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Dissertation - Digitale Bibliothek Braunschweig

1. unbelastet Hofbildung Wachstum ub Anhang 150 Wald ub Gruppe 3 P frequentans 57 Isolate Aromatische S uren 1 Nutzung 0 keine Nutzung Isolat Nr Hip 4HB 3HB Phal Phac Benz Ver 2 4DHB W335 1 W336 W337 W340 W344 W345 W346 1 1 1 1 1 1 1 eS fe te fe a 1 1 1 1 0 0 0 ub unbelastet Hofbildung Wachstum Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde am Institut f r Agrar kologie der Bundesforschungsanstalt f r Landwirtschaft FAL Braunschweig angefertigt Herrn Dr H H Reber bin ich f r die Bereitstellung des interessanten Themas sowie seine st ndige Diskussionsbereitschaft und kritische Durchsicht der Arbeit zu gro em Dank ver pflichtet Mein Dank gilt meinem Mentor Herrn Prof Dr H J Aust f r die freundliche bernahme des 1 Referats Herrn Prof Dr O Larink danke ich f r das Interesse an meiner Arbeit und die bernahme des Korreferats Frau S Behn danke ich sehr f r die schnelle und unkomplizierte Hilfe im Labor sowie eine stets freundliche Arbeitsatmosph re Der Arbeitsgruppe von Frau Dr T H Anderson mit Frau M Bota und Herrn K Steffens m chte ich meinen herzlichen Dank f r die M glichkeit der Nutzung der Bildanalyseeinrich tung der Respirometrieanlage
2. 1 0 5 0 8 0 6 2 04 0 2 Acker wb 24 d Acker b 0 0 5 1 0 1 5 Kupfer im N hrboden mM Acker wb Acker b Relative Biomassebildung 0 0 5 1 0 1 5 Kupfer im Nahrboden mM e Abb 20 Einfluss steigender Kupferkontamination des N hrbodens auf die relative Kolonie flache a die relative Koloniedichte b sowie das Produkt aus beiden Parametern die relati ve Biomassebildung c bei jeweils 20 Isolaten von P nigricans aus unterschiedlich schwer metallbelasteten Ackerb den wb wenig belastet b belastet Signifikante Unterschiede zwischen Isolaten aus wenig belastetem und belastetem Ackerboden waren nicht zu erkennen Ergebnisse 87 Relative Koloniefl che 0 1 2 3 4 Kupfer im N hrboden mM Wald ub Halde b Relative Koloniedichte 0 1 2 3 4 Kupfer im N hrboden mM Wald ub Halde b Relative Biomassebildung 0 1 2 3 4 Kupfer im Nahrboden mM e Abb 21 Einfluss steigender Kupferkontamination des N hrbodens auf die relative Kolonie fl che a die relative Koloniedichte b sowie das Produkt aus beiden Parametern die relati ve Biomassebildung c bei jeweils 20 Isolaten von P fellutanum aus Wald und Haldenbo den ub unbelastet b belastet Nur bei einer Kontamination des N hrbodens mit 2 mM Kupfer waren signifikante Unters
3. UXT 2 zu berechnen Mean Gray Grauwert Durch diese Funktion wird der durchschnittliche Grauwert Intensi t t des Messobjekts bestimmt In der Standardeinstellung vergibt das Programm relative Werte von Null bis 255 Wenn n tig kann dieser maximale Messbereich eingeschr nkt wer Material und Methoden 27 den Darauf wurde in dieser Arbeit verzichtet um die gesamte Variabilit t der Intensit ten erfassen zu k nnen Mean Red Rot Mean Green Gr n Mean Blue Blau Die Auswahl dieser drei Funktionen erm glicht die Messung der durchschnittlichen Intensit ten der Rot Gr n und Blaut ne des Objekts Die relativen Messbereiche gleichen dem des Grauwerts Sind laut Definition die Messwerte f r Rot Gr n und Blau gleich Null so ist das Objekt schwarz bei einem maxi malen Wert von 255 ist das Objekt wei Hue Typical typische Farbenabstufung Diese Funktion stellt in einem gedachten Farbdrei eck von Rot Gr n und Blau einen Punkt den typischen Farbmischwert Farbton hue dar der von der Intensit t der Anregung der drei Sensoren f r RGB durch das eingestrahlte Licht abh ngt Auch hier werden relative Werte zwischen Null und 255 vergeben Mean Saturation Sattigung Diese Funktion gibt den statistischen Durchschnitt aus den Werten der Farbs ttigung mit den Extremen Null und 255 wieder Mean Brightness Helligkeit Der Durchschnitt der Helligkeitswerte Die Messwertangabe erfolgt als Dezim
4. Abb 10 Dendrogramm von 20 Testpilzen P1 P20 die in 19 Farbparametern Kap 2 2 2 1 3 mit einem Kameraabstand von 36 cm vermessen wurden Bildanalysedaten im An hang unter 7 1 Die ersten vier Knotenpunkte von der h chsten Distanz aus betrachtet sind nummeriert 45 90 Distanz 135 180 Abb 11 Dendrogramm von 20 Testpilzen P1 P20 die in 19 Farbparametern Kap 2 2 2 1 3 mit einem Kameraabstand von 17 cm vermessen wurden Bildanalysedaten im An hang unter 7 1 Die ersten vier Knotenpunkte von der h chsten Distanz aus betrachtet sind nummeriert Ergebnisse 53 3 1 1 2 Differenzierungskraft der 20 Messparameter beim Kameraabstand von 36 cm Die Unterscheidungskraft aller von einem Bildanalysesystem verwendeten Parameter kann auf einfache Weise durch Clusteranalyse der Bilddaten von Vergleichsstammen bekann ter Pilze ermittelt werden Wenn diese Pilze in Parallelkulturen vorliegen k nnte man erwar ten dass in dem zu erstellenden Dendrogramm die Parallelen eines Stamms nebeneinander angeordnet d h von den Parallelen anderer St mme getrennt sind Dies w rde eventuell auch gelten wenn von einer Art unterschiedliche St mme vorl gen W ren Isolate einer Art dage gen identische St mme so w rden sich die Bezeichnungen der Parallelkulturen wahrschein lich durchmischen d h sie w ren nicht mehr unbedingt als Parallelen nebeneinander ange ordnet Die Abbildung 12 zeigt das Dendrogramm
5. 3 2 2 2 Abschatzung der katabolischen Vielseitigkeit schwermetallgestresster Pilzge meinschaften im Boden durch respirometrische Bestimmung aromatenspezifischer Ab bauzeiten Schwermetallwirkungen auf Gemeinschaften von Bodenmikroorganismen lassen sich auch messen indem man den Abbau der aromatischen Testsubstrate in situ d h direkt im Boden verfolgt Wenn diese dem Boden in quienergetischen Mengen zugesetzt werden m ssen sich aufgrund ihrer voneinander abweichenden Qualit t als C und Energiequellen unterschiedliche Abbauzeiten einstellen Kap 2 2 2 2 2 Unter Schwermetallstress m ssten sich die Abbauzeiten gerade wegen dieser ungleichen Substratqualit t unterschiedlich verl n gern so dass ihre Verteilung weniger gleichm ig ausf llt Weiter wurde vermutet dass sich aus der Verteilung aromatenspezifischer Abbauzeiten wie aus der Verteilung aromatenspezi fischer CFU Indices f r die Verteilung von Abbauf higkeiten im Boden evenness kataboli sche Vielseitigkeit errechnen lassen Da bei diesen Messungen im Gegensatz zur Bestim mung substratspezifischer CFU die Schwermetalle wirksam bleiben kann davon ausgegan gen werden dass zwischen belasteten und unbelasteten B den Unterschiede sichtbar werden Obwohl in B den neben Pilzen auch Bakterien aktiv sind kann aus der Tatsache dass der Pilzanteil an der Bodenatmung mindestens 70 betr gt Anderson und Domsch 1975 ge schlossen werden dass auch bei diesen Versuch
6. Bodenpaar I Ackerb den aus Kl rschlammversuch wb wenig belastet b belastet Schlammgaben 300 m ha al Flie bach et al 1994 n b nicht bestimmt Bodenpaar II Naturb den ub unbelastet b belastet 2 1 2 Nahrmedien und L sungen f r die Kultivierung von Pilzen Die im Folgenden aufgef hrten Medien und L sungen wurden bei der Isolierung und Kultivierung der Pilze sowie bei Substratnutzungstests eingesetzt Die Qualit t des Agars wurde dem jeweiligen Verwendungszweck entsprechend ausgew hlt Die Zusammensetzung der N hrb den und Fl ssigmedien war der jeweiligen Fragestellung angepasst F r die Isolie rung bildanalytische Untersuchungen und Schwermetalltests wurde ausschlieBlich ein leicht modifizierter N hrboden nach Martin 1950 verwendet Tab 5 Material und Methoden 14 Tab 5 N hrboden nach Martin Saccharose Pepton aus Casein 4 MgSO 7 HO Fadenagar Spurenelementl sung pH Aqua deion ad 1000 ml F r s mtliche Bildanalyseversuche wurde aus optischen Gr nden anstelle des Fadenagars gereinigter Agar 12 g T verwendet Siehe Tabelle 8 F r die brigen Medien wurde eine Mineralstoffbasis aus drei Stamml sungen nach Winogradsky Pochon und Tardieux 1962 verwendet L sung A enthielt nur Di Kalium hydrogenphosphat Tab 6 L sung B die brigen Mineralien Tab 7 einschlie lich 2 5 einer Stamml sung von Spu
7. 11 5891 84 7 7503 7 7478 1 9141 12 3770 11 9772 2 1100 12 8106 12 3721 2 0711 12 7447 12 3125 2 4807 5 8020 5 8026 2 4777 5 8306 5 8310 2 4657 5 7798 5 7799 0 8269 7 4621 7 4638 0 8764 7 2689 7 2759 1 1786 7 4066 7 4109 10 0731 7 5624 7 5575 9 3438 7 5895 7 5816 10 7117 7 5900 7 5864 1 9363 8 2110 8 1845 1 8467 8 2405 8 2114 1 8800 8 2644 8 2342 2 2160 5 7586 5 7596 2 2244 5 7821 5 7839 Oberseite der Kolonie Unterseite der Kolonie Mean T Typical V Variation 2 2557 5 7882 5 7897 Anhang 133 M Green i M Saturation Gray y M Brightness Bright y M Density Density y 92 231 12 0618 8 2426 0 7056 8 2064 0 6553 92 230 13 8022 8 2876 0 8334 8 2449 0 7730 93 230 12 2800 8 2025 0 6945 8 1685 0 6464 115 29 1565 8 2710 1 8749 8 2021 1 7390 118 28 4691 8 2527 1 8319 8 1869 1 6973 116 29 6160 8 3091 1 9439 8 2374 1 8003 79 11 1810 7 7689 0 3637 7 7681 0 3542 79 12 5250 7 7137 0 4295 7 7703 0 4155 79 11 6825 7 7269 0 3648 7 7270 0 3571 58 35 3000 11 4014
8. 8 9317 6 0071 0 4138 6 0190 0 4136 61 9 5438 5 9702 0 4120 5 9809 0 4121 82 6 1598 7 3679 0 1622 7 3679 0 1622 83 5 7934 7 3695 0 1504 7 3695 0 1504 78 6 4666 7 3094 0 1715 7 3095 0 1713 77 9 7069 6 2979 0 5385 6 3181 0 5353 78 9 8588 6 4617 0 5803 6 4802 0 5725 78 9 5214 6 3627 0 5502 6 3865 0 5441 6 3695 7 6505 0 1699 7 6504 0 1695 6 2506 7 6331 0 1644 7 6331 0 1641 5 7979 7 6240 0 1525 7 6240 0 1525 Anhang 136 M Green i M Saturation M Brightness M Density i 108 43 7 6319 7 6313 107 44 7 6606 7 6600 107 45 7 6557 7 6550 37 188 13 3258 12 8405 38 13 2540 12 7763 Oberseite der Kolonie Unterseite der Kolonie M Mean T Typical V Variation M Green 34 M Saturation 13 6716 Brightness Bright y 13 1532 M Density Density y 107 52 7 6596 0 1631 7 6595 0 1625 105 55 7 7161 0 1908 7 7158 0 1901 107 53 7 6755 0 1503 7 6755 0 1500 35 13 2080 1 2469 12 7345 1 1335 35 13 2515 1 2267 12 7741 1 1152 34 13 3114 1 2111
9. Summe aller 171 Korrelationskoeffizienten aus der Korrelationsmatrix Hauptkomponentenanalyse Eine Bewertung aller in diesem Abschnitt durchgef hrten Untersuchungen ergibt sich aus der Tabelle 21 Schon wegen der oben festgestellten Unvereinbarkeit von Bildern bzw Bilddaten aus verschiedenen Kameraabst nden bei der computergest tzten Gruppierung und der besseren subjektiven berpr fbarkeit von Datengruppen Clustern durch Bilder war die Verwendung des mittleren Abstands geboten Die Tabelle 21 macht deutlich dass dieser Ab stand hinsichtlich zweier Kriterien den mittleren Rang einnahm wahrend der bez glich der Bilddaten als optimal zu beurteilende kleine Abstand hinsichtlich des Anteils unvollstandig erfasster gro er Kolonien am schlechtesten abschnitt Es zeigt sich somit dass der mittlere Abstand zwar nicht in jeder Hinsicht optimal ist durch die geringen Abweichungen vom je weiligen Optimum aber einen guten Kompromiss darstellt Wie am Anfang dieses Abschnitts gesagt wurde sollte es m glich sein die durch computergest tzte Clusterung gebildeten Gruppen visuell zu begutachten Es wurde vermutet dass f r diesen Zweck die f r die Bildanalyse wichtigen Parameter der Verteilung von Farben und Helligkeit eine untergeordnete Rolle spielen die eigentlichen Farbparameter Grau Rot Gr n und Blau dagegen entsprechend den vier Arten von Sinneszellen des menschlichen Au ges von gr erer Bedeutung seien Da das Auge Farben nur
10. Universitat Berufsweg Michael Stelzer 08 08 1971 Braunschweig 1978 1982 Grundschule in Wendeburg 1982 1984 Orientierungsstufe in Wendeburg 1984 1987 Gymnasium na Seidel Schule in Braunschweig 1987 1991 Gymnasium Hoffmann von Fallersleben in Braunschweig Abitur 1991 WS 1991 WS 1997 Technische Universitat Carolo Wilhelmina Braunschweig Studium der Biologie Vertiefungsfach Mikrobiologie Nebenfacher Botanik und Genetik Juni 1996 Oktober 1997 Anfertigung einer Diplomarbeit am In stitut f r Bodenbiologie der FAL Braunschweig ber das Thema Nutzung der Bildanalyse bei der Bestimmung der Diversit t pilz licher Lebensgemeinschaften November 1997 Diplom Pr fung November 1997 Oktober 1998 Literaturrecherche und Metho denstudien am Institut f r Bodenbiologie der FAL Braunschweig zur Vorbereitung der Promotionsarbeit Ausarbeitung eines An trags f r die Promotion DFG Oktober 1998 Oktober 2002 Erstellung einer Promotionsarbeit am Institut f r Agrar kologie der FAL Braunschweig ber das Thema Zusammenhang zwischen Stresstoleranz Diversitat und katabo lischer Vielseitigkeit schwermetallgestresster Bodenpilze
11. eignete Verd nnungsstufe variierte von Aromat zu Aromat sie musste so gew hlt werden dass die heranwachsenden Kolonien gut z hlbar waren Als Kontrollen wurden ein Vollmedi um Tab 5 und Mineralsalzagar Tab 9 verwendet mit dem Ziel sowohl kr ftiges als auch kryptisches Wachstum identifizieren zu k nnen Die erstarrten Platten wurden invertiert bei 25 C inkubiert und nach 14 Tagen ausgewertet Die Daten dienen der Abschatzung der kata bolischen Vielseitigkeit auf der Gemeinschaftsebene Kap 2 2 4 2 2 2 2 2 Bestimmung aromatenspezifischer Abbauzeiten in Bodenproben Die Methode basiert auf der Beobachtung dass Aromaten aufgrund ihrer Molek l struktur unterschiedlich schnell abgebaut werden k nnen Daher m ssen die Abbauzeiten d h die Inkubationszeiten zwischen Substratzugabe und Erscheinen des betreffenden Atmungsgip fels bei Applikation quienergetischer Mengen unterschiedlich lang sein Da der Anteil der Pilze an der Atmungsaktivit t mindestens 70 betr gt und mit zunehmendem Stress sogar weiter zunimmt Anderson und Domsch 1975 Blagodatskaya und Anderson 1998 Schlegel 1992 wird davon ausgegangen dass durch Messung der Bodenatmung weitgehend die Pilz gemeinschaft erfasst wird Die Berechnung quienergetischer Substratmengen beruhte auf der Zahl der Elektro nen die beim Abbau eines Molek ls flieBen k nnen verf gbare Elektronen Payne 1970 Als Bezugssubstrat diente 4 Hydroxybenzoes ure 28 Elektrone
12. 0 01073 0 03287 0 01131 0 06014 0 00495 0 00634 0 00235 0 00278 0 00135 0 00208 0 00286 0 00000 0 00131 0 00000 0 00000 0 00132 0 00328 0 00091 0 00000 0 00000 Substrat Versuch Nr 3 Hydroxybenzoat 0 TRE 0 Hippurat 0 06250 4 Hydroxycinnamat 0 05263 4 Hydroxybenzoat 0 05556 Cinnamat 0 05263 Benzoat 0 04762 Phenylalanin 0 05263 2 Hydroxybenzoat 0 04167 Phenylacetat 0 03704 Mandelat 0 03571 2 Aminobenzoat 0 03125 2 4 Dihydroxybenzoat 0 02564 Terephthalat 0 02564 Anisat 0 02041 2 6 Dihydroxybenzoat 0 01923 Veratrat 0 01587 4 Aminobenzoat 0 01639 Nicotinat 0 01064 Phthalat 0 00870 p Toluat 0 00826 Gentisat 0 00000 evenness 0 93544 Durchschnittswert DW 0 03250 Mittlere Abweichung MA 0 02449 Katabolische Vielseitigkeit 1 32735 0 93588 0 03101 0 02436 1 27303 0 93316 0 03184 0 02477 1 28540 0 93 0 03178 4 0 02454 1 30 0 03 0 82549 0 04405 0 03917 1 12470 0 85584 0 03431 0 03546 0 96767 0 85859 0 03282 0 03524 0 93128 0 85 0 03706 0 03662 1 01 0 02 0 00610 0 00221 0 10 Applikation in quienergetischen Mengen Bezugsgr e 1 5 mmol 4HB kg ub unbelastet b belastet Signifikante Ver nderung infolge Schwermetallstress Ergebnisse 78 Die aus der Verteilung aromatenspezifischer Abbauzeiten errechneten Indices even und katabolische Vielseitigkeit zeigen nicht nur zwischen
13. MP6 Mean Saturation MP7 Mean Brightness MP8 Mean Density MP9 Farbparameter der Kolonieunterseite Mean Gray MP10 Mean Red MP 11 Mean Green MP 12 Mean Blue MP13 Hue Typical MP14 Mean Saturation MP15 Gray Variation MP16 Mean Brightness MP17 Bright Variation MP18 Mean Density MP19 Density Variation MP20 Ergebnisse 60 3 1 1 3 Suche nach der geeigneten Clusterebene Aus der Tatsache dass die Bilddaten der drei Isolate von Penicillium fellutanum auf einer h heren Distanzstufe bei geringerer Ahnlichkeit clusterten als die Daten der Dreifach animpfungen Tripletts von 27 Vergleichsst mmen definierter Arten Abb 12 l sst sich ableiten dass eine Distanzstufe die der h chstm glichen hnlichkeitsstufe ann hernd 100 entspricht als Clusterebene ungeeignet ist Da die Variabilit t der zu einer Art geh renden St mme unbekannt ist w re es nicht gerechtfertigt die Clusterebene a priori festzule gen Vielmehr m sste diese abh ngig von der Variabilit t der Arten in einer Gruppe zu diffe renzierender Pilze f r jede Gruppe neu ermittelt und festgelegt werden Die Festlegung auf eine bestimmte starre Clusterebene und nicht auf eine Linie wechselnder Distanzen ist n tig weil der Vorgang des Clusterns nicht auf einer Vordifferenzierung der Isolate nach wichtigen und einer Nachdifferenzierung nach weniger wichtigen Parametern beruht sondern weil alle Parameter gleiches Gewicht haben Diese
14. TG mit 20 ml einer 1 N KCI L sung in einer PE Flasche aufgeschwemmt Nach 30 Min maschinellen Sch ttelns wurde der pH Wert unter st ndigem R hren mittels einer Glaselektrode Labor pH Meter 765 Knick Elektronische Messger te Berlin Deutschland bestimmt Bestimmung der Bodenfeuchte Proben feuchten Bodens zwischen 4 g und 8 g wur den auf die Trocknungsschale des Feuchtigkeitsmessers Ultra X UX 2010 A Gronert Lage Material und Methoden 22 Deutschland gegeben und der Strahler auf Stufe 3 eingeschaltet Nach vollst ndiger Ver dampfung des Bodenwassers durch die W rmestrahlung Gewichtskonstanz wurde die Feuchtigkeit des Bodens vom Ger t in Prozent mit einer Nachkommastelle angegeben Bestimmung der Schwermetallgehalte von Bodenproben Die Schwermetallgehalte der B den wurden nach Konigswasseraufschluss Schlichting et al 1995 durch Messung im Atomabsorptionsspektralphotometer AAS bestimmt VARIAN GTA 100 Spectr AA 200 Darmstadt Deutschland Nach der Trocknung 24 h 105 C wurden die Proben 1 g TG gem rsert und 1 h bei 450 C im Muffelofen verascht Anschlie end wurden die Proben mit 6 ml 38 HCl und 2 ml 65 HNO versetzt und auf einem Sandbad bei 100 105 C f r 2 h vorsichtig erhitzt Nach Resuspendierung in 2 M HNO und Filtration durch einen s urefesten Filter S amp S 595 2 Schleicher und Sch ll Dassel Deutschland wurde das Extraktionsvolu men mit 2 M HNO3 auf 50 ml aufgef llt F r
15. Wachstums zu ermitteln Von dieser Analyse wurde erwartet dass nicht nur Unterschiede auf der Gemeinschaftsebene sondern auch auf der Artebene sichtbar w rden Die Abbildungen 16 und 17 zeigen die Verteilung der Wachstumsraten von etwa 400 Pilzisolaten je Boden Besonders auffallend sind die Unterschiede innerhalb des Bodenpaars I Abb 16 W hrend im wenig belasteten Acker etwa 15 der Isolate schneller als 4 mm d wuchsen war dieser Anteil im belasteten Acker geringer als 4 Interessant wenn auch sta tistisch nicht gesichert ist das einmalige Auftreten eines Isolats mit 19 mm d Wuchsleistung im wenig belasteten Acker wahrend das schnellstw chsige Isolat aus dem belasteten Boden nur eine t gliche Wuchsleistung von etwa 13 mm zeigte In den beiden Naturb den waren die Unterschiede hnlich wenn auch nicht so ausgepragt Abb 17 Wahrend im Waldboden et wa 4 der Pilze schneller als 4 mm d wuchsen waren es im Haldenboden nur 3 Daf r ist der Anteil der schneller als 10 mm d wachsenden Pilze im Waldboden deutlich h her als im Haldenboden Ergebnisse 66 10 0 8 0 Lineares Wachstum mm d r 4 0 20 0 18 0 16 0 14 0 12 0 6 0 2 0 Acker wb 419 Isolate nach Wachstum sortiert 18 0 14 0 6 0 Lineares Wachstum mm d 20 0 16 0 12 0 10 0 8 0 E 4 0 2 0 Acker b 414 Isolate nach Wachstum sortiert Abb 16 E
16. Zusammenfassend l sst sich zu diesem Zeitpunkt noch keine eindeutige Aussage hinsichtlich des Einflusses von Schwermetallstress auf die katabolische Vielseitig keitcru von Bodenpilzen treffen wenn einzelne Daten auch zu entsprechenden Spekulationen Anlass geben Wie aufgrund von Daten mit Penicillien Tab 32 u 33 zu vermuten ist w r den solche Ver nderungen wahrscheinlich auch nur die Gemeinschaftsebene betreffen d h durch Ver nderungen der Artenzusammensetzung zustande kommen nicht aber die Artebene Im Gegensatz zur CFU Methode zeigte die Anwendung der Respirometriemethode hinsichtlich des Einflusses von Schwermetallen auf die katabolische Vielseitigkeit der B den berechnet aus den Kehrwerten aromatenspezifischer Abbauzeiten signifikante Unterschiede sowohl zwischen als auch innerhalb der beiden untersuchten Bodenpaare auf Tab 29 u 30 Es ergab sich dass der Vielseitigkeitsindex im belasteten Ackerboden um 12 6 im belaste ten Haldenboden sogar um 22 3 gegen ber den jeweiligen Kontrollen abnahm Die Ab nahme der Gleichm igkeit der Verteilung relativer Abbauzeiten evenness war zwar gerin ger aber ebenfalls signifikant Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den beiden Boden paaren ergibt sich aus der Tatsache dass die katabolische Vielseitigkeit des gestressten Ackerbodens 1 53 0 06 gr er war als die des ungestressten Waldbodens 1 30 0 03 Veranderungen auf der Substratseite waren im Gegensatz zu der
17. ber dem kleinen Kameraabstand musste sogar die Tatsache gewertet werden dass im Vergleich mit dem gro en Abstand nur 4 3 der Kolonien nicht vollst ndig abgebildet werden konnten mit dem kleinen Abstand dagegen 8 8 Abb 8 Tab 21 Da vorgesehen war die nicht vollst ndig abgebildeten gro en Pilze zur visuellen berpr fung der Bildcluster als Vollbild darzustellen war der zus tzliche Arbeitsaufwand der mit dem mittleren Kameraabstand n tig war nur etwa halb so gro wie mit dem kleinen Abstand Die in dieser Arbeit angewandten Methoden der Cluster und Hauptkomponentenana lyse PCA beruhen auf der Bestimmung von Korrelationen zwischen den eingesetzten Mess parametern Dabei k nnen Objekte umso besser differenziert werden je mehr Messparameter eingesetzt werden und je weniger diese miteinander korreliert sind bzw je geringer die Sum me aller paarweise zu ermittelnden parameterspezifischen Korrelationen ist Im Gegensatz dazu ist die Unterscheidungskraft jedes einzelnen Parameters umso geringer je mehr er mit allen anderen Parametern korreliert ist d h je gr er die Summe der Korrelationen ist Bei den in dieser Arbeit eingesetzten Messparametern waren deutliche Unterschiede aufgetreten So zeigte sich dass die Varianz der das Wachstum der Pilze betreffenden Messwerte wegen ihrer geringen Korrelation mit den Farbparametern zu etwa 88 an der Differenzierung der Pilze beteiligt war die Varianz des Farbparameters Mean Densit
18. den auf der einen und den Naturb den auf der anderen Seite waren die Unterschiede gesichert Diese Tatsache ergab sich insbesondere aus dem Dendrogramm der Abbildung 18 das auf den relativen CFU der Tabellen 27 und 28 ba siert Deutlich waren im Dendrogramm nur die Ackerb den von den Naturb den getrennt wahrscheinlich bedingt durch den groBen Unterschied im Boden pH Auffallend war auch dass nur bei zwei der vier untersuchten B den Acker b u Wald ub alle drei Stichproben als Triplett vorlagen ein Anzeichen f r relativ starke Ver nderungen innerhalb der anderen Pilz gemeinschaften zwischen den Probenahmezeitpunkten Insbesondere innerhalb des wenig belasteten Ackerbodens war der Index der katabolischen Vielseitigkeitcry 1 80 0 25 gr Deren Schwankungen unterworfen als der Index des belasteten Ackerbodens 1 93 0 05 Auch hier lieBe sich durch weitere Versuche eventuell ein Zusammenhang zwischen der An passungsf higkeit an St rungen und dem Variationskoeffizienten der katabolischen Vielsei tigkeitcry best tigen Warum nicht alle B den im Dendrogramm der Abbildung 18 als Tripletts erschienen l sst sich wegen der zu geringen Stichprobenzahl nicht beantworten Die Auswertung substratspezifischer Ver nderungen erfolgte durch Vergleich der rela tiven Haufigkeiten mit der die 21 aromatischen S uren von den Pilzen als alleinige C Quelle genutzt werden konnten Tab 27 u 28 Bei Ber cksichtigung der jeweiligen Mittelwerte und
19. eren Gruppen aus einem Bodenpaar isolierten Pilze sollten hinsichtlich ih rer F higkeit die in der Tabelle 10 aufgef hrten 21 aromatischen S uren als einzige C und Energiequelle nutzen zu k nnen getestet werden Da 4 Methoxycinnamat in Medien von pH 6 0 immer ein Prazipitat bildete wurde bei diesem Substrat auch die Hofbildung bonitiert Jede aromatische S ure wurde in einer Konzentration von 10 mM in ein Minimalmedium Tab 9 eingearbeitet Jede Substratplatte wurde mit vier Isolaten beimpft Die Myzelst cke wurden vor dem Auslegen in einer sterilen Glukosel sung 25 mg Aqua dest gewaschen um bersch ssige Sporen abzuwaschen Vermeidung von Sporenstreuungen und eine Start hilfe f r das Wachstum bereitzustellen Als Kontrolle dienten Mineralsalzagarplatten Tab 9 Eine Substratnutzung war durch deutlich sichtbaren Bewuchs gekennzeichnet und musste eindeutig vom kryptischen Bewuchs der Kontrolle zu unterscheiden sein Nach 14 Tagen In kubation bei 25 C wurden die Platten ausgewertet Die berpr fung der Abbaubarkeit von 15 Polymeren und hydrophoben Substanzen Tab 11 wich wegen deren unterschiedlicher Verf gbarkeit und der davon abh ngigen Zube reitung von dem oben beschriebenen Test auf Nutzung aromatischer S uren ab Zur Vorbe reitung des Tests wurden zun chst Sporensuspensionen 1 ml jedes Pilzes in Petrischalen mit einem Mineralsalzagar als Tr germedium Fadenagar pH 6 0 vermischt und bei 25 C be br tet
20. higkeiten auf der Artebene beruhen und zum anderen im Sinne von Salonius 1981 auf der Abnahme der Diversit t mit der Folge dass der Gemeinschaft eventuell nicht mehr alle Abbauf higkeiten zur Verf gung stehen Sie k nnte aber drittens auch darauf zur ckgef hrt werden dass unter Schwermetall stress katabolische Enzyme lediglich unterschiedlich gehemmt werden F higkeiten also gar nicht verloren gehen Schlie lich k nnen alle drei M glichkeiten zutreffen Zur berpr fung der ersten Hypothese sind Isolate mindestens einer Art aus belastetem und unbelastetem Boden hinsichtlich ihrer Abbauf higkeiten zu untersuchen Hinweise f r die G ltigkeit einer Hypothe se im Sinne von Salonius 1981 erg ben sich aus Ver nderungen im Verh ltnis substratspezifi scher Vermehrungseinheiten colony forming units CFU zueinander Tr fen die beiden ersten Hypothesen nicht zu so k nnte die dritte durch Messung substratspezifischer Abbauzeiten an Bodenproben im Respirometer berpr ft werden Wenderoth und Reber 1999 b Vorausset zung dazu ist dass die verschiedenen Testsubstrate wenn m glich in quienergetischen Men gen angeboten werden Als Testsubstrate sind verschiedene Polymere und hydrophobe Substan zen sowie aromatische S uren vorgesehen Die Abbauwege aromatischer S uren durch Bakteri en und Pilze weisen laut Wright 1993 viele Gemeinsamkeiten aber auch wesentliche Unter schiede auf M gliche Abbauwege von Benzoes ure und h
21. ihrer Standardabweichungen lie en sich f r die beiden Ackerb den relative Zunahmen der Fahigkeiten zum Abbau von 3 Hydroxybenzoat Phenylalanin und Gentisat sowie die relative Abnahme der F higkeit zur Nutzung von Veratrat errechnen Aufgrund experimenteller Er fahrungen mit Bakterien Reber 1973 1975 Wenderoth und Reber 1999 a k nnen die drei erstgenannten Verbindungen eher als leicht Veratrat dagegen eher als schwer abbaubar ange sehen werden Diese Ver nderungen w rden daher den Erwartungen entsprechen Bei einem stringenteren Vergleich der Ergebnisse d h bei Betrachtung von Proben gleicher Entnahme zeitpunkte unter Ber cksichtigung des durch Streuung der CFU bedingten Messfehlers sind Unterschiede in den substratspezifischen Vermehrungseinheiten zwischen den Ackerb den dagegen nicht zu sichern Diskussion 110 Zu ahnlichen Ergebnissen kommt man bei einem Vergleich der beiden Naturb den Die Betrachtung nur der Mittelwerte und ihrer Standardabweichung w rde auf eine relative Zunahme der Fahigkeit zur Nutzung von 3 Hydroxybenzoat und eine relative Abnahme der Fahigkeiten zum Abbau von 2 Hydroxybenzoat 2 Aminobenzoat Veratrat und 4 Methoxy cinnamat hindeuten w hrend der Vergleich von Proben gleicher Entnahmezeit nur eine gesi cherte Abnahme der Fahigkeit zur Nutzung von 4 Methoxycinnamat anzeigt Hier ist aller dings darauf hinzuweisen dass diese Substanz von den Pilzen des Haldenbodens berhaupt nicht genutzt wurde
22. licht es eine sinnvolle Unterscheidung zwischen den beiden Begriffen Toleranz und Resis tenz zu treffen die in der Literatur h ufig nicht pr zise verwendet werden Gadd 1986 b 1989 Da der Erwerb der Widerstandsf higkeit gegen ber Antibiotika als Resistenz bezeich net wird k nnte man die unter Schwermetallstress erworbene Fahigkeit zur Repression der Mehrsynthese von SH Gruppen ebenfalls als Resistenz bezeichnen Die offensichtlich konsti tutive Fahigkeit zur Steigerung der Synthese von SH Gruppen Metallothioneinen in konta minierten Medien bei Pilzen die vor der Isolierung und Kultivierung keinem permanenten Schwermetallstress ausgesetzt waren und folglich keine Resistenz erwerben konnten m sste folglich als Toleranz bezeichnet werden Um diese These zu untermauern w re allerdings zu untersuchen ob andere Pilze hnlich reagieren wie P fellutanum Zusammenfassung 116 5 Zusammenfassung Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen ob bei schwermetallgestressten Bodenpilzen ein Zusammenhang zwischen Stresstoleranz Diversit t und katabolischer Viel seitigkeit besteht und wie dieser eventuell zu deuten ware Die Untersuchungen wurden durch die Beobachtung angeregt dass Bakterien unter Schwermetallstress Fahigkeiten zum Abbau energetisch schwer abbaubarer aromatischer S uren verlieren und dadurch besser berleben k nnen Dies wurde als ein Toleranzmechanismus aufgefasst Es ergab sich daher die Frage ob
23. werden sowie die in der Arbeit f r jede aromatische S ure verwendete Abk rzung Diese aromatischen S uren unterscheiden sich in der Substratqualitat f r Pilze und werden von die sen aber auch im Boden unterschiedlich schnell katabolisiert In Bodenproben wurden die aromatischen S uren in fester Form einger hrt f r alle brigen Untersuchungen wurden 100 mM oder 200 mM Stamml sungen hergestellt Material und Methoden 16 Die fiir Substratnutzungstests mit Isolaten verwendeten Polymere und hydrophoben Substanzen sind mit den verwendeten Abk rzungen in der Tabelle 11 aufgef hrt Ebenfalls angegeben sind die Substratkonzentrationen die sich in Vorversuchen als geeignet erwiesen hatten In jedem Fall handelt es sich jeweils um die gr tm glichen am Markt erh ltlichen Reinheitsgrade 2 1 3 1 Aromatische S uren Tab 10 F r Substratnutzungstests mit Isolaten zur Bestimmung aromatenspezifischer Ver mehrungseinheiten CFU und f r Atmungsversuche mit Boden als alleinige C und Energie quelle verwendete aromatische S uren Zahl verf gbarer Aromatische S ure Abk rzung Elektronen pro Molek l 2 Aminobenzoat 2AB 28 4 Aminobenzoat 4AB 28 2 4 Dihydroxybenzoat 2 4DHB 26 2 6 Dihydroxybenzoat 2 6DHB 26 2 Hydroxybenzoat 2HB 28 3 Hydroxybenzoat 3HB 28 4 Hydroxybenzoat 4HB 28 4 Hydroxycinnamat 4HC 38 4 Methoxycinnamat 4MC 44 Anisat Anis 34 Benzoat Benz 30 Cinnamat Cin 40 Gentisat Gent 26 Hippurat Hip 36 Mandelat
24. 00 4 54 0 85 5 18 0 55 4 70 0 42 2 4 Dihydroxybenzoat 5 12 0 79 6 79 0 79 6 51 0 75 6 14 0 90 6 43 1 19 5 75 0 99 5 78 1 76 5 99 0 38 2 Hydroxybenzoat 5 80 0 90 5 58 1 24 6 33 1 34 5 90 0 39 6 92 0 92 6 35 0 81 5 55 0 61 6 27 0 69 Cinnamat 3 04 0 66 4 40 1 04 10 1442 02 5 86 3 77 4 19 1 05 4 23 0 63 3 97 1 12 4 13 0 14 2 Aminobenzoat 4 66 0 87 5 40 0 99 5 65 1 19 5 24 0 51 4 9040 99 4 87 1 16 5 03 0 76 4 93 0 08 Mandelat 6 46 0 64 3 54 0 49 4 09 1 01 4 69 1 55 4 00 1 01 3 50 0 88 3 00 0 58 3 50 0 50 4 Aminobenzoat 4 72 0 72 4 47 1 33 0 00 3 06 2 66 4 49 1 09 5 07 1 22 3 63 0 81 4 39 0 73 Gentisat 3 67 0 94 1 75 0 52 3 4140 77 2 94 1 04 4 72 0 63 6 52 1 10 5 78 1 06 5 67 0 91 4 2 6 Dihydroxybenzoat 4 75 1 02 1 89 0 70 1 90 0 87 2 85 1 65 2 77 0 37 1 92 0 68 3 09 1 00 2 59 0 60 4 Methoxycinnamat 2 73 0 59 2 39 0 45 2 06 0 70 2 39 0 34 2 75 0 90 2 49 0 94 2 76 0 36 2 67 0 15 Anisat 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 Phthalat 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 Terephthalat 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 Nicotinat 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 703 0 9138 4 76 2 29 2 08 Summe aller CFU x 10 56 evenness Durchschnittswert DW Mittlere Abweichung MA Katabolische Vielseitigkeit Bedeutungswerte aromatenspezifische CFU Summe aller CFU wb wenig belastet b belastet debe 0 8933 4 76 2 78 1 71 0 651 0
25. 16 05 84 47 14 3 82 15 18 79 89 15 5 13 13 87 73 00 16 8 64 10 16 53 47 20 9 80 9 20 48 42 MP18 9 89 9 11 47 95 MP13 10 37 8 63 45 42 MP3 10 94 8 06 42 42 MP5 11 18 7 82 41 16 MP7 11 28 7 72 40 63 11 11 50 7 50 39 47 MP2 11 53 7 47 39 32 4 11 61 7 39 38 89 MP8 11 94 7 06 37 16 MP9 11 96 7 04 37 05 MP12 12 53 6 47 34 05 MP10 12 55 6 45 33 95 17 12 72 6 28 33 05 19 12 74 6 26 32 95 Lineares Wachstum in mm d MP1 Farbparameter der Kolonieoberseite Mean Gray MP2 Mean Red MP3 Mean Green MP4 Mean Blue MP5 Hue Typical MP6 Mean Saturation MP7 Mean Brightness MP8 Mean Density MP9 Farbparameter der Kolonieunterseite Mean Gray MP10 Mean Red MP11 Mean Green MP 12 Mean Blue MP13 Hue Typical MP14 Mean Saturation MP15 Gray Variation MP16 Mean Brightness MP17 Bright Variation MP18 Mean Density MP19 Density Variation MP20 Summe aller 19 Korrelationskoeffizienten r als Wurzeln aus den Bestimmtheitsma en Aus der Hauptkomponentenanalyse anderer Datens tze geht hervor dass die Bedeu tung der in der Bildanalyse eingesetzten Messparameter offensichtlich variieren kann Die Abbildung 14 zeigt die Positionen der 20 verwendeten Messparameter wie sie sich aus den Datens tzen von drei Stichproben aus einem schwermetallbelasteten Haldenboden ergeben haben Es ist zu erkennen dass die Parameter aus drei Stichproben durchaus auf drei Quad ranten Z hl
26. 23 Reproduzierbarkeit optimal geeignet Falls mit den entsprechenden Untersuchungen nicht sofort begonnen werden konnte wurde der Boden bei 4 C im K hlraum dunkel gelagert In diesem Fall wurden Proben einen Tag vor Respirationsversuchen mit Boden auf 20 C tempe riert Tab 13 Zeitpunkte der Probenahmen und der Isolierungen Bodenstichprobe Probenahme Ausplattierung Acker wbl Marz 1999 Mai 1999 Acker b1 Marz 1999 Acker wb2 M rz 1999 Dezember 1999 Acker b2 Marz 1999 Acker wb3 April 2000 August 2000 Acker b3 April 2000 Wald ubl Januar 1999 Februar 1999 Halde b1 Oktober 1998 Wald ub2 Januar 1999 August 1999 Halde bi Januar 1999 Wald ub3 Oktober 1999 M rz 2000 Halde b3 Oktober 1999 wb wenig belastet b belastet ub unbelastet 2 2 2 1 2 Isolierung Kultivierung und Stammhaltung von Pilzisolaten Isolierung Je 10 g Boden TG wurden in 100 ml Natriumhexametaphosphatl sung 1 g aufgeschwemmt und 30 Min maschinell gesch ttelt Die Bodensuspension wurde im Verh ltnis 1 10 mit Ringerl sung 1 Tablette 500 mI H O entsprechend 2 25 g NaCl 0 105 g KCl 0 08 g CaCl 0 01 g NaHCO 0 105 g pH 6 9 verd nnt Diejenige Verd nnungsstufe wurde verwendet mit welcher ca 5 10 Pilze pro Petrischale isoliert wer den konnten Vorversuch Je nach Bodentyp lag die optimale Verd nnung bei 10 oder 10 Nur solche Platten auf denen die Pilze gut getrennt wuchsen wur
