abk rzung Funktion Proben Typ UV B Medianwaass mitUV B UV A ohneUV B UV A Erh hung Medianwaz95 wes0s Medianwea20 360 Erniedrigung 1 Aminocyclopropane 1 carboxylate 2 8 1 9 1 2 ACS 5 synthase ACS5 genomisch 64 1 Aminocyclopropane 1 carboxylate 2 0 1 6 1 1 ACS 2 synthase ACC2 genomisch 53 1 4 1 3 0 9 ERS2 Putative ethylene receptor ERS2 EST 49 1 Aminocyclopropane 1 carboxylate 1 6 1 5 1 1 ACS 1 synthase like protein genomisch 4 Referenzen At3g61510 ACST Liang et al 1995 At1901480 ACS2 Liang et al 1996 Yamasaki et al 2000 At5g65800 ACS5 Vogel et al 1998 7 Primarstoffwechsel ANOVA Induktion Induktion Induktion Funktion Proben Typ Genbanknummer UV B Medianyazos mitUV B UV A ohneUV B UV A Erh hung Medianwaz9s wasos Medianwes20 360 Erniedrigung 0 0017 1 4 1 6 0 9 Glyoxalase I putative 3 UTR At1908110 74 0 0368 1 6 1 5 0 9 Glyoxalase Il 3 UTR At1g53580 66 Unknown protein similar to chloroplast omega 6 fatty acid desaturase fad6 0 0009 1 5 1 5 0 9 EST At3g12120 66 Glyoxalase Il isozyme 0 0455 1 6 1 6 1 0 like protein 3 UTR At1906130 56 Succinate dehydrogenase iron 0 0043 1 7 1 5 0 9 protein subunit putative EST At3g27380 69 H transporting ATPase type 2 plasma 0 0295 1 7 1 5 1 0 membrane EST At4g30190 44 H transporting ATP synthase beta chain mitochondrial like 0 0079 1 3 1 0 0 8 protein EST At5g08670 3
88. H H L Spektrum i ue L 7 _ WG295 5 ech i I R WG305 To a aL E 40 4 L E c o w 200 2 D 160 4 xe 120 4 S gt d WG320 Selen ar aE O 40 4 Ss gt Cc az c 0 200 E 160 4 5 120 4 N WG335 80 4 dot 5 Ka JE a ale WG360 Die Balken entsprechen den Gesamt Mittelwerten der Konzentrationen an Querce tinderivaten beider Experimente eines Basisszenarios mit den dazugeh rigen Stan dardabweichungen n 2x3 154 Angang D Akkumulation von Sinapoylglukose in Abh ngigkeit der PAR Anhang D Akkumulation von Sinapoylglukose in Abh ngigkeit der PAR Epar mom e 1310 1030 540 1270 Basisszenario HIH MH L H H L Spektrum al M WG295 T aa H WG305 oO dees E 10 4 E T z m KA 50 O x gt 40 4 D gt O 30 4 S gt WG320 Se e 10 74 alle bal 0 SS Ke 50 e T N 30 4 g WG335 x de A WG360 Die Balken entsprechen den Gesamt Mittelwerten der Konzentrationen an Sina poylglukose beider Experimente eines Basisszenarios mit den dazugeh rigen Stan dardabweichungen n 2 x 3 Danksagung 155 Danksagung Folgenden Personen danke ich herzlich f r die Unt
89. Hydroxylase genomisch At4g10490 Node 73 Superoxiddismutase FeSOD EST At4g25100 Glutathion S Transferase ahnliches Protein S UTR Probe Atig 8380 Vermutliche Glukosyltransferase S UTR Probe At2g15490 PEARLI EST At4g12480 Unbekanntes Protein Chlorophylikatabolismus genomisch At4g37000 Vermutliche Glyoxalase S UTR Probe At1908110 Hypothetisches Protein S UTR Probe Atig30420 Cytochrom P450 ahnliches Protein S UTR Probe At4g37320 Glyoxalase Il lsoenzym hnliches Protein S UTR Probe Atig06130 Abbildung 3 20 Clusteranalyse der Genexpressionswerte der Szenarien L H H H und HI L Die Abbildung zeigt Node 78 und Node 73 Die Rotintensitat visualisiert das AusmaB der Induktion durch UV B Strahlung Die gr ne Farbe zeigt an dass die Gene in ihrer Expression reprimiert sind im Vergleich zur Kontrolle aus WG320 F r die m glichen Funktionen der Transkripte siehe Text 98 Ergebnisse 3 8 5 1 Orginaldaten aus Node 78 Salzstress induziertes Tonoplasten Vermutlicher ABC Transporter protein At3g26520 TIP1 2 At2g36910 AtMDR1 rel Expression zu WG320 rel Expression zu WG320 rel Expression zu WG320 rel Expression zu WG320 Cytochrom P450 ahnliches Protein Cytochrom P450 ahnliches Protein At2g45560 CYP76C1 At1913090 CYP71B28 Glutathionreduktase cytosolisch Glukosyltransferase ahnliches Protein At3g24170 GSH RED2 At4g14100 UGT75C1 Aquaporin Plasmamembran Protein 1B At2g45960 WG2
90. Karlsruhe Desoxynukleotide dATP dTTP dCTP dGTP MBI Fermentas St Leon Rot Diethylpolycarbonat DEPC SIGMA Aldrich Chemie Steinheim Dimethylformamid Merck Darmstadt Dithiothritol DTT Invitrogen Life Technologies Karlsruhe Dodecylsulfat Na Salz SDS SERVA Heidelberg Ethanol Merck Darmstadt Ethidiumbromid SIGMA Aldrich Chemie Steinheim Ethylendiamintetraessigsaure Dinatrium SERVA Heidelberg Ficoll Type 400 Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Formaldehyd Fluka Chemie Buchs Formamid Fluka Chemie Buchs Glycerol SIGMA Aldrich Chemie Steinheim Hexadecyltrimethylammoniumbromide CTAB SIGMA Aldrich Chemie Steinheim 34 Material und Methoden Isoamylalkohol Merck DgaA Darmstadt Isopropanol 2 Propanol Merck Darmstadt Isopropyl D Thiogalaktopyranosid SIGMA Aldrich Chemie Steinheim IPTG Lithiumclorid SIGMA Aldrich Chemie Steinheim Methanol Merck Darmstadt MgCl 6GH2O Merck Darmstadt MgSO SIGMA Aldrich Chemie Steinheim Morpholinopropansulfons ure MOPS SERVA Heidelberg Na3Citrat 2H2O United States Biological USA Natriumchlorid Merck Darmstadt Oligo dT Invitrogen Life Technologies Karlsruhe pAW109 RNA Applied Biosystems Foster City CA USA Polyvinylpyrrolidon PVP 360 MW 360 000 SIGMA Aldrich Chemie Stein
91. Lehrstuhl f r Phytopathologie Die spektrale Abh ngigkeit der Wirkung von UV induzierten Reaktionen in Arabidopsis thaliana Michael G tz Vollst ndiger Abdruck der von der Fakult t Wissenschaftszentrum Weihenstephan f r Ern hrung Landnutzung und Umwelt der Technischen Universit t M nchen zur Erlangung eines akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften Dr rer nat genehmigten Dissertation Vorsitzender Univ Prof Dr rer nat Gerhard Wenzel Pr fer der Dissertation 1 Priv Doz Dr rer nat Christian Langebartels 2 Univ Prof Dr rer nat Gert Forkmann Die Dissertation wurde am 11 05 2004 bei der Technischen Universit t M nchen eingereicht und durch die Fakult t Wissenschaftszentrum Weihenstephan f r Ern h rung Landnutzung und Umwelt am 09 09 2004 angenommen INHALTSVERZEICHNIS SEINKEITUNG een 7 1 1 Stratosph rischer Ee le EE 7 1 2 Spektrale Abh ngigkeit der Wirkung von UN Girablung 7 1 2 1 Monochromatische Wirkungsspektroskopie sssssseenessssessrerrernenssesrree 10 1 2 2 Polychromatische Wirkungsspektroskopie ssssssssenensssessrernrnrressserrene 10 1 3 Wirkung von UV Strahlung auf Pilanzen nennen 13 1 3 1 kologische Auswirkungen 13 1 3 2 Biochemische Regulation des Sekund rstoffwechsels 16 1 3 2 1 Signalaufnahme PhotoreZeptoren nennen 16 1 3 2 2 5ignaltkansduktions ass 18 EC TranskriptionsfaktoreN E 20 1 3 3 UV Abschirmung du
92. Opidest aufgenommen und dann in Nunclon OmniTray transferiert Die Kon zentration der gereinigten PCR Produkte lag in einem Bereich zwischen 200 350 ng ul Ein Aliquot von 2 ul wurde auf einem 1 5 igen Agarosegel kontrolliert Mit dem Microgrid II Roboter wurden die PCR Produkte auf Membranen bertragen Hybond N 15 mm x 73 mm Dazu wurde ein Stempel mit 400 um Nadeldurch messer verwendet Dieser spotete je bertragung ca 20 nl Fl ssigkeit Jedes PCR Produkt wurde zehnmal gestempelt was einer Fl ssigkeitsmenge von 200 nl und einer DNA Menge von 40 70 ng Spot entsprach Das Spoting Muster ist in der Abbildung 2 8 zu sehen 2 3 1 2 T7 Referenzhybridisierung Die beladenen Membranen wurden durch UV cross linking 120 mJ fixiert Im An schluss wurden sie je f nf Minuten in 0 4 M NaOH 0 5 M Tris 1 5 M NaCl pH 7 5 und 2x SSC gegeben F nf Membranen wurden mit 50 ml frisch hergestellter Hybri disierungsl sung in eine Schale gegeben Die Pr hybridisierungszeit betrug 4 h Die Pr hybridisierungstemperatur war in einem Wasserbad unter leichtem Sch tteln auf 37 C einzustellen Das Oligonukleotid T7 5 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3 konnte mit einer T4 Polynukleotidkinase MBI Fermentas am 5 Ende radioaktiv markiert werden F r eine Membran wurde ein Reaktionsansatz mit 0 5 ul Enzym 10 U ul 1 25 ul 10 uM T7 Oligonukleotid 0 625 ul 10x Puffer for forward reaction 1 ul y P ATP 2500 uCi mmol
93. PIP1 4 Salt stress induced tonoplast intrinsic 0 0065 1 2 1 6 0 8 protein 3 UTR At3g26520 105 TIP1 2 Aquaporin plasma membrane intrinsic 0 0133 1 3 1 1 0 6 protein 1B 3 UTR At2g45960 95 PIP1 2 Aquaporin plasma membrane intrinsic 0 0157 2 0 2 0 1 1 protein 2C 3 UTR At2g37180 87 PIP2 3 Plasma membrane 0 0394 1 5 1 4 0 8 intrinsic protein 2a 3 UTR At3g53420 66 PIP2 1 0 0268 2 2 1 8 1 1 Unknown protein 3 UTR At5g18290 65 SIP1 2 Aquaporin plasma membrane intrinsic 0 0285 2 1 1 8 1 1 protein 2B 3 UTR At2g37170 60 PIP2 2 0 0053 2 4 1 6 1 0 Hypothetical protein 3 UTR At1g31880 56 NIP3 1 Plasma membrane 0 0003 1 0 1 0 0 7 intrinsic protein 1a 3 UTR At3g61430 48 PIP1 1 Putative aquaporin 0 0291 0 9 1 2 D water channel protein 3 UTR At2g39010 44 PIP2 6 Membrane channel like 0 0091 1 3 1 1 0 7 protein 3 UTR At4g17340 44 TIP2 2 Putative delta tonoplast 0 0137 1 8 1 5 1 1 integral protein 3 UTR At1952180 43 Pseudogen 0 0139 1 8 1 6 1 1 Putative protein 3 UTR At1901620 42 PIP1 3 Referenzen At4g00430 PIP1 4 Kinoshita et al 1994 Stammbaum Einordnung UV B reaktiver Kanalproteine Johanson et al 2001 SIP1 2 NIPs NIPS 1 gt NP31 NIP1 1 NIP1 2 NIP2 1 NIP4 1 NIP4 2 NIP7 1 IS opaa TIP3 1 TIP3 2 TIP1 1 TIPs 0 05 changes
94. Pflanzen un ter Variation des Verh ltnisses von UV B zu PAR fehlten bisher Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit bestand darin erstmals mit Arabidopsis thaliana kologisch relevante UV Szenarien mit Hilfe polychromatischer Experimente durch zuf hren um dadurch komplexe Interaktionsmuster von UV B UV A und PAR Bestrahlung sowohl auf Transkript als auch auf der Metabolitebene des Schutzpig mentstoffwechselweges aufzuzeigen Dar berhinaus sollte die Genexpression mit Hilfe eines DNA Arrays unter den verschiedenen Bestrahlungsmodalit ten unter sucht werden 32 Material und Methoden 2 Material und Methoden Ger te Analysenwaage 0 00001 g Sartorius AG G ttingen Ausschwingzentrifuge Hettich Hettich Tuttlingen Autoklav 5075 EL Tuttnauer New York USA Dioden Array Detektor Modell 168 Beckman Coulter GmbH Unterschlei heim Drehofen zur radioaktiven Hybridisierung Uniequip Martinsried Eppendorf Zentrifuge 5415C Eppendorf Hamburg FLA 3000 FUJI Photo Film Co LTD Japan Gelelektrophorese Kammern PeqLab Erlangen Heizblock Bachofer GmbH Reutlingen Hettich Tischzentrifuge EBA12 Hettich Tuttlingen HPLC Gold Beckman Coulter GmbH Unterschlei heim K hlzentrifuge RC58 Plus Sorvall Kendro Stuttgart Microgrid II BioRobotics UK Mikrodismembrator II Braun Melsungen Mikrotiterplattenzentrifuge 4K15C Sigma GmbH Osterode Radialspe
95. S ulenzentrifugati onsschritte wurden laut Handbuch von MicroSpin Columns G 400 Amersham durchgef hrt Die Messung eines Aliquots ergab eine Aktivit t im Bereich von 250000 350000 cpm ul Die gereinigte Probe wurde bei 100 C f r 2 min im Thermo block denaturiert und auf Eis abgek hlt Die cDNA wurde zu den vorhybridisierten Membranen gegeben Die Hybridisierungzeit betrug ca 20 h bei 68 C Vor Beginn der Waschschritte wurden die L sungen in einem Wasserbad auf 68 C vorgew rmt Das Waschen erfolgte in den Hybridisierungsr hrchen in einem Dreh ofen mit folgenden L sungen 2x SSC 0 1 SDS kurz vorgesp lt 30 min mit 2x SSC 0 1 SDS bei 68 C 30 min mit 0 2x SSC 0 1 SDS bei 68 C Die Membranen wurden wie in Kapitel 2 2 1 2 beschrieben exponiert und digitali siert Das Strippen der cDNA von den Membranen erfolgte gem den Beschreib ungen von Strip EZ RT Amersham Zur berpr fung der vollst ndigen Entfer nung von Signalen wurden die Membranen nochmals exponiert Material und Methoden 49 2 3 2 DNA und RNA Techniken 2 3 2 1 Isolierung genomischer DNA Genomische DNA wurde laut Herstellerangaben mit GenomeStar der Firma Hy baid extrahiert Ausgangsmaterial war homogenisiertes 80 C gek hltes Pflanzen material Die DNA Konzentration wurde photometrisch bestimmt 2 3 2 2 Aufreinigung von PCR Produkten Die Reinigung von PCR Produkten wurde mit Hilfe des QlAquick PCR purification Kit der
96. S Puffer Die Laufzeit betrug 2 h Nach der Elektrophorese wurde die RNA ber Nacht auf eine Nylonmembran trans feriert Hybond N Amersham Dazu musste das Gel auf ein in 20x SSC tau chendes 3 MM Papier gelegt werden Der Rand des Gels war mit Parafilm ausgelegt worden Auf das Gel kamen zwei Schichten 3 MM Papier Die Gr e der Membran und die des Papiers waren der des Gels exakt anzupassen Auf das 3 MM Papier wurden ca 20 cm zugeschnittenes saugf higes Papier glegt Auf dieses wurde f r ein Gel mit 20 x 20 cm Ausma 1 kg Ballast gestellt Die Transferzeit betrug 20 h Nach dieser Zeit wurde der vollst ndige Transfer vom Gel in die Membran unter UV Licht kontrolliert Die RNA wurde bei 120 mJ Bestrahlung UV quervernetzt F r die Hybridisierung wurde der Puffer ULTRAhyb verwendet Ambion Die Pr hybridi sierungszeit betrug 1 h Die Markierung der Sonde ist nach den Herstellerangaben von Ambion durchgef hrt worden Strip EZ DNA Die markierte Sonde konnte von nichteingebauten Nukleotiden laut Herstellerangaben mit MicroSpin Columns S 400 getrennt werden Amersham Die Hybridisierung erfolgte f r 16 h bei 42 C im Hybridisierungsofen Die Membran wurde zuerst mit der Waschl sung 2x SSC 0 1 SDS und im An schluss mit 0 5x SSC 0 1 SDS bei 42 C je 15 min gewaschen Die L sungen wurden im Wasserbad auf 42 C vorgew rmt Die Exposition erfolgte auf einem mit 2x SSC getr nktem 3 MM Papier f r 15 h Bevor die Ima
97. SC salines Natriumcitrat FADH Flavinadenindinukleotid T Thymidin FHT Flavanon 3 Hydroxylase Gen Taq Thermophilus aquaticus FLS Flavonolsynthase Gen TM eingetragene Handelmarke FR rotes Licht 730 nm Tris 2 Amino 2 hydroxymethyl 1 3 propandiol G Guanosin U Enzymaktivitat Gic Glukose Upm Umdrehungen pro Minute GST GlutathionS Transferasen UTR nicht translatierter Bereich eines Gens H M L Hoch Mittel Niedrig UV A Ultraviolette Strahlung 315 400 nm Ho Nullhypothese UV B Ultraviolette Strahlung 280 315 nm H Alternativhypothese UV Ber biologisch gewichtete UV B Bestrahlungsst rke H2Obidest vollentsalztes Wasser UV C Ultraviolette Strahlung 100 280 nm HPLC Hochdruckfl ssigkeitschromatografie UV Strahlung Ulitraviolette Strahlung IPTG lsopropyl B D Thiogalaktopyranosid V Versuch K13 Sonnensimulator K13 viv Volumen je Volumen LB Luria Bertani VE Wasser vollentsalztes Wasser LB Leerposition auf dem DNA Array wi Masse je Volumen MIPS M nchner Informationszentrum f r Proteinsequenzen WG Wei glasfilter MOPS 4 Morpholinpropansulfonsaure x x fach konzentriert MuLV Moloney Murine Leukaemia Virus NADPH Nikotins ureamid Adenindinukleotid Phosphat Einleitung 7 1 Einleitung 1 1 Stratosph rischer Ozonabbau Anthropogene Aktivit ten insbesondere der Aussto von Fluorchlorkohlen wasserstoffen haben zu einer lang anhaltenden Ausd nnung der stratosph rischen Ozonschicht gef hrt die in besonders drastischen Ausma en Abnahme gt 50
98. SH POX3 0 0091 1 3 0 9 0 6 Unknown protein 3 UTR At1978370 40 AtGSTU20 Atpm24 1 utilizes cumene hydroperoxide and trans stilbene oxide as substrate MedLine ID EST cross 0 0415 1 4 1 3 1 0 8290582 hybridization At4g02520 35 Thylakoid bound 0 0001 1 2 1 1 0 8 ascorbate peroxidase EST At1977490 31 APOX 0 0011 1 4 1 2 0 9 Peroxidase like protein EST At2938380 31 POX Rote Hinterlegung At2g25080 war sowohl als EST als auch als 3 UTR auf dem DNA Array Referenzen At3g24170 GSH RED2 Lee et al 1998 Loebler 1996 At2g25080 GSH POX3 Gachotte amp Benveniste 1996 Jung et al 2002 At1977490 APOX Jespersen et al 1997 At2g38380 POX Fujiyama et al 1990 5 Photosynthese ANOVA Induktion Induktion Induktion Funktion Proben Typ Genbanknummer UV B Medianwaass mitUV B UV A ohneUV B UV A Erh hung Medianwa2os wa305 Medianwas320 360 Se Unknown protein 0 0034 1 7 1 4 0 9 chlorophyll catabolism genomisch At4g37000 50 23 kDa polypeptide of 0 0006 0 9 1 0 0 7 oxygen evolving comlex EST At1906680 47 Beta carotene 0 0398 1 5 1 5 1 1 hydroxylase genomisch At5g52570 43 Putative triosephosphate 0 0391 1 1 1 1 0 8 isomerase EST At2g21170 33 Referenzen At1906680 Kochhar et al 1996 At5g52570 Sun et al 1996 At4g37000 W thrich et al 2000 At2921170 Henze et al 1994 Anhang A UV B reaktive
99. Signalintensit t SR korrelierte dabei eng mit dem DNA Gehalt R 0 91 0 97 2 5 2 Problembehandlung bei fehlenden Messwerten Die experimentelle Schwierigkeit fehlender Messwerte eines Gens innerhalb einer Wiederholungsreihe tritt bei Array Hybridisierungen immer wieder auf Es besteht zwar die M glichkeit diese einfach von der Liste zu entfernen was aber die auswert baren Daten deutlich reduzieren w rde Dabei w rden auch solche Gene entfernt werden die in einer Behandlung messbar waren Um dieser Eventualit t Rechnung zu tragen muss ein Platzhalter eingef hrt werden Hierf r gab es zwei M glichkei ten 1 Nichtgemessene Werte werden durch den Mittelwert der gemessenen Gene substituiert 2 Dynamische Platzhalter 62 Material und Methoden 1 Messung Referenzhybridisierung 2 Messung CDNA Probe Abbildung 2 8 Normalisierung der DNA Arrays Die gespoteten Membranen wurden zuerst mit einem radioaktiv markiertem Oligonukleotid hybridi siert 1 Quantifizierung Die Sequenz dieser Sonde hatten alle PCR Produkte des Arrays gemein sam Der Vorgang diente sowohl der Qualit tskontrolle als auch der Normalisierung der cDNA Expressionswerte 2 Quantifizierung Die oberen zwei Abbildungen zeigen die Signale der 579 Gene nach der Referenzhybridisierung links und nach einer Hybridisierung mit einer radioaktiven cDNA rechts Die untere H lfte zeigt einen Ausschnitt n
100. T 28 Einleitung 1 3 3 3 Anthocyane Der erste Schritt in der Anthocyanbiosynthese wird durch die Dihydroflavonolreduk tase eingeleitet was zu Leucoanthocyanidinen f hrt Diese werden demnach aus den gleichen Substraten gebildet wie die bereits vorgestellten Flavonole Heller amp Forkmann 1988 Im Gegensatz zu den Flavonolen haben Anthocyane jedoch ihr Absorptionsmaximum im Spektrum des sichtbaren Lichtes 400 700 nm und sie werden deswegen als Schutz gegen ber erh hten Intensit ten an PAR diskutiert Sie k nnen bersch ssige photosynthetische Strahlungsenergie absorbieren welche nicht mehr in chemische Energie eingebunden werden kann und als prim re Folge peroxisomales H202 oxidative Prozesse in Gang setzen w rde Vandenabeele et al 2004 Erh hte Gehalte an Anthocyanen verursacht durch Hochlichtstress in Kombi nation mit k hler Temperatur beeintr chtigen andererseits nicht die photosyntheti sche Leistungsf higkeit der Pflanze Pietrini et al 2002 1 3 4 UV Sch den und deren Reparatur 1 3 4 1 DNA Mutationen Die Absorption der DNA von UV B Photonen f hrt in vivo haupts chlich zur Bildung von Cyclobutan Pyrimidindimeren CPDs und zu einem niedrigeren Anteil zu 6 4 Photoprodukten der DNA Britt 1996 Abbildung 1 8 Die mutagene Wirkung der UV B Strahlung f hrt zellul r zu einem gest rten Ablauf der DNA und RNA Polymerisation da die Polymerasen die Modifikationsstrukturen nicht bersetzen k nnen was
101. Zusammenhang gebracht worden sind Die Resul tate zeigten dass sich die Pflanzen bei starker UV B Intensit t und begleitenden niedrigen PAR Bestrahlungsst rken nur ungen gend abschirmen konnten was im Mesophyligewebe die typischen oxidativen Stressreaktionen initiierte Da im Freiland aber hohe UV B Werte fast immer mit hoher PAR auftreten weisen die Ergebnisse darauf hin dass Arabidopsis thaliana vor allem durch die Akkumulati on von Quercetinderivaten ein gro es Potential besitzt solare UV B Strahlung abzu schirmen 128 Literaturverzeichnis 6 Literaturverzeichnis Ahmad M amp Cashmore A R 1997 The blue light receptor cryptochrome 1 shows functional de pendence on phytochrome A or phytochrome B in Arabidopsis thaliana Plant J 11 421 427 Ahmad M amp Cashmore A R 1996 Seeing blue the discovery of cryptochrome Plant Mol Biol 30 851 861 Ahmad M Jarillo J A Klimczak L J Landry L G Peng T Last R L amp Cashmore A R 1997 An enzyme similar to animal type II photolyases mediates photoreactivation in Arabi dopsis Plant Cell 9 199 207 Ahmad M Jarillo J A Smirnova O and Cashmore A R 1998 Cryptochrome blue light photore ceptors of Arabidopsis implicated in phototropism Nature 392 720 723 Ahmed M S Ramesh V Nagaraja V Parish J H amp Hadi S M 1994 Mode of binding of quercetin to DNA Mutagen 9 193 197 Alfenito M R Souer E Good
