PapilloCheck - Greiner Bio-One
Contents
1. Klassifizierung gem Verord nung EG Nr 1272 2008 Akute orale Toxizit t Kategorie 4 Akute inhalative Toxizit t Kategorie 4 Chronische aquatische Toxizit t Kategorie 3 Haut tzend Kategorie 1c Hautreizend Kategorie 2 Schwere Au gensch den Kategorie 1 GHS Pik togramm und Sig nalwort Q GEFAHR Q GEFAHR H und P S tze H302 H332 H314 H412 P273 P280 P305 P351 P338 EUH032 H315 H318 P280 P305 P351 P338 Gesundheitssch dlich beim Ver schlucken Gesundheitssch dlich beim Einat men Verursacht schwere Ver tzungen der Haut und schwere Augensch den Sch dlich f r Wasserorganismen mit langfristiger Wirkung Freisetzung in die Umwelt vermei den Schutzhandschuhe Schutzkleidung Augenschutz Gesichtsschutz tragen BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN Einige Minuten lang behutsam mit Wasser sp len Vorhandene Kontaktlinsen nach M glichkeit entfernen Weiter sp len Unverz glich ein GIFTINFOR MATIONSZENTRUM oder einen Arzt anrufen Erg nzende Angaben zu Gefahrstof fen EU Entwickelt bei Ber hrung mit S ure sehr giftige Gase Verursacht Hautreizungen Verursacht schwere Augensch den Schutzhandschuhe Schutzkleidung Augenschutz Gesichtsschutz tragen BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN Einige Minuten lang behutsam mit Wasser sp len Vorhandene Kon taktlinsen nach M glichkeit entfer nen Weiter sp len Die2. r die angegebene Anzahl an PapilloCheck Chips Anzahl an PapilloCheck Chips Komponenten 2 3 Destilliertes oder entionisiertes Wasser 140 ml 280 ml 420 ml PapilloCheck Puffer A Konzentrat 14 ml 28 ml 42 ml PapilloCheck Puffer B Konzentrat 1 75 ml 3 5 ml 5 25 ml Gesamtvolumen 155 75 ml 311 50 ml 467 25 ml Die Waschl sungen d rfen auf keinen Fall wiederverwendet werden da dies zu einer Ansammlung abgewaschener PCR Produkte und dadurch zu einer Verf lschung der PapilloCheck Ergebnisse f hren k nnte Verwenden Sie f r jeden Test frische Waschl sungen Die vorbereitete Waschl sung kann bis zu eine Woche lang bei Raumtemperatur aufbewahrt werden berpr fen Sie ob SDS ausgefallen ist Ist dies der Fall erw rmen Sie die Waschl sung bis sich der Niederschlag gel st hat und lassen Sie das Gemisch anschlie end wieder Raumtemperatur annehmen F hren Sie dann die Vorbereitungen f r das n chste Hybridisierungsexperiment durch 26 PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 8 3 2 Hybridisierung Die Hybridisier amp ung muss bei Raumtemperatur 20 25 C durchgef hrt werden Die wichtigsten Arbeitsschritte zum Hybridisieren der PCR Produkte der PapilloCheck PCR Reaktion auf dem PapilloCheck Chip sind in Abbildung 5 gezeigt ug Mischen und zentrifugieren Sie die PCR Produkte kurz vor der Verwendung Wurden die PCR Produkte bis zur Hybridisierung bei 20 C aufbewahrt m ssen Sie
3. t Nicht HPV Organismen Es wurden folgende Nicht HPV Organismen mit PapilloCheck getestet 5 10 ng genomische DNA Es wurden keine positiven Signale erhalten Acinetobacter baumannii Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter Iwoffii Actinobacillus actinomycetemcomitans Serovar c Actinomyces odontolyticus Actinomyces viscosus Bacillus subtilis Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium breve Campylobacter concisus Campylobacter gracilis Campylobacter rectus Candida albicans Capnocytophaga gingivalis Capnocytophaga ochracea Capnocytophaga sputigena Citrobacter amalonaticus Citrobacter freundii Citrobacter freundii Citrobacter koseri Citrobacter koseri Clostridium difficile Clostridium perfringens Eikenella corrodens Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter sakazakii Enterococcus durans Enterococcus faecali Enterococcus faecium Escherichia coli Eubacterium nodatum Fusobacterium nucleatum Gardnerella vaginalis Hafnia alvei Kingella denitrificans Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Lactobacillus casei Lactobacillus crispatus Lactobacillus gasseri Lactobacillus iners Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus vaginalis Mogibacterium timidum Morganellamorganii Mycoplamahominis Mycoplasma buccale Mycoplasmafaucium Mycoplasmafermentans Mycoplasma genitalium Mycoplasma orale Mycoplasma pirum Mycoplasma salivrium Mycoplosma pneumoniae Neisseria elongata Neisseria gonorrhoeae Peptoniphil
4. 2 Bei dem zweiten Schritt 15 Minuten bei 95 C wird einerseits die Uracil N Glycosylase inaktiviert und andererseits die HotStarTaq Polymerase aktiviert Das UNG System der PapilloCheck PCR eliminiert nur Kontaminationen mit PCR Produkten aus vorherigen PCR Reaktionen Andere Kontaminationen beispielsweise solche die w hrend der Probenvorbereitung der DNA Extraktion oder der Zugabe von PCR Template stattfinden lassen sich damit nicht eliminieren Es m ssen daher nach wie vor die in Kapitel 7 beschriebenen Anweisungen und besonderen Vorsichtsma nahmen zur Verhinderung von Kontaminationen befolgt werden Der Kauf des PapilloCheck beinhaltet eine eingeschr nkte Lizenz im Rahmen der US Patente 5 035 996 5 683 896 5 945 313 6 287 823 und 6 518 026 und entsprechender ausl ndischer Patente Longo M C et al Use of uracil DNA glycosylase to control carry over contamination in polymerase chain reactions Gene 93 125 128 1990 22 PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 8 2 3 Ansatz der PCR Reaktion Mit Ausnahme der HotStarTaq Polymerase und der Uracil N Glycosylase enth lt der PapilloCheck PCR MasterMix bereits alle Komponenten die f r die Durchf hrung der PCR Reaktion ben tigt werden PCR Puffer MgCl dNTPs Primer PCR Kontroll Template Das PapilloCheck Testkit wurde mit der HotStarTaq Polymerase von Qiagen validiert siehe Kapitel 2 Die Verwendung dieses Enzyms
5. Den Objekttr gerhalter in den oCheck Waschbeh lter mit Waschl sung tauchen Den oCheck Griff anbringen Den die PapilloCheck Chip s bei Raumtemperatur 10 Sekunden in Waschl sung waschen Den die PapilloCheck Chip s 60 Sekunden in der auf 50 C vorgew rmten Waschl sung Il waschen Den die PapilloCheck Chip s bei Raumtemperatur 10 Sekunden in Waschl sung Ill waschen Durch Zentrifugieren s mtliche Fl ssigkeit von der Oberfl che des PapilloCheck Chips entfernen Den die PapilloCheck Chip s mit dem CheckScanner scannen Scannen und Auswertung nach Beschreibung im Benutzerhandbuch der CheckReport Software Berichte erstellen ode 3 Minuten 1 Minute 500 g max Geschw
6. HPV 53 HPV 70 HPV 42 HPV 35 HPV 56 HPV 73 HPV 43 HPV 39 HPV 58 HPV 82 HPV 44 HPV 55 PapilloCheck ist nicht zur Differenzierung zwischen HPV 44 und HPV 55 geeignet EN Walboomers J et al 1999 Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide J Pathol 189 1 12 9 Burd EM Human papillomavirus and cervical cancer Clin Microbiol Rev 2003 16 1 17 Bosch F X et al 2008 Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type specific implications in cervical neoplasia Vaccine 26 Suppl 10 K1 16 Meijer C J et al 2009 Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older Int J Cancer 124 3 516 20 GA N gt PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 10 6 3 Testprinzip PapilloCheck ist ein Microarray basiertes Testkit f r den Nachweis und die Genotypisierung eines Fragments des E1 Gens im Genom des humanen Papillomavirus HPV Das Testprotokoll ist in Abbildung 1 im berblick dargestellt Vor der PapilloCheck Analyse muss zun chst DNA aus einer zervikalen Abstrichprobe extrahiert werden Probenentnahme und DNA Extraktion sind nicht Teil des PapilloCheck Testkits Speziell vorgesehene Produkte f r die Probenentnahme PapilloCheck Probenentnahmeset und die DNA Extraktion oCheck DNA Extraktionskit sind separat von Greiner Bio One erh ltlich B
7. befolgt werden um eine maximale Sicherheit f r das Laborpersonal zu gew hrleisten und qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erreichen Molekularbiologische Prozesse wie DNA Extraktion Amplifikation und Nachweis von DNA m ssen von entsprechend geschultem Personal durchgef hrt werden Dar ber hinaus ist ein sauberer und gut strukturierter Arbeitsablauf von entscheidender Bedeutung als Vorbeugema nahme gegen falsche Ergebnisse die durch Abbau der Proben DNA oder Kontamination mit Amplifikaten entstehen k nnten Dazu ist es erforderlich die Laborbereiche f r Extraktion Amplifikation und Detektion wie in Kapitel 7 2 beschrieben voneinander zu trennen In jedem Bereich sollten separate Ausr stung Verbrauchsmaterialien Laborkittel und Handschuhe vorhanden sein berf hren Sie niemals Laborkittel Handschuhe oder Equipment von einem Bereich in einen anderen 7 2 Raumaufteilung Abbildung 3 zeigt beispielhaft eine Aufteilung eines Labors in drei separate Bereiche Ein Bereich wird nur zur DNA Extraktion verwendet ein anderer ist zum Ansetzen und zur Durchf hrung von PCR Reaktionen bestimmt und im letzten Bereich erfolgen Hybridisierung und Analyse Jeder Raum ist ausschlie lich f r die zweckbestimmte Anwendung oder Technik zu verwenden um eine Kontamination der Proben zu verhindern Um die versehentliche Verwendung von Ausr stungen und Verbrauchsmaterialien in mehreren Bereichen zu vermeiden wird eine Kennzeichnung mit unterschiedli