27. 3 0030 11 0799 2 7462 59 33 9070 11 6909 2 9216 11 3454 2 6704 55 34 8556 11 5540 2 9778 11 2196 2 7227 16 9458 7 0511 0 7394 7 0646 0 7235 12 8095 7 0631 0 5922 7 0792 0 5707 14 4557 7 1545 0 6192 7 1691 0 5982 17 9250 8 1523 1 0987 8 1093 1 0186 19 4699 7 8965 1 1224 7 8654 1 0449 19 7570 7 9189 1 1564 7 8874 1 0766 5 5326 7 7750 0 1889 7 7735 0 1826 6 5191 7 7327 0 2474 7 7303 0 2365 5 8398 7 7267 0 1903 7 7257 0 1846 7 8855 7 6893 0 2923 7 6856 0 2806 8 1654 7 7153 0 3073 7 7108 0 2949 7 3749 7 7047 0 2681 7 7016 0 2580 11 8126 5 9516 0 4715 5 9609 0 4712 11 0008 5 9943 0 4701 6 0050 0 4694 11 7189 5 9600 0 4706 5 9698 0 4704 Anhang 134 Pilz Nr Saturation M Brightness IM Density Erl 128 9 2902 9 1484 Er2 131 9 3983 9 2469 Er3 136 9 5240 9 3615 Pfal 38 7 0748 7 0479 Pf a2 38 7 0755 7 0549 Pf a3 37 6 8465 6 8354 Chl 12 0522 11 6805 Ch2 12 0117 11 6436 Ch3 12 0778 11 7039 Pfbl 7 5079 7 4587 Pf b2 7 2367 7 2047 Pf b3 7 0844 7 0617 Bal 7 7375 7 7339 2 7 7609 7 7538 Ba3 7 7763 7 7698 Pfcl 6 6616 6 6644 Pf c2 6 7876 6 7833 Pf c3 6 7631 6 7609 Trl 7 5335 7 5338 Tr2 7 5430 7 5434 Tr3
28. 4392 157 182 170 120 135 58 12 1161 5 7226 0 3529 5 7290 0 3582 P19 133 142 142 117 127 33 6 5291 6 5347 125 157 139 79 137 94 4 0201 6 9220 0 2743 6 9374 0 2512 P20 160 176 169 138 136 36 5 8539 5 8451 135 171 151 84 137 97 9 7322 6 2373 0 4854 6 2617 0 4845 VK 0 345 0 395 0 314 0 327 0 147 0 389 0 289 0 276 0 185 0 150 0 174 0 326 0 031 0 517 0 661 0 192 1 207 0 182 1 141 DW aller 19 0 382 0 314 DW der VK eigentlicher Farbparameter F1 F4 F9 F12 0 277 0 093 IDW der VK der Parameter fiir Verteilung von Farben und Helligkeit F5 F8 F13 F19 0 458 0 396 Abstand zwischen Frontlinse des Objektivs und der Agaroberflache VK Variationskoeffizient SD DW wobei SD Standardabweichung DW Durchschnittswert Farbparameter der Kolonieoberseite Mean Gray F1 Mean Red F2 Mean Green F3 Mean Blue F4 Hue Typical F5 Mean Saturation F6 Mean Brightness F7 Mean Density F8 Farbparameter der Kolonieunterseite Mean Gray F9 Mean Red F10 Mean Green F11 Mean Blue F12 Hue Typical F13 Mean Saturation F 14 Gray Variation F 15 Mean Brightness F16 Bright Variation F17 Mean Density F18 Density Variation F19 Anhang 129 Kamera abstand Pilz Nr F1 F2 F4 F5 F6 F7 F8 F9 FIO FI2 3 4 FIS F16 F17 F18 F19 17 cm P1 127 134 134 114 127 25 6 6761 6 6846 114 133 125 83 134 67 6 0303 7 3189 0 1611 7 3189 0 1607 P2 155 181 160 12
29. 7 5050 7 5054 Sbl 6 0047 6 0063 Sb2 6 0001 6 0024 Sb3 5 9314 5 9326 Mr 8 2903 8 2487 Mr2 8 4352 8 3813 Mr3 8 4147 8 3628 Oberseite der Kolonie Unterseite der Kolonie Mean T Typical V Variation Anhang 135 M Green M Saturation Gray y M Brightness Bright y M Density Density v 105 159 26 8932 8 7091 1 9221 8 6125 1 7703 104 154 26 5434 8 6698 1 8863 8 5765 1 7378 103 156 26 1079 8 7398 1 8954 8 6429 1 7444 150 72 9 5986 6 0474 0 4428 6 0620 0 4424 152 73 10 3231 6 0355 0 4568 6 0489 0 4566 151 73 10 2037 6 0466 0 4562 6 0610 0 4561 59 63 39 7429 11 7929 3 2387 11 4318 2 9677 55 69 40 8379 12 1861 3 3923 11 7908 3 1060 57 65 39 4583 11 9532 3 2595 11 5792 2 9848 67 8 2373 6 0601 0 4086 6 0771 0 4088 66 8 7824 6 0184 0 4125 6 0306 0 4122 68 8 4566 6 0484 0 4135 6 0629 0 4131 75 13 2802 7 7144 0 7712 7 6996 0 7165 73 13 1221 7 7607 0 7823 7 7440 0 7262 75 12 7541 7 7255 0 7205 7 7111 0 6705 62 9 4412 5 9955 0 4262 6 0066 0 4260 62
30. 86 21 8702 8 7208 1 3032 8 6325 1 2121 89 21 0938 8 6375 1 2419 8 5564 1 1549 88 21 0582 8 6741 1 2712 8 5901 1 1806 10 8222 7 7583 0 3279 7 7546 0 3219 11 8377 7 7623 0 3852 7 7561 0 3751 11 4842 7 7918 0 3858 7 7846 0 3745 9 2249 7 2372 0 4025 7 2457 0 3836 9 9323 7 2173 0 4371 7 2271 0 4168 9 9301 7 2185 0 4320 7 2283 0 4116 48 3478 11 8518 3 5615 11 4654 3 2977 48 6342 12 1573 3 6489 11 7457 3 3741 48 8170 12 0163 3 6425 11 6161 3 3694 12 8409 7 2601 0 5195 7 2706 0 5000 13 2722 7 3190 0 4980 7 3286 0 4783 11 9734 7 3132 0 4488 7 3220 0 4302 5 6629 7 7844 0 1963 7 7826 0 1893 4 8550 7 7860 0 1747 7 7847 0 1678 4 7615 7 7511 0 1536 7 7503 0 1492 Anhang 132 Pilz Nr mm d M Saturation M Brightness i M Density Fel 9 1211 99 7 7715 7 7665 2 8 5257 102 7 7525 7 7492 Fc3 8 6728 104 7 7445 7 7418 Pll 1 9988 37 5 7892 5 7915 2 2 0421 37 5 7747 5 7765 2 0649 37 5 7793 5 7813 MI 11 4728 87 7 7984 7 7951 Mf2 11 3793 84 7 7937 7 7910 Mf3
31. 8833 4 76 2 99 1 59 907 0 9064 4 76 2 49 1 91 927 0 9022 4 76 2 52 1 89 954 0 9083 4 76 2 39 Ver nderung infolge Schwermetallstress nur bei Betrachtung von Mittelwert MW und Standardabweichung signifikant s Text Ergebnisse 73 Tab 28 Berechnung der katabolischen Vielseitigkeit von Bodenpilzen in Naturb den aus der relativen Verteilung aromatenspezifischer Ver mehrungseinheiten CFU LSD 0 05 n 10 Platten 3 Versuche Unterschiede zwischen den Naturb den waren nicht signifikant Wald ub Bedeutungswerte 9o Halde b Versuch Nr Substrat 2 MW 1 2 MW Hippurat Phenylalanin 4 Hydroxybenzoat 4 Hydroxycinnamat Phenylacetat 3 Hydroxybenzoat 2 Hydroxybenzoat 2 Aminobenzoat 2 4 Dihydroxybenzoat Veratrat Benzoat Gentisat 4 Aminobenzoat Cinnamat Mandelat Anisat 4 Methoxycinnamat Phthalat Terephthalat 2 6 Dihydroxybenzoat Nicotinat Summe aller CFU x 10 evenness Durchschnittswert DW Mittlere Abweichung MA Katabolische Vielseitigkeit Bedeutungswerte aromatenspezifische CFU Summe aller CFU ub unbelastet b belastet debe 10 33 0 88 10 05 0 88 11 61 0 25 9 91 1 61 7 93 3 46 8 92 0 85 6 3743 48 4 95 2 83 8 21 0 65 7 22 1 12 4 19 0 10 4 10 0 55 2 04 0 74 2 26 2 49 0 28 0 49 1 19 0 22 0 44 0 43 0 00 0 00 0 00 0 00 2355 0 8548 4 76 3 61 1 32 14 07 2 23 13 2
32. 950 ml pH 8 0 Das Reaktionsgemisch zur Bestimmung des Proteingehalts von Pilzmyzelien enthielt 100 ul Probe und 1400 ul Reagenz Beide wurden in einem Eppendorf Reaktionsgef 1 5 ml angesetzt und per Hand geschiittelt Als Nullwert wurde anstelle der Probe 100 ul zweifach destilliertes Wasser verwendet Der entstehende Farbkomplex war zwischen 5 Min und 90 Min stabil seine Extinktion wurde bei einer Wellenlange von 595 nm gemessen Fiir Eichkurven Kap 3 3 4 diente Gamma Globulin das in Konzentrationsbereichen von 10 100 ug mI bzw 100 1000 ug mI eingesetzt wurde Die Proben wurden nach Bedarf vor der Messung mit Wasser verd nnt wenn die Proteinkonzentration 1000 ug ml berschritt Die Messungen erfolgten in zwei Parallelen Das Reaktionsgemisch zur spektralphotometrischen Quantifizierung der SH Gruppen wurde in einem Eppendorf Reaktionsgef 1 5 ml angesetzt und bestand aus 0 900 ul Pro be 300 ul Ellman Reagenz sowie zweifach destilliertem Wasser bis zu einem Endvolumen von 1500 ul Mischen erfolgte durch Sch tteln von Hand Als Nullwert wurde anstelle der Probe zweifach destilliertes Wasser verwendet Nach 30 Min Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Extinktion bei einer Wellenlange von 412 nm gemessen F r die Erstellung der Eichkurve Kap 3 3 4 diente Glutathion in einem Konzentrationsbereich zwischen 0 mM und 0 1221 mM entsprechend 0 37 5 ug Die Sulfhydrylgruppen wurden als Schwefel SH S gemessen Es
33. Anhang ai KZ ki e N kg o N Gruppe 3 P frequentans KH Wald ub en S a Z o E 4 Polymere 1 Nutzung 0 o S 5 LA 3 S x bai e s O x 5 a Z s z i o 5 ij e Ay a a 4 9 O D z i lt s o a ub unbelastet Hofbildung Wachstum 143 Anhang ai ki e E Wi Su S S S lt x ES o EI Q 2 gt i en S a Z o E Polymere 1 Nutzung 0 o S 5 3 S x bai e bai D O x 5 a Z s z i o 5 ij e Fr a a 4 9 O D z i lt s a ES ub unbelastet Hofbildung Wachstum 144 Anhang Acker wb Gruppe 1 nigricans 20 Isolate on 3 5 Z o E Hofbildung Wachstum Aromatische S uren 1 Nutzung 0 wenig belastet Ze 2 Ez X 2 S lt oO z oO ea Q N lt g S lt E QO ea
34. Der geringe Nahrstoffgehalt des Fadenagars lief die Auskeimung der Sporen und ein konfluentes kryptisches Wachstum zu Nach 24 h wurden auf die so herangezogenen Pilz kulturen etwa 0 5 cm x 0 5 cm gro e Substratst cke sieben je Platte ausgelegt Diese waren vorher aus den Agarplatten ausgeschnitten worden deren Herstellung in Kapitel 2 1 3 2 be schrieben wurde Als Kontrollst ck wurde in jeder Plattenmitte ein St ck Mineralsalzagar gereinigter Agar ausgelegt Lediglich mit dem Substrat Tannin wurde abweichend verfah Material und Methoden 34 ren F r den Test mit diesem Substrat wurde ein Medium in herk mmlicher Weise bereitet Tab 9 und mit vier Myzelst cken je Agarplatte beimpft Bei diesem Substrat wurde wie bei 4 Methoxycinnamat Wachstum und Aufklarung des Mediums bonitiert Der Test wurde nach einer 14 t gigen Inkubation bei 25 C ausgewertet Die Daten dienen der Absch tzung der katabolischen Vielseitigkeit auf der Organismenebene Kap 2 2 4 2 2 3 2 Untersuchungen zur Toleranz Resistenz von Pilzen 2 2 3 2 1 Abschatzung von Wachstum und relativer Biomassebildung Wie unter Kapitel 2 2 2 1 3 dargelegt beruhte die Charakterisierung der Pilzisolate u a auf der Erfassung des linearen Wachstums durch Bildanalyse Diese Messungen konnten auch bei Belastung der Testmedien mit Schwermetallen durchgef hrt werden so dass die Re duktion des Langenwachstums der Pilze infolge Schwermetallstress relativ einfach und genau
35. Einfluss von Schwermetallen auf lineares Wachstum und relative Biomasse bei Penicillium fellutanum und Penicillium nigricans Zur Ermittlung des Einflusses von Schwermetallen auf das lineare Wachstum von Pe nicillien wurden etwa 40 Isolate von P fellutanum aus unbelastetem Waldboden und belaste tem Haldenboden auf N hrb den zunehmender Schwermetallkontamination CuSO u ZnSO geimpft Der t gliche Zuwachs mm d wurde bildanalytisch bestimmt Wie die Ta belle 34 zeigt wurden neben der Kontrolle 0 f r Kupfer die Konzentrationen 4 mM und 8 mM und f r das weniger toxische Zink die Konzentrationen 7 mM und 15 mM getestet Ohne Schwermetallkontamination des Mediums wuchsen die Isolate aus Waldboden n 40 im Durchschnitt etwas schneller 3 83 0 45 mm d als die aus Haldenboden n 41 3 56 0 19 mm d Auch die mittlere Abweichung von der durchschnittlichen Wachstumsrate der Pilze war im Waldboden 0 45 3 83 0 117 gr er als im Haldenboden 0 19 3 56 0 053 Aufgrund des schon in Kapitel 3 2 1 1 Gesagten Tab 25 Abb 16 u 17 l sst eine hohe Vari abilit t des Wachstums auf eine hohe Diversit t schlie en Demnach muss P fellutanum im unkontaminierten Waldboden eine gr ere innerartliche Diversit t aufweisen als im kontami nierten Haldenboden Eine h here Variabilitat der Isolate aus Waldboden war auch noch zu erkennen wenn die Testmedien mit 4 mM und 8 mM Cu bzw 7 mM Zn kontaminiert wa ren Mit zunehmende
36. Feuchtbiomasse bei dem offensichtlich kupfersensitivsten Isolat W165 aus Waldboden der vier Testisolate von P fellutanum in Fl ssigkultur mit zwei verschiede nen Kupferkonzentrationen n 1 Bei einer Konzentration von 1 5 mM Kupfer wurde die station re Wachstumsphase eher erreicht und insgesamt weniger Feuchtbiomasse gebildet als bei 1 mM Kupfer Auch der geeignete Zeitpunkt der Myzelernte wurde in einem Vorversuch ermittelt Hierzu wurden mehrere Parallelen eines Isolats von P fellutanum in 150 ml unbelasteter Fl ssigkultur angezogen Zwischen zwei und sieben Tagen Inkubation wurden pro Tag drei Parallelen geerntet und ihre Feuchtbiomasse bestimmt Wie aus der Abbildung 23 zu entneh men ist lag nach drei Tagen Inkubation gen gend Feuchtbiomasse vor und die Kultur war noch nicht zu alt da die station re Wachstumsphase in der es bereits zu Ver nderungen in der Zusammensetzung der Zellbestandteile kommen kann zu diesem Zeitpunkt noch nicht erreicht war Die Analyse von Ans tzen mit relativ toleranten resistenten Pilzen und gering gestressten sensitiven Pilzen erfolgte daher in der Regel nach drei Tagen Inkubation Nur An s tze mit sensitiven Isolaten bei den beiden h chsten Kupferkonzentrationen wurden nach f nf Tagen analysiert Ergebnisse 90 16 14 12 2 2 10 5 6 9 9 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Tage der Inkubation Abb 23 Bildung von Feuchtbiomasse bei P fellutanum in 150 ml unbelasteter Fl
37. Haldenboden aus Tonschiefer und Grauwacke der Schachtanlage Ortiliae in Clausthal Zellerfeld 51 48 3 N 10 19 8 O Letzterer wurde mikrobiologisch schon von Burkhardt et al 1993 untersucht Die Bodenproben entstammen der Rhizosph re von Deschampsia flexuosa L Trin Gramineae Schmeil und Fitschen 1982 Ein lehmiger Kontrollboden mit hnlich niedrigem pH Wert Tab 3 war nicht aufzufinden Der niedrige pH Wert des lehmigen Hal denbodens ist auf einen hohen Anteil an Sulfiden im Ausgangsgestein zur ckzuf hren Material und Methoden 13 Die abiotischen Parameter und Schwermetallgehalte der B den sind in den folgenden Tabel len 3 und 4 zusammengestellt Tab 3 Abiotische Bodenparameter Bodenpaar I Bodenpaar Parameter Acker ab Ackerb Waldub Haldeb Corg 0 79 1 38 n b n b N 96 0 08 0 13 n b n b pH 1 N KCI 6 02 5 27 3 35 3 43 H20 14 8 16 6 16 37 Bodenpaar I Ackerb den aus Kl rschlammversuch wb wenig belastet b belastet Schlammgaben 300 m ha FlieBbach et al 1994 Bodenpaar II Naturb den ub unbelastet b belastet n b nicht bestimmt Tab 4 Schwermetallgehalte der Versuchsb den mg kg Bodenpaar I Bodenpaar II Schwermetall SM Acker wb Ackerb Waldub Haldeb Cu 15 2 99 5 1 3 42 2 Zn 48 2 345 2 8 3 160 Ni 6 1 21 7 2 3 30 7 0 2 2 6 0 1 0 2 Pb n b n b 5 1 3037 8 Summe SM gerundet 70 469 17 3271
38. Man 34 Nicotinat Nic 22 Phenylacetat Phac 36 Phenylalanin Phal 40 Phthalat Phth 30 p Toluat pTol 36 Terephthalat Ter 30 Veratrat Ver 38 Ausschlie lich als Substrat f r Nutzungstests mit Einzelisolaten und zur Bestimmung aromatenspezifischer Vermehrungseinheiten CFU verwendet Ausschlie lich zur Bestimmung aromatenspezifischer Abbauzeiten in Bodenproben verwendet Material und Methoden 17 2 1 3 2 Polymere Tab 11 F r Substratnutzungstests verwendete Polymere und hydrophobe Substanzen Polymer Hydrophobe Substanz Abk rzung Beschreibung Substratmenge in 20 ml Mineralsalzagar pH 6 0 Carragenin Cellulose Avicel Celluloseacetat Chitin Sp ne Dextran Gellan Keratin gemahlen Lecithin Ligninsulfons ure Ca Salz Manutex RH Paraffin Rhamsan Tannin Xanthan Xylan Car Cel Celac Chi Dex Gel Ker Lec Manu Par Rha Tan Xan Xyl Galactan aus Rhodophyceen Polysaccharid Glukose Cellulose mit Acetylgruppen 40 Polysaccharid N Acetyl glucosamin Polysaccharid Leuconostoc Spp Heteropolysac charid Auro monas elodea Fibrill res Protein Phosphatidyl cholin Fett s urepolymer Phenylpropan grundk rper des Lignins in Pro panseitenkette sulfoniert Polysaccharid Na Alginat Alkan Polysaccharid Alcaligenes Polyphenol Polysaccharid Xanthomonas campestris Polyose aus Xylopyranosen u anderen Pe
39. Notwendigkeit f hrt dazu dass beim Vorgang des Clusterns nicht generell Arten identifiziert werden k nnen sondern vielmehr Bildtypen unter schieden werden die aber berwiegend Arten darstellen Bei der Suche nach einer geeigneten Clusterebene ist die Tatsache zu ber cksichtigen dass in Stichproben aus mikrobiellen Gemeinschaften in der Regel nur wenige Arten in gro er Zahl auftreten relativ viele Arten dagegen oft nur durch ein Individuum vertreten sind so dass die evenness der Artenverteilung einen Wert lt 1 annehmen muss Eine evenness von 1 erg be sich dagegen wenn die Daten der in der Abbildung 12 dargestellten Pilze auf einer hnlichkeitsstufe von 99 95 d h auf der Ebene der Tripletts geclustert w rden Die Grup pe der drei zu P fellutanum geh renden Isolate w re in diesem Fall zerschnitten Es lag nahe die evenness der Verteilung von Bildtypen wie sie sich in einem Dendrogramm in Abh ngig keit der verschiedenen Distanzstufen ergibt zu untersuchen Da die Distanz in Dendrogram men kein Kontinuum darstellt sondern von den Knotenpunkten abh ngt wurden in einem Dendrogramm der Bilddaten von Isolaten aus belastetem und wenig belastetem Boden f r bestimmte Knoten Zahl und Gr e der entsprechenden Bildtypen abgelesen und daraus die zugeh rige evenness berechnet Die Abbildung 15 zeigt dass die evenness mit zunehmender relativer Distanz drei Minima aufweist Von diesen erf llt nur das erste e 0 92 bei einer rela
40. Produkt die relative Biomasse in gleichem Ma e abnahm Abb 20 c Da auch die Durch schnittswerte f r die relative Biomasse bei den St mmen aus Acker wb und Acker b mit zu nehmender Kupferkontamination des N hrbodens mit gleicher Rate abnahmen kann man davon ausgehen dass sich trotz der st rkeren Belastung im Acker b noch keine Tole ranz Resistenz gegen ber Schwermetallen entwickelt hatte Anders scheinen die Verh ltnisse in den Naturb den zu sein Hier waren die Variati onskoeffizienten f r Kolonieflache und Koloniedichte der 20 Isolate von P fellutanum aus Haldenboden auf dem unkontaminierten N hrboden gr er als bei den Isolaten aus Waldbo den Im Gegensatz zu P nigricans weist dies auf eine etwas h here Diversit t der Isolate aus belastetem Haldenboden gegen ber den Isolaten aus unbelastetem Waldboden hin Der groBe Unterschied zu P nigricans besteht vor allem darin dass die Koloniedichte bei Kupferstress mit geringerer Rate abnahm als die Kolonieflache wenn dieser Effekt bei den Isolaten aus Waldboden auch weniger ausgepr gt war als bei den Isolaten aus Haldenboden Abb 21 a u b Daraus ergibt sich f r die relative Biomasse eine st rkere Abnahme bei den Waldisolaten und folglich eine geringere Toleranz Resistenz als bei den Haldenisolaten Abb 21 c Ergebnisse 86 9 Acker wb E Acker b Ki e 5 24 0 0 5 1 0 1 5 Kupfer im N hrboden mM 1 2
41. abgeleiteten Variati onskoeffizienten konnten vorhandene Unterschiede in der durchschnittlichen Wuchsleistung der Pilzgemeinschaften je nach ihrer Herkunft quantifiziert werden Tab 25 Das durch schnittliche Wachstum der Pilze nahm dabei in der Reihenfolge Acker wb gt Wald ub gt Diskussion 104 Halde b gt Acker b ab wobei nicht alle Unterschiede gesichert waren Die Variabilit t des Wachstums und damit auch seine Diversitat erkennbar am mittleren Variationskoeffizienten nahm in der Reihenfolge Acker wb gt Acker b gt Wald ub gt Halde b ab Auch hier waren nicht alle Unterschiede gesichert Grunds tzlich sind f r das beobachtete Ph nomen zwei Erkl run gen m glich entweder ndern sich die einzelnen Pilzarten unter dem Schwermetalleinfluss im Boden so stark dass sie auch im Test ohne Schwermetalle langsamer wachsen oder es kommt bei weitgehend konstanter Wuchsleistung der Arten zu einer Verschiebung im Artenspektrum Durch Vergleich zweier Bildtypen die aufgrund taxonomischer Bestimmung den Arten Peni cillium nigricans und P fellutanum angeh rten Tab 31 erwies sich die erste Alternative als weitgehend gegenstandslos Isolate dieser Arten aus belasteten B den wuchsen nicht langsa mer als solche aus unbelasteten B den Dagegen kann das geringere durchschnittliche Wuchspotential der Pilze aus belaste tem Acker im Vergleich zu den Isolaten aus wenig belastetem Acker damit erkl rt werden dass Stress physiol
42. den nicht zu gesicherten Unterschieden Auffallend ist dass die Variationskoeffizienten der Bildtypenzahlen in den jeweils unbelasteten Varian ten der beiden Bodenpaare etwas mehr als doppelt so hoch sind wie die der belasteten Varian ten Ergebnisse 70 Tab 26 Einfluss von Schwermetallen auf die Zahl der Bildtypen in jeweils 125 Pilzisolaten aus zwei Bodenpaaren LSD p 0 05 n 3 Zwischen den jeweiligen Belastungsstufen der Bodenpaare waren die Unterschiede nicht signifikant jedoch zeigte der Variationskoeffizient der Zahl der Bildtypen deutliche Unterschiede an Die Bildanalysedaten aller Isolate befinden sich im Anhang unter 7 3 s beiliegende CD Acker ab Ackerb Waldub Halde b Versuch 1 Anzahl Isolate 132 142 126 129 Zahl der Bildtypen 125 Isolate 43 282 34 962 29 924 25 715 Versuch 2 Anzahl Isolate 141 137 133 132 Zahl der Bildtypen 125 Isolate 41 334 38 141 30 360 23 829 Versuch 3 Anzahl Isolate 146 135 141 135 Zahl der Bildtypen 125 Isolate 31 345 33 455 40 964 28 307 Versuche gesamt Anzahl Isolate 419 414 400 396 Zahl der Bildtypen 125 Isolate 38 654 35 519 33 750 25 950 6 404 2 393 6 252 2 248 Variationskoeffizient SD MW 0 166 0 067 0 185 0 087 Bodenpaar I wb wenig belastet b belastet Bodenpaar II ub unbelastet b belastet Mittelwert MW mit Standardabweichung SD aller drei Versuche 3 2 2 Einfluss von Schwermetallen auf die k
43. der Bilddaten der 29 in der Tabelle 12 auf gef hrten verschiedenfarbigen Vergleichsst mme von Pilzarten sowie einen Ausschnitt dar aus Bildanalysedaten im Anhang unter 7 2 W hrend sich die Gesamtansicht des Dendrogramms ber eine Distanz von 0 800 erstreckt Abb 12 a beschr nkt sich der Aus schnitt auf den Distanzbereich von 0 1 Abb 12 b Alle Pilze wurden in drei Parallelen kulti viert und analysiert Wie erwartet werden im Dendrogramm bis auf Pf a und Pf b Penicilli um fellutanum alle St mme als Tripletts wiedergegeben Abb 12 b wobei die Distanz beim Stamm An Aspergillus niger maximal 0 4 betr gt entsprechend einer hnlichkeit von we nigstens 99 95 Bei zwei der drei Isolate von P fellutanum scheint die oben angedeutete Durchmischung vorzuliegen weil die Tripletts von Pf a und Pf b im Dendrogramm nicht von einander getrennt wurden Isolat Pf c scheint dagegen ein von beiden abweichender Typ zu sein da er als Triplett dargestellt wird Aus der Tatsache dass die anderen 27 St mme bzw Isolate als Tripletts auf sehr hoher Ahnlichkeitsstufe entsprechend einer geringen Distanz erscheinen kann geschlossen werden dass die Gesamtheit der in der Bildanalyse eingesetzten Messparameter auch beim Kameraabstand von 36 cm ausreichend differenzierende Daten liefert Da 27 von 29 Pilzen als Tripletts wiedergegeben werden kann von einer Trefferquote von mindestens 93 1 ausgegangen werden Unter der Voraussetzung dass die beid
44. dichte allein Flache Pilz Nr Kupfer im N hrboden mM 0 1 2 4 mm H248 393 8 209 7 116 0 54 8 H275 462 2 273 8 162 1 54 7 W370 383 5 216 7 47 0 12 2 W378 508 7 247 7 49 5 14 5 relativ H248 1 0 533 0 295 0 139 275 1 0 592 0 351 0 118 W370 1 0 565 0 123 0 032 W378 1 0 487 0 097 0 029 Mean Gray unbeimpfte Petri 239 5 231 2 227 9 220 2 schale n 10 0 5 2 4 1 7 4 4 beimpfte H248 40 30 20 41 Petrischale H275 42 33 31 45 W370 40 146 191 195 W378 39 125 196 200 Extinktion Differenz zwischen H248 199 5 201 2 207 9 179 2 unbeimpft H275 197 5 198 2 196 9 175 2 und W370 199 5 85 2 36 9 25 2 beimpft W378 200 5 106 2 31 9 20 2 relativ H248 1 1 009 1 042 0 898 H275 1 1 004 0 997 0 887 W370 1 0 427 0 185 0 126 W378 1 0 530 0 159 0 101 Relative Biomasse Produkt aus H248 1 0 537 0 307 0 125 relativer Flache H275 1 0 595 0 350 0 105 und W370 1 0 241 0 023 0 004 relativer Extinktion W378 1 0 258 0 015 0 003 Ergebnisse 65 3 2 Wirkung von Schwermetallen auf Bodenpilze auf der Gemeinschaftsebene 3 2 1 Wirkung auf die Diversitat von Pilzgemeinschaften 3 2 1 1 Verteilung der Wuchsleistungen von Pilzen in Acker und Naturb den Die Erfassung der Bilddaten aller Pilzisolate schloss die Bestimmung ihres linearen Wachstums ein Bildanalysedaten im Anhang unter 7 3 s beiliegende CD Es lag daher na he m gliche Unterschiede zwischen den vier Pilzgemeinschaften auch hinsichtlich des
45. die mikrobielle Diversit t haben auch Predatoren und Parasiten z B Protozoen durch deren Akti vit t vor allem h ufige Bakterien und Pilzarten dezimiert werden Wild 1995 Bei fortdauernder Einbringung einseitiger C Quellen z B in Monokulturb den ist ein R ckgang der Mikroorganismenvielfalt zwar noch nicht direkt beobachtet worden jedoch deu tet die Steigerung der Biomasseatmung Anderson und Domsch 1990 auf eine solche Ver nde rung hin Das Gleiche ware bei lang andauerndem Energiemangel zu erwarten entsprechend Einleitung 3 ihrer unterschiedlichen berlebensstrategie w rden Organismen mit den h chsten Anspr chen an Qualit t und Konzentration von C Quellen als erste aus einer Lebensgemeinschaft ver schwinden Unterst tzt wird diese These durch Degens et al 2000 die fanden dass Mangel an verf gbarem Kohlenstoff im Boden zu einer reduzierten katabolischen Diversit t in Mikroorga nismengemeinschaften f hrt Eine Reduktion der Artenvielfalt ist auf jeden Fall zu erwarten wenn die Intensitat bzw Konzentration physikalischer und chemischer Faktoren ber den jeweils optimalen Bereich der einzelnen Arten hinausgeht d h wenn die Organismen gestresst sind Atlas 1984 Odum 1985 Stress wird u a hervorgerufen durch zu hohe Strahlung z B Temperatur oder zu hohe Protonen bzw Schwermetallkonzentrationen in der Bodenl sung Schwermetalle k nnen an Sulfhydryl SH Gruppen von Enzymen andocken Proteins
46. die Bestimmung wurden die Proben in 100 ml PE Flaschen berf hrt Die Gehalte an Ni Cu Pb und Cd des Waldbodens sowie Cd des Hal denbodens wurden ber Graphitrohrtechnik AAS die Gehalte an Ni Cu Pb und Zn des Hal denbodens sowie Zn des Waldbodens ber Flammentechnik AAS ermittelt Die Extraktions gehalte der Schwermetalle wurden in mg ausgegeben 2 2 2 Untersuchung von Pilzgemeinschaften Diversitat und Leistungsfahigkeit 2 2 2 1 Abschatzung der Diversitat 2 2 2 1 1 Vorbehandlung von Bodenproben f r mikrobiologische Untersuchungen Nach der Entnahme Tab 13 wurden die Bodenproben so angetrocknet dass sie leicht zu sieben waren Dazu wurden Kunststoffsiebe der Maschenweite 4 mm verwendet Nach Sieben Homogenisieren pH und Feuchtigkeitsbestimmung wurden sie in Kunststoff beutel mit Wattestopfen zur Sicherstellung gen genden Gasaustauschs etwa acht Wochen bei Raumtemperatur ca 20 C vorinkubiert Wie noch unver ffentlichte Ergebnisse Wenderoth und Reber zeigen bewirkt diese Aquilibrierung eine Art Klimaxstadium bei dem leicht ver f gbare Substrate abgebaut sind die substratinduzierte Atmung SIR substrate induced re spiration einen Minimalwert und katabolische Vielseitigkeit sowie Diversit t der Bodenmik roorganismen einen Maximalwert erreicht haben Dieser Zustand der nach 4 8 Wochen Inku bationszeit eintritt ist f r Diversit tsanalysen und bodenphysiologische Tests wegen seiner Material und Methoden
47. die Varianz des Farbparameters Mean Density der Kolonieunterseite MP19 dage gen nur zu 32 95 Die hier durchgef hrte Evaluierung der Messparameter f rdert dar ber hinaus das Verst ndnis der Hauptkomponentenanalyse in der Abbildung 10 Es ist zu erken nen dass die vier am besten unterscheidenden Parameter MP1 MP6 MP14 u MP15 alle der Parametergruppe III angeh ren die am st rksten mit der zweiten Hauptkomponente y Achse korreliert ist w hrend die weniger gut unterscheidenden Parameter mit der ersten Hauptkomponente x Achse korreliert sind Es wird auch deutlich dass die aufgrund der Hauptkomponentenanalyse als relativ schlecht zu bewertenden deckungsgleichen bzw eng benachbarten Parameter wenigstens mit etwa einem Drittel der Varianz ihrer Messwerte zur Unterscheidung der Pilze beitragen und auf keinen Fall weggelassen werden d rfen Ergebnisse 58 Tab 23 Berechnung der Unterscheidungskraft der 20 in der Bildanalysemethode eingesetzten Messparameter MP Kap 2 2 2 1 3 aus den jeweils 19 m glichen Korrelationen Grundlage sind die Daten der in der Tabelle 12 genannten 29 Pilzst mme bzw Isolate Bildanalysedaten im Anhang unter 7 2 Die am schlechtesten differenzierenden Parameter weisen immerhin eine Unterscheidungskraft von ber 30 auf und d rfen daher nicht weggelassen werden max 2Kor Unterscheidungs Messparameter Exo Unkorreliertheit kraftparam 96 1 2 24 16 76 88 21 6 2 95
48. different cropping histories Soil Biology and Biochemistry 22 251 255 Anderson TH Domsch KH 1993 The metabolic quotient for gCO as a specific ac tivity parameter to assess the effects of environmental conditions such as pH on the mi crobial biomass of forest soils Soil Biology and Biochemistry 25 393 395 Anderson TH Domsch KH 1994 Stoffwechselkoeffizienten mikrobieller Sekund rprodu zenten Verhalten und Entwicklung der mikrobiellen Biomasse in Waldstandorten In Stabilit tsbedingungen von Wald kosystemen Teil B Berichte des Forschungszentrums f r Wald kosysteme G ttingen Reihe B 37 146 156 Andrews JH 1984 Relevance of r and K theory to the ecology of plant pathogens In Cur rent perspectives in microbial ecology Klug MJ Reddy CA Hrsg American Society of Microbiology Washington DC 1 7 Arnebrant K Baath E Nordgren A 1987 Copper tolerance of microfungi isolated from polluted and unpolluted forest soil Mycologia 79 890 895 Atlas RM 1984 Use of microbial diversity measurements to assess environmental stress In Current perspectives in microbial ecology Klug MJ Reddy CA Hrsg American Soci ety of Microbiology Washington DC 540 545 Baldrian P 2000 Effect of heavy metals on the growth and biodegradative abilities of wood rotting fungi PhD Thesis Charles University Prague Literaturverzeichnis 119 Barkay T Tripp SC Olson BH 1985 Effect of metal rich
49. erfolgten immer mit der h chsten Kameraposition 68 cm bei der die Petrischale als Ganzes auf dem Monitor bzw Messfeld abgebildet war Diese Position war durch den Abstand zwischen Frontlinse des Objektivs und der Agaroberfl che definiert F r die Farbmessungen hatte es sich als sinnvoll erwiesen jedes Pilzisolat als gro formatiges Portrait darzustellen um m glichst genau Details der Morphologie und der Farbgebung bild analytisch erkennen zu k nnen Hierf r wurde eine mittlere Kameraposition von 36 cm ge wahlt Die mittlere Kameraposition stellte fiir die Farbmessung einen Kompromiss dar weil eine Abh ngigkeit der Licht bzw Farbqualit t vom Kameraabstand festgestellt wurde so dass Isolate gleicher Arten im Grenzbereich zweier Kameraabst nde nicht als identisch er kannt w rden Au erdem war nur in dieser Position gew hrleistet dass auch bei kleinen Ko lonien Strukturen noch gut zu erkennen waren Da gro e oder ausgewachsene Pilze nur ohne den u eren Randbereich der Kolonie aufgenommen werden konnten wurden diese zus tz lich mit der oberen Kameraposition aufgenommen Material und Methoden 29 Vermessung optisch dichter Pilze Optisch dichte Pilze sind im Durchlicht leicht vor dem hellen Hintergrund des N hrbodens zu erkennen und daher bildanalytisch auch einfach zu vermessen Vor der eigentlichen Vermessung ist es notwendig das zu vermessende Objekt zu segmentieren Die sogenannte Segmentierung trennt durch Aufl
50. f r eine etwaige visuelle berpr fung von Datenclustern der mittlere Kameraabstand der am besten geeignete ist Das Clusterergebnis der Bildanalysedaten der 20 sich in ihrem Grauwert unterschei denden Pilze zeigen die Dendrogramme in den Abbildungen 9 11 Es ist zu erkennen dass sich die drei Dendrogramme hinsichtlich Zusammensetzung der Cluster Reihenfolge bzw Anordnung der Isolate und Distanz nur geringf gig voneinander unterscheiden Beispielswei se ist die Distanz im Dendrogramm der mit einem Kameraabstand von 17 cm vermessenen Pilze etwas geringer als bei den beiden anderen Dendrogrammen Zwischen den mit einem Kameraabstand von 68 cm und 36 cm erstellten Dendrogrammen ist auch die Ahnlichkeit bez glich der Anordnung der Isolate gr er da das Isolat P16 nur in dem mit einem Kamera Ergebnisse 51 Tab 22 Durchschnittswerte farbparameterspezifischer Variationskoeffizienten bei drei Ka meraabst nden Berechnungsgrundlage bildeten 20 sich in ihrem Grauwert unterscheidende Pilze die in den 19 in dieser Arbeit eingesetzten Farbparametern Kap 2 2 2 1 3 bei allen drei Kameraabst nden vermessen wurden Bildanalysedaten im Anhang unter 7 1 Der Durchschnittswert der fiir eine visuelle Uberpriifung von Datenclustern wichtigen eigentli chen Farbparameter ist beim mittleren Kameraabstand am gr ten Kamera DW aller DW der VK der Parameter DW der VK der Parameter abstand cm 19 VK F1 F4 u F9 F12 F5 F8 u F13 F1
51. ih rer jeweiligen Standardabweichung scheint Schwermetallstress keinen Einfluss auf die Ver teilung von Abbaufahigkeiten in den beiden Bodenpaaren auszutiben Dagegen lieBen sich Unterschiede zwischen den Bodenpaaren erkennen sowohl die evenness als auch die katabo lische Vielseitigkeit war bei den Gemeinschaften aus Ackerb den signifikant h her als aus Naturb den Diese Aussage wird durch eine Clusteranalyse der in den Tabellen 27 und 28 dargestellten relativen Nutzungsh ufigkeiten unterst tzt Die Abbildung 18 zeigt ein Dendro gramm in dem die beiden Bodenpaare auf einer hohen Distanzstufe voneinander getrennt sind Die relativ groBe Ahnlichkeit zwischen den Belastungsstufen jedes Bodenpaars erkenn bar an der Tatsache dass die drei zu einem Boden durchgef hrten Versuche keine deutlich getrennten Tripletts bildeten best tigt die jeweils geringe Schwermetallwirkung e 3 E20 28 PE lt lt lt lt lt lt Z Z Z 0 20 40 S S 60 a 80 100 120 Abb 18 Ahnlichkeit in der katabolischen Vielseitigkeit zwischen den Acker und Naturb den basierend auf der relativen Verteilung aromatenspezifischer Vermehrungseinheiten CFU s Tabellen 27 u 28 Distanz 0 totale Ahnlichkeit Beide Bodenpaare sind auf einer hohen Distanzstufe getrennt Bodenpaar I Ackerb den A wb wenig belastet b belastet Bodenpaar II Wald W und Haldenboden H ub unbelastet b belastet Ergebnisse 75
52. kommt bei dem die Gefahr einer ber bzw Unterbelichtung wahr scheinlich wesentlich eingeschr nkt ist Daher war experimentell zu untersuchen ob und wel che Nachteile sich eventuell aus der Verwendung nur eines mittleren Kameraabstands ergeben und zu entscheiden ob diese akzeptiert werden k nnen Ein Problem stellte zun chst die Abbildbarkeit der Kolonien dar Da mit dem Kamera abstand von 68 cm der gesamte Durchmesser der Petrischalen abgebildet werden konnte galt dies auch f r die zum Zeitpunkt der Bildaufnahme 7 d nach Animpfen ausgewachsenen Pilze Bei Aufnahme mit dem mittleren Kameraabstand von 36 cm war aber nur ein Kolonie durchmesser von bis zu 48 mm vollst ndig abbildbar Da in dieser Arbeit die Wachstumsraten aller Pilze bestimmt wurden Abb 8 lie sich der Anteil der Pilze absch tzen die nach der festgesetzten Bebr tungsdauer von sieben Tagen den kritischen Koloniedurchmesser von 48 mm berschritten hatten Dies waren Pilze einer t glichen Wachstumsrate gt 6 86 mm Aus den Daten der Abbildung 8 lie sich entnehmen dass nur 70 von 1629 betrachteten Pilzisola Ergebnisse 47 Tab 19 Auswirkungen des Kameraabstands auf vier Farbparameter Kap 2 2 2 1 3 bei Vermessung verschiedener Farbtesttafeln Mit geringerem Kameraabstand nehmen die Farb messwerte ab Farbtesttafel Kameraabstand Mean Gray Mean Red Mean Green Mean Blue rot 68 53 157 4 0 36 49 148 0 0 17 40 122 0 0 gr n 68 94