102. a protein with homology to myb proto oncogene products and with structural similarities to transcriptional activators EMBO J 6 3553 3558 Peer W A Brown D E Tague B W Muday G K Taiz L amp Murphy A S 2001 Flavonoid accumulation patterns of transparent testa mutants of Arabidopsis Plant Physiol 126 536 548 Pfaffl M W 2001 A new mathematical modell for relative quantification in real time RT PCR Nucl Acid Res 29 1 6 Picton S Gray J Barton S AbuBakar U Lowe A amp Grierson D 1993 cDNA cloning and characterisation of novel ripening related mRNAs with altered patterns of accumulation in the ripening inhibitor rin tomato ripening mutant Plant Mol Biol 23 193 207 Pietrini F lannelli M A amp Massacci A 2002 Anthocyanin accumulation in the illuminated surface of maize leaves enhances protection from photo inhibitory risks at low temperature without further limitation to photosynthesis Plant Cell Environ 25 1251 1259 Precht M amp Kraft R 1993 Biostatistik 2 Oldenbourg Verlag GmbH M nchen Quaite F E Sutherland B M amp Sutherland J C 1992 Action spectrum for DNA damage in alfalfa lowers predicted impacted of ozone depletion Nature 358 576 578 Rao MV amp Ormrod D P 1995 Impact of UVB and O3 on the oxygen free radical scavenging system in Arabidopsis thaliana geneotypes differing in flavonoid biosynthesis Phytochem Photobiol 62 7
103. ach dem Gridding mit der Image Software ArrayVisionTM 5 1 In jedes Subgrid wurden sechs verschiedene Gene gespotet die jeweils repliziert aufgetragen waren Replica An der Position LB wird f r diese sechs DNA Sequenzen ein Hintergrundwert ge messen Die Verrechnung der Daten erfolgte ber die HARUSPEX Expressionsdatenbank des MPI f r Molekulare Pflanzenphysiologie siehe Kapitel 2 5 1 Das bessere Verfahren ist eine Fallentscheidung mithilfe dynamischer Platzhalter In Kapitel 2 5 1 wurde das Prinzip der Berechnung der Detektionslimits dL abgehan delt Basierend auf diesen Zahlen und den Messwerten von detektierten Werten in Material und Methoden 63 nerhalb einer Variante k nnen entsprechende Platzhalter geschaffen werden Damit ein Gen innerhalb einer Behandlungsvariante dem Substitutionsverfahren unterzo gen werden konnte musste es zun chst ber alle Wiederholungen in mindestens 67 der Messungen detektiert worden sein Fehlende Werte wurden anhand der Standardabweichung SAsgetert und des Mittelwertes MW getert der detektierten Ge ne angepasst F r den Wert des Platzhalters wurde der dynamische Hintergrund dL herangezogen F r diese Ann herung wurden drei F lle unterschieden 1 MWoaetekt SAdetext 2 GL gt MWaetekt SAdetekt gt Platzhalter MW getert MW Ate SAdetekt 2 2 dL lt MWaetekt SA detekt gt Platzhalterz dL 2 3 dL gt MWaetekt SAdetekt g
104. an 1996 In der fahT Mutante kann im Vergleich zu der tt5 Mutante eine er h hte Peroxidation der Lipidfraktion nach 72 h UV B Einwirkung beobachtet werden Landry et al 1995 In den eigenen Experimenten hingegen waren Gene von Prote inen des oxidativen Stresses nur dann durch UV B induziert wenn bei hoher UV B Intensit t die Konzentrationen an Quercetinderivaten niedrig waren Szenario L H Die Sinapins ureester und die Kaempferolderivate dienen demnach als konstitutiver 112 Diskussion Strahlungsschutz der sich nicht UV spektralabh ngig zeigte Vielmehr sind Sinapin s urederivate zu Beginn der Bestrahlungsperiode im Jugendstadium dominant wo bei diese Funktion im sp teren Verlauf der Entwicklung und Akklimatisierung verlo ren geht Burchard et al 2000 Die erhobenen HPLC Profile zeigten dass den Quercetinderivaten eine besondere Rolle im Schutz der Pflanze gegen ber UV B Strahlung einzur umen ist F r diese besondere Funktion der Quercetinderivate spricht dass sie unter ambien ten UV B Bedingungen kaum synthetisiert werden Unter solchen Lichtbedingungen sind Kaempferolderivate dominant und zwar in vergleichbaren Konzentrationen als mit zus tzlichem UV B Veit amp Pauli 1999 Das Enzym F3 H spielt also eine kriti sche Rolle bei der UV Abschirmung Das haben Versuche mit tt7 Mutanten best tigt Die Blockade des Enzyms f hrt zwar im Vergleich zum Wildtyp unter UV B Belastung zu erh hten Konzentrationen an Kaem
105. an PAR sich f r die Pflanze eine strahlungsadequate Konzentration an Quercetinderivaten einstellt die sich wahrscheinlich im sp teren Verlauf der Vegetationsperiode wenig ver ndert Die Schwierigkeit des Verst ndnises der Dynamik der Akkumulation von Quercetinderi vaten liegt darin dass nach dem momentanen Wissensstand nichts ber den Kata bolismus bekannt ist Aufgrund eigener Messungen ist anzunehmen dass diese Mo lek le zumindest w hrend des vegetativen Wachstums der Pflanze wenig Abbau erfahren Vergleicht man die Mittelwerte der beiden Hoch UV B Varianten mit niedri gem und hohem PAR Hintergrund so k nnte das Ergebnis derart interpretiert wer den dass im fr heren Stadium der Bestrahlungsperiode die Endkonzentrationen der Quercetinderivate geregelt werden Im Szenario H H f llt dieses Signal entsprechend h her aus als bei der Variante L H Um die Frage des zeitlichen Moments der Ein stellung des notwendigen Gehaltes an Quercetinderivaten experimentell zu belegen w ren kinetisch ausgerichtete Versuche beider PAR Hintergr nde notwendig Fest zuhalten bleibt weiterhin dass 25 mW UV Bs H L mit einem vergleichbaren PAR Hintergrund als bei H H nicht ausreichten um die UV B Erh hung der Konzentration an Quercetinderivaten ber die Wachstumsperiode herbeizuf hren 4 5 Gene des Sekund rmetabolismus Unter den in Kapitel 3 8 3 vorgestellten UV B responsiven Genen waren f nf Gene aus dem Sekund rmetabolismus der Tabelle 3
106. bbildung 3 13 Spektrale Abh ngigkeiten der Konzentrationen an Sinapins ureestern SinGlc SinMal H L Das linke Diagramm zeigt die Konzentrationen an Sinapoylglukose und malat des Versuches V322 Das rechte Diagramm zeigt die Ergebnisse des Versuches V324 Mittelwerte und Standardabweichungen der Balken wurden f r V322 mit n 3 und f r V324 mit n 3 berechnet Ergebnisse 81 3 4 2 Genexpression der Flavonoidbiosynthese Im Gegensatz zu den Metaboliten zeigten die Gene der Flavonoid Biosynthese bei H L eine ausgepr gte Reaktion auf UV B Strahlung Abbildung 3 14 Die Auswer tung der Ergebnisse ist in Tabelle 3 8 zusammengefasst rel Expression WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Abbildung 3 14 Spekirale Abhangigkeit der Transkription der Flavonoidbiosynthese Gene nach 14 d UV Exposition H L Tabelle 3 8 Statistische Auswertung der RT PCR Analysen des Basisszenarios H L kritischer E Signifikanz 6 10 0 004 3 06 2 79 0 065 3 06 n s Induktion UV B UV A ohne UV B 2 49 2 88 Chalkonisomerase n 2x2 Flavanon 3 Hydroxylase n 2x2 Flavonoid 3 Hydroxylase n 2x3 0 000 Ge 4 10 Flavonolsynthase n 2x2 0 005 3 06 5 85 H0 Genexpression ist nicht spektralabh ngig im UV Bereich signifikant p lt 0 05 H1 Genexpression ist spektralabh ngig im UV Bereich hoch signifikant p lt 0 01 sehr hoch
107. biosynthese im Samen ben tigt werden belegen transiente Coexpressi onsstudien Die Promotoren des Typs BZ7 und AT BZ1 UDP 3 OH Anthocyanidin Glukosyltransferase AT Dihydroflavonolrekuktase sind nur dann aktiv wenn qui valente Mengen an C1 und R B vorhanden sind Diese scheinen hierbei als Homo dimere an die Zielsequenz zu binden und wirken synergetisch W hrend die Antho cyanbiosynthese diese Transkriptionsfaktoren ben tigt ist in Mais die Synthese von Phlobaphenen unabh ngig von diesen regulativen Elementen Die Flavonoidklasse der Phlobaphene wird im Gegensatz zu den Anthocyanen von dem Transkriptions faktor P gesteuert MYB Vertreter Dieser aktiviert einen Promotor des Typs AT was 22 Einleitung zur Synthese der Phlobaphenvorstufe Flavan 4 ol f hrt P alleine kann Promotoren des Typs AT ansteuern nicht aber die BZ1 Typen Durch diese Differenzierung kann die Pflanze Anthocyan und Phlobaphensynthese getrennt regeln Die Anthocyanbiosynthese im Samen steht aber nicht nur unter der Kontrolle der Transkriptionsfaktoren C1 und R B sondern wird berdies durch VP1 Viviparous T kontrolliert Dieses Regulativ bt au erdem pleiotrope Eigenschaften aus weil es zus tzlich die Reifung des Embryos zentral steuert VP1 ist also ein hierarchisch bergeordneter Transkriptionsfaktor der eine wichtige Funktion bei der Fruchtreife einnimmt Die Flavonoid und Anthocyanbiosynthese ist demnach im Samen von Zea mays in ein bergeordnete
108. by ultraviolet induced chlorophyll fluorescence measurements Plant Cell Environ 23 1373 1380 Caldwell M M 1971 Solar ultraviolet radiation and the growth and development of higher plants In Photophysiology ed A C Giese Vol 6 New York pp 133 177 Caldwell M M amp Flint S D 1993 Implications of increased solar UV B for terrestrial vegetation In The role of the stratosphere in global change Springer Verlag Heidelberg pp 495 516 Caldwell M M amp Flint S D 1994 Stratospheric ozone reduction solar UV B radiation and terres trial ecosystems Climatic Change 28 375 394 Caldwell M M Robberecht R amp Flint S D 1983 Internal filters prospects for UV acclimation in higher plants Physiol Plant 58 445 450 Caldwell M M Teramura A H amp Tevini M 1989 The changing solar ultraviolet climate and the ecological consequences for higher plants Trends Ecol Evol 4 363 367 Capella A N Menossi M Arruda P amp Benedetti C E 2001 COI1 affects myrosinase activity and controls the expression of two flower specific myrosinase binding protein homologues in Arabidopsis Planta 213 691 699 130 Literaturverzeichnis Carre I A amp Kim J Y 2002 MYB transcription factors in the Arabidopsis circadian clock J Exp Bot 53 1551 1557 Cen Y P amp Bornman J F 1990 The response of bean plants to UV B radiation under different irradiances of background
109. che Pflanzenpathologie GSF M nchen Neuherberg bei PD Dr Langebartels Die spektrale Abh ngigkeit der Wirkung von UV induzierten Reaktionen in Arabidopsis thaliana Dr rer nat
110. cia faba genannt Eisinger et al 2000 1 2 2 Polychromatische Wirkungsspektroskopie Eine realistischere Bewertung liefert die polychromatische Wirkungsspektroskopie In einer meist sehr umfangreichen und langwierigen Versuchsreihe wird eine Anzahl m glichst gleichartiger Pflanzen unter verschiedenen sonnen hnlichen Spektren mit zunehmenden UV Anteilen und Bestrahlungsst rken kultiviert Die Entwicklung des betrachteten Endpunkts Akkumulation von Inhaltsstoffen Wachstumsparameter Genaktivit t etc wird quantitativ erfasst Sind gen gend statistisch abgesicherte Da ten vorhanden und sind die Bestrahlungsszenarien spektralradiometrisch vermessen Einleitung 11 kann man versuchen eine biologische Wichtungsfunktion zu finden welche die ge fundenen biologischen Daten modelliert Mit sukzessiven Approximationen wird die Funktion verfeinert bis eine optimale Anpassung Fit erreicht ist Cullen et al 1992 Rundel 1983 Steinm ller amp Tevini 1985 Ein alternativer Ansatz ist die diffe rentielle Wirkungsspektroskopie Hier wird die Differenz der biologischen Wirkungen ermittelt die unter zwei Spektren mit wenig verschiedener kurzwelliger Absorptions kante registriert wurden Cooley et al 2000 Holmes 1997 In jedem Fall muss zur Berechnung der BWF die Dosisabh ngigkeit ermittelt werden d h dass Bestrah lungexperimente nicht nur mit Spektren verschiedener Absorptionskante sondern auch mit verschiedenen Bestrahlungsst
111. den Detektionskriterien entsprachen vgl Kapitel 2 4 Von diesen 112 Sequenzen waren im Szenario L H 104 UV B erh ht und acht Klone durch UV B Strahlung erniedrigt transkribiert 3 8 2 Induzierte Gene Probleme in Folgeanalysen In zahlreichen Expressionsstudien aus der Literatur beziehen sich die Ergebnisse auf die Mittelwerte von Array Wiederholungen z B Scatter Plots Die Varianz der ein zelnen Gene blieb jedoch unber cksichtigt bzw sie wurde zwar angegeben die sta tistische Signifikanz wurde jedoch nicht gepr ft Diese Datenpr sentation ist nur ver tretbar wenn sich im Experiment ausgepr gte Induktionen zeigen Ergebnisse von schwach induzierbaren Genen vor allem bei niedrigen Signalst rken vgl Kapitel 2 5 3 sind ohne Statistik sehr fragw rdig und in Verifikationsexperimenten zum gro Ben Teil nicht zu best tigen Wenn die Induktionsfaktoren nicht auf Signifikanz ge pr ft werden kann es in einer anschlie enden Clusteranalyse zur Zusammenf hrung von Messwerten kommen die nur zuf llig zu einer Gruppe interessanter Gene ge rechnet wurden was demzufolge zu einer falschen biologischen Interpretation f hren w rde Die Messung der spektralen Abh ngigkeit von Expressionsmustern mit dem DNA Array ist exemplarisch in Abbildung 3 18 dargestellt Die dazugeh rige Grafik ist in Abbildung 3 19 zu sehen Bei der DNA Sequenz handelt es sich um ein Transkript aus der Familie der Glukosyltransferasen Ergebnisse 93
112. der Anthocyanbiosynthese in der phyAphyB Mutante weniger ausgepr gt sind als im Wildtyp Ahmad amp Cashmore 1997 Solche Experimente versprechen ein genaueres Bild vom Zusammenspiel verschiedener Strahlungsarten bei der Einstellung der notwendigen Konzentration an Quercetinde rivaten zum Schutz vor UV B Strahlung 126 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung In der Vergangenheit wurden zahlreiche Studien zur Auswirkung von UV B Strahlung auf Pflanzen angefertigt Die meisten Ergebnisse beruhten jedoch haupts chlich auf transienten Reaktionen Damit das Risiko erh hter bodennaher UV Strahlung aber realistisch eingesch tzt werden kann fehlten bisher Wirkungsspektren von Schutz molek len unter Langzeiteinfluss von UV Strahlung In dieser Arbeit wurden in den Sonnensimulatoren der GSF Versuche unter kologisch relevanten Bestrahlungs szenarien mit der genetischen Modellpflanze Arabidopsis thaliana unternommen die an UV B Werten angepasst waren wie sie durch eine weitere Abnahme der Ozon schicht in Zukunft zu erwarten sind Die Langzeitversuche sind polychromatisch mit f nf fein abgestuften UV Filtern realisiert worden WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Neben der Spektral und Dosisvariation im UV Bereich ist zus tzlich die Energiemenge an Photonen der photosynthetisch aktiven Strahlung PAR ver ndert gewesen Daraus ergaben sich die Simulationen H H M H L H und HAL PAR UV B H M und L stehen f r hoch mittel und engl low
113. der Enzyme dieser Gene besteht in der Entsorgung des zelltoxischen Stoffwechselnebenproduktes Methylglyoxal welches beim Abbau von Threonin oder aus Triosephosphaten der Glykolyse gebildet werden kann Karlson et Ergebnisse 105 al 1994 Im ersten Schritt wird Methylglyoxal nichtenzymatisch zu Hemithioacetal umgesetzt Die Glyoxalase isomerisiert dieses Produkt zu S D Lactoglutathion welches durch Glyoxalase Il in der Umwandlung zu D Milchs ure unsch dlich gemacht wird Es ist zwar gezeigt worden dass Methylglyoxal durch kovalente Bin dungen mit der DNA oder durch unspezifische Reaktionen mit Arginin und Lysin resten als Zellgift stark wirksam ist warum es jedoch zu einer Uberbelastung dieses Effektors kommt ist weitgehend unbekannt Hou et al 1995 Westwood amp Thornal ley 1995 F Andere At3916450 war das einzige Gen in dieser Kategorie dem eine physiologische Aufgabe bei der Pathogenabwehr zugeschrieben werden k nnte Eckardt 2001 Das Protein besitzt 61 Homologie zu dem Transkriptionsfaktor MPB1 2 der die Myrosinaseaktivit t in Arabidopsis Glukosinolathydrolyse reguliert Capella et al 2001 Die Hydrolyse von Glukosinolaten f hrt zu Isothiocyanat oder Nitrilverbindun gen die vor Herbivoren sch tzen k nnen Eckardt 2001 Hingegen zeigten die Gene At4g10490 At4912480 At1930420 und At4g3700 kaum Verwandtschaften zu bekannten Funktionen Nichtsdestoweniger hatte At4g3700 47 Homologie zu einem Gen des Chl
114. des Basisszenarios H H In der rechten Spalte sind die Induktionswerte angegeben die sich aus den Verh ltnissen der Expres sionsmittelwerte der UV Varianten mit UV B WG295 WG305 und ohne UV B Strahlung WG320 WG335 und WG360 berechneten Induktion UV B UV A ohne UV B z Chalkonisomerase n 2x2 0 534 3 S 1 22 Flavanon 3 Hydroxylase n 2x2 0 094 S 1 36 Flavonoid 3 Hydroxylase n 2x3 3 39 0 025 2 78 1 85 Flavonolsynthase n 2x2 10 76 0 000 SI 1 91 HO Genexpression ist nicht spektralabh ngig im UV Bereich signifikant p lt 0 05 H1 Genexpression ist spektralabh ngig im UV Bereich hoch signifikant p lt 0 01 sehr hoch signifikant p lt 0 001 72 Ergebnisse rel Expression WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Abbildung 3 4 Spektrale Abh ngigkeit der Transkription der Flavonoidbiosynthese Gene nach 14 d UV Exposition H H 3 2 Mittel PAR Hoch UV B M H 3 2 1 Schutzpigmente Flavonolderivate Die Konzentrationen an Quercetinderviaten zeigten im Szenario M H die deutlichsten Spektralabh ngigkeiten Abbildung 3 6 Den Kaempferolderivaten konnte bei dem Experiment V320 eine leichte statistisch signifikante spektrale Abh ngigkeit zuge schrieben werden die aber weniger ausgepr gt war als die der Quercetinderivate Sinapins ureester Die Gehalte an Sinapins ureestern waren im Szenario M H nicht spektralabh ngig Vielmehr konn
115. dient exposed to supplemental UV B radiation in the field Arctic Alpine Res 19 21 27 Bartling D Radzio R Steiner U amp Weiler E W 1993 A glutathione S transferase with glu tathione peroxidase activity from Arabidopsis thaliana Eur J Biochem 216 579 586 Batschauer A 1999 Light perception in higher plants Cell Mol Life Sci 55 153 166 Baxevanis A D 2001 The molecular biology database collection an updated compilation of bio logical database resources Nucl Acid Res 29 1 10 Beggs C J amp Wellmann E 1994 Photocontrol of flavonoid biosynthesis In Photomorphogenesis in plants eds R E Kendrick amp G H M Kronenberg Kluwer Academic Press Dordrecht pp 733 751 Literaturverzeichnis 129 Berenbaum M 1988 Effects of electromagnetic radiation on insect plant interactions In Plant stress insect interactions ed E A Heinrichs John Wiley amp Sons New York pp 167 185 Berkelaar E J Ormrod D P amp Hale B A 1996 The influence of photosynthetically active radia tion on the effects of ultraviolet B radiation on Arabidopsis thaliana Photochem Photobiol 64 110 116 Bieza K amp Lois R 2001 An Arabidopsis mutant tolerant to lethal ultraviolet B levels shows constitu tively elevated accumulation of flavonoids and other phenolics Plant Physiol 126 1105 1115 Boccalandro H Mazza C A Mazella M A Casal J J amp Ballare C L 2001 Ultraviolet
116. ditions New Phytol 137 617 Literaturverzeichnis 135 Lee H Jo J amp Son D 1998 Molecular cloning and characterization of the gene encoding glu tathione reductase in Brassica campestris Biochim Biophys Acta 1395 309 314 Lehfeldt C Shirley A M Meyer K Ruegger M O Cusumano J C Viitanen P V Strack D amp Chapple C 2000 Cloning of the SNG1 gene of Arabidopsis reveals a role for a serine car boxypeptidase like protein as an acyltransferase in secondary metabolism Plant Cell 12 1295 1306 Leyva A Jarillo J A Salinas J amp Martinez Zapater J M 1995 Low temperature induces the accumulation of phenylalanine ammonia lyase and chalcone synthase mRNAs of Arabidopsis thaliana in a light dependent manner Plant Physiol 108 39 46 Li J Ou Lee T M Raba R Amundson R amp Last R L 1993 Arabidopsis flavonoid mutants are hypersensitive to UV B irradiation Plant Cell 5 171 179 Liang X Oono Y Shen N F Kohler C Li K Scolnik P A amp Theologis A 1995 Characteriza tion of two members ACS1 and ACS3 of the 1 aminocyclopropane 1 carboxylate synthase gene family of Arabidopsis thaliana Gene 167 17 24 Liang X Shen N F amp Theologis A 1996 Li regulated 1 aminocyclopropane 1 carboxylate syn thase gene expression in Arabidopsis thaliana Plant J 10 1027 Lim E K Li Y Parr A Jackson R Ashford D A amp Bowles D J 20