8. das relative Risiko der Entwicklung von Krebs bzw zervikalen intraepithelialen L sionen CIN vom Virustyp abh ngig Etwa 70 aller Zervikalkarzinome werden mit einer persistierenden Infektion mit HPV 16 oder 18 in Zusammenhang gebracht Unter den Niedrigrisiko Typen haben HPV 6 und 11 die h chste Pr valenz Aufgrund einer fast 100 igen tiologischen Verkn pfung zwischen karzinogenem HPV und Zervikalkarzinom werden Tests auf hrHPV inzwischen im Rahmen der prim ren Geb rmutterhalskrebsvorsorge in Betracht gezogen 6 1 Zweckbestimmung Bei PapilloCheck handelt es sich um ein diagnostisches Kit f r den qualitativen Nachweis und die Genotypisierung von 24 Typen des humanen Papillomavirus in DNA Aufreinigungen aus menschlichen Zervikalabstrichen Das Kit ist nur zur Verwendung durch qualifiziertes Personal bestimmt PapilloCheck entspricht den Anforderungen der Richtlinie ber In Vitro Diagnostika 98 79 EG und ist folglich mit der CE Kennzeichnung versehen Alle mit PapilloCheck erhaltenen Diagnostikergebnisse sollten in Verbindung mit anderen klinischen oder Laborbefunden ausgewertet werden 6 2 Mit PapilloCheck nachweisbare HPV Typen PapilloCheck erm glicht die Identifizierung von 18 Hochrisiko lund 6 Niedrigrisikotypen _ des humanen Papillomavirus HPV Tabelle 1 Tabelle 1 Mit PapilloCheck nachweisbare HPV Typen HPV 16 HPV 45 HPV 59 HPV 6 HPV 18 HPV 51 HPV 66 HPV 11 HPV 31 HPV 52 HPV 68 HPV 40 HPV 33
9. dem Greiner Bio One Vertriebsh ndler vor Ort in Verbindung Verwenden Sie keine besch digten Kitkomponenten da dies zu Leistungseinbu en des Kits f hren kann Verwenden Sie das PapilloCheck Testkit nicht nach dem Verfallsdatum Verwenden Sie keine abgelaufenen Reagenzien Mischen Sie keine Reagenzien aus verschiedenen Chargen Verwenden Sie nur Reagenzien Ausr stung die mit dem Kit geliefert wurden bzw vom Hersteller empfohlen werden Die Mikropipetten das Wasserbad und der Heizblock m ssen regelm ig geeicht bzw gewartet werden Das Pipettieren von kleinen Fl ssigkeitsmengen im Mikroliterbereich erfordert bung Achten Sie daher darauf dass Sie die ben tigten Volumina mit den Mikropipettoren so pr zise wie m glich pipettieren Verhindern Sie die Kontamination von Reagenzien bei der Entnahme von Aliquots aus Reagenzgef en Alle Zentrifugationsschritte sollten bei Raumtemperatur 18 25 C durchgef hrt werden PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 7 3 4 Sichere Arbeitsweise e Gehen Sie bei der Handhabung biologischer Proben die humanes potenziell infekti ses Material enthalten mit u erster Vorsicht vor Zur Verringerung der Infektionsgefahr wird empfohlen in einer Sterilbank zu arbeiten bis die Proben vollst ndig Iysiert wurden Handhaben und entsorgen Sie alle biologischen Proben so als ob diese infekti se Erreger bertragen k nnten e Pipettieren Sie niemals mit dem Mun
10. der Vorbereitung der PCR Reaktion Wiederholen Sie die PapilloCheck Analyse ab dem Schritt der Vorbereitung der PCR Reaktion Wiederholen Sie die PapilloCheck Analyse ab dem Schritt der Vorbereitung der PCR Reaktion Wiederholen Sie die PapilloCheck Analyse ab dem Schritt der Vorbereitung der PCR Reaktion Achten Sie darauf das Reaktionsgemisch gr ndlich zu mischen Wiederholen Sie die DNA Extraktion und die PapilloCheck Analyse Wiederholen Sie die Hybridisierung Wiederholen Sie die Hybridisierung berpr fen Sie die Funktion und die korrekte Programmierung des Thermocyclers PCR Schritte Geschwindigkeit der Temperaturerh hung Volumen Achtung Verwenden Sie entweder das GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems als Thermocycler oder den Veriti 96 Well Thermocycler Applied Biosystems in Kombination mit PapilloCheck Wiederholen Sie die PapilloCheck Analyse ab dem Schritt der Vorbereitung der PCR Reaktion Wiederholen Sie die DNA Extraktion Die Probenentnahme ist fehlgeschlagen Die Probe ist u erst transparent Konzentrieren Sie die Probe entsprechend der Beschreibung in Kapitel 9 1 und wiederholen Sie die DNA Extraktion oder wiederholen Sie die Probenentnahme Dieses Ergebnis wird als g ltig eingestuft wenn die CheckReport Software mindestens einen HPV Typ in der Probe mit einem Signal ber einem definierten Schwellenwert erfasst Die Proben und oder PCR Kontrolle kann in diese
11. eine klinische Spezifit t f r gt CIN2 von 96 7 95 KI 95 7 97 7 F r den GP5 6 PCR EIA lagen die Werte vergleichsweise bei 96 4 185 192 95 Kl 93 9 98 9 bzw 97 7 95 Kl 96 9 98 5 siehe Tabelle 9 und 10 Tabelle 9 Vergleich der nach Kontrollen und F llen stratifizierten Ergebnisse des PapilloCheck 14 hr HPV Typen und des GP5 6 PCR EIA PapilloCheck GP5 6 PCRIEIA Gesamt 14 hr HPV Typen Kontrollen 1 386 96 5 4 0 3 1 390 96 7 18 1 3 29 2 0 47 3 3 1 404 97 7 36 2 3 1 437 4 2 1 8 4 2 181 94 3 184 95 8 Gesamt 9 185 96 4 192 Tabelle 10 Klinische Sensitivit t und Spezifit t des PapilloCheck und des GP5 6 PCR EIA Ergebnisse f r mindestens einen der 14 hr HPV Typen HPV 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 oder 68 14 hrHPV PapilloCheck GP5 6 Klinische Sensitivit t f r 2 CIN3 Klinische Spezifit t f r 2 CIN2 96 7 97 7 7 Comparison of the clinical performance of PapilloCheck human papillomavirus detection with that of the GP5 6 PCR enzyme immunoassay in population based cervical screening Hesselink AT Heideman DA Berkhof J Topal F Pol RP Meijer CJ Snijders PJ J Clin Microbiol 2010 Mar 48 3 797 801 Epub 2009 Dec 30 8 Bulkmans N W L Rozendaal P J Snijders F J Voorhorst A J Boeke G R Zandwijken F J van Kemenade R H Verheijen K Groningen M E Boon H J Keuning M van B
12. ist eine Voraussetzung daf r die angegebenen Leistungsparameter zu erf llen Das Reaktionsgemisch wird optimalerweise in einer gesch tzten Umgebung angesetzt z B einer PCR Hood um eine Kontamination der Reaktion zu vermeiden ug Setzen Sie das Reaktionsgemisch bestehend aus PapilloCheck PCR MasterMix HotStarTaq Polymerase und Uracil N Glycosylase f r die erforderliche Anzahl an PCR Reaktionen entsprechend den Angaben in Tabelle 3 an Wenn mehrere Proben analysiert werden sollte das Reaktionsgemisch in einem Ansatz Batch in der f r alle Analysen ben tigten Menge angesetzt werden Zum Ausgleich von Volumenschwankungen beim Pipettieren empfiehltessich dieAnzahl der Reaktionen n f rjeden Chip um 1 zu erh hen n 1 d h es wird ein f r 13 Amplifikationsreaktionen ausreichendes Volumen des Reaktionsgemisches angesetzt wenn 12 Proben getestet werden sollen siehe Tabelle 3 Verwenden Sie pro Chip jeweils eines der 5 MasterMix R hrchen des Kits Es wird empfohlen bei jedem PapilloCheck PCR MasterMix Ansatz eine Negativkontrolle mitzuf hren Als Negativkontrolle eignet sich der DNA Elutionspuffer des jeweiligen DNA Extraktionskits oder PCR Wasser ug Mischen Sie das Reaktionsgemisch gr ndlich indem Sie es entweder 2 Sekunden vortexen und anschlie end zentrifugieren oder mehrmals auf und ab pipettieren m Aliquotieren Sie das Reaktionsgemisch indem Sie pro PCR Reaktion 21 ul des Reaktionsgemisches in ein d
13. nnwandiges 0 2 ml PCR Reaktionsgef pipettieren Die DNA Template Zugabe sollte in einem separaten Arbeitsbereich durchgef hrt werden siehe Kapitel 7 2 m Geben Sie jeder PCR Reaktion 5 ul DNA Extrakt zu und mischen Sie den Reaktionsansatz indem Sie ihn entweder 2 Sekunden vortexen und anschlie end zentrifugieren oder mehrmals auf und ab pipettieren Das Gesamtvolumen einer PCR Reaktion betr gt 26 ul m Stellen Sie die Reaktionsgef e in den Thermocycler und starten Sie die PCR Reaktion mit dem in Kapitel 8 2 1 beschriebenen Thermocycler Programm Tabelle 2 Nach Abschluss der PCR sollten die Amplifikationsprodukte entweder sofort f r die Hybridisierung verwendet oder bis zu eine Woche im Dunkeln bei 20 C aufbewahrt werden PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 23 Tabelle 3 Ansetzen der PapilloCheck PCR Reaktion 1 Reaktion 13 Reaktionen 1 Chip PapilloCheck PCR MasterMix HotStarTaq Polymerase 5 E ul Uracil N Glycosylase 1 200 verd nnt 0 005 E pl Gesamtvolumen vor Zugabe von Proben DNA DNA Extrakt aus zervikaler Probe DNA Template Gesamtvolumen pro Reaktion PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 26 Reaktionen 2 Chips 39 Reaktionen 3 Chips 52 Reaktionen 4 Chips 1029 6 ul 1092 ul 24 8 3 NHybridisierung und Waschen 8 3 1 Vorbereitung Die Hybridisierung muss bei Raumtemperatur 20 25 C
14. unabh ngigen Replikaten mit PapilloCheck analysiert Die Replikate wurden an drei Tagen jeweils vom selben Laboranten getestet Tabelle 6 Zusammensetzung der Proben zur berpr fung der Wiederholpr zision Proben ID Menge an DNA x Faches der Nachweisgrenze Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 HPV 16 HPV 18 HPV 31 menschliche genomische DNA HPV 16 HPV 18 HPV 31 menschliche genomische DNA HPV 16 HPV 18 HPV 45 menschliche genomische DNA HPV 16 HPV 18 HPV 45 menschliche genomische DNA HPV 18 HPV 31 HPV 45 menschliche genomische DNA Template 180 Kopien 1 500 Kopien 1 400 Kopien ing 180 Kopien 1 500 Kopien 1 400 Kopien 5ng 1 800 Kopien 450 Kopien 300 Kopien 5ng 10 000 Kopien 5 000 Kopien 20 000 Kopien 2 5 ng 4 500 Kopien 500 Kopien 90 Kopien 2 5 ng In allen f nf Proben und bei jeder Analysewiederholung wurden die drei richtigen HPV Typen erkannt und die Analyse war f r den nicht enthaltenen Typ negativ Demnach waren 75 von 75 Einzeltestergebnissen 5 Proben x 5 Replikate x 4 verschiedene HPV Templates korrekt PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 11 3 Vergleichspr zision Die Vergleichspr zision des PapilloCheck Testkits wurde mithilfe von 22 klinischen Proben siehe Tabelle 7 ermittelt die HPV in Konzentrationen an der Nachweisgrenze enthielten Die Bestimmung wurde mit derselben Methode mit identischem Prob