53. liegen also achsennah Durch die Nahe zu den beiden Achsen wird nicht nur die Korrelation der Parameter zu den beiden Hauptkomponenten hergestellt sondern auch die Korrelation der Messparameter untereinander ausgedr ckt Die Abbildung 13 zeigt dass die 20 Messparameter berwiegend achsennah sowie kreisf rmig angeordnet sind Dar ber hinaus lassen sich drei Gruppen von Parametern erkennen eine rechts der y Achse I eine links davon II sowie eine oberhalb der x Achse III Gruppe I enthalt Parameter f r die Verteilung von Farben und Helligkeit MP7 MP9 u MP16 MP20 Gruppe II bilden eigentli che Farparameter MP2 MP5 u MP10 MP13 und in Gruppe III sind weitere Parameter f r die Verteilung von Farben und Helligkeit mit dem linearen Wachstum zusammengefasst MP1 MP6 MP14 u MP15 Innerhalb der Gruppen I und II liegen einige Parameter ber einander bzw dicht nebeneinander Dies bedeutet dass diese Parameterpaare MP8 u MP9 MP17 u MP19 MP18 u MP20 bzw MP2 u MP4 MP10 u MP12 nicht nur sehr hoch mit einander korreliert sind sondern auch jeweils eine fast identische Unterscheidungskraft haben m ssen Eine weitergehende Information bez glich der Unterscheidungskraft der 20 Messpa rameter ist der Hauptkomponentenanalyse nicht zu entnehmen so dass zus tzliche Untersu chungen n tig sind Zur Evaluierung jedes einzelnen Messparameters wurde die jeweils zuge h rige Datenreihe aus der Bildanalyse mit den Datenreihen der 19 ve
54. r Bakterien nicht mehr lohnt Verlustmutanten h tten sogar einen kologischen Vorteil weil sie z B nach Plasmidverlust nicht mehr zur Synthese der entsprechenden Abbauenzyme gezwungen w rden und dadurch schneller wachsen k nnten Bowater et al 1996 Modi et al 1991 Reber und Wenderoth 1997 Der Verlust von F higkeiten zur Nutzung bioenergetisch ung nstiger Substrate k nnte somit ein Toleranzmecha nismus sein und urs chlich mit dem berleben der Bakterien unter Stress und damit auch mit ihrer Diversit t zusammenh ngen Es war anzunehmen dass zunehmender Schwermetallstress auch bei Pilzen zu einer Versch rfung ihrer energetischen Situation f hren w rde und die einzelnen Arten darauf rea gieren w rden Da nicht ausgeschlossen werden konnte dass Pilze hnlich wie Bakterien mit einem Verlust katabolischer F higkeiten reagieren w rden war in dieser Arbeit ein Vergleich der katabolischen Vielseitigkeit von Pilzgemeinschaften und Arten aus schwermetallbelaste tem und unbelastetem Boden unerl sslich Denkbar war aber ebenfalls dass Pilze aufgrund ihrer gr eren Komplexit t auf den Verlust von Abbauf higkeiten zur Steigerung ihrer Schwermetalltoleranz nicht angewiesen sind und daher bekannte Mechanismen entwickeln bzw optimieren Auf jeden Fall war zu vermuten dass diese Mechanismen und ihre Ausbil dung bei einzelnen Arten unterschiedlich gut ausgepr gt sind mit der Folge dass es unter Stress zu Ver nderungen im
55. sewage sludge application on the bacterial communities of grasslands Applied and Environmental Microbiology 49 333 337 Beneke T Schwippert W 1999 WinSTAT f r Excel Benutzerhandbuch Birch HF 1958 The effect of soil drying on humus decomposition and nitrogen availability Plant and Soil 10 9 31 Bjornsen PK 1986 Automatic determination of bacterioplankton biomass by image analysis Applied and Environmental Microbiology 51 1199 1204 Blackburn N Hagstr m A Wikner J Cuadros Hansson R Bjornsen PK 1998 Rapid de termination of bacterial abundance biovolume morphology and growth by neural net work based image analysis Applied and Environmental Microbiology 64 3246 3255 Blagodatskaya EV Anderson TH 1998 Interactive effects of pH and substrate quality on the fungal to bacterial ratio and of microbial communities in forest soils Soil Biol ogy and Biochemistry 30 1269 1274 Bowater RP Rosche WA Jaworski A Sinden RR Wells RD 1996 Relationship between Escherichia coli growth and deletions of CTGCAG repeats in plasmids Journal of Mo lecular Biology 264 82 96 Bradford MM 1976 A rapid and sensitive procedure for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding Analytical Biochemistry 72 248 254 Brookes PC McGrath SP 1984 Effects of metal toxicity on the size of the soil microbial biomass The Journal of Soil Science 35 341 346
56. ssigkultur n 3 Nach drei Tagen Inkubation lag einerseits gen gend Feuchtbiomasse f r Aufschl sse vor andererseits war die station re Wachstumsphase noch nicht erreicht Die Erstellung von Eichkurven f r die Proteinbestimmung nach Bradford 1976 und die Bestimmung der Sulfhydryl SH Gruppen nach Ellman 1959 erfolgte gem Kapitel 2 2 3 2 2 F r die Proteinbestimmung wurden zwei Eichkurven verwendet um unterschiedli che Konzentrationsbereiche erfassen zu k nnen Die in den Abbildungen 24 und 25 gezeigten Eichkurven decken die Proteinkonzentration zwischen 100 1000 ug ml bzw 10 100 ug mI ab Ein Beispiel einer Eichkurve f r die SH Gruppenbestimmung durch das E man Reagenz zeigt die Abbildung 26 Wegen seiner Instabilit t musste das Reagenz nach drei Monaten erneuert und folglich auch die Eichkurve neu aufgenommen werden Ergebnisse 91 1200 1000 800 600 400 Protein ug ml 200 0 y 1387 7 58 373 0 9718 0 2 0 4 0 6 Extinktion bei 595 nm 0 8 Abb 24 Protein Eichkurve f r den Konzentrationsbereich 100 1000 ug ml 120 100 80 60 40 Protein ug ml W 20 y 71188 3x 3 7974 0 9938 0 02 0 04 0 06 0 08 Extinktion bei 595 nm 0 10 Abb 25 Protein Eichkurve f r den Konzentrationsbereich 10 100 ug ml Ergebnisse 92 0 14 0 12 0 2473 0 0013 0 9988 0 10 0 08 0 06 0 04 SH Gruppen
57. tierten Photonen bei Betrachtung eines Bildausschnitts nicht entsprechend vermehren son dern auf einen gr eren Teil der Bildebene Chipfl che verteilt werden Verd nnungseffekt so dass sich bei hellen Objekten der vorherrschende Farbanteil verst rkt Umgekehrt w rde bei einem gr eren Kameraabstand die Zahl der Photonen auf einen Bruchteil der Chipfl che Diskussion 100 konzentriert so dass das Objekt heller d h mit geringerem Farbanteil abgebildet wird Diese Tatsache hatte dazu gef hrt dass Isolate der gleichen Art bzw Farbgruppe deren Kolonie gr en im berschneidungsbereich zweier Kameraabst nde l gen ungewollt in zwei unter schiedliche Gruppen eingeteilt worden w ren Aus diesem Grund mussten Bilder von allen Pilzisolaten mit einem mittleren Kameraabstand 36 cm von Frontlinse des Objektivs bis Agaroberfl che aufgenommen werden Um sicherzustellen dass dieser Kameraabstand nicht eventuell zu Farbdaten mit wesentlich schlechterer Unterscheidungskraft f hrte wurden drei Kameraabst nde 68 gt 36 gt 17 cm in dieser Hinsicht verglichen Die Bestimmung von Kor relationen jeder der 19 farbparameterspezifischen Datenreihen mit den 18 verbleibenden Da tenreihen machte deutlich dass diese Bef rchtung unbegr ndet war Die Unterscheidungs kraft der Farbdaten des mittleren Kameraabstands war nur um etwa 5 schlechter zu beurtei len als die des kleinen Kameraabstands Tab 20 Als Vorteil des mittleren gegen
58. ub Halde b 0 Mos 0 05882 0 05000 0 05000 0 05000 0 04762 0 04348 0 04000 0 03846 0 03571 0 03030 0 02381 0 02632 0 01923 0 01852 0 01587 0 01449 0 01000 0 00787 0 00813 0 00000 0 TET 0 06349 0 05634 0 05333 0 04819 0 05063 0 04396 0 04040 0 03883 0 03361 0 02797 0 02878 0 02454 0 01896 0 01860 0 01702 0 01544 0 00911 0 00789 0 00802 0 00000 0 06283 0 06161 0 05299 0 05296 0 05027 0 04862 0 04669 0 00057 0 00246 0 00318 0 00280 0 00223 0 00515 0 04069 0 0 03811 0 03501 0 02984 0 02608 0 00095 0 00121 0 00169 0 02550 0 0 01953 3 0 01878 4 0 01626 0 01544 0 00992 0 00815 0 0 00814 4 0 00000 0 0 TUN 0 09524 0 11765 0 08000 0 18182 0 08000 0 03922 0 05405 0 03390 0 03077 0 02899 0 02899 0 00000 0 01626 0 00000 0 00000 0 01709 0 02817 0 01290 0 00000 0 00000 0 0 07407 0 08696 0 06452 0 07407 0 07407 0 03774 0 05128 0 02899 0 02817 0 02667 0 02817 0 00000 0 01481 0 00000 0 00000 0 01460 0 02469 0 01170 0 00000 0 00000 0 SE 0 08163 0 05195 0 05797 0 08163 0 07018 0 04938 0 04938 0 02920 0 03008 0 02484 0 02367 0 00000 0 01365 0 00000 0 00000 0 01509 0 02162 0 01347 0 00000 0 00000 0 07849 0 08365 0 08552 0 06750 0 11251 0 07475 0 04211 0 05157 0 03069 0 02967 0 02683 0 02694 0 00000 0 01491 0 00000 0 00000 0 01560 0 02483 0 01269 0 00000 0 00000 0 00261
59. und autochthoner Arten erkannt Wi nogradsky 1924 die Synonyme f r r und K Strategen sind Laut Alexander 1997 stellt sich in einer Mikroorganismengemeinschaft ein physiologisches Gleichgewicht steady state ein wenn die Biomasse einen ann hernd konstanten Minimalwert erreicht hat und der Anteil der K Strategen an der Gesamtgemeinschaft besonders hoch ist Der fr heste Zeitpunkt dieses Zu stands im Boden der sich an einem niederen Verh ltnis von Basalatmung zu glukoseinduzierter Atmung erkennen l sst Anderson 1994 ist nach Reber und Wenderoth 1997 optimal f r vergleichende Analysen der Diversit t von Mikroorganismengemeinschaften Der nach jeder Vegetationsperiode einsetzende sequenzielle Abbau von Pflanzenr ck st nden mit der Anreicherung schwer abbaubarer organischer Substanz und die damit einherge hende Organismensukzession weisen auf die positive Wirkung der C und Energiequellen f r die Artenvielfalt organotropher Mikroorganismen hin Die Einbringung einseitiger C Quellen in den Boden hat wahrscheinlich keine Wirkung auf die Vielfalt der Mikroorganismen Jedoch ist damit zu rechnen dass die Gleichm igkeit der Artverteilung evenness Pielou 1966 durch eine solche St rung kurzfristig abnimmt Mit der Abnahme der evenness w rde auch der Shan non Index der Diversit t das Produkt aus evenness und Logarithmus des Artenreichtums der Gemeinschaft Shannon und Weaver 1969 kleiner werden Einen positiven Einfluss auf
60. und diverser Laboreinrichtungen aussprechen Besonders m chte ich mich f r die entspannte und freundliche Arbeitsatmosph re sowie der stetigen Hilfsbereitschaft bedanken Der Arbeitsgruppe von Frau Dr C Scholz Seidel danke ich f r die Bestimmung der Schwer metallgehalte in den Versuchsb den Herrn Dr O Heinemeyer m chte ich f r die Behebung technischer Probleme an der Respi rometrieanlage danken Den Kolleginnen und Kollegen des Instituts f r Agrar kologie bin ich zu Dank f r die stete Hilfsbereitschaft und ein freundliches Arbeitsklima verpflichtet Herrn Dr S Draeger vom Institut f r Mikrobiologie der T U Braunschweig danke ich freundlichst f r die Bereitstellung und Bestimmung von Pilzst mmen Herrn Dipl Min D P tz der Firma Nikon GmbH D sseldorf m chte ich sehr f r den freundlichen Kundenservice bez glich der Bildanalyseeinrichtung danken Der Arbeitsgruppe Chemische Mikrobiologie von Herrn Dr W R Abraham der Gesellschaft f r Biotechnologische Forschung mbH GBF Braunschweig danke ich f r die M glichkeit jederzeit das Clusteranalysenprogramm Pirouette zur Datenauswertung nutzen zu d rfen Meinen Eltern m chte ich Dank sagen f r die jahrelange Unterst tzung jeglicher Art Diese Arbeit wurde im Rahmen des Projekts Re 290 12 1 zwei Jahre lang von der Deutschen Forschungsgemeinschaft DFG gef rdert Lebenslauf Angaben zur Person Name Geburtsdatum Geburtsort Ausbildung Schulischer Werdegang
61. wurden jeweils mindestens zwei Parallelen gemessen Material und Methoden 37 2 2 4 Bestimmung kologischer Indices Artenreichtum und Diversit t Nach Odum 1980 gibt es mehrere Indices f r die Vielfalt oder Diversit t von Mikroorganismengemeinschaften bzw Stichproben daraus Hier zu werden drei Indices des Artenreichtums 3 5 gez hlt Dies sind 5 1 GE S 4 4 _ 5 DAT 5 sowie der Shannon Index der allgemeinen Diversit t H 6 Shannon und Weaver 1969 H gt log B 6 wobei S Zahl der Arten Bildtypen N Zahl der Individuen Isolate und nj Zahl der Individuen je Art bzw Bildtyp 2 Bedeutungswert der Art In dieser Arbeit wurde der einfachste der drei Indices des Artenreichtums d3 verwen det da sich diese Werte durch die sogenannte rarefaction s u auf gleiche Individuenzahlen beziehen lassen und anschlieBend leicht gemittelt werden k nnen Dies ist weder mit den bei den anderen Indices des Artenreichtums noch mit dem Shannon Index m glich Rarefaction Da Isolierungen meist zu unterschiedlichen Isolat bzw Individuenzah len f hren ein Vergleich aber nur zwischen gleich gro en Stichproben sinnvoll ist m ssen die Artenzahlen in den verschieden gro en Stichproben auf dieselbe Individuenzahl bezogen werden Dies wird durch die sogenannte rarefaction Sanders 1968 Simberloff 1972 er reicht die in der haufigen Zufallsauswahl gleich groBer Unterstichprob
62. 12 8285 1 1010 Anhang 137 7 3 Bildanalysedaten von Pilzisolaten aus den Acker Bodenpaar D und Naturb den Bodenpaar II Die Bildanalysedaten von Pilzisolaten aus den Acker und Naturb den liegen aufgrund ihres gro en Umfangs nicht gedruckt vor sondern wurden in Form von Microsoft Word Dateien auf einer CD als Anlage beigef gt Dabei sind die Dateinamen den einzelnen Bodenstichpro ben wie folgt zugeordnet Bodenstichprobe Microsoft Word Datei Acker wbl Acker wb l doc Acker wb2 Acker wb 2 doc Acker wb3 Acker wb 3 doc Acker b1 Acker b l doc Acker bi Acker b 2 doc Acker b3 Acker b 3 doc Wald ubl Wald ub l doc Wald ub2 Wald ub 2 doc Wald ub3 Wald ub 3 doc Halde b1 Halde b 1 doc Halde bi Halde b 2 doc Halde bi Halde b 3 doc wb wenig belastet b belastet ub unbelastet 138 Anhang 7 4 Substratnutzungsspektren von Isolaten der Gattung Penicillium on g 2 o Polymere 1 Nutzung 0 Acker wb Gruppe 1 P nigricans 20 Isolate o R Ke 8 gt bai e e O x 5 a z bai z i o o a Ay bai LA A 4 9 O O ES z i E Z s o d i wenig belastet Hofbildung Wachstum wb 139 Anhang Acker b Gruppe 1 P ni
63. 1852 0 01471 0 00000 0 00000 0 05882 0 04762 0 04545 0 04167 0 05000 0 04348 0 03571 0 03704 0 03125 0 03448 0 03125 0 02778 0 02703 0 02564 0 02439 0 02439 0 02326 0 01786 0 01449 0 00000 0 00000 0 05833 0 04884 0 04581 0 04487 0 04418 0 04201 0 03593 0 03558 0 03449 0 03394 0 03322 0 02937 0 02667 0 02537 0 02492 0 02451 0 02392 0 01836 0 01515 0 00000 0 00000 0 00256 0 00211 0 00061 0 00555 0 00520 0 00180 0 00037 0 00197 0 00324 0 00149 0 00192 0 00210 0 00036 0 00145 0 00091 0 00076 0 00072 0 00044 0 00096 0 00000 0 00000 0 T 0 08000 0 04444 0 00000 0 06452 0 06061 0 04255 0 03509 0 03636 0 05714 0 02985 0 03922 0 05128 0 01325 0 01681 0 01835 0 01905 0 10526 0 00922 0 00000 0 13333 0 TAYE 0 08333 0 04167 0 00000 0 05263 0 05882 0 03846 0 03226 0 03226 0 04762 0 02778 0 03571 0 04545 0 01266 0 01613 0 01818 0 01923 0 11111 0 00654 0 00000 0 14286 0 SC 0 07692 0 04167 0 00000 0 05000 0 06250 0 04000 0 03333 0 03333 0 05000 0 02857 0 03704 0 04762 0 01639 0 01613 0 01818 0 01852 0 07692 0 00769 0 00000 0 12500 0 07244 0 08009 0 04259 0 00000 0 05572 0 06064 0 04034 0 03356 0 03399 0 05159 0 02873 0 03732 0 04812 0 01410 0 01635 0 01824 0 01893 0 09777 0 00781 0 00000 0 13373 0 00407 0 00321 0 00160 0 00000 0 00773 0 00184 0 00207 0 00143 0 00213 0 00496 0 00105 0 00177 0 0029
64. 2203 2 1965 209 247 231 151 134 70 6 4760 4 5224 0 4413 4 4372 0 4653 P20 244 249 247 235 0 10 1 0973 1 0742 224 252 248 174 127 58 10 6995 3 0367 1 0164 2 9450 1 0207 WK 0 262 0 270 0 239 0 278 1 271 0 563 0 797 0 794 0 171 0 114 0 154 0 312 0 043 0 828 0 779 0 623 0 658 0 627 0 615 IDW aller 19 VK 0 495 0 323 IDW der VK eigentlicher Farbparameter F1 F4 F9 F12 0 225 0 070 DW der VK der Parameter f r Verteilung von Farben und Helligkeit F5 F8 F13 F19 0 691 0 289 Abstand zwischen Frontlinse des Objektivs und der Agaroberfl che VK Variationskoeffizient SD DW wobei SD Standardabweichung DW Durchschnittswert Farbparameter der Kolonieoberseite Mean Gray F1 Mean Red F2 Mean Green F3 Mean Blue F4 Hue Typical F5 Mean Saturation F6 Mean Brightness F7 Mean Density F8 Farbparameter der Kolonieunterseite Mean Gray F9 Mean Red F10 Mean Green F11 Mean Blue F12 Hue Typical F13 Mean Saturation F14 Gray Variation F15 Mean Brightness F16 Bright Variation F17 Mean Density F18 Density Variation F19 Anhang 128 Kamera abstand Pilz Nr F1 F2 F4 F5 F7 F8 F9 FI2 F13 Fl4 Fl5 F16 F17 F18 F19 36 cm P1 164 174 172 149 127 24 5 6482 5 6496 159 186 172 120 135 61 9 3696 5 6613 0 2221 5 6666 0 2283 P2 174 202 179 142 145 47 5 5111 5 5044 102 157 119 33 140 175 9 3156 7 6072 0 2517 7 6076 0 2504 P3 182 207 186 1
65. 232 0 9 1 3269 1 3117 230 250 247 194 127 39 10 0108 2 4748 0 9783 2 3855 0 9760 P5 236 241 239 228 0 10 1 5628 1 5526 226 248 244 186 127 44 11 8997 2 8450 1 0977 2 7565 1 1033 P6 122 121 133 113 127 34 8 0403 7 8954 199 220 215 163 132 46 17 2966 4 7117 0 8953 4 6677 0 9312 P7 119 119 130 110 128 34 8 1827 8 0362 200 222 216 165 131 45 16 1215 4 6885 0 8856 4 6421 0 9204 P8 116 114 126 108 84 29 7 8786 7 7876 201 225 216 162 132 48 13 8974 4 7486 0 8001 4 7059 0 8337 P9 115 114 126 106 128 36 8 3630 8 2011 199 220 215 163 129 45 18 5026 4 6461 0 9764 4 5994 1 0126 P10 110 108 121 103 127 35 8 4716 8 3235 200 221 216 166 127 44 18 8644 4 5738 1 1187 4 5310 1 1516 P11 236 251 249 208 127 29 1 9258 1 8534 206 248 231 140 127 93 36 4085 3 6804 1 6537 3 6186 1 6991 P12 221 228 227 208 0 17 2 5239 2 5041 237 251 250 213 127 27 11 0523 1 7186 1 0845 1 6521 1 0725 P13 210 217 217 197 0 19 2 9828 2 9661 241 252 251 221 127 21 9 9942 1 3592 0 9663 1 3048 0 9555 P14 202 209 209 189 0 22 3 2560 3 2432 245 254 254 228 127 17 5 4320 0 9932 0 5446 0 9474 0 5244 P15 189 201 202 165 127 33 4 7308 4 7036 212 244 235 158 127 66 14 1516 4 0604 1 1205 3 9928 1 1499 P16 184 189 193 169 127 22 4 4274 4 4139 90 135 98 39 148 195 61 3611 9 7925 3 5505 9 5515 3 3220 P17 212 219 218 200 0 18 2 7330 2 7198 246 252 251 234 127 12 10 8356 0 9168 1 0582 0 8828 1 0418 P18 227 231 232 216 0 13 2 2116 2 1914 247 252 251 238 127 9 11 2096 0 7622 1 1058 0 7353 1 0853 P19 228 236 234 214 0 18 2
66. 32 2 189 196 Degens BP Schipper LA Sparling GP Duncan LC 2001 Is the microbial community in a soil with reduced catabolic diversity less resistent to stress or disturbance Soil Biology and Biochemistry 33 1143 1153 Domsch KH Gams W Anderson TH 1993 Compendium of Soil Fungi Reprint Vol 1 IHW Verlag D 85386 Eching Literaturverzeichnis 121 Dubuisson MP Jain AK Jain MK 1994 Segmentation and classification of bacterial cul ture images Journal of Microbiological Methods 19 279 295 Duxburry T Bicknell B 1983 Metal tolerant bacterial populations from natural and metal polluted soils Soil Biology and Biochemistry 15 243 250 Ecker DJ Butt TR Sternberg EJ Neeper MP Debouck C Gorman JA Crooke ST 1986 Yeast metallothionein function in metal ion detoxification The Journal of Biological Chemistry 261 16895 16900 Ellman GL 1959 Tissue sulfhydryl groups Archives of Biochemistry and Biophysics 82 70 T Flie bach A Martens R Reber HH 1994 Soil microbial biomass and microbial activity in soils treated with heavy metal contaminated sewage sludge Soil Biology and Biochemistry 26 9 1201 1205 Flury B Riedwyl H 1983 Angewandte multivariate Statistik Computergest tzte Analyse mehrdimensionaler Daten Gustav Fischer Verlag Stuttgart Gadd GM 1986 a The uptake of heavy metals by fungi and yeasts the chemistry and physi ology of the process and applications for biotechno
67. 5 0 00201 0 00039 0 00010 0 00037 0 01829 0 00134 0 00000 0 00894 4 Hydroxycinnamat 0 06061 3 Hydroxybenzoat 0 05128 Cinnamat 0 04651 Anisat 0 05128 2 Hydroxybenzoat 0 04255 Hippurat 0 04255 Phenylacetat 0 03636 Mandelat 0 03636 Phthalat 0 03774 Veratrat 0 03509 Terephthalat 0 03509 2 6 Dihydroxybenzoat 0 03175 Nicotinat 0 02667 2 4 Dihydroxybenzoat 0 02667 4 Hydroxybenzoat 0 02597 Phenylalanin 0 02532 p Toluat 0 02469 2 Aminobenzoat 0 01869 Benzoat 0 01626 4 Aminobenzoat 0 00000 Gentisat 0 00000 evenness 0 94987 Durchschnittswert DW 0 03197 Mittlere Abweichung MA 0 01755 Katabolische Vielseitigkeit 1 82198 0 95099 0 02968 0 01725 1 72080 0 94844 0 03055 0 01792 1 70537 0 95 0 03074 0 01757 1 75 0 001 0 00116 0 00033 0 06 0 90287 0 04406 0 02769 1 59137 0 89126 0 04258 0 02904 1 46618 0 90743 0 04080 0 02672 1 52678 0 90 0 04248 0 02782 1 53 0 008 0 00163 0 00116 0 06 Applikation in quienergetischen Mengen Bezugsgr e 1 5 mmol 4HB kg wb wenig belastet b belastet 4 Signifikante Ver nderung infolge Schwermetallstress Ergebnisse 77 Tab 30 Abschatzung der katabolischen Vielseitigkeit von Naturb den durch Verrechnung der reziproken Abbauzeiten Atmungsmaxima aromati scher S uren LSD 0 05 3 Die Unterschiede zwischen dem Waldboden und dem Haldenboden waren signifikant Wald
68. 5 144 50 5 8385 5 8421 100 153 115 31 140 180 9 6047 7 6981 0 2575 7 6980 0 2568 P3 161 185 166 135 145 42 5 7265 5 7277 103 156 120 36 140 169 9 8992 7 5806 0 2732 7 5810 0 2712 P4 140 158 145 119 145 38 6 3094 6 3133 119 145 130 85 139 73 8 0836 7 0683 0 3940 7 0820 0 3692 P5 136 151 141 117 144 36 6 5122 6 5031 117 143 127 82 139 75 8 5621 7 1543 0 3676 7 1650 0 3460 P6 83 80 94 76 92 5 9 8427 9 6151 108 122 121 82 128 61 11 2092 7 4153 0 4177 7 4206 0 4031 P7 80 78 9 73 126 52 9 9979 9 7638 108 123 121 82 128 61 10 6868 7 4194 0 3946 7 4245 0 3801 P8 TI 74 87 71 74 44 10 0038 9 7861 109 124 121 82 131 62 8 8578 7 4241 0 2979 7 4272 0 2875 P9 78 76 89 73 70 53 10 2018 9 9430 107 122 120 82 128 60 12 3444 7 4292 0 4575 7 4357 0 4412 P10 TI 74 87 71 92 50 10 1362 9 8937 109 124 122 83 128 61 13 4037 7 3437 0 5533 7 3479 0 5447 Pll 118 136 130 90 133 61 7 0457 7 0600 107 142 121 58 136 131 23 3887 7 7132 1 2993 7 6879 1 2126 P12 119 124 127 106 127 30 7 2540 7 2230 114 136 126 80 134 75 6 6133 7 3079 0 1753 7 3080 0 1750 P13 112 117 120 101 127 30 7 6340 7 5795 112 130 122 83 134 64 6 7515 7 3755 0 1931 7 3751 0 1909 P14 114 119 122 101 127 34 7 8501 7 7683 113 133 124 8 135 67 6 3286 7 3418 0 1700 7 3419 0 1692 P15 105 112 116 90 125 38 7 5927 7 5780 100 127 117 57 134 112 11 9069 7 7006 0 3662 7 6973 0 3587 P16 107 110 116 97 106 28 7 8273 7 7722 48 79 51 15 149 221 39 4158 12 3925 3 1723 11 9781 2 9101 P17 117 123 125 105 127 31 7 6088 7 5418 114 133 125 8
69. 54 145 39 5 3486 5 3395 107 159 124 38 140 166 9 7824 7 4952 0 2766 7 4961 0 2734 P4 161 181 166 138 145 37 5 9045 5 9002 140 169 152 101 139 70 10 1492 6 0422 0 4363 6 0588 0 4383 P5 161 178 166 140 144 34 5 9706 5 9604 137 166 148 98 139 72 10 1254 6 1315 0 4645 6 1576 0 4657 P6 63 59 73 58 123 70 11 0658 10 7678 118 133 131 92 128 57 11 7000 7 0867 0 5156 7 0951 0 5040 P7 62 59 72 57 123 68 11 1251 10 8221 119 134 132 93 128 56 11 2431 7 0416 0 5156 7 0508 0 5035 P8 60 56 69 56 70 56 11 1502 10 8514 119 134 131 91 130 59 9 4400 7 0794 0 4619 7 0861 0 4509 P9 59 55 68 54 123 74 11 4338 11 1034 119 134 132 93 128 57 12 8632 7 0120 0 5752 7 0231 0 5624 P10 57 52 65 53 90 70 11 5237 11 1900 121 136 133 93 128 57 14 1719 6 9760 0 6108 6 9847 0 6010 P11 134 154 146 102 134 59 6 2985 6 3166 122 160 137 70 136 123 25 2043 6 8663 1 2390 6 8612 1 1949 P12 134 141 142 120 127 29 6 7081 6 6976 150 178 164 108 135 70 8 0960 5 7857 0 1849 5 7958 0 1936 P13 122 127 131 110 127 29 7 1890 7 1569 148 172 161 113 135 60 9 2342 5 8462 0 3297 5 8555 0 3320 P14 122 128 130 108 127 33 7 4529 7 3945 155 181 168 117 135 62 8 1309 5 7099 0 1652 5 7176 0 1749 P15 102 108 113 87 123 38 7 7243 7 7082 124 154 143 78 133 96 12 8487 6 8272 0 6016 6 8412 0 5896 P16 103 106 112 92 106 28 8 0263 7 9584 59 92 64 22 139 208 43 9631 11 5489 3 4333 11 2026 3 1549 P17 130 137 138 116 127 30 7 0800 7 0383 156 180 168 120 135 57 11 8042 5 7348 0 3513 5 7411 0 3554 P18 143 150 151 128 127 26 6 4506 6
70. 6 135 63 7 5726 7 3013 0 2103 7 3012 0 2085 P18 120 125 128 108 127 27 7 2528 72186 113 131 124 84 133 64 7 6008 7 3460 0 2174 7 3455 0 2150 P19 116 123 124 102 127 32 7 1034 7 0994 103 132 116 61 136 104 3 2978 7 6095 0 0866 7 6095 0 0866 P20 126 138 135 108 134 38 6 7091 6 7133 108 139 122 64 137 104 8 6220 7 4707 0 2375 7 4708 0 2357 VK 0 219 0 274 0 189 0 191 0 185 0 262 0 190 0 179 0 138 0 120 0 138 0 299 0 038 0 501 0 711 0 147 1 405 0 135 1 350 IDW aller 19 VK 0 351 0 392 IDW der VK eigentlicher Farbparameter F1 F4 F9 F12 0 196 0 065 IDW der VK der Parameter fiir Verteilung von Farben und Helligkeit F5 F8 F13 F19 0 464 0 490 Abstand zwischen Frontlinse des Objektivs und der Agaroberflache VK Variationskoeffizient SD DW wobei SD Standardabweichung DW Durchschnittswert Farbparameter der Kolonieoberseite Mean Gray F1 Mean Red F2 Mean Green F3 Mean Blue F4 Hue Typical F5 Mean Saturation F6 Mean Brightness F7 Mean Density F8 Farbparameter der Kolonieunterseite Mean Gray F9 Mean Red F10 Mean Green F11 Mean Blue F12 Hue Typical F13 Mean Saturation F 14 Gray Variation F 15 Mean Brightness F16 Bright Variation F17 Mean Density F18 Density Variation F19 Anhang 130 7 2 Bildanalysedaten von 29 Pilzstammen bzw isolaten Pilz Nr nm d M Saturation M Brightness IM Density i Aol 2 7376 161 8 8237 8 7345 2 6023 159 8 7407 8 6597 2 5314 158
71. 7 Diversit t und metabolische Vielseitigkeit von Mikroorga nismengemeinschaften im Boden Schrifienreihe des BML Angewandte Wissenschaft Heft 465 Biologische Vielfalt in Okosystemen 168 184 Salonius PO 1981 Metabolic capabilities of forest soil microbial populations with reduced species diversity Soil Biology and Biochemistry 13 1 10 Sanders HL 1968 Marine benthic diversity a comparative study American Naturalist 102 243 282 Schlegel HG 1992 Allgemeine Mikrobiologie 7 Auflage Georg Thieme Verlag Stuttgart New York Schlichting E Blame HP Stahr K 1995 K nigswasserextrakt von B den f r Mineralstoffe und Phosphor In Bodenkundliches Praktikum Blackwell Wissenschafts Verlag Berlin Wien ver ndert Schmeil O Fitschen J 1982 Flora von Deutschland und seinen angrenzenden Gebieten Ein Buch zum Bestimmen der wildwachsenden und h ufig kultivierten Gef pflanzen 87 Auflage Rauh W Senghas KH Bearb Quelle und Meyer Verlag Heidelberg Shannon CE Weaver W 1969 The mathematical theory of communication Fourth edition The University of Illinois Press Urbana Chicago London Literaturverzeichnis 125 Sieracki ME Reichenbach SE Webb KL 1989 Evaluation of automated threshold selec tion methods for accurately sizing microscopic fluorescent cells by image analysis Applied and Environmental Microbiology 55 2762 2772 Simberloff D 1972 Properties of the rarefaction diver
72. 8 angestellten Untersuchungen zur strukturellen Diversit t von Bakterien aus den gleichen Ackerb den gesicherte Unterschiede zwischen den beiden B den Man kann daher davon ausgehen dass Pilze auf Schwermetalle weniger empfindlich reagie ren als Bakterien In hnliche Richtung weisen wahrscheinlich auch Ergebnisse von Anderson und Domsch 1994 die zeigen konnten dass bei zunehmendem Protonenstress in Waldstandorten der Anteil der pilzlichen Atmung gegen ber der bakteriellen Atmung zu nimmt Die hier mitgeteilten Ergebnisse zum Einfluss von Schwermetallen auf die Diversit t von Pilzen sind nicht die ersten ihrer Art Zu nennen sind vor allem Untersuchungen von Jor dan und Lechevalier 1975 sowie schwedische Arbeiten Arnebrant et al 1987 Nordgren et al 1983 1985 Beide Gruppen untersuchten B den die mit bis zu 13 5 Zn Jordan und Lechevalier 1975 bzw je 2 Cu und Zn Nordgren et al 1983 wesentlich st rker belastet waren als z B der hier untersuchte Haldenboden ca 0 3 Pb so dass Unterschiede in der Arten bzw Gattungszusammensetzung zwischen belasteten und wenig belasteten B den leichter nachweisbar waren Genaue Angaben zur Artendiversit t sind diesen Arbeiten aber nicht zu entnehmen Berechnet man aus den von Jordan und Lechevalier 1975 auf sehr un terschiedlichen Stichproben beruhenden Daten sog rarefaction Kurven s Abb 3 so sind Unterschiede bez glich des Artenreichtums gleich gro er Stichproben ebe
73. 8 7812 8 6981 2 5648 11 1516 10 8249 2 6351 11 2341 10 9016 2 5205 11 2868 10 9491 0 9798 8 4853 8 4109 0 9978 8 4379 8 3679 0 9689 8 4166 8 3499 2 7068 7 5527 7 5528 2 7467 7 5840 7 5839 2 7714 7 5811 7 5810 12 7223 7 8950 7 8780 13 1435 7 9368 7 9159 12 8087 7 8424 7 8287 3 0958 10 3524 10 0961 3 0992 10 2745 10 0249 3 2698 10 0972 9 8630 3 9541 10 2473 10 0290 3 8844 10 2569 10 0359 3 6395 10 2544 10 0328 2 4736 7 5388 7 5391 2 5146 7 4025 7 4076 2 5182 7 5336 7 5336 10 0864 7 8248 7 8210 9 9417 7 8475 7 8435 9 9960 7 8082 7 8055 Oberseite der Kolonie Unterseite der Kolonie M Mean T Typical V Variation 131 M Green i M Saturation ST M Brightness Bright y M Density Density y 99 135 20 7453 8 3760 1 2570 8 3136 1 1674 100 135 21 6100 8 3616 1 3107 8 2986 1 2170 99 136 21 8074 8 4177 1 3493 8 3505 1 2516 122 49 16 2824 7 2612 0 9044 7 2625 0 8437 121 49 15 2626 7 3147 0 8021 7 3136 0 7490 118 54 20 3967 7 4642 1 2602 7 4524 1 1684 79 40 9262 10 3729 3 2178 10 1294 2 9523 8l 136 41 3144 10 2323 3 1923 9 9988 2 9311 79 138 40 7881 10 3936 3 2185 10 1486 2 9525
74. 9 68 0 495 0 323 0 225 0 070 0 691 0 289 36 0 382 0 314 0 277 0 093 0 458 0 396 17 0 351 0 392 0 196 0 065 0 464 0 490 Abstand zwischen Frontlinse des Objektivs und der Agaroberfl che VK Variationskoeffizient SD DW wobei SD Standardabweichung DW Durchschnittswert Eigentliche Farbparameter Kolonieoberseite Mean Gray F1 Mean Red F2 Mean Green Mean Blue F4 Kolonieunterseite Mean Gray F9 Mean Red F10 Mean Green F11 Mean Blue F12 Parameter f r Verteilung von Farben u Helligkeit Kolonieoberseite Hue Typical F5 Mean Saturation Mean Brightness FT Mean Density F8 Kolonieunterseite Hue Typical F13 Mean Saturation F14 Gray Variation F15 Mean Brightness F16 Bright Variation F17 Mean Density F18 Density Variation F19 abstand von 17 cm erstellten Dendrogramm bereits am ersten Knotenpunkt von der h chsten Distanz aus betrachtet von den brigen Isolaten abgetrennt wird Das Cluster mit den Isolaten P6 P10 ist dagegen in allen drei Dendrogrammen vorhanden 50 100 Distanz 150 200 Abb 9 Dendrogramm von 20 Testpilzen P1 P20 die in 19 Farbparametern Kap 2 2 2 1 3 mit einem Kameraabstand von 68 cm vermessen wurden Bildanalysedaten im Anhang unter 7 1 Die ersten vier Knotenpunkte von der h chsten Distanz aus betrachtet sind nummeriert Ergebnisse 52 50 100 Distanz 150 200
75. 9 1 97 13 11 0 54 11 46 1 38 10 51 1 57 8 94 1 69 8 77 0 80 4 95 0 78 5 38 0 60 4 69 0 69 1 32 0 26 1 04 0 14 0 30 0 11 0 78 0 69 0 87 0 54 0 47 0 14 0 05 0 05 0 00 0 00 0 00 0 00 3839 0 7898 4 76 4 54 1 05 13 02 d 12 09 10 88 d 10 37 4 9 82 9 72 7 98 5 97 5 74 5 66 2 71 2 01 1 25 1 10 0 79 0 55 0 34 0 00 0 00 0 00 0 00 1 66 1 36 1 39 1 77 0 47 0 60 0 26 0 00 0 00 0 00 0 00 t2 34 13 36 5 72 t1 77 13 96 4 70 2 67 19 35 5 24 0 95 5 98 3 76 5 78 2 73 21 94 5 24 5 94 1 76 2 47 0 48 2 39 2 63 0 80 1 39 3 79 0 66 1 91 0 70 1 74 0 71 0 48 0 08 0 00 0 08 0 03 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 12 09 5 20 11 83 5 07 13 26 3 67 5 98 2 05 5 46 1 71 12 095 02 3 48 1 47 1 20 0 24 8 84 2 93 4 29 3 07 3 69 0 74 5 64 1 08 1 46 0 34 0 25 0 07 10 40 6 07 0 02 0 01 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 Ver nderung infolge Schwermetallstress nur bei Betrachtung von Mittelwert MW und Standardabweichung signifikant s Text 13 15 13 34 15 68 8 12 8 41 16 69 3 85 1 71 5 87 2 17 2 59 3 30 1 32 0 28 3 47 0 04 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 75 4 88 0 99 0 97 1 32 3 23 3 70 4 84 4 96 t de EE oe B pe e CA e Ergebnisse 74 Gemessen an den beiden Indices evenness und katabolische Vielseitigkeit und
76. 90 128 65 36 87 85 120 58 17 65 63 92 41 blau 68 112 39 96 202 36 102 32 89 187 17 78 18 70 148 wei 68 255 255 255 255 36 138 149 144 124 17 105 113 110 93 Abstand zwischen Frontlinse des Objektivs und der Agaroberfl che 20 0 18 0 16 0 14 0 12 0 10 0 8 0 6 0 4 0 2 0 95 7 aller Isolate Lineares Wachstum mm d Isolate 1 1629 Abb 8 Verteilung der Wachstumsraten von 1629 Pilzisolaten Isolate mit einer t glichen Wachstumsrate von bis zu 6 86 mm sind mit einem Kameraabstand von 36 cm vollst ndig abbildbar Dies entspricht 95 7 der untersuchten Isolate ten 4 3 zum festgesetzten Termin der Bildaufnahme einen Koloniedurchmesser gt 48 mm aufwiesen und nicht vollst ndig aufgenommen werden konnten Zu diesen Pilzen geh rten vor allem Isolate der Gattungen Mucor und Trichoderma die f r die etwaige visuelle ber Ergebnisse 48 pr fung der Gruppenzugeh rigkeit zus tzlich bei einem Abstand von 68 cm aufgenommen wurden Dieser zus tzliche Aufwand erschien akzeptabel Der kleine Kameraabstand 17 cm konnte dagegen nur Kolonien von maximal 21 mm Durchmesser abbilden Dies entsprach einer taglichen Wachstumsrate von 3 mm und einem Anteil von 8 8 nicht vollstandig ab bildbarer Pilze Genauso wichtig wie der Anteil der nicht voll aufgenommenen Bilder ist die Frage ob der f r die visuelle Beurteilung von Pilzbildern als besonders geeignet angesehene Kameraab stand vo
77. Artenspektrum k me Ein wesentlicher Teil dieser Arbeit war daher der Frage der Diversit t von Pilzen auf der Art und Gemeinschaftsebene gewidmet Die Diversit t von Pilzgemeinschaften wurde bisher gesch tzt indem die Isolate in Stichproben unterschiedlicher Herk nfte bestimmten Arten zugewiesen und aus der Artenver teilung Diversit tsindices berechnet wurden Diese Vorgehensweise ist praktisch nicht an wendbar wenn mehrere ausreichend gro e Stichproben je Boden analysiert werden sollen auf die oben genannten physiologischen Untersuchungen aus Interpretationsgr nden aber Diskussion 97 nicht verzichtet werden kann Ein Gro teil dieser Arbeit bestand daher in der Entwicklung einer kombinierten Methode aus Bild und Clusteranalyse zur Erkennung und Eingruppierung einer gro en Zahl von Pilzisolaten Die M glichkeit neben der Farbe von Pilzkolonien auch deren Gr e und Dichte zu bestimmen gestattete dar ber hinaus einfache Methoden zur Ab sch tzung der Wuchsrate aller Isolate bzw zur Biomassebildung unter Stressbedingungen zu entwickeln 4 1 Beurteilung der entwickelten Methoden Die Bildanalyse ist in der Mikroorganismentaxonomie oder bei Versuchen zur Grup pierung von Mikroorganismen mehrfach angewendet worden Bei taxonomischen Untersu chungen an Pilzen insbesondere Fusarien haben Newton und Kendrick 1990 sowie Gott wald et al 1996 die Bildanalyse bei der Erkennung der Sporenmorphologie eingesetzt wah r