117. dliche Hybridisierungs und Expo sitionszeiten Die biologische Variabilit t hingegen setzt sich in erster Linie aus den Unterschieden zwischen dem Pflanzenmaterial einer Bestrahlungsvariante zusam men Der durchschnittliche Gesamtfehler konnte in WG295 und WG360 des Versu ches V320 ermittelt werden Dort wurde jeweils an zehn verschiedenen Positionen Proben je f nf Pflanzen entnommen und von diesen RNA extrahiert Mit diesen RNAs wurden zehn verschiedene DNA Arrays hybridisiert und die Daten normalisiert Die relativ hohe Anzahl an Wiederholungen best tigte zus tzlich die Normalvertei lungshypothese der Genexpressionsmessungen was Voraussetzung f r die an schlie ende Varianzanalyse war Precht amp Kraft 1993 Betrachtete man alle detek tierten Gene dieses Versuches so lag der mittlere Fehler einer Bestrahlungsvariante bei 35 Ein differenzierteres Bild ber die Fehlerverteilung von Genen in Abh ngig keit ihrer Signalst rken ist in Abbildung 2 9 wiedergegeben Der Gesamtfehler eines Expressionswertes setzt sich demnach aus zwei Komponenten zusammen die durch das additive Modell beschrieben werden konnten Var VN VNo Sh 6 7 VN entspricht dem normalisierten Transkriptionswert f r den die Varianz bestimmt wurde Die Komponente o wurde aus den schw cheren Signalen mit m m o n m s n 1 nj Zahl der Wiederholungen jedes Gens 10 n ni i 1 i 1 berechnet M war eine willk rlich festgelegte Zahl an schwach
118. e FLS Flavonolsynthase DER Dihydroflavonolreduktase GT Glukosyltransferasen ANS Anthocyanidinsynthase Dihydroquercetin Biosynthese UV abschirmender Flavonoide aus Winkel Shirley 2001 Die Flavonoidbiosynthese beginnt mit der Katalyse von p Cumaroyl CoA mit 3 Malonyl CoA zu Narin geninchalkon Das Schema f hrt zu den Flavonolglykosiden die nach dem momentanen Stand des Wissens als Hauptschutz vor UV Strahlung angesehen werden vgl Veit amp Pauli 1999 26 Einleitung 1 3 3 2 UV Abschirmung durch Sinapins ureester Die Sinapins ureester sind nahe verwandt mit den Flavonoiden Der gemeinsame Syntheseweg endet bei der p Cumars ure Freie Sinapins ure kommt in Pflanzen fast nicht vor Pflanzen setzen diese in Sinapins ureester um und lagern diese in der Vakuole ab Lehfeldt et al 2000 Ruegger et al 1999 Die Biosynthese der Sina pins ureester ist in Abbildung 1 7 dargestellt Sinapins ure Glukosyltransferase SGT und Sinapoylglukose L Malat Sinapoyltransferase SMT welche die spei cherf higen Esterformen bilden konnten in A thaliana erst vor kurzem gefunden werden Lehfeldt et al 2000 Lim et al 2001 Sinapins ureester sind abgesehen innerhalb der Brassicaceen in Pflanzen nicht sehr weit verbreitet Sie konnten in j ngster Zeit in Daucus carota Ananas comosus Capsicum annum und Beta vulga ris gefunden werden Fernandez De Simon et al 1992 Halaweish amp Dougall 1990 Winter amp Herrmann
119. e amp Kim 2002 Kranz et al 1998 Yang amp Klessig 1996 Welche Gene und Sequenzmotive von den verschiedenen Mitgliedern tats chlich reguliert und verwendet werden ist zum gro en Teil unbekannt Romero et al 1998 Mit am besten charakterisiert sind die Transkriptionsfaktoren der Anthocyanbio synthese in Zea mays Doebley 1993 F r die Regulation sind die sechs Transkrip tionsfaktoren C1 Pl R B P und VP1 verantwortlich Bruce et al 2000 C1 und PI sind Vertreter der MYB Familie Grotewold et al 2000 Paz Ares et al 1987 R und B sind funktionell quivalente Proteine der Protoonkogene MYC C1 wird f r die Anthocyansynthese im Samen ben tigt Der dazu homologe Pl Transkriptionsfaktor erf llt die gleiche Funktion au erhalb des Samens so dass beide Regelelemente gewebespezifisch transkribiert werden Die beiden Proteine reichen jedoch nicht aus um die Anthocyanbiosynthese in Gang zu setzten Sie ben tigt zus tzlich die Trans lation von R B B ist dabei ein singul res Gen w hrend die R Proteine von einer Genfamilie kodiert werden Im Gegensatz zu den Vertretern der MYB Familie C1 und PI werden R und B nicht gewebespezifisch exprimiert Je nach Maisvariet t zeigen sie unterschiedliche zeitliche und r umliche Expressionsmuster was besonders f r die Mitglieder der R Genfamilie gilt Westhoff et al 1996 Die Tatsache dass so wohl C1 als auch R B f r die Transkription der Strukturgene der Flavonoid und Anthocyan
120. e durchgef hrt Das Zusatzexperiment hatte gezeigt dass unter Ausschluss von UV B Strahlung nur noch die PAR Komponente zur Bildung der Produkte beitr gt Die Regressionsanalyse der Daten liefert eine lineare Abh n gigkeit nach folgender Gleichung nmol cm par 9 045 r Epyr 2 1 Amol m e mit einem Korrelationskoeffizienten r 0 85 F r die Analyse der UV Abhangigkeit wurden ausschlie lich die zus tzlich durch UV Strahlung induzierten Anteile der 86 Ergebnisse Quercetingehalte quv Qtota Qpar ber cksichtigt Die reduzierten Quercetin konzentrationen wurden f r jede PAR UV Filter Kombination einzeln bestimmt wobei negative Werte gleich null gesetzt wurden Diese reduzierten Daten bildeten die Grundlage f r die Berechnung der BWF s A f r die UV abh ngige Bildung von Quercetinderivaten in den Blattrosetten bei Dauerexposition Allerdings ist zum Ver st ndnis der BWF zus tzlich die Kenntnis der Dosisfunktion W Hsa erforderlich Die se beschreibt die UV induzierten Quercetingehalte als Funktion der mit der BWF ge wichteten Bestrahlung Hea ist die Uber den UV Bereich und ber die Zeit z B einen Tag integrierte Strahlungsdosis Hier flie t die Annahme ein dass alle UV Quanten unabh ngig von ihrer Wellenl nge den gleichen biochemischen Prozess ausl sen allerdings mit wellenl ngenabh ngiger Effizienz Da die Zahl der unabh ngigen Be handlungsvarianten bei einer h heren Pflanze auf Grund des gro
121. e uvh1 Mutante hingegen ist nicht bef higt diesen Reparaturweg zu bestreiten Funktionsanalysen zeigten dass UVH1 eine Untereinheit des Enzymkomplexes des nucleotide excision repair Mechanismus ist Die Pflanze verf gt demnach ber eine zus tzliche vom Licht unabh ngige Reparaturm glichkeit Dimerenstrukturen benachbarter Pyrimidine zu beseitigen Dieser d rfte aber im Vergleich zu den Photolyasen eine unter geordnete Rolle spielen Liu et al 2000 En EN u NO CH P Wi CH HA UV BIUV G B UV C S H a to Ek O CPDII UV A ON V o H H TT Cyclobutan Pyrimidindimer UV B UV C 6 4Photolyase UV A CH Valenzisomerisierung N Lou UV A UV B A AMO Cf SE EN W ae UV C 6 4 TT Dimer Dewarisomer Abbildung 1 8 DNA Mutationen durch UV B Strahlung und deren Reparatur Jansen 1998 Taylor et al 1990 Die Abbildung zeigt zwei verschiedenen M glichkeiten der Dimerenbildung durch UV B Strahlung Cyclobutandimer und 6 4 Dimer Die enzymatische Reparatur der Mutationsprodukte erfolgt in vivo durch die Cyclobutan CPDII und der 6 4 Photolyase Erl uterungen siehe Text 30 Einleitung 1 3 5 UV B Sch digung des Photosyntheseapparates Die Photosynthese ist der zentrale Prozess f r die Energiegewinnung der Pflanze Erh hte UV B Strahlung kann die Funktionst chtigkeit des Photosyntheseapparates negativ beeinflussen was bei steigender terrestrischer UV B Strahlung zur Reduzie rung landwirtschaftlicher
122. eferenzen At2g23210 UGT84B3P Kita et al 2000 At4g14100 UGT75C1 Yamazaki et al 1999 At5g05870 UGT76C1 Picton et al 1993 148 Anhang A UV B reaktive Gene 4 Antioxidatives System ANOVA Induktion Induktion Induktion Funktion Proben Typ Genbanknummer UV B Abk rzung Medianwa2s5 mitUV B UV A ohneUV B UV A Erh hung Medianwa295 wc305 Medianwe320 360 Erniedrigung Glutathione reductase 0 0007 2 2 EN 0 8 cytosolic 3 UTR At3g24170 155 GSH RED2 Glutathione S 0 0018 2 5 2 5 1 1 transferase 3 UTR At1910370 129 AtGSTU17 Glutathione S 0 0000 2 8 2 1 0 9 transferase like protein 3 UTR At5g17220 127 AtGSTF12 Putative copper zinc 0 0001 1 1 1 5 0 6 superoxide dismutase EST At2g28190 127 Cu Zn SOD 0 0021 0 8 1 2 0 6 Superoxide dismutase EST At4g25100 94 Fe SOD Putative glutathione 0 0020 1 4 1 4 0 8 peroxidase 3 UTR At2g25080 82 GSH POX3 Glutathione S 0 0085 2 5 1 8 1 0 transferase like protein 3 UTR Atig78380 76 AtGSTU19 Glutathione S 0 0075 2 2 1 8 1 1 transferase 3 UTR At3g03190 66 AtGSTF11 Glutathione transferase 0 0422 1 1 1 3 0 8 AtGST 10 3 UTR At5g41210 65 AtGSTT1 0 0019 1 4 1 3 0 8 Superoxidase dismutase EST At1908830 57 Cu Zn SOD Glutathione transferase 0 0219 1 9 1 5 1 0 like 3 UTR At5g41220 51 AtGSTT3 Putative glutathione 0 0014 1 1 1 1 0 8 peroxidase EST At2925080 40 G
123. eine des Calvinzyk lus festgestellt werden Greenberg et al 1997 Nogues amp Baker 1995 Strid et al 1994 Die Reduktion wurde jedoch bei diesen Studien mit niedrigen PAR Werten beobachtet In kologisch relevanten Untersuchungen mit hoher PAR reduzierte sich durch zus tzliche UV B Bestrahlung zwar die Biomasse eine Reduktion der Kon zentration an Photosyntheseproteinen konnte jedoch nicht gefunden werden Fiscus amp Booker 1995 Einleitung 31 1 4 Themenstellung UV Studien an Pflanzen konzentrierten sich in der Vergangenheit in erster Linie auf transiente Effekte mit z T unrealistischen Bestrahlungsbedingungen In diesen Ver suchen erfolgte eine starke Induktion der pflanzlichen Reaktion Sie wurden daher haupts chlich zur Aufkl rung der biochemischen Regulation des Sekund rmetabo lismus angewandt Jenkins et al 2001 Jin et al 2000 Mackerness 2000 Macker ness 2001 Neben dieser Disziplin gab es eine Reihe an kologisch relevanten Stu dien bei denen der UV Anteil k nstlich modifiziert wurde Dies geschah entweder durch Filter die nur einen Teil der UV B Strahlung durchlie en und somit die UV B Belastung reduzierten bzw durch k nstliche Quellen die eine UV B Erh hung simu lierten In solchen Untersuchungen wurden zwar spektrale Abh ngigkeiten der UV Antwort beschrieben Cooley et al 2001 Day et al 1994 Day et al 1996 Ghetti et al 1999 Strid 1993 umfassende spektrale Experimente an h heren
124. el R Tsang E W Van Montagu M amp Inze D 1990 Charac terization of iron superoxide dismutase cDNA s from plants obtained by genetic complementa tion in Escherichia coli Proc Natl Acad Sci USA 87 9903 9307 Vandenabeele S Vanderauwera S Vuylsteke M Rombauts S Langebartels C Seidlitz H K Zabeau M Montagu M V Inze D amp Van Breusegem F 2004 Catalase deficiency dras tically affects gene expression induced by high light in Arabidopsis thaliana Plant J 39 45 58 Vass l Sass L Spetea C Bakou A Ghanotakis D F amp Petrouleas V 1996 UV B induced inhibition of photosynstem II electron transport by EPR and chlorophyll fluorescence Impair ment of donor and acceptor side components Biochem J 35 8964 8973 Veit M amp Pauli G F 1999 Major flavonoids from Arabidopsis thaliana leaves J Nat Prod 62 1301 1303 Vogel J P Woeste K E Theologis A amp Kieber J J 1998 Recessive and dominant mutations in the ethylene biosynthetic gene ACS5 of Arabidopsis confer cytokinin insensitivity and ethylene overproduction respectively Proc Natl Acad Sci USA 95 4766 4771 Wade H K Bibikova T N Valentine W J amp Jenkins G I 2001 Interaction within a network of phytochrome cryptochrome and UV B phototransduction pathways regulate chalcone syn thase gene expression in Arabidopsis tissue Plant J 25 675 685 Wang W Takezawa G amp Pooviah
125. elle 3 12 Statistische Auswertung von Node 107 Das Ausma der Reprimierung durch UV B Strahlung wird durch rote Pfeile angezeigt signifikant bei p lt 0 05 Schwarze Pfeile deuten eine UV B Unterdr ckung an die nicht signifikant war L H H H HL Gen UV B UV A UV B UV A UV B UV A MedianW Goes Aueagel Medianwe205 wa30s Medianwe295 wa305 Glycinreiches RNA Bindeprotein 0 65 0 72 n s 0 32 Glutathion S Transferase 0 46 1 17 UV A 0 94 Vermutliche Glukosyltransferase 0 54 0 79 n s 0 59 Vermutliche Glutathion S Transferase 0 53 0 66 n s 0 81 n s Glutathione S Transferase 0 69 0 94 n s 0 70 Chlorophylibindendes Protein Typ 1 PSII 0 93 0 97 n s 1 24 n s eg gt 0 6 1 HO Genexpression ist nicht spektralabh ngig im UV Bereich signifikant p lt 0 05 LL Se 0 4 0 6 H1 Genexpression ist spektralabhangig im UV Bereich hoch signifikant p lt 0 01 HL lt 0 4 sehr hoch signifikant p lt 0 01 3 8 7 berpr fung der Array Ergebnisse mittels RT PCR Die berpr fung der Resultate von AtGSTF2 wurde mit RT PCR durchgef hrt Die Tendenzen aus den DNA Array Erbenissen konnten dadurch best tigt werden siehe Abbildung 3 26 und Tabelle 3 13 rel Expression WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 Abbildung 3 26 RT PCR Ergebnisse der Transkription von AtGSTF2 At4g02520 Er
126. en homogen verteilt worden sind Die Samenzahl wurde so abge wogen 50000 Samen 1 g dass bei 300 ul Volumen ca drei Samen abgegeben wurden Die Aussaatdichte betrug 5 x 300 ul je Anzuchtt pfchen Im Anschluss sind die Samen lichtdicht verschlossen worden um sie f r zwei Tage bei 4 C vernalisie ren zu lassen Unter ambienten Lichtbedingungen ca 200 umol m s bei einer Temperatur von 22 C keimten die Samen vier Tage an Nachfolgend erfolgte im Sonnensimulator eine sechst gige Akklimatisierungsphase unter Ausschluss der Wellenl ngen lt 400 nm und einem PAR Hintergrund von ca 200 umol m s Nach dem f nften Akklimatisierungstag wurde die Dichte auf f nf Pflanzen je T pfchen re duziert Ab dem siebten Tag im Sonnensimulatur konnten die Pflanzen mit UV be handelt werden Abbildung 2 2 Der Tag Nachrhythmus war auf 14 10 h eingestellt wobei die t gliche UV Periode 10 h betrug Die Pflanzen wuchsen f r zwei Wochen unter den definierten Bedingungen aus Tabelle 2 1 Die Ernte begann bei allen Ver suchen um 14 Uhr Es wurde ausschlie lich die Blattrosette geerntet Wurzeln und eventuelle Infloreszenzen sind entfernt worden Das geerntete Pflanzenmaterial wur de unter fl ssigem Stickstoff dismembriert und bei 80 C aufbewahrt 44 Material und Methoden 2 3 Molekularbiologische Methoden 2 3 1 DNA Arrays Mit der DNA Array Technik kann die Expression von mehreren hundert Genen paral lel erfasst werden Neue
127. er Diskussion 123 Transkription der CHS belegt Mackerness 2001 Die Aktivierung weiterer Flavo noidbiosynthese Gene in H L deutet an dass die Expression der Gene der Flavo noidbiosynthese durch Transkriptionsfaktoren bergeordnet reguliert wird Bruce et al 2000 Hemm et al 2001 Die Aktivierung der Gene der Flavonoidbiosynthese k nnte auf einen spezifischen UV B Rezeptor zur ckf hrt werden Die Photolyase ist jedoch wegen der fehlenden Coexpression zu den Flavonoidbiosynthese Genen als Rezeptor fragw rdig 4 9 PAR Schwellenwert In Kapitel 3 2 2 sind die Unterschiede der Expression der Gene der Flavonoidbio synthese unter den beiden Bestrahlungsversuchen des Szenarios M H dargestellt Beide Experimente waren jeweils mit hoher UV B Bestrahlung und 1000 V320 bzw 700 umol m s V323 PAR Hintergrund durchgef hrt worden Die Expressionsda ten der Versuche wurden nicht zusammengef hrt da die Induktionen sehr unter schiedlich waren Die Konzentrationen an Quercetinderivaten waren in V323 niedri ger als in V320 Die niedrigere Konzentration in V323 legt die Vermutung nahe dass ein Schwellenwert von mindestens 700 pmol m s ber die Vegetationsperiode notwendig ist um die Pflanze bei hoher UV B Bestrahlung ausreichend mit Querce tinderivaten auszur sten Ferner kann festgestellt werden dass das Expressionsver halten der Flavonoidbiosynthese Gene in V323 dem des Szenarios L H hnelt w h rend das bei V320 dem d
128. er behaftet ist Die Genexpression der Flavonoidbiosynthese zeigte sich bei H H nicht mehr UV spektralabh ngig Dieses Verhalten der Genaktivit t widersprach prinzipiell den Mo dellvorstellungen der Wirkungsspektroskopie die an der Pflanze bei h herer Be strahlungsenergie einen gr eren biochemischen Effekt unterstellt als das bei nied rigeren Energiestufen der Fall sein m sste Die untersuchten Gene waren jedoch bei L H und auch bei H L induziert Vergleicht man die Ergebnisse mit den Metabolitda ten so ergeben sich daraus zwei Fragen 1 Wieso sind die Gene bei dem Szenario H H nicht mehr aktiv 2 Wieso sind die Gene bei H L aktiv Auf den ersten Blick w rde man vermuten dass diese Ergebnisse betrachtet man zun chst nur die Transkription der F3 H das genaue Gegenteil des Metabolitenbil des wiederspiegeln in dem sich die Quercetinderivate fast gegenl ufig darstellen Die physiologischen Vorg nge in der Pflanze pr sentierten sich nach der Bestrah lungsperiode wesentlich komplexer als man das auf den ersten Blick annehmen konnte Um sich das Verhalten der Gene mit dem Verlauf der Schutzmolek le zu er Diskussion 117 kl ren m ssen die Aspekte der Akklimatisierung und die sich daraus ableitende UV B Absorptionskapazit t betrachtet werden Der PAR abh ngige Aufbau an Schutzmolek len vollzieht sich wahrscheinlich in den ersten Tagen der Strahlungsexposition Bei der Endpunktbestimmung liegt in der oberen Epider
129. er vorliegenden Ar beit wurden an die Firma MWG in Auftrag gegeben 2 3 2 9 PCR aus genomischer DNA Mullis amp Faloona 1987 Genomische Array Proben wurden mit genspezifischen Primern gewonnen Das Re aktionsvolumen betrug dazu 50 ul bestehend aus 5 ul 10x PCR Puffer 15 mM MgCle 1 ul 10 mM dNTPs 1 5 ul 10 uM Primer a 1 5 ul 10 uM Primer b 1 ul Taq Polymerase 5 U ul 5 ul DNA 200 ng ul und 35 ul HeObidest Das PCR Programm enthielt einen Vorabdenaturierungsschritt von 95 C f r 5 min und 30 sec Im Anschluss folgten 40 Zyklen mit 95 C f r 1min Annealing Temperatur f r Pri 52 Material und Methoden mer a und b 52 58 C f r 45 sec und 72 C f r 2 min Zum Abschluss des PCR Programms wurden zus tzlich 72 C f r 7 min programmiert Die Gr e des PCR Produkts wurde mittels eines DNA Standards in einer Agarose gel Elektrophorese ermittelt Damit die genomisch gewonnenen DNA Fragmente in einer gemeinsamen PCR mit den ESTs amplifiziert werden konnten wurden sie im Anschluss gem den Kapiteln 2 2 2 2 2 2 2 4 in den Vektor pGEM T ligiert und in den Bakterienstamm JM109 transformiert RNA Gewinnung f r Hybridisierung der DNA Arrays Aus 150 mg dismembriertem Pflanzenmaterial wurde gem Chang et al 1993 Gesamt RNA extrahiert Die Konzentration ng ul wurde bei einer Wellenl nge von 260 nm photometrisch bestimmt Parallel dazu wurde zur Reinheitskontrolle der RNA das Verh ltnis 260
130. eraturverzeichnis 133 H rtensteiner S Chinner J Matile P Thomas H amp Donnison S 2000 Chlorophyll breakdown in Chlorella protothecoides charcterization of degreening and cloning of degreening related genes Plant Mol Biol 42 429 450 Horvath D M amp Chuna N H 1996 Identification of an immediate early salicylic acid inducible to bacco gene and characterization of induction by other compounds Plant Mol Biol 31 1061 1072 Hou S M Nori P Fang J L amp Vaca C E 1995 Methylglyoxal induces hprt mutation and DNA adducts in human T lymphocytes in vitro Environ Mol Mutagen 26 286 291 Hudson B J F amp Lewis L I 1983 Polyhydroxy flavonoid antioxidants for edible oils Structural criteria for activity Food Chem 10 47 55 Ibdah M Krins A Seidlitz H K Heller W Strack D amp Vogt T 2002 Spectral dependence of flavonol and betacyanin accumulation in Mysembryanthemum crystallinum under enhanced ul traviolet radiation Plant Cell Environ 25 1145 1154 Jansen M A K Babu T S Heller D Mattoo A K amp Edelman M 1996 Ultraviolet B effects on Spirodela oligorrhiza induction of different protection mechanisms Plant Sci 106 217 223 Jansen M A K Gaba V Greenberg B M Mattoo A K amp Edelman M 1996 Low threshold levels of ultraviolet B in a background of photosynthetically active radiation trigger rapid deg radation of the D2 pr