15. 3 Waschen und Trocknen Mit dem von Greiner Bio One erh ltlichen Spezial Equipment k nnen bis zu vier PapilloCheck Chips gleichzeitig gewaschen werden siehe Kapitel 2 Das f r die Verarbeitung der PapilloCheck Chips ben tigte zus tzliche Equipment besteht aus drei oCheck Waschbeh ltern und einem Griff f r den magnetischen Objekttr gerhalter der Hybridisierungskammer Die verschiedenen Arbeitsschritte sind in Abbildung 6 dargestellt IT IT IT IT IT Im II Heben Sie den magnetischen Objekttr gerhalter mit den hybridisierten PapilloCheck Chips vorsichtig aus der Hybridisierungskammer Tauchen Sie den Objekttr gerhalter mit den PapilloCheck Chips direkt in den oCheck Waschbeh lter mit Waschl sung I Achten Sie darauf dass die Magnetseite nach oben zeigt Bringen Sie den oCheck Griff an dem Objekttr gerhalter an und beginnen Sie mit dem ersten von insgesamt drei Waschschritten Waschen Sie den Chip bei Raumtemperatur 20 25 C in Waschl sung I indem Sie ihn 10 Sekunden lang rasch auf und ab bewegen Die Arrays m ssen dabei stets mit Waschl sung bedeckt bleiben Waschen Sie den Chip f r 60 Sekunden in der auf 50 C vorgew rmten Waschl sung Il indem Sie ihn kr ftig auf und ab bewegen Waschen Sie den Chip bei Raumtemperatur 20 25 C in Waschl sung Ill indem Sie ihn 10 Sekunden lang rasch auf und ab bewegen Entfernen Sie durch Zentrifugation sofort s mtliche Fl ssigkeit von der
16. Chip Oberfl che Wenn Sie f r die Mikroarrays eine spezielle Tischzentrifuge verwenden betr gt die Zentrifugationsdauer 1 Minute Wenn Sie eine f r 50 ml Gef e geeignete Zentrifuge verwenden geben Sie je einen gewaschenen PapilloCheck Chip in ein 50 ml Gef und zentrifugieren Sie 3 Minuten bei 500 g bei Raumtemperatur Der PapilloCheck Chip ist nun bereit zum Scannen und sollte unverz glich gescannt werden Sp len Sie die oCheck Waschbeh lter nach jedem abgeschlossenen Wasch und Trocknungsprozess zum Reinigen mehrmals mit Wasser aus PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 29 Erster Waschschritt m Heben Sie den magnetischen Objekttr gerhalter vorsichtig aus der Hybridisierungskammer m Tauchen Sie den Objekttr gerhalter rasch in den oCheck Waschbeh lter mit Waschl sung m Bringen Sie den oCheck Griff an m Waschen Sie den die PapilloCheck Chip s bei Raumtemperatur 10 Sekunden lang in Waschl sung l indem Sie den Objekttr gerhalter auf und ab bewegen Zweiter Waschschritt m Waschen Sie den die PapilloCheck Chip s in der in einem Wasserbad vorgew rmten Waschl sung bei 50 C f r 60 Sekunden indem Sie den Objekttr gerhalter auf und ab bewegen Dritter Waschschritt m Waschen Sie den die PapilloCheck Chip s bei Raumtemperatur 10 Sekunden lang in Waschl sung Ill indem Sie den Objekttr gerhalter auf und ab bewegen Trocknen m Entfer
17. EEOCHECKTVERFA HREN tee EE 18 8 1 Probenentnahme und DNA Extraktion 2 22002n000n00nnnnnnnnnnnnnnnnnn REENEN ENEE REENEN REENEN 18 E ES e En e Ei 18 83172 E dee E 20 8 2 Polymerasekettenreaktion PCR BEE 21 82 1 e En Wel liMermacyGiers co eaa E 21 8 2 2 Behandlung mit Uracil N Glycosylase UNG era 22 82 orana den e EE 23 6 9 HyDridisier ng nd Waschen EE 25 8 3 eV OLDELSHU RG anna 25 8 352 e lee e EE 27 8 33 Ten Tee WR elen E EE 29 8 4 Scannen und Auswertung des PapilloCheck Chips 2222002200s2nan0000nnnnnnnnnnnnnn anne 31 PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 I FEHLERBEHERUNE anne een 32 10 TECHNISCHER SUPPORT 2 220 2002n002000n0nanunnnnnnnn nun nun nun nun nun nnnnnnnn anne 33 11 LEISTUNGSMERKMALE VON PAPILLOCHECK 222222022000002a0000nnnnnnnnnnnnnn nn 34 11 1 Analytische Leistungsbewertung von PapilloCheck uuuurr22au002002an0000nnnnnnnnnnnnnnnunnnnnnnnnn 34 111 1 Apaisene er ee ee 34 11 1 2 Analytische Spezifit t HM Ivpen nennen 35 11 1 3 Analytische Spezifit t Ncht HM Organsmen nn 35 Oh fer AE Da neet E 36 113 We EE ED E 37 TERORIS EE 38 11 5 Klinische Leistungsbewertung von PapilloCheck 2u22000200000000n0nnnnnonnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nn 39 12 PAPILEOCHEEKIKURZPROTOKOLE ee 41 12 1 Raum 2 PCR Ansatz des Reaktionsgemisches u zu20220002000000000nnn0nnnnnnnnnn
18. aktuelle Version des Sicherheitsdatenblatts f r dieses Produkt kann von der Greiner Bio One Website heruntergeladen werden www gbo com bioscience biochips_download PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 5 ENTSORGUNG Nach dem Waschen und Trocknen des PapilloCheck Chips k nnen die Waschl sungen II und Ill ohne weitere besondere Vorsichtsma nahmen entsorgt werden Den gebrauchten PapilloCheck Chip unbenutzte Kitkomponenten und unbenutzten Hybridisier amp ungsmix im Laborm ll entsorgen Befolgen Sie die national und regional geltenden Richtlinien zur Abfallentsorgung PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 6 EINLEITUNG In praktisch allen F llen von Geb rmutterhalskrebs der zweith ufigsten Krebserkrankung bei Frauen weltweit liegt eine persistierende Infektion mit einem karzinogenen humanen Papillomavirus HPV vor Bislang sind ber 100 HPV Typen identifiziert worden von denen etwa 40 sexuell bertragen werden und die Genitalschleimhaut infizieren Zervikale HPV Typen werden in eine Hochrisikogruppe high risk HPV hrHPV und eine Niedrigrisikogruppe low risk HPV IrHPV eingeteilt Die Hochrisiko HPV Typen werden generell mit einem erh hten Risiko f r die Entwicklung eines Zervikalkarzinoms in Verbindung gebracht wohingegen die HPV Typen in der Niederrisikogruppe berwiegend gutartige Genitalwarzen hervorrufen Doch auch innerhalb der Hochrisikogruppe ist
19. allegooijen A J van den Brule and C J Meijer 2004 POBASCAM a population based randomized controlled trial for implementation of high risk HPV testing in cervical screening design methods and baseline data of 44 102 women Int J Cancer 110 94 101 PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 Zur Untersuchung der Pr valenz der vom PapilloCheck erfassten HPV Typen wurden zervikale Abstriche von 881 Frauen gescreent Alle zervikalen Proben wurden in STM Probenentnahmemedium Qiagen Hilden Deutschland aufgenommen Am h ufigsten war HPV 16 mit einer Nachweisrate von 19 4 gefolgt von HPV 31 HPV 39 HPV 51 und HPV 52 In Tabelle 11 sind die Pr valenzen f r alle nachweisbaren Typen aufgef hrt Tabelle 11 Pr valenz der mit PapilloCheck nachweisbaren HPV Typen Pr valenz mit dem HPV Genotyp PapilloCheck HPV 16 19 40 HPV 31 14 40 HPV 39 9 30 HPV 51 9 10 HPV 52 7 50 HPV 58 6 10 HPV 53 6 10 HPV 42 5 80 HPV 66 5 90 HPV 68 5 60 HPV 45 4 50 HPV 33 4 40 HPV 18 4 00 HPV 70 4 10 HPV 59 2 50 HPV 82 1 90 HPV 35 1 60 HPV 73 1 50 HPV 6 0 60 HPV 11 0 60 HPV 40 0 40 Evaluation of the performance of the novel PapilloCheck HPV genotyping test by comparison with two other genotyping systems and the HC2 test Schopp B Holz B Zago M Stubenrauch F Petry KU Kjaer SK Iftner T J Med Virol 2010 Apr 82 4 605 15 40 PapilloChec
20. as LI O lt Q PapilloCheck Gebrauchsanweisung HPV DNA Chip Diagnostik Kit f r die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ 6 11 16 18 31 33 35 39 40 42 43 44 55 45 51 52 53 56 58 59 66 68 70 73 82 in Zervikalproben REF 465 060 Nur zur Verwendung f r die In Vitro Diagnostik durch geschultes Laborpersonal Greiner Bio One GmbH Maybachstr 2 e 72636 Frickenhausen Deutschland Telefon 49 0 7022 948 0 Fax 49 0 7022 948 514 info de gbo com www gbo com bioscience Revision BQ 013 08 Mai 2015 gt greiner bio one SYMBOLGLOSSAR de en fr es pt ni da SV pl no el tr Im Dunkeln lagern Store in the dark stocker a labri de la lumi re Conser varen un lugar oscuro Conserva re al buio Conservar num local escuro Donker bewaren Opbeva res m rkt F rvaras m rkt Przechow ywa w ciemno ci Oppbeva res m rkt ATto nkKE ETOI OTA OKOTEIV Karanl k yerde saklay n z Mindes tens haltbar bis Use by Date limite de conser vation jusqu au A utilizar preferi blemente antes de Da utilizzare entro e non oltre A utilizar prefer velmente antes de Tenminste houdbaar tot Anvendes senest Sista f r bruknings dag Termin zydatno ci holdbar til TO Iy TEpO laTNpE TaI Son kullanma tarihi Vor Gebrauch Anwe
21. ch der Systemanforderungen sind die Gebrauchsanweisungen des CheckSanner und der CheckReport Software zu beachten 4 F r die PapilloCheck Waschschritte werden drei oCheck Waschbeh lter ben tigt PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 3 VERSAND UND LAGERUNG Das PapilloCheck Testkit wird bei Raumtemperatur versendet Dennoch muss das Kit nach Erhalt umgehend bei 4 8 C und lichtgesch tzt aufbewahrt werden Bei sachgem er Aufbewahrung k nnen das PapilloCheck Testkit und seine Komponenten bis zum angegebenen Verfallsdatum verwendet werden Unter diesen Aufbewahrungsbedingungen entspricht das Haltbarkeitsdatum auch nach dem ersten ffnen des Kits und seiner Komponenten dem Verfallsdatum 4 SICHERHEITSHINWEISE Das PapilloCheck Testkit ist nur f r die Verwendung im Labor und nicht als Arzneimittel f r den Gebrauch zu Hause oder f r andere Zwecke bestimmt Tragen Sie stets einen geeigneten Laborkittel Einmalhandschuhe und Schutzbrille und beachten Sie die in diesem Abschnitt aufgef hrten Sicherheitshinweise Die folgenden Komponenten des PapilloCheck Testkits enthalten gesundheitssch dliche oder gef hrliche Substanzen Kitkomponen tenmenge PapilloCheck Hybridisie rungspuffer PapilloCheck Puffer B elal E Substanzen Menge Guanidin thiocyanatl sung 25 60 CAS Nr 593 84 0 Natriumdo decylsulfat l sung lt 20 CAS Nr 151 21 3