78. Brookes PC Heijnen CE McGrath SP Vance ED 1986 Soil microbial biomass estimates in soils contaminated with metals Soil Biology and Biochemistry 18 4 383 388 Brown MT Hall IR 1989 Metal tolerance in fungi In Heavy Metal Tolerance in Plants Evolutionary Aspects Shaw AJ Hrsg CRC Press Orlando FL 95 104 Burges A 1939 Soil fungi and root infection Broteria 8 35 fasc 2 Burkhardt C Insam H Hutchinson TC Reber HH 1993 Impact of heavy metals on the degradative capabilities of soil bacterial communities Biology and Fertility of Soils 16 154 156 Buxton EW 1954 Heterocaryosis and variability in Fusarium oxysporum f gladioli Journal of General Microbiology 10 71 84 Cervantes C Gutierrez Corona F 1994 Copper resistance mechanisms in bacteria and fungi FEMS Microbiology Reviews 14 121 138 Literaturverzeichnis 120 Chander K Brookes PC 1991 Effects of heavy metals from past applications of sewage sludge on microbial biomass and organic matter accumulation in a sandy loam and silty loam U K soil Soil Biology and Biochemistry 23 10 927 932 Chander K Brookes PC 1993 Residual effects of zinc copper and nickel in sewage sludge on microbial biomass in a sandy loam Soil Biology and Biochemistry 25 9 1231 1239 Chaudri AM McGrath SP Giller KE Rietz E Sauerbeck DR 1993 Enumeration of in digenous Rhizobium leguminosarum biovar trifolii in soils previously treated with meta
79. CFU Methode berwiegend signifikant Auffallend war allerdings dass einige Substrate die sich in Reinkulturversuchen als gute C Quellen erwiesen hatten Reber und Wenderoth 1997 und deshalb bei Stress h t ten st rker genutzt werden m ssen nicht entsprechend reagierten Als Beispiele seien 4 Hydroxybenzoat Phenylalanin und Benzoat genannt die im Acker b gegen ber Acker wb abnahmen Nicht zu verstehen ist auch die Nichtnutzung des leicht abbaubaren Gentisat im wenig belasteten Acker und in den beiden Naturb den Das ebenfalls auf den Respirometriedaten beruhende Dendrogramm in der Abbildung 19 zeigt dass bis auf den Haldenboden die drei Stichproben eines Bodens jeweils als Triplett dargestellt wurden also eine sehr hohe hnlichkeit untereinander aufwiesen W hrend bei der CFU Methode Abb 18 zwei Hauptcluster deutlich zu erkennen waren fielen die Respiro Diskussion 111 metriedaten in vier erkennbare Cluster Aus der Stellung der Tripletts zueinander l sst sich eventuell sogar die kombinierte Wirkung der beiden Stressoren d h einer hohen Konzentrati on von Protonen und Schwermetallen ablesen W hrend links der weng belastete weng saure pH 6 Ackerboden steht folgen nach rechts der unbelastete aber saure pH 3 4 Waldboden der belastete wenig saure pH 6 Ackerboden und der belastete saure pH 3 4 Haldenboden Nach dieser Einteilung ware den Schwermetallen eine h here ko physiologische Wirksamkeit zuzu
80. Isolate auf einem Agarmedium gleicher Zusammensetzung und Schichtdicke sowie bei gleichen Inkubationsbedingungen kultiviert werden Kap 2 2 2 1 2 Bei der Bildaufnahme m ssen im Gegensatz zur Fotografie Lichtquelle Belichtungszeit Blende und Kameraabstand konstant gehalten werden weil sonst identische oder sehr hnli che Isolate nicht als solche erkannt w rden Daher ist es durchaus m glich dass die Bilder nicht exakt mit dem subjektiven Empfinden des Betrachters bereinstimmen Aus Gr nden der Konstanthaltung der Beleuchtungs und Belichtungsbedingungen ist auch eine sorgf ltige Kalibrierung des Messsystems erforderlich Kap 2 2 2 1 3 Urspr ngliches Ziel bei der Entwicklung des bildanalytischen Teils der Methode war es formatf llende Bilder der einzelnen Pilzkolonien aufzunehmen um sicherzustellen dass das Bildanalysesystem m glichst viele Strukturen insbesondere von kleinen Kolonien erken nen kann Damit w re der Wechsel zwischen mehreren Kameraabst nden n tig gewesen Zu f llig wurde entdeckt dass sich bei ndernden Kameraabst nden auch die Lichtqualit t des vom Objekt reflektierten Lichts nderte So wurde z B ein vom Auge als schwach beige an n hernd farblos erkannter Pilz mit abnehmendem Kameraabstand dunkler und r ter Kap 3 1 1 1 Diese Beobachtung konnte aufgrund der Analyse von Farbtesttafeln best tigt werden Tab 19 Die Erscheinung kann nur damit erkl rt werden dass sich die vom Objekt reflek
81. N mM Q M gt N S 5 m o 8 ea en Q x E x 2 E RZ wb 145 Anhang Acker b Gruppe 1 P nigricans 20 Isolate on 3 5 Z o E ER Aromatische S uren 1 Nutzung 0 Hofbildung Wachstum belastet Ze 2 Ez X 2 S lt oO z oO ea Q N lt g S lt E QO ea N mM Q M gt N S O m o e T ea en oO x E x 2 E RZ b 146 Anhang Wald ub Gruppe 2 P fellutanum 20 Isolate keine Nutzung E e gS gt N 5 2 Il g o 3 Hos N o lt o Ee E E Hofbildung Wachstum unbelastet 2 2 5 E a E lt Q Q m Q S N o lt s gt 5 S m N m T Q Si 5 gt N S 5 m o s m CH Q T s amp l T 2 3 4 ub 147 Anhang on 3 5 Z o E re Aromatis
82. Pilze unter dem Einfluss von Schwermetallen eine hnliche berlebensstrategie verfolgen oder andere Mechanismen der Toleranz bzw Resistenz besitzen Zur Beantwortung der obigen Frage wurden vier Pilzgemeinschaften aus unterschied lich stark kontaminierten B den untersucht Bodenpaar I Ackerb den pH 6 bestand aus den am geringsten und am h chsten mit Schwermetallen Cu Zn Ni u Cd belasteten Vari anten eines Kl rschlammversuchs Gesamtbelastung 70 mg ke bzw 469 mg kel Boden paar II Naturb den pH 3 4 enthielt einen unbelasteten Wald und einen belasteten Hal denboden Cu Zn Ni Cd u Pb Gesamtbelastung 17 mg kg bzw 3271 mg kg Die Unter suchungen fanden sowohl auf Gemeinschafts als auch auf Artebene statt Zur Absch tzung der strukturellen Diversit t der Pilzgemeinschaften in den Testb den wurde ein computergest tztes kombiniertes Verfahren aus Bild und Clusteranalyse entwi ckelt mit dessen Hilfe ca 400 Pilzisolate je Boden hinsichtlich Wachstum und Farben ver messen und Isolate gleichen Bildtyps nach Auswertung der Bilddaten gruppiert wurden Vor teile dieser Methode sind relative Schnelligkeit eine hohe Reproduzierbarkeit bei konstanten Inkubations und Messbedingungen Anwendbarkeit ohne Artenkenntnis sowie zeitliche Trennung von Bildaufnahme und Bildanalyse Die Diversit t wurde als Zahl der Bildtypen in 125 Isolaten angegeben Daneben wurde ein Bildanalyseverfahren entwickelt das es erm g lich
83. Tabelle 18 Ergebnisse 43 Abb 4 Pilzkolonie von Alternaria sp Oberseite links und Unterseite rechts Abb 5 Pilzkolonie von Gliocladium sp Oberseite links und Unterseite rechts Ergebnisse 44 Abb 6 Pilzkolonie von Paecilomyces lilacinus Oberseite links und Unterseite rechts Abb 7 Pilzkolonie von Penicillium fellutanum Oberseite links und Unterseite rechts Ergebnisse 45 Tab 18 Bildanalysedaten von vier Pilzst mmen unterschiedlicher Gattung Jeder Pilz wurde in den 20 in dieser Arbeit eingesetzten Messparametern MP1 MP20 Kap 2 2 2 1 3 ver messen Pilzstamm Mess Alternaria Gliocladium Paecilomyces Penicillium arameter sp sp lilacinus _fellutanum MP1 3 9541 2 7068 1 9988 1 6127 2 69 104 158 124 93 153 179 135 4 80 112 162 130 5 35 50 135 107 6 137 144 144 134 7 152 131 37 38 8 10 2473 7 5527 5 7892 7 0748 9 10 0290 7 5528 5 7915 7 0479 10 57 87 98 139 MPII 65 152 134 168 MP12 62 86 104 150 MP13 43 25 56 99 MP14 135 143 141 137 15 72 199 115 72 16 48 3478 21 8702 29 1565 9 5986 MP17 11 8518 8 7208 8 2710 6 0474 MP18 3 5615 1 3032 1 8749 0 4428 MP19 11 4654 8 6325 8 2021 6 0620 MP20 3 2977 1 2121 1 7390 0 4424 Lineares Wachstum in mm d MP1 Farbparameter der Kolonieoberseite Mean Gray MP2 Mean Red MP3 Mean Green MP4 Mean Blue 5 Hue Typical MP6 Mean Saturation MP7 Me
84. Zusammenhang zwischen Stresstoleranz Diversitat und katabolischer Vielseitigkeit schwermetallgestresster Bodenpilze Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultat der Technischen Universitat Carolo Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften Dr rer nat genehmigte Dissertation von Michael Stelzer aus Braunschweig 1 Referent 2 Referent eingereicht am miindliche Priifung am Prof Dr H J Aust Prof Dr O Larink 10 10 2002 12 12 2002 2003 Inhaltsverzeichnis I 1 Einleitung und Stand der Forschung 1 1 1 Zusammenhang zwischen Umweltfaktoren Uberlebensstrategie und Diversitat 1 1 2 Ziele dieser Arbeit 7 2 Material und Methoden 12 2 1 Material 12 2 1 1 B den 12 2 1 2 N hrmedien und L sungen f r die Kultivierung von Pilzen 13 2 1 3 Substrate 15 2 1 3 1 Aromatische S uren 16 2 1 3 2 Polymere 17 2 1 4 Arbeitsplatz fiir die Bildanalyse 18 2 1 5 Pilzstamme 20 2 2 Methoden 21 2 2 1 Bestimmung physikalisch chemischer Parameter von Bodenproben 21 22 2 Untersuchung von Pilzgemeinschaften Diversit t und Leistungsfahigkeit 22 2 2 2 1 Abschatzung der Diversitat 22 2 2 2 1 1 Vorbehandlung von Bodenproben fiir mikrobiologische Untersuchungen 22 2 2 2 1 2 Isolierung Kultivierung und Stammhaltung von Pilzisolaten 23 2 22 13 Bildanalyse 25 2 2 2 1 4 Clusteranalyse der Bilddaten 30 2 2 2155 Beurteilung der Unterscheidungskraft der in der Bildanalyse ein
85. abh ngigen evenness Gleichm igkeit in der Stichprobe Da in Dendrogrammen mit abnehmender Knotenzahl Z hlrichtung s Abb 9 11 die evenness der resultierenden Datencluster Bildtypen abnimmt wobei mehrere Minima auftreten Abb 15 wurde die Clusterebene so gelegt dass sie mit dem ersten evenness Minimum zusammenfiel In dem dargestellten Beispiel Abb 15 entsprach dies einer Ahnlichkeitsstufe von ca 97 und einer Typenzahl von etwa 75 in 274 Isolaten bzw durchschnittlich etwa vier Isolaten je Bildtyp Es ist klar dass bei dieser Vorgehensweise Arten zerschnitten werden k nnen z B wenn ein Bildtyp sich nach Kernsegregation Buxton 1954 Hoffmann 1964 zu einem ande ren Ph notypen Bildtypen entwickelt Sehr hnlich aussehende Arten wie z B P felluta num und P frequentans k nnen auch zu einem Bildtypen zusammengefasst werden wenn die Clusterebene nicht hoch genug liegt Dieser Sachverhalt macht klar dass selbst die An passung der Clusterebene an den jeweiligen Datensatz kein Garant f r eine fehlerfreie Arten einteilung ist Das Problem der Clusteranalyse ist die Starrheit der Clusterebene Wegen der geschilderten Problematik wurden f r vergleichende physiologische Untersuchungen an St mmen aus schwermetallbelastetem und unbelastetem Boden solche Bildtypen ausgew hlt die auf einer sehr hohen hnlichkeitsstufe clusterten Eine taxonomische berpr fung Dr Draeger Institut f r Mikrobiologie der T U Braunschweig z
86. admium binding peptide I from Schizosaccharomyces pombe Biochemical and Biophysical Research Communications 103 1021 1028 Newton G Kendrick B 1990 Image processing in taxonomy Sydowia 42 246 272 Nielson KB Atkin CL Winge DR 1985 Distinct metal binding configurations in metal lothionein The Journal of Biological Chemistry 260 5342 5350 Nordgren A Baath E S derstr m B 1983 Microfungi and microbial activity along a heavy metal gradient Applied and Environmental Microbiology 46 1829 1837 Nordgren A Baath E S derstr m B 1985 Soil microfungi in an area polluted by heavy metals Canadian Journal of Botany 63 448 455 Odum EP 1980 Grundlagen der Okologie Georg Thieme Verlag Stuttgart New York Odum EP 1985 Trends expected in stressed ecosystems Bio Science 35 7 419 422 Ow DW Ortiz DF Speiser DM McCue KF 1994 Molecular genetic analysis of cadmium tolerance in Schizosaccharomyces pombe In Metal Ions in Fungi Winkelmann G Winge DR Hrsg Marcel Dekker New York Mycology 11 339 359 Park D 1968 The ecology of terrestrial fungi In The Fungi Volume III The Fungal Popu lation Ainsworth GC Sussman AS Hrsg Academic Press New York and London 5 39 Payne WJ 1970 Energy yields and growth of heterotrophs Annual Review of Microbiology 24 17 52 Pianka ER 1970 On r and K selection American Naturalist 104 592 597 Pielou EC 1966 The measurement of diversity in di
87. age von Bildmasken und Anwendung von Programmfiltern den zu vermessenden Bereich des Bildes vom brigen Bildbereich Erreicht wird dies durch Definition eines Schwellenwerts f r die Farben Rot Gr n und Blau RGB Durch den Vorgang des Segmentierens werden alle Bildelemente eli miniert die nicht zu der zu vermessenden Pilzkolonie geh ren Nach Invertierung kann die im Bin rmodus wei dargestellte Kolonie in den zuvor ausgew hlten Parametern vermessen werden Der gesamte Ablauf der Vermessung optisch dichter Pilze kann in Form eines Mak ros aufgenommen gespeichert und ausgef hrt werden Vermessung von Pilzen geringer optischer Dichte Pilze geringer optischer Dichte sind im Myzelwuchs weniger stark verzweigt als optisch dichte oft pigmentlos und k nnen deshalb Licht schlecht absorbieren Die Folge ist dass diese Pilze im Durchlicht aufgrund der geringen Extinktion von der Kamera nur schlecht in ihrer Gr e erkannt werden Dies er schwert sowohl Wachstums als auch Farbmessungen Ein solches Isolat muss generell im Auflicht vermessen werden Zur Kontrasterh hung wurde der helle Untergrund durch einen mattschwarz lackierten Hintergrund ersetzt Im Ge gensatz zur Vermessung im Durchlicht konnte nicht ber die homogen wei e Umgebung der Kolonie segmentiert werden Hier war es notwendig die Kolonie selbst an mehreren Punkten des Randbereichs zu markieren Der bisher segmentierte Bereich wurde mit Hilfe der Bild maske sichtbar Es g
88. aiser EA Walenzik G 1989 Soil microbial biomass and respi ration measurements an automated technique based on infra red gas analysis Plant and Soil 116 191 195 Hoffmann GM 1964 Untersuchungen ber die Kernverh ltnisse bei Fusarium oxysporum f callistephi Archiv fiir Mikrobiologie 49 51 63 Jenkinson DS 1966 Studies on the decomposition of plant material in soil II Partial sterili zation of soil and the soil biomass Journal of Soil Science 17 280 302 Jordan MJ Lechevalier MP 1975 Effects of zinc smelter emissions on forest soil micro flora Canadian Journal of Microbiology 21 1855 1865 Kendrick WB Burges NA 1962 Biological aspects of the decay of Pinus sylvestris leaf litter Nova Hedwigia 4 313 432 Kj ller A Struwe S 1996 Microbial diversity and its relationship to decomposition proc esses In Functional implications of biodiversity in soil Ecosystems research report No 24 73 85 Lindenbein W 1952 ber einige chemisch interessante Aktinomycetenst mme und ihre Klassifizierung Archiv f r Mikrobiologie 17 361 383 Liu J Dazzo FB Glagoleva O Yu B Jain AK 2001 CMEIAS A computer aided system for the image analysis of bacterial morphotypes in microbial communities Microbial Ecology 41 173 194 MacArthur RH Wilson EO 1967 The theory of island biogeography Princeton University Press Princeton NJ Martin JP 1950 Use of acid rose bengal and streptomycin in the plate metho
89. allbelastetem Haldenboden statistisch nicht sichern Dies muss darauf zur ckgef hrt werden dass der pH Wert in beiden B den sehr niedrig war 3 4 so dass schon von einem gewissen Stress im Waldboden ausgegangen werden konnte der durch den hinzukommenden Schwermetallstress im Haldenboden augenscheinlich nicht wesentlich verst rkt wurde Diskussion 105 Griinde die neben dem pH Wert fiir den relativ geringen Unterschied der durch schnittlichen Wuchsleistung der Pilze aus den jeweils unbelasteten B den der beiden Paare von Bedeutung sein k nnten sind m glicherweise die Verf gbarkeit der Kohlenstoff C und Energiequellen aber auch die Wasserkapazit t der B den Durch den Bewuchs mit Lolium perenne L Gramineae Schmeil und Fitschen 1982 entsteht im wenig belasteten Ackerbo den leicht abbaubares Pflanzenmaterial l sliche Zucker Pektin oder St rke Pugh 1980 welches die relativ hohe durchschnittliche Wuchsleistung z B der Zuckerpilze Burges 1939 verursacht Die geringere Qualit t der C Quellen im sandigen Waldboden De schampsia flexuosa L Trin Gramineae Schmeil und Fitschen 1982 und Kiefernnadeln die unter gleichen Bedingungen weniger schnell wachsende Pilze selektionieren w rde k nn te eventuell durch den Wechsel von extremer Austrocknung und Wiederbefeuchtung kompen siert werden so dass r Strategen offensichtlich fast genauso gef rdert werden wie im Acker boden mit seinem durch hohen Lehmantei
90. alt die Segmentierung so lange fortzusetzen bis der Kolonierand ge schlossen segmentiert vorlag Durch verschiedene Befehle des Programms konnte die teilwei se segmentierte Kolonie mit der Maske ausgef llt und auch im Randbereich gegl ttet werden Dar ber hinaus konnten angrenzende fehlsegmentierte Maskenbereiche weggeschnitten und das Segmentierungsergebnis durch eine Konturfunktion in seiner Richtigkeit berpr ft wer den Dabei war zu beachten dass die Maske der Kolonie in keiner Verbindung zu dem Rand bereich des brigen Bildes stand da diese Bereiche sonst mit in die Messung eingeflossen w ren Entsprach der segmentierte Bildbereich der realen Kolonie wurde diese ebenfalls im Bin rmodus vermessen Messung von Farben F r die Farbmessung im Auflicht galt der Segmentierungsab lauf zur Vermessung von Pilzen geringer optischer Dichte Jedes gespeicherte Bild der Pilz unter und Oberseite wurde im programmeigenen LIM Format Laboratory Imaging verlust Material und Methoden 30 frei komprimiert und hat eine Gr Be von etwa 800 KB Die zun chst auf der Festplatte des Rechners gespeicherten Bilder wurden auf CD kopiert und von dort je nach Bedarf fiir die Farbmessung abgerufen Fiir die separate Vermessung der Unter und Oberseite jedes Pilzes wurden die im Abschnitt Messfunktionen beschriebenen Parameter vor jeder Messung aufge rufen Unterseite Mean Gray Mean Red Mean Green Mean Blue Hue Typical Mean Saturation M
91. alzahl Mean Density Farbdichte Der Durchschnitt aller Werte f r die Farbdichte des Objekts Messwerte liegen als Dezimalzahlen vor Gray Variation Variation des Grauwerts Die Variation des Grauwerts Intensit t ist aus einem Intensit tshistogramm abgeleitet Sie kommt der gew hnlichen Standardabweichung der Intensit tswerte gleich wird in Dezimalzahlen ausgedr ckt und ist die Basis f r die Be rechnung von Mean Gray Bright Variation Variation der Helligkeit Die Standardabweichung der Helligkeitswerte in Form von Dezimalzahlen wiedergegeben Density Variation Variation der Farbdichte Die Standardabweichung aller Werte f r die Farbdichte des Objekts ebenfalls als Dezimalzahlen vorliegend Bis auf die drei eine Variation beschreibenden Messfunktionen Gray Variation Bright Variation und Density Variation wurden alle Farbfunktionen zur Vermessung der Unter und Oberseite einer Pilzkolonie angewendet Die Variationsfunktionen wurden ausschlieBlich zur n heren Beschreibung der Kolonieunterseite herangezogen da die Pilze auf der Unterseite meist weniger differenziert sind als auf der Oberseite Die Clusterung von Probedaten hatte gezeigt dass die Anwendung der oben aufgef hrten Messfunktionen zu dem besten Differen zierungsergebnis f hrte nicht dargestellt Die Kolonieoberseite wird durch insgesamt acht Material und Methoden 28 und die Kolonieunterseite durch elf Farbparameter beschrieben Einschlie li
92. an Brightness MP8 Mean Density MP9 Farbparameter der Kolonieunterseite Mean Gray MP10 Mean Red MP11 Mean Green MP 12 Mean Blue MP13 Hue Typical MP14 Mean Saturation MP15 Gray Variation MP16 Mean Brightness MP17 Bright Variation MP18 Mean Density MP19 Density Variation MP20 3 1 1 1 Suche nach geeigneten Bedingungen fiir die Bildaufnahme Wenn Gr e Struktur und Farbe eines Pilzes sowohl f r die Gewinnung von Bildda ten als auch f r die vorgesehene subjektive berpr fung von Pilzgruppen Cluster aufgrund von Bildern m glichst optimal aufgenommen werden sollen m ssten Pilzkolonien nicht nur bildf llend sondern auch farblich so dargestellt werden dass sowohl das Bildanalysesystem als auch das menschliche Sehverm gen Unterschiede optimal erkennen k nnen Diese Forde rungen waren mit einer einzigen Aufnahme nicht zu erf llen so dass ein Kompromiss hin sichtlich Kameraabstand und Lichtintensit t gefunden werden musste In diesem Zusammen hang muss gesagt werden dass die verwendete Kamera die Belichtung nicht wie ein Fotoap Ergebnisse 46 parat an die herrschende Beleuchtungsintensit t anpassen kann sondern dass Blende und Be lichtungszeit manuell eingestellt und konstant gehalten werden m ssen Aus Gr nden der Vergleichbarkeit von Aufnahmebedingungen und folglich auch von Bildern ist dies auch n tig Nat rlich w re eine Anpassung des Kameraabstands an die Gr e der Pilzkolonie mi
93. and aus den beiden am st rksten und am wenigsten mit Schwermetallen belasteten Varianten eines Klarschlamm versuchs der Bundesforschungsanstalt fiir Landwirtschaft FAL Braunschweig Zwischen 1980 und 1990 wurde j hrlich eine Menge von 300 m ha Kl rschlamm entsprechend 12 t ha TM ausgebracht seit 1990 nicht mehr Da der Kl rschlamm wenig belastet war wurde er um die damals g ltigen Grenzwerte f r die Bodenbelastung mit Schwermetallen zu erreichen zus tzlich mit Blei Cadmium Chrom Kupfer Nickel Quecksilber und Zink in Mengen von mg kg 2400 40 2400 2400 400 50 bzw 6000 kontaminiert Der Kontroll boden wurde bei diesem Versuch nicht beschlammt enthielt aber eine Altlast aus einem fr heren Versuch Zum Ausgleich der D ngewirkung des Kl rschlamms wurde die Kontrolle aber mit mineralischem N D nger 180 kg N ha a versorgt Der Bodentyp beider Ver suchsparzellen ist eine Parabraunerde Die Bodenproben wurden der Rhizosph re von Lolium perenne L Gramineae Schmeil und Fitschen 1982 entnommen In mehreren fr heren Untersuchungen wurden mikrobiologische Daten ber diese B den zusammengetragen Chaudri et al 1993 FlieBbach et al 1994 Wenderoth und Reber 1999 a 1999 b Bodenpaar II waren Naturb den Dabei handelte es sich um einen sandigen Waldbo den am Rand einer Kiefernschonung nahe Rolfsb ttel Kreis Gifhorn 52 24 2 N 10 26 0 O Kontrolle und einen mit Schwermetallen hochbelasteten lehmigen
94. atabolische Vielseitigkeit von Pilzgemein schaften 3 2 2 1 Absch tzung der katabolischen Vielseitigkeit schwermetallgestresster Pilzge meinschaften im Boden durch Bestimmung aromatenspezifischer Vermehrungseinhei ten CFU Wie in Kapitel 2 2 2 2 1 dargelegt kann die katabolische Vielseitigkeit einer Mikroor ganismengemeinschaft im Boden durch Bestimmung aromatenspezifischer Vermehrungsein heiten CFU abgeschatzt werden da Aromaten hinsichtlich ihrer Qualit t als Kohlenstoff C und Energiequellen groBe Unterschiede aufweisen Die Berechnung von Indices wurde in Kapitel 2 2 4 ausf hrlich dargestellt Die Tabellen 27 und 28 zeigen relative Werte der Vertei lung aromatenspezifischer Vermehrungseinheiten CFU und daraus errechnete Indices Wie die jeweils letzte Spalte zeigt sind bei Betrachtung der Mittelwerte und zugeh riger Stan dardabweichungen Ver nderungen auf der Seite der F higkeiten als Folge von Schwermetall stress nur in wenigen Fallen gesichert So nahm in den Ackerb den die Fahigkeit zur Nutzung von 3 Hydroxybenzoat Phenylalanin und Gentisat zu die Nutzung von Veratrat 2 4 Dimethoxybenzoat dagegen ab Andererseits wurden in den Naturb den als Folge von Schwermetallstress nur das Testsubstrat 3 Hydroxybenzoat st rker und die Substrate 2 Hy Ergebnisse 71 droxybenzoat Salicyls ure 2 Aminobenzoat Veratrat und 4 Methoxycinnamat weniger genutzt Ein stringenterer Vergleich der Ergebnisse d h die Betrac
95. bb 21 jeweils zwei ausgewahlt die gegen ber Kupfer offensichtlich besonders sensitiv bzw tole rant resistent waren Neben der Biomassebildung wurde der Gehalt an Protein sowie die Bil dung von Sulfhydryl SH Gruppen quantifiziert Kap 2 2 3 2 2 deren Mehrsynthese als Bildung von Metallothioneinen verstanden wurde Die Auswahl der geeigneten Kontaminationsstufen f r das Fl ssigmedium wurde u a davon abh ngig gemacht dass auch der schwermetallsensitivste Pilz nach einer bestimmten Inkubationszeit ausreichend Biomasse f r den Zellaufschluss und die anschlieBende Quantifi zierung von Protein und SH Gruppen bilden konnte Die Abbildung 22 zeigt den zeitlichen Verlauf der Bildung von Feuchtbiomasse f r die Konzentrationen 1 mM und 1 5 mM Kupfer bei dem offensichtlich kupfersensitivsten Isolat W165 der vier Testisolate Die Kurvenverl u fe deuten an dass bei einer Konzentration von 1 5 mM Kupfer im Testmedium die Kurve wesentlich flacher verl uft die station re Wachstumsphase eher erreicht und insgesamt weni ger Biomasse gebildet wurde Aus diesem Grund wurde f r die beiden sensitiven Isolate W108 u W165 1 mM Kupfer und f r die relativ toleranten resistenten Isolate H11 u H271 1 5 mM Kupfer als maximale Kontaminationsstufe gew hlt Ergebnisse 89 120 100 Sp 80 E 60 8 5 40 20 1 0 mM Kupfer 1 5 mM Kupfer 0 0 5 6 7 8 9 Tage der Inkubation Abb 22 Bildung von
96. bestimmt werden konnte Bei diesen Messungen fiel auf dass sich das Erscheinungsbild der Pilzkolonien auch in einer weiteren Hinsicht ver nderte sie wuchsen d nner d h ihr Myzel war weniger dicht ausgepragt Diese Erscheinung war bildanalytisch an der geringeren Ex tinktion im Durchlicht zu quantifizieren Es wurde angenommen dass aus der Multiplikation der Relativwerte von reduzierter Kolonieflache und reduzierter Koloniedichte ein f r die relative Biomassebildung unter verschieden starken Stressbedingungen abgeleitet werden konnte Die entsprechenden Untersuchungen zur Entwicklung und Anwendung der Methode finden sich im Hauptteil dieser Arbeit Kap 3 1 2 2 2 3 2 2 Nachweis von Protein und Sulfhydryl SH Gruppen Zur Quantifizierung von Protein und SH Gruppen wurden ausgewahlte kupfertoleran te resistente und kupfersensitive Pilzisolate in 150 ml Fl ssigmedium Tab 5 in Gegenwart von Kupfersulfat CuSO angezogen Als Kulturgef e dienten 1 Liter Erlenmeyerkolben Die in Vorversuchen als geeignet ermittelten Kontaminationsstufen waren neben der Kon trolle 0 0 5 1 und 1 5 mM Kupfer f r tolerante resistente sowie 0 33 0 67 und 1 mM Kup fer f r sensitive Pilze Durch die Wahl geringerer Kupfergehalte f r sensitive Pilze sollte ge wahrleistet sein dass diese in allen Kontaminationsstufen gen gend Biomasse bilden k nnen Material und Methoden 35 Beimpft wurden die Kolben mit 1 ml einer dichten Sporensuspen
97. bh ngig von der betrachteten F higkeit sogar bei jedem Or ganismus unterschiedliche Optima gibt Schlegel 1992 Hinsichtlich des Wachstums im Kul turgef kann die optimale Temperatur z B 28 C betragen Tats chlich wird dieser Wert in unseren B den im Sommer nur selten angetroffen und ist f r das berleben der Mikroorganis men sicher nicht das Optimum da andernfalls die ohnehin begrenzten Kohlenstoff C und Energiequellen noch schneller verbraucht w rden Ahnliches gilt f r die Verf gbarkeit des Stickstoffs N Suboptimale Bedingungen oder Mangel sind zwar nicht unmittelbar die Ursache vielfaltiger Mikroorganismengemeinschaften wahrscheinlich schaffen sie aber durch die Ver langsamung des Stoffwechsels Stabilit t und tragen so zur Erhaltung der Diversit t bei Positiv f r die Erhaltung der Vielfalt wirkt sich vermutlich auch aus dass die Bedingungen im Boden in einem von Jahreszeit und Witterungsverlauf bestimmten Bereich oszillieren aber auch r umlich variieren so dass abwechselnd die eine oder die andere Art im Vorteil ist Eine gr ere Kon stanz der Bedingungen w rde dagegen zur Anreicherung der bestangepassten Arten und St m me f hren und damit auf Dauer neben der Artenvielfalt auch die Redundanz der Leistungen der Gemeinschaft reduzieren Reber und Wenderoth 1997 F r die Artenvielfalt von Mikroorganismengemeinschaften besonders wichtig ist sicher die Vielfalt und unterschiedliche Qualit t der C und Energie
98. ch des Wachs tumsparameters wird also jedes Isolat durch 20 Parameter charakterisiert Wachstums und Farbmessungen mit dem Lucia Bildanalyseprogramm Generell wurden die Pilze in ihrem Wachstum im Durchlichtmodus vermessen Die Farbmessungen wurden dagegen ausschlieBlich im Auflichtmodus ausgef hrt da die Farbgebung von Ober und Unterseite eines Objekts nur im Auflicht getrennt werden kann Zur Vermeidung einer Kontamination w hrend der siebent gigen Inkubationszeit durfte der Schalendeckel f r die Wachstumsmessung nicht entfernt werden Aufgrund manchmal nicht unerheblicher Kon denswasserbildung im Schalendeckel wurde das Wachstum deshalb anhand der Kolonieunter seite gemessen Der Wachstumsstart wurde generell auf 24 h nach dem Animpfen festgelegt gleichg ltig ob die Beimpfung ber ein Myzelst ck oder eine Sporensuspension erfolgte Je nach Wachstumsgeschwindigkeit erfolgte die zweite Messung des Koloniewachstums 2 4 Tage nach dem Anwachsen Am sechsten Tag erfolgte die Farbmessung der Unterseite mit geschlossenem Schalendeckel die der Oberseite nach Entfernen des Schalendeckels um Strukturen besser darstellen zu k nnen Im Gegensatz zur Wachstumsmessung wurden f r die Farbmessungen digitale Bilder aufgenommen Dies erm glichte die Erhebung der Messdaten zu einem sp teren Zeitpunkt sowie eine subjektive berpr fung der nach der Clusteranalyse Kap 2 2 2 1 4 der Bilddaten zu Alben zusammengefassten Bilder Wachstumsmessungen
99. che S uren 1 Nutzung 0 Hofbildung Wachstum Halde b Gruppe 2 P fellutanum 20 Isolate belastet Ze 2 Ez X 2 S lt oO Fe oO ea Q N lt g S lt E QO ea N ea Q M gt N S O m o 8 T ea en Q x E x 2 4 b 148 Anhang keine Nutzung 0 57 Isolate Nutzung Gruppe 3 frequentans Aromatische S uren 1 KH unbelastet Hofbildung Wachstum 2 2 5 E a E lt Q Q m Q S N lt s gt 5 S m N m Q Si gt S m o s m CH Q T s amp l T 2 3 4 Wald ub ub 149 Anhang 57 Isolate Gruppe 3 frequentans ki Wald ub keine Nutzung 0 Nutzung Aromatische S uren 1 2 2 5 a 2 lt Q Q m a bei lt s gt _ S m N m T Q Zu gt S 5 m o s m T CH Q Ei T 2 3 4
100. chen Fahigkeiten erheblich eingeschrankt Penicillium nigricans das optisch gut zu erkennen ist war physiologisch lediglich durch seine F higkeit zur Nutzung von Anisat von den beiden anderen Arten zu unterscheiden Penicillium frequentans ist aufgrund seiner Nutzung von Veratrat 4 Aminobenzoat und Nicotinat zwar von den beiden anderen Arten unterscheidbar Da die aromatischen S uren aber nicht von allen Isolaten genutzt wurden ist eine Einordnung einzelner Isolate aufgrund dieser katabolischen F higkeiten nicht m glich Eventuell lassen sich die drei Arten aber hinsichtlich ihrer durchschnittlichen katabolischen Leistungsfahigkeit bzw Vielseitigkeit unterscheiden Zwar konnten die Experimente aus Mangel an Material nur einmal durchgef hrt werden so dass eine statistische Sicherung nicht m glich ist Jedoch nehmen beide Indices in der Reihenfolge P nigricans gt P frequentans gt P fellutanum ab Dies gilt auch f r die evenness die wie die katabolische Vielseitigkeit ein Index f r die Ver teilung von F higkeiten in Populationen oder Gemeinschaften ist Dagegen ist eine Wirkung von Schwermetallen auf die katabolischen Fahigkeiten der beiden Arten P nigricans und P fellutanum praktisch nicht nachweisbar da die beobachteten Unterschiede zu gering waren Ergebnisse 81 Tab 32 H ufigkeit der Nutzung von 21 aromatischen S uren als einzige C Quelle durch I solate von drei Arten der Gattung Penicillium aus unterschiedlich schw
101. chiede zwischen den Isolaten aus Wald und Haldenboden zu erkennen Ergebnisse 88 3 3 4 Physiologisch biochemische Unterschiede zwischen vier ausgew hlten Isolaten von Penicillium fellutanum aus Wald und Haldenboden Wie die Abbildung 21 zeigt waren die Unterschiede zwischen den Isolaten aus Wald und Haldenboden nur bei einer Kontamination des N hrbodens von 2 mM Kupfer signifikant Es war zu fragen ob dies die einzige M glichkeit der Unterscheidung zwischen kupfertole ranten resistenten und sensitiven Isolaten von P fellutanum darstellt oder ob die beiden Isolategruppen auch durch physiologische bzw biochemische Charakteristika voneinander zu trennen sind Bekanntlich besitzen Pilze Mechanismen die Toleranz bzw Resistenz vermit teln und die es ihnen gestatten einem Schwermetallstress auszuweichen Tomsett 1993 Nach Gadd 1986 b 1989 werden in der Pilztoxikologie die Begriffe Toleranz bzw Resis tenz gegen ber Schwermetallen h ufig als Synonyme verwendet weil sie angeblich noch nicht eindeutig definiert wurden Dies gelte auch f r die Synthese der ubiquit ren Metallothi oneine die sowohl die Aufnahme als auch die Detoxifikation von Schwermetallen regulieren Hamer 1986 Mehra und Winge 1991 Nielson et al 1985 Da eine Definition der genann ten Begriffe auch f r die Interpretation der eigenen Ergebnisse von Nutzen sein k nnte wur den aus den 40 getesteten Isolaten von P fellutanum aus Wald und Haldenboden A
102. chsleistung und katabolische Vielseitigkeit von Bodenpilzen auf der Artebene 111 4 4 Energetische Betrachtungen zu berlebensstrategie und Diversit t von Pilzen unter dem Einfluss von Schwermetallen 112 5 Zusammenfassung 116 6 Literaturverzeichnis 118 7 Anhang 127 7 1 Bildanalysedaten von 20 verschiedenfarbigen Pilzisolaten die bei einem Kameraabstand von 68 36 und 17 cm vermessen wurden 127 7 2 Bildanalysedaten von 29 Pilzstammen bzw isolaten 130 7 3 Bildanalysedaten von Pilzisolaten aus den Acker Bodenpaar D und Naturb den Bodenpaar ID siehe beiliegende CD 137 7 4 Substratnutzungsspektren Isolaten der Gattung Penicillium 138 Einleitung 1 1 Einleitung und Stand der Forschung 1 1 Zusammenhang zwischen Umweltfaktoren berlebensstrategie und Diversit t Mikroorganismengemeinschaften sind wie die Arten aus denen sie bestehen von den Umweltfaktoren abh ngig deren Wirkung von der jeweiligen Intensit t oder Konzentration be stimmt wird Bei den meisten Umweltfaktoren lasst sich ein suboptimaler bzw Mangelbereich ein optimaler und ein sch dlicher bzw toxischer Bereich unterscheiden Bei wenigen anderen Faktoren z B nicht essentiellen Elementen l sst sich dagegen nur ein indifferenter und ein sch dlicher toxischer Bereich erkennen Stadelmann und Santschi Fuhrimann 1987 Man kann davon ausgehen dass sich die Mikroorganismen nicht nur hinsichtlich ihrer Optima unter scheiden sondern auch dass es a
103. d for estimat ing soil fungi Soil Science 69 215 232 Mehra RK Winge DR 1991 Metal ion resistance in fungi molecular mechanisms and their regulated expression Journal of Cellular Biochemistry 45 30 40 Mehra RK Tarbet EB Gray WR Winge DR 1988 Metal specific synthesis of two met allothioneins and y glutamyl peptides in Candida glabrata Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 85 8815 8819 Meijer BC Kootstra GJ Wilkinson MHF 1990 A theoretical and practical investigation into the characterization of bacterial species by image analysis Binary 2 21 31 Mills AL Colwell RR 1977 Microbiological effects of metal ions in Chesapeake Bay water and sediment Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 53 99 103 Literaturverzeichnis 123 Modi RI Wilke CM Rosenzweig RF Adams J 1991 Plasmid macro evolution selection of deletions during adaptation in a nutrient limited environment Genetica 84 195 202 Moller S Kristensen CS Poulsen LK Carstensen JM Molin S 1995 Bacterial growth on surfaces automated image analysis for quantification of growth rate related parameters Applied and Environmental Microbiology 61 741 748 Munger K Lerch K 1985 Copper metallothionein from the fungus Agaricus bisporus chemical and spectroscopic properties Biochemistry 24 6751 6756 Murasugi A Wada C Hayashi Y 1981 Purification and unique properties in UV and CD spectra of c