131. erst tzung bei meiner Dissertati on Herrn PD Dr Christian Langebartels f r die berlassung dieses interessanten The mas und f r die kritische berpr fung der Manuskripte Herrn Prof Dr Gert Forkmann f r die bereitwillige bernahme des Koreferats Herrn Prof Dr Gerhard Wenzel f r seine Bereitschaft die Pr fungskommission zu leiten Herrn Prof Dr Heinrich Sandermann f r die hervorragende interdisziplin re Integra tion am Institut f r Biochemische Pflanzenpahtologie Herrn Dr habil Dieter Ernst f r die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe Molekulare Phytodiagnostik und f r die Betreuung dieser Arbeit Herrn Dr Werner Heller f r seine st ndige Diskussionsbereitschaft und f r seine fun dierte fachliche Betreuung hinsichtlich sekund rer Pflanzeninhaltsstoffe Herrn Dr Harald Seidlitz und seinen Mitarbeitern der Abteilung Experimentelle Um weltsimulation f r die Planung und die Durchf hrung der Bestrahlungsversuche Herrn PD Dr Anton Schaffner f r die Bereitstellung der spezifischen 3 UTR Proben Herrn Dr Andreas Krins f r die spektralanalytischen Modellierungen Herrn Dr Gerhard Welzl vom Institut f r Biomathematik und Biometrie f r die Bera tung bei statistischen Problemen Frau Susanne Stich f r die zuverl ssige Durchf hrung der HPLC Analytik 156 Danksagung Dem Bayerischen Staatsministerium f r Wissenschaft Forschung und Kunst das im Rahmen des Bayerischen Forschungsverbundes
132. es Szenario H H n her steht Die unterschiedliche UV B Induktion der vermutlichen Photolyase CPDI bei V320 und V323 in Abbildung 4 4 deutet einen vermuteten Grenzwert an PAR an Die Geninduktionen fallen in V323 nicht in der Deutlichkeit des Szenarios L H aus was in den vergleichsweise h heren Konzentrationen an Quercetinderivaten seine Ursache haben k nnte In Versuch V323 war der Gehalt an Sinapoylglukose relativ hoch Obwohl den Sinapins urees tern f r den UV B Schutz keine bedeutende Rolle zugeschrieben wurde k nnten die Molek le in V323 zus tzlich UV B Strahlung filtern und dadurch w ren die Gene des oxidativen Stresses weniger aktiv als in Szenario L H Wurden die Versuche V320 und V323 des Szenarios M H in die Clusteranalyse mit einbezogen so war die Ten denz der Geninduktion in V323 jedoch dem Szenario L H hnlich w hrend das Ex pressionsmuster aus Experiment V320 dem Szenario H H entsprach 124 Diskussion 3 4 e N bei oO S p lt 0 05 5 N lt 2 a o o 1 5 u Si x UI en 0 T T l T T WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 mm Experiment V323 Szenario M H Experiment V320 Abbildung 4 4 Genexpression der CPDII V320 PAR 1000 pmol mei V323 PAR 700 pmol m s Die Abbildung zeigt die UV B Reaktion einer vermutlichen CPDII Photolyase in den Experimenten V320 und V323 M H Die Photolyase war nur bei V323 durch UV B Strah
133. esponse to blue light Plant J 18 551 556 Literaturverzeichnis 137 Nogues S amp Baker N R 1995 Evaluation of the role of damage to photosystem Il in the inhibition of CO assimilation in pea leaves on exposure to UV B radiation Plant Cell Environ 18 781 787 Oberholzer V Durbin M L amp Clegg M T 2000 Comparative genomics of chalcone synthase and Myb genes in the grass family Genes Genet Syst 75 2000 O Grady K Goekjian V H Naim C J Nagao R T amp Key J L 2001 The transcript abundance of GmGT 2 a new member of the GT 2 family of transcription factors from soybean is down regulated by light in a phytochrome dependent manner Plant Mol Biol 47 367 378 Orth A B Teramura A H amp Sisler H D 1990 Effects of ultraviolet B radiation on fungal disease development in Cucumis sativus Amer J Bot 77 1188 1192 Paiva N L Sun Y Dixon R A VanEtten H D amp Hrazdina G 1994 Molecular cloning of isofla vone reductase from pea Pisum sativum L evidence for a 3R Isoflavone intermediate in pisatin biosynthesis Arch Biochem Biophys 312 501 510 Panagopoulos Bornman J F amp Bj rn L 1992 Response of sugar beet plants to ultraviolet B 280 320 nm radiation and Cercospora leaf spot disease Plant Physiol 84 140 145 Paz Ares J Ghosal D Wienand U Peterson P A amp Saedler H 1987 The regulatory c1 locus of Zea mays encodes
134. ete Metho de wurde am MPI f r Molekulare Pflanzenphysiologie etabliert Colebatch et al 2002 Hierbei handelt es sich um ein lineares Verfahren Der Algorithmus unterstellt dass die Summe aus allen gemessenen Spots unabh ngig von der jeweiligen Be handlung ann hrend die gleiche ist Diese Annahme kann nur gemacht werden wenn sich eine ausreichende Zahl an Genen auf dem Array befindet Die Annahme w re jedoch ung ltig wenn eine selektive Auswahl von z B nur 100 Stressgenen stattf nde W rden bei einem solchen Array die meisten Gene auf einen Stressor reagieren k nnte nur wenig Effekte geltend gemacht werden Der eigene DNA Array war jedoch mit 579 Genen f r dieses Verfahren geeignet Die Signalintensit ten wur den zun chst auf den Arrays gemessen Zu diesem Zweck wurde die Software Ar rayVision5 1 verwendet InterFocus Die Einstellungen der Software waren so zu w hlen dass nur die Pixelintensit ten gemessen wurden Zus tzliche Einstellungs m glichkeiten wie Hintergrundabzug Normalisierungsverfahren und Referenzge nauswahl waren laut Benutzerhandbuch zu deaktivieren Die Zuordnung der Punkte war im Programm so einzustellen dass jeder Spot durch seine Koordinate definiert war z B R1 C1 r1 c1 Die gemessenen Daten aus der Referenz und cDNA Hybridisierung wurden ber die Expressionsdatenbank HARUSPEX normalisiert Die Referenzhybridisierung diente sowohl der qualitativen berpr fung der P
135. ette UV B unbeeinflusst darstellt Tats chlich konnte an epidermalen Transmissionsstudien gezeigt werden dass UV Pigmente der Epidermis mehr als 90 der einfallenden UV B Strahlung absorbieren k nnen DeLucia et al 1992 Die Reaktionen der Gene der Flavonoidbiosynthese auf UV B Strahlung k nnen demnach indirekte Effekte sein die je nach Ausstattung an Schutzmolek len haupt sachlich die mRNAs der Mesophyllzellen betreffen In dieser Blattschicht sind die Konzentrationen an Flavanoiden sehr gering trotzdem ist eine vergleichsweise star ke Expression metabolisierender Gene zu beobachten was ebenfalls darauf hindeu tet dass dort die Pigmentgehalte nicht mit dem Genexpressionsmuster korrelieren Kalbin et al 2001 Die Aktivierung eines Gens f hrt demnach nicht zwingend zur Erh hung der entsprechenden Metabolitkonzentration 118 Diskussion Die Ergebnisse des H L Szenarios k nnen ebenfalls mit der epidermalen Transmis sion erkl rt werden Lagen dort relativ niedrige Konzentrationen an Derivaten von Quercetin vor reichte nach 14 d Bestrahlung eine relativ niedrige Intensit t an UV B Strahlung aus um subzellul re Reaktionen der Gene der Flavonoidbiosynthese aus zul sen ohne sich jedoch auf der Ebene der Metaboliten fortzusetzen F r ein detai lierteres Bild der Akkumulation an Quercetinderivaten m ssten die Biosynthese Proteine unter den verschiedenen Bestrahlungsregimen hinsichtlich Translationsrate und Enzymaktivi t n
136. etti et al 1999 Ibdah et al 2002 sowie das generalisierte Pflanzenwirkungsspektrum nach Caldwell 1971 Das letztere stellt eine Synthese aus verschiedenen experimentellen Daten dar die meist auf monochromatischer UV Strahlung beruhten Die Summe dieser Daten f hr te zu einer Formel die zudem oberhalb 313 nm willk rlich gleich null gesetzt wurde Die anderen Wirkungsfunktionen die mit realistischer polychromatischer also son nen hnlicher Strahlung gewonnen wurden wie auch in der vorliegenden Arbeit zei gen einen flacheren Verlauf unabh ngig vom betrachteten Endpunkt Ghetti et al 1999 Photoinhibition Ibdah et al 2002 Mesembryanthinbildung Quaite et al 1992 DNA Sch digung vorliegende Arbeit Akkumulation an Quercetinderivaten Der Unterschied in den Steigungen dieser Wirkungsfunktionen d rfte wegen der ex perimentellen Unsicherheiten nicht signifikant sein Unter diesem Gesichtspunkt ist die hnlichkeit der Verl ufe bemerkenswert Sie deutet m glicherweise darauf hin dass viele UV induzierten Prozesse in der Pflanze auf einen gemeinsames Prim r signal zur ckzuf hren sind Einen Hinweis darauf haben fr here Experimente mit transgener Arabidopsis ergeben bei denen das Auftreten von Pyrimidindimeren im Genom von Pflanzen zu einer Reorganisation und Destabilisierung des Genoms der Pflanze f hrte Ries et al 2000 Alle polychromatischen Wirkungsfunktionen weisen eine signifikante Komponente im UV A Bereich auf
137. flanze signifikant erh ht vor lag Berkelaar et al 1996 In Versuchen mit realistischeren Freilandwerten konnte diese Beobachtung ebenfalls gemacht werden was in Bohnen bei einer biologisch effektiven Tagesdosis von 6 2 kJ m d UV Bge in Kombination mit drei verschie denen PAR Hintergr nden 700 500 230 umol m s gezeigt wurde Cen amp Born man 1990 Die PAR Abh ngigkeit der UV B Reaktion konnte berdies bei einer Freilandsimulation in Glycine max festgestellt werden in der die UV B Antwort bei 1400 umol m s PAR schw cher ausgepr gt war als bei niedrigem PAR Hintergrund Mirecki amp Teramura 1984 Gest tzt durch diese Ergebnisse kann an genommen werden dass die PAR Abh ngigkeit der UV B Antwort relativ unabh n gig von dem Niveau der PAR Stufen stattfinden k nnte Ob h here Bestrahlungs st rken als 1300 umol m s die Akkumulation an Quercetinderivaten weiter anstei gen lassen ist nicht zu erwarten da in einem Experiment mit 2000 umol m e PAR kein zus tzlicher Anstieg festzustellen war Bestrahlungsst rken von 2000 umol m s k nnen in der Natur nur an extrem sonnigen Tagen gemessen werden Dauerhaf 114 Diskussion te Expositionen unter diesen Bedingungen f hren demnach zu einem Stresszustand den die Pflanze nicht mehr durch eine Erh hung des Grundschutzes ausgleichen kann 4 4 Akklimatisierung von Pflanzen an Strahlungsbedingungen Der Begriff Akklimatisierung beschreibt e
138. ge Platte aufgelegt wurde sind die Membranen mit einer Haushaltsfolie eingewickelt worden Eingelesen wur den die radioaktiven Signale mit dem Scanner FLA3000 Fuji mit 50 um Aufl sung Die Entfernung der hybridisierten CDNA wurde nach den Beschreibungen von Ambi on durchgef hrt Die vollst ndige Entfernung der Sonden konnte durch eine erneute Exposition berpr ft werden 58 Material und Methoden 2 4 Biochemische Methoden 2 4 1 HPLC phenolischer Inhaltsstoffe Die HPLC von l slichen Quercetin und Kaempferolderivaten sowie den Estern der Sinapins ure erfolgte nach Turunen et al 1999 Die Strukturformeln und Chroma togramme der UV absorbierenden Metaboliten sind in Abbildung 3 1 dargestellt Die Molek lstrukturen waren bereits bekannt Veit amp Pauli 1999 Das bei 80 C eingelagerte Pflanzenmaterial wurde im gefrorenen Zustand dis membriert und danach bei 4 C f r 16 h mit Methanol extrahiert Die anschlie ende Zentrifugation verlief bei 11000 Upm Der berstand wurde bei 80 C f r weitere Analysen aufbewahrt Die Metaboliten konnten durch eine HPLC Gold Beckman in einer Spherisorb ODSII S ule Bischof getrennt werden Proben Methanol H20 75 25 v v Injekti onsvolumen 10 ul wurden von der S ule durch einen L sungsmittelgradienten elu iert Dieser bestand aus L sungsmittel A 980 ml H2O 20 ml 5 Ammoniumformiat gel st in 98 iger Ameisens ure und L sungsmittel B 882 ml Methanol 96 ml H2O
139. gebnisse 109 Tabelle 3 13 Statistische Zusammenfassung der quantitativen RT PCR von AtGSTF2 At4902520 sst E p kntischerF_ Signifkanz_ induktion UV B UV A ohne UV B ro ae T GC EE HO Genexpression nicht spektralabh ngig im UV Bereich H1 Genexpression spektralabh ngig im UV Bereich signifikant p lt 0 05 hoch signifikant p lt 0 01 sehr hoch signifikant p lt 0 001 3 9 Photosynthetische Pigmente Die Pigmentanalytik ist momentan noch nicht f r alle Bestrahlungsvarianten durchge f hrt worden Die vorl ufigen Ergebnisse sind deswegen in Anhang B abgebildet Untersucht wurden die Pigmente des Photosystems II der Versuche V318 und V320 Bei der Gegen berstellung der Versuche ergaben sich erniedrigte Konzentrationen an Chlorophyllen und Xanthophyllen in V318 aufgrund der 300 umol m s h heren PAR Bestrahlungss rke dieses Versuches Des weiteren konnte gezeigt werden dass in V318 eine Reduktion der Pigmentkonzentrationen im Strahlungsbereich der UV B Strahlung stattfand die bei V320 nicht zu beobachten war Neben diesen Un terschieden konnte in beiden Bestrahlungsversuchen kein a Carotin und kein Zea xanthin gemessen werden 110 Diskussion 4 Diskussion 4 1 Biologisches Wirkungsspektrum Abbildung 4 1 zeigt in logarithmischer Darstellung den Verlauf des Wirkungs spektrums aus Kapitel 3 7 im Vergleich zu einigen weiteren experimentellen und pflanzlich orientierten Spektren aus der Literatur Gh
140. h bis in den UV A Bereich erstreckt In einer k rzlich erschienenen Revision des generalisierten Pflanzenwirkungsspek trums legen Flint und Caldwell Flint amp Caldwell 2003 eine Wichtungsfunktion vor die sich bis in den UV A Bereich erstreckt Da die Wirkung auf die Pflanze aus dem Produkt aus Wirkungsfunktion und spektraler Bestrahlungsst rke bestimmt wird und im Sonnenspektrum die UV A Komponente um zwei bis drei Gr enordnungen in tensiver ist als im UV B Bereich darf auch die UV A Komponente f r die UV Wirkung nicht unber cksichtigt bleiben Einleitung 13 1 3 Wirkung von UV Strahlung auf Pflanzen 1 3 1 kologische Auswirkungen Pflanzen sind von Natur aus der UV Strahlung ausgesetzt UV Strahlung ist aber nicht nur sch dlich f r die Pflanzen sondern sie ist f r die Entwicklung von Wurzeln Sprosse und Bl ten notwendig Weiterhin regeln UV Strahlen die ffnung der Sto mata und den Phototropismus Eisinger et al 2000 Das Risiko negativer Einfl sse von UV Strahlung auf Pflanzengemeinschaften durch den stratosph rischen Ozonabbau wird in erster Linie von der UV B Strahlung zu erwarten sein Dies begr ndet sich dadurch dass die bodennahen UV A Komponenten unabh ngig vom Absorptionsverm gen des stratosph rischen Ozons die Erdoberfl che erreichen UV B Studien wurden zu einem gro en Teil transient an Einzelpflanzen durchgef hrt Welche langfristigen Auswirkungen UV B Strahlung auf Pflanzengemeinschaften ausl sen
141. heim Polyvinylpyrrolidon K 30 SIGMA Aldrich Chemie Steinheim Randomhexamere Invitrogen Life Technologies Karlsruhe Rinderserumalbumin BSA Fraktion V SIGMA Aldrich Chemie Steinheim Salmonsperm DNA Boehringer Mannheim Spermidine SERVA Heidelberg Sulfosalicylsaure Merck Darmstadt Trichloressigsaure Merck Darmstadt Tris hydroxymethyl aminomethan Biomol Feinchemikalien GmbH Hamburg Triton X 100 SIGMA Aldrich Chemie Steinheim Tween 20 SIGMA Aldrich Chemie Steinheim Xylencyanol Merck Darmstadt Material und Methoden Radiochemikalien 35 a P dATP Redivue Amersham Pharmacia Biotech Freiburg y SP dATP Redivue Amersham Pharmacia Biotech Freiburg o P dATP Redivue Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Molekularbiologische Handelsprodukte GenomeStar Hybaid AGS Heidelberg NucleoSpin 96 Flash Macherey Nagel D ren Omniscript RT Kit Qiagen Hilden oGEM T Easy Vector System Promega GmbH Mannheim Qiaprep Miniprep Kit Qiagen Hilden QlAquick Gel Extraction Kit Qiagen Hilden QlAquick PCR Purification Kit Qiagen Hilden Quantitect SYBR Green PCR Kit Qiagen Hilden Strip EZ DNA Ambion Austin UK Strip EZ RT Ambion Austin UK ULTRAhyb Ambion Austin UK Enzyme und Enzyminhibitoren DNa
142. hutz angesehen werden der ferner nicht durch PAR beeinflusst war Die Experimente deckten auf dass Arabidopsis zum UV B Schutz bevorzugt Quercetinverbindungen produziert Eine m gliche Erkl rung ist dass Quercetin neben seiner Absorptionseigenschaft ein ausgesprochen hohes anti oxidatives Potential besitzt Die Induktionen der Gene des Biosyntheseweges der Flavonoide waren in der Simu lation H H nicht mehr UV spektralabh ngig Sie hatten jedoch eine deutliche Reakti on auf UV B Strahlung in den Szenarien L H und H L Die Ergebnisse deuten darauf hin dass am Ende der Periode des vegetativen Wachstums in erster Linie das UV Abschirmverm gen ausschlaggebend f r die zellul re Aktivierung von Transkripten der Flavonoidbiosynthese war Die Pflanzen waren bei hohen Konzentrationen an Quercetinderivaten aufgrund der epidermalen Absorptionseigenschaften der Molek le nicht mehr auf die Aktivit t metabolisierender Gene angewiesen so dass nur mit relativ unrealistischen Bestrahlungsbedingungen die Gene der Flavonoidbiosynthese hohe Aktivit t zeigten um damit den fehlenden Grundschutz zu erg nzen Expressionsstudien mit 579 ausgew hlten Stressgenen konnten zeigen dass 28 Gene ausschlie lich in der Simulation L H durch UV B zu induzieren waren Node 73 und 78 der Clusteranalyse Die Funktionszuordnung der Gene machte deutlich dass sie zum gro en Teil f r Enzyme kodieren die in der Vegangenheit mit einem oxidativen Stress in der Pflanze in
143. hyljasmonsaure Ethylen die Infektion Pseudomonas syringe und Sulfonylharnstoffe eine deutliche Induktion dieses Gens bewirkt Glombitza et al 2004 Wegen der sehr starken Homologie zu AtGSTF2 k nnten AtGSTF3 und AtGSTF7 eine hnliche Funktion ausf hren L H H H H L e E E oS oe e gt gt gt gt gt gt 55353555 Glutathion S Transferase EST At1g02930 Glycinreiches RNA Bindeprotein EST At2g21660 Glutathion S Transferase Atom 24 1 3 UTR Probe At4g02520 Vermutliche Glukosyltransferase 3 UTR Probe At3g02100 Vermutliche Glutathion S Transferase 3 UTR Probe A2902930 Vermutliche Glutathion S Transferase EST At1g02930 Glutathion S Transferase 3 UTR Probe Atig02920 Chlorophyllbindendes Protein Typivon PSII EST At2g34420 Abbildung 3 24 Clusteranalyse der Genexpressionswerte der Szenarien L H H H und H L Die Abbildung zeigt Node 107 Die Gr nintensit t visualisiert das Ausma der Reprimierung durch UV B Strahlung Die rote Farbe zeigt an dass die Gene in ihrer Expression induziert sind im Ver gleich zur Kontrolle aus WG320 F r die m glichen Funktionen der Transkripte siehe Text Neben den Vertretern der Glutathion S Transferasen war die Glukosyltransferase At3g02100 UGT83A1 und das glycinreiche RNA Bindeprotein At2921660 durch UV B Stahlung abreguliert Die Transkripte dieser RNA bindenden Proteine konnten in der Vergangenheit in Sinapsis alba als zirkadian reguliert beschrieben werden Heintzen et al
144. ie chemischen Strukturen wurden durch die Kombination von NMR Spektroskopie Nukleare Magnetische Resonanz Massen und UV Spektroskopie sowie der chira len Kapillar Elektrophorese identifiziert Die strukturanalytischen Daten der Verbin dungen sind detailliert in der Ver ffentlichung von Veit amp Pauli 1999 zusammenge fasst Die daraus abgeleiteten Strukturformeln sind in Abbildung 3 1 dargestellt 68 Ergebnisse K3 0 04 wi 0 03 F K2 OH LE a i E Oo K1 a2 o OH 0 COOH Q 0 02 Q3 MeO en O z e 3 HO S Q1 OMe ge OMe 2 001 fo 2 lt S1 s2 0 00 t WJ w A S1 S3 0 20 25 30 35 Rententionszeit min SS on OH SE EE amp Ce Q SL Ronee Renee Ga HOT s OH x Ou x on OH OH Gees OH OH cou OH OH L OH HON OO 0H HO Aon ih ou HO OH OH OH OH OH K1 01 K2 Q2 K3 Q3 K1 K2 und K3 R1 H Q1 Q2 und Q3 R1 OH Abbildung 3 1 Chemische Strukturen der analysierten Pigmente Si und S3 Sinapinapoyl 1 O D Glukosid und 1 O Sinapoyl L Malat S2 des HPLC Chroma togramms zeigt eine Sinapins ureverbindung unbekannter chemischer Struktur an Die Quercetin Q1 Q3 und Kaempferolderivate K1 K3 unterscheiden sich durch die Hydroxylierung an der 2 Position R1 Die glykosidische Konjugation ist bei K1 Q1 und K2 Q2 sowie K3 Q3 jeweils gleich K1 Q1 3 O B D Glukopyranosyl 6 1 B D Glukopyranosid 7 O a L Rhamnopyranosid K2 Q2 3 O B D Glukopyranosid 7 O a L Rhamnop