22. cher Farbcodierung empfohlen Abbildung 3 Raumaufteilung Raum 1 In diesem Raum wird die komplette DNA Extraktion durchgef hrt Raum 2 In Raum 2 wird der Reaktionsmix f r die PCR hergestellt und aufgeteilt optimal ist die Verwendung einer PCR Hood Die Zugabe der in Raum 1 extrahierten DNA Proben muss in einem separaten Bereich in Raum 2 erfolgen Raum 3 Im dritten Laborraum werden die Hybridisierungsreaktion die Waschschritte und die Trocknung des Chips durchgef hrt Zudem befindet sich hier der CheckScanner in Verbindung mit der CheckReport Software f r die abschlie ende Analyse des PapilloCheck Tests WederEquipment Ausr stungnoch Verbrauchsmaterialien sollten zwischen den verschiedenen Laborr umen und bereichen ausgetauscht werden Daher ist die Bereitstellung von Ausr stungsgegenst nden und Verbrauchsmaterialien in jedem Laborraum unabdingbar und sollte bei der Ausstattung des Labors einkalkuliert werden PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 7 3 Warnhinweise und Vorsichtsma nahmen 7 3 1 Vermeidung von Kontaminationen Laborkittel m ssen bei allen Arbeitsschritten getragen werden dabei sind f r jeden Laborraum eigene Laborkittel erforderlich Handschuhe m ssen bei jedem Analyseschritt getragen und h ufig gewechselt werden vor allem w hrend der DNA Extraktion Der Arbeitsplatz muss mit einer geeigneten Reinigungsl sung dekontaminiert werden Ber hren Sie niemals di
23. d e Essen Trinken Rauchen und das Auftragen von Kosmetika sind in den Arbeitsbereichen untersagt e Vermeiden Sie den direkten Kontakt mit den biologischen Proben sowie ein Verspritzen oder Verspr hen der Proben e Tragen Sie bei der Arbeit mit humanen Proben stets einen Laborkittel Handschuhe und eine Schutzbrille e Waschen Sie Ihre H nde nach der Handhabung von Proben und Reagenzien gr ndlich PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 8 PAPILLOCHECK VERFAHREN Das folgende Kapitel enth lt eine ausf hrliche Beschreibung der verschiedenen Arbeitsschritte die zur Erstellung eines detaillierten Berichts f hren In diesem Bericht ist bersichtlich und f r jede analysierte Zervikalprobe angegeben ob darin einer oder mehrere der 24 nachweisbaren HPV Typen vorhanden ist sind und um welche n Typ en es sich dabei handelt Abbildung 4 zeigt eine bersicht ber die verschiedenen durchzuf hrenden Arbeitsschritte Au erdem ist angegeben in welchem Unterkapitel der jeweilige Schritt des Testprotokolls beschrieben wird Die Arbeitsschritte m ssen in der in diesem Kapitel aufgef hrten Reihenfolge durchgef hrt werden Jeder spezifische Arbeitsschritt ist mit einem blauen Pfeil un gekennzeichnet Die Probenentnahme die DNA Extraktion und die Analyse mit der CheckReport Software sind nicht Teil des PapilloCheck Testkits Daher ist die Beschreibung dieser Arbeitsschritte in diesem Kapitel abgek rzt A
24. de Code du lot C digo de lote Codice del lotto C digo do lote Lot nummer Lotnum mer Lot nummer Kod partii batch nr KW IK Trapridag Parti kodu Wichtiger Hinweis Important Note Note im portante Nota im portante Nota im portante Aviso im portante Belangri jke op merking Vigtig henvis ning Viktigt medde lande Wazne Viktig merknad ZnUOVTIKD UTT DEIEN nemli Not INHALTSVERZEICHNIS 1 r 13 20 218 DES RE 5 VERBRAUCHSMATERIALIEN UND EQUIPMENT 2 22 22022002n002n0nnnnnnnnnnnnnnnnn 6 VERSAND UND KENE ee egen eegen 8 le A EE US EE 8 GAEREN 9 EINERIE e ee ae 10 6 1 ZWECKDESCHNMIUN te EE 10 6 2 Mit PapilloCheck nachweisbare HVP Typen 2 0222220020022a000000nn0nn0nnnnnnnunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnannn 10 0 3 E dl Te SE 11 6 4 Design des PapilloCheck DNA Chips 2 20022220000000220nn0n00nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn anne 13 0 4 19 1Pap1loCheck Chip Ee EE 13 0 4 2 En e Eent e EE 14 ANLEITUNGEN F R DEN PAPILLOCHECK ARBEITSABLAUF ek 15 TA Allgemeine e Va EE 15 7 27 Raumauktellung EE 15 7 3 Warnhinweise und Vorsichtsma nahmen 22 4224 2a000nBnn0nn nn non nnnnn nn nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nun 16 2 3 1 ANERER Eet 16 1 32 Anleitung zur Handhabung der DNA ChNIPS Pr ar re ee 16 L33 Allgemeine Ee eeneg Ee Te BEE 16 123 4 ZSleWere Arbeitsweise tee en Se N 17 BPARI
25. durchgef hrt werden Beginnen Sie mit den erforderlichen Vorbereitungen f r die Hybridisierung und die Waschschritte sp testens 30 Minuten vor Beginn der Hybridisierung ug Lassen Sie die Hybridisierungs und Waschpuffer 30 Minuten bei Raumtemperatur 20 25 C stehen damit sich etwaige Niederschl ge l sen k nnen und mischen Sie sie vor Gebrauch gr ndlich Die Aufbewahrung des PapilloCheck Testkit bei 4 8 C kann dazu f hren dass das SDS im Hybridisierungspuffer und in Puffer B ausf llt Lassen Sie die L sungen Raumtemperatur annehmen und vortexen bzw sch tteln Sie anschlie end das Gef bzw die Flasche bis sich der Niederschlag vollst ndig gel st hat ug Bereiten Sie die oCheck Hybridisierungskammer vor Legen Sie ein frisches feuchtes Papiertuch in die Hybridisier amp ungskammer und schlie en Sie den Deckel damit eine mit Feuchtigkeit ges ttigte Atmosph re entsteht Die Hybridisierung muss in einer mit Feuchtigkeit ges ttigten Atmosph re stattfinden um eine Verdunstung des geringen Volumens auf dem Chip zu vermeiden Von Greiner Bio One ist eine spezielle Hybridisier amp ungskammer f r die PapilloCheck Analyse erh ltlich siehe Kapitel 2 ug Inkubieren Sie die erforderliche Anzahl an PapilloCheck Chips mindestens 10 Minuten lang bei Raumtemperatur 20 25 C in der vorbereiteten Hybridisierungskammer Der magnetische Objekttr gerhalter der Hybridisierungskammer enth lt nur auf einer Seite einen Magne
26. e Innenseite des Deckels des Reaktionsgef es ffnen Sie zur Vermeidung einer Kreuzkontamination jeweils nur ein Gef Es m ssen geeignete Filterspitzen mit Aerosolbarriere verwendet werden frei von DNase RNase und humaner DNA Die Pipettenspitzen sollten zwischen Fl ssigkeitstransfers stets gewechselt werden 7 3 2 Anleitung zur Handhabung der DNA Chips DNA Chips sollten in einer staubfreien Umgebung verwendet werden Die Ablagerung von Staub und anderen Partikeln auf der Chip Oberfl che ist zu vermeiden Die Hybridisierungszone auf der Chip Oberfl che darf nicht ber hrt werden F r die Hybridisierung ist nur die mit einem Barcode gekennzeichnete Seite des Chips bestimmt Beschriften Sie die DNA Chips nicht Markerstifte k nnen unspezifische Fluoreszenz auf dem Chip erzeugen Die DNA Arrays sind nur f r den Einmalgebrauch bestimmt Hybridisierte Chips k nnen nicht wiederverwendet werden Bewahren Sie unbenutzte Chips in der Originalkunststoffbox Slidebox auf Diese sollte im verschlossenen Folienbeutel mit Trockenmittel aufbewahrt werden 7 3 3 Allgemeine Vorsichtsma nahmen Dieses Kit ist nur zur In Vitro Diagnostik vorgesehen und sollte ausschlie lich von Personal verwendet werden das in den Laborpraktiken f r die In Vitro Diagnostik geschult wurde berpr fen Sie die Kitkomponenten bei Lieferung auf etwaige Besch digungen Sollte eine der Komponenten z B Pufferflaschen besch digt sein setzen Sie sich mit
27. elle 8 aufgef hrt Tabelle 8 Robustheit von PapilloCheck Parameter Bereich Hybridisierungstemperatur 20 25 C Hybridisierungsdauer 13 17 Minuten Waschtemperatur 48 52 C 1 Waschschritt 10 15 Sekunden 2 Waschschritt Waschdauer 60 75 Sekunden 3 Waschschritt 10 15 Sekunden 38 PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 11 5 Klinische Leistungsbewertung von PapilloCheck Zur klinischen Leistungsbewertung des PapilloCheck Tests mittels der Bestimmung der klinischen Sensitivit tund Spezifit twurde eine Vergleichsstudie mit PapilloCheck und dem GP5 6 PCREIA Test durchgef hrt In dieser Studie wurden Proben von 1 437 repr sentativen Frauen mit normaler Zytologie Kontrollgruppe im Alter ber 40 Jahren Durchschnittsalter 49 Jahre Altersbereich 40 bis 60 Jahre und von 192 repr sentativen Frauen Durchschnittsalter 34 Jahre Altersbereich 30 bis 60 Jahre mit histologisch best tigten CIN3 L sionen Fallgruppe analysiert Alle in dieser Studie verwendeten Proben stammten urspr nglich von Frauen in der Interventionsgruppe der populationsbasierten randomisierten kontrollierten Implementierungsstudie POBASCAM und wurden zu Beginn der Studie entnommen baseline round Nach Beschr nkung der PapilloCheck Analyse auf die 14 hrHPV Typen die mit dem GP5 6 PCR EIA erfasst werden zeigte PapilloCheck eine klinische Sensitivit t f r 2 CIN3 von 95 8 184 192 95 KI 92 8 98 8 und
28. en Thermocyclers GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 26 ul die Geschwindigkeit der Temperaturerh hung ramp speed auf 9600 und die Deckeltemperatur auf 103 C ein Veriti 96 Well Thermocycler Applied Biosystems Verwenden Sie das Hilfsprogramm zur Methodenkonvertierung Convert Method des Veriti 96 Well Thermocyclers um das PapilloCheck PCR Programm einzugeben und w hlen Sie den 9600 Emulation Mode Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 26 ul und die Deckeltemperatur auf 103 C ein PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 peqSTAR 96X Universal PEQLAB Biotechnologies GmbH Verwenden Sie das vorpgrogrammierte PapilloCheck R PCR Programm PapilloCheck js gemeinsam mit dem Thermocycler F r gew hnlich kann das Programm unter folgendem Pfad aufgerufen werden local Scripts GreinerBioOne PapilloCheck js 8 2 2 Behandlung mit Uracil N Glycosylase UNG Der PapilloCheck PCR MasterMix enth lt dUTP das w hrend der PapilloCheck PCR in die Amplifikationsprodukte eingebaut wird und so den Abbau der PCR Produkte durch UNG erm glicht UNG spaltet das PCR Produkt an den Stellen an denen ein Desoxyuridylat Rest eingebaut worden ist Gespaltene PCR Produkte werden anschlie end nicht mehr amplifiziert Eine UNG Behandlung kann daher zur Eliminierung einer Kontamination mit Amplifikaten aus vorherigen PCR Reaktionen verwendet werden P