104. d ub gt Halde b gt Acker b abnimmt Ergebnisse 68 Tab 25 Dabei sind die Unterschiede zwischen Acker wb und den drei anderen B den zwi schen Acker b und den drei anderen B den sowie der Unterschied zwischen Wald ub und Acker b gesichert p 0 05 der Unterschied zwischen den Naturb den Wald ub u Halde b dagegen nicht Da wie schon dargelegt wurde Kap 2 2 4 eine gro e Variation der Wachstumsraten der aus einem Boden isolierten Pilze ein Indikator f r deren Diversit t darstellt wurden f r die jeweils drei Stichproben aus den vier B den die Variationskoeffizienten des Wachstums errechnet Wie die Tabelle 25 zeigt nimmt der mittlere Variationskoeffizient des Wachstums in der Reihenfolge Acker wb gt Acker b gt Wald ub gt Halde b ab Wie beim durchschnittlichen Wachstum sind die Unterschiede zwischen Acker wb und den anderen B den sowie zwischen Acker b und Halde b gesichert p 0 05 dagegen nicht die Unterschiede zwischen Wald ub und Acker b bzw Halde b Tab 25 Einfluss von Schwermetallstress auf den Variationskoeffizienten des linearen Wachstums von Pilzisolaten aus belasteten und unbelasteten B den LSD p 0 05 n 3 Zwischen den Ackerb den waren die Unterschiede signifikant nicht aber zwischen Wald und Haldenboden Die Wachstumsdaten aller Isolate befinden sich im Anhang unter 7 3 s beiliegende CD Acker wb Ackerb Waldub Halde b Versuch 1 Anzahl Isolate 132 142 126 129 Du
105. den ausgew hlt Dies sollte sicherstellen dass schnellw chsige Pilze gegen ber langsameren Pilzen nicht im Vorteil wa ren bzw bevorzugt wurden um eine Verfalschung der Pilzdiversit t m glichst auszuschlie Den Zur Anzucht der Pilze wurde 1 ml der geeigneten Bodensuspension in eine Petrischale gegeben und nach dem Koc schen Plattenguss mit 10 ml auf 45 C abgek hltem N hrme dium Tab 5 vermengt Dem abgek hlten Nahrmedium wurde als Antibiotikum 300 mg Material und Methoden 24 Streptomycinsulfat zugesetzt Nach Festwerden des Mediums wurden die Petrischalen inver tiert und bei 25 C inkubiert Die heranwachsenden Pilze wurden im Verlauf der folgenden Tage mittels Impfspatel isoliert und auf Schr gagarr hrchen 6 ml gleiches Medium ohne Streptomycinsulfat zwecks Stammhaltung berimpft Kultivierung der Pilze Exakt 20 ml N hrmedium Tab 5 welches unter Verwen dung von gereinigtem optisch klarem Agar hergestellt worden war wurden in eine sterile Kunststoffpetrischale mit Nocken C A Greiner amp S hne GmbH Kremsm nster Osterreich 8 6 cm gegeben Diese Schalen bieten f r bildanalytische Untersuchungen gegen ber Glaspetrischalen den wesentlichen Vorteil der optischen Einheitlichkeit Zur Vermeidung von st renden Nachbarkolonien die durch streuende Sporen w hrend des Animpfvorgangs verur sacht werden k nnen wurden sporulierende Pilze mittels Sporensuspension die jeweils mit steriler Prill s
106. den beiden Bodenpaaren gesicherte Unterschiede an sondern auch jeweils zwischen den Acker und den Naturb den Diesen eindeutigen Schwermetalleffekt l sst auch das in der Abbildung 19 gezeigte Dendro gramm erkennen Deutlich ist die Anordnung aller drei Versuche eines Bodens als Triplett zu sehen sowie die deutliche Abgrenzung zwischen den B den Die gr te Streuung trat inner halb des Haldenbodens auf wbi A wb2 A wb3 W ubl W ub2 W ub3 A bl A b2 A b3 20 40 60 Distanz 80 100 120 Abb 19 Ahnlichkeit in der katabolischen Vielseitigkeit zwischen den Acker und Naturb den basierend auf der Verteilung von reziproken Abbauzeiten Atmungsmaxima aromati scher S uren Distanz 0 totale hnlichkeit Alle drei Versuche eines Bodens clustern auf einer geringen Distanzstufe als Triplett Bodenpaar I Ackerb den A wb wenig belastet b belastet Bodenpaar II Wald W und Haldenboden H ub unbelastet b belastet 3 3 Wirkung von Schwermetallen auf Bodenpilze auf der Artebene Ein Nebenziel der kombinierten Bild und Clusteranalyse war es Isolate gleicher Pilz arten aus belastetem und unbelastetem Boden ohne mehrmaligen Zugriff auf die Stamm sammlung zu finden Grund f r diese MaBnahme war die Gefahr der Kontamination und ge netischen Ver nderung Segregation von Kernen der Isolate Sie wurde durch das gemeinsa me Clustern von Isolaten aus jeweils einem Bodenpaar unterst tzt Es zeigte s
107. diesem Prinzip F r die Auswahl des in dieser Arbeit eingesetzten Programms stand weniger die Visualisierung des Verwandschaftsgrads zwischen den Isolaten als similarity Distanz oder index im Vordergrund als vielmehr die Leistungsfahigkeit und Bequemlichkeit der Handhabung Wegen seiner geringen Kapazit t maximal 85 Isolate je Dendrogramm schied das MS Excel Add In Programm XLSTAT Version 4 4 von vornherein aus Das Programm Material und Methoden 31 Pirouette war zwar sehr leistungsf hig lieferte aber bei einer vergr erten Darstellung zur Identifizierung der optimalen Clusterebene nur Ausschnitte des Dendrogramms Eine groBe Kapazit t verbunden mit der M glichkeit das gesamte Dendrogramm zu vergr ern hat nur das Programm WinSTAT ebenfalls ein Excel Add In aufzuweisen das die Clusteranalyse nach der Ward Methode incremental sums of squares Beneke und Schwippert 1999 Ward 1963 durchfiihrt und Ahnlichkeiten als Distanz ausgibt In dieser Arbeit wurde fiir die Clusteranalyse daher ausschlieBlich WinSTAT eingesetzt Die Clusteranalyse liefert unter schiedlich gro e Gruppen von Bildtypen entsprechend Arten falls diese bestimmt werden die in die Berechnung kologischer Indices eingehen Kap 2 2 4 2 2 2 1 5 Beurteilung der Unterscheidungskraft der in der Bildanalyse eingesetzten Messparameter durch Hauptkomponentenanalyse Ein Messparameter der sich aufgrund seiner spezifischen Messwerte von anderen Pa rameter
108. drei gezeigten Pilzar ten weisen ein hnliches durchschnittliches lineares Wachstum auf lineares Wachstum Pilzart Herkunft Isolatzahl DW MA P nigricans Acker wb 20 1 315 0 150 0 114 Acker b 20 1 374 0 111 0 081 P fellutanum Wald ub 20 1 376 0 077 0 056 Halde b 20 1 429 0 104 0 073 frequentans Wald ub 57 1 407 0 065 0 046 wb wenig belastet ub unbelastet b belastet DW Durchschnittswert mm d MA Mittlere Abweichung VK Variationskoeffizient MA DW Ergebnisse 80 3 3 2 Einfluss der Bodenbelastung mit Schwermetallen auf die katabolische Vielseitig keit von Isolaten dreier Arten der Gattung Penicillium Wie in Material und Methoden dargelegt Kap 2 1 3 1 u 2 1 3 2 wurden fir diese Untersuchungen aromatische S uren Polymere und hydrophobe Substanzen als Testsubstrate verwendet Die Bereitung der Medien wurde an gleicher Stelle beschrieben Von den drei untersuchten Arten wurde Penicillium nigricans aus den Ackerb den P fellutanum aus den Naturb den und P frequentans nur aus dem Waldboden isoliert Die Nutzung aromatischer S uren durch die drei Arten ist in der Tabelle 32 zusam mengestellt Es wird deutlich dass von den angebotenen Verbindungen etwa eine H lfte von allen Isolaten der drei Arten ein anderer Teil dagegen von keinem Isolat genutzt wurde Da durch sind die M glichkeiten einer Differenzierung der Arten aufgrund ihrer katabolis
109. e gro e hnlichkeit untereinander signalisieren Dabei sind die hnlichkeiten zwischen den zum gleichen Zeitpunkt entnommenen Proben aus belastetem und wenig be lastetem Ackerboden A wbl u A bl A wb2 u A b2 sogar gr er als zwischen den Proben aus dem selben Boden Gleiches gilt f r die beiden Proben die im rechten Ast angeordnet sind A wb3 u A b3 Diskussion 107 E ud e M z z SZ e e lt lt lt lt lt lt 0 50 S z 100 a 150 200 Abb 29 Dendrogramm nach Clusteranalyse der 40 hintereinander angeordneten Hauptkom ponenten zwei f r jeden der 20 Messparameter jeder Stichprobe Es clustern berwiegend Datens tze gleichen Probenahmezeitpunkts und nicht gleicher Belastungsstufe zusammen Bodenpaar I Ackerb den A wb wenig belastet b belastet Bodenpaar II Wald W und Haldenboden H ub unbelastet b belastet Eine entsprechende bereinstimmung zwischen den Pilzgemeinschaften aus Wald und Haldenboden existiert verst ndlicherweise nicht obwohl auf pH Gleichheit und gleichen Bewuchs geachtet wurde Die Tatsache dass beide Bodentypen Unterschiede in der Korngr Denverteilung und im Wasserhalteverm gen aufweisen und etwa 100 km voneinander entfernt sind hatte anscheinend gr eres Gewicht Die gr ere hnlichkeit zwischen Proben gleichen Entnahmedatums als zwischen Proben gleicher Belastung bei den Ackerb den macht nicht nur deutlich dass es sinnvoll ist Prob
110. ean Brightness Mean Density Gray Variation Bright Variation Density Variation Oberseite Mean Gray Mean Red Mean Green Mean Blue Hue Typical Mean Saturation Mean Brightness Mean Density Pilze die zum Zeitpunkt der Bildaufnahme 7 d nach Animpfen den Petrischalenrand erreicht hatten lie en sich nicht mehr wie beschrieben segmentieren Um dennoch die Farben dieser Isolate messen zu k nnen wurde ein Kreis definierter Gr e Sonde aufgezogen in nerhalb dessen die Farben des Pilzes gemessen werden konnten Der Messkreis wurde von der Schalenmitte her aufgezogen und endete kurz vor dem Rand der Schale ber eine Hilfsmar kierung auf dem Monitor konnte die Gr Be des Messkreises reproduziert werden 2 2 2 1 4 Clusteranalyse der Bilddaten Die 19 Farbrohdaten und der aus der Gr enmessung abgeleitete Wert f r das lineare Wachstum mm d waren f r die Auffindung von hnlichkeiten zwischen den verschiede nen Pilzisolaten vorgesehen Diesem Zweck diente eine Clusteranalyse Flury und Riedwyl 1983 Steinhausen und Langer 1977 In der Regel beruht die Clusteranalyse Cluster Gruppe auf der Gleichbehandlung aller Daten und wurde auch so angewendet Die Ahnlich keiten zwischen den Isolaten wurden in Form eines Dendrogramms ausgegeben das einer Art Verwandtschaftsstammbaum entspricht und auf einem hierarchischen bin ren Einteilungs prinzip beruht Mit geringen Abweichungen arbeiten die drei eingesetzten Programme nach
111. egen ber Schwermetallen zu steigern sie verlieren anscheinend F higkeiten zur Nutzung seltener meist schwer abbaubarer aromatischer S uren Dies gilt f r die Gemeinschaftsebene Burkhardt et al 1993 Reber 1992 Wenderoth und Reber 1999 a aber auch f r die Artebene Wende roth et al 2001 und ist damit zu erkl ren dass sich zuf llige Verlustmutanten unter den Stressbedingungen anreichern Der m gliche biochemische und kologische Nutzen verminder ter katabolischer Vielseitigkeit wurde darin gesehen dass Bakterien ohne die genannten Fahig Einleitung 4 keiten unter Schwermetallstress von energetisch nutzlos gewordenen Substraten Reber und Wenderoth 1997 nicht mehr zur Synthese katabolischer Enzyme gezwungen werden und wegen der Beschrankung vor allem auf energetisch profitable Substrate ihren Stoffwechsel relativ beschleunigen k nnen Dies ist m glicherweise f r die Aufrechterhaltung von Toleranz mechanismen notwendig und kann erkl ren warum Arten ohne diesen Mechanismus aus einer Gemeinschaft verschwinden k nnen und so deren Diversit t abnehmen lassen Weiter wurde diskutiert dass Bakterien die weniger genetische Information weitergeben m ssen von den noch verf gbaren leichter abbaubaren Substraten zwar kleinere aber evtl mehr und potentiell schneller wachsende Zellen bilden Diese These wird durch Ergebnisse von Modi et al 1991 und Bowater et al 1996 gest tzt Die Abnahme der kataboli
112. eigte dass diese Bildtypen alle zu P fellutanum geh rten Die hier vorgestellte Methode zur Absch tzung der Pilzdiversit t hat den gro en Vorteil dass alle Proben durch das Clustern auf einer durch das erste even ness Minimum definierten hnlichkeitsstufe der gleichen Behandlung unterworfen werden Sie wird f r besser als solche Methoden gehalten bei denen die Bestimmung der Isolate zum einen zur Art zum anderen aber nur zur Gattung erfolgt z B Jordan und Lechevalier 1975 Nordgren et al 1985 Diskussion 103 Neben der kombinierten Methode aus Bild und Clusteranalyse zur Abschatzung der strukturellen Diversit t von Stichproben aus Pilzgemeinschaften wurde in dieser Arbeit ein weiteres bildanalytisches Verfahren entwickelt das erlaubt die relative Biomassebildung von Pilzen bei Wachstum auf festem Medium aus dem Produkt von relativer Koloniedichte Ex tinktion im Durchlicht und relativer Kolonieflache abzusch tzen Kap 3 1 2 Ziel war die m glichst genaue Erfassung von Schwermetallwirkungen auf der Stammebene Dabei stand die Auffindung von Pilzst mmen die hinsichtlich ihrer Toleranz Resistenz gegen ber Schwermetallen unterschiedlich reagierten Screening im Vordergrund des Interesses Wie die Daten der Abbildungen 20 und 21 zeigen ist die bildanalytische Methode f r diesen Zweck geeignet Durch die gleichzeitige Bestimmung von Kolonieflache und Koloniedichte vermittelt sie sogar ein differenzierteres Bild der Reakt
113. eit eine schnelle Me thode zur Absch tzung der strukturellen Diversit t von Pilzgemeinschaften zu entwickeln Dabei ist es nicht n tig wie auch in einigen der oben zitierten Arbeiten verfahren wird die verschiedenen pilzlichen Isolate einer Stichprobe bis zur Artebene zu identifizieren Wichtig erschien vor allem insbesondere beim Vergleich zweier Stichproben aus unterschiedlich kon taminierten B den dass diese bei der Clusteranalyse simultan analysiert d h quasi wie eine Stichprobe behandelt wurden Dass die Bildanalyse durchaus in der Lage ist Arten zu unter scheiden zeigte ein Versuch mit definierten Arten die jeweils mit drei parallelen Kulturen analysiert wurden Abb 12 Nur bei der Art Penicillium fellutanum die mit drei Isolaten in die Analyse einging waren die Tripletts zweier Isolate durchmischt Dies beruhte wahrschein lich darauf dass die sechs Kulturen dem gleichen Stamm angeh rten und nicht etwa auf ge ringer Leistungsf higkeit des Bildanalysesystems Wie Arbeiten anderer Autoren zeigten ist eine Artbestimmung bei der Absch tzung der strukturellen Diversit t von Mikroorganismengemeinschaften nicht unbedingt erforder lich Schon Lindenbein 1952 hat die Diversit t von Streptomyceten durch Analyse von Farbmustern bei Kultur auf verschiedenen Medien ermittelt w hrend Reber 1992 versuchte die Diversit t von Bakteriengemeinschaften aufgrund der von den einzelnen Isolaten genutz ten Substrate abzusch tzen Be
114. en aus den zu verglei chenden Stichproben und der Mittelung der jeweils zugeh rigen Artenzahlen besteht Dabei Material und Methoden 38 wird die Gr e der Unterstichprobe so gew hlt dass sie kleiner als die kleinste der zu ver gleichenden Stichproben ist Folglich werden gro e Stichproben etwas st rker ausged nnt rarefied als kleine Werden in dieser Zufallsrechnung Monte Carlo Verfahren Crowley 1992 verschieden groBe Unterstichproben gezogen so ergeben sich sogenannte rarefaction Kurven die die tats chlichen Unterschiede zwischen zwei Stichproben wahrheitsgem wi derspiegeln Es ist klar dass dieses Verfahren wegen der Mittelung Dezimalzahlen liefert F r die Durchf hrung dieser Rechnungen standen laboreigene DOS Programme zur Verf gung Kap 2 1 4 In der vorliegenden Arbeit wurde die Zahl der Bildtypen auf die Unterstichpro bengr e von 125 Isolaten Individuen bezogen Ein Beispiel f r die Unterscheidung zweier Stichproben mittels rarefaction zeigt die Abbildung 3 unbelastet belastet Zahl der Bildtypen 0 25 50 75 100 125 150 175 Zahl der Isolate Abb 3 Beispiel f r den korrekten Vergleich des Artenreichtums von Stichproben durch rarefaction In dieser Arbeit wurde die Zahl der Bildtypen zwecks Vergleich auf die Unterstichprobengr e von 125 Isolaten Individuen bezogen Pfeile Variationskoeffizient des Wachstums Die Absch tzung der Diversit t mikrobieller Gemeinschaf
115. en gleichen Isolierungszeitpunkts zu vergleichen son dern weist indirekt auch auf die G te der Bildanalysedaten f r Diversit tsanalysen hin Die in dieser Arbeit gefundenen Unterschiede hinsichtlich der strukturellen Diversit t von Pilzgemeinschaften zwischen den Varianten der beiden Bodenpaare waren so gering dass sie statistisch nicht gesichert werden konnten Dagegen waren zumindest zwischen den beiden Ackerb den Unterschiede hinsichtlich der Wachstumsrate der Pilze Durchschnittswert u Variationskoeffizient sicher Dies kann als Indiz daf r gelten dass die strukturelle Diversitat bei Pilzen als ein Indikator f r Stresswirkungen weniger empfindlich ist als Durchschnittswert und Variationskoeffizient des Wachstums Die vermeintlich geringe Empfindlichkeit der Di versit t in den Ackerb den gegen ber Schwermetallen k nnte aber auch andeuten dass im Diskussion 108 Laufe der Jahre die letzte Aufbringung schwermetallhaltigen Kl rschlamms auf die Parzellen lag zur Zeit der ersten Probenahme etwa zehn Jahre zur ck eine Rediversifizierung im be lasteten Boden stattgefunden hat Diese kann man sich so vorstellen dass einige der schnell w chsigen Arten durch stressadaptierte langsamw chsige Arten ersetzt wurden Immerhin ist in schwermetallbelasteten B den eine Rediversifizierung von Bakterien beobachtet worden Barkay et al 1985 Im Gegensatz zu den hier an Pilzen gewonnenen Ergebnissen erbrach ten die von Wenderoth 199
116. en sich durchmischenden Tripletts von P fellutanum tats chlich einem Stamm angeh ren darf sogar eine Trefferquote von 100 angenommen werden Ergebnisse 54 Pfu Pe Sb Pfb Pfa Pfc AS Hv Ch Sc 100 200 300 400 500 600 700 800 Distanz Distanz gt S Ex Lt Lu FA b Abb 12 Dendrogramm geclusterter Bildanalysedaten Kameraabstand 36 cm Daten s im Anhang unter 7 2 von 29 Pilzst mmen drei Parallelen Namen s Tab 12 a Gesamtansicht mit einem Distanzbereich von 0 800 b Vergr erungsausschnitt aus der Abbildung 12 a mit einem Distanz bereich von 0 1 Bis auf die Isolate Pf a und Pf b clustern alle Pilze als Tripletts Reihenfolge der Parallelen von Pf a und Pf b im Dendrogramm von links nach rechts Pf a1 Pf b3 Pf b2 Pf a2 Pf a3 Pf bl Ergebnisse 55 Die Frage welchen Anteil jeder der 20 Messparameter Kap 2 2 2 1 3 an dem in der Abbildung 12 gezeigten Differenzierungsergebnis tats chlich hat wurde zun chst durch eine Hauptkomponentenanalyse PCA der Bildanalysedaten der 29 Teststimme zu kl ren ver sucht Bei diesem statistischen Verfahren wird die Korrelation der Messparameter untereinan der d h deren Bedeutung in der Regel auf eine k nstliche zweidimensionale Ebene proji ziert Diese Projektion erfolgt so dass m glichst viele Parameter in der Nahe der beiden Hauptkomponenten
117. en von Pilzen in Acker und Naturb den 65 3 2 1 2 Wirkung von Schwermetallen auf die strukturelle Diversit t der Pilze in Acker und Naturb den 69 3 2 2 Einfluss von Schwermetallen auf die katabolische Vielseitigkeit von Pilzgemeinschaften 70 3 2 2 1 Absch tzung der katabolischen Vielseitigkeit schwermetallgestresster Pilzgemeinschaften im Boden durch Bestimmung aromatenspezifischer Vermehrungseinheiten CFU 70 3 2 2 2 Absch tzung der katabolischen Vielseitigkeit schwermetallgestresster Pilzgemeinschaften im Boden durch respirometrische Bestimmung aromatenspezifischer Abbauzeiten 75 3 3 Wirkung von Schwermetallen auf Bodenpilze auf der Artebene 78 3 3 1 Einfluss der Bodenbelastung mit Schwermetallen auf die Wuchs leistung von Isolaten dreier Arten der Gattung Penicillium 79 3015 2 Einfluss der Bodenbelastung mit Schwermetallen auf die katabolische Vielseitigkeit von Isolaten dreier Arten der Gattung Penicillium 80 3 3 3 Einfluss von Schwermetallen auf lineares Wachstum und relative Biomasse bei Penicillium fellutanum und Penicillium nigricans 83 3 3 4 Physiologisch biochemische Unterschiede zwischen vier ausge Inhaltsverzeichnis HI w hlten Isolaten von Penicillium fellutanum aus Wald und Haldenboden 88 4 Diskussion 96 4 1 Beurteilung der entwickelten Methoden 97 4 2 Wirkung von Schwermetallen auf Diversit t und katabolische Vielseitigkeit von Bodenpilzen auf der Gemeinschaftsebene 103 4 3 Wirkung der Bodenbelastung auf Wu
118. en weitgehend Pilze erfasst werden In den Tabellen 29 und 30 wurden die Ergebnisse als reziproke Werte der Abbauzeiten dargestellt Der Grund hierf r ist dass Abbauzeiten gt 150 h nicht messbar waren und als un endlich h tten gewertet werden m ssen so dass die Berechnung der Indices nicht m glich gewesen w re Der Einsatz von Kehrwerten erlaubte es dagegen solche Abbauzeiten mit dem Wert Null zu belegen Er hatte auch den Vorteil dass zunehmender Schwermetallstress durch kleiner werdende Zahlen wiedergegeben wurde Wie aus den Tabellen ersichtlich ist konnte in beiden Ackerb den 4 Aminobenzoat nicht genutzt werden Dar ber hinaus konnte im we nig belasteten Ackerboden Gentisat und im belasteten Ackerboden Anisat nicht veratmet wer den Von den Naturb den konnte ebenfalls das Substrat Gentisat nicht genutzt werden Im belasteten Haldenboden konnte f r die aromatischen S uren Terephthalat 2 6 Dihydroxy benzoat Veratrat und p Toluat keine Nutzung festgestellt werden Ergebnisse 76 Tab 29 Absch tzung der katabolischen Vielseitigkeit von Ackerb den durch Verrechnung der reziproken Abbauzeiten Atmungsmaxima aromati scher S uren LSD p 0 05 3 Die Unterschiede zwischen den Ackerb den waren signifikant Acker wb Versuch Nr Substrat 2 0 05556 0 04762 0 04545 0 04167 0 04000 0 04000 0 03571 0 03333 0 03448 0 03226 0 03333 0 02857 0 02632 0 02381 0 02439 0 02381 0 02381 0 0
119. end Pitt 1990 mikroskopische und makroskopische Merkmale zur Klassifizierung von Pe nicillien bildanalytisch bestimmte Die Methode wurde auch zur Bestimmung von Wachs tumsraten der Kolonien von Krebszellen Slocum et al 1990 bzw Bakterien Wimpenny et al 1995 eingesetzt Die Zahlung bakterieller Kolonien auf Agarplatten ist ebenfalls be schrieben worden Colin 1996 1997 Bereits 1986 gelang es Bjernsen durch Anwendung der Bildanalysetechnik in Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie die Biomasse von Bakterioplankton aus der Fl che der Zellen im mikroskopischen Bild zu bestimmen Eine Methode zur schnellen Abschatzung der bakteriellen Abundanz des Biovolumens der Mor phologie und des Wachstums durch Bildanalyse entwickelten Blackburn et al 1998 Das Wachstum von Bakterien auf Oberfl chen konnte mit der Bildanalyse durch Messung wachs tumsbezogener Parameter quantifiziert werden Meller et al 1995 Meijer et al 1990 konnten durch morphometrische Vermessung mikroskopischer Bilder von bakteriellen Rein kulturen zeigen dass trotz innerartlicher Variation bestehende Unterschiede zwischen Arten bildanalytisch feststellbar sind Eine Unterscheidung von Bakterienzellen in Mischkulturen war durch interaktive semi automatische Segmentierung Kap 2 2 2 1 3 vorher aufgenom mener Bilder von Pr paraten m glich Dubuisson et al 1994 Dass die interaktive Segmen tierung digitaler Bilder oft genauer als die automatische Segmentier
120. entwickelten Bild analysemethode Stelzer 1997 wurden Pilzst mme aus der Sammlung des Instituts f r Mik robiologie der T U Braunschweig sowie drei Isolate der Art Penicillium fellutanum aus den eigenen Isolierungsarbeiten vermessen Diese Pilze sind mit den verwendeten Abk rzungen in der Tabelle 12 alphabetisch aufgef hrt Material und Methoden 21 Tab 12 Pilzstamme Pilzart Abk rzung 1 Alternaria sp As 2 Aspergillus flavus Af 3 Aspergillus niger An 4 Aspergillus ochraceus Ao 5 Botrytis allii Ba 6 Cladosporium cucumerinum Ce 7 Cladosporium herbarum Ch 8 Eurotium repens Er 9 Fusarium culmorum Fc 10 Gliocladium sp Gs 11 Hormodendrum violaceum Hv 12 Hypomyces sp Hs 13 Mortierella ramanniana Mr 14 Mucor flavus Mf 15 Mucor mucedo Mm 16 Oidiodendron rhodogenum Or 17 Paecilomyces lilacinus 18 Penicillium camemberti 19 Penicillium funiculosum Pfu 20 Penicillium fellutanum Isolat 1 Pfa 21 Penicillium fellutanum Isolat 2 Pfb 22 Penicillium fellutanum Isolat 3 Pfc 23 Penicillium notatum Fleming Stamm Pn 24 Scopulariopsis brevicaulis Sb 25 Stachybotrys chartarum Sc 26 Trichoderma harzianum Th 27 Trichoderma viride Tv 28 Trichothecium roseum Tr 29 Verticillium cinnabarinum Ve 2 2 Methoden 2 2 1 Bestimmung physikalisch chemischer Parameter von Bodenproben Bestimmung des Boden pH Werts Zur Bestimmung des pH Werts der B den wur den nach dem Sieben 10 g Boden
121. er Bildqualit t m glich gewesen Wie die Abbildungen 4 7 zeigen sind morphologische Strukturen relativ undeutlich zu erkennen ein Umstand der nicht nur auf der unbefriedigenden Druckqualit t sondern auch auf der ungen genden Ab stimmung zwischen Bildebene Chipfl che der Kamera und dem verwendeten Objektiv be ruht Der Chip der eingesetzten Fluoreszenzkamera hatte eine lichtempfindliche Fl che von 107 53 mm das f r die Makroaufnahmen zur Verf gung stehende Objektiv Mikro NIKKOR 60 mm ist aber f r eine Kleinbildkamera mit der Bildfl che von 864 mm vorgesehen und hat in Verbindung mit der Kamera eine ausgesprochene Tele Funktion 8 fach Die Verwendung einer Sony Kamera in Kombination mit einem f r Makroaufnahmen offensichtlich besser geeigneten Objektiv f hrte im Rahmen einer Zusammenarbeit mit der Firma Nikon D ssel dorf zu Aufnahmen einer wesentlich besseren Qualitat Stelzer et al 1999 so dass insbe sondere Unterschiede zwischen den Pilzen hinsichtlich der Verteilung von Farben und Hellig keitswerten z B Bright Variation gr er gewesen w ren Wie schon dargelegt wurde handelt es sich bei der hier vorgestellten Methode zur Gruppierung von Pilzisolaten um eine Kombination aus Bild und Clusteranalyse Aus der Tatsache dass in einem Kontrollversuch zur berpr fung der Methode jeweils drei gleichzei tig angeimpfte Kolonien einer Art im Dendrogramm immer als Triplett auf hoher hnlich keitsstufe auftraten ko
122. ermetallbelasteten B den Schwermetalle hatten keinen Einfluss auf die katabolischen F higkeiten zur Nutzung von aromatischen S uren bei den Arten P nigricans und P fellutanum Die Substratnutzungs spektren befinden sich im Anhang unter 7 4 Zahl getesteter Isolate Substrate Hippurat 4 Hydroxycinnamat Phenylalanin Benzoat Cinnamat 2 Aminobenzoat 4 Hydroxybenzoat 2 Hydroxybenzoat 3 Hydroxybenzoat 2 4 Dihydroxybenzoat Anisat 4 Methoxycinnamat Hofbildung Phenylacetat Veratrat Mandelat 4 Aminobenzoat Gentisat 2 6 Dihydroxybenzoat Phthalat Terephthalat Nicotinat Summe der Haufigkeiten Leistungsf higkeit 20 20 Vielseitigkeit 1 37 1 33 0 8555 0 8475 0 7561 0 7944 0 8513 wb wenig belastet ub unbelastet b belastet Konzentration 10 mM Nutzung Angebot Summe der tats chlichen Haufigkeiten Summe der maximal m glichen H ufigkeiten Die Untersuchungen zur Nutzung von Polymeren und hydrophoben Substanzen f hr ten im Prinzip zu keinem anderen Ergebnis Tab 33 P fellutanum scheint sich von den bei den anderen Arten durch die Nutzung von Paraffin bzw die Nichtnutzung von Rhamsan und Gellan zu unterscheiden w hrend sich P frequentans durch etwas h here Indices von den Ergebnisse 82 beiden anderen Arten abhebt Hinsichtlich des Abbaus von Polymeren f hrten Schwermetalle be
123. et J ngere Arbeiten zur berlebensstrategie von Pilzen stammen von Pugh 1980 und Cooke und Whipps 1993 In seinem bersichtsartikel schreibt Pugh 1980 dass die beiden Muster schnelles Wachstum mit starker Reproduktion und langsames Wachstum mit geringer Reproduktion zwar der erstmals bei Tieren beschriebenen Strategien r und K MacArthur und Wilson 1967 oder ruderalem bzw kompetitivem und stressangepasstem Verhalten bei Pflan zen Grime 1979 entsprechen In Anbetracht ihres komplexen Verhaltens hielt er die beiden Einleitung 5 Extreme r und K aber nicht ausreichend fiir die Beschreibung der Uberlebensstrategien von Pil zen und schlug insgesamt vier Katagorien vor die das Verhalten gegen ber Stress einschlieBen Tab 1 Tab 1 Beschreibung von Uberlebensstrategien bei Pilzen nach Pugh 1980 Uberlebensstrategie Merkmale RUDERALES VERHALTEN Schnelles Wachstum und starke Sporulation Uberleben bei geringem Stress hohe Ansprii che an Energiequelle entsprechend r Strate gie Zuckerpilze KOMPETITIVES VERHALTEN Langsames Wachstum und geringe Sporulati on Uberleben bei geringem Stress geringe Anspr che an Energiequelle entspechend K STRESS TOLERANZ Langsames Wachstum geringe Sporulation berleben bei starkem Stress geringe An spr che an Energiequelle BERLEBENDE FL CHTENDE Pilzarten dieser Kategorien besitzen besonde re Strukturen die das berleben bei Aus trocknung oder UV Strahl
124. etrachtet wurden Unterschiede zwischen den Ackerb den waren dagegen nicht signifikant Die Abschatzung der katabolischen Vielseitigkeit aus der Verteilung koloniebildender Ein heiten CFU zeigte dass Schwermetalle in dieser Hinsicht wirkungslos waren Dies galt so wohl fiir die Gemeinschaftsebene als auch fiir die Artebene Penicillien Unterschiede be standen aber zwischen den beiden Bodenpaaren Auf der Bodenebene waren aufgrund spezi fischer Verz gerungen in der Veratmung von aromatischen S uren deutliche Unterschiede zwischen den vier Pilzgemeinschaften zu erkennen Grund hierf r ist die fortdauernde Wirk samkeit hoher Protonen und Schwermetallkonzentrationen Eine Kontamination von N hrboden mit Kupfer f hrte bei Isolaten von P fellutanum aus unbelastetem Waldboden zu einer st rkeren Reduktion von Wuchsleistung und Koloniedichte und damit der relativen Biomasse als bei Isolaten aus belastetem Haldenboden Biochemisch konnte nachgewiesen werden dass die Isolate aus unbelastetem Waldboden bei Gegenwart von Cu Ionen ein h heres SH P Verh ltnis aufwiesen als Isolate aus be lastetem Haldenboden Die Mehrsynthese von SH Gruppen wurde als Bildung von Metal lothioneinen verstanden durch die Pilze eingedrungene Schwermetalle detoxifizieren k nnen Starke Reduktion der Biomassebildung und gleichzeitige Mehrsynthese energetisch teurer SH Gruppen bei Isolaten von P fellutanum aus Waldboden sowie geringe Biomassereduktio
125. eworfene Problem die nicht ausreichende Definition der beiden Begriffe Schwermetalltoleranz und Schwermetallresis tenz gefunden werden kann Alle in dieser Arbeit durchzuf hrenden Experimente sind in den FlieBschemata 1 und 2 dargestellt Einleitung 11 Flie schema 1 Untersuchung der Testb den Isolierung von 400 Bodensuspension Pilzen je Boden geeignet verd nnt Bestimmung des linearen Substratnutzungsspektrum Wachstums und der Farbgebung von 21 aromatischen S uren Aromatenspezifische Ver mehrungseinheiten CFU Strukturelle Diversitat Katabolische Vielseitigkeit Flie schema 2 Untersuchung von pilzlichen Reinkulturen ES Bildanalytische Bestim Substratnutzungsspektrum Substratnutzungsspektrum mung der relativen Bio von 15 Polymeren von 21 aromatischen S uren massebildung auf jedes Isolats durch Bildanalyse Schwermetall Agarplatte li Deutung des Wachstums auf Agarplatte Simultane Bestimmung von Biomasse SH Gruppen und l Proteingehalt in Schwermetall Fl ssigkultur Genutzte Substrate je Isolat Toe nalen ge Katabolische Vielseitigkeit gen ber Schwermetall Material und Methoden 12 2 Material und Methoden 2 1 Material 2 1 1 Boden Die Untersuchungen zur strukturellen Diversit t und katabolischen Vielseitigkeit schwermetallgestresster und ungestresster Bodenpilze wurden an vier B den durchgef hrt die zu zwei Bodenpaaren zusammengefasst wurden Bodenpaar I best
126. fation zus tzliche Reduktions quivalente die dem Organismus f r die Syn these von Biomasse fehlen falls im Medium nicht gen gend Verbindungen mit reduziertem Schwefel Methionin Cystein Glutathion zur Verf gung stehen Bei den beiden Isolaten von P fellutanum aus belastetem Haldenboden wurde weder der starke Abfall der Biomassebil dung im Mittel nur 17 bei 1 mM Cv noch eine Mehrsynthese von SH Gruppen gemes sen Diese beiden Isolate m ssen also einen Mechanismus besitzen der die energetisch teure Biosynthese von SH Gruppen bei Wachstum in Gegenwart von Schwermetallen reprimiert Um welchen Mechanismus es sich dabei handelt war hier nicht Gegenstand der Untersu chungen Denkbar ist eine ge nderte Permeabilit t der Zellwand f r Schwermetalle oder ihre extrazellul re Chelatisierung bzw Prazipitation durch sekretierte Metabolite Cervantes und Gutierrez Corona 1994 Tomsett 1993 Die Beziehung zwischen Biomasse und dem SH zu Protein Verh ltnis jeweils bezogen auf die ungestresste Variante ist in der Abbildung 30 dargestellt Diskussion 114 gt gt E E 0 0 5 1 0 0 0 5 1 0 Relative Biomassebildung b Relative Biomassebildung E 2 5 2 5 2 2 2 0 2 0 oe dos SR 1 0 5 0 1 0 a d 0 5 0 5 Q Q 24 0 24 0 0 5 1 0 0 5 1 0 E Relative Biomassebildung d Relative Biomassebildung Abb 30 Korrelation zwischen relativer Biomassebildun
127. fferent types of biological collections Journal of Theoretical Biology 13 131 144 Pitt JI 1990 PENNAME a new computer key to common Penicillium species In Modern concepts in Penicillium and Aspergillus classification Samson RA Pitt JI Hrsg Ple num Press New York and London 279 281 Literaturverzeichnis 124 Pochon J Tardieux P 1962 Techniques d analyse en microbiologie du sol Editions de la Tourelle St Mande Seine Powlson DS 1976 Effects of biocidal treatments on soil organisms In Soil microbiology a critical review Walker N Hrsg Butterworths London and Boston 193 224 Pugh GJF 1980 Strategies in fungal ecology Transactions of the British mycological Soci ety 75 1 1 14 Raper KB Thom C 1949 A manual of the Penicillia The Williams amp Wilkins Company Baltimore Reber HH 1973 Comparative studies with two Pseudomonads on the sequential degradation of aromatic substances metabolized via different pathways Archiv fiir Mikrobiologie 89 305 315 Reber HH 1975 Investigation on the sequential degradation of aromatic substances in Pseu domonads In Biod gradation et humification Kilbertus G Resinger O Mourrey A und da Fonseca C Hrsg Pierron Sarragu mines Reber HH 1992 Simultaneous estimates of the diversity and the degradative capability of heavy metal affected soil bacterial communities Biology and Fertility of Soils 13 181 186 Reber HH Wenderoth DF 199
128. g und relativem Verh ltnis von Sulf hydrylgruppen zu Protein SH P in kupferbelasteter Fl ssigkultur bei Isolaten von Penicilli um fellutanum aus Haldenboden H a u b und Waldboden W c u d Kupfer wurde in den Konzentrationen 0 0 5 1 u 1 5 mM Isolate aus Haldenboden bzw 0 0 33 0 67 u 1 mM Isolate aus Waldboden appliziert Nur bei den Isolaten aus Waldboden W geht das relative Verh ltnis von SH P mit zunehmender Kupferkontamination ber einen Wert von 1 hinaus Aufgrund dieser Messungen scheint die oben angesprochene Hypothese von Atlas 1984 schon deshalb als wenig stichhaltig weil durch den in der Natur vorherrschenden Wechsel der Bedingungen Verf gbarkeit von C und Energiequellen Temperatur und Feuch tigkeit Fressfeinde und Parasiten einmal die eine dann die andere Gruppe von Organismen relativ im Vorteil ist Bei konstanten Bedingungen w rden die meisten Organismen mit hnli chen Anspr chen bzw Fahigkeiten aus einem Habitat verschwinden Verlust von Redun danz Konkurrenz zwischen Arten kann daher nicht als Ursache f r die Diversit t von Mikroorganismengemeinschaften angesehen werden Vielmehr scheint sie wie die Redun Diskussion 115 danz oder die Diversit t eine Folge der nat rlichen Oszillation der Umweltbedingungen zu sein Die simultane Bestimmung von Biomassereduktion und Repression der Biosynthese von SH Gruppen in Kulturen von Penicillium fellutanum unter Schwermetalleinfluss erm g