145. in producing skin cancer a theoretical analysis Proc Natl Acad Sci USA 71 3363 3366 Sheahan J J amp Rechnitz G A 1999 Differential visualization of transparent testa mutants in Arabidopsis thaliana Anal Chem 65 961 963 Shimizu T Akada S Senda M Ishikawa R Harada T Niizeki M amp Dube S K 1999 En hanced expression and differential inducibility of soybean chalcone synthase genes by sup plemental UV B in dark grown seedlings Plant Mol Biol 39 785 795 Shirley B W Kubasek W L Storz G Bruggemann E Koorneef M Ausubel F M amp Goodman H M 1995 Analysis of Arabidopsis mutants deficient in flavonoid biosynthesis Plant J 8 659 671 Sidler M Hassa P Hasan S Ringli C amp Dudler R 1998 Involvement of an ABC transporter in a developmental pathway regulating hypocotyl cell elongation in the light Plant Cell 10 1623 1636 Siefermann Harms D 1988 One step separation of carotene and xanthophyll isomers chlorophylls and pheophytins J Chromatogr 448 411 416 Literaturverzeichnis 139 Skipsey M Andrews C J Townson J K Jepson I amp Edwards R 2000 Cloning and characteri zation of glyoxalase from soybean Arch Biochem Biophys 374 261 268 Smart C C amp Flemings A J 1996 Hormonal and environmental regulation of a plant PDR5 like ABC transporter J Biol Chem 271 19351 19357 Stanewsky R Kaneko M Emery P Beretta
146. inen Reaktionszustand der Pflanze der nach l nger anhaltender Bestrahlungsdauer weniger aktiv ist als zu Beginn der Ex position W hrend der Akklimatisierungsphase an erh hte Strahlungsbedingungen ereignen sich im Organismus ausgepr gte biochemische Reaktionen Die starke Antwort zu Beginn setzt oft schon nach wenigen Stunden Bestrahlung ein In wel chem Ausma diese Akklimatisierungsreaktionen stattfinden ist in erster Linie von den Vorkultivierungs und den physikalischen Bestrahlungsst rken abh ngig In Cy anobakterien sind die Anpassungsreaktionen an Hochlichtbedingungen sehr ausge pr gt wobei bereits nach 15 min Bestrahlung eine Vielzahl an Transkripten der Pho tosynthese induziert wird Hihara et al 2001 Der Begriff Hochlicht unterliegt dabei in der Literatur keinen definierten Strahlungsin tensit ten so dass in den eigenen Versuchen bei einer PAR von 500 umol m s von Niedriglicht gesprochen wird w hrend andere dieses Niveau bereits als Hoch licht festlegen Bailey et al 2001 Die Pflanze zeigt nach einer UV B Exposition schon nach einem Tag eine gesteiger te Aktivit t an antioxidativ wirksamen Genen Bei gleichbleibender UV B Bestrahlung ber mehrere Tage geht diese Aktivit tserh hung verloren Jansen 1998 Auf wel chen molekularen Grundlagen diese Beobachtungen beruhen ist weitgehend unbe kannt Das Ausbleiben der UV B Reaktion nach mehreren Tagen Bestrahlung kann physiologisch bedeuten dass die Pflanze
147. ktrometer Bentham Reading Berkshire UK Sigma 2 K15 Laborzentrifuge Sigma GmbH Osterode Spektrofluorimeter Modell RF530 Shimadzu Duisburg Spektrophotometer Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Spherisorb ODSII Typ NC 4 6 x 250 nm 5 um mit Vors ule Bischoff Leonberg Szintillationszahler LS1801 Beckman Coulter GmbH UnterschleiBheim TaqMan ABI 7700 SDS Perkin Elmer Langen Termocycler Express Hybaid Heidelberg Thermocycler MJ PTC 100 MJ Research Waltham USA Thermocycler MJ PTC 200 MJ Research Waltham USA Thermocycler Sprint Hybaid Heidelberg Tragbarer Kontaminations monitor LB1210B Berthold Bad Wildbad Material und Methoden 33 Univapo 100H Uniequip Martinsried UV Stratalinker Stratagene La Jolla USA Waage 0 01 g Sartorius AG G ttingen Chemikalien B Mercaptoethanol SIGMA Aldrich Chemie Steinheim NH4 2SO4 Merck Darmstadt 5 Brom 4 Chlor 3 Indolylphosphat BCIP Boehringer Mannheim 5 Bromo 4 Chloro 3 Indolyl B D Galaktopyranosid X Gal Boehringer Mannheim Agarose Ultrapure Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Borsaure SIGMA Aldrich Chemie Steinheim Bromphenolblau SIGMA Aldrich Chemie Steinheim Chloroform Merck Darmstadt Chloroform Phenol Isoamylalkohol DH 5 2 24 25 1 v v Invitrogen Life Technologies
148. leiche Absorptionskapazit t aufweisen Stephan 1996 Die Wichtigkeit der Flavonoiden als UV B Schutz in der Pflanze ergibt sich auch da durch dass Quercetin im Zellkern direkt an der DNA entdeckt wurde und infolgedes Einleitung 27 sen UV B bedingte Mutationen am Erbgut effektiver abgeschirmt werden k nnen als mit zellsaftgel sten Sinapins urederivaten Ahmed et al 1994 euler C3H COOH HO HO Kaffeesaure p Cumars ure OMT CH COOH ee HO O O Ferulas ure ICH Ge N Sn MgO x EE el HO 3 HO OMe OMe MeO xa COOH Sinapoylcholin Sinapoylmalat noe OH 5 Hydroxyferulasaure SCT SMT OMT e MeO e COOH CH OH SGT 2 00 Z OMe HO HO OH OMe OH OMe Sinapinsaure Sinapoylglukose Abbildung 1 7 Biosynthese UV absorbierender Sinapins ureester aus Ruegger et al 1999 Das Enzym p Cumars ure 3 Hydroxylase C3H katalysiert im ersten Schritt der Biosynthese die Kaf feesaure Durch eine Methylierungsreaktion mit Hilfe einer Methyltransferase OMT wird Ferulasaure metabolisiert Diese wird an C5 hydroxyliert mit Hilfe von Ferulas ure 5 Hydroxylase F5H und nochmals methyliert OMT so dass freie Sinapins ure entsteht Die beiden Hauptformen sind Sina poylglukose und Sinapoylmalat Die katalysierenden Enzyme sind Sinapins ure Glukosyltransferase SGT und Sinapoylglukose L Malat Sinapoyltransferase SMT Sinapoylcholin wird durch das En zym Sinapoylglukose Cholin Sinapoyltransferase synthetisiert SC
149. lung signifikant induziert in Relation zur Expression von WG320 4 10 Ausblick Um die kausale Rolle der Quercetinderivate im Zusammenhang mit der UV B Abschirmung weiter verfolgen zu k nnen waren Versuche mit Mutanten notwendig welche nicht in der Lage sind diese Metaboliten herzustellen Zu diesem Zweck w r de sich die tt7 Mutante anbieten Der Verlust der Substrataffinit t in der F3 H ist durch eine C zu T EMS Mutation an Triplett 113 verursacht Wildtyp T AA Glu tamin Q Koorneef 1990 Schoenbohm et al 2000 Die Mutante tr gt aber den genetischen Hintergrund des kotyps Landsberg erecta und Ergebnisse k nnten daher nicht mit den bisherigen verglichen werden Sinnvoller w re der Ansatz eines transgenen Wildtyps Columbia bei der das Enzym durch ein Antisense Konstrukt nicht mehr translatiert wird Mit den transgenen Arabidopsis h tte man im Szenario H H die M glichkeit die Funktion der Quercetinderivaten im Zusammenhang mit der UV B Abschirmung zu berpr fen Des weiteren k nnte die Regulation der Gehalte an Quercetinderivaten in der f he ren Phase der Bestrahlungsperiode Gegenstand weiterer Untersuchungen sein In Diskussion 125 erster Line ist in diesem Zusammenhang an Experimente mit Mutanten der Phytoch romrezeptoren zu denken um damit zu Beginn der Strahlungsperiode den Einfluss der Rezeptoren auf die Anreicherung an Quercetinderivaten einsch tzen zu k nnen Es ist gezeigt dass die UV B Induktion
150. m Lichtstimulus und den zellul ren Regulationssystemen vermittelt werden Der Lichtreiz muss von der Pflanze empfangen und weitergegeben werden Die am besten untersuchten Rezep toren in Pflanzen sind die Phytochrome Ihnen wird eine Schl sselfunktion in der Photomorphogenese der Pflanze zugesprochen Phytochrome kommen in zwei Zu standsformen vor die sich in ihrem Absorptionsmaxima unterscheiden Liegt dieses bei 660 nm spricht man von der inaktiven Form w hrend die aktive Form ihr Maxi mum bei 730 nm hat Die Aktivierung und Inaktivierung dieses Photorezeptors ist dabei reversibel und beide Formen stehen aufgrund ihrer berlappenden Absorpti onskurven in einem photodynamischen Gleichgewicht Phytochrome sind Chromoproteine die aus einem Apoprotein und einem kovalent gebundenem offenkettigem Tetrapyrrolsystem aufgebaut sind Die Aktivierung des Rezeptors erfolgt durch die chromophore Quantenaufnahme und die dadurch be dingte Verschiebung der negativen Ladungsstruktur des Proteins welche die Faltung der A Dom ne bewirkt Westhoff et al 1996 Neben dem Absorptionsmaximum im Rotlichtbereich besitzten Phytochrome ein wei teres Maximum im Bereich der UV A Strahlung Komplexe Interaktionen der ver schiedenen Phytochrome PHYA PHYE k nnen zusammen mit den Photorezepto ren der Cryptochrome CRY1 CRY2 die typischerweise Komponenten der UV A Strahlung absorbieren sich auf der Ebene der Genexpression auswirken Feinbaum amp Ausubel
151. man C D Buell R Mol J Koes R amp Walbot V 1998 Functional complementation of anthocyanin sequestration in the vacuole by widely divergent glutathione S transferases Plant Cell 10 1135 1150 Ang L H Chattopadhyay S Wei N Oyama T Okada K Batschauer A amp Deng X W 1998 Molecular interaction between COP1 and HY5 defines a regulatory switch for light control of Arabidopsis development Mol Cell 1 213 222 Arber W amp Leim S 1969 DNA modification and restriction Ann Rev Biochem 38 467 500 Aro E M Virgin I amp Andersson B 1993 Photoinhibition of photosystem Il inactivation protein damage and turnover Biochim Biophys Acta 1143 113 134 Bailey S Walters R G Jansson S amp Horton P 2001 Acclimation of Arabidopsis thaliana to the light environment the existence of separate low light and high light responses Planta 213 794 801 Baldridge G D O Neill N R amp Samac D A 1998 Alfalfa Medicago sativa L resistance to the root lesion nematode Pratylenchus penetrans defense response gene mRNA and isoflavon oid phytoalexin levels in roots Plant Mol Biol 38 999 1010 Balzi D amp Goffeau A 1994 Genetics and biochemistry of yeast multidrug resistance Biochim Bio phys Acta 1187 152 162 Barnes P W Flint S D amp Caldwell M M 1987 Photosynthesis damage and protective pigments in plants from a latitudinal arctic alpine gra
152. mis eine physiologisch relevante Konzentration an Quercetinderivaten vor die das darunter liegende Mesophyligewebe vor UV B Transmission sch tzt Die epidermale Anreicherung h tte eine Gewebespezifiz t der Genexpression zur Folge die sich innerhalb des Blattquerschnittes differentiell zeigen m sste da in der Epi dermis weniger UV B Strahlung zellul r aktiv w re w hrend die biochemische Hauptreaktion in den pigmentarmen Mesophylizellen stattfinden m sste Diese Diffe renzierung konnte bereits f r die CHS in Pisum sativum gezeigt werden Zum einem wurde in dieser Studie gezeigt dass die CHS nach 9 h UV B Exposition in den Me sophylizellen st rker exprimiert war als in der dar berliegenden Epidermis Zum an deren f hrte eine Akklimatisierung der Pflanzen zu einer Abschw chung der gewe bespezifischen Unterschiede Kalbin et al 2001 Die Bestrahlungszeit von 14 Ta gen f hrt zu einer vollkommen akklimatisierten Pflanze die sich ber die Zeit einen physiologisch notwendigen Strahlungsschutz angeeignet hat Liegt im Szenario H H die Konzentration an Schutzmolek len entsprechend hoch in der Epidermis vor f hrt das schlie lich dazu dass in diesem Gewebe keine UV B Antwort von Genen der Flavonoidbiosynthese stattfindet Weiterhin w rde dabei epidermal nahezu die ge samte UV B Strahlung absorbiert werden was eine verminderte Reaktion im Me sophyllgewebe zur Folge hatte und sich letztendlich das gesamte Expressionsbild der Blattros
153. n MS Excel Diese Analyse lieferte schlie lich z 1 k 78 um und 2 2 w 4g mol ae 1 9 mol m l 43 2J m J m Abbildung 3 17 zeigt sowohl die reduzierten gemessenen UV Induktionen der Quer cetingehalte quy mit den zugeh rigen Messunsicherheiten als Balken als auch die mit den obigen Parametern modellierten Werte als Punkte aufgetragen In Anbetracht der einfachen Annahmen und der geringen Zahl unabh ngiger Versuchsvarianten ist die bereinstimmung sehr zufriedenstellend Die gr ten Abweichungen ergeben sich bei Szenarien mit der Filtervariante WG295 doch liegen sie immer noch inner halb der experimentellen Unsicherheit Konzentrationen an Quercetinderivaten 88 Ergebnisse 200 180 160 140 5 120 100 80 60 40 20 nmol cm 200 180 160 140 5 120 100 4 80 60 40 20 nmol cm 200 180 160 140 120 5 100 4 80 60 40 20 nmol cm 200 180 160 140 4 120 4 100 4 80 60 40 20 nmol cm V318 V321 Ch BW es e WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 S WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 V320 e FE V323 l Ba e WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 V325 En e V327
154. n Profiling Die Clusteranalyse als Hilfsmittel zur Sondierung von Genexpressionsdaten wurde erstmals mit Saccharomyces cerevisiae durchgef hrt Eisen et al 1998 Die eigenen Daten master tabels bestehend aus 401 Zeilen genes und 30 Spalten Arrays mussten zun chst einer Transformation unterzogen werden Im ersten Schritt wurden die Werte dazu zur Basis zwei logarithmiert Die Basis zwei ist deshalb gew hlt worden um bei der hnlichkeitsberechnung einer doppelten Induk Ergebnisse 95 tion die gleiche Gewichtung einzur umen wie einer 0 5fachen Reprimierung Im n chsten Schritt erfolgte eine Normierung und eine Standardisierung Sie fand in der Art statt dass von jedem Expressionswert der logarithmierten Matrix der Zeilen und Spaltenmittelwert abgezogen wurden und schlie lich der Gesamtmittelwert addiert wurde Die Matrix enthielt nun Werte deren Zeilen und Spaltenmittelwerte jeweils 0 betrugen Die Normierung hatte zum einen den Zweck dass die Expressionen der Gene auf ihren jeweiligen Mittelwert kalibriert wurden wodurch Tendenzen auf un terschiedlicher Induktionsh he egalisiert waren Die zus tzliche Normierung ber die Spalten Arrays unterlag zum anderen dem Gedanken dass m gliche Unterschie de zwischen den Arrays abzugleichen seien Darunter versteht man systematisch bedingte Fehler die bei der Benutzung unterschiedlicher Kontrollen denkbar sind oder auch noch zu einem gewissen Ma e aus un
155. n dem alle Gene miteinander verbunden 96 Ergebnisse waren Eisen et al 1998 Die Clusteranalyse sollte dazu dienen die Gene zu grup pieren um biologisch interessante Forschungsbereiche zu finden Die Expressions profile dieser Gene konnten im Anschluss aus den Orginaldaten n her in Betracht genommen werden Die Abbildung 3 20 zeigt die Ergebnisse aus der Clusteranalyse Node 78 19 Gene und Node 73 9 Gene enthalten Gene die ausschlie lich im Szenario L H signifikant durch UV B Strahlung zu induzieren waren Die Trennung der Gene in zwei Gruppen beruht auf den deutlicheren UV B Effekt in Node 78 In den Varianten H H und H L waren diese Transkripte durch UV B Strahlung in ihrer Expression unbeeinflusst Die Orginaldaten der Genexpression der beiden Gruppen sind in Abbildung 3 21 und Abbildung 3 22 dargestellt 3 8 5 Zellul re Funktionen der Gene aus Node 78 und 73 Die metabolischen Aufgaben der gruppierten Gene lie en sich allgemein der zellul ren Detoxifikation zuschreiben Sie konnten hierbei in sechs Gruppen eingeteilt wer den A ROS Detoxifikation 5 B CYTP450 Monooxygenasen 6 C Glukosyltransferasen 5 D Zellul re Transportproteine 5 E Glyoxalasen 2 F Andere 5 A ROS Detoxifikation UV B Strahlung kann oxidative Vorg nge in Gang setzten Mackerness et al 1999 Surplus et al 1998 Prim r entsteht nach UV B Einwirkung durch gest rte Redoxvorg nge an der Thylakoidmemb
156. nd diese Gene nicht mehr ben tigt werden Zu Beginn der Bestrahlungsperiode von H H k nnte die Pflanze verst rkt Quercetin zur Radi kalentsorgung produzieren um reaktive Sauerstoffspezies zu detoxifizieren die we gen des begleitenden Hochlichts entsehen m ssten Das biochemische Signal f r die Pflanze mehr Quercetinderivate wie die rote Kurve in Abbildung 4 2 zeigt zu bilden f llt also zu einem fr heren Zeitpunkt der Bestrahlungsdauer Durch diesen Regel mechanismus k nnte sich eine strahlungsadequate Konzentration aufbauen die durch ein Verst rkungssignal der Phytochromrezeptoren geregelt sein k nnte Boccalandro et al 2001 Wenn hohe UV B Strahlung mit niedrigem PAR Anteil kombiniert wird ist zu Vegetationsende ein mangelnder Grundschutz vorhanden der die Aktivierung des zellul ren Detoxifikationssystems verursacht vgl Kapitel 3 8 4 Node 78 und Node 73 4 7 Antioxidative Wirksamkeit von Quercetin Die reduzierende Eigenschaft einer phenolischen Verbindung als Elektronen oder Wasserstoffdonator macht eine biologische Funktion als Reduktionssmittel zur Ent sorgung von zellul ren Radikalen naheliegend Rice Evans et al 1997 Phenole bieten zudem ideale chemische Struktur um freie zellul re Radikale abzufangen Einige Phenole besitzen in vitro ein h heres antioxidatives Potential als Vitamin C oder Vitamin E Rice Evans et al 1996 Dies konnte in der Vergangenheit f r die Entsorgung von Hydroxylradikalen OH
157. nes Gen wurde durch einen intern normalisierten Platzhalter nach Gleichung a ersetzt Um diese Werte noch von detektierten Genen unterscheiden zu k nnen wurden sie mit 1 multipliziert Die negativen Wert wurde schlie lich durch NP dividiert siehe vollst ndige Norma lisierung Die Platzhalter dL eines nicht gemessenen Gens konnten als Mindest Material und Methoden 61 wert betrachtet werden den ein Transkript berschreiten musste um als detektiert zu gelten Vollst ndige Normalisierung Der zweite Normalisierungsschritt bezog sich auf die Werte der Referenzhybridisier ung Im ersten Schritt wurden die Daten der internen Normalisierung unterzogen NR war ein intern normalisierter Wert der Referenzhybridisierung von Spot i des Gens c Dieser wurde nur berechnet wenn SR gt 2 LBR galt War dies nicht der Fall wurde das Gen in der Exressionsliste mit lt nil gt gekennzeichnet und konnte dadurch f r Folgeanalysen ausgeschlossen werden weil sich zu wenig DNA auf dem Spot befand Ein vollst ndig normalisierter Wert VN lie sich durch VN Nei NR be rechnen No war dabei der intern normalisierte Wert aus der cCDNA Hybridisierung des selben Gens Die Korrektur der normalisierten CDNA Werte N mit Referenz werten setzte eine lineare Beziehung zwischen DNA Menge und NR voraus Dieser Zusammenhang konnte in eigenen Versuchen an acht PCR Fragmenten mit einer L nge von 260 1000bp L nge gezeigt werden Die
158. ngszeit wurde die Temperatur f r 1 h auf 37 C erh ht Neben den eigentlichen Proben wurde eine sog NTC Probe her gestellt None Template Control die einen RNA Mix aller Probanden enthielt Zu dieser 10 ul wurden bis auf die Reversen Transkriptase alle Reaktionskomponen ten pipettiert Die NTC Probe diente bei allen RT PCRs als Negativkontrolle zur berpr fung etwaiger DNA Verunreinigungen Zudem konnte mit der Probe festge stellt werden ob die PCR Primerpaarungen unspezifische Produkte bildeten F r die PCR Reaktion wurde der Quantitect SYBR Green PCR Kit der Firma Quiagen verwendet Dieses System arbeitet mit einem Farbstoff der sich in doppelstr ngige DNA einlagert Durch einen Laserstrahl kann die Fluoreszenz dieses Farbstoffs bei 540 nm induziert werden Die Primeroptimierung war f r jedes Gen in einem Vorlauf am TaqMan durchzufth ren Die PCR wurde auf ein Agarosegel aufgetragen und es wurde berpr ft ob das Produkt aus einer diskreten Bande bestand Hierbei war besonders darauf zu achten ob eine Primerkombination eine sog Dimerenfluoreszenz hervorrief Diese entsteht durch das gegenseitige Anlagern beider Primer und f hren zu einem Fehlsignal da auch hier der Inkorporationsfarbstoff eine Fluoreszenz induziert Die Primer wurden so gew hlt dass das Amplifikat eine L nge von 200 300 bp hatte Die Anlagerungs Material und Methoden 55 temperatur war so einzustellen dass sie zwischen 58 C und 62 C lag
159. nis Abk rzung Abk rzung 16Srrn 16S ribosomale RNA OD optische Dichte A Adenosin p Wahrscheinlichkeit ANOVA Varianzanalyse PAR photosynthetisch aktive Strahlung 400 700 nm Atxgyyyyy Gencode fiir Arabidopsis thaliana PCR Polymerasekettenreaktion bp Basenpaare PD generalisiertes Pflanzenwirkungsspektrum nach Caldwell 1971 bZIP basic leucine zipper Protein PHYA PHYE Phytochrom A E c Cytosin psbA D1 Komplex Photosystem Il cGMP zykisches Guanosin monophosphat PSI Photosystem I CHI Chalkonisomerase Gen PVP Polyvinylpyrrolidon CHS Chalkonsynthase Gen q Quercetinderivate cov Covarianz R rotes Licht 660 nm cpm Zerfalle pro Minute rbcL Ribulose Bisphosphat Carboxylase CRY1 CRY2 Cryptochrome 1 2 rER rauhes Endoplasmatisches Retikulum C Terminus Carboxyl Ende eines Proteins Rha Rhamnose Cytochrome P450 Monooxygenase Pigment absorbiert bei CytP450 450 nm RNA Ribonukleins ure dATP Desoxyadenosintriphosphat ROS reaktive Sauerstoffspezies DET1 de etiolated1 Gen rRNA ribosomale RNA DNA Desoxyribonukleins ure RT reverse Transkription dNTP Desoxynukleosidtriphosphat RT PCR Echtzeit PCR EDTA Ethylendiamintetraessigs ure RUBISCO Ribulose Bisphosphat Carboxylase Oxygenase eff PCR Effizienz SDS Natriumdodecylsulfat EST expremiertes cCDNA Stiick SOD Superoxiddismutase F3 H Flavonoid 3 Hydroxylase Gen S