29. enmaterial von unterschiedlichen Personen und in unterschiedlichen Laboren mit unterschiedlichem Equipment durchgef hrt Die Ergebnisse wurden als konkordant f r positive Proben klassifiziert wenn bei Einzel oder Zweifachinfektionen identische HPV Typen erkannt wurden oder wenn bei Mehrfachinfektionen mit drei oder vier Typen zwei bzw drei identische HPV Typen erkannt wurden Tabelle 7 Ergebnisse der berpr fung der Vergleichspr zision Proben Nr Ergebnis Labor 1 Ergebnis Labor 2 Konkordanz 1 HPV 33 HPV 33 2 HPV 35 HPV 35 3 negativ negativ 4 HPV 45 HPV 45 Es wurden mit allen klinischen Proben konkordante Ergebnisse erhalten Die in Labor 2 erfassten Signale zus tzlicher Typen in den mehrfach infizierten Proben 7 HPV 82 und 15 HPV 68 lagen nur knapp ber dem definierten Schwellenwert und diskordante Ergebnisse wurden als unproblematisch klassifiziert PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 11 4 Robustheit Zur Untersuchung der Robustheit des PapilloCheck Testsystems wurden Variationen der folgenden Parameter gepr ft e Hybridisierungstemperatur e Hybridisierungsdauer e Waschtemperatur e Waschdauer Alle Tests wurden in 3 Replikaten mit hohen Template Konzentrationen 1 ng HPV Referenzplasmid oder ca 200 x 10 Kopien je Probe durchgef hrt Die untersuchten Wertebereiche der Parameter in denen ein robuster Nachweis von HPV mit PapilloCheck m glich ist sind in Tab
30. estellinformationen finden Sie in Kapitel 2 Nach der Extraktion von viraler und menschlicher genomischer DNA aus einer zervikalen Probe wird ein 350 bp Fragment des viralen E1 Gens mittels Polymerasekettenreaktion PCR in Gegenwart eines Sets HPV spezifischer Primer amplifiziert In derselben Reaktion wird ein Fragment des menschlichen Single Copy Gens ADAT1 humane tRNA spezifische Adenosindeaminase1 amplifiziert um das Vorhandensein von menschlichem Probenmaterial in der zervikalen Probe zu berwachen Probenkontrolle Au erdem wird zur Kontrolle der PCR ein im PapilloCheck PCR MasterMix vorhandenes internes Kontroll Template amplifiziert PCR Kontrolle Der PapilloCheck PCR MasterMix enth lt zudem dUTP Mit einer Uracil N Glycosylase UNG Behandlung l sst sich so eine m gliche Kontamination mit PCR Produkten aus vorherigen PCR Reaktionen verhindern siehe Kapitel 8 2 2 Anschlie end werden die PCR Produkte an spezifische DNA Sonden und On Chip Kontrollen auf der PapilloCheck Chip Oberfl che hybridisiert Jeder Chip enth lt 12 DNA Microarrays sodass 12 zervikale Proben gleichzeitig analysiert werden k nnen W hrend der Hybridisierung wird die gebundene DNA fluoreszenzmarkiert und ungebundene DNA wird in anschlie enden Waschschritten entfernt Die Effizienz der Hybridisierung wird berwacht Hybridisierungskontrolle Abschlie end wird der PapilloCheck Chip automatisch mithilfe des CheckScanner gescannt und mit der Chec
31. etzt und in 3 Replikaten gemessen d h insgesamt 6 Replikate pro Konzentration Dar ber hinaus enthielt jeder Test 10 ng menschliche DNA Im Falle einer Variation der validierten Daten wurden die Konzentrationen des betreffenden Plasmids erh ht oder verringert und erneut getestet 6 Replikate aus 2 unabh ngigen Verd nnungsreihen Die Nachweisgrenze war die niedrigste Konzentration bei der alle 6 Replikate positiv waren Direkt analysiert ohne Ber cksichtigung der DNA Aufreinigung Die Mengenangabe bezieht sich auf die in dem Plasmid vorhandene HPV DNA 34 PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 11 1 2 Analytische Spezifit t HPV Typen Die Referenzplasmide f r die aufgef hrten HPV Typen wurden mit 2 12 x 10 Kopien PCR Reaktion getestet HPV 6b HPV 11 HPV 13 HPV 16 HPV 18 HPV 26 HPV 30 HPV 31 HPV 33 HPV 34 HPV 35 HPV 39 HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44 HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 54 HPV 55 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 61 HPV 66 HPV 67 HPV 68 HPV 69 HPV 70 HPV 71 HPV 73 HPV 74 HPV 81 HPV 82 HPV 84 HPV 85 HPV 91 Es wurden folgende Kreuzhybridisierungen festgestellt HPV 55 liefert ein Signal mit der HPV 44 Sonde Die CheckReport Software zeigt deshalb ein HPV 44 HPV 55 Kombinationsergebnis an HPV 13 kann mit der HPV 11 Sonde kreuzreagieren liefert aber kein falschpositives Signal da HPV 13 in zervikalen Proben nicht vorkommt 11 1 3 Analytische Spezifit
32. eutschland aufgenommen werden m ssen verd nnt werden hierf r zu 100 ul Probe 150 ul destilliertes Wasser geben Die 250 ul verd nnte Probe k nnen mit dem oCheck DNA Extraktionskit aufgereinigt werden Wenn die Probe eines zervikalen Abstrichs stark konzentriert und bereits aggregiert zu sein scheint muss die Probe im Allgemeinen vor Beginn der DNA Extraktion verd nnt und homogenisiert werden Proben von zervikalen Abstrichen die stark verd nnt sind und keine sichtbaren Zellen aufweisen sollten konzentriert werden um zur DNA Extraktion eine h here Zellausbeute zu erzielen Zentrifugieren Sie 1000 ul der Probe f r 5 Minuten bei 11 000 g und resuspendieren Sie das Pellet in 250 ul destillierttem Wasser Anschlie end k nnen die 250 ul mit dem oCheck DNA Extraktionskit aufgereinigt werden Dieser Konzentrationsschritt ist nur f r zervikale Abstrichproben geeignet die mit dem PapilloCheck Probenentnahmesset in PreservCyt Probenentnahmemedium oder in Surepath Probenentnahmemedium entnommen aufgenommen worden sind Wurde das STM Probenentnahmemedium verwendet ist eine Konzentration durch Zentrifugation nicht m glich 20 PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 8 2 Polymerasekettenreaktion PCR Bei der PCR handelt es sich um ein sehr empfindliches Verfahren mit dem sich u erst kleine DNA Mengen nachweisen lassen Zur Vermeidung einer Kontamination der Reaktion m ssen besondere V
33. heck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 Beginnen Sie mit den Vorbereitungen sp testens 30 Minuten vor Beginn der Hybridisierung Etwaige Niederschl ge in Hybridisierungs und Waschpuffern aufl sen und gut mischen Gen gend Waschl sung f r die Anzahl der zu analysierenden PapilloCheck Chips ansetzen Destilliertes oder BEE EE Wasser 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml PapilloCheck Puffer A Konz 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml PapilloCheck Puffer B Konz 1 75 ml 3 5 ml 5 25 ml 7 ml Gesamtvolumen 155 75 ml 311 50 ml 467 25 ml 623 ml Die Waschl sung in drei oCheck Waschbeh lter aliquotieren Waschl sung Il in einem Wasserbad auf 50 C aufw rmen Die zu analysierende Anzahl an PapilloCheck Chips bei Raumtemperatur in der vorbereiteten Hybridisierungskammer inkubieren Die PCR Produkte mischen und kurz zentrifugieren Hybridisierungspuffer mischen und kurz zentrifugieren 30 ul PapilloCheck Hybridisierungspuffer mit 5 ul PCR Produkt mischen Gr ndlich mischen und kurz zentrifugieren Mit einer Multikanalpipette in jedes Well des PapilloCheck Chips 25 ul des Hybridisierungsgemisches berf hren Bildung von Luftbl schen vermeiden Den PapilloCheck Chip exakt 15 Minuten bei Raumtemperatur 20 25 C inkubieren Fe Den magnetischen Objekttr gerhalter aus der Hybridisierungskammer heben
34. i sung lesen Consult Instruc tions For Use Lire les in structions avant utilisation Antes de usar lea las instruccio nes Leggere le istruzi oni prima dell uso Antes de usar leia as inst ruc es Gebruik saanwij zing lezen L s brugsan visningen L s bruk sanvisnin gen f re anv nd ning Przed u yciem przeczyta instrukcj Les bruksan visning f r bruk TTPIV TNV xpnon Sla oTe TIG o nyleg Kullanma dan nce talimat okuyun PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 Katalog nummer Catalog Number Numero de r f rence Numero de cat lo go Numero catalogo N mero de cat lo go Catalo gusnum mer Katalog nummer Katalog nummer Numer katalo gowy katalog nummer Ap i u KataA you Katalog numaras Hersteller Manufac turer Fabricant Fabri cante Produt tore Fabri cante Fabrikant Producent Tillverkare Producent produsent Mapaywy g retici firma In Vitro Diagnos tika Medi zinprodukt In Vitro Dianostic Medical Device Produit m di cal de diagnostic in vitro Producto medicinal de diagn sti co in vitro Dispositivo medico diagnosti co in vitro Producto medicinal de diagn sti ca in vitro In vitro diag nostisch medisch product In vitro meskdicin doag nose apparat In vi
35. idisierungs Orientierungs und Druckkontrolle Probenkontrolle PapilloCheck berwacht die Qualit t der Proben und oder der DNA Extraktion durch Amplifikation des menschlichen Single Copy Gens ADAT1 humane tRNA spezifische Adenosindeaminase Wenn in der extrahierten DNA aus der zervikalen Probe eine ausreichende Menge an menschlicher DNA vorhanden ist wird auf den Spots der Probenkontrolle ein Fluoreszenzsignal erzeugt Wenn keine oder eine unzureichende ADAT1 Amplifikation stattfindet gibt die CheckReport Software die Probenkontrolle als failed fehlgeschlagen an und die Analyse muss wiederholt werden weil entweder zu wenig Zellen in der Zervikalprobe vorhanden sind und oder die Extraktionsqualit t ungen gend ist siehe Kapitel 9 PCR Kontrolle PapilloCheck berwacht auch die Qualit t der PCR Reaktion Bei Amplifikation eines im PapilloCheck PCR MasterMix vorhandenen internen Kontroll Template wird auf den Spots der PCR Kontrolle auf dem PapilloCheck Chip ein Signal erzeugt Die Qualit t der Amplifikationsreaktion wird von der CheckReport Software automatisch berwacht Wenn die PCR Qualit t einen vordefinierten Schwellenwert unterschreitet gibt die CheckReport Software die PCR Kontrolle als failed fehlgeschlagen an und die Analyse muss wiederholt werden siehe Kapitel 9 Auch wenn in der Probe sehr viel HPV DNA vorhanden ist kann das Fluoreszenzsignal der PCR Kontrolle sehr schwach sein ode