129. gesetzten Messparameter durch Hauptkomponentenanalyse 31 2 2 2 2 Abschatzung der Leistung von Pilzgemeinschaften im Boden 31 223224 Bestimmung aromatenspezifischer Vermehrungseinheiten von Pilzen 31 2 2 2 2 2 Bestimmung aromatenspezifischer Abbauzeiten in Bodenproben 32 2 2 3 Physiologische Untersuchungen an Reinkulturen 33 2 2 3 1 Tests auf Nutzung von aromatischen S uren Polymeren und hydrophoben Substanzen 33 2 2 3 2 Untersuchungen zur Toleranz Resistenz von Pilzen 34 2 2 3 2 1 Abschatzung von Wachstum und relativer Biomassebildung 34 22 322 Nachweis von Protein und Sulfhydryl SH Gruppen 34 2 2 4 Bestimmung kologischer Indices 37 Inhaltsverzeichnis 3 Ergebnisse 42 3 1 Entwicklung von Methoden 42 3 1 1 Entwicklung und Erprobung eines kombinierten Verfahrens aus Bild und Clusteranalyse zur Bestimmung der strukturellen Diversitat von Stich proben aus Pilzgemeinschaften 42 3 1 1 1 Suche nach geeigneten Bedingungen f r die Bildaufnahme 45 3 1 1 2 Differenzierungskraft der 20 Messparameter beim Kameraabstand von 36 cm 53 3 1 1 3 Suche nach der geeigneten Clusterebene 60 3 1 2 Entwicklung einer Methode zur Absch tzung der Wirkung von Schwermetallstress auf die Biomasse von Pilzkolonien durch bildanalytische Bestimmung von Koloniefl che und Koloniedichte 62 3 2 Wirkung von Schwermetallen auf Bodenpilze auf der Gemeinschaftsebene 65 3 2 1 Wirkung auf die Diversit t von Pilzgemeinschaften 65 3 2 1 1 Verteilung der Wuchsleistung
130. gricans 20 Isolate keine Nutzung of 5 Z I o E 27 o S 5 3 S x bai e bai D O x 5 a s z i o o ij e Ay a a 4 9 O D O z i Z s o Rz Hofbildung Wachstum belastet b 140 Anhang ai w S a kel a 3 S x R 2 gt en S S 3 2 o E Polymere 1 Nutzung 0 o S 5 3 S x bai e bai KS O x 5 a s z i o ij e Ay a a 4 9 O D z i lt s o pice Hofbildung Wachstum unbelastet ub 141 Anhang en 8 a 3 2 o amp B Polymere 1 Nutzung 0 Hofbildung Wachstum ai w S 2 a m a S 3 S S x R 2 e 2 gt E belastet o S 5 3 S x bai e bai D O x 5 a s x o ij e N 8 QO a 4 9 O D z i lt s pice b 142
131. h Stress meist in einer Reduk tion des Wachstums u ert lag es nahe auch den Einfluss von Schwermetallen auf das Wachstum von Pilzen bildanalytisch zu untersuchen Vorversuche hatten gezeigt dass dabei nicht nur das L ngenwachstum erkennbar an einer reduzierten Koloniefl che sondern auch die Koloniedichte ersichtlich an einer erh hten Lichtdurchl ssigkeit d h an einer reduzierten Extinktion in Mitleidenschaft gezogen wird Es wurde angenommen dass das Produkt beider Gr en ein besseres Bild von der Wirkung eines Stressors ergibt als jede f r sich allein so dass es sinnvoll erschien mit der Messung von Koloniefl che und dichte Ver nderungen der relativen Biomasse absch tzen zu k nnen Biomassever nderungen k nnen in der Regel nur durch W gen des in Fl ssigkulturen gebildeten Myzels ermittelt werden eine Methode die arbeitsaufw ndig und wenig reproduzierbar ist Bei der Bestimmung der Koloniefl che wurde die im Bildanalyseprogramm Lucia verf gbare Messfunktion Area nach Kalibration mit Millimeterpapier verwendet Kap 2 2 2 1 3 Die Absch tzung der Koloniedichte erfolgte unter Verwendung der Messfunktion Ergebnisse 63 Mean Gray im Durchlicht Dabei wurde die Extinktion des Lichts durch die Kolonie aus der Differenz zwischen der Lichtdurchl ssigkeit als Grauwert der unbeimpften Agarplatte Agar Petrischale hoher Wert und der Lichtdurchl ssigkeit der beimpften Agarplatte Agar Petrischale Kolonie nied
132. htung von Proben gleicher Entnahmezeitpunkte unter Beriicksichtigung des durch Streuung der CFU bedingten Messfeh lers zeigt nur noch hinsichtlich der Nutzung von 4 Methoxycinnamat in den Naturb den ei nen gesicherten Unterschied in den substratspezifischen Vermehrungseinheiten an Ergebnisse 72 Tab 27 Berechnung der katabolischen Vielseitigkeit von Bodenpilzen in Ackerb den aus der relativen Verteilung 9o aromatenspezifischer Ver mehrungseinheiten CFU LSD p 0 05 10 Platten 3 Versuche Unterschiede zwischen den Ackerb den waren nicht signifikant Bedeutungswerte Vo Acker wb Acker b Substrat Versuch Nr 1 2 3 MW 1 2 3 MW Hippurat 9 19 1 39 12 5442 23 9 16 1 74 10 30 1 95 7 61 1 29 8 24 1 98 9 71 40 90 8 52 1 08 4 Hydroxybenzoat 5 75 2 11 10 6122 67 10 54 1 26 8 97 2 79 8 66 1 27 9 50 0 95 10 58 0 90 9 58 0 96 4 Hydroxycinnamat 9 04 0 98 8 26 2 09 7 31 1 12 8 20 0 87 7 48 1 07 6 41 1 70 5 1440 79 6 34 1 17 3 Hydroxybenzoat 8 56 1 48 7 08 2 09 7 43 1 39 7 69 0 77 10 82 1 26 9 83 1 63 10 21 1 34 10 28 0 50 Phenylalanin 6 31 1 12 7 47 1 65 7 34 1 50 7 04 0 63 8 95 1 56 8 73 1 54 9 69 1 87 9 12 0 50 Phenylacetat 7 11 1 09 5 75 1 14 6 08 1 12 6 32 0 71 5 74 0 94 6 3940 84 5 33 1 04 5 82 0 53 Benzoat 6 97 1 68 5 75 1 42 6 05 1 12 6 26 0 63 5 20 0 71 5 64 0 77 5 57 1 00 5 47 0 24 Veratrat 6 11 1 26 6 33 1 56 5 99 1 19 6 14 0 17 4 38 1
133. hwermetallbelastung des Haldenbodens wahrscheinlich nicht durch sein gutes Wasserhalteverm gen kompensiert werden so dass der Variationskoeffizient der Wuchsleistung besonders niedrig war Die bildanalytische Absch tzung der strukturellen Diversit t von jeweils etwa 400 Pilzisolaten aus den vier Testb den zeigte dass die auf gleiche Stichprobengr e 125 Isola Diskussion 106 te bezogene Zahl der Bildtypen die als Index der Diversit t dem Shannon Index vorgezogen wurde in der Reihenfolge Acker wb gt Acker b gt Wald ub gt Halde b abnahm Tab 26 Bei ausschlie licher Betrachtung von Mittelwert und Standardabweichung waren die Unterschie de innerhalb der beiden Bodenpaare nicht signifikant Gesichert war nur der Unterschied zwi schen den beiden Ackerb den und dem Haldenboden Wertet man dagegen die drei Einzel versuche paarweise nach dem Zeitpunkt ihrer Probenahme aus so kann wenigstens von einer h heren Pilzdiversit t im Waldboden im Vergleich zum Haldenboden ausgegangen werden weil zu allen Probenahmezeitpunkten eine h here Zahl von Bildtypen gefunden wurde Tab 26 Schlie t man den Variationskoeffizienten der Zahl der Bildtypen in die Beurteilung der Ergebnisse ein so lie e sich eventuell noch ein weiterer Unterschied zwischen den gestressten und ungestressten Varianten jedes Bodenpaars ablesen Der h here Wert der ungestressten Gemeinschaften w rde falls er durch weitere Versuche best tigt werden k nnte w
134. i P nigricans zu einer geringf gigen Erh hung der Indices hatten aber bei P fellutanum eine uneinheitliche Wirkung Da die Reaktionen von P nigricans und P fellutanum bez glich der Nutzung von Polymeren und Aromaten gegens tzlich verliefen kann eine Schwermetall wirkung auf die F higkeit zum Abbau beider Substanzklassen praktisch ausgeschlossen wer den Die Daten zu den Substratnutzungsspektren der einzelnen Isolate befinden sich im An hang unter 7 4 Tab 33 H ufigkeit der Nutzung von 15 Polymeren und hydrophoben Substanzen durch Iso late von drei Arten der Gattung Penicillium aus unterschiedlich schwermetallbelasteten B den Schwermetalle hatten keinen gesicherten Einfluss auf die katabolischen Fahigkeiten zur Nutzung von Polymeren hydrophoben Substanzen bei den Arten P nigricans und P felluta num Die Substratnutzungsspektren befinden sich im Anhang unter 7 4 Zahl getesteter Isolate Substrate Tannin Hofbildung 19 20 15 18 Chitin 18 11 Cellulose Avicel 20 20 Ligninsulfons ure Ca Salz 16 15 Rhamsan 0 0 Gellan 0 0 Paraffin 2 1 Carragenin Xanthan Dextran Manutex RH Celluloseacetat Leistungsf higkeit 0 46 0 49 0 51 0 47 0 55 wb wenig belastet ub unbelastet b belastet Medien Substrate liegen in disperser Form vor Nutzung Angebot Summe der tats chlichen H ufigkeiten Summe der maximal m glichen H ufigkeiten Ergebnisse 83 3 3 3
135. ich dass nur zwei Bildtypen in ausreichender Zahl in beiden Varianten eines Bodenpaars vorkamen Einer Ergebnisse 79 dieser Bildtypen aus den beiden Naturb den war monoverticillat und konnte der Art Penicil lium fellutanum Domsch et al 1993 Raper und Thom 1949 zugeordnet werden Der ande re Bildtyp aus den beiden Ackerb den war divaricat und entsprach der Art Penicillium nigri cans Ein weiterer monoverticillater Bildtyp wurde nur aus Waldboden isoliert und als Peni cillium frequentans identifiziert Diese drei Arten wurden physiologisch hinsichtlich ihres Wachstums ihrer katabolischen F higkeiten sowie ihres Verhaltens gegen ber Schwermetal len untersucht 3 3 1 Einfluss der Bodenbelastung mit Schwermetallen auf die Wuchsleistung von Isola ten dreier Arten der Gattung Penicillium Die Ergebnisse der Wachstumsanalyse sind in der Tabelle 31 zusammengestellt und entsprechen den Bildanalysedaten die auch bei der Eingruppierung der Bildtypen Kap 3 2 1 2 Verwendung fanden Sie zeigen dass die Bodenbelastung mit Schwermetallen weder bei P nigricans noch bei P fellutanum zu signifikanten Ver nderungen hinsichtlich ihrer Wuchsleistung auf unkontaminiertem N hrboden Tab 5 f hrte Insgesamt sind die drei un tersuchten Arten mit einer durchschnittlichen Wuchsleistung von etwa 1 4 mm d in eine Gruppe mittlerer Wachstumsgeschwindigkeit einzuordnen Tab 31 Lineares Wachstum von Isolaten der Gattung Penicillium Die
136. icher Organismen handelt Variationskoeffizient Ma 7 DW wobei MA mittlere Abweichung vom Durchschnittswert _ wi n Anzahl der untersuchten Isolate DW Durchschnittswert aller Wachstumsraten Wi jeder einzelne von n Messwerten Indices der Verteilung von Fahigkeiten in Pilzgemeinschaften Wahrend bei der Absch tzung des Artenreichtums bzw der allgemeinen Diversitat Shannon Index einer Ge meinschaft potentiell alle Arten dieser Gemeinschaft in der Stichprobe erscheinen k nnen kann von den tats chlich vorhandenen Fahigkeiten der Gemeinschaft nur ein Bruchteil nach gewiesen werden weil nicht alle m glichen Tests durchgef hrt werden k nnen Wegen dieser Einschr nkungen ist es wenig sinnvoll die Vielfalt der Leistungen einer Gemeinschaft wie gelegentlich beobachtet Degens 1998 Degens und Harris 1997 Degens et al 2000 2001 als Diversit t anzugeben Viel sinnvoller erscheint in diesem Zusammenhang nur die Vertei Material und Methoden 40 lung der tats chlich gemessenen Fahigkeiten anzugeben Ein f r die Verteilung von Fa higkeiten ist z B die sogenannte evenness 8 Pielou 1966 die allerdings vom Shannon Index der allgemeinen Diversitat abgeleitet ist H e log A 8 wobei H Shannon Index A Zahl der angebotenen Substrate Dabei muss in der o a Gleichung 6 als Bedeutungswert f r jede substratspezifische Fahig keit der Term fi eingese
137. idance anorganisches Ion Niederschl ge resultiert Pilzliche Zellwand Erh hte Metallbindefahigkeit Vermeidung avoidance Permeabilit t Reduzierter Transport in die Zel Vermeidung le oder zunehmender Efflux avoidance Vakuolen Erh hter Transport in Abtrennung subzellul re Kompartimente sequestration Anorganische Chelatoren Ver nderter Metabolismus Abtrennung z B Sulfide sequestration Organische Chelatoren Veranderter Metabolismus Abtrennung z B Citrat sequestration Metallbindende Proteine Erh hte Synthese Abtrennung sequestration Versuche auch bei Pilzen einen bioenergetischen Zusammenhang zwischen reduzierter Artendiversit t einerseits sowie Schwermetalltoleranz und katabolischer Vielseitigkeit auf der Artebene andererseits herzustellen existieren bisher nicht Jedoch hat Salonius bereits 1981 auf einen Zusammenhang zwischen Diversit t und Abbauleistung von Pilzgemeinschaften im Bo den hingewiesen Er beimpfte durch y Strahlen sterilisierte Proben eines Waldbodens mit unter schiedlich artenreichen Sporensuspensionen von Pilzen des gleichen Bodens und stellte fest dass der durch die Sterilisation des Bodens verf gbar gewordene Kohlenstoff umso intensiver veratmet wurde je gr er die Artenvielfalt im Inokulum war Diese Beobachtung kann wenigs tens zum Teil erkl ren warum es in schwermetallbelasteten Waldb den zu einer Anreicherung von organischer Substanz kommt Coughtrey et al 1979 Eine Beziehung zw
138. idung avoi dance und der Abtrennung sequestration Tab 2 Offensichtlich ist es die Kombination ver schiedener Toleranz bzw Resistenzmechanismen die das Verhalten eines Pilzes gegen ber Schwermetallen bestimmen Gadd 1986 b Die ungerichtete Mutation von Toleranz oder Re sistenzgenen und die gerichtete Selektion ihrer Produkte in einem Mikroorganismus steigerten sukzessiv dessen Widerstandsf higkeit gegen ber einem Stressor Da aber Mutationen nicht bei allen Arten mit gleicher Rate und Effizienz ablaufen ist mit der unterschiedlichen Auspr gung von Toleranz oder Resistenz zu rechnen Obwohl keine generelle Beziehung zwischen Tole ranz Resistenz von Isolaten in Reinkultur und der Schwermetallbelastung des Herkunftstandorts zu bestehen scheint Arnebrant et al 1987 Brown und Hall 1989 Yamamoto et al 1985 ist anzunehmen dass weniger angepasste Arten das Feld f r die angepassten Arten r umen Eine Konsequenz ware die Abnahme der Diversitat der betreffenden Gemeinschaft Beispiele f r die Abnahme der Artendiversit t in schwermetallbelasteten Waldb den lieferten Jordan und Lechevalier 1975 sowie Nordgren et al 1983 Einleitung 7 Tab 2 Mechanismen der Schwermetalltoleranz bei Pilzen nach Tomsett 1993 Zellbestandteil Vorgang Ergebnis der Mutation Toleranzmechanismus Abgesondertes Protein Erh hte Produktion die in Vermeidung organisches Molek l oder Zunahme extrazellul rer avo
139. ie der Va riationskoeffizient des Wachstums auf die bessere Reaktionsf higkeit ungestresster Gemein schaften gegen ber St rungen z B C Eintrag kurzfristige Pestizideinwirkung hinweisen Ein hoher Variationskoeffizient der Diversit t k nnte bedeuten dass die Gesamtdiversit t ber eine ganze Vegetationsperiode betrachtet h her ist als die zu einzelnen Stichprobenzei ten gemessene und insbesondere auch h her als die Gesamtdiversit t einer Gemeinschaft mit geringem Variationskoeffizienten M glicherweise ver ndert sich die Diversit t der Pilze wie die mikrobielle Biomasse des Bodens Anderson 1994 Reber und Wenderoth 1997 im Laufe eines Jahres und die Amplitude dieses Zyklus wird durch Schwermetallstress verrin gert Dass der Zeitpunkt der Isolierung eine wichtige Rolle f r die Absch tzung der Diver sit t bzw die Zusammensetzung der Pilzgemeinschaften spielt geht aus dem Dendrogramm in der Abbildung 29 hervor Vor dessen Erstellung wurde f r jeden der zw lf Datens tze eine PCA durchgef hrt bei der f r jeden der 20 Messparameter zwei Hauptkomponenten ermittelt wurden Dies reduzierte die Gesamtzahl der Daten von 2600 je Stichprobe 130 Isolate a 20 Messparameter auf 40 Hauptkomponenten Erst diese reduzierten Datens tze wurden der Clusteranalyse unterworfen Das Dendrogramm zeigt dass zumindest vier der sechs Da tens tze der Proben aus Ackerb den auf dem linken Ast des Dendrogramms angeordnet sind und damit ein
140. in Oxford Wimpenny J Wilkinson T Peters A 1995 Monitoring microbial colony growth using im age analysis techniques In Binary 7 14 18 Winogradsky S 1924 Sur la microflore autochthone de la terre arable Compte rendus heb domadaire des s ances de l Acad mie des Sciences Paris 178 1236 1239 Wood JM 1984 Microbiological strategies in resistance to metal ion toxicity In Metal Ions in Biological Systems Sigel H Hrsg Marcel Dekker New York 18 333 351 Wood JM Wang HK 1983 Microbial resistance to heavy metals Environmental Science and Technology 17 582 590 Wright JD 1993 Fungal degradation of benzoic acid and related compounds World Journal of Microbiology and Biotechnology 9 9 16 Yamamoto H Tatsuyama K Uchiwa T 1985 Fungal flora of soil polluted with copper Soil Biology and Biochemistry 17 6 785 790 Anhang 127 7 Anhang 7 1 Bildanalysedaten von 20 verschiedenfarbigen Pilzisolaten die bei einem Kameraabstand von 68 36 und 17 cm vermessen wurden Kamera abstand Pilz Nr Fl F2 FA F5 F6 F7 F8 F9 FIO F12 FI13 Fl4 FI F16 F17 F18 F19 68 cm P1 25 253 252 248 0 3 0 3765 0 3650 248 253 252 240 127 8 9 5558 0 6522 0 9503 0 6276 0 9312 P2 250 252 252 245 0 4 0 4498 0 4401 176 244 201 85 138 133 12 4875 5 3999 0 1796 5 3958 0 1887 P3 250 252 251 246 0 4 0 4939 0 4848 183 248 209 94 138 126 13 7988 5 2874 0 2521 5 2758 0 2726 P4 240 245 243
141. in einem bestimmten Intensit ts Ergebnisse 50 bereich des Lichts sehen kann unterhalb einer gewissen Intensit t werden alle Farben als Schwarz oberhalb als Wei wahrgenommen sind Intensit tsunterschiede f r das Sehen von Bedeutung Deshalb erschien es sinnvoll die Variationskoeffizienten von Grau Rot Gr n und Blau mit den bildanalytisch ebenfalls wichtigen Parametern der Farbverteilung zu ver gleichen bzw zu verrechnen Tab 21 Beurteilung der drei betrachteten Kameraabstande hinsichtlich ihrer Eignung f r die Gewinnung von Bilddaten und deren subjektive Beurteilung durch Bilder Kamera Unvollst ndig abge Rel Vorz glichkeit Subjektive Beurtei abstand cm bildete Kolonien der Bilddaten 96 lung 68 0 94 16 nicht optimal 36 4 3 94 76 optimal 17 8 8 100 nicht optimal Abstand zwischen Frontlinse des Objektivs und der Agaroberfl che Wie die Tabelle 22 zeigt nimmt der Durchschnittswert aller 19 Variationskoeffizien ten in der Reihenfolge der Kameraabst nde 68 gt 36 gt 17 cm ab w hrend der Durchschnitts wert aller elf Parameter f r die Verteilung von Farben und Helligkeit in der Reihenfolge der Kameraabst nde 68 gt 17 gt 36 cm zur ckgeht Nur der Durchschnittswert der Variationskoef fizienten der acht eigentlichen Farbparameter ist beim mittleren Kameraabstand am h chsten gefolgt von den Kameraabst nden 68 cm und 17 cm Damit best tigt sich die Vermutung dass
142. influss von Schwermetallen auf die Wuchsleistung von Bodenpilzen in Ackerb den Bodenpaar I a Ackerboden wenig belastet wb b Ackerboden belastet b Pilze aus wenig belastetem Ackerboden weisen eine h here durchschnittliche Wuchsleistung als die aus belastetem Ackerboden auf Wachstumsdaten aller Isolate im Anhang unter 7 3 s beiliegen de CD Ergebnisse 67 20 0 18 0 16 0 Wald ub 14 0 12 0 10 0 8 0 6 0 4 0 2 0 Lineares Wachstum mm d r 400 Isolate nach Wachstum sortiert 20 0 18 0 16 0 14 0 12 0 10 0 8 0 6 0 4 0 20 Lineares Wachstum mm 41 b 396 Isolate nach Wachstum sortiert Abb 17 Einfluss von Schwermetallen auf die Wuchsleistung von Bodenpilzen in sauren Na turb den Bodenpaar II a Waldboden unbelastet ub b Haldenboden belastet b Pilze aus unbelastetem Waldboden weisen eine h here durchschnittliche Wuchsleistung als die aus belastetem Haldenboden auf Wachstumsdaten aller Isolate im Anhang unter 7 3 s beilie gende CD Die in den Abbildungen 16 und 17 zutage tretenden Unterschiede zwischen den Pilz gemeinschaften werden noch deutlicher wenn der Durchschnittswert die mittlere Abwei chung davon und der Variationskoeffizient der Wachstumsraten der Pilze aus den drei einzel nen Stichproben je Boden betrachtet werden Es zeigt sich dann dass das durchschnittliche Wachstum der Pilze in der Reihenfolge Acker wb gt Wal
143. ion der einzelnen Pilze auf Schwerme talle als die Ermittlung der Biomasse allein W re z B wie sonst blich nur das Wachstum als Kriterium der Schwermetalltoxizit t herangezogen worden so h tten sich bei Penicillium fellutanum praktisch keine Unterschiede zwischen den Isolaten aus Wald bzw Halde ergeben Abb 21 Die gr ere Sensitivit t der Waldisolate dieser Art wird erst dann erkennbar wenn auch die Koloniedichte ber cksichtigt wird Umgekehrt nimmt bei P nigricans die Kolonie flache Wachstum starker ab als die Koloniedichte Abb 20 Aufgrund der Art und Weise wie die relative Biomasse berechnet wird nimmt sie bei geringen Konzentrationen im Toxizi t tstest st rker ab als die beiden tats chlich gemessenen Parameter 4 2 Wirkung von Schwermetallen auf Diversit t und katabolische Vielseitigkeit von Bo denpilzen auf der Gemeinschaftsebene Untersuchungen zum Einfluss von Schwermetallen auf die Diversit t von Bodenpilzen schlossen die Messung von Wachstumsraten und die Bestimmung von Farbparametern ein Allein schon die Sortierung aller aus den einzelnen B den isolierten Pilze nach ihrer Wachs tumsrate machte deutlich dass diese physiologische Eigenschaft zumindest auf der Gemein schaftsebene durch Schwermetalle beeinflusst wird Abb 16 u 17 Durch Angabe der ge meinschaftsspezifischen Verteilung der Wuchsraten als Indices wie z B deren Durch schnittswert der mittleren Abweichung von diesem Wert und des davon
144. ischen mikrobiel ler Diversit t und Abbauprozessen wurde auch von Kj ller und Struwe 1996 diskutiert 1 2 Ziele dieser Arbeit Da die Leistungsf higkeit schwermetallkontaminierter B den nach den Befunden mehre rer Autoren abnimmt Burkhardt et al 1993 Flie bach et al 1994 Wenderoth und Reber 1999 a und Pilze am Kohlenstoffumsatz im Boden zwischen 70 und 97 beteiligt sind An derson und Domsch 1975 Blagodatskaya und Anderson 1998 ist es naheliegend bei der Er Einleitung 8 forschung der Ursachen dieser Leistungsabnahme nach den Bakterien auch die Pilze zu untersu chen Dabei ist das Hauptziel der vorliegenden Arbeit zu tiberpriifen ob bei Pilzen ebenfalls ein bioenergetischer Zusammenhang zwischen katabolischer Vielseitigkeit und Toleranz Resistenz gegen ber Schwermetallen auf der Artebene sowie der strukturellen Diversit t auf der Gemein schaftsebene besteht Die Arbeit erfordert also nicht nur die Isolierung und Gruppierung einer gro en Zahl von Pilzen zum Zweck der Diversit tsabsch tzung sondern auch die weitere Un tersuchung zumindest eines Teils der Isolate im Hinblick auf ihre katabolischen F higkeiten und ihre Toleranz Resistenz gegen ber Schwermetallen Die Abnahme der Leistungsf higkeit von B den k nnte grunds tzlich drei Ursachen ha ben auf die Experimente abgestimmt werden m ssen Sie k nnte zum einen wie bei Bakterien festgestellt Wenderoth und Reber 1999 a auf dem Verlust von F
145. kker New York Mycology 10 69 95 Tyler G 1981 Heavy metals in soil biology and biochemistry In Soil Biochemistry 5 Paul EA Ladd JN Hrsg Marcel Dekker Inc New York Basel 371 414 Tyler G Balsberg Pahlsson M Bengtsson G Baath E Tranvik L 1989 Heavy metal ecology of terrestrial plants microorganisms and invertebrates A review Water Air and Soil Pollution 47 189 216 Ward JH 1963 Hierarchical grouping to optimize an objective function Journal of the American Statistical Association 58 238 244 Literaturverzeichnis 126 Wenderoth DF 1998 Einfluss von Schwermetallstress auf die Diversit t und katabolische Vielseitigkeit mikrobieller Lebensgemeinschaften im Boden Dissertation Technische Universit t Carolo Wilhelmina Braunschweig Wenderoth DF Reber HH 1999 a Correlation between structural diversity and catabolic versatility of metal affected prototrophic bacteria in soil Soil Biology and Biochemistry 31 345 352 Wenderoth DF Reber HH 1999 b Development and comparison of methods to estimate the catabolic versatility of metal affected soil microbial communities Soi Biology and Bio chemistry 31 1793 1802 Wenderoth DF Stackebrandt E Reber HH 2001 Metal stress selects for bacterial ARDRA types with a reduced catabolic versatility Soil Biology and Biochemistry 33 667 670 Wild A 1995 Umweltorientierte Bodenkunde Eine Einf hrung Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg Berl
146. l contaminated sewage sludge Soil Biology and Biochemistry 25 301 309 Colin TS 1996 Agar plate colony counting and size determination Application note Prod uct SigmaScan Pro Labtronics Inc Jandel scientific software Colin TS 1997 Colony counting and size determination Application note Product Mocha Video Analysis System Labtronics Inc Cooke RC Whipps JM 1993 Ecophysiology of fungi Blackwell Scientific Publications 16 18 Coughtrey PJ Jones CH Shales SW 1979 Litter accumulation in woodlands contaminated by Pb Zn Cd and Cu Oecologia 39 51 60 Crowley PH 1992 Resampling methods for computation intensive data analysis in ecology and evolution Annual Review of Ecology and Systematics 23 405 447 Dean Ross D Mills AL 1989 Bacterial community structure and function along a heavy metal gradient Applied and Environmental Microbiology 55 2002 2009 Degens BP 1998 Microbial functional diversity can be influenced by the addition of simple organic substrates to soil Soil Biology and Biochemistry 30 14 1981 1988 Degens BP Harris JA 1997 Development of a physiological approach to measuring the catabolic diversity of soil microbial communities Soil Biology and Biochemistry 29 9 10 1309 1320 Degens BP Schipper LA Sparling GP Vojvodic Vukovic M 2000 Decreases in organic C reserves in soils can reduce the catabolic diversity of soil microbial communities Soil Biology and Biochemistry
147. l gr eren Wasserhalteverm gen Wiederbefeuch ten trockenen Bodens bewirkt ein als flush bekannt gewordenes Ph nomen Birch 1958 Jen kinson 1966 Powlson 1976 das schnell wachsende Pilze f rdert die bei der anschlie en den Austrocknung Sporen bilden Diese traten im Waldboden aufgrund der angewandten Iso lierungsmethode wahrscheinlich besonders h ufig auf In diesem Zusammenhang muss auch der Variationskoeffizient des Wachstums der Pilze in den einzelnen Stichproben gesehen werden Tab 25 Dieser war z B im wenig be lasteten Ackerboden in drei Versuchen h her als im unbelasteten Waldboden Die relativ kon stante Bodenfeuchte im wenig belasteten Ackerboden k nnte daf r verantwortlich sein dass auch langsamw chsige Pilze wachsen wenn gute C Quellen verbraucht sind und die schnell wachsenden Arten wegen Energiemangels sporulieren auf N hrb den aber erscheinen Im Waldboden dagegen k nnte die Entfaltung der K Strategen nach Entwicklung der r Strategen durch h ufiger auftretende Austrocknung immer wieder unterbrochen werden w hrend letzte re mit den durch die Trockenheit teilweise konservierten guten C Quellen ihr Wachstum fort setzen k nnen Der belastete Acker hatte sogar ein etwas h heres Wasserhalteverm gen als der wenig belastete Flie bach et al 1994 ein m glicher Grund daf r dass der Variations koeffizient der Wuchsleistung immer noch h her war als im unbelasteten Waldboden Dage gen konnte die hohe Sc
148. logy In mmobilisation of Ions by Bio sorption Eccles H Hunt S Hrsg Ellis Horwood Chichester 135 147 Gadd GM 1986 b Fungal responses towards heavy metals In Microbes in Extreme Envi ronments Herbert RA Codd GA Hrsg Academic Press London 85 110 Gadd GM 1989 Metal tolerance In Microbiology of Extreme Environments Edwards C Hrsg Open University Press Milton Keynes 178 210 Gadgil M Solbrig OT 1972 The concept of r and K selection evidence from wild flowers and some theoretical considerations American Naturalist 106 14 31 Garrett SD 1951 Ecological groups of soil fungi a survey of substrate relationships New Phytologist S0 149 166 Gisi U 1990 Boden kologie Georg Thieme Verlag Stuttgart New York Gottwald S Germeier C Ruhmann W Lorch HJ Ottow JCG 1996 Einsatz der digitalen Bildanalyse f r die Bestimmung von Fusarium spp 50 Deutsche Pflanzenschutztagung Mitteilungen aus der Biologischen Bundesanstalt f r Land und Forstwirtschaft 321 352 Griffin DM 1972 Ecology of soil fungi Chapman and Hall London Grime JP 1979 Plant strategies and vegetation processes J Wiley Chichester New Nork Brisbane amp Toronto Gupta UC 1967 Carbohydrates In Soil Biochemistry McLaren AD Petersen GF Hrsg Marcel Dekker New York 91 118 Literaturverzeichnis 122 Hamer DH 1986 Metallothionein Annual Review of Biochemistry 55 913 951 Heinemeyer O Insam H K
149. m u Parameter f r Verteilung von Farben und Helligkeit MP1 MP6 MP14 u 15 Lineares Wachstum in mm d MP1 Farbparameter der Kolonieoberseite Mean Gray MP2 Mean Red MP3 Mean Green MP4 Mean Blue 5 Hue Typical MP6 Mean Saturation Mean Brightness MP8 Mean Density MP9 Farbparameter der Kolonieunterseite Mean Gray MP10 Mean Red MP11 Mean Green MP 12 Mean Blue MP13 Hue Typical MP14 Mean Saturation MP15 Gray Variation MP16 Mean Brightness MP17 Bright Variation MP18 Mean Density MP19 Density Variation MP20 Ergebnisse 24 Unterscheidungskraft jeder Messparameter tats chlich besitzt Diese Berechnung erfolgte nach der Gleichung 11 n 1 Unterscheidungskraftparam 96 I x 100 11 n wobei n Zahl der Messparameter Summe der Korrelationen eines Messparameters mit den verbleibenden Messparametern Die Tabelle 23 zeigt die Reihenfolge der 20 Messparameter wie sie sich bei aufstei gender Sortierung der Korrelationssummen Spalte 2 bzw absteigender Unterscheidungs kraft ergibt Aus dieser Reihenfolge ist die tats chliche Unterscheidungskraft noch nicht abzu lesen Diese ergibt sich erst wenn der Anteil der nicht korrelierten Messwerte nach Anwen dung der obigen Gleichung 11 berechnet wird Es zeigt sich dann dass die Varianz der das Wachstum der Pilze MP1 betreffenden Messwerte zu 88 21 zur Unterscheidung der Pilze beitragt
150. mM 0 02 0 0 2 0 4 0 6 Extinktion bei 412 nm Abb 26 Beispiel f r eine Eichkurve zur Bestimmung des SH Gruppen Gehalts von Zellauf schl ssen Der Einfluss von Kupfer in der N hrl sung auf die Biomassebildung den Proteinge halt der Zellen und den Schwefelgehalt der Sulfhydrylgruppen SH S bei den vier ausge w hlten Isolaten von P fellutanum ist in der Tabelle 35 dargestellt Je Isolat und Kontamina tionsstufe wurden zwei Parallelen untersucht die jeweils in zwei Zeilen untereinander stehen Wie zu erkennen ist verloren die beiden Isolate aus Haldenboden unter Kupfereinfluss nur relativ wenig Biomasse die Isolate aus Waldboden dagegen deutlich mehr wobei Isolat W165 noch st rker betroffen war als W108 Die Werte f r Protein nahmen bei allen vier Pilzen in der Tendenz hnlich aber relativ etwas st rker ab als die Biomasse Dabei ergaben sich deutliche Unterschiede zwischen den Isolaten aus Haldenboden und Waldboden Bei einer Konzentration von 1 mM Kupfer im Medium war die Proteinsynthese der beiden Halde nisolate auf Werte zwischen 55 und 60 der ungestressten Kontrolle abgefallen die der beiden Waldisolate sogar auf Werte zwischen 2 und 14 Dagegen betrug die relative Synthese von Sulfhydrylgruppen bei den beiden Isolaten aus Haldenboden jeweils etwa 32 5 und bei den Isolaten aus Waldboden 20 8 bzw 4 1 Ergebnisse 93 Tab 35 Bildung von Biomasse Protein und Sulfhydrylgruppen in ausgew hlte
151. n Substrate mit einer h he ren Zahl verf gbarer Elektronen mussten in entsprechend geringerer Konzentration appliziert werden Die eigentliche Applikationsmenge hatte sich nach der Empfindlichkeit des Respiro meters zu richten Das verwendete Ger t registrierte den CO2 Aussto8 der Bodenproben mit Hilfe eines Infrarot Gas Analysators Heinemeyer et al 1989 Bei Einsatz eines leicht ab baubaren Substrats und eines Bel ftungsstroms von 150 ml min durfte der Messbereich des Ger ts nicht bertroffen werden F r das Bezugssubstrat war dies eine Menge von 75 die 50 g Boden TG zugesetzt wurden Die Applikation der aromatischen S uren erfolgte in Anlehnung an Anderson und Domsch 1978 Dabei wurde die Substratmenge mit soviel Talkum vermischt dass die an zuwendende Gesamtmenge Substrat Talkum immer 300 mg betrug Dieses Gemisch wur de mit Hilfe eines elektrisch betriebenen Handmixers in die Bodenproben einger hrt so dass Material und Methoden 33 eine homogene Substratverteilung gegeben war Die Bebr tung der Bodenproben erfolgte bei 22 C Der CO gt Aussto der Bodenproben wurde st ndlich bis zum Erscheinen des At mungsmaximums verfolgt Die Daten dienen der Absch tzung der katabolischen Vielseitig keit auf der Gemeinschaftsebene Kap 2 2 4 2 2 3 Physiologische Untersuchungen an Reinkulturen 2 2 3 1 Tests auf Nutzung von aromatischen S uren Polymeren und hydrophoben Sub stanzen Die in gr
152. n in Verbindung mit einer Repression der SH Gruppensynthese bei Isolaten aus Haldenboden unter Stressbedingungen erm glichte die Unterscheidung der Begriffe Toleranz und Resis tenz W hrend alle Pilze durch ihre F higkeit zur Bildung von SH Gruppen eine konstitutive Toleranz gegen ber Schwermetallen besitzen muss die Repression dieser Fahigkeit in Ge genwart von Schwermetallen als Resistenz bezeichnet werden Literaturverzeichnis 118 6 Literaturverzeichnis Alexander M 1997 Microbial communities and interactions a prelude In Manual of Envi ronmental Microbiology Hurst CJ Knudsen GR McInerney MJ Stetzenbach LD und Walter MV Hrsg ASM Press Washington DC 5 13 Anderson TH 1994 Physiological analysis of microbial communities in soil Applications and limitations In Beyond the biomass Ritz K Dighton J Giller KE Hrsg John Wiley amp Sons Chichester New York Brisbane Toronto Singapore British Society of Soil Sci ence BSSS 67 76 Anderson JPE Domsch KH 1975 Measurement of bacterial and fungal contributions to respiration of selected agricultural and forest soils Canadian Journal of Microbiology 21 314 322 Anderson JPE Domsch KH 1978 A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils Soil Biology and Biochemistry 10 215 221 Anderson TH Domsch KH 1990 Application of eco physiological quotients qCO and qD on microbial biomasses from soils of
153. n 36 cm auch f r die computergest tzte Gruppierung der Pilze ausreichend gute Bild daten liefert Um diese Frage beantworten zu k nnen wurden 20 sich in ihrem Grauwert un terscheidende Pilze bei den drei Kameraabst nden von 68 36 und 17 cm von Frontlinse bis Agaroberflache hinsichtlich der 19 in die Untersuchungen einbezogenen Farbparameter ver messen Bildanalysedaten der 20 Pilze jeweils f r die drei Kameraabst nde im Anhang unter 7 1 Da die modernen Verfahren der Hauptkomponentenanalyse bzw der Clusteranalyse auf der Berechnung von Korrelationen zwischen den verschiedenen Parametern beruhen wurde angenommen dass die obige Frage durch Bestimmung aller m glichen Korrelationskoeffi zienten zwischen den betrachteten Farbparametern und ihrer Verrechnung beantwortet werden kann Durch Hauptkomponentenanalyse war es m glich f r jeden der drei Datens tze die Summe aller 171 Korrelationskoeffizienten aus der ausgegebenen Korrelationsmatrix zu bestimmen Tab 20 Spalte 2 Da eine hohe Korrelation zwischen zwei Messreihen ahnlich wie die starke Kopplung bin rer Datenreihen ein Zeichen f r relativ geringe Unterschei dungskraft zweier Parameter ist je nachdem wie stark beide mit den verbleibenden Parame tern korreliert sind muss derjenigen Datenreihe die h chste Unterscheidungskraft zugeordnet werden bei der die Summe der Korrelationskoeffizienten am geringsten ist Um die Unter scheidungskraft der mit verschiedenen Kameraabst nde