160. nm 280 nm bestimmt das in einem Bereich von 1 8 2 1 lag Um die Integrit t der Probe zu berpr fen wurde die RNA auf einem 1 5 igem Agaro segel in 1x TBE Puffer bei 80 V f r 1 5 h elektrophoretisch getrennt RNA Gewinnung f r quantitative RT PCRs F r die RNA zur quantitativen RT PCR musste das Protokoll von Chang et al 1993 an der Stelle abge ndert werden an der mit LiCl gef llt wurde da Li Kationen die Taq Polymerase inhibieren Aus diesem Grund wurde dort mit einem Volumen 750 ul Isopropanol bei 20 C f r 2 h gef llt Nach einer Zentrifugation bei 4 C mit 14000 Upm f r 20 min konnte die RNA pelletiert werden Nach dem Waschschritt in 75 igem Ethanol v w wurde der berstand abgenommen und die RNA in 750 ul Tris HCl MgClo Puffer gel st In diesem Puffer wurde kontaminierende DNA durch Zugabe von 20 U DNasel bei 37 C f r 30 min verdaut Durch Zugabe eines Volu mens Chloroform Phenol Isoamylalkohol wurde das Enzym durch zentrifugieren mit 14000 Upm bei 4 C f r 20 min in die Phenolphase gebracht Der berstand wurde abgenommen und in ein neues Reaktionsgef berf hrt Er wurde nochmals mit einem Volumen Isopropanol vermischt f r 2 h bei 20 C gelagert und im Anschluss mit 14000 Upm bei 4 C f r 20 min gef llt Der berstand wurde abgezogen und das Pellet in 75 igem Ethanol v w gewaschen und luftgetrocknet Das Pellet wurde in 35 ul DEPC H2Opidest aufgenommen und die Konzentration photometrisch auf 300
161. nslatierter Bereich Bereich 3 UTR Probe 177 bp cDNA Sequenz 650bp Genbank Suche SDNA Sequenz EST Gen Genname Identit ten Gen Genname Identit ten AtMDR4 At2g47000 AtMDR4 177 177 100 AtMDR17 AtMDR8 AtMDR16 AtMDR5 AtMDR3 644 76 AtMDRQ 612 71 Erh hung der Hybridisierungsspezifit t durch 3 UTR Proben Abbildung 2 5 Schwarz Kodierende Sequenz des Gens rot Heterologe 3 UTR Probe gr n Sequenzbereich einer analogen cDNA aus Glombitza 2002 Die Tabelle zeigt dass die 3 UTR Sequenz von AtMDR4 keinen homologen DNA Abschnitt im Genom von Arabidopsis aufweist w hrend die analoge cDNA starke Homologien zu anderen Genen zeigt und dadurch Kreuzhybridisierung zwischen diesen Genen stattfinden kann Die 3 UTR Proben wurden zun chst mit den Primern M13forward und M13reverse amplifiziert Die Produkte wurden nach einer gelelektrophoretischen Kontrolle 1 100 verd nnt Aus dieser wurden im Anschluss 3 ul 2 5 ng f r eine nested PCR mit 100 ul Reaktionsvolumen eingesetzt Die PCR konnte mit den Reaktionsbe dingungen der ESTs durchgef hrt werden Als Primer wurden T7 5 TAA TAC GAC 46 Material und Methoden TCA CTA TAG GG 3 und SP6 5 ATT TAG GTG ACA CTA TAG 3 eingesetzt Die Oligonukleotid Konzentration betrug 0 3 uM Die beiden 100 ul Reaktionen wurden im Anschluss laut Herstellerangaben mit Millipore MultiScreen PCR aufgereinigt in 55 ul He
162. nthese waren nicht spektralabh ngig reguliert p lt 0 01 Die Induktionsfaktoren der Gene und die statistische Analyse der quantita tiven RT PCR sind in Tabelle 3 3 zusammengestellt Tabelle 3 2 Primerkombinationen f r die quantitativen RT PCR Analysen Als zellul re endogene Kontrolle diente die 18S rRNA At2g01010 Die mit und gekennzeichneten Primerpaare der 18S ribosomalen Untereinheit und die der Gene der Flavonoidbiosynthese waren jeweils ein Paar in der RT PCR vgl Kapitel 2 3 2 10 Sequenz Fragmentl nge bp CHI_sen 5 TCA CGT TTG TAC CGT CCG TCA AGT 3 CHI_asen Chalkonisomerase At39g55120 5 CCG TTA ACG GCA GTT TCA TTG TCA 3 270 FHT_sen 5 TAT GAC TCG TCT CGC TCG TGA CTT 3 FHT_asen Flavanon 3 Hydroxylase At3g51240 5 TCC GTC ACT TTC ACC CAA CCT T 3 222 F3 H_sen 5 GGT GAA CAT GTG TGT AGT CAA CGC T 3 F3 H_asen Flavonoid 3 Hydroxylase At5g07990 5 CCA TCA TTT CCG TCA CCA TTG A 3 116 FLS_sen 5 GAA GCA ATC CCG TTG GAG TTC AT 3 FLS_asen Flavonolsynthase At5g08640 5 GGT TTA GCG ACG GAT TCT TTC T 3 269 18S1_sen 18S Ribosomale 5 TGC AAC AAA CCC CGA CTT ATG GA 3 18S1_asen Untereinheit Fragment 1 At2901010 5 TTT GAA TGA TGC GTC GCC AGC A 3 18S2_sen 18S Ribosomale 5 TTT GGT GTG CAT TGG TCG GCT T 3 1852_asen Untereinheit Fragment 2 At2g01010 5 GGC AAA TGC TTT CGC AGT TGT T 3 sen Senseprimer asen Antisenseprimer Tabelle 3 3 Statistische Auswertung der RT PCR Analysen
163. nus von CRY1 und k nnte sich nach derzeitigen Modellvorstellungen nach einem UV A Impuls von der Rezeptordom ne l sen was als erster Signaltransduktionsschritt nach der UV A Aufnahme verstanden werden k nnte und dadurch de CRY1 Antworten initiiert werden Yang et al 2001 Ferner konnte gezeigt werden dass COP1 in direkter Interaktion mit dem positiven Lichtre gulator HY5 steht HY5 bindet als bZIP Transkriptionsfaktor vgl Kapitel Transkripti onsfaktoren in der Promotorregion der Chalkonsynthase Box ll CCACGTGGCC Das COP1 HY5 Fusionsprotein ist wahrscheinlich bei seiner Aktivierung im Nukleus lokalisiert Das Lichtsignal f hrt zur Trennung der Dom nen freies HY5 bindet an den CHS Promotor und aktiviert die Transkription des Gens Ang et al 1998 1 3 2 2 Signaltransduktion Durch die starke Konservierung von Signaltransduktionsfaktoren der Lichtantwort in niedrigen und h heren Tieren sowie aufgrund der starken hnlichkeiten dieser Kom ponenten in Hefe liegt der Schluss nahe dass sich lichtabh ngige Regelmechanis men innerhalb der Eukaryoten im Laufe der Evolution wenig ver ndert haben Emery et al 2000 Liu 2001 Stanewsky et al 1998 Wichtige Signaltransduktionskompo nenten wie heterodimere G Proteine Phosphoinositidphosphat Ca Calmodulin und Proteinkinasen verschiedener Spezifit t konnten in den letzten Jahren der Licht regulation in Pflanzen zugeschrieben werden Bowler amp Chua 1994 Frohnmeyer et al
164. orophylikatabolismus H rtensteiner et al 2000 Lu et al 1998 Tommasini et al 1998 W thrich et al 2000 3 8 6 Gengruppe aus Node 107 Kurzwellige UV B Strahlung ist biologisch besonders wirksam weshalb die Mehrzahl der gruppierten Stressgene erh ht transkribiert wurde Trotzdem legte Node 107 acht unterdr ckte Gene zusammen Abbildung 3 24 Haupts chlich befanden sich in dieser Gruppe nah verwandte GST Gene Die beiden ESTs der Sequenz At1902930 konnte wegen m glicher Kreuzhybridisierung nicht ausgewertet werden 93 Homo logie zu At1902920 In Abbildung 3 25 sind die Orginaldaten der Gene dargestellt Die Ergebnisse der ANOVA sind in Tabelle 3 12 zusammengestellt 106 Ergebnisse In der Tendenz war die UV B Unterdr ckung im Basisszenario L H am deutlichsten w hrend sie sich in H H weniger ausgepr gt darstellte Die Glutathion S Transferase AtGSTF2 war in allen drei Szenarien signifikant durch UV B reprimiert Das Protein von AtGSTF2 konnte subzellul r sowohl in der Plasmamembran als auch an den Mikrosomen lokalisiert werden Zettl et al 1994 Die Expression des Gens steigt mit zunehmender Vegetationsdauer und erlangt in den Bl ttern von bl henden Pflanzen ein Maximum Zhou amp Goldsbrough 1993 Eine vergleichbare Abregulation von AtGSTF2 konnte j ngst durch eine bl hverz gernde Wirkung einer Bromoxynil Applikation gezeigt werden Glombitza et al 2004 Indessen hatten andere Stressoren wie Met
165. otein of photosystem Il Plant J 9 693 699 Jansen M A K Gaba V and Greenberg B M 1998 Higher plants and UV B radiation balancing damage repair and acclimation Trends Plant Sci 3 131 135 Jenkins G l Long J C Wade H K Shenton M R amp Bibikova T N 2001 UV and blue light signalling pathways regulating chalcone synthase gene expression in Arabidopsis New Phy tol 151 121 131 Jespersen H M Kjaersgard V Ostergaard L amp Welinder K G 1997 From sequence analysis of three novel ascorbate peroxidases from Arabidopsis thaliana to structure function and evo lution of seven types of ascorbate peroxidase Biochem J 326 305 310 Jin H Cominelli P B Parr A Mehrtens F Jones J Tonelli C Weisshaar B amp Martin C 2000 Transcriptional repression by AtMYB4 controls production of UV protecting sun screens in Arabidpsis EMBO J 19 6150 6161 Johannes G Carter M S M B Brown P O amp Sarnow P 1999 Identification of eukaryotic mRNAs that are translated at reduced cap binding complex elF4F concentrations using a cDNA microarray Proc Natl Acad Sci USA 23 13118 13123 Johanson U Karlsson M Johansson 1l Gustavsson S Sj vall S Fraysse L Weig A amp Kjell bom P 2001 The complete set of genes encoding major intrinsic proteins in Arabidopsis provides a framework for a new nomenclature for major intrinsic proteins in plants Plant Ph
166. pes Proc Natl Acad Sci USA 95 12432 12437 W thrich K L Bovet L Hunziker P E Donnison S amp H rtensteiner S 2000 Molecular clon ing functional expression and characterisation of RCC reductase involved in chlorophyll ca tabolism Plant J 21 189 198 Xu W Bak S Decker A Paquette S M Feyereisen R amp Galbraith D W 2001 Microarray based analysis of gene expression in very large gene families the cytochrome P450 gene su perfamily of Arabidopsis thaliana Gene 272 61 74 Yamasaki H Fujii N amp Takahashi H 2000 The ethylene regulated expression of CS ETR2 and CS ERS genes in cucumber plants and their possible involvement with sex expression in flowers Plant Cell Physiol 41 608 616 Yamazaki M Gong Z Fokuchi Mizutani M Fukui Y Tanaka Y Kusumi T amp Saito K 1999 Molecular cloning and biochemical characterization of a novel anthocyanin 5 O glucosyltransferase by mRNA differential display for plant forms regarding anthocyanin J Biol Chem 274 7405 7411 Yang H Q Tang R H amp Cashmore A R 2001 The signalling mechanism of Arabidopsis CRY1 involves direct interaction with COP1 Plant Cell 13 2573 2587 Yang Y amp Klessig D F 1996 Isolation and characterization of a tobacco mosaic virus inducible myb oncogene homolog from tobacco Proc Natl Acad Sci USA 93 14972 14977 Zellner R Peter T Dammer K amp Quintern L ed
167. pferolderivaten trotzdem sind tt7 Mutanten weniger vor UV B Strahlung abgeschirmt als Wildtypen Demzufolge sind Kaempfe rolderivate weniger effektiv in der UV B Abschirmung als Quercetinderivate Ryan et al 2001 Quercetinderivate sind in Arabidopsis nicht an die Zellwand gebundenen so dass nur die analysierten wasserl slichen Verbindungen f r eine epidermale UV Absorption sorgen k nnen W Heller unver ffentlicht Weiterhin bleibt zu diskutieren ob andere Verbindungsklassen des Sekund rstoff wechsels an der UV B Abschirmung teilhaben notwendige Experimente mit z B catechin oder anthocyan defizienten Mutanten liegen derzeitig nicht vor Catechine werden zwar in Arabidopsis synthetisiert die Konzentrationen sind aber wesentlich niedriger als die der Flavonole W Heller unver ffentlicht Sie kommen deswegen f r eine essentielle Funktion in der UV Abschirmung kaum in Frage Die m gliche Bedeutung der Anthocyane im Zusammenhang mit der Abschirmung vor Strahlung wurde bereits in Kapitel 1 3 3 3 geschildert 4 2 Entwicklungsspezifit t der Pigmentbildung Die Pigmentbildung innerhalb verschiedener Blattetagen stellt sich nach l nger an haltender UV B Einwirkung unterschiedlich stark ausgepr gt dar Das erste Laub blattpaar zeigt z B nach UV B Bestrahlung in zehn Tage alten Arabidopsis eine sehr ausgepr gte Konzentrationserh hung an Flavonoiden die nach 28 Tage in dieser Etage nicht mehr existiert Die UV B bedingte Erh
168. ponses in Arabidopsis thaliana role of salicylic acid and reactive oxy gen species in the regulation of transcripts encoding photosynthetic and acidic pathogenesis related proteins Plant Cell Environ 21 685 694 Takahashi S Nakajima N Saji H amp Kondo N 2002 Dirunal change of cucumber CPD photolyase gene CsPHR expression and its physiological role in growth under UV B irradia tion Plant Cell Physiol 43 342 349 Tang L Lin W Wu X Liang Y amp Chen F 2002 Effects of enhanced ultraviolet B radiation on growth development and yield formation in rice Oryza sativa L Ying Yong Sheng Tai Xue Bao 13 1278 1282 Taylor J S Lu H F amp Kotyk J J 1990 Quantitative conversion of the 6 4 photoproduct of TpdC to its dewar valence isomer upon exposure to simulated sunlight Photochem Photobiol 51 161 167 Teramura A H amp Murali N S 1986 Intraspecific differences in growth and yield of soybean ex posed to ultraviolet B radiation under greenhouse and field conditions Environ Exp Bot 26 89 95 Tevini M 1993 Effects of enhanced UV B radiation on terrestrial plants In UV B radiation and ozone depletion effects on humans animal and plant microorganisms and materials ed M Tevini CRC Press Boca Raton Lewis Publisher USA pp 125 153 Tevini M Braun J amp Fieser G 1991 The protective function of the epidermal layer of rye seed lings against ultraviolet B radia
169. quot des Reaktionsansatzes wurde zusammen mit einem DNA L ngenstandard der die entspechenden DNA Fragmentgr en des zu erwartenden PCR Produkts enthielt auf ein 1 iges Agarosegel aufgetragen Nach einer Auftrennungszeit von 1 5 h konnte die zu erwartende Fragmentl nge berpr ft werden 2 3 2 5 Isolierung von Plasmid DNA aus Escherichia coli Das notwendige Bakteriensediment wurde aus einem beimpften 5 ml LB Medium Ampicillin 50 ug ml gewonnen das f r 16 h bei 240 Upm und 37 C inkubiert wurde Davon wurde ein 2 ml Reaktionsgef aufgef llt und bei 14 000 Upm f r 15 min pel letiert Der berstand wurde verworfen Die Isolierung des Plasmids wurde mit Hilfe des QlAprep Miniprep Kit der Firma Qiagen durchgef hrt Die DNA wurde von der S ule mit 30 ul H gt Opidest eluiert Die DNA Konzentration im Eluat wurde photometrisch bestimmt 2 3 2 6 Gelelektrophorese Die gr enabh ngige Separation von Makromolek len durch Gelelektrophorese ba siert auf der elektrokinetischen Eigenschaft dass ein geladener Partikel durch elek trostatische Krafte in Bewegung gesetzt wird Dabei ist die Wanderungsgeschwindig keit der DNA Fragmente umgekehrt proportional zum Logarithmus ihrer Molekular Material und Methoden 51 gewichte Zus tzlich h ngt das Wanderungsverhalten von der Dichte der Gelmatrix ab weswegen die Agarosekonzentration an die Fragmentgr e des aufzutrennen den DNA Fragmentes angepasst wurde und zwischen 1 und 2 w
170. r DNA Array Ergebnisse mittels quantitativer RT PCR C Glukosyltransferasen Die Glukosyltransferase UGT84B3P At2923210 zeigte eine ausgepr gte Spektralabhangigkeit Die Sequenz besitzt 51 Proteinhomologie zu einer bekannten Limonoidglukosyltransferase aus Citrus unshiu Kita et al 2000 UGT84A2 ist nahe verwandt zu diesem Protein besitzt aber eine Substratspezifiz t zu Sinapins ure Lim et al 2001 Des weiteren zeigte UGT75C1 eine sehr deutliche spektrale Abh ngigkeit Die abgeleitete Aminos uresequenz war 64 homolog zu einer Anthocyanidin 3 O Glukosyltransferase UGT73B4 besitzt ebenfalls starke hnlichkeit zu UGT75C1 ein Gen das durch oxidativem Stress und Salicyls ure induziert wird Horvath amp Chuna 1996 Picton et al 1993 Sullivan et al 2001 Surplus et al 1998 104 Ergebnisse Die Oxidation von sekund ren Verbindungen durch CYTP450 Monooxygenasen zieht in vielen F llen eine Glukosyltransferasen Reaktion nach sich Die Pflanze kann mit dieser Reaktionsabfolge z B Xenobiotika entsorgen Kreuz amp Martinoia 1999 Glukosyltransferasen verbessern die Wasserl slichkeit von Verbindungen Die Glykoside haben einen besseren Zugang zu Tonoplastentransportsystemen und k nnen in der Vakuole ber l ngere Zeit gespeichert werden Lim et al 2001 Mock amp Strack 1993 D Zellul re Transportproteine F r den aktiven Transport in die Vakuole mittels ATP wurden die ABC Transporter MDR1 Subklasse MDR
171. r Gene und die Ergebnisse der dazugeh rigen ANOVA sind in Tabelle 3 6 dargestellt Die Daten sind in Abbildung 3 11 zusammengestellt 10 rel Expression 0 j WG295 WG305 WG320 CHI FHT F3 H y FLS WG335 WG360 Abbildung 3 11 Spektrale Abh ngigkeit der Transkription der Flavonoidbiosynthese Gene nach 14 d UV Exposition L H Tabelle 3 6 Statistische Auswertung der RT PCR Analysen des Basisszenarios L H F kritischer E Signifikanz Induktion UV B UV A ohne UV B HO Genexpression ist nicht spektralabh ngig im UV Bereich H1 Genexpression ist spektralabh ngig im UV Bereich Chalkonisomerase n 2x2 8 47 0 001 3 06 1 84 35 92 0 000 Flavonoid 3 Hydroxylase n 2x3 11 03 0 000 2 7 4 04 Flavonolsynthase n 2x2 10 76 0 000 K 3 92 signifikant p lt 0 05 hoch signifikant p lt 0 01 sehr hoch signifikant p lt 0 001 Ergebnisse 79 3 4 Hoch PAR Niedrig UV B H L In WG295 waren in H L 25 mWm UV Bs appliziert worden siehe Kapitel 2 1 Der PAR Hintergrund war mit ca 1300 umol m sl PAR vergleichbar mit dem H H Szenario 3 4 1 Schutzpigmente Flavonolderivate Im Gegensatz zu den bisher vorgestellten Ergebnissen waren im Szenario H L die Gehalte an Quercetinderivaten nicht spektralabh ngig im UV Spektrum Die Ergeb nisse sind in
172. r Sch digung der DNA durch Cyklobutanstrukturen und damit zur Aktivierung der daf r notwendigen Reparaturgene vgl Abbildung 1 7 Es ist ge zeigt worden dass nach transienter UV B Bestrahlung h here PAR Werte die CPD Bildung und dadurch auch DNA Strangbruchprozesse im Genom verst rken Ries et al 2000 Die eigenen Resultate zeigen jedoch dass ein vermutliches Photolyase Gen unter Langzeiteinfluss von UV B Strahlung bei hohen PAR Werten Szenario H H nicht mehr durch UV B induziert war Ist die Pflanze aufgrund niedrigerer PAR Hintergr nde nicht in der Lage einen Grundschutz aufzubauen sind am Ende der Bestrahlungsperiode DNA Reparaturgene aktiv In Mais wurde gezeigt dass die Ge halte an phenolischen Verbindungen f r das Ausma an DNA Sch digung verant wortlich sind Stapleton amp Walbot 1994 Die epidermale Abschirmung durch pheno lische Verbindungen wurde in der Vergangenheit mehrmals gezeigt Bieza amp Lois 2001 Rao amp Ormrod 1995 Stapleton amp Walbot 1994 Der eigene Befund dass bei akklimatisierten Pflanzen nicht generell phenolische Verbindungen einen epiderma len UV Schutz herbeif hren sondern dass daf r die Quercetinverbindungen verant wortlich sein m ssten ist eine neue Erkenntnis 122 Diskussion Vermutliche Photolyase CPDII Typ 1 At1g12370 p lt 0 01 nah WG295 WG305 WG320 WG335 WG360 rel Expression zu WG320 Pm L H PS H H BE HI Abbildung 4 3 Expres
173. r Simulation L H vorhanden Dieses Szenario diente deswegen zur Hauptselektion interessanter Gene Als Kenngr en in der so erstellten Liste waren f r jedes Gen drei Parameter angegeben Zuerst ist der Median der sechs Indukti onsfaktoren aus WG295 berechnet worden Neben dem ist zus tzlich der Medi anwe295 we30s aufgelistet Das dritte Kriterium stellt der Medianwes20 360 dar siehe Anhang A Im ersten Schritt der Genselektion wurde die Prim rliste aus 227 Genen erstellt die aus Sequenzen bestand die sich auf einem signifikanten Niveau UV spektral abh n gig erwiesen p lt 0 05 Die hohe Anzahl an signifikant reagierenden Genen konnte auf eine generell geringe Variation innerhalb der Messwiederholungen zur ckgef hrt werden Im zweiten Selektionsschritt wurde nach Genen in der Prim rliste gesucht die eine deutliche Hoch oder Abregulation im Spektralbereich von UV aufwiesen Zur Bewertung der Spektralabh ngigkeit der Genexpression wurde die prozentuale UV B Erh hung bzw Erniedrigung mit Medianwc2s5 wc305 Medianwaa20 360 100 100 f r jedes Gen berechnet Alle Transkripte die nicht mindestens eine 30 ige UV B Erh hung oder Erniedrigung erfuhren wurden von der Liste entfernt Von den 227 Genen der Prim rliste entstand so eine Liste von 149 Genen Im letzten Schritt wur de mit dieser Liste nach detektierten Genen in H H W H und H L gesucht und es 92 Ergebnisse blieben 112 Gene brig die in allen Simulationen letztendlich