36. ie beim Pipettieren vorsichtig vor damit keine Luftbl schen entstehen Der zweite Waschschritt muss bei 50 C durchgef hrt werden Vergewissern Sie sich dass die Waschl sung Il 50 C warm ist Der zweite Waschschritt muss bei 50 C durchgef hrt werden berpr fen Sie die Temperatur des Wasserbads Vergewissern Sie sich dass das Wasserbad auf eine Temperatur von 50 C eingestellt ist berpr fen Sie notfalls die Temperatur mit einem Thermometer Setzen Sie das Hybridisierungsgemisch noch einmal mit den korrekten Volumina an und hybridisieren Sie die PCR Produkte auf einem anderen Chip 32 PROBLEM und Ursache PCR KONTROLLE FEHLGE SCHLAGEN Keine Zugabe von HotStarTaq DNA Polymerase zum MasterMix Zugabe defekter HotStarTaq DNA Polymerase zum MasterMix Zugabe unverd nnter Uracil N Glycosylase zum MasterMix Unzureichendes Mischen des Reaktionsgemisches Vorhandensein von PCR Inhibitoren in der Probe Durchf hrung der Hybridisierung ohne Zugabe von PCR Produkt Unzureichendes Mischen des Hybridisierungsgemisches Probleme mit dem Thermocycler PROBENKONTROLLE FEHLGESCHLAGEN Keine Zugabe von Proben DNA zu der PCR Reaktion DNA Aufreinigung fehlgeschlagen Nicht gen gend Probenmaterial vorhanden PCR UND ODER PROBENKONTROLLE IST NICHT FEHLGESCHLAGEN ES WIRD ABER EIN SNR WERT VON 0 ANGEZEIGT Anmerkungen und Vorschl ge Wiederholen Sie die PapilloCheck Analyse ab dem Schritt
37. illoCheck Chips b und c Von der CheckReport Software angezeigte Bilder bei den beiden beim Scannen verwendeten unterschiedlichen Anregungswellenl ngen b roter Kanal 635 nm c gr ner Kanal 532 nm und Layout Schema des PapilloCheck Mikroarrays Es sind HPV Typen spezifische Sonden und On Chip Kontrollen dargestellt PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 6 4 2 _ On Chip Kontrollen Das Design des PapilloCheck DNA Chips umfasst zahlreiche On Chip Kontrollen Mehrere Kontrollsysteme berwachen alle kritischen Schritte des Tests und der Chip Verarbeitung einschlie lich der Probenqualit t und der DNA Extraktion Probenkontrolle der Qualit t der PCR Reaktion PCR Kontrolle der Effizienz der Hybridisierung Hybridisierungskontrolle sowie der Spot Homogenit t der aufgetragenen Sonden und der Druckqualit t Orientierungskontrolle und Druckkontrolle Die CheckReport Software zeigt nicht nur das Vorhandensein bzw Nichtvorhandensein von HPV Typen an sondern fasst auch automatisch die entsprechenden Werte der Kontrollen in einem ausf hrlichen Bericht zusammen Zum Auslesen der verschiedenen Kontrollen werden beide Anregungswellenl ngen des CheckScanner verwendet Der rote Kanal Anregungswellenl nge 635 nm dient der Kontrolle der Qualit t der Analyse Proben und PCR Kontrolle der gr ne Kanal Anregungswellenl nge 532 nm der Kontrolle der Qualit t der Hybridisierung und des Chips Hybr
38. k Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 12 PAPILLOCHECK KURZPROTOKOLL 12 1 Raum 2 PCR Ansatz des Reaktionsgemisches m Uracil N Glycosylase 1 200 in PCR Wasser verd nnen m UNG Verd nnung sorgf ltig mischen m Das Reaktionsgemisch f r die erforderliche Anzahl an PCR Reaktionen ansetzen 1 13 26 39 52 Reaktion Reaktionen Reaktionen Reaktionen Reaktionen 1 Chip 2 Chips 3 Chips 4 Chips PapilloCheck PCR MasterMix 19 801 257 4ul 514 841 772241 1029 6 ul HotStarTaq Polymerase 0 2 ul 2 6 ul 5 2 ul 78 ul 10 4 ul 5 U ul Uracil N Glycosylase 1 200 verd nnt 0 005 U ul 1 u 13ul 26 yl 39 ul 52 ul Gesamtvolumen vor Zugabe von 21 ul 273 ul 546 ul 819 ul 1092 ul Proben DNA m Das Reaktionsgemisch sorgf ltig mischen m Das Reaktionsgemisch aliquotieren F r jede PCR Reaktion 21 ul des Reaktionsgemisches in ein 0 2 ml PCR Reaktionsgef eines PCR Streifens geben PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 K U R 74 P R A T O K A L L 12 2 Raum 2 PCR Zugabe von DNA Template PCR Reaktion m In jede PCR Reaktion 5 ul DNA Template zugeben m Gr ndlich mischen m Die PCR Reaktion mit dem vorbereiteten Thermocycler Programm starten Anzahl der Zyklen 1 1 30 s 45s Halten Hold K U R Z p R A T O K A L L PapilloC
39. k Plugin 862 081 oCheck Hybridisierungskammer mit Objekttr gerhalter 447 070 Computer f r CheckScanner und CheckReport Software a Griff f r Objekttr gerhalter 447 001 oCheck Waschbeh lter 447 020 Ben tigte Enzyme e Taq Polymerase HotStarTaq DNA Polymerase 5 U ul Qiagen 203203 203205 203207 203209 e Uracil N Glycosylase Uracil DNA Glycosylase 1 U ul Fermentas EN0361 EN0362 Zus tzliche Verbrauchsmaterialien e PCR Wasser e Destilliertes oder entionisiertes Wasser e Einmalhandschuhe Zus tzliches Equipment e Tischzentrifuge f r 1 5 und 2 ml Reaktionsgef e e Zentrifuge f r 50 ml Polypropylengef e z B BeckmanCoulter Zentrifuge Allegra X 22 Festwinkelrotor C0650 oder Objekttr gerzentrifuge z B Labnet Slide Spinner VWR International Galaxy MiniArray Zentrifuge e Tischzentrifuge f r einzelne 0 2 ml Reaktionsgef e oder PCR Ber Streifen z B Labnet Spectrafuge Minizentrifuge e PCR Thermocycler GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems Vert TV 96 Well Thermocycler Applied Biosystems peqSTAR 96X Universal PEQLAB Biotechnology GmbH e Wasserbad 50 C e Mikropipetten verschiedene Volumenbereiche von 1 1000 ul e 8 Kanal Multipipette Volumenbereich 5 50 ul z B Brand Transferpette 8 Brand e Pipettor f r Glas und Kunststoffpipetten e Vortex Mixer e St nder f r verschiedene Reaktionsgef e Zus tzliches Equipment e Computer hinsichtli
40. kReport Software analysiert und ausgewertet Bestellinformationen finden Sie in Kapitel 2 Der CheckScanner ist ein Zweifarben Laserscanner Anregungswellenl ngen 532 und 635 nm mit dem die von den vorhandenen HPV spezifischen Amplifikationsprodukten und den Kontrollen erzeugten Fluoreszenzsignale erfasst werden k nnen siehe Kapitel 6 4 2 Die CheckReport Software erm glicht die Visualisierung Analyse und Auswertung der Ergebnisse und fasst die Werte der erfassten HPV Typen und der Kontrollen automatisch in einem Bericht zusammen Der Bericht enth lt bersichtliche Angaben dar ber ob einer oder mehrere der 24 nachweisbaren HPV Typen vorhanden sind und um welche n Typ en es sich dabei handelt Dank der umfassenden On Chip Kontrollen ist die Analyse dar ber hinaus in h chstem Ma e zuverl ssig PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 1 PCR Reaktion III III TE gt LU 2 Hybridisierung 3 Waschen und Trocknen IDDIE Abbildung 1 PapilloCheck Testprotokoll 1 PCR Reaktion Nach der DNA Extraktion werden ein 350 bp Fragment des viralen E1 Gens und Fragmente der beiden Kontroll Targets mittels PCR amplifiziert Die Amplifikationsprodukte werden anschlie end an komplement re DNA Sonden auf dem Chip hypbridisiert 2 Hybridisierung Jeder HPV Typ wird von einer spezifischen in f nf Replikaten vorhandenen DNA Sonde erfasst W hrend der Hybridisierung wird die gebundene DNA f
41. luoreszenzmarkiert 3 Waschen und Trocknen Ungebundene DNA wird anschlie end durch mehrmaliges Waschen entfernt 4 Scannen und Auswertung Der PapilloCheck Chip wird mit dem CheckScanner und der CheckReport Software gescannt analysiert und ausgewertet Es wird ein Bericht mit bersichtlichen Angaben dar ber erstellt ob einer oder mehrere der 24 nachweisbaren HPV Typen vorhanden sind und um welche n Typ en es sich dabei handelt PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 6 4 Design des PapilloCheck DNA Chips 6 4 1 PapilloCheck Chip Layout Jeder PapilloCheck Chip enth lt 12 Microarrays mit der Bezeichnung Well A1 B6 Jeder PapilloCheck Mikroarray enth lt 28 verschiedene Sonden und ist von einem erh hten Rand umgeben Jede Sonde wird in f nf Replikaten aufgetragen Spots Das Layout des PapilloCheck Mikroarray ist in Abbildung 2 gezeigt und die On Chip Kontrollen sind in Kapitel 6 4 2 n her erl utert OOCOOO000000 ejejejeiejeiejeieie ejejejeiejejejeieie LIL I 1010101010 ejejeje e e ejeieie ejejeje ejeiejeieie ejejejeiejeiejeieie ejejeje e e ejeieie ejejeje ejeiejeieie ejejejeieje ejeieie ejejejeie e ejeieie REES TIIT OTIIIIYIIT Sleleieieieieieieie Sieleieieieieieieie TIIIIYIIT TIIIIIIIY OO0O0000000 6 6 0 0 6 0 016 8 HPV 42 OO0O0000000 0000000000 roter Kanal 635 nm gr ner Kanal 532 nm Abbildung 2 Aufbau des PapilloCheck Chips a Schema des Pap
42. m Fall aufgrund einer Kompetition w hrend der PCR ein nur schwaches oder gar kein Fluoreszenzsignal liefern 10 TECHNISCHER SUPPORT Im Kundendienst von Greiner Bio One stehen Ihnen erfahrene Wissenschaftler mit umfassendem theoretischem und praktischem Fachwissen auf dem Gebiet der Molekularbiologie und der oCheck Produkte zur Verf gung Wenn Sie Fragen zu oder Probleme mit oCheck Produkten haben wenden Sie sich bitte an Ihren Greiner Bio One Vertriebsh ndler vor Ort 33 PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 11 LEISTUNGSMERKMALE VON PAPILLOCHECK 11 1 Analytische Leistungsbewertung von PapilloCheck 11 1 1 Analytische Sensitivit t Die Nachweisgrenze wurde mithilfe von Referenzplasmiden welche die von PapilloCheck verwendetet E1 Zielregion enthielten f r jeden nachweisbaren HPV Typ ermittelt Die Nachweisgrenzen sind in Tabelle 5 aufgef hrt Tabelle 5 Nachweisgrenzen der nachweisbaren HPV Typen Kopien AST Reaktion pg mi HPV 6 30 0 052 HPV 11 150 0 26 HPV 16 50 0 086 HPV 18 300 0 516 HPV 31 300 0 522 HPV 33 300 0 519 HPV 35 750 1 29 HPV 39 90 0 052 HPV 40 30 0 052 HPV 42 30 0 052 HPV 52 100 0 174 HPV 58 150 0 255 HPV 43 100 0 175 HPV 59 50 0 087 HPV 66 100 0 171 HPV 68 30 0 052 HPV 70 30 0 052 HPV 73 200 0 338 HPV 82 30 0 052 Jede Konzentration eines HPV Referenzplasmids wurde in 2 unabh ngigen Verd nnungsreihen anges