154. n CFU zu der der seltenen dagegen weiter ab d h die Variation der Messwerte erh hte sich Dieser Zusammenhang wurde zur Berechnung des Index der katabolischen Vielseitigkeit auf der Gemeinschaftsebene herangezogen Da der Durchschnittswert nur von der Zahl der Tests ab h ngt also innerhalb eines Versuchs einen konstanten Wert aufweist nimmt die katabolische Vielseitigkeit bei Stress ab Varianzanalysen ANOVA analysis of variance erfolgten mit Hilfe des Programms WinSTAT R Fitch Software Staufen Deutschland unter Anwendung der Methode LSD le ast significant difference bei Einstellung einer Signifikanz von p 0 05 Signifikante Unter schiede wurden entweder durch Konfidenzintervalle oder unterschiedliche Buchstabenindices a v c gekennzeichnet Ergebnisse 42 3 Ergebnisse 3 1 Entwicklung von Methoden 3 1 1 Entwicklung und Erprobung eines kombinierten Verfahrens aus Bild und Clus teranalyse zur Bestimmung der strukturellen Diversitat von Stichproben aus Pilzge meinschaften Die klassische Methode bei der eine groBe Zahl von Isolaten m glichst gleichen Ko loniealters zeitgleich angeimpft werden m ssen damit eine Sortierung nach Kolonieaspekt Form von Sporen und Sporentr gern mit geringer Fehlerquote erfolgen kann ist relativ ar beitsaufw ndig Bei Eingruppierung einer gro en Zahl von Isolaten sind daher andere Unter suchungen wie z B die Absch tzung der katabolischen Vielseitigkeit der Pilze oft
155. n Isolaten von P fellutanum aus Halden und Waldboden W in 150 ml Fl ssigkultur Vollmedium nach Martin 1950 und Gegenwart von Kupfer n 2 Kupfer im N hrmedium mM Isolat Nr Parameter 0 0 5 1 0 1 5 HII Biomasse mg 509 0 401 0 285 0 382 0 482 0 362 0 457 0 363 0 Protein mg 73 1 55 1 35 7 20 1 73 3 57 6 44 9 19 7 SH S ug 64 3 32 2 18 3 11 1 66 3 31 5 24 2 12 3 271 Biomasse mg 797 0 713 0 714 0 688 0 818 0 823 0 755 0 676 0 Protein mg 118 5 94 8 69 4 48 4 123 0 105 1 77 3 52 4 SH S ug 144 1 62 4 47 2 25 4 146 8 77 0 47 1 29 6 0 0 33 0 67 1 00 W108 Biomasse mg 628 0 549 0 382 0 296 0 673 0 579 0 372 0 318 0 Protein mg 89 5 73 7 18 9 14 4 88 7 76 3 29 3 11 2 SH S ug 101 3 47 7 22 3 20 9 97 9 58 0 34 4 20 6 W165 Biomasse mg 951 0 913 0 267 0 116 0 971 0 925 0 229 0 107 0 Protein mg 124 5 102 3 16 5 2 8 118 1 102 6 16 3 2 0 SH S ug 124 0 82 3 13 2 5 2 115 8 74 7 10 3 4 6 Sulfhydrylgruppen als Schwefel SH S gemessen Aufschlussreicher als die absoluten Zahlen in der Tabelle 35 sind Verh ltniszahlen wie z B das Protein zu Biomasse Verh ltnis P B oder das SH Gruppen zu Protein Verh ltnis SH P In den Abbildungen 27 und 28 sind relative Verh ltniszahlen dargestellt wobei das jeweilige Verh ltnis in der ungestressten Kontrolle als 1 gesetzt wird Die angege benen Werte stellen Mittelwerte der in der Tabelle 35 aufgef hrten Parallelen da
156. n gewonnenen Daten quantifizieren zu k nnen mussten die in Spalte 2 aufgef hrten Werte noch von der maximal m glichen Summe aller Korrelationskoeffizienten subtrahiert werden Spalte 3 Diese Summe betr gt 171 wenn alle m glichen Korrelationen zwischen den 19 betrachteten Farbparametern den Wert 1 auf weisen s Reihengleichung 10 S a a gt a 10 i l wobei n 18 Ergebnisse 49 Die relative Vorz glichkeit der Bilddaten aus den drei Kameraabst nden ergab sich durch Relativierung Spalte 4 Es zeigte sich dass entgegen der Annahme der kleinste Kameraab stand Daten mit der h chstm glichen Unterscheidungskraft lieferte die Daten der beiden an deren Kameraabstande aber hinsichtlich ihrer Auswertbarkeit nur um etwa 5 6 schlechter zu beurteilen waren Tab 20 Berechnung der Unterscheidungskraft von drei Kameraabst nden aus den 171 m g lichen Korrelationen von 19 farbparameterspezifischen Bilddaten Berechnungsgrundlage bildeten 20 sich in ihrem Grauwert unterscheidende Pilze die in den 19 in dieser Arbeit ein gesetzten Farbparametern Kap 2 2 2 1 3 bei allen drei Kameraabst nden vermessen wurden Bildanalysedaten im Anhang unter 7 1 Kameraabstand cm Ekor Unkorreliertheit Rel Vorz glichkeit der Bilddaten 96 68 89 36 81 64 94 16 36 88 84 82 16 94 76 17 84 30 86 70 100 Abstand zwischen Frontlinse des Objektivs und der Agaroberfl che
157. n stark unterscheidet d h mit diesen nicht korreliert 1st findet bei zweidimensionaler Darstellung in der Hauptkomponentenanalyse einen von anderen Parametern deutlich abwei chenden Platz Umgekehrt nehmen stark korrelierte Parameter eine gleiche oder hnliche Po sition ein Diese Analyse wurde auf die bei der Bildanalyse erhaltenen Daten nicht nur mit dem Ziel angewendet die Unterscheidungskraft der einzelnen Messparameter zu beurteilen sondern auch die Tauglichkeit der Bildanalysedaten f r die Unterscheidung der verschiedenen Isolate zu bewerten F r diese Untersuchungen wurde das Programm XLSTAT Kap 2 1 4 mit den Einstellungen Classical und Correlations eingesetzt 2 2 2 2 Abschatzung der Leistung von Pilzgemeinschaften im Boden 2 2 2 2 1 Bestimmung aromatenspezifischer Vermehrungseinheiten von Pilzen Zur Bestimmung aromatenspezifischer Vermehrungseinheiten CFU colony forming units wurden 21 aromatische S uren als einzige C und Energiequelle in einer Konzentration von 10 mM in eine Mineralsalzl sung mit gereinigtem Agar Tab 9 eingearbeitet Diese aromatischen S uren Tab 10 haben unterschiedliche Substratqualit ten und k nnen von Pilzen und im Boden verschieden schnell als C und Energiequelle genutzt werden Genau Material und Methoden 32 1 ml einer geeigneten Verdiinnungsstufe der jeweiligen Bodensuspension Kap 2 2 2 1 2 wurde mit verfl ssigtem Agarmedium 45 C vermischt Koch scher Plattenguss Die ge
158. nalyse scheint deshalb gebo ten weil die Absch tzung der Diversitat allein schon sehr arbeitsaufwandig ist in dieser Arbeit aber Schwermetalleffekte nicht nur auf der Gemeinschaftsebene sondern auch auf der Organis menebene interessieren Diese Methode w rde es auch erleichtern ann hernd identische Pilze aus verschiedenen Isolierungen und B den in der Stammsammlung f r weitergehende physiolo gische Tests zu finden Mit der M glichkeit simultan Flache und Dichte Lichtextinktion von Pilzkolonien im Durchlicht zu ermitteln und aus dem Produkt beider Gr en ein Ma f r die relative Biomassebildung abzuleiten lie e sich die Bildanalyse auch bei der Absch tzung der in vitro Toleranz Resistenz gegen ber Schwermetallen einsetzen Isolate gleicher Bildtypen aus belastetem und unbelastetem Boden die sich bei mikro skopischer berpr fung als tats chlich identisch erwiesen haben sind f r weitere physiologi sche und chemische Untersuchungen vorgesehen Dabei soll nicht nur ihre katabolische Vielsei tigkeit gegen ber aromatischen S uren und Polymeren sowie hydrophoben Substanzen ermittelt werden sondern auch ihre Fahigkeit unter Schwermetallstress mit der Mehrsynthese von Sulf hydryl SH Gruppen zu reagieren Diese wird als ein Indiz f r die Bildung von Metallothionei nen interpretiert Aufgrund dieser und der bildanalytischen Daten zur Biomassebildung soll ge pr ft werden ob eine L sung f r das von Gadd 1986 b 1989 aufg
159. nfalls nicht signifi kant Nordgren et al 1985 geben in ihrer umfangreichen Arbeit zwar den Shannon Index der allgemeinen Diversit t an es fehlen jedoch Angaben auf welche Stichprobengr e sich die ser bezieht Dagegen wurde in der vorliegenden Arbeit wenig Wert auf qualitative Unter schiede gelegt d h hinsichtlich der Artenzusammensetzung der Pilzgemeinschaften daf r umso mehr auf quantitative Unterschiede also hinsichtlich des Informationsgehalts der Pilz gemeinschaften Typenreichtum Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit war es den Einfluss von Schwermetallen auf die katabolische Vielseitigkeit von Pilzgemeinschaften in B den zu untersuchen Sie war als Kehrwert des Variationskoeffizienten substratspezifischer Vermehrungseinheiten CFU bzw reziproker Abbauzeiten in situ definiert worden Kap 2 2 4 Gleichung 9 Dabei dienten Diskussion 109 21 aromatische S uren als Testsubstrate unterschiedlicher energetischer Wertigkeit Da die katabolische Vielseitigkeit ein Verteilungsindex von Abbaufahigkeiten ist wurde die even ness der substratspezifischen Messwerte aus Vergleichsgriinden mit herangezogen Die Er gebnisse der CFU Methode Tab 27 u 28 zeigen dass weder in Bodenpaar I Ackerb den noch in Bodenpaar II saure Naturb den signifikante Unterschiede in der Verteilung aroma tenspezifischer Abbaufahigkeiten durch Schwermetalleinfluss innerhalb dieser Pilzgemein schaften auftraten Nur zwischen den Ackerb
160. nicht rea lisierbar Es wurde vermutet dass die Bildanalyse eine M glichkeit darstellt beiden Anspr chen gerecht zu werden Wegen der Speicherbarkeit zeitlich versetzt aufgenommener Bilder w re es auch m glich die eigentliche Bildanalyse Erstellen der Bilddaten zu einem sp teren Zeitpunkt durchzuf hren und wenn n tig das Ergebnis der sich anschlieBenden Clusterana lyse s u anhand der Bilder subjektiv zu berpr fen Au erdem w rde es die Methode ges tatten ann hernd identische Pilzisolate z B aus zwei miteinander zu vergleichenden Ge meinschaften f r anschlieBende physiologische Untersuchungen leicht zu identifizieren Die Bildanalyse kann nicht wie das Gehirn s mtliche im Bild enthaltene Information nutzen Vielmehr besteht ihre Arbeitsweise darin die vorhandene Information mit Hilfe parametri sierter Messfunktionen in eine relativ kleine Zahl von Bilddaten umzuwandeln Solche Mess funktionen erm glichen z B die Wiedergabe von Farbwerten und die Bestimmung der Ob jektgr e Damit die so gewonnenen Bilddaten zur Gruppierung von Pilzisolaten herangezo gen werden k nnen m ssen sie noch einer sogenannten Clusteranalyse Kap 2 2 2 1 4 un terworfen werden die einer Ahnlichkeitsanalyse gleichkommt In den Abbildungen 4 7 sind als Beispiel vier vom Bildanalysesystem aufgenommene Pilze unterschiedlicher Gattungen von der Ober und Unterseite der Pilzkolonien dargestellt Die zugeh rigen Bildanalysedaten zeigt die
161. nlichen Substanzen durch Pilze zeigt die Abbildung 1 Einleitung 9 Phenol 3 Hydroxybenzoat Benzoat COOH COOH A e Y Catechol 3 4 Dihydroxybenzoat 4 Hydroxybenzoat COOH COOH E lt Ki e E 2 3 Dihydroxybenzoat 2 Hydroxybenzoat 2 5 Dihydroxybenzoat 1 3 4 Trihydroxybenzen OH OH ex m E5 E6 COOH H Es 2 4 Dihydroxybenzoat 1 3 Dihydroxybenzen OH OH on on OOH Abb 1 Abbauwege fiir den Katabolismus von Benzoat und ahnlichen Verbindungen in Pilzen nach Wright 1993 Ei Benzoat 4 Hydroxylase E 4 Hydroxybenzoat 3 Hydroxylase 3 Hydroxybenzoat 4 Hydroxylase Phenol 2 Hydroxylase Es 2 Hydroxybenzoat 3 Hydroxylase 2 Hydroxybenzoat 5 Hydroxylase 2 Hydroxybenzoat 4 Hydroxylase Es 1 3 Dihydroxybenzen 4 Hydroxylase Es 3 4 Dihydroxybenzoat Hydroxylase Einleitung 10 Ein weiteres Ziel dieser Arbeit ist es die Entwicklung bildanalytischer Methoden Stel zer 1997 voranzutreiben Damit sollte es m glich werden das Wachstum der einzelnen Isolate zu messen und im selben Arbeitsgang Bilddaten zu produzieren die in einer nachgeschalteten Clusteranalyse Flury und Riedwyl 1983 Steinhausen und Langer 1977 mit dem Ziel ver rechnet werden k nnen die Diversitat aller Isolate einer Stichprobe abzuschatzen Die Entwick lung eines solchen kombinierten Verfahrens aus Bild und Clustera
162. nnte auf eine ausreichend hohe Spezifit t der Bilddaten geschlossen werden Abb 12 b Da aber durchaus geringe Unterschiede zwischen den Tripletts zu erken nen waren und andererseits unterschiedliche St mme von Penicillium fellutanum auf einer weniger hohen Ebene clusterten entstand das Problem welche Clusterebene bei einer unbe kannten Stichprobe mit einer gr eren Zahl unterschiedlicher St mme der gleichen Art zu w hlen sei Bei der Clusteranalyse von biologischem Datenmaterial wird die Clusterebene Diskussion 102 d h die Distanz bzw Ahnlichkeitsstufe auf der die Gruppenbildung erfolgt h ufig a priori festgelegt Wenn es sich um DNA Fragmente handelt kann als Clusterebene eine Ahnlich keitsstufe von 100 durchaus optimal sein Dies ist aber bei der Clusterung von Ph notypen z B in der Chemotaxonomie nicht der Fall Gleiches gilt f r die Gruppierung von Pilzbildern bzw den entsprechenden Bilddaten Da bei den Bilddaten von St mmen einer Art mit einer gewissen Varianz zu rechnen war und zusammengeh rende St mme in einem Cluster zu sammengefasst werden sollten musste die Clusterebene auf einer Ahnlichkeitsstufe unter 100 liegen Ziel war es eine Clusterebene zu finden die sich an immer wechselnde Stich proben anpasst und in einer Stichprobe gleichzeitig sowohl seltene als auch h ufige Bildty pencluster entstehen l sst Eine solche Situation ergibt sich bei einer jeweils von der Zusam mensetzung der Stichprobe
163. ntosen aus Haferspelzen 1 25 g autoklaviert 5 g autoklaviert 0 02 g zweimal tyndallisiert 1 25 g autoklaviert 0 2 g dreimal tyndallisiert 0 2 g zweimal tyndallisiert 4 g dreimal tyndallisiert 1 g autoklaviert 5 g autoklaviert 1 25 g autoklaviert 1 g autoklaviert 0 2 g dreimal tyndallisiert 2 5 g im Liter autoklaviert 0 2 g dreimal tyndallisiert 1 g autoklaviert Autoklavierung 20 Min bei 121 C Tyndallisierung Erhitzung auf 100 C im Abstand von 24 h Material und Methoden 18 Die in der letzten Spalte der Tabelle 11 angegebenen Konzentrationen hatten sich in Vorversuchen als optimal fiir das Erkennen der Substratnutzung durch Testpilze erwiesen Alle Medien au er die mit Dextran Rhamsan und Xanthan enthielten gereinigten Agar und die in der Tabelle 9 angegebenen Mineralsalze nur diese drei Substrate wurden ohne Mine ralsalze bereitet Bis auf Tannin Angabe in g I wurden alle Polymerenmedien in Mengen von 20 ml bereitet und nach dem Sterilisieren in Petrischalen gegossen Medien mit Cellulose Celluloseacetat Chitin Keratin Xylan Lecithin und Paraffin die letzten beiden nach Homo genisieren mit dem Ultra Turrax TP 18 10 Janke und Kunkel IKA Werk Staufen Deutsch land wurden in gek hlte Petrischalen 0 C gegossen um vorzeitige Entmischung der Emulsionen zu vermeiden 2 1 4 Arbeitsplatz fiir die Bildanalyse Die bildanalytische Quantifizierung des Pilzwachstums
164. ogisch gesehen eine Abnahme der Substratqualit t bedeutet wie an dem langsameren Wachstum von Pilzen auf kontaminierten N hrb den zu erkennen ist Tab 34 Offensichtlich sind langsamer wachsende K Strategen an diese Bedingungen besser ange passt als die schneller wachsenden r Strategen u a Phycomyceten so dass sie sich auf Kos ten letzterer relativ anreichern k nnen Dieses Verhalten der Bodenpilze steht im Gegensatz zur Selektion von r Strategen bei Bakterien Wenderoth und Reber 1999 a Wenderoth et al 2001 so dass man von unterschiedlichen berlebensstrategien ausgehen kann Bei Bakteri enarten reichern sich unter Stress St mme geringerer katabolischer Vielseitigkeit an Wende roth et al 2001 wobei insbesondere Fahigkeiten zur Nutzung schwer abbaubarer Substrate verloren gehen Dies scheint ein kologischer Vorteil zu sein Da Pilze katabolische F higkei ten offensichtlich nicht verlieren Tab 27 u 28 m ssen sie auf den durch Stress verst rkten Energiemangel mit anderen Mechanismen reagieren s unten Das Verschwinden schnell w chsiger Arten u ert sich auch in der Tatsache dass der Variationskoeffizient der Wachs tumsraten der Pilze aus belastetem Ackerboden geringer war als derjenige der Isolate aus we nig belastetem Ackerboden Tab 25 Im Gegensatz zu den Verh ltnissen in den Ackerb den Bodenpaar I lieBen sich die Unterschiede in der Wuchsleistung zwischen den Pilzen aus unbelastetem Wald und schwermet
165. oloniedichte Extinktion bildanalytisch abgesch tzt werden kann Je 20 Isolate von P nigricans aus wenig belastetem und belastetem Ackerboden wurden auf mit Kupfer kontaminierte N hrb den geimpft und diesbez glich miteinander verglichen Ein Vorversuch hatte gezeigt dass neben der Kontrolle nicht kontaminierter N hrboden Kupferkonzentrationen von 0 5 1 und 1 5 mM sinnvoll waren Um zu zeigen wie sich die beiden f r die Bestimmung der relativen Biomasse verwendeten Parameter Koloniefl che u Koloniedichte gegen ber Schwermetall stress verhalten werden die entsprechenden Werte zus tzlich zur relativen Biomasse ihrem Produkt dargestellt Da die einzelnen Werte immer auf die des unkontaminierten N hrbodens bezogen wurden wurden f r die Kontrollen in den Abbildungen 20 a c und 21 a c die Varia tionskoeffizienten angegeben Bei den Isolaten aus wenig belastetem Ackerboden waren diese immer etwas gr er als bei Isolaten aus belastetem Ackerboden Hieraus kann hnlich wie Ergebnisse 85 beim Wachstum Tab 34 bei den Isolaten aus wenig belastetem Ackerboden auf eine ver gleichsweise etwas h here innerartliche Diversit t geschlossen werden als bei den Isolaten aus belastetem Ackerboden Die Abbildungen 20 a und 20 b zeigen dass sich Koloniefl che und Koloniedichte bei den St mmen von P nigricans aus Ackerb den hinsichtlich ihrer Ab nahme infolge Kupferstress nicht nennenswert voneinander unterschieden so dass auch ihr
166. ordnen als dem geringen pH Wert des Bodens Die erkenn bare Trennung der schwermetallbelasteten von den wenig oder nicht belasteten B den durch die Respirometerdaten ist insofern verstandlich als bei dieser Methode die Schwermetalle voll wirksam blieben wahrend sie bei der CFU Methode durch die Herstellung von Boden suspensionen weitgehend ausged nnt wurden Die CFU Methode weist somit eher auf Unter schiede hin die auf der Organismenebene entstanden wahrend die Respirometriemethode die Qualit t des Habitats anzeigt Nimmt man aufgrund der substratspezifischen CFU einerseits an dass es auf der Gemeinschaftsebene der Pilze zu keiner Ver nderung in der Verteilung katabolischer F higkeiten kommt so muss man aus den Respirometriedaten schlie en dass die beobachteten Ver nderungen von Abbauzeiten nur auf der unterschiedlichen Hemmung katabolischer Enzyme durch die beiden Stressoren beruhen k nnen F r die Reaktionsf hig keit eines Bodens ist es allerdings unerheblich ob dauerhafte Veranderungen auf einem tat s chlichen Verlust katabolischer F higkeiten oder nur auf der Hemmung von Enzymaktivit ten beruhen 4 3 Wirkung der Bodenbelastung auf Wuchsleistung und katabolische Vielseitigkeit von Bodenpilzen auf der Artebene Die in der Tabelle 31 dargestellten Ergebnisse der Wachstumsanalyse von drei Arten der Gattung Penicillium zeigen dass die Schwermetallbelastung des Bodens weder bei P nigricans noch bei P fellutanum zu einer e
167. quellen Gupta 1967 die Arten und St mme nicht nur mit unterschiedlicher katabolischer Vielseitigkeit Wenderoth und Reber 1999 a entstehen lassen sondern auch die Ursache f r die Entwicklung unterschiedlicher ber lebensstrategien sind Schnell wachsende Arten bzw St mme sogenannte r Strategen sind vorrangig auf energetisch gute schnell flieBende C und Energiequellen in vergleichsweise hoher Konzentration angewiesen wahrend die langsam wachsenden K Strategen mit weniger Einleitung 2 guten Substraten und oder niedrigeren Konzentrationen auskommen und sich dabei gegen ber den r Strategen durchsetzen Andrews 1984 Gisi 1990 Die Bezeichnungen r und K stammen urspriinglich aus einer Beschreibung der Lebensstrategie von Makroorganismen Gadgil und Solbrig 1972 Pianka 1970 MacArthur und Wilson 1967 wendeten diese Klassifizierung auf Tiere an Nach Odum 1980 beruht die Einteilung in r und K Strategen auf dem Verh ltnis der Nutzungsanteile der verfiigbaren Energie fiir die Fortpflanzung bzw die Erhaltung der Arten Demnach sind r Strategen Organismen mit hoher Vermehrungsrate hohes Verh ltnis von Fort pflanzungsenergie zu Erhaltungsenergie sowie geringer Lebensdauer und K Strategen Orga nismen mit vergleichsweise geringem Fortpflanzungspotential sowie hoher Lebensdauer In der Bodenmikrobiologie wurden die beiden gegens tzlichen Strategien schon vor mehr als 75 Jah ren mit der Unterscheidung allochthoner zymogener
168. r Die Abbil dung 27 macht deutlich dass das Protein zu Biomasse Verh ltnis bei den beiden Waldisolaten deutlich st rker abnahm als bei den Haldenisolaten Dagegen nahm das Sulfhydrylgruppen zu Protein Verh ltnis bei den beiden Isolaten aus Waldboden ab Kupferkonzentrationen von Ergebnisse 94 etwa 0 5 mM um das 1 5 bis 2 fache zu w hrend dieses Verh ltnis bei den Haldenisolaten sogar leicht abnahm Abb 28 Wird das Sulfhydrylgruppen zu Biomasse Verh ltnis gebildet so sind keine groBen Unterschiede zwischen den Herk nften aus Wald und Halde zu erkennen nicht abgebildet Aus der Tatsache dass Biomasse und Protein bei den Waldisolaten st rker abnahmen als bei den Haldenisolaten sind erstere von vornherein als sensitiver zu bezeichnen als letztere Sowohl Waldisolate als auch Haldenisolate besitzen die offensichtlich konstituti ve Fahigkeit zur Synthese von SH Gruppen die wahrscheinlich ubiquit r verbreitet ist Ha mer 1986 Mehra und Winge 1991 Nielson et al 1985 Da diese bei den Haldenisolaten in Gegenwart von Schwermetallen unterdr ckt wurde Repression bei den Waldisolaten dage gen verstarkt in Erscheinung trat Induktion muss die Fahigkeit zur Repression der Mehrsyn these von SH Gruppen eine zus tzlich erworbene F higkeit darstellen Relatives Verhaltnis P B 0 0 5 1 RU 1 5 Kupferkonzentration im Medium mM Abb 27 Abh ngigkeit des relativen Verh ltnisses von Protein zu Bioma
169. r Schwermetallbelastung zeigten die Pilze aus Waldboden einen relativ steileren Abfall in der Wuchsleistung als die Pilze aus Haldenboden ein Zeichen f r ihre h here Sensitivit t gegen ber den beiden Schwermetallen Da sich Kupfer und Zink in diesem Versuch nur durch ihre konzentrationsabh ngige Toxizit t unterschieden wurde in den fol genden Versuchen ausschlie lich Kupfer verwendet auch wenn die vier Testb den nur gering mit diesem Schwermetall belastet waren Tab 4 Ergebnisse 84 Tab 34 Einfluss von Kupfer und Zink auf das lineare Wachstum von Isolaten der Art P fel lutanum aus mit Schwermetallen SM belastetem Haldenboden n 41 und unbelastetem Waldboden n 40 Isolate aus Waldboden reagierten auf die zunehmende Belastung mit Schwermetallen empfindlicher als Isolate aus Haldenboden SM im N hrboden mm d Wald ub Cu mM 0 4 8 DW 3 83 0 32 0 14 MA 0 45 0 27 0 12 Zn mM 0 7 15 DW 3 83 1 28 0 81 MA 0 45 0 31 0 11 Halde b Cu mM 0 4 8 DW 3 56 1 69 0 69 MA 0 19 0 75 0 38 Zn mM 0 7 15 DW 3 356 1 53 0 87 MAT 0 19 0 26 0 12 ub unbelastet b belastet DW Durchschnittswert MA mittlere Abweichung Zur Untersuchung des Einflusses von Schwermetallen auf die Biomassebildung ein zelner Pilzarten wurde das in Kapitel 3 1 2 Tab 24 beschriebene Verfahren eingesetzt mit dem die relative Biomasse als Produkt aus relativer Koloniefl che und relativer K
170. rbleibenden Messpara meter korreliert Dabei wurde davon ausgegangen dass bei v lliger Gleichheit zweier Daten reihen bzw wenn die eine Datenreihe ein Vielfaches der anderen ist wenn also maximale Korrelation von 1 vorliegt nur eine von beiden Datenreihen oder beide zur H lfte zur Unter scheidung der zu untersuchenden Objekte beitragen Umgekehrt ist davon auszugehen dass bei einer geringen Korrelation beide Datenreihen in hohem Ma e zur Unterscheidung beitra gen Eine hohe Summe aller 19 m glichen Korrelationen w rde daher eine geringe eine nied Summe dagegen eine hohe Unterscheidungskraft andeuten Da die maximal m gliche Summe aller Korrelationen bei 20 Messparametern einen Wert von 19 annimmt lie sich aus der tats chlichen Summe der messparameterspezifischen Korrelationen errechnen welche Ergebnisse 56 z gt gt gt amp 85526853553555 1 0 Abb 13 Ermittlung der Differenzierungskraft der in der Bildanalysemethode verwendeten 20 Messparameter MP Kap 2 2 2 1 3 innerhalb von 29 vermessenen Pilzst mmen n 3 Na men s Tab 12 Bildanalysedaten im Anhang unter 7 2 durch Hauptkomponentenanalyse PCA Darstellung Abszisse 1 Hauptkomponente Ordinate 2 Hauptkomponente Grup pen von Parametern I Parameter f r Verteilung von Farben und Helligkeit MP7 MP9 u MP16 MP20 II eigentliche Farbparameter MP2 MP5 u MP10 MP13 lineares Wachstu
171. rchschnittswert DW mm d 2 505 1 096 1 998 1 729 Mittlere Abweichung 2 431 0 675 1 079 0 663 Variationskoeffizient MA DW 0 970 0 616 0 540 0 383 Versuch 2 Anzahl Isolate 141 137 133 132 Durchschnittswert DW mm d 2 397 1 377 1 867 1 887 Mittlere Abweichung MA 2 023 0 692 0 661 0 897 Variationskoeffizient MA DW 0 844 0 503 0 354 0 475 Versuch 3 Anzahl Isolate 146 135 141 135 Durchschnittswert DW mm d 2 330 1 381 2 038 1 588 Mittlere Abweichung MA 1 905 0 970 1 275 0 578 Variationskoeffizient MA DW 0 817 0 702 0 625 0 364 Versuche gesamt Anzahl Isolate 419 414 400 396 Mittelwert MW der Durchschnitts 2 411 1 285 1 968 1 735 werte DW mm dp 0 088 0 163 0 089 0 150 Mittelwert MW der Variationskoeffi 0 877 0 607 0 5064 0 407 zienten MA DW 0 082 0 100 0 139 0 059 Bodenpaar I wb wenig belastet b belastet Bodenpaar II ub unbelastet b belastet Ergebnisse 69 3 2 1 2 Wirkung von Schwermetallen auf die strukturelle Diversit t der Pilze in Acker und Naturb den Nach Atlas 1984 verlieren Mikroorganismengemeinschaften unter Stress Arten ein Vorgang der sich durch eine Verringerung der Diversit t u ert Aufgrund des geringeren Variationskoeffizienten des Wachstums der Pilze aus den Schwermetallvarianten der beiden Bodenpaare war zu erwarten dass auch die Vielfalt der Pilze als Folge von Schwermetall stress abnehmen w
172. rde Wie in Kapitel 2 2 2 1 3 erl utert wurde diese Eigenschaft der vier untersuchten Pilzgemeinschaften bildanalytisch ermittelt Bildanalysedaten im Anhang unter 7 3 s beiliegende CD Da der Shannon Index der Diversit t Shannon und Weaver 1969 von der Gr e der Stichprobe abh ngt wurde hier auf seine Bestimmung verzichtet und die Zahl der Bildtypen in einer definierten Zahl von Isolaten durch rarefaction errechnet Kap 2 2 4 Das Ergebnis dieser Untersuchungen ist in der Tabelle 26 zusammengestellt Wie der Variationskoeffizient des Wachstums Tab 25 nahm die auf gleiche Stichprobengr e bezo gene Zahl der Bildtypen in der Reihenfolge Acker wb gt Acker b gt Wald ub gt Halde b ab Im Gegensatz zu dem erstgenannten Versuch waren die Unterschiede zwischen den jeweiligen Belastungsstufen der beiden Bodenpaare aber nicht signifikant Nur zwischen den beiden Ackerb den einerseits und dem Haldenboden andererseits war der Unterschied in der Zahl der Bildtypen je 125 Isolate gesichert Dies gilt allerdings nur wenn die Mittelwerte und Stan dardabweichungen von Wald und Halde miteinander verglichen werden Vergleicht man da gegen die zu jeweils gleichen Zeitpunkten ermittelten Werte f r Wald und Halde so erschei nen die Unterschiede als gesichert da die Variante Wald immer h here Bildtypenzahlen als Halde lieferte Dagegen f hrt die gleiche auf den Versuchszeitpunkt bezogene Betrachtungs weise bei Vergleich der beiden Ackerb
173. renelementen Tab 8 Medien f r Substratnutzungstests wurden wie in der Tabelle 9 angezeigt hergestellt Tab 6 L sung A K HPO 5g Aqua bidest ad 1000 ml Tab 7 L sung B MgSO 2 5 g NH4NO 25 g Spurenelementl sung 25 ml Aqua bidest ad 1000 ml Siehe Tabelle 8 Material und Methoden 15 Tab 8 Spurenelementl sung FeSO di HO 1 g MnSO 0 2 g Borsaure 0 1 g Molybdansaure 0 1 g 71804 7 0 18 g CuSO3 5 HO 0 16 g HCl 2 mM Aqua bidest ad 1000 ml Fir Substratnutzungstests mit Polymeren und hydrophoben Substanzen wurde der in der Tabelle 9 aufgef hrte Mineralsalzagar ohne Substratstamml sung als Tr germedium ver wendet Dabei wurde gereinigter Agar durch Fadenagar 20 g ersetzt der das f r diesen Test wichtige kryptische Wachstum erlaubt Kap 2 2 3 1 Tab 9 Medien f r Substratnutzungstests L sung A 50 ml L sung B 25 ml Substratstamml sung 200 mM 50 ml Agar gereinigt 12g pH 6 0 Aqua bidest ad 1000 ml 2 1 3 Substrate Die bei Substratnutzungstests mit Isolaten bei der Bestimmung aromatenspezifischer Vermehrungseinheiten CFU und bei Atmungsversuchen mit Boden als alleinige Kohlenstoff C und Energiequelle verwendeten aromatischen S uren sind in der Tabelle 10 aufgef hrt Ebenfalls angegeben ist die Zahl verf gbarer Elektronen die beim Abbau des Molek ls frei
174. rheblichen ph notypischen Ver nderung f hrte Die Art P frequentans wurde in diese Untersuchungen mit aufgenommen obwohl sie nur aus unbelastetem Waldboden isoliert wurde Sie ist wie P fellutanum monoverticillat und wurde daher anf nglich mit diesem verwechselt Die Tabelle 31 zeigt dass die drei Pilze fast gleiche Wuchsraten aufwiesen unabh ngig davon aus welchem Boden sie stammten Die jeweils geringf gig h here Wuchsleistung von P nigricans und P fellutanum aus den belasteten B den ist statistisch nicht gesichert Diskussion 112 Auch ein gesicherter Einfluss der Bodenbelastung mit Schwermetallen auf die katabo lische Vielseitigkeit von P nigricans und P fellutanum gegen ber aromatischen S uren konnte nicht nachgewiesen werden Tab 32 Dagegen k nnen Unterschiede in der Nutzung von Polymeren nicht ausgeschlossen werden Wahrend bei P nigricans aus Ackerb den eine geringe Steigerung der Nutzung der Polysaccharide Gellan Rhamsan und Xanthan auftrat wurde bei P fellutanum aus Haldenboden zumindest eine betrachtlich geringere Nutzung von Chitin und Tannin gegen ber den Isolaten aus Waldboden festgestellt Tab 33 Da diese beiden B den aber etwa 100 km voneinander entfernt sind k nnen die Unterschiede bei die sem Pilz nicht unbedingt auf die Schwermetallwirkung im Haldenboden zur ckgef hrt wer den Obwohl auf gleichen Pflanzenbewuchs geachtet wurde k nnten sie auch darauf beruhen dass an den beiden Standor
175. richtung im Uhrzeigersinn von oben rechts nach oben links verteilt sein k nnen Dies gilt z B f r den MP1 Wachstum der in den Quadranten 2 3 und 4 plaziert wurde oder f r den MP6 und den MP7 in den Quadranten 1 2 und 4 Dieser Sachverhalt unterst tzt die Ergebnisse 59 obige These dass bei der Auswertung der Bildanalysedaten Messparameter weggelassen werden darf 1 0 MP1 2 A MP3 O MP4 MPS MP H o MP7 e MP8 A A MP9 SEN D el AN Q OMP12 d MP13 MP14 15 MP16 nm MP17 MP18 9 MP19 OMP20 Gen T 0 T T 1 1 0 0 5 0 0 5 O 1 1 5 LLI o 0 5 50 A Q 1 0 Abb 14 Ermittlung der Differenzierungskraft der in der Bildanalysemethode verwendeten 20 Messparameter MP Kap 2 2 2 1 3 innerhalb eines schwermetallbelasteten Haldenbodens durch Hauptkomponentenanalyse PCA Es wurden jeweils drei Stichproben zu etwa 130 Pilzisolaten untersucht Bildanalysedaten im Anhang unter 7 3 auf beiliegender CD Die Dif ferenzierungskraft der Parameter dargestellt durch die Lage der Symbole im Diagramm vari iert in Abh ngigkeit von der Stichprobe was beweist dass kein Parameter weggelassen wer den darf Darstellung Abszisse 1 Hauptkomponente Ordinate 2 Hauptkomponente Lineares Wachstum in mm d MP1 Farbparameter der Kolonieoberseite Mean Gray MP2 Mean Red MP3 Mean Green MP4 Mean Blue MP5 Hue Typical
176. riger Wert errechnet Da bei diesen Messungen die Dicke der Agarschicht eine kritische Gr Be war wurden die Kunststoffpetrischalen mit exakt 20 ml Agarmedium Tab 5 beschickt Methodische Probleme bei diesen Messungen ergaben sich aus zwei Tatsachen w hrend die Lichtdurchlassigkeit der Pilzkolonien als Folge der Belas tung zunahm wurde das Medium durch die Schwermetallbelastung triiber und damit dunkler Dies bedeutete nicht nur dass zu jeder Belastungsstufe die Lichtdurchlassigkeit der beimpften und die der unbeimpften Petrischale gemessen werden musste sondern auch dass die maxi mal gestressten Kolonien wegen ihrer geringeren optischen Dichte vom Bildanalyseprogramm nicht immer voll erkannt wurden so dass die anzuwendende Beleuchtungsstarke verringert d h an die gestressten und nicht an die ungestressten Kolonien angepasst werden musste Bei dieser Anpassung war die SchlieBung der Blende um eine Stufe 5 6 8 in der Regel aus reichend Die oben beschriebene Vorgehensweise ist in der Tabelle 24 am Beispiel von je zwei mutmaBlich toleranten resistenten und sensitiven Isolaten von Penicillium fellutanum aus Halden und Waldboden dargestellt Daten zur absoluten und relativen Kolonieflache gehen aus den ersten beiden Zeilenbl cken hervor Um die Lichtdurchl ssigkeit der unbeimpften Agarplatten m glichst genau zu bestimmen wurden je Belastungsstufe zehn Parallelen ver messen Der dritte Zeilenblock macht deutlich dass die dabei auf
177. rst tzen die Auf nahme gering konzentrierter Spurenelemente Bei hohen toxisch wirkenden Schwermetallkon zentrationen dienen sie der Detoxifizierung Der Transport bersch ssiger Schwermetalle aus der Zelle heraus Efflux ist ebenso energieabh ngig wie die Ausscheidung organischer S uren Citrat oder Oxalat die Schwermetalle als Chelate oder Kristalle extrazellul r fixieren Intra zellul r kann eine Akkumulation von Schwermetallen in Vakuolen erfolgen Gadd 1986 b Zu den metabolismusabh ngigen Resistenzmechanismen wird auch die Metalltransformation durch Oxidation Reduktion bzw durch Methylierung Demethylierung gez hlt durch die es Pilzen m glich ist ein toxisches Schwermetall in eine weniger toxische Form zu berf hren Gadd 1989 Die Detoxifizierung von Schwermetallen kann dar ber hinaus auch durch spezielle schwermetallbindende Proteine erfolgen Diese ubiquit r verbreiteten Proteine werden als Me tallothioneine oder Phytochelatine bezeichnet Hamer 1986 Mehra und Winge 1991 Nielson et al 1985 Die Synthese der Metallothioneine wird berwiegend spezifisch von den Metallen z B Kupfer oder Cadmium induziert Ecker et al 1986 Munger und Lerch 1985 Murasugi et al 1981 Ow et al 1994 In einem Pilz k nnen durchaus verschiedene metallspezifische Proteine nebeneinander vorkommen Mehra et al 1988 Nach Tomsett 1993 lassen sich die genannten Mechanismen in zwei Gruppen einteilen n mlich in solche der Verme
178. rtrags wurde die Ein waage an Al O3 vom Trockengewicht abgezogen Anzucht und Aufschluss des untersuchten Zellmaterials erfolgten nach einer Methode von Baldrian 2000 Eine Abwandlung betraf lediglich den Zellaufschluss der mit effektiver als mit dem urspr nglich verwendeten Ultra Turrax TP 18 10 Janke und Kunkel IKA Werk Staufen Deutschland war Die photometrische Bestimmung von Protein und SH Gruppen erfolgte nach den Methoden von Bradford 1976 bzw Ellman 1959 Das zur Quantifizierung von Proteinen ben tigte Bradford Reagenz Bradford 1976 wurde gem der Tabelle 15 hergestellt Nach dem Mischen wurde das Reagenz durch einen Faltenfilter filtriert und bei 4 C aufbewahrt Es ist bis zu sechs Monate haltbar Tab 15 Bradford Reagenz Coomassie Brilliant Blue G 250 100 mg Ethanol 96 50 ml Phosphors ure 85 100 ml Aqua bidest ad 1000 ml Material und Methoden 36 Das zur Quantifizierung der SH Gruppen ben tigte E man Reagenz Ellman 1959 und der darin enthaltene Phosphatpuffer wurden nach den Angaben der Tabellen 16 und 17 angesetzt Nach dem Mischen wurde das Reagenz filtriert Faltenfilter und bei 4 C aufbe wahrt Das Reagenz ist bis zu drei Monate haltbar Tab 16 Ellman Reagenz 5 5 Dithiobis 2 Nitrobenzoes ure DTNB 3 96 mg Phosphatpuffer 0 1 M pH 8 0 ad 100 ml Tab 17 Phosphatpuffer 0 1 M KH PO 50 ml 0 1 M Na HPO4 2H O