174. ran ein Superoxidradikal O gt Dieses kann spontan zerfallen oder enzymatisch durch die Superoxiddismutase zu Wasserstoffperoxid und Sauerstoff umgesetzt werden in den Chloroplasten FeSOD F r die Entgiftung von H202 sind zellul re Redoxsysteme mit Glutathion notwendig Jung et al 2002 Auff llig war dass ROS detoxifizierende Gene ausschlie lich in L H aktiv waren w hrend in den anderen Szenarien dies nicht der Fall war Ergebnisse 97 LH HH HL m do D d gt gt gt gt gt 3 Node 78 gt 222 BS a Salzstress induziertes Tonoplastenprotein 3 UTR Probe At3926520 Vermutlicher ABC Transporter 3 UTR Probe At2936910 Cytochrom P450 hnliches Protein 3 UTR Probe At2945560 Cytochrom P450 hnliches Protein 3 UTR Probe A o 2000 Glutathionreduktase cytosolisch 3 UTR Probe At3g24170 Glukosyltransferase ahnliches Protein 3 UTR Probe At4g14100 Aquaporin Plasmamembranprotein 1B 3 UTR Probe At2945960 Unbekanntes Protein 3 UTR Probe At3950760 Glutathion S transferase 3 UTR Probe At1g10370 Cytochrom P450 Homolog 3 UTR Probe At4g12320 Zimtsaure 4 Hydroxylase 3 UTR Probe At2930490 ABC Transporter EST Atig30400 Transmembranprotein 3 UTR Probe At4g00430 Vermutliches Cytochrom P450 3 UTR Probe At2922330 Vermutliches Lectin EST At3916450 Glutathion S Transferase hnliches Protein 3 UTR Probe At5g17220 Vermutliche Glukosyltransferase 3 UTR A2923210 Indol 3 acetat B glukosyltransferase cDNA At3921560 Vermutliche Flavanon 3
175. rch phenolische Inhaltsstoffe 22 1 3 3 1 UV Abschirmung duch Flavonoide 22244440004444440nnnnnn Hann 23 1 3 3 2 UV Abschirmung durch Sinapins ureester sssnnneneeeeeeeeeennn reene 26 ENEE 28 1 3 4 UV Sch den und deren Reparatur 28 1 3 4 1 DNA Mutatonen AANEREN 28 1 3 42 DNA Reparalit ass 28 1 3 5 UV B Sch digung des Photosyntheseapparates nn 30 1 4 Themenstelling su een ests ees seeds otek EERE A E EELNE 31 2 MATERIAL UND METHODEN ee 32 2 1 UV StrahlungssiM latiOM EE 39 22 Pfil nzenanz cht EE 43 2 3 Molekularbiologische Methoden 44 E ee EE 44 2 3 1 1 PCR Amplifikation der Array Proben Targets 44 2 3 1 2 T7 Relerenzhybridisierung a scrss ae ea 46 2 3 1 3 cDNA Hybridisierung seen 47 2 3 2 DNA und RNA Techniken 2224 40000444440nnnnnnHHnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 49 2 3 2 1 Isolierung genomischer DNA 49 2 3 2 2 Aufreinigung von PCR Produkte nesses csccioscvenccoiserantiacvesevedeesauteaes cxeneese 49 2 3 2 3 Vektorligation des DCH Produkte 49 2 3 2 4 Transformation rekombinanter Dlasmide 49 2 3 2 5 Isolierung von Plasmid DNA aus Escherichia co 50 2 3 2 6 Gelelektrophorese 44444444440nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 50 2 3 2 7 Restriktionsverdau Arber amp Leim 1060 51 2 3 2 8 Enzymatische DNA Sequenzierung 22224444000nnnnnnnn nennen 51 2 3 2 9 P
176. rden Die Aktivierung durch Paraquat welches den Elektronenfluss an der Au enseite der Thylakoidmembran unterbricht spricht desgleichen f r die Hypothese dass Superoxid durch UV B Strahlung haupts chlich am Chloroplasten gebildet wird Lee et al 1998 AtGSTU19 besitzt m glicherweise zwar eine Peroxidaseaktivit t es wird aber als Glutathion S Transferasen GST gewertet GSTs zeigen sich aber auch besonders bei oxidativem Stress aktiv Cheng et al 1996 Des weiteren waren die GSTs AtGSTU17 und AtGSTF12 in Node 78 gruppiert worden welche auf ein sekund res Substrat Glutathion kovalent bertragen k nnen Durch diesen Reaktionsmechanismus besitzt die Pflanze ein System mit dem sie zelltoxische Verbindungen in der Vakuole entsorgen kann Alfenito et al 1998 Tommasini et al 1993 B CYTP450 Monooxygenasen Die gruppierten CYTP450 Monooxygenasen waren keine Vertreter der mitochondrialen Atmungskette sondern sie k nnen an sekund ren Verbindungen einen bestimmten Reaktionstyp ausf hren Allgemein bertragen sie molekularen Sauerstoff unter Abspaltung eines Wassermolek ls nach folgender Reaktionsglei chung RH O2 NADPH H gt ROH H2O NADP Eine bekannte Monooxygenase zeigte sich als CYP73A5 Zimts ure 4 Hydroxylase das Zimts ure zu 4 Hydroxyzimts ure umsetzt Mizutani et al 1997 Eine sehr enge Verwandschaft zu diesem Protein hatte CYP706A6 was eine 3 5 Hydroxylase darstellen k nnte De Vet
177. ringssperma DNA vor jeder Hybridisierung frisch denaturiert hinzugege ben LB Medium 2 5 w v Miller s Luria Broth Base Sigma 60 ul 5 M NaOH 100 ml Medium LB Platten 1 25 w v Bacto Agar Difco Laboratories Detroit USA 2 5 w v Miller s Luria Broth Base Sigma 60 ul 5 M NaOH 100 ml Medium 38 Material und Methoden RNA Auftragepuffer 5x 7 5 ml deionisiertes Formamid 1 5 ml 10x MOPS 2 4 ml Formaldehyd 1 0 ml H3Opidest 1 0 ml Glycerol 0 08 ml 10 Bromphenolblau RNA Extraktionspuffer 2 CTAB alle L sungen in DEPC 2 PVP 360 HeObidest hergestellt 100 mM Tris HCl pH 8 0 2 0 M NaCl 0 5 g l Spermidin gemischt und autoklaviert 2 B Mercaptoethanol kurz vor der Extraktion beigeben SOC Medium 2 0 g Trypton 0 5 g Hefeextrakt 1 ml 1 M NaCl auf 97 ml mit H2Opidest aufgef llt autoklaviert und abk hlen lassen 0 25 ml 2 M Mg Vorrat 1 ml 2 M Glukose fertiges Medium mit 0 2 um Filtereinheit sterilisiert pH Medium 7 0 2 M Mg Vorrat 20 33 g MgCl 6H20 24 65 g MgSO 7H 0 mit autoklaviertem H2Ohigest auf 100 ml aufgef llt SSTE Puffer 1 0 M NaCl alle L sungen in DEPC 0 5 SDS HeObidest hergestellt 10 mM Tris HCl pH 8 0 1 mM EDTA pH 8 0 STE Puffer 25 mM Tris HCl pH 8 0 150 mM NaCl 1 mM EDTA Tris HCl MgClo Puffer 40 mM Tris HCl pH 7 5 6 mM MgCle Material und Methoden 39 Analysesoftware und ffentlich zug
178. s Entwicklungsprogramm eingebunden Doebley 1993 1 3 3 UV Abschirmung durch phenolische Inhaltsstoffe Die UV Abschirmung wird in der Pflanze in erster Linie durch das Absorptionsverm gen phenolischer Inhaltsstoffe bewirkt Solche Verbindungen sind in der Pflanze in sehr gro er Vielfalt vorhanden Welche Verbindungsklassen im Wesentlichen f r die UV Abschirmung sorgen ist abh ngig von deren Konzentrationen deren zellul ren Lokalisation und ihrem spezifischen UV Absorptionsverm gen Vergleichsweise niedrig konzentrierte phenolische Inhaltsstoffe k nnen zwar durch UV B Strahlung induziert werden wie das f r Myricetin 3 Galaktosid und f r die Chlorogens ure in Birkenbl ttern gezeigt wurde Lavola et al 1997 f r das gesamte UV Abschirmpotential spielte diese Reaktion jedoch nur eine untergeordnete Rolle Die ses wird in Birke prim r durch Quercitrin determiniert das nach UV B Bestrahlung um ein Vielfaches h her konzentriert vorliegt Die Ergebnisse der Vergangenheit deuten darauf hin dass die UV Abschirmung nicht durch eine generelle Erh hung phenolischer Inhaltsstoffe bewirkt wird sondern dass die Pflanze zu diesem Zweck ganz bestimmte Molek le des Sekund rstoffwechsels verwendet In Arabidopsis thaliana haben sich in der Vergangenheit vor allem durch den Einsatz von Mutanten zwei sekund re Verbindungsklassen herauskristallisiert die obenste hende Kriterien eines effektiven Absorbers besonders gut erf llen n mlich die
179. s haben pharmakologische Studien gezeigt von ei nem Flavoprotein bewerkstelligt was eine deutliche Parallele zu der UV A vermittelten Signalaufnahme ist Die Cryptochrome die im Spektralbereich der UV A Strahlung agieren stellen derartige Flavoproteine dar Die Ergebnisse zeigen dass die UV B Rezeption durch ein hnliches Molek l bewirkt wird welches an der Plas mamembran einen Elektronentransport initiiert Long amp Jenkins 1998 Die Unter schiede zwischen UV B und UV A Antwort sind insbesondere in der Regulation der Kalziumhom ostase zu sehen Long amp Jenkins 1998 Die Gemeinsamkeiten und Unterschiede der CRY1 abhangigen Induktion der CHS sowie der UV B Antwort ber einen unbekannten Rezeptor sind in Abbildung 1 5 zusammengefasst Abbildung 1 5 UV B UV A Signaltransduktion der Chalkon synthase aus Long amp Jenkins 1998 Abbildung A UV A Rezeption an der Plasma membran durch CRY1 Abbildung B Signaltransduktions Kaskade der UV B Antwort Abk rzungen CRY Cryptochrom PM Plasmamembran IM Internale Membran wahrscheinlich Tonoplasten membran DPI Diphenyleniodonium FeCN Ferricyanid EB Erythrosin B CaM Calmodulin W 7 Antagonist von Calmodulin RR und Nif Kalziumkan le die sensitiv auf Ruthenium Rot und Nifdipin reagieren 20 Einleitung UV B Strahlung f hrt in der Pflanze in hnlicher Weise zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies ROS wie das nach einem Pathogenbefall zu
180. sel RNase free 10 U ul Boehringer Mannheim Lysozym 10 U ul Merck Darmstadt RNase Inhibitor RNasin 40 U ul Invitrogen Life Technologies Karlsruhe Superscript II 200 U l Invitrogen Life Technologies Karlsruhe T4 Polynukleotidekinase 10 U ul MBI Fermentas St Leon Rot Taq Polymerase 5 U ul Abigene Heidelberg Materialien 3 MM Papier Schleicher amp Schuell Dassel Hybond N Nylonmembran Rolle Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Hybond N Nylonmembran 15 mm x 73 mm Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Hybridisierungsr hrchen 50 mm x 150 mm ThermoHybaid Heidelberg 36 Material und Methoden Imaging Plate BAS IP 2340 FUJI Photo Film Co LTD Japan MicroSpin Columns G 25 Amersham Pharmacia Biotech Freiburg MicroSpin Columns S 400 Amersham Pharmacia Biotech Freiburg MicroWell Platten Polystyrol Nunc GmbH amp Co KG Wiesbaden MultiScreen PCR Millipore Eschborn Nunclon OmniTray Nunc GmbH amp Co KG Wiesbaden Optical Wells Optical Caps Applied Biosystems Foster CA Parafilm American National Can London UK PCR Reaktionsgef e 8er Streifen 96er Platten Biozym Hess Oldendorf Pflanzenanzucht Tonhaltige Anzuchterde Floraton Bayerische Gartnerei Genossenschaft BZV Aschheim M nchen Anzuch
181. sen demzufolge so interpretiert werden dass die Vorstufen Aglykone die antioxidative Funktion am rER aus ben bevor sie glykosidisch gebunden werden Quercetinderivate nehmen aber dennoch die essentielle Funktion der UV Abschirmung wahr Rice Evans et al 1997 Diskussion 121 Die subzellul re Metabolisierung am rER findet wahrscheinlich in einem Multienzym komplex statt in dem die Enzyme CHS und CHI mit eingebunden sind Die F3 H bernimmt in diesem Komplex eine Ankerfunktion f r CHS und CHI Dieser Sachver halt konnte in der Elongationszone von Arabidopsis Wurzeln festgestellt werden Hier werden bei der tt7 Mutante die Proteine von CHS und CHI deutlich weniger akkumu liert als im Wildtyp was mit der Konzentration der Flavonoid Endprodukte einher geht Der F3 H k nnte somit neben der Bildung der antioxidativen Quercetinstruktur eine wichtige Funktion in der zellul ren Verankerung weiterer Flavonoid Proteinen zu einem Multienzymkomplex am rER zukommen der die notwenige r umliche N he der beteiligten Proteine f r die st rungsfreie Synthese der Flavonoide sicherstellt Saslowsky amp Winkel Shirley 2001 Winkel Shirley amp Burbulis 1999 4 8 DNA Reparatur Das Expressionsprofil einer vermutlichen CPD unter den Bestrahlungsszenarien in Abbildung 4 3 zeigt dass die DNA Reparatur nur in L H aktiv war Photolyasen sind wichtige Markergene f r UV B Reparatur Bildet die Pflanze wenig Schirmpigmente aus f hrt dies zu eine
182. sion einer vermutlichen Photolyase Die Abbildung zeigt das UV B Induktionsverm gen eines vermutlichen Photoreparaturgens CPDIl Das Gen war durch UV B Strahlung nur im Szenario L H signifikant induziert in Relation zur Expres sion von WG320 In zahlreichen Studien wird vermutet dass die DNA in der Pflanze durch ihr Absorp tionsmaximum im UV B Bereich als Photorezeptor wirken k nnte Beggs amp Well mann 1994 Ibdah et al 2002 Weiterhin kann die DNA Reparatur durch die Photo lyasen als Initialsignal f r biochemische Reaktionen angesehen werden da de UV Anregung der Pterin und Flavinchromophore einen prim ren Elektronenfluss ausl sen k nnen und dadurch ROS entstehen Jenkins et al 2001 Die Coexpression der CPDIl und der Gene der Flavonoidbiosynthese im Szenario L H spricht einerseits f r die Theorie des prim ren Signals durch die Photolyasen andererseits zeigt die CPDII keine Reaktion auf UV B Strahlung im Szenario H L w hrend die Gene Fla vonoidbiosynthese eine deutliche Reaktion in diesem Bestrahlungsversuch zeigten Vielmehr ist die Aktivit t der CPDIl wenn auch weniger stark ausgepr gt etwa mit den Genen aus Node 78 und 73 vergleichbar Die Coexpression zu Genen die durch oxidativen Stre aktiviert werden l sst die Photolyase als ROS Quelle neben dem Photosystem n her ins Blickfeld r cken Dass die Genaktivierung der Flavo noidbiosynthese nicht durch ROS bedingt ist wurde bereits in Arabidopsis an d
183. stematic tissue Plant J 5 799 813 Heller W amp Forkmann G 1988 Biosynthesis of flavonoids In The Flavonoids Advances in re search since 1986 ed J B Harborne Vol 11 Capman and Hall Ltd London pp 499 535 Hemm M R Herrmann K M amp Chapple C 2001 AtMYB4 a transcription factor general in the battle against UV Trends Plant Sci 6 135 136 Henze K Schnarrenberger C Kellermann J amp Martin W 1994 Chloroplast and cytosolic trio sephosphate isomerases from spinach purification microsequencing and cDNA cloning of the chloroplast enzyme Plant Mol Biol 26 1961 1973 Hihara Y Kamei A Kanehisa M Kaplan A amp Ikeuchi M 2001 DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light Plant Cell 13 793 806 Hillebrand H Bartling D amp Weiler E W 1998 Structural analysis of the nit2 nit1 nit3 gene cluster encoding nitrilases enzymes catalyzing the terminal activation step in indole acetic acid bio synthesis in Arabidopsis thaliana Plant Mol Biol 36 89 99 Hock B amp Elstner E F 1995 Schadwirkungen auf Pflanzen Spektrum Akademischer Verlag GmbH Heidelberg Holmes M G 1997 Action spectra for UV B effects on plants monochromatic and polychromatic approaches for analysing plant responses In Plants and UV B responses to environmental change ed P J Lumsden Cambridge University Press Cambridge pp 31 52 Lit
184. t Platzhalters MW getekt Ein aktives Gen einer Behandlungsvariante das diesem Prozedere unterzogen wur de besa nun ber alle Wiederholungen Messwerte Ein zus tzliches Problem das sich beim Vergleich des Expressionsmusters eines Gens ber mehrere Behandlungen ergab waren fehlende Messwerte innerhalb ei nes Versuches Hatte ein Gen mindestens in einer Behandlungsvariante Messwerte wurden die fehlenden Werte der anderen Behandlungsvarianten durch deren dL Werte ersetzt Die Mehrzahl der dL Werte lagen alsdann zwischen 0 2 0 05 In die sem Bereich bewegte sich der Analysefehler in einem Bereich zwischen 50 170 Kapitel 2 5 3 Messreihen eines Gens die zuf llig zustande kommen konnten wa ren hier mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht signifikant spektralabh ngig 2 5 3 Messfehler Die Messung der Genexpression mit Hilfe der DNA Arrays ist mit einem Messfehler behaftet Um diesen zu ermitteln wurde die Fehlerverteilung in Abh ngigkeit der Signalst rke ermittelt Aus diesem Sachverhalt konnte ein Fehlermodell entwickelt werden Rocke amp Durbin 2001 Dieses enthielt die gesamte Variation die sich aus 64 Material und Methoden den beiden Teilvariationen zwischen den Arrays und der Variabilit t innerhalb einer Behandlungsvariante zusammensetzte Die Variation zweier Hybridisierungen mit gleicher RNA kann sich aus verschiedenen Fehlerquellen bilden wie z B variieren de Hintergrundwerte Pipettierfehler und unterschie
185. t Licht bestrahlt wird das sowohl wei es als auch UV enth lt In Kapitel 1 3 2 2 wurde bereits die molekulare Regulation und das Zusammenspiel von HY5 mit Photorezeptoren er rtert HY5 ist ein bZIP Transkriptionsfaktor der speziell in die zweite Box bindet und daf r das zentrale Motiv ACGT ben tigt Ne ben der Bindung des bZIP Proteins ist f r die Aktivierung des Gens ein Transkripti onsfaktor der MYB Familie in der Box notwendig Solche Elemente k nnen bei ver schiedenen Genen in hnlicher Sequenzfolge in mehrfacher Anzahl hintereinander angeordnet sein und ber ihre H ufung die Genaktivit t bestimmen Weisshaar et al 1991 Offen bleibt allerdings die Frage ob es eine Vielzahl von cis regulierten Elementen gibt die sich von Promotor zu Promotor unterscheiden oder ob die un terschiedlichen Photorezeptoren die gleichen Lichtschalter benutzen Die Transkrip Einleitung 21 tionsfaktoren der MYB Genfamilie umfassen in Arabidopsis thaliana das ein ver gleichsweise kleines Genom besitzt sch tzungsweise ber 100 verschiedene Kan didatengene Die Zuordnung zu dieser Famile erfolgte durch die kennzeichnenden Helix Turn Helix Motive der Proteine R2R3 Neben den Regulationsm glichkeiten innerhalb des Sekundarmetabolismus Borevitz et al 2000 Hemm et al 2001 steuern die Transkriptionsfaktoren die Genaktivit t innerhalb verschiedener Pflan zenorgane nach Pathogenbefall und den der zirkadianen Rhythmik Carr
186. tative comparision of mRNA levels in invasive and noninvasive human melanoma cell subpopulations Anal Biochem 295 17 21 Greenberg B M Wilson M J Hung X D Duxburg L L amp Gensemer R 1997 The effects of ultraviolet B radiation on higher plants In Plants for Environmental Studies eds W Wang J Gorsuch amp J S Hughes CRC Press New York pp 1 35 Grotewold E Sainz M B Tagliani L Hernandez J M Bowen B amp Chandler V L 2000 Identi fication of the residues in the Myb domain of maize C1 that specify the interaction with the bHLH cofactor R Proc Natl Acad Sci USA 97 13579 13584 Halaweish F T amp Dougall D 1990 Sinapoyl glucose synthesis by extracts of wild carrot cultures Plant Sci 71 179 184 Harmer S L Hogenesch J B Straume M Chang H S Han B Zhu T Wang X Kreps J A amp Kay S A 2000 Orchestrated transcription of key pathways in Arabidopsis by the cir cadian clock Science 290 2110 2113 Harper J F Surowy T K amp Sussmann M R 1989 Molecular cloning and sequence of cDNA encoding the plasma membrane proton pump H ATPase of Arabidopsis thaliana Proc Natl Acad Sci USA 86 1234 1238 Heintzen C Melzer S Fischer R Kappeler S Apel K amp Staiger D 1994 A light and tempera ture entrained circadian clock controls expression of transcripts encoding nuclear proteins with homology to RNA binding proteins in meri
187. tattfindet Xu et al 2001 Da die Ahnlichkeit zweier Gene bis 99 betragen kann wurden Sequenzen aus dem hete rologen 3 UTR Bereich gewonnen Abbildung 2 5 Die resultierenden DNA Fragmente wurden mit einem FASTA Blast gegen das Genom von Arabidopsis ver glichen um die Spezifiz t der Probe zu berpr fen Baxevanis 2001 Nielsen amp Knudsen 2002 2 3 1 1 PCR Amplifikation der Array Proben Targets Die Plasmide der ESTs wurden laut Herstellerangaben mit dem NucleoSpin 96 Flash der Firma Machen Nagel isoliert Die gereinigten Plasmide wurden in Mikroti terplatten berf hrt und in einer neuen Platte mit H gt Opjgest 1 50 verd nnt Mit der Ver Material und Methoden 45 Verd nnungsstufe wurden je EST zwei 100 ul PCRs angesetzt Als Primer wurden M13forward 5 GTA AAA CGA CGG CCA GT 3 und M13reverse 5 GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3 verwendet Eine Reaktion bestand aus 10 ul 10x PCR Puffer 2 ul 10 mM dNTPs 3 ul 10 uM M13forward 3 ul 10 UM M13reverse 0 5 ul Taq Polymerase 5 U ul 3 ul Plasmid DNA 20 50 ng ul und 78 5 ul H2Obidest Die Reaktion wurde mit 96er PCR Platten durchgef hrt Das PCR Programm begann mit einem Denaturierungsschritt bei 95 C f r 5 30 min Im Anschluss folgten 40 Zyklen mit 95 C f r 1 min 52 C f r 45 sec und 72 C f r 2 min Zum Abschluss des PCR Programms wurden zus tzlich 72 C f r 7 min eingestellt Kodierende Sequenz 5 untranslatierter S 3 untra