43. m Verd nnen Sie die Uracil N Glycosylase 1 200 in PCR Wasser Verwenden Sie f r jeden PapilloCheck PCR Reaktionsansatz eine frische UNG Verd nnung siehe Kapitel 8 2 3 Die verd nnte UNG darf nicht wiederverwendet werden m Mischen Sie die UNG Verd nnung sorgf ltig indem Sie sie entweder 2 Sekunden vortexen und anschlie end zentrifugieren oder mehrmals auf und ab pipettieren Die Ausgangskonzentration der Uracil N Glycosylase betr gt 1 U ul Die Konzentration nach Verd nnung betr gt demnach 0 005 U ul Das PapilloCheck Testkit wurde mit der Uracil N Glycosylase von Fermentas validiert siehe Kapitel 2 Die Verwendung dieses Enzyms ist eine Voraussetzung daf r die angegebenen Leistungsparameter zu erf llen mg Geben Sie 1 pl dieser Verd nnung zu jeder PapilloCheck PCR Reaktion siehe Kapitel 8 2 3 Tabelle 3 Diese Menge ist ausreichend um eine Kontamination der PCR zu eliminieren Achten Sie darauf keine h her konzentrierte UNG L sung zu verwenden da sich dies negativ auf die PCR Effizienz auswirken k nnte und so die Empfindlichkeit des PapilloCheck reduziert wird Das PCR Reaktionsgemisch wird f r die UNG Behandlung 20 Minuten bei 37 C inkubiert Anschlie end wird die UNG in einem weiteren 15 min tigen Inkubationsschritt bei 95 C inaktiviert Diese beiden Schritte sind bei der PapilloCheck PCR bereits ber cksichtigt und entsprechen den ersten beiden Schritten des Thermocycler Programms siehe Tabelle
44. n Inkubieren Sie den Chip in der mit Feuchtigkeit ges ttigten Atmosph re der vorbereiteten Hybridisier amp ungskammer exakt 15 Minuten bei Raumtemperatur 20 25 C im Dunkeln Achten Sie darauf die Hybridisierungskammer w hrend der Hybridisierung nicht zu bewegen ndern Sie keinesfalls Inkubationsdauer oder Temperatur der Hybridisierungsreaktion da dies entweder zu einem Verlust der Intensit t des Fluoreszenzsignals oder zu einem Anstieg unspezifischer Fluoreszenzsignale f hren k nnte Setzen Sie die hybridisierten Chips nicht direkt dem Sonnenlicht aus PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 m Bereiten Sie in der Hybridisierungskammer eine mit Feuchtigkeit ges ttigte Atmosph re vor m Inkubieren Sie die erforderliche Anzahl an PapilloCheck Chips bei Raumtemperatur 20 25 C in der Hybridisierungskammer siehe Kapitel 8 3 1 m Mischen Sie 30 ul PapilloCheck Hybridisierungspuffer in einem 0 2 ml Reaktionsgef eines PCR Streifens mit Du PCR Produkt Gr ndlich mischen m berf hren Sie mit einer Multikanalpipette in jedes Well des PapilloCheck Chips 25 pl des Hybridisierungsgemisches m Schlie en Sie die Hybridisierungskammer und inkubieren Sie den PapilloCheck Chip exakt 15 Minuten bei Raumtemperatur 20 25 C Abbildung 5 Arbeitsschritte bei der Hybridisierung PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 28 8 3
45. nen Kapitel 8 4 Scannen amp Auswertung Abbildung 4 bersicht ber die verschiedenen PapilloCheck Arbeitsschritte PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 8 1 2 DNA Extraktion Die DNA Extraktion ist nicht Teil des PapilloCheck Testkits Die Extraktion von DNA vor der PapilloCheck Analyse muss mit dem oCheck DNA Extraktionskit durchgef hrt werden das ebenfalls von Greiner Bio One erh ltlich ist Bestellinformationen finden Sie in Kapitel 2 Bitte halten Sie sich beim Gebrauch des oCheck DNA Extraktionskits genau an die Gebrauchsanweisung F r die DNA Extraktion mit dem oCheck DNA Extraktionskit werden 250 ul Probenl sung ben tigt Proben von humanen zervikalen Abstrichen die mit dem e PapilloCheck Probenentnahmeset Greiner Bio One kat Nr 465 070 e in PreservCyt Probenentnahmemedium Hologic Bedford MA USA entnommen bzw aufgenommen werden k nnen direkt verarbeitet werden Proben von zervikalen Abstrichen die in dem e Surepath Probenentnahmemedium BD Franklin Lakes NJ USA aufgenommen werden m ssen vor Gebrauch gewaschen werden Zentrifugieren Sie 250 ul der Probe f r 5 Minuten bei 11 000 g und resuspendieren Sie das Pellet in 250 ul destilliertem Wasser Anschlie end k nnen diese 250 ul mit dem oCheck DNA Extraktionskit aufgereinigt werden Proben von zervikalen Abstrichen die in dem e STM Probenentnahmemedium Qiagen Hilden D
46. nen Sie durch Zentrifugieren sofort s mtliche Fl ssigkeit von der Oberfl che der PapilloCheck Chips 3 Minuten 1 Minute 500 g max Geschw Abbildung 6 Arbeitsschritte beim Waschen Die verschiedenen Wasch und Trocknungsschritte vor der Analyse des PapilloCheck Chips mit dem CheckScanner und der CheckReport Software 30 PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 8 4 Scannen und Auswertung des PapilloCheck Chips Legen Sie den die PapilloCheck Chip s in den CheckScanner und fahren Sie mit dem Scannen fort wie es ausf hrlich im Benutzerhandbuch der CheckReport Software beschrieben ist Ausf hrlichere Informationen zur Installation des CheckScanner und der CheckReport Software sowie zu den Anforderungen an das Computersystem finden Sie in der entsprechenden Gebrauchsanweisung des CheckScanner und der CheckReport Software Bei jeder Datenanalyse mit der CheckReport Software muss sichergestellt werden dass die auf Ihrem Computer installierte Version der CheckReport Software mit der auf dem aktuell verwendeten PapilloCheck Kit angegebenen Version bereinstimmt Ist dies nicht der Fall muss die CheckReport Software aktualisiert werden Die neueste Software Version kann von der Greiner Bio One Website heruntergeladen werden www gbo com bioscience biochips_download PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 31 9 FEHLERBEHEBUNG Gehen Sie v
47. nnnnnnnnnnnnnnn 41 12 2 Raum 2 PCR Zugabe von DNA Template PCR Reaktion uuu2ur200 n00nnnnnnnnnnnnenn nen 42 12 3 Raum 3 Hybridisierung Vorbereitung Hybridisierungsreaktion uuurs0 n00nn0n0nennnnen 43 12 4 Raum 3 Waschen amp Trocknen Scannen amp Auswertung uuusss nu0nnnnnnnnnannnnnannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnen AA PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 1 INHALT DES KITS PapilloCheck Testkit Inhalt Menge 5 x PapilloCheck PCR MasterMix 1 x PapilloCheck Slidebox mit 5 PapilloCheck Chips 2 x PapilloCheck Hybridisation Buffer PCR MasterMix 5 x 300 ul Slidebox 5 x 12 Arrays 5 x 12 Arrays Hybridisierungspuffer 2 x 1 000 ul Puffer A Konzentrat 2 x PapilloCheck BUF A conc 2x40 ml Puffer B Konzentrat 1 x PapilloCheck BUF B conc 1x15ml 1 Ein PapilloCheck Testkit ist ausreichend f r die Analyse von 60 Proben 2 Enth lt alle f r die PCR ben tigten Komponenten au er der Taq DNA Polymerase und der Uracil N Glycosylase 3 Ein PapilloCheck Chip enth lt 12 PapilloCheck Microarrays PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 2 VERBRAUCHSMATERIALIEN UND EQUIPMENT PapilloCheck sollte nur zusammen mit dem aufgef hrten Verbrauchsmaterial und Equipment und nur von Fachpersonal angewendet werden Verbrauchsmaterialien Greiner Bio One Kat Nr Menge PapilloCheck Testkit PapilloCheck Probenen
48. or wie im Folgenden beschrieben wenn w hrend des Scannens des Chips eine oder mehrere der folgenden Fehlermeldungen angezeigt wird werden oder wenn die PapilloCheck Analyse aufgrund bestimmter Kontrollen auf dem Chip fehlschl gt Wenn Sie Fragen zu oder Probleme mit PapilloCheck Produkten haben wenden Sie sich bitte an Ihren Greiner Bio One Vertriebsh ndler vor Ort PROBLEM und Ursache FEHLERMELDUNG COULD NOT READ BARCODE BARCODE KONNTE NICHT GELESEN WERDEN Besch digter Barcode Falsch geladener Chip FEHLERMELDUNG MISSING SPOTS FEHLENDE SPOTS DRUCKONTROLLE FEHLGESCHLAGEN ODER ORIENTIERUNGSKONTROLLE FEHLGESCHLAGEN Staub auf dem Chip Bildung von Luftbl schen w hrend des berf hrens des Hybridisierungsgemisches auf den Chip HYBRIDISIERUNGSKONTROLLE FEHLGESCHLAGEN Falsche Temperierung der Waschl sung Il Falsche Temperierung des Wasserbads Falsches Ansetzen des Hybridisierungsgemisches PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 Anmerkungen und Vorschl ge berpr fen Sie den Barcode auf Besch digungen Geben Sie den Barcode manuell ein wenn das entsprechende Fenster ge ffnet wird berpr fen Sie die Ausrichtung des Chips und scannen Sie den Chip in der korrekten Ausrichtung Wiederholen Sie die Hybridisierung des der PCR Produkt e auf einem anderen Chip Wiederholen Sie die Hybridisierung des der PCR Produkt e auf einem anderen Chip Gehen S
49. orsichtsmaflsnahmen getroffen werden siehe Kapitel 7 Die f r die PCR erforderlichen Enzyme HotStarTaq Polymerase und Uracil N Glycosylase sind im PapilloCheck Testkit nicht enthalten und m ssen separat erworben werden siehe Kapitel 2 Das PapilloCheck Testkit wurde mit der HotStarTaq Polymerase von Qiagen und der Uracil N Glycosylase von Fermentas validiert Bestellinformationen in Kapitel 2 Die Verwendung dieser Enzyme ist eine Voraussetzung daf r die angegebenen Leistungsparameter zu erf llen 8 2 1 Einstellen des Thermocyclers Das PapilloCheck Testkit ist mit den folgenden Thermocyclern validiert worden e GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems e Veriti 96 Well Thermocycler Applied Biosystems e peqSTAR 96X Universal PEQLAB Biotechnologies GmbH Es muss unbedingt einer der vorstehend genannten Thermocycler verwendet werden um die angegebenen Leistungsparameter zu erf llen Das Thermocycler Programm f r die PapilloCheck PCR ist in Tabelle 2 dargestellt Tabelle 2 Thermocycler Programm f r die PapilloCheck PCR Zeit Temp C Anzahl der Zyklen 20 min 37 C 1 15 min 95 C 1 30 s 95 C 258S 55 C 40 45s 12 30 s 95 C 45 8 72 C Halten Hold 10 C Zus tzlich m ssen bei jedem Thermocycler die folgenden Reaktionsparameter eingestellt werden Eine Beschreibung der Vorgehensweise zum Einstellen dieser Parameter finden Sie in der Gebrauchsanweisung des jeweilig