179. schen Vielseitigkeit von Bakterien lieBe sich also dahingehend interpretieren dass die Bedeutung der r Strategie unter Stress zu nimmt Die bisher geschilderten Zusammenh nge basieren weitgehend auf Untersuchungen an Bakterien und Boden Ergebnisse fr herer Untersuchungen zur berlebensstrategie von Pilzen sind von Garrett 1951 und Griffin 1972 zusammengefasst worden Nach diesen Autoren sind auch bei Pilzen eindeutige Abh ngigkeiten von der Qualit t der verf gbaren C und Energie quellen nachgewiesen worden Bei Abbau von Pflanzenmaterial bevorzugen Erstbesiedler oder Pionierpilze vornehmlich einfache Zucker und Starke Burges 1939 verwendete f r diese Pilze den Begriff Zuckerpilze um solche Arten zu bezeichnen die weder Cellulose noch Lignin ab bauen k nnen H ufig liefern die Erstbesiedler die Substrate f r die Nachfolgerpilze und die so geschaffenen Substratbedingungen verbessern die Lage einiger Pilze f r bestimmte Zeit Kendrick und Burges 1962 Die sogenannte Substratsukzession Park 1968 verl uft ausge hend von den Zuckerpilzen ber Cellulose und Keratinabbauer bis hin zu Pilzen die in der Lage sind noch weniger gute Substrate wie Tannin oder Lignin als Energiequellen zu nutzen Griffin 1972 In einer groben taxonomischen Einteilung hat Garrett 1951 Zuckerpilze in erster Linie den Phycomyceten Celluloseabbauer den Ascomyceten und Fungi Imperfecti sowie Ligninabbauer berwiegend den Basidiomyceten zugeordn
180. sion in 0 004 Prill sung entsprechend 0 125 cm einer ausgewachsenen Kolonie Je nach Kontaminationsstufe und Ertrag wurden die Standkulturen nach drei bis sieben Tagen Inkubation im Dunkeln bei 25 C abfiltriert mit deionisiertem Wasser gewaschen und in 50 ml Bechergl sern bekannten Ge wichts gewogen Das Myzel wurde in der Regel drei Tage nach Versuchsansatz geerntet da zu diesem Zeitpunkt schon ein ausreichender Zellertrag vorlag die Kulturen aber noch nicht die station re Phase erreicht hatten Kap 3 3 4 Abb 23 Sensitive Pilze die bei 0 67 mM bzw 1 mM Kupfer im Medium noch nicht gen gend Biomasse gebildet hatten mussten aller dings entsprechend l nger kultiviert werden AnschlieBend erfolgte der Aufschluss des Myzels durch M rsern unter Zugabe einer geeigneten Menge Aluminiumoxid Al203 Die zugegebene Menge an AlO orientierte sich am Ertrag der Biomasse Damit das Zellmaterial m glichst fein gem rsert werden konnte wurde das grob zerstoBene Myzel etwa 30 Min im Gefrierfach angefroren Die Zellpaste wurde in einen Zentrifugenbecher bersp lt insgesamt 50 ml und 10 Min bei 13 000 Upm 18370 x g und 10 C zentrifugiert 10 ml des berstands wurden f r die Protein und SH Gruppen Bestimmung abgenommen Der Rest sowie der nicht f r die Messungen ben tigte Teil des berstands wurde in das zugeh rige Becherglas berf hrt und bei 105 C ber Nacht bis zur Gewichtskonstanz getrocknet Zur Bestimmung des Biomassee
181. sity measurement American Naturalist 106 414 418 Slocum HK Malmberg M Greco WR Parsons JC Rustum YM 1990 The determination of growth rates of individual colonies in agarose using high resolution automated image analysis Cytometry 11 793 804 Stadelmann FX Santschi Fuhrimann E 1987 Beitrag zur Abstiitzung von Schwermetall Richtwerten im Boden mit Hilfe von Bodenatmungsmessungen Abschlufbericht Eidge n ssische Forschungsanstalt f r Agrikulturchemie und Umwelthygiene Liebefeld Sch weiz Steinhausen D Langer K 1977 Clusteranalyse Einf hrung in Methoden und Verfahren der automatischen Klassifikation deGruyter Lehrbuch Berlin New York Stelzer M 1997 Nutzung der Bildanalyse bei der Bestimmung der Diversit t pilzlicher Le bensgemeinschaften Diplomarbeit Technische Universit t Carolo Wilhelmina Braun schweig Stelzer M Diedrichs M Reber HH 1999 Bestimmung der Diversit t pilzlicher Lebensge meinschaften durch Bildanalyse Werbeschrift mit der Firma Nikon GmbH D sseldorf Tomori Z Marcin J Zolotova I Krekule I 1998 Interactive segmentation of biomedical images Proc 14th Biennial International Conference Biosignal 98 Brno Czech Repub lic June 23 25 1998 SegmentTool plug in module for mageTool Internet site http www saske sk tomori Tomsett AB 1993 Genetics and molecular biology of metal tolerance in fungi In Stress tolerance of fungi Jennings DH Hrsg Marcel De
182. sonders interessant ist in diesem Zusammenhang dass selbst DNA Restriktionsmuster nicht notwendigerweise zu einer sicheren Gruppeneinteilung f hren Nach Untersuchungen von Wenderoth und Reber 1999 a wurden durch zwei Restriktionsen zyme nur etwa 10 der Isolate gleichen ARDRA Typen ARDRA amplified ribosomal DNA Diskussion 99 restriction analysis zugeteilt Beide Enzyme f hrten aber zu ann hernd gleichen Diversitats indices Soll eine Diversit tsanalyse auf exakter Artbestimmung beruhen m sste jedes Isolat nicht nur mit Hilfe herk mmlicher biochemischer Tests und oder aufgrund seiner morpholo gischen Eigenschaften bestimmt sondern anschlie end oft auch einer DNA Sequenzanalyse unterworfen werden Dies w rde entweder die Zahl der Isolate die in einem Arbeitsgang analysiert werden k nnen soweit reduzieren dass die aus den Daten errechneten kologi schen Indices wenig aussagekraftig waren oder zu wenig Zeit f r die Bearbeitung physiologi scher und biochemischer Fragen lassen Solche Untersuchungen wurden aber f r die Interpre tation stressabh ngiger Ver nderungen in der Zusammensetzung von Pilzgemeinschaften als unerl sslich erachtet Da die Bildanalyse auf der Erkennung von Ph notypen beruht ist die Anwendung die ser Methode in hohem Ma e von der Einhaltung konstanter Bedingungen abh ngig Diese betreffen nicht nur die Kultivierung der Pilzisolate sondern auch den Prozess der Bildauf nahme So m ssen alle
183. sse P B von der Kupferkonzentration bei Isolaten von fellutanum aus Halden und Waldboden W Das relative Verh ltnis von P B nahm bei den Isolaten aus Waldboden sichtbar st rker ab als bei den Isolaten aus Haldenboden Ergebnisse 95 Relatives Verhaltnis SH P 0 0 5 1 0 1 5 Kupferkonzentration im Medium mM Abb 28 Abh ngigkeit des relativen Verh ltnisses von SH Gruppen zu Protein SH P von der Kupferkonzentration bei Isolaten von P fellutanum aus Halden H und Waldboden W Wahrend das relative Verh ltnis von SH P bei den Isolaten aus Haldenboden leicht abnahm stieg es bei den Isolaten aus Waldboden um das 1 5 bis 2 fache an Diskussion 96 4 Diskussion Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es die Reaktion von Bodenpilzen auf Schwer metallstress zu klaren Im Vordergrund des Interesses stand die Frage ob ein Zusammenhang zwischen Diversit t und katabolischer Vielseitigkeit bei diesen Organismen besteht und wie sie die durch den Stress versch rfte energetische Mangelsituation l sen Die Untersuchungen wurden durch die Beobachtung von Wenderoth und Reber 1999 a angeregt wonach Bakte rien unter Schwermetallstress katabolische Fahigkeiten verlieren Das Phanomen wurde bio energetisch begr ndet Da dieser Verlust vorrangig schwerabbaubare aromatische S uren be traf wurde vermutet dass diese unter Schwermetallstress ihre Substratqualit t soweit einb Den dass sich eine Nutzung f
184. ste dieses unter Verwendung von Farb und Fl chenstandards im Auflicht nach Vorschrift des Programmherstellers kalibriert werden um reproduzierbare Messbedingungen v a be z glich der Lichtqualit t gew hrleisten zu k nnen Dazu wurden die Systemeinstellungen verwendet die sich auch bei der Vermessung der Pilzkolonien bew hrt hatten wie z B ein Kameraabstand von 68 cm eine Blende des Objektivs von 5 6 und eine Belichtungszeit der Kamera von 1 50 Sek Auto Auf die ausf hrliche Darstellung der einzelnen Kalibration sablaufe wurde im Folgenden verzichtet da diese je nach verwendetem Programm variieren k nnen Eine metrische Kalibration war erforderlich um das lineare Wachstum einer Pilzkolo nie real messen zu k nnen Ziel war es die gemessene Gr e nicht in Bildpunkten Pixel sondern wie zur Vermessung der Pilze n tig in Millimetern mm auszudr cken Als Kalib rierstandard diente Millimeterpapier Als Standard f r den Schwarzabgleich wurde eine matt schwarz lackierte Kunststoffplatte verwendet die auf der Bildebene plaziert wurde Der Wei abgleich wurde mit der Milchglasscheibe als Standard auf der Bildebene durchgef hrt Die Kalibration des Systems hinsichtlich Farbigkeit Density und Helligkeit Brightness erfolgte mittels Farbtesttafeln Jobo Labortechnik GmbH Gummersbach Deutschland der Farben Rot Gr n Blau einigen Graut nen sowie Schwarz und Wei die ebenfalls auf der Bildebene positioniert werden m
185. t Einschr nkungen m glich Bei der Vermessung eines hellen beigefarbenen Pilzes in den vier Grundfarben Grau Rot Gr n und Blau fiel aber auf dass die Bilder mit abnehmenden Kameraabst nden 68 gt 36 gt 17 cm dunkler wurden erkennbar an abnehmenden Messwer ten und gleichzeitig Rot gegen ber den anderen Farben relativ zunahm Diese Beobachtung war Anlass den Einfluss des Kameraabstands auf vier Farbparameter Kap 2 2 2 1 3 anhand von Farbtesttafeln zu untersuchen Tab 19 Die abnehmenden Messwerte bestatigen dass die Farben mit geringerem Kameraabstand dunkler werden und Farbverh ltnisse sich gering f gig ver ndern F r die Aufnahme von Pilzbildern w rde dies bedeuten dass bei unter schiedlichen Kameraabst nden trotz konstanter Belichtung gro e schnellwiichsige Isolate relativ heller dargestellt w rden als kleine langsamw chsige und dass Isolate einer Art und einer kritischen Gr e bei der ein vorher festgelegter Wechsel von einem Kameraabstand zum anderen erfolgen m sste durch voneinander abweichende Bilddaten charakterisiert w r den Besonders gravierend w rde sich dieser Sachverhalt auf die Bilder gro er und heller bzw kleiner und dunkler Pilzkolonien auswirken die bei gro em Kameraabstand berbelich tet bei kleinem Abstand dagegen unterbelichtet w ren Aus diesem Sachverhalt ergibt sich auch dass f r eine nachtr gliche subjektive berpr fung von Pilzgruppen nur ein mittlerer Kameraabstand in Frage
186. te den Einfluss von Schwermetallen auf die relative Biomasse auf festen N hrb den wachsender Pilze durch simultane Bestimmung von Kolonieflache und dichte aufzuzeigen Die Absch tzung der katabolischen Vielseitigkeit von Pilzgemeinschaften ein Index f r die Gleichm igkeit der Verteilung von Abbauf higkeiten erfolgte auf zwei Arten durch Quantifizierung aromatenspezifischer Vermehrungseinheiten CFU und durch respirometri sche Bestimmung aromatenspezifischer Abbauzeiten in Bodenproben Die katabolische Viel seitigkeit von Pilzisolaten ergab sich dagegen aus dem Verh ltnis aus genutzten zu angebote nen Substraten aromatische S uren u Polymere Zusammenfassung 117 Die Unterscheidung zwischen Toleranz und Resistenz gegen ber Schwermetallen bei Pilzisolaten erfolgte durch simultane Bestimmung der Biomasse und des Verh ltnisses von Sulfhydryl SH Gruppen zu Protein P in kupferkontaminierten Fl ssigkulturen Die oben erwahnten Untersuchungen f hrten zu folgenden Erkenntnissen Der Einfluss von Schwermetallstress auf die Wuchsleistung von Bodenpilzen f hrte nur bei Isolaten aus Ackerb den zu einer signifikanten Abnahme des mittleren Durchschnittswerts und des Variationskoeffizienten Nur der wenig belastete Ackerboden war von allen B den unterschieden Bei Vergleich der beiden Bodenpaare hinsichtlich ihrer Pilzdiversit t waren Unterschiede nur zwischen Wald und Halde gesichert wenn gleiche Probenahmezeitpunkte b
187. ten beruht auf der Unterscheidung von Arten oder anderen Einheiten deren Be stimmung ihrerseits von der Messung mehrerer charakteristischer Merkmale abh ngt Unter schiede zwischen Gemeinschaften k nnen aber auch aufgezeigt werden wenn nur ein einzi Material und Methoden 39 ges Merkmal erfasst wird Ein geeignetes Merkmal ist z B die Wachstumsrate wenn sie unter absolut gleichbleibenden Bedingungen gemessen wird Da die Erfassung nur eines Merkmals eine Gruppierung von Organismen nicht erlaubt ist damit die Bestimmung eines Diversitats index nicht m glich Man kann aber davon ausgehen dass jede Pilzart durch eine mittlere Wachstumsgeschwindigkeit gekennzeichnet ist Unterschiede innerhalb einer Gemeinschaft hinsichtlich dieses Merkmals w rden dann nicht nur die Variabilit t der Arten bez glich die ses Merkmals widerspiegeln sondern k nnten auch als ein Indikator f r die Diversit t der Gemeinschaft angesehen werden Durch Bestimmung der Durchschnittswerte der Wachs tumsraten und ihrer Streuung sowie den daraus abgeleiteten Variationskoeffizienten lassen sich die untersuchten Gemeinschaften charakterisieren In dieser Arbeit wurde der Variations koeffizient aus dem Durchschnittswert der Wachstumsraten und der mittleren Abweichung berechnet 7 Die mittlere Abweichung wurde gew hlt um klarzumachen dass es sich nicht um Mehrfachmessungen an einem Organismus sondern um einmalige Messungen an einer gr eren Zahl unterschiedl
188. ten ein unterschiedliches Angebot von C Quellen vorlag Erst wenn sich ein Verlust von Fahigkeiten in zwei benachbarten B den wie den beiden Ackerb den nachweisen lie e k nnte er eindeutig mit der Toxizit t der Schwermetalle in Verbindung gebracht werden Dies war bei verschiedenen Bakterienarten beobachtet worden Wenderoth et al 2001 und wurde schon im Zusammenhang mit der berlebensstrategie von Bakterien und Pilzen diskutiert Vorbehaltlich der Untersuchung weiterer Arten auch aus anderen Gat tungen kann bisher also nicht auf eine Abnahme der katabolischen Vielseitigkeit bei Pilzen auf der Artebene geschlossen werden 4 4 Energetische Betrachtungen zu berlebensstrategie und Diversit t von Pilzen unter dem Einfluss von Schwermetallen Nach Odum 1985 sind Gemeinschaften von Mikroorganismen besonders stressemp findlich wenn die Diversit t vor der Stresseinwirkung relativ hoch war Atlas 1984 begr n dete das Entstehen einer hohen Diversit t und evenness der Artenverteilung mit der starken Konkurrenz zwischen den Arten Sie werde bei Stress aufgehoben mit der Folge dass sich einzelne Arten auf Kosten der anderen verst rkt vermehren k nnten Dagegen vermuteten Wenderoth und Reber 1999 a 1999 b aufgrund gleichzeitiger Untersuchungen zu Diversitat und katabolischer Vielseitigkeit von Bakterien dass der Grad der Diversit t u a einen bio energetischen Hintergrund haben muss Bestimmend f r das berleben unter Stress
189. ten relativen Distanz aus betrachtet b Vergr erungsausschnitt aus der Abbildung 15 a mit einem relati ven Distanzbereich von 0 2 Ergebnisse 62 ma ist nicht nur die Zahl der Cluster und Einzelisolate zunehmend geringer sondern auch die Zahl der Individuen je Cluster zunehmend gr er Die durch das erste Minimum der evenness charakterisierte Clusterebene ist nicht nur an den jeweiligen Datensatz angepasst sondern auch f r alle Datens tze reproduzierbar und scheint daher weniger willk rlich zu sein als a priori festgelegte Ahnlichkeitsstufen Da aber nicht ausgeschlossen werden kann dass Datens tze verschiedener Herkunft auch bei der ge nannten Vorgehensweise zu voneinander abweichenden Clusterebenen f hren erschien es sinnvoll die Datens tze von Pilzen aus zu vergleichenden Gemeinschaften zu vereinigen und wie in der Abbildung 12 gezeigt auf einer gemeinsamen Ebene zu clustern Die Bestimmung der Typenzahl je Stichprobe erfordert dann lediglich die nachfolgende Trennung der Cluster entsprechend der Herkunft der Isolate Die Vorgehensweise in dieser Arbeit erfolgte immer nach diesem Schema 3 1 2 Entwicklung einer Methode zur Absch tzung der Wirkung von Schwermetallstress auf die Biomasse von Pilzkolonien durch bildanalytische Bestimmung von Kolonieflache und Koloniedichte Die Absch tzung der Diversit t von Pilzen durch Bildanalyse schloss die Messung des Wachstums als wichtiges Unterscheidungsmerkmal ein Da sic
190. tiven Distanz von 0 35 Pfeil die Bedingung des Nebeneinanders von Bildtypengrup pen Cluster und Einzelisolaten Bei diesem ersten Minimum wurden noch sieben Einzeliso late gez hlt w hrend das gr te Cluster 21 Isolate enthielt Im Fall der beiden anderen Mini Ergebnisse 61 1 00 280 0 99 evenness 0 98 Zahl der Bildtypen 740 _ 0 97 200 n 0 96 5 095 160 0 94 120 S v 0 93 0 92 80 0 91 40 0 90 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 a Relative Distanz 95 1 00 280 0 99 9 evenness 0 98 Zahl der Bildtypen 240 _ 0 97 200 amp 2 0 96 2 0 95 160 S S 0 94 120 v 0 93 0 92 80 0 91 40 0 90 0 0 0 0 25 0 50 0 75 1 00 1 25 1 50 1 75 2 00 b Relative Distanz 95 Abb 15 Ermittlung der geeigneten Clusterebene durch Gegen berstellung von relativer Dis tanz in Dendrogrammen und der evenness der Verteilung von Bildtypen in einer Stich probe In diesem Beispiel wurden Bildanalysedaten einer Gruppe von 274 Pilzisolaten aus Bodenpaar I geclustert 132 Isolate aus wenig belastetem Ackerboden u 142 Isolate aus be lastetem Ackerboden s Anhang unter 7 3 bzw beiliegende CD Das zugeh rige Dendro gramm war wegen seiner Gr e nicht darstellbar und wurde nur am Bildschirm ausgewertet a Gesamtansicht mit einem relativen Distanzbereich von 0 22 Die geeignete Clusterebene fallt mit dem ersten Minimum der evenness Pfeil zusammen von der gerings
191. topfen verschlossen und bei 25 C inkubiert Nach etwa drei Tagen erfolgte die berpr fung der Reinheit Reinkulturen wurden fortlau fend nummeriert und bei 4 C im K hlschrank gelagert Zur Vermeidung von Infektionen wurden die R hrchenst nder in Kunststofft ten verwahrt Nach Bedarf wurden Pilze auf neue Stammr hrchen berimpft um z B gen gend Impfmaterial zur Verf gung zu haben Material und Methoden 25 Isolate die aufgrund der Diversit tsuntersuchungen in beiden Proben eines Boden paars vorkamen und f r weitergehende Untersuchungen vorgesehen waren mussten noch besser vor Kontamination z B durch Milben gesch tzt werden als die Arbeitsstammkultu ren Zu diesem Zweck wurden etwa f nf Myzelst cke in 5 ml sterilem destilliertem Wasser in Schraubglasr hrchen 10 cm bei 4 C aufbewahrt Die Myzelst cke wurden aus dem Rand bereich von Kolonien mittels Skalpell ausgeschnitten Diese Art der Konservierung ist laut Angaben von Frau Dr Lang pers nliche Mitteilung g ngige Praxis in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZ Braunschweig 2 2 2 1 3 Bildanalyse Die oben genau beschriebenen Bedingungen der Anzucht von Pilzen sind wichtig f r die absolute Reproduzierbarkeit von Bilddaten mit deren Hilfe in dieser Arbeit gro e Zahlen von Bodenisolaten zum Zweck der Diversit tsabsch tzung gruppiert werden Kalibration des Bildanalysesystems Vor dem Einsatz des Bildanalysesystems mus
192. tretende Standardabwei chung im Durchschnitt nur etwa 1 betr gt Der vierte Zeilenblock enth lt die je nach Belas tung ermittelten Grauwerte der beimpften Petrischalen Die Extinktionswerte in Block 5 erge ben sich aus der Differenz der in Block 3 und 4 aufgef hrten Grauwerte Ihre Relativierung f hrt zu den in Zeilenblock 6 angegebenen Werten Das Produkt der relativen Werte aus Block 2 und 6 stellt die relative Biomasse der vier Testpilze unter dem Einfluss des verwende ten Schwermetalls Kupfer dar Block 7 Es ist zu erkennen dass die relative Biomasse den Schwermetalleffekt auf das Wachstum von Pilzen schon bei geringerer Belastung des Medi ums anzeigt als die Kolonieflache Auch Unterschiede in der Toleranz Resistenz der vier Testpilze werden durch Abschatzung der relativen Biomasse schon in der ersten Belastungs stufe 1 mM deutlicher sichtbar als durch Messung von Koloniefl che bzw Koloniedichte allein Ergebnisse 64 Tab 24 Einfluss der Kupferkonzentration auf die Koloniegr e und die Koloniedichte Ex tinktion von Isolaten von P fellutanum aus Halden H und Waldboden W Aufgef hrt sind die Koloniefl che absolut und relativ die gemessenen Grauwerte Mean Gray unbe impfter und beimpfter Petrischalen sowie die davon abgesch tzte Extinktion absolut und relativ Die relative Biomasse zeigt Unterschiede hinsichtlich der Toleranz Resistenz der Pilze bei geringer Belastung besser an als die Kolonieflache bzw
193. trukturen ver ndern und kompetitiv aktive Zentren von Enzymen hemmen Tyler 1981 Tyler et al 1989 Mikroorganismen haben im Lauf der Evolution zwar Fahigkeiten entwickelt mit den verschiedenen Arten von Stress fertig zu werden d h sie haben unterschiedliche Grade von Toleranz bzw Resistenz entwickelt die ihnen ein berleben in sauren oder kontaminierten Habitaten erm glichen Dean Ross und Mills 1989 Duxburry und Bicknell 1983 Mills und Colwell 1977 F higkeiten wie z B die Aktivierung von Ionenpumpen Wood 1984 die toxische Ionen aus der Zelle bef rdern oder die Synthese von Metallothioneinen die in das Zellinnere gelangte Schwermetalle an SH Gruppen binden Gadd 1989 erfordern aber einen Teil der den Mikroorganismen zur Verf gung stehenden Energie die andernfalls der Zellvermehrung oder dem Zellerhalt dienen k nnte Wood und Wang 1983 Dies ist auch der Grund warum die mikrobielle Biomasse in sauren oder schwermetallkontaminierten B den einen h heren Atmungsquotienten gCO aufweist und im Vergleich mit neutralen bzw nicht kontaminierten B den abnimmt Anderson und Domsch 1993 Brookes und McGrath 1984 Brookes et al 1986 FlieBbach et al 1994 In Kl rschl mmen ist die negative Wirkung der Schwermetalle oft st rker als der positive Effekt der mit dem Schlamm ausgebrachten organischen Substanz Chander und Brookes 1991 1993 Bakterien haben eine bisher nicht beachtete M glichkeit ihre Toleranz g
194. tung Abb 2 Bildanalyseapparatur zur Quantifizierung des Pilzwachstums und der Farbkompo nenten pilzlicher Kolonien Optikstandards Grau und Farbtesttafeln Art No 6817 12095 Jobo Labortechnik GmbH Gummersbach Deutschland Wei standard Milchglasscheibe Schwarzstandard Probenhalterung aus Kunststoff Gr enstandard Millimeterpapier Material und Methoden 20 Rechner Pentium r 90 MHz 32 MB RAM mit Grafikkarte Magiclib Rev 3 31 Matrox Graphics Inc Montreal Kanada Monitor 19 mit 72 Hz Bildwiederholung CD Brenner Software Betriebssystem DOS Version 6 22 Benutzeroberflache Microsoft Windows 95 Version 4 00 950 B Microsoft Corporation Redmond WA USA Bildanalyseprogramm Lucia G Version 3 52 a for Nikon GmbH Laboratory Imaging LIM Prag Tschechische Republik Tabellenkalkulations und Statistikprogramme Microsoft Excel Version 97 SR 2 Microsoft Corporation Redmond WA USA Programme f r Clusteranalyse und Hauptkomponentenanalyse PCA Kap 2 2 2 1 4 u 2 2 2 1 5 XLSTAT fiir MS Excel Version 4 4 Dr Thierry Fahmy Paris Frankreich WinSTAT fir MS Excel Version 1999 3 R Fitch Software Staufen Deutschland Pirouette Version 2 0 Infometrix Inc Woodinville WA USA Programme zur Anwendung der rarefaction Methode Kap 2 2 4 ANDI MOPS eigene DOS Programme 2 1 5 Pilzstimme Zur Uberpriifung der Genauigkeit der wahrend dieser Arbeit weiter
195. tzt werden wobei f Zahl substratspezifischer CFU oder reziproker Abbauzeiten F Summe aller CFU oder reziproker Abbauzeiten Da H immer etwas kleiner als der Logarithmus der Artenzahl bzw hier die Zahl der durchgef hrten Tests ist ist aus Gleichung 8 abzuleiten dass die evenness den Wert 1 nicht berschreiten kann Um die Berechnung der evenness erm glichen zu k nnen war es aller dings notwendig anstelle Null bei Nichtnutzung eines Substrats einen sehr kleinen Wert z B 1 x 109 einzusetzen Als f r die Verteilung von Abbaufahigkeiten in Gemeinschaften haben Wende roth und Reber 1999 b einen Index eingef hrt den sie als katabolische Vielseitigkeit 9 bezeichneten Katabolische Vielseitigkeit a 9 MA wobei DW Durchschnittswert aller substratspezifischen Messwerte z B CFU bzw reziproker Abbauzeiten MA mittlere Abweichung vom Durchschnittswert s o Material und Methoden 41 Die Entwicklung dieses Index der dem Kehrwert des Variationskoeffizienten enspricht beruht auf der Beobachtung dass in schwermetallgestressten Bakteriengemein schaften der Anteil der Isolate mit relativ hoher Zahl getesteter katabolischer Fahigkeiten abnahm umgekehrt der Anteil der Isolate mit geringer Zahl von Fahigkeiten zunahm Ab nahme der katabolischen Vielseitigkeit auf der Organismenebene Entsprechend nahm mit steigender Bodenbelastung der Anteil der an sich schon haufigen substratspezifische
196. und damit auch f r die Diversit t von Mikroorganismengemeinschaften sei vielmehr wie jede Art bzw sogar jeder Stamm mit der gegebenen energetischen Situation auskommt W hrend sich bei Diskussion 113 Bakterien unter Stress St mme mit einer geringeren katabolischen Vielseitigkeit anreichern also ein Verlust von F higkeiten zur Nutzung energetisch wenig profitabler C Quellen zu beobachten ist Wenderoth et al 2001 reagieren Pilze auf Dauerstress durch Schwermetalle offensichtlich mit einem Mechanismus der den Energieaufwand f r die Stressbew ltigung herabsetzt In der Literatur Hamer 1986 Mehra und Winge 1991 Nielson et al 1985 wird behauptet die Fahigkeit zur Bildung von Metallothioneinen sei ein weit verbreiteter Mecha nismus zur Abwehr von Schwermetallstress Wenn bei den eigenen Versuchen die Synthese von Metallothioneinen auch nur durch eine erh hte Konzentration von SH Gruppen im Prote in nachgewiesen wurde so l sst diese Mehrsynthese in zwei Isolaten von P fellutanum aus unbelastetem Waldboden bei Wachstum in kupferhaltigem Medium vermuten dass es sich dabei um eine konstitutive Schutzfunktion handelt Die Synthese von SH Gruppen muss aber ein sehr energieaufwandiger Mechanismus sein da sie mit einer starken Mindersynthese von Biomasse in schwermetallhaltigem Medium verbunden ist im Mittel 70 bei 1 mM Cu Tab 35 Tats chlich erfordert die Mehrsynthese von SH Gruppen durch Reduktion des Schwefels im Sul
197. und der Farbkomponenten pilzlicher Kolonien fand an einer Bildanalyseeinrichtung der Firma Nikon GmbH D sseldorf Deutschland statt Diese Einrichtung setzte sich wie folgt zusammen Kamera DEI 470 T CCD Video Camera System Kamera Videosteuerungskasten mit Keyboard Optronics Engineering Goleta CA USA Objektiv Mikro NIKKOR 60 mm Nikon GmbH D sseldorf Deutschland Makrostand MacroStand mit integriertem Auf und Durchlicht Abb 2 App No 00MSTD2520 Synop tics Ltd Cambridge UK Je ein Seitenarmstativ M CXLA8 50 f r Kamera und Auflichtvorrichtung h henverstell bar Vorhang aus schwarzem Samtstoff zur Fremdlichtabschirmung Weiteres Zubeh r Milchglasscheibe zwei schwarze Probenhalterungen Beleuchtungsapparatur Auflichtvorrichtung h henverstellbar mit zwei parallel angeordneten Halterungen f r Leuchtstoffr hren Material und Methoden 19 Durchlichtvorrichtung mit vier im Quadrat angeordneten Halterungen f r Leuchtstoffr hren abgedeckt durch Milchglasscheibe Leuchtstoffr hren in Tageslichtqualitat 5400 K OSRAM L 8W 12 950 LUMILUX de Luxe Osram GmbH M nchen Deutschland Eine Skizze der eingesetzten Bildanalyseapparatur ist in der Abbildung 2 dargestellt Kamera Objektiv Auflichtaufhangung Reprostander mit Reproarmen _ vadum h henverstellbar 5 schwarzer Samt _ Petrischale mit Pilz Stableuchtstoffr hre i 5400 K Durchlichteinrich
198. ung 0 004 in einem Eppendorf Reaktionsgef 1 5 ml angesetzt wurde angeimpft Hierzu wurden 10 ul Suspension in die Schalenmitte pipettiert Schablone Zu gering oder gar nicht sporulierende Pilze wurden durch ein kleines quadratisches Myzelst ck angeimpft das dem Rand einer Vorkultur mittels Skalpell entnommen worden war Beimpfte Petrischalen wurden in einem Brutraum bei 22 C inkubiert Die Platten wurden invertiert in einem Regal auf Styroporplatten und in gleicher H he ausgelegt um starke Kondenswasserbildung im Schalendeckel zu verhindern bzw um eine absolut identi sche Inkubationstemperatur zu gew hrleisten Gegen zu starke Austrocknung wurden die Platten mit transparenter Kunststofffolie abgedeckt Um die Sporulierung der Pilze w hrend der Inkubationszeit anzuregen wurden die be impften Petrischalen mit Schwarzlicht OSRAM L 36 W 73 568 SYLVANIA Blacklight Blue F 36 W BLB in einst ndigem Wechsel Zeitschaltuhr bestrahlt Laut Hersteller Osram GmbH M nchen Deutschland emittieren die Leuchtstoffr hren ausschlieBlich langwelliges UV Licht 300 400 nm das f r das Auge unsch dlich ist Die Leuchtstoffr hren waren 75 cm ber den Kulturen angebracht um zu starker W rmeentwicklung vorzubeugen Stammhaltung Jeder isolierte Pilz wurde auf ein Schr gr hrchen berimpft Dieses enthielt 6 ml N hrmedium Tab 5 welches mit Fadenagar ohne Streptomycinzusatz ange setzt wurde Das R hrchen wurde mittels Wattes
199. ung gew hrleisten z B Sklerotien und gef rbte Sporen In ihrer Charakterisierung der berlebensstrategie von Pilzen z hlen Cooke und Whipps 1993 dagegen nur die drei Kategorien C R und S auf die f r wettbewerbsorientiertes compe titivelcombative ruderales und stressangepasstes Verhalten stehen Abgeleitet von diesen Hauptkategorien werden jedoch auch die vier sekund ren Strategien C R SR C S und C S R unterschieden Das Verhalten eines Pilzes gegen ber Schwermetallstress im Boden wird durch den Besitz bestimmter Toleranz und oder Resistenzmechanismen bestimmt Gadd 1986 b 1989 ist der Auffassung dass diese Begriffe nicht ausreichend definiert und haufig nach subjektiven Krite rien verwendet w rden Daher werden sie in dieser Arbeit bis auf Weiteres immer zusammen genannt Je nach Art Effektivit t und Anzahl der vorhandenen Mechanismen und in Abh ngig keit vom Grad der Kontamination des Habitats k nnen Pilze als tolerant resistent oder sensitiv gegen ber Schwermetallstress eingestuft werden Mehrere passive oder aktive Mechanismen haben sich entwickelt die aber auch einen unterschiedlichen energetischen Anspruch haben So ist z B die Bindung von Schwermetallen an der Zelloberfl che oder extrazellul ren Polysaccha Einleitung 6 riden unabh ngig die intrazellul re Aufnahme Influx durch die Zellmembran in der Regel dagegen abh ngig vom Stoffwechsel Gadd 1986 a Beide Mechanismen unte
200. ung ist und ein korrekter Segmentierungsablauf enorm wichtig f r eine Messung mit geringer Fehlerquote ist demonst rierten Sieracki et al 1989 anhand der mikroskopischen Gr enbestimmung fluoreszieren der Zellen Auch Tomori et al 1998 setzten bei der Auswertung biomedizinischer Bilder die Diskussion 98 interaktive Segmentierung ein In der eigenen Arbeit erwies sich die interaktive bzw semi automatische Segmentierung insbesondere bei der Vermessung pigmentloser Pilze Kap 2 2 2 1 3 als sinnvoll Liu et al 2001 gelang vor kurzem die mikroskopische Abschatzung der morphologischen Bakteriendiversit t unter Zuhilfenahme der Bildanalysetechnik wobei auf vorherige Isolierung und anschlie ende Kultivierung der Organismen verzichtet werden konnte Eine Methode die wie in dieser Arbeit entwickelt Wachstumsdaten und Farbdaten f r die Charakterisierung von Pilzen verwendet und die gewonnenen Bildanalysedaten einer Clusteranalyse mit dem Ziel der Gruppierung hnlich aussehender Isolate unterwirft ist bis her nicht bekannt geworden Wegen der Bestimmung nur makroskopisch ermittelbarer Para meter k nnte man ihr den Vorwurf machen sie differenziere nur Ph notypen und sei daher f r eine exakte Artbestimmung nicht geeignet Letzteres war mit der Entwicklung der hier beschriebenen kombinierten Methode aus Bild und Clusteranalyse allerdings auch nicht be absichtigt Vielmehr war es das Ziel dieses Teils der vorliegenden Arb
201. ussten S mtliche Kalibrationen wurden vom Programm ge Material und Methoden 26 speichert Beispieldaten erfolgter Kalibration Value der Helligkeit und Farbigkeit zeigt die Tabelle 14 Tab 14 Helligkeits und Farbigkeitswerte nach erfolgter Kalibration Helligkeit Farbigkeit Referenztafel Value _ Brightness Value Density 1 schwarz 68 10 66 10 2 blau 78 9 77 9 3 grau a 88 8 88 8 4 grau b 126 7 126 7 5 gr n 133 6 134 6 6 rot 206 5 205 5 7 grau c 235 2 234 2 8 wei 255 0 255 0 Messfunktionen Unter Verwendung folgender parametrisierter Messfunktionen aus dem Bildanalyseprogramm Lucia wurden die Pilze in ihrem Wachstum und ihrer Farbgebung vermessen Equivalent Diameter equivalenter Durchmesser Nach erfolgter metrischer Kalibration des Bildanalyseprogramms kann der equivalente Durchmesser mm einer Pilzkolonie nach der Formel 1 4x Fl che 1 S 1 gemessen werden ber den davon abgeleiteten Radius ist es bei zeitlich versetzten Messun gen m glich die lineare Wachstumsgeschwindigkeit in mm d zu bestimmen Die Fl che Area dient als Hauptkriterium der Gr e wobei die unkalibrierte Fl che die Zahl der Bild elemente Pixel die kalibrierte Fl che dagegen die Realfl che angibt Wird die Koloniefl che nicht direkt ber die Funktion Area Fl che ermittelt so ist es auch m glich unter Ver wendung des Radius die Koloniefl che ber die Formel der Kreisfl che 2
202. y dagegen nur zu etwa 33 Dies galt f r den Datensatz mit bekannten Testst mmen Tab 23 Bei anderen Datens tzen ist sicher mit abweichenden Werten zu rechnen wie auch aus den zweidimensionalen Dia grammen der entsprechenden Hauptkomponentenanalysen hervorgeht Abb 13 u 14 wenn diese auch nicht die Informationen liefern wie sie die paarweise ermittelten parameterspezifi schen Summen der Korrelationen Tab 23 wiedergeben Diskussion 101 Sicher haben die Farbparameter bei der hier angewandten Methode ein Ubergewicht das sich aus ihrer leichten Bestimmbarkeit ergab Weitere Parameter z B das L ngen Brei ten Verh ltnis von Sporen oder die Hyphenverzweigung in Mikrokolonien hatten zwar ein gesetzt werden k nnen aber die Methode wegen der daf r erforderlichen Mikroskopie erheb lich arbeitsaufw ndiger gestaltet Ein Parameter der die Kreisf rmigkeit Circularity von Objekten beschreibt erwies sich bei der Differenzierung von Pilzen dagegen als wenig sinn voll da zufallig nicht kreisrund wachsende Kolonien von solchen typischer Wuchsform ge trennt worden w ren Andererseits w re die Einbeziehung der Koloniedichte die bei der Ab sch tzung der relativen Biomassebildung im Durchlicht leicht zu bestimmen ist Kap 3 1 2 durchaus sinnvoll gewesen wenn ihre Einsetzbarkeit rechtzeitig erkannt worden ware Eine Steigerung der Unterscheidungskraft der hier eingesetzten Messparameter ware auch durch eine Verbesserung d

Dissertation - Digitale Bibliothek Braunschweig

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