188. ten et al 1999 Heller amp Forkmann 1988 Die Hydroxylierungsreaktion dieses Gens und die RT PCR berpr fung sind in Abbildung 3 23 dargestellt Das Protein k nnte Dihydromyricetin herstellen Als Sub strat von CYP706A6 kommen Dihydrokaempferol und Dihydroquercetin in Frage De Vetten et al 1999 CYP71B28 CYP76C1 CYP79B3 und CYP81D5 waren zwar durch ihr hydrophobes Segment mit dem Monooxygenasen typischerweise am rER anhaften als Monooxygenasen eingeteilt Kahn amp Durst 2000 ber eine metabolische Funktion als solche kann momentan jedoch noch keine klare Aussage getroffen werden Ergebnisse 103 In Arabidopsis sind derzeit nahezu 300 verschiedene Monooxygenasen in 45 Unterfamilien eingeteilt Sie setzen ein breites Spektrum an nat rlichen Substraten um Williams et al 2000 Williams et al 1998 Xu et al 2001 CYTP450 Monooxygenasen sind auch bei der Pathogenabwehr aktiv Whitebred amp Schuler 2000 HO CH OH OH ARn OH O Dihydrokaempferol hti F n F3 5 H DI hf2 J OH 2 HO ECH O OH HO Of OH O 2 4 6 8 10 12 14 16 1820 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 35H O bu A op hf1 hf2 OH OH O Dihydroquercetin P J Dihydromyricetin At4g12320 CYP706A6 Abbildung 3 23 berpr fung der Induktion von CYP706A6 mittels RT PCR Szenario L H Die Abbildung zeigt die m gliche Funktion von CYP706A6 innerhalb der Flavonoidbiosynthese Die rechte Abbildung zeigt die Verifizierung de
189. ten sollte Es wird h u fig zur Absch tzung von UV Wirkungen auf Mikroorganismen verwendet 12 Einleitung Das generalisierte Pflanzenaktionsspektrum Caldwell 1971 Diese BWF die unter verschieden Acronymen PD f r plant damage PAS300 f r plant action spectrum normalized at 300 nm und UVBge f r UV B biologically effective in der Literatur erscheint wird bei Untersuchungen pflanzlicher UV Reaktionen sehr haufig verwen det Es stellt eine Synthese aus verschiedenen experimentellen Daten dar die meist auf Untersuchungen mit monochromatischer UV Strahlung beruhten Die Summe dieser Daten f hrte zu einer Formel die oberhalb A 313 3 nm willk rlich gleich null gesetzt wurde A lt 313 3 nm s A 12 03 1 A 313 3 exp A 300 31 08 Normierung bei 300 nm A gt 313 3 nm s A 0 Diese Funktion wird in der vorliegenden Arbeit allgemein verwendet um die jeweili gen UV B Bestrahlungsverh ltnisse zu charakterisieren Allen drei genannten Wichtungsfunktionen ist der generalisierte Aspekt gemeinsam d h zugunsten einer breiten Anwendbarkeit werden die Reaktionen individueller Or ganismen au er Betracht gelassen Die beiden letzteren Funktionen zeigen oberhalb von 315 nm also im UV A Bereich sehr kleine Werte bzw null Weiter unten wird gezeigt dass Wichtungsfunktionen die mit realistischer polychromatischer also son nen hnlicher Strahlung gewonnen wurden einen flacheren Verlauf zeigen der sic
190. ten zwischen den Experimenten V320 und V323 bei den Gehalten an Sinapoylglukose Temperatureffekte festgestellt werden Abbildung 3 7 Die statisti sche Zusammenfassung ist in Tabelle 3 4 dargestellt Ergebnisse 73 3 2 2 Genexpression der Flavonoidbiosynthese Die Genexpressionsdaten aus Experiment V320 und V323 wurden f r das Szenario M H nicht zusammengef hrt da zwischen den beiden Versuchen gro e Unterschie de in der Induzierbarkeit der Gene der Flavonoidbiosynthese bestanden Die Indukti onen der Transkripte waren bei Experiment V320 dem Szenario H H hnlich indes sen zeigte sich das Expressionsprofil des Versuches V323 sehr hnlich zum Basis szenario L H Abbildung 3 5 und Abbildung 3 8 Aufgrund der niedrigen Anzahl an Messwerten wurde auf eine statistische Analyse der einzelnen Versuche verzichtet Tabelle 3 4 Varianzanalyse der Pigmentmessungen in Pflanzen an dem Szenario M H V320 n 10 F p kritischer E Signifikanz Kaempferolderivate 11 20 2 58 Quercetinderivate 23 96 2 58 Sinapoylglukose 9 83 2 58 Sinapoylmalat 5 94 0 001 2 58 10 48 0 001 3 48 H0 Pigmentkonzentration ist nicht spektralabh ngig im UV Bereich signifikant p lt 0 05 H1 Pigmentkonzentration ist spektralabh ngig im UV Bereich hoch signifikant p lt 0 01 sehr hoch signifikant p lt 0 001 10 8 S 2
191. terschiedlichen Markierungseffi zienzen der cCDNA Synthese herr hren konnten Im letzten Transformationsschritt f r die eigentliche Clusteranalyse wurde die normalisierte Marix auf s 1 f r die Zeilen und Spalten standardisiert Landgrebe et al 2002 Die Transformation wurde mit allen master tables der Strahlungsexperimente durchgef hrt Die Daten wurden dann auf die 112 Gene aus Kapitel 3 8 1 reduziert und die Werte auf UV B und UV B medianisiert Diese Zahlen entspachen prinzi piell den Kenngr en Medianweass waaos und Medianwes2o sso aus Anhang A Die hnlichkeit von Genen wurde in der Clusteranalyse ber den Pearsonschen Korrela tionskoeffizienten bewertet COV X Y IN X X Y Y r i 1 Sx Sy Sx Sy Dieser lag im Bereich 1 1 und beschreibt die Ahnlichkeit im Expressionsverhalten zweier Gene r 1 identisch r 0 unabh ngig voneinander r 1 gegenl ufig Nach der Berechnung der hnlichkeiten aller m glichen Paarungen begann das ei gentliche Clustering f r das ein hierarchisches System gew hlt wurde welches mit den beiden hnlichsten Genen startete und f r dieses Paar einen Knoten zuwies NODE 1 Gleichzeitig wurde diesem Paar ein neues Expressionsprofil zugeordnet das sich aus dem Mittelwert der beiden Elemente ergab average linkage Die hn lichkeitsmatrix wurde mit diesem Wert aktualisiert Der Prozess wurde n 1fach wie derholt bis schlie lich ein Element blieb i
192. tion Photochem Photobiol 53 329 333 140 Literaturverzeichnis Tommasini R Evers R Vogt E Mornet C Zaman G H Schinkel A H Borst P amp Martinoia E 1996 The human multidrug resistance associated protein functionally complements the yeast cadmium factor 1 Proc Natl Acad Sci USA 93 6743 6748 Tommasini R Martinoia E Grill E Dietz K J amp Amrhein N 1993 Transport of oxidized glu tathione into barley vacuoles Evidence for the involvement of the glutathione S conjugate ATPase Z Naturforsch 48c 867 871 Tommasini R Vogt E Fromenteau M H rtensteiner S Matile P Amrhein N amp Martinoia E 1998 An ABC transporter of Arabidopsis thaliana has both glutathione conjugate and chlo rophyll catabolite transport activity Plant J 13 773 780 Turunen M Heller W Stich S Sandermann H Sutinen M L amp Norokorpi Y 1999 The effects of UV exclusion on the soluble phenolics of young scots pine seedlings in the subarctic Envi ron Pollut 106 219 228 Tusnady G E Bakos E Varadi A amp Sarkadi B 1997 Membrane topology distinguishes a sub family of the ATP binding cassette ABC transporters FEBS Lett 402 1 3 Utsugi S Sakamoto W Murata M amp Motoyoshi F 1998 Arabidopsis thaliana vegetative storage protein VSP genes gene organization and tissue specific expression Plant Mol Biol 38 565 576 Van Camp W Bowler C Villarro
193. toffwechsel 14 Wundantmort 33 Ethylenstoffwechsel 15 Photosynthese 23 Zellul rer Signalstoffwechsel 54 DNA Reparatur Proteinmodifikation 1 Unbekannte Proteine bzw Hg Ozon induzierbar 10 Jasmons urebiosynthese 3 Summe 579 Tabelle 3 11 Array Proben des Sekundarstoffwechsls mit gr tenteils bekannter Funktion en Alle Herkunft Code ABRC Arabidopsis Biological Resource Center Chorismatmutase At1969370 ABRC Anthranilatsynthase Komponente l 1 Vorl ufer At5g05730 ABRC Anthranilatsynthase B Kette At5g57890 ABRC Phenylalanin Ammoniumlyase PAL At3g53260 aus genomischer DNA BIOP Phenylalanin Ammoniumlyase PAL3 At5g04230 aus genomischer DNA BIOP Phenylalanin Ammoniumlyase PALT At2g37040 aus genomischer DNA BIOP 4 Cumarat CoA Ligase 4CL At1g51680 ABRC Cinnamylalkohol Dehydrogenase CADT At4939330 ABRC Cinnamylalkohol Dehydrogenase ELI3 1 At4937980 ABRC Chalkonsynthase CHS At5g13930 ABRC Chalkonisomerase CHI At3g55120 ABRC Flavanon 3 Hydroxylase FHT At3g51240 ABRC Vermutliche Flavanon 3 Hydroxylase At4g10490 aus genomischer DNA BIOP Flavonolsynthase FLS At5g08640 ABRC Vermutliche NADPH Oxidoreduktase FR At1g75280 ABRC ee nem bes O Methyltransferase Kaffesauremethyltransferase OMT At5g54160 ABRC Ferulas ure 5 Hydroxylase F5H At4936220 aus genomischer DNA BIOP Indol 3 acetat B glukosyltransferase SGT AT3g21560
194. tt pfchen Teku Sechsergebinde P ppelmann GmbH amp Co Kunststoffwerk Werkzeugbau L hne Kalksand 0 1 0 4 mm Vertrieb Sekret Baustoffe Taufkirchen Hersteller Dorfner Hirschau Kristallquarzsand 0 6 1 2 mm Vertrieb Sekret Baustoffe Taufkirchen Hersteller Dorfner Hirschau Plasmide pBluescript Ampicillinresistenz Stratagene LaJolla USA pGEM T Easy Ampicillinresistenz Promega GmbH Mannheim Losungen Puffer und Medien 100x Denhardt L sung 2 w v Ficoll Type 400 Pharmacia 2 w v Polyvinylpyrrolidon PVP 360 Sigma 2 w v BSA Fraktion V Sigma autoklaviert und sterilfiltriert 10x MOPS 0 2 M MOPS 50 mM Natriumacetat 10 mMEDTA auf 1000 ml aufgef ll pH 7 einstellt autoklaviert Material und Methoden 37 10x PCR Puffer 750 mM Tris HCl pH 9 0 200 mM NHz 2SOa 0 1 TWEEN 20 15 mM MgCl 10xTBE 0 89 M Tris 0 89 M Bors ure 200 mM EDTA 1xTE 10 mM Tris HCl pH 8 0 1 mM EDTA 20x SSC 3 M NaCl 0 3 M Na Citrat 2H20O pH 7 0 DNA Auftragspuffer 5x 0 1 Bromphenolblau m v 0 1 Xylencyanol m v 25 Saccharose m v 0 25 M EDTA Formamidgel 1 0 Agarose w v in 60 C abgek hlte Agarose 1x MOPS 3 Formaldehyd v v 5 ul 100 ml Gel Ethidiumbromid Heringssperma DNA 10 mg ml autoklaviert Hybridisierungsl sung 5x SSC 5x Denhardt 0 5 SDS 100 pg ml He
195. tuttgart Kinoshita T Hara Nishimura l Siraishi H Okada K Shimura Y amp Nishimura M 1994 Nucleo tide sequence of a transmembrane protein TMP C cDNA in Arabidopsis thaliana Plant Physiol 105 1441 1442 Kita M Hirata Y Moriguchi T Endo Inagaki T Matsumoto R Hasegawa S Suhayda C G amp Omura M 2000 Molecular cloning and characterization of a novel gene encoding limonoid UDP glucosyltransferase in Citrus FEBS Lett 469 173 178 Klein M Martinoia E Hoffmann Thoma G amp Weissenb ck G 2000 A membrane potential de pendent ABC like transporter mediates the vacuolar uptake of rye flavone glucuronides regu lation of glucuronide uptake by glutathione and its conjugates Plant J 21 289 304 Kochhar A Khurana J P amp Tyagi A K 1996 Nucleotide sequence of the psbP gene encoding precursor of 23 kDa polypeptide of oxygen evolving complex in Arabidopsis thaliana and its expression in the wild type and a constitutively photomorphogenic mutant DNA Res 31 277 285 Kolb C A K ser M A Kopecky J Zotz G Riederer M amp Pf ndel E E 2001 Effects of natural intensities of visible and ultraviolet radiation on epidermal ultraviolet screening and photosyn thesis in grape leaves Plant Physiol 127 863 875 Koorneef M 1990 Mutation affecting the testa colour in Arabidopsis Arabidopsis Inf Serv 27 1 4 Koorneef M amp Stam P 1992 Genetic anal
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197. ung ergab sich eine Varianz aus den Versuchssch chten WG295 mit varwg295 VNe VNo 0 0576 0 007156 und WG360 mit varwgsso VN VNci 0 051 0 0169 f r WG360 Die beiden unabh ngig voneinander erstellten Modelle zeigten sehr hnliche kalkulatorische Varianzen was darauf r ckschlie en lie dass die Variationen innerhalb der Bestrahlungsfelder in einem sehr hnlichen Bereich lagen Die errechenbare Standardabweichung in Abh ngigkeit des gemes senen Standardfehlers ist in Abbildung 2 10 dargestellt 66 Material und Methoden 2 0 1 8 1 6 1 4 1 2 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 SA WG295 Modellgleichung 0 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 SA WG295 gemessen y 0 9244x 0 045 R 0 9599 Abbildung 2 10 Gegen berstellung der Standardfehler aus dem Fehlermodell und der gemessenen Expression Die Standardabweichung der Modellgleichung ist in Abh ngigkeit Standardabweichung aufgetragen Die Berechnung wurde SAygzss VN y VNo 0 0576 0 007156 durchgef hrt mit der gemessenen dem Modell Ergebnisse 67 3 Ergebnisse Im Sonnensimulator der GSF wurden vier verschiedene Basis Strahlungszenarien realisiert die durch unterschiedliche Intensit ten im PAR UV Bereich charakterisiert waren Diese Strahlungsszenarien werden im Folgenden mit H H M H L H und H L bezeichnet H M und L stehen f r hoch mittel und niedrig engl low
198. v variierte Die Agarose wurde in 1x TBE Puffer aufgekocht Im Anschluss wurden 5 ul Ethidi umbromid 100 ml Agarose hinzugegeben Durch leichtes Schwenken des Kolbens wurde das Ethidiumbromid homogen verteilt Der Farbstoff interkaliert zwischen den gestapelten Basenpaaren der Nukleins uren und die Banden konnten durch Anre gung mit UV Licht 320 nm im Gel sichtbar gemacht werden Die Agarosel sung wurde bei der Temperatur von ca 60 C in einen mit K mmen versehenen Geltr ger gegossen und man lie die Agarose bei Raumtemperatur f r 45 min aush rten Die Proben wurden jeweils mit 1 5 Volumen Auftragspuffer ver setzt und auf das Gel aufgetragen Als Laufpuffer diente 1x TBE Puffer Zur Gr en bestimmung der DNA Banden wurde als Referenz ein DNA Gr enstandard mitge trennt Die Elektrophorese erfolgte bei einer Feldst rke von 5 10 V cm 2 3 2 7 Restriktionsverdau Arber amp Leim 1969 Der Restriktionsverdau wurde so angesetzt dass das Volumen der einzusetzenden Enzyml sung 1 10 des Gesamtvolumens nicht berschritt um dadurch eine Inhibiti on durch das im Lagerpuffer der Enzyme befindliche Glycerin zu vermeiden Pro 1 ug zu spaltender DNA wurden 3 bis 5 U Enzym eingesetzt Die optimale Temperatur f r die Reaktion war den Herstellerangaben zu entnehmen 2 3 2 8 Enzymatische DNA Sequenzierung Die enzymatische DNA Sequenziermethode beruhte auf der Kettenabbruchmethode nach Sanger et al 1977 DNA Sequenzierungen im Rahmen d
199. yranosid K3 Q3 3 O a L Rhamnopyranosid 7 O a L Rhamnopyranosid F r eine exakte Quantifizierung wurde das oben abgebildete Chromatogramm mittels der Deconvolu tion Funktion der HPLC Software nach einem Standardverfahren getrennt Ergebnisse 69 3 1 Hoch PAR Hoch UV B H H 3 1 1 Schutzpigmente Flavonolderivate Die Konzentrationen der Quercetinderivate unterlagen in beiden Versuchen einer deutlichen spektralen Abh ngigkeit im UV Bereich Abbildung 3 2 In WG295 waren die Quercetinderivate beider Experimente etwa dreimal h her konzentriert als in WG360 Die Konzentrationen an Kaempferolderivativen zeigten nur schwach ausge pr gte spektrale Abh ngigkeiten Sinapins ureester Die Sinapins ureester unterlagen in ihren Konzentrationen hnlich wie bei den Kaempferolderivaten nur andeutungsweise einer spektralen Abh ngigkeit Abbildung 3 3 Die Statistik der Pigmentanalytik f r das Basisszenario H H ist in Tabelle 3 1 zusammengefasst Tabelle 3 1 Varianzanalyse der Pigmentmessungen in Pflanzen an dem Szenario H H W EK oer Seege DREES REES BEE p KriischerF Fass Sinapoylgiukose 1016 0013 Bra Sinapoylmalat 0 29 0 879 3 48 n s H0 Pigmentkonzentration ist nicht spektralabh ngig im UV Bereich signifikant p lt 0 05 H1 Pigmentkonzentration ist spektralabh ngig im UV Bereich hoch signifikant p lt 0 01 sehr hoch signifikant p lt 0 001
200. ysiol 126 1358 1369 Jordan B R 1996 The effects of ultraviolet B radiation on plants a molecular perspective Adv Bot Res 22 98 162 Jordan B R Chow W S Strid A amp Anderson J M 1991 Reduction in cab and psb A RNA tran scripts in response to supplementary ultraviolet B radiation FEBS Lett 284 5 8 Jung B G Lee K O Lee S S Chi Y H Jang H H Kang S S Lee K Lim D Yoon S C Yun D J Inoue Y Cho M J amp Lee S Y 2002 A Chinese cabbage cDNA with high se quence identity to phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidases encodes a novel iso form of thioredoxin dependent peroxidase J Biol Chem 15 12572 12578 Kahn R amp Durst F 2000 Function and evolution of plant cytochrome P450 Recent Adv Phyto chem 34 151 189 134 Literaturverzeichnis Kalbin G Hidema J Brosche M Kumagai T Bornman J F amp Strid A 2001 UV B induced DNA damage and expression of defence genes under UV B stress tissue specific molecular marker analysis in leaves Plant Cell Environ 24 983 990 Kampranis S C Damianova R Atallah M Toby G Kondi G Tsichlis PN amp Makris A M 2000 A novel plant glutathione S transferase peroxidase suppresses Bax lethality in yeast J Biol Chem 275 29207 29216 Karlson P Doenecke D amp Koolman J 1994 Kurzes Lehrbuch der Biochemie f r Mediziner und Naturwissenschaftler Georg Thieme Verlag S
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202. z B die Anzahl von UV induzierten Cyclobutanpyrimidin Dimeren s u Die Bestimmung solcher quantitativen Zusammenh nge ist sehr aufw ndig Meist gen gt es die relative Ab h ngigkeit zu bestimmen d h die Wirkung bei einer beliebigen Wellenl nge wird auf die Wirkung einer vorgegebenen Wellenl nge normiert meist 300 nm Zur Unter scheidung vom Wirkungsspektrum spricht man von der biologischen Wichtungsfunk tion BWF Auf diese Weise k nnen auch verschiedenartige BWFs miteinander ver glichen werden In der Natur sind Pflanzen und andere Organismen dem breiten Spektrum der sola ren Globalstrahlung ausgesetzt Bezeichnet man die spektrale Bestrahlungsstarke mit Ex A t und die BWF mit s A so ergibt sich der gesamte biologische Effekt B E als B E s A Ex Ast da Einleitung 9 Spektrale Bestrahlungsst rke mW m nh Wellenl nge nm Abbildung 1 1 Typische Spektren der terrestrischen Globalstrahlung bei verschiedenen Sonnenh hen ber dem Horizont gemessen in Neuherberg am 17 04 1996 48 41 N 11 41 E 495 m H he ber Meeresspiegel 10 10 102 10 10 10 Spektrale Bestrahlungsstarke mW m nech 107 300 320 30 360 380 400 Wellenl nge nm Abbildung 1 2 Logarithmische Auftragung von Abbildung 1 1 im Strahlungsbereich von 300 400 nm 10 Einleitung Die Integration erstreckt sich ber den Spektralbereich der UV B und UV A Strahlung 280 400 nm
203. zlich gepr ft werden ob die Konzentrationen der Quercetinderivate einem Einfluss der PAR Bestrahlungsst rke unterlagen Zur berpr fung dieser Hypothese wurden die spekt ralen Ergebnisse von H H gegen die des L H Szenarios durch eine zweifaktorielle Varianzanalyse auf eine etwaige Beeinflussung durch diesen Strahlungsbereich ge testet Damit die Hauptwirkung der Faktoren UV Strahlung und PAR auf die Akkumu lation an Quercetinderivaten gepr ft werden konnte musste eine eventuelle Wech selwirkung zwischen beiden Strahlungskomponenten statistisch ausgeschlossen werden da es sonst keinen Sinn h tte die Hauptwirkung von PAR und UV Strahlung zu testen Precht amp Kraft 1993 In Tabelle 3 9 sind die statistischen Kenngr en dieses Tests zusammengestellt Dort ist ersichtlich dass die UV spektrale Wirkung auf einem sehr hohem Signifikanzniveau von PAR abh ngig war p lt 0 001 Tabelle 3 9 Statistische berpr fung der PAR Abh ngigkeit der Synthese der Quercetinderivate ee i Geam s son EEE signifikant p lt 0 05 hoch signifikant p lt 0 01 sehr hoch signifikant p lt 0 001 84 Ergebnisse 3 7 Wirkungsspektrum f r die Akkumulation an Quercetinderivaten Das Ziel der polychromatischen Versuche war es aus den erhobenen Daten f r UV B Schutzmolek le Wirkungsspektren zu erstellen um damit das Risiko erh hter UV B Strahlung sowie die Strahlungsbeeinflussung des Schutzpotentials dieser Molek le funktionell
204. zu einer gest rten DNA Replikation und RNA Transkription f hrt Britt 1996 1 3 4 2 DNA Reparatur Die Reparatur der DNA Sch den geschieht haupts chlich durch die lichtgetriebene Photoreaktivierung der DNA durch die Photolyasen Britt 1996 Die Photolyasen setzen die Cyclobutan und 6 4 Pyrimidine wieder zur nativen bersetzbaren DNA um Ahmad et al 1997 Sakamoto et al 1998 Waterworth et al 2002 Die Mutati onen des Cyclobutantyps werden spezifisch durch die CPDIl Photolyase und die 6 4 Dimere durch die 6 4 Photolyase r ckg ngig gemacht Taylor et al 1990 CPDII Photolyasen tragen zwei chromophore Gruppen eines Flavin und Fols uretyps de ren Absorptionsmaxima in einem Wellenbereich von 350 450 nm liegen Die ber Einleitung 29 tragung eines Elektrons im katalytischen Zentrum der CPDII auf die Cyclobutanstruk tur f hrt zur R ckbildung in zwei lesbare Pyrimidine Jansen 1998 Sancar 1994 Die 6 4 Photolyasen sind zu den CPDII Photolyasen je nach Organismus etwa zu 30 aminos urenhomolog Die enzymatischen Redoxvorg nge sind bei den 6 4 Photolyasen anderer Natur als die der CPDII Photolyasen Nakajima et al 1997 Weber et al 2002 Beide Enzyme m ssen aber f r ihre Reparaturaktivitat durch Komponenten der UV A Strahlung photoaktiviert werden In Arabdiopsis thaliana konnte allerdings beobachtet werden dass die Pflanze im Dunklen DNA Reparatur betreibt Diese Funktion wurde dem UVHT Locus zugeschrieben Di

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