50. r sogar ganz fehlen weil es w hrend der PCR Reaktion zu einer Kompetition kommt In diesem Fall muss das Fluoreszenzsignal mindestens einer HPV spezifischen Sonde einen vordefinierten Schwellenwert berschreiten damit der Test g ltig ist Hybridisierungskontrolle PapilloCheck berwacht die Effizienz der Hybridisierung mithilfe einer fluoreszenzmarkierten Sonde im PapilloCheck Hybridisierungspuffer die an spezifische DNA Sequenzen auf dem PapilloCheck Chip hybridisiert Bei einer ausreichenden Hybridisierungseffizienz wird auf jedem Spot ein Fluoreszenzsignal erzeugt Die Ergebnisse der f nf Hybridisierungskontrollspots auf dem PapilloCheck Chip werden ebenfalls von der CheckReport Software ausgewertet Orientierungs und Druckkontrolle Die Spots mit der Orientierungskontrolle auf dem PapilloCheck Chip erzeugen Fluoreszenzsignale unabh ngig von der Effizienz des Hybridisierungsvorgangs Diese Spots dienen der CheckReport Software als Richtpunkte f r das pr zise Auffinden der Spots einer Voraussetzung f r die korrekte Analyse der Signale Dar ber hinaus wird die Qualit t des Druckvorgangs durch Vorhandensein eines Fluoreszenzsignals an jedem Spot Druckkontrolle berwacht PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 7 ANLEITUNGEN F R DEN PAPILLOCHECK ARBEITSABLAUF 7 1 Allgemeine Hinweise Bei der Etablierung von modernsten molekularbiologischen Methoden m ssen folgende Hinweise genau
51. sie vor dem Mischen zun chst auftauen bevor Sie wie beschrieben fortfahren k nnen m ortexen Sie den Hybridisierungspuffer vor der Verwendung und zentrifugieren Sie ihn kurz ug Mischen Sie 30 ul des PapilloCheck Hybridisierungspuffers in einem frischen Reaktionsgef eines PCR 8er Streifens mit 5 ul PCR Produkt indem Sie entweder kurz vortexen oder den Ansatz mehrmals auf und ab pipettieren ug Zentrifugieren Sie den Ansatz kurz ug berf hren Sie in jedes Chip Well 25 ul des Hybridisierungsgemisches und verwenden Sie dazu 6 Kan le einer Multikanalpipette Achten Sie darauf dass keine Luftbl schen entstehen Es empfiehlt sich jeweils 6 Proben parallel mit einer 8 Kanal Multipipette zu pipettieren siehe Abbildung 5 Dadurch erh hen sich Effizienz und Geschwindigkeit des Arbeitsschrittes und das Verdunstungsrisiko wird reduziert Werden mehrere Objekttr ger gleichzeitig pipettiert ist der Gebrauch einer Multikanalpipette obligatorisch um die korrekte Hybridisierungsdauer einzuhalten Es sollten m glichst alle 12 Wells eines Chips hybridisiert werden Falls weniger als 12 Proben analysiert werden sollen lassen Sie die unbenutzten Wells leer Unbenutzte Wells auf einem gebrauchten Chip k nnen nicht f r k nftige Proben verwendet werden Behandeln Sie den Chip umsichtig um ein Versch tten des Hybridisierungsgemisches zu vermeiden Versch tten kann zu Kreuzkontamination der Proben und zu falschpositiven Ergebnissen f hre
52. ten Wenn weniger als vier PapilloCheck Chips parallel hybridisiert werden sollen m ssen Sie darauf achten den Objekttr gerhalter von der dem Magneten gegen ber liegenden Seite aus mit PapilloCheck Chips zu best cken Andernfalls sind die PapilloCheck Chips w hrend der Waschschritte nicht mit Fl ssigkeit bedeckt m Setzen Sie die Waschl sungen II und Ill nach der folgenden Anleitung an Ansetzen der Waschl sungen Il und Ill ug Bereiten Sie so viel Waschl sung f r die Waschl sungen II und Ill vor wie Sie f r die zu analysierende Anzahl an PapilloCheck Chips ben tigen siehe Tabelle 4 ug Aliquotieren Sie drei gleiche Volumina der Waschl sung in drei separate oCheck Waschbeh lter und beschriften Sie diese als Waschl sung l II und Ill Jeder oCheck Waschbeh lter ist mit einer eingravierten Skala versehen welche die korrekte Menge an Waschl sung f r bis zu 4 Chips anzeigt Bitte verwenden Sie diese Skala zur berpr fung des Waschl sungsvolumens m W rmen Sie Waschl sung Il vor dem Gebrauch mindestens 20 Minuten bei 50 C in einem temperaturgeregelten Wasserbad vor Achten Sie darauf dass der F llstand des Wasserbads dem F llstand der Waschl sung II entspricht PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 Tabelle 4 Herstellung der Waschl sung Die in dieser Tabelle angegebenen Volumen sind ausreichend f r alle drei Waschschritte Waschl sung II und Ill und f
53. tnahmeset oCheck DNA Extraktionskit Einzels ulenaufreinigung Sterile DNase freie Mikropipettor Filterspitzen 0 5 10 ul Filterspitzen 0 5 20 ul Filterspitzen 10 100 ul Filterspitzen 10 200 ul Filterspitzen 100 1000 ul Filterspitzen DNase freie Reaktionsgef e 1 5 ml Reaktionsgef e 0 2 ml Reaktionsgef e 8x 0 2 ml PCR Streifen Deckelketten f r 8 x 0 2 ml PCR Streifen 50 ml Polypropylengef e Kunststoffpipetten f r Pipettor 465 060 465 075 515 040 165 288 17174 288 1712 288 139 288 750 288 616 201 683 201 673 210 373 270 210 261 Testkit f r 60 Reaktionen 50 Proben Testkit f r 50 Aufreinigungen 96 960 96 960 96 960 96 960 60 600 500 4000 500 1000 125 1250 125 1250 25 450 10 ml Pipette 607 180 oder 607 160 25 ml Pipette 760 180 oder 760 160 50 ml Pipette 786 180 oder 768 160 1 Einige der genannten Spitzengr en sind optional je nachdem welche Mikropipetten zur Verf gung stehen 2 Prinzipiell wird die Verwendung von PCR 8er Streifen empfohlen Wenn keine PCR Streifen zur Verf gung stehen k nnen auch Einzelreaktionsgef e 0 2 ml verwendet werden 3 Nur erforderlich wenn keine Objekttr gerzentrifuge zur Verf gung steht PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 Equipment Greiner Bio One Kat Nr Menge CheckScanner 862 070 1 CheckReport Software Basisversion 862 080 CheckReport Software PapilloChec
54. tro medicinsk doag nostisk apparatur Diag nostyka in vitro Produkt yw in vitro di agnostisk medisinsk utstyr In vitro IAYVWOTIK IATpIK TTPOIOVTA In vitro diagnostik t bbi tan r n Tempera turbegren zung Tempe rature limitation Limite de temp ra ture Limitaci n de tempera tura Limitazio ne tempe ratura Limita o de tempera tura Tempera tuurbeper king Tempera turbegra ens r Tempe ratur be gr nsning Ograni czenie tempera tury tempe raturbe grensning TTEPIOPIOU G BepuoKkpao lag S cakl k s n rlamas Inhalt ausrei chend f r lt n gt Tests contains sufficient for lt n gt tests Contenu suffisant pour lt n gt tests Contenido suficiente para lt n gt ensayos Contenuto sufficiente per test lt n gt Conte do suficiente para lt n gt ensaios Voldoen de inhoud voor lt n gt tests Indehol der nok til lt n gt test Inneh llet r cker till lt n gt tester Zawarto wystarcza na lt n gt test w Innhold tilstrekke lig for lt n gt tester lepiex uevo apOKET y q lt n gt TEOT eri i lt n gt test i in yeter lidir LE Reizend Irritant irritant Irritante Irritante irritante Irriterend Lokalirri terende irriterande dra ni cy irriterende EPEBIOTIK Tahris edici Chargen bezeich nung Batch co
55. us asaccharolyticus Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus micros Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia Prevotella nigrescens Proteus hauseri Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Serratia marcescens Staphylococcus aureus ssp aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus saprophyticus Stenotrophomonas maltophilia Streptococcus agalactiae Streptococcus constellatus Streptococcus criceti Streptococcus cristatus Streptococcus gordonii Streptococcus intermedius Streptococcus mitis Streptococcus mutans Streptococcus oralis Streptococcus parasanguinis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarius Streptococcus sanguinis Streptococcus sobrinus Tannerella forsythensis vormals Bacteroides forsythus Treponema denticola Ureaplasma uralyticum Veillonella parvula 35 PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 11 2 Wiederholpr zision Zur berpr fung der Wiederholpr zision des Tests wurden f nf Proben die jeweils drei verschiedene HPV Referenz Templates sowie DNA aus dem menschlichen Genom enthielten mit PapilloCheck analysiert Die Kopienzahl der verschiedenen in den Proben vorhandenen HPV Zielregionen sowie die Menge der menschlichen DNA im Hintergrund wurden variiert siehe Tabelle 6 Jede Probe wurde in f nf
56. usf hrliche Informationen finden Sie in der jeweiligen Gebrauchsanweisung z B des PapilloCheck Probenentnahmesets des oCheck DNA Extraktionskits und der CheckReport Software 8 1 Probenentnahme und DNA Extraktion 8 1 1 Probenentnahme Die Probenentnahme ist nicht Teil des PapilloCheck Testkits Ein Probenentnahmeset f r zervikale Proben ist ebenfalls von Greiner Bio One erh ltlich PapilloCheck Probenentnahmeset Bestellinformationen finden Sie in Kapitel 2 PapilloCheck wurde validiert mit DNA die mit dem oCheck DNA Extraktionskit aus menschlichen zervikalen Abstrichen gewonnen wurde welche mit einem der folgenden Probenentnahme Systeme bzw Medien vorgenommen wurde e PapilloCheck Probenentnahmeset Greiner Bio One Frickenhausen Deutschland e PreservCyt Hologic Bedford MA USA e Surepath BD Franklin Lakes NJ USA e STM Qiagen Hilden Deutschland e Easyfix Labonord Templemars Frankreich e Cyt All Alphapath Mauguio Frankreich Weitere Informationen ber geeignete Transportmedien oder DNA Extraktionssysteme erhalten Sie von Ihrem Greiner Bio One Vertriebsh ndler vor Ort oder auf der Website von Greiner Bio One www gbo com bioscience biochips_download PapilloCheck Gebrauchsanweisung Revision BQ 013 08 Mai 2015 Kapitel 8 1 2 DNA Extraktion heck P gxtractio Kapitel 8 2 PCR Kapitel 8 3 2 Hybridisierung Kapitel 8 3 3 Waschen amp Trock
Download Pdf Manuals
Related